y molecular de distrofias de - uam

Universidad Autónoma de Madrid Facultad de Ciencias Dpto. de Biología

Caracterización clínica y molecular de distrofias de retina (Enfermedad de Norrie) y formas maculares

(Retinosquisis y Enfermedad de Stargardt).

TESIS DOCTORAL Rosa Riveiro Álvarez

Madrid, 2006

La Doctora Carmen Ayuso García, Jefa Asociada del Departamento de Genética de la Fundación

Jiménez Díaz,

CERTIFICA:

Que la presente Memoria titulada: Caracterización clínica y molecular de distrofias de retina

(Enfermedad de Norrie) y formas maculares (Retinosquisis y Enfermedad de Stargardt), que presenta Dña.

Rosa Riveiro Álvarez para obtener el Grado de Doctor, ha sido realizada bajo mi dirección, autorizándola

para su presentación al Tribunal Calificador.

Madrid, a 20 de Julio de 2006.

V B

Fdo. Dra. Carmen Ayuso García Fdo. Prof. Dr. José Fernández Piqueras

Directora de la Tesis Doctoral Tutor de la Tesis Doctoral

AGRADECIMIENTOS

Después de casi ocho meses escribiendo, creo que ha llegado el momento en el que, por fin, os

puedo dedicar unas palabras. Quiero transmitiros que, sin vosotros, la realización de este trabajo hubiese

sido imposible para mí y por ello quiero daros las gracias a todos y cada uno de vosotros.

En primer lugar, quiero agradecer a las Doctoras Carmen Ayuso y Carmen Ramos que me

acogiesen en el laboratorio, hace algo más de cuatro años. No sólo tengo que darles las gracias por todo lo

que he aprendido, sino por su cercanía, su amabilidad y su apoyo.

De manera especial, quiero agradecer a la Doctora Carmen Ayuso la dirección incansable de este

trabajo, pero sobre todo, la paciencia y la capacidad de persuasión que ha tenido con su becaria incesante.

Quiero dar las gracias a la Doctora Isabel Valverde, por haberme orientado tan bien y porque

gracias a ella he tenido esta oportunidad. No me puedo olvidar de su preocupación y cariño todas las veces

que hemos intercambiado unas palabras en el pasillo.

Agradezco a todos mis compañeros de la red EsRetNet su apoyo a lo largo de estos años y que

hayan estado tan cerca siempre que les he necesitado.

De forma especial, quiero dar las gracias a los pacientes, ya que sin ellos no se hubiese podido

realizar este trabajo. Agradezco su paciencia y su colaboración, tanto en la recogida de muestras como en

la realización de los diversos estudios oftalmológicos.

Sobre todo, quiero dar las gracias a mis compañeros del Servicio de Genética de la FJD, ya que

vosotros habéis sido los auténticos compañeros de diario a lo largo de estos años y por eso, quiero daros

las gracias una y mil veces:

- a mi queridísima Aco, por haber compartido conmigo tu enorme conocimiento, por tu cariño y tu apoyo

constante. Porque siempre que he necesitado algo, has dado lo mejor de ti misma y con creces;

- a Chonny, no sólo por todo lo que me has enseñado desde el principio, sino por tu cariño, tu comprensión

y por esas largas horas de terapia, que tan bien nos han venido;

- a Elena, por estar siempre ahí detrás, espalda con espalda. Gracias por todo lo que hablas y aconsejas,

pero también por todo lo que escuchas y comprendes, por echarme siempre una mano y conseguir que no

fibrile;

- a Diego y a Fer, no sólo por vuestra inestimable ayuda a la hora de corregir textos varios en inglés y

solucionar problemas informáticos, respectivamente, sino por vuestra paciencia y confianza.

- a Anita y a Dan, por compartir vuestros conocimientos y vuestras bromas, por todos los buenos momentos

dentro y fuera del laboratorio;

- a Jesús, por enseñarme a hacer Southern y a conocer otros estilos musicales, pero sobre todo, por

echarme un cable a diario y por tu gran sentido del humor;

- a María G.H., por todo lo que me has enseñado, por transmitirme tu inquietud intelectual y tu tesón;

- a Jana, por ser una becaria pequeña estupenda y por confiar en mí, tanto en temas moleculares como en

otros más cotidianos;

- a Cristina y a Míguel, por vuestro trabajo y vuestro sentido del humor y, sobre todo, por conseguir que la

música no deje de sonar en el laboratorio;

- a María F., por ser una fuente inagotable de conocimiento, por tu cariño y tu preocupación, por haberme

echado una mano cuando te he necesitado;

- a Isa, por tus inteligentes preguntas y tus brillantes comentarios, por tu ayuda inestimable y por tu

constante preocupación de madre;

- a Marta, por tu cariño y por no dudar en ayudar cuando se pide un favor, por el ímpetu con el que

transmites tus conocimientos, sean sobre temas científicos o sobre cualquier otro;

- a Aurora y a Tere, por tantas horas de charlas y risas, por conseguir que esos pequeños descansos nos

desestresen a todos un poco;

- a Toñi, por ser tan cariñosa conmigo, dentro y fuera de la consulta;

- a nuestros últimos y estupendos fichajes, Carol, Nuria y Almu, por vuestro entusiasmo con cada cosa que

aprendéis, por vuestro enorme sentido del humor y por vuestro cariño;

También quiero dar las gracias a mis compañeros del Instituto Cajal, especialmente a la Doctora

Paola Bovolenta por haberme acogido durante cuatro meses en su laboratorio, y a Pilar, Jazz, Cristina e

Ivan, por todo lo que me han enseñado, por su enorme paciencia y sentido del humor.

Gracias a todos mis amigos, a los de Vigo y a los de Madrid, por ser como sois, especiales. Porque

aunque no nos veamos a diario, nada cambia entre nosotros y siempre estáis cerca cuando se os necesita.

Mil gracias por vuestra preocupación y apoyo a lo largo de estos últimos meses.

A mis padres, por su cariño, bondad y generosidad infinitos. Por su apoyarme en mis decisiones,

por comprenderme y ayudarme a diario. Porque gracias a vosotros cualquier cosa es posible.

De manera especial, quiero dar las gracias a Gonzalo, no sólo por ser un marido excepcional, sino

por ser un gran amigo y compañero. Por tus inteligentes consejos, por ser mi apoyo a diario y por no dejar

nunca de sorprenderme. Por contagiarte con mi alegría y, lo que es mejor, compartirla con los demás. Por

ayudarme a no preocuparme cuando las cosas no tienen solución, o cuando la tienen.

Mil gracias por estar siempre a mi lado.

If you wanna kiss the sky,

better learn how to kneel.

Misterious Ways

U2

A mis padres, a mis amigos,

a Gonzalo.

A vosotros os dedico esta Tesis.

Índice

Páginas

Prólogo 1

I‐ Introducción

1‐ El ojo humano 3

1.1- Anatomía del globo ocular 3

1.2- La retina 3

1.2.1- Desarrollo embrionario del globo ocular y de la retina 4

1.2.2- Histología de la retina 5

1.2.3- Fisiología: El proceso de fototransducción 10

2‐ Retinopatías hereditarias 12

2.1- Introducción 12

2.2- Diagnóstico oftalmológico 12

2.2.1- Antecedentes personales y familiares 12

2.2.2- Exploración oftalmológica 13

2.3- Características de las retinopatías hereditarias 14

2.3.1- Heterogeneidad en el patrón de herencia 14

2.3.2- Heterogeneidad genética 15

2.3.3- Heterogeneidad clínica 16

3‐ Enfermedades congénitas de la retina 16

4‐ Enfermedad de Norrie (ND) / Vitreorretinopatía Exudativa Familiar (VREF) 17

4.1- Rasgos clínicos 17

4.2- El gen: NDP 18

4.3- La proteína: Norrina 18

5‐ Retinopatías hereditarias centrales: Distrofias maculares 19

5.1- Aspectos clínicos 19

5.2- Aspectos genéticos 20

6‐ Retinosquisis Juvenil Ligada al Cromosoma X (XLRS) 20


6.2- El gen: RS1 21

6.3- La proteína: Retinosquisina 21

Índice

Páginas

7‐ Enfermedad de Stargardt (STGD) / Fundus Flavimaculatus (FFM) 24


7.2- El gen: ABCA4 25

7.3- Variantes alélicas de ABCA4 25

7.3.1- Variantes alélicas 25

7.3.2- Fenotipos asociados a defectos en ABCA4 26

7.4- La proteína: ABCA4/RmP 27

8‐ Perspectivas de futuro: tratamientos 29

8.1- Remodelación de la retina en el proceso degenerativo 29

8.2- Terapia génica 30

8.3- Retinas artificiales 31

8.4- Células madre 31

II‐ Justificación, Hipótesis de Trabajo y Objetivos 32

III‐ Pacientes y Métodos 34

1‐ Pacientes y familias estudiadas 35

1.1- Procedencia de los pacientes 35

1.2- Consulta y cuestionario inicial 35

1.3- Clasificación de las familias estudiadas 35

2‐ Metodología 51

2.1- Obtención de ADN genómico 51

2.1.1- Extracción de ADN genómico 51

2.1.1.1- Extracción de ADN por método salino 51

2.1.1.2- Extracción automática de ADN 52

2.1.2- Espectrofotometría de ADN: lectura de la concentración 52

2.1.3- Purificación de ADN genómico 53

2.2- Estudio genético directo 54

2.2.1- Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR 55

2.2.1.1- Condiciones de la PCR 55

2.2.1.2- Cebadores 55

2.2.1.3- Detección del producto de PCR mediante electroforesis 57

2.2.2- Cribado de mutaciones mediante microarray de genotipado 58

Índice

Páginas

2.2.3- Secuenciación automática 59

2.2.3.1- Purificación del producto de PCR 59

2.2.3.2- Reacción de secuenciación 60

2.2.3.3- Purificación del producto secuenciado 61

2.2.4- Análisis con enzimas de restricción 62

2.2.5- MLPA (Multiplex Ligation Probe Assay) 63

2.2.6- dHPLC (denaturing High-Performance Liquid Chromatography) 64

2.3- Estudio genético indirecto 65

2.3.1- Reacción en Cadena de la Polimerasa: PCR 65

2.3.1.1- Condiciones de la PCR 65

2.3.1.2- Cebadores 65

2.3.2- Análisis de haplotipos 68

2.3.3- Diseño de árboles genealógicos 68

2.4- Estudios de expresión 69

2.4.1- Vectores de expresión 69

2.4.2- Cultivos celulares y transfección 69

2.4.3- Inmunocitoquímica 72

2.4.4- Western Blot 72

IV‐ Resultados 76

1‐ Gen NDP 77


1.1.1- Familias estudiadas 77

1.1.2- Caracterización de mutaciones 77

1.1.3- Caracterización de polimorfismos 78




1.2.3- Haplotipos prevalentes 79

1.3- Correlación genotipo-fenotipo 81

1.4- Origen geográfico de las mutaciones 82

2‐ Gen RS1 84




Índice








2.5- Estudios de expresión 92

2.5.1- Localización subcelular de la Retinosquisina 92

2.5.2- Detección de la Retinosquisina mediante Western Blot 92

3‐ Gen ABCA4 94











3.5- Frecuencia de alelos mutantes de ABCA4 entre la población general 128

V‐ Discusión 130

1‐ Discusión general 131

2‐ Epidemiología de las distrofias de retina estudiadas 132

3‐ Gen NDP 133




4‐ Gen RS1 136




Índice

5‐ Gen ABCA4 138

5.1- Implicación en la Enfermedad de Stargardt 138

5.1.1- Estudio genético directo 138

5.1.2- Estudio genético indirecto 142

5.2- Implicación en la Distrofia de Conos y Bastones Autosómica Recesiva 144



5.3- Implicación en la Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva 145



5.4- Implicación en otras distrofias de retina 146

5.4.1- Implicación en la Distrofia Macular Autosómica Dominante 146

5.4.2- Implicación en familias con fenotipo diverso 146

5.5- Implicación en reorganizaciones cromosómicas 147


5.7- Epidemiología de los alelos mutantes en ABCA4 153

6‐ Distribución geográfica de las mutaciones en los pacientes estudiados. 153

7‐ Estrategias de estudio genético en retinopatías de herencia ligada al cromosoma X 155

8‐ Estrategias de estudio genético en retinopatías de herencia autosómica recesiva 155

VI‐ Conclusiones 157

VII‐ Bibliografía 160

VIII‐ Bases de datos 174

IV‐ Publicaciones 176

1

PRÓLOGO

El ojo es un órgano complejo que nos permite apreciar el mundo que nos rodea, adquirir nuevos

conocimientos y comunicarnos con los demás. Todas las partes del globo ocular son importantes para

percibir correctamente una imagen, pero sin duda, la capa fundamental en el proceso de la visión es la

retina.

Conocer la organización de la retina ha sido una meta para muchos científicos durante los últimos

cien años. Las descripciones anatómicas de Santiago Ramón y Cajal (1892) de los distintos tipos celulares

que constituyen la retina de los vertebrados, el temprano conocimiento de los procesos fotoquímicos que

tienen lugar en ellos y los estudios de adaptación a la visión en color, hicieron posible que en los años

sesenta se tuviese un rudimentario conocimiento de cómo debía estar organizada la retina y cuál era su

funcionamiento.

En el campo de la Genética, también se han producido importantes avances a lo largo de estos

años. Sin duda, se han producido tres acontecimientos relevantes. El primero de ellos, ocurrido ya en el

siglo pasado, fue el descubrimiento de la estructura de la doble hélice del ácido desoxirribonucleico (ADN)

por James Watson y Francis Crick (1953), basado en los estudios previos de Rosalind Franklin, Maurice

Wilkins y Erwin Chargaff. De esta manera, se identificaba la molécula portadora de toda la información

genética de un organismo. Posteriormente, el científico español Severo Ochoa y el norteamericano Arthur

Kornberg volvían a revolucionar al mundo científico al conseguir descifrar el código genético, hecho que

permitía traducir la secuencia de bases del ADN en aminoácidos, los componentes esenciales de las

proteínas que constituyen nuestro organismo.

Han pasado cincuenta años desde el modelo de la doble hélice e incluso ha comenzado un nuevo siglo,

hasta que se ha podido obtener la secuencia completa del ADN a través del Proyecto Genoma Humano

(PGH; Abril 2003).

Hoy en día, la comunidad científica trata de aunar todos los conocimientos que nos han legado los

investigadores que nos han precedido, con el fin de comprender mejor cuáles son los mecanismos

moleculares subyacentes a cualquier proceso biológico. Asimismo, es preciso determinar qué sistema no

funciona correctamente en un determinado proceso de enfermedad, así como encontrar un tratamiento

eficaz, ya sea a través de fármacos, implantes o terapia génica.

A todos ellos que, con su gran esfuerzo, su valioso trabajo y su excepcional inteligencia, nos han

permitido tomar el relevo en este arduo camino, cada vez más avanzado,

Gracias.

Esquema de la retina de vertebrados mostrando los principales tipos celulares.

Dibujo original de Cajal, alrededor de 1890.

I- Introducción

2

I- Introducción

3

I- INTRODUCCIÓN

1- EL OJO HUMANO

1.1- ANATOMÍA DEL GLOBO OCULAR

En el ojo, se diferencian varias estructuras externas:

- una apertura negra, la pupila, que permite que la luz entre en el ojo;

- el iris, que es un músculo coloreado circular, responsable del color de los ojos. La contracción y relajación

del iris regula el tamaño de la pupila, permitiendo la entrada de mayor o menor cantidad de luz;

- una superficie externa transparente, la córnea, que recubre la pupila y el iris. Ésta es la primera lente y la

más potente del sistema óptico que, junto con el cristalino, permite la producción de una imagen definida a

nivel de los fotorreceptores;

- la esclera, que forma parte de la pared que sustenta el globo ocular. La esclera es contigua a la córnea.

En una sección sagital del ojo, se diferencian tres capas distintas:

1- La capa externa, formada por la esclera y la córnea.

2- La capa intermedia, dividida en dos partes:

- anterior: contiene el iris y el cuerpo ciliar; - posterior: contiene la coroides o capa vascular.

3- La capa interna o parte sensorial del ojo, la retina.

Existen tres cámaras rellenas de fluídos:

- cámara anterior: entre la córnea y el iris;

- cámara posterior: entre el iris, los ligamentos que sostienen al cristalino y el propio cristalino; ambas

cámaras están rellenas de humor acuoso.

- cámara vítrea: situada entre el cristalino y la retina; rellena de humor vítreo.

El cristalino, situado detrás del iris, está suspendido por unos ligamentos unidos a la porción

anterior del cuerpo ciliar. La contracción y relajación de estos ligamentos como consecuencia de las

acciones del cuerpo ciliar, producen cambios en la forma del cristalino en un proceso denominado

acomodación, que permite formar una imagen definida en la retina. Además, el ojo es rotado por los

músculos oculares. (Figura I.1)

1.2- LA RETINA La retina es la más interna de las tres túnicas de las que se componen los ojos de los vertebrados:

esclera, coroides y retina (Weisz & Keogh, 1987). Se diferencian dos regiones:

- retina anterior o ciega: reviste la cara posterior del cuerpo ciliar, los procesos ciliares y el iris;

- retina posterior o sensible: es la porción del ojo sensible a la luz, que desarrolla una función receptora e

integradora de las imágenes que recibe. En ella se observan dos elementos:

I- Introducción

- la papila del nervio óptico: corresponde al punto ciego de la retina por el que los axones de las

células ganglionares abandonan la retina para formar el nervio óptico;

- la mácula: es una región de la retina de aproximadamente 5 milímetros (mm) de diámetro. Es la

región encargada de la visión de mayor nitidez y definición.

Figura I.1: Anatomía externa e interna del globo ocular (www.eyedesignbook.com).

1.2.1- DESARROLLO EMBRINARIO DEL GLOBO OCULAR Y DE LA RETINA

Durante la gastrulación (proceso que sufre el embrión y que conduce a la formación de las tres

capas germinales: ectodermo, mesodermo y ectodermo), el ojo embrionario consiste en un surco óptico

localizado en el centro del encéfalo anterior (Figura I.2A).

Este surco óptico se separa en dos vesículas ópticas laterales, en torno al vigésimo octavo día de

gestación en humanos (Figura I.2B). A medida que se desarrollan estas vesículas, sus extremos distales se

expanden y se constriñen, formando los tallos ópticos.

A continuación, se produce un evento crucial en el desarrollo ocular, que es interacción de la

vesícula óptica con la placa del cristalino. Como resultado, la placa del cristalino se invagina y se

convierte en la fóvea del cristalino (Figura I.2C).

En este momento, en los tallos ópticos se desarrollan unos surcos denominados fisura óptica, de cuyo

mesénquima se forman los vasos sanguíneos hialoideos. A medida que se acercan y se fusionan los

bordes de la fisura, los vasos hialoideos quedan encerrados dentro del nervio óptico y darán lugar a la

arteria y a la vena central de la retina.

4

I- Introducción

Entre el trigésimo primer y el trigésimo quinto día de gestación, la fóvea del cristalino se cierra

formando las vesículas del cristalino. A su vez, estas vesículas se invaginan, dando lugar a la cúpula óptica, de doble capa (Figura I.2D).

La capa externa de la cúpula óptica originará el epitelio pigmentario de la retina (EPR) (sexta

semana de gestación) y la capa interna dará lugar a la retina neural (entre la cuarta y la quinta semana de

gestación) (Figura I.2E). Los primeros conos y bastones aparecen en embriones humanos entre la semana

diez y la semana quince, mientras que las capas de células horizontales, bipolares y ganglionares aparecen

a la mitad del desarrollo embrionario.

Figura I.2: Desarrollo embrionario del globo ocular y de la retina (Graw J, 2003).

1.2.2- HISTOLOGÍA DE LA RETINA

La sección vertical de la retina humana muestra una estructura estratificada compleja que incluye el

epitelio pigmentario de la retina, las capas neuronales y las membranas limitantes externa e interna, en las

que se producen las conexiones sinápticas. Las células implicadas en las distrofias de retina (DR) son los

fotorreceptores y las células del epitelio pigmentario de la retina (Haw AW, 1970; Krstic RV, 1997).

Las primeras neuronas de la vía visual son los fotorreceptores, que se sitúan en la capa de conos y

bastones o capa nuclear externa. Los fotorreceptores traducen la señal luminosa y establecen sinapsis en

la capa plexiforme externa con la siguiente neurona: la célula bipolar, situada en la capa nuclear interna.

Esta neurona emite su axón a la capa plexiforme interna y conecta con la célula ganglionar, en la capa de las células ganglionares.

5

I- Introducción

Por último, los axones de las células ganglionares se dirigen hacia la papila del nervio óptico, formando la

capa de fibras del nervio óptico.

Figura I.3: Estructura de la retina.

EPITELIO PIGMENTARIO DE LA RETINA (EPR) Es la capa más externa de la retina. Está unida a la membrana de Bruch, que la separa de la

coroides o capa vascular. El EPR está formado por células columnares cargadas de melanina, contienen

microvellosidades en su polo apical y vainas cilíndricas en su membrana plasmática que envuelven los

segmentos externos de conos y bastones (Junqueira LC & Carneiro J, 1987).

Sus funciones, vitales para el proceso visual, son las siguientes:

1- Reciclaje de fotorreceptores: fagocitosis y digestión lisosómica de los discos del segmento externo de

conos y bastones.

2- Interviene en el ciclo de la vitamina A.

3- Síntesis de melanina: absorbe la luz no capturada por los fotorreceptores, impidiendo que se refleje

dentro del ojo.

4- Aporte de nutrientes para los fotorreceptores.

5- Síntesis de glicosaminoglicanos (componentes de la matriz extracelular de los fotorreceptores).

6- Barrera entre la circulación coloidal y las capas externas de la retina. Transporte iónico y de agua desde

el espacio subretinal.

6

I- Introducción

FOTORRECEPTORES

Los fotorreceptores son células alargadas sobre las que incide la luz siguiendo un eje longitudinal.

Su morfología está constituída por dos regiones diferenciadas: el segmento interno y el segmento externo.

En la región basal del segmento interno, se encuentran el núcleo y la región axónica. Esta región celular

también contiene abundantes mitocondrias, el retículo endoplasmático rugoso y el aparato de Golgi.

El segmento externo, unido al segmento interno por un estrecho cilio, posee un gran desarrollo de

membranas fotosensibles.

Figura I.4: Estructura del fotorreceptor.

Además de presentar diferencias morfológicas, los conos y los bastones difieren entre sí en su

función y distribución. Los conos son los responsables de la visión a elevados niveles de luz (fotópica), por

lo que perciben el color y una visión diurna muy rica en detalles. Contienen unos pigmentos visuales

denominados opsinas y, en función del fotopigmento que portan, los conos se subdividen en rojos, verdes

y azules. Existen unos seis millones de conos, la mayor densidad de ellos se encuentran en la mácula, la

región central de la retina. En el centro de la mácula se sitúa la fóvea, que es la región de mayor agudeza

visual.

Los bastones poseen un umbral de excitación más bajo y son los responsables de la visión

nocturna (escotópica) y en blanco y negro. En la retina humana hay alrededor de unos ciento cincuenta

millones de bastones, dispuestos de forma periférica. Por tanto, a medida que nos alejamos de la fóvea,

aumenta la densidad de bastones y disminuye la densidad de conos, disminuyendo la agudeza visual.

Segmento externo

Es el polo sensorial de la célula y está en íntimo contacto con el EPR. Es una prolongación celular

que diferencia morfológicamente a los conos (cortos y gruesos) de los bastones (largos), en la que tiene

lugar el proceso de fototransducción. Ultraestructuralmente, está constituido por microvesículas formando

unos mil discos apilados (Rawn JD, 1989). Éstos se encuentran rodeados por membrana plasmática,

formada a partir de invaginaciones de la membrana celular, que se separan de ésta en el caso de los

bastones y que permanecen como tales invaginaciones en el caso de los conos.

7

I- Introducción

8

Estas estructuras no son estáticas, sino que están sometidas a un proceso de reciclaje continuo:

- en los bastones, los discos migran hacia la porción apical del fotorreceptor progresivamente y son

fagocitados por el EPR. El proceso de migración dura entre nueve y doce días y el EPR fagocita alrededor

del 10% del segmento externo diariamente. Simultáneamente, se va añadiendo membrana nueva en el

lugar de la unión segmento externo-interno (Zinn KM & Marmor MF, 1979; Travis GH, 1997).

- En los conos, no se da la renovación de los discos ya que éstos son plegamientos de la propia membrana.

Se piensa que la estructura del disco se mantiene gracias a proteínas específicas del segmento

externo de conos y bastones, como la proteína RDS/periferina y la proteína ROM1, que contribuyen al

mantenimiento de la curvatura de los discos y de su anclaje al citoesqueleto del fotorreceptor (Connell GJ &

Molday RS, 1990).

Desde el punto de vista bioquímico, la membrana del segmento externo se caracteriza por una

elevada fluidez, debido a una composición baja en colesterol y extremadamente alta en ácidos grasos

esenciales (Deamen FJM, 1973). Otro componente que aparece en una composición inusualmente alta es

la vitamina E (α-tocoferol), que contribuye a la eliminación del producto generado por la fotooxidación de los

ácidos grasos del segmento externo.

Segmento interno

El segmento interno está separado del externo mediante una constricción denominada cilio de conexión, que interviene en el metabolismo celular sintetizando macromoléculas que liberan energía para

la fototransducción.

Esta porción del fotorreceptor presenta apilamiento de mitocondrias, contiene los orgánulos celulares y

acumula gran cantidad de glucógeno. El núcleo se localiza al comienzo del axón, el cual realiza sinapsis

con las células bipolares, lo que supone el primer relevo de la vía visual.

Opsinas o pigmentos visuales

Los segmentos externos de conos y bastones contienen sólo un tipo de pigmento visual por tipo

celular. El 11-cis-retinaldehído es el cromóforo para los cuatro pigmentos visuales. Se dispone

paralelamente al plano de la bicapa y perpendicularmente a las α-hélices, posición que le permite el

aumento en la captura de fotones. Las opsinas son proteínas que participan en la fotorrecepción: absorben

luz a distintas longitudes de onda, transformándola en impulsos nerviosos.

La rodopsina, opsina que se expresa en los bastones, se excita en condiciones de baja intensidad

lumínica y su máximo de absorción es de 493 nanómetros (nm) (Merbs SL & Nathans, 1992). Existen otros

tres pigmentos visuales que se localizan en los conos y absorben a distintas longitudes de onda (Stockman

A et al., 2000). El pigmento azul absorbe a 426 nm y su gen se encuentra localizado en 7q31. Las dos

últimas opsinas se encuentran en el cromosoma Xq28: el pigmento verde que absorbe a 530 nm y el

I- Introducción

pigmento rojo que absorbe a 552 o 557 nm, dependiendo de la presencia de un polimorfismo en el codon

180 que puede ser alanina o serina.

Figura I.5: Espectros de absorción de los pigmentos de los fotorreceptores.

OTROS TIPOS CELULARES

Células bipolares

Son las segundas neuronas del proceso visual. Establecen sinapsis mediante sus dendritas con el

fotorreceptor en la capa plexiforme externa y emiten su axón a la capa plexiforme interna, donde ocurre el

tercer relevo sináptico con las células amacrinas o las células ganglionares (Boycott BB et al., 1987). Su

función es crucial para detectar contrastes débiles o cambios en la intensidad de luz.

Células horizontales

Este tipo celular está ubicado entre la capa nuclear interna, donde se observan sus somas y en la

capa plexiforme externa, donde extiende sus dendritas y sus axones.

Sus terminaciones dendríticas forman sinapsis tripartitas o tríadas con los conos y las células bipolares de

los conos. Las terminaciones derivadas de sus axones inervan lateralmente las esférulas, que es como se

denomina a las conexiones que se establecen entre los bastones y la célula bipolar del bastón.

Se considera que desempeñan un papel esencial en el circuito de contraste simultáneo y la adaptación

neural a la luz.

Células amacrinas

Este término quiere decir “sin axón”. Establecen sinapsis con las células bipolares, con las células

ganglionares y con otras células amacrinas en la capa plexiforme interna.

Células ganglionares

Son las mediadoras del último relevo sináptico de la retina. Sus dendritas conectan con las células

amacrinas y bipolares en la capa plexiforme interna y sus cuerpos se localizan en la capa de células

ganglionares. Sus axones se organizan en la capa de axones del nervio óptico, que abandona la retina por

el punto ciego. Su función consiste en distinguir y seleccionar la información visual que se transmite al

cerebro (Lennie P et al., 1990).

9

I- Introducción

10

La glía. La célula de Müller Las células gliales son un componente esencial de la retina. Histológicamente, se diferencian

células tanto del tipo astroglía como microgliales pero, sobre todo, destaca la célula de Müller.

La célula de Müller está dispuesta verticalmente a todas las capas de la retina, abarcando todas ellas:

desde el soma, en la capa nuclear interna, irradian prolongaciones hacia las capas más internas de la

retina, rodeando vasos sanguíneos y en contacto con el humor vítreo. También emiten prolongaciones

hacia las capas de los fotorreceptores, rodeando a estas células. A su paso por las distintas capas, cubren

los cuerpos neuronales y las dendritas de los distintos tipos celulares.

Desempeñan funciones esenciales para la supervivencia de la retina: constituyen un tejido de

sostén para los diversos tipos celulares, intervienen en la nutrición retiniana mediante el acúmulo de

glucógeno y ejercen una función defensiva mediante fagocitosis.

1.2.3- FISIOLOGÍA: EL PROCESO DE FOTOTRANSDUCCIÓN

El proceso de fototransducción tiene lugar en los discos del segmento externo de los

fotorreceptores. El fotorreceptor es sensible a la luz y responde al estímulo luminoso variando su potencial

de membrana y, como consecuencia, varía su emisión del neurotransmisor glutamato al espacio sináptico

en la capa plexiforme externa.

En el bastón, adaptado a la oscuridad, el potencial de membrana está en torno a unos -40 milivoltios (mV).

Este potencial se mantiene en ausencia de luz debido a la existencia de una “corriente oscura” catiónica:

esta corriente se produce en reposo en el segmento externo del bastón por la actividad de un transportador

catiónico Na+/Ca2+ dependiente de GMP cíclico (GMPc) que, en oscuridad, permanece abierto.

Por tanto, se produce una liberación tónica de glutamato al espacio sináptico en ausencia de estímulos

visuales.

La molécula fotosensible de los discos de los bastones es la rodopsina, que consta de una parte

proteica, la opsina y un grupo prostético unido covalentemente, el 11-cis-retinal.

Fase luminosa

La cascada visual comienza con la captación de un fotón de luz, que provoca la activación de la

rodopsina por la isomerización del 11-cis-retinal a todo-trans-retinal, provocando un desplegamiento de la

proteína. Entonces, la rodopsina pasa en milisegundos por distintos estados energéticos derivados de los

cambios conformacionales y alcanza su forma activa y más estable: metarrodopsina II.

La rodopsina activada, a su vez, interactúa con la siguiente proteína de la cascada: la transducina,

que es una proteína heterotrimérica que consta de tres subunidades (α,β,γ). La rodopsina estimula la

subunidad α de la transducina, que se disocia y cataliza la conversión de GDP a GTP.

La transducina activada provoca un cambio conformacional en el complejo de la fosfodiesterasa

(PDE), una proteína G heterotetramérica: consta de dos tipos de subunidades activadoras (α,β) y dos

subunidades inhibitorias (γ). La disociación de estas dos últimas hace que la PDE hidrolice el GMPc a GMP.

I- Introducción

Esta situación provoca el cierre de los canales catiónicos de la membrana plasmática del bastón,

produciendo un aumento de polaridad en la membrana.

Esta hiperpolarización genera el potencial receptor, constituyendo la primera señal eléctrica de transmisión

de información neuronal (Yau KW, 1994).

Figura I.6: Esquema de las proteínas de la cascada visual.

Fase oscura

La finalización de la fotoexcitación se produce por inactivación de la metarrodopsina II por la

fosforilación de resíduos de serina y treonina de su extremo carboxilo terminal, mediante la enzima

rodopsina quinasa.

Posteriormente, la rodopsina fosforilada se une a la arrestina: la actuación de ambas enzimas evita la unión

de la rodopsina a la transducina, permitiendo que se paralice el proceso (Wilden U et al., 1996).

También es necesaria la inactivación de la transducina y la PDE, proceso en el que parecen estar

involucradas la concentración de Ca2+ intracelular y la recoverina: el descenso de las concentraciones de

Ca2+ provoca la activación de la recoverina, enzima que a su vez activa la guanilato ciclasa, que

reconstituye los niveles de GMPc. De esta forma, se reanuda la apertura de los canales dependientes de

GMPc.

El aumento del Ca2+ inhibe a su vez la actividad de la recoverina. La transducina GTPasa se

encarga de catalizar la separación de la transducina y la PDE, permitiendo su inactivación al unirse de

nuevo a sus subunidades inhibitorias.

Mientras, el todo-trans-retinal (el cromóforo) es reducido rápidamente a todo-trans-retinol, por la enzima

retinol deshidrogenasa y mediado por el paso de NADPH a NADP. Para que se produzca este último paso,

es necesario que el todo-trans-retinal sea transportado desde la membrana intradiscal al citoplasma del

fotorreceptor por la proteína RmP (Sun H et al., 2000), como se verá más adelante.

El proceso de fototransducción que se ha descrito en los bastones, ocurre de forma similar en los

conos. La diferencia radica en la longitud de onda a la que absorben las opsinas de los distintos conos.

De esta manera, cada tipo de cono se excita de forma espectralmente independiente, para un determinado

color.

11

I- Introducción

12

2- RETINOPATÍAS HEREDITARIAS

2.1- INTRODUCCIÓN

Las distrofias hereditarias de la retina son un conjunto de enfermedades degenerativas y

generalmente progresivas, causadas por la afectación primaria de los fotorreceptores, que ocurren en una

de cada 3000 personas. Se caracterizan por ser transtornos hereditarios, por la evolución progresiva y por

no tener, por el momento, un tratamiento ni paliativo ni curativo, lo que conlleva a la pérdida total o parcial

de la visión (Rivolta C et al., 2002).

Histológicamente, la pérdida de los fotorreceptores es seguida generalmente por alteraciones en el

epitelio pigmentario y en la glía de la retina. Finalmente, los cambios degenerativos también afectan a las

neuronas de la retina profunda, a los vasos y a la cabeza del nervio óptico (Milam et al., 1998).

Las distrofias de retina (DR) se pueden clasificar, de manera general, en:

- formas periféricas, en las que los bastones son las células de la retina que se ven afectados inicialmente;

incluyen las formas típicas de Retinosis Pigmentaria (RP),

- formas centrales, con degeneración de los conos en su inicio, pudiendo afectarse de forma secundaria o

no los bastones; incluyen las distrofias maculares (DM), las distrofias de conos, las distrofias de conos y

bastones (DCB), etc.

2.2- DIAGNÓSTICO OFTALMOLÓGICO

2.2.1- ANTECEDENTES PERSONALES Y FAMILIARES

El diagnóstico temprano de las DR requiere una historia clínica completa, en la que se resaltan tres

aspectos fundamentales (www.retinosis.org):

a) Sintomatología y edad de comienzo: Generalmente el paciente se queja de pérdida de la agudeza

visual, reducción del campo visual, mala adaptación a la oscuridad (hemeralopia/ceguera nocturna) o

intolerancia a la luz (fotofobia), etc. El comienzo de los síntomas es muy variable, existiendo formas muy

tempranas (incluso congénitas), formas juveniles (entre la primera y la segunda década de vida) y formas

adultas.

b) Árbol genealógico: Dado el carácter hereditario de esta patología, es necesario reconstruir al menos

tres generaciones del enfermo. También es importante tener en cuenta la posible existencia de

consanguinidad en la familia, especialmente en aquellos casos que puedan presentar herencia recesiva de

la enfermedad.

c) Antecedentes personales: Resultan fundamentales, tanto en relación al proceso ocular (diagnóstico

diferencial de formas secundarias), como a cualquier alteración sistémica (diagnóstico diferencial e

identificación sindrómica).

http://www.retinosis/

I- Introducción

13

2.2.2- EXPLORACIÓN OFTALMOLÓGICA

La exploración oftalmológica incluye, entre otras, las siguientes pruebas (García-Sandoval B, 2001):

- Agudeza visual: Se utiliza, entre otras, el test de visión de los colores 100-HUE Farnsworth-Munsell, que

consiste en cuatro conjuntos de fichas de color removibles con un total de 85 fichas de referencia de color a

lo largo del espectro visible. Las anomalías en la visión de color son detectadas cuando el paciente es

incapaz de colocar las fichas en el orden correcto (Figura I.7a).

- Biomicroscopía del segmento anterior: Permite detectar cataratas subcapsulares posteriores, unos de

los hallazgos más frecuentes en los pacientes con RP.

- Campimetría: La técnica más empleada para valorar el campo visual es el campímetro de Goldman, que

proporciona información sobre la densidad del escotoma (zona sin visión) en valor absoluto y la representa

en escala de grises (Figura I.7b).

- Funduscopia: Examen del fondo de ojo utilizando un microscopio de rendija y unas lentes corneales de

contacto o simplemente una lente manual de 90 dioptrías (Figura I.7c).

- Electrooculograma (EOG): Es un examen que consiste en colocar pequeños electrodos cerca de los

músculos de los ojos para medir el movimiento de éstos.

- Electrorretinograma (ERG): Esta prueba consiste en el registro -mediante un electrodo encajado en una

lente de contacto- de los cambios del potencial eléctrico obtenido en la retina tras un estímulo luminoso.

Sirve para evaluar la integridad funcional de la retina y, más específicamente, de los bastones (ERG

escotópico), de los conos (ERG fotópico) o de ambos sistemas fotorreceptores (ERG mixto) (Figura I.7d).

- Angiofluoresceingrafía (AFG): Permite observar un efecto pantalla por los depósitos de pigmento que

impiden ver la fluorescencia coroidea (Figura I.7e).

- Tomografía de coherencia óptica (TCO): Representa los estratos de la retina en forma de una imagen

de sección transversal de alta resolución. Los colores calientes -rojo y blanco-, corresponden a zonas de

alta reflectividad. Los colores fríos -azul y negro-, cuentan con una reflectividad más débil y caracterizan

células ganglionares, fotorreceptores y la coroides (Figura I.7f).

I- Introducción

Figura I.7: a) Test de los colores 100-HUE Farnsworth-Munsell. b) Campimetría: las zonas oscuras representan las

regiones en las que se produce el escotoma. c) Fondo de ojo de un individuo sano. d) ERG con patrón bifásico típico de

un individuo normal. e) Imagen obtenida por AFG de un individuo sano, en el que se observa la fluorescencia de los

vasos sanguíneos de la coroides. f) Imagen obtenida por TCO, en la que se observan las distintas capas celulares.

2.3- CARACTERÍSTICAS DE LAS RETINOPATÍAS HEREDITARIAS

Unas de las características típicas de las DR es su elevada heterogeneidad, tanto a nivel genético

como a nivel clínico. De hecho, las manifestaciones de cada una de las diversas formas de DR varían en

función del patrón de herencia con el que se transmiten a las siguientes generaciones (Valverde D, 2001).

2.3.1- HETEROGENEIDAD EN EL PATRÓN DE HERENCIA

Herencia autosómica dominante (AD)

Se caracteriza porque en cada generación aparece al menos un afecto (transmisión vertical).

Varones y hembras se encuentran afectados por igual, ya que el gen alterado está situado en alguno de los

veintidós autosomas y presenta dos alelos, uno normal y otro mutado.

El riesgo de transmisión es del 50% en cada hijo de un afecto. La transmisión de varón a varón permite el

diagnóstico diferencial respecto a la herencia ligada al X.

Herencia autosómica recesiva (AR)

En este modelo de herencia aparecen varios miembros afectos dentro de una misma generación

(transmisión horizontal). Los progenitores son portadores sanos (presentan un alelo sano y otro mutado) y

la enfermedad se manifiesta cuando alguno de los hijos (varón o hembra) hereda ambos alelos mutados:

uno del padre y otro de la madre.

Por tanto, la enfermedad se hereda por ambas ramas familiares y la consanguinidad o la endogamia entre

las mismas suele ser un hecho frecuente. El riesgo de aparición de la enfermedad es de un 25% para cada

hijo. Todos los hijos de un afecto serán portadores.

14

I- Introducción

15

Herencia ligada al cromosoma X (XL)

En este tipo de patrón de herencia, las mujeres portadoras transmiten la enfermedad a sus

descendientes sin padecerla, con la probabilidad de un 50% de tener hijos varones afectos y un 50% de

tener hijas portadoras. No existe transmisión entre varones, puesto que el padre afecto únicamente aporta

el cromosoma Y a su hijo varón. Sin embargo, todas sus hijas serán portadoras del defecto genético.

Algunas portadoras pueden presentar síntomas de la enfermedad, debido a la inactivación al azar

del cromosoma X (MacDonald IM, 1997). En cualquier caso, las manifestaciones clínicas suelen ser más

leves y muy variables e incluso pueden existir asimetrías en la afectación de ambos ojos.

Herencia digénica y trialelismo

Es una condición génica causada por la interacción de dos mutaciones en dos genes diferentes no

ligados, donde sus productos proteicos están funcionalmente conectados.

En algunos casos, genes recesivos pueden verse afectados por un tercer alelo mutante que ejerce un

efecto modificador, suavizando o agravando el fenotipo. Un ejemplo de trialelismo se produce en la

Amaurosis Congénita de Leber y en el Síndrome de Bardet-Bield.

Herencia mitocondrial

Existen genes involucrados en patologías oftalmológicas que se encuentran en el genoma

mitocondrial. Son enfermedades de herencia materna, ya que las mitocondrias se transmiten a la siguiente

generación a través de los óvulos. Algunos ejemplos son la neuropatía óptica hereditaria de Leber (NOHL),

el síndrome de Kearns-Seyre (KSS) y la neuropatía, ataxia y retinosis pigmentaria (NARP).

No hay evidencia de que las DR se manifiesten más tempranamente en las generaciones

sucesivas, es decir, no se produce el fenómeno de anticipación genética producido por mutaciones

dinámicas (alelos expandidos), excepto en el caso de la DR causada por mutaciones en el gen ATXN7

(antes SCA7, ataxia espinocerebelosa 7).

2.3.2- HETEROGENEIDAD GENÉTICA

Heterogeneidad alélica

Se produce cuando diferentes mutaciones a lo largo de la secuencia de un mismo gen

desencadenan el mismo proceso degenerativo.

Heterogeneidad no alélica

Se produce cuando distintos genes o loci son responsables de la misma enfermedad.

Prácticamente, en todos los cromosomas se encuentran genes involucrados en alguna patología retiniana.

Hasta el momento se han localizado un total de 163 loci, de los cuales 114 ya han sido clonados

(www.sph.uth.tmc.edu/Retnet).

I- Introducción

16

2.3.3- HETEROGENEIDAD CLÍNICA

Formas no sindrómicas

Son aquellas DR en las que únicamente se manifiesta la patología ocular. Se presentan asociadas

a los modelos de herencia conocidos mendelianos.

Formas sindrómicas

Son aquellas DR que aparecen acompañadas de un cuadro clínico complejo, con manifestaciones

extraoculares. Suponen un 13-18% de todas las retinopatías hereditarias, se han descrito del orden de 77

síndromes distintos (www.retina-internacional.org). Pueden deberse a una herencia mitocondrial, herencia

dominante, herencia recesiva, trialelismo o reordenamientos cromosómicos.

Dentro de las formas sindrómicas, los más frecuentes son el Síndrome de Usher (recesivo) y el Síndrome

de Bardet-Bield (recesivo y trialélico).

Por lo tanto, a la hora de diagnosticar a un paciente, es importante determinar si se trata de una

degeneración exclusivamente ocular o bien si forma parte de un trastorno sistémico ya que algunas

retinopatías son un síntoma frecuente de distintos errores metabólicos congénitos, especialmente en

alteraciones del sistema peroxisomal, errores del metabolismo de los ácidos grasos y defectos de la cadena

respiratoria mitocondrial.

3- ENFERMEDADES CONGÉNITAS DE LA RETINA

Las enfermedades congénitas de la retina son relativamente frecuentes en la población: en todo el

mundo, entorno a 1,4 millones de niños menores de dieciséis años son ciegos (Johnson GJ et al., 2003).

Entre otros defectos oculares que se producen de forma temprana o incluso congénita, destacan los

siguientes:

- microftalmia: disminución del tamaño normal del globo ocular;

- anoftalmia: ausencia de los globos oculares, en cuyo caso pueden estar presentes los esbozos ópticos;

- persistencia de vítreo primitivo: se localiza centralmente como una masa retrolental que emite procesos

ciliares hacia la cápsula posterior del cristalino;

- retinopatía del prematuro / de la prematuridad: retinopatía bilateral del recién nacido que ocurre en

prematuros de bajo peso que han sido sometidos a concentraciones altas de oxígeno, lo que provoca

alteraciones vasculares en la retina e isquemia de la misma con posterior neovascularización, proliferación

vitreorretiniana y desprendimiento traccional de la retina.

- desprendimiento de retina: separación que se produce entre la retina y el EPR, acumulándose líquido en

el espacio virtual existente entre los dos.

- coloboma: se produce por un déficit en el cierre o soldadura de la fisura óptica y que puede afectar,

mayoritariamente, al desarrollo del iris o de la retina.

Algunos de estos defectos oculares hereditarios pueden deberse, entre otras causas, a alteraciones

en los genes NDP y RS1, como se verá a continuación

I- Introducción

4- ENFERMEDAD DE NORRIE (ND)/ VÍTREORRETINOPATÍA EXUDATIVA FAMILIAR (VREF)

4.1- RASGOS CLÍNICOS La Enfermedad de Norrie (ND; MIM +310600) es un trastorno recesivo ligado al X caracterizado por

una serie de cambios fibrosos y vasculares en la retina desde el nacimiento, que progresan durante la

infancia y la adolescencia causando pérdida de la agudeza visual de diferentes grados en varones.

Los cambios retinianos más severos son masas fibrovasculares de color amarillo-grisáceo,

llamados también “pseudogliomas” por su parecido a los tumores, que aparecen en los primeros meses de

vida y producen ceguera legal (agudeza visual < 20/200). Estas masas producen un aumento de la reacción

fibrótica en la retina, así como cambios vasculares, que habitualmente producen hemorragia del vítreo.

Desde el tercer mes de vida hasta los 8-10 años, se producen cambios progresivos en la retina: opacidad

del cristalino (cataratas), atrofia del iris con adhesión entre cristalino-iris (posterior synechiae) o adhesión

entre iris-córnea (anterior synechiae) y aumento de la presión intraocular, que puede resultar dolorosa. En

los estadios más avanzados de la enfermedad, los globos oculares se ven disminuidos y las córneas

presentan un aspecto blanquecino, de forma que los ojos parecen hundidos en las órbitas (microftalmia).

El 50% de los varones afectos presentan sordera neurosensorial que comienza en la infancia

temprana debido a defectos en la cóclea, así como retraso mental de diferentes grados (Warburg M, 1961;

Warburg M, 1975).

Un fenotipo más suave supone la aparición de una masa blanca desde el disco óptico hasta el

cristalino -persistencia de vítreo primitivo hiperplásico (PHPV)- y anomalías vasculares periféricas, con o sin

cambios fibrosos -vitreorretinopatía exudativa familiar (FEVR; MIM #305390)-. Los varones afectos no

presentan sordera neurosensorial ni retraso mental (Fullwood P, 1993).

Figura I.8: A) Fondo de ojo de un paciente con vitreorretinopatía exudativa. Debido a cambios proliferativos en la

retina, se observan alteraciones en los vasos sanguíneos que aparecen alargados. Los exudados amarillos aparecen

cerca de la fóvea, debido a filtraciones de los vasos periféricos. B) La AFG (angiofluoresceingrafía) muestra

hiperfluorescencia de la región temporal del disco óptico y distorsión de los vasos sanguíneos a nivel macular.

17

I- Introducción

18

También se han identificado algunos casos de Enfermedad de Coats (MIM #300216) y retinopatía

de prematuridad (ROP; MIM #305390; descrita anteriormente) debido a mutaciones en el gen NDP (Black

GCM, 1999; Shastry BS, 1997).

La Enfermedad de Coats o teleangiectasia retiniana se caracteriza por un defecto en el desarrollo de la

vascularización de la retina que resulta en extravasación retiniana con exudados subretinianos y

desprendimiento de retina. Mediante AGF, se observan áreas con ausencia de perfusión, dilataciones y

aneurismas capilares. Al inicio, cuando sólo está afectado un sector de la retina, la visión está conservada.

Posteriormente, el desprendimiento de retina conduce a la pérdida de la visión.

4.2- EL GEN: NDP

El gen responsable de la Enfermedad de Norrie de denomina NDP (Norrie Disease Protein gene),

se localiza en Xp11.4 y consta de tres exones, pero sólo los exones 2 y 3 se traducen: el exón 1 está

situado dentro de la región 5´UTR (untranslated, no traducida) y se especula que desempeña una función

reguladora en la región promotora del gen, el exón 2 contiene los primeros 58 codones mientras que el

exón 3 es el de mayor tamaño y contiene los residuos 59-133 de la pauta abierta de lectura así como 917

pares de bases (pb) de la región 3´UTR.

Hasta el momento, se han identificado más de setenta mutaciones en el gen NDP (www.hgdm.org), la

mayoría provocan cambio de aminoácido (en inglés missense) y se producen en los exones 2 y 3.

4.3- LA PROTEÍNA: NORRINA

El gen NDP codifica una proteína secretable de 133 aminoácidos llamada “Norrina” cuyos residuos

de cisteína forman puentes disulfuro que sugieren un papel fundamental en la estructura y función de la

retina. La Norrina es un miembro de la familia de los factores de crecimiento tipo “cysteine-knot” y se

especula que interviene en la interacción neuroectodérmica célula-célula, que resulta crítica para el

desarrollo normal de la retina, del Sistema Nervioso Central (SNC) y de la cóclea.

Las alteraciones que ocurren en esta proteína, producen una vascularización incompleta de la

retina, tanto en pacientes con Enfermedad de Norrie como con vítreorretinopatía exudativa familiar. Sin

embargo, existe una forma de FEVR causada por defectos en el gen frizzled-4 (FZD4; MIM *604579) que

codifica un receptor de la vía Wnt. La vía de señalización de Wnt, que está conservada evolutivamente en

todos los organismos, regula un conjunto de procesos centrales para el desarrollo y las funciones celulares.

Estos procesos incluyen la proliferación celular, la diferenciación de células en tejidos especializados y el

establecimiento de regiones distintas dentro de la célula. Los cambios en la vía Wnt se han relacionado con

distintas enfermedades humanas, como el cáncer y la enfermedad de Alzheimer, entre otras.

Recientemente, se ha determinado que la Norrina y FZD4 funcionan como un par ligando-receptor

respectivamente, basándose en la similitud de los fenotipos vasculares causados por mutaciones en

Norrina y FZD4 tanto en humanos como en ratones: se ha observado que la Norrina se une con elevada

http://www.hgdm.org/

I- Introducción

especificidad al receptor FZD4, aunque requiere la presencia del co-receptor LRP5 (MIM *107770), para

provocar la activación de la vía Wnt (Xu et al., 2004).

Por tanto, estos datos consideran que el sistema Norrina-FZD4 desempeña un papel esencial en el

desarrollo vascular del ojo y del oído.

Figura I.9: Secciones histológicas de retinas de ratón silvestre y de ratón mutante fz4-/-, a nivel de la capa de fibras

nerviosas, plexiforme interna y plexiforme externa. En la retina fz4-/-, se desarrollan expansiones concretas a partir de

los vasos primarios, pero los vasos secundarios y terciarios están ausentes (Xu et al., 2004).

5- RETINOPATÍAS HEREDITARIAS CENTRALES: DISTROFIAS MACULARES

5.1- ASPECTOS CLÍNICOS

La degeneración macular se caracteriza por alteraciones de la pigmentación, estrechamiento

arteriolar, cierto grado de atrofia óptica y deterioro progresivo de la función visual. La dispersión y

acumulación del pigmento retiniano da lugar a alteraciones visibles en el examen oftalmológico, que van

desde el aspecto moteado del pigmento hasta las acumulaciones típicas en forma de espículas óseas.

Estas maculopatías comparten unas características comunes: el material acumulado es de tipo lipofucsina,

se deposita en el epitelio pigmentario y las alteraciones afectan más severamente a la zona de la mácula.

La enfermedad comienza a manifestarse en la infancia con una disminución bilateral gradual y progresiva

de la visión central, aunque puede permanecer estacionaria durante muchos años. Este tipo de afectación

retiniana es más frecuente en individuos de raza blanca que en los de raza negra (Wright AF & Jay B,

1994).

19

I- Introducción

5.2- ASPECTOS GENÉTICOS

Las distrofias maculares suelen presentarse como casos esporádicos, autosómicos dominantes,

recesivos o ligados al cromosoma X. Dentro de las formas dominantes hay muchos tipos, que se distinguen

por sus manifestaciones clínicas, como la Enfermedad de Best, las distrofias en patrón, la distrofia macular

de Sorby y las drusas de herencia dominante. Entre las formas recesivas, destaca la Enfermedad de

Stargardt, que se considera la distrofia macular juvenil más común. En las formas ligadas al cromosoma X,

destaca la Retinosquisis juvenil. En general, las formas más frecuentes son las seniles, como la Distrofia

Macular Asociada a la Edad (DMAE).

6- RETINOSQUISIS JUVENIL LIGADA AL CROMOSOMA X (XLRS)

6.1- RASGOS CLÍNICOS

La Retinosquisis juvenil ligada al cromosoma X (XLRS; MIM +312700) es una de las causas más

comunes de degeneración macular juvenil en varones, con una prevalencia que oscila entre 1:5000 a

1:25000 (Mooy CM et al., 2002). La manifestación clínica más común es la pérdida de visión en la primera

década de vida, en algunos casos a los tres meses de edad, ocasionando una pérdida precoz de la

agudeza visual (20/60-20/120). El deterioro de la visión es leve hasta la quinta o sexta década de vida, a

partir de la cual la degeneración visual es progresiva y puede producirse ceguera legal en torno a los 70

años de edad.

El fondo de ojo se caracteriza por una degeneración macular microquística, que presenta una

distribución radial típica desde la fóvea hasta la periferia (patrón en “rueda de carro”). También se produce

degeneración vitreorretiniana y rotura de la capa de fibras nerviosas, que genera grandes hendiduras

(“schisis”). Estos desdoblamientos de las capas retinianas reciben el nombre de “velos vítreos” (Tantri A et

al., 2004). Este desgarro de las capas superficiales de la retina ocasiona degeneración de los

fotorreceptores, disminución de la capa ganglionar y alteraciones en el EPR. Posteriormente, surgen

lesiones en la retina periférica, alteraciones en el vítreo y reducción de la onda b en el ERG.

Figura I.10: A) Fondo de ojo de un paciente con RS; se observa atrofia macular y velos vítreos. B) Imagen obtenida por

TCO (Tomografía de Coherencia Óptica) que muestra las cavidades microquísticas en la fóvea.

20

I- Introducción

En estadios más tardíos, la hemorragia del vítreo constituye la fundamental complicación, ya que

agrava el déficit visual. En ocasiones se manifiesta por estrabismo (desviación de uno de los ojos de su

dirección normal, por lo que los ejes visuales no pueden dirigirse en un mismo tiempo al mismo punto), o

por nistagmus (espasmos de los músculos del ojo que produce movimientos oculares rápidos e

involuntarios) En un 40% de los casos, se produce desprendimiento de retina.

6.2- EL GEN: RS1

El gen asociado a esta enfermedad se denomina RS1 y fue identificado por clonación posicional.

Está situado en el brazo corto del cromosoma X (Xp22.2-p22.1), consta de 6 exones y codifica una proteína

de 224 aminoácidos denominada Retinosquisina (Sauer GC et al., 1997). Este gen contiene una región

altamente conservada en los exones 4-6, conocida como dominio discodín, como se verá más adelante.

RS1 se expresa principalmente en los fotorreceptores, en las células bipolares y en los axones más distales

de las células de Müller (Wu WW et al., 2005).

Hasta el momento se han identificado más de ciento treinta mutaciones en este gen

(www.hgmd.org; www.dmd.nl/rs), la mayoría de ellas en los exones 4-6 que codifican el dominio discoidín,

mientras que la mayor parte de las mutaciones que ocurren en la región de los exones 1-3 producen una

terminación prematura de la transcripción, originando una proteína truncada o ausencia de la proteína.

Figura I.11: Diagrama del gen RS1 y sus seis exones. Los exones 4-6 (sombreados) comprenden el dominio discoidín.

Las barras grises (encima) indican la frecuencia relativa de mutaciones dentro de cada exón (Tantri et al., 2004)

6.3- LA PROTEÍNA: RETINOSQUISINA

La Retinosquisina se expresa y se secreta a nivel de los fotorreceptores, en las células bipolares y

en los procesos distales de las células de Müller, en forma de un complejo proteico formado por varias

subunidades. La proteína secretada se asocia, por un lado, con la superficie de conos y bastones a nivel

del segmento interno, de la capa nuclear externa y de la capa plexiforme externa y, por otro lado, se une a

la superficie de las células bipolares dentro de la capa nuclear interna y de la capa plexiforme interna de la

retina (Reid SN et al., 2003).

21

http://www.hgmd.org/

I- Introducción

La característica estructural más destacada de la proteína es el dominio discoidín, formado por 157

aminoácidos (exones 4-6 de RS1), que suponen el 75% de la cadena polipeptídica procesada (Sauer GC et

al., 1997). Los dominios discoidín están presentes en una gran variedad de proteínas de membrana y

extracelulares, que intervienen en procesos de señalización y de adhesión celular (Factor V y Factor VIII

involucrados en la coagulación sanguínea; Neuropilinas 1 y 2, que intervienen en la regeneración y

degeneración del sistema nervioso, etc) (Baumgartner S et al., 1998; Vogel, 1999).

Las proteínas que contienen esta estructura contienen resíduos de cisteína al principio (Cys63) y al

final (Cys 219) del dominio. Ambos aminoácidos se sitúan próximos entre sí y son necesarios para el

correcto plegamiento de la proteína, ya que forman un puente disulfuro intramolecular (Wu WW & Molday

RS, 2003). Además, este dominio tiene tres resíduos de cisteína adicionales:

- Cys110 y Cys 142, que se supone que forman otro enlace disulfuro, estabilizando estas regiones de la

proteína para su inserción en la bicapa lipídica;

- Cys83: no aparece en el dominio discoidín de otras proteínas y aparece muy enterrado dentro de la

Retinosquisina, por lo que se especula que alteraciones en esta posición deben tener un bajo efecto en el

plegamiento, en la secreción o en el ensamblaje de la proteína.

Recientemente, se ha analizado la estructura oligomérica de la Retinosquisina para comprender las

funciones de esta proteína extracelular en la adhesión de las células retinianas y cómo las mutaciones en

RS1 producen Retinosquisis (Wu W et al., 2005). Este estudio ha permitido determinar que la estructura de

esta proteína es un octámero constituído por ocho subunidades idénticas, formado por la unión de cuatro

dímeros. Todas las uniones se establecen mediante puentes disulfuro, de la siguiente manera:

- puentes intermoleculares entre los resíduos Cys 59∼Cys223: mantienen la formación del octámero;

- puentes intermoleculares entre resíduos Cys40∼Cys40: forman dímeros entre dos subunidades

adyacentes o entre dos subunidades opuestas. (Figura I.12).

Figura I.12: A) Representación esquemática de la Retinosquisina procesada (sin el péptido señal de 23 aminoácidos).

La región RS1 (círculo) comprende los primeros 39 resíduos de la proteína y 5 resíduos del extremo C-terminal. El

dominio discoidín se representa en la elipse, las cisteínas involucradas en enlaces disulfuro intramoleculares (azules) e

intermoleculares (negras o grises) también se muestran.

B) Estructura del octámero: representados en gris, los enlaces disulfuro Cys40 forman dímeros entre subunidades

adyacentes (en este modelo, no se descarta que se puedan establecer entre subunidades opuestas); los enlaces

Cys59∼Cys223 que mantienen la formación del octámero se muestran en negro. (Wu et al., 2005).

22

I- Introducción

Asimismo, se ha especulado que el proceso de secreción de la Retinosquisina debe ser el

siguiente: la secuencia líder inicia la inserción y traslocación de la cadena peptídica naciente a través de la

membrana del retículo endoplasmático (RE). Una señal peptidasa en el lumen del RE corta la secuencia

líder en la Ser23, dando lugar al polipéptido procesado. El plegamiento del dominio discoidín ocurre con la

formación de los enlaces intramoleculares Cys63∼Cys219 y Cys110∼Cys142, mediante puentes disulfuro.

A continuación, se establecen los puentes disulfuro intermoleculares Cys40∼Cys40 y Cys59∼Cys223 entre

los segmentos 5´y 3´ flanqueantes al dominio discoidín, para formar el octámero (Figura I.12).

Figura I.13: Secreción de la Retinosquisina. En este esquema se representa la inserción de la proteína en el retículo

endoplasmático (RE), el ensamblaje de los monómeros mediante puentes disulfuro y su secreción (Wu et al., 2005).

También se han realizado estudios con modelos estructurales del dominio discodín, con el fin de

predecir cuál es el efecto de las mutaciones en el gen RS1 (Wang T et al., 2006). En este caso, los autores

concluyeron que existen tres mecanismos moleculares diferentes que producen XLRS: mutaciones que

interfieren en la secreción, mutaciones que interfieren en la oligomerización y mutaciones que permiten la

secreción y oligomerización, pero que interfieren en la función de la proteína.

En conclusión, se produce retención intracelular de la mayoría de las proteínas mutantes, lo que explicaría

porqué la severidad de la enfermedad no es específica de la mutación responsable, es decir, no existe

correlación entre el genotipo y el fenotipo, como ya se había descrito con anterioridad (Wang T et al., 2002).

23

I- Introducción

7- ENFERMEDAD DE STARGARDT (STGD) / FUNDUS FLAVIMACULATUS (FFM)

La Enfermedad de Stargardt (STGD; MIM #248200) es una forma de degeneración macular juvenil,

con un patrón de herencia autosómico recesivo, descrita por primera vez por Karl Stargardt en 1909. Se

calcula que la prevalencia de la Enfermedad de Stargardt es de 1 entre 10.000, por lo que está considerada

como la distrofia macular hereditaria más común. De hecho, la frecuencia de portadores en la población se

ha estimado en torno a un 2% (Blacharski PA, 1988).

7.1- RASGOS CLÍNICOS

Esta distrofia macular se presenta entre la primera y la segunda década de vida, produciendo una

severa disminución de la agudeza visual central mientras que la visión periférica es normal. En la mayor

parte de los casos, los pacientes presentan una agudeza visual normal durante su infancia (Zhang K et al.,

1995; Allikmets R et al., 1997; Allikmets R, 1997b).

Desde un punto de vista histopatológico, el rasgo más característico es la aparición de acúmulos de

lipofucsina que se depositan en forma de motas amarillentas hacia el polo posterior del EPR. En los

estadíos más avanzados, se observa una gran zona atrófica en la mácula. Otros hallazgos oftalmológicos

muestran, mediante AFG, un fenómeno conocido como coroides oscura o silente: la circulación retiniana

destaca considerablemente sobre una coroides oscura, debido a que la fluorescencia de los capilares se ve

enmascarada por los acúmulos de pigmento que contienen las células del EPR. El electrorretinograma

(ERG) y el electroculograma (EOG) pueden ser normales en estadíos tempranos, pero se muestran

moderadamente alterados en las formas más avanzadas de la enfermedad (Aaberg TM, 1986).

Una variante de la STGD es el fundus flavimaculatus (FFM). Este término se utilizó por primera vez

para describir un fondo de ojo con motas blanco-amarillentas de forma irregular, que aparecían dispersas

por todas partes (Franceschetti A & Francois J, 1965). Por lo general, se considera que el paciente padece

STGD cuando los acúmulos de lipofucsina se disponen hacia el polo posterior del EPR y la pérdida de

visión comienza en primera o segunda década de vida. Sin embargo, el término FFM se emplea cuando

estos acúmulos están dispersos por todo el fondo de ojo, la enfermedad tiene un comienzo más tardío y

existe cierta preservación de la agudeza visual.

Figura I.14: A) Fondo de ojo de un paciente con Enfermedad de Stargardt (STGD); mácula atrófica y con acúmulos

amarillos de pigmento a su alrededor. B) AFG (angiofluoresceingrafía) que muestra la coroides oscura del paciente y la

fluorescencia de los acúmulos de lipofucsina; también se aprecia el patrón típico en “ojo de buey“.

24

I- Introducción

25

7.2- EL GEN: ABCA4

El primer locus genético para la Enfermedad de Stargardt se localizó en el brazo corto del

cromosoma 1 (1p21-p13) (Kaplan J et al.; 1993). Cuatro años más tarde se identificó el gen responsable de

enfermedad, ABCR (retina-specific ABC transporter), y alternativamente se denominó ABCA4 (ATP binding

cassette [ABC] transporter; Allikmets R et al., 1997a). Este gen consta de 50 exones que se traducen en su

totalidad. Tiene una pauta abierta de lectura de 6.819 pares de bases que generan un polipéptido de 2.273

aminoácidos, denominado RmP (Rim protein; “proteína periférica”).

También se han descrito formas dominantes de la enfermedad (Stargardt-like disease), cuyos

genes responsables se encuentran en el cromosoma 6 (STGD3, ELOVL4; Elongation of Very Long Chain

Fatty Acids-like 4; Stone EM et al., 1994), en el cromosoma 13 (STGD2; Zhang K et al., 1994) y en el

cromosoma 4 (STGD4; Kniazeva M et al., 1999).

7.3- VARIANTES ALÉLICAS DE ABCA4

7.3.1- VARIANTES ALÉLICAS

Las mutaciones en ABCA4 se han visto asociadas a diferentes distrofias de retina, que incluyen:

- Enfermedad de Stargardt autosómica recesiva (arSTGD) / Fundus flavimaculatus (FFM) (Allikmets R et al.,

1997a)

- Retinosis Pigmentaria autosómica recesiva (arRP) (Martinez-Mir A et al., 1998)

- Distrofia de conos y bastones autosómica recesiva (arDCB) (Cremers FP et al., 1998)

- Degeneración macular asociada a la edad (DMAE) (Allikmets R et al., 1997).

Con el fin de explicar este espectro de fenotipos oftalmológicos, los investigadores propusieron un

modelo que explicaba la severidad de las enfermedades producidas por ABCA4 basándose en la actividad

residual de la proteína que generaban las mutaciones en este gen (Maugeri et al., 1999). Así, se

clasificaron los alelos mutantes de ABCA4 en “suaves”, “moderados” o “severos” y se estableció una

correlación entre diferentes combinaciones de alelos y diferentes fenotipos:

- Los pacientes con dos alelos “moderados” o la combinación de un alelo “suave” y otro “severo”,

conservan cierta actividad residual de la proteína y desarrollan STGD.

- Las DCB o la RP, son el resultado de un genotipo con dos alelos “severos” o la combinación de un alelo

“severo” y otro “moderado”. En estos fenotipos, la actividad de la proteína se ve muy reducida o es

inexistente.

- Por último, aquellos pacientes portadores de un solo alelo mutante y un alelo sano tienen un elevado

riesgo de desarrollar DMAE.

I- Introducción

Actividad residual de

ABC A4

Fenotipo Normal Normal DMAE STG STG arDCB RPARalelo 1 moderada severa moderada severa severa severa

alelo 2 moderada suave moderada severa

Figura I.15: En este gráfico se representa la relación inversamente proporcional que existe entre la severidad de la

mutación y la actividad residual de la proteína RmP (Maugeri et al., 1999).

Los estudios mutacionales de ABCA4 sugieren que quizá se trate del gen más polimórfico, hasta el

momento, implicado en distrofias de retina (Lewis RA et al., 1999; Rivera A et al., 2000). De hecho, en

ABCA4 se han identificado más de cuatrocientas alteraciones, desde mutaciones puntuales a deleciones de

varios exones (www.hgmd.org). La mayoría de los cambios reportados son mutaciones que provocan

cambio de aminoácido (Briggs CE et al., 2001; Gerth C et al., 2002; Yatsenko AN et al., 2001).

Los alelos causantes de enfermedad suponen entre el 66% y el 80% de los cromosomas asociados a

Stargardt estudiados (Yatsenko AN et al., 2001; Shroyer NF et al., 2001). Algunas de estas mutaciones se

han encontrado en elevada frecuencia en determinadas poblaciones de Europa y Estados Unidos,

sugiriendo un efecto fundador (Maugeri et al., 1999).

7.3.2- FENOTIPOS ASOCIADOS A DEFECTOS EN ABCA4

Distrofia de conos y bastones (DCB)

El diagnóstico de las DCB se realiza cuando el paciente presenta visión central disminuída o

borrosa, sin presentar ceguera nocturna. El fondo de ojo se caracteriza por presentar una mácula en “ojo de

buey” o con alteraciones granulares en el EPR, pudiendo existir o no cierta afectación de la retina periférica.

El campo visual presenta escotoma central, mientras que el campo periférico es normal o muestra una

constricción moderada. El trazado del ERG puede mostrar una respuesta de conos reducida o abolida, en

comparación con la respuesta menos alterada de los bastones, o puede reflejar una alteración por igual en

ambos sistemas de fotorreceptores.

Retinosis Pigmentaria (RP)

Aunque las características clínicas de la RP varían de unos pacientes a otros e incluso entre los

miembros afectados de una misma familia, la tríada clínica clásica consiste en afectación binocular con

ceguera nocturna (hemeralopia), reducción concéntrica del campo visual (“visión en túnel”, “visión en cañón

de escopeta”), pigmentación periférica del fondo del ojo con aspecto en espículas óseas u osteoclastos

(Birch DG et al., 1999; Klevering et al., 2004).

26


I- Introducción

Distrofia macular asociada a la edad (DMAE)

Es la primera causa de pérdida severa de visión entre la población de edad avanzada en el mundo

occidental (Allikmets et al., 1997). Es una enfermedad multifactorial, en la que interviene un componente

ambiental (tabaco, dieta, nivel de colesterol) y un componente genético (un alelo mutante en gen ABCA4,

polimorfismos en el gen del factor H del complemento; ambos en el cromosoma 1).

Por lo general, afecta a personas mayores de cincuenta años, aunque la incidencia aumenta

considerablemente a partir de los setenta años de edad. Se estima que un 30% de la población de esta

franja de edad padece alguna forma previa de la enfermedad, denominada MAE (Maculopatía asociada a la

edad), que produce alteraciones -percepción de manchas por la mañana, cuando el ojo se ha

acostumbrado a la oscuridad del sueño-, debido a la acumulación de drusas en la retina. Puede que el

proceso se detenga en esta fase o que evolucione hacia una de las dos formas de DMAE:

- forma húmeda: se produce de manera repentina, por la formación de neovasos;

- forma seca: se produce una evolución más lenta y progresiva, en la que las drusas se van fundiendo y

forman zonas de atrofia.

Figura I.16: Fondos de ojo correspondientes a los distintos fenotipos producidos por mutaciones en ABCA4, además de

la STGD: A) Distrofia de conos y bastones; B) Retinosis Pigmentaria; C) Distrofia Macular Asociada a la Edad.

7.4- LA PROTEÍNA: ABCA4/RmP

La proteína codificada por el gen ABCA4 también recibe el nombre de Rim Protein (RmP) porque

aparece en los bordes (en inglés rims) de los discos del segmento externo de los fotorreceptores. ABCA4

es un miembro de la superfamilia de los transportadores de tipo ABC (adenosin triphosphate-binding

cassette). Muchas de estas proteínas utilizan ATP para transportar sustratos -péptidos, lípidos o sustancias

hidrofóbicas- a través de las membranas celulares (Azarian Sm & Travis GH, 1997).

Otro miembro bien conocido de esta familia, es la proteína codificada por el gen de la fibrosis quística,

CFTR.

27

I- Introducción

Los típicos transportadores ABC consisten en un polipéptido que contiene dos dominios

transmembrana y dos dominios de unión a nucleótidos (NBDs; Nucleotide-binding domains). Los NBDs son

hidrofílicos, constan de unos noventa-ciento diez aminoácidos y están altamente conservados,

compartiendo un 30-50% de homología entre los distintos transportadores. Cada NBD contiene dos

motivos, el motivo “Walker A” y el motivo “Walker B”, que son comunes dentro de la categoría de proteínas

de unión a nucleótidos. El rasgo distintivo entre los transportadores ABC es el motivo, que contiene la

secuencia consenso “LeuSerGlyGlyGln” (Stefkova J et al., 2004).

Figura I.17: Transportador ABC completo, con 2 dominios transmembranales y 2 NBDs (Stefkova J et al., 2004).

ABCA4 es un transportador de tipo flipasa (transmembranal), localizado en la membrana intradiscal

del segmento externo de los fotorreceptores. En condiciones normales, la proteína RmP transporta un

compuesto denominado todo-trans-retinal o N-RPE (N-retinilideno-fosfatidiletanolamina), desde la

membrana intradiscal al citoplasma del fotorreceptor, mediante la hidrólisis del enlace existente entre el

todo-trans-retinal y la fosfatidiletanolamina (Sun H et al., 2000). En el citosol, el todo-trans-retinal se reduce

a todo-trans-retinol, que atraviesa la membrana plasmática del segmento externo y es capturado por las

células del EPR, donde se reconvierte en 11-cis-retinal (cromóforo común a los cuatro tipos de

fotopigmentos). Por tanto, esta proteína transporta derivados de la vitamina A en los segmentos externos

de los fotorreceptores después de su exposición a la luz.

En ausencia de la proteína RmP, su sustrato comienza a acumularse en el espacio intradiscal y al

unirse una segunda molécula de N-RPE, se genera el compuesto A2PE (N-retinilideno-N-retinil-

fosfatidiletanolamina).

Por último el A2PE se hidroliza, originando un fluoróforo de lipofucsina denominado A2E (N-

retinilideno-N-retinil-etanolamina), cuya acumulación es tóxica para las células del EPR, que son las

encargadas de digerir los discos del segmento externo de los fotorreceptores (Eldred GE & Lasky MR,

1993). De forma secundaria al fallo de estas células, se produciría la muerte de los fotorreceptores.

28

I- Introducción

Figura I.18: Ciclo de los retinoides. Para el correcto funcionamiento de la vía visual, la molécula de todo-trans-retinal

debe salir del segmento externo del fotorreceptor transportada por la proteína RmP, codificada por el gen ABCA4.

8- PERSPECTIVAS DE FUTURO: TRATAMIENTOS

8.1- REMODELACIÓN DE LA RETINA EN EL PROCESO DEGENERATIVO

Estudios recientes en ratas con mutaciones en genes que se expresan tanto en fotorreceptores

(FR) como en células del epitelio pigmentario (EPR), han permitido observar que cuando comienza la

degeneración y muerte de los FR, el resto de las neuronas involucradas en la vía visual tratan de establecer

nuevas conexiones sinápticas con las células que no están dañadas (Cuenca N et al., 2004; Cuenca N et

al., 2005). Este hecho provoca una remodelación de la estructura de la retina, que es importante conocer

para poder aplicar los futuros tratamientos de forma eficaz. El proceso degenerativo estudiado se produce

en tres fases:

- Fase 1: los FR sufren un período de estrés, en el que se produce la desorganización de sus contactos

sinápticos;

- Fase 2: se produce la muerte gradual de los FR y puede iniciarse la muerte de alguna neurona retiniana;

- Fase 3: las células neuronales se mueren progresivamente, incluyendo las células ganglionares, y las

células de Müller rellenan los espacios dejados por éstas. A su vez, las células del EPR migran e invaden

las retina. La red vascular aparece totalmente modificada.

Según la fase de la enfermedad, se deberán utilizar estrategias terapéuticas distintas. Si la

enfermedad se encuentra en la fase 1 y 2, se podrán emplear estrategias para ralentizar la degeneración,

como son la inyección de factores neurotróficos, células encapsuladas o estrategias para curar la

29

I- Introducción

30

enfermedad, como son los transplantes retinianos y la terapia génica. Si la degeneración se encuentra en

fase 3, se podrán utilizar transplantes retinianos, incluyendo células y visión artificial.

8.2- TERAPIA GÉNICA

La terapia génica es una nueva forma de tratamiento de las enfermedades, que consiste en la

introducción en las células de material genético -genes completos y otro tipo de ácidos nucleicos- para

corregir un problema biológico. La base de la terapia génica es que se puede corregir la enfermedad

proporcionando a las células la información genética necesaria para que por sí mismas sinteticen la

proteína adecuada, en lugar de administrarla directamente, como sucede con los fármacos convencionales.

Esto permitiría en numerosos casos atacar la causa de la enfermedad, en lugar de limitarse a tratar sus

síntomas.

Las posibles aplicaciones de la terapia génica en el futuro tratamiento de las distrofias de retina

(DR), son las siguientes:

- deficiencias enzimáticas: en estos casos, el objetivo consistiría en implantar una copia normal del gen

defectuoso en un grupo pequeño de células retinianas, de tal forma que su producto proteico fuese

secretado por estas células a los fotorreceptores adyacentes.

- sustitución génica: en algunas DR, la terapia génica consistiría en reemplazar el gen defectuoso

directamente en los fotorreceptores. La transferencia del gen normal se realizaría por medio de un vector,

que reconociese de forma altamente específica al fotorreceptor, como célula huésped.

Hasta el momento, los vectores más eficaces son los de tipo viral. Para construir un vector viral de terapia

génica, se deben eliminar los genes del virus (fundamentales para que pueda multiplicarse) y sustituirlos

por el gen terapéutico. De esta forma, se aprovecha la eficacia del virus para entrar en las células y se

evitan los riesgos de su diseminación.

- factores neurotróficos: protegen a las neuronas de la muerte celular, aportando nutrientes e inhibiendo el

proceso de apoptosis que se origina en la retina. El problema que se plantea es que es necesaria una

administración continuada de estos factores, lo que puede ocasionar efectos secundarios adversos.

Además, resulta difícil atravesar la barrera sanguínea retinal. Con terapia génica, los factores neurotróficos

se podrían aplicar en dosis fisiológicas y se podrían evitar los efectos secundarios.

Hoy en día, se está experimentando con terapia de células encapsuladas, que consiste en implantar

en la retina bolitas de material sintético poroso que contienen células del epitelio pigmentario transformadas

genéticamente para producir cantidades masivas del factor neurotrófico.

I- Introducción

31

8.3- RETINAS ARTIFICIALES

Los investigadores Alan y Vincent Chow han inventado la llamada Retina Artificial de Silicio

(ASRTM), un microchip que mide menos de una décima de pulgada y que es menos grueso que un cabello

humano. El ASRTM contiene tres mil quinientas células solares microscópicas que convierten la luz en

impulsos eléctricos. El propósito de este chip es reemplazar los fotorreceptores dañados de la retina, ya

que intentan sustituir la estimulación que realizan los fotorreceptores sobre sus células diana, como son las

células horizontales y las bipolares.

La cirugía consiste en una minúscula incisión en la córnea, que permite situar el implante tras la

retina. Los primeros implantes de retinas artificiales, en pacientes con diversos grados de ceguera, ya se

han completado. De momento, únicamente se están evaluando la seguridad y la efectividad del chip,

colocando una versión reducida de éste en un lateral de la retina. Si los implantes son tolerados por el ojo,

se realizarán nuevas operaciones a mayor escala, que podrían devolver la visión incluso a pacientes en

estadíos muy avanzados de la enfermedad.

8.4- CÉLULAS MADRE

Son aquellas células dotadas simultáneamente de la capacidad de autorrenovación (es decir,

producir más células madre) y pluripotencia o totipotencia, es decir, de originar células hijas comprometidas

en determinadas rutas de desarrollo, que finalmente se diferenciarán en tipos celulares especializados. En

el contexto de la actual investigación, se pretende obtener células madre que se mantengan como tales en

cultivo en el laboratorio y que, bajo determinados estímulos, puedan conducir a poblaciones de células

diferenciadas.

Las células madre embrionarias de ratón (y quizá las humanas), son excelentes para manipulación

genética, y pueden realizar recombinación homóloga, por lo que se podría ensayar incluso terapia génica

sustitutiva, reemplazando genes anómalos por versiones correctas. Esta técnica consistiría en transferir un

núcleo somático a un óvulo y desarrollar el blastocisto artificial, a partir del cual se aislarían las células

madre y se manipularían por ingeniería genética para corregir el defecto.

También se puede intentar la manipulación genética de células madre no embrionarias: se ha visto

que células madre neuronales de fetos humanos fueron manipuladas genéticamente y demostraron su

capacidad de secretar productos terapéuticos, por lo que muestran un potencial para corregir defectos

metabólicos en neuronas y glía. En este sentido, se ha destacado la utilidad de las células madre de retina,

así como la aparición de una nueva metodología para emplear vectores no víricos en terapia génica a

través de los denominados inmunoliposomas.

Cristalografía de Rayos X del esqueleto azúcar-fosfato del ADN.

Rosalind Franklin, 1952.

II‐ Justificación, Hipótesis de Trabajo y Objetivos

32

II- Justificación, Hipótesis de Trabajo y Objetivos

II‐ JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS

Las distrofias hereditarias de retina son un grupo muy heterogéneo, tanto genética como

clínicamente, de enfermedades oftalmológicas degenerativas. Hasta el momento, el tratamiento de estas

retinopatías aún no es posible. El estudio molecular de los genes responsables resulta fundamental, ya que

permitirá:

- establecer la confirmación molecular del diagnóstico clínico previamente establecido;

- determinar el patrón de herencia con el que se transmite la patología y ofrecer una prevención eficaz a

través de un asesoramiento genético adecuado y

- conocer el defecto genético causante de enfermedad, para poder aplicar el tratamiento preciso en el

futuro.

Los objetivos planteados en este trabajo han sido los siguientes:

1- Caracterizar, desde el punto de vista genético y molecular, a los pacientes clínicamente diagnosticados

de Enfermedad de Norrie, Retinosquisis, Enfermedad de Stargardt y formas asociadas.

2- Validar la técnica de genotipado empleada en el estudio del gen ABCA4 (microarray).

3- Determinar el origen parental de las mutaciones mediante el estudio genético familiar.

4- Establecer una correlación genotipo-fenotipo.

5- Facilitar al paciente un asesoramiento genético adecuado.

6- Contribuir a los estudios epidemiológicos de las distrofias de retina estudiadas.

33

“El Hombre de Vitruvio”

Leonardo da Vinci, alrededor de 1490.

III- Pacientes y Métodos

34


III- PACIENTES Y MÉTODOS

1- PACIENTES Y FAMILIAS ESTUDIADAS

1.1- PROCEDENCIA DE LOS PACIENTES

El reclutamiento de pacientes y familiares que han participado en este estudio se realizó a través de

la Red Española de Investigación en Distrofias de Retina (EsRetNet) -constituida por seis grupos

multidisciplinares de investigación: Fundación Jiménez Díaz (Madrid), Hospital San Pablo (Barcelona),

Hospital de Tarrasa (Tarrasa), Hospital La Fe (Valencia), Hospital Virgen del Rocío (Sevilla) y Universidad

de Vigo (Vigo)- y de otros hospitales externos.

Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes que participaron en el estudio, de

acuerdo con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki (www.wma.net).

1.2- CONSULTA Y CUESTIONARIO INICIAL

El diagnóstico de los pacientes fue llevado a cabo por genetistas y oftalmólogos experimentados.

Habitualmente y con el fin de obtener la mayor cantidad de información posible, se entrega al paciente un

cuestionario que debe cumplimentar. En él se recogen los datos personales y familiares del afecto, así

como el registro de cuándo comenzó a padecer los primeros síntomas.

La información recogida en el cuestionario y en la consulta, así como los datos clínicos obtenidos en el

examen oftalmológico, serán de gran utilidad para elaborar una historia clínica completa y orientar el

estudio del gen responsable de su enfermedad.

1.3- CLASIFICACIÓN DE LAS FAMILIAS ESTUDIADAS

El estudio clínico y molecular se ha realizado en un total de 169 familias, que fueron clasificadas de

acuerdo con los siguientes criterios clínicos:

- Los pacientes con Enfermedad de Norrie o con vitreorretinopatía exudativa se diagnosticaron según los

criterios oftalmológicos establecidos por Warburg (Warburg M, 1975), la presencia o no de síntomas

sistémicos y su evolución. El diagnóstico diferencial incluye el “pseudoglioma” que puede ser debido a

diversas causas como inflamación, hemorragia, trauma, neoplasia u otra malformación congénita.

- El diagnóstico de pacientes afectos de Retinosquisis se fundamenta en signos oftalmoscópicos que

incluyen microquistes perifoveolares radiales (patrón en “rueda de carro”), opacidad de vasos retinianos,

lesiones en la retina periférica y alteraciones en el cuerpo vítreo (“velos vítreos”). El ERG muestra

disminución de la onda “b”. El diagnóstico diferencial incluye la RP típica y la enfermedad de Goldmann-

Favre (presencia de cuerpo vítreo licuificado con presencia de velos vítreos, edema macular, degeneración

pigmentaria de la retina con hemeralopia y ERG extinguido), los traumatismos y el desprendimiento de

retina antiguo.

35

http://www.wma.net/


- Los pacientes con Enfermedad de Stargardt se seleccionan según los siguientes criterios oftalmológicos:

pérdida de la visión central, reducción de la agudeza visual a una edad temprana, pérdida del reflejo foveal,

apariencia granular de fóvea, estrías alrededor de la lesión macular, atrofia coroidal en el centro de la retina

y esclerosis de vasos coroidales, cambios en el epitelio pigmentario de la retina. Cuando los acúmulos de

pigmento se localizan hacia el polo posterior de la retina, se denomina Fundus flavimaculatus.

- El diagnóstico de la distrofia de conos y bastones se basa en los siguientes criterios: pérdida de la visión

central con historia de ceguera nocturna, severa reducción de la agudeza visual (20/100 que empeora con

la edad) y alteración de la visión de los colores. Los hallazgos funduscópicos muestran degeneración

macular, alteraciones en la retina periférica que incluyen acúmulos de pigmento o afinamiento del epitelio

pigmentario. La disminución de la respuesta del ERG se produce primero en los conos y posteriormente en

los bastones.

- La Retinosis Pigmentaria se diagnostica en pacientes que desarrollan ceguera nocturna a una edad

temprana con reducción progresiva y concéntrica del campo visual. El fondo de ojo presenta vasos

retinianos disminuidos, despigmentación del EPR, pigmento en forma de osteoclastos (espículas óseas) y

palidez papilar. La respuesta del ERG disminuye en los bastones y posteriormente en los conos, llegando a

estar abolida en la etapa final de la enfermedad. (Birch DG et al., 1999; Klevering BJ et al., 2004).

- Los pacientes con distrofia macular autosómica dominante presentan una herencia autosómica dominante

(a diferencia de la STGD, DCB y RP, que son autosómicas recesivas) y las siguientes características

oftalmológicas: pérdida de la agudeza visual central y anomalías maculares simétricas. La edad de

comienzo es variable, aunque generalmente se produce durantes las dos primeras décadas de vida.

Las familias presentadas en este trabajo, los genes implicados y los fenotipos asociados se

muestran en la siguiente tabla:

Gen estudiado Nº familias Nº familias vs. fenotipo Diagnóstico clínico

2 Enfermedad de Norrie NDP 11

9 Vitreorretinopatía exudativa

RS1 29 29 Retinosquisis

74 Enfermedad de Stargardt

28 Distrofia de conos y bastones

ABCA4 17 Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva 129

3 Fenotipo diverso

7 Distrofia macular autosómica dominante

Total 169

Tabla III.1: Clasificación de las familias estudiadas en este trabajo.

36


a) Gen NDP (Retinopatías ligadas al cromosoma X):

- Enfermedad de Norrie (ND): ANF-7, ANF-8.

- Vitreorretinopatía exudativa familiar (VREF): XLDM-46, ND-1, ND-2, ND-4, ND-5, ND-6, ND-10, ND-12,

ND-14.

b) Gen RS1 (Distrofia Macular ligada al cromosoma X):

- Retinosquisis juvenil: XLRS-29, XLRS-30, XLRS-43, XLRS-44, XLRS-45, XLRS-53, XLRS-55, XLRS-56,

XLRS-70, ONCE-62, XLRS-93, XLRS-95, XLRS-97, XLRS-101, XLRS-102, XLRS-103, XLRS-104, XLRS-

107, XLRS-108, XLRS-112, XLRS-114, RP-130bis, RP-162bis, XLRS-124, XLRS-143, XLRS-144, XLRS-

145, XLRS-161, XLRS-185.

Gen ABCA4c) : (Distrofias Maculares Autosómicas Recesivas -STGD, DCB-, Retinosis Pigmentaria

Autosómica Recesiva y Distrofia Macular Autosómica Dominante):

- Enfermedad de Stargardt (STGD): ARDM-12, ARDM-14, ARDM-15, ARDM-16, ARDM-17, ARDM-22,

ARDM-31, ARDM-38, ARDM-39, ARDM-40, ARDM-47, ARDM-52, ARDM-57, ARDM-58, ARDM-60, ARDM-

61, ARDM-62, ARDM-63, ARDM-64, ARDM-65, ARDM-66, ARDM-67, ARDM-68, ARDM-69, ARDM-71,

ARDM-72, ARDM-75, ARDM-76, ARDM-77, ARDM-78, ARDM-81, ARDM-82, ARDM-83, ARDM-84, ARDM-

88, ARDM-90, ARDM-91, ARDM-96, ARDM-100, ARDM-110, ARDM-111, ARDM-116, ARDM-117, ARDM-

118, ARDM-119, ARDM-122, ARDM-123, ARDM-125, ARDM-128, ARDM-129, ARDM-130, ARDM-131,

ARDM-135, ARDM-137, ARDM-138, ARDM-139, ARDM-140, ARDM-142, ARDM-146, ARDM-148, ARDM-

151, ARDM-153, ARDM-155, ARDM-156, ARDM-158, ARDM-160, ARDM-162, ARDM-163, ARDM-164,

ARDM-165, ARDM-167, ARDM-168, ARDM-170, SRP-773.

- Distrofia de conos y bastones (DCB): ARDM-49, ARDM-79, ARDM-85, ARDM-86, ARDM-99, ARDM-126,

ARDM-133, ARDM-134, ARDM-159, ARDM-169, ARDM-174, ARDM-176, ARDM-192, ARDM-195, RP-55,

RP-267, RP-577, RP-586, RP-657, RP-719, RP-763, RP-827, RP-828, RP-959, RP-964, RP-965, RP-971,

RP-973.

- Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva (RPAR): ARDM-54, ARDM-89, RP-82, RP-417, RP-578, RP-

586, RP-700, RP-716, RP-766, RP-775, RP-813, RP-818, RP-834, RP-854, RP-857, RP-927, RP-937.

- Fenotipo diverso (en la misma familia, existen casos de STGD, DCB o RPAR): RP-280, RP-315, RP-532.

- Distrofia macular autosómica dominante: ADDM-59, ADDM-74, ADDM-80, ADDM-92, ADDM-94, ADDM-

105, ADDM-106.

Los árboles genealógicos se muestran a continuación:

37


Gen NDP: Familias con Retinopatías ligadas al cromosoma X -ND, VERF-

I:1 I:201/746

II:101/745

II:2SG-2651

V89fs

ANF-7

I:1 I:2

II:2SG-2658

II:3II:1

ANF-8

I:201/702

II:101/700

II:301/534

II:501/699

II:2

III:101/535

II:4

III:201/695

III:301/696

I:101/701

XLDM-46

I:101/753

II:101/752

II:301/751

II:2

I:201/754

ND-1

IV:5

V:603/133

V:403/141

III:1 III:203/130

IV:103/134

IV:403/139

IV:603/131

IV:2

V:1 V:2

IV:3

V:303/140

V:503/132

II:1 II:2

I:1 I:2

II:3 II:5II:4

III:4 III:5 III:6 III:8III:3

IV:703/599

IV:803/600

IV:1003/598

IV:11

III:7

IV:12 IV:15IV:9

V:7 V:8

IV:14IV:13

V:9 V:10 V:11

ND-2

38


ND-10

I:1

II:201/1221

II:301/1223

II:6II:1

III:201/1222

II:4

III:3 III:4III:101/1220

I:2

II:503/553

I:1

05/820

I:2

05/848

II:2

05/817

II:3

05/849

II:1

05/821

III:1 III:2

ND-12

I:1 I:2

II:2

05/1148

II:3

05/1149

II:5

05/1146

II:1

III:1

05/930

III:2

II:4

III:3

05/1151

III:4

05/1150

ND-14

I:1 I:2

II:2

2762

II:3

2761

II:1

III:1

2763

III:2

2764

III:3

2765

III:5

2766

III:7

2768

III:9

2770

III:11

2771

III:13

2773

III:4

2767

IV:1

2775

IV:2

2776

IV:3

2777

III:6

2769

IV:4

2778

IV:5

2779

III:8

IV:6

2780

IV:7

2781

III:10

2772

IV:8

2782

III:12

2774

IV:9

2783

IV:10

2784

IV:11

2785

IV:12

2786

IV:13

2787

ND-5

I:1 I:2

II:1

04/33

ND-6

II:203/182

I:1 I:203/181

II:103/180

ND-4

39


Gen RS1: Familias con Distrofia Macular ligada al cromosoma X -Retinosquisis-

XLRS-29

XLRS-43 XLRS-44

I:102/596

II:202/46

II:1

III:101/508

III:202/47

I:202/595

I:199/685

I:2

II:299/686

II:4II:199/687

III:1 III:399/688

II:3

III:4III:299/684

I:2

II:2 II:4II:1

III:696/526

III:896/524

III:296/765

III:397/61

III:196/548

IV:196/549

IV:296/550

IV:396/417

III:4

IV:497/60

IV:597/59

IV:697/81

IV:797/82

III:596/558

IV:896/523

IV:996/528

IV:1096/551

III:7

IV:1196/527

IV:1296/525

II:3

III:996/552

III:1296/553

III:10

IV:1396/709

IV:1496/708

III:11

IV:1696/555

IV:1796/556

I:1

IV:1596/554

XLRS-30

I:1 I:2

II:2 II:3

?II:5 II:6

III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:601/22

II:4

III:7 III:8 III:9 III:10 III:11

II:7

III:12 III:13 III:14 III:15

II:1

40


I:103/943

I:203/942

II:103/986

II:203/974

II:403/940

II:303/941

XLRS-101

I:103/544

I:203/545

II:103/532

II:203/533

II:303/546

XLRS-93

I:1 I:203/746

II:103/745

II:203/748

II:303/747

XLRS-95

I:103/817

I:203/818

II:103/816

XLRS-97

I:1 I:2

II:2 II:4II:1

III:204/657

III:1

IV:1

II:3

III:304/708

III:404/707

XLRS-70

I:101/753

II:101/752

II:301/751

II:2

I:201/754

ONCE-62

I:2I:1

II:103/895

XLRS-103

I:101/1247

I:201/1249

II:101/1248

II:301/1250

II:201/1251

II:401/1252

XLRS-56

XLRS-102

I:2I:1

II:103/894

I:101/169

I:201/170

II:100/584

II:200/585

II:400/587

II:500/588

II:300/586

XLRS-55

I:1 I:201/674

II:200/718

II:1

III:200/720

III:3III:100/719

XLRS-45

I:1

II:201/1221

II:301/1223

II:6II:1

III:201/1222

II:4

III:3 III:4III:101/1220

I:2

II:503/553

XLRS-53

41


XLRS-143

I:2I:1

II:104/804

I:2I:1

II:103/148

XLRS-112

I:1

II:104/56

II:204/704

II:304/705

I:204/706

XLRS-114

I:22043

I:12042

II:12044

II:22045

II:32046

RP-130bis

I:103/632

I:299/266

II:199/267

II:299/268

II:303/631

RP-162bis

II:1 II:204/315

III:204/1632

I:1 I:2

II:304/1631

II:404/1633

III:102/1050

XLRS-124

I:103/961

I:2

II:203/962

II:103/963

III:103/964

III:203/965

XLRS-107

II:103/970

II:203/969

I:103/971

I:203/972

XLRS-108

II:2 II:304/1280

III:203/986

I:1 I:2

II:504/1279

II:4

III:404/803

III:304/1277

II:6

III:5 III:604/1276

III:104/1278

II:104/1281

II:704/1275

XLRS-144

I:2I:1

II:104/805

XLRS-145

I:2I:1

II:104/806

XLRS-161 XLRS-185

I:2I:1

II:104/1522

?II:2

06/203

I:205/1220

I:105/1219

II:105/1221

XLRS-104

42


Gen ABCA4: Familias con Distrofia Macular Autosómica Recesiva -Enfermedad de Stargardt-

I:198/308

II:298/309

II:398/331

II:11886

I:298/307

ARDM-12

I:198/333

I:298/334

II:398/336

II:298/335

II:104/1308

ARDM-14

I:199/1012

I:299/1013

II:1CG-1673

II:299/1014

ARDM-15

I:198/284

I:298/282

II:1CG-1728

II:298/283

ARDM-16

I:1 I:203/677

II:199/964

III:1

II:2

III:2

II:303/676

ARDM-31 ARDM-38

ARDM-39 ARDM-40 ARDM-47

I:202/281

I:102/282

II:197/451

ARDM-17

I:104/701

I:204/702

II:198/900

II:204/703

ARDM-22

I:102/815

I:202/814

II:200/573

II:102/813

I:102/145

I:202/146

II:102/147

II:200/1000

I:1

II:201/573

I:3

II:103/857

I:202/484

II:302/485

I:202/530

II:102/531

II:202/532

I:102/533

ARDM-60

II:2

III:102/723

II:102/721

II:302/722

I:102/724

II:402/725

I:202/726

ARDM-61

I:102/267

I:202/268

II:102/319

II:202/320

II:300/947

I:1 I:2

II:101/1170

II:2 II:3

ARDM-52

I:102/438

I:202/431

II:102/439

II:202/416

II:302/440

ARDM-57 ARDM-58

I:1 I:2

II:1 II:302/535

II:2

III:102/534

43


I:202/759

II:1 II:302/599

II:5 II:6II:4

III:1

II:202/756

III:2

I:1


I:102/1149

II:102/800

I:202/1150

ARDM-65

I:104/3

I:204/2

II:402/662

II:203/899

II:304/1

II:1

I:102/835

I:202/833

II:202/834

II:102/799

ARDM-71

I:102/644

I:202/643

II:202/642

II:102/645

ARDM-67

I:2I:1

II:102/429


I:1 I:2

II:102/766

I:1 I:2

II:102/793

ARDM-72

I:1 I:2

II:102/853

ARDM-75

I:2I:1

II:102/855

ARDM-76

I:102/1090

II:502/806

II:103/126

II:303/127

I:202/1089

II:203/169

II:402/807

?III:1

05/50

I:1 I:2

II:102/857

ARDM-77

ARDM-78

II:202/888

II:302/889

II:402/891

I:1 I:202/890

II:102/887

ARDM-81

I:103/187

I:203/188

II:103/183

II:203/189

ARDM-82

I:103/338

I:2

II:103/337

II:203/339

ARDM-83

I:105/1366

I:205/1367

II:102/915

I:102/764

I:202/763

II:102/622

II:202/766

II:402/354

II:302/765

44


I:103/344

I:203/341

II:103/340

II:203/342

II:303/343

ARDM-84 ARDM-88

ARDM-96

I:2

II:104/754

II:204/816

I:104/817

ARDM-100

I:1 I:2

II:203/378

II:103/910

I:1 I:204/609

II:104/608

II:203/749

ARDM-110

II:104/87

I:104/871

I:204/903

ARDM-90 ARDM-91

I:103/774

I:203/775

II:103/848

II:303/773

II:203/564

I:105/593

I:205/394

II:103/425

II:205/392

II:305/395

ARDM-111

I:104/577

II:303/1158

I:204/578

II:104/624

II:2

ARDM-116

I:2

II:104/142

I:1

II:204/143

II:3

I:1 I:2

II:104/144

ARDM-117 ARDM-118

I:104/561

I:204/560

II:404/183

II:104/559

II:204/616

II:304/558

I:105/1368

I:205/1369

II:304/184

II:105/1370

II:205/1371

ARDM-119

I:304/1590

I:404/1520

II:204/233

II:304/1521

II:104/1414

I:105/1256

I:205/1255

ARDM-122

I:1 I:2

II:104/264

ARDM-123

II:103/770

I:103/771

I:203/772

ARDM-125

I:1 I:205/87

II:305/86

II:105/88

II:204/387

ARDM-128

I:1 I:2

II:104/399

ARDM-129 ARDM-130

I:1 I:2

II:104/509

ARDM-131

I:104/491

I:204/492

II:104/458

II:204/493

45



I:1 I:2

II:104/542

I:104/840

II:104/839

I:204/841

I:103/1094

I:205/29

?II:1

05/30

I:104/734

II:204/674

II:104/735

I:204/733

I:104/769

II:104/771

II:204/772

II:304/768

I:204/770

ARDM-140

ARDM-142

I:104/492

I:204/943

II:904/920

II:1204/940

II:1004/941

II:1 II:2 II:4II:3 II:5 II:6 II:7 II:8 II:11 II:13

ARDM-153ARDM-146 ARDM-148 ARDM-151

I:204/849

II:104/847

I:104/848

I:1 I:2

II:104/985

I:1 I:2

II:104/1209

I:104/1331

I:204/1332

II:304/1333

II:204/1242

II:1

I:104/1361

I:204/1362

II:104/1364

II:204/1364

ARDM-155

ARDM-156

I:104/1395

I:204/1396

II:104/1394

II:204/1397

II:304/1398

ARDM-158 ARDM-160

I:1 I:2

II:104/1473

I:104/1512

I:204/1511

II:204/1509

II:104/1510

ARDM-162

I:105/15

I:205/24

II:105/123

II:205/16

II:304/1578

II:405/17

II:505/18

II:605/19

II:705/20

II:805/21

II:905/22

II:1005/23

II:1104/1610

II:1204/1609

46


ARDM-163

I:104/1557

I:2

II:104/1558

II:204/1559

II:304/1560

II:404/1561

II:504/1562

II:605/77

ARDM-164 ARDM-165 ARDM-167 ARDM-168

I:1 I:2

II:105/2

I:1 I:2

II:105/3

I:1 I:2

II:105/108

I:1 I:205/189

II:1 II:205/196

II:305/279

ARDM-169

I:105/175

I:205/174

II:205/177

II:105/176

ARDM-139

I:105/406

I:205/398

II:205/396

II:105/397

I:2I:1

II:103/207

SRP-773

Gen ABCA4: Familias con Distrofia Macular Autosómica Recesiva -Distrofia de conos y bastones-

ARDM-49

I:102/285

I:202/287

II:201/896

II:102/286

I:104/1385

I:204/1384

II:204/1388

II:304/1386

II:404/1387

II:504/1389

II:604/1390

II:102/978

ARDM-79

I:2I:1

II:103/373

ARDM-85 ARDM-86

I:1 I:204/1337

II:103/372

II:204/1336

I:1 I:2

II:103/864

ARDM-99

I:104/411

I:204/412

II:104/357

II:204/744

II:304/460

II:504/431

II:404/518

ARDM-126 ARDM-133

I:204/644

II:104/645

II:304/631

I:3 I:4

II:204/633

II:404/632

I:104-469

?III:1

06/73

?III:2

06/74

II:104/536

I:204/568

II:204/537

II:304/538

I:1

ARDM-134 ARDM-159

I:1 I:204/1515

II:104/1504

47


I:1 I:205/189

II:1 II:205/196

II:305/279

ARDM-169

I:1 I:205/490

II:105/486

II:205/487

II:301/213

II:405/488

II:505/489

II:605/573

II:705/504

ARDM-174

I:105/534

I:205/536

II:205/535

II:405/537

II:105/538

II:306/130

ARDM-176

I:1 I:2

II:105/1363

ARDM-192

I:1 I:2

II:11053

RP-55 ARDM-195

I:105/1328

I:205/1326

II:105/1299

II:205/1325

II:305/1327

RP-267

I:105/693

I:205/694

II:105/695

II:205/698

II:305/697

II:405/696

I:1 I:2

II:199/631

RP-577

RP-586

I:1 I:2

II:199/1217

RP-657

I:1 I:2

II:101/922

I:105/751

I:205/734

II:105/736

II:205/735

RP-719

I:103/671

I:203/673

II:103/672

II:203/98

RP-763

I:1 I:2

II:103/1123

RP-827 RP-828

I:1 I:2

II:103/1127

I:1 I:2

II:105/515

RP-964 RP-965RP-959 RP-973RP-971

I:1 I:2

II:105/612

I:1 I:2

II:105/548

I:1 I:2

II:105/753

I:1 I:204/1229

II:104/1226

II:304/1227

II:404/1228

II:204/1230

III:104/1231

III:204/1232

48


Gen ABCA4: Familias con Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva

ARDM-54 ARDM-89 RP-82 RP-417

RP-586

I:103/252

I:203/251

II:103/231

II:203/232

I:1 I:2

II:197/884

I:1 I:2

II:11799

I:1 I:2

II:199/703

I:1 I:2

II:199/1217

I:101/1239

II:101/1238

II:201/1265

II:301/1199

I:201/1237

RP-578 RP-700 RP-716

RP-766 RP-775

I:101/1242

I:201/1244

II:101/1246

II:201/1245

II:301/1243

II:401/1240

II:601/1241

II:501/1200

I:1 I:2

II:102/464

I:1 I:2

II:103/235

I:1 I:2

II:103/385

I:1 I:2

II:103/944

RP-813 RP-818 RP-834

I:1 I:2

II:103/908

I:1 I:2

II:104/469

RP-854 RP-857 RP-927 RP-937

I:1 I:2

II:104/1505

I:104/1299

I:204/1298

II:104/368

II:204/1626

I:104/1553

I:204/1554

II:104/1552

II:204/1555

II:304/1556

I:1 I:2

II:105/225

49


Gen ABCA4: Familias con Fenotipo diverso -STGD, DCB, RPAR-

RP-280 RP-315 RP-532

I:195/91

I:295/92

II:195/93

II:295/94

II:395/95

II:495/96

I:295/397

I:1

II:195/398

II:295/399

I:199/117

I:299/116

II:299/115

II:199/114

II:399/146

Gen ABCA4: Familias con Distrofia Macular Autosómica Dominante

ADDM-59 ADDM-74 ADDM-80

I:202/468

I:1

II:102/479

II:203/871

I:1 I:2

II:102/837

I:1 I:2

II:102/920

ADDM-92 ADDM-94

II:1 II:203/446

I:1

III:203/398

III:1

IV:203/397

II:3

III:503/690

III:403/458

IV:1

V:106/183

III:603/631

III:3

IV:303/456

I:1 I:2

II:103/640

ADDM-105 ADDM-106

I:1 I:203/1192

II:103/1169

I:1 I:2

II:103/591

50


2- METODOLOGÍA

2.1- OBTENCIÓN DE ADN GENÓMICO

El material de partida empleado en los estudios moleculares ha sido el ácido desoxirribonucleico o

ADN, obtenido a partir de muestras de 15 centímetros cúbicos (cc) de sangre periférica con el

anticoagulante EDTA (ácido etilendiaminotetraacético).

2.1.1- EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO

La extracción de ADN se ha realizado utilizando dos métodos distintos:

2.1.1.1- EXTRACCIÓN DE ADN POR EL MÉTODO SALINO

En un principio, el ADN se obtuvo por precipitación salina, que consiste en tratar la muestra con una

serie de disoluciones tampón (tampones) que rompen las membranas celulares de los eritrocitos y de los

leucocitos. Los leucocitos o glóbulos blancos son las células nucleadas de la sangre a partir de las cuales

se obtiene el ADN.

El protocolo empleado fue el siguiente:

Cuadro III.1A: Protocolo de extracción de ADN por el método salino.

1- Trasvasar las muestras de sangre a tubos Falcon 50 (50 ml) y enrasar con suero fisiológico (NaCl 0,09%).

Centrifugar a 3000 rpm, 15 min, 4ºC.

2- Decantar el sobrenadante. Enrasar con TLE, agitar y mantener 30 min en hielo.


3- Decantar el sobrenadante. Enrasar con TLE, agitar y mantener 10 min en hielo.


4- Decantar el sobrenadante. Enrasar con TLE y agitar.


5- Decantar el sobrenadante.

Añadir 3 ml de TLL, 200 μl SDS (dodecil sulfato de sodio) 10% y 500 μl solución proteinasa-k.

Dar un vórtex e incubar a 37ºC toda la noche.

6- Añadir 1ml NaCl 6M. Dar un vórtex. Centrifugar a 3000 rpm, 30 min, a tpa.amb.

7- Decantar el sobrenadante en un tubo Falcon 15 (15 ml). Centrifugar a 3000 rpm, 30 min, tpa.amb.

8- Decantar el sobrenadante en un tubo y centrifugar a 3000 rpm, 30 min, tpa.amb.

9- Decantar el sobrenadante en un tubo y enrasar con etanol absoluto (100%).

Agitar; se observa la precipitación del ADN.

10- Lavar el ADN dos veces en etanol 70% a -20ºC.

11- Pasar el ADN a tubo limpio y centrifugar en vacío 15 min para eliminar los restos de etanol.

12- Pasar el ADN a un criovial y resuspender en 700 μl TRIS-EDTA 1mM / 0´1mM.

51


Los reactivos utilizados se detallan a continuación:

tracción de ADN por el método salino.

Leyen

DN

La extracción automática del ADN se realizó mediante el BioRobot EZ1 (QIAGEN, Hilden,

er as

imultán angre periférica del paciente. El ADN eluido se obtiene a una

onc

.1.2 ONCENTRACIÓN

n las muestras extraídas por precipitación salina, ya que la

onc o era conocida, con el objetivo de preparar alícuotas del ADN original a

na con

Cuadro III.2: Lectura de concentración del ADN en el espectrofotómetro.

Reactivos:

TLE

Solución proteinasa-k: 10 ml proteinasa-k (10 mg/ml) + 5 ml SDS 10% + 400 μl EDTA 0´25M pH 8 + enrasar

TRI asar con H2Od hasta 100

ml.

(tampón de lisis de eritrocitos): 5 ml TRIS 2M pH 8 + 2´5 ml MgCl 1M + enrasar con H2 2Od hasta 500 ml.

TLL (tampón de lisis de leucocitos): 5 ml TRIS 2M pH 8 + 40 ml NaCl 5M + 4 ml EDTA 0´25M + enrasar con

H Od hasta 500 ml. 2

con H Od hasta 50 ml. 2

S/EDTA 1mM/0´1mM pH8: 50 μl TRIS 2M pH 8 + 40 μl EDTA 0´25M pH 8 + enr

Cuadro III.1B: Reactivos utilizados en la ex

da: ml, mililitros; rpm, revoluciones por minuto; min, minutos; μl, microlitros; M, molar (moles/litro); tpa.amb.,

temperatura ambiente; mM, milimolar = milimoles/litro; H2Od, agua destilada.

2.1.1.2- EXTRACCIÓN AUTOMÁTICA DEL A

G many), siguiendo las instrucciones del fabricante. El aparato permite la extracción de 1-6 muestr

eamente, a partir de 350 μl de ss

c entración óptima de aproximadamente 50 nanogramos por microlitro (ng/μl).

2 - ESPECTROFOTOMETRÍA DE ADN: LECTURA DE LA C

Esta técnica se realizó únicamente co

c entración del ADN obtenido n

u centración óptima de 50 ng/μl.

1- e cuantificaron las muestras de ADN en un espectrofotómetro Gene Quant pro (Amersham), siguiendo

;

3- Una vez obtenida la concentración del ADN original, preparar alícuotas a una concentración de 50 ng/μl.

S

las instrucciones del fabricante.

2- Registrar las medidas de las ABS obtenidas:

ABS 260nm: indica la concentración de ADN;

ABS 280nm: indica la concentración de proteínas;

ABS 230nm: indica la concentración de sales

Coeficiente ABS 260/ABS 280: indica la pureza:

- valores ∼1´6: indican contaminación por proteínas

- valores ∼2: indican contaminación por RNA

52


2.1.3- PURIFICACIÓN DE ADN GENÓMICO

Este proceso se realiza cuando las muestras de ADN -extraídas por precipitación salina- no

res alores óptimos de pureza.

ón del ADN genómico.

p entan los v

1- Añadir 5 μl RNAasa A (25mg) por cada 500 μl ADN. Incubar a 37ºC, 1h.

2- Añadir 75 μl SDS 10% por cada 1 ml ADN. Agitar.

n un volumen de fenol-cloroformo.

Si la muestra no está limpia, dar 2 pases. Recoger el sobrenadante.

5- Efectuar un pase en un volumen de cloroformo-isoamílico.

Dar un vórtex y centrifugar a 13000 rpm, 2 min.

Recoger

7- Añadir 2 vol

8- Conservar el ADN purificado en TRIS-EDTA 1mM/0´1mM pH8.

3- Añadir 20 μl proteinasa-k por cada 1 ml ADN. Agitar. Incubar a 56ºC, 1h.

4- Efectuar un pase e

Dar un vórtex y centrifugar a 13000 rpm, 2 min.

la fase acuosa.

6- Añadir 80 μl NaCl 5M por cada 1 ml ADN.

úmenes de etanol absoluto, para precipitar el ADN.

Cuadro III.3: Purificaci

53


2.2- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO

El protocolo para abordar el estudio directo de los tres genes de interés se realizó de la siguiente

manera:

enes NDP y RS1a) G :

1- a, del afecto y de sus familiares.

2- o, en el afecto.

4- s del afecto, mediante secuenciación del fragmento

entra la mutación.

ción, de mutaciones nuevas en población control.

Extracción de ADN a partir de sangre periféric

Amplificación mediante PCR de los exones de cada gen estudiad

3- Secuenciación automática de los exones de cada gen.

Ampliación del estudio directo a los familiare

concreto en el que encu

5- Confirmación, mediante ensayo de restric

b) Gen ABCA4

:

1- Extracción de ADN a partir de sangre periférica, del afecto y de sus familiares.

2- Cribado de mutaciones y polimorfismos mediante un microarray de genotipado, en el afecto.

3- Validación de resultados mediante secuenciación automática de los exones en los que se han

identificado las mutaciones responsables.

4- Ampliación del estudio directo a los familiares del afecto, mediante secuenciación de los fragmentos

concretos en los que se encuentran las mutaciones.

5- En pacientes con un único alelo mutante identificado, cribado de la región exónica completa

mediante secuenciación automática.

6- En pacientes con un único alelo mutante identificado, cribado de la región exónica completa

mediante MLPA (Multiplex Ligation Probe Assay).

7- Confirmación, mediante ensayo de restricción, de mutaciones nuevas en población control.

8- Cribado de una mutación prevalente en población control mediante dHPLC (denaturing High

Performance Liquid Chromatography)

54


2.2.1- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR

NDICIONES DE LA PCR

A continuación, se muestran las condiciones que fueron utilizadas para amplificar las distintas

uencias de los cebadores y las temperaturas de hibridación (Th) empleadas en la

mplificación de los diversos fragmentos se verán más adelante.

Reactivos y Concentraciones Ciclos (n=30)

2.2.1.1- CO

regiones exónicas. Las sec

a

Reactivo Concentración Temperatura Tiempo

ADN 50 ng/μl 95ºC 5 min

Tampón (Roche) 1´5 mM MgCl 2

Nuc M (de cada uno) 95ºC 20 s leótidos (Invitrogen) 1´25 m

Cebadores (Pacisa+Giralt) 10 μM (de cada uno) Th 30x 20 s 30x

DMSO -aditivo opcional- (Merck) 10% del volumen final 72ºC 40 s

GC-rich -aditivo opcional- (Roche) 20% del volumen final

Taq polimerasa (Roche) 2´5 unidades 72ºC 10 min

Agua estéril (Braun) csp 50 μl 4ºC ∞

Tabla III.2: Condiciones utilizadas para amplificar los diferentes exones de los genes NDP, RS1 y ABCA4.

Leyendas: DMSO, dimetilsulfóxido; csp, cantidad suficiente para; s, segundos.

El volumen final de la reacción fueron 50 μl. La reacción de PCR se realizó en un termociclador

en

.2.1.2- C

S-)

mplead enes NDP, RS1 y ABCA4, las temperaturas de

ibr C-

ch, que

en

cuando

E badores Tpa. (ºC)

Tam. (pb)

GC-rich

G eAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems).

2 EBADORES

A continuación, se muestran las secuencias de los cebadores (sentido -S- y antisentido -A

os para amplificar las regiones exónicas de los ge

idación específicas y el tamaño de cada fragmento (pb). También se detalla la utilización o no de G

es un aditivo necesario:

h

ri

- la amplificación de regiones ricas en guaninas y/o citosinas, más difíciles de desnaturalizar;

la amplificación del fragmento no es específica.-

Tabla III.3: Gen NDP; los cebadores utilizados fueron descritos por Berger W et al., 1992.

xón Ce

ND1 S⇒ 5´ TCCCCGATAACGAGCGCCT 3´ AS⇒ 5´ CCTAGGCAAGCCGGCAGC 3´ 60 364 -

ND2a S⇒ 5´ GTTCCATTAGTGGTTCTGGG 3´ AS⇒ 5´ TTATCACCAGCAGGGAGAGC 3´ 58 322 +

ND2b S⇒ 5´ CCGATCCTGCCCTTTCCTT 3´ AS⇒ 5´ CTTGCCTGTTTCTGAGGGAA 3´ 58 337 -

ND3 S⇒ 5´ CCTGGCTAAGGTTGTGGCAT 3´ AS⇒ 5´ CCTGGGAGTAGCTTGTCCTT 3´ 58 349 -

55


Tabla III.4: Gen RS1; los cebadores utilizados fueron descritos por Sauer GC et al. 1997.

Exón Cebadores Tpa. (ºC) Tam. (pb)

RS1 S⇒ 5´ CTCAGCCAAAGACCTAAGAAC 3´ AS⇒ 5´ GTATGCAATGAATGTCAATGG 3´ 54 216

RS S⇒ 5´ GTGATGCTGTTGGATTTCTC 3´ AS⇒ 5´ CAAGTGATAGTCCTCTATG 3´ 56 176 2

RS3 S⇒ 5´ CTGCCCTGCCTCTCTGGTTG 3´ AS⇒ 5´ GGTGTTCCCAATGACTGTTCC 3´ 60 178

RS4 S⇒ 5´ GGTGCTTGTTGAGTATTGAG 3´ AS⇒ 5´ AAAATCCCCGGGCCCTGC 3´ 54 219

RS5 S⇒ 5´ GAGAGCCAGCACCTGCGG 3´ AS⇒ 5´ GGGTGCGAGCTGAAGTTGG 3´ 65 311

RS6 S⇒ 5´ CCCG 5´ CTTTGTTCTGACTTTCTCTGGC 3´ 62 414 ATGTGATGGTGACAGG 3´ AS⇒

: Gen ABCA4; los cebadores on descritos por Rivera A et al. 200

Exón Ce Tpa. (ºC) Tam. (pb)

Tabla III.5 utilizados fuer 0.

badores

STG1 GTGTGGTC TTT 3´ 141 S⇒ 5´ AATCTGGTCTTC 3´ AS⇒ 5´ GTTTA GCTCCACACCTC 58

STG2 GAA CAGACC TCTC 3´ 197 S⇒ 5´ AATCTCTTAGCACCACT 58 C 3´ AS⇒ 5´ AGGCC AAAG

STG3 AC AAGGGGTG GCAAC 3´ 57 249 S⇒ 5´ CCTGCTTGGTCTCCATG 3´ AS⇒ 5´ ACGTG T

STG4 GGCTTTGTC 3´ GGTGAGGG ATGC 3´ 213 S⇒ 5´ CCTTATTAATGA 57 AS⇒ 5´ ATA AAATG

STG5 CCCTTCAACACCC 3´ TGCTTCCCTCC CCAG 3´ 220 S⇒ 5´ CCATTTC 58 AS⇒ 5´ G CCT

STG6 285 S⇒ 5´ CTACCACAGGGCAGTTTCTA 3´ AS⇒ 5´ CAGGAATCACCTTGCAATTG 3´ 58

STG7 S⇒ 5´GA 57 229 TCAGACTGTGCCTATGTG 3´ AS⇒ 5ÁTAAGTGGGGTAAATGGTGG 3´

STG8 S⇒ 5´GAGCATTGGCCTCACAGCAG 3´ A 5ĆCCCAGGTTTGGTTTCACC 3´ 54 400 S⇒

STG9 239 S⇒ 5ÁGGTTACAAGCAATGGGGAG 3´ AS⇒ 5´TCTGGGAGGTCCAGGGTAC 3´ 58

S ⇒ 5ĆCCCCCTTACTCTGATCAT 3´ 50 145 TG10 S⇒ 5ÁTCTTTGTCTGGTTTTAGGC 3´ AS

S S⇒ 5´GAATTTCTAAGCAGAGCAGTG 3´ AS⇒ 5ÁGCTCTGGCCCCACTCATG 3´ 54 303 TG11

S S⇒ 5ÁGTTGAGTGTTTGCAGTTGG 3´ AS⇒ 5ĆTGACTTTGGAGAAATGCAG 3´ 58 307 TG12

S GAGGTGTGAGTGAGC 3´ AS⇒ 5´TTAGCGTGTCATGGAGGAGG 3´ 58 277 TG13 S⇒ 5´TCGG

S 14 TG S⇒ 5´TTAGCGTGTCATGGAGGAGG 3´ AS⇒ 5ÁATCCAGGCACATGAACAGG 3´ 57 362

STG15 S⇒ 5ÁGGCTGGTGGGAGAGAGC 3´ AS⇒ 5´GGACTGCTACGGACCATTC 3´ 56 373

STG16 S⇒ 5ĆTGTTGCATTGGATAAAAGGC 3´ AS⇒ 5´GATGAATGGAGAGGGCTGG 3´ 56 330

S GATAGGG 3´ AS⇒ 5´ CACACCGTTTACATAGAGGGC 3´ 58 231 TG17 S⇒ 5´ CTGCGGTAAGGTAG

S 209 TG18 S⇒ 5ĆTCTCCCCTCCTTTCCTG 3´ AS⇒ 5´GCCTTTTCCTCGCCTCTG 3´ 56

S TGGGAAAGAGTAGACAGCCG 3´ 57 320 TG19 S⇒ 5´TGGGGCCATGTAATTAGGC 3´ AS⇒ 5´

S S⇒ 5´GCCCTCCTAAGGCATGTTG 3´ AS⇒ 5´TATCTCTGCCTGTGCCCAG 3´ 57 294 TG20

STG21 S⇒ 8 305 5´GTAAGATCAGCTGCTGGAAG 3´ AS⇒ 5´GAAGCTCTCCTGCTCCAAGC 3´ 5

STG22 S⇒ 5ÁGGTACCCCCACAATG AS⇒ 5ÁGCCCAGCCCAGGAGACT 3´ 56 260 CC 3´

STG23 3´ G 3 58 382 S⇒ 5´TTTTTGCAACTATATAGCCAGG AS⇒ 5ÁGCCTGTGTGAGTAGCCAT ´

STG24 3 59 187 S⇒ 5´GCATCAGGGAGAGGCTGTC 3´ AS⇒ 5ĆCAGACGGAACCCAAGTATG ´

STG25 3´ 3´ 56 379 S⇒ 5´GGTAACCTCACAGTCTTCC AS⇒ 5´GGGAACGATGGCTTTTTGC

STG26 ´ ´ 48 220 S⇒ 5´TCCCATTATGAAGCAATACC 3 AS⇒ 5ĆCTTAGACTTTCGAGATGG 3

STG27 S⇒ 5´GAGATCCAGACCTTATAGGC 3´ AS⇒ 5´GTTATAACCCATGCCTGAAG 3´ 54 415

STG28 S⇒ 5ÁCGTGTGACATCTCCATGCC 3´ AS⇒ 5ĆCCTTCTAAGCAGCATGTGA 3´ 58 250

56


Exón . (ºC) Tam. (pb) Cebadores Tpa

STG29 59 234 S⇒ 5ÁGGCTCTGAGTTGCATGATG ⇒ 5ĆTGCCATCTTGAACCCACC 3´ 3´ AS

S TG30 54 253 S⇒ 5ÁCTTTGAGGCTGATTATGGAA 3´ AS⇒ 5ĆCCCGTTGTTTGGAGGTC 3´

S TG31 56 198 S⇒ 5´TATAAGTCCTCAAGTTCCAAG 3´ AS⇒ 5ÁATATCTTCTACAGGGAGCC 3´

S TG32 58 180 S⇒ 5´TAACGGCACTGCTGTACTTG 3´ AS⇒ 5´TCATGGCTGTGAGGTGTGC 3´

S A ´ TG33 58 228 S⇒ 5´TTCATGTTTCCCTACAAAACCC 3´ S⇒ 5ÁAAATCCTACTCAAATCTCCAG 3

S TG34 56 269 S⇒ 5´GCTTAACTACCATGAATGAG 3´ AS⇒ 5´TCAGCAGGAGGAGGGATG 3´

S TG35 58 270 S⇒ 5´TAACTAGCTGTTAATGCAGCG 3´ AS⇒ 5ÁAGAGTGGAGAAGGTGACAA 3´

S S⇒ 5´GTATCTTCTCCTCCTTCTGC 3´ AS⇒ 5ĆACACAAGCTCCACCTTGG 3´ 58 303 TG36

S S⇒ 5ĆAGGTCTGAGAGGTTAAGTG 3´ AS⇒ 5ĆCACCAGGCTTCTCTTCAG 3´ 58 211 TG37

S S⇒ 5´GGAATGGAATGTGGAACTCC 3´ AS⇒ 5ÁCACATACTCTACTATCCTAC 3´ 54 253 TG38

STG39 S⇒ 211 5´GGTTTGCCCCGTTTCCAAC 3´ AS⇒ 5´TCCCAGCTTTGGACCCAG 3´ 56

STG40 58 236 S⇒ 5ÁGGTCTGTGGGGTGAGCTG 5´TCTGGATGCCCTGAGCTGC 3´ 3´ AS⇒

STG41 58 221 S A ⇒ 5´GAAAGGACAGTGCCAAGGAC 3´ S⇒ 5´TCTAACCAGCACCTCCAAAC 3´

STG42 57 149 S⇒ 5ĆCGTCTCAGTTCTCAGTCC 3´ AS⇒ 5ÁGAGCTGATGTTCGGAAGCC 3´

STG43 56 276 S⇒ 5ĆTTACCCTGGGGCCTGAC 3´ AS⇒ 5´TCAGAGCCACCCTACTATAG 3´

STG44 54 287 S⇒ 5´GAAGCTTCTCCAGCCCTAGC 3´ AS⇒ 5´TGCACTCTCATGAAACAGGC 3´

STG45 51 208 S⇒ 5ĆTTGTCTTCTCCAAATGGCA 3´ AS⇒ 5´TTTAAGCCCTTGGTGCGGC 3´

STG46 57 256 S⇒ 5´GAAGCAGTAATCAGAAGGGC 3´ AS⇒ 5ĆCTCACATTCTTCCATGCTG 3´

STG47 57 219 S⇒ 5ĆACATCCCACAGGCAAGAG 3´ AS⇒ 5ÁTCCACAGAAGGCAAGC 3´

STG48 57 357 S⇒ 5ÁGGCCCAACCACTAACAGAG 3´ AS⇒ 5ÁCACTGGGTGTTCTGGACC 3´

STG49 54 178 S⇒ 5´GTGTAGGGTGCTGTTTTCC 3´ AS⇒ 5ĆAAGCTGTGGACTGCATAAG 3´

STG50 57 66 S⇒ 5ÁAACCAAGATGACGCGAGTC 3´ AS⇒ 5´GGAACGAGCGGTGTGAAAG 3´

2.2.1.3- D EDI

Lo resol de a osa a

ntr frag 25-6 P

in se ).

ro e ag o-ED V, volt

ETECCIÓN DEL PRODUCTO DE PCR M ANTE ELECROFORESIS

s exones amplificados por PCR se vieron mediante electroforesis en gel gar una

conce ación del 3%, que permite separar mentos de ADN en un rango de 1 00 pb. ara

determ ar el tamaño, se empleó un marcador de peso molecular de un rango de una kiloba (kb

Cuad III.4A- Protocolo de elaboración de geles d arosa. Leyenda: g, gramo; TBE, Tris-Borat TA; io.

1- P % d Bor DTA).

T lver la

U ro d

Ve gelifica

bromofe

azul d bromof

- marcador d )⇒ 1

En cubeta ucir el g V, 30 min.

V

e agarosa (Serva) en tampón TBE 1x. (Tris-reparar un gel a una concentración del 3 ato-E

apar y calentar en microondas hasta diso agarosa por completo.

e etidio (Roche). na vez disuelta, añadir un 18 % de bromu

2- rter en una carcasa con peines y dejar r.

3- Cargar las muestras, mezcladas con azul de

- muestras⇒ 20 μl producto de PCR + 2 μl

nol, en la siguiente proporción:

e enol 6x (10% del volumen de muestra)

e peso molecular 1 kb (Roche μl marcador + 9 μl azul de bromofenol 1x.

de electroforesis (Bio-Rad), introd4- el en el tampón (TBE 1x). Correr a 90

isualizar el gel bajo luz UV (Gelprinter® SuperII).5-

57


Los reactivos utilizados en la preparación de los geles se detallan a continuación:

os

CRIB CROA

E izad tacio previo

4, de onales de crib

, S rphi Cadena Senc

, De esis, esnaturalizante) y

e la icas que represen

ión s en limorfismos de

nuc mor

El realiza a sarrol

os ndo rimer Extens

asp uero gre periférica

te.

Figura I ie de cristal (“chip

de A a polimerasa realiza la

ext ón i ntos de

or lavado. Se produce la detección de la señal emitida.

Reactiv

Taos:

1x: partir del tampón comercial Tmpón TBE BE 10x ( n 1x con 2Od.

zul de nol 100

zul e TB .

Pronadisa) y llevar a una concentració H

A bromofenol 6x: 0´25 g azul de bromofe + 40 g sacarosa + enrasar con H Od hasta ml. 2

A de bromofenol 1x: Añadir 5 volúmenes d E 1x por volumen de azul de bromofenol 6x

Cuadro III.4B: Reactivos utilizad en la electroforesis de fragmentos de ADN.

2.2.2- ADO DE MUTACIONES MEDIANTE MI RRAY DE GENOTIPADO

l microarray de genotipado se ha util o con el fin de realizar un análisis mu nal en

ABCA ya que presenta mayor sensibilidad de tección frente a las técnicas convenci ado

(SSCP ingle Strand Conformation Polymo sm, Polimorfismo Conformacional de illa;

DGGE naturing Gradient Gel Electrophor Electroforesis en Gel de Gradiente D

del gen ABCA4 en una sola reacción, permit identificación de 438 variantes genét ta la

detecc del 75% de las alteraciones descrita este gen, incluyendo mutaciones y po un

leótido (SNPs, Single Nucleotide Poly phisms) (Jaakson J et al., 2003). único

análisis previo del gen ABCA4 fue do por la empresa AsperBio Ltd., que h de lado

la tecnología APEX (Arrayed P ión) divers microarrays de genotipado utiliza

(www. erbio.com). El material de partida f n 50 μl ADN extraído a partir de san del

pacien

1 2 3 4

II.1: Método APEX. 1) Los 438 oligos sintéticos se inmovilizan por su extremo 5´ sobre una superfic

DN”). 2) Los fragmentos de la muestra amplificados por PCR se hibridan con los oligos. 3) L

ensi ncorporando nucleótidos. Los 4 terminadores están marcados con 4 fluorocromos distintos. 4) Los fragme

ADN y los nucleótidos no incorporados se eliminan p

58


2.2.3- S

.2.3 ACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR

un

ma uestras.

espu or, se extrae el

agmento de ADN del gel con una cuchilla limpia y se introduce en un tubo eppendorf de 1´5 ml.

El protocolo de p tion Kit, Qiagen,

ilden, Germany), fue el siguiente:

Cuadro III.5- Protocolo para la purificación del producto de PCR a partir de geles de agarosa.

ndo el fragmento amplificado está constituído por una única banda, es decir, no a

as inespecíficas en el gel de agarosa, el producto de PCR se puede purificar directamente. Para ell

s ®

pro

ECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA

2 .1- PURIFIC

Este proceso se utilizó para extraer y purificar fragmentos de ADN de geles de agarosa, de

ta ño comprendido entre 100 pb y 10 kb, que resulta imprescindible antes de secuenciar las m

D és de la electroforesis del producto de PCR, se coloca el gel en un transiluminad

fr

urificación, realizado mediante un kit comercial (QIA-quick Gel Extrac

H

1- Pesar el gel cortado y añadir 3 volúmenes de buffer QG (μl) por volumen de gel (mg).

4-

3000 rpm, 1 min, tpa.amb.

8- irar el filtrado y centrifugar 1 min adicional.

9- Colocar la columna en un tubo eppendorf limpio de 1´5 ml.

10- Añadir 30 μl de tampón de elución (buffer EB) al centro de la columna, dejar reposar 1 min y centrifugar a


Incubar a 50ºC, 10 min o hasta que el gel se haya disuelto completamente.

Para que el gel se disuelva mejor, dar un vórtex al tubo cada 2-3 min durante la incubación.

2- Tras la completa disolución del gel, comprobar que el color de la mezcla es amarillo.

El buffer QG contiene un indicador de pH (amarillo si el pH < 7´5; naranja o violeta si pH > 7´5), ya que la

adsorción del ADN a la membrana QIAquick es eficaz sólo a pH < 7´5.

Si el color de la mezcla fuese naranja o violeta, añadir 10 μl de acetato de sodio 3 M pH 5´0 y agitar.

3- Añadir un volumen de isopropanol y mezclar con la pipeta.

Colocar la columna QIAquick en uno de los tubos de 2 ml proporcionados.

5- Para la adsorción del ADN, aplicar la muestra en la columna y centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb.

6- Tirar el filtrado y volver a colocar la columna en el mismo tubo.

7- Para lavar, añadir 750 μl tampón de lavado (buffer PE) a la columna, dejar en reposo 2-5 min y centrifugar

a 1

T

Cua parecen

o, band

e empleó un kit comercial (E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit, OMEGA) que utiliza como material de partida el

ducto de PCR, sin necesidad de separar previamente el fragmento amplificado por electroforesis.

59


El protocolo utilizado fue el siguiente:

1- Determinar el volumen de partida del producto de PCR: añadir 4 volúmenes de tampón CP (μl) por

volumen de PCR.

2- Aplicar la solución a la columna HiBind® colocada en un tubo colector de 2 ml.

3- Centrifugar a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb.

Tirar el líquido sobrante.

4- Lavar la columna 2 veces: añadir 750 μl de tampón de lavado (Wash Buffer) y centrifugar a 13000 rpm, 1

min, tpa.amb.


5- Centrifugar la columna vacía a 13000 rpm, 1 min, tpa.amb., para secarla.

1mM pH8 y centrifugar a

6- Colocar la columna en tubo eppendorf de 1´5 ml.

O estéril (Braun) o TRIS/EDTA 1mM/0´Para eluir el ADN, añadir 30-50 μl H2


Cuadro III.6- Protocolo de purificación a partir de producto de PCR.

.2.3 R

cuenciación. En la reacción se

mp entes

ac

as con siguientes:

CICLOS (n=25)

2 .2- EACCIÓN DE SECUENCIACIÓN

Una vez purificado el producto de PCR, se realiza la reacción de se

leó un premix (dRhodamine DNA Sequencing Kit, Applied Biosystems) que incorpora los siguie

re tivos: tampón de la reacción, dNTPs (90%), ddNTPs (10%) y la enzima ADN polimerasa.

diciones utilizadas fueron lasL

Reactivos

Reactivo Volumen Temperatura Tiempo

AD 6 μl 94ºC 3 min N

Premix (Applied Biosystems) 4 μl 96ºC 10 s

Cebador [10mM] (Pacisa+Giralt) 1 μl 50ºC 25x 5 s 25x

DMSO (Merck) 1 μl 60ºC 4 min

Agua estéril (Braun) csp 20 μl 4ºC ∞

Tabla III.6: Condiciones de la reacción de secuenciación.

El producto de esta reacción se resuelve mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático

(ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) y la información obtenida se analiza mediante el

programa informático Sequencing Analysis Software v 5.1.1.

El volumen final de la reacción fueron 20 μl y la temperatura de hibridación (Th) fueron 50ºC. La

reacción de PCR se realizó en un termociclador GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems).

60


2.2.3.3- PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO SECUENCIADO

Los productos de la reacción de secuenciación se purifican mediante unas columnas que contienen

n polímero denominado Sephadex G-501 (Princetown Separations), que permite eluir las moléculas de

ay as

olita q coge el ADN (producto

ecue ci es (dNTPs, ddNTPs, enzima, etc.) quedan retenidos en la

lum a

Una vez que se ha p el producto secuenciado, hay líquido sobrante y

resuspender el botó n agente d ralizant ras en el

secuenciador:

u

m or tamaño, mientras que las moléculas pequeñas quedan retenidas en el interior de cada una de l

b s ue conforman esta matriz. De esta forma, al centrifugar la columna se re

s n ado), mientras que los reactivos sobrant

co n .

1- Resuspender la columna de Sephadex con 800 μl H2O estéril (Braun).

tpa.amb.

ppendorf de 1´5 ml y añadir 20 μl reacción de secuenciación.

Centrifugar, una vez, a

Recoger el ADN eluíd

4- Lavar la columna con 750 μl H2Od y rehidratar durante 2-3 h.

5- Centrifugar 2 veces a 4000 rpm, 2 min, tpa.amb.

Tirar el líquido sobrante y conservar a 4ºC.

Dar un vórtex y rehidratar durante 2-3 h.

2- Centrifugar la columna 2 veces a 4000 rpm, 2 min,


3- Colocar la columna en tubo e


o y reservar.

Cuadro III.7- Protocolo de purificación de la reacción de secuenciación.

urificado

) con u

que evaporar el

cargan (pellet esnatu e, antes de r las muest

1 ´5 ml -con l cción de fi trador

rífuga de vacío (Concentrator , eppendorf). C r a tpa.am evaporar el

.

2- Resuspender el pelle

3- Dar vórtex y pulsada.

Desnaturalizar a 95ºC, 2 min. Mantener los tubos en hielo para evitar la renaturalización.

4- Cargar las muestras en el secuenciador automático (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, Applied

- Colocar los tubos eppendorf de 1 a rea secuenciación puri cada- en un concen

5301de ADN / cent entrifu

Cuadro III.8- Desnaturalización de la reacción de secuenciación.

ga b. hasta

líquido por completo

t con 25 μl formamida, dejar actuar 15 min como mínimo.

Biosystems).

61


2.2.4- ANÁLISIS CON ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Los ensayos de restricción se utilizaron para confirmar la presencia o ausencia de una mutación.

Una vez que se ha identificado el cambio, se introduce la secuencia en el programa informático Vector Nti

Suite v9. Este programa busca una endonucleasa de restricción (ER) que reconozca el cambio en la

secuencia, bien porque la mutación genere una nueva diana de restricción o bien porque destruya una

diana que existía previamente. Las ER utilizadas (New England BioLabs) y las condiciones de digestión de

los productos de PCR se recogen en las siguientes tablas:

Digestión

Enzimas y dianas

Enzima Diana Temperatura Tiempo

Aci I 5’…C↓CGC…3’ 37ºC 3 horas

Alu I 5’…AG↓CT…3’ 37ºC 3 horas

AGG…3’ 37ºC 3 horas

5’…C↓CGG…3’ 37ºC 3 horas

37ºC 3 horas

Eco NI 5’…CCTNN↓NNN

Msp I

Taq I 5’…T↓CGA…3’

Tabla III.7: Enzimas de restricción utilizadas, dianas que reconocen y condiciones de la digestión.

Reactivos

Reactivos Volúmenes

ADN (producto de PCR) 10 μl

Tampón 2 μl

Enzima de restricción (10 unidades/μl) 3 μl

Agua csp 20 μl

Tabla III.8: Reactivos de la digestión. El volumen final de la reacción fueron 20 μl.

l proto

Cuadro III.9- Ensayo de restricción.

E colo para realizar el ensayo de restricción fue el siguiente:

1- Amplificar por PCR el fragmento de interés.

2- Incubar el producto de PCR con la enzima de restricción a 37ºC, 3h (Ver condiones Tabla III.7).

3- Resolver mediante electroforesis en gel de agarosa al 3% (Ver Cuadro III.4).

62


2.2.5- MLPA (Multiplex Ligation Probe Assay)

Esta técnica fue utilizada con la finalidad de detectar pérdidas (deleciones) o ganancias

(inserciones) de material genético. El análisis de las muestras se realizó mediante dos kits comerciales

(MRC-Holland B.V.: SALSA MLPA KIT P151 y 152 ABCA4), siguiendo el siguiente protocolo:

a) Desnaturalización del ADN:

· Partir de 5 μl ADN: desnaturalizar a 95ºC, 5 min. Enfriar a 25ºC.

b) Hibridación de las sondas

c) Reacción de ligaci

d) PCR: se realizó en mp PCR System 2700 (A Biosystems).

Reactivos CICLOS (n=35)

:

· Añadir 1´5 μl SALSA Probe-Mix y 1´5 μl MLPA buffer. Mezclar con cuidado.

Incubar a 95ºC, 1 continuación, inmin. A cubar a 60ºC, 16h.

ón

· Reducir la tpa. a 54ºC, añadir 32 μl de M r. La solució gase est por:

3 μl

Incubar a 54ºC, 15 min.

· Calentar a 98ºC, 5 min para inactivar la ligasa. Antes de la PCR, mantener el termociclador a 60ºC.

ix Ligase y mezcla n Mix Li á formada

Ligase 65-A + 3 μl Ligase 65-B + 1 μl Ligase 65 + 25 μl H O. 2

un termociclador GeneA pplied

Reactivo Volumen Te ratura Tiempo mpe

Reacción de ligación (ADN molde) 10 μl

SALSA PCR buffer 10x acción) 4 μl

SALSA PCR p

SALSA Enzyme dilution buffer (tampón enzima) 2 μl

SALSA Polymerase (enzima) 0´5 μl

72ºC

72ºC

4ºC

(pre-PCR)

30 s

30 s 35x

60 s

20 min

∞

60ºC

95ºC (tampón re

rimers (cebadores) 2 μl 60ºC 35x

Agua estéril (Braun) csp 50 μl

e) El r

Cuadro III.10- Protocolo del MLPA para el gen ABCA4.

ect oforesis capilar

· El producto de PCR obtenido se resuelve por electroforesis capilar (ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer,

Applied Biosystems) mediante el programa informático GeneMapper Software v3.5.

Cargar las muestras en el secuenciador de la siguiente manera:

1 μl producto de PCR + 0´5 μl m Liz; Applied Biosystems) + 8´5 μl

formamida (Merck).

arcador de peso molecular (GS-500

63


2.2.6- dHPLC (denaturing High-Performance Liquid Chromatography)

ue

resentaron un patrón alterado o de heterodúplex, que se establece cuando está presente una mutación. La

lizó en el cromatógrafo WaveTM DNA Fragment Analysis System 4500

omic), siguiendo el siguiente protocolo:

nálisis de c ragmento depende composició s a lo

larg Por se realizó un análi temperatur a para

dete peratura óp obtenida por s .

La Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento -en condiciones desnaturalizantes- permitió realizar

un cribado previo de las muestras, con el fin de identificar una mutación prevalente entre los pacientes de

STGD, como se verá más adelante. A continuación, se secuenciaron sólo aquellas muestras q

p

detección de mutaciones se rea

(Transgen

1- Mezclar los productos de PCR (muestra control + muestra problema) en proporción 1:1, ya que el dHPLC

re una muestra homozigota normal y homozigota mutante.

2- Desnaturalizar los productos de PCR a 95ºC, 5 min en un termociclador (GeneAmp PCR System

eterodúplex.

3- Cargar 5 μl del producto de PCR mezclado en la columna (DnaSepTM column; Transgenomic).

odúplex y los homodúplex en un gradiente de acetonitrilo, formado por la combinación

de las soluciones A y B (WAVE OptimizedTM; Transgenomic). tware,

0´9 ml/min

- Duración de la carrera: 8 min, incluyendo lavado y equilibrado de la columna.

no puede diferenciar ent

2700; Applied Biosystems). Mantener a 54ºC, 1h para favorecer la formación de los h

4- Analizar los heter

TM5- Determinar los gradientes óptimos para eluir los amplificados mediante el programa Navigator Sof

bajo la aplicación Mutation Detection:

- Flujo del gradiente:

- Detección del ADN: luz UV (260nm)

Cuadro III.11- Protocolo de análisis de muestras en el dHPLC.

La temperatura óptima de a ada f de la n de base

o del mismo y, por tanto, es variable. ello, sis a a óptla im

ctar dicho alelo mutante. La tem tima, imulación en el aparato, fueron 63´2ºC

64


2.3- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO

2.3.1- REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR

2.3.1.1- CONDICIONES DE LA PCR

En la siguiente tabla se muestran las condiciones que fueron utilizadas para amplificar las dis

regiones microsatélites. Las secuencias de los ce

tintas

badores empleados en la amplificación de los diversos

arcadores se verán más adelante.

LOS (n=30)

m

Reactivos y Concentraciones CIC

Reactivo Concentración Temperatura Tiempo

ADN 50 ng/μl 95ºC 12 min

T p 95ºC 15 s am ón (Roche) 1´5 mM MgCl2N s 10xucleótidos (Invitrogen) 2´5 mM (de cada uno) 55ºC 10x 15

72ºC 30 s C

fluoroc 89ºC 15 s

ebador sentido marcado con

romo (Applied Biosystems) 5 μM

Ceb

(Pacis5 μM

72ºC 30 s

ador antisentido sin marcar 55ºC 20x 15 s 20x

a+Giralt)

Taq p 2´5 unidades 72ºC 30 min olimerasa (enzima)

Agua ∞ estéril (Braun) csp 15 μl 4ºC

Tabla III.9: Condiciones u flanqueantes a los genes

NDP, RS1 y ABCA4.

temperatura de hibridación (Th) fueron 55ºC. La reacción de PCR se realizó en un termociclador GeneAmp

PCR System 2700 (Applied Biosystems).

Los productos de PCR correspondientes a los marcadores microsatélites se resolvieron mediante

electroforesis capilar, como se verá más adelante.

2.3.1.2- CEBADORES

A continuación, se muestran las secuencias de los cebadores empleados para amplificar los

marcadores microsatélites flanqueantes a los genes NDP, RS1 y ABCA4, así como la localización en los

respectivos cromosomas. Como se indica en la tabla anterior, el cebador sentido está marcado con un

fluorocromo que permitirá su posterior detección mediante electroforesis capilar.

tilizadas para amplificar los diferentes marcadores microsatélites

Estas regiones se amplificaron mediante PCR múltiple (multiplex PCR), que permite la amplificación

simultánea de tres o cuatro marcadores microsatélites. El volumen final de la reacción fueron 15 μl y la

65


Los datos para seleccionar los distintos marcadores se obtuvieron a partir de dos bases de datos

lectrónicas:

; 2, 3) National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview).

Cebadores(1) Distancia (Mb)(2) Locus(3)

e

- (1) The GDB Human Genome Database (www.gdb.org)- (

Tabla III.10: Marcadores microsatélites flanqueantes al gen NDP. Leyenda: Mb: megabase.

Marcadores Fluorocromo

DXS8090 NED S⇒ 5´GGGTGAAATTCCATCACAAA3´ ATGTACAAAAAATA3´ 41,08 Xp AS⇒ 5ÁCAAATGCAG

DXS1068 PET S⇒ 5ĆCTCTAAAGCATAS⇒ 5ĆCCAT TG3´ 5 AGGGTCCA3´

CTGAGAACACGC 43,0 Xp

8012 HEX S⇒ 5ÁGCTTAGCAAGCCCAAGTAA3´ AS⇒ 5´GGACA ACCATAAC3´ 45,5 Xp DXS TAAACATTCAG

S⇒ 5ĆCA 3´ AS⇒ 5ÁC GTG CCTCACTCCAGCCTGAG

TTTGACCTTATCAAACAGDXS7 6-FAM 3´ 47,6 Xp

MAOB NED SAS⇒⇒ 5´GAAGCATCG AGGAGT3´

5ÁTTTGGCCT AGTTAG3´ - X AAGTTCATAG p

NDP

DXS8080 HEX S⇒ 5´GGCCAACAAGAGCAAAACT3´ AS⇒ 5´TCCTTAGACCCAAA CC3´ 48,4 Xp CTT

DXS1003 NED S⇒ 5´TTCACCCAT 3´ AS⇒ 5ĆCATTCC AAG3´ 50,7 Xp AGAAGCCGT

TCACTGGC

Tabla III.11: Marcadores microsatélites flanqueantes al gen RS1.

Marcadores Fluorocromo Cebadores(1) Distancia (Mb)(2) Locus(3)

DXS8022 NED S⇒ 5ĆTGTCACAGAAGTCCCATTTTA3´ AS⇒ 5´GGAAACTAATGCAGCATGTC3´ 18,05 Xp

DXS1053 PET S⇒ 5´TTAAGGAAGTATGAGGCTCCA3´ AS⇒ 5´TT 19,68 Xp GGTGCAAAAGTAATCACG3´

DXS8019 6-FAM S⇒ 5´TTCATTAAAAGCCGTCTTTG3´ AS⇒ 5´TGTTGAGTTTCCTCACAGC3´ 21,86 Xp

DXS9911 HEX TCTAAAACAGT3´ AS⇒ 5´GCTATATATCTGCTATGCAGTGG3´ - Xp S⇒ 5ĆCCGATTTCC

RS1

DXS999 HEX S⇒ 5´GCTAACAACCTAGACTTCAACC3´ AS⇒ 5ĆAGTTTCACAATCTCTGCC3´ 22,95 Xp

DXS1226 6-FAM S⇒ 5´ CTAAACCCATCTGNCCTC3ÁS⇒ 5´TTTCCAGCAACTACCTTTCAT3´ 27,69 Xp

DXS989 6-FAM S⇒5ÁGAAGATAGATATACCCACTCACC3´ AS⇒ 5ÁCATAAGAAATAAAATGGCTGC3´ 27,30 Xp

66


Tabla III.12: Marcadores microsatélites flanqueantes al gen ABCA4.

Marcadores Fluorocromo Cebadores(1) Distancia (Mb)(2) Locus(3)

D1S464 NED S⇒ 5´GCCTAAATTTCTTACACATCCTAAC3´ 73,98 1p AS⇒ 5´GTTTTAAACACCACAAATAAATGT3´

D1S167 6-FAM S⇒ 5´TAAATTCTCCTT TTGGGTC3´ AS⇒ 5´TGAGTCATCT CGTTTAAGA3´ 88,51 1p G

G

D1S43 S⇒ 5´GGCCACATGGGAATTTTCT3´ 1p 5 HEX AS⇒ 5ÁGCAGTTCAAGGCCACAGT3´ 89,81

D1S2804 NED S⇒ 5ÁAAGGATA G3´ C3´

TTTTGGCCCT 91,13 1p AS⇒ 5ĆAACGAGTATATTAGCATGACC

D1S2868 PET C3´ 91,59 1p S⇒ 5ÁGGTATAATCTGCAATAAAAAACTT3´ AS⇒ 5ÁAAGTAAAACAATATGAAGCCA

ABCA4

D1S236 6 ´ -FAM S⇒ 5ÁAACCACCTACCAATGTCTGTC3 93,06 1p AS⇒ 5´GAAGCTGTCGTTATGGGGT3´

D 1S2664 6-FAM S⇒ 5ĆAGCCCACAGAATAACACTG3´ 94,20 1p AS⇒ 5´TTCATGCTATGATTTTCCGC3´

D GA3´ 95,35 1p 1S2793 VIC S⇒ 5´GCCCTTCAGTTCCCAGA3´ AS⇒ 5´TGTATTAGTCAAGTTTCACCAGA

de lo amplificaron v ueve ma ores

cionales, distribuidos a lo largo del cromosoma 1. Estos marcadores se seleccionaron de

comercial: Linkage Mapping Sets v2.5 (Applied Biosystems).

Tabla III.13: Marcadores micr a: cM: centimorgan.

Marc Locus adores Distan (1) (2)

Además s marcadores flanqueantes al gen ABCA4, se eintin rcad

microsatélites adi

un kit

osatélites distribuidos a lo largo del cromosoma 1. Leyend(1) (2)adores Distancia (cM) Marc cia (cM) Locus

D1S450 16,61 1p D1S196 169,4 1q

D1S2667 19,88 176,3 1q 1p D1S218

D1S234 44,49 188,55 1q 1p D1S238

D1S255 58,6 192,5 q 1p D1S408 1

D1S2797 68,9 1p D1S2757 19 q 3,41 1

D1S2890 80,9 194,98 1q 1p D1S413

D1S2829 94,99 194, q 1p D1S1660 98 1

D1S2803 96,23 207,07 1q 1p D1S249

D1S207 107,16 1p D1S425 215,07 1q

ABCA4 22 q D1S229 2,29 1

D1S206 122,64 S213 228,26 1q 1p D1

D1S2726 132,11 0 24 q 1p D1S280 5,24 1

D1S4 4 257,498 144,9 1q D1S2785 6 1q

D1S4 1 261,884 157,5 1q D1S2842 6 1q

D1S2878 165,78 1q D1S2836 271,84 1q

67


2.3.2- ANÁLISIS DE HAP

tenidos se resu ctroforesis capila 1 tic

Analyze s) y ico GeneM er Softwar .

Cuadro III.12- Pre ABI PRISM 3100.

2.3.3- D E ÁRB EN

trucción de l s h oles genealógi realizó m e

el programa informático Cyrillic v

LOTIPOS ®r (ABI PRISM 3 00 GeneLos productos de PCR ob elven por ele

r, Applied Biosystem app e v3.5 se analizan mediante el programa informát

1 μl de la dilución 1:10 del producto de PCR + 0´5 μl marcador de peso molecular (GS-500 Liz; Applied

B ) + 12 μl midaiosystems (Merck). forma

®paración de las muestras para su análisis en el

ISEÑO D OLES G EALÓGICOS

La cons o aplotipos en los correspondientes árb cos se ediant

2.1.

68


2.4- ESTUDIOS DE EXPRESIÓN

roteína Retinosquisina, codificada por el gen RS1. Se utilizó esta proteína por dos motivos:

es una proteína de bajo peso molecular: 25 kilodalton (kDa)

es

a p se realizó en el Laboratorio de Neurobiología del Desarrollo del

stituto Cajal (CSIC, Madrid), por cortesía de la Dra. Paola Bovolenta.

.4.1- VECTORES DE EXPRESIÓN

Como vector de expresión, se utilizó un plásmido comercial que contiene la pauta abierta de lectura

c-His en posición carboxilo terminal (OmicsLink ORF

Express

Características del vector

A continuación se describen las técnicas empleadas en los estudios de expresión “in vitro” de la

p

-

- una proteína secretable por las células, que puede ser detectada en los medios de cultivo.

uesta a punto de esta metodología L

In

2

del gen RS1, marcado con los antígenos My

ion Clone, EX-Q0232-M10; RZPD; www.rzpd.de). En la siguiente figura se describe la construcción

utilizada:

Promotor CMV (Citomegalovirus) Célula hospedadora Mamíferos

Antibiótico de selección bacteriana Ampicilina Etiqueta (marcaje) C-Myc C-His

Figura III.2: Estructura y características del vector de expresión utilizado.

2.4.2- CULTIVOS CELULARES Y TRANSFECCIÓN

Se utilizaron dos líneas celulares, MDCK (procedentes de riñón canino) y HEK 293 (procedentes de

riñón embrionario humano). Las condiciones de cultivo fueron las siguientes:

Cuadro III.13- Condiciones de cultivo de las líneas celulares MDCK y HEK 293.

CCMMVV OORRFF

MMCC11 MMCC22

TT77 CC--MMyycc CC--HHiiss PPoolliiAA

1- Trabajar en campana de flujo laminar vertical (Cultek).

2- Atemperar el medio de cultivo en baño termostatizado a 37ºC.

3- En placas Petri de 10 cm de diámetro (Falcon), añadir 10 ml medio D-MEM GlutaMAX™ (Dulbecco´s

modified Eagle´s medium; GIBCO) + 10% suero bovino fetal (Sigma-Aldrich) + gentamicina 1:1000

(GIBCO).

4- Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2 Heraeus, Hera Cell( ).

69


Las líneas celulares se transfectan cuando se encuentran en crecimiento exponencial.

ormalmente, este crecimiento se produce cuando las células tienen una confluencia del 50-70%, obtenida

Se generaron líneas estables con ambos tipos celulares, e las que crecen

en la placa han incorporado el plásmido en su genoma y, p expresarán la

menor medida. Cada tipo celular se transfectó con tres plá

- RS1-Myc-His: proteína que se quiere estudiar

sfectadas con G418 (análogo

sintético de la neomi eucariotas estables

ue han sido transfectadas con vectores que contienen un gen de resistencia frente a la neomicina.

N

en cultivo 24 horas después de haberles dado un pase. La transfección se realizó con el reactivo FuGENE

(Roche), como se indica a continuación:

Cuadro III.14- Protocolo de transfección del reactivo FuGENE.

1- Atemperar el reactivo de lipotransfección FuGENE (Roche) a tpa. amb., 5 min. Trabajar en campana.

es del tubo.

4- Añadir 4 μl ADN plasmídico⇒ [ADN plasmídico]= 1 μg/μl. Incubar 45 min.

5- Añadir la solución anterior, gota a gota, sobre la placa de cultivo.

2- Añadir 100 μl medio D-MEM GlutaMAX™, sin suero bovino fetal, en tubos de vidrio.

3- Añadir 12 μl FuGENE directamente sobre el medio, sin tocar las pared

6- Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2, 72 h.

s decir, que todas las célu

or tanto, proteína en mayor o

smidos diferentes:

- Flg-SFRP-Myc: proteína secretable; control positivo

- pcDNA: es un vector vacío; control negativo.

A las 72 horas de la transfección, se comenzó la selección de las células tran

cina; GIBCO), que permite mantener y seleccionar líneas celulares

q

1- Trabajar en campana de flujo laminar vertical.

2-

X™ + 10% suero bovino fetal

+ gentamicina 1:1000 + G418 500 μg/μl (GIBCO).

4- Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2.

Atemperar el medio de cultivo en baño termostatizado a 37ºC.

3- En placas Petri de 10 cm de diámetro, añadir 10 ml medio D-MEM GlutaMA

Cuadro III.15- Selección de líneas celulares estables con G418.

70


Una vez comenzada la selección, las células que no han incorporado el plásmido comienzan a

morir y únicamente sobreviven aquellas que han sido transfectadas. Al cabo de dos semanas, se aíslan

varios clones de cada una de las lineas celulares transfectadas con los diferentes plásmidos.

Cuadro III.16- Selección de clones a partir de líneas celulares estables.

1- Bajo el microscopio, marcar los clones por debajo de la placa de cultivo.

2- Trabajar en campana de flujo laminar vertical.

3- Absorber el medio de cultivo de la placa con pipeta Pasteur de vidrio.

4- Rodear los clones previamente marcados con un cilindro de plástico (punta amarilla cortada y

Anadir 3 ml PBS 1x a la placa, para preservar la viabilidad celular.

5- Introducir en cada ci μ

Incubar 2-5 min, en funci

6- Pasar las células a una placa multiwell-24 (Falcon) con medio D-MEM GlutaMAX™ + 10% suero bovino

fetal + gentamicina 1:1000 + G418 500 μg/μl.

Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2.

7-

fetal + gentamicina 1:1000 +

autoclavada), impregnado en vaselina.

lindro 100 l tripsina-EDTA 1x, para despegar las células.

on del tipo celular.

Una vez pasados los clones, retirar los cilindros de plástico con unas pinzas y absorber el PBS 1x con

pipeta Pasteur de vidrio.

8- Añadir a la placa 10 ml medio D-MEM GlutaMAX™ + 10% suero bovino

G418 500 μg/μl.

Incubar en incubador a 37ºC, 5% CO2.

Los reactivos utilizados se detallan a continuación:

Soluc

P

8

hasta

Trips rcial de Tripsina-EDTA 10x y llevar a una concentración 1x con

PBS 1x.

iones:

BS 1x (Phosphate Buffered Saline): Disolver en 800 ml H Od: 2

0 g NaCl + 2 g KCl + 26´8 g Na HPO + 2´4 g H PO + ajustar el pH a 7´4 con HCl 1M + enrasar con H2 4 2 4 2Od

1L.

ina-EDTA 1x: partir de la solución come

71


Cada uno de los clones se siembra por duplicado en la placa multiwell-24 y en uno de ellos se

coloca un cristal tratado con polilisina (1 μg/μl). Una vez crecidos los clones, se aislarán:

- por un lado, los cristales tratados con polilisina, para realizar la técnica de inmunocitoquímica y comprobar

eficiencia de transfección;

por otro lado, los extractos celulares y los medios condicionados, para detectar la proteína por Western

lot.

.4.3-

E s células se realizo sigiendo el protocolo que se describe a

ontinuac

Cuadro III.17a- Protocolo de inmunocitoquímica.

lución PBS-T 1x.

.4.4- WESTERN BLOT La Retinosquisina se detectó mediante SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel

electrophoresis) y Western Blot, en extractos celulares y medios condicionados.

la

-

B

2 INMUNOCITOQUÍMICA

l marcaje inmunofluorescente de la

c ión:

1- Fijar las células con paraformaldehído 4% (diluido en PBS 1x), 15 min.

Lavar con PBS-T 1x, 5 min. Repetir 2 veces. 2-

3- -T 1x + 5% suero bovino fetal + 1% seroalbúmina bovina, 1h.

5- n. Repetir 2 veces.

7- es.

8- PBS 1x), 5 min⇒ Tiñe núcleos celulares.

9- Lavar con H2O y secar. Montar con Mowiol (medio de montaje) sobre un portaobjetos.

10- Las células m

Bloquear con solución de bloqueo: PBS

4- Añadir el anticuerpo 1io diluido 1:2000 (en sol. bloqueo), incubar 1 ½ hora (monoclonal α-c-myc; Sigma).

Lavar con PBS-T 1x, 5 mi

6- Añadir el anticuerpo 2io diluido 1:2000, incubar 45 min (Alexa 488; Molecular Probes).

Lavar con PBS-T 1x, 5 min. Repetir 2 vec

Incubar con Hoechst 1:1000 (diluido en

arcadas se detectaron mediante microscopía de fluorescencia (Leica).

Solución:

PBS-T 1x Phosphate Buffered Saline Tween : Añadir Tween 20 diluido 1:1000 en PBS 1x. ( )

Cuadro III.17b- Preparación de la so

2

72


L s de SDS-poliacrilamida se prepararon bajo las siguientes condiciones:

os gele

Le nd

Cuadro III.19a- Preparación previa de las muestras para SDS-PAGE.

Cuadro III.19b- Reactivos empleados en el aislamiento previo de las muestras para SDS-PAGE.

1- Región separadora del gel:

- 5 ml H O 2

- 6 ml acrilamida/bis-acrilamida (30% acrilamide/bis-acrilamide solution, 29’2:0’8; Biorad) ⇒

12% poliacrilamida

- 3’8 ml Tris 1’5M pH 8’8

- 0’15 ml SDS 10%

- 0’15 ml APS 10%

- 6 μl TEMED

se prepara la región concentradora del gel (stack):

0’5 ml acrilamida/bis-acrilamida

- 0’38 ml Tris 1’5M pH 6’8

2- Una vez solidificada,

- 2’1 ml H2O

-

- 30 μl SDS 10%

- 30 μl APS 10%

Cuadro III.18-

dico; TEMED, N, N, N’, N’ tetrametiletilendiamina.

Protocolo de elaboración de geles de SDS-poliacrilamida.

ye a: SDS, dodecil sulfato sódico; APS, persulfato só

Los medios y las células se aislaron de la siguiente manera:

1- Medios condicionados:

- Recoger el medio y pasa pm, 5 min.

- Recoger el sobrenadante y mantenerlo en hielo⇒ este paso elimina posibles restos celulares.

2- Extractos celulares

r a un tubo eppendorf 1´5 ml, centrifugar a 1000 r

:

- Una vez recogido el medio, añadir solución de lisis de proteínas e inhibidores de proteasas.

ener en hielo 20 min, dando un vórtex cada 5 min.

- Recoger el sobrenada onentes celulares que no

han sido lisados.

- Mant

- Centrifugar a 13000 rpm, 5 min, 4ºC.

nte y mantenerlo en hielo ⇒ este paso elimina los comp

Solución de lisis de proteínas: 1´5 ml NaCl 5M + 5 ml Nonidet P40 10x + 2´5 ml Tris pH8 + enrasar con PBS

rotease Inhibitor Cocktail

Tablets, Roche), llevar a 1x con la solución de lisis de proteínas.

1x hasta 50 ml.

Inhibidores de proteasas: A partir de la solución comercial 20x (“Complete” P

73


Una vez aislados los medios condicionados y los extractos celulares, las muestras se

esnaturalizaron de la siguiente manera:

alización y reducción previa de las muestras para SDS-PAGE.

adro III.20b- Preparación del tampón de Laemmly.

La electroforesis se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:

a

tran ontar la transferencia, los papeles de filtro

hatmann y la membrana de nitrocelulosa (Hybond-ECL, Amersham Biosciences) deben ser previamente

humedecid

d

1- En tubo eppendorf 1´5 ml, cargar 15 μl muestra + 15 μl Laemmly buffer 2x con β-mercaptoetanol (agente

reductor).

2- Hervir las mu a 100ºC, 5 min.

3- Centrifugar a 1 er en hielo mientras se carga el gel.

estras en termobloque

eg. Manten3000 rpm, 10 s

Cuadro III.20a- Desnatur

Reactivo

Laemml Tris-HCl 0´0125M + 2% SDS + 5% β-mercaptoetanol + 20%

glicerol + H 6´8.

:

y buffer 2x con β-mercaptoetanol:

0´001% azul de bromofenol; p

Cu

1- Cargar en el gel las muestras y 7 μl marcador de peso molecular (Precision Plus Protein dual color; Bio-

2- Realizar la electroforesis a 180 V, aproximadamente 1 hora o hasta que se hayan resuelto todas las

Rad).

Running Bufferbandas del marcador. El tampón de electroforesis utilizado fue 1x.

Cuadro III.21a- Condiciones de la SDS-PAGE.

So

Ru buffer): 144g glicina + 36´3g Tris + 10g SDS + enrasar hasta 1L

con

Ru

luciones tampón:

nning Buffer 10x (Laemmli electrolyte

H2Od.

nning Buffer 1x: A artir del Running Buffer p 10x, llevar a 1x con H2Od.

Cuadro III.21b- Tampones de la SDS-PAGE.

Una vez finalizada la electroforesis de proteínas, se sumerge el gel en tampón de transferenci

sfer buffer), para eliminar el exceso de SDS. Antes de m(

W

os en este tampón.

74


La transferencia de las proteínas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa se realizó bajo las

siguientes condiciones:

Cuadro III.22a- Protocolo de transferencia. Leyenda: mA, miliamperio.

s lavados posteriores.

A

1- En un cassette (Bio-Rad), montar la transferencia en el siguiente orden:

cátodo→ e sponja→ 2 papeles Whatmann→ gel→ membrana de nitrocelulosa→ 2 papeles Whatmann→

La electroforesis se realizó en Transfer Buffer 1x.

esponja→ ánodo.

2- Transferir a 300 mA, 45 min.

Soluciones:

Transffer Buffer: Running Buffer 1x+ metanol 20x.

TBS 1x (Tris Buffered Sali

6´05 g Tris+ 8´76 g NaCl + ajustar el pH a 7´5 con HCl 1M + enrasar con H2Od hasta 1L.

TBS-T 1x (Tris Buffered Saline Tween): Añadir Tween 20 diluido 1:1000 en PBS 1x.

ne): Disolver en 800 ml H Od: 2

Cuadro III.22b- Tampones empleados en la transferencia y en lo

continuación, se realizó el Western blot, bajo las siguientes condiciones:

Cuadro III.23- Protocolo de Western Blot utilizado.

Leyenda: HRP, horse radish peroxidase (peroxidasa de rábano); enzima que cataliza la oxidación del luminol en

presencia de peróxido de hidrógeno.

1- En un Falcon 50, bloquear la membrana con sol ción de bloqueo: TBS-T 1x + 5% leche desnatada en

polvo. Incubar a tpa.amb., 1h, en agitación orbital.

rpo 1io diluido 1:5000 (en sol. bloqueo), incubar 1 ½ hora (monoclonal α-c-myc; Sigma).

el anticuerpo 2io diluido 1:100000, incubar 45 min (PO conjugated AffinityPure goat α-mouse IgG;

5- Lavar con TBS-T 1x, cada 10 min., durante 1 hora. Realizar un último lavado con PBS 1x.

6- Lavar la membrana con H2

7- Revelar con ECL (Enhanced Chemiluminiscence) Advance Western Blotting Detection Kit (Amersham);

incubar 5 min en oscuridad. Secar la membrana.

u

2- Añadir el anticue

3- Lavar con TBS-T 1x, cada 10 min., durante 1 hora.

4- Añadir

Jackson Inmunoresearch Laboratories).

O y secar.

75

Córtex visual primario

Tracto ópticoCuerpo

geniculado lateral

Radiaciones ópticas

Esquema de la vía visual.

IV- Resultados

76

IV-Resultados

IV- RESULTADOS

1- GEN NDP


1.1.1- FAMILIAS ESTUDIADAS

El estudio molecular directo del gen NDP fue realizado en un total de once familias (ver pág.36).

1.1.2- CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES

Se identificó la mutación responsable en siete de las once familias estudiadas (7/11):

- cuatro mutaciones en las que se produce un cambio de aminoácido en la proteína (4/7): p.Arg38Cys

(identificada en dos familias distintas), p.Arg121Gln y p.Lys104Asn;

- una mutación que produce un codon de parada prematuro (1/7), originando una proteína de menor

tamaño de lo normal: p.Tyr120X;

- una deleción “de novo” de cinco nucleótidos, que altera la pauta de lectura y genera un codon de parada

prematuro, dando lugar a una proteína truncada (1/7): p.Val89fsX101;

- una mutación que afecta al sitio donador del procesamiento (mecanismo de corte y empalme de los

intrones) del intrón 1 del gen NDP (1/7): IVS1+1 G>A.

Familia Cambio de nucleótido Cambio de aminoácido Localización

ANF-7 c.654_658delTGTCG p.Val89fsX101 Exón 3

ANF-8 c.776C>A p.Tyr120X Exón 3

XLDM-46 c.778G>A p.Arg121Gln Exón 3

ND-2 c.529C>T p.Arg38Cys Exón 2

ND-5 c.529C>T p.Arg38Cys Exón 2

ND-12 IVS1+1G>A Intrón 1

ND-14 c.728G>T p.Lys104Asn Exón 3

Tabla IV.1: Mutaciones identificadas en el gen NDP.

77

IV-Resultados

De las mutaciones identificadas en nuestros pacientes, tres son mutaciones nuevas, es decir, no

descritas previamente: p.V89fsX101, p.Tyr120X y p.Lys104Asn.

A B

C AsnLys

Figura IV.1: Mutaciones nuevas identificadas en el gen NDP. A) p.Val89fsX101; B) p.Tyr120X; C) p.Lys104Asn.

El cambio p.Tyr120X se confirmó mediante un ensayo de restricción, ya que esta mutación elimina

una diana reconocida por la endonucleasa de restricción Msp I.

1.1.3- CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS En las familias estudiadas, no se identificaron polimorfismos.

78

IV-Resultados



El análisis de haplotipos se realizó en nueve de las once familias (9/11), debido a que en dos familias

(2/11) únicamente se estudió el caso índice (ver págs. 38-39). En uno de estos dos varones se identificó la

mutación responsable de enfermedad.

1.2.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS

Este análisis realizado en las nueve familias permitió descartar el gen NDP como causante de

enfermedad en una de ellas (1/9), ya que los haplotipos no cosegregaban con la patología ocular. En las

ocho familias restantes (8/9), los haplotipos obtenidos del análisis de los marcadores microsatélites sí

mostraron cosegregación con la enfermedad. En dos de estas familias (2/8) no se han identificado

mutaciones en NDP, mientras que en las seis restantes (6/8) fue posible encontrar el defecto genético.

11 Familias

· Con estudio familiar: 9

· Sin estudio familiar: 2

· Cosegregan: 8

· No cosegregan: 1 ⇒ NNDD--44..

· Mutación identificada: 6⇒ AANNFF--77, XXLLDDMM--4466, NNDD--22, NNDD--55, NNDD--1122, NNDD--1144.. (Ver Tabla IV.1)

· Sin mutación identificada: 2 ⇒ NNDD--11, NNDD--1100..

· Mutación identificada: 1⇒ AANNFF--88.. (Ver Tabla IV.1)

· Sin mutación identificada: 1 ⇒ NNDD--66..

Figura IV.2: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con Enfermedad de Norrie o Vitreorretinopatía

exudativa familiar.

1.2.3- HAPLOTIPOS PREVALENTES

En dos de las familias estudiadas (ND-2 y ND-5) se observó que compartían la misma mutación

[p.Arg38Cys (c.529C>T)] y que además compartían el mismo haplotipo, lo que hizo sospechar que en ambas

familias existiese identidad por descendencia. Para confirmar esta situación, se amplificaron un total de siete

marcadores microsatélite flanqueantes al locus NDP. Este estudio molecular mostró que la región de ADN

común en las dos familias comprendía 5,35 Mb y estaba situada entre los marcadores DXS1068 y DXS8080

(Figura IV.3).

79

IV-Resultados

80

NNDD--22

III:4

? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?

III:3

???????

IV:7

162255178154183175182

IV:8

162255178154183175182

IV:11

162255178154183175184

IV:10

? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?

III:1

???????

DXS8090DXS1068DXS8012

DXS7MAOB

DXS8080DXS1003

IV:1

164255178154183175182


DXS7MAOB

DXS8080DXS1003

IV:6

166 162259 255182 178158 154187 183173 175186 182

IV:5

???????

V:3

162255178154183175182

V:4

162255178154183175182

IV:4

166 162259 255182 178158 154187 183173 175186 182

IV:3

???????

V:1

166259182158187173186


DXS7MAOB

DXS8080DXS1003

V:2

166259182158187173186

III:2

162 160255 253178 176154 152187 183173 175182 180

II:1 II:4II:2 II:3

NNDD--55

Figura IV.3:

IV:132787

162255178154183175168

II:22762

160 162253 255176 178152 154174 174171 183166 168

II:32761

162255178154183175168

II:1

168249170156191175164


DXS7MAOB

DXS8080DXS1003

III:32765

162255178154183175168

III:92770

168 162249 255170 178156 154191 183175 175164 168

III:132773

168 162249 255170 178156 154191 183175 175164 168

III:8

???????

IV:62780

168249170156191175164


DXS7MAOB

DXS8080DXS1003

IV:72781

168249170156191175164

III:122774

164253180152187173166

IV:92783

168249170156191175164

IV:102784

164 162253 255180 178152 154187 183173 175166 168

IV:112785

164 162253 255180 178152 154187 183173 175166 168

III:12763

162255178154183175168


DXS7MAOB

DXS8080DXS1003

IV:122786

164 168253 249180 170152 156187 191173 175166 164

183 175 168

IV:132787

162255178154183175168

II:22762

160 162253 255176 178152 154174 174171 183166 168

II:32761

162255178154183175168

II:1

168249170156191175164


DXS7MAOB

DXS8080DXS1003

III:32765

162255178154183175168

III:92770

168 162249 255170 178156 154191 183175 175164 168

III:132773

168 162249 255170 178156 154191 183175 175164 168

III:8

???????

IV:62780

168249170156191175164


DXS7MAOB

DXS8080DXS1003

IV:72781

168249170156191175164

III:122774

164253180152187173166

IV:92783

168249170156191175164

IV:102784

164 162253 255180 178152 154187 183173 175166 168

IV:112785

164 162253 255180 178152 154187 183173 175166 168

III:12763

162255178154183175168


DXS7MAOB

DXS8080DXS1003

IV:122786

164 168253 249180 170152 156187 191173 175166 164

183 175 168

171 175 166

IV-Resultados

Figura IV.3: Árboles genealógicos simplificados de las familias ND-2 y ND-5, respectivamente. El análisis de haplotipos

realizado con siete marcadores microsatélites (Cen-DXS1003-DXS8080-NDP-MAOB-DXS7-DXS8012-DXS1068-

DXS8090-Tel) confirmó que ambas familias compartían el mismo haplotipo (barra negra). Existen marcadores en las

familias que se desvían de la segregación (Familia ND-2, individuo IV:1, marcador DXS8090; Familias ND-2 y ND-5,

marcador DXS1003). En este análisis se muestra la región común del cromosoma X que comparten (haplotipo negro) y

que los marcadores distales y proximales no están ligados.

1.3- CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO

En los pacientes estudiados, las mutaciones identificadas en el gen NDP se asociaron a tres

fenotipos distintos:

- Enfermedad de Norrie (ND) que produce ceguera desde el nacimiento y, en algunos varones, sordera

neurosensorial y retraso mental;

- Vitreorretinopatía exudativa familiar (VREF) que cursa con vascularización incompleta de la retina, pero sin

alteraciones sistémicas;

- Persistencia de vítreo primitivo hiperplásico (PHPV), que consiste en la aparición de una masa blanca entre

el disco óptico y el cristalino.

Familia Mutación Características retinianas Manisfestaciones extraoculares Fenotipo

ANF-7 p.V89fsX101 Microftalmia unilateral, cataratas. Sordera neurosensorial, retraso mental. ND

ANF-8 p.Tyr120X Microftalmia, cataratas, phthisis bulbi, opacidad corneal.

Sordera, bajo coeficiente intelectual. ND

XLDM-46 p.Arg121Gln Ceguera congénita, phthisis bulbi. No VREF

IV:1⇒ Afectación oftalmológica. No VREF

V:3⇒ Ceguera desde los 5 años. No PHPV ND-2 p.Arg38Cys V:4⇒ Ceguera desde los 2 años, buena

visión en su ojo derecho. No VREF

ND-5 p.Arg38Cys Afectación oftalmológica;

existe un varón asintomático con mutación (III:1).

No VREF

ND-12 IVS1+1G>A Afectación oftalmológica. Retraso mental. ND

ND-14 p.Lys104Asn Afectación oftalmológica. No VREF

Tabla IV.2: Familias con mutación identificada en el gen NDP y fenotipos asociados. En la familia ND-2, se destacan tres

varones con la misma mutación y fenotipos diferentes.

81

IV-Resultados

En la tabla anterior se observa que las distintas mutaciones se asocian a fenotipos diversos e incluso

existe variabilidad intrafamiliar, como se observa en la familia ND-2. El caso más representativo de

heterogeneidad clínica aparece en la familia ND-5, en la que se identificó un varón de 60 años con la

mutación p.Arg38Cys y que no había desarrollado ningún síntoma (Figura IV.3, Familia ND-5, individuo III.1)

Para confirmar esta situación, se extrajo una segunda muestra de sangre del sujeto y se obtuvo el mismo

resultado.

A B DC

pseudogliomas exudados

Figura IV.4: Imágenes del fondo de ojo de un paciente con Enfermedad de Norrie (ANF-7). En ellas se aprecian

pseudogliomas (A, B) y alteraciones en los vasos sanguíneos, que originan exudados cerca de la fóvea (C, D).

1.4- ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS MUTACIONES

Los datos familiares recogidos en la consulta y en el cuestionario (ver pág. 35) permiten conocer la

procedencia geográfica del linaje materno de los pacientes, por lo que se puede representar el origen

geográfico de las mutaciones identificadas.

Familia ANF-7 ANF-8 XLDM-46 ND-2 ND-5 ND-12 ND-14

Procedencia Ciudad Real Cuenca Barcelona Madrid Guadalajara Barcelona Arteixo (La Coruña)

82

IV-Resultados

pp..AArrgg112211GGllnn IIVVSS11++11GG>>AA

pp..LLyyss110044AAssnn

pp..AArrgg3388CCyyss


pp..TTyyrr112200XX

pp..VV8899ffssXX110011

Figura IV.5: Mapa de España en el que se representa el origen geográfico de las mutaciones identificadas en el gen

NDP. La mayor parte proceden del centro de la península, mientras que dos surgen en Barcelona y una en Galicia.

83

IV-Resultados

2- GEN RS1



El estudio molecular directo del gen RS1 fue realizado en un total de veintinueve familias (ver

pág.36).

2.1.2- CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES En este estudio molecular se identificaron mutaciones en el gen RS1 en veinte familias (20/29), de

las cuales diecinueve son españolas y una es portuguesa:

- dieciocho mutaciones en las que se produce un cambio de aminoácido en la proteína (18/20):

p.Glu72Lys (identificada en tres familias españolas -en una de ellas se produce “de novo”- y en una

portuguesa), p.Tyr89Cys, p.Leu137Pro, p.Arg141Cys, p.Gln154Arg (identificada en cinco familias

distintas), p.Arg197Cys, p.Arg209His, p.Arg213Gln, p.Glu215Gln, p.Glu215Val y p.Leu216Pro.

- una mutación “de novo” que produce un codon de parada prematuro (1/13): p.Gln80X.

- una inserción de un nucleótido (1/13), que altera la pauta de lectura y genera una proteína anómala de

sesenta y nueve aminoácidos más larga de lo normal: p.His194fsX263.

Familia Cambio de nucleótido Cambio de aminoácido Localización

XLRS-43*, 93, 104, 185 c.214G>A p.Glu72Lys Exón 4

XLRS-108* c.238C>T p.Gln80X Exón 4

XLRS-44 c.266A>G p.Tyr89Cys Exón 4

XLRS-102 c.410T>C p.Leu137Pro Exón 5

XLRS-95 c.421C>T p.Arg141Cys Exón 5

XLRS-30, 70, 97, 143, 161 c.461A>G p.Gln154Arg Exón 5

XLRS-124 c.579_580insC p.His194fsX263 Exón 6

XLRS-145 c.589C>T p.Arg197Cys Exón 6

XLRS-112 c.626G>A p.Arg209His Exón 6

XLRS-45 c.638G>A p.Arg213Gln Exón 6

XLRS-29 c.643G>C p.Glu215Gln Exón 6

XLRS-101 c.644A>T p.Glu215Val Exón 6

XLRS-107 c.647T>C p.Leu216Pro Exón 6

Tabla IV.3: Mutaciones identificadas en el gen RS1. Se identificaron un total de trece cambios diferentes en hemizigosis

en la región codificante del gen. *: Indica que la mutación se produce “de novo”.

84

IV-Resultados

De las mutaciones identificadas en nuestros pacientes, cuatro son mutaciones nuevas: p.Gln80X,

p.Leu137Pro, p.Gln154Arg y p.Glu215Val.

A B

DC

Q154R (A461G)

Figura IV.6: Mutaciones nuevas identificadas en el gen RS1. A) p.Gln80X; B) p.Leu137Pro; C) p.Gln154Arg;

D) p.Glu215Val.

La alteración más frecuente en nuestras familias fue el cambio p.Gln154Arg, que se identificó en

cinco de ellas (5/20). (Figura IV.5C). Para determinar que se trataba de un cambio patogénico y no de un

polimorfismo, se estudiaron setenta y seis cromosomas en individuos control mediante ensayo de restricción,

ya que la mutación genera una diana de restricción para la enzima Aci I. El análisis mostró que la mutación

no aparecía en ninguno de los controles. Asimismo, el análisis de haplotipos demostró que la mutación

segregaba en todos los individuos afectos pertenecientes a estas cinco familias, como se verá más adelante.

Mediante el estudio directo, se identificaron otras dos mutaciones nuevas que provocan cambio de

aminoácido, p.Leu137Pro y p.Glu215Val, localizadas en los exones 5 y 6 del gen RS1 respectivamente

(Figuras IV.5 B y D). Estas nuevas variantes alélicas no se encontraron en setenta y seis cromosomas

control analizados, ya que ambas alteraciones eliminan las dianas de restricción para las endonucleasas Eco

NI y Alu I, respectivamente.

El cambio p.Glu215Val se identificó en un varón afecto y también en su madre, por lo que se descarta que

este evento mutacional se haya producido “de novo” (Familia XLRS-101, ver pág. 41). Sin embargo, no se

pudo establecer el origen de la mutación p.Leu137Pro, ya que únicamente se estudió el caso índice (Familia

XLRS-102, ver pág. 41).

Por último, se identificó una mutación nueva que produce un codon de parada prematuro, originando

una proteína truncada: p.Gln80X (Figura IV.5A). Este cambio aparece en el varón pero no en su madre, lo

que sugiere que la alteración se haya producido “de novo”. (Familia XLRS-108, ver pág. 42).

85

IV-Resultados

2.1.3- CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS

En las familias estudiadas, no se identificaron polimorfismos.



El estudio familiar se realizó en diecinueve de las veintinueve familias (19/29), debido a que en diez

familias (10/29) únicamente se contaba con el caso índice (ver págs. 40, 41, 42). En seis de estos varones

estudiados (6/10) se identificó la mutación en RS1.

2.2.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS

En las diecinueve familias en las que se realizó el estudio familiar, fue posible descartar el gen RS1

como responsable en dos de ellas (2/19) en las que se observó que los haplotipos no cosegregaban con la

enfermedad. En las diecisiete familias restantes que mostraban cosegregación, se identificó el defecto

genético en catorce de ellas (14/17).



· Cosegregan: 17

· No cosegregan: 2 ⇒ XXLLRRSS--5566, XXLLRRSS--111144.

· Mutación identificada: 14⇒ XXLLRRSS--2299, XXLLRRSS--3300, XXLLRRSS--4433, XXLLRRSS--4455, XXLLRRSS--7700, XXLLRRSS--9933, XXLLRRSS--9955, XXLLRRSS--9977, XXLLRRSS--110011, XXLLRRSS--110044, XXLLRRSS--110077, XXLLRRSS--110088, XXLLRRSS--112244, XXLLRRSS--118855. (Ver Tabla IV.3)

· Sin mutación identificada: 3 ⇒ OONNCCEE--6622, RRPP--113300bbiiss, RRPP--116622bbiiss.

· Mutación identificada: 6⇒ XXLLRRSS--4444, XXLLRRSS--110022, XXLLRRSS--111122, XXLLRRSS--114433, XXLLRRSS--114455, XXLLRRSS--116611. (Ver Tabla IV.3)

· Sin mutación identificada: 4 ⇒ XXLLRRSS--5533, XXLLRRSS--5555, XXLLRRSS--110033, XXLLRRSS--114444.

29 Familias

Figura IV.7: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con Retinosquisis juvenil.

86

IV-Resultados

2.2.3- HAPLOTIPOS PREVALENTES

En este estudio molecular, se han identificado dos mutaciones prevalentes: p.Gln154Arg y

p.Glu72Lys. El cambio más frecuente fue la nueva mutación p.Gln154Arg, que se identificó en cinco familias

(ver Tabla IV.3). Una vez realizado el estudio familiar, se observó que los pacientes pertenecientes a estas

familias compartían un haplotipo idéntico, sugiriendo identidad por descendencia.

Para confirmar esta situación, se amplificaron un total de siete marcadores microsatélites a lo largo del

cromosoma X, flanqueantes al gen RS1. Este análisis permitió determinar que los pacientes compartían un

fragmento común de ADN de 3,27 Mb, localizado entre los marcadores DXS1053 y DXS999.

I:1 I:2

II:1

I:1 I:2

II 1

I:1 I:2

II:1

I:1 I:2

II:1

I:1 I:2

II:1

XXLLRRSS--116611 XXLLRRSS--114433 XXLLRRSS--3300 XXLLRRSS--9977 XXLLRRSS--7700

DXS8022 DXS1053 DXS8019 DXS9911 RS1 DXS999 DXS1226 DXS989

164 202 155 176 RS1 265 294 176

174 202 155 176 RS1 265 292 176

172 202 155 176 RS1 265 294 176

174 202 155 176 RS1 265 290 176

172 202 155 178 RS1 265 298 192

170 202 155 176 RS1 265 298 178

TEL

CEN

99/684

04/657

03/816 04/804 04/1522

Figura IV.8: Árboles genealógicos simplificados de las familias XLRS-30, XLRS-70, XLRS-97, XLRS-143 Y XLRS-161,

portadoras de la mutación p.Gln154Arg (c.461A>G) y análisis de haplotipos realizado con 7 marcadores microsatélites

(Tel-DXS8022-DXS1053-DXS8019-DXS9911-RS1-DXS999-DXS1226-DXS989-Cen). El estudio molecular confirmó que

los individuos portadores de la mutación p.Gln154Arg compartían una región común en el cromosoma X, localizada entre

los marcadores DXS1053 y DXS999.

La segunda mutación más frecuente fue el cambio p.Glu72Lys, que se identificó en cuatro familias

(ver Tabla IV.3). Sin embargo, estas familias no parecen estar relacionadas entre si, ya que presentaban

haplotipos diferentes (Figura IV.8).

87

IV-Resultados

88

Los datos oftalmológicos obtenidos de cada paciente, así como las mutaciones identificadas, se

recogen en la siguiente tabla (Tabla IV.4):

En los pacientes estudiados, se observaron manifestaciones clínicas similares, independientemente

del tipo de mutación identificada en el gen RS1. En general, presentan pérdida de la agudeza visual central,

amplitud reducida de la onda b en el ERG y fondo de ojo en el que se observan desgarros (en inglés schisis)

maculares y presencia de velos vítreos. Los pacientes de mayor edad (XLRS-44, XLRS-95) presentan

afectación macular más severa y atrofia del EPR (George ND et al., 1996).


Figura IV.9: Árboles genealógicos simplificados de las familias portadoras de la mutación p.Glu72Lys, construidos con 3

marcadores microsatélites (Tel- DXS9911-RS1-DXS999- DXS989-Cen). En este caso, se descarta un posible efecto

fundador, ya que los varones afectos presentan haplotipos distintos entre si.

II:202/46

178 178272 274180 182

II:1

???

III:101/508

178274182

III:202/47

178274182

I:102/596

?

I:202/595? ?

XXLLRRSS--4433

XXLLRRSS--110044

II:2

???

II:304/1280

182 178256 272186 176

III:203/986

182256186

I:1

???

I:2

? ?? ?? ?

II:504/1279

182 178256 272186 176

II:4

???

III:404/803

182256186

III:304/1277

176 178264 272176 176

II:6

???

III:5

???

III:604/1276

178 182256 256192 186

III:104/1278

178 178272 272168 176

II:104/1281

182 178256 272186 176

II:704/1275

182 178256 272186 176

XXLLRRSS--118855

I:105/1219

176259186

I:205/1220

182 180273 273176 184

II:105/1221

182273176

XXLLRRSS--9933

I:103/544

176272176

I:203/545

176 178256 264178 176

II:103/532

176 178272 264176 176

II:203/533

176 176272 256176 178

II:303/546

176256178

89

Mutación Familia Edad de inicio

Edad actual Fondo de ojo Apariencia del

vítreo ERG Complicaciones

p.Glu72Lys XLRS-43 4 meses 8 años Desprendimiento de retina, microquistes periféricos. Normal Reducido Estrabismo congénito,

leves anomalías vasculares.

p.Glu72Lys XLRS-93 12 años 34 años Microquistes maculares, squisis periférica. Velos vítreos Estrabismo y ambliopía, AV: 20/100.

p.Glu72Lys XLRS-104 8 años 17 años Squisis macular y periférica, quistes maculares. Velos vítreos ↓ amplitud onda b AV: 10-20/100

p.Gln80X XLRS-108 7 años No disponible.

p.Tyr89Cys XLRS-44 10 años 52 años Atrofia macular del EPR, papilas pálidas. Velos vítreos Onda b no registrable Cataratas, AV: 10/100, escotomas absolutos.

p.Leu137Pro

XLRS-102 6 años 22 años Squisis macular y periférica, quistes

maculares. Normal Onda b no registrable Hemorragias del vítreo, AV: 20-32/100.

p.Arg141Cys XLRS-95 4-5 años 40 años Atrofia macular del EPR, atrofia coriorretiniana.

Degeneración vitreorretiniana tipo Goldmann-Favre

Sin respuesta Catarata incipiente, no perfusión de los capilares), AV: 10/100.

p.Gln154Arg XLRS-30 18 meses 22 años Desprendimiento de retina, mácula con grandes agujeros. Normal Hemorragia del vítreo

p.Gln154Arg XLRS-70 1 año 3 años Desdoblamiento de las capas retinianas,

degeneración macular microquística. Velos vítreos ↓ amplitud onda b Endotropía e hipermetropía.

p.Gln154Arg XLRS-97 6 meses 4 años Desprendimiento de retina, squisis macular. Normal ↓ amplitud onda b Hemorragia vitreorretiniana, estrabismo.

p.Gln154Arg XLRS-143 2 años 7 años Squisis macular y periférica. Normal ↓ amplitud onda b AV: 20-30/100

p.Gln154Arg XLRS-161 1 año 3 años Squisis macular Normal ↓ amplitud onda b

p.His194fsX263 XLRS-124 7-8 años 15 años Squisis macular Normal Alterado Pérdida de visión, fotofobia y discromatopsia.

p.Arg197Cys XLRS-145 3 años 25 años Squisis macular. Normal ↓ amplitud onda b AV: 40-50/100

p.Arg209His XLRS-112 Congénito 34 años RS desde la infancia. Persistencia de vítreo primitivo. Cataratas congénitas, AV: 2-5/100.

p.Arg213Gln XLRS-45 7 años 18 años Squisis macular y periférica. Normal ↓ amplitud onda b Nictalopia, AV: 10/100.

p.Glu215Gln XLRS-29 5 años 21 años Microquistes en máculas. Normal Onda b no registrable Nictalopia, fotofobia, escotomas relativos, hemorragia del vítreo,

AV: 10-20/100.

p.Glu215Val XLRS-101 2 años 23 años Lesión macular bilateral. Normal Abolido Estrabismo nictalopia, fotofobia, ambliopía, AV: 30-40/100.

p.Leu216Pro XLRS-107 13 años 26 años Squisis macular. Velos vítreos ↓ amplitud onda b AV: 20-30/100.

IV-Resultados

En la tabla anterior, se observa que los pacientes presentan alteraciones semejantes en el fondo de

ojo, con complicaciones clínicas que difieren entre si. La edad de comienzo de la enfermedad es variable,

aunque suele producirse en la infancia temprana o incluso ser congénita.

Figura IV.10: A) Fondo de ojo de paciente con RS (XLRS-45), de 17 años, en la que se observan grandes velos vítreos

(flechas negras). B) TCO del paciente de la familia XLRS-104, de 16 años, en la que se aprecian quistes a nivel macular

(flechas blancas). C) Fondo de ojo y D) AGF del paciente de la familia XLRS-95, de 40 años de edad. En estadíos más

avanzados de enfermedad, se produce atrofia del EPR (flecha negra) y acúmulo de gran cantidad de pigmento (flecha

blanca).

Como caso particular, en la familia XLRS-29 se identificó una mujer afecta, portadora de la mutación

p.Glu215Gln: presentaba ERG abolido, tanto el escotópico como el fotópico, y escotoma absoluto. Otras dos

mujeres de la misma familia mostraban el ERG reducido, pero eran asintomáticas.

Figura IV.11: Árbol genealógico de la familia XLRS-29. La flecha roja muestra a la mujer portadora de la mutación

p.Glu215Gln, que es afecta. Las mujeres señaladas con flechas azules, también portadoras de mutación, presentan

alterado el ERG pero mantienen una buena visión.

I:2

? ?? ?? ?

II:2

? ?? ?? ?

II:4

? ?? ?? ?

II:1

???

III:696/526

177 179275 273173 179

III:896/524

177 179275 273173 179

III:296/765

177 179275 273173 169

III:397/61

177 179275 258173 179

III:196/548

179273179

IV:196/549

179 179273 273179 169

IV:296/550

179 177273 275179 173

IV:396/417

179273169

III:4

(177)(262)(179)

IV:497/60

177275173

IV:597/59

177275173

IV:697/81

179258179

IV:797/82

177 179262 258179 179

III:596/558

181258193

IV:896/523

181 179258 273193 179

IV:996/528

181 179258 273193 179

IV:1096/551

177275173

III:7

???

IV:1196/527

177275173

IV:1296/525

177275173

II:3

???

III:996/552

179273169

III:1296/553

179 181258 272179 181

III:10

? ?? ?? ?

IV:1396/709

179 177273 258169 177

IV:1496/708

???

III:11

???

IV:1696/555

179258179

IV:1796/556

181272181

I:1

???

IV:1596/554

179258179

AA CCBB DD

90

IV-Resultados


En la siguiente tabla se muestra la procedencia geográfica de las madres de los pacientes, por lo

que se puede representar el origen geográfico de las mutaciones identificadas.

Familia XLRS-29 XLRS-30 XLRS-43 XLRS-44 XLRS-45 XLRS-70 XLRS-93

Procedencia Toledo Oviedo Madrid Málaga Córdoba Ayamonte (Huelva) Madrid

Familia XLRS-95 XLRS-97 XLRS-101 XLRS-102 XLRS-104 XLRS-107 XLRS-108

Procedencia Valencia Bilbao Murcia Barcelona Segades (Valladolid) Zaragoza Barcelona

Familia XLRS-112 XLRS-124 XLRS-143 XLRS-145 XLRS-161 XLRS-185

Procedencia Cuenca Madrid Sta. Cruz Tenerife

Sta. Cruz Tenerife Sevilla Lisboa

(Portugal)

pp..GGlluu221155GGllnn

pp..GGllnn115544AArrgg

pp..GGlluu7722LLyyss ((22))

pp..TTyyrr8899CCyyss

pp..AArrgg221133GGllnn



pp..GGlluu221155VVaall

pp..LLeeuu113377PPrroo pp..GGlluu7722LLyyss

pp..LLeeuu221166PPrroo pp..GGllnn8800XX

pp..AArrgg220099HHiiss

pp..HHiiss119944ffssXX226633

pp..GGllnn115544AArrgg pp..AArrgg119977CCyyss


pp..GGlluu7722LLyyss


Figura IV.12: Mapa de la Península Ibérica en el que se representa el origen geográfico de las alteraciones identificadas

en el gen RS1. La distribución de las mutaciones es homogénea, con cierta agregación en el centro y en el sur de

España, así como en el archipiélago canario.

91

IV-Resultados

2.5- ESTUDIOS DE EXPRESIÓN

2.5.1- LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE LA RETINOSQUISINA

Una vez realizada la técnica de inmunocitoquímica, la proteína se detectó en las células mediante

microscopía de fluorescencia confocal:

AA BB CC

Figura IV.13: Imágenes obtenidas mediante microscopía confocal, en células HEK 293 transfectadas con el plásmido

RS1-c-Myc-c-His. A) Imagen de una región de la preparación a 60x.

B) Imagen de dos células de la preparación anterior, obtenida con el objetivo 60x y ampliada con zoom.

C) Imagen de otra región de la preparación en la que se muestran los núcleos contrateñidos con Hoechst (azules).

Las imágenes anteriores muestran que la Retinosquisina se localiza en el citoplasma celular. Sin

embargo, no se detecta en el medio de la preparación, cuando se trata de una proteína secretable. Este

hecho sugiere que la proteína se secreta en muy baja proporción y mediante una transfección transitoria (se

realiza la técnica de inmunohistoquímica a las 72 horas de la transfección) no se detecta. Por ello, se

seleccionaron líneas celulares estables que expresan esta proteína en mayor proporción (ver pág.70).

2.5.2- DETECCIÓN DE LA RETINOSQUISINA MEDIANTE WESTERN BLOT A continuación se muestran las imágenes obtenidas por autorradiografía de los geles SDS-PAGE,

tanto en transfecciones transitorias como en líneas celulares estables:

92

IV-Resultados

Figura IV.14: Western Blot de extractos celulares (EC) y medios condicionados (MC) de RS1 (Retinosquisina), SFRP

(control positivo de secreción) y pcDNA (control negativo). La línea celular utilizada fue HEK 293.

Leyenda: M, marcador de peso molecular.

En la autorradografía del gel, se observa que la Retinosquisina aparece en los extractos celulares, al

igual que en la inmunocitoquímica, pero no se secreta al medio cuando se obtiene mediante transfección

transitoria. Sin embargo, la proteína secretable codificada por el gen SFRP se detectó en los medios

condicionados (Figura IV.14; carril MC SFRP, tamaño 37 kDa).

Al seleccionar líneas estables, fue posible detectar la proteína codifica por RS1 (tamaño 25 kDa), tanto en los

EC como en los MC. Se observan diferencias en la secreción entre los distintos clones:

Figura IV.15: Western Blot de extractos celulares (EC) y medios condicionados (MC) de RS1 (Retinosquisina), SFRP

(control positivo de secreción) y pcDNA (control negativo) líneas MDCK estables.

93

IV-Resultados

3- GEN ABCA4



El estudio molecular directo del gen ABCA4 fue realizado en un total de ciento veintinueve familias

(ver pág.36).

3.1.2- CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES El estudio molecular del gen ABCA4 realizado con el microarray de genotipado, permitió identificar

pacientes con dos alelos mutantes, con un alelo mutante y sin alelos mutantes. Debido al elevado número de

familias estudiadas, los resultados se presentan por fenotipos.

a) Enfermedad de Stargardt (STGD)

Se estudiaron un total de setenta y cuatro familias con STGD, entre las cuales se identificaron:

- veintinueve familias con dos alelos mutantes,

- veintitrés familias con un alelo mutante,

- veintidós familias en las que no se identificaron mutaciones.

0

5

10

15

20

25

30

2 alelosmutantes

1 alelo mutante 0 alelosmutantes

Familias con Enfermedad de Stargardt

Nº familias

Figura IV.16: Familias STGD clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en las siguientes

tablas:

94

IV-Resultados

Familias con dos alelos mutantes

Alelo 1 Alelo 2 Familia

Exón Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido Exón Cambio de

nucleótido Cambio de aminoácido

5 c.455G>A p.Arg152Gln 5 c.455G>A p.Arg152Gln 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys ARDM-141

46 c.6320G>A p.Arg2107His 46 c.6320G>A p.Arg2107His 17 c.2588G>C p.Gly863Ala

ARDM-151

21 c.3163C>T p.Arg1055Trp 19 c.2888 del G p.Gly963fs

5 c.455G>A p.Arg152Gln 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys ARDM-17 46 c.6320G>A p.Arg2107His

46 c.6320G>C p.Arg2107Pro

ARDM-22 19 c.2888 del G p.Gly963fs 45 c.6179T>G p.Leu2060Arg ARDM-31 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 35 c.4926C>G p.Ser1642Arg ARDM-47 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-57 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-60 13 c.1804C>T p.Arg602Trp 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-61 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-62 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser ARDM-64 6 c.634C>T p.Arg212Cys 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser ARDM-66 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 41 c.5819T>C p.Leu1940Pro ARDM-72 5 c.466A>G p.Ile156Val 13 c.1804C>T p.Arg602Trp

ARDM-76 6 c.768G>T p.= o altera el procesamiento (*) 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu

ARDM-82 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3364G>A p.Glu1122Lys ARDM-88 28 c.4139C>T p.Pro1380Leu - IVS40+5 G>A

28 c.4222T>C p.Trp1408Arg ARDM-96 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu

35 c.4918C>T p.Arg1640Trp 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys

ARDM-110 46 c.6320G>A p.Arg2107His

42 c.5882G>A p.Gly1961Glu

ARDM-111 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 22 c.3322C>T p.Arg1108Cys

ARDM-116 46 c.6320G>A p.Arg2107His

30 c.4469G>A p.Cys1490Tyr

ARDM-119 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-128 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu


- IVS40+5 G>A

17 c.2588G>C p.Gly863Ala ARDM-138

19 c.2828G>A p.Arg943Gln 30 c.4537insC p.Gln1513fs


23 c.3386G>T p.Arg1129Leu

95

IV-Resultados





ARDM-153 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs 42 c.5881G>A p.Gly1961Arg ARDM-155 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 13 c.1804C>T p.Arg602Trp ARDM-168 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu 45 c.6179T>G p.Leu2060Arg ARDM-170 9 c.122C>T p.Arg408X 30 c.4457C>T p.Pro1486Leu

Tabla IV.5: Familias STGD en las que se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4. 1: Indica que estas familias se analizaron previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).

Leyenda: p.=, indica que no cambia el aminoácido (antes: p.= (*) p.Val256Val).

Familias con un alelo mutante





25 c.3758C>T p.Thr1253Met ARDM-121

42 c.5882G>A p.Gly1961Glu

ARDM-161 38 c.5395A>G p.Asn1799Asp ARDM-38 13 c.1804C>T p.Arg602Trp ARDM-39 - IVS40+5 G>A ARDM-40 21 c.3056C>T p.Thr1019Met ARDM-63 18 c.2690C>T p.Thr897Ile ARDM-65 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-75 48 c.6721C>G p.Leu2241Val ARDM-78 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-81 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-90 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser ARDM-91 19 c.2791G>A p.Val931Met

ARDM-125 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs ARDM-131 18 c.2701A>G p.Thr901Ala ARDM-135 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-146 21 c.3056C>T p.Thr1019Met ARDM-158 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs ARDM-162 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-163 30 c.4457C>T p.Pro1486Leu ARDM-164 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu ARDM-165 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs ARDM-167 22 c.3211ins GT p.Ser1071fs SRP-773 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu

Tabla IV.6: Familias STGD en las que únicamente se ha identificado un alelo mutante en ABCA4. 1: Indica que esta familia se analizó previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).

96

IV-Resultados

Todas las mutaciones identificadas por el microarray se comprobaron mediante secuenciación

automática. Únicamente se identificaron dos posibles fallos de detección:

- un falso positivo en la familia ARDM-153, debido a que el cambio de nucleótido se producía en la posición

c.5881 G>A (p.Gly1961Arg) en lugar de la posición c.5882 G>A (p.Gly1961Glu) detectada por el chip, es

decir, el el nucleótido anterior (ver Tabla IV.5).

BA B C

Figura IV.17: Secuencias del exón 42 del gen ABCA4. A) Secuencia silvestre;

B) Secuencia con la mutación p.Gly1961Arg; C) Secuencia con la mutación p.Gly1961Glu.

- un falso negativo en la familia ARDM-81, en la que no se detectó la mutación c.4297G>A (p.Val1433Ile),

como se verá más adelante.

A partir de los resultados obtenidos de nuestras familias, calculamos la frecuencia de detección del

microarray en nuestros pacientes STGD, para compararla con los porcentajes de detección obtenidos

habitualmente en otras poblaciones europeas y americanas:

(29 familias x 2 alelos mutantes) + (23 familias x 1 alelo mutante)

x 100 = 54,7%.

148 alelos totales

97

IV-Resultados

Con el fin de testar la eficiencia del microarray en nuestros pacientes STGD, se seleccionaron nueve

pacientes en los que sólo se había identificado uno de los alelos mutantes y se secuenciaron los cincuenta

exones del gen ABCA4. Se identificó el segundo alelo mutante en seis de ellos y se identificaron cinco

mutaciones nuevas:

- una mutación “de novo” en la que se produce un cambio de aminoácido en la proteína: p.Val1433Ile;

esta mutación está descrita y se encuentra incluida entre las cuatrocientas treinta y ocho variantes

alélicas detectadas por el microarray. El hecho de que no se hubiese detectado puede deberse a un

falso negativo del chip.

- tres mutaciones en las que se produce un codon de parada prematuro: p.Gln1315X (identificada en dos

familias, en una de ellas se produce “de novo”): p.Gln2187X.

- una inserción de un nucleótido, que altera la pauta de lectura, genera un codon de parada prematuro y,

en consecuencia, una proteína truncada: c.4739 del T.

- una mutación que afecta al sitio aceptor del procesamiento (mecanismo de corte y empalme de los

intrones) del intrón 22 del gen ABCA4: IVS22-2 A>T.





25 c.3758C>T p.Thr1253Met ARDM-121

42 c.5882G>A p.Gly1961Glu 27 c.3943C>T p.Gln1315X

ARDM-38 13 c.1804C>T p.Arg602Trp 33 c.4739 del T Leu1580fs ARDM-39 - IVS40+5 G>A No detectado ARDM-40 21 c.3056C>T p.Thr1019Met 27 c.3943C>T p.Gln1315X * ARDM-63 18 c.2690C>T p.Thr897Ile No detectado

No detectado ARDM-65 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu ARDM-78 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu 48 c.6559C>T p.Gln2187X ARDM-81 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu 29 c.4297G>A p.Val1433Ile * ARDM-90 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser - IVS22 -2A>T

Tabla IV.7: Mutaciones identificadas en el gen ABCA4 por secuenciación automática.

*: Indica que la mutación se produce “de novo”. 1: Indica que esta familia se analizó previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).

98

IV-Resultados

A B

Figura IV.18: Mutaciones nuevas detectadas en el gen ABCA4. A) p.Gln1315X (c.3943C>T); B) Leu1580fs (4739 del T);

C) Q2187X (c.6559C>T); D) IVS22-2 A>T.

Los tres pacientes anteriores en los que no se identificó el segundo alelo responsable de

enfermedad, se analizaron con la técnica MLPA, para detectar posibles pérdidas o ganancias de material

genético que incluyesen regiones exónicas completas, en las que pudiesen existir mutaciones que no serían

detectadas por secuenciación automática. Mediante este estudio, se observó que los pacientes no

presentaban deleciones ni inserciones de ninguna de las cuarenta y ocho sondas que hibridan

específicamente con cuarenta y ocho exones del gen ABCA4.

Por tanto, la tasa de detección total (microarray+secuenciación+MLPA) de alelos mutantes es la siguiente:

(35 familias x 2 alelos mutantes) + (17 familias x 1 alelo mutante)

x 100 = 58,8%.

148 alelos totales

Asimismo, se amplió el estudio mutacional a los familiares del paciente mediante secuenciación de

las regiones del gen ABCA4 en las que previamente se han identificado mutaciones mediante el microarray

de genotipado.

C DExón 23

99

IV-Resultados

En la familia ARDM-61 (ver pág. 43), se identificó en la paciente la mutación p.Arg1129Leu en

homozigosis (ver Tabla IV.5). No se identificaron otras alteraciones patogénicas, a excepción de dos

polimorfismos en homozigosis (p.His423Arg, IVS33+48 C>T). Al ampliar el estudio familiar, se observó que

únicamente su padre era portador de un alelo mutante mientras que su madre presentaba alelos silvestres

en ambas copias del gen (Figura IV.19 A, B). Con el fin de determinar si esta segregación se había producido

por disomía uniparental paterna o por microdeleción del cromosoma 1 materno, se realizó la técnica MLPA

que permite detectar pérdidas (o ganancias) de material genético. El resultado de este análisis molecular

permitió establecer que la paciente presentaba ambas copias del gen ABCA4, descartando una posible

deleción del alelo materno (Figura IV.19 C). Estudios posteriores demostraron que esta segregación era

debida a una isodisomía parcial paterna, como se verá más adelante.

02/724 02/726 02/725

LLeeuu GGllyy AAsspp AArrgg IIllee AAllaa IIllee ↓↓ LLeeuu

CC TT TT GG GG GG GG AACC CCGG CC AA TT TT GG CC CCAA TT CC ↓↓ TT

LLeeuu GGllyy AAsspp AArrgg IIllee AAllaa IIllee

CC TT TT GG GG GG GG AACC CCGG CC AA TT TT GG CC CCAA TT CC

LLeeuu GGllyy AAsspp AArrgg IIllee AAllaa IIllee ↓↓ LLeeuu

CC TT TT GG GG GG GG AACC CCGG CC AA TT TT GG CC CCAA TT CC ↓↓ TT

B

C

02/725

Control

A

II:2

III:102/723

II:102/721

II:302/722

I:102/724

II:402/725

I:202/726

Figura IV.19: A) Árbol genealógico de la familia ARDM-61. B) Secuencias de la paciente (mutación p.Arg1129Leu en

homozigosis), de su padre (portador del cambio p.Arg1129Leu) y de su madre (no portadora), respectivamente. C)

Electroferogramas del MLPA realizado en la paciente y en un control sano (los picos sombreados representan las sondas

que hibridan con los exones de ABCA4, los picos normales son sondas sintéticas). Cada sonda presenta un patrón de

amplificación normal, que sugiere que existe una dosis normal en ambas copias del gen ABCA4. Por tanto, se descarta la

posibilidad de microdeleción materna.

100

IV-Resultados

b) Distrofia de conos y bastones (DCB)

Se estudiaron un total de veintiocho familias con DCB, entre las cuales se identificaron:

- seis familias con dos alelos mutantes,

- cuatro familias con un alelo mutante,

- dieciocho familias en las que no se identificaron mutaciones.

0

5

10

15

20

25

30

2 alelosmutantes

1 alelomutante

0 alelosmutantes

Familias con Distrofia de Conos y Bastones

Nº familias

Figura IV.20: Familias DCB clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en las siguientes

tablas:


Alelo 1 Alelo 2 Familia Cambio de


Cambio de nucleótido

Cambio de aminoácido Exón Exón

ARDM-79 19 c.2888delG p.Gly963fs 19 c.2888delG p.Gly963fs ARDM-86 19 c.2888delG p.Gly963fs 19 c.2888delG p.Gly963fs

ARDM-126 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser 43 c.5929G>A p.Gly1977Ser ARDM-133 1 c.32T>C p.Leu11Pro 19 c.2888 del G p.Gly963fs ARDM-176 19 c.2888delG p.Gly963fs 45 c.6179T>G p.Leu2060Arg

RP-267 36 c.5041_5055del p.Val1681_Cys1685del 36 c.5041_5055del p.Val1681_Cys1685del

Tabla IV.8: Familias DCB en las que se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4.

101

IV-Resultados






ARDM-99 29 c.4297G>A p.Val1433Ile ARDM-174 35 c.4918C>T p.Arg1640Trp

RP-577 9 c.1140T>A p.Asn380Lys RP-959 5 c.466A>G p.Ile156Val

Tabla IV.9: Familias DCB en las que únicamente se ha identificado un alelo mutante en ABCA4.

El cambio c.2888delG fue el alelo mutante más frecuente entre los pacientes DCB. Se identificaron

dos pacientes con esta alteración en homozigosis (ARDM-79 y ARDM-86) y otros dos pacientes en los que la

mutación forma un heterozigoto compuesto (ver Tabla IV.8). En la paciente de la familia ARDM-79, el

diagnóstico clínico cambió de STGD (a los 10 años de edad) a DCB (a los 26 años), durante la realización de

este estudio. Esta mujer presentó inicialmente hallazgos oftalmológicos compatibles con STGD (palidez

papilar, maculopatía inespecífica con puntos de pigmento que confieren un aspecto grisáceo, campo visual

con escotoma paracentral, vasos retinianos ligeramente atenuados y discromatopsia). En una segunda

exploración realizada a los veintiséis años de edad, la paciente mostró ERG abolido (fotópico y escotópico),

reducción del campo visual periférico (prácticamente escotoma absoluto), afinamiento de los vasos retinianos

y pigmento en forma de espículas óseas, consistente con un diagnóstico de DCB.

Las mutaciones identificadas por el microarray se confirmaron mediante secuenciación automática,

siendo correctas en todos los casos. Asimismo, en el paciente perteneciente a la familia ARDM-99, en el que

únicamente se había identificado un alelo responsable de enfermedad, se analizaron los cincuenta exones

del gen ABCA4 mediante secuenciación. En este caso, no se detectó el segundo alelo mutante.

Este paciente también se analizó mediante MLPA, sin que se identificasen alteraciones en las sondas que

pudiesen sugerir pérdidas o ganancias de material genético.

102

IV-Resultados

c) Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva (RPAR)

Se estudiaron un total de diecisiete familias con RPAR, entre las cuales se identificaron:

- cuatro familias con un alelo mutante,

- trece familias en las que no se identificaron mutaciones,

- no se identificó ninguna familia que fuese portadora de mutaciones en ambos alelos de ABCA4.

0

5

10

15

20

25

30

2 alelosmutantes

1 alelomutante

0 alelosmutantes

Familias con Retinosis Pigmentaria Autosómica Recesiva

Nº familias

Figura IV.21: Familias RPAR clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en la siguiente tabla:





ARRP-700 42 c.5843CA>TG p.Pro1948Leu SRP-766 15 c.2300T>A p.Val767Asp SRP-775 5 c.466A>G p.Ile156Val SRP-834 - IVS40+5 G>A

Tabla IV.10: Familias RPAR en las que únicamente se ha identificado un alelo mutante en ABCA4.

Las mutaciones identificadas en estas familias se comprobaron por secuenciación, coincidiendo con

los resultados obtenidos por el microarray de genotipado.

103

IV-Resultados

d) Fenotipo diverso

Se estudiaron un total de tres familias en las que aparecen afectos con distintas distrofias de retina,

entre las cuales se identificaron:

- una familia en la que se identificó un afecto de STGD con dos alelos mutantes,

- dos familias en las que se identificaron sendos afectos con un único alelo mutante.

0

5

10

15

20

25

30

2 alelosmutantes

1 alelomutante

0 alelosmutantes

Familias con fenotipo diverso

Nº familias

Figura IV.22: Familias con afectos que presentan distintos fenotipos clasificadas en función de los alelos mutantes

identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias, así como el fenotipo exhibido,

se recogen en las siguientes tablas:


Alelo 1 Alelo 2 Familia ⇒ Nº ADN Fenotipo Cambio de




RP-2801 ⇒ 95/93 38 c.5413A>G p.Asn1805Asp 38 c.5413A>G p.Asn1805Asp STGD

RP-280 ⇒ 95/96 38 c.5413A>G p.Asn1805Asp RP precoz

Tabla IV.11: Familia con miembros que presentan distintos fenotipos retinianos en las que se han identificado ambos

alelos mutantes en ABCA4. 1: Indica que esta familia se analizó previamente en la Universidad de Barcelona (Paloma E et al., 2001).

104

IV-Resultados

p.Asn1805Asp

I:195/91

I:295/92

II:195/93

II:295/94

II:395/95

II:495/96

p.Asn1805Asp P,Asn1805Asp

p.Asn1805Asp p.Asn1805Asp p.Asn1805Asp

SSTTGGDD RRPP pprreeccoozz

Figura IV.23: Árbol genealógico de la familia RP-280 en la que muestra la segregación de los alelos mutantes en ABCA4

y los respectivos fenotipos.

En una mujer afecta de esta familia (II:4), portadora de un único alelo mutante en ABCA4, se

identificó un alelo mutante en el gen CRB1 (Human Crumbs Homologue 1), implicado en la Amaurosis

Congénita de Leber (LCA) y RP precoz (E.Vallespin et al., 2005). Esta mujer presenta un fondo de ojo típico

de RP con preservación del epitelio paraarteriolar, mientras que su hermano afecto, portador de la mutación

p.Asn1805Asp en homozigosis, manifiesta un fenotipo típico de Enfermedad de Stargardt.

Como se observa en la Figura IV.20, los alelos mutantes identificados en ABCA4 cosegregan con la

enfermedad en el probandus (II:1), pero no en su hermana. El análisis de haplotipos confirmó esta

segregación, como se verá más adelante.


Alelo 1 Alelo 2 Familia ⇒ Nº ADN Fenotipo Cambio de




RP-315 ⇒ 95/397 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu DCB

RP-315 ⇒ 95/398 DM Best

RP-315 ⇒ 95/399 42 c.5882G>A p.Gly1961Glu FFM

RP-532 ⇒ 99/115 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu STGD

RP-532 ⇒ 99/114 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu DCB

RP-532 ⇒ 99/146 23 c.3386G>T p.Arg1129Leu DCB

Tabla IV.12: Familias con miembros que presentan distintos fenotipos retinianos en los que se ha identificado un alelo

mutante en ABCA4. Leyenda: DM: Distrofia macular de Best; FFM: Fundus flavimaculatus.

105

IV-Resultados

B

I:295/397

I:1

II:195/398

II:295/399

p.Gly1961Glu

p.Gly1961Glu

FFFFMM

DDCCBB

DDMM BBeesstt

A

I:199/117

I:299/116

315. B) Familia RP-532.

lelos mutantes en ABCA4 y los respectivos fenotipos.

madre afecta (I:2) presenta un fenotipo de DCB, mientras

24), que es una manifestación menos severa que

fondo de ojo que concuerda con distrofia macular de

cada por mutaciones en el gen VMD2 -Vitelliform

En la familia RP-532 isma segregación del alelo

ermano (II:2) muestra un fenotipo STGD.

Figura IV.24: A) Familia RP-

En ambos árboles genealógicos se muestra la segregación de los a

En la familia RP-315, se observa que la

que su hijo afecto (II:2) muestra un fenotipo FFM (ver pág.

la STGD. Como caso peculiar, la hija (II:1) presenta un

Best (distrofia macular juvenil, autosómica dominante, provo

Macula Dystrophy Gene 2-).

, los tres hermanos afectos presentan la m

p.Arg1129Leu. Sin embargo, ambas hermanas (II:1, II:3) presentan un fenotipo DCB mientras que el

h

Las mutaciones identificadas en estas familias se comprobaron por secuenciación, coincidiendo con


II:299/115

II:199/114

II:399/146

P,Arg1129Leu

DDCCBB

SSTTGGDD p.Arg1129Leu

DDCCBB

p.Arg1129Leu p.Arg1129Leu

106

IV-Resultados

e) Distr

, entre las cuales se identificaron:

dos familias con un alelo mutante; en una de ellas (ADDM-92) se identificó una paciente afecta de distrofia

acular, compatible con STGD, en la que se detectaron ambos alelos mutantes en ABCA4.

- cinco familias en las que no se identificaron mutaciones,

ofia Macular Autosómica Dominante (ADDM)

Se estudiaron un total de siete familias con ADDM

-

m

0

5

10

15

20

25

30

2 alelosmutantes

1 alelomutante

0 alelosmutantes

Familias con Distrofia Macular Autosómica Dominante

Nº familias

Figura IV.25: Familias ADDM clasificadas en función de los alelos mutantes identificados.

Los alelos mutantes de ABCA4 identificados en las distintas familias se recogen en la siguiente tabla:


Alelo 1 Alelo 2 Familia ⇒ Nº ADN Exón Cambio de

nucleótido Cambio de aminoácido Exón Cambio de


Fenotipo

ADDM-59⇒ 02/468 42 c.5582G>A p.Gly1961Glu DM

ADDM-92 ⇒ 03/397 5 c.466A>G p.Ile156Val DM

ADDM-92 ⇒

03/456 5 c.514G>A p.Gly172Ser 45 c.6148G>T p.Val2050Leu STGD

ADDM-92 ⇒ 03/691 18 c.2690C>T p.Thr897Ile

Tabla IV.13: Familias ADDM en las que se han identificado alelos mutantes en ABCA4.

Leyenda: DM: Distrofia macular.

107

IV-Resultados

En la familia ADDM-92 se realizó un estudio con el microarray en individuos afectos (III:5, IV:2, IV:3)

y en alg los mutantes en

a afecta

ojo de esta paciente es compatible con STGD.

Figu ealóg a ADDM-9 la que se muestra la segregación de los alelos mutantes en

AB ectivo notip

Las mutaciones identificadas en n por secuenciación, coincidiendo con


unos miembros sanos (II:2, III:4, III:6), mediante el cual se identificaron diversos ale

ABCA4, como se indica en la Figura IV:23 (en la Tabla IV.13 únicamente se recogen los familiares que

presentan diferentes alelos entre sí). La ampliación del estudio familiar permitió identificar a una prim

(IV:3) con mutaciones en ambos alelos del gen. El fondo de

ra IV.26: Árbol gen ico de la famili 2 en

CA4 y los resp s fe os.

estas familias se comprobaro

II:1 II:203/446

I:1

III:203/398

III:1

II:3

IV:203/397

III:503/690

III:403/455

IV:1

V:1/18306

III:603/691

III:3

IV:303/456

p.Ile156Val

DDMM

DDMM

p.Ile156Val

p.Ile156Val

p.Val2050Leu p.Thr897Ile

SSTTGGDD

p.Val2050Leu p.Ile156Val p.Gly172Ser

108

IV-Resultados

109

En la siguiente gráfica se comparan los alelos mutantes identificados en los distintos fenotipos, en la

que se aprecia que la patología en la que se detecta un mayor número de alelos mutantes es en la STGD.

En las restantes retinopatías, el mayor porcentaje lo representa la no detección de mutaciones.

0STGD DCB RPAR Otr

5

10

15

20

25

30

35

40

os

2 alelos mutantes1 alelo mutante0 alelos mutantes

Figura IV.27 pos asociados a mutaciones en el gen ABCA4 y

os en cada uno de ellos.

Leye 15, RP-532, ADDM-59 y ADDM-92.

con dos alelos mutantes.

En la mue tinueve pacientes, se identificaron un total de

nco alelos mutantes diferentes:

treinta y nueve alelos sencillos (39/45),

-

- un alelo triple mutante (1/45).

ncia al tipo de mutaciones, se observó que:

la mayor parte de las mutaciones producen un cambio de aminoácido en la proteína (35/45),

cinco producen cambios en la pauta de lectura (5/45),

- tres

miento de los intrones (2/45).

generan un codon de parada prematuro y, por tanto, una proteína truncada (3/45),

- dos alteran los sitios donadores/aceptores del procesa

-

-

En refere

-

cuarenta y ci

cinco alelos dobles mutantes (5/45),

: Histograma en el que se representan los distintos fenoti

porcentaje de alelos mutantes identificad

nda: En la columna Otros se incluyen las familias RP-3

La familia RP-280 se clasifica como STGD

stra que conforman nuestros ciento vein

cuencias.

110

Figura IV.28: gráfi e representan el total lelos mutantes di entificados en el gen ABCA4, así como sus respectivas freEn esta ca s de a ferentes (45) id

0

5

10

15

20

25

R1129LG1961E

2888 del G

R152Q + R2107H + R1108CG1977S

3211 ins GT R602W

IVS40 +5 G>AI156V

L2060RQ1315XT1019MV1433I

R1108C + R2107HP1486L

5041 del VVAIC

N1805D

T1253M + G1961E

G863A + R1055WN1799DR2017PS1642R

4739 del TT897IR212CL1940PL2

V25241V

6V o alt.proc.

Q2187XE1122KP1380L

IVS22 -2 A>T

V931M

W1480R + R1640WC1490Y

T901AG863A + R943Q

4537 ins CG1961R

R408XL11P

R1640WN380P

K1948LV767D

%00´́9933%11´́8877%%%

88´́441

2222´́44

1%%

33%%

´́447777 %% 44´́6677%% 33´́7744%%

22´́8800%

IV-Resultados

3.1.3- CARACTERIZACIÓN DE POLIMORFISMOS El microarray de genotipado ha permitido detectar mutaciones bios a nivel de ADN que resultan

patológicos para el individuo) y polimorfismos (cambios a nivel de ADN a nivel de proteína no patológicos

para el individuo) en el gen ABCA4. En este gen se ha identificado dos e polimorfismos:

- cambios en la secuencia de ADN que no alteran la secuencia de aminoácidos de la proteína: mutaciones

sinónimas o polimorfismos;

- cambios de nucleótido que producen un cambio de aminoácido en la proteína, pero que se han

identificado en homozigosis en población control sin que produzca ectación retiniana en el individuo:

polimorfismos proteicos.

En la siguiente tabla se indican las frecuencias de los cambios identifica :

Polimorfismo

(cam

o

tipos d

n af

dos


Cambio de aminoácido

Frecuencia

6 c.635G>A p.Arg212His 3´3% 10 c.1268A>G p.His423Arg 28´3% 10 c.1269C>T p.= (1) 3´3% - IVS10+5 del G 21´7%

19 c.2828G>A p.Arg943Gln 6´1% 28 c.4203C>A p.= (2) 2´9% - IVS33+48 C>T 57´0%

40 c.5603A>T N1868I 10´2% 40 c.5682G>C p.= (3) 27´4% 41 c.5814A>G p.= (4) 16´8% 42 c.5843CA>TG P1948L 3´3% 42 c.5844A>G p.= (5) 12´7% 44 c.6069C>T p.= (6) 9´0% 45 c.6249C>T p.= (7) 8´2% 46 c.6285T>C p.= (8) 16´4% - IVS48+21 C>T 2´4%

49 c.6764G>T p.Ser2255Ile 6´5%

Tabla IV.14: Polimorfismos, proteicos y no proteicos, iden dos en ABCA4.

Leyenda: p.=, indica que no cambia el aminoácido (antes: p.= (1) p.His423His; p p.Pro1401Pro; p.= (3) p.Leu1894Leu;

p.= (4) p.Leu1938Leu; p.= (5) p.Pro1948Pro; p.= (6) p.Ile2023Ile; p.= (7) p 083Ile; p.= (8) p.Asp2095Asp.

tifica

.= (2)

.Ile2

111

IV-Resultados

Se identificaron un total de diecisiete polimorfismos diferentes, de los cuales:

och

Figura IV. ados en el CA4 y sus resp ecuencias.

- o son mutaciones sinónimas (8/17),

- seis son variantes que provocan un cambio de aminoácido en la proteína (6/17),

- tres cambios se producen en zona intrónica (3/17).

29: Polimorfismos identific gen AB ectivas fr

020406080

100120140160

R212H

H42 423H

10+5

del G

86

8I

L189

4L19

3 948L19

48PI20

23I

I2083

I

D

IV

>T

S2255

I3R

H

IVSR94

P14 48 C>N1

3Q 01P T

IVS33+ L P

8L

P1 2095

D

21 C

S48+

33´́33%%

2288´́33%%

33´́33%%

2211

2

´́77%%

66´́11%% 2´́99%%

5577´́00%%

1100

60

45

30

15

0

´́22%%

2277´́44%%

1166´́88%%

33´́33%%

1122´́77%%99´́00%% 88´́22%%

1166´́44%%

22´́44%% 66´́55%%

112

IV-Resultados

3.2- ES

de las ciento veintinueve familias (79/129), como se

erá a continuación.

.2.2- ANÁLISIS DE HAPLOTIPOS

Debido al elevado número de familias estudiadas, los resultados se presentan por fenotipos.

a) Enfermedad de Stargardt (STGD)

El análisis de haplotipos se realizó en cincuenta y tres de las setenta y cuatro familias con STGD

(53/74), ya que en veintiuna de las familias (21/74) únicamente se contaba con el caso índice (ver págs. 43-

47). En las familias estudiadas, fue posible descartar el gen ABCA4 como responsable en cuatro de ellas

(4/53) en las que se observó que los haplotipos no cosegregaban con la enfermedad. En las cuarenta y

nueve familias restantes que mostraban cosegregación, se identificaron alelos mutantes en cuarenta y dos

de ellas (42/49).

Figura IV.30: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con Enfermedad de Stargardt.



· Cosegregan: 49

· No cosegregan: 4⇒ AARRDDMM--7711,, AARRDDMM--111188,, AARRDDMM--114400,, AARRDDMM--115566.

· Con alelos mutantes: 42⇒ AARRDDMM--1122, AARRDDMM--1144,, AARRDDMM--1155,, AARRDDMM--1166,, AARRDDMM--1177,, AARRDDMM--2222,, AARRDDMM--3311,, AARRDDMM--3388,, AARRDDMM--3399,, AARRDDMM--4400,, AARRDDMM--4477,, AARRDDMM--5577,, AARRDDMM--6600,, AARRDDMM--6611,, AARRDDMM--6622,, AARRDDMM--6633,, AARRDDMM--6644,, AARRDDMM--6655,, AARRDDMM--7722,, AARRDDMM--7788,, AARRDDMM--8811,, AARRDDMM--8822,, AARRDDMM--9900,, AARRDDMM--9911,, AARRDDMM--9966,, AARRDDMM--111100,, AARRDDMM--111111,, AA

TUDIO GENÉTICO INDIRECTO


El estudio familiar se realizó en setenta y nueve

v

3

RRDDMM--111166,, AARRDDMM--111199,, AARRDDMM--112255,, AARRDDMM--112288,, AARRDDMM--113311,, AARRDDMM--113377,, AARRDDMM--113388,, AARRDDMM--113399,, AARRDDMM--114466,, AARRDDMM--115533,, AARRDDMM--115555,, AARRDDMM--116622,, AARRDDMM--116633,, AARRDDMM--116688,, AARRDDMM--117700. (Ver Tablas IV.5 y IV.6)

· Sin alelos mutantes: 7⇒ AARRDDMM--6677,, AARRDDMM--8833,, AARRDDMM--112222,, AARRDDMM--8844,, AARRDDMM--110000,, AARRDDMM--114422,, AARRDDMM--116600.

· Con alelos mutantes: 10⇒ AARRDDMM--6666,, AARRDDMM--7755,, AARRDDMM--7766,, AARRDDMM--8888,, AARRDDMM--113355,, AARRDDMM--115588,, AARRDDMM--116644,, AARRDDMM--116655,, AARRDDMM--116677,, SSRRPP--777733. (Ver Tablas IV.5 y IV.6) · Sin alelos mutantes: 11⇒ AARRDDMM--5522,, AARRDDMM--5588,, AARRDDMM--6688,, AARRDDMM--6699,, AARRDDMM--7777,, AARRDDMM--111177,, AARRDDMM--112233,, AARRDDMM--112299,, AARRDDMM--113300,, AARRDDMM--114488,, AARRDDMM--115511.

74 Familias STGD

113

IV-Resultados

Como se ha visto anteriormente (ver pág. 100), en la familia ARDM-61 se identificó que la paciente

resentaba la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis debido a una isodisomía parcial paterna, ya que

ador del alelo mutante. La posibilidad de que esta segregación fuese debida a

una una

D1S435-D1S2804-D1S2868-ABCA4-D1S236-D1S2664. En esta región del brazo corto

el cromosoma 1, se observó que la paciente era homozigota para todos los marcadores y que éstos eran

énticos a uno de los dos alelos paternos (Figura IV.31, barra negra). La región homozigota (isodisómica)

e 4´4 Mb, incluyendo el locus de ABCA4.

Figura IV.31: Árbol genealógico de la familia ARDM-61 en el que se muestran treinta y dos marcadores genéticos

distribuidos a lo largo del cromosoma 1, en la paciente y en sus padres.

p

únicamente su padre era port

microdeleción del alelo materno se descartó mediante el análisis de cinco marcadores microsatélites

flanqueantes al gen:

d

id

comprendía una distancia física d

D1S206

D1S167 D1S435 D1S2804 D1S2868 D1S236 D1S2664

D1S464

D1S2793

D1S450 D1S2667

D1S234

D1S207

D1S255

D1S2797

D1S2890

D1S2829 D1S2803

D1S1660 D1S249 D1S425

D1S218

D1S2726

D1S498

D1S484 D1S2878 D1S196

D1S238 D1S408 D1S2757 D1S413

D1S229 D1S213 D1S2800 D1S2785 D1S2842

D1S2836

AABBCCAA44

02/7242 33 21 11 11 21 12 11 32 22 41 21 32 12 1? ?2 12 32 21 23 23 21 12 11 23 22 22 22 31 22 12 31 21 31 22 12 11 22 1

02/7252 13 11 21 11 21 12 31 22 12 11 21 12 22 2? ?2 22 22 21 13 23 31 22 21 23 12 12 12 11 12 32 11 11 21 32 32 31 12 1

02/7261 31 22 11 12 31 23 22 11 21 32 22 32 11 3? ?1 31 32 11 22 13 12 12 22 11 31 21 21 21 13 21 21 12 13 13 23 21 21 1

+ + - + - -

114

IV-Resultados

Como se muestra en la figura anterior, se analizaron veintisiete microsatélites adicionales,

localizados a lo largo del cromosoma 1. Se observó que la paciente presentaba marcadores heterozigotos

biparentales cerca del centrómero (D1S2726), así como en la región distal del brazo corto (D1S450,

D1S2667) y del brazo largo (D1S2842). En los restantes marcadores, se observaron regiones no

informativas en las cuales no se puede diferenciar entre una segregación biparental normal o heterodisomía

uniparental maternal.

El análisis de haplotipos permitió determinar que esta segregación era producida por una isodisomía

parcial paterna, con los puntos de rotura localizados entre 1p22.3 (D1S167-D1S435) y 1p22.1 (D1S2664-

res D1S2793 y D1S206 (brazo corto) también podrían estar involucrados en la

isodisomía, pero no son informativos.

Asimismo, la paternidad se confirmó mediante el análisis de marcadores microsatélites localizados

en los cromosomas 13, 18, 21, X e Y (datos no presentados en este trabajo).

b) Distrofia de conos y bastones (DCB)

El análisis de haplotipos se realizó en catorce de las veintiocho familias con DCB (14/28), ya que en

catorce de las familias (14/28) únicamente se contaba con el caso índice (ver págs. 47, 48). En las familias

estudiadas, fue posible descartar el gen ABCA4 como responsable en dos de ellas (2/14) en las que se

observó que los haplotipos no cosegregaban con la enfermedad. En las doce familias restantes que

mostraban cosegregación, se identificaron alelos mutantes en ocho de ellas (8/12).

Figura IV.32: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con distrofia de conos y ba



· Cosegregan: 12

· No cosegregan: 2⇒ AARRDDMM--113344,, AARRRRPP--771199.

· Con alelos mutantes: 8⇒ AARRDDMM--7799, AARRDDMM--8866,, AARRDDMM--112266,, AARRDDMM--113333,, AARRDDMM--117744,, AARRDDMM--117766,, RRPP--226677,, RRPP--995599. (Ver Tablas IV.8 y IV.9)

· Sin alelos mutantes: 4⇒ AARRDDMM--4499,, AARRDDMM--116699,, SSRRPP--776633,,

D1S2793). Los marcado

stones.

AARRDDMM--119955.

· Con alelos mutantes: 2⇒ AARRDDMM--9999,, RRPP--557777. (Ver Tablas IV.8 y IV.9)

28 Familias DCB

· Sin alelos mutantes: 12⇒ AARRDDMM--8855,, AARRDDMM--115599,, AARRDDMM--119922,, AARRRRPP--5555,, RRPP--558866,, RRPP--665577,, SSRRPP--882277,, SSRRPP--882288,, SSRRPP--996644,, RRPP--996655,, RRPP--997711,, RRPP--997733.

115

IV-Resultados

c) Retin

n la familia ARRP-700, el análisis de haplotipos permitió descartar el gen ABCA4 como responsable

de enfermedad, ya que ambos hermanos afectos (II:1, II:5) mostraban haplotipos diferentes. En el hermano

afecto (II:1) se identificó un alelo mutante, como se indica en la siguiente figura:

Figu lelo

mutante p.Pro1489Leu.

· Con alelos mutantes: 3⇒ SSRRPP--776666

osis Pigmentaria Autosómica Recesiva (RPAR)

El análisis de haplotipos se realizó en cinco de las diecisiete familias con RPAR (5/17), (ver pág. 49).

En dos de estas familias se pudo descartar el gen ABCA4 como responsable de enfermedad (2/5) y en una

de ellas se identificó un alelo mutante (1/2). En las tres familias que mostraban cosegregación, no se

identificaron alelos mutantes.


· Cosegregan: 3

Figura IV.33: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con RPAR.

E

ra IV.34: Árbol genealógico de la familia ARRP-700, en el que se muestra los haplotipos y la segregación del a

17 Familias RPAR

· No cosegregan: 2

· Sin estudio familiar: 12 ,, SSRRPP--777755,, SSRRPP--883344 (Ver Tabla IV.10).

n alelos mutantes: 9 ⇒ AARRRRPP--8822,, RRPP--441177,, RRPP--557788,, RRPP--558866,, SSRRPP--771166,, · SiSSRRPP--881133,, SSRRPP--881188,, RRPP--885544,, RRPP--993377.

I:101/1242

158 154191 183188 188

I:201/1244

154 170177 179188 184

II:101/1246

158 154191 177188 188

II:201/1245

154 154183 177188 188

II:301/1243

154 170183 179188 184

II:401/1240

154 154183 177188 188

II:601/1241

154 154183 177188 188

II:501/1200

158 170191 179188 184

p.Pro1948Leu

p.Pro1948Leu

· Sin alelos mutantes: 3⇒ AARRDDMM--8899,, SSRRPP--885577,, RRPP--992277

· Con alelos mutantes: 1⇒ AARRRRPP--770000 (Ver Tabla IV.10).

AARRDDMM--5544.

.

· Sin alelos mutantes: 1⇒

116

IV-Resultados

d) Fenotipo diverso

Figura IV.35: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las familias con fenotipo diverso.

Como se ha mostrado anteriormente (ver pág. 104), en la familia RP-280 se identificó la mutación

p.Asn1805Asp en homozigosis en el probandus con STGD (II:1), mientras que su hermana (II:4) es

heterozigota pa gación de los

aplotipos confirmó la distribución de los alelos mutantes.

Figura IV.36: Árbol genealógico de la familia RP-280, en el que se muestran los haplotipos y la segregación del alelo

mutante p.Asn1805Asp.

3 Familias Fenotipo diverso

· Con estudio familiar: 3 · Cosegregan: 3

El análisis de haplotipos se realizó en las tres familias que presentaron distintos fenotipos asociados

a mutaciones en el gen ABCA4. En las tres familias, los haplotipos cosegregaban con la enfermedad y se

identificaron alelos mutantes.

ra dicho cambio y presenta un fenotipo compatible con RP precoz. La segre

h

· Con alelos mutantes: 3⇒ RRPP--228800,, RRPP--331155,, RRPP--553322 (Ver Tablas IV.11 y IV.12)

.

I:195/91

154 158177 177189 185

I:295/92

154 154177 185189 207

II:195/93

154 154177 177189 189

II:295/94

154 154177 185189 207

II:395/95

158 154177 185185 207

II:495/96

158 154177 177185 189

p.Asn1805Asp p.Asn1805Asp

p.Asn1805Asp

p.Asn1805Asp

SSTTDDGG RRPP pprreeccoozz

p.Asn1805Asp p.Asn1805Asp

117

IV-Resultados

En la familia RP-315 el alelo mutante p.Gly1961Glu aparece en la madre y en el hijo, como se ha

En la familia RP-532, los haplotipos cosegregan con la enfermedad. Los tres hermanos comparten

los mismos haplotipos y el alelo mutante p.Arg1129Leu.


mutante p.Arg1129Leu.

visto anteriormente (ver pág. 106). El análisis de haplotipos mostró que ambos hermanos comparten uno de

los dos cromosomas paternos (rojo), pero cada uno ha heredado un cromosoma materno diferente.

DDCCBB


mutante p.Gly1961Glu.

I:295/397

170 158183 191206 188

I:1

? ?? ?? ?

II:195/398

154 158179 191206 188

II:295/399

154 170179 183206 206

p.Gly1961Glu

p.Gly1961Glu DDMM BBeesstt FFFFMM

I:199/117

170 154185 183206 206

I:299/116

158 168183 191206 188

II:299/115

170 158185 183206 206

II:199/114

206 2

170 168185 183

06

II:399/146

06

170 158185 183206 2 p.Arg1129Leu

DDCCBB

SSTTGGDD

p.Arg1129Leu

p.Ar

DDCCBB

p.Arg1129Leu g1129Leu

118

IV-Resultados

e ofia Macular Autosómica Dominante (ADDM)

El análisis de haplotipos se realizó en dos de las siete familias con ADDM (2/7), (ver pág. 50). En una

de estas familias se pudo descartar el gen ABCA4 como responsable de enfermedad (1/2), aunq

) Distr

ue se

entificó un alelo mutante. En la familia que mostró cosegregación (1/2), también se identificó un alelo

utante. En las familias restantes, no se detectaron mutaciones.

Figura IV lias con ADDM.

En la familia ADDM ABCA4, como se ha visto

an

descartar el gen ABCA4 como responsable

Figura IV.40: Árbol genealógico de la familia ADDM-92; haplotipos y segregación de los alelos mutantes.



· Cosegregan: 1

· No cosegregan: 1 · Con alelos mutantes: 1⇒

id

m

.39: Esquema del análisis de haplotipos realizado en las fami

-92 se identificaron diversos alelos mutantes en

teriormente (ver pág. 107). El análisis de haplotipos que se muestra en la siguiente figura no puede

de enfermedad.

AADDDDMM--5599 (Ver Tabla IV.13).

· Sin alelos mutantes: 5 ⇒ AADDDDMM--7744,, AADDDDMM--8800,, AADDDDMM--9944,, AADDDDMM--110055,, AADDDDMM--110066.

· Con alelos mutantes: 1⇒ AADDDDMM--9922 (Ver Tabla IV.13).

7 Familias ADDM

II:1

? ?? ?? ?

II:203/446

154185

168183

208 188

III:203/398

154 154189 185206 208

III:1

? ?? ?? ?

IV:203/397

154 154183 185208 208

II:3

? ?? ?? ?

III:503/690

154 168191 183188 188

III:403/455

154 168177 183206 188

IV:1

? ?? ?? ?

V:106/183

158 154177 185208 208

I:1

? ?? ?? ?

III:603/691

168 168179 183204 188

III:3

? ?? ?? ?

IV:303/456

154 154189 177184 206

p.Ile156Val

DDMM

p.Ile156Val

p.Gly172Ser p.Val2050Leu

p.Thr897Ile SSTTGGDD

p.Ile156V

DDMM

p.Ile156Val

p.Val2050Leu

119

IV-Resultados

3.3.2- HAPLOTIPOS PREVALENTES Mediante el estudio genético directo realizado en nuestras familias, se ha identificado un alelo

mutante prevalente (ver pág. 110, Figura IV.28). En el gráfico anterior se puede observar que la mutación

más frecuente en nuestra población es el cambio p.Arg1129Leu, que aparece en dieciocho pacientes y en

cinco de ellos se produce en homozigosis.

El análisis de haplotipos realizado con marcadores extragénicos (microsatélites) e intragénicos (SNPs o

polimorfismos de único nucleótido, detectados mediante el microarray) permitió identificar que algunos de

los pacientes portadores de dicha mutación comparten un haplotipo similar, como se muestra en la siguiente

ta

Familias

bla:

Marcadores ARDM-31 ARDM-47 ARDM-57 ARDM-611 ARDM-62 ARDM-78 ARDM-82

D1S435 168 154 168/154 158 154/154 154 164 DIS2804 182 182/182 182 182/182 182 192 182 D1S2868 146 146/146 146 146/146 144 146 146

p(c

.His423Arg .1268A>G) A//G A//G A//G G A//G A G

p.Arg1129Leu (c.3386G>T) T T/T T T T T T

IVS33 + 48C>T T T/T T T C//T T T

D1S236 188 202/206 206 206/206 206 210 206

Familias

Marcadores ARDM-96 ARDM-111 ARDM-119 ARDM-128 ARDM-139 ARDM-155 ARDM-162

D1S435 168 154/154 168/154 168/168 154 154 170 DIS2804 190 188/182 172/182 172/172 182 182 182 D1S2868 142 142/146 146/146 146/146 146 146 146

p.His4(c.1268

23Arg A>G) A//G G G G A//G A//G A//G

p.Arg11(c.3386

29Leu G>T) T T T T T T T

IVS33 + 48C>T T T T T T T T

D1S236 206 206/184 206/206 206/206 206 206 188 Tabla

p.Arg1129

símbolo”//” ind

p.Arg1129

IV.15: marcadores extragénicos e intragénicos al gen ABCA4, identificados en familias con la mutación

Leu. En los marcadores intragénicos, los alelos salvajes se muestran en azul y los mutantes en rojo. El

ica que no se ha podido establecer la fase del alelo. Las familias subrayadas indican que el cambio

Leu se produce en homozigosis; por tanto, se muestran ambos alelos, paterno y materno, respectivamente. 1: En esta paciente la homozigosidad se ha producido por isodisomía parcial (ver pág. 100).

120

IV-Resultados

En la tabla anterior no se incluyen las familias ARDM-66, ARDM-76, ARDM-164 y SRP-773, ya que

en ellas

observa que el cambio IVS33+48C>T está presente siempre que

fismo aunque éste aparece en heterozigosis. En la familia ARDM-78, el cambio p.His423Arg no se

roduce, mientras que IVS33+48C>T aparece asociado a la mutación p.Arg1129Leu.

de los ma dore satélites identi r la

ARDM-47 ) -61 os al debido diso ía parcial -11

materno), ARDM-139 y ARDM-155. Si no se cons el marcador D1S el más ABCA4, ver

pág. 67 rva que amilia -57 y ARDM-82 ten un haplotipo ar con atro

anterio V.41A)

El se po más prevalente arte s familia -11 (alelo pa R -128

(amb ura IV.41B). Por úl ilias ARDM-31 y ARDM-162 comparten un haplotipo

idéntico, que r distal

Figura IV.41: Haplotipos compartidos por las diferentes familias con la mutación R1129L.

116688118822114466GG TT TT

220066

únicamente se ha estudiado el caso índice y no se puede establecer la fase de los marcadores

microsatélites y polimorfismos.

Según los resultados anteriores, se

aparece la mutación p.Arg1129Leu, aunque en la familia ARDM-62 no se ha podido establecer la fase.

En las familias en las p.Arg1129Leu se produce en homozigosis, el cambio p.His423Arg aparece asociado a

dicha mutación en todas excepto en la familia ARDM-47, en la que no se pudo determinar la fase del

polimor

p

El análisis rca s micro ficó un haplotipo compartido po s familias

(alelo materno , ARDM (en amb elos, a la iso m ), ARDM 9 (alelo

idera 435 ( distal de

), se obse las f s ARDM compar simil las cu

res (Figura I .

gundo haploti

s alelos) (Fi

lo comp n la s ARDM 9 terno) y A DM

o g timo, las fam

únicamente difiere en el marcado D1S435 (Figura IV.41C).

AA AARRDDMM--4477,,

115544 118822 114466 GG TT TT

220066

115544 118822 114466 AA////GG

TT TT

220066

AARRDDMM--6611,, AARRDDMM--111199,, AARRDDMM--113399,, AARRDDMM--115555

115544 118822 114466 GG TTTT

2200

66

11554411

8822

11

4466AA

////GG TTTT

220066

115544 118822 114466 AA////GG

TTTT

220066

AARRDDMM--5577,, AARRDDMM--8822

1155881188

22

1144

66AA////

GG

TTTT

2200

66

116688 117722 114466 GG

1

TTTT

118888

T

15544 118822 114466 AA////GG

TTT

118888

AARRDDMM--3311,, AARRDDMM--116622

117700 118822 114466 AA////GG

TTTT

118888

AARRDDMM--111199,, AARRDDMM--112288 BB CC

116688 117722 114466 GG TTTT

118888

121

IV-Resultados

122

El segundo alelo más frecuente en la muestra de pacientes STGD fue el cambio p.Gly1961Glu (ver

pág. 110, Figura IV.28). El haplotipo establecido con las mutaciones detectadas por el microarray mostró que

p.Gly1961Glu siempre aparece asociado a cuatro polimorfismos de único nucleótido. Sin embargo, el

aplotipo formado con los marcadores microsatélites extragénicos difiere entre los distintos pacientes.

l se representan los polimorfismos proteicos y en rojo la mutación.

s el alelo complejo

[p.Arg152 uce en

homoz nte

[p.Arg110 5). Los

haplotip s. El

anális

Figura IV.43: Haplotip 08Cys+p.Arg2107His] y

[p.Arg1108Cys+p.Arg210 . Los marcadores u ados fueron los siguientes: TEL- D1S435-

DIS2804-D1S2868- c.455G>A (p.Arg152Gln) - c.3322C>T (p.Arg1108Cys) - c.6320G>A (p.Arg2107His) -D1S236-CEN.

Las mutaciones se representan en rojo.

h

Figura IV.42: Haplotipos de las familias con la mutación p.Gly1961Glu; los marcadores utilizados fueron los siguientes:

TEL- D1S435- DIS2804- c.5682G>C (p.Leu1864Leu) - c.5814A>G (p.Leu1938Leu) - c.5843CA>TG (p.Pro1948Leu) –

c.5844A>G (p.Pro1948Pro) - c.5882G>A (p-Gly1961Glu) - D1S236-CEN.

En azu

18

Otra mutación frecuente en nuestros pacientes e

Gln+p.Arg1108Cys+p.Arg2107His], que aparece en cuatro familias, en una de ellas se prod

igosis (ARDM-14). En otras dos familias (ARDM-110 y ARDM-116), se detectó el alelo doble muta

8Cys+p.Arg2107His], que difiere del anterior en la mutación p.Arg152Gln (ver pág. 9

os construidos con los marcadores microsatélites son similares entre los diferentes paciente

is de haplotipos se muestra en la siguiente figura:

os de las familias con los alelos complejos [p.Arg152Gln+p.Arg11

7His], respectivamente tiliz

115588 118888 cc..55668822GG>>CC cc..55881144AA>>GG cc..55884433CCAA>>TTGG cc..55884444AA>>GGcc..55888822GG>>AA 1

800

AARRDDMM--1122

115544 119911 cc..55668822GG>>CC cc..55881144AA>>GG cc..55884433CCAA>>TTGG cc..55884444AA>>GGcc..55888822GG>>AA

1

220088 1


1

18899 1


1

18855 2


1

21144 1

15544 118855 cc..55668822GG>>CC cc..55881144AA>>GGcc..55884433CCAA>>TTGG cc..55884444AA>>GG cc..55888822GG>>AA

18833

AARRDDMM--5577 AARRDDMM--6600 AARRDDMM--6655 AARRDDMM--116688 AARRDDMM--8811

115544 119900 114444 cc..445555GG>>AA cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA 118888

AARRDDMM--1144 AARRDDMM--1177 AARRDDMM--113377 AARRDDMM--113399 AARRDDMM--111166 AARRDDMM--111100




115544 119900 114444 -- cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA 118888

115588 119988 114444 -- cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA 118888

115544 118822 114488

cc..445555GG>>AA cc..33332222CC>>TT cc..66332200GG>>AA

220066

IV-Resultados


Con el fin de determinar la severidad de las mutaciones identificadas en el gen ABCA4, se han

agrupado los pacientes en función de la combinación de alelos mutantes que presentan, el fenotipo exhibido

y en la edad de comienzo de la enfermedad. Los datos utilizados en el análisis se recogen en las siguientes

blas: ta

1- En primer lugar, se clasifican los pacientes con el alelo prevalente p.Arg1129Leu en homozigosis. Los

síntomas comienzan en la segunda década de vida y el fenotipo resultante es STGD: presentan escotoma

central, discromatopsia (no percepción de los colores), fotosensibilidad y agudeza visual disminuida (entre

0´1-0´5). Algunos casos presentan estrabismo y alteración de la onda b en el ERG.

Familia Alelo 1 Alelo 2 Edad de inicio (años) Fenotipo

ARDM-61 p.Arg1129Leu p.Arg1129Leu 12 STGD ARDM-111 p.Arg1129Leu p.Arg1129Leu 18 STGD ARDM-119 p.Arg11 STGD29Leu p.Arg1129Leu 19 ARDM-128 p.Arg11 STGD 29Leu p.Arg1129Leu 19 ARDM-47 p.Arg11 STGD 29Leu p.Arg1129Leu 21

N= 5; Media de edades ⇒ x = 17´8 años; Desviación estándar ⇒ σ = 3´42

Edad de inicio (años) Fenotipo

2- A continuación, se muestran los pacientes heterozigotos compuestos con el alelo p.Arg1129Leu.

Asimismo, el fenotipo asociado a esta combinación de alelos es siempre STDG y la edad de comienzo oscila

desde la primera década de vida hasta la cuarta.

Familia Alelo 1 Alelo 2

29Leu p.= o altera el procesamiento 9 STGD ARDM-76 p.Arg11

ARDM-78 p.Arg1129Leu p.Gln2187X 10 STGD ARDM-155 p.Arg1129Leu p.Arg602Trp 11 STGD ARDM-57 p.Arg1129Leu p.Gly1961Glu 15 STGD ARDM-82 p.Arg1129Leu p.Glu1122Lys 15 STGD ARDM-66 rg1129Leu p.Leu1940Pro 17 GD p.A ST

A p.A Trp STRDM-96 rg1129Leu p.Trp1408Arg p.Arg1640 17 GD

ARDM-139 p.Arg152Gln

p.Arg1108Cys p.Arg2107His

p.Arg1129Leu 20 STGD

ARDM-62 p.Arg1129Leu p.Gly1977Ser 39 STGD

ARDM-31 p.Arg1129Leu p.Ser1642Arg 40 STGD N= 10; Media de edades⇒ x = 19´3 años; Desviación estándar= σ = 10´6

123

IV-Resultados

3- En la siguiente tabla se recogen los pacientes con STGD que portan, al menos, un alelo complejo. Al igual

que en el grupo anterior, la edad de comienzo es muy variable.


ARDM-14 p.Arg152Gln


p.Arg152Gln p.Arg1108Cys p.Arg2107His

5 STGD

ARDM-17 p.Arg152Gln


p.Arg2107Pro 8 STGD

ARDM-110 p.Arg1108Cys p.Arg2107His p.Gly1961Glu 8 STGD

ARDM-15 p.Gly863Ala c.2888delG 11 p.Arg1055Trp STGD

ARDM-116 p.Arg1108Cys p.A is p.Cys1490Tyr 11 STGD rg2107Hp.Arg152Gln

STGD ARDM-137 p.Arg1108Cys IVS40+5 G>A 13 p.Arg2107His p.Gly863Ala p.Arg943Glu STGD ARDM-138 c.4537ins C 19

p.Thr1253Met ARDM-12 p.Gln1315X 38 STGD p.Gly1961Glu

N= 8; Media de edades= 14´1 años; Desviación estándar= σ = 9´8

4- A continuación se recogen los pacientes que portan alelos sencillos, a excepción del alelo mutante

p.Arg1129Leu. Presentan STGD y la edad de comienzo se sitúa entre la primera y la segunda década de

vida.


STGD ARDM-38 p.Arg602Trp c.4739 del T 8 STGD ARDM-40 p.Thr1019Met p.Gln1315X 8 STGD ARDM-90 p.Gly1977Ser IVS22 -2A>T 8 STGD ARDM-72 p.Ile156Val p.Arg602Trp 12 STGD ARDM-22 c.2888delG p.Leu2060Arg 12 STGD ARDM-170 p.Arg408X p.Pro1486Leu 14 STGD ARDM-64 p.Arg212Cys p.Gly1977Ser 15 STGD ARDM-168 p.Gly1961Glu p.Leu2060Arg 15

ARDM-88 IVS40+5 G>A 16 STGD p.Pro1380Leu STGD ARDM-60 p.Arg602Trp p.Gly1961Glu 17 STGD ARDM-81 p.Gly1961Glu p.Val1433Ile 18 STGD ARDM-153 c.3211insGT p.Gly1961Arg 24

N= 12; Media de edades= 13´9 años; Desviación estándar= σ = 4´5

124

IV-Resultados

5- Por último, se muestran las familias que presentan un fenotipo DCB, caracterizado por pérdida de la visión

central, ceguera nocturna y alteraciones en el ERG que se manifiestan primero en conos y posteriormente en

astones. El comienzo de la enfermedad es muy temprano, ya que se produce en la primera década de vida.

Familia A Edad de inicio (años) Fenotipo

b

lelo 1 Alelo 2

RP-267 p.Val168 p.Va el 6 DCB 1_Cys1685del l1681_Cys1685dARDM c.2 8 -79 888delG c.2888delG DCB ARDM c.2 8 -86 888delG c.2888delG DCB

ARDM p.L -133 eu11Pro c.2888delG 8 DCBARDM-176 c.2 p.Leu2060Arg 10 DCB 888delG ARDM p.Gl p 0 -126 y1977Ser .Gly1977Ser 1 DCB

N edade esviación est ar= σ = 1´4

= 6; Media de s= 8´3 años; D ánd

125

IV-Resultados


En la siguiente tabla se muestra la procedencia geográfica de los padres de los pacientes, por lo que

se puede representar el origen geográfico de las mutaciones identificadas.

Procedencia ocedenPr cia

F el ilia elo paterno Alelo materno amilia Alelo paterno Al o materno Fam Al

A (Sevilla) ARDM-90 Segovia RDM-12 Peñaflor ARDM-14 Madrid Ciudad R ARDM-91 Guadalajara eal

ARDM-15 Ciud Guadalaj ARDM-96 Burgos C( a)

idamón ad Real ara La Rioj

ARDM-16 T ARDM-110 ano udad Real) d Puerto Ll

(Cioledo Madri

ARDM-17 a (Vizcaya) Madrid ARDM-111 Barrik

ARDM-22 Toledo ARDM-116 Castro Caldelas (Orense)

ARDM-31 Salamanca ARDM-119 San Sebastián (Guipúzcoa)

Echarri Aranaz (Navarra)

ARDM-38 Cáceres ARDM-125 -

ARDM-39 Valladolid ARDM-128 Galdako (Vizcaya)

Horga (Vizcaya)

ARDM-40 Segovia ARDM-131* Yunclillos (Toledo)

Ines (Soria)

ARDM-47 Madrid ARDM-135 -

ARDM-57 Madrid ARDM-137 Ciudad Real Fuentes de León (Badajoz)

ARDM-60 Huelva Ciudad Real ARDM-138 (1) Lucerna (Suíza) Ginebra (Suíza)

ARDM-61 Burgos ARDM-139 Prádanos de Bureba (Burgos) Madrid

ARDM-62 Almadén (Ciudad Real) ARDM-146 Oviedo

ARDM-63 Toledo ARDM-153 Alora (Málaga)

Osuna (Sevilla)

ARDM-64 Madrid Zaragoza ARDM-155 Vélez-Rubio (Almería) ARDM-65 Madrid ARDM-158* Las Palmas Cuenca ARDM-66 Nuñomoral (Cáceres) ARDM-162 Papatrigo (Ávila) ARDM-72 Pontevedra ARDM-163 Ingenio (Las Palmas) ARDM-75 Cuenca ARDM-164 San Sebastián (Guipúzcoa)

ARDM-76 Barcelona ARDM-165 Monforte de Lemos (Lugo)

Puebla de Brollón (Lugo)

ARDM-78 Ciudad Real ARDM-167* Torre de Juan Abad (C. Real)

Úbeda (Jaén)

ARDM-81 Madrid ARDM-168 Oviedo ARDM-82 Ávila Madrid ARDM-170 Madrid ARDM-88 Tenerife SRP-773 Madrid

Tabla IV.16: Procedencia de los alelos mutantes en ABCA4 en familias STGD.

126

IV-Resultados

127

Procedencia Procedencia

Familia Alelo paterno Alelo materno Familia Alelo paterno Alelo materno

ARDM-79 Toledo ARRP-700 Madrid ARDM-86 SRP-766 La goza) Asturias Almunia (ZaraARDM-99 ula (M 5 sesM urcia) SRP-77 Avile (Murcia)

ARDM-126 * (Salaman Valladolid Toledo SRP-834 Cantalpino ca)

ARDM-133 Na de la Mata (Cáceres)

o valmoral Aldea Rodrig(Salamanca) RP-280 -

ARDM-174 dosera ( CácereLa Co Badajoz) RP-315 s

ARDM-176 Sta. Mª del Páramo )

S. Martín del Camino (León) (León RP-532 Sevilla

RP-267 San Ginés (Orense) ADDM-59 Madrid RP-959 León Cas Burgos) ADDM-92 trillo de la Reina (

Tabla IV.17: Procedencia de los alelos mutantes en ABCA4 en familias DCB, ( de de Su presentan los alelos : Indica de esta se.

Figura IV.44: Origen geográfico de las alteraciones identificadas en el gen ABCA4.

RPAR, fenotipo diverso y ADDM. 1): El paciente proce iza, no se re en el mapa. * que no se pue blecer la fa

VV225566VV RR11112299LL

II115566VV RR660022WW

VV993311MM GG886633AA++RR110055

55WW

NN11779999DD2288

8888 ddeellGG ((33))LL22006600RR TT889977II

GG11997777SS ((22))

TT11225533MM++GG11996611EE QQ11331155XX

33221111iinnssGGTTR

R11112299LL

MadridMadrid::RR11112299LL ((55)) //// GG11996611EE ((55))

RR115522QQ++RR11110088CC++RR22110077HH ((33)) RR22110077PP //// RR221122CC VV11443333II //// RR440088XX

PP11448866LL

//// PP11994488LL

Ciudad RealCiudad Real::RR115522QQ++RR11110088CC++RR22110077HH ((22)) //// RR11112299LL ((22))

RR11110088CC++RR22110077HH //// 22888888 ddeellGG GG11996611EE //// GG11997777SS

QQ22118877XX

RR11112299LL SS11664422RR

LL

1111PP

RR6600

22WW 44773399 ddeellTT RR11112299LL LL11994400PP

22888888 ddeellGG GG11996611EE

II

VVSS4400++55GG>>AA TT11001199MM QQ11331155XX GG11997777SS

IIVVSS2222--22AA>>TT

RR660022WW

RR11112299LL

((33))

GG11997777SS VV776677DD

LL22224411VV

EE11112222KK RR11112299LL

PP11338800LL IIVVSS4400++55GG>>AA

RR11112299LL ((44))

RR11110088CC++RR22110077HH CC11440099YY

5500

4411 ddeell1155ppbb ((22))

RR11112299LL

RR11112299

LL ((22))

IIVVSS

4400++55GG>>AA RR11664400WW

TT11001199MM

GG11996611EE LL22006600RR

22

888888 ddeellGG ((22))

GG11996611RR

RR660022WW RR11112299LL

PP11448866

33221111iinnssGG

VV11443333II II115566VV

22888888 ddeellGG

LL22006600RR II115566VV

IV-Resultados

3.5- FRECUENCIA DE ALELOS MUTANTES DE ABCA4 ENTRE LA POBLACIÓN GENERAL

Con el fin de deter uencia de portadores (sanos) de alelos mu CA4, se

est muta eu el alel lente e ente

(fre 4/107= 22´4%), en un to atrocientos cro

- osomas se ana ediante ensayo de r , con la ER ción

la diana de res a endonucleasa.

- s cromosomas se mediante dHPLC

Mediante ayo portadore ón p.Arg1129L rgo, el

análi er rom ida de alto en los restantes cromo as,

permitió ectar un odúplex en os control ). A

con , se secuenciaron l muestras que presen atrón alte s

el al

- g. 101)

tantes en ABminar la frec

udió la ción p.Arg1129L , ya que es o preva ntre los paci s analizados

cuencia=2 tal de cu mosomas:

Aci I, ya que la mutacien crom lizaron m estricción

destruye tricción de est

tresciento analizaron .

ens de restricción, no se identificaron s de la mutaci eu. Sin emba

sis post ior realizado por c

patró

atografía líqu

o o en heter

rendimiento som

det n alterad dos individu (Figura IV.41

tinuación as dos taron un p rado y se identificó en amba

elo p.Arg1129Leu.

Figura IV.41: Patrón cromatográfico de un individuo control y de un individuo portador del alelo p.Arg1129Leu.

Los cálculos realizados se indican a continuación:

El alelo p.Arg1129Leu representa el 22´4% de los alelos mutantes identificados en ABCA4 (ver pá

y la tasa de detección del microarray es del 54´7% en pacientes STGD (ver pág. 88):

Por tanto: p.Arg1129Leu ⇒ 0´224 x 0´547 = 0´122⇒ 12´2% de los alelos posibles muta

STGD, es decir, el 12´2% de la frecuencia alélica mutante (q) para ABCA4.

ntes en

BBllaannccoo

CCoonnttrrooll ssaannoo

MMuuttaannttee

128

IV-Resultados

- La frecuencia del alelo p.Arg1129Leu en la población general es 2/400 = 0´005, por tanto:

res de alelos

mutantes en dad de

1:588.

- Para calcular las frecuencias genotípicas a partir de las frecuencias alélicas, se utilizó la fórmula del

equilibrio de Hardy-Weinberg:

A partir de la ecuación anterior, se obtiene que la frecuencia (estimada) de portado

ABCA4 en nuestra población sea del 7´87% y la prevalencia (estimada) de la enferme

Frecuencia absoluta mutante

Frecuencia alelo R1129L 12´2 =

qq

100 ⇒ qq =

0´005 x 100 = 0´041

12´2

EEqquuiilliibbrriioo ddee HHaarrddyy--WWeeiinnbbeerrgg⇒⇒ pp22 ++ 22ppqq ++ qq22 == 11

Homozigotos sanos= p2 = 0´9197 Heterozigotos sanos = 2pq = 0´0786 Homozigotos mutantes= q2 = 0´0017

129

Representación de la retina realizada por Ramón y Cajal (1852-1934).

V‐ Discusión

130

V- Discusión

V‐ DISCUSIÓN

1‐ DISCUSIÓN GENERAL

“Durante el año 1896 […] ataqué con nuevos bríos la retina, el más antiguo y pertinaz de mis

amores de Laboratorio…”, eran las palabras de Santiago Ramón y Cajal recogidas en su obra Historia de

mi labor científica. Sus descripciones anatómicas y fisiológicas de los diversos tipos celulares

revolucionaron las investigaciones neurológicas de la época, más aún, cuando los medios ópticos de los

que disponía para observar las retinas de los diferentes vertebrados eran, cuando menos, rudimentarios.

Hoy en día, la estructura de la retina se conoce en profundidad y su análisis ha permitido determinar que la

mayoría de las conexiones neuronales establecidas por Cajal eran correctas.

El avance de la Ciencia ha permitido que la Biología Molecular llegue a “ver” incluso dentro de los

fotorreceptores. De hecho, se han identificado un total de ciento sesenta y seis loci (localizaciones

genéticas), de los cuales se han clonado un total de ciento dieciséis (www.sph.uth.tmc.edu/Retnet). Las

proteínas codificadas por estos genes intervienen en el desarrollo celular de la retina, en la integridad

estructural, en el transporte de metabolitos, en la cascada de fototransducción, en el control y el

mantenimiento de la cascada, etc., y consiguen que esta estructura, elegantemente organizada, confiera

uno de los sentidos más importantes: la visión.

El conocimiento de la secuencia de estos genes, de las mutaciones que se producen y de la repercusión

fenotípica que puedan tener en el paciente resulta imprescindible para comprender las interacciones que se

generan entre las diferentes proteínas existentes en las células retinianas.

Como se ha observado a lo largo de este trabajo, es necesario un enfoque multidisciplinar, en el

que la correcta clasificación clínica de la patología y el abordaje molecular preciso resultan esenciales. El

resultado de esta investigación conjunta permite, por un lado, conocer la prevalencia y la distribución

geográfica de las distrofias de retina estudiadas y, por otro lado, facilitar al paciente un asesoramiento

genético adecuado. En un futuro cada vez más próximo, el conocimiento de la causa genética de la

enfermedad permitirá aplicar al paciente el tratamiento adecuado, sustituyendo el gen dañado (terapia

génica).

La caracterización genotípica y fenotípica resultan esenciales para el diagnóstico de estas

enfermedades, no obstante, es necesaria una aproximación funcional que permita determinar cuál es el

papel de cada una de las proteínas codificadas por estos genes, así como las interacciones que puedan

existir entre ellas y la interacción que existe entre los genes y el ambiente. Conocer los productos proteicos

permitirá identificar posibles dianas terapéuticas con herramientas genómicas, que harán más efectivos

dichos tratamientos.

131

V- Discusión

PPaacciieennttee

EEssttuuddiioo ggeennééttiiccoo

IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddeell ggeenn rreessppoonnssaabbllee

NNoo iiddeennttiiffiiccaacciióónn ddeell ggeenn rreessppoonnssaabbllee

EEssttuuddiioo ggeennóómmiiccoo

IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddee SSNNPPss

BBúússqquueeddaa ggeennóómmiiccaa

IInnffoorrmmee yy ccoonnsseejjoo ggeennééttiiccoo

TTrraattaammiieennttoo:: tteerraappiiaa ggéénniiccaa

BBúússqquueeddaa ddee oottrrooss ggeenneess CCoonnoocciiddooss

DDeessccoonnoocciiddooss

EEssttuuddiioo ffuunncciioonnaall

IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddee ddiiaannaass tteerraappééuuttiiccaass

DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee llaa ffuunncciióónn ddee llaa pprrootteeíínnaa

pprrooggnnoossiiss ddeell ppaacciieennttee

TTrraattaammiieennttoo

IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddee nnuueevvooss ggeenneess

Figura V.1- Esquema de los diferentes estudios moleculares aplicables a las distrofias de retina hereditarias.

2‐ EPIDEMIOLOGÍA DE LAS DISTROFIAS DE RETINA ESTUDIADAS

El estudio epidemiológico sobre distrofias de retina realizado en pacientes españoles ha permitido

conocer la prevalencia de estas enfermedades en España. Hasta el momento, se han estudiado un total de

tres mil novecientos treinta y seis casos (3936) correspondientes dos mil ciento sesenta y seis familias no

emparentadas (2166) (Ayuso C et al., Memoria Red EsRetNet 2005; comunicación personal). En el

siguiente gráfico se muestran las frecuencias de los fenotipos observados: la ND y la XLRS presentan una

frecuencia muy baja (0´5% y 1´2%, respectivamente). La STGD es algo más frecuente (3´8%), siendo la

RPAR uno de los fenotipos más prevalentes en población española. Sin embargo, mientras que la mayoría

de los casos de STGD están asociados a mutaciones en ABCA4, únicamente una pequeña fracción de

casos con RPAR (0´43%) y algo más con DCB (0´71%) están causados por mutaciones en este gen,

existiendo una gran heterogeneidad genética.

132

V- Discusión

Otras DR

ND

XLRS

STGD

DCB

RPAR

RPAR-ABCA4

Otras RP (RPAD, XLRP)

Otros

DDRR⇒⇒1100%%

11´́22%% 00´́55%% 33´́88%%

00´́7711%% 1166%%

RRPP⇒⇒7744%%

3377%% 3377%%

00´́4433%%

Figura V.2- Porcentajes de las distrofias de retina presentadas en este trabajo con respecto al total de casos españoles

estudiados hasta el momento (3936 casos; Ayuso C et al., Memoria final EsRetNet 2005).

3‐ GEN NDP


En las familias presentadas en este trabajo, se identificaron seis mutaciones diferentes en el gen

NDP asociadas a dos fenotipos diferentes, Enfermedad de Norrie (ND) y vitreorretinopatía exudativa

familiar (VREF). La Enfermedad de Norrie es una displasia retiniana congénita que, en la mayoría de los

casos, produce ceguera desde el nacimiento. La vitreorretinopatía exudativa familiar ligada al cromosoma X

es un defecto del desarrollo caracterizado por vascularización incompleta de la retina periférica. Las formas

de VREF ligadas al cromosoma X se asocian a mutaciones en el gen NDP, aunque también se han descrito

formas autosómicas recesivas y autosómicas dominantes (Clevers H, 2004). De hecho, en el cromosoma

11q13-23 se han identificado dos loci implicados en FEVR autosómica dominante, que corresponden a los

genes Fzd4 (frizzled-4 gene) y LRP5 (Robitaille J et al., 2002; Toomes C et al., 2004). Recientemente se ha

observado que las proteínas Norrina y FZD4 funcionan como un par ligando-receptor: la Norrina se une con

elevada especificidad al receptor FZD4, aunque requiere la presencia del co-receptor LRP5, para provocar

la activación de la vía Wnt. Este sistema de señalización desempeña un papel esencial en el desarrollo

vascular del ojo, del oído interno y del cerebelo (Xu Q et al., 2004).

Mediante el estudio molecular realizado en el gen NDP se identificaron dos nuevas mutaciones que

producen un codon de parada prematuro: p.Val89fsX101 que se produce “de novo” y p.Tyr120X (ver pág.

77). La consecuencia de estas alteraciones es una proteína truncada, que se asocia con un fenotipo más

severo de la enfermedad, en el que, además de problemas visuales, se presentan sordera neurosensorial y

133

V- Discusión

retraso mental de diferentes grados. De hecho, este tipo de mutaciones siempre se asocian a un fenotipo

ND (Wong F et al., 1993; Chynn E et al., 1996). Sin embargo, existen diversos ejemplos de alteraciones que

generan un cambio de aminoácido en la proteína y que también producen ND (www.hgmd.org).

En una de nuestras familias (ND-12) se identificó una mutación que afecta al sitio donador del

procesamiento (mecanismo de corte y empalme de los intrones) del intrón 1 del gen NDP: IVS1+1G>A.

Este cambio se había descrito con anterioridad (Fuchs S et al., 1996), asociado a ND. Asimismo, nuestro

paciente presenta pérdida severa de visión y retraso mental.

Las mutaciones identificadas que provocan un cambio de aminoácido, únicamente causan pérdida

de visión en nuestros pacientes y se asocian con una forma menos severa de la enfermedad. Existen

algunos ejemplos de VREF ligada al cromosoma X debido a mutaciones en el gen NDP y, en todos los

casos, se deben a cambios que no generan una proteína truncada (Chen ZY et al., 1993; Fuchs S et al.,

1996; Johnson K et al., 1996; Torrente I et al., 1997; Shastry BS et al., 1997).

La mutación p.Arg121Gln identificada en la familia XLDM-46 se había descrito previamente, incluso

en otra familia española (Fuentes JJ et al., 1993). Ambas comparten haplotipos, lo que sugiere que

nuestros pacientes probablemente pertenezcan a otra rama de esta familia.

El cambio p.Lys104Asn, identificado en una familia gallega (ND-14), únicamente se ha descrito en este

trabajo y está asociado a VERF. La alteración p.Arg38Cys, detectada en dos de nuestras familias (ND-2,

ND-5), se había reportado previamente (Royer et al., 2003).


En las dos familias portadoras de la mutación p.Arg38Cys, el análisis de los marcadores

microsatélites flanqueantes al gen NDP permitió identificar que compartían el mismo haplotipo, por lo que

se puede sospechar identidad por descendencia. En la figura IV.3 (ver pág. 80), se observa que el individuo

IV.1 perteneciente a la familia ND-2 difiere en el marcador DXS8090 (164) con respecto a los restantes

varones afectos y las mujeres portadoras de ambas familias (162). Observando el haplotipo de su madre

para ese marcador (III:2; 162 pb), se aprecia que se producido una repetición más del dinucleótido CA (164

pb), mostrando la inestabilidad de estas regiones genómicas (Jones MH & Nakamura Y, 1992).

Este cambio (p.Arg38Cys), descrito por primera vez por Royer G et al., se identificó en un varón

afecto de una familia francesa, pero no se encontró en el análisis realizado en población control en un total

de setenta y cinco cromosomas. La detección de esta mutación en una familia francesa y en nuestras dos

familias españolas sugiere la posibilidad de un efecto fundador en población del sur de Europa.

134


V- Discusión


Las mutaciones identificadas en nuestros pacientes, a excepción del cambio IVS1+1G>A localizado

en el intrón 1, se producen en el dominio “cysteine-knot”, localizado entre los aminoácidos 32 y 133. Se

considera que esta región de la proteína desempeña un papel fundamental en las interacciones

neurológicas.

Exones 1 y 2 no traducidos Dominio “cysteine-knot”

Codon de parada prematuro

Altera la pauta de lectura


Figura V.3- Representación esquemática de la estructura del gen NDP y de las mutaciones identificadas en nuestros

pacientes.

La mayor parte de las alteraciones descritas en el gen NDP se producen en este dominio, como las

mutaciones en el codon 121 [p.Arg121Trp (777C>T)] y [p.Arg121Gly (777C>G)], asociadas a VREF y ND,

respectivamente (Fuchs S et al., 1996; Zhu D & Maumanee H, 1994). Se han reportado diversas

mutaciones en este aminoácido, por lo que se puede asumir que debe desarrollar una función importante

en esta estructura de la proteína. La severidad de los fenotipos asociados a mutaciones en el codon 121

puede depender del tipo de alteración que se produzca.

Asimismo, se produce expresividad variable entre los pacientes de las familias en las que se

identificó el cambio p.Arg38Cys. En la familia ND-2, uno de los varones afectos presenta persistencia de

vítreo primitivo hiperplásico y se quedó ciego a los cinco años, mientras que su hermano padece

vitreorretinopatía exudativa y conserva buena visión en su ojo derecho. Este es un ejemplo de que una

mutación puede producir dos fenotipos diferentes, incluso dentro de la misma familia. La variabilidad

intrafamiliar se ha descrito en diversas enfermedades hereditarias, incluyendo retinopatías (Weleber RG et

al., 1993; Kondo H et al., 2003; Dharmaraj N et al., 2003).

De hecho, esta mutación produce un fenotipo ND en la familia francesa en la que se describió esta

alteración por primera vez (Royer et al., 2003). Sin embargo, este cambio se identificó en un varón

asintomático de la familia ND-5. En este paciente, se podría sospechar una situación de penetrancia

incompleta, no descrita con anterioridad en la literatura.

La variabilidad de expresión en varones afectos, en relación con las funciones cognitiva y auditiva,

así como en la edad de comienzo de los síntomas, sugieren que genes modificadores u otros factores

relacionados deben desempeñar un papel esencial, no bien definido todavía, en la modulación del fenotipo

de la enfermedad (Fuentes JJ et al., 1993).

135

V- Discusión

Una vez que se conoce que el binomio Norrina-Fzd4 interviene en la vía Wnt del desarrollo,

podemos sospechar que existen mutaciones más agresivas (como las que producen un codon de parada

prematuro) que alteran considerablemente la estructura de la proteína, especialmente si se producen en el

dominio “cysteine-knot”. En consecuencia, la unión ligando-receptor desaparece y la vía Wnt se interrumpe,

produciendo un defecto más severo en la vascularización retiniana.

4‐ GEN RS1


El estudio molecular del gen RS1, realizado en veintinueve familias, permitió identificar el defecto

genético responsable de enfermedad en veinte de ellas. Se detectaron un total de trece mutaciones

diferentes, cuatro de las cuales no se habían reportado previamente (p.Gln80X, p.Leu137Pro, p.Gln154Arg

y p.Glu215Val). La caracterización molecular de RS1 permitió determinar que las alteraciones no se

producen al azar, si no que se localizan en los exones 4, 5 y 6 del gen que codifican el dominio discoidín de

la proteína.

Codon de parada prematuro

Altera la pauta de lectura


Péptido señal Dominio discoidín Dinucleótidos CG

Figura V.4- Representación esquemática de la estructura del gen RS1 y de las mutaciones identificadas en nuestros

pacientes.

Entre los trece cambios identificados, se ha observado que ocho de ellos (8/13; 61´5%) se

producen en dinucleótidos CG, que son secuencias consideradas como puntos calientes de mutación en el

genoma (Lutsenko E & Bhagwat AS, 1999). En RS1 existen veintiséis dinucleótidos CG, que representan

aproximadamente un 7´7% de la secuencia codificante del gen. Se analizaron todas las alteraciones

puntuales identificadas hasta ahora en RS1 (www.hgmd.org) y se observó que el 18´5% de ellas se

producen en estos dinucleótidos.

136

V- Discusión

El cambio p.Gln80X (XLRS-108), ocurre en un dinucleótido CG y se produce “de novo”, generando

una proteína truncada que carece de dominio discoidín. Asimismo, la mutación p.Glu72Lys se produce “de

novo” en la familia XLRS-43. De hecho, esta alteración se ha descrito en repetidas ocasiones en

poblaciones diferentes. Otro punto caliente de la secuencia codificante se sitúa en un tracto de seis

citosinas (posiciones nucleotídicas 574_579), en el que se produce la inserción de una citosina que

desplaza la pauta de lectura y genera una proteína anómala de sesenta y nueve aminoácidos más larga de

lo normal (p.His194fsX263). Esta inserción se ha descrito previamente en tres familias no relacionadas de

Austria, Reino Unido y Estados Unidos (The Retinoschisis Consortium, 1998).

Las mutaciones identificadas en nuestras familias, así como las alteraciones descritas en pacientes

procedentes de otras poblaciones, indican que existe una tasa considerable de mutaciones “de novo” en el

gen RS1, debida en parte a la elevada prevalencia de dinucleótidos CG en su secuencia. Esta situación

pone de manifiesto que se producen múltiples orígenes de la XLRS.

La sustitución más frecuente en nuestros pacientes con Retinosquisis, p.Gln154Arg, se identificó en

cinco familias no relacionadas entre sí (ver pág. 87). Esta mutación se describe por primera vez en este

trabajo y, a diferencia de los cambios anteriores, no se produce en un dinucleótido CG.


El análisis de los marcadores microsatélites realizado en las familias portadoras de la mutación

p.Gln154Arg permitió identificar que comparten un haplotipo común, por lo que se puede sospechar

identidad por descendencia. Teniendo en cuenta que únicamente se ha descrito otro cambio en este codon

(p.Gln154X; The Retinoschisis Consortium, 1998) y que esta alteración no se produce en un dinucleótido

CG, se puede sospechar que esta mutación se ha transmitido a partir de un ancestro común.

El cambio p.Glu72Lys se identificó en tres familias españolas y en una familia portuguesa. Esta

mutación tiene un efecto fundador en población finlandesa, en la que uno de cada tres pacientes con XLRS

presenta esta alteración (Huopaniemi L et al., 1999). Sin embargo, en nuestras familias se trata de una

mutación recurrente, quizá porque se produce en un dinucleótido CG, pero no fundadora, ya que los

pacientes presentan haplotipos diferentes entre sí. De hecho, en la familia XLRS-43 esta mutación se

produce “de novo” en una mujer portadora que tiene dos gemelos afectos (ver pág. 88).

137

V- Discusión


Independientemente de la heterogeneidad de las mutaciones, los pacientes presentan

manifestaciones clínicas similares, con cierta variabilidad intrafamiliar en la edad de comienzo y en la

progresión. Como caso particular, en la familia XLRS-29 se identificó una mujer con síntomas clínicos (ver

pág. 90). Aunque se trata de situaciones excepcionales, en la literatura se han descrito casos de mujeres

con Retinosquisis producida por consanguinidad (Forsius H et al., 1973; Francois P et al., 1989; Mendoza-

Londono R et al., 1999). En el estudio molecular de RS1 realizado por Mendoza-Londono R et al., se

describe una mutación en homozigosis en las mujeres afectas como causa de la enfermedad. En nuestra

familia, los padres de la paciente no están emparentados entre sí, por lo que su fenotipo se podría explicar

por una inactivación sesgada del cromosoma X o por una alteración en otro gen responsable.

El estudio molecular del gen RS1 permite establecer que el espectro de mutaciones es amplio y las

manifestaciones oftalmológicas son variables. Se ha observado la agudeza visual de los pacientes

disminuye con la edad y que la maculopatía empeora a partir de los treinta años, pero no existe correlación

entre el tipo de mutación y la severidad de la enfermedad. De hecho, se aprecia variación en las

manifestaciones clínicas entre varones afectos de la misma familia.

Estudios recientes con modelos estructurales del dominio discodín, permitieron determinar que las

mutaciones en RS1 pueden inhibir la secreción de la proteína, alterar su oligomerización o interferir en su

función (Wang T et al., 2006). Los autores concluyeron que se produce retención intracelular de la mayoría

de las proteínas mutantes, lo que explicaría porqué la severidad de la enfermedad no es específica de la

mutación responsable, es decir, no existe correlación entre el genotipo y el fenotipo.

Por tanto, la identificación de la mutación responsable en varones con XLRS confirma el

diagnóstico clínico y facilita un asesoramiento genético adecuado para los familiares, pero no permite

predecir la evolución (prognosis) del paciente.

5‐ GEN ABCA4

5.1- IMPLICACIÓN EN LA ENFERMEDAD DE STARGARDT

5.1.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO Las diversas mutaciones en el gen ABCA4 se han asociado con diferentes distrofias de retina,

aunque en la etiología de la STGD es donde desarrollan un papel decisivo. ABCA4 consta de cincuenta

exones, con una pauta abierta de lectura de 6.819 pares de bases, por lo que la detección de mutaciones

en este gen supone un reto. Para el cribado mutacional previo de nuestros pacientes, se utilizó el

microarray de genotipado ABCR400 diseñado por Asperbio (Jaakson K et al., 2003) y las mutaciones

detectadas se confirmaron mediante secuenciación automática.

138

V- Discusión

Para evaluar la eficiencia del microarray, se estudiaron un total de setenta y cuatro familias

diagnosticadas de STGD. En nuestra muestra, se identificaron ochenta y un alelos potencialmente

asociados a enfermedad, lo que supone una tasa de detección de 54´7% (ver pág. 97). Se identificaron

ambos alelos mutantes en el 39´2% (29/74) de los pacientes, un alelo mutante en el 31´1% (23/74) y no se

identificaron mutaciones en 29´7% (22/74) restante de los casos.

Estos porcentajes son simililares a los identificados por Jaakson K et al., ya que en sus series de

pacientes el microarray detecta entre el 54-56% de los alelos asociados a enfermedad, en pacientes con

Stargardt elegidos al azar y que no han sido analizados previamente, dependiendo de la composición étnica

de la muestra y del grado de caracterización clínica y molecular de la misma. En su estudio incluyen

pacientes europeos procedentes de Italia (Nápoles), Países Bajos (Nijmegen) y Eslovenia (Ljubljana) y

pacientes norteamericanos reclutados en dos centros (Harkness Eye Institute, Universidad de Columbia,

Nueva York; National Eye Institute, NIH, Bethesda, MD). La distribución de los alelos mutantes en estas

poblaciones, así como en población española, se muestra en la siguiente tabla:

Pacientes STGD Cromosomas analizados

Alelos asociados a

enfermedad (%)

Alelos complejos Alelos más frecuentes Distribución

de los alelos Valores medios

Univ. Columbia Nueva York 120 68 (56´7%) 10

p.Gly1961Glu 10% p.Gly863Ala 4´2% IVS38-10T>C 4´2%

2- 38´3% 1- 36´7% 0- 25´0%

NEI/NIH 40 24 (60%) 5 IVS38-10T>C 14´3% p.Gly1961Glu 7´1%

2-45´0% 1- 30´0% 0- 25´0%

2- 41´6% 1- 33´4% 0- 25´0%

Italia (Nápoles) 62 34 (54´8%) 0 p.Gly1961Glu 12´9% IVS35+2T>C 9´7%

2- 32´2% 1- 45´2% 0- 22´6%

Países Bajos (Nijmegen) 36 20 (55´6%) 4

p.Gly1961Glu 11% p.Gly863Ala 8´3% p.Val256Val 8´3%

2- 38´9% 1- 33´3% 0- 27´8%

Eslovenia (Ljubljana) 28 15 (53´6%) 0

p.Gly1961Glu 21´4% p.Arg681X 7´1% p.Gln1412X 7´1%

2- 28´6% 1- 50´0% 0- 21´4%

2- 33´3% 1- 42´8% 0- 23´9%

España 148 81 (54´7%) 6 p.Arg1129Leu 22´4% p.Gly1961Glu 8´4% c.2888delG 7´4%

2- 39´2% 1- 31´1% 0- 29´7%

2- 39´2% 1- 31´1% 0- 29´7%

Tabla V.1: Eficiencia de detección de mutaciones del microarray ABCR400 en población europea y norteamericana

(Jaakson K et al., 2003) y en población española.

Según estos datos, se detectaron ambos alelos mutantes en un porcentaje más elevado de

pacientes españoles que en la media de pacientes europeos reportados por Jaakson K et al. Sin embargo,

el porcentaje de pacientes en los que no se han identificado alelos mutantes también fue más elevado

(29´7% en España frente al 23´9% europeo y el 25´0% norteamericano), indicando la inclusión de

fenocopias que no se pueden evitar por completo debido a los medios de selección, ya que los pacientes

son remitidos por diversos oftalmólogos entre los cuales no se establece un protocolo común de diagnóstico

para STGD. Se ha observado que en aquellos pacientes que se han caracterizado clínicamente en detalle,

se identifican ambos alelos mutantes.

139

V- Discusión

Además de la eficiencia obtenida, el microarray es altamente sensible y específico, ya que en un

total de doscientos cincuenta y ocho alelos analizados (=129 pacientes ABCA4) únicamente se identificaron

un falso positivo (no específico) y un falso negativo (no sensible), que determinan una

especificidad/sensibilidad del 99´6% (ver pág. 97).

La secuenciación automática del gen ABCA4 realizada en nueve pacientes STGD en los que se

había detectado previamente un alelo mutante, permitió identificación del segundo alelo asociado a

enfermedad en seis de ellos (6/9), que supone una tasa de detección total (microarray+secuenciación) de

58´8% (ver pág. 99). En consecuencia, la distribución de los alelos es la siguiente:

Pacientes STGD Cromosomas analizados

Alelos asociados a enfermedad (%)

Distribución de los alelos ABCR400

Distribución de los alelos ABCR400 + secuenciación

España 148 81 (54´7%) 2- 39´2% 1- 31´1% 0- 29´7%

2- 47´3% 1- 23´0% 0- 29´7%

Tabla V.2: Eficiencia de detección de mutaciones mediante el microarray ABCR400 y mediante la combinación de

métodos ABCR400+secuenciación automática, en población española.

El análisis realizado con MLPA en los tres pacientes STGD restantes, no detectó ninguna alteración

que implicase deleción o duplicación de material genético que pudiese representar el segundo alelo

responsable de enfermedad. Por tanto, únicamente la secuenciación automática de todas las posiciones

nucleotídicas del gen ABCA4 permite una mayor tasa de detección de mutaciones frente al microarray de

genotipado.

Además de la diferencia en la tasa de detección de mutaciones entre las poblaciones estudiadas,

las frecuencias de los alelos mutantes también son distintas. La mutación más frecuente en población

europea es el cambio p.Gly1961Glu. En los pacientes españoles aparece con una frecuencia del 8´41%,

que la sitúa en el rango observado en otras poblaciones europeas, a excepción de Eslovenia, en la que

este cambio aparece con mayor frecuencia (21´4%). Fumagalli A et al. analizaron los polimorfismos del

exón 42 de ABCA4 y definieron un haplotipo común, en el que p.Gly1961Glu se asocia con tres

polimorfismos de único nucleótido (c.5836-43A>C, c.5836-11A>G y c.5844A>G), sugiriendo un origen

común a partir de un mismo cromosoma ancestral.

En nuestros pacientes STGD, el alelo p.Gly1961Glu E siempre aparece asociado al haplotipo c.5682G>C,

c.5814A>G, c.5843CA>TG y c.5844A>G, que así mismo puede sugerir la hipótesis de un origen ancestral

común.

140

V- Discusión

Sin embargo, el alelo mutante más frecuente en nuestra muestra de pacientes STGD es el cambio

p.Arg1129Leu, que representa el 22´4% de los alelos asociados a enfermedad. La prevalencia de esta

mutación en pacientes norteamericanos es del 1% (Webster AR et al., 2001). Este alelo siempre aparece

asociado a un polimorfismo localizado en el intrón 33 del gen (IVS33+48C>T), por lo que se puede

sospechar un origen común en población española. En un 35´7% de las familias, esta mutación también

aparece asociada al polimorfismo p.His423Arg (c.1268A>G), aunque en un 57´1% no se ha podido

establecer la fase. Considerando que p.Arg1129Leu y IVS33+48C>T aparecen en desequilibrio de

ligamiento y pueden indicar un posible origen común, el cambio p.His423Arg ha debido producirse

posteriormente como un evento mutacional recurrente, ya que en las familias en las que la que la mutación

p.Arg1129Leu se produce en homozigosis, el polimorfismo IVS33+48C>T también aparece en homozigosis,

pero el cambio p.His423Arg se identifica en heterozigosis. El hecho de que en la familia ARDM-78 el

cambio p.His423Arg no aparece, pero si el alelo complejo p.Arg1129Leu + IVS33+48C>T, refuerza esta

hipótesis (ver pág. 120).

Alelo mutante Población STGD Frecuencia alélica Referencia

Eslovenia 21´4% Jaakson K et al., 2003

Italia 12´9% Jaakson K et al., 2003

Italia 10% Fumagalli A et al., 2001

Alemania 12% Rivera A et al., 2000

Países Bajos 11% Jaakson K et al., 2003

p.Gly1961Glu

España 8´4% Este trabajo Países Bajos /

Alemania 15% Maugeri A et al., 1999

Reino Unido 3´6% Papaioannou M et al., 2000

Francia 2´8% Maugeri A et al., 2002

España 1´87%* Este trabajo

España 3% Paloma E et al., 2001

p.Gly863Ala

Italia 0% Simonelli F et al., 2000

p.Arg1129Leu España 22´4% Este trabajo

Tabla V.3: Frecuencia alélicas de las mutaciones más prevalentes en ABCA4 en pacientes STGD europeos.

*: Este cambio forma dos alelos dobles mutantes, [p.Gly863Ala +p.Arg1055Trp] y [p.Gly863Ala + p.Arg 943GlnQ]; cada

uno de ellos aparece con una frecuencia del 0´93%.

En el gen ABCA4 se producen dos o más alteraciones en cis, denominadas “alelos complejos”,

reportadas por primera vez por Shroyer NF et al., 2000. En nuestros pacientes, se identificaron seis alelos

complejos, cinco dobles mutantes y uno triple mutante (ver pág. 109). Cabe destacar que las mutaciones

p.Arg1108Cys y p.Arg2107His únicamente aparecen combinadas como un alelo doble mutante en dos

familias (ver pág. 95). En otras cuatro familias, estas alteraciones se asocian a un tercer cambio (R152Q) y

en una de ellas este alelo triple mutante se produce en homozigosis (ver pág. 95).

141

V- Discusión

El alelo [p.Arg152Gln+p.Arg1108Cys+p.Arg2107His] puede haber evolucionado a partir del alelo

[p.Arg1108Cys+p.Arg2107His], por evento mutacional recurrente. De hecho, son los dos alelos complejos

más prevalentes entre nuestros pacientes. El análisis de los marcadores microsatélites muestra que los

pacientes comparten un haplotipo similar, incluso el paciente de la familia ARDM-110 (doble mutante) tiene

un haplotipo idéntico al que muestran las familias ARDM-14 (alelo materno), ARDM-17 y ARDM-137 (triples

mutantes). Este hecho sugiere que la mutación p.Arg152Gln se ha producido recientemente, ya que los

cambios/polimorfismos de único nucleótido tienen una tasa de mutación mucho menor que los

microsatélites, que son más inestables (Morral N et al., 1994).

La mayoría de las mutaciones que se producen en el gen ABCA4 son puntuales, cambia un

nucleótido determinado que origina diversos tipos de cambios a nivel de la proteína. El cambio más

frecuente son las mutaciones que provocan cambio de aminoácido, seguidas de los cambios que alteran la

pauta de lectura. Esto puede ser debido a que al copiar un gen de tamaño considerable como ABCA4, se

produzca deslizamiento (en inglés, slippage) de la polimerasa y se introduzcan nucleótidos de más o de

menos. Las alteraciones menos frecuentes son las que provocan un codon de parada prematuro y las que

alteran el procesamiento de los intrones, que no dejan de ser mutaciones puntuales que generan un codon

específico (de parada) o que ocurren en un lugar concreto (sitios aceptores/donadores de procesamiento),

respectivamente. Sólo dos mutaciones se producen “de novo” (ARDM-40, ARDM-81), a excepción de la

isodisomía parcial de la familia ARDM-61, que sugiere un elevado número de portadores sanos en nuestra

población.

5.1.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO El estudio familiar realizado en cuarenta y nueve familias STGD en las que se identificó al menos un

alelo mutante, permitió determinar que los haplotipos siempre cosegregan con la enfermedad (ver pág.

113). En aquellas familias en las que se pudo excluir ABCA4 como gen responsable, no se identificaron

pacientes que fuesen portadores de mutaciones por azar. Este hecho sugiere que en aquellas familias con

un alelo mutante identificado y que cosegregan, debe existir un segundo alelo mutante. Por tanto, sería

recomendable utilizar un segundo método de cribado que permita detectar nuevas mutaciones, como el

dHPLC, de mayor sensibilidad que métodos anteriores como SSCP y DGGE (Stenirri S et al., 2004).

El análisis de los marcadores microsatélites llevado a cabo en las familias con el alelo

p.Arg1129Leu puede sugerir que esta mutación tenga un origen común. Los microsatélites o repeticiones

cortas en tándem (STR, Short Tandem Repeats) resultan útiles para observar los cromosomas que portan

la mutación p.Arg1129Leu, ya que la variabilidad de los alelos en estos loci se produce principalmente por

adiciones o deleciones de repeticiones de nucleótidos, debido al deslizamiento de la polimerasa (Weber JL,

1990).

142

V- Discusión

En las familias p.Arg1129Leu, se observó que un 50% tienen el haplotipo [182-146- p.Arg1129Leu -

206] (ver pág. 121). Por lo general, en los análisis de parsimonia (no realizados en este trabajo), se

considera que el alelo más antiguo en: 1) el más frecuente, 2) el que da lugar a un mayor número de alelos

diferentes, 3) el que tiene un mayor número haplotipos asociados. Asumiendo estas premisas, lo esperable

es que a partir del haplotipo [182-146- p.Arg1129Leu -206], se haya generado el haplotipo [182-146-

P.Arg1129Leu-188] y, finalmente, el haplotipo [172-146-P.Arg1129Leu-188], como se muestra en la figura

anterior. El deslizamiento (en inglés, slippage) en un alelo de uno de los tres loci (microsatélites) es el

mecanismo que genera más haplotipos diferentes (Morral N et al., 1994).

118822 114466

Figura V.5: Posible evolución de los haplotipos asociados al alelo mutante p.Arg1129Leu (c.3386G>T).

El número de cromosomas presentados en este trabajo es muy limitado, por lo que no se puede

realizar un estudio sobre el origen, evolución y dispersión de la mutación p.Arg1129Leu. Sin embargo, su

elevada prevalencia entre los alelos asociados a STGD en población española y la similitud de los

haplotipos puede sugerir un origen común.

118822 114466 cc..33338866GG>>TT220066

118822 114466 cc..33338866GG>>TT118888

117722 114466

cc..33338866GG>>TT118888

118822 114466

cc..33338866GG>>TT220066

118822 114466 cc..33338866GG>>TT220066

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118822 114466 cc..33338866GG>>TT118888

117722 114466 cc..33338866GG>>TT118888

143

V- Discusión

5.2- IMPLICACIÓN EN LA DISTROFIA DE CONOS Y BASTONES AUTOSÓMICA RECESIVA

5.2.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO En nuestra muestra de pacientes DCB, se han identificado ambos alelos mutantes en ABCA4 en

seis pacientes (6/28; 21´4%), un alelo mutante en cuatro pacientes (4/28; 14´3%) y no se identificaron

mutaciones en los restantes dieciocho pacientes (18/28; 64´3%). Por tanto, se ha detectado al menos un

alelo mutante en diez de las veintiocho familias, que representa un 35´7% de los casos. Este porcentaje de

detección es superior que el 33% descrito por Klevering BJ et al., 2004. Sin embargo, las diferencias entre

ambas poblaciones no fueron significativas (test Chi-cuadrado, α=0´05). De las seis familias en las se

identificaron ambos alelos mutantes, en cuatro de ellas las mutaciones se producen en homozigosis

(ARDM-79, ARDM-86, ARDM-126 y RP-267), dos de ellas son consanguíneas (ARDM-86, ARDM-126).

El alelo asociado a enfermedad más prevalente fue el cambio c.2888delG (6/16), representando el

37´5% de todos los alelos mutantes identificados. Este cambio es el tercer alelo patológico más frecuente

de la muestra de pacientes estudiados (ver pág. 110).

En este trabajo, el estudio clínico evolutivo en la familia ARDM-79 permitió modificar el diagnóstico

de la probandus de STGD a DCB. El hecho de que en nuestros pacientes la mutación c.2888delG está

asociada a un DCB, tanto en homozigosis como en heterozigosis, sugiere que este cambio debe ser

considerado un alelo severo asociado a enfermedad. El alelo c.2888delG aparece en heterozigosis,

constituyendo un alelo doble mutante en las familias ARDM-133 y ARDM-176, que portan las mutaciones

[c.2888delG +p.Leu11Pro] y [c.2888delG + p.Leu2060Arg], respectivamente. Esto es importante ya que los

pacientes que portan este cambio pueden diagnosticarse como STGD en etapas tempranas de la

enfermedad y posteriormente evolucionar a un fenotipo DCB. De hecho, debe tenerse en cuenta

especialmente en las familias ARDM-15 y ARDM-22 (que porta el mismo genotipo que la familia ARDM-

176), actualmente clasificadas como STGD (ver pág. 95). La edad de comienzo de la enfermedad en estos

pacientes se produce entre los ocho-doce años y padecen ceguera nocturna en torno a los dieciocho años

(ver págs. 124-125).

En las restantes familias DCB, únicamente se detectó un alelo patológico que en todos los casos

produce un cambio de aminoácido en la proteína (ver pág. 102). En la familia ARDM-99, en la que

previamente se había identificado un alelo mutante, no se identificó el segundo alelo responsable de

enfermedad tras las secuenciación de la región exónica completa y análisis con MLPA. Estos resultados

sugieren que el paciente sea portador de mutación en ABCA4 por azar, ya que no se pudo realizar el

estudio familiar, o que puedan existir mutaciones en zonas no codificantes del gen que no han sido

analizadas, como el promotor o los intrones.

144

V- Discusión

5.2.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO El análisis de haplotipos realizado en aquellas familias en las que se identificó al menos uno de los

alelos mutantes mostró cosegregación con la enfermedad. En dos familias este estudio permitió excluir el

gen ABCA4 (ver pág. 115), sugiriendo la existencia de otro gen responsable. En estas familias excluidas no

se identificaron alelos mutantes, lo que descarta que alteraciones en este gen puedan ejercer algún efecto

modulador o regulador sobre el fenotipo del paciente.

5.3- IMPLICACIÓN EN LA RETINOSIS PIGMENTARIA AUTOSÓMICA RECESIVA

5.3.1- ESTUDIO GENÉTICO DIRECTO

En las diecisiete familias RPAR estudiadas, se identificaron cuatro con un alelo mutante, de las

cuales una fue excluida como ligada a ABCA4 por el análisis familiar (3/17; 17´6%). Este porcentaje de

detección es más elevado que el 5% descrito por Klevering BJ et al., 2004 y que el 16% descrito por

Wiszniewski W et al., 2005. Sin embargo, las diferencias entre nuestra serie de pacientes y las series

reportadas por ambos autores son fueron significativas (test Chi-cuadrado, α=0´05).

En la literatura, se describe que los pacientes con ambos alelos mutantes identificados en ABCA4

presentan pérdida severa de la función visual, atrofia extensa y respuestas abolidas en el ERG. No

obstante, al no haberse identificado los dos alelos mutantes en ABCA4 en la mayoría de las familias

estudiadas, no es posible establecer en nuestra serie un fenotipo RPAR asociado específicamente a este

gen, ni conocer cuáles son las mutaciones causantes de dicho fenotipo.

5.3.2- ESTUDIO GENÉTICO INDIRECTO

En una de las cuatro familias con un alelo mutante en ABCA4, el análisis de haplotipos permitió

descartar su implicación en la patología, sugiriendo que en este paciente la causa primaria de la

enfermedad no es la mutación identificada en este gen (ARRP-700, ver pág. 116).

En RPAR la heterogeneidad genética es enorme. En 4/17 familias, la causa genética

aparentemente es detectada en ABCA4, pudiendo tener mutación(es) en cualquiera de los genes

candidatos conocidos u otros. Incluso en los casos con aparente cosegregación (3/17), pueden existir otras

causas genéticas. Recientemente, se ha localizado un locus en 1p13.3-p21.2 situado a 4´9 cM (7´1 Mb) de

ABCA4, en una familia pakistaní (Zhang Q et al., 2005). La identificación y el estudio de este gen podrían

ayudar a dilucidar la diversidad fenotípica de la RPAR localizada en esta región, ya que quizá las

alteraciones en este nuevo gen podrían ser responsables de este fenotipo más agresivo en nuestros

pacientes.

145

V- Discusión

5.4- IMPLICACIÓN EN OTRAS DISTROFIAS DE RETINA

5.4.1- IMPLICACIÓN EN LA DISTROFIA MACULAR AUTOSÓMICA DOMINANTE

Las familias con herencia autosómica dominante se incluyeron en este trabajo, porque no se puede

descartar que progenitor e hijos puedan tener mutaciones en ambas copias del gen ABCA4 y que

compartan un alelo mutante común.

En estas familias con ADDM, se identificaron dos pacientes con un alelo mutante (ver pág. 107). En

la familia ADDM-59, los haplotipos excluyeron el gen ABCA4 como responsable de la patología. En la

familia ADDM-92, se identificó el cambio p.Ile156Val (reportado como asociado a un fenotipo STGD por

Papaioannou M et al., 2000), que no mostró cosegregación con los haplotipos. El análisis mutacional

realizado reveló un total de seis haplotipos diferentes identificados en las tres mujeres afectas (III:5, IV:2,

IV:3), descartando las mutaciones en ABCA4 como causa común a los fenotipos DR observados en esta

familia:

- en la paciente con STGD (IV:3) se identificaron ambos alelos mutantes, que son muy probablemente la

causa de su enfermedad;

- en una paciente con DM (IV:2) se identificó un alelo mutante distinto, que posiblemente se trate de una

asociación fortuita;

- en la tercera paciente con DM (III:5), no se identificaron alelos mutantes en ABCA4, por lo que la causa

genética de su enfermedad es desconocida;

- por último, se identificó un alelo mutante -diferente a los anteriores- en una mujer sana (III:6).

Por tanto, en esta familia se puede concluir que no existe una causa genética común a las distintas DR

presentes en las tres afectas, existiendo un caso típico de STGD con ambas mutaciones identificadas en

ABCA4 y dos pacientes con distrofia macular de otra causa genética. No obstante, no se puede descartar

que el cambio p.Ile156Val desarrolle un posible efecto modulador sobre el fenotipo DM de la probandus

(IV:2).

5.4.2- IMPLICACIÓN EN FAMILIAS CON FENOTIPO DIVERSO

Entre el total de familias en las que se realizó el estudio mutacional del gen ABCA4, se identificaron

tres que resultaron peculiares debido a que los diferentes afectos manifestaban distintos fenotipos,

atribuibles a mutaciones en este gen.

En la familia RP-280 se pudieron confirmar dos diagnósticos clínicos; en el hermano con STGD se

identificó la mutación p.Asn1805Asp en homozigosis en el gen ABCA4, mientras que en la hermana

diagnosticada de RP con preservación del epitelio paraarteriolar se detectó una mutación en el gen CRB1.

Las mutaciones en este gen se transmiten con un patrón autosómico recesivo, por lo que es muy probable

que exista un segundo alelo mutante en CRB1 (no detectado hasta el momento) que justifique su

enfermedad. Esta familia en la que existen distintos fenotipos compatibles con alteraciones en ABCA4,

pone de manifiesto que, independientemente de las combinaciones de alelos que se produzcan

146

V- Discusión

(moderado+severo, severo+severo, etc.), puede existir más de un gen relacionado con las distrofias

retinianas implicado en las patologías familiares (en este caso, CRB1).

En trabajos previos en los que se identificaron disomías uniparentales completas para el cromosoma 1, se

estableció, por un lado, que no deben existir genes improntados y, por otro lado, que el número total de

mutaciones recesivas por cromosoma en un individuo concreto debe ser bajo. Esta afirmación se realizó en

base a que el paciente no presentaba anomalías adicionales a la enfermedad en cuestión causada por una

mutación en homozigosis en un gen determinado (Thompson DA et al., 2002). Sin embargo, en nuestra

familia se han producido dos enfermedades oftalmológicas recesivas, con mutaciones en sendos genes

localizados en el cromosoma 1.

En la familia RP-315 se observa una herencia autosómica dominante, ya que la madre y sus dos

hijos presentan problemas visuales aunque exhiben fenotipos distintos. El análisis de haplotipos mostró que

ambos hermanos comparten uno de los cromosomas 1 paternos, pero cada uno ha heredado un

cromosoma 1 materno diferente (ver pág. 118). Por tanto, el único alelo mutante detectado (p.Gly1961Glu

materno) no es el causante de la enfermedad, al menos en la hija, que además presenta Distrofia Macular

de Best, normalmente asociada a mutaciones en el gen VMD2. Si éste fuese el gen responsable de la

retinopatía en la hija y teniendo en cuenta que el padre era sano, podría haberse producido una mutación

“de novo” que explicase la patología. Por tanto, los haplotipos podrían cosegregar con ABCA4 únicamente

en la madre y en el hijo y sus diferentes manifestaciones clínicas se podrían explicar en función de sus

respectivos alelos mutantes no identificados (Figura IV.34, barras azul y roja).

Al igual que ocurre en la familia ADDM-92 con el alelo mutante p.Ile156Val, es probable que el alelo

p.Gly1961Glu se produzca por asociación fortuita y que la patología se deba a otro gen responsable.

Por último, en la familia RP-532 se observó que el alelo p.Arg1129Leu y los haplotipos

cosegregaban con la enfermedad. Este alelo únicamente se ha visto asociado a STDG en los pacientes

presentados en este trabajo (ver págs. 95-96). Los tres hermanos comparten los mismos haplotipos, sin

embargo, las dos hermanas presentan un fenotipo más agresivo de DCB. Por tanto, es posible que la

patogénesis se deba a un alelo severo aún no identificado y que en principio la enfermedad se manifieste

como STGD y posteriormente evolucione a DCB, como ocurre con el alelo c.2888delG en las familias

ARDM-79 y ARDM-86, comentadas anteriormente (ver pág. 144).

5.5- IMPLICACIÓN EN REORGANIZACIONES CROMOSÓMICAS

A lo largo del estudio mutacional del gen ABCA4 realizado en ciento veintinueve familias, se

identificó una paciente perteneciente a la familia ARDM-61 con la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis.

Sin embargo, el patrón de herencia no fue autosómico recesivo, ya que el alelo en heterozigosis

únicamente se detectó en su padre. La paternidad se confirmó mediante marcadores microsatélites, por

tanto, la paciente podía presentar isodisomía parcial paterna en el cromosoma 1 o un cariotipo anómalo

debido a una microdeleción materna en la región 1p, causando hemizigosidad para el locus ABCA4.

147

V- Discusión

Se realizaron cariotipos convencionales y de alta resolución que no mostraron anomalías

cromosómicas estructurales. El análisis de dosis realizado con MLPA confirmó la presencia de dos copias

del gen ABCA4, sugiriendo isodisomía parcial paterna. La evolución y severidad de la enfermedad fueron

similares a los mostrados por otros pacientes con el alelo p.Arg1129Leu en homozigosis, confirmando que

este alelo mutante produce un efecto moderado en la patogénesis de la STGD.

Los hallazgos moleculares indicaron que la paciente ha heredado dos copias del cromosoma 1, una

de cada progenitor, a excepción de la región isodisómica identificada en el brazo corto del homólogo

materno. Por tanto, la recombinación ha sido postzigótica (mitótica). Este mecanismo se puede deber a una

recombinación producida en una célula trisómica, seguida de un rescate de la trisomía. También puede

ocurrir por pérdida del cromosoma 1p materno seguida de duplicación del cromosoma 1p paterno.

++

XX

++

XX

Profase (Meiosis I)

Cromosomas homólogos paternos

1ª división meiótica (Meiosis I)

2ª división meiótica (Meiosis II)

Gametogénesis normal No disyunción en Meiosis II⇒ Isodisomía

Isodisomía parcial Isodisomía parcial

Homólogo materno

Homólogo materno

Recombinación (mitótica) en célula

trisómica y rescate de trisomía

⇒Pérdida del 1p

materno y duplicación del 1p paterno

Figura V.6: Posibles mecanismos que producen isodisomía parcial o segmentaria.

148

V- Discusión

La recombinación postzigótica en una célula diploide puede provocar mosaicismo con isodisomía

parcial. No obstante, no se pudo determinar este mecanismo en la paciente ya que únicamente se analizó

el ADN extraído a partir de linfocitos de sangre periférica. Es menos frecuente que se produzca un rescate

de trisomía, ya que las trisomías del cromosoma 1 son extremadamente infrecuentes y los fetos portadores

de estas aneuploidías mueren antes de implantarse (Field LL et al., 1998). Si éste hubiese sido el

mecanismo, ha debido producirse prácticamente durante la primera división celular del zigoto, produciendo

la pérdida completa de las células trisómicas.

También se ha identificado una región en 1q en la que no se puede distinguir entre una segregación

normal (biparental) o heterodisomía materna (ver pág. 114, Figura IV.31). No obstante, que se produzca

este reordenamiento es bastante improbable y quizá esta segregación se deba a que ambos padres

comparten uno de los dos alelos de estos marcadores. Aunque los marcadores microsatélites utilizados

presentan elevada heterozigosidad, es posible que presenten un alelo muy prevalente entre la población

española, que explique que ambos progenitores compartan uno de los dos alelos en un total de catorce

marcadores (D1S2878-D1S2785).

Otros ejemplos de disomía uniparental en el cromosoma 1 se han reportado previamente, tanto de

origen paterno como materno (Pulkkinen L et al., 1997; Gelb BD et al., 1998; Takizawa Y et al., 1998;

Dufourcq-Lagelouse R et al., 1999; Takizawa Y et al., 2000; Rivolta C et al., 2002; Thompson DA et al.,

2002). Entre ellos, existen dos casos con degeneración retiniana; por un lado, un paciente con isodisomía

uniparental completa que produce homozigosidad para una mutación en el gen RPE65 (Thompson DA et

al., 2002), por otro lado, un paciente con heterodisomía uniparental e isodisomía parcial, en el que se

identifica una mutación en homozigosis en el gen USH2A (Rivolta C et al., 2002). En relación con

enfermedades oftalmológicas, también se han descrito casos de isodisomía uniparental en otros

cromosomas (Thompson DA et al., 2002, Pentao L et al., 1992).

Una de las consecuencias de este tipo de reordenamientos es la alteración de la impronta

genómica (Engel E, 1980). Al igual que ha ocurrido en nuestro caso, los pacientes que presentan ambos

cromosomas 1 derivados de un solo progenitor se identificaron por la evolución de sus respectivas

enfermedades recesivas, sin mostrar anomalías genéticas adicionales. Del estudio de estos casos, se ha

descrito que no deben existir genes improntados en el cromosoma 1 que generen alteraciones en el

fenotipo (Thompson DA et al., 2002). No obstante, se debe tener en cuenta que estos reordenamientos

aumentan el riesgo de padecer enfermedades con herencia autosómica recesiva. Por tanto, familias con

retinopatías recesivas pueden tener descendencia afecta, con una mutación en homozigosis, incluso

cuando uno de los progenitores es portador sano de un alelo mutante y el otro progenitor presenta alelos

silvestres.

149

V- Discusión

cas únicamente representan una pequeña fracción de todos los alelos

utantes asociados a ABCA4. Hasta ahora, supone el reordenamiento estructural de mayor tamaño en el

ue se ha visto involucrado este gen (www.hgmd.org). En los casos en los que se identifican mutaciones en

omozig

s con diferentes distrofias de retina ha

ermitido establecer que las alteraciones en este gen son responsables del fenotipo STGD y DCB. Sin

barg

e produce en torno a la segunda década de vida. Cuando esta variante aparece combinada con

tro alelo en trans (doble heterozigoto), se observa que el comienzo de los síntomas no es tan homogéneo

y varía mucho de unos pacientes a otros, por lo que el desarrollo de la enfermedad debe estar determinado

por la patogenidad del otro alelo. Este hecho podría explicar que los pacientes que presentan en trans

Un patrón de herencia no mendeliano para el gen ABCA4 se ha descrito previamente, en un

paciente que presentaba retinosis pigmentaria severa causada por una mutación en homozigosis que

alteraba el procesamiento (1938-1 G>A). Los autores especularon que esta alteración se debía a una

deleción del locus materno, sin embargo, no se pudo comprobar (Rozet JM et al., 1999). Es posible que la

segregación de este alelo se haya producido por disomía uniparental como en nuestra paciente. En este

caso, el análisis con la técnica de MLPA podría determinar el número de copias del locus ABCA4 en el

probandus.

Hasta el momento, la isodisomía parcial del cromosoma 1p, como se muestra en nuestro caso, no

se ha descrito previamente. Este hallazgo tiene una consecuencia importante en lo que se refiere al consejo

genético de la paciente; como el riesgo de recurrencia de disomía uniparental parcial es muy bajo, el riesgo

de que sus hermanos y su futura descendencia padezcan STGD es prácticamente inapreciable.

Este estudio, que forma parte del análisis mutacional realizado en setenta y cuatro familias STGD

indica que las alteraciones genómi

m

q

h osis, es recomendable realizar un análisis de haplotipos para descartar una posible disomía

uniparental. Además de la detección de la mutación p.Arg1129Leu en homozigosis, la información de

homozigosidad de dos polimorfismos intragénicos obtenida mediante el microarray contribuyó a la

sospecha de una no segregación del alelo materno.


El análisis molecular del gen ABCA4 realizado en paciente

p

em o, su implicación en otras retinopatías como la RPAR o la ADDM no es tan evidente, de hecho, en

algunas de estas familias se ha observado que la presencia de alelos mutantes en ABCA4 no cosegrega

con la enfermedad o se produce por asociación fortuita. Este hecho se puede deber a la prevalencia de

alelos mutantes que existe en población control.

Los pacientes con STGD y DCB en los que se han identificado ambos alelos mutantes se han

agrupado en función de la combinación de alelos que exhiben y de la edad de comienzo de la enfermedad

(ver págs. 123-125). De esta manera, se ha observado que el alelo p.Arg1129Leu siempre aparece

asociado a un fenotipo STGD y tiene un efecto moderado en la patogénesis, ya que el comienzo de los

síntomas s

o

150

V- Discusión

al nes más severas (alteran el procesamiento de los intrones -ARDM-76- o que generan un codon de

parada prematuro -ARDM-78-) presenten disminución de la agudeza visual en la primera década de vida.

En los pacientes que presentan alelos complejos, dobles y triples mutantes, también se observa un

desarrollo temprano de la enfermedad (pág. 124). Las excepciones se producen en las familias ARDM-138

y ARDM-12. En la ARDM-138, un comienzo más tardío se podría explicar porque el alelo complejo

p.Gly863Ala

teracio

+p.Arg943Gln se ha descrito como una mutación de efecto patológico limitado (Sun H et al.,

000).

n el ca

ugeriría un

fecto patológico considerable. Cabe destacar que este paciente es de edad avanzada (76 años) y es

osible

ue manifiestan síntomas a partir de los ocho años de

dad (ARDM-38, ARDM-40, ARDM-90; ver pág. 124), que portan un alelo que altera considerablemente la

roteína (4739 del T, Q1315X y IVS22 -2A>T, respectivamente).

iente de la familia ARDM-22 (diagnosticada como STGD)

resenta el mismo genotipo que la paciente perteneciente a la familia ARDM-176 (diagnosticada como

DCB). E

2

E so del paciente perteneciente a la familia ARDM-12, la enfermedad comienza de forma tardía, en

torno a la cuarta década de vida (38 años). Se conoce que el cambio p.Gly1961Glu se considera un alelo

de efecto moderado, pero se desconoce cuál puede ser el efecto del alelo complejo p.Gly1961Glu

+Thr1253Met. El segundo alelo causante de su enfermedad genera una proteína truncada, que s

e

p que no recuerde con exactitud el comienzo de su enfermedad, o bien, que describa el inicio de los

síntomas cuando la disminución de la agudeza visual sea ya crítica. Es posible que alguna de estas

situaciones pudiese explicar que una combinación de alelos severos produzca un aparente, pero no real,

desarrollo tardío de la STGD. No obstante, no se puede descartar que existan otros factores que modulen

la patogenicidad de dichos alelos.

En los pacientes que presentan alelos simples, la enfermedad comienza entre la primera y la

segunda década de vida. Se observan pacientes q

e

p

En el fenotipo DCB, se ha identificado un alelo prevalente (c.2888delG) que aparece en

homozigosis y en heterozigosis en cuatro de los seis pacientes (ver pág. 125). Los dos pacientes restantes

son homozigotos para los cambios c.5041_5055del y p.Gly1977Ser, respectivamente. En todos ellos la

enfermedad comienza en la primera década de vida (6-10 años de edad). Los cambios c.2888delG y

p.Gly1977Ser aparecen como dobles heterozigotos en cuatro pacientes diagnosticados como STGD en la

actualidad (ver págs. 123-124). De hecho, la pac

p

n la paciente de la familia ARDM-22 sería recomendable realizar un seguimiento oftalmológico de

su enfermedad a largo plazo, considerando que porta un alelo asociado a DCB. Los restantes datos de

correlación genotipo-fenotipo en nuestra serie con la mutación c.2888delG pudieran demostrar una

evolución hacia afectación también periférica en el transcurso del tiempo.

151

V- Discusión

152

En la siguiente figura se muestran las mutaciones identificadas en ABCA4, situadas en los

correspondientes dominios de la proteína codificada por este gen:

Figura V.7: Localización de las mutaciones identificadas en ABCA4 en la proteína Rim.

Las mutaciones puntuales están indicadas con flechas negras, mientras que las mutaciones que alteran la

pauta de lectura o el procesamiento se muestran con flechas rojas.

El modelo de la proteína es de Sun H et al., 2000.

Según el modelo de Sun H et al., las mutaciones en el dominio NBD-1 (Nucleotide Binding Domain

1) eliminarían la actividad ATPasa de la proteína tanto a nivel basal como cuando es estimulada por el

retinal. En cambio, las mutaciones en el NBD-2 (Nucleotide Binding Domain 2) no alteran la actividad

TPasa basal pero tienden a inhibir la hidrólisis del ATP dependiente de retinal por parte del NBD1. Aunque

stas observaciones muestran cómo se ve alterada la funcionalidad de la proteína, no permiten establecer

a co

minar posibles interacciones de

ABCA4 con otras proteínas retinianas.

A

e

un rrelación genotipo-fenotipo en nuestros pacientes. En el caso de la familia ARDM-126 (alelo

p.Gly1977Ser en homozigosis), presenta ambas mutaciones en el NBD-2 y muestran un fenotipo DCB,

aunque es posible que la actividad ATPasa basal se siga manteniendo. Además, el cambio en homozigosis

que presenta es una mutación puntual que cambia el aminoácido, sin alterar los residuos restantes de la

proteína.

Para determinar la severidad de los alelos mutantes que se producen en ABCA4, es necesario

realizar un estudio funcional que permita establecer qué pérdida de funcionalidad genera cada variante

alélica. Es preciso tener en cuenta que generalmente, se producen más de una mutación en cada alelo

(alelos complejos) y que es posible que cada uno conlleve un efecto patológico asociado, por mínimo que

sea. Por otro lado, sería recomendable realizar un estudio para deter

RR115522QQ

RR11110088CC RR22110077HH

GG886633AA

RR11005555WW

VV993311MM 22888888 ddeell GG

PP..AARRGG11

RR660022WW

RR221122CC II115566VV VV225566VV

PP11338800LL

RR994433QQ

RR22110077PP

GG11996611EE GG11996611RR

GG11997777SS

EE11112222KK

WW11440088RR

RR11664400WW

CC11449900YY

44553377iinnssCC

IIVVSS4400++55GG>>AA

33221111iinnssGGTT

PP11448866LL

RR440088XX

TT11225533MM

NN11779999DD

TT11001199MM

TT889977II

LL22224411VV

TT990011AA

44773399ddeellTT

VV11443333II

QQ22118877XX

IIVVSS2222--22AA>>TT

ddeellVVVVAAIICC11668811

LL1111PP

PP11994488LL

VV776677DD

NN11880055DD

GG117722SS

VV22005500LL

NN

QQ11331155XX

SS11664422RR

NN338800KK

mmeemmbbrraannaa

CCNNBBDD--11 NNBBDD--22

LL11994400PP

LL22006600RR

V- Discusión

5.7- EPIDEMIOLOGÍA DE LOS ALELOS MUTANTES EN ABCA4

El estudio del gen ABCA4 realizado en individuos control ha permitido estimar la frecuencia de

ortadores sanos entre nuestra población en 7´87%. El hecho de que entre 5-10% de la población general

(este trabajo; Jaakso dora de alelos asociados a

enfermedad tiene consi ías retinianas atribuibles a

ABCA4 y sugiere que la r revisada. La frecuencia de

portadores observada considerablemente mayor de

retinopatías debido a muta

La prevalen se ha determinado, pero la

frecuencia de portadore dios previos puede haberse

sobreestimado por do nalizados sea relativamente

pequeño y, por tanto, se trate de un mbinaciones de

alelos (mutantes) o de los

denomina n

alteraciones retinianas.

‐ DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE LAS MUTACIONES EN LOS PACIENTES ESTUDIADOS.

s, que se ha originado independientemente (ver pág. 88). Sin embargo, esta mutación muestra un

fecto fundador en población europea, concretamente en población finlandesa, en la que uno de cada tres

ciente

En ABCA4, el espectro de variantes alélicas se encuentra ampliamente distribuido a lo largo de

todas las regiones geográficas. Cabe destacar que se identifican un número muy considerable de alelos

mutantes en Madrid y Castilla La Mancha (ver pág. 127), aunque quizá esté producido por el sesgo en la

p

n K et al., 2003; Yatsenko AN et al., 2001) sea porta

derables implicaciones en la proporción de patolog

prevalencia actual de la enfermedad (1:10000) debe se

en este estudio muestra una frecuencia estimada

ciones en este gen, aproximadamente 1/600.

cia precisa de retinopatías asociadas a ABCA4 aún no

s hallada en nuestra población así como en otros estu

s razones: por un lado, que el número de controles a

a estimación sesgada; por otro lado, que existan co

que no produzcan alteraciones (tempranas) en el fenotipo. Este sería el cas

dos polimorfismos proteicos, que se han identificado en homozigosis en individuos si

6

Las mutaciones identificadas en los distintos genes analizados se distribuyen homogéneamente por

toda la geografía española. En la ND, la mutación p.Arg38Cys se identificó en dos familias que compartían

haplotipos procedentes de Madrid y Guadalajara, y en una familia francesa (Royer et al., 2003). El número

de pacientes estudiados es muy limitado y, a excepción del cambio p.Arg38Cys, cada paciente presenta

una mutación distinta, por lo que no se observa agregación asociada a una región geográfica concreta (ver

pág. 83).

En RS1, aparecen dos mutaciones prevalentes. Por un lado, el cambio p.Gln154Arg que sugiere la

existencia de un ancestro común en todos los pacientes (ver pág. 87) y, por otro lado, el cambio

p.Glu72Ly

e

pa s con XLRS presenta esta alteración (Huopaniemi L et al., 1999). El cambio p.Gln154Arg se

localiza en Asturias, País Vasco, Andalucía y en el archipiélago canario. Pese a que la distribución

geográfica es dispersa, se especula que esta mutación ha debido producirse a lo largo de un periodo de

tiempo relativamente corto ya que los pacientes comparten un haplotipo idéntico para cuatro marcadores

microsatélites y éstos son hipermutables (Jones MH & Nakamura Y, 1992).

153

V- Discusión

recogida de datos. En el alelo p.ArgG1129Leu, se observó cierta agregación en el País Vasco, Navarra,

urgos

omparando los alelos prevalentes de estas retinopatías en otras poblaciones europeas (alelo

p.Glu72

n sobre las poblaciones, alterando las frecuencias alélicas y las características de

us individuos (deriva genética). Por lo general, estos cambios conllevan la pérdida de los alelos menos

ecuentes, disminuyendo la diversidad genotípica de la población. Es posible que, a lo largo del tiempo,

stos procesos hayan generado frecuencias alélicas diferentes entre las poblaciones del norte y del sur de

peos

B y Madrid (15/22 alelos p.ArgG1129Leu), estando ausente en ambos archipiélagos y noroeste

peninsular. Si se asumiese que este alelo ha tenido un origen común, es posible que esta variante haya

surgido hace bastante tiempo, ya que se ha producido cierta divergencia entre los marcadores

microsatélites y se han originado haplotipos ligeramente diferentes, aunque similares. No obstante, sería

necesario realizar un estudio de haplotipos en población control para poder determinar qué haplotipos

pueden estar asociados al mutante ancestral y estimar en qué momento se ha producido esta alteración.

C

Lys en Finlandia (RS1); alelo p.Gly1961Glu en Alemania, Países Bajos, Eslovenia e Italia (ABCA4)

con las frecuencias de estas mutaciones en población española, se observan diferencias genéticas con

nuestros vecinos europeos. Estas diferencias se pueden deber, en gran parte, al elevado número de

migraciones e invasiones que ha sufrido la Península Ibérica a lo largo de su historia. Estos

desplazamientos de población pueden diseminar un alelo (mutante) en concreto. Por el contrario, si la

población se asienta, puede originar un efecto fundador. La evolución y la selección natural son procesos

estocásticos que ocurre

s

fr

e

Europa, estableciendo un gradiente (clina) de mutaciones desde los países nórdicos y centro euro

hasta la cuenca mediterránea.

Figura V.8: Distribución geográfica y frecuencia relativa de diferentes mutaciones identificadas en RS1 y

ABCA4 en diversos países europeos (The Retinoschisis Consortium, 1998; Jaakson K et al., 2003; este trabajo).

pp..AArrgg11112299LLeeuu

pp..GGllyy886633AAllaa

pp..GGllnn115544AArrgg pp..GGlluu7722LLyyss

pp..GGllyy11996611GGlluu

154

V- Discusión

7‐ ESTRATEGIAS DE ESTUDIO GENÉTICO EN RETINOPATÍAS DE HERENCIA LIGADA AL CROMOSOMA X

A continuación, se muestra el algoritmo diagnóstico propuesto para el estudio genético de la

Enfermedad de Norrie/Vitreorretinopatía exudativa familiar y de la Retinosquisis juvenil:

Figura V.1 nes en ABCA4.

Figura V.9: Algoritmo diagnóstico para la ND/VREF y la XLRS.

8‐ ESTRATEGIAS DE ESTUDIO GENÉTICO EN RETINOPATÍAS DE HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA

A continuación, se muestra el algoritmo diagnóstico propuesto para el estudio genético de la

Enfermedad de Stargardt y otras formas asociadas a mutaciones en el gen ABCA4, compatibles con una

herencia autosómica recesiva:

P

0: Algoritmo diagnóstico para la STGD, DCB, RPAR y formas asociadas a mutacio

Paacciieennttee AADDNN

A

SSeeccuueenncciiaacciióónn aauuttoommááttiiccaa::NNDDPP,, RRSS11

CCoonn mmuuttaacciióónn

SSiinn mmuuttaacciióónn

Annáálliissiiss ddee hhaapplloottiippooss

CCoosseeggrreeggaa

NNoo ccoosseeggrreeggaa

IInnffoorrmmee

IInnffoorrmmee FinFin

Búsqueda de otros genes implicados

Búsqueda de otrosIInnffoorrmmee

I

FinFin

Innffoorrmmee

genes implicados

PPaacciieennttee AADDNN

MMiiccrrooaarrrraayy AABBCCRR440000

22 aalleellooss mmuuttaanntteess

SSiinn mmuuttaacciioonneess

AAnnáálliissiiss ddee hhaapplloottiippooss

CCoosseeggrreeggaa

NNoo ccoosseeggrreeggaa

IInnffoorrmmee

IInnffoorrmmee

IInnffoorrmmee

FFiinn

FFiinn

BBúússqquueeddaa ddee oottrroossggeenneess iimmpplliiccaaddooss

CCoonnffiirrmmaacciióónn:: sseeccuueenncciiaacciióónn aauuttoommááttiiccaa

11 aalleelloo mmuuttaanntteeCCrriibbaaddoo mmuuttaacciioonnaall 5500 eexxoonneess AABBCCAA44

CCoonn mmuuttaacciióónn IInnffoorrmmee FFiinnddHHPPLLCC

SSiinn mmuuttaacciióónn IInnffoorrmmee

155

157

VI- Conclusiones

VI- Conclusiones

158

VI- CONCLUSIONES

1- En el gen NDP, se ha observado que las mutaciones más agresivas (asociadas a proteína truncada)

producen un fenotipo más severo (ND), con afectación oftalmológica, auditiva y retraso mental.

2- En el gen RS1, las mutaciones identificadas en nuestras familias, así como las alteraciones descritas en

pacientes procedentes de otras poblaciones, indican que existe una tasa considerable de mutaciones “de

novo”, debida en parte a la elevada prevalencia de dinucleótidos CG en su secuencia.

Esta situación se asocia a una ausencia de efecto fundador y origen múltiple de la XLRS.

3- La identificación de la mutación responsable en varones con XLRS confirma el diagnóstico clínico y

facilita un asesoramiento genético adecuado para los familiares, pero no permite predecir la evolución

(prognosis) del paciente.

4- La detección de alelos mutantes en ABCA4, utilizando como método previo de cribado el microarray

ABCR400, sólo puede ser implementada mediante un método posterior de análisis mutacional

(secuenciación+dHPLC) y a través de una caracterización clínica precisa en pacientes con STGD. En el

fenotipo DCB, la baja tasa de detección de mutaciones puede deberse a la existencia de otros genes

responsables (heterogeneidad genética).

5- En aquellos pacientes en los que los haplotipos cosegregan con la patología y se ha identificado un alelo

mutante en ABCA4 o no se han detectado mutaciones, la utilización de un método de cribado adicional al

microarray de genotipado (secuenciación o dHPLC) aumenta la tasa de detección (6/10 familias).

6- La implicación de ABCA4 en la STGD y en DCB es patente. No obstante, su etiopatogenia en los otros

fenotipos (RPAR y ADDM) no es tan evidente y la presencia de mutaciones puede deberse a una

asociación fortuita.

7- Los grandes reordenamientos genómicos únicamente representan una pequeña fracción de todos los

alelos mutantes asociados a ABCA4.

8- Algunos alelos mutantes de ABCA4 se asocian de forma clara a un fenotipo retiniano:

- p.Arg1129Leu a STGD de inicio tardío

- c.2888delG a DCB.

9- En este tipo de retinopatías tan heterogéneas (genética, alélica y clínicamente), se debe tener en cuenta

que los distintos fenotipos exhibidos en una misma familia pueden deberse:

- a la variación fenotípica por un alelo mutante

- o a la coexistencia de diferentes genes implicados, que pueden ser conocidos o no.

VI- Conclusiones

159

10- La mutación p.Arg1129Leu es la más prevalente en población española. Pese al número limitado de

cromosomas estudiados, su elevada prevalencia entre los alelos asociados a STGD y la similitud de los

haplotipos pueden sugerir un origen ancestral común.

11- La prevalencia de alelos mutantes en ABCA4 en población general española, analizada mediante la

medida de la frecuencia del alelo p.Arg1129Leu en población control, se podría estimar en el 7´87%. Si

bien, estos datos deberían ser confirmados con un estudio más exhaustivo mediante el microarray de

genotipado en un número elevado de sujetos control.

Biblioteca Barroca (Klementinum), Praga. K.I. Dienzenhoffer, principios del siglo XVIII.

VII- Bibliografía

160

VII- Bibliografía

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MA.



VIII- Bases de datos

174

VIII- Bases de datos

175

VIII- BASES DE DATOS

Las bases de datos de Internet utilizadas han sido las siguientes:

- Retinal Information Network: www.sph.uth.tmc.edu/Retnet

- Retina International: www.retina-international.org

- The GDB Human Genome Database: www.gdb.org

- The Human Genome Mutation Database: www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php

- The National Center for Biotechnology Information: www.ncbi.nih.gov

Además de las bases de datos anteriores, se han consultado las siguientes páginas Web:

- Asper Biotech: www.asperbio.com

- Eye Design Book by Curt Deckert, PhD: www.eyedesignbook.com

- Retinosis Pigmentaria: www.retinosis.org

- The World Medical Association: www.wma.net

- German Resource Center for Genome Research: www.rzpd.de

http://www.sph.uth.tmc.edu/Retnet/

http://www.sph.uth.tmc.edu/Retnet

http://www.gdb.org/

http://www.ncbi.nih.gov/

http://www.asperbio.com/

http://www.asperbio./

http://eyedesignbook.com/

http://www.eyedesignbook.com/

http://www.retinosis/

http://www.wma.net/

http://www.wma.net/

176

IX‐ Publicaciones

IX- Publicaciones

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IX- PUBLICACIONES

A) Enfermedad de Norrie / Vitreorretinopatía exudativa

· Genotype-phenotype variations in five Spanish families with Norrie disease or X-linked FEVR. R.Riveiro-Alvarez, M.J. Trujillo-Tiebas, A.Gimenez-Pardo, M.Garcia-Hoyos, D.Cantalapiedra, I.Lorda-

Sanchez, M.Rodriguez de Alba, C.Ramos, C.Ayuso.

Molecular Vision 2005: 11: 705-12.

· Submission of Mutation Data. NDP. Human Genetics (2005) 118, 534. Temporary accession number:

M20051121/14.00.56. R Riveiro-Alvarez, Trujillo MJ, Gimenez A, Cantalapiedra D, Vallespin E, Villaverde C,

Ayuso C.

B) Retinosquisis juvenil ligada al cromosoma X

· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 534. Accession number: Hi0503. R

Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo-Tiebas, A Gimenez, M Garcia-Hoyos, D Cantalapiedra, E Vallespin, A Queipo, C

Ramos, C Ayuso.

· Submission of Mutation Data. RS1. Human Genetics (2005) 118, 535. Accession number: Hm0512b. R


Ramos, C Ayuso.



Ramos, C Ayuso.



Ramos, C Ayuso.



Ramos, C Ayuso.

IX- Publicaciones

178

C) Enfermedad de Stargardt

· Microarray-based mutation analysis of the ABCA4 gene in Spanish patients with Stargardt disease: evidence of a prevalent mutated allele. Valverde D, Riveiro-Alvarez R, Bernal S, Jaakson K, Baiget M, Navarro R, Ayuso C.

Revista: Molecular Vision (en prensa).

· Spectrum of the ABCA4 gene mutations implicated in severe retinopathies from Spanish patients. D Valverde, R Riveiro-Alvarez, M Baiget, M Carballo, G Antiñolo, JM Millan, B Garcia-Sandoval, C Ayuso.

Revista: IOVS (en prensa).

- Partial paternal uniparental disomy (UPD) of chromosome 1 in a patient with Stargardt disease. R Riveiro-Alvarez, D Valverde, I Lorda-Sanchez, MJ Trujillo-Tiebas, D Cantalapiedra, E Vallespin, J Aguirre-

Lamban, C Ramos, C Ayuso.

Revista: Molecular Vision (en prensa).

· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number:

Hm0536. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.


Hm0537. R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.


Hm0538. R Riveiro-Alvarez, J Aguirre, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C

Ayuso.

· Submission of Mutation Data. ABCA4. Human Genetics (2006) 118, 774-785. Accession number: Hs0512.

R Riveiro-Alvarez, MJ Trujillo, D Cantalapiedra, E Vallespin, C Villaverde, D Valverde, C Ayuso.

y molecular de distrofias de - uam

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