xilanases de leveduras e fungos leveduriformes e sua ... · tese (doutorado) - universidade federal...
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Universidade Federal de Minas Gerais
Escola de Farmácia
Departamento de Alimentos
CARLA ALVES LARA
Xilanases de leveduras e fungos leveduriformes e sua
aplicação em processos de produção de bioetanol
lignocelulósico e panificação
Belo Horizonte
2013
CARLA ALVES LARA
Xilanases de leveduras e fungos leveduriformes e sua
aplicação em processos de produção de bioetanol
lignocelulósico e panificação
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de Farmácia
da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial
à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos.
Área de concentração: Ciências de Alimentos
Orientadora: Prof(a). Dra. Evelyn de Souza Oliveira Lopes
Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa – Departamento de Microbiologia,
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais.
Co-orientador: Dr. César Fonseca – Unidade de Bioenergia – Laboratório Nacional
de Energia e Geologia, I. P. (LNEG) – Lisboa, Portugal.
Colaboradora: Dra. Susana Marques – Unidade de Bioenergia – Laboratório
Nacional de Energia e Geologia, I. P. (LNEG) – Lisboa, Portugal.
Belo Horizonte
2013
Lara, Carla Alves.
L318x
Xilanases de leveduras e fungos leveduriformes e sua aplicação em processos de produção de bioetanol lignocelulósico e panificação./ Carla Alves Lara. – 2013.
154 f.: il.
Orientadora: Evelyn de Souza Oliveira Lopes Coorientador: Carlos Augusto Rosa Coorientador: César Simões da Fonseca Colaboradora: Susana Marques Tese (doutorado) - Universidade Federal de Minas
Gerais, Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos.
1. Leveduras (fungos) – Teses. 2. Leveduras
xilanolíticas – Teses. 3. Hidrólise de xilana – Teses. 4. Biotecnologia microbiana – Teses. 5. Aplicações biotecnológicas de xilanases – Teses. 6. Etanol lignocelulósico – Teses. 6. Panificação – Microbiologia – Teses. I. Lopes, Evelyn de Souza Oliveira. II. Rosa, Carlos Augusto. III. Fonseca, César Simões da. IV. Marques, Susana. V. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. VI. Título.
CDD: 660.62
Aos meus queridos pais, Wilson e Neide e ao meu irmão Sandro.
“Não viva sua pesquisa, faça sua pesquisa”.
Waldo Vieira
AGRADECIMENTOS
O universo conspirou a meu favor e colocou no meu caminho pessoas maravilhosas que
hoje só tenho a agradecer.
Essa tese resultou de um esforço conjunto de pessoas muito queridas, não incluindo apenas
àquelas que contribuíram de forma direta, mas de todos que estiveram comigo nessa
caminhada.
Em primeiro lugar queria agradecer à Prof.(a) Dra. Evelyn de Sousa Oliveira Lopes, uma
pessoa que gosto muito, por ter aceitado ser minha orientadora e ter me dado a
oportunidade de iniciar este projeto. Obrigada pelo apoio incondicional durante todo o
percurso deste trabalho, pela sua amizade, pela orientação e por estar sempre comigo.
Quero prestar meus sinceros agradecimentos ao meu co-orientador, o Prof. Dr.Carlos Rosa,
que confiou em mim para realização deste trabalho. Obrigada pelas orientações, correções,
incentivos e também pela pressão que muitas vezes foi positiva. Agradeço também pela
compreensão nos momentos difíceis que passei. Obrigada pela magnífica oportunidade de
realizar um estágio fora do país, pela confiança creditada a mim, afinal, estava a representar
seu nome em outra instituição. E por fim, fico muito honrada por ter trabalhado com um
profissional que admiro muito.
Ao Dr.César Fonseca, co-orientador, uma pessoa excepcional, eu só tenho a agradecer:
pela receptividade em Portugal, pela atenção, pelos ensinamentos, orientações e
discussões científicas durante o planejamento, realização e análise das experiências.
Obrigada pela ajuda na escrita da tese e pelas ótimas correções. Agradeço pela presença
no laboratório no meio da semana e no final de semana quando precisava. Obrigada pelo
acompanhamento em cada experiência feita in locu, pela disponibilidade de me levar em
outra Universidade e ainda acompanhar o andamento das experiências. Obrigado por me
ajudar a superar todas as dificuldades tanto de ordem prática, quanto teórica, sempre me
incentivando a aprender. Obrigada pelo cuidado dentro e fora do LNEG, até no hospital foste
e ainda discutimos os últimos ajustes de uma apresentação para “Jornadas de Biologia de
Leveduras”, onde me representou. Eu aprendi muito com você todo esse tempo.
À minha colaboradora, Dra. Susana Marques, pelos ensinamentos, pelas orientações, pela
dedicação e disponibilidade em me responder a qualquer dúvida teórica ou prática.
Obrigada pelo acompanhamento e pelas discussões das experiências realizadas e também
pelas correções e ajuda na escrita da tese. Pelo cuidado dentro e fora do LNEG, pela visita
no laboratório durante a noite para saber se estava tudo bem. Obrigada pelo cuidado e
preocupação quando estive hospitalizada. Enfim, muitíssimo obrigada pela orientação
científica durante o trabalho e pela sua amizade.
Ao coordenador Prof. Dr. Roberto Junqueira do curso de Pós-Graduação de Ciências de
Alimentos pelo incentivo e pelo apoio e aos professores do PPGCA, em especial ao Prof. Dr.
Afonso Liguori, pela disponibilidade no empréstimo de equipamento e auxílio na análise de
textura de pães.
À Professora Iza, obrigada pelo incentivo e pelas palavras de confiança para que eu
chegasse até aqui, tenho muito respeito e admiração por você, professora.
Às secretárias Úrsula e Marilene pela disponibilidade em me ajudar a resolver questões
burocráticas.
À Luciana Rodrigues Faleiro, minha amiga de infância, obrigada pelo apoio incondicional,
pela sensatez e sabedoria em me ajudar a fazer escolhas assertivas nos momentos difíceis.
Às minhas grandes e velhas amigas, que sempre estão comigo, me apoiando e me
incentivando a buscar novos horizontes e a ser feliz: Andrea Carrara, Aline Selva, Anna
Luíza, Eliane Lara, Elisângela Lara, Magda, Maria Lúcia, Shirlene e Zayran.
À Raquel Cadete, que me ajudou a entender um pouco mais de leveduras... E agradeço
pela força, pelas palavras de carinho nos momentos difíceis, sem ela não teria chegado a
Portugal, inteira e confiante. Obrigada também pela convivência e pela amizade.
Aos amigos de laboratório no Brasil, obrigada pela boa convivência, amizade e pelas
gentilezas: Ana Diolinda, Beatriz, Camila Gontijo, Cosme, Denise Sande, Flávia Gonçalves,
Elaine, Letícia, Luciana Brandão, Renata e Michele.
Obrigada aos meus novos amigos “Turma do Rock” de Piracema pelos momentos bons que
vivi esse ano com vocês.
Ao Eder Neto pelas palavras de incentivo, pelo carinho e disponibilidade de me ouvir.
À minha estagiária, voluntária, Paula Lima, obrigada pela ajuda no laboratório.
Às pessoas incríveis e muito queridas do LNEG eu só tenho a agradecer: a Amélia, Lina,
Margarida, Ana Pestana, Susana Alves, Cláudia Freitas agradeço pela disponibilidade em
qualquer contribuição, e aos meus queridos amigos que nunca esquecerei, agradeço pela
convivência: Alexandra, Thiago, Pedro, Carol, Patrícia Branco, Luca, Raphaela e Francisco.
E em especial: a Carla Ferreira, muitíssimo obrigado pela sua amizade, pelo cuidado e
carinho de sua família, pela companhia no laboratório e por me ajudar a realizar muitos
experimentos; ao Nuno Faria, agradeço pela amizade sincera, pela assessoria dada sempre
quando precisava de ajuda tanto no âmbito laboratorial e quanto ao que diz respeito a
carros. Você é um amigo de muito bom astral, que sempre me dizia palavras reconfortantes
nos momentos difíceis; e a Talita Fernandes por me receber em sua casa sempre com muito
carinho e alegria. Agradeço pela amizade e convivência no laboratório.
Quero agradecer muitíssimo à Carla Jorge e ao Nuno do ITQB – Universidade Nova de
Lisboa – pela ajuda na realização da purificação de meu extrato enzimático. Obrigada por
me receberem tão bem em vosso laboratório.
E à minha família mais que querida: a querida vó Nenê, a minha Tia Maria, a minha prima
Cleusa e amiga Rosângela por estarem comigo nos momentos difíceis e pela força que me
deram, muito obrigada. E a todos os meus queridos primos, primas, tios e tias.
Ao meu pai e meu irmão pelo amor, carinho, paciência, compreensão, generosidade e
reconhecimento, obrigado por me aturarem todo esse tempo eu amo muito vocês meus
queridos.
Obrigada a minha mãe, por estar aqui hoje me aplaudindo, obrigada pelo seu amor
incondicional, sua amizade, suas palavras de incentivo. Pelo seu exemplo de coragem e
força para superar os momentos difíceis. Eu amo muito você, minha mãe querida.
Obrigada a empresa Vilma pela oportunidade de realização dos experimentos de
panificação, agradeço ao em especial ao Sergio, Anne, Ronaldo, Geraldo e Ricardo.
À empresa Novozymes, Granotec, Curitiba, Brasil.
À Capes, pelo apoio financeiro e pela bolsa PDEE (Doutorado sanduíche em Lisboa).
Ao Projeto UE-Brasil ProEthanol2G - “Integration of Biology and Engineering into an
Economical and Energy-Efficient 2G Bioethanol Biorefinery” financiado na Europa pela
Comissão Europeia (FP7-251151) e no Brasil pelo CNPq (processo nº 551392/2010-0,
551245/2010-7 e 560715/2010-2).
Ao Laboratório Nacional de Energia e Geologia, I.P. (LNEG), Portugal, na pessoa do Dr.
Francisco Gírio, Coordenador da Unidade de Bioenergia.
i
RESUMO A exploração da diversidade microbiana permite a descoberta de novas fontes de enzimas
com potencial aplicação na indústria biotecnológica. O objetivo deste trabalho foi selecionar
e caracterizar enzimas xilanolíticas produzidas por leveduras e fungos leveduriformes e
avaliar sua aplicabilidade em alguns processos biotecnológicos.
Na primeira parte deste estudo, isolados de leveduras associadas à madeira e ao bagaço de
cana-de-açúcar em decomposição foram investigados quanto a sua capacidade de produzir
enzimas xilanolíticas. Vinte e um isolados de leveduras, que apresentaram atividade de
xilanase em meio sólido contendo xilana Beechwood, foram cultivados em meio líquido, e os
cinco isolados que apresentaram maior atividade xilanolítica foram caracterizados quanto à
atividade de xilanase e β-xilosidase em dois substratos indutores: xilana e D-xilose. A xilana
foi o melhor indutor de atividade de xilanase (medida a 50°C) em Cryptococcus laurentii
UFMG-HB-48, Scheffersomyces shehatae UFMG-HM-9.1a e Sugyiamaella smithiae UFMG-
HM-80.1 (1,16, 0,69 e 0,50 U mL-1, respectivamente). A maior atividade específica (11,05 U
mg-1) foi obtida pelo Cr. laurentii UFMG-HB-48 a 50°C usando xilana como indutor. A maior
atividade extracelular de β-xilosidase foi encontrada, com indução por xilana, em Su.
smithiae UFMG-HM-80.1 (0.76 U mL-1). Com indução por xilose, a maior atividade
intracelular de β-xilosidase foi detectada em Cr. laurentii UFMG-HB-48 a 50°C e, quando
medida a 30°C, a maior atividade intracelular de β-xilosidase foi encontrada em Candida
tropicalis UFMG-HB-93a. Este estudo identificou um conjunto de leveduras com capacidade
de hidrolisar a xilana, revelando as estratégias metabólicas para a assimilação dos seus
produtos de degradação (xilo-oligossacarídeos e xilose).
Neste trabalho, o fungo leveduriforme Aureobasidium pullulans foi usado como referência
para os ensaios enzimáticos, por ser conhecido como uma fonte de enzimas xilanolíticas
com alta atividade específica. Verificou-se que a linhagem A. pullulans UFMG-Bro-53
caracteriza-se por apresentar uma maior atividade volumétrica a 30°C semelhante à obtida a
50ºC (21,7 U mL-1) e cerca de três vezes superior à obtida a 30ºC em A. pullulans Y-2311,
uma linhagem bem caracterizada na literatura. As atividades de xilanases obtidas com A.
pullulans UFMG-Bro-53 foram significativamente superiores às obtidas com as leveduras
identificadas neste trabalho. Quando induzido por xilana, o extrato extracelular do A.
pullulans UFMG-Bro-53 apresentou atividade xilanase máxima a uma temperatura de 40°C
e pH na faixa 4,0-5,0. A fração mais abundante do extrato possui massa molecular aparente
de 22 kDa. Entre frações purificadas com atividade de xilanase, esta apresenta uma
atividade ótima a uma temperatura de 40°C e a pH 4,0-5,0. O extrato extracelular de A.
pullulans UFMG-Bro-53 apresentou especificidade xilanolítica, sem demonstrar atividade
ii
celulase ou protease. Por isso, este extrato foi aplicado em processos biotecnológicos, como
a hidrólise de hemicelulose (xilana) em material lignocelulósico e em processos de
panificação.
O extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 foi avaliado na hidrólise de xilana e de
palha de trigo pré-tratada hidrotermicamente, e na atuação em sacarificação e fermentação
simultânea (SSF) na produção de etanol lignocelulósico. O extrato mostrou ser mais
eficiente na hidrólise de xilana e palha de trigo por comparação com a hemicelulase
comercial HTec2, gerando concentrações de D-xilose que chegaram a cinco vezes
superiores com palha de trigo a 10% (p/v) de conteúdo em sólidos. Quando usado na
suplementação da celulase comercial CTec2 atingiu um rendimento de hidrólise enzimática
mais elevado do que CTec2 sem suplementação. Nos experimentos de SSF, a 35ºC,
usando xilana Beechwood como substrato e a levedura fermentadora de xilose Spathaspora
passalidarum UFMG-HMD1.1, o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 atuou eficientemente na
degradação de xilana à xilose com um rendimento maior (estimado em 66%) em relação à
hidrólise realizada separadamente (apenas 16%) atingindo uma concentração de etanol de
6,6 g L-1, correspondente a um rendimento de 0,2 g g-1. Quando comparado com uma
levedura Saccharomyces cerevisiae comercial (Ethanol Red), capaz de fermentar apenas a
fração de hexoses, a levedura S. passalidarum UFMG-HMD1.1, fermentadora de hexoses e
pentoses, promoveu uma melhoria no rendimento de conversão da palha de trigo a etanol
com a suplementação com o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53, uma vez que as xilanases
do extrato disponibilizaram mais xilose que, por sua vez, pôde ser fermentada por S.
passalidarum.
A utilização das enzimas xilanolíticas presentes no extrato extracelular do A. pullulans
UFMG-Bro-53 foi ainda analisada em processo de panificação. Na dose de 120 U (xilanase)
kg-1 de farinha de uma mistura de panificação para a produção de pão de forma, conduziu a
um aumento no volume e uma redução da firmeza do miolo, em relação ao controle
negativo, sem adição de enzimas, mas atingindo valores semelhantes aos obtidos com a
xilanase comercial Spring Mono, uma glicosil hidrolase da família GH11. No entanto, para
doses superiores a 120 U kg-1 de farinha, o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 parece ter um
efeito negativo nas propriedades do pão, o que parece estar associado ao fato do extrato
conter xilanases da família GH10, que não possui eficiência na panificação, quando
comparado com outras contidas no extrato como as da família GH11.
Palavras-chave: leveduras xilanolíticas, Aureobasidium pullulans, xilanases, hidrólise de
xilana, aplicações biotecnológicas de xilanases, etanol lignocelulósico, panificação.
iii
ABSTRACT
The exploration of microbial diversity enables the discovery of new sources of enzymes with
potential application in the biotechnology industry. The aim of this work was to select and
characterize xylanolytic enzymes - produced by yeasts - and evaluate their applicability in
biotechnological processes.
In the first part of this study, yeast isolates associated to rotting wood and sugarcane
bagasse were investigated for their ability to produce xylanolytic enzymes. Twenty-one yeast
isolates showing xylanolytic activity on solid medium containing Beechwood xylan were
grown in liquid medium, and the five isolates presenting the highest xylanolytic activity were
characterized regarding the xylanase and β-xylosidase activities using two inducing
substrates: xylan and D -xylose. Xylan was the best inducer of xylanase activity (measured
at 50°C) in Cryptococcus laurentii UFMG-HB-48, Scheffersomyces shehatae UFMG-HM-
9.1a and Sugyiamaella smithiae UFMG-HM-80.1 (1.16, 0.69 and 0.50 U mL-1, respectively).
The highest specific activity (11.05 U mg-1) was obtained by Cr. laurentii UFMG-HB-48 at
50°C using xylan as inducer. The highest level of extracellular β-xylosidase activity found
was induced by xylan in Su. smithiae UFMG-HM-80.1 (0.76 U mL-1). Upon induction of D-
xylose, the highest level of intracellular β-xylosidase activity was detected by Cr. laurentii
UFMG-HB-48 at 50°C, and, when measured at 30°C, the highest intracellular β-xylosidase
activity was found by Candida tropicalis UFMG-HB-93a. This study identified a set of yeasts
with xylan-hydrolyzing capacity, revealing the metabolic strategies for the assimilation of their
degradation products (xylo- oligosaccharides and xylose).
In this work, the yeast-like fungus Aureobasidium pullulans, known as a source of xylanolytic
enzymes with high specific activity, has been used as a reference for the enzymatic assays.
It was found that the strain A. pullulans UFMG-Bro-53 showed higher volumetric activity at
30°C, similar to that obtained at 50°C (21.7 U mL-1) and three times greater than the activity
obtained at 30°C by A. pullulans Y-2311, a strain well characterized in the literature. The
xylanolytic activities obtained with A. pullulans UFMG-Bro-53 were significantly higher than
those obtained with the yeasts previously identified in this work. Therefore, this strain (A.
pullulans UFMG-Bro-53) was further studied, particularly in the characterization of its
xylanolytic potential. When induced by xylan, the extracellular extract of this strain showed a
maximum xylanase activity at 40°C and pH 4.0-5.0. The most abundant fraction of the extract
has an apparent molecular mass of 22kDa. Among the purified fractions showing xylanase
activity, this fraction shows an optimal activity at 40°C and pH 4.0-5.0. The extracellular
extract of A. pullulans UFMG-Bro-53 showed xylanolytic specificity without cellulase or
iv
protease activities. Thus, this extract has been used in biotechnological processes, as in the
hydrolysis of hemicellulose (xylan) in lignocellulosic materials and baking processes.
The extracellular extract of A. pullulans UFMG-Bro-53 was evaluated in the hydrolysis of
xylan and pretreated wheat straw and in simultaneous saccharification and fermentation
(SSF) for the production of lignocellulosic ethanol. The extract was more efficient in the
hydrolysis of xylan and wheat straw when compared to the commercial hemicellulase HTec2,
generating D-xylose yields five times higher with wheat straw at 10% solids content. When
used in supplementation of the commercial cellulase CTec2, it reached a higher enzymatic
hydrolysis yield than when using CTec2 without supplementation. In SSF experiments, at
35°C, using Beechwood xylan as substrate and yeast strain S. passalidarum UFMG-HMD-
1.1, XBro extract acted efficiently in the degradation of xylan to xylose with a higher yield
(estimated at 66%) compared to the hydrolysis performed separately (16%), reaching an
ethanol concentration of 6.6 g L-1,corresponding to 0.2 g g-1 ethanol yield. When compared
with the commercial hexose-fermenting yeast Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red),
Spathaspora passalidarum UFMG-HMD-1.1, a hexose and pentose-fermenting yeast,
promoted an improvement in the conversion yield of wheat straw into ethanol when
supplemented with the XBro extract, once the xylanases present in the extract provided more
xylose, which, in turn, could be fermented by S. passalidarum.
The use of xylanolytic enzymes present in the extracellular extract of A. pullulans UFMG -Bro
-53 was further analyzed in a baking process. In a dosage of 120 U (xylanase) kg-1 of flour of
a baking mixture for bun production, it led to an increase in volume and a reduction in crumb
firmness of bread, when compared to the negative control, i.e. without addition of enzymes,
but reaching similar values to those obtained with the commercial xylanase Spring Mono, a
glycoside hydrolase from family GH11. However, at dosages higher than 120 U kg-1 of flour,
the extract appears to have a negative effect in bread properties, which seems to be
associated with the fact that this extract contains family GH10 xylanases, in addition to family
GH11 xylanases.
Key words: xylanolytic yeasts, Aureobasidium pullulans, xylanases, xylan hydrolysis,
xylanase biotechnological applications, lignocellulosic ethanol, baking.
v
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................................ ix
INTRODUÇÃO............................................................................................................................... 1
REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................................... 3
1 BIOMASSA E MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS.................................................................... 3
1.1 Celulose................................................................................................................................... 4
1.2 Lignina ..................................................................................................................................... 5
1.3 Hemicelulose............................................................................................................................ 6
2 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA............................................. 10
2.1Celulases................................................................................................................................... 10
2.2 Hemicelulases.......................................................................................................................... 11
2.2.1 Endo-1,4-β-xilanases............................................................................................................ 12
2.2.2 β-1,4-D-xilosidases............................................................................................................... 13
2.2.3 Enzimas ligninolíticas........................................................................................................... 16
3 LEVEDURAS PRODUTORAS DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS................................................. 17
4 APLICAÇÕES DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS........................................................................... 19
4.1 Aplicação de enzimas xilanolíticas na produção de bioetanol de segunda geração (2G)....... 20
4.1.2 Produção do bioetanol de segunda geração (2G)................................................................ 21
4.2 Aplicação de enzimas xilanolíticas na panificação................................................................... 29
APRESENTAÇÃO.......................................................................................................................... 33
CAPÍTULO I
Identification and characterisation of xylanolytic yeasts isolated from decaying wood and
sugarcane bagasse in Brazil……………………………………………………………………………..
35
Abstract.......................................................................................................................................... 36
Introduction..................................................................................................................................... 37
Material and Methods..................................................................................................................... 39
Yeast isolation................................................................................................................................ 39
Preliminary plate screening of the xylanase- producing strains……………………………………... 40
vi
Yeast identification......................................................................................................................... 41
Selection of the Best xylanolytic strains………………………………………………………………... 41
Cultivations in xylan and xylose and determination of specific growth rates.................................. 42
Production and characterization of xylanolytic enzymes................................................................ 42
Enzymatic activities........................................................................................................................ 43
Protein assay.................................................................................................................................. 43
Results and discussion................................................................................................................... 44
Isolation and identification of xylanase-producing yeasts……………………………………………. 44
Selection and quantitative characterisation of xylanolitic activities………………………………….. 46
References..................................................................................................................................... 52
Capítulo II
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATO EXTRACELULAR DE Aureobasidium
pullulans UFMG-Bro-53: ATIVIDADE XILANOLÍTICA COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
63
Resumo.......................................................................................................................................... 63
1INTRODUÇÃO............................................................................................................................. 64
2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................................ 65
2.1Micro-organismos e manutenção de culturas........................................................................... 65
2.2 Produção de extratos extracelulares com atividade xilanolítica.............................................. 65
2.3 Ensaios enzimáticos e quantificação de proteína.................................................................... 66
2.4 Fracionamento de extrato extracelular com base em atividades xilanolíticas......................... 67
2.5 Efeito da temperatura e pH e estabilidade das enzimas xilanolíticas ................................... 67
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................................. 68
3.1Produção de enzimas xilanolíticas extracelulares por Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53...................................................................................................................................................
68
3.2Caracterização das enzimas xilanolíticas do extrato extracelular de Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53.................................................................................................................................
69
3.3Fracionamento do extrato extracelular de Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53................. 73
Capítulo III APLICAÇÃO DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS DE Aureobasidium pullulans UFMG-Bro 53 NA HIDRÓLISE DE XILANA E MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS E FERMENTAÇÃO DA Spathaspora passalidarum UFMG-HMD1.1 PARA A PRODUÇÃO DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO...............................................................................................................
78
Resumo.......................................................................................................................................... 78
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................................ 80
vii
2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................................ 82
2.1 Hidrólise enzimática................................................................................................................. 82
2.1.1 Matéria prima........................................................................................................................ 82
2.1.2 Enzimas................................................................................................................................. 82
2.2 Experimentos de hidrólise enzimática...................................................................................... 83
2.3 Produção de bioetanol de segunda geração........................................................................... 85
2.3.1Micro-organismos e meio de cultivo usado na fermentação.................................................. 85
2.3.2 Enzimas utilizadas na hidrólise enzimática no processo de produção de etanol ................. 86
2.3.3 Experimentos de SSF a partir de xilana e palha de trigo com extrato xilanolítico
extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53..................................................................................
86
2.3.4 Parâmetros fermentativos..................................................................................................... 86
2.3.5 Métodos analíticos................................................................................................................ 88
2.3.6 Análise estatística................................................................................................................. 88
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................................. 88
3.1 Hidrólise enzimática de xilana em xilana comercial e palha de trigo com extrato xilanolítico extracelular de Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53...............................................................
88
3.2 Suplementação de celulases com o extrato xilanolítico extracelular de Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53 e efeito na hidrólise enzimática de palha de trigo...................................
91
3.3 Produção de etanol por SSF a partir de xilana e palha de trigo com extrato xilanolítico extracelular de Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53................................................................
92
3.3.1 Produção de etanol hemicelulósico a partir de xilana por SSF............................................. 93
3.3.2 Produção de etanol celulósico a partir de palha de trigo pré-tratada por SSF com celulase suplementada com extrato xilanolítico XBro..................................................................................
95
3.3.3 Produção de etanol lignocelulósico a partir de palha de trigo pré-tratada por SSCF celulase suplementada com XBro e com levedura Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1.................
96
Capítulo IV
INFLUÊNCIA DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS DE Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53 EM
PROCESSO DE PANIFICAÇÃO.................................................................................................
99
RESUMO........................................................................................................................................ 99
ABSTRACT.................................................................................................................................... 96
1INTRODUÇÃO............................................................................................................................. 100
2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................................ 101
2.1 Matéria prima........................................................................................................................... 101
viii
2.1.1 Ingredientes........................................................................................................................... 101
2.1.2 Enzimas................................................................................................................................ 101
2.2 Produção de pão de forma e avalição da qualidade............................................................... 102
2.2.1 Atividade enzimática.......................................................................................................... 103
2.2.2 Análise estatística.............................................................................................................. 103
RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................................... 104
CONCLUSÕES.............................................................................................................................. 108
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................. 111
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac - acetil
Araf - L-arabinofuranose
ART - açúcares redutores totais
ASEAN - Associação dos países do sudoeste da Ásia
BCA - Ácido Bicinconínico
CAZy - Carbohydrate-Active enzymes
CBP - bioprocesso consolidado
DNS - ácido dinitrossalicílico
DTU - Technical University of Dynamark
DO - densidade óptica
EUA - Estados Unidos da América
Galp - galactopiranose
Glcp - D-glucopiranose
GlcpUA - D-glucuronopiranose
GH - glicosil hidrolases
GP - Grau de polimerização
ICB - Instituto de Ciências Biológicas
LNEG - Laboratório Nacional de Energia e Geologia
kDa - kilodalton
Manp - D-manopiranose
NADH - Nicotinamida Adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
NAD+ - Nicotinamida Adenina dinucleotídeo
OMe - o-metil
pH - potencial hidrogeniônico
pI - ponto isoelétrico
SHF - sacarificação e fermentação separada
SSCF - sacarificação e cofermentação simultânea
SSF - sacarificação e fermentação simultânea
TCA - ácido tricloroacético
U - unidade internacional para atividade de enzima
UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais
XDH - xilitol desidrogenase
XOS - xilo-oligossacarídeos
x
XR - xilose redutase
Xyl - xilose
Xylp - D-xilopiranose
WEAX - arabinoxilano extraível em água
WUAX - arabinoxilana não extraível em água
YNB - Yeast Nitrogen Base
xi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Enzimas hidrolíticas do tipo endoxilanase, principais famílias glicosil hidrolase (GH) e micro-organismos produtores.
15
TABELA 2- Enzimas hidrolíticas do tipo β-xilosidase, principais famílias glicosil hidrolase (GH) e micro-organismos produtores.
16
TABELA 3- Leveduras produtoras de enzimas xilanolíticas 19
Capítulo I
Table 1 - Identification and occurrence of positive xylanase -producing yeast species
screened in solid medium in relation to the sampled substrate.
56
Table 2 – Specific growth rates of yeasts cultivated in xylan (1%) or xylose (3%) as
sole carbon and energy source, at 30ºC.
56
Table 3 – Yeast extracellular xylanase volumetric and specific activities (at 30 and
50ºC) after incubation at 30°C, for 72 h, using xylose or xylan as inducer.
57
Capítulo II
TABELA 1 – Atividade xilanolítica a 30°C e 50°C de cada componente de proteína
individual do extrato extracellular do A. pullulans UFMG-Bro-53.
74
Capítulo III
TABELA 1 – Caracterização da palha de trigo pré-tratada 81
TABELA 2. Modelo experimental da hidrólise enzimática 83
TABELA 3 – Produção máxima de etanol (ao fim de 96 horas) por SSF com S.
cerevisiae Ethanol Red, a 35ºC, 150 rpm, em condições de anaerobiose, a partir da
fração de celulose de palha de trigo aplicando Cellic CTec2: sem suplementação,
suplementada com Cellic HTec2 e suplementada com extrato A. pullulans UFMG-
Bro-53 (XBro).
94
TABELA 4 – Produção máxima de etanol (ao fim de 96 horas) por SSCF com Sp.
passalidarum UFMG-HMD-1.1, a 35ºC, 150 rpm, em condições de anaerobiose, a
partir das frações de celulose e hemicelulose de palha de trigo aplicando Cellic
CTec2: sem suplementação, suplementada com Cellic HTec2 e suplementada com
extrato XBro.
95
Capítulo IV
TABELA 1 – Formulação usada para a produção do pão de forma 101
TABELA 2 – Efeito da xilanase comercial Spring Mono e do extrato de xilanases
Bro-53 no volume do pão de forma.
102
xii
TABELA 3 – Efeito da xilanase comercial Spring Mono e do extrato de xilanases
Bro-53 na firmeza do miolo do pão de forma.
104
TABELA 4 – Exemplos de enzimas comerciais comuns usadas em panificação
105
xiii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Ilustração da estrutura da biomassa lignocelulósica e organização dos
seus principais constituintes: celulose, hemicelulose e lignina. Fonte: adaptado de
MENON e RAO, 2012.
4
FIGURA 2 – Representação da cadeia de celulose, e da sua unidade mínima.
Fonte: FENGEL e WEGENER, 1989.
5
FIGURA 3 – Álcoois precursores da biossíntese da lignina. Fonte: adaptado de
SJÖSTRÖM, 1992.
6
FIGURA 4 – Tipos mais comuns de hemicelulose. Abreviações: Ac, acetil, OMe, o-
metil, Araf, L-arabinofuranose, Galp, galactopiranose, Glcp, D-glucopiranose,
GlcpUA, D-glucuronopiranose, Manp, D-manopiranose, Xylp, D- xilopiranose.
Fonte: adaptado de KENNEDY et al., 1987.
7
FIGURA 5 – Estrutura química da xilana. Fonte: ATKINS, 1992. 8
FIGURA 6 – Estrutura da Glucuronoxilana (a) e da Arabinoxilana (b). Enzimas
xilanolíticas envolvidas na degradação da xilana: acetilxilana esterase, α-
glucuronidase, endoxilanase e α-L-arabionofuranosidase. Hidrólise realizada por β-
xilosidase (c). Os números indicam átomos de carbono com grupos substituintes
ligados. Ac. Grupo acetil. Fonte: POLIZELI et al., 2005.
11
FIGURA 7 – Bioprocesso do etanol lignocelulósico. a) Pré-tratamentos da biomassa
lignocelulósica por processos alcalinos. b) Pré-tratamentos hidrotérmicos ou ácidos.
23
FIGURA 8 – Via fúngica do catabolismo de D-xilose e L-arabinose a etanol. Os
números destacados representam as enzimas da via metabólica. 1- aldose/xilose
redutase; 2- L-arabitol 4- desidrogenase; 3- L-xilulose redutase; 4- xilitol
desidrogenase; 5- xilose isomerase; 6- xilocinase; 7- L-arabinose isomerase; 8- L-
ribulocinase; 9- L-ribulose-5-fosfato 4-epimerase; G-3P- gliceraldeído-3-fosfato;
PPP- via da pentose fosfato (adaptado de van MARIS et al., 2006)
28
FIGURA 9 – Conversão da WUAX em WEAX pelas endoxilanases. Fonte: HILLE e
SCHOONEVELD-BERGMANS, (2004).
31
Capítulo I
Figure 1 – Extracellular xylanase volumetric activities determined at 50ºC after
induction by xylan in liquid medium at 30°C for 48 h.
58
Figure 2 – Yeast growth in xylan (1%) medium at 30ºC. Symbols: , C. tropicalis
UFMG-HB 93a; , Cr. diffluens UFMG-HM-88.2; , Cr. laurentii UFMG-HB-48;
, Su. smithiae UFMG-HM-80.1; , Sc. shehatae UFMG-HM-9.1a.
59
xiv
Figure 3 – 1,4--D-Xylosidase total activity (U) and its cellular localisation after
incubation at 30°C, for 72 h using xylan (A) or xylose (B) as an inducer (total of 25
mL medium). Black bars, extracellular activity; Gray bars, membrane-associated
activity; White bars, intracellular activity.
60
Capítulo II
FIGURA 1 – Efeito da temperatura na atividade xilanase em extratos extracelulares
das linhagens de A. pullulans UFMG-Bro-53 e Y-2311, após indução por xilana.
Atividade volumétrica (A) e atividade específica (B). Proteína quantificada pelo
método BCA. As barras de erros representam os desvios-padrão dos respectivos
valores.
67
FIGURA 2 – Perfil de atividade xilanase em diferentes temperatura (A) e pH (B) do
extrato extracelular de A.pullulans UFMG-Bro-53, após 48 h de indução em meio
contendo xilana. A determinação da temperatura foi efetuada a pH 5,5 e a
determinação de pH a 40ºC.
68
FIGURA 3 – Perfil de atividade de β-xilosidase em diferentes temperatura (A) e pH
(B) do extrato extracelular de Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53, após 48 h de
indução em meio contendo xilana. O ensaio de temperatura foi efetuado a pH 5,5 e
o ensaio de pH a 70ºC.
69
FIGURA 4 – Ensaio de estabilidade da atividade xilanase em extrato extracelular de
Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53, por incubação durante 72 horas, a 45ºC,
pH 4.8 (tampão acetato), na ausência (A) ou na presença de substrato (xilana) (B).
70
FIGURA 5 – Ensaio de estabilidade da atividade de β-xilosidase em extrato
extracelular de Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53, por incubação durante 72
horas, a 45ºC, pH 4,8 (tampão acetato).
71
FIGURA 6 – SDS-PAGE (10% poliacrilamida) das frações do extrato extracelular do
A. pullulans UFMG-Bro-53. As proteínas foram coradas com o azul brilhante de
Coomassie R-250. (A) M – padrões de peso moleculares, Extrato, Flow-through
(FT), frações (1 a 6) da coluna Resource Q. (B) Frações (7 a 10, 12 e 14) da coluna
Resource Q. (C) Flow-through (proteína mais abundante – 22 kDa) e frações (7 a
11) da coluna Mono S. As amostras foram padronizadas em relação à quantidade
de proteína (BRADFORD, 1976) (2,5 µg por amostra).
72
FIGURA 7– Perfil de atividade xilanase em diferentes temperatura (A) e pH (B) da
fração pura de massa molar 22 kDa extracelular de Aureobasidium pullulans
UFMG-Bro-53 e do extrato . O perfil de atividade em função da temperatura foi
efetuado a pH 5,5 e o perfil em função do pH a 40ºC. Os perfis do extrato são
representados com linha tracejada para fins comparativos.
75
xv
Capítulo III
FIGURA 1 – Rendimento de xilose e xilobiose a partir da Cellic HTec2 e do extrato
A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro), a 200 U g-1 (xilana), na hidrólise enzimática da
fração de xilana a 50°C, pH 5,5, em xilana comercial 2% (p/v) e palha de trigo pré-
tratada 10% (p/v) em sólidos totais.
87
FIGURA 2 – Eficiência do extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro)
e da hemicelulase comercial Cellic HTec2, a 1000 U g-1 (xilana), na hidrólise de
xilana beechwood 3% (p/v) e de palha de trigo pré-tratada 15% (p/v) em sólidos
totais, a 45°C, pH 4,8. Rendimento de conversão a xilose e xilobiose.
88
FIGURA 3 – Rendimento de hidrólise enzimática da xilana e da celulose de palha
de trigo pré-tratada por suplementação da celulase Cellic CTec2 (CT) com o extrato
extracellular do A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro) ou da hemicelulase comercial
Cellic HTec2 (HT) a 45°C pH 4,8. Rendimento, em xilose (A) e rendimento em
glicose (B).
90
FIGURA 4 – Produção de etanol por Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1 a 35ºC, com
agitação (150 rpm), em condições de anaerobiose. (A) Processo SSF a partir de
xilana beechwood (30 g L-1) usando o extrato extracelular do A. pullulans UFMG-
Bro-53 (XBro); e (B) Fermentação de D-xilose comercial (30 g L-1) suplementada
com o extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro). Concentrações de
D-xilose (-▲-) e etanol (--).
92
FIGURA 5 – Produção de etanol por SSF com S. cerevisiae Ethanol Red, a 35ºC,
150 rpm, em condições de anaerobiose, a partir da fração de celulose de palha de
trigo, aplicando a celulase Cellic CTec2: sem suplementação (-▲-); suplementada
com Cellic HTec2 (--); suplementada com extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 (-■-).
93
FIGURA 6 –Produção de etanol por SSCF com Sp. passalidarum UFMG-HMD-1.1,
a 35ºC, 150 rpm, em condições de anaerobiose, a partir das frações de celulose e
hemicelulose de palha de trigo aplicando a celulase Cellic CTec2: sem
suplementação (-▲-); suplementada com Cellic HTec2 (--); suplementada com
extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro) (-■-).
95
Capítulo IV
FIGURA 1 – Efeito de concentrações diferentes de xilanase comercial Spring Mono
e do extrato de xilanases Bro-53 no volume do pão de forma e percentagem média
(%) de aumento em relação ao controle negativo.
103
1
INTRODUÇÃO
O uso de enzimas na indústria biotecnológica tem crescido ao longo do tempo.
Atualmente, a maioria das enzimas é de origem microbiana. Isto se deve à maior
diversidade de enzimas disponíveis a partir de micro-organismos e também aos custos e
inconveniências de se extrair enzimas de tecidos animais e vegetais. Neste contexto, há um
grande incentivo para a exploração da diversidade microbiana e sua relevância para a
indústria biotecnológica. O reconhecimento que a biodiversidade é a fonte de inovação em
biotecnologia (BULL et al., 1992) levou a exploração e ao isolamento de leveduras
importantes biotecnologicamente de diversos habitats.
A busca de leveduras que possuem capacidade hidrolítica, como as celulases e
hemicelulases (xilanases) são de grande interesse, devido à associação com diversas
aplicações, por exemplo, na indústria de biocombustíveis e de alimentos, como na produção
de bioetanol de segunda geração e no setor de panificação, além de serem usadas na
indústria de polpa e papel.
O aumento do preço do petróleo, a instabilidade política e econômica mundiais e as
crescentes preocupações ambientais têm conduzido a novos desafios em busca por fontes
renováveis de energia, e de alternativas ao uso de petróleo. Esta busca tem mobilizado,
internacionalmente, setores acadêmicos, industriais, sociais e governamentais, com ênfase
no desenvolvimento de processos biotecnológicos, de menor impacto ambiental.
A produção do bioetanol de segunda geração envolve um processo ainda em
desenvolvimento por exigir uma conversão eficiente da biomassa lignocelulósica. Para que
esse processo seja viável economicamente é preciso aumentar o rendimento em açúcares
fermentáveis: hexoses que já são usados na produção do etanol celulósico, e pentoses que
utilizadas na cofermentação de açúcares aumentaria a produtividade de etanol e reduziria o
custo do processo. As xilanases são enzimas hemicelulolíticas que agem na degradação da
hemicelulose, constituinte da biomassa, liberando pentoses, principalmente D-xilose. As
xilanases comerciais disponíveis são principalmente de origem fúngica e possuem atividade
ótima acima de 50°C, temperatura mais alta do que a exigida pela sacarificação e
cofermentação simultânea (SSCF). A importância de encontrar enzimas microbianas que
possuem atividade ótima compatível com a SSCF é que esse fato viabilizaria a produção de
bioetanol de segunda geração.
O etanol é produzido a partir de grãos e cana-de-açúcar (bioetanol de primeira
geração), mas para suprir o aumento da demanda energética, principalmente no setor de
transporte, é de fundamental importância o investimento no bioetanol de segunda geração.
2
A proposta geral deste trabalho foi selecionar leveduras produtoras de enzimas
xilanolíticas e caracterizar seu perfil xilanolítico para aplicação em processos
biotecnológicos, como a produção de bioetanol de segunda geração e em panificação.
3
REVISÃO DE LITERATURA
1. BIOMASSA E MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS
A fixação de dióxido de carbono por organismos autotróficos permite o
armazenamento de carbono na forma orgânica sob a forma de carboidratos, proteínas,
lipídeos e outros constituintes dos seres vivos. Este material biológico é denominado de
biomassa e é considerado como uma potencial fonte de carbono renovável para a produção
de energia e outros produtos (CHERUBINI, 2010; CHUNDAWAT et al., 2011). As principais
fontes de biomassa para aplicação biotecnológica incluem culturas agrícolas, madeira ou
resíduos de madeira e/ou florestais, plantas, herbáceos, resíduos de origem animal,
resíduos de processamento industrial e resíduos municipais (SAHA, 2003a). A lignocelulose
é o principal componente da biomassa, representando cerca de metade de toda a matéria
produzida via fotossíntese e mais que 90% do peso seco das células das plantas (MAGEE e
KOSARIC, 1985; KENNEDY et al., 1987). A biomassa lignocelulósica é constituída pelos
polímeros principais – celulose (40-50%) e hemicelulose (10-40%) e pela lignina (20-30%), e
estes estão fortemente associados por ligações cruzadas do tipo covalente. A celulose está
envolvida por uma matriz de hemicelulose e lignina (SUN e CHENG, 2002; ERICKSSON e
BERMEK, 2009). A lignina e a hemicelulose são encontradas nos espaços entre as
microfibrilas de celulose em uma parte do vegetal que forma a parede celular (lamela média,
parede primária e secundária) (FIG. 1) (ERICKSSON e BERMEK, 2009).
A relativa proporção constituinte dos materiais lignocelulósicos varia com a espécie,
estágio de crescimento e desenvolvimento da planta (ALLISON et al., 1995).
Plantas Gimnospermas, denominadas coníferas, resinosas ou softwood (madeira
suave), geralmente possuem alto conteúdo de lignina em relação às espécies de plantas
Angiospermas, conhecidas como hardwood, plantas folhosas e referidas como plantas com
flor. Por sua vez, o conteúdo de hemicelulose é maior em gramíneas.
4
FIGURA 1 – Ilustração da estrutura da biomassa lignocelulósica e organização dos seus
principais constituintes: celulose, hemicelulose e lignina. Fonte: adaptado de MENON e
RAO, 2012.
1.1 Celulose
A celulose é o polímero orgânico mais abundante do planeta (CHI et al., 2009) sendo
o principal elemento estrutural da parede celular da maioria das plantas. A celulose é um
homopolímero linear de resíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas β-(1,4) (FIG. 2).
Durante a biossíntese, diversas cadeias de celulose são sintetizadas simultaneamente e de
forma ordenada, buscando um arranjo supramolecular que confira maior estabilidade à
molécula e, portanto, menor energia potencial. Este arranjo depende de uma rede de
ligações de hidrogênio, intra e intermoleculares, que são favorecidas pela rotação de 180°
da segunda unidade de glicose em relação à primeira, e assim por diante. Desta forma, a
celobiose é definida como unidade conformacional mínima da celulose, enquanto a glicose
representa a unidade fundamental das cadeias do homopolímero (PRADE, 1996). O
tamanho ou extensão da cadeia de celulose é medido através de seu grau de polimerização
(GP) que representa o número de unidades de anidroglicose que formam cada cadeia
polimérica. O GP varia de acordo com a fonte, o grau de maturação da parede celular, o
processamento sofrido pelas fibras ou envelhecimento, podendo atingir 15000 unidades de
glicose.
5
FIGURA 2 – Representação de parte da cadeia de celulose. Fonte: FENGEL e WEGENER,
1989.
Embora a celulose tenha alta afinidade com a água devido à presença de grupos
hidroxila, ela é completamente insolúvel, e é muito mais resistente à degradação do que
outros polímeros de glicose, como o amido. Os componentes naturais da celulose possuem
estruturas heterogêneas de dois tipos: as altamente ordenadas denominadas de regiões
cristalinas; as menos ordenadas denominadas de regiões amorfas. A fração cristalina da
celulose varia com a fonte e a maneira de como o material é preparado. O grau de
cristalinidade da celulose é uma propriedade relevante, sendo as regiões cristalinas mais
resistentes à hidrólise enzimática (MAGEE e KOSARIC, 1985; NIEHAUS et al., 1999).
1.2 Lignina
A lignina é uma macromolécula tridimensional e amorfa representando de 20 a 30%
do total da lignocelulose (KENNEDY et al., 1987). A lignina é mais hidrofóbica que a
celulose e hemicelulose, e essa macromolécula junto com a hemicelulose preenche os
espaços entre as fibras de celulose, além de atuar como material ligante entre os
componentes da parede celular da madeira dando rigidez e força à estrutura lignocelulósica
(BREEN e SINGLETON, 1999). A lignina possui elevada massa molecular e é
estruturalmente muito diferente de outros componentes da lignocelulose (RAMOS, 2003;
ORTS et al., 2008). É sintetizada a partir de unidades de fenilpropano. Os precursores da
biossíntese da lignina são os alcoóis sinapílico, coniferílico e para-cumarílico (FIG. 3).
6
FIGURA 3 – Álcoois precursores da biossíntese da lignina. Fonte: adaptado de SJÖSTRÖM,
1992.
Os diferentes tipos de acoplamento entre os precursores dão origem a vários tipos
de ligação entre as unidades fenilpropano. As mais abundantes são: -O-4 e α-O-4 (50 a
65%), β-5 (6 a 15%), -1 (9 a 15%), 5-5 (2 a 9%) e - (2 a 5%). Esses vários tipos de
ligações formadas originam uma estrutura tridimensional complexa (KANTELINEN, 1992).
Não é comum o uso da lignina como substrato em fermentação devido a ser resistente a
degradação química e biológica (TAHERZADEH e KARIMI, 2007).
1.3 Hemicelulose
A hemicelulose pertence a uma classe de heteropolímeros, altamente ramificado,
possui baixa estabilidade térmica e química em relação à celulose, provavelmente por ter
estrutura amorfa e apresentar menor grau de polimerização. Portanto, é mais fácil de ser
hidrolisada em açúcares simples do que a celulose (POPA, 1996; SAHA e COTTA, 2007).
Esse heteropolímero geralmente está localizado na parede celular e no meio da lamela
média da célula vegetal (WOODARD, 1984; VIIKARI et al., 1994) (ver FIG. 1).
A hemicelulose representa em geral 15-30% da biomassa, é composta por 2 a 6
açúcares diferentes com um grau de polimerização que varia de 100 a 200 (BASTAWDE,
1992; SAHA e COTTA, 2007). Os tipos de hemicelulose são designados de acordo com a
presença na cadeia principal de xilana, manana, galactana e arabinana (BEG, 2001). A
grande maioria das hemiceluloses apresenta ligações glicosídicas -1,4 entre os açúcares
constituintes da cadeia principal, exceto as galactanas em que a ligação é do tipo -1,3
(MAGGE e KOSARIC, 1985). As unidades da hemicelulose podem conter pentoses (D-
xilose e L-arabinose), hexoses (D-glicose, D-galactose, L-ramnose e L-fucose), ácidos
7
urônicos (D-glucurônicos, D-metilgalacturônico e D-galacturônico) e outros ácidos (acético,
ferúlico e p-cumárico) (SAHA e COTTA, 2007). Alguns grupos hidroxila de açúcares podem
ser variavelmente modificados por metilação ou acetilação (KENNEDY et al., 1987). A
quantidade de cada componente pode variar de acordo com a espécie da planta, estágio de
desenvolvimento e tipo de tecidos. As classes de hemicelulose mais comuns são à base de
xilana (glucuronoxilana e arabinoglucuronoxilana), a glucomanana (EBRINGEVORÁ, 2005)
a arabinogalactana e a galactoglucomanana (HALTRICH et al., 1996; SUNNA e
ANTRANIKIAN, 1997; KULKARNI et al.,1999; SUBRAMANIYAN e PREMA, 2002). Em cada
classe existe ainda uma heterogeneidade em relação ao grau e a natureza da cadeia
(MUELLER-HARVEY, 1986) (FIG. 4).
FIGURA 4 – Tipos mais comuns de hemicelulose. Abreviações: Ac, acetil, OMe, o-metil,
Araf, L-arabinofuranose, Galp, galactopiranose, Glcp, D-glucopiranose, GlcpUA, D-
glucuronopiranose, Manp, D-manopiranose, Xylp, D- xilopiranose. Fonte: adaptado de
KENNEDY et al., 1987.
A xilana é um polímero heterogêneo, altamente ramificado e de estrutura amorfa,
portanto, mais fácil de ser hidrolisada que a celulose. A xilana é o principal polissacarídeo
estrutural constituinte da hemicelulose, principalmente em gramíneas, e o segundo
polissacarídeo mais abundante da natureza (PRADE, 1996). A xilana está presente na
parede celular na maioria das plantas e é encontrada na parede secundária de células
vegetais (PRADE, 1996).
A cadeia principal da xilana e seus grupos substituintes são representados na FIG. 5.
8
R1
p-ácido cumárico
α-D-ácido glucurônico
α-D- arabinofuranose
R2
Grupo acetil
α -D- glucuronopiranose (Cα lignina)
4-O-metil-α-D- glucuronopiranose (Cα lignina)
α –L- arabinofuranose (Cα e C α lignina)
ácido ferúlico, grupo acetil, ácido p-cumárico
R3
α –L- arabinofuranose (Cα e C α lignina, ácido ferúlico, grupo acetil, ácido p-cumárico)
β-D-galactopiranosil (1-5) α-L-arabinofuranose
β-D-xilopiranosil (1-2) α-L-arabinofuranose
α-L-arabinofuranosil (1-2, 1-3, 1-2 arabinofuranose)n
β-D-galactopiranosil (1-4) D-xilopiranosil (-2)-α-L-arabinofuranose
FIGURA 5 – Estrutura química da xilana. Fonte: ATKINS, 1992.
A xilana em madeira existe como O-acetil-4-O-metilglucuronoxilana em hardwood de
Angiosperma, ou em quantidades pequenas, constituindo apenas um terço do total, como
arabino-4-O-metilglucuronoxilana, em softwood de Gimnosperma. O grau de polimerização
da xilana em hardwood nativa varia entre 150 e 200 e em softwood, 70-130, sendo sempre
mais baixo que o da celulose (SUNNA e ANTRANI KIAN, 1997).
A glucuronoxilana (GX) (O-acetil-4-O-metilglucuronoxilana) consiste de um polímero
de xilana, sendo a principal hemicelulose de hardwood, que pode ter pequenas quantidades
9
de glucomanana. Em hardwood, GX representa 15-30% de sua massa seca e é menos
abundante em softwood 7-12% (HALTRICH et al., 1996; ALÉN, 2000). GX são polímeros
lineares de β-D-xilopiranose unidos por ligações glicosídicas -1,4. Algumas unidades de D-
xilose são acetiladas no carbono 2 e no carbono 3 e o polímero também possui grupos
ácidos de 4-O-metil-α-D-glucuronopiranose unidos à cadeia principal por ligações α (1,2) e
são mais resistentes a ácidos do que os grupos acetil (COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993a;
PEREIRA et al., 2003). A presença destes grupos acetil permite que a xilana seja
parcialmente solúvel em água (SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).
A arabinoglucuronoxilana é um polímero que também consiste de uma cadeia linear
com unidades de β-D-xilopiranose com grupos laterais de ácidos urônicos 4-O-metil-α-D-
glucupiranosil e L-arabinofuranosil unidos por ligações glicosídicas α-(1,2) e α-(1,3)
(WOODWARD, 1984). Esse tipo de xilana é encontrado em culturas agrícolas, cereais e
gramíneas e em softwood - madeira suave, (5-10% de sua massa seca) (ALÉN, 2000). Em
softwood a xilana (arabinoglucuronoxilana) é menos ramificada e acetilada, contendo grupos
laterais de ácido glucurônico e L-arabinofuranose, ligado a cadeia principal por ligações
glicosídicas α-1,2 e α-1,3, respectivamente (PULS e SCHUSEIL, 1993; PEREIRA et al.,
2003).
A arabinoglucuronoxilana e a glucuronoxilana possuem uma função adesiva por
formar ligações covalentes e não covalentes, com a celulose, lignina e outros polímeros
essenciais para manter a integridade da parede celular (HALTRICH et al., 1996).
A hemicelulose tipo manana como glucomananas e gactoglucomananas são os
principais componentes hemicelulósicos da parede secundária de softwoods, enquanto, que
em hardwoods ocorre em quantidades menores.
A galactoglucomanana (O-acetil-galactoglucomanana) é a principal hemicelulose de
softwoods, ocorre de 20 a 25% de massa seca (PEREIRA et al., 2003). A
galactoglucomanana consiste de uma cadeia principal de D-glucopiranose e unidades de D-
manopiranose unidas por ligações glicosídicas β-1,4, parcialmente acetiladas no C2 ou C3 e
substituídos por unidades de α-Dgalactopiranose ligados a glicose ou manose por ligações
α-(1,6).
A acetil-galactoglucomanana é a principal hemicelulose em madeiras de coníferas e
pode ser divididas em duas frações: com taxas de galactose:glicose:manose cerca de 1:1:3
(fração com alto conteúdo de galactose) e 0,1:1:4 (fração com baixo conteúdo de galactose).
Essa última fração prevalece em softwood, e é conhecida como glucomanana (SUURNAKKI
et al., 1997). A hardwood contém somente uma pequena fração de glucomanana (2-5%),
com traços de glicose e manose com taxa 1:1-2 (SUURNAKKI et al., 1997), pois a
hemicelulose deste tipo de madeira é essencialmente composta por glucuronoxilana (como
referido acima).
10
2. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
A conversão da biomassa lignocelulósica em muitos produtos de valor agregado,
com exceção do papel, requer uma eficiente desconstrução dos polissacarídeos
(BANERJEE, et al., 2010). A hidrólise enzimática é mais eficiente que a conversão química,
o substrato não é perdido devido a modificações químicas e as condições de operação são
moderadas e não corrosivas. Durante a hidrólise enzimática, o uso de celulases,
hemicelulases e enzimas auxiliares são necessárias para otimizar o processo de
degradação da lignocelulose, aumentar o rendimento em açúcares simples e reduzir o custo
do processo ( BERLIN et al., 2005; SELIG et al., 2008). Essas enzimas são conhecidas
como hidrolíticas, que catalisam a adição de água com a clivagem das ligações glicosídicas,
liberando oligômeros e monômeros.
2.1 Celulases
Na biomassa lignocelulósica, a celulose encontra-se em forma altamente cristalina,
associada à hemicelulose e envolvida pela lignina. A hidrólise da celulose requer uma ação
sinergística de três classes de enzimas celulolíticas: endoglucanases, exoglucanases ou
celobioidrolases e β-glicosidases.
Endo-β-1,4-glucanases (EC 3.2.1.4) são também conhecidas como β-1,4-D-glucano
glucanoidrolases são endoglucanases que hidrolisam as ligações β-1,4-D-glicosídicas
aleatoriamente na cadeia de celulose, produzindo vários oligossacarídeos, celobiose e
glicose, gerando um decréscimo significativo no grau de polimerização (DP) e produzindo
novas regiões terminais redutoras e não redutoras (HENRISSAT, 1991).
As exoglucanases (EC 3.2.1.91), também denominadas β-1,4-celobioidrolases,
hidrolisam as ligações β-1,4-D-glicosídicas na celulose e celotetraose, liberando
majoritariamente celobiose, além de glicose e celotriose. As exoglucanases principais são
a CBH I e CBH II, que hidrolisam a cadeia de celulose a partir das extremidades
redutora e não-redutora, respectivamente (HENRISSAT, 1991; NIEHAUS et al., 1999). As
celobioidrolases apresentam em sua estrutura uma região responsável pela ligação da
molécula ao substrato (CBD- cellulose binding domain) e sofrem inibição pelo seu produto
de hidrólise, a celobiose (AWAFO et al., 1998).
As β-glicosidases (EC 3.2.1.21) ou celobiases catalisam a hidrólise da cadeia
terminal não redutora liberando unidades de glicose. Essas enzimas possuem alta
especificidade para β-D-glicosídeos (HENRISSAT, 1991; NIEHAUS et al., 1999). A ação
11
desta enzima reduz o efeito inibidor da celobiose sobre as endo- e exo-glucanases (ZHANG
et al., 2006; OYEKOLA, 2004).
2.2 Hemicelulases
As hemicelulases são glicosil hidrolases (GH) que hidrolisam especificamente a
hemicelulose (KENNEDY et al., 1987). A completa degradação da hemicelulose é
importante no ciclo do carbono e, devido à complexidade e à heterogeneidade de sua
estrutura, requer a ação de várias hemicelulases (FIG. 6) (BEG et al., 2001; SHALLOM e
SHOHAM, 2003; COLLINS et al., 2005a).
FIGURA 6 – Estrutura da Glucuronoxilana (a) e da Arabinoxilana (b). Enzimas xilanolíticas
envolvidas na degradação da xilana: acetilxilana esterase, α-glucuronidase, endoxilanase e
α-L-arabionofuranosidase. Hidrólise realizada por β-xilosidase (c). Os números indicam
12
átomos de carbono com grupos substituintes ligados. Ac. Grupo acetil. Fonte: POLIZELI et
al., 2005.
As hemicelulases mais estudadas são as que hidrolisam a hemicelulose do tipo
xilana. Usualmente, a xilana é desramificada antes ou em conjunto com a despolimerização
da cadeia principal. São requeridas diferentes enzimas dependendo do tipo específico de
xilana a ser hidrolisada. Essas incluem enzimas que despolimerizam a cadeia principal:
endo-1,4-β-xilanases e β-xilosidases.
Existem ainda enzimas acessórias ou desramificadoras, que removem grupos
laterais ou substituintes como as α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, acetilxilana
esterase e esterases de ácido fenólico (ácido ferúlico e ácido p-cumárico esterases) (BEG et
al., 2001, GRAY et al., 2006, POLIZELI et al., 2005, RYABOVA et al., 2009). Quando os
substituintes são removidos, a xilana pode tornar-se menos solúvel e formar agregados que
estereoquimicamente retardam ou diminuem sua degradação (VIIKARI et al., 1999).
Portanto, a remoção simultânea da cadeia lateral e a clivagem na cadeia principal pelas
endoenzimas melhoram sinergisticamente a taxa de degradação da hemicelulose
(TENKANEN e POUTANEN, 1992; DE VRIES et al., 2000).
2.2.1 Endo-1,4-β-xilanases
As endoxilanases (1,4-β-D-xilana xilanoidrolase EC 3.2.1.8) são enzimas que clivam
as ligações β-1,4-xilosídicas entre dois resíduos D-xilopiranosídeo. As endoxilanases
formam o maior grupo de enzimas hidrolíticas envolvidas na degradação da cadeia da xilana
(insolúvel), reduzindo o seu grau de polimerização e liberando oligossacarídeos solúveis de
diferentes comprimentos (MEAGHER et al., 1988; Li et al., 2000). As ligações mais
suscetíveis de hidrólise enzimática dependem da natureza das moléculas do substrato, ou
seja, do comprimento da cadeia, do grau de ramificações e da presença de substituintes
(REILLY, 1981, LI et al., 2000). Essas enzimas possuem uma maior atividade contra o
polímero de xilana e a taxa da reação de hidrólise diminui com a diminuição do comprimento
da cadeia dos oligossacarídeos (MEAGHER et al., 1988). Os principais produtos da hidrólise
são a xilobiose, xilotriose e oligômeros contendo de 2 a 4 resíduos de β-D-xilopiranosil
(COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993a).
Vários estudos sugerem que as xilanases são comumente enzimas indutíveis (BEG
et al., 2001), e que a eficiente produção enzimática depende da fonte de carbono indutor.
Verificou-se que a biossíntese da xilanase pode ser induzida por xilana, xilose, xilobiose ou
13
vários resíduos β-D-xilopiranosil adicionados ao meio de cultura (KULKARNI et al., 1999;
POLIZELI et al., 2005; KUMAR et al., 2008). Contudo, a produção constitutiva de xilanase já
foi relatada por KHASIN e colaboradores (1993). A repressão catabólica por glicose é um
fenômeno comum observado na biossíntese da xilanase (KULKARNI et al., 1999).
As xilanases de origem fúngica têm massas moleculares entre 6 e 83 kDa e são
geralmente mais ativas a pH entre 3,5 e 6,5 e entre 40 e 60ºC. As xilanases de origem
bacteriana têm massas moleculares maiores, entre 15 a 85 kDa, com poucas exceções.
Estas são mais ativas a pH entre 5,0 a 8,0 e entre 50 e 80ºC (SUNNA e ANTRANIKIAN,
1997).
As endoxilanases são enzimas altamente diversificadas em diferentes níveis:
estrutural, bioquímico e catalítico. Atualmente, a maioria dos micro-organismos produzem
diferentes tipos de endoxilanases. A classificação clássica baseada no produto final da
reação de hidrólise, que diz que essas podem ser divididas em desramificadoras ou não,
liberando ou não arabinose, via hidrólise de grupos laterais 1,3-α-L-arabinofuranose da
arabinoxilana (WONG et al.,1988), mostra algumas limitações (PÄES et al., 2012). A nova
classificação também proposta por WONG et al., (1988) é baseada nas propriedades físico-
química das xilanases, que correlaciona massa molecular e o ponto isoelétrico (pI). As
xilanases têm sido divididas em famílias: membros com maior massa molar (> 30 kDa) e pI
ácido, pertencem à família F ou 10; membros com menor massa molecular (< 30 kDa) pI
básico são da família G ou 11. Este sistema de classificação pode ainda mostrar algumas
exceções, sendo que novas enzimas podem ser descobertas e não pertencer a nenhum
desses grupos (PÄES et al., 2012).
A classificação das xilanases (EC 3.2.1.-) nos grupos (e.g. GH10 e GH11) baseia-se
nas similaridades da sequência de aminoácidos e do domínio catalítico (HENRISSAT e
BAIROCH, 1993; SAPAG et al., 2002). Membros dessas famílias ocorrem em bactérias e
fungos e podem apresentar diferentes funções fisiológicas (BIELY et al., 1997).
Um banco de dados dedicado a enzimas ativas com carboidratos, “Carbohydrate-
Active enzymes” (CAZy), (CANTAREL et al., 2009) reune todas as sequencias de GH
disponíveis e é de livre acesso. As verdadeiras β-(1,4) xilanases com um único sítio
catalítico são restritas as famílias 5, 8, 10, 11 e 30 (TAB. 1).
2.2.2 β-1,4-D-xilosidases
As β-D-xilosidases (1,4-β-D-xilana xiloidrolase; EC 3.2.1.37) são conhecidas como
xilobiases e exo-β-1,4-xilanases em função de sua relativa afinidade com a xilobiose e
xilooligossacarídeos maiores, respectivamente. As β-xilosidases são definidas como
14
enzimas que catalisam a clivagem da xilobiose e o ataque do terminal não redutor dos xilo-
oligossacarídeos para liberar xilose (SORENSEN et al., 2003; RASMUSSEN et al., 2006)
(FIG. 6 C). Devido a sua ação catalítica, a β-xilosidase assume um importante papel na
degradação da xilana pela remoção dos produtos da endoxilanase (pequenos oligômeros de
β-D-xilopiranosil), que inibem a atividade desta enzima e, consequentemente, limita a
eficiência da hidrólise da xilana (ANDRADE et al., 2004). A afinidade da β-xilosidase na
degradação de xilo-oligossacarídeos é inversamente proporcional ao seu grau de
polimerização. Estas enzimas têm a capacidade de clivar substratos artificiais como p-
nitrofenil e o-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo (KURAKABE et al., 1997), substratos
normalmente utilizados para determinação in vitro da atividade β-xilosidase.
Em relação à localização da β-xilosidase, contrariamente às xilanases que são
secretadas pelas células para o meio de crescimento (extracelular) a β-xilosidase pode ser
intracelular ou associada à parede, dependendo do tipo de micro-organismo e das
condições de cultura (LENARTOVICZ et al., 2003). Em muitas bactérias e leveduras a β-
xilosidase está associadas às células e são assim consideradas por ocorrerem no citosol ou
espaço periplasmático (BIELY et al., 1980; BAJPAI, 1997). Quando intracelulares, os xilo-
oligossacarídeos necessitam ser transportados para o citoplasma da célula onde são então
convertidos em xilose intracelularmente (KRÁTKÝ e BIELY 1980). Em fungos filamentosos
as enzimas β-xilosidase permanecem associadas ao micélio em estágios iniciais da fase de
crescimento e são liberadas mais tarde para o meio por secreção ou como resultado de lise
celular (WONG e SADDLER, 1992). Desta maneira, várias β-xilosidases têm sido
recuperadas no meio extracelular (SAHA, 2003b; YAN et al., 2008), enquanto que outras
permanecem no espaço intracelular durante todo o período de crescimento (KUMAR e
RAMÓN, 1996; LEMBO et al., 2006). As β-xilosidases de fungos geralmente apresentam-se
na forma monomérica, mas algumas são relatadas por possuírem duas ou três subunidades
(SUNNA e ANTRANIKIAN, 1997).
Comumente essa proteínas possuem alta massa molecular, entre 60 e 360 kDa. A
maioria das enzimas de fungos apresenta um pH ótimo de atividade entre 4,0 e 5,0 (SAHA,
2003b) e uma temperatura ótima que pode variar de 40 a 80ºC. A termoestabilidade é
altamente variável, dependendo do micro-organismo em questão (RIZZATTI et al., 2001). O
interesse em enzimas termoestáveis tem aumentado muito nos últimos anos, devido à
resistência à inativação, diminuindo a limitação de seu uso em processos industriais
(GUPTA e GUPTA, 1993; WALSH, 2002).
Uma vez que as enzimas com atividade de β-xilosidase têm também atividade com
outros substratos, a classificação destas enzimas com base na especificidade não é
adequada. Nos últimos anos, devido a inúmeros estudos moleculares, os genes de β-
xilosidase de alguns fungos filamentosos têm sido isolados e sequenciados. Assim, as β-
15
xilosidases são hoje tal como as outras glicosil hidrolases (KNOB et al., 2010), agrupadas
em famílias, de acordo com a similaridade da sequência de seus aminoácidos. Essa
classificação é baseada essencialmente na estrutura primária e não na estrutura
tridimensional e o mecanismo molecular da enzima. Os membros de uma mesma família
apresentam similaridade nas características estruturais, mas diferenças nas propriedades
físico-químicas, modo de ação e especificidade de substrato. De acordo com o CAZy, as β-
xilosidases são encontradas nas famílias 3, 30, 39, 43, 52 e 54 glicosil hidrolases (GHs)
(TAB. 2) (CANTAREL et al., 2009).
TABELA 1 – Enzimas hidrolíticas do tipo endoxilanase, principais famílias glicosil hidrolase (GH) e micro-organismos produtores.
Enzima hidrolítica GH Micro-organismo produtor Referência
Endo-β-1,4-xylanase
(EC 3.2.1.8)
GH8
Glaciecola mesófila Guo e Zhang, 2013
Bacillus halodurans Takami, 1999
Pseudoalteromonas arctica Elleuche et al. 2011
Pseudoalteromonas haloplanktis Collins et al. 2002
GH10
Alicyclobacillus sp. Wang et al. 2011
Geobacillus thermantarcticus GenBank: AEI87757.1
Lechevalieria sp. Zhou et al. 2012
Streptomyces avermitilis Hernandes et al. 2008
Hordeum vulgar Van Campenhout e Volckaert, 2005
Hypothenemus hampei Padilla-Hurtado et al. 2012
Aureobasidium pullulans Tanaka et al. 2006
GH11
Bacillus halodurans Martinez et al. 2002
Bacillus subtilis Lu et al. 2006
Aspergillus fumigatus Jeya et al. 2009
Aspergillus japonicus Wakiyama et al. 2010
Aspergillus niger Fang et al. 2013
Aureobasidium pullulans Li e Ljungdahl, 1994; Ohta et al, 2001
Penicillium chrysogenum GenBank: BAG75460.1
Thermomyces lanuginosus GenBank: AEH57194.1
GH43 Bifidobacterium adolescentis Suzuki et al. 2006
16
TABELA 2 – Enzimas hidrolíticas do tipo β-xilosidase, principais famílias glicosil hidrolase (GH) e micro-organismos produtores.
Enzima hidrolítica GH Micro-organismo produtor Referência
β-1,4-Xilosidase
(EC 3.2.1.37)
GH3
Caldanaerobius polysaccharolyticus Han et al. 2012
Caldicellulosiruptor bescii GenBank: ACM61424.1
Acremonium cellulolyticus GenBank: BAK96214.1
Aspergillus aculeatus GenBank: BAH30674.1
Aspergillus awamori Kurakake et al. 2005
Aspergillus fumigatus GenBank: ABA40420.1
Aspergillus japonicus Wakiyama et al. 2008
Aspergillus oryzae GenBank: BAA24107.1
Aureobasidium pullulans Ohta et al. 2010
GH30 Bifidobacterium breve Hyun et al. 2012
Phytophthora infestans Brunner et al. 2012
GH43
Bacillus halodurans Takami, 1999
Bacillus subtilis GenBank: AAB41091.1
Aspergillus terréus Guo et al. 2013
GH39 Bacillus halodurans Takami, 1999
2.2.3 Enzimas ligninolíticas
A biodegradação da lignina é um processo oxidativo que envolve um complexo
sistema enzimático de baixa especificidade, produzido por fungos que vivem em madeiras,
designados fungos de decomposição – branca, marrom e branda – de acordo com os
aspetos macroscópicos do tecido de deterioração. Os fungos da podridão branca, em que
se inclui o fungo Phanaerochatae chysosporium, são os mais importantes. Algumas
bactérias, em especial os actinomicetos, são também capazes de degradar a lignina. As
principais enzimas envolvidas são lignina peroxidase (ligninase), manganês peroxidase e
lacase (polifenol oxidase) (BREN e SINGLETON, 1999).
17
3. LEVEDURAS PRODUTORAS DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS
Em termos econômicos e ecológicos, as pesquisas com micro-organismos que
utilizam xilana e respectivos sistemas enzimáticos têm-se tornado cada vez mais relevantes,
embora o foco seja principalmente em fungos filamentosos (SUN e CHENG, 2002), por
serem conhecidos como eficientes produtores de enzimas xilanolíticas. Contrariamente, há
um número menor de pesquisas realizadas com leveduras, mas vários autores têm
estudado esses micro-organismos por fins de caracterização taxonômica e ecológica e/ou
na prospecção de novas enzimas para aplicação biotecnológica (SHIVAJI e PRASAD,
2009).
As leveduras são fungos unicelulares e tipicamente saprófitos, sendo ubíquos em
todos os biomas do mundo (ROSA e PÉTER, 2006; STARMER e LACHANCE, 2011).
O conhecimento sobre a decomposição da matéria orgânica, por exemplo, da
madeira, é importante para o entendimento do processo de degradação e dos fatores que
afetam a transformação da lignocelulose (GONZÁLEZ, 1989) como também dos micro-
organismos produtores de enzimas responsáveis pela decomposição da matéria
lignocelulósica. Os fungos filamentosos crescem em madeira em decomposição, degradam
esse material, rico em celulose, usando um complexo sistema de enzimas incluindo
endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases (BALDRIAN e VALASKOVA, 2008).
O complexo de enzimas celulolíticas usados por espécies de fungos assegura uma rápida
colonização do substrato. Durante a decomposição da madeira, foi observado que bactérias,
leveduras e fungos filamentosos encontravam-se estreitamente associados nesse processo
(BLANCHETTE e SAHW, 1978). Já durante o estágio intermediário de decomposição, as
mudanças ocorridas são principalmente afetadas pela comunidade de fungos (HEILMANN-
CLAUSEN e BODDY, 2005).
A variação no número de leveduras identificadas em diferentes tipos de madeira em
decomposição corresponde à distribuição e abundância natural de fungos basidiomicetos
decompositores na área estudada (GONZÁLEZ, 1989). Alguns dos basidiomicetos
encontrados em comunidades associadas à madeira em decomposição são produtores de
xilanases (CADETE et al., 2009, MORAIS et al., 2013a). Os ascomicetos também têm sido
isolados a partir de madeira em decomposição (MIDDELHOVEN e KURTZMAN, 2007;
CADETE et al., 2012, MORAIS et al., 2013a) e casca de árvores (BHADRA et al., 2008).
Várias leveduras foram descritas como capazes de produzir enzimas xilanolíticas
(BIELY 1980; LEATHERS, 1986; BHADRA et al., 2008; PARACHIN et al., 2009; VAZ et al.,
2011; CARRASCO et al., 2012; ROMERO et al., 2012, MORAIS
18
et al., 2013b),incluindo linhagens de leveduras pertencentes aos gêneros Cryptococcus,
Pichia, Candida, Trichosporon, Dekkera, Hanseniaspora, Metschnikowia, Rohodotorula,
Sugiyamaella (TAB. 3).
O ascomiceto Aureobasidium pullulans, é um fungo leveduriforme, conhecido como
levedura negra (COOKE, 1959, DOMSCH et al., 2003). O Aureobasidium pullulans é um
saprófito cosmopolita, rotineiramente encontrado em superfície de folhas (PRASONGSUK et
al., 2005), cascos de árvore (BHADRA et al., 2008) e em várias superfícies como concreto,
madeira, paredes pintadas e ambientes internos (PUNNAPAYAK et al. 2003). Sabe-se que
A. pullulans é produtor de muitas enzimas hidrolíticas incluindo, amilases, proteases,
esterases, pectinases e as hemicelulases, xilanases e manases (LEATHERS, 2002). Há
linhagens de cores variadas, exibindo pigmentos vermelho, amarelo, laranja ou roxo. Estas
linhagens, que se distinguem das linhagens típicas de aparência esbranquiçada para negra
(WICKERHAM e KURTZMAN 1975), têm sido isoladas somente de regiões tropicais e sub-
tropicais, sendo também descritas como proeminentes produtoras de endoxilanase (EC
3.2.1.8) (LEATHERS et al., 1984).
19
TABELA 3 – Leveduras produtoras de enzimas xilanolíticas
Micro-organismo Referência
Leveduras produtoras de xilanase
Aureobasidium pullulans Leathers, 1986; Bhadra et al., 2008
Aureobasidium microstictum Jiménez et al., 1991
Candida bertae Jiménez et al., 1991
Cryptococcus albidus Morosoli, 1985; Biely, 1980; Petrescu et al., 2000
Cryptococcus flavus Parachin et al., 2009
Cryptococcus laurentii Lee et al., 1986
Cryptococcus podzolicus Lee et al., 1986
Filobasidium uniguttulatun Jiménez et al., 1991
Pseudozyma hubeiensis Bastawde et al., 1994
Scheffersomyces stipitis Lee et al. 1986; Özcan et al., 1991; Basaran et al., 2001
Spencermartinsiella sp. Morais et al., 2013a
Sugiyamaella xylanicola Morais et al., 2013b
Tremella sp. Morais et al., 2013a
Trichosporon cutaneum Stevens e Payne 1977
Trichosporon mycotoxinivoran Thongekkaew et al. 2012
Trichosporon pullulans Stevens e Payne 1977
Leveduras produtoras de β-xilosidase
Aureobasidium pullulans Ohta et al., 2010
Hanseniapora osmophila Manzanares et al., 1998
Hanseniapora uvarum Manzanares et al., 1998
Pichia anômala Manzanares et al., 1998
Pichia membranifaciens Romero et al., 2012
4. APLICAÇÕES DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS
Nos últimos anos, o potencial biotecnológico da xilana e das enzimas xilanolíticas
tem recebido maior atenção dos pesquisadores e a aplicação dessas enzimas têm crescido
no mercado (WONG e SADDLER, 1992; BEG et al., 2000, 2001; COLLINS, et al., 2005b).
São diversas as áreas com potencialidades industriais das xilanases, incluindo a indústria
têxtil, de polpa e papel, farmacêutica, alimentar e agroindústria com a produção de ração
animal.
20
No setor alimentar, hoje em dia, os xilo-oligossacarídeos são utilizados
principalmente como edulcorantes ou aditivos em alimentos (LACHKE, 2006). Em relação à
saúde humana, os xilo-oligossacarÍdeos são considerados prebióticos, sendo um meio
seletivo ao crescimento de probiótico como Lactobacillus sp. e Bifidobacterium bifidum
(GIBSON, 2004). A D-xilose, monômero resultante da hidrólise completa da xilana, tem sido
utilizada por micro-organismos na produção de xilitol, um poliálcool que encontra larga
aplicação como adoçante natural de alimentos, podendo ser um substituto do açúcar para
diabéticos (PARAJÓ et al., 1998, Yang et al., 2005).
A aplicação de enzimas amilolíticas, lipases e xilanolíticas em alimentos tem
aumentado consideravelmente nos últimos anos, devido ao aumento do custo de matérias-
primas tradicionais e também pela busca de outros ingredientes alternativos (AHUJA et. al.,
2004). Na indústria alimentar, enzimas como pectinases, celulases e xilanases são usadas
na extração e clarificação de sucos, aumentando o rendimento na extração do suco,
portanto, com vantagens em relação à produção final (POLIZELI et al., 2005). As xilanases
podem ser empregadas na panificação, juntas com outras enzimas como amilases, glucose
oxidase e proteases.
Outro foco do uso das xilanases é a produção de biocombustíveis, como o bioetanol
de segunda geração (2G). A conversão da hemicelulose, juntamente com a celulose, em
açúcares simples que podem ser transformados em etanol por micro-organismos com
capacidade fermentativa, aumentaria a quantidade de açúcares e consequentemente
aumentaria a produtividade de bioetanol (GÍRIO et al., 2010). A utilização completa dos
açúcares é um dos pré-requisitos para render etanol lignocelulósico economicamente
competitivo (MACRELI et al., 2014)
4.1 Aplicação de enzimas xilanolíticas na produção de bioetanol de segunda geração
(2G)
O aumento do preço do petróleo, a instabilidade política e econômica mundial e as
crescentes preocupações ambientais, quanto ao significativo aumento dos gases com efeito
estufa e consequentes mudanças climáticas, têm conduzido à procura de fontes de energia
alternativas, renováveis e seguras, produzidas segundo critérios de sustentabilidade
(econômicos, sociais e ambientais). De fato, é urgente a substituição de combustíveis
fósseis por fontes de combustível renováveis de forma a minimizar os danos ambientais
(KUMAR et al., 2013). A biomassa lignocelulósica é a quarta fonte de energia mundial, atrás
do carvão, petróleo e gás natural e a primeira fonte de carbono renovável (BARZ et al.,
2010; SEC, 2010), tendo um significativo potencial econômico como futuro substituinte do
21
petróleo numa perspectiva de biorrefinaria, para produção de biocombustíveis, químicos e
biomateriais. O desenvolvimento de uma economia baseada na biomassa – bioeconomia –
como fonte de carbono renovável para a produção de energia, químicos e materiais, reduz a
dependência de importação de petróleo e melhora o desenvolvimento sócio-econômico de
muitos países, como os países pertencentes ao ASEAN (Associação dos países do sudeste
da Ásia) onde desde a virada do século o crescimento no consumo de combustíveis tem
aumentado progressivamente (KUMAR et al., 2013).
A utilização de materiais lignocelulósicos para a produção de bioetanol se tornou
uma prioridade mundial (GÍRIO et al., 2010) devido aos fatores ambientais e econômicos
referidos. O bioetanol é considerado como uma das fontes de energia renováveis mais
comuns sendo produzido principalmente no Brasil (a partir da cana-de-açúcar) e pelos EUA
(a partir do milho) – etanol de primeira geração (1G). É desejável que o respectivo aumento
na produção de bioetanol não envolva aumento e/ou desvio da área plantada para a
produção de biocombustíveis (BARZ e DELIVAND, 2011), em detrimento de outras culturas
e/ou pondo em causa a manutenção da biodiversidade. A produção de bioetanol em larga
escala passará pela utilização de resíduos lignocelulósicos – etanol de segunda geração
(2G). A utilização de tecnologias que utilizam os materiais lignocelulósicos como matéria
prima (resíduos agrícolas, agroindustriais e florestais) apresenta como vantagens a
abundância desses materiais, impacto positivo na conservação do ambiente e
biodiversidade, além de diminuir a dependência dos combustíveis fósseis (LUO et al., 2009).
O processo industrial de produção de bioetanol lignocelulósico envolve o pré-
tratamento da biomassa, a hidrólise enzimática, a fermentação e a destilação (GÍRIO et al.,
2010).
4.1.2 Produção do bioetanol de segunda geração (2G)
Os maiores desafios na produção do bioetanol 2G está na desconstrução eficiente
da biomassa (pré-tratamento e hidrólise), na conversão de todos os açúcares presentes nos
hidrolisados lignocelulósicos em etanol, com elevado rendimento e produtividade, e na
integração do bioprocesso num contexto de biorefinaria. As tendências recentes favorecem
a integração de, pelo menos, três eventos chaves (FIG. 7) – pré-tratamento, hidrólise e
fermentação – tanto para melhorar o rendimento e produtividade do etanol quanto para
diminuir o custo de produção (LYND et al., 2002, 2008; VAN ZYL et al., 2007; MARGEOT
et al., 2009).
Nos pré-tratamentos da biomassa lignocelulósica por processos alcalinos a lignina é
solubilizada deixando a celulose e a hemicelulose na fração sólida. Na hidrólise enzimática
22
com celulases e hemicelulases, as xilanases, além de contribuirem diretamente para a
hidrólise do xilano, podem contribuir para o aumento o rendimento da hidrólise da celulose
devido à solubilização da fração hemicelulósica.
23
A
B
FIGURA 7 – Bioprocesso do etanol lignocelulósico. a) Pré-tratamentos da biomassa
lignocelulósica por processos alcalinos. b) Pré-tratamentos hidrotérmicos ou ácidos.
24
Nos pré-tratamentos hidrotérmicos ou ácidos a hemicelulose é parcialmente
solubilizada/hidrolizada, mas em condições mais suaves, permanece uma maior quantidade
de hemicelulose na fração sólida. Na hidrólise enzimática com celulases e hemicelulases, as
xilanases, além de contribuírem diretamente para a hidrólise da xilana, podem contribuir
para o aumento do rendimento da hidrólise da celulose devido à solubilização da fração
hemicelulósica. A hidrólise enzimática pode ser separada da fermentação (SHF), ou
simultânea, com a fermentação de hexoses derivada da hidrólise da celulose e pentoses
derivada da hidrólise da hemicelulose (SSCF). As enzimas hidrolíticas podem ser
produzidas no mesmo biorreator que os processos de hidrólise enzimática e fermentação,
em um único passo, sendo denominado Bioprocesso Consolidado (CBP).
Antes da utilização de enzimas para a hidrólise dos polissacarídeos, é necessário um
passo de pré-tratamento para destruição da estrutura rígida da biomassa. O pré-tratamento
aumenta assim a área de superfície das fibras de celulose e consequentemente o contato
das enzimas hidrolíticas, resultando numa maior digestibilidade dos polissacarídeos
(MANSFIELD et al., 1999; SANCHEZ e CARDONA, 2008; GÍRIO et al., 2010). O processo
de pré-tratamento pode ser realizado por métodos físicos, físico-químicos, ou biológicos
(OLSSON e HÄHN-HÄGERDAL, 1996; SUN e CHENG, 2002), e tem sido investigado para
diferentes materiais lignocelulósicos, levando em consideração as suas distintas
características físico-químicas. Assim, é necessário adotar um pré-tratamento com
tecnologia adequada, pois essa etapa é considerada crucial na conversão biológica para
etanol e representa um dos principais fatores econômicos do processo (GALBE e ZACCHI,
2007).
Entre os pré-tratamentos mais usados encontram-se os tratamentos térmicos,
explosão de fibras com amônia, explosão de CO2; hidrotérmicos, como a explosão a vapor e
a auto-hidrólise; tratamento com ácidos concentrados ou diluídos (sulfúrico, clorídrico e
fosfórico) e álcalis; extração por solventes orgânicos; tratamentos biológicos (empregando
micro-organismos produtores de enzimas lignonilíticas, como por exemplo, fungos
causadores da podridão branca) (CARDONA e SANCHES, 2007; ALVIRA et al., 2010;
GÍRIO et al., 2010).
Cada tecnologia de pré-tratamento apresenta vantagens e desvantagens, e o pré-
tratamento mais apropriado dependem de vários fatores, como o tipo de matéria-prima e sua
recalcitrância e o fim a que se destina. O desafio de qualquer estratégia de pré-tratamento
da lignocelulose é o fracionamento adequado da hemicelulose, celulose e/ou lignina,
juntamente com uma baixa degradação dos açúcares que constituem esses polímeros, a fim
de se obter rendimentos e taxas de fermentação máximas no processo empregado (GÍRIO
et al., 2010).
25
Com a redução da severidade do pré-tratamento o substrato ainda permanece com
sólidos ricos em celulose e uma significativa proporção de hemicelulose insolúvel e
consequentemente, maior quantidade e diferentes tipos de enzimas são requeridas para
atingir alto rendimento de açúcar de ambas as frações de açúcares poliméricos, celulose e
hemicelulose. De fato, a recuperação máxima de hemicelulose é geralmente atingida
usando, por exemplo, a auto-hidrólise com baixa severidade, o que previne a degradação
dos açúcares hemicelulósicos (GARROTE et al., 1999; CARVALHEIRO et al., 2004, 2009;
MOURA et al., 2007; VEGAS et a., 2008; PETERSEN et al., 2009). Contrariamente, a
hidrólise eficiente da celulose é obtida depois que a lignocelulose passa por um pré-
tratamento usando condições severas (BOUSSAID et al., 1999; SÖDERSTRÖM et al.,
2002; YOURCHISIN e VAN WALSUM, 2004; XU et al., 2009).
Os tratamentos hidrotérmicos são considerados promissores, pois utilizam apenas
água como único adjuvante adicionado ao material, proporcionando hidrólise das
hemiceluloses e obtenção de sólidos ricos em celulose e lignina de pureza elevada, que
podem não necessitar de tratamento (neutralização e/ou lavagem) para posterior utilização
(CARVALHEIRO et al., 2008). Apesar, de a hemicelulose ser predominantemente recolhida
na fração líquida (solúvel) depois do pré-tratamento hidrotérmico, a sua hidrólise é
geralmente incompleta gerando grandes quantidades de XOS (CARVALHEIRO et al., 2008).
O pré-tratamento de auto-hidrólise de baixa severidade tem sido sugerido seguido de
hidrólise química ou enzimática, para converter os polissacarídeos e oligossacarídeos em
monossacarídeos (CARVALHEIRO et al., 2008).
Dependendo do processo e das condições utilizadas durante o pré-tratamento da
matéria-prima lignocelulósica, os açúcares lignocelulósicos podem ser degradados a
derivados do furano, ácidos como o acético, fórmico e levulínico e compostos fenólicos
(PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000; CARDONA et al., 2010; GÍRIO et al., 2010).
Esses compostos agem inibindo o metabolismo microbiano, razão pela qual são chamados
de inibidores, dificultando a bioconversão dos açúcares nos produtos desejados (CANILHA
et al., 2010) e, consequentemente, afetando o desempenho na produção de etanol pelos
micro-organismos fermentadores (CARDONA et al., 2010).
A presença de substâncias inibidoras muitas vezes impõe a necessidade de
purificação dos hidrolisados antes da utilização e/ou adaptação dos micro-organismos ao
açúcar a ser utilizado (WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998). No processo de
destoxificação, uma variedade de tratamentos físico-químicos e também tratamentos
biológicos pode ser utilizada (PALMQVIST e HAHN-HAGERDAL, 2000a). Já foram
propostas como estratégias a esta etapa, conduzidas tanto de forma individual quanto
combinada, os métodos de neutralização, adsorção por resinas de troca iônica, adsorção
por carvão ativado e overliming com hidróxido de cálcio (CARVALHEIRO et al., 2005;
26
CANILHA et al., 2010). No entanto, um passo adicional de destoxificação na produção de
etanol lignocelulósico pode contribuir para a inviabilidade econômica do processo global.
Por outro lado, para o bioetanol se tornar competitivo no mercado é essencial a
bioconversão da hemicelulose em açúcares fermentáveis (WYMAN, 1999) e a fermentação
desses açúcares com elevados rendimentos e produtividades (GÍRIO et al., 2010). O
método mais promissor é um pré-tratamento ameno da biomassa seguido por hidrólise
enzimática dos polissacarídeos usando celulases e hemicelulases. Além disso, as
hemicelulases facilitam a hidrólise da celulose por aumentar a exposição das fibras e
tornarem-se mais acessíveis para as celulases (SHALLOM e SHOHAN, 2003). E ainda, a
hidrólise enzimática mostra distintas vantagens sobre os métodos de hidrólise baseados em
ácido, por ser mais suave, com potencial para maior rendimento e não ter problemas em
relação à corrosão de equipamentos.
O processo de hidrólise enzimática dos polissacarídeos e oligossacárideos é
normalmente efetuado com coquetéis enzimáticos comerciais, cuja composição em enzimas
celulolíticas e hemicelulolíticas são variáveis. Estes coqueteis são normalmente produzidos
por fungos filamentosos e têm temperaturas ótimas de atividade acerca de 50ºC (DUARTE e
COSTA-FERREIRA 1994; KNOB et al., 2010). A hidrólise enzimática pode ser efetuada de
forma separada (SHF) ou simultânea com a fermentação (SSF). O SHF possibilita a
utilização da temperatura ótima de atuação das enzimas na hidrólise e temperatura ótima de
crescimento dos micro-organismos responsáveis pela fermentação. Entretanto, possui o
inconveniente da hidrólise enzimática ser inibida pelo produto da reação, que se acumula
durante o processo o que diminui a produtividade e o rendimento de hidrólise (OLOFSSON
et al., 2008). O SSF é um processo muito atrativo do ponto de vista econômico, não só por
integrar duas operações num único bioreator, mas também por reduzir o efeito de inibição
pelo produto da hidrólise enzimática que é continuamente removido pela fermentação. No
entanto, este processo é realizado em condições de temperatura sub-ótima para o processo
de hidrólise enzimática, de forma que a temperatura de operação seja compatível com o
processo de fermentação (OLOFSSON et al., 2008).
Na produção de bioetanol 2G, a integração do processo para utilização de hexoses e
pentoses numa única etapa tem sido vista como um dos fatores chave para a sua
viabilidade econômica. Neste sentido, a sacarificação e co-fermentação em simultâneo
(SSCF) tem-se destacado como um processo atrativo, uma vez que a sacarificação e
fermentação de hexoses e pentoses são realizadas numa única etapa (OLOFSSON et al.,
2008, GÍRIO et al., 2010).
Além disso, a baixa concentração de glicose no meio, proporcionada pela
sacarificação e fermentação em simultâneo pode favorecer o co-transporte de xilose para o
interior da célula (FONSECA et al., 2011). Para isso, a hidrólise da xilana a xilose deve ser
27
completa e seletiva de forma a maximizar a razão xilose/glicose no início do processo de
SSCF.
A integração na produção do bioetanol 2G é denominada Bioprocesso Consolidado
– Consolidated Bioprocessing (CBP) (LYND et al., 2005; CARDONA e SANCHES, 2007). O
CBP vem ganhando reconhecimento como um potencial avanço na diminuição dos custos
de processamento da lignocelulose (GÍRIO et al., 2010). Nesse sentido, tem sido dada
relevância à procura e/ou desenvolvimento de micro-organismos que exibam todas as
características desejadas ao CBP para a produção de etanol lignocelulósico e contribuir
efetivamente para os três passos mais importantes: produção de enzimas hidrolíticas,
hidrólise dos polissacarídeos presentes na biomassa pré-tratada, co-fermentação de
hexoses e pentoses para um maior rendimento.
Alguns micro-organismos como a Escheria coli apresenta várias vantagens na
produção de etanol, como a habilidade de fermentar uma variedade de açúcares que
incluem D-xilose e L-arabinose, simplicidade em manipulação genética e prioridade em uso
industrial (por ex. produção de proteínas recombinantes). Entretanto, várias desvantagens
podem ser notadas: crescimento em faixa estreita e neutra de pH, o que pode ser
susceptível à contaminação, baixa tolerância à inibidores derivados da lignocelulose e ao
etanol e formação de uma mistura de produtos, reduzindo o rendimento de etanol (DIEN et
al., 2003).
A bactéria Zymomonas mobilis apresenta alto rendimento e produtividade específica
de etanol a partir de glicose em condições anaeróbicas. Contudo, a Z. mobilis apresenta
desvantagens similares a E. coli, quanto a faixa de pH de crescimento e baixa tolerância de
inibidores derivados da lignocelulose. E ainda, a Z. mobilis possui uma estreita faixa de
substrato, sem a capacidade de utilizar todos os açúcares derivados da lignocelulose, com
exceção da glicose.
Visto que a fermentação de D-xilose representa um desafio, nas últimas décadas as
pesquisas tem focado na descoberta e no estudo de micro-organismos fermentadores de D-
xilose (HÄHN-HÄGERDAL et al., 2007; AGBOGBO et al., 2008). Até o momento conhece-
se alguns micro-organismos fermentadores de D-xilose, que incluem linhagens das
leveduras Scheffersomyces stipitis, Sc. shehatae, Sc. lignosa, Sc. insectosa, Pachysolen
tannophilus, Candida tenuis (AGBOGBO et al., 2008; FERREIRA et al., 2011; WOHLBACH
et al., 2011), Spathaspora passalidarum (NGUYEN et al., 2006; WOHLBACH et al., 2011;
HOU et al., 2012) e Sp. arborariae (CADETE et al., 2009; CUNHA-PEREIRA et al., 2011).
Dentre o elevado número de leveduras nativas que assimilam D-xilose e que são
capazes de fermentação (de glicose), apenas um pequeno número é capaz de fermentar
xilose a etanol (HAHN-HÄGERDAL et al., 2007). Essa aparente discrepância é intrínseca à
via metabólica da D-xilose. Essa via liga o metabolismo da D-xilose à via pentose fosfato por
28
meio da conversão da D-xilose em xilulose 5-fosfato (FIG. 8). A D-xilose internalizada pode
ser metabolizada por duas vias: uma envolvendo duas reações de oxidação-redução; e
outra envolvendo uma reação de isomerização. Na via de oxidação-redução, a xilose é
metabolizada por duas enzimas, a xilose redutase, (XR) e a xilitol desidrogenase (XDH). A
XR reduz a D-xilose a xilitol e a XDH oxida o xilitol a D-xilulose. Na via de isomerização, é
somente necessária uma etapa, uma vez que a D-xilose é diretamente convertida a D-
xilulose por meio da enzima xilose isomerase (XI). A D-xilulose formada é fosforilada a D-
xilulose 5-fosfato pela xilulocinase (XK), e metabolizada por meio da via pentose fosfato em
etanol (GRANSTROM e LEISOLA, 2002). A conversão de pentoses em xilulose 5-fosfato é
um pré-requisito para sua utilização por vias catabólicas centrais (SLININGER et al., 1987).
A via da pentose fosfato consiste de uma fase oxidativa que converte hexoses fosfato em
pentoses fosfato, suprindo o NADPH necessário na via biossintética, e uma fase não-
oxidativa, na qual as pentoses fosfato são convertidas em hexoses fosfato e trioses fosfato
(JEFFRIES, 1983). O gliceraldeído 3-fosfato e a frutose 6-fosfato são produzidos na fase
não oxidativa. Ambos podem ser convertidos a piruvato na via Embden-Meyerhof-Parnas,
ou glicólise. O piruvato pode ser descarboxilado e reduzido a etanol ou entrar no ciclo do
ácido cítrico. A via da pentose fosfato também é responsável pela geração de ribose 5-
fosfato, utilizada na síntese de ácidos nucléicos, e histidina e eritrose 4-fosfato, necessários
na síntese de aminoácidos aromáticos (WINKELHAUSEN e KUZMANOVA, 1998).
FIGURA 8 – Via fúngica do catabolismo de D-xilose e L-arabinose a etanol. Os números
destacados representam as enzimas da via metabólica. 1- aldose/xilose redutase; 2- L-
arabitol 4- desidrogenase; 3- L-xilulose redutase; 4- xilitol desidrogenase; 5- xilose
29
isomerase; 6- xilocinase; 7- L-arabinose isomerase; 8- L-ribulocinase; 9- L-ribulose-5-fosfato
4-epimerase; G-3P- gliceraldeído-3-fosfato; PPP- via da pentose fosfato (adaptado de van
MARIS et al., 2006)
Saccharomyces cerevisiae, a levedura utilizada em fermentações alcoólicas
industriais, fermenta eficientemente hexoses com elevados rendimentos e produtividades,
mas não tem a capacidade de metabolizar os polímeros (celulose e hemicelulose) e as
pentoses derivadas da hemicelulose (D-xilose e L-arabinose) presentes nos materiais
lignocelulósicos. No entanto, este parece permanecer como o micro-organismo escolhido
para a produção de etanol 2G, uma vez que tem uma tolerância a etanol muito superior à
verificada nos restantes micro-organismos referidos acima, bem como a inibidores presentes
após o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica (ALMEIDA et al., 2007).
Entretanto, foram já desenvolvidas várias estirpes recombinantes de S. cerevisiae
com capacidade de fermentar D-xilose, de hidrolisar celulose, de hidrolisar xilana e
fermentar a xilose resultante, ou a combinação da hidrólise e fermentação da celulose e
xilana (GÍRIO et al., 2010). Apesar de não ser ainda um processo eficiente, as melhores
linhagens recombinantes de S. cerevisiae contêm os genes XYL1 e XYL2 da levedura Sc.
stipitis, que codificam as enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH),
respectivamente (KOTTER et al., 1990; AMORE et al., 1991) ou o gene XylA de um fungo
anaeróbio do género Piromyces que codifica a enzima xilose isomerase (XI) (KUYPER et al.,
2005). Já as linhagem de S. cerevisiae capazes de hidrolisar celulose e/ou xilana expressam
celulases e hemicelulases, na sua maioria, de fungos filamentosos dos géneros Aspergilus
e/ou Trichoderma (VAN ZYL et al., 2007).
4.2 Aplicação de enzimas xilanolíticas na panificação
O pão é o alimento mais comum e tradicional no mundo (ESTELLER, 2004). O pão
está presente na vida do Homem desde os seus primórdios, porém, a sua produção era
rudimentar. Ao longo do tempo, a sua produção foi aperfeiçoada, ganhando novas formas,
formulações e processos. Os avanços tecnológicos permitiram a substituição ou a
agregação de ingredientes buscando uma melhor qualidade.
O trigo é o cereal mais importante em panificação, embora em algumas partes do
mundo o uso de centeio seja substancial (GOESAERT et al., 2005). Dentre as farinhas dos
diferentes cereais, apenas a do trigo tem a capacidade de formar uma massa viscoelástica e
as proteínas formadoras do glúten são as principais responsáveis por esta característica
30
(TEDRU et al., 2001). Todos os grãos contêm proteínas, mas somente a proteína do trigo
possui a habilidade de formar glúten, o qual constitui num filme elástico responsável pela
retenção do gás produzido durante a fermentação da massa e os primeiros estágios de
cozimento do pão e, consequentemente, pelo crescimento da mesma. Portanto, a habilidade
da farinha de trigo formar uma massa viscoelástica, requerida para a produção de pão,
depende amplamente das propriedades físico-químicas peculiares de suas proteínas,
particularmente das proteínas do glúten (PIZZINATO, 1999). As proteínas do trigo são
divididas em dois grupos, um deles formado pelas albuminas e globulinas (não formadoras
de glúten), e o outro, formado pela gliadina (alta extensibilidade e baixa elasticidade) e
glutenina (baixa extensibilidade e alta elasticidade) que são as proteínas formadoras do
glúten (HOSENEY, 1994). O glúten é constituído por uma massa viscoelástica tridimensional
que proporciona as características físicas e reológicas de plasticidade, viscosidade e
elasticidade importantes para a massa (WIESIR, 2007; COSTA et al., 2008).
A farinha geralmente consiste aproximadamente de 80% de amido, 12% de
proteínas, com conteúdo de arabinoxilana (AX) variando de 2-3% em farinha de trigo,
podendo chegar até a 5% em farinha de trigo integral e 8% em farinha de centeio (BAILLET
et al., 2003; GOESAERT et al., 2005). A arabinoxilana mesmo estando presente em
pequenas quantidades, é um ingrediente funcional extremamente importante, pois ela pode
se ligar à água dez vezes o equivalente ao seu peso, representando cerca de 30% da
capacidade de retenção da água da farinha de trigo e consequentemente exerce um efeito
significativo na farinha e também na qualidade da massa e do pão (COURTIN e DELCOUR,
2002; BAILLET et al., 2003).
A arabinoxilana em farinha de trigo tipicamente consiste de aproximadamente 20-
25% de uma fração solúvel em água (WEAX - water extractable arabinoxylans) e outra
fração não solúvel em água (WUAX - water unextractable arabinoxylans) (COURTIN e
DELCOUR, 2001; PRIMO-MARTÍN et al., 2005).
Em geral, considera-se que WUAX tem grande capacidade de retenção de água e
apresenta efeito negativo na qualidade da massa, ou seja, não melhora as características
reológicas da massa, enquanto WEAX apresenta propriedade de retenção das bolhas de
gás na massa e leva a soluções altamente viscosas, apresentando um efeito positivo
(aumento de volume e estrutura do miolo) na panificação (COURTIN et al., 2001; AUTIO,
2006). A natureza não solúvel em água de WUAX deve-se à combinação de interações não
covalentes e covalentes com moléculas adjacentes de AX e outros componentes da parede
celular, tais como proteínas e ou moléculas de celulose (VARDAKOU et al., 2003a).
Segundo WANG et al., (2003), WUAX interferem na formação de glúten, direta e
indiretamente. O efeito indireto está relacionado com a competição pela água e o direto,
com a interação entre WUAX e o glúten. Acredita-se que WUAX desestabilizam as bolhas
31
de gás por formarem barreiras físicas no glúten durante o desenvolvimento da massa e
absorverem uma grande quantidade de água, que fica indisponível para o desenvolvimento
do glúten resultando em diminuição do volume do pão (GOESAERT et al., 2005; AUTIO,
2006).
Vários modelos que descrevem os efeitos benéficos de xilanases em panificação têm
sido relatados e um deles está representado na FIG. 9, onde endoxilanases com
especificidade para WUAX despolimerizam essa fração e liberam água, a qual é ligada a
outros constituintes da farinha (HILLE e SCHOONEVELD-BERGMANS, 2004).
FIGURA 9 – Conversão da WUAX em WEAX pelas endoxilanases. Fonte: HILLE e
SCHOONEVELD-BERGMANS, (2004).
Devido a diferenças na especificidade ao substrato, modo de ação, interações com
inibidores e capacidades cinéticas nem todas as xilanases são efetivas na panificação. Na
verdade, atualmente considera-se que as mais adequadas nesse processo são aquelas que
agem sobre as frações não solúveis em água, solubilizando arabinoxilana, levando a perda
da capacidade de reter água e ao aumento da viscosidade (ROUAU et al., 1994; COURTIN
et al., 1999; SORENSEN, 2003; SORENSEN et al., 2004; VARDAKOU et al., 2003b). Essa
ação não somente remove a arabinoxilana insolúvel que interfere na formação da rede de
glúten na massa, como ainda, aumenta a estabilidade do sistema de massa devido ao
aumento da viscosidade. Por sua vez, obtém-se uma massa mais estável e flexível, de fácil
manuseio e melhor over spring (‘salto de forno’ – quando a massa ao crescer ultrapassa a
altura da borda da forma) e também um maior volume do pão e uma melhoria na estrutura
de miolo (mais fino e mais macio) (COURTIN et al., 1999; QI SI e DROST-
LUSTENBERGER, 2002; SORENSEN, 2003).
Os efeitos das xilanases são visíveis imediatamente após a mistura e continuam
durante o descanso, quando as propriedades viscoelásticas da massa mudam
significativamente (MARTÍNEZ-ANAYA e JIMÉNEZ, 1998). Níveis excessivos de xilanase
32
resultam em massas fracas e inconsistentes e pães com características indesejáveis no que
diz respeito à estrutura do miolo, distribuição de bolhas de gás e cor da crosta. Isso ocorre
devido à grande degradação de AX e conseqüentemente, à perda da capacidade de
retenção de água da massa (GOESAERT et al., 2005; HILHORST et al., 2002). Essa
pegajosidade interfere no processamento e, com isso, a massa requer maior cuidado na
manipulação (MARTÍNEZ-ANAYA e JIMÉNEZ, 1998).
33
APRESENTAÇÃO
Este trabalho partiu de isolados de leveduras de amostras de madeira e bagaço de cana-de-
açúcar em decomposição coletadas em florestas (Reservas e Parques Nacionais e
Reservas Privadas) e em usinas de álcool e açúcar (Estado de São Paulo, Minas Gerais e
Bahia) respectivamente. De um total de 358 isolados de levedura, obtidos em meio
enriquecido com xilose ou xilana, 75 apresentaram atividade de xilanase em meio sólido e
foram identificados. Essa parte inicial do trabalho, que inclui a coleta e processamento de
amostras e identificação destes isolados foi realizada por Cadete (2009) e Oliveira (2009) e
consta no Capítulo I. Estes isolados fazem parte da Coleção de Micro-organismos da
Universidade Federal de Minas Gerais e foram gentilmente cedidos para realização deste
trabalho.
A presente tese foi organizada em 4 capítulos que exploraram leveduras com capacidade de
produzir enzimas xilanolíticas e a aplicação destas enzimas na indústria biotecnológica,
principalmente, na produção de bioetanol de segunda geração e na panificação.
O Capítulo I é referente a um manuscrito aceito para publicação, em língua inglesa, à revista
Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology. Todo o isolamento, identificação,
seleção, produção e caracterização de leveduras produtoras de enzimas xilanolíticas foram
abordados neste capitulo. Nesta parte do trabalho, o fungo leveduriforme Aureobasidium
pullulans foi usado como referência para os ensaios enzimáticos, por ser já conhecido como
uma fonte de enzimas xilanases com alta atividade específica.
Por sua vez, no Capítulo II, a linhagem de A. pullulans UFMG-Bro-53 previamente isolada a
partir de água armazenada em bromélia e identificada como potente produtora de xilanase
em ensaio em placa (YNB-xilana) edepositada na coleção de culturas do Instituto de
Ciências Biológicas (ICB) da Universidade Federal Minas Gerais (UFMG) foi caracterizada
quanto à produção de enzimas xilanolíticas tendo como objetivo a sua potencial aplicação
biotecnológica em processo de hidrólise a temperaturas inferiores a 40ºC.
No Capítulo III, o extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 foi aplicado em
processos de hidrólise enzimática de hemicelulose em material lignocelulósico. O extrato
extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 foi avaliado na hidrólise da xilana e da palha de
trigo pré-tratada com ação individual e como suplementação a celulase comercial aplicadas
34
nesses mesmos substratos. Foi também validada a sua eficiência em processo de
sacarificação e fermentação simultânea (SSF) para a produção de etanol lignocelulósico
com uma levedura fermentadora de xilose, Spathaspora passalidarum UFMG-HMD-1.1.
O Capítulo IV aborda a aplicação do extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 em
processo de panificação. O efeito das xilanases do extrato do A. pullulans UFMG-Bro-53 no
volume do pão e na firmeza do seu miolo foi avaliado na produção de pão de forma.
35
CAPÍTULO I
Identification and characterisation of xylanolytic yeasts isolated
from decaying wood and sugarcane bagasse in Brazil
Carla A. Lara1,2,3, Renata O. Santos2, Raquel M. Cadete2, Carla Ferreira3, Susana Marques3,
Francisco Gírio3, Evelyn S. Oliveira1, Carlos A. Rosa2* & César Fonseca3
1 Departamento de Alimentos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, 31270-901 Brazil
2 Departamento de Microbiologia, ICB, C.P. 486, Universidade Federal de Minas Gerais,
Belo Horizonte, Minas Gerais, 31270-901, Brazil
3 Laboratório Nacional de Energia e Geologia, I.P., Unidade de Bioenergia, Estrada do Paço
do Lumiar 22, 1649-038 Lisboa, Portugal
*Corresponding author
E-mail: [email protected]
Telephone: +55 31 34092751 Fax: +55 31 34092739
Artigo publicado pela Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology
36
Abstract
In this study, yeasts associated with lignocellulosic materials in Brazil, including decaying
wood and sugarcane bagasse, were isolated, and their ability to produce xylanolytic
enzymes was investigated. A total of 358 yeast isolates were obtained, with 198 strains
isolated from decaying wood and 160 strains isolated from decaying sugarcane bagasse
samples. Seventy-five isolates possessed xylanase activity in solid medium and were
identified as belonging to nine species: Candida intermedia, C. tropicalis, Meyerozyma
guilliermondii, Scheffersomyces shehatae, Sugiyamaella smithiae, Cryptococcus diffluens,
Cr. heveanensis, Cr. laurentii and Trichosporon mycotoxinivorans. Twenty-one isolates were
further screened for total xylanase activity in liquid medium with xylan, and five xylanolytic
yeasts were selected for further characterization, which included quantitative analysis of
growth in xylan and xylose and xylanase and -D-xylosidase activities. The yeasts showing
the highest growth rate and cell density in xylan, Cr. laurentii UFMG-HB-48, Su. smithiae
UFMG-HM-80.1 and Sc. shehatae UFMG-HM-9.1a, were, simultaneously, those exhibiting
higher xylanase activity. Xylan induced the highest level of (extracellular) xylanase activity in
Cr. laurentii UFMG-HB-48 and the highest level of (intracellular, extracellular and membrane-
associated) -D-xylosidase activity in Su. smithiae UFMG-HM-80.1. Also, significant -D-
xylosidase levels were detected in xylan-induced cultures of Cr. laurentii UFMG-HB-48 and
Sc. shehatae UFMG-HM-9.1a, mainly in extracellular and intracellular spaces, respectively.
Under xylose induction, Cr. laurentii UFMG-HB-48 showed the highest intracellular -D-
xylosidase activity among all the yeast tested. C. tropicalis UFMG-HB 93a showed its higher
(intracellular) -D-xylosidase activity under xylose induction and higher at 30ºC than at 50ºC.
This study revealed different xylanolytic abilities and strategies in yeasts to metabolise xylan
and/or its hydrolysis products (xylo-oligosaccharides and xylose). Xylanolytic yeasts are able
to secret xylanolytic enzymes mainly when induced by xylan and present different strategies
(intra- and/or extracellular hydrolysis) for the metabolism of xylo-oligosaccharides. Some of
37
the unique xylanolytic traits identified here should be further explored for their applicability in
specific biotechnological processes.
Keywords: xylanases, xylanolytic yeasts, xylan, enzymes, lignocellulosic biomass
Introduction
The degradation of lignocellulosic biomass is complex because those materials are
composed of a rigid structure combining cellulose, hemicellulose and lignin (Sjöström 1993).
Cellulose and hemicellulose are polysaccharides. While cellulose is a homopolymer
composed of D-glucose units linked by β-1,4 glycosidic bonds, hemicellulose is usually
heterogeneous and its composition is dependent on the type of lignocellulosic material (Gírio
et al. 2010). The most abundant hemicellulose is xylan, which is found as arabinoxylan in
cereals and glucuronoxylan in hardwoods (Ebringevorá et al. 2005). In some of the tissues of
grasses and cereals, xylans can account for up to 50% of the biomass. Xylan consists of β-
1,4-linked D-xylose units with substituents such as acetyl, arabinosyl and glucuronosyl
residues (Sjöström 1993). While cellulolytic enzymes have been thoroughly studied,
manipulated and improved, xylanolytic enzymes have received less attention. Xylanolytic
enzymes are valuable for applications in the pulp and paper industry as well as the textile
and food sectors (Beg et al. 2001; Collins et al. 2005; Polizeli et al. 2005). Moreover, those
enzymes can be used in the hydrolysis of lignocellulosic biomass for the production of
second-generation bioethanol (Gírio et al. 2010) or other biofuels and biochemicals.
Xylanolytic enzymes include endo-1,4-β-xylanases, or simply xylanases (4-β-D-xylan
xylanohydrolase, EC 3.2.1.8), which cleave internal β-(1→4)-xylosidic linkages in xylan
backbone to yield xylo-oligosaccharides, and xylan 1,4-β-xylosidases, or simply β-
xylosidases (4-β-D-xylan xylanohydrolase, EC 3.2.1.37), which liberate D-xylose monomers
from the non-reducing end of xylo-oligosaccharides. Additional enzymatic activities, such as
α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, acetyl xylan esterases and phenolic acid
38
esterase, remove side-chain ramifications (Polizeli et al. 2005; Gray et al. 2006; Ryabova et
al. 2009).
Most research on this topic has been focused on xylanase-producing filamentous fungi (Sun
and Cheg 2002), as those microorganisms are known to be efficient enzyme producers. On
the contrary, only a limited number of studies have been performed with yeasts (Biely et al.
1980; Manzanares et al. 1999; Chavez et al. 2006; Bhadra et al. 2008; Romero et al. 2012).
Yeasts are commonly found in sugar-rich substrates, such as decaying lignocellulosic
biomass, including leaf detritus, rotten wood or agricultural and agro-industrial residues
(González et al. 1989; Middelhoven and Kurtzman 2007; Baldrian and Valaskova 2008;
Bhadra et al. 2008; Cadete et al. 2009, 2012; Morais et al. 2013a).
Yeasts have been studied by several authors due to their potential use in the production of
novel enzymes and chemicals (Satyanarayana and Kunze 2009). Saccharomyces
cerevisiae, which is widely used in industrial alcoholic fermentation and other
biotechnological processes, lacks the ability to hydrolyse lignocellulosic materials. However,
S. cerevisiae has been engineered to express genes from other microorganisms,
preferentially filamentous fungi, to perform direct conversion of cellulose and/or xylan to
ethanol (Fujita et al. 2004; Katahira et al. 2004) through the so-called Consolidated
Bioprocessing (CBP) (Gírio et al. 2010). On the contrary, some yeast strains are naturally
able to produce value-added products (e.g. triglycerides, lipids, pigments, alcohols, acids,
etc.) and simultaneously enzymes for the degradation of lignocellulosic materials, like
cellulases and/or xylanases, including those belonging to the genera Cryptococcus, Pichia,
Candida, Trichosporon, Dekkera, Hanseniaspora, Metschnikowia, Rhodotorula,
Sugiyamaella and Wickerhamomyces (Stevens and Payne 1977; Fall et al. 1984; Leathers
1986; Biely and Kremnický 1998; Fengxia et al. 2008; Carrasco et al. 2012; Romero et al.
2012; Morais et al. 2013a, 2013b). Those yeasts may represent a novel source of hydrolytic
enzymes with unique traits. The present study was conducted to identify novel yeast strains
present in decaying wood from forests and in sugarcane bagasse from sugar/1G ethanol
mills in Brazil. We aimed to select strains that are able to produce xylanolytic enzymes and to
39
characterise the xylanolytic profile of the best producers for potential application in
biotechnological processes.
Materials and Methods
Yeast Isolation
Yeasts were isolated from two sources of lignocellulosic biomass: decaying wood and
sugarcane bagasse. Sampling of decaying wood was carried out at six different sites
including the Private Reserve of the Sanctuary of Caraça and the National Park of Serra do
Cipó (Minas Gerais state, southeastern Brazil). This region consists of a zone of contact
between the ‘Cerrado’, the Atlantic Rain Forest and the ‘Caatinga’ ecosystems (Barbosa et
al. 2009; Cadete et al. 2009). Another sampling was performed in the Rio Doce State Park,
which is the largest preserved semi-deciduous Atlantic Rain Forest area found in Minas
Gerais state (Cadete et al. 2009). Samples were also collected at the Private Natural
Heritage Reserve of Woodstock and the Private Natural Heritage Reserve of Bello & Kerida,
two areas of Atlantic Rain Forest ecosystems located in the city of Nova Friburgo, Rio de
Janeiro state. The last sampling site was the Forest Reserve of Fazenda Bela Vista, close to
the municipality of Castanheiras, in the state of Rondônia - belonging to the Amazon Forest
biome. A total of eighty-nine decayed wood samples were collected in these areas between
2008 and 2009. The field collections were made according to the Brazilian diversity rules.
Decaying sugarcane bagasse samples were collected at 17 different sugar-ethanol plants in
northeastern and southeastern Brazil. Samples were collected in the municipalities of
Florestal, Esmeraldas, Betim and São Joaquim de Bicas (midwest region of Minas Gerais
state) and Salinas (northern region of Minas Gerais). Additionally, sampling was conducted
in the municipalities of Piracicaba (São Paulo state), São Fidelis (Rio de Janeiro state) and
Recife (Pernambuco, northeastern Brazil). The samples were collected at each point (middle
40
and surface), based on their depth in the accumulated bagasse. Ninety-five decaying
sugarcane bagasse samples were collected from the distilleries between 2008 and 2009.
All samples were stored in sterile plastic bags and transported under refrigeration to the
laboratory within 24 h. One gram of each sample was placed into Erlenmeyer flasks with 20
mL of sterile YNB-xylan medium [yeast nitrogen base, 6.7 g.L-1; beechwood xylan (Sigma),
10 g.L-1; chloramphenicol, 0.2 g.L-1; pH 5.0±0.5]. The flasks were incubated at 25˚C on an
orbital shaker at 150 rpm for 3-10 days. When growth was detected, 0.5 mL of the culture
was transferred to a tube containing 5 mL of sterile-YNB-xylan medium. The tubes were
incubated as described above. After growth detection, one loopful of each tube was streaked
on YNB-xylan agar plates. The plates were incubated at 25˚C until yeast colonies developed.
The different yeast morphotypes were purified by restreaking on yeast extract–malt extract
agar (YMA – glucose, 10 g.L-1; peptone, 5 g.L-1; yeast extract, 3 g.L-1; malt extract, 3 g.L-1;
agar, 20 g.L-1) and stored at -80˚C or in liquid nitrogen for later identification.
Preliminary plate screening of the xylanase-producing strains
One loopful of a pure and recent culture (24-48 h of growth) of each yeast isolate was diluted
in sterile distilled water. An aliquot of 50 μL of this solution was transferred to the centre of a
Petri dish containing xylan-agar medium (yeast nitrogen base, 6.7 g.L-1; xylan, 10 g.L-1; agar,
20 g.L-1; pH 5.0), and the plates were incubated at 25°C for 5 to 15 days. The xylanase-
producing isolates were identified based on the formation of a clear halo around the colonies,
as a result of hydrolysis of partial soluble xylan in the solid media (Teather and Wood 1982;
Bhadra et al. 2008).
Yeast Identification
Only the xylanase-positive isolates identified based on the plate-screening test were further
characterised. The yeasts were preliminarily grouped according to various characteristics,
41
including their colony morphology and standard tests for growth on different carbon and
nitrogen sources (Kurtzman et al. 2011). Physiology-based groupings were confirmed by
PCR fingerprinting using the Intron Splice Site primer EI-1 (5´CTGGCTTGGTGTATGT) (De
Barros-Lopes et al. 1996). Yeast strains with identical DNA banding patterns were grouped
and putatively considered to belong to the same species (Rosa et al. 2007; Cadete et al.
2012). At least one representative strain from each EI-1 PCR group was subjected to
sequence analysis of the D1/D2 region and internal transcribed spacer (ITS) domains of the
large subunit of the rRNA gene as described below. Physiologically distinct strains with
unique EI-1 PCR banding patterns were also selected for direct identification by sequencing
of the D1/D2 region and ITS domains. The D1/D2 and ITS domains were amplified by PCR,
directly from whole cells as previously described (Lachance et al. 1999). The amplified DNA
was concentrated, cleaned and sequenced in an ABI3130 (Life Technologies, USA)
automated sequencing system. The sequences were assembled, edited and aligned with the
program MEGA5 (Tamura et al. 2011). The existing sequences for other yeasts were
retrieved from GenBank.
Selection of the best xylanolytic strains
Isolates belonging to all of the xylanolytic species identified were further evaluated for
production of xylanase activity by growing in YNB-xylose medium (yeast nitrogen base, 6.7
g.L-1; D-xylose, 30 g.L-1) at 30ºC, 150 rpm, for 24 h, harvesting (by centrifugation at 2,600×g
for 15 min) and inoculating to an initial optical density at 600 nm (OD600nm) of 0.4 in YNB-
xylan medium. After 48 h at 30ºC and 150 rpm, the cells were separated by centrifugation,
and the xylanase activity was assayed in the cell-free supernatant, as described in the
enzymatic activities section. Yeast isolates showing the highest xylanase activity were
selected for further characterisation of the xylanolytic profile.
42
Cultivations in xylan and xylose and determination of specific growth rates
The yeast isolates with the highest xylanolytic activities were pre-grown in liquid medium
(initial pH of 5.0) in YNB-xylose medium, at 30ºC, 150 rpm, for 24 h and inoculated to an
initial OD600nm of 0.1 in two different media: 1) YNB-xylose (xylose 30 g.L-1) and 2) YNB-
xylan (xylan, 10 g.L-1). Yeast growth was followed spectrophotometrically at 600 nm and
specific growth rate was determined during the exponential growth phase. Although
Beechwood xylan is not fully soluble in aqueous medium, it was possible to follow the
OD600nm of yeast cells and to determine the specific growth rate in xylan. Experiments were
performed at least in duplicate.
Production and characterisation of xylanolytic enzymes
For the production and characterization of xylanolytic enzymes, the yeast isolates with the
highest xylanolytic activities were also pre-grown in liquid medium (initial pH of 5.0) in YNB-
xylose medium, at 30ºC, 150 rpm, for 24 h. After cells were harvested by centrifugation
(2,600×g for 15 min) and inoculated to an initial OD600nm of 3 to 4 in two different media: 1)
YNB-xylose (xylose 30 g.L-1) and 2) YNB-xylan (xylan, 10 g.L-1). The yeast cells were
cultivated in a 100-mL shake flask with 25 mL of medium at 30°C, 150 rpm, for 72 h. Cells
grown on xylose and xylan were harvested by centrifugation, and the cell-free supernatants
were used to determine the corresponding extracellular enzyme activities. To determine the
intracellular and membrane-associated β-D-xylosidase activities, cell pellets (0.6 g wet
mass) were collected in 2-mL Eppendorf tubes, and 1.0 mL Y-PER®- Yeast Protein
Extraction Reagent (Pierce) was added (Katz et al. 2003). The mixture was incubated for 1 h
at room temperature on an orbital shaker at 150 rpm. Crude cell-free extracts were obtained
by recovering the supernatants after spinning down the cell debris (Fonseca et al. 2007a)and
used to estimate intracellular enzyme activities. Crude extracts (without separation of cell
debris) were used to estimate the sum of membrane and intracellular enzyme activities. The
43
yeast-like fungus Aureobasidium pullulans NRRL Y-2311 was used as a positive control for
the enzyme assays using xylose or xylan as inducers under the same conditions.
Enzymatic activities
Xylanase was assayed according to Bailey et al. (1992) with a few modifications. The assay
mixture consisted of 100 µL of culture supernatant and 300 µL of a xylan (10 g.L-1)
suspension in 50 mmol.L-1 acetate buffer (pH 5.5). The mixture was incubated at 30 or 50°C
for 30 min followed by immediate chilling on ice. The amount of reducing sugars released
was determined using the dinitrosalicylic acid (DNS) method (Miller 1959). One unit of
enzyme activity was defined as the amount of enzyme required to release 1 μmol of reducing
sugars in 1 minute under the assay conditions. All enzymatic measurements were performed
in triplicate.
-D-Xylosidase activity was assessed by reaction of 50 µL of the appropriately diluted
enzyme solutions with 100 µL of 5 mmol.L-1 p-nitrophenyl--D-xylopyranoside (pNPX), as a
synthetic substrate, in 50 mmol.L-1 acetate buffer (pH 5.5). This reaction mixture was
incubated at 30 and 50°C for 30 min. The reaction was stopped by adding 150 µL of 1 mol.L-
1 Na2CO3, and the absorbance was measured at 410 nm. One unit (U) of -D-xylosidase
activity was defined as the amount of enzyme that liberated 1 µmol of p-nitrophenol per min
from pNPX. All enzymatic measurements were performed in triplicate.
Protein assay
The protein concentration was determined using the Bicinchoninic Acid (BCA) Protein
Quantitation Assay (Thermo Scientific - Pierce) with BSA as a standard. The specific enzyme
activities are given in units (U) per mg protein.
44
Results and discussion
Isolation and identification of xylanase-producing yeasts
A total of 358 yeast isolates were obtained in this study, with 198 isolated from decaying
wood collected in 6 Brazilian forests (National and State Parks and Private Reserves) and
160 isolated from decaying sugarcane bagasse samples collected at 17 Brazilian sugar-
ethanol plants. Among the 358 isolates, 75 (21%) were positive for xylanase activity in solid
medium. The xylanase-producing yeasts isolates were identified as 12 ascomycetous
isolates belonging to 5 species (Candida intermedia, Candida tropicalis, Meyerozyma
guilliermondii, Scheffersomyces shehatae and Sugiyamaella smithiae) and 63
basidiomycetous isolates belonging to 4 species (Cryptococcus diffluens, Cryptococcus
heveanensis, Cryptococcus laurentii and Trichosporon mycotoxinivorans) (Table 1).
Among ascomycetous strains, six were obtained from decaying wood and six were obtained
from decaying sugarcane bagasse samples. Scheffersomyces shehatae and M.
guilliermondii were the most frequent ascomycetous species found with xylanase activity,
and both were represented by four isolates each. Scheffersomyces shehatae is frequently
associated with lignocellulosic materials and is described as one of the best xylose-
fermenting yeast species (Toivola et al. 1984). This species was first described as a
xylanase-producer in the 1980s (Lee et al. 1986). More recently, xylanolytic isolates from this
species were found in decaying wood in Brazil (Morais et al. 2013a). In this study, M.
guilliermondii was isolated from sugarcane bagasse. This species has already been reported
in insect frass, flowers, fruits, soil, alcohol fermentation processes and clinical specimens
(Kurtzman 2011) and decaying wood (Cadete et al. 2012; Morais et al. 2013a). Previously
identified M. guilliermondii isolates obtained from decaying wood showed no xylanase activity
in plate assays (Morais et al. 2013a), but one hemicellulase, acetyl esterase, was found in
extracellular extracts of this species (Basaran and Hang 2000). In this study, xylanase-
producing M. guilliermondii was not the only species found in sugarcane bagasse; C.
tropicalis and C. intermedia isolates, obtained from sugarcane bagasse, also revealed
xylanase activity. These species are commonly associated with lignocellulosic materials
45
(Lachance et al 2011), and recent isolates have been obtained from decaying wood in Brazil
(Cadete et al. 2012; Morais et al. 2013a). Although C. tropicalis, C. intermedia and M.
guilliermondii have been thoroughly studied regarding pentose (D-xylose and L-arabinose)
utilisation (Granström et al. 2002; Gárdonyi et al. 2003; Fonseca et al. 2007b), these
ascomycetous species were not previously reported as xylanase-producers. These strains
show potential for biotechnological applications, namely as a source of genes for the
metabolic engineering of S. cerevisiae for the fermentation of lignocellulosic materials
(Fonseca et al. 2011a). In this study, Sugiyamaella smithiae obtained from decaying wood
was identified for the first time as a xylanase-producer. Recently, a new Sugiyamaella
species (Su. xylanolytica) revealing xylanolytic activity was also found in decaying wood
(Morais et al. 2013b).
Among the 63 basidiomycetous yeasts showing xylanase activity, 33 isolates were obtained
from decaying wood and 30 were isolated from decaying sugarcane bagasse. Cryptococcus
was the most frequently genus identified in this work, with 62 isolates related to three
species: Cryptococcus diffluens (albidus clade), Cr. heveanensis (heveanensis clade) and
Cr. laurentii (bulleromyces clade). Cryptococcus laurentii was the most frequently occurring
yeast species, with 31 isolates obtained from decaying wood samples and 29 from
sugarcane bagasse samples, while Cr. diffluens and Cr. heveanensis, both with only one
isolate each, were obtained from sugarcane bagasse. Strains belonging to the genus
Cryptococcus have already been reported in palm wine, soil, seawater, decaying wood, the
phyllosphere of grasses, wood sorrel and clinical sources (Fonseca et al. 2011b). Moreover,
several species from this genus are known xylanase producers (Biely et al. 1980; Leathers
1986; Lee et al. 1986; Parachin et al. 2009). Several Cryptococcus species are described as
able to grow using xylan as a substrate rather than cellulose (Jiménez et al. 1991),
suggesting specificity of their hydrolytic enzymes to hemicellulose. Trichosporon
mycotoxinivorans was the only xylanase-producing basidiomycetous yeast that does not
belong to the Cryptococcus genus. Yeast species of the genus Trichosporon were described
as able to hydrolyse both cellulose and xylan (Stevens and Payne 1977; Stüttgen and Sahm
46
1982). Specifically, the ability to produce xylanolytic enzymes by T. mycotoxinivoran was
also described by Thongekkaew et al. (2012). All the isolates from the species C. intermedia,
C. tropicalis, M. guilliermondii, Sc. shehatae, Su. smithiae, Cr. diffluens, Cr. heveanensis and
T. mycotoxinivorans and 7 (out of 60) isolates from Cr. laurentii (those showing the larger
halo of hydrolysis in xylan plates), in a total of 21 strains, were selected for quantitative
evaluation of xylanase activity.
Selection and quantitative characterisation of xylanolytic yeasts The 21 yeast isolates selected from the plate assay were characterised for their total
extracellular xylanase activity in liquid medium, after xylan induction for 48 h (Fig. 1). Among
the nine species described as xylanase producers, five representative yeasts were selected
based on the intraspecific highest extracellular xylanase activity: Cr. laurentii UFMG-HB-48,
Su. smithiae UFMG-HM-80.1, Cr. diffluens UFMG-HM-88.2, Sc. shehatae UFMG-HM-9.1a
and C. tropicalis UFMG-HB-93a. Isolates from species C. intermedia, M. guilliermondii, Cr.
heveanensis and T. mycotoxinivorans were not further studied due to their relatively low
xylanase activities.
The best xylanolytic yeasts were characterised in relation to their ability to growth in xylan as
sole carbon and energy source (Fig. 2) Moreover, the specific growth rates of these five
yeasts were determined both in xylan and xylose medium (Table 2). Although C. tropicalis
UFMG-HB-93a revealed the highest specific growth rate in xylose (0.41 h-1), it grew slowly in
xylan (0.03 h-1) and reached low cell density after 48h. On contrary, the other four yeasts
grew slower in xylose when comparing to C. tropicalis UFMG-HB-93a, but the specific growth
rate in xylan was higher (> 0.10 h-1) and more than 50% (0.11-0.15 h-1) of that determined in
xylose (0.18-0.27 h-1), reaching high cell densities (Fig. 2). In the case of Cr. diffluens UFMG-
HM-88.2 and Su. smithiae UFMG-HM-80.1, the specific growth rate in xylan (0.14 and 0.15 h-
1, respectively) was more that 75% of that determined in xylose (0.18 and 0.19 h-1,
respectively), which suggests that the metabolism of xylan and their hydrolysis products is
performed at similar rates. Apparently, these yeasts are specially adapted to the directly use
47
of xylan in their natural habitats, producing the appropriate amount and combination of
enzymes for complete xylan catabolism, i.e. hydrolysis of xylan into xylose and subsequent
intracellular xylose metabolism.
The xylanolytic profile of the five yeasts selected was further characterised in terms of
induction, by xylose or xylan, and the effect temperature on enzyme activity was also
evaluated at 30ºC and 50ºC, corresponding to the most common optimal temperature for
yeast growth and the typical optimal temperature of xylanolytic enzymes. Extracellular
xylanase volumetric activities were determined after 72 h (Table 3). All the yeasts tested
produced low amounts of extracellular enzymes using xylose as an inducer. Although the
activity level was one order of magnitude lower than the control (A. pullulans Y-2311 3 and
18 U.mL-1 at 30 and 50°C, respectively), three yeasts produced significant amounts of
xylanases using xylan as the inducer and showed higher activity at 50ºC than at 30ºC: Cr.
laurentii UFMG-HB-48 (1.16 U.mL-1/11.05 U.mg-1), Sc. shehatae UFMG-HM-9.1a (0.69
U.mL-1/4.63 U.mg-1) and Su. smithiae UFMG-HM-80.1 (0.50 U.mL-1/2.37 U.mg-1). These
yeasts were also those showing higher specific growth rates and cell densities in xylan
medium (Fig. 2, Table 2). The volumetric and specific xylanase activities were similar
between the best xylanolytic yeasts since they produce similar amounts of extracellular
protein (0.1-0.2 mg.mL-1). Under the conditions tested, Sc. shehatae UFMG-HM-9.1a
showed similar xylanase activities at 30ºC (0.52 U.mL-1) and 50°C. The xylanase activities
previously reported for Sc. shehatae are very low (< 0.05 U.mL-1) (Lee et al. 1986), one order
of magnitude lower than those found in this study. On the contrary, a specific strain of the
related species Scheffersomyces stipitis (CBS 5775) was identified as having relatively high
xylanase activity (2.4 U.mL-1) (Özcan et al. 1991). Sugiyamaella smithiae UFMG-HM-80.1
presented higher xylanase activity than the new species Su. xylanicola (0.15 U.mL-1) under
the same conditions, i.e., using xylan as an inducer (Morais et al. 2013b). Candida tropicalis
UFMG-HB-93a and Cr. diffluens UFMG-HM-88.2 produced negligible titers of xylanase
activity under both induction conditions. On the contrary, Cr. laurentii UFMG-HB-48 showed
the highest xylanase volumetric activity, which is far superior to the previously reported
48
residual activity for the same species (Lee et al. 1986), but it is far inferior to that reported for
the related species Cr. flavus (Parachin et al. 2009). Although xylanases are usually induced
by xylan, xylose, xylobiose or xylo-oligosaccharides (Kulkarni et al. 1999b; Polizeli et al.
2005; Kumar et al. 2008), in yeasts these enzymes have been shown to be better induced by
xylan than by xylose, as reported both here and in other studies with specific yeast strains
(Parachin et al. 2009, Morais et al. 2013b).
The selected yeasts were also evaluated in terms of their -D-xylosidase activity. This activity
was determined both in extracellular and intracellular spaces, as well as associated with
membrane, at 30 and 50ºC, using xylose or xylan as inducers (Fig. 3). Scheffersomyces
shehatae UFMG-HM-9.1a showed residual -D-xylosidase activity under xylose induction.
Additionally, C. tropicalis UFMG-HB-93a, Cr. diffluens UFMG-HM-88.2 and Su. smithiae
UFMG-HM-80.1, showed virtual absence of extracellular -D-xylosidase activity in xylose-
induced cultures. Cryptococcus laurentii UFMG-HB-48 was the only strain revealing
measurable extracellular -D-xylosidase activity with xylose induction, and it presented the
highest intracellular -D-xylosidase activity among the yeasts tested, with a specific activity
corresponding to 0.03 U.mg-1 protein. This activity in Cr. laurentii UFMG-HB-48
corresponded to the same order of magnitude as the control A. pullulans Y-2311 (0.05 U.mg-
1 protein). Interestingly, the -D-xylosidase activity in Cr. laurentii UFMG-HB-48 was mainly
intracellular in xylose-induced cells and mainly extracellular in xylan-induced cells (Fig. 3). In
a previous study, the related Cr. albidus showed mainly intracellular -D-xylosidase activity
(Biely et al. 1980). Sugyiamaella smithiae UFMG-HM-80.1 produced the highest -D-
xylosidase activities under xylan induction (Fig. 3a), with the enzyme(s) present in
intracellular and extracellular spaces, as well as in the membrane-associated.
Scheffersomyces shehatae UFMG-HM-9.1a presented a different pattern of total -D-
xylosidase distribution in xylan-induced cells, with mainly intracellular -D-xylosidase activity
(Fig. 3a). In Sc. stipitis CBS 5775, the -D-xylosidase activity was found to be mainly
extracellular (60%) (Özcan et al. 1991). Cryptococcus diffluens UFMG-HM-88.2 showed
49
intracellular -D-xylosidase activity in cells induced by xylose and low extracellular activities
in xylan-induced cells. The -D-xylosidase activity in C. tropicalis UFMG-HB-93a was mainly
intracellular and membrane associated in cells induced by both xylose and xylan. Candida
tropicalis UFMG-HB-93a was the only strain showing higher intracellular -D-xylosidase
activities at 30ºC than at 50ºC, under xylose induction. Most -D-xylosidase described have
optimal temperatures above 50ºC (Knob et al. 2010). However, one was recently found in
culture supernatants of xylan-grown Pichia membranifaciens, showing optimal activity at
35ºC (Romero et al. 2012).
This study describes the isolation of a large number of yeast isolates from decaying
lignocellulosic materials showing xylanase activities. The extracellular xylanase activities
reported for theses yeasts were low when compared to the activities found for filamentous
fungi (generally > 10 U.mL-1) (Haltrich et al. 1996; Shah and Madamwar 2005), including the
yeast-like fungus A. pullulans NRRL Y-2311 (control).
Ecological studies of fungi and yeasts during the natural decay of wood showed that the
yeast diversity is higher in partly delignified wood (González et al. 1989), and their growth is
most likely supported by the xylose liberated by the filamentous fungi (Jiménez et al. 1991).
However, several yeasts are able to secrete both endo-xylanases and -D-xylosidases to
use the products of xylan degradation as a sole carbon and energy source. The results
obtained show that the secretion of xylanolytic enzymes mainly occurs under xylan induction.
The -D-xylosidases, which cleave terminal D-xylose monomers from the non-reducing end
of xylo-oligosaccharides, of the yeasts studied were mainly intracellular. Yeasts can use
xylose and/or hydrolyse xylo-oligosaccharides to xylose extracellularly and/or transport those
xylo-oligosaccharides to the cytoplasm and convert them to xylose intracellularly (Krátký and
Biely 1980; Biely and Kremnický 1998; Kremnický and Biely 1998). The transport and
hydrolysis of xylo-oligosaccharides provides these yeast with a competitive advantage
against those that are only able to assimilate xylose as a carbon and energy source.
50
Despite the low level of xylanase activities detected, the production of these enzymes can be
further optimised, characterised and tested. Rather than looking for high volumetric activities,
the identification of unique traits such as optimal temperature of activity, specificity and high
stability, while having significant specific activity, may allow for potential biotechnological
application of these strains, such as for direct use in bread making, simultaneous
saccharification and co-fermentation processes for the production of biofuels and chemicals,
or their heterologous expression, e.g., in other yeasts such as S. cerevisiae, through
metabolic engineering or synthetic biology strategies, through the development of
consolidated bioprocessing (CBP) systems (Gírio et al. 2010).
Acknowledgements
Carla Lara thanks for the financial support from CAPES-PDEE (process 4716/11-6).
This work was co-funded by the European Commission in the framework of EU-Brazil Project
ProEthanol2G - “Integration of Biology and Engineering into an Economical and Energy-
Efficient 2G Bioethanol Biorefinery” (FP7-251151), by Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq, process no 551392/2010-0, 551245/2010-
7 and 560715/2010-2), the Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP, process number
2084/07), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) and
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP/BIOEN/FAPEMIG).
51
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Table 1 - Identification and occurrence of positive xylanase -producing yeast species
screened in solid medium in relation to the sampled substrate.
Species Number isolates/substrate
Total of
isolates
Decaying
wood
(HM)1
Decaying
sugarcane bagasse
(HB)2
Ascomycetous
Candida intermedia - 1 (S/E-SP) 1
Candida tropicalis - 1 (S/E-SP) 1
Meyerozyma guilliermondii - 4 (S/E-MG) 4
Scheffersomyces shehatae 4 (2 C-MG; 2 W-RJ) - 4
Sugiyamaella smithiae 2 (FBV-RO) - 2
Basidiomycetous
Cryptococcus diffluens 1 (FBV-RO) - 1
Cryptococcus heveanensis 1 (RD-MG) - 1
Cryptococcus laurentii
31
3 (2 SC-MG; 1RD-
MG)
29
4 (3 S/E-MG;
1 S/E-SP)
60
(7)*
Trichosporon
mycotoxinivorans - 1 (S/E-MG) 1
1 C-MG – Caraça, Minas Gerais; SC-MG – Serra do Cipó, Minas Gerais; RD-MG – Rio Doce, Minas Gerais; W-RJ – Woodstock, Rio de
Janeiro; FBV-RO – Fazenda da Bela Vista, Roraima.
2 .S/E-MG – Sugar/etanol plant, Minas Gerais; S/E-SP – Sugar/etanol plant, São Paulo.
* Only 7 out 60 Cr. laurentii isolates were further screened in liquid medium containing xylan (1%) (see Fig. 1).
Table 2 – Specific growth rates of yeasts cultivated in xylan (1%) or xylose (3%) as sole
carbon and energy source, at 30ºC.
Strains Growth rate (h
-1)
Xylan Xylose
C. tropicalis UFMG-HB 93a 0.03 ± 0.00 0.41 ± 0.03
Cr. diffluens UFMG-HM 88.2 0.14 ± 0.00 0.18 ± 0.00
Cr. laurentii UFMG-HB 48 0.15 ± 0.01 0.27 ± 0.02
Sc. shehatae UFMG-HM 9.1a 0.11 ± 0.01 0.18 ± 0.01
Su. smithiae UFMG-HM 80.1 0.15 ± 0.00 0.19 ± 0.01
57
Table 3 – Yeast extracellular xylanase volumetric and specific activities (at 30 and 50ºC)
after incubation at 30°C, for 72 h, using xylose or xylan as inducer.
Volumetric activity (U mL-1
) Specific activity (U mg-1
)
Strains
Inducer Inducer
Xylan Xylose Xylan Xylose
Temperature of reaction (°C) Temperature of reaction (°C)
30 50 30 50 30 50 30 50
C. tropicalis UFMG-HB 93ª
0.01 ±0.00d 0.01 ±0.00
d 0.0 ± 0.00 0.0 ± 0.00
0.01 ± 0.00e 0.0 ± 0.02
e 0.01 ± 0.00
b 0.01 ±0.00
b
Cr. diffluens UFMG-HM 88.2
0.01 ±0.01d 0.03 ±0.01
d 0.01 ± 0.00 0.01 ± 0.01
0.03 ± 0.03e 0.09 ± 0.04
e 0.02 ± 0.02
b 0.04±0.03
ab
Cr. laurentii UFMG-HB 48
0.58±0.02bc
1.16 ±0.04a 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00
5.50 ± 0.20b 11.05 ±0.39
a 0.00 ± 0.00
b 0.00 ± 0.00
b
Sc. shehatae UFMG-HM 9.1a
0.52 ± 0.18bc
0.69 ±0.19b 0.00 ± 0.00 0.02 ± 0.01
3.51±1.46bcd
4.63 ±1.59bc
0.00 ± 0.00b 0.01 ±0.00
b
Su. smithiae UFMG-HM80.1
0.30 ± 0.00cd
0.50±0.04bc
0.02 ± 0.02 0.02 ± 0.01
1.44 ± 0.02de 2.37 ±0.15cde
0.07 ±0.07ab
0.20 ± 0.09a
Comparing the average volumetric activity induced by xylan, the same letter indicates no significant difference
at the level of 5% probability through the Tukey test. Comparing the average of the specific activities induced by
xylan and xylose in the same column, the same letter indicates no significant difference at the level of 5%
probability by Tukey test.
58
Figure 1 – Extracellular xylanase volumetric activities determined at 50ºC after induction by
xylan in liquid medium at 30°C for 48 h.
59
Figure 2 – Yeast growth in xylan (1%) medium at 30ºC. Symbols: , C. tropicalis UFMG-
HB 93a; , Cr. diffluens UFMG-HM-88.2; , Cr. laurentii UFMG-HB-48; , Su. smithiae
UFMG-HM-80.1; , Sc. shehatae UFMG-HM-9.1a.
60
Figure 3 – 1,4--D-Xylosidase total activity (U) and its cellular localisation after incubation
at 30°C, for 72 h using xylan (A) or xylose (B) as an inducer (total of 25 mL medium). Black
bars, extracellular activity; Gray bars, membrane-associated activity; White bars, intracellular
activity.
61
CAPÍTULO II
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATO EXTRACELULAR
DE Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53: ATIVIDADE
XILANOLÍTICA COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
RESUMO
O fungo leveduriforme Aureobasidium pullulans é uma promissora fonte de enzimas
xilanases com alta atividade específica a temperaturas entre 35ºC e 50ºC. Uma linhagem
dessa espécie foi isolada a partir de água armazenada em bromélia e identificada como
potente produtora de xilanase em ensaio em placa (YNB-xilana). Esta linhagem foi
depositada na coleção de culturas do ICB (UFMG), designada por A. pullulans UFMG-Bro-
53 e utilizada neste estudo de produção de enzimas xilanases. Como referência, foi usada a
linhagem A. pullulans Y-2311, cuja caracterização, em relação ao seu sistema xilanolítico,
está documentada na literatura. A linhagem A. pullulans UFMG-Bro-53 caracteriza-se por
apresentar uma maior atividade volumétrica a 30°C comparativamente com A. pullulans Y-
2311. O extrato desta linhagem apresentou atividade máxima a uma temperatura de 40°C e
pH na faixa 4,0-4,5. A fração mais abundante do extrato possui massa molar de 22 kDa. Das
frações purificadas, esta fração é a que apresenta uma atividade ótima a uma temperatura
de 40°C e pH na faixa 4,0-4,5. A atividade β-xilosidase é ótima a 80ºC e pH 4,0-5,0 e
apresenta grande estabilidade a temperaturas moderadas (45ºC). Por ser um extrato com
atividade essencialmente xilanolítica e por ter uma atividade específica relativamente alta a
30ºC, o extrato da A. pullulans UFMG-Bro-53 possui potencial biotecnológico para aplicação
na indústria de biocombustíveis e de alimentos, nomeadamente na produção de bioetanol
2G, com valorização integral dos carboidratos (celulose e xilana), e no setor de panificação.
Palavras-chave: xilanases extracelulares, Aureobasidium pullulans, fracionamento de
xilanases, aplicações biotecnológicas de xilanases.
62
1 INTRODUÇÃO
A xilana é um heteropolímero com ligações glicosídicas β-1,4 entre resíduos de D-
xilose que pode ainda conter resíduos de L-arabinose, D-ácido glucurônico e/ou 4-O-metil-
D-ácido glucurônico (PULS e SCHUSEIL, 1993). Este heteropolímero é o mais abundante
componente da maioria das hemiceluloses, constituindo 20 a 30% da massa seca de
resíduos agrícolas (DETROY, 1981) sendo também encontrado em hardwood (POLIZELI et
al., 2005). A xilana consiste em um substrato insolúvel e é hidrolisável química ou
bioquimicamente, respectivamente por ácidos ou por múltiplas enzimas, normalmente de
origem microbiana, especialmente de fungos filamentosos e bactérias, sendo uma fonte de
carbono e energia para uma variedade de micro-organismos. Durante a hidrólise da xilana,
as endo-1,4-β-xilanases quebram ligações internas na cadeia principal liberando
oligossacarídeos de cadeias menores, as β-xilosidases agem na xilobiose liberando xilose.
Muitos fungos e bactérias secretam múltiplas isoenzimas de xilanases como produto de
genes distintos. Fungos como Trichoderma reesei (TANGNU et al, 1981) e Aspergillus niger
(FREDERICK, 1985) são conhecidos produtores de enzimas hidrolíticas capazes de atuar
em polissacarídeos, como as celulases. Além de celulases estes fungos filamentosos
produzem hemicelulases, muitos dos quais possuem ampla afinidade para substratos, os
quais podem incluir xilana (TODA et al., 1971). Essas celulases, muitas vezes, devem ser
removidas de extratos enzimáticos para certas aplicações industriais (TAN et al., 1987). No
entanto, existem alguns micro-organismos, como o fungo leveduriforme Aureobasidium
pullulans, que produzem xilanases livre de celulases (BIELY et al., 1985).
Aureobasidium pullulans é um saprófito que ocasionalmente ocorre em superfície de
plantas, sendo descrito como produtor de xilanases com alta atividade específica e com
temperatura ótima entre 35ºC e 50ºC (Leathers, 1986). Existem linhagens com variantes de
cor (‘color variant’), produzindo pigmentos brilhantes de cor vermelha, amarela, laranja ou
roxo em vez de aparência esbranquiçada de algumas linhagens, que depois se torna negra
(WICKERHAM e KURTZMAN 1975). Por esta última razão, estes micro-organimos
pertencem a um grupo conhecido como ‘leveduras negras’ (‘black yeasts’) (STERFLINGER,
2006).
Este fungo leveduriforme, devido à sua capacidade de produzir xilanases com
elevada atividade específica e especificidade de substrato, tem sido estudado para
aplicação no branqueamento de polpa de papel (YANG et al., 1992). Outras aplicações
biotecnológicas de xilanases a temperaturas inferiores a 40ºC incluem processos de
panificação (COLLINS et al., 2005) e produção de bioetanol lignocelulósico por sacarificação
e co-fermentação simultâneas (GÍRIO et al., 2010).
63
A linhagem A. pullulans UFMG-Bro-53, que faz parte da coleção de micro-
organismos da Universidade Federal de Minas Gerais, revelou ter uma atividade xilanolítica
elevada quer a 30ºC quer a 50ºC. O objetivo deste capítulo foi caracterizar e extrato
extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53. Os extratos extracelulares de A. pullulans UFMG-
Bro-53 foram produzidos e, numa primeira fase, comparados com A. pullulans NRRL Y-
2311. O objetivo deste estudo foi: I- caracterizar o extrato extracelular de A. pullulans
UFMG-Bro-53 e analisar o perfil de temperatura e pH; II- avaliar a especificidade e
estabilidade térmica das suas atividades xilanase e beta-xilosidase; III- fracionar o extrato e
caracterizar as suas enzimas xilanolíticas purificadas. A elevada atividade xilanolítica a
temperaturas entre 30ºC e 40ºC, e especificidade, realça o potencial biotecnológico do
extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Micro-organismos e manutenção de culturas
A linhagem A. pullulans UFMG-Bro-53, previamente isolada de água, armazenada em
folhas de bromélia, pertence à coleção de culturas de micro-organismos do Instituto de
Ciências Biológicas (ICB), Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte,
Brasil. A linhagem A. pullulans NRRL Y-2311, usada como referência, foi obtida pelo
Laboratório Nacional de Energia e Geologia, I.P. (LNEG), Lisboa, Portugal, através de
requisição à Colecção de Culturas (NRRL) do Agriculture Research Service (ARS), United
States Department of Agriculture (USDA), Estados Unidos da América.
As linhagens de A. pullulans foram mantidas em caldo GYMP (glicose 20 g L-1; extrato
de levedura 5 g L-1; extrato de malte 10 g L-1; Na2PO4 2 g L-1) com 200 g L-1 de glicerol a -
80ºC e reativadas em meio sólido com extratos de malte e de levedura (YMA – glicose 10 g
L-1; extrato de levedura 3 g L-1; extrato de malte; peptona 5 g L-1; ágar 20 g L-1).
2.2 Produção de extratos extracelulares com atividade xilanolítica
As células foram pré-cultivadas em meio líquido (pH inicial 5,0) contendo YNB-D-
xilose (yeast nitrogen base, 6,7 g L-1; xilose 30 g L-1) a 30°C e agitação de 150 rpm por 24
64
horas. No final do cultivo, a cultura foi centrifugada (2,600×g por 15 min), as células
coletadas e inoculadas a uma DO600nm de 4 em meio YNB-xilana (yeast nitrogen base, 6,7 g
L-1; xilana, 10 g L-1). A produção de enzimas xilanolíticas foi induzida em frascos
Erlenmeyers 100-mL com 25 mL de meio de cultura a 30°C, 150 rpm, por 72 h e ao final o
extrato enzimático foi coletado por centrifugação, e usado para determinar as atividades
enzimáticas extracelulares.
2.3 Ensaios enzimáticos e quantificação de proteína
A atividade xilanase foi determinada de acordo com BAILEY et al. (1992) com
algumas modificações. A mistura reacional consistiu de 100 µL de sobrenadante da cultura e
300 µL de suspensão de xilana (10 g L-1) em 50 mmol L-1 de tampão acetato (pH 5,5). A
mistura foi incubada a 30 ou 50°C por 30 minutos. A reação foi interrompida pela adição de
600 µL do reagente do DNS sendo a mistura fervida durante 5 minutos. As amostras foram
resfriadas em banho de gelo e a absorvância lida a 540 nm em espectrofotômetro (MILLER,
1959). Uma unidade de atividade de enzima (U) foi definida como a quantidade de enzima
requerida para liberar 1 μmol de açúcares redutores em 1 minuto sobre condições definidas
do ensaio. Todas as medidas enzimáticas foram realizadas em triplicatas e em, pelo menos,
duas diluições distintas, sendo uma diluição duas vezes maior.
A atividade -D-xilosidase foi determinada pela reação de 50 µL de solução de
enzima, adequadamente diluída, com 100 µL de p-nitrofenil--D-xilopiranósido (pNPX) (5
mmol L-1), substrato sintético, em 50 mmol L-1 de tampão acetato (pH 5.5). Essa mistura
reacional foi incubada a 30 e 50°C por 30 min. A reação foi paralisada pela adição de 150 µL
de Na2CO3 (1 mol L-1) (LI et al., 1993), e a absorvância foi medida a 410 nm. Uma unidade
(U) de atividade -xilosidase enzima (U) foi definida como a quantidade de enzima requerida
para liberar 1 μmol de p-nitrofenol em 1 minuto a partir do pNPX. Todas as medidas
enzimáticas foram realizadas em triplicatas e em duas diluições distintas.
A atividade sobre papel de filtro (FPase), descreve a atividade total celulolítica e foi
determinada pela liberação de açúcares redutores a partir de papel de filtro Whatman n°1
(aproximadamente 50 mg) como substrato, após incubação durante 30 minutos a 30 e 50°C.
Os açúcares redutores foram determinados pelo método do ácido dinitrosalicílico (DNS)
(Miller, 1959) e medida absorvância a 540 nm.
A atividade de protease foi determinada pela incubação de 1mL de 2.5% de
azocaseína, preparada em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0 e 1 mL de extrato enzimático
diluído adequadamente a 30ºC por 30 minutos, paralisando a reação com 8 mL de 5% TCA,
centrifugação a 15,000x g por 5 minutos. Foi adicionado 5,0 mL de solução KOH a 0,5
65
mol/mL e em seguida foi medida a absorvância a 445 nm (CHARNEY e TOMARELLI et
al.,1949).
A concentração de proteína foi determinada usando os métodos: ácido
bicinconínico (BCA) Protein Quantitation Assay (Thermo Scientific - Pierce) ou Bradford
(BRADFORD 1976), com soro de albumina bovina (BSA) como padrão. A atividade de
enzima específica foi expressa em unidades (U) por mg de proteína.
2.4 Fracionamento de extrato extracelular com base em atividades xilanolíticas
Um maior volume de extrato foi produzido como descrito na seção 2.2 Produção de
extratos extracelulares com enzimas atividade xilanolíticas, exceto para o período de
indução, que durou 48 h, por não se encontrarem diferenças significativas nas atividades
xilanolíticas entre 48 e 72 h de incubação. O extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-
53 foi então submetido ao processo de fracionamento. Todos os procedimentos de
fracionamento foram realizados a 4°C.
A cultura de A. pullulans UFMG-Bro-53 foi centrifugada a 2,600×g por 15 minutos. O
sobrenadante (400 mL) foi concentrado por ultrafiltração (usando uma membrana de 3 kDa)
até um volume final de 55 mL. O sobrenadante concentrado foi dialisado contra tampão
acetato de sódio 20 mM (pH 5,5) e então aplicado a uma coluna Resource Q (GE
Healthcare) previamente equilibrada com tampão acetato de sódio 20 mM (pH 5,5). As
proteínas adsorvidas foram eluídas em gradiente linear de NaCl (0-1 M) no mesmo tampão
a um fluxo de 4 mL min-1. A atividade de xilanase foi encontrada na fração que não foi
adsorvida pela coluna e também em amostras eluídas. Esta fração não adsorvida pela
coluna foi submetida a uma coluna Mono S (GE Healthcare) que havia sido equilibrada com
tampão acetato de sódio 20 mM (pH 5,0). A eluição foi realizada em um gradiente linear (0-1
M) no mesmo tampão, com um fluxo de 1 mL min-1. A atividade de xilanase foi encontrada
na fração não adsorvida pela coluna e também nas frações eluídas. As xilanases adsorvidas
foram reunidas, dialisadas e aplicadas a uma segunda coluna Mono S. A eluição foi
realizada como previamente descrita.
A pureza das frações finais de proteínas foi analisada por eletroforese em gel de
poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) (10% poliacrilamida) de acordo com o
método de LAEMMLI (1970). Depois da eletroforese, as proteínas foram coradas com Azul
brilhante de Coomassie R-250.
66
2.5 Efeito da temperatura e pH e estabilidade das enzimas xilanolíticas
O extrato bruto de A. pullulans UFMG-Bro-53 e a fração mais abundante foram
usados para determinar a temperatura e o pH ótimo das enzimas xilanolíticas. A
temperatura ótima das atividades xilanolíticas (xilanase e β-xilosidase) foi determinada em
temperaturas que variaram de 20 a 90°C, em tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,5. Para
a determinação do pH ótimo, usou-se tampão acetato de sódio 50 mM e tampão fosfato de
sódio 50 mM, variando o pH entre 3,0 e 8,0, a 40°C no caso da atividade de xilanase e a
70ºC no caso da β-xilosidase. A estabilidade térmica da enzima foi avaliada pela incubação
do extrato bruto do A. pullulans-UFMG-Bro-53 em tampão acetato de sódio 50 mM pH 4,8, a
45°C. No caso da atividade de xilanase, a estabilidade foi avaliada também incubando na
presença de substrato (suspensão de xilana Beechwood 10 g L-1) a pH 4,8 e 45°C. Foram
obtidas alíquotas ao fim de 0, 6, 12, 24, 48 e 72 h, que foram congeladas para posterior
determinação das atividades residuais.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Produção de enzimas xilanases extracelulares por Aureobasidium pullulans
UFMG-Bro-53
A produção de enzimas xilanolíticas por A. pullulans UFMG-Bro-53 foi testada, por
comparação com uma linhagem descrita na literatura como produtora de xilanases (A.
pullulans Y-2311), em meio contendo xilana como substrato indutor, a pH inicial igual a 5,5 e
a uma temperatura de 30ºC. Os extratos extracelulares de enzimas xilanolíticas foram
caracterizados a 30 e 50ºC para atividade de xilanase (FIG. 1).
67
A B
FIGURA 1 – Efeito da temperatura na atividade xilanase em extratos extracelulares das
linhagens de A. pullulans UFMG-Bro-53 e Y-2311, após indução por xilana. Atividade
volumétrica (A) e atividade específica (B). Proteína quantificada pelo método BCA. As barras
de erros representam os desvios-padrão dos respectivos valores.
O extrato xilanolítico extracelular da linhagem A. pullulans Y-2311 apresentou uma
atividade volumétrica a 50ºC cerca de 2-3 vezes superior da determinada a 30ºC (17,9 e 6,7
U mL-1, respectivamente), enquanto que o extrato de A. pullulans UFMG-Bro-53 apresentou
atividades xilanases semelhantes às duas temperaturas (21,7 U mL-1, FIG. 1 A). Ao
determinar a proteína total nos extratos extracelulares de A. pullulans UFMG-Bro-53 e A.
pullulans Y-2311, verificou-se que no primeiro a proteína era inferior (0,81 mg mL-1 e 1,24
mg mL-1, respectivamente), sendo que a atividade específica de xilanase foi claramente
maior em A. pullulans UFMG-Bro-53 (FIG. 1 B). A atividade xilanase determinada a 50ºC
para A. pullulans Y-2311 foi significativamente inferior à relatada na literatura (LEATHERS,
1986), tanto as condições de determinação de atividade usadas no presente trabalho (pH
5,5 em vez de 5,0), quanto as condições de indução (relativo à quantidade de inóculo usado
no período de indução) foram diferentes das relatadas por LEATHERS (1986). As condições
ótimas de atividade xilanase de A. pullulans UFMG-Bro-53 foram determinadas na seção
seguinte.
3.2 Caracterização das enzimas xilanolíticas do extrato extracelular de Aureobasidium
pullulans UFMG-Bro-53
O extrato extracelular da A. pullulans UFMG-Bro-53 foi usado para a determinação
da temperatura e pH ótimos das atividades de xilanase e β-xilosidase. Verificou-se que as
68
atividades xilanolíticas obtidas ao final de 48 e 72 h não variavam significativamente, tanto a
30ºC quanto a 50ºC, e os ensaios seguintes foram realizados com o extrato extracelular de
A. pullulans UFMG-Bro-53 após 48 h de indução com xilana.
O perfil de temperatura e pH de atividade de xilanase foi realizado de 20 a 90ºC e pH
3 a 8, respectivamente (FIG. 2). A xilanase do extrato mostrou atividade máxima a 40°C
(FIG. 2 A), com mais de 70% de atividade presente a 30 e 50°C. Contudo, a atividade da
xilanase diminuiu significativamente abaixo de 30°C e acima de 50°C, chegando a zero a
partir de 70ºC, isso pode ser explicado pela inativação térmica da(s) enzima(s) acima desta
temperatura. A xilanase exibiu atividade máxima a uma faixa de pH 4,0 a 4,5 (FIG. 2 B),
decrescendo significativamente a pH mais ácido ou mais alcalino. Um decréscimo de mais
de 60% relativamente à atividade máxima foi observado a pH 5,5, pH usado nos ensaios
anteriores.
A B
FIGURA 2 – Perfil de atividade xilanase em diferentes temperatura (A) e pH (B) do extrato
extracelular de A.pullulans UFMG-Bro-53, após 48 h de indução em meio contendo xilana. A
determinação da temperatura foi efetuada a pH 5,5 e a determinação de pH a 40ºC.
Os efeitos de temperatura e pH do extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53
foram similares ao relatados por LEATHERS (1986), que descreveu uma atividade de
xilanase ótima num intervalo de temperatura entre 35 e 50°C e pH entre 4,0 e 4,5. No
entanto, a 30ºC, a atividade de xilanase das linhagens de A. pullulans estudadas foi inferior
e correspondeu a 80% da atividade a 50ºC (LEATHERS, 1986). Já o perfil de temperatura
típico de xilanases aponta para 50ºC, ou superior, como a temperatura ótima de xilanases
mesofílicas (COLLINS et al., 2005).
69
A atividade de β-xilosidade foi também caracterizada no extrato extracelular de
A.pullulans UFMG-Bro-53, tendo sido determinada atividade ótima a 80°C e o pH 4,0 (FIG.
3).
A B
FIGURA 3 – Perfil de atividade de β-xilosidase em diferentes temperatura (A) e pH (B) do
extrato extracelular de Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53, após 48 h de indução em
meio contendo xilana. O ensaio de temperatura foi efetuado a pH 5,5 e o ensaio de pH a
70ºC.
A temperatura e pH ótimos encontrados para a atividade de β-xilosidase no extrato
extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 (80ºC e pH 4,0) estão de acordo com aqueles
valores encontrado nos extrato extracelular em A. pullulans CBS 58475 (80ºC e pH 4,5)
(DOBBERSTEIN e EMEIS, 1991) com valores de atividade máxima em culturas de xilana de
0,04 e 0,20 U mL-1, respectivamente. As atividades de β-xilosidase descritas em fungos
apresentam, em geral, temperaturas ótimas de atividade superiores às das endo-xilanases,
usualmente a 60ºC ou acima (KNOB et al., 2010).
Com o objetivo de avaliar o potencial biotecnológico do extrato extracelular de A.
pullulans UFMG-Bro-53 quanto às suas atividades xilanolíticas, foram efetuados estudos de
especificidade e estabilidade do extrato.
O extrato não apresentou atividade celulolíticas, por determinação de atividade de
FPase, nem atividade proteolíticas. Os extratos de A. pullulans foram descritos como livres
de celulase (LEATHERS 1986), podendo ser aplicados na hidrólise seletiva de
hemiceluloses, com aplicações relevantes na indústria de polpa e papel, no branqueamento
da polpa (YANG et al., 1992) ou, na indústria da panificação, quando este extrato não
apresentar atividade proteolíticas (COLLINS et al., 2005). A estabilidade térmica da xilanase
70
foi efetuada na ausência e na presença de substrato (xilana), a 45°C, pH 4,8 por 72 h (FIG.
4), condições usadas em processos de hidrólise enzimática de biomassa (ver Cap III). A
amostra no tempo inicial (t=0) não foi incubada a 45°C, e sua atividade enzimática neste
tempo foi considerada como 100%. O ensaio de estabilidade indicou que a enzima xilanase,
na ausência de substrato, perde grande parte (mais de 60%) da atividade logo nas primeiras
6 h de incubação (FIG. 4 A). No entanto, na presença do substrato xilana (FIG. 4 B),
apresentou uma estabilidade térmica acima de 80% da atividade máxima até às 12 h de
incubação, sendo a perda da atividade relativamente linear ao longo do tempo, e no final de
72 h, semelhante à observada na ausência de xilana logo ao fim de 6 h de incubação (FIG.
4 A).
A B
FIGURA 4 – Ensaio de estabilidade da atividade xilanase em extrato extracelular de
Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53, por incubação durante 72 horas, a 45ºC, pH 4.8
(tampão acetato), na ausência (A) ou na presença de substrato (xilana) (B).
Foi ainda determinada a estabilidade da atividade de β-xilosidase no extrato
extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53, a 45°C, pH 4,8, por 72 h (FIG. 5). Ao contrário da
atividade de xilanase, a atividade de β-xilosidase demonstrou grande estabilidade a 45ºC,
mantendo-se acima dos 80% da atividade máxima durante as 72 h de experimento.
71
FIGURA 5 – Ensaio de estabilidade da atividade de β-xilosidase em extrato extracelular de
Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53, por incubação durante 72 horas, a 45ºC, pH 4,8
(tampão acetato).
3.3 Fracionamento do extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53
De forma a identificar as diferentes enzimas responsáveis pelas atividades
xilanolíticas determinadas, o extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 foi fracionado
por cromatografia iônica e as atividades xilanolíticas das frações foram determinadas a 30 e
50 ºC – FIG. 6, TAB. 1; Apêndice 1.
O extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 apresentou uma proteína de
aproximadamente 22 kDa como a mais abundante (FIG. 6 A), o que, de acordo com estudos
com outras linhagens de A. pullulans (LEATHERS 1986, 1988; MYBURGH et al., 1991; LI et
al., 1993), poderá ser responsável pela atividade de xilanase ótima a temperaturas entre 35
e 50ºC.
72
A
B
C
FIGURA 6 – SDS-PAGE (10% poliacrilamida) das frações do extrato extracelular do A.
pullulans UFMG-Bro-53. As proteínas foram coradas com o azul brilhante de Coomassie R-
250. (A) M – padrões de peso moleculares, Extrato, Flow-through (FT), frações (1 a 6) da
coluna Resource Q. (B) Frações (7 a 10, 12 e 14) da coluna Resource Q. (C) Flow-through
(proteína mais abundante – 22 kDa) e frações (7 a 11) da coluna Mono S. As amostras
73
foram padronizadas em relação à quantidade de proteína (BRADFORD, 1976) (2,5 µg por
amostra).
A cromatografia de troca aniônica do extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-
53 em uma Resource Q permitiu o fracionamento de enzimas xilanolíticas com alta massa
molar como determinado pelo SDS-PAGE (FIG. 6 A e B). A β-xilosidase, com massa molar
aparente maior que 100 kDa, foi eluída com NaCl 150 mM, enquanto que xilanases, com
massa molar de 30 kDa e 88 kDa, foram eluídas em NaCl 200 mM e NaCl 250 mM,
respectivamente. A xilanase que não foi adsorvida na Resource Q foi submetida a uma
resina de troca catiônica, Mono S, e eluída em gradiente linear de NaCl (FIG. 6 C). O flow-
through contém uma xilanase pura de 22 kDa, a proteína mais abundante do extrato
extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53, enquanto que nas frações eluídas entre 150 e
300 mM NaCl obteve-se uma xilanase de 25 kDa, parcialmente pura (FIG. 6 C). Essas
frações foram reunidas, dialisadas e submetidas a uma segunda operação em Mono S.
Esse último passo de purificação resultou na eluição da xilanase de 25 kDa pura em 250
mM de NaCl.
Como representado na TAB. 1, as atividades específicas da xilanase de 25 kDa
(APXln-II) foram bastante semelhantes às da xilanase de 30 kDa (APXln-III), sendo a
atividade a 30ºC cerca de metade da determinada a 50ºC. A xilanase de 88 kDa (APXln-IV)
exibiu a maior atividade específica entre todas as enzimas xilanolíticas fracionadas, com a
atividade a 50ºC quatro vezes superior à determinada a 30ºC. A fração de 22 kDa (APXln-I)
apresentou atividade similar a 30 e 50°C, como demonstrado pela razão da atividade
específica determinada às duas temperaturas. A atividade específica da APXln-I revelou-se
superior às xilanases APXln-II e APXln-III, mas inferior às determinadas para APXln-IV. A
fração de massa molar acima de 100 kDa correspondeu à proteína β-xilosidase (APXld).
A identificação de 4 xilanases de massas molares 22, 25, 30 e 88 kDa e de uma β-
xilosidase de massa molar superior a 100 kDa (no caso 224 kDa) está de acordo com várias
publicações sobre a identificação de enzimas xilanolíticas individuais na espécie A. pullulans
(LEATHERS 1986, 1988; MYBURGH et al., 1991; LI et al., 1993; LI e LJUNGDAHL, 1994;
DOBBERSTEIN e EMEIS, 1991).
74
TABELA 1 – Atividade xilanolítica a 30°C e 50°C de cada componente de proteína individual
do extrato extracellular do A. pullulans UFMG-Bro-53.
Componentes xilanolíticos
Massa Moar Aproximada
Atividade específica a
30°C
Atividade específica a
50°C
Razão da atividade específica a 30 e 50°C
kDa
(U mg-1) (U mg-1)
APXln*-I (FT I MS)
22
71,04
78,32
0,91
APXln-II (10 MS3, 9 MS4)
25
10,99
23,54
0,47
APXln-III (F6 Resource Q)
30
8.35
17,20
0,49
APXln-IV (F7,8,9 Resource Q)
88
106,65
420,20
0,25
APXld** (F4 Resource Q)
>100
1,.53
3,11
0,49
*APXln – Atividade Xilanase determinada pelo método DNS (açúcares redutores); **APXld – atividade
β-xilosidase determinada pela hidrólise de pNPX. MS – Mono S (fração 10 da MS3, fração 9 da MS4).
A fração pura de massa molecular 22 kDa do extrato extracelular de A. pullulans
UFMG-Bro-53 (APXln-I) foi caracterizada quanto ao pH e temperatura ótimas (FIG. 7). Os
perfis obtidos para atividade de xilanase coincidem com os determinados no extrato,
confirmando ser essa a proteína mais abundante no extrato e que, consequentemente, é a
principal responsável pelo perfil de atividade xilanolítica observado em A. pullulans UFMG-
Bro-53. Os perfis de atividade em diferentes temperatura e pH são muito semelhantes aos
observados para a correspondente fração de A. pullulans Y-2311 (LEATHERS, 1989).
75
A B
FIGURA 7– Perfil de atividade xilanase em diferentes temperatura (A) e pH (B) da fração
pura de massa molar 22 kDa extracelular de Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53 e do
extrato . O perfil de atividade em função da temperatura foi efetuado a pH 5,5 e o perfil em
função do pH a 40ºC. Os perfis do extrato são representados com linha tracejada para fins
comparativos.
Apesar da grande influência da proteína de 22 kDa nas características xilanolíticas
do extrato, o processo de purificação demonstrou que a atividade xilanolítica está associada
a mais de um tipo de proteína, tendo sido identificadas as 4 xilanases relatadas e uma β-
xilosidase em linhagens de A. pullulans (LI et al., 1993; DOBBERSTEIN e EMEIS, 1991).
Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53 demonstrou neste estudo ser capaz de
produzir xilanases com potencial biotecnológico, devido a sua atividade específica, não
possuir atividade celulase e apresentar uma atividade xilanase significativa a 30°C, que são
características importantes a serem exploradas em processos de hidrólise enzimática
seletiva de biomassa lignocelulósica, nomeadamente na produção de biocombustíves
avançados. Além disso, essas enzimas xilanolíticas apresentam também potencial uso nas
indústrias de papel e de panificação.
76
CAPÍTULO III
APLICAÇÃO DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS DE Aureobasidium pullulans UFMG-Bro 53 NA HIDRÓLISE DE XILANA E MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS E FERMENTAÇÃO DA Spathaspora passalidarum UFMG-HMD1.1 PARA A PRODUÇÃO DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO RESUMO
A crescente preocupação com o impacto ambiental causado pelos combustíveis
fósseis tem levado à busca de fontes de energia renováveis menos poluentes, como o
bioetanol de segunda geração (2G). A tecnologia associada à produção deste
biocombustível, produzido a partir de materiais lignocelulósicos, tem sido desenvolvida nos
últimos anos, em processos de hidrólise enzimática e fermentação. O objetivo deste trabalho
foi avaliar o extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 na hidrólise da xilana e da
palha de trigo pré-tratada e avaliar sua atuação em processos combinados de hidrólise
enzimática e fermentação na produção de bioetanol, especificamente em processos de
sacarificação e fermentação simultânea (SSF). O extrato mostrou ser mais eficiente na
hidrólise de xilana Beechwood e na hidrólise de palha de trigo quando comparado com a
hidrólise dos mesmos usando a hemicelulase comercial HTec2, com um rendimento em
xilose cinco vezes superior a palha de trigo a 10% (p/v) de sólidos totais. O rendimento em
xilobiose foi maior para os substratos tratados com HTec2, o que demonstra, que o extrato
A. pullulans UFMG-Bro-53 apresentou uma atividade catalítica de β-xilosidase mais
eficiente. Quando usado como suplementação à celulase comercial CTec2 foi obtido um
rendimento maior do que apenas com CTec2 sem suplementação. Nos experimentos de
SSF a 35ºC, usando xilana beechwood como substrato e a levedura Sp. passalidarum
UFMG-HMD1.1, o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 atuou eficientemente na degradação
de xilana a xilose com um rendimento em 66%, maior em relação a hidrólise realizada em
um experimento sem a fermentação simultânea. Este valor resultou em uma produção de
etanol com uma concentração de 6,6 g L-1 com um rendimento de 0,2 g g-1. A levedura Sp.
passalidarum UFMG-HMD1.1, fermentadora de hexoses e pentoses, promoveu uma
melhoria no rendimento de conversão da palha de trigo a etanol com a suplementação com
o extrato do A. pullulans UFMG-Bro-53, devido ao aumento da disponibilidade de xilose
para a fermentação.
77
Palavras-chave: enzimas xilanolíticas, Aureobasidium pullulans, xilana, hidrólise enzimática
de biomassa lignocelulósica, bioetanol de segunda geração
78
1 INTRODUÇÃO
O aumento da demanda de energia, a preocupação crescente com as mudanças
climáticas e o aumento do preço do petróleo, estimulou o desenvolvimento de
biocombustíveis, como alternativa renovável para ampliar a matriz energética (BÃNOS et al.
2011, JAYED et al. 2011). A produção de biocombustíveis, como o bioetanol produzido a
partir do amido do milho e da cana-de-açúcar, tem sido foco de debates devido à
sustentabilidade dos seus processos de produção, nomeadamente quanto ao impacto
ambiental causado pelo uso de monoculturas e desgaste do solo, e o que pode afetar a
biodiversidade. Nesse contexto, o bioetanol produzido a partir da biomassa lignocelulósica,
resultante de resíduos agrícolas, florestais ou agro-industriais, poderá contribuir para a
produção de biocombustíveis mais sustentáveis (BACOVSKY et al., 2013; LEAL et al.,
2013). A utilização de tecnologias de produção de biocombustívieis que utilizam os
materiais lignocelulósicos como matéria-prima apresenta como vantagens o baixo custo,
abundância, impacto positivo na conservação do ambiente e biodiversidade, além de
diminuir a dependência dos combustíveis fósseis (LUO et al., 2009).
O processo industrial de produção do bioetanol lignocelulósico exige uma
degradação eficiente da biomassa envolvendo três passos: o pré-tratamento, a hidrólise
enzimática, e a fermentação alcoólica (GÍRIO et al., 2010). O pré-tratamento é essencial
para superar a recalcitrância da biomassa e o consequente aumento da acessibilidade das
enzimas á celulose (GÍRIO et al., 2010; KUMAR e WYMAN, 2009). Entre os diversos pré-
tratamentos desenvolvidos até o momento, os hidrotérmicos são considerados promissores
e adequados aos resíduos da biomassa (ALVIRA et al., 2010). Com a aplicação deste
método, o substrato ainda permanece como um sólido rico em celulose contendo uma
significativa proporção de hemicelulose insolúvel (CARVALHEIRO et al. 2008, QINQ et al,
2010). Quanto menor severidade apresentar o pré-tratamento hidrotérmico, menor é a
solubilização da hemicelulose (CARVALHEIRO et al. 2008). A hidrólise enzimática
apresenta vantagens relativamente à hidrólise química (ácida ou alcalina), devido à sua
elevada especificidade que evita a formação de produtos de degradação (provenientes dos
açúcares e lignina) do substrato, maximizando o rendimento de conversão. Adicionalmente,
a hidrólise enzimática é efetuada sob condições de operação moderadas e não corrosivas.
Durante a hidrólise enzimática, é necessário o uso de celulases, hemicelulases e enzimas
auxiliares para promover a conversão completa da lignocelulose, aumentando o rendimento
em açúcares simples e reduzindo o custo do processo (BERLIN et al., 2005; SELIG et al.,
2008).
79
Os açúcares obtidos por hidrólise enzimática dos polissacarídeos componentes do
material lignocelulósico serão convertidos a etanol por fermentação microbiana. Os estágios
de hidrólise enzimática e fermentação, para obtenção de etanol como produto final, poderão
ser realizados sequencialmente, como processo de hidrólise e fermentação separadas
(SHF), ou simultaneamente como sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). No
decorrer da hidrólise enzimática, a acumulação de produto pode promover a inibição das
enzimas reduzindo a sua atividade hidrolítica (KUMAR e WYMAN, 2009). No processo SSF,
o açúcar simples liberado pela hidrólise vai sendo convertido a etanol, não acumulando, o
que minimiza a inibição pelo produto final da atividade enzimática. No entanto, o processo
SSF terá de ser realizado em condições de temperatura intermediárias (aprox. 35ºC) às
ótimas para a hidrólise enzimática (aprox. 50ºC) e para fermentação (aprox. 30ºC), como
uma solução de compromisso (OLOFSSON et al. 2008).
Saccharomyces cerevisiae é um dos micro-organismos mais frequentemente
utilizados para produzir etanol devido à sua elevada produtividade e tolerância ao álcool e
outras substâncias tóxicas. No entanto, esta levedura não é capaz de fermentar pentoses
(ex. xilose), açúcares que constituem uma fração significativa da maioria da biomassa
lignocelulósica, mais especificamente de hemiceluloses contendo xilana. Entre as espécies
que fermentam D-xilose, Spathaspora passalidarum é conhecida como uma das melhores
produtoras de etanol (NAKAMURA et al., 2008).
O sucesso da bioconversão da hemicelulose, além da celulose, em etanol é um fator
decisivo para a viabilidade econômica do processo (CHANDEL et al., 2010). Nesse sentido,
o papel das xilanases na hidrólise da biomassa é de suma importância. A atuação de
enzimas xilanolíticas, removendo a hemicelulose insolúvel, diminui a barreira entre a
celulose e a lignina, melhorando assim também significativamente a ação das celulases
devido ao maior acesso à celulose (KUMAR e WYMAN, 2009, LAUREANO-PEREZ et al.
2005; OHGREN et al., 2007).
As xilanases são glicosil hidrolases (GH) que degradam especificamente xilana. O
sistema hidrolítico inclui enzimas que despolimerizam a cadeia principal - endo-1,4-β-
xilanase e β-xilosidase – e também enzimas que removem grupos laterais do polímero ou
oligômeros (enzimas auxiliares) (BEG et al., 2001; GRAY et al., 2006; POLIZELI et al., 2005;
RYABOVA et al., 2009).
O processo de hidrólise enzimática é normalmente efetuado com coquetéis
enzimáticos comerciais, com composição variável em enzimas celulolíticas e
hemicelulolíticas. Estes coquetéis comerciais têm origem em extratos extracelulares de
fungos filamentosos selecionados ou geneticamente modificados. Alguns coquetéis
hemicelulolíticos que são usualmente aplicados em complemento aos celulolíticos estão
descritos como xilanase-específicos (sem atividade celulase), atuam em temperaturas
80
ótimas de atividade próxima de 50ºC (DUARTE e COSTA-FERREIRA 1994; KNOB et al.
2010) e a sua atuação é geralmente limitada pelo reduzido nível de ação da β-xilosidade
(COUGHLAN e HAZLEWOOD, 1993b), o que poderá estar relacionado, ou induzir, inibições
das enzimas xilanolíticas pelos produtos das reações de hidrólise. Esta limitação conduz a
uma incompleta hidrólise enzimática da xilana, o que, associado ao fato de D-xilose não ser
naturalmente fermentada pela levedura S. cerevisiae, limita a aplicação de xilanases em
processos de produção de etanol 2G. A inibição pelos produtos de hidrólise na hidrólise
enzimática de xilana, desaconselha a sua utilização em processos de hidrólise enzimática
separada da fermentação (SHF). Por sua vez, a sacarificação e fermentação simultâneas
(SSF), que terão de ser efetuados a uma temperatura mais baixa (usualmente a 35ºC ou
inferior), para que a fermentação possa ocorrer, pode conduzir a hidrólise enzimática de
xilana pouco eficiente, devido à baixa atividade das enzimas xilanolíticas a essas
temperaturas.
A pesquisa de enzimas xilanolíticas com elevada atividade a baixa temperatura
poderá permitir a utilização destas enzimas em processos de SSF de xilana. Em leveduras e
fungos leveduriformes foram já identificadas atividades de xilanase e β-xilosidase com
temperaturas ótimas inferiores às dos fungos filamentosos que são usados para a produção
dos coquetéis comerciais (LEATHERS 1986; MANZANARES et al., 1999; ROMERO et al.,
2012; LARA et al., em revisão – Cap I).
As enzimas xilanolíticas produzidas a partir de um fungo leveduriforme ascomiceto,
Aureobasidium pullulans-UFMG-Bro-53, possuem características favoráveis à aplicação em
processos SSF e em particular em processos denominados sacarificação e co-fermentação
(de glicose e xilose) simultâneas (SSCF), por atender as condições ótimas intermediárias de
temperatura exigidas ao processo, isto é em relação a elevada atividade a cerca de 35°C
(Cap II).
A suplementação de coqueteis enzimáticos celulolíticos com xilanases tem sido
relatada por melhorar a hidrólise enzimática de material lignocelulósico, nomeadamente de
palha de milho pré-tratada (KUMAR e WYMAN, 2009; LI et al., 2010) e palha de trigo pré-
tratada (ALVIRA et al., 2011), conduzindo então a maior rendimento na fermentação (JIN et
al., 2010, KUMAR e WYMAN, 2009).
O objetivo deste trabalho consiste em I- avaliar a aplicação do extrato xilanolítico do
Aureobasidium pullulans-UFMG-Bro-53 na hidrólise enzimática de xilana e de material
lignocelulósico pré-tratado, II-avaliar a atuação desse extrato em processos combinados de
hidrólise enzimática e fermentação na produção de bioetanol (SSF).
81
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Hidrólise enzimática
2.1.1 Matéria prima
No presente estudo, foram usados como substratos: a xilana beechwood comercial
(Sigma) e palha de trigo pré-tratadas. A palha de trigo foi submetida a um pré-tratamento
hidrotérmico suave (190°C por 10 minutos) pela Universidade Técnica da Dinamarca (DTU),
e gentilmente cedida para este trabalho. A TAB. 1 apresenta a caracterização da palha de
trigo pré-tratada realizada pelo de acordo com o protocolo NREL (SLUITER et al., 1998).
TABELA 1 – Caracterização da palha de trigo pré-tratada
Componente
% base de massa seca
Celulose
41.62 ± 0.41
Xilana
22.21 ± 0.16
Arabinana
0.9 ± 0.02
Galactana
0.99 ± 0.14
Lignina insolúveis em ácido
23.66 ± 0.28
Cinzas insolúves em ácido
1.92 ± 0.03
Cinzas total
5.31 ± 0.02
Total
94.69
2.1.2 Enzimas
O extrato extracelular da A. pullulans UFMG-Bro-53 e as preparações comerciais
Cellic HTec2 e Cellic CTec2, gentilmente cedidas pela Novozymes (Dinamarca), foram
usados nos experimentos de hidrólise enzimática, SS(C)F e SSF. A enzima Cellic HTec2 é
uma preparação de hemicelulases com elevada atividade de endoxilanase e atividade
82
celulase residual, enquanto a Cellic CTec2 é uma preparação de celulases com alta
atividade de β-glicosidase possuindo também atividade hemicelulolítica.
O extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 possui atividade xilanolítica e foi
produzido de acordo com o procedimento descrito na seção ‘Produção de enzimas
xilanolíticas’ do capítulo II.
2.2 Experimentos de hidrólise enzimática
Os experimentos preliminares de hidrólise enzimática foram realizados usando como
substrato: xilana beechwood numa concentração de 2% (p/v); e palha de trigo pré-tratada
numa suspensão de concentração 10% (p/v) (em termos de sólidos totais). O meio de
hidrólise continha (em frascos Erlenmeyer de 100 mL): substrato (xilana ou palha de trigo
pré-tratada); 0,08% (p/v) de azida de sódio (para evitar contaminação microbiana); 4 mL de
extrato xilanolítico de A. pullulans UFMG-Bro-53 ou 3 μL de HTec2, ambos correspondendo
atividades equivalentes a 200 U (endo-xilanase) g-1 de xilana; e tampão acetato de sódio 50
mM pH 5,5, para completar o volume total inicial de 20 mL. Os frascos foram incubados a
50°C, com agitação orbital (150 rpm), durante 96 horas. As alíquotas foram recolhidas ao fim
de 0, 6, 24, 48, 72 e 96 horas de incubação.
Numa segunda fase de experimentos de hidrólise enzimática (e quando integrados
com a fermentação), a palha de trigo pré-tratada foi usada como substrato numa
concentração de 15% (p/v) (em termos de sólidos totais), com o objetivo de verificar o efeito
da suplementação com enzimas xilanolíticas (extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 em
comparação com a enzima comercial Cellic HTec2) na ação da enzima celulolítica comercial
Cellic CTec2 e, simultaneamente, a hidrólise de hemicelulose no substrato lignocelulósico.
As preparações enzimáticas do A. pullulans UFMG-Bro-53 ou Cellic HTec2 foram usadas
numa dosagem equivalente a 1000 U g-1 de xilana, como suplemento da Cellic CTec2
(aplicada numa dose de 20 FPU g-1 de glucana) na hidrólise de palha de trigo pré-tratada. A
TAB.2 apresenta o modelo experimental da hidrólise enzimática realizada, usando os
substratos xilana e palha de trigo pré-tratada.
83
TABELA 2. Modelo experimental da hidrólise enzimática
Frasco/Substrato Cellic CTec2 Cellic HTec2 A. pullulans -UFMG-Bro 53
1-Palha de trigo
X
2-Palha de trigo
X
3-Palha de trigo
X
4-Palha de trigo
X X
5-Palha de trigo
X X
6- Xilana
X
7-Xilana
X
As misturas reacionais (50 mL em Erlenmeyers de 250 mL), em tampão acetato de
sódio 50 mM pH 4,8, foram incubadas a 45°C, com agitação orbital (150 rpm), durante 96
horas.
As alíquotas retiradas dos experimentos de hidrólise enzimática foram aquecidas em
banho fervente por 10 minutos (para inativar enzimas), centrifugadas (14000×g, 10
min) e congeladas a - 20°C, para posteriormente serem analisadas quanto aos produtos
recorrendo a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
2.3 Produção de bioetanol de segunda geração
2.3.1 Micro-organismos e meio de cultivo usado na fermentação
Nos ensaios de fermentação para a produção de etanol, foram usadas as seguintes
leveduras: linhagem Spathasphora passalidarum UFMG-HMD1.1, que é fermentadora de D-
xilose e glicose (Cadete et al., 2012); e Saccharomyces cerevisae Ethanol red (Fermentis,
France), uma linhagem industrial usada na indústria de álcool combustível, fermentadora de
glicose mas não de xilose.
As células de Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1 foram conservadas em extrato de
malte e levedura ágar YMA (glicose 10 g L-1; peptona 5 g L-1; extrato de levedura 3 g L-1;
extrato de malte 3 g L-1; ágar 20 g L-1), em placas a 30°C por 24 a 48 h. As células foram
cultivadas em 50 mL de meio líquido YPX (extrato de levedura 10 g L-1; peptona 20 g L-1; D-
84
xilose 30 g L-1) em frascos Erlenmeyer-250 mL que foram incubados com agitação orbital
(200 rpm) por 24 h a 30°C. As células foram recuperadas por centrifugação (2600xg, 20
min), lavadas duas vezes e ressuspendidas no meio de fermentação a uma concentração
total (inicial) de massa seca igual a 1 g -1L.
As células de Sc. cerevisiae Ethanol Red foram preparadas em frascos Erlenmeyer
100-mL com 20 mL de meio de crescimento contendo (50 g L-1 glucose; 2 g L-1 extrato de
levedura; 2,5 g L-1 (NH4)2SO4; 1 g L-1 KH2PO4; 0,3 g L-1 MgSO4.7H2O). Depois de 16 h de
incubação com agitação orbital (150 rpm) a 35°C, as células foram centrifugadas a 2600xg
por 20 min. As células foram lavadas duas vezes e ressuspendidas no meio de fermentação
a uma concentração total (inicial) de 1 g L-1.
2.3.2 Enzimas utilizadas na hidrólise enzimática no processo de produção de etanol
O extrato xilanolítico de A. pullulans UFMG-Bro-53 e as preparações comerciais
Cellic CTec2 e Cellic HTec2 da Novozymes (Dinamarca) foram usados em processos de
sacarificação e fermentação silmultânea (SSCF e SSF)
2.3.3 Experimentos de SSF a partir de xilana e palha de trigo com extrato xilanolítico
extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53
Os experimentos de SSF, usando como meio de cultivo o substrato lignocelulósico
suplementado com nutrientes (10 g L-1 de extrato de levedura e 20 g L-1 de peptona) para
Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1 e para Sc. cerevisiae Ethanol Red (2 g L-1 extrato de
levedura; 2,5 g L-1 (NH4)2SO4; 1 g L-1 KH2PO4; 0,3 g L-1 MgSO4.7H2O), foram iniciados com a
adição simultânea das enzimas a serem testadas e da levedura produtora de etanol.
Nestes experimentos, estudou-se a produção de etanol a partir de xilana beechwood,
numa concentração 3% (p/v) e de palha de trigo pré-tratada numa concentração de 15%
(p/v) em termos de sólidos totais, usando extrato xilanolítico de A. pullulans UFMG-Bro-53 e
uma levedura fermentadora de xilose, Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1.
Foram efetuados três conjuntos de experimentos em condições de hidrólise enzimática
(quando à dose enzimática) semelhantes às descritas na seção anterior 2.2, exceto no que
diz respeito à temperatura (35ºC em vez de 45ºC):
85
a) Sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) de xilana beechwood a etanol
usando o extrato xilanolítico A. pullulans UFMG-Bro-53 e uma levedura fermentadora de
xilose (C5), Spathasphora passalidarum UFMG-HMD1.1.
b) Sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) de palha de trigo pré-tratada a
etanol aplicando Cellic CTec2 suplementada com extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 ou
Cellic Htec2 e uma levedura industrial que apenas fermenta glicose (C6), Saccharomyces
cerevisiae Ethanol Red (Fermentis, France).
c) Sacarificação e co-fermentação simultâneas (SSCF) palha de trigo pré-tratada a
etanol aplicando Cellic CTec2 suplementada com extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 ou
Cellic Htec2 e uma levedura capaz de fermentar glicose e xilose (C6/C5), Spathasphora
passalidarum UFMG-HMD1.1.
Como controle, foram efetuados cultivos de ambas as leveduras em meio contendo
xilose e glicose+xilose. A levedura Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1 foi igualmente cultivada
usando como substrato isoladamente xilana beechwood e o próprio extrato A. pullulans
UFMG-Bro-53 (nas mesmas concentrações).
Os experimentos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) foram realizados
em duplicata durante 96 horas, usando tampão hidrogenoftalato de potássio 50 mM pH 4,8,
a 35°C com agitação orbital (200 rpm). Em ambos os cultivos da fermentação foram usados
frascos erlenmeyers 100-mL com 50 mL de meio de fermentação. Os frascos foram
fechados com rolhas de borracha e acoplados a um sistema de agulha mergulhado em
glicerol para liberação dos gases produzidos pela fermentação sem entrada de ar. Antes do
início da fermentação e na abertura do frasco para retirada de alíquotas, foi efetuada uma
injeção de gás de nitrogênio para remoção do ar (condições anaeróbicas).
As alíquotas recolhidas foram aquecidas em banho fervente por 10 minutos (para
inativar enzimas), centrifugadas (14000×g, 10 min) e congeladas a -20°C, para
posteriormente serem analisadas em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
2.3.4 Parâmetros fermentativos
Os parâmetros fermentativos Yp/s (g/g, rendimento em etanol), (% eficiência da
fermentação) e o consumo de xilose foram determinados experimentalmente. O Yp/s do
etanol foi calculado correlacionando o P produzido com o S consumido (produto obtido
pelo substrato consumido). A conversão eficiente (, %) foi calculada como a percentagem
do rendimento máximo de etanol teórico (0,51 g de etanol por g de D-xilose). O consumo de
86
D-xilose (%) foi determinado como a percentagem consumida em relação à concentração
inicial de açúcar.
2.3.5 Métodos analíticos
Os produtos da hidrólise enzimática (glucose, xilobiose e xilose) e da fermentação
(etanol, glicerol, xilitol, acetato e etanol) foram quantificados por CLAE com um cromatógrafo
Merck Hitachi (Darmstadt, Germany), equipado com uma coluna Aminex HPX-87H (Bio-Rad
Hercules, CA, USA), a 50ºC, e um detector de índice de refração (L-7490, Merck Hitachi),
usando H2SO4 5mM como fase móvel, a um fluxo de 0,4 mL min-1.
As atividades xilanolíticas foram determinadas segundo método descrito na seção
‘Ensaio enzimático e quantificação de proteínas’ do capítulo II.
As atividades celulolíticas – atividade em papel de filtro (FPase) - foram
determinadas usando papel de filtro Whatman n° 1 (50 mg) como substrato. Os açucares
redutores liberados da mistura reacional foram quantificados pelo método do ácido
dinitrosalicílico (DNS) segundo Miller, (1959).
2.3.6 Análise estatística
Foi feita a análise de variância (ANOVA) (p≤0,05) e a comparação entre as médias
pelo teste de Duncan a (p≤0,05) de probabilidade com os testes de hidrólise da palha de
trigo pré-tratada.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Hidrólise enzimática de xilana em xilana comercial e palha de trigo com extrato xilanolítico extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53
As atividades celulolíticas (FPase) e xilanolíticas (xilanase) dos extratos enzimáticos
foram determinadas nas condições aplicadas para a sacarificação dos substratos, ou seja, a
45°C, pH 4,8. Enquanto os coquetéis comerciais Cellic HTec2 e Cellic CTec2 apresentaram
atividades xilanase e FPase significativas, o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 apresentou
atividade xilanase de 104,3 U mL-1 e não apresentou atividade celulase.
87
O extrato xilanolítico extracellular do A. pullulans UFMG-Bro-53 foi avaliado num
ensaio preliminar em xilana beechwood 2% (p/v) e em palha de trigo pré-tratada 10% (p/v)
em sólidos – aproximadamente 2% (p/v) xilana), num processo de hidrólise enzimática a
uma temperatura de 50°C e um pH de 5,5. Foi usada uma preparação comercial xilanolítica,
Cellic HTec2, para efeito comparativo. A eficiência de hidrólise é determinada com base na
concentração de D-xilose e xilobiose obtida a partir de cada substrato (FIG. 1).
FIGURA 1 – Rendimento de xilose e xilobiose a partir da Cellic HTec2 e do extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro), ambas a 200 U g-1 (xilana), na hidrólise enzimática da fração de xilana a 50°C, pH 5,5, em xilana comercial 2% (p/v) e palha de trigo pré-tratada 10% (p/v) em sólidos totais.
Com o uso das enzimas xilanolíticas do A. pullulans UFMG-Bro-53, obteve-se uma
hidrólise de xilana semelhante à obtida com Cellic HTec2 (aproximadamente 25-30%), mas,
em palha de trigo, o extrato XBro foi mais eficiente do que Cellic HTec2 (60% versus 30%).
A concentração de xilose obtida (hidrólise completa da xilana) é maior com XBro do que
com Cellic HTec2, quer em xilana quer em palha de trigo pré-tratada, atingindo-se
concentrações de D-xilose três e cinco vezes superiores, respectivamente.
Consequentemente, o rendimento em xilobiose foi maior para os substratos tratados com a
HTec2, o que demonstra, que o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 possui uma atividade
catalítica de β-xilosidase mais eficiente, promovendo a hidrólise da xilana a xilose com maior
rendimento, nas condições escolhidas para o ensaio.
A atuação do extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 foi avaliada, em comparação com a
hemicelulase Cellic HTec2, nos dois substratos numa concentração maior de sólidos,
0
10
20
30
40
50
60
70
HTec2 XBro HTec2 XBro
Xilana Palha de trigo
Rendim
ento
(%
)
xilose xilobiose
88
equivalente à usada em seções seguintes de hidrólise enzimática com celulases e em
processos de sacarificação e fermentação simultâneas: xilana beechwood 3% (p/v) e palha
de trigo pré-tratada 15% (p/v) em sólidos totais (FIG. 2).
FIGURA 2 – Eficiência do extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro) e da
hemicelulase comercial Cellic HTec2, a 1000 U g-1 (xilana), na hidrólise de xilana
beechwood 3% (p/v) e de palha de trigo pré-tratada 15% (p/v) em sólidos totais, a 45°C, pH
4,8. Rendimento de conversão a xilose e xilobiose.
A dosagem de enzima usada neste ensaio foi de 1000 U g-1 de xilana. O extrato
xilanolítico de A. pullulans UFMG-Bro-53 e a hemicelulase HTec2 exibiram, na presença de
xilana, comportamentos similares quanto ao rendimento de conversão a xilose. Já a HTec2
teve maior rendimento em xilobiose. Por sua vez, com a palha de trigo o extrato de A.
pullulans UFMG-Bro-53 promoveu um rendimento de conversão a xilose aproximadamente
duas vezes superior àquele obtido com HTec2. Os rendimentos obtidos com maior (50%)
concentração de substrato promoveram um menor rendimento de hidrólise enzimática, não
excedendo 25% de rendimento de hidrólise nestas condições, apesar de ter sido usado uma
dose de xilanase cinco vezes superior e condições mais favoráveis para as atividades de
xilanase. Encontram-se duas razões para esse efeito: i) a maior concentração de sólidos
impede uma agitação eficiente e o acesso homogêneo das enzimas ao substrato, o que é
justificado pelo fato de a eficiência de hidrólise enzimática ser drasticamente reduzida
quando se usa palha de trigo a 15% de sólidos em vez de 10%; ii) uma inibição da hidrólise
enzimática pelo produto, o que poderá ser justificado pelo menor rendimento de hidrólise de
0
10
20
30
40
50
60
70
HTec2 XBro HTec2 XBro
Xilana Palha de trigo
Rendim
ento
(%
)
xilose xilobiose
89
xilana a 3% com o o extrato de A. pullulans UFMG-Bro-53, em relação ao observado com
2% (cerca de 22% contra 26%, respectivamente).
O efeito mais drástico foi verificado com o aumento de sólidos de palha de trigo com
o extrato de A. pullulans UFMG-Bro-53, que poderá ser justificado com a combinação de
efeitos reológicos (agitação e acesso de enzimas ao substrato) e bioquímicos (inibição pelo
produto).
3.2 Suplementação de celulases com o extrato xilanolítico extracelular de A. pullulans
UFMG-Bro-53 e efeito na hidrólise enzimática de palha de trigo
Demonstrado o potencial xilanolítico do extrato de A. pullulans UFMG-Bro-53, novos
experimentos foram realizados para avaliar o efeito desse extrato na suplementação de
enzimas celulolíticas (Cellic CTec2) para uma mais eficiente hidrólise da palha de trigo,
partindo-se de 15% (p/v) de sólidos totais. Para efeito comparativo, a celulase Cellic CTec2
foi também suplementada com a enzima comercial hemicelulolítica Cellic HTec2 e testada
sem suplementação. Os rendimentos de conversão obtidos, em termos de xilose e glicose,
estão representados na FIG. 3.
A suplementação de Cellic CTec2 com enzimas xilanolíticas do A. pullulans UFMG-
Bro-53 levou a um maior rendimento na hidrólise de ambos os constituintes polissacarídicos
(xilana e celulose) da palha de trigo pré-tratada, quando comparada com a suplementação
com Cellic HTec2 e com a utilização isolada de Cellic CTec2. Os valores das médias obtidas
para o rendimento de conversão de xilose para a suplementação do extrato de A. pullulans
UFMG-Bro-53 a Cellic Ctec2 e da Cellic CTec2 sem suplementação diferem entre si
significativamente (p<0,05) pelo teste de Duncan. Ao contrário das enzimas xilanases
comerciais produzidas por fungos filamentosos, com atividade ótima acima de 50°C
(DUARTE e COSTA-FERREIRA 1994; KNOB et al. 2010), o extrato extracelular de A.
pullulans UFMG-Bro-53 possui alto potencial para ser usado em experimentos de SSF, por
apresentar alta atividade a temperaturas de 35ºC (Cap II).
A
90
B
FIGURA 3 – Rendimento de hidrólise enzimática da xilana e da celulose de palha de trigo
pré-tratada por suplementação da celulase Cellic CTec2 (CT) com o extrato extracellular do
A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro) ou da hemicelulase comercial Cellic HTec2 (HT) a 45°C
pH 4,8. Rendimento, em xilose (A) e rendimento em glicose (B).
3.3 Produção de etanol por SSF a partir de xilana e palha de trigo com extrato
xilanolítico extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53
Com a finalidade de avaliar o potencial do extrato do A. pullulans UFMG-Bro-53 na
produção de etanol lignocelulósico, esse foi usado em processos de sacarificação e
fermentação simultâneas (SSF) com xilana beechwood (3% p/v) ou palha de trigo pré-
0
10
20
30
40
50
60
CTec2 CTHT CTXBro
Rendim
ento
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
CTec2 CTHT CTXBro
Rendim
ento
(%
)
91
tratada (15% p/v) e leveduras produtoras de etanol a partir de glicose (C6) ou glicose e
xilose (C6/C5).
3.3.1 Produção de etanol hemicelulósico a partir de xilana por SSF
A produção de etanol a partir de xilana foi avaliada utilizando o extrato XBro para
hidrolisar a xilana a xilose e, simultaneamente, a levedura Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1
para fermentar a xilose a etanol em condições anaeróbias (ver condições na seção Material
e Métodos). A levedura Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1 é conhecida por ser capaz de
fermentar xilose a etanol de forma eficiente, atingindo rendimentos de aproximadamente
0,4 g g-1 a 30ºC (CADETE et al., 2012), sendo capaz de fermentar a 35ºC ainda que com
menor rendimento (MELO, 2013). Neste trabalho, verificou-se que Sp. passalidarum UFMG-
HMD1.1 é incapaz de converter xilana diretamente a etanol, demonstrando que não produz,
nas condições testadas, enzimas xilanolíticas. É importante realçar que também não foram
detectados xilo-oligossacarídeos ou acumulação de xilose ao fim de 96 horas. Já quando o
meio foi suplementado com o extrato XBro, verificou-se que Sp. passalidarum UFMG-
HMD1.1 foi capaz de produzir etanol a uma concentração de 6,6 g L-1 de etanol a partir de
30 g L-1 de xilana, a 35ºC (FIG. 4 A), correspondendo a um rendimento de 0,2 g g-1. O etanol
produzido é efetivamente obtido a partir da xilana, pois quando efetuado o cultivo de Sp.
passalidarum UFMG-HMD1.1 usando unicamente extrato XBro como substrato (apenas
contendo 0,12 g L-1 de xilose) não foi obtido qualquer produto de fermentação. Verificou-se
que, nas condições testadas, a 35ºC, Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1 produz etanol a
partir de xilose com um rendimento de conversão de 0,3 g g-1 (FIG. 4 B). Este cultivo foi
efetuado na presença e na ausência de extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53, o
que significa que este extrato não tem efeito direto no metabolismo desta levedura. O menor
rendimento obtido em relação ao anteriormente descrito poderá estar relacionado com a
temperatura utilizada para o SSF, 35ºC, em vez dos 30ºC usados por CADETE et al.,
(2012). De fato, 35ºC foi descrito como a temperatura máxima de fermentação pela
linhagem de Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1 (MELO, 2013).
A
92
B
FIGURA 4 – Produção de etanol por Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1 a 35ºC, com agitação
(150 rpm), em condições de anaerobiose. (A) Processo SSF a partir de xilana beechwood
(30 g L-1) usando o extrato extracelular do A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro); e (B)
Fermentação de D-xilose comercial (30 g L-1) suplementada com o extrato extracelular do A.
pullulans UFMG-Bro-53 (XBro). Concentrações de D-xilose (-▲-) e etanol (--).
Assumindo um rendimento de 0,3 g g-1 para a conversão da xilose a etanol (como
determinado a partir de 30 g L-1 de xilose nas mesmas condições), Sp. passalidarum deverá
ter fermentado 22,5 g L-1 de xilose, o que significa que o extrato xilanolítico A. pullulans
UFMG-Bro-53 deverá ter promovido a hidrólise de xilana a xilose com um rendimento
estimado em 66%, no decorrer do processo SSF. Portanto, a extensão de hidrólise da xilana
foi significativamente melhorada quando acoplada à fermentação, pois quando aplicado o
mesmo extrato à xilana, nas mesmas doses de substrato e de A. pullulans UFMG-Bro-53,
havia sido obtido um rendimento de hidrólise enzimática, ou seja, de conversão de xilana a
xilose inferior a 20% (FIG. 2).
0
2
4
6
8
0 24 48 72 96
Co
ncen
tração
(g/L
)
Tempo (h)
0
10
20
30
0 24 48
Co
ncen
tração
(g
/L)
Tempo (h)
93
3.3.2 Produção de etanol celulósico a partir de palha de trigo pré-tratada por SSF com
celulase suplementada com extrato xilanolítico de A. pullulans UFMG-Bro-53
Estudou-se também o efeito da suplementação da celulase Cellic CTec2 com
enzimas hemicelulolíticas (extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 por comparação com a enzima
comercial Cellic HTec2) na produção de etanol a partir da fração de celulose da palha de
trigo pré-tratada pela levedura S. cerevisiae Ethanol Red (FIG. 5).
FIGURA 5 – Produção de etanol por SSF com S. cerevisiae Ethanol Red, a 35ºC, 150 rpm,
em condições de anaerobiose, a partir da fração de celulose de palha de trigo, aplicando a
celulase Cellic CTec2: sem suplementação (-▲-); suplementada com Cellic HTec2 (--);
suplementada com extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 (-■-).
Nas condições definidas para os ensaios a adição de extrato A. pullulans UFMG-Bro-
53 não conduziu a uma melhor atuação da celulase Cellic CTec2 quanto à extensão de
hidrólise da celulose da palha de trigo, não produzindo efeito significativo na produção de
etanol, ao contrário da suplementação com Cellic HTec2 (FIG. 5 e TAB. 3). No entanto, a
adição de extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 promoveu um aumento da concentração de
xilose acumulada (TAB. 3), indicando que a eficiência das enzimas xilanolíticas é superior
quanto a suplementação com extrato de A. pullulans UFMG-Bro-53.
0
4
8
12
16
20
0 24 48 72 96
Eta
no
l (
g/L
)
Tempo (h)
94
TABELA 3 – Produção máxima de etanol (ao fim de 96 horas) por SSF com S. cerevisiae
Ethanol Red, a 35ºC, 150 rpm, em condições de anaerobiose, a partir da fração de celulose
de palha de trigo aplicando Cellic CTec2: sem suplementação, suplementada com Cellic
HTec2 e suplementada com extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro).
Enzimas [Etanol]máx
(g L-1
) Rendimento*
(% máx teórico) [Xilose]acumulada
(g L-1
)
Cellic CTec2 12,6±2,18 23,1 (35,7) 11,5±0,13
Cellic CTec2 + Cellic HTec2 15,0±1,30 27,4 (42,4) 12,1±1,09
Cellic CTec2 + XBro 13,1±0,45 23,9 (36,9) 13,2±0,72
*Calculado relativamente à concentração máxima de etanol possível de obter por fermentação a partir
da glicose e xilose resultantes da hidrólise completa da celulose e xilana existentes na palha de trigo
pré-tratada (entre parêntesis o valor de rendimento considerando apenas a fração de celulose).
3.3.3 Produção de etanol lignocelulósico a partir de palha de trigo pré-tratada por
SSCF celulase suplementada com A. pullulans UFMG-Bro-53 e com a levedura Sp.
passalidarum UFMG-HMD-1.1
Finalmente, estudou-se o efeito da celulase Cellic CTec2 com e sem suplementação
de enzimas xilanolíticas (extrato do A. pullulans UFMG-Bro-53 por comparação com a a
hemicelulase Cellic HTec2) na produção de etanol a partir das frações de celulose e
hemicelulose da palha de trigo pré-tratada pela levedura Sp. passalidarum UFMG-HMD-1.1,
que é capaz de fermentar quer glicose quer xilose (FIG. 6, TAB. 4).
95
FIGURA 6 –Produção de etanol por SSCF com Sp. passalidarum UFMG-HMD-1.1, a 35ºC,
150 rpm, em condições de anaerobiose, a partir das frações de celulose e hemicelulose de
palha de trigo aplicando a celulase Cellic CTec2: sem suplementação (-▲-); suplementada
com Cellic HTec2 (--); suplementada com extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 (XBro) (-■-).
TABELA 4 – Produção máxima de etanol (ao fim de 96 horas) por SSCF com Sp.
passalidarum UFMG-HMD-1.1, a 35ºC, 150 rpm, em condições de anaerobiose, a partir das
frações de celulose e hemicelulose de palha de trigo aplicando Cellic CTec2: sem
suplementação, suplementada com Cellic HTec2 e suplementada com extrato XBro.
Enzimas [Etanol]máx
(g L-1
) Rendimento*
(% máx teórico) [Xilose]acumulada
(g L-1
)
Cellic CTec2 14,3±0,33 26,1 12,1±0,57
Cellic CTec2 + Cellic HTec2 14,8±1,22 27,1 11,4±0,38
Cellic CTec2 + XBro 16,7±0,45 30,5 14,1±0,95
*Calculado relativamente à concentração máxima de etanol possível de obter por fermentação a partir
da glucose e xilose resultantes da hidrólise completa da celulose e xilana existentes na palha de trigo
pré-tratada.
A utilização de uma levedura capaz de fermentar as frações C6 e C5 (glicose e xilose),
como é o caso de Sp. passalidarum UFMG-HMD-1.1, permitiu uma melhoria no rendimento
de conversão da palha de trigo a etanol com a suplementação com o extrato de A. pullulans
UFMG-Bro-53. Por um lado, Sp. passalidarum UFMG-HMD-1.1, sendo capaz de fermentar
xilose, aumenta os rendimentos de etanol obtidos a partir do material lignocelulósico por
permitir a fermentação da fração hemicelulósica para além da celulósica. Por outro lado, o
efeito positivo das hemicelulases na hidrólise da hemicelulose permitiu uma maior
0
4
8
12
16
20
0 24 48 72 96
Eta
no
l (
g/L
)
Tempo (h)
96
disponibilidade de xilose para a fermentação, com um efeito mais visível com o extrato de A.
pullulans UFMG-Bro-53. Tal efeito também se reflete na maior acumulação de xilose ao
longo do processo (TAB. 2). No entanto, a conversão da D-xilose a etanol poderia ter sido
mais eficiente uma vez que nas condições testadas existiu um período de latência, em que a
levedura Sp. passalidarum UFMG-HMD-1.1 demorou pelo menos 24 horas a iniciar a
produção de etanol. Assim, verificou-se uma acumulação de açúcar (glicose e xilose) sendo
depois o consumo de glucose preferencial. Esta latência poderá estar relacionada com o
fato de Sp. passalidarum UFMG-HMD-1.1 estar a atuar a uma temperatura (35ºC) que
poderá afetar o seu desempenho ótimo, pois esta é a temperatura máxima de fermentação
desta linhagem (MELO, 2013). A realização do processo a uma temperatura mais baixa,
30ºC em vez de 35ºC, poderia evitar a latência, apesar de diminuir a atividade celulase de
Cellic CTec2. Por outro lado, o prolongamento da fermentação poderia ter originado
rendimentos em etanol maiores do que os determinados, uma vez que ainda existia xilose
disponível para fermentação.
97
CAPÍTULO IV
EMPREGO DE ENZIMAS XILANOLÍTICAS DE Aureobasidium
pullulans UFMG-Bro-53 EM PROCESSO DE PANIFICAÇÃO
RESUMO
As xilanases têm sido usadas como aditivos na indústria de panificação para melhorar a
qualidade do pão em termos de volume e firmeza do miolo. Neste estudo, foi testado o
extrato extracelular do Aureobasidium pullulans UFMG-Bro-53, constituído de uma mistura
de enzimas pertencentes à família GH 10 e GH 11. As xilanases desse extrato influenciaram
positivamente a massa, causando um aumento significativo (p ≤ 0,05) no volume do pão de
forma e uma diminuição significativa (p ≤ 0,05) da firmeza do miolo ambos em comparação
ao controle negativo, sem adição de enzimas.
Palavras-chave: Aureobasidium pullulans, panificação, xilanase, volume, textura, pão de
forma
98
1 INTRODUÇÃO
O pão é um alimento comum e tradicional em nossa sociedade e devido a um
crescente aumento da demanda por produtos naturais e diversificação de produtos, as
enzimas com potencial aplicabilidade em panificação estão sendo, cada vez mais, usadas
como aditivos por forma a conferirem propriedades físico-químicas melhoradas ao pão
(ESTELLER, 2004). As xilanases são usualmente usadas em combinação com outras
enzimas hidrolíticas como a amilase, lipases e várias outras (ex. oxidorredutases), pois
melhoram as propriedades reológicas da massa e as propriedades organolépticas do pão
(QI SI e DROST-LUSTENBERGER, 2002). As xilanases melhoram a flexibilidade e a
estabilidade da massa, aumentam o volume do pão e melhoram a estrutura do miolo (MAAT
et al., 1992; QI SI e DROST-LUSTENBERGER, 2002; BAILLET et al., 2003; GUY e
SARABJIT, 2003).
A farinha de trigo possui aproximadamente 2-3% de arabinoxilana em sua
composição, podendo chegar a 5% em farinha de trigo integral e 8% em farinha de centeio.
A arabinoxilana é um polímero complexo, composto por uma cadeia principal linear de
unidades de (1,4)-β-D-xilopiranosil e resíduos substituintes de α-arabinose na posição C(O)-
3 e/ou C(O)-2. Outro substituinte é o ácido ferúlico que pode ser ligado ao C(O)-5 da
arabinose, por meio de uma ligação éster (GOESAERT et al., 2005; ORDAZ-ORTIZ e
SAULNIER, 2005).
Apesar de estar presente em pequena quantidade, a arabinoxilana é extremamente
importante pela capacidade de se ligar à água, exercendo um efeito significativo na
qualidade da massa e do pão. Pode ser classificada em arabinoxilana solúvel (WEAX) e não
solúvel (WUAX) em água. A fração WEAX tem uma forte influência na viscosidade do meio
aquoso, enquanto que a fração WUAX tem uma forte capacidade de retenção da água e
pode influenciar negativamente a qualidade da massa, em detrimento da indisponibilidade
da água para a formação do glúten.
A natureza insolúvel das frações WUAX deve-se a ligações covalentes e interações
não covalentes com moléculas vizinhas de arabinoxilanas e outros componentes da parede
celular, como proteínas, celulose e lignina (AUTIO, 2006; GOESAERT et al., 2005;
VARDAKOU et al., 2003).
Diante a especificidade do substrato, o padrão de ação, interações com inibidores e
capacidade cinética, nem todas as xilanases são efetivas na panificação. As mais
adequadas são aquelas que atuam ativamente nas frações não solúveis, solubilizando a
fração da arabinoxilana e, consequentemente, aumentando a massa molecular da
arabinoxilana. Assim, há uma perda da capacidade de retenção da água e um aumento da
99
viscosidade (ROUAU et al., 1994; COURTIN et al., 1999; SORENSEN, 2003; SORENSEN
et al., 2004; VARDAKOU et al., 2003a). Por sua vez, o resultado é uma massa mais estável
e flexível, de fácil manuseio e melhor over spring. Consequentemente, obtém-se um pão
com um volume maior e com uma melhoria na estrutura de miolo; mais fino e mais macio
(COURTIN et al., 1999; QI SI e DROST-LUSTENBERGER, 2002; SORENSEN, 2003).
As xilanases das famílias GH8, GH10 e GH11 foram testadas em panificação, e
verificou-se que as xilanases GH10 não possuem um efeito positivo no volume do pão
(COLLINS et al., 2005). O extrato extracelular do fungo leveduriforme Aureobasidium
pullulans UFMG-Bro-53, fonte de enzimas das famílias GH10 e GH11, foi utilizado num
processo de panificação neste trabalho. O objetivo deste estudo foi investigar a influência
das xilanases deste extrato no volume do pão de forma e na firmeza de seu miolo. Uma
endoxilanase comercial GH11 foi usada como controle para avaliar a eficiência do extrato
extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 como aditivo em panificação.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Matéria prima
2.1.1 Ingredientes
Para produzir os pães de forma foram utilizados os seguintes ingredientes: farinha de
trigo branca da marca Vilma (com características analisadas); cloreto de sódio; açúcar
cristal; melhorador Zea 500 (lote 06869); amido de milho e/ou mandioca e/ou trigo; açúcar;
estabilizantes – monooleato de polioxietileno (20), sorbitana (INS 433), lecitina de soja (INS
322), ácido ascórbico (INS 300) e alfa-amilase (INS 1100); aromatizante artificial e corante
beta-caroteno sintético (INS 160ai); margarina da marca Coamo; fermento biológico úmido
(Saccharomyces cerevisiae) Fleischmann®; leite em pó (marca Tangará Foods); propionato
de cálcio.
2.1.2 Enzimas
O fungo leveduriforme A. pullulans-UFMG-Bro-53 foi usado para a produção de
xilanases usadas neste ensaio. As células foram pré-crescidas em meio líquido (pH inicial
100
igual a 5,0) em YNB-D-xilose (YNB, 6,7 g.L-1, D-xilose, 30 g.L-1), a 30 °C, 150 rpm em
agitador horizontal (modelo New Brunswick Scientific CO. INC. series 25), por 24 h. As
células foram obtidas por centrifugação (2,600×g por 15 min.) e inoculadas a uma DO600nm
entre 3 e 4, em frascos erlemeyers de 125 mL contendo meio com YNB, 6,7 g.L-1 e xilana
beechwood 10 g.L-1. As células foram cultivadas em 25 mL de meio, a 30 °C, 150 rpm por 72
h. A cultura foi centrifugada e o sobrenadante (extrato Bro-53) foi usado nos testes de
panificação.
Uma enzima comercial, Spring Mono (ou Pentopan Mono) (Novozymes), uma
endoxilanase de Thermomyces lanuginosus da família GH11, foi gentilmente cedida pela
Granotec (Curitiba, Brasil) para ser usada como referência.
2.2 Produção de pão de forma e avaliação da qualidade
A formulação padrão do pão de forma está apresentada na TAB. 1. Em cada ensaio
foram processados 1 kg de farinha de trigo, dando quatro pães de forma por ensaio. A
eficiência das preparações enzimáticas foi avaliada nesse experimento que foi realizado em
duplicatas.
O pão de forma foi preparado usando o método direto de massa. Os ingredientes,
juntamente com as várias preparações de enzimas, foram misturados em um mixer
automático espiral (marca Hypo-HAE 10). Este estágio foi conduzido em dois passos. O
primeiro, a uma velocidade baixa por 5 minutos e o segundo, a velocidade alta até o
desenvolvimento do glúten. A massa foi dividida em quatro porções iguais de 400 g. A
massa de cada porção foi trabalhada manualmente e deixada em descanso sob um material
plástico a uma temperatura inicial de 28,5°C por 15 min. Depois de modelados manualmente
as porções foram colocadas em forma untada e levadas para uma câmara de fermentação
por 100 minutos, a 30ºC, e umidade de 60% (controlada). Depois da fermentação foram
colocadas em forno (marca As), para assar a 180ºC por 20 min. Depois de assados, os pães
de forma foram retirados do recipiente e deixados em arrefecimento por duas horas. O
volume dos quatro pães foi medido para cada preparação enzimática usando o método de
deslocamento de sementes. Em seguida foram embalados em sacos de polipropileno em
temperatura ambiente e depois fatiado para análise de firmeza do miolo um dia depois do
processamento.
A textura dos pães foi determinada após 1 dia de armazenamento. Os parâmetros
utilizados na análise de textura instrumental foram: sonda de alumínio P/35; velocidade de
ensaio: 1,7 mm s-1, 40% de compressão da amostra; velocidade pré-teste: 1,7 mm s-1,
101
Velocidade pós-teste: 3,0 mm s-1; e força: 20 g (força de compressão) de acordo com o
métodos AACC número 74-09 (1995).
TABELA 1 – Formulação usada para a produção do pão de forma
Formulação
Ingrediente (g) (base de farinha)
Farinha 100
Água 65
Fermento 3
Sal 2
Açúcar 4
Margarina 3
Leite em pó 4
Propionato de cálcio 2
Melhorador 1
Fonte: adaptado de JAEKEL et al. (2012)
2.2.1 Atividade Enzimática
A atividade de xilanases foi determinada segundo método de BAILEY et al., (1980) e
os açúcares redutores, quantificados pelo método de DNS (MILLER, 1959). Uma unidade
internacional (U) é definida como, a quantidade de enzimas requerida para liberar 1
micromol de açúcares redutores por minuto. A atividade de protease foi determinada pela
incubação, a 30ºC durante 30 min, 1 mL de 2.5% de azocaseína preparada em tampão Tris
50 mM pH 8.0, com 1 mL de solução teste adequadamente diluída. Para paralisar a reação
foi usado 8 mL de ácido tricloroacético (TCA) 5%, em seguida a mistura foi centrifugada a
15,000xg por 5 min. Mol mL-1. Foi adicionado 5 mL de solução KOH 0,5 mol mL-1 e em
seguida foi medida a absorvância a 445 nm (CHARNEY e TOMARELLI et al.,1949).
2.2.2 Análise estatística
Foi feita a análise de variância (ANOVA) e a comparação entre as médias pelo teste
de Tukey (p≤ 0,05) com os resultados obtidos para volume do pão e a textura.
102
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O extrato extracelular de enzimas xilanolíticas foi produzido a partir do A. pullulans-
UFMG-Bro-53 e usado neste estudo para testar sua eficiência em panificação. O extrato
possui atividade de xilanase ótima a uma temperatura igual a 40°C; entretanto, a 30°C
apresenta mais de 75% da atividade ótima (Cap II). Esse extrato não apresenta atividade
proteolítica.
O volume é um dos parâmetros mais importantes para avaliar a qualidade do pão. A
adição de enzimas xilanolíticas, presentes no extrato A. pullulans-UFMG-Bro-53, na mistura
de panificação conduziu a um aumento no volume do pão de forma em relação ao controle
negativo, sem adição de enzimas de 8% (TAB. 2 e FIG. 1). O maior volume obtido pelo
extrato Bro-53 (1948 mL) não possui diferença significativa pelo teste de Tukey (p 0,05) da
mesma concentração usada (90 U kg-1 de farinha) da mistura comercial Spring mono. A
diferença entre o aumento do volume das mesmas foi de 5% (FIG. 1). O volume específico
dos pães de forma deste trabalho apresentaram valores que variaram de 4,9 (controle
negativo) a 5,7 mL g-1 (enzima comercial na concentração de 180 U kg-1 de farinha). O
extrato Bro-53 na concentração de 120 U kg-1 de farinha apresentou volume específico igual
a 5,3 mL g-1, valor maior que o encontrado por JAEKEL et al. (2012) para pão de forma de
farinha branca (5,1 mL g-1) usando uma xilanase comercial, e por ISHIDA (2012), que
determinou a média do volume específico de pão de forma de farinha branca no mercado
brasileiro (4,7 mL g-1).
TABELA 2 – Efeito da xilanase comercial Spring Mono e do extrato de xilanases Bro-53 no
volume do pão de forma.
Xilanase U Xilanase/kg de farinha
Volume (mL)
Controle negativo
0 1783c
Spring Mono (Xyl GH 11)
90 2055ab
Spring Mono (Xyl GH11)
180 2077a
Bro-53 (extrato - Xyl GH 10 e 11)
60 1625d
Bro-53 (extrato - Xyl GH 10 e 11)
90 1948b
Bro-53 (extrato - Xyl GH 10 e 11)
120 1946b
Bro-53 (extrato - Xyl GH 10 e 11)
180 1825c
Médias indicadas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p≤0,05).
103
Uma concentração maior que 120 U kg-1 de farinha deixou a massa pegajosa e com
uma menor viscosidade e, consequentemente, provocou uma diminuição no volume do pão.
Efeitos indesejáveis na qualidade de pão com super dosagem de uma mesma enzima já
foram relatados por vários autores (MCLEARY, 1986; MAAT et al., 1992; SI, 1997;
COURTIN e DELCOUR, 2002); contrariamente, esses efeitos não foram encontrados por
JIANG et al. (2005).
FIGURA 1 – Efeito de concentrações diferentes de xilanase comercial Spring Mono e do
extrato de xilanases Bro-53 no volume do pão de forma e percentagem média (%) de
aumento em relação ao controle negativo.
Em relação à firmeza (TAB. 3), os pães com preparações enzimáticas apresentaram
resultados menores quando comparados ao controle negativo, um dia após o
processamento, ou seja, com o pão ainda fresco. A preparação enzimática Bro-53 usando
90 U kg-1 de farinha reduziu 37,4% da firmeza do miolo quando comparado com o controle
negativo. A enzima comercial usando o dobro da concentração reduziu 43,8% da firmeza. O
aumento do volume do pão possivelmente está relacionado com a diminuição da firmeza do
miolo. Muitos estudos indicam que as xilanases podem reduzir a firmeza inicial do miolo do
pão (MARTÍNEZ-ANAYA et al., 1997; LAURIKAINEN et al., 1998; JIANG et al., 2005).
Volume Controle (-) SM 90 U/kg SM 180 U/kg Bro-53 90 U/kg Bro-53120 U/kg
Aumento 13% 14% 8% 8%
104
TABELA 3 – Efeito da xilanase comercial Spring Mono e do extrato de xilanases Bro-53 na
firmeza do miolo do pão de forma.
Xilanase U Xilanase/kg de farinha
Firmeza (g)
Controle negativo 0 312a
Spring Mono (Xyl GH 11) 90 189bc
Spring Mono (Xyl GH11) 180 175c
Bro-53 (extrato - Xyl GH 10 e 11) 90 195bc
Bro-53 (extrato-Xyl GH 10 e 11) 120 240b Médias indicadas pela mesma letra não diferem a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
O endurecimento do miolo pode ser atribuído a diferentes formas de cristalização do
amido, mudanças estruturais nas proteínas e xilanases e ainda na perda de umidade do pão
depois do processamento (OVADIA e WALKER, 1996; ESTELLER et al., 2004).
A eficiência do extrato de xilanases (GH10 e GH11) produzido por A. pullulans
UFMG-Bro-53 poderia apresentar um melhor efeito, perante a adição da fração pura da
xilanase GH 11. Essa hipótese é baseada no fato que xilanases GH 10 a partir de uma
Candida adeliae TAE85 não foram efetivas na melhoria da qualidade da massa (COLLINS et
al., 2005). Enzimas dessa família parecem agir na arabinoxilana solúvel em água. Segundo
BIELY et al. (1993; 1997), enzimas GH10 degradam a xilana a um maior grau e, de fato, a
sua utilização na panificação conduz frequentemente a massas pegajosas indesejáveis e a
uma perda excessiva de capacidade de retenção de água devido ao excesso de hidrólise da
arabinoxilana quer solúvel quer insolúvel (ROUAU et al., 1994; SORENSEN et al, 2004).
A enzima endoxilanase comercial Spring Mono GH11 de um Thermomyces
lanuginosus foi usada neste ensaio como controle positivo e, como esperado, teve um efeito
positivo em relação ao aumento do volume do pão de forma e à redução à firmeza do miolo.
De fato, todas as xilanases comerciais usadas em panificação industrial parecem pertencer
a GH 11 (TAB. 4).
Este estudo demonstrou que a adição de xilanases produzidas a partir do A.
pullulans-UFMG-Bro-53 na massa provocou efeitos positivos na qualidade do pão de forma,
sendo, portanto, uma importante fonte de enzimas xilanolíticas com aplicações promissoras
na indústria de alimentos, nomeadamente, em panificação.
105
TABELA 4 – Exemplos de enzimas comerciais comuns usadas em panificação
Produtor de Enzima Preparação Xilanase
Micro-organismo GH (Família)
AB enzymes Veron® 191 Aspergillus niger 11
Belden Puratos
Veron® Special Bacillus subtilis 11
Bel’ase B210 Bacillus subtilis 11
Bel’ase F25 Aspergillus niger 11
Danisco
Grindamyl TM H Aspergillus niger 11
GrindamylTM Powerbake
Bacillus subtilis 11
DSM
Bakezyme® HS Aspergillus niger 11
Bakezyme® BXP Bacillus subtilis 11
Genencor Intl.
Multifect® Xylanase Trichoderma reesei
11
Multifect® XL Trichoderma reesei
11
Novozymes Pentopan Mono* Thermomyces lanuginosus
11
*Mesma designação para Spring Mono como informado pela Novozyme-Brasil Fonte:
COLLINS et al., 2005
106
CONCLUSÕES
Os materiais lignocelulósicos, como a madeira e o bagaço de cana-de-açúcar em
decomposição, são uma importante fonte de exploração para o isolamento de leveduras
potencialmente produtoras de enzimas xilanolíticas. Neste trabalho foram obtidos 358
isolados de leveduras a partir destes materiais, dos quais 21% exibiram atividade xilanolítica
em meio sólido com xilana. Estes isolados produziram maiores níveis de atividade usando
xilana como indutor.
Embora as leveduras obtidas neste estudo tenham apresentado atividades xilanolíticas
inferiores às usualmente obtidas com fungos filamentosos as condições de produção destas
enzimas podem ser otimizadas e sujeitas a caracterização e testes de aplicação específica.
A identificação de características únicas tais como temperatura ótima de atividade,
especificidade e estabilidade, em detrimento de atividade específica elevada, pode permitir
uma potencial aplicação biotecnológica destas leveduras.
O extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 foi identificado como um potente
produtor de xilanases, tendo sido caracterizado após indução por xilana. Este extrato exibiu
uma atividade de xilanase semelhante a 30 e 50°C, o que poderá favorecer a sua aplicação
em processos de hidrólise enzimática de biomassa associada a processos fermentativos
(SSF) e em processos de panificação. O extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53
apresentou atividade máxima a 40°C e possui mais de 70% dessa atividade a 30°C. A faixa
ótima de pH (4-5) deste extrato também favorece a aplicação nos processos acima
indicados, uma vez que coincide com o pH ótimo para crescimento de leveduras e para o
processo de panificação (semelhante ao pH da massa).
A adsorção enzima-substrato resultou em uma maior estabilidade das enzimas xilanolíticas
do extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53.
O fracionamento do extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 mostrou a presença
de mais de uma proteína com atividade xilanolítica, sendo a fração de 22 kDa a mais
abundante do extrato, contribuindo, com as suas características específicas para definir
perfil de temperatura e pH do extrato (ótimos a 40ºC, pH 4,0).
107
O extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 mostrou ter especificidade de substrato
(xilana), não apresentando atividade celulolítica e nem proteolítica.
O extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 mostrou maior eficiência na hidrólise de
xilana beechwood (2% p/v) e de palha de trigo pré-tratada (10% p/v em sólidos) quando
comparado com a hemicelulase comercial Cellic HTec2, atingindo rendimento em xilose 5
vezes superior com palha de trigo.
A suplementação de celulases comerciais (e.g. Cellic CTec2) com hemicelulases como a
Cellic HTec2 e o extrato A. pullulans UFMG-Bro-53 aumenta não só o rendimento de
hidrólise da xilana como também da celulose em palha de trigo pré-tratada. Este fato
evidencia a importância das xilanases na degradação e valorização da biomassa
lignocelulósica.
O extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53 possui alto potencial para ser usado em
experimentos de SSF, por apresentar alta atividade a temperaturas de 30-35ºC. Nos
experimentos de SSF usando xilana beechwood como substrato, o extrato da XBro foi
determinante na produção de etanol por Spathaspora passalidarum UMFG-HMD-1.1
(rendimento de 0,2 g g-1), com atuação eficiente na degradação de xilana a xilose, com um
rendimento de hidrólise estimado em 66% em SSF (contra 17% em hidrólise enzimática).
Esse fato demonstra que a sacarificação e a fermentação em simultâneo aumenta a
extensão da hidrólise enzimática por remoção da inibição pelo(s) produto(s) da hidrólise.
A associação da levedura Sp. passalidarum UFMG-HMD1.1 a uma celulase comercial
(Cellic CTec2) suplementada com o extrato XBro promoveu também uma melhoria no
rendimento de conversão da palha de trigo a etanol(por comparação com Sc. cerevisiae
Ethanol Red e Cellic Ctec2) uma vez que o extrato terá aumentado a disponibilidade de
xilose, que poderá ser fermentada por Sp. passalidarum.
As xilanases presentes no extrato extracelular de A. pullulans UFMG-Bro-53, com atividade
significativa a temperaturas de 25-30ºC, contribuiram para a qualidade da massa dos pães
de forma, com resultados significativos no aumento do volume do pão e na redução da
firmeza do seu miolo.
Com este trabalho ficou demonstrado o potencial de aplicação de xilanases de leveduras ou
fungos leveduriformes em processos biotecnológicos que operam a temperaturas de 25-
108
35ºC como a produção de etanol lignocelulósico por sacarificação e fermentação simultânea
(SSF) e a panificação.
109
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APÊNDICE 1 Cromatografia de troca Iônica
Cromatograma - Coluna Resource Q
Cromatograma - Coluna I Mono S pH5.5
128
Cromatograma II Mono S – pH5.5
Cromatograma III Mono S pH 5.0
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Cromatograma IV Mono S pH 5.0