dissertação cintia-edith
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CINTIA MACHADO
Diferenciação molecular de duas espécies de peixes antárticos do
gênero Notothenia (Notothenioidei: Nototheniidae) através da
análise do DNA mitocondrial.
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre, pelo Curso de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná. Orientadora: Drª Edith Susana Elisabeth Fanta
CURITIBA 2006
i
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES .......................................................................................... ii LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................... iii RESUMO.................................................................................................................... iv ABSTRACT ................................................................................................................. v 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................1
A Região Antártica...................................................................................................1 Peixes da Região Antártica......................................................................................2 Estudos genéticos em peixes ..................................................................................4 DNA Mitocondrial de peixes.....................................................................................5 Técnicas de Biologia Molecular utilizadas em estudo de populações .....................7
2. OBJETIVOS ..........................................................................................................10 3. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................11
3.1 Reagentes .......................................................................................................11 3.2 Tampões e soluções........................................................................................11 3.3 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados ..........................................................12 3.4 Equipamentos utilizados ..................................................................................12 3.5 Material biológico/Amostras.............................................................................12 3.6 Técnicas ..........................................................................................................14
3.6.1 Extração do DNA.......................................................................................14 3.6.2 Amplificação do gene mitocondrial Citocromo b .......................................16 3.6.3 Amplificação do gene mitocondrial ND2....................................................17 3.6.4 Digestão do gene ND2 com endonucleases de restrição..........................18
4. RESULTADOS......................................................................................................20 5. DISCUSSÃO .........................................................................................................23 6. CONCLUSÕES .....................................................................................................26 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS..........................................................................27 ANEXOS ...................................................................................................................34
ii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Região Antártica indicando o paralelo de 60° S delimitando a região, os
mares de Ross e Weddel, a Península Antártica e o Pólo Sul )...........................1 Figura 2: Ilha do Rei George e sua localização em relação ao Continente Antártico..2 Figura 3: molécula de mtDNA de Protopterus dolloi indicando a organização dos
genes e a região controle de transcrição e replicação ........................................6 Figura 4: Pontos de coleta dos peixes na Baia do Almirantado. ..............................13 Figura 5: Produto da extração do DNA em gel de agarose 1%.................................15 Figura 6: Produto da extração do DNA em gel de agarose 1% (Kit). ........................15 Figura 7: Resultado da Amplificação do segmento do gene Citocromo b em gel de
agarose 1%. .......................................................................................................16 Figura 8: Resultado da amplificação do gene ND2 em gel de agarose 1%. ...........17 Figura 9: Produto da purificação em gel de agarose 1%, utilizando o marcador de
peso molecular λ Hind III para estimar a quantidade do DNA obtido. ................18 Figura 10: Marcadores de tamanho molecular em gel de acrilamida 5%, utilizados
para comparação das bandas geradas na digestão com a indicação do tamanho das bandas.........................................................................................................19
Figura 11: Resultado da amplificação do segmento do gene ND2 por eletroforese em gel de agarose 1%. ............................................................................................20
Figura 12: Produto da purificação do produto do PCR em gel de agarose 1%. ........20 Figura 13: Resultado das digestões com as enzimas AluI, DdeI, HindIII, MboII e RsaI
em gel de poliacrilamida 5%. .............................................................................21
iii
LISTA DE ABREVIATURAS
Cyt b - Citocromo b
DNA - Ácido desoxirribonucleico
dNTP - desoxirribonucleotídeo
EACF - Estação Antártica Comandante Ferraz
EDTA - Ácido etileno-diamino-tetracético
Kb - Quilobase (1000 pares de nucleotídeos)
mM - milimolar
mtDNA - DNA mitocondrial
ND2 - NADH desidrogenase subunidade 2
pb - pares de base
PCR - polymerase chain reaction
RFLP - Restriction Fragment Length Polimorfism
RNA - Ácido ribonucléico
TEMED - Tetramethylenediamine
TRIS - Tris (hidroximetil) aminometano
iv
RESUMO
A subordem Notothenoidei, da ordem dos perciformes, é endêmica nas águas geladas do Oceano Austral. Este grupo representa 45% das espécies conhecidas na região antártica e, mais significativamente, envolve mais de 95% da biomassa de peixes encontrados no Oceano Austral. Até pouco tempo os estudos sistemáticos de peixes antárticos eram baseados apenas em caracteres morfológicos. Entretanto, apenas os caracteres morfológicos não eram suficientes para uma identificação decisiva das espécies e para os estudos filogenéticos. Assim, as técnicas moleculares são ferramentas importantes nos casos em que a identificação de espécies com base em características morfológicas e citogenéticas é difícil, bem como na separação de populações próximas geograficamente. Especimes de Notothenia rossii e Notothenia coriiceps foram coletados na Baia do Almirantado, Ilha Rei Jorge, e alguns exemplares de N. coriiceps no Mar de Ross. Os especimes de N. coriiceps exibiram consideráveis variações na morfologia, as mesmas que, definiam no passado duas espécies: N. coriiceps e N. neglecta. O objetivo do presente trabalho foi a diferenciação molecular de duas espécies de peixes da região antártica (N. rossi e N. coriiceps) através da análise do DNA mitocondrial e a determinação de possíveis diferenças entre os indivíduos classificados como N. coriiceps, porém com variação fenotípica marcante. Um segmento do gene mitocondrial NADH desidrogenase subunidade 2 foi amplificado pela técnica do PCR (Polymerase Chain Reaction). A diferenciação das espécies foi determinada pela técnica do RFLP (Restriction Fragment Length Polimorfism) onde aproximadamente 690 pares de base do gene amplificado foram digeridos com enzimas de restrição. Foi possível diferenciar as espécies N. coriiceps da N. rossii através desta técnica. Nenhuma diferença foi encontrada entre os especimes classificados como N. coriiceps, mesmo entre aqueles exemplares que apresentaram considerável variabilidade fenótipica.
v
ABSTRACT
Fishes of the Southern Ocean surrounding Antarctica are dominated by species of the suboder Notothenioidei. This group represents over 45% of the known species in the Antarctic region and, more significantly, involves more than 95% of the biomass of fish in the Sourthern Ocean. Up to recent times the systematic studies of Antarctic fishes were based barely in morphological characters. However morphological characters were not sufficient for a decisive identification of the species and for phylogenetical studies. The past decades have been an active period in taxonomy and systematics studies of this group. Specimens of Notothenia rossii and Notothenia coriiceps were collected in Admiralty Bay, King George Island, and some N. coriiceps in the Ross Sea. The N. coriiceps specimens exhibit considerable variation in morphology, that lead, in the past, to the definition of two species: N. coriiceps and N. neglecta. The question was to determine if N. neglecta and N. coriiceps are different species or sub-species, or if it is the same species with a wide range of morphological, physiological and behavioural variability. Polymerase chain reaction was used to amplify a region of NADH dehydrogenase subunit 2 mitochondrial DNA gene. Species differentiation was determined by digestion of the obtained 690 bp amplicon with restriction enzimes. Discrimination between N. rossii and N. coriiceps was possible with this methodology (restriction fragments). No differences were found within N. coriiceps specimens, even among those with extreme morphological differences, that would be classified as N. coriiceps and as N. neglecta.
1
1. INTRODUÇÃO
A Região Antártica
A Antártica fazia parte de um grande continente chamado Gondwana
juntamente com a América do Sul, África, Índia e Austrália. A Gondwana se separou
e os continentes, subcontinentes e ilhas foram formados a aproximadamente 150
milhões de anos atrás. O isolamento do Continente Antártico se completou e a
corrente circum-Antártica estabeleceu-se em um tempo geologicamente recente,
pois ocorreu a aproximadamente 30 milhões de anos atrás (Di Prisco et al, 1991).
O continente antártico está localizado ao sul do paralelo de 60° S e suas
terras possuem cerca de 14 milhões de km², recobertos em 99% de sua área com
gelo. No inverno, o gelo forma um cinturão de cerca de 1000 km de extensão,
cobrindo 18 a 19 milhões de Km² da superfície do oceano austral, enquanto que, nos
meses de verão, recua praticamente até o litoral com exceção dos mares de Weddel
e Ross (Figura 1).
Figura 1: Região Antártica indicando o paralelo de 60° S delimitando a região, os mares de Ross e Weddel, a Península Antártica e o Pólo Sul (fonte: Wikipédia, enciclopédia eletrônica)
O Oceano Polar Antártico, que circunda o Continente Antártico, é o ambiente
marinho mais frio e estável termicamente da Terra. A temperatura do mar nas áreas
próximas ao continente nunca varia, permanecendo constantemente em –1,9ºC, e
Ross Sea
Weddel Sea
Antarctic Peninsula
South Pole
2
nas regiões mais ao nordeste, Peninsula Antártica e ilhas, pode variar de +1,5ºC no
verão até –1,8ºC no inverno (Sidell, 2000).
Devido ao isolamento do Oceano austral e de suas características físicas e
geológicas, os peixes e outros organismos marinhos sofreram uma evolução
adaptativa que permitiu que lá sobrevivessem.
O Tratado da Antártica é um documento assinado em 1 de Dezembro de 1959
pelos países que reclamavam a posse de partes do continente da Antártica, em que
se comprometem a suspender as suas pretensões por um período indefinido,
permitindo a liberdade de exploração científica do continente, num regime de
cooperação internacional.
O Brasil aderiu ao Tratado da Antártica em 16 de maio de 1975 e em 6 de
fevereiro de 1984 inaugurou a Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF)
localizada na Ilha Rei George, no Arquipélago Shetland do Sul.
Figura 2: Ilha do Rei George e sua localização em relação ao Continente Antártico. Fonte:(Dani et al, 2005)
Peixes da Região Antártica
A fauna de peixes existente ao sul da Convergência Antártica se caracteriza
por uma escassa diversificação. Das 20000 espécies de peixes marinhos, apenas
cerca de 200 habitam as águas geladas do oceano austral. O endemismo das
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espécies de peixes antárticos também é bem característico, ou seja, está muito
menos propagado entre as espécies de águas mais profundas (Fisher e Hureau,
1988).
A literatura tem identificado alguns mecanismos de adaptação às
temperaturas extremamente baixas necessários para a sobrevivência desses
organismos neste ambiente. Um desses mecanismos que despertou grande
interesse de muitos pesquisadores é a presença de glicoproteínas anticongelantes
no sangue de algumas espécies de peixes antárticos (Sidell, 2000). Outro
mecanismo bioquímico de adaptação, que também gera bastante interesse entre os
pesquisadores, é que algumas espécies de peixes antárticos, os “ice-fish” ou peixes
gelo, não possuem hemoglobina ou qualquer outro tipo de pigmento responsável
pelo tranporte de O2 para os tecidos (Near et al., 2003).
A subordem Notothenoidei, da ordem dos perciformes, é endêmica nas águas
geladas do oceano austral (Eastman, 1993). Este grupo representa 45% das
espécies conhecidas na região antártica e, mais significativamente, envolve mais de
95% da biomassa de peixes ali encontrados (Eastman e Eakin, 2000).
A Família Nototheniidae é a mais diversificada considerando-se estrutura,
habitat e distribuição das espécies. Os peixes estão largamente distribuídos pelo
oceano austral desde o norte da convergência antártica até o sul da África e Nova
Zelêndia (Kock, 1992). A família é composta de 12 gêneros e aproximadamente 50
espécies (Eastman e Eakin, 2000).
A classificação e sistemática dos peixes antárticos tem sido consagradas em
varias literaturas, algumas com finalidades comerciais (Fisher e Hureau, 1988; Kock,
1992), outras com objetivos de identificação taxonômica (Gon e Heemstra, 1990) e
perspectivas evolucionárias (Eastman, 1993).
Uma das espécies comuns e circum-Antárticas é a Notothenia coriiceps
(Eastman, 1993), com a qual foram realizados inúmeros trabalhos científicos
(FANTA et al, 2003; LUCCHIARI et al, 1989; SUGIZAKI et al, 1997). Ela é
semelhante à uma outra espécie descrita como N. neglecta (Fischer e Hureau,
1988). É possivel distinguir os dois morfos pelo seu aspecto externo, seu
comportamento, seus hábitos alimentares e por algumas de suas estruturas (Fanta
et al, 2003), na baía do Almirantado, Ilha do Rei George, nas Shetlands do Sul
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(Fanta et al, 2000). Entretanto, em outros locais os autores tem afirmado haver
somente a N. coriiceps e que a N. neglecta na verdade seria sinônimo da primeira.
Desde as publicações de Gon e Heemstra (1990) e Eastman (1993) várias
mudanças aconteceram na taxonomia dos peixes antárticos, no número de espécies
e de familias, e sua nomeclatura e seu sequenciamento agora difere da referência
padrão para taxonomia de peixes (Eastman e Eakin, 2000). Muitas dessas
mudanças ocorreram devido aos estudos moleculares que estão sendo realizados
na região antártica.
Estudos genéticos em peixes
Estudos morfológicos e citogenéticos têm contribuído na separação de
espécies próximas e, muitas vezes, na elucidação da história evolutiva de
populações. Muitas vezes, entretanto, esses estudos não são suficientes para
elucidar questões evolutivas de espécies e populações de peixes. Assim, as técnicas
moleculares são ferramentas importantes nos casos em que a identificação de
espécies com base em características morfológicas e citogenéticas são difíceis, bem
como na separação de populações próximas geograficamente (Marques, 2002).
As pesquisas em genética de populações de peixe têm sido largamente
utilizadas para a elucidação de questões relativas à estruturação de populações de
diversas espécies, de sua origem e características peculiares, divergências
genéticas entre populações, migração e eventos históricos (Parker et al., 1998).
Até pouco tempo os estudos sistemáticos de peixes antárticos eram baseados
apenas em caracteres morfológicos (Gon e Heemstra, 1990; Eastman, 1993).
Entretanto, apenas os caracteres morfológicos não eram suficientes para uma
identificação decisiva das espécies e para os estudos filogenéticos (Bargelloni et al.,
2000; Fanta et al., 2000).
Os primeiros estudos moleculares de peixes antárticos foram reportados por
McDonald et al. (1992). Um grupo de seis espécies (principalmente do gênero
Trematomus) da subordem Notothenioidei foram analisados usando-se marcadores
aloenzimaticos. Os resultados desta pesquisa contribuiram muito para estudos
filogenéticos desses animais (Clarke e Johnston, 1996). Dois anos mais tarde,
5
Bargelloni et al. (1994) apresentaram um estudo baseado em sequências de genes
mitocondriais, mais especificamente das sequências 12S e 16S ribossomais rRNA
genes, de 18 espécies repesentantes de 5 familias da subordem Notothenioidei.
A partir daí, várias pesquisas a nível cromossômico foram realizadas com o
objetivo de estudar a filogenia e a evolução dos peixes antárticos (Bargelloni et al,
1997; 2000; Lecointre et al, 1997; Ritchie et al, 1997).
Trabalhos mais recentes tem investigado relações filogenéticas dentro de
famílias, subfamílias e gêneros da subordem Notothenioidei. Exemplos destes
trabalhos são os de Chen et al. (1997) e Near et al. (20003) que estudaram a
filogenia de espécies da família Channichthydae (Notothenioidei: Perciformes)
baseando-se em dois genes mitocondriais. Na mesma linha de pesquisa aparecem
Ritchie et al. (1996) que estudaram espécies da subfamilia Trematomidae
(Nototheniidae: Notothenioidei) e Patarnello et al., (2003) que trabalharam com
espécies do gênero Chinodraco (Channichthydae: Notothenioidei).
Contudo, os estudos moleculares em peixes da região antártica não objetivam
apenas estudos de relações filogenéticas. Trabalhos como os de Chen et al. (1997)
e Bargelloni et al. (1998), utilizaram esses estudos para examinar a evolução de
caracteres específicos como hemoglobina e a expressão de glicoproteínas
anticongelantes presentes nestes organismos. Várias análises a nível molecular
foram conduzidas em peixes antárticos e tropicais, definindo assim o seu
comportamento bioquímico e fisiológico (Lucchiari et al. 1989; Fanta et al. 1989;
1990; Bacila et al. 1989; Zamora et al. 1992; Rodrigues et al. 1994; Sugizaki et al.
1997; Carvalho et al. 1998).
DNA Mitocondrial de peixes
O DNA mitocondrial animal é constituído de uma molécula de pequena fita
dupla circular e que codifica aproximadamente 5% de toda maquinaria necessária
para o funcionamento da mitocôndria (Nahum, 2001). Dependendo do tipo da célula,
pode-se encontrar mais de mil genomas mitocondriais por célula. Nos animais,
geralmente o tamanho do mtDNA é de aproximadamente 16.500 bp. São descritos
6
37 genes, dos quais 13 codificam proteínas, 2 codificam RNAs ribossomais e 22
codificam RNAs transportadores (Meyer, 1993).
Os genes mitocondriais que codificam RNAs mensageiros para proteinas
estão envolvidos diretamente no processo do transporte de elétrons e fosforilação
oxidativa. Dentre os 13 genes, sete codificam subunidades da enzima NADH
desidrogenase (ND1, 2, 3, 4, 4L, 5, 6.), três codificam subunidades da enzima
citocromo c oxidase (COI, II, III), dois codificam subunidades da ATP sintetase (ATP
6 e 8) e o gene que codifica o citocromo b em uma sequência única. Nos
vertebrados existe uma região não codificadora conhecida como “alça D” (em inglês:
D-loop) que contém o controle da replicação e trancrição desse genoma (Nahum,
2001). A figura 3 ilustra uma molécula de mtDNA de uma espécie de peixe
sequenciada por Zardoya e Meyer (1996). A ordem dos genes no genoma
mitocondrial de peixes não difere da ordem ‘consenso’ dos genes nos vertebrados
(Meyer, 1993).
Figura 3: molécula de mtDNA de Protopterus dolloi indicando a organização dos genes e a região controle de transcrição e replicação. Os sítios de restrição das endonucleases EcoRI e HindIII também estão sugeridos nesta figura. (fonte: Zardoya e Meyer, 1996)
Outra característica importante no mtDNA é a sua alta taxa de evolução a
qual acredita ser 10 vezes superior à de um gene de cópia única nuclear. Algumas
das explicações para este fenômeno são, a baixa capacidade de reparo da enzima
DNA polimerase e a alta exposição da molécula de DNA aos agentes oxidativos
gerados durante o processo de respiração celular. (Meyer, 1993). A taxa de
evolução do mtDNA não é homogênea entre os seus diferentes genes. Alguns
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genes acumulam mais rapidamente essas substituições de bases, dentre os quais
podemos citar os genes codificadores das subunidades da NADH desidrogenase,
citocromo c oxidase e dos RNAs transportadores. Os genes codificadores para as
subunidades ribossômicas e para o citocromo b estão entre os mais conservados
entre os organismos (Saccone, 1994). Dos genes mitocondriais, a região controle
(D-loop) é a que mais acumula mutações podendo elevar sua taxa de evolução de
dois a cinco vezes às dos genes que codificam proteínas (Meyer, 1993).
A taxa de evolução é um dado importante na escolha do gene para resolver
questões filogenéticas, taxonômicas e genética de populações. Quando se pretende
comparar duas espécies de peixes muito próximas, por exemplo, é apropriado o uso
de genes com taxas de substituições mais altas. No entanto, na pesquisa de eventos
mais antigos como a formação de espécies, gêneros, famílias, os genes mais
conservados podem ser bons indicadores (Saccone, 1994, Meyer, 1993).
A ausência de recombinação e a herança materna aliados à sua alta taxa de
evolução, heterogênea entre seus genes, fazem com que o mtDNA seja um
excelente marcador para estudos filogenéticos, taxonomia molecular e nos
movimentos migratórios de populações ao redor do mundo (Saccone, 1994). O DNA
mitocondrial de várias espécies de peixes tem sido largamente utilizado para
estudos de populações e em relações inter e intra espécies (Bernardi e Goswami,
1997, Wolf et al, 2000, Sotelo et al, 2001, Karaiskou et al, 2003).
Técnicas de Biologia Molecular utilizadas em estudo de populações
O desenvolvimento da eletroforese de proteínas, nos anos 50, deu início aos
estudos moleculares acerca das variações genéticas nas diversas espécies. As
isoenzimas foram e ainda são muito utilizadas para estudos em biologia evolutiva. O
termo “isoenzimas” define um grupo de múltiplas formas da mesma enzima que
ocorrem em uma espécie, como resultado da presença de mais de um gene
codificando cada uma das enzimas (Ferreira, 1998).
O principio básico da eletroforese é a migração diferencial de moléculas com
cargas e tamanhos diferentes. A sequência de aminoácidos em uma proteína é
determinada pela sequência de nucleotídeos que a codifica. Pequenas mudanças na
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sequência do DNA podem alterar a estrutura, portanto, a mobilidade eletroforética de
uma proteína. Uma das vantagens dessa técnica é que se pode mostrar vários
indivíduos por vez e ter diversos locus analisados para cada indivíduo (Arias e
Infante-Malachias, 2001).
Com o advento das técnicas modernas de biologia molecular, surgiram vários
métodos de detecção de variabilidade genética diretamente ligados ao nível do DNA.
A utilização de endonucleases de restrição permitiu a análise de polimorfismo de
comprimento de fragmentos de DNA (“Restriction Fragment Length Polimorfism” –
RFLP). As enzimas de restrição são enzimas que algumas linhagens de bactérias
desenvolveram para se defenderem de organismos bacteriófagos, um fenômeno
chamado de restrição controlada pelo hospedeiro. Essas enzimas tem capacidade
de cortar a molécula de DNA em sequências específicas de 4 a 8 nucleotídeos
chamados de sítios de restrição (Brown, 2003). A presença ou ausência dessas
sequências pode resultar de inserções, deleções ou rearranjos que alterem as
distâncias entre os sítios de restrições nos diversos indivíduos. A técnica de RFLP
envolve a clivagem do DNA por enzimas de restrição, a separação por eletroforese,
em gel de agarose ou poliacrilamida, dos fragmentos gerados na clivagem e sua
visualização em forma de bandas (Ferreira, 1998).
O desenvolvimento da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR –
polymerase chain reaction), pelo bioquímico Kary Mullis, em 1985, aumentou muito a
eficiência de detecção de polimorfismos no nível de DNA. Este aumento se deve a
redução do tempo de execução dos experimentos, do seu custo e da sua
complexidade (Ferreira, 1998). A técnica de PCR se baseia na síntese enzimática in
vitro de milhões de cópias de um segmento específico de DNA, através de
amplificação em ciclos, na presença da enzima DNA polimerase. Para a seleção do
segmento específico de DNA a ser amplificado é necessário a utilização de
seqüências de oligonucleotídeos chamados de iniciadores (“primers”), que delimitam
a seqüência alvo. Os oligonucleotídeos iniciadores são sintetizados artificialmente e
suas seqüências de nucleotídeos são complementares a seqüências específicas que
flanqueiam a região alvo (Matioli e Passos-Bueno, 2001). Um ciclo da reação
envolve a desnaturação da dupla fita do DNA alvo através da elevação da
temperatura para 94°C, seguida do anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores
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pela redução da temperatura a 35°C e, da extensão da DNA polimerase partindo do
terminal 3’ desses oligounucleotídeos. Esta extensão envolve a adição de
nucleotídeos pela DNA polimerase utilizando como molde a seqüência alvo. O ciclo
é repetido por algumas dezenas de vezes e a cada ciclo a quantidade de DNA alvo
dobra seguindo uma progressão geométrica (Brown, 2003).
A combinação das técnicas de PCR e RFLP é muito utilizada nas pesquisas
de variabilidade genética de populações de peixes (Wolf, 2000) e na identificação de
espécies de peixes em pesquisas de fraudes em produtos alimentícios (Quinteiro et
al, 1998; Sotelo et al, 2001; Jerome et al, 2003; Karaiskou et al, 2003). Neste caso a
amplificação precede a digestão. O conhecimento do gene em estudo aumenta
ainda mais as informações resultantes da pesquisa, ou seja, os dados do gene,
como sua taxa de evolução, somados com os polimorfismos encontrados nos
indivíduos pesquisados relata muito sobre sua história evolutiva.
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2. OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram:
1) Desenvolver um marcador molecular para diferenciar espécies de peixes
antárticos através da combinação das técnicas PCR-RFLP;
2) Determinação de possíveis diferenças entre os indivíduos classificados como
N. coriiceps, porém com variação fenotípica marcante, utilizando-se a técnica
do RFLP;
3) Comparação dos exemplares de peixes da espécie Notothenia coriiceps
encontrados na Baía do Almirantado com alguns exemplares dessa mesma
espécie capturados em outra região Antártica.
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3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Reagentes
Procedência dos reagentes utilizados:
• Bio-Rad.: Acrilamida, azul de bromofenol.
• Eppendorf: TripleMaster® PCR System
• Invitrogen Inc.:Agarose, Marcador de DNA λ HindIII, Marcador de DNA 1kb
Plus, Marcador de DNA 100 pb, Taq DNA polimerase, kit para extração de
DNA (Easy-DNA), dNTPs, EDTA.
• Merck: Etanol absoluto, Fenol saturado, Fenol/clorofórmio/álcool-isoamílico.
• Promega: Endonucleases de restrição, proteinase K
• Roche: High Pure PCR Product Purification Kit
• Sigma: Brometo de etídeo, Ficoll, TEMED.
3.2 Tampões e soluções
• Gel de agarose 1%: 1 grama de agarose, 100mL de TBE.
• Gel de poliacrilamida 5%: Acrilamida 5%
• Solução de brometo de etídeo: 0,5 µg/mL de brometo de etídeo em água
destilada.
• Tampão da amostra: Ficoll 400 25%, azul de bromofenol 0,25%, xyleno
cyanol FF 0,25%.
• Tampão para eletroforese – TBE: Tris-base 89mM, ácido bórico 89mM,
EDTA 2mM pH 8,0.
• Tampão de ressuspensão – TE: Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM pH 8,0.
• Tampão de extração: Tris-HCl pH 8.0, 50mM NaCl, 10mM EDTA.
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3.3 Oligonucleotídeos iniciadores utilizados
Gene Oligo Seqüência
Cyt b H15149 5’ – GCC CCT CAG AAT GAT ATT TGT CCT CA – 3’
Cyt b L14735 5’ – AAA AAC CAC CGT TGT TAT TCA ACT A – 3’
ND2 ND2R 5’ – GCG GTG GGA GCT AGC TCT TGT TTA – 3’
ND2 ND2F 5’ – ACC ACC CCC GGG CAG TTG AAG – 3’
3.4 Equipamentos utilizados
• Banho-maria biomatic;
• Centrifuga para microtubos da marca Eppendorf, modelo 5415 D;
• Cuba horizontal para eletroforese Amersham Biosciences HE 33 Mini
Submarine Unit;
• Cuba vertical para eletroforese Amersham Biosciences SE 250;
• Espectrofotômetro Amersham Biosciences;
• Fonte de eletroforese FB300 – Fisher Biotech;
• Sistema de fotodocumentação digital envolvendo gabinete escuro acoplado a
um transiluminador de UV, câmara digital e comutador;
• Termociclador da marca GeneAmp® PCR System, modelo 9700;
• Termomixer da marca Eppendorf, modelo Confort.
3.5 Material biológico/Amostras
Foram coletados 72 exemplares de peixes da espécie Notothenia
coriiceps/neglecta e 47 exemplares da espécie Notothenia rossii em 7 pontos
localizados na Baía do Almirantado (Figura 4). As coletas foram realizadas através
de redes de espera trimalha e pesca com linha e anzol.
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Figura 4: Pontos de coleta dos peixes na Baia do Almirantado. Fonte: (Simões et al, 2004)
Os peixes foram acondicionados em tanques na Estação Antártica Brasileira
Comandante Ferraz (EACF), devidamente classificados de acordo com Fisher e
Hureau (1988), e seus dados morfométricos anotados. Amostras de 1 cm3 de tecido
muscular foram retiradas da região imediatamente anterior à base da nadadeira
dorsal, após o peixe ter sido sacrificado para outros estudos. As amostras foram
colocadas em álcool etílico a 10% ou congeladas e trazidas para o Brasil.
A análise molecular foi realizada em amostras de 50 espécimes de peixes
antárticos sendo 14 da espécie Notothenia rossii (Nr), 22 de Notothenia coriiceps,
tendo estas apresentado diferenças fenotípicas (Nc1 e Nc2), e 14 de Notothenia
coriiceps coletadas na região do Mar de Ross (NcR) doadas pelo Dr. Inigo Everson
do British Antarctic Survey.
Tabela I: mostra o número total de amostras e algumas variáveis como sexo e tamanho dos
espécimes utilizados nos testes.
ESPÉCIES
CARACTERÍSTICAS N. rossii N. coriiceps N. coriiceps/
neglecta
N. coriiceps (Mar de Ross)
N° total de amostras 14 11 11 14
Sexo Masculino 8 5 7 9
Sexo Feminino 6 6 5 5
Comprimento total (cm) 32 a 38 35 a 45 36 a 45 34 a 46
14
A tabela II mostra a classificação dos peixes coletados na Baía do
Almirantado. Foram utilizadas as variáveis “cara larga” correspondendo ao fenótipo
neglecta e “cara estreita” correspondendo ao fenótipo coriiceps (Fanta et al, 2000;
Fischer e Hureau, 1988), além de exemplares com características fenotipicas
intermediárias, para a escolha dos animais amostrados e analisados. Notothenia
rossii foi utilizada como um controle do método empregado para determinação de
diferenças encontradas entre espécies próximas do mesmo gênero.
Tabela II: mostra as principais características utilizadas para a classificação dos peixes.
ESPÉCIES
CARACTERÍSTICAS N. rossii N. coriiceps N. coriiceps/ neglecta
N. coriiceps (Mar de Ross)
N° de raios da nadadeira 1ª dorsal
4 a 7 4 a 6 3 a 7 3 a 7
N° de raios da nadadeira 2ª dorsal
32 a 35 35 a 37 37 a 40 36 a 41
N° de raios das nadadeiras peitorais
22 a 24 16 a 18 16 a 19 16 a 18
N° de raios da nadadeira anal
27 a 30 27 a 30 39 a 32 28 a 31
Relação distância interorbital / comprimento da cabeça
29 a 31 23 a 25 26 a 33 24 a 32
3.6 Técnicas
3.6.1 Extração do DNA
O DNA total foi extraído do tecido muscular dos peixes utilizando a
metodologia do Fenol/Clorofórmio descrita por Ritchie et al (1997). Uma porção de
100mg de tecido em 400µL de tampão de extração (Tris-HCl pH 8.0, 50mM NaCl,
10mM EDTA) foi digerida com 10µL de dodecil sulfato de sódio a 10% e 20µL de
proteinase-K a 10mg/mL. A mistura foi incubada em termomixer (Eppendorf) a 55°C
15
por duas horas. Após a digestão, o DNA foi extraído com fenol (Tris-HCl pH 8.0
saturado) e fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), precipitado com etanol
absoluto a 4°C. O precipitado foi lavado com etanol 70% e ressuspendido em
tampão TE (10mM Tris-HCl ph 8.0, 1mM EDTA). O DNA extraído foi analisado por
eletroforese em gel de agarose 1% e sua concentração foi estimada por
espectrofotometria (Figura 5).
Figura 5: Produto da extração do DNA em gel de agarose 1%.
Não foi possível obter um material de qualidade na extração com
fenol/clorofórmio, provavelmente devido a más condições das amostras. Então, foi
utilizado um kit de extração de DNA da Invitrogen (Easy-DNA) para tentar isolar uma
maior quantidade e qualidade de DNA (Figura 6).
Figura 6: Produto da extração do DNA em gel de agarose 1% (Kit).
Marcador λ Hind III
Amostra
Amostra
Amostra
Amostra
Amostra
Marcador λ Hind III
Amostra
Amostra
16
3.6.2 Amplificação do gene mitocondrial Citocromo b
Com um melhor material extraído partiu-se, então, para a amplificação de um
pequeno segmento do gene mitocondrial citocromo b, pela técnica do PCR
(Polymerase Chain Reaction), utilizando os iniciadores universais H15149 e L14841
desse gene (Kocher et al., 1989). A reação ocorreu em tubos de 100µL contendo
tampão Taq DNA polimerase (20mM Tris-HCl pH 8.0, 50mMKCl), MgCl2 1,5mM,
200µM de cada dNTP, 10pmol de cada oligonuceotídeo iniciador, 500ng de DNA
extraído e 2,5 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen). Os reagentes foram
misturados e aquecidos a 94°C por 4 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturação
a 94°C por 30 segundos, anelamentos a 55°C por 30 segundos e extensão a 72°C
por 30 segundos.
A visualização da amplificação foi realizada por eletroforese em gel de
agarose 1% utilizando um padrão de peso molecular de 1 kb Plus (Invitrogen) para
comparação (Sambrook e Russell, 2001). Para controle, foram utilizados amostras
de DNA extraído a partir de duas variedades de uma espécie de carpa (Cyprinus
carpio), sendo utilizadas as mesmas técnicas de extração e amplificação que no
grupo teste (Figura 7).
Figura 7: Resultado da Amplificação do segmento do gene Citocromo b em gel de agarose 1%.
Não se obtendo a amplificação desejada para as amostras dos peixes testes,
provavelmente por incompatibilidade dos iniciadores, houve a necessidade de mudar
o gene de estudo. Após uma revisão bibliográfica, escolheu-se o gene mitocondrial
NADH desidrogenase subunidade 2 (ND2) para continuar o estudo, por ser um gene
Amostra
Amostra
Amostra
Amostra
Carpa
Carpa
Marcador 1 kb Plus
17
que mostraria equivalência ao citocromo b na interpretação dos resultados (Meyer,
1993).
3.6.3 Amplificação do gene mitocondrial ND2
Para a amplificação do gene mitocondrial ND2 foi necessário a utilização de
iniciadores desenhados a partir de seqüências de peixes antárticos depositadas na
Internet no National Center of Biotechnology Information (NCBI) vinculado ao
National Institute of Health (NIH) no endereço eletrônico
<<http://www.ncbi.nlm.nih.gov>>. Para isso foi utilizado o pacote de programas
Lasergene (DNASTAR Inc.) de onde foram extraídas as seqüências de 3 espécies
de peixes antárticos através do programa EditSeq. As seqüências foram alinhadas
pelo programa Megalign e foram escolhidas regiões conservadas dessas seqüências
para desenhar os oligonucleotídeos iniciadores com a ajuda do programa
Primerdesign (anexo 4).
A técnica de amplificação utilizada para o ND2 foi a mesma descrita para a
amplificação do gene citocromo b com exceção da enzima que foi alterada para
TripleMaster® PCR System (Eppendorf). O resultado da amplificação do gene ND2
está mostrado na Figura 8.
Figura 8: Resultado da amplificação do gene ND2 em gel de agarose 1%.
Foi obtido sucesso na amplificação de um segmento do gene mitocondrial
ND2. O produto da amplificação foi então purificado utilizando-se o kit de purificação
de PCR (High Pure PCR purification Kit - ROCHE) e sendo quantificado por
eletroforese em gel de agarose a 1% utilizando-se o marcador de peso molecular λ
Hind III (Figura 9).
Amostra
Amostra
Carpa
Marcador 1kb Plus
18
Figura 9: Produto da purificação em gel de agarose 1%, utilizando o marcador de peso molecular λ Hind III para estimar a quantidade do DNA obtido.
3.6.4 Digestão do gene ND2 com endonucleases de restrição
Após a purificação o produto do PCR foi digerido com quatro enzimas de
restrição AluI, DdeI, HindIII, MboII e Rsa I (Promega), escolhidas através do mapa
de restrição gerado pelo software DNAstar (Anexo n° 5).
A técnica de digestão é chamada de RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism) na qual 5µL da amostra amplificada foram digeridos por 10 unidades
de cada enzima a 37°C por duas horas (Sambrook e Russell 2001). Os fragmentos
gerados na digestão foram separados por eletroforese em gel de acrilamida 5% e
analisados em comparação com um padrão de tamanho molecular de 1kb Plus
(invitrogen) e 100pb (Figura 10).
Produto PCR purificado - 1µL
Marcador λ Hind III – 250ng total
3ng - 564 bp
10,5ng - 2027 bp 12,0ng - 2322 bp
22,5ng - 4361 bp 33,9ng - 6557 bp 48,7ng - 9416 bp 22,5ng - 4361 bp
19
Figura 10: Marcadores de tamanho molecular em gel de acrilamida 5%, utilizados para comparação das bandas geradas na digestão com a indicação do tamanho das bandas.
1kb Plus DNA Ladder (invitrogen)
12000 pb – 5000 pb –
2000 pb – 1650 pb –
1000 pb – 850 pb –
650 pb –
500 pb – 400 pb –
300 pb –
200 pb –
100 pb –
100 pb DNA Ladder (invitrogen)
2072 pb –
1500 pb –
600 pb –
500 pb –
400 pb –
300 pb –
200 pb –
100 pb –
20
4. RESULTADOS
O DNA total foi extraído a partir de tecido muscular de 50 espécimes de
peixes antárticos sendo 14 da espécie Notothenia rossii (Nr), 22 de Notothenia
coriiceps (amostras G e N), tendo estas apresentado diferenças na morfologia (Nc1 e
Nc2), e 14 de Notothenia coriiceps coletadas na região do Mar de Ross (NcR). Foram
amplificados aproximadamente 690 bp do gene mitocondrial ND2 das referidas
amostras (Figura 11).
Figura 11: Resultado da amplificação do segmento do gene ND2 por eletroforese em gel de agarose 1%.
O produto da amplificação foi purificado com o kit de purificação de PCR
retirando as bandas inespecíficas e restos de material utilizado na amplificação
como enzimas, DNA total, sais, etc... (Figura 12).
Figura 12: Produto da purificação do produto do PCR em gel de agarose 1%.
Marcador 1 kb plus Nr Nr Nr Nr Nc1 Nc1
Nc2 Nc2 NcR NcR NcR NcR
Marcador λ HindIII Nr Nr Nc1
Nc2 NcR NcR
21
Após a purificação o material foi digerido pelas enzimas de restrição citadas
na metodologia. O resultado da digestão foi determinado em eletroforese de gel de
poliacrilamida (Figura 13).
Figura 13: Resultado das digestões com as enzimas AluI, DdeI, HindIII, MboII e RsaI em gel de poliacrilamida 5%.
Figura 13.1 – Digestão com a enzima AluI Figura 13.2 – Digestão com a enzima DdeI
Figura 13.3 – Digestão com a enzima HindIII Figura 13.4 – Digestão com a enzima MboII
Figura 13.5 – Digestão com a enzima RsaI
Nr Nr Nc1 Nc2 NcR 1 kb
Plus NcR Nr Nr Nc1 Nc2 NcR 1 kb
Plus NcR
Nr Nr Nc1 Nc2 NcR 1 kb Plus
NcR Nr Nr Nc1 Nc2 NcR 1 kb Plus
NcR
Nc1
Nc2
NcR
NcR
Nr 100 pb
Nr
22
Foi possível diferenciar as espécies N coriiceps da N rossii através desta
técnica salvo o padrão de restrição gerado pela enzima MboII que não permitiu a
diferenciação. Os fragmentos gerados pela digestão com a enzima AluI não ficaram
bem nítidos também dificultando a análise. Não foram encontradas diferenças entre
os espécimes classificados como N. coriiceps e possivelmente N. neglecta, mesmo
quando os espécimes apresentaram diferenças na morfologia. Também não foram
encontradas diferenças entre os espécimes de N. coriiceps capturados na Baia do
Almirantado com os capturadas no Mar de Ross.
As fotos das digestões das demais amostras podem ser vistas nos anexos (nº
1, 2 e 3).
23
5. DISCUSSÃO
O primeiro passo no desenvolvimento de um marcador genético é a obtenção
de um DNA de qualidade, suficiente para ser usado na amplificação por PCR
(Ferreira, 1998). O primeiro protocolo de extração de DNA utilizado nesse trabalho
não mostrou ser eficiente para a amplificação do gene de estudo. Isto pode ter
acontecido pelas condições em que as amostras foram conservadas. As amostras
de tecido muscular que estavam sob refrigeração não haviam sido conservadas na
temperatura ideal, ou seja, de -70°C (Sambrook e Russell, 2001); e, a concentração
do etanol, nas amostras que utilizaram este tipo de conservação, também não foi a
ideal, ou seja, 90% (Sambrook e Russell, 2001).
A utilização do kit para extração de DNA, Easy-DNA (Invitrogen) mostrou
algumas vantagens na obtenção do DNA proveniente das amostras de peixes. As
duas vantagens principais, ou seja, que levaram à substituição do primeiro protocolo,
foram: rapidez, praticidade e a obtenção de um material de melhor qualidade e
quantidade.
A escolha do gene para responder questões de populações deve ser uma
preocupação primordial (Russo, 2001). O gene mitocondrial Citocromo b foi
inicialmente escolhido por ser largamente utilizado em trabalhos onde o principal
objetivo era a diferenciação de espécies de peixes. Levando em consideração a
facilidade de encontrar trabalhos similares e disponibilidade de primers universais
para este gene e específicos para peixes, este pareceu ser um bom gene para este
estudo. No entanto, os oligonucletídeos iniciadores universais adaptados para
peixes, retirados da literatura (Wolf, 2000), não foram compatíveis com as
seqüências de Cyt b das espécies em questão. O gene de estudo foi alterado para o
ND2, uma vez que não foram encontradas seqüências de Cyt b de espécies de
peixes da região antártica para construção de iniciadores mais específicos para o
genoma mitocondrial dessas espécies.
A amplificação de aproximadamente 690 pb do gene mitocondrial ND2 do
DNA extraído das amostras foi relativamente rápida. Os oligonucleotídeos
iniciadores desenhados a partir de seqüências ND2 de espécies de peixes antárticos
mostraram bastante especificidade.
24
Considerando os resultados desta pesquisa, somados as informações
retiradas da literatura, o gene ND2 mostrou ser um bom gene para diferenciação de
espécies de peixes do mesmo gênero. Houve clareza e reprodutibilidade na
diferenciação das espécies N coriiceps e N rossii, considerando o padrão de bandas
gerado na técnica do RFLP.
Os peixes da família Nototheniidae são facilmente distinguidos dos outros
peixes da subordem Notothenoidei por suas características morfológicas. São peixes
com corpo alongado, na maioria das vezes achatados ventralmente, cabeça grande
e levemente deprimida, olhos grandes, boca protáctil com a mandíbula inferior mais
larga que a superior, corpo inteiramente escamoso, dentre outras características. No
entanto, a classificação das espécies desta família às vezes se torna difícil graças a
sua grande diversificação.
Espécies do gênero Trematomus, por exemplo, foram alvos de estudos e
discussões por causa de suas variabilidades morfológicas. A ocorrência de dois
morfotipos de Trematomus newnesi, o morfo típico e o morfo de boca grande,
encontrados nas águas próximas a estação de McMurdo, inspiraram Eastman e
DeVries (1997) a pesquisar a presença de plasticidade fenotípica nesta espécie.
McDonald et al. (1992), através de estudos de marcadores aloenzimáticos, sugeriu a
espécie Trematomus bernacchii como um complexo de duas espécies crípticas. A
única diferença morfológica encontrada nos dois grupos, distinguidos por McDonald
et al. 1992 através da análise de aloenzimas, foi a coloração. Bernardi e Goswami,
(1997) investigaram, através de análise de dois genes mitocondriais, 12S e 16S, a
ocorrência de espécies crípticas nas duas variedades de Trematomus bernacchii
encontradas, sendo que, no entanto, não foi possível a diferenciação através dos
genes estudados.
O gênero Notothenia também foi alvo de discussões. A espécie Notothenia
coriiceps, descrita por Richardson em 1844, largamente distribuída entre as espécies
de águas rasas, portanto, encontrada em grande quantidade na Baía do
Almirantado, apresenta uma considerável variação morfológica. Nybelin (1951)
descreveu Notothenia neglecta como uma nova espécie do gênero. Fisher e Hureau
(1988) consideraram N. coriiceps e N. neglecta como espécies distintas e
destacaram como diferenças entre elas o número de raios das nadadeiras peitorais
25
e da segunda dorsal, distância interorbital e o comprimento da cabeça. Em 1966,
DeWitt considerou que N. neglecta seria uma subespécie da N. coriiceps usando a
justificativa de que Nybelin havia utilizado um número muito pequeno de amostras
na sua classificação (Gon e Heemstra, 1990).
Assim, depois de verificar a grande variabilidade fenotípica da Notothenia
coriiceps/neglecta (Fanta et al. 2000) ficou a dúvida se esta seria uma espécie com
morfologias variáveis, se seriam duas espécies. Os resultados obtidos aqui
respondem a essa pergunta inicial mostrando que N. coriiceps é nitidamente
diferente de N. rossii, ou seja, que são duas espécies distintas, mas que o que
consideramos ser N. neglecta realmente é uma variedade fenotípica de N. coriiceps.
26
6. CONCLUSÕES
1) A sequência de DNAmt de espécies de peixes antárticos difere
consideravelmente da sequência dos outros peixes, tanto marinhos quanto de
água doce, uma vez que não foi possível a amplificação do gene Cyt b
utilizando primers universais.
2) O gene ND2 é um bom marcador para diferenciação de espécies de peixes
como foi mostrado nos padrões de bandas gerado pela técnica do RFLP para
as espécies N. coriiceps e N. rossii.
3) A variabilidade fenotípica encontrada entre os indivíduos classificados como
N. coriiceps e N. neglecta não determina se tratar de duas espécies distintas.
4) Os peixes da espécie N. coriiceps encontrados na Baia do Almirantado não
diferem dos encontrados no Mar de Ross em nível de espécies e em
caracteres morfológicos.
5) PCR-RFLP é uma boa metodologia para diferenciar espécies de peixes.
27
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34
ANEXOS
35
Anexo 1: Padrão de bandas gerado após a digestão do segmento de ND2 amplificado com a enzima RsaI:
100 NcR NcR NcR NcR NcR NcR NcR NcR NcR pb
100 Nr Nr Nr Nr Nr Nr Nr Nr Nr pb
1 kb Nc1 Nc1 Nc1 Nc2 Nc2 Nc2 NcR NcR Nr Plus
1 kb Nc1 Nc1 Nc1 Nc2 Nc2 NcR Nr Nr 1 kb Plus
100 Nc1 Nc1 Nc1 Nc1 Nc2 Nc2 Nc2 Nc2 Nc2 pb
36
Anexo 2: Padrão de bandas gerado após a digestão do segmento de ND2 amplificado com a enzima DdeI:
100 NcR NcR NcR NcR NcR NcR NcR NcR NcR pb
100 Nr Nr Nr Nr Nr Nr Nr Nr Nr pb
1 kb Nc1 Nc1 Nc1 Nc2 Nc2 Nc2 NcR NcR Nr Plus
1 kb Nc1 Nc1 Nc1 Nc2 Nc2 NcR Nr Nr 1 kb Plus
100 Nc1 Nc1 Nc1 Nc1 Nc2 Nc2 Nc2 Nc2 Nc2 pb
37
Anexo 3: Padrão de bandas gerado após a digestão do segmento de ND2 amplificado com a enzima RindIII
100 NcR NcR NcR NcR NcR NcR NcR NcR NcR pb
100 Nr Nr Nr Nr Nr Nr Nr Nr Nr pb
1 kb Nc1 Nc1 Nc1 Nc2 Nc2 NcR Nr Nr 1 kb Plus
1 kb Nc1 Nc1 Nc1 Nc2 Nc2 Nc2 NcR NcR Nr Plus
100 Nc1 Nc1 Nc1 Nc1 Nc2 Nc2 Nc2 Nc2 Nc2 pb
38
Anexo 4: Primers utilizados (Primerdesign).
39
Anexo 5: Mapas de restrição ND2 para Notothenia rossii e Notothenia coriiceps.