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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - MESTRADO

WANDERSON SILVA PEREIRA

Chenopodium ambrosioides L.: AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA E

AÇÃO NA RESPOSTA INFLAMATÓRIA

São Luís 2009

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WANDERSON SILVA PEREIRA

Chenopodium ambrosioides L.: AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA E

AÇÃO NA RESPOSTA INFLAMATÓRIA

São Luís 2009

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Maranhão, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientadora: Profª. Drª. Flávia Raquel Fernandes do Nascimento

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Pereira, Wanderson Silva Chenopodium ambrosioides L.: avaliação toxicológica e ação na resposta inflamatória/Wanderson Silva Pereira. – São Luís, 2009. _f. Impresso por computador (Fotocópia). Orientador: Flávia Raquel F. do Nascimento. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Maranhão, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2009.

1. Mastruz – Avaliação Toxicológica 2. Chenopodium

ambrosioides L. 3. Extrato Bruto Hidroalcoólico 4. Antiinflamatório 5. Edema de pata 6. Granuloma 7. Peritonite

CDU 582.683.2: 615.9

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a esta força maior que nos impulsiona para a realização

de todos os nossos objetivos, nos fortalece e nos guia, DEUS.

Em seguida, a uma pessoa eterna na minha vida, que posso sempre contar em

todos os momentos sejam bons ou ruins, que admiro pela garra de encarar os acasos da

vida, minha amiga, amor e mãe JANETE MENDES SILVA.

Aos meus avós Antero da Silva (in memorian) e Maria da Conceição Mendes (in

memorian). Tenho certeza que de onde estiverem estão orgulhosos por mais essa

conquista de um membro de sua família.

À minha orientadora Flávia Raquel F. Nascimento pelo apoio desde a graduação,

mostrando a importância de uma boa pesquisa e os melhores caminhos a serem tomados

na vida profissional de um cientista, pessoa que respeito e admiro.

As pessoas que amo muito e que fazem parte da minha vida, por sempre estarem

dispostos e terem palavras que me confortam. Sempre serei grato por Deus tê-los

colocados em meu caminho: Fernanda Sampaio, Graciomar Costa, Sanara Marques,

Deysianne Chagas, Priscila Barcelos, Tonicley Alexandre, Ailton Nunes, Mayara

Pinheiro, Fernando Patrício, Josias Brito, Johnny Ramos, Bruno de Paulo, Adriano

Fucht e Rafael Nery, obrigado pela companhia de vocês.

Aos amigos do mestrado Izabel Bogéa e Dênis Rômulo, pela companhia nas

aulas e desenvolvimento de atividades relacionadas à pós-graduação.

Ao Laboratório de Imunofisiologia da Universidade Federal do Maranhão pela

possibilidade de desenvolvimento deste trabalho (Lana, Abigail, Nádia, Leandro,

Thiare, Anne Karine, Aramys, Eder, Lucilene, Márcia, Mayara Cristina, Dona Joana,

Jardel e Hidel).

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A banca de qualificação composta pelas Profª Drª Rosane Guerra e a Profª Drª

Flávia Amaral pelas sugestões para o melhoramento do trabalho.

Ao mestrado de Ciências da Saúde que possibilitou a conquista de mais uma

etapa da minha vida profissional e ao CNPq pela bolsa que ajudou muito como

participações de eventos, aquisição de livros e estágio.

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“O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis”

José de Alencar

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RESUMO

Chenopodium ambrosioides L. (mastruz) é uma erva originária da América Central e do Sul, sendo um dos vegetais mais utilizados pela população brasileira para o tratamento de doenças pulmonares, distúrbios intestinais, hemorróidas, infecções fúngicas, helmínticas, contusões e equimoses. Experimentalmente, já foi demonstrado que esta espécie tem ação imunoestimulatória, anti-helmíntica, cicatrizante, anti-tumoral e anti-leishimanial. Além disso, a fitoquímica das folhas revela a presença de substâncias como flavonóides e terpenos, que podem apresentar um efeito anti-inflamatório. Dessa forma avaliamos o efeito do tratamento oral com o extrato bruto hidroalcoólico (EBH) das folhas de C. ambrosioides sobre a resposta inflamatória e sua toxicidade. Foram utilizados camundongos Swiss (5 animais/grupo), que receberam 100µL de EBH na dose de 5mg/kg durante 6 dias para a determinação de vias (intraperitoneal, subcutânea ou oral) utilizando modelos clássicos de inflamação como edema de pata, formação de granuloma e peritonite. Para avaliação do tratamento oral sobre a resposta imunológica, os animais receberam 100µL de EBH nas doses de 5 e 50mg/kg, ou água apiogênica durante 17 dias utilizando o modelo de formação de granuloma. Para a análise toxicológica (análise comportamental, avaliação da massa corpórea, massa dos órgãos vitais, celularidade de órgãos linfóides e avaliação bioquímica do soro), os camundongos receberam 100µL de EBH nas doses de 5, 50 e 500mg/kg ou água apiogênica. No modelo de edema de pata houve efeito anti-edematogênico quando o EBH foi administrado pelas vias IP, SC e oral. No granuloma de 6 dias, apenas o tratamento pela via oral apresentou efeito anti-inflamatório, enquanto pela via IP apresentou efeito pró-inflamatório e pela via SC não houve efeito. No granuloma de 17 dias o EBH na dose de 5mg/kg apresentou efeito anti-inflamatório, porém, na dose de 50mg/kg não houve diferenças significativas. O EBH não apresentou alterações no influxo celular da peritonite induzida por LPS. Ocorreu inibição da liberação espontânea de peróxido de hidrogênio (H2O2) no grupo EBH50 no modelo de granuloma, mas não houve alterações na liberação de H2O2 no modelo de peritonite. O EBH via oral na dose de 5mg/kg inibiu a produção de IL-4, IFN-γ e IL-2, mas não alterou a produção de IL-10. Entretanto, na dose de 50mg/kg houve inibição de IL-4 e IFN-γ, e aumento de IL-10, porém não foram observadas diferenças para IL-2. O EBH na dose de 5mg/kg não apresentou sinais de toxicidade, enquanto a dose de 50mg/kg induziu sinais de toxicidade renal e a dose de 500mg/kg induziu alterações de comportamento e fisiológicas, e sinais de hepatotoxicidade. Nossos dados mostram que o EBH de C. ambrosioides quando consumido, por via oral, a uma dose de 5mg/kg não promove toxicidade, mas apresenta efeito anti-inflamatório, tanto para inflamação aguda como crônica, agindo possivelmente na produção de prostaglandinas. No entanto, se faz necessários estudos que elucidem hipóteses aqui propostas e isolamento da molécula ativa anti-inflamatória para que futuramente se tenha um fitoterápico à base de

C. ambrosioides. Palavras-chave: Chenopodium ambrosioides, Extrato bruto hidroalcoólico, antiinflamatório, edema de pata, granuloma, peritonite, toxicologia.

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ABSTRACT Chenopodium ambrosioides L. (Mastruz) is a weed original from Central and South America. It`s one of the plants used by Brazilian people for the treatment of lung diseases, intestinal disorders, hemorrhoids, fungal and helminthic infections, contusions and bruises. Experimentally, has been shown that this species is an immunostimulant, anti-helminthic, healer, anti-tumoral and anti-leishimanial agent. Also, the phytochemistry of the leaves reveals the presence of flavonoids and terpenes, which are important for the anti-inflammatory effect. So we evaluated the effect caused by oral treatment with hydroalcoholic crude extract (HCE) from the leaves of C. ambrosioides on the inflammatory response and its toxicit. Swiss mice (5 animals/ group) were used. They received 100µL of (HCE) at the dose of 5mg/kg during 6 days for the determination of the route of administration (intraperitoneal, subcutaneous or oral) using classic models of inflammation as footpad oedema, granuloma formation by foreign body and peritonitis. For the evolution of the oral treatment on the immune response, the mice received 100µL of HCE at the dose 5 and 50mg/kg or aiogenic water for 17 days using the model of granuloma formation. For the toxicological analysis (behavioral analysis, evaluation of body mass, weight of vital organs, cellularity of lymphoid organs and serum biochemistry), the mice received 100µL of HCE at the dose of 5, 50 and 500mg/kg or apiogênica water. In the foodpad oedema model the anti-edematogenic effect was observed when the HCE was administered by IP, SC and oral. However, in 6 days granuloma only the oral treatment induced an anti-inflammatory effect, while the IP route was pro-inflammatory and the SC route showed no effect. In 17 days granuloma, the HCE at the dose of 5mg/kg showed an anti-inflammatory effect, however, at the dose of 50 mg/kg there were no significant differences. The HCE showed no changes in cellular influx of peritonitis induced by LPS. There was inhibition of spontaneous release of hydrogen peroxide (H2O2) in group EBH50 in the model of granuloma, but no changes in the release of H2O2 in the model of peritonitis. The HCE when administered orally at the dose of 5mg/kg inhibited the production of IL-4, IFN-γ and IL-2 but did not alter the concentration of IL-10. Meanwhile, at the dose of 50mg/kg it inhibited the IL-4 and IFN-γ and increased IL-10, but no differences were observed for IL-2. The HCE at the dose of 5mg/kg did not promote toxicity, while at the dose of 50 mg/kg induced signs of renal toxicity and the dose of 500mg/kg induced behavior changes and signs of hepatotoxicity. Our data showed that the HCE of C. ambrosioides when used by oral route at a dose of 5mg/kg does not promote toxicity, but has an anti-inflammatory effect for acute and chronic inflammations, possibly acting in the production of prostaglandins. However, it is necessary to study elucidative proposals here mentioned and the isolation of the active anti-inflammatory molecule so a phytotherapic based in C. ambrosioides can be made in the future.

Keywords: Chenopodium ambrosioides, hydroalcoholic crude extract, anti-

inflammatory, footpad oedema, granuloma, peritonitis, toxicology.

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LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO II

Tabela 1 - Efeitos do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o comportamento.....................................................................

69

Tabela 2 - Efeitos do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o peso dos órgãos vitais...........................................................

71

Tabela 3 - Efeitos do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o número de células dos órgãos linfóides................................

72

Tabela 4 - Efeitos do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a bioquímica sanguínea............................................................

73

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LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Figura 1 – Aspecto das partes aéreas de Chenopodium ambrosioides............................ 27 Figura 2 - Efeitos do tratamento por diferentes vias com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a indução de edema de pata por carragenina 1%.......................

33

Figura 3 - Efeitos do tratamento por diferentes vias com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a formação de granuloma por corpo estranho............................

35

Figura 4 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides no número de células peritoneais.........................................................................................

36

Figura 5 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a liberação de H2O2.............................................................................................................

37

Figura 6 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a formação de granuloma por corpo estranho.....................................................................

38

Figura 7 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o peso dos órgãos linfóides na inflamação crônica.............................................................

39

Figura 8 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o número de células dos órgãos linfóides na inflamação crônica...................................

40

Figura 9 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a determinação da liberação de H2O2 na inflamação crônica.............................................

41

Figura 10 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a liberação de citocinas....................................................................................................

42

CAPÍTULO 2

Figura 1 - Efeitos do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a variação ponderal....................................................................

70

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AGL – Ácidos graxos livres

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância

ALT – Alanina-aminotransferase

AST – Aspartato aminotransferase

BCG – Bacilo de Calmette-Guérin

COX2 – Cicloxigenase 2

D.O – Densidade óptica

DMSO – Dimetil sulfóxido

EBH – Extrato bruto hidroalcoólico

H2O2 – Peróxido de hidrogênio

HDL – Lipoproteína de alta densidade

IFN-γ – Interferon-gama

IL - Interleucina

IP – Intraperitoneal

LDL – Lipoproteína de baixa densidade

LPS – Lipopolissacarídeo

NK – “Natural Killer”

NO – Óxido nítrico

OMS – Organização Mundial de Saúde

PA – Peso do animal

PBS – Solução salina tamponada com fosfato

PG – Prostaglandinas

PF – Peso final

PI – Peso inicial

PMA – Acetato miristato de forbol

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PO – Peso do órgão

SC – Subcutâneo

SFB – Soro fetal bovino

TGA – Enzimas transaminase glutâmico pirúvica

TGO – Enzimas transaminase glutâmico

Th – Célula T auxiliar

VLDL – Lipoproteína de muito baixa densidade

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

INTRODUÇÃO........................................................................................................... 16

REFERÊNCIAS........................................................................................................... 18

CAPÍTULO I: AVALIAÇÃO DO TRATAMENTO COM Chenopodium

ambrosioides POR DIFERENTES VIAS SOBRE PROCESSO INFLAMATÓRIO

I.1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 20

I.2 OBJETIVOS........................................................................................................... 25

I.3 MATERIAL E MÉTODOS

I.3.1 Animais................................................................................................................ 26 I.3.2 Espécie Vegetal.................................................................................................... 26 I.3.3 Obtenção do extrato bruto hidroalcoólico (EBH) das folhas de Chenopodium

ambrosioides................................................................................................................. 27 I.3.4 Modelos de inflamação........................................................................................ 28 I.3.4.1 Indução de edema de pata por carragenina....................................................... 28 I.3.4.2 Formação de granuloma por corpo estranho...................................................... 29 I.3.4.2.1 Determinação de citocinas no soro................................................................. 29 I.3.4.3 Peritonite induzida por Lipopolissacarídeo (LPS)............................................. 30 I.3.5 Determinação da liberação do peróxido de hidrogênio (H2O2)............................ 30 I.3.6 Análise estatística................................................................................................. 30

I.4 RESULTADOS

I.4.1 Efeito do tratamento com EBH por diferentes vias sobre a resposta inflamatória

I.4.1.1 Efeitos sobre indução de edema de pata por carragenina.................................. 32 I.4.1.2 Efeitos sobre a Formação de granuloma por corpo estranho............................ 34 I.4.2 Efeito do tratamento com EBH por via oral I.4.2.1 Efeitos sobre indução de peritonite por lipopolissacarídeo (LPS).................... 36 I.4.2.2 Efeitos sobre a liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2)........................... 37 I.4.2.3 Efeitos sobre a formação de granuloma por corpo estranho crônico................ 38 I.4.2.4 Efeitos sobre o peso e o número de células dos órgãos linfóides na inflamação crônica........................................................................................................

39

I.4.2.5 Liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2)................................................... 41 I.4.2.6 Efeitos sobre a produção e liberação de citocinas............................................. 42 I.5 DISCUSSÃO.......................................................................................................... 43

I.6 CONCLUSÕES...................................................................................................... 51

14

REFERÊNCIAS........................................................................................................... 52

CAPÍTULO II: AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA E BIOQUÍMICA DO TRATAMENTO SUBCRÔNICA ORAL COM EXTRATO BRUTO HIDROALCOÓLICO DE Chenopodium ambrosioides

II.1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 59

II.2 OBJETIVOS.......................................................................................................... 62

II.3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 63

II.3.1 Animais............................................................................................................... 63 II.3.2 Obtenção do extrato bruto hidroalcoólico (EBH) das folhas de Chenopodium

ambrosioides................................................................................................................ 63 II.3.3 Análise toxicológica............................................................................................ 64 II.3.3.1 Quantificação das células peritoniais............................................................... 64 II.3.3.2 Quantificação das células obtidas da medula óssea......................................... 65 II.3.3.3 Quantificação das células obtidas do baço...................................................... 65 II.3.3.4 Quantificação das células obtidas do linfonodo.............................................. 65 II.3.3.5 Análise bioquímica........................................................................................... 66 II.3.3.5.1 Dosagem de colesterol total.......................................................................... 66 II.3.3.5.2 Dosagem de triglicerídeos............................................................................. 66 II.3.3.5.3 Dosagem de proteínas totais......................................................................... 67 II.3.3.5.4 Dosagem de albumina................................................................................... 67 II.3.3.5.5 Dosagem de uréia.......................................................................................... 67 II.3.4 Análise estatística................................................................................................ 68 II.4 RESULTADOS..................................................................................................... 69

II.4.1 Avaliação toxicológica

II.4.1.1 Efeitos sobre o comportamento e a fisiologia dos camundongos..................... 69 II.4.1.2 Efeitos sobre a variação ponderal.................................................................... 70 II.4.1.3 Efeitos sobre o peso dos órgãos vitais............................................................. 71 II.4.1.4 Efeitos sobre o número de células dos órgãos linfóides.................................. 72 II.4.1.5 Efeitos sobre a bioquímica sanguínea.............................................................. 73 II.5 DISCUSSÃO.......................................................................................................... 74

II.6 CONCLUSÕES..................................................................................................... 81

REFERÊNCIAS........................................................................................................... 82

ANEXOS

15

16

INTRODUÇÃO

No Brasil, a flora nativa compreende cerca de 120000 espécies de plantas

superiores, as quais os indígenas usaram e ainda usam para o tratamento de seus males

ou como veneno em suas guerras e caçadas (Sarti; Carvalho, 2004). A utilização de

plantas em enfermidades é uma das mais antigas formas de prática medicinal da

humanidade. O interesse em medicamentos derivados de plantas superiores,

especialmente fitoterápicos, aumentou expressivamente na última década. Estima-se que

em torno de 25% de todos os medicamentos modernos sejam derivados direta ou

indiretamente de plantas superiores (Calixto, 2000). Esse consumo é feito com pouca ou

nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas. Sua utilização visa o

tratamento, cura e prevenção de doenças (Veiga Junior et al., 2005).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), para que uma espécie vegetal

seja utilizada como fitoterápico deve obedecer a um critério básico de não toxicidade

(WHO, 1978), mesmo assim, mais de 80% da população dos países em

desenvolvimento depende da medicina tradicional ou de medicamentos a base de

plantas, como sua fonte primária de cuidados com a saúde (WHO, 2002).

Pesquisas realizadas para avaliação do uso seguro de plantas medicinais e

fitoterápicos no Brasil ainda são incipientes e alguns dados têm mostrado que a

utilização de plantas como Chenopodium ambrosioides pode apresentar benefícios

diversos à saúde.

Estudos etnofarmacológicos registram que a população brasileira utiliza

C. ambrosioides na forma de chás, infusões ou xaropes, no tratamento de afecções

pulmonares e distúrbios intestinais (Chevallier, 1996), hemorróidas (Masucci, 1992),

inflamações (Moraes, 1996), infecções fúngicas e helmínticas (Vieira, 1992), úlceras

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leishmanióticas (França et al., 1996), contusões e equimoses (Lorenzi; Matos, 2002).

Entretanto, apesar da larga utilização, alguns relatos de toxicidade têm sido feitos

(Chevallier, 1996; Ruffa et al., 2002), podendo causar sintomas como convulsões,

irritação de mucosas, vômitos, vertigens, dores de cabeça, problemas renais e hepáticos,

e surdez temporária (Paciornik, 1990). Esse efeito tóxico é dependente da dose como a

maioria das drogas e é causada principalmente por um monoterpeno constituinte de seu

óleo essencial denominado ascaridol, assim como outras substâncias (Cavalli et al.,

2004).

Com isso, o presente trabalho teve como objetivo mostrar o efeito do extrato

bruto hidroalcoólico (EBH) das folhas de C. ambrosioides sobre o processo

inflamatório e analisar sua toxicidade. Para melhor entendimento do propósito, no

capítulo I apresentaremos os diferentes efeitos observados devido ao tratamento com

C. ambrosioides por diferentes vias sobre processo inflamatório e no capítulo II

abordaremos os efeitos tóxicos e alterações na bioquímica sanguínea devido ao

tratamento subcrônico por via oral com EBH das folhas de C. ambrosioides.

18

REFERÊNCIAS

CALIXTO, J. B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal medicines (phytotherapeutic agents). Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33: 179-189, 2000. CAVALLI, J. F.; TOMI, F.; BERNARDINI, A. F.; CASANOVA, J. Combined analysis of the essential oil of Chenopodium ambrosioides by GC, GC–MS and 13CNMR spectroscopy: quantitative determination of ascaridole, a heatsensitive compound. Phytochemical Analysis, 15: 275-279, 2004. CHEVALLIER, A. The encyclopedia of medicinal plants. New York: A D K Publiching Book, 1996. FRANCA, F.; LAGO, E. L.; MARSDEN, P. D. Plants used in the treatment of leishmanial ulcers due to Leishmania (Viannia) braziliensis in an endemic area of Bahia. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 29: 229-232, 1996. LORENZI, H.; MATOS, F. J. A. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas. Nova Odessa – SP: Instituto Plantarum de Estudos da Flora, 542p, 2002. MASUCCI, O. As plantas como remédio na cura de doenças. São Paulo: Brasileiros, 1992. MORAES, E. M. Perfil botânico, químico, farmacológico e toxicológico das plantas medicinais utilizadas no Maranhão. Monografia de conclusão de curso (Graduação em Farmácia) – Universidade Federal do Maranhão, 1996. PACIORNIK, E. F. A planta nossa de cada dia: plantas medicinais – descrição e uso. 2.ed. Curitiba: Gráfica Copygraf. 92p, 1990. RUFFA, M. J.; FERRARO, G.; WAGNER, M. L.; CALCAGNO, M. L.; CAMPOS, R. H.; CAVALLO, L. Cytotoxic effect of Argentine medicinal plant extracts on human hepatocellular carcinoma cell line. Journal of Ethnopharmacology, 79: 335-339, 2002. SARTI, S. J.; CARVALHO, J. C. T. Fitoterapia e fitoterápicos. In: CARVALHO, J. C. T. Fitoterápicos anti-inflamatórios: aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas. Ribeirão Preto, SP: Tecmedd, p.13-38, 2004. VEIGA JUNIOR, V. F.; PINTO, A. C.; MACIEL, M. A. M. Plantas medicinais: cura segura? Química Nova, 28: 519-528, 2005. VIEIRA, L. S. Fitoterapia da Amazônia: manual de plantas medicinais. São Paulo: Agronômica Ceres, 1992.

19

WORLD HEALTH ORGANIZATION. The promotion and Development of Traditional Medicine Technical Report Series no. 615. WHO, Geneva, pp. 1-15, 1978. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Traditional Medicine Strategy 2002-2005. Geneva, 2002.

20

21

I.1 INTRODUÇÃO

O gênero Chenopodium pertence à família Chenopodiaceae e compreende cerca

de 120 espécies de ervas perenes ou anuais. As folhas são alternas, flores pequenas e

andróginas ou ainda unissexuadas; sementes livres ou aderentes e frutos envoltos

totalmente, ou em parte, pelo cálice. O gênero é abundante nos trópicos e regiões

adjacentes especialmente na América Tropical e África, onde pode ser encontrada uma

grande variedade de espécies com propriedades medicinais (Pio Correa, 1984).

Chenopodium ambrosioides L. é uma erva originária da América Central e do

Sul, porém hoje é considerada cosmopolita e pode ser encontrada na forma silvestre ou

cultivada em várias partes do mundo (Chevallier, 1996). Apresenta porte herbáceo com

forte aroma, normalmente ereto, com cerca de 1m de altura. A reprodução ocorre por

sementes. A produção de sementes é muito intensa, podendo chegar a dezenas de

milhares por planta. Essa espécie prefere solos de textura média, com boa fertilidade e

suprimento moderado de água, tolerando solos salinos. É espécie comum no Brasil,

onde é conhecida popularmente por mastruz, mastruço ou erva-de-Santa-Maria

(Lorenzi; Matos, 2002).

C. ambrosioides é largamente utilizado, principalmente no Maranhão, para o

tratamento de doenças inflamatórias (Moraes, 1996). A palavra inflamação, do grego

phlogosis e do latim flamma, significa fogo, área em chamas. O primeiro autor a listar

os quatro sinais cardinais da inflamação foi Celsius, um escritor romano do século I

d.c., que relatou o aumento no fluxo sanguíneo e a dilatação dos pequenos vasos, rubor,

a permeabilidade vascular aumentada, tumor, que levaria a um aumento na temperatura

local, calor, à passagem de células do sangue circulante e dor local, dolor (Rocha;

Garcia, 2006).

22

Hoje, estudos microscópicos estabelecem os sinais clínicos da inflamação como

resultados da vasodilatação, acúmulo de leucócitos, aumento do fluido intersticial e

estimulação dos terminais nervosos por mediadores (Aller et al., 2007).

A inflamação é uma resposta complexa do tecido conjuntivo vascularizado à

infecção, antígenos ou lesão tecidual e tem por função erradicar os agentes microbianos

ou irritantes, e potencializar o reparo tecidual (Nathan, 2002; Tracey, 2002; Sherwood;

Toliver-Kinsky, 2004; Flower; Perretti, 2005).

A terapia popular para processos inflamatórios consiste na administração oral de

preparações vegetais e também no uso tópico desses produtos sobre as lesões. Muitas

vezes essa prática é empírica, visto que grande parte dos usuários, não tem noção da real

eficácia deste tratamento, tão pouco dos possíveis efeitos colaterais. Há estudos

mostrando que alguns produtos naturais consumidos pela população não possuem a

atividade para o qual são utilizados. Então, o estudo químico e biológico das espécies

mais utilizadas pela população torna-se importante no sentido de comprovar ou não, a

eficácia destes produtos.

Estudos quanto à ação de C. ambrosioides sobre o processo inflamatório ainda

são bastante controversos. Neste contexto, a inflamação está dividida em várias etapas,

que se iniciam com o aumento da permeabilidade, extravasamento e formação de

edema, característica da fase aguda, até uma fase mais tardia que envolve migração

celular. A migração é um processo dependente da produção local de quimiocinas, que

atuam principalmente na quimiotaxia de leucócitos, monócitos, neutrófilos e outras

células efetoras do sangue para os locais com infecções ou lesões (Kunkel; Butcher,

2002).

Vários modelos inflamatórios foram desenvolvidos para determinar os

mecanismos e constituintes envolvidos no processo inflamatório e com isso avaliar a

23

ação de fitoterápicos ou drogas, usados nos tratamentos de doenças inflamatórias. Esses

modelos permitem investigar como os extratos podem estar agindo sobre as várias fases

do processo inflamatório.

O modelo de edema de pata, por exemplo, simula uma inflamação aguda, que se

trata de uma resposta imediata, que tem curta duração, sejam minutos, horas ou dias.

Suas principais características são: alterações no calibre vascular levando a um aumento

do fluxo sangüíneo local; mudanças estruturais na microvasculatura que permite a saída

de proteínas plasmáticas e de leucócitos, formando edema e migração de leucócitos da

microcirculação (Chertov et al., 2000).

Esse modelo é um protótipo da fase exsudativa da inflamação induzido pela

aplicação de carragenina que se apresenta como um evento bifásico (Vinegar et al.,

1969), onde a fase inicial é atribuída à liberação de histamina e de serotonina na 1ª hora

(Crunkhon; Meacock, 1971). O aumento da permeabilidade vascular então é mantido

até 2 horas e meia. Após esse período, até 6 horas, há produção de mediadores químicos

como prostaglandinas devido à liberação de cininas como bradicininas, de proteases e

de lisossomos, que estão intimamente associados à migração de leucócitos para o sitio

inflamado, caracterizando assim a segunda fase do edema (Vinegar et al., 1969;

Crunkhon; Meacock, 1971). Essa migração de neutrófilos, monócitos e células natural

killer (NK) é comumente iniciada em respostas inatas, através da geração local de

mediadores inflamatórios, como quimiocinas e citocinas específicas, seguindo uma

lesão inflamatória (Nourshargh; Marelli-Berg, 2005).

A passagem dos leucócitos do compartimento vascular para o tecido

extravascular é guiada por interações adesivas específicas entre os leucócitos e as

células endoteliais. A seqüência de eventos envolvidos nestes processos compõe a teoria

do recrutamento leucocitário. Envolve marginação e captura dos leucócitos livres

24

circulantes do lúmen vascular; rolagem, ativação, firme adesão e extensão na superfície

do endotélio; com subseqüente movimento através da barreira das células endoteliais,

também chamado de diapedese (Nourshargh; Marelli-Berg, 2005); passo seguido da

migração quimiotática dos leucócitos (Wagner; Roth, 2000; Walzog; Gaehtgens, 2000);

destruição tecidual e as tentativas de cicatrização. Esses processos caracterizam a

inflamação crônica.

A inflamação crônica granulomatosa pode ser de dois tipos: granuloma de corpo

estranho, geralmente inerte; e granuloma imune, formado por reações mediadas por

células T a antígenos pouco degradáveis. No granuloma existem células epitelióides

(que se unem formando células gigantes multinucleadas), linfócitos, plasmócitos,

neutrófilos e em seu interior ocorre necrose. Os granulomas são característicos de

doenças causadas por agentes infecciosos particulares, por poeiras minerais ou por

outras condições desconhecidas (Alexander et al., 1999).

O granuloma induzido pela implantação de algodão simula e permite a avaliação

de três fases: a fase transudativa que ocorre logo nas 3 primeiras horas; a fase

exsudativa que ocorre entre 3 e 72 horas e a fase proliferativa que ocorre entre 3 e 6 dias

depois do implante (Swingle; Shideman, 1972). O granuloma é caracterizado pelo

acúmulo de macrófagos que se organizam ao redor do corpo estranho (Ismail et al.,

1997). Essa reação granulomatosa ao corpo estranho é dependente de elementos

imunológicos, sendo a infiltração celular das lesões decorrentes da ativação de diversos

mediadores químicos (Warren, 1976; Jiranek et al., 1995) produzidos principalmente,

pelos macrófagos isolados, os quais liberam ânion superóxido, prostaglandinas

(Umezawa et al., 1974; Chensue et al., 1983), óxido nítrico (Iuvane et al., 1994) e outras

substâncias efetoras.

25

Outro modelo de inflamação é a peritonite, que simula uma resposta inflamatória

pela presença de microorganismos como bactérias patogênicas ou ainda pela presença

de substâncias estranhas ao organismo. Esse modelo pode ser induzido pela aplicação

intraperitoneal de BCG (Bacilo de Calmette-Guérin), carragenina, LPS

(lipopolissacarídeo) de Escherichia coli, uma bactéria gram-positiva, ou qualquer outro

agente flogístico capaz de desencadear migração, proliferação e ativação de macrófagos,

neutrófilos e linfócitos, tanto para cavidade peritoneal quanto para os órgãos linfóides.

Além de aumentar a expressão de moléculas de adesão como as selectinas P ou E na

superfície de células endoteliais, poucos minutos após a exposição aos leucotrienos B4,

fragmentos C5a do complemento, ou a histamina, que é liberada pelos mastócitos em

resposta a presença de C5a (Godaly et al., 2001; Bochenska-Marciniak et al., 2003).

Dessa forma, ensaios experimentais devem ser feitos para investigar se o uso dos

extratos já utilizados pela população possui real efeito anti-inflamatório. Tais estudos

poderão possibilitar a descoberta de uma terapia alternativa no tratamento de

inflamações, de forma que beneficie as classes menos favorecidas que são as mais

atingidas, já que o tratamento convencional possui um custo elevado. O uso de

fitoterápicos tem aumentado bastante e estudos que visam um tratamento alternativo

para doenças como a artrite reumatóide (Lipsky; Tao, 1997) e lupus eritomatoso (Qin et

al., 1981), se faz necessário. Então, condições inflamatórias como essas expostas e

trabalhos desenvolvidos por Nascimento et al. (2006), Cruz et al. (2007) e Patrício et al.

(2008), impulsionaram o desenvolvimento deste estudo para o entendimento dos

processos desencadeados pela presença do EBH de C. ambrosioides no mecanismo

inflamatório.

26

I.2 OBJETIVOS

I.2.1 Geral

Avaliar o efeito do tratamento com extrato bruto hidroalcoólico (EBH) das

folhas de Chenopodium ambrosioides sobre o processo inflamatório em camundongos.

I.2.2 Específicos

Analisar o efeito de diferentes vias de tratamento com EBH sobre o processo

inflamatório utilizando vários modelos;

Investigar o efeito do EBH sobre a liberação de peróxido de hidrogênio por

células peritoneais;

Determinar o efeito do EBH sobre o peso e quantidade de células linfóides;

Determinar o efeito do EBH sobre a produção de citocinas.

27

I.3 MATERIAL E MÉTODOS

I.3.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss machos (5 animais/grupo), com 8 a 12

semanas de idade, pesando em média 25g, obtidos no Biotério Central da Universidade

Federal do Maranhão, São Luís, MA, Brasil. Os animais foram mantidos a temperatura

média de 26 + 2ºC e umidade relativa de 44-56%, sob ciclos normais de dia e noite de

12 horas. Os animais tiveram livre acesso a ração esterilizada e água acidificada. Todos

os procedimentos foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Maranhão (Protocolo: 012975/2008-43).

I.3.2 Espécie vegetal

I.3.2.1 Classificação botânica

Segundo Joly (2002) a espécie vegetal apresenta a seguinte taxonomia:

Reino: Vegetal

Divisão: Angiosperma

Classe: Dicotyledoneae

Sub-classe: Archichlamydeae

Ordem: Centrospermae

Família: Chenopodiaceae

Gênero: Chenopodium

Espécie: Chenopodium ambrosioides

28

Figura 1- Aspecto das partes áereas de Chenopodium ambrosioides. A coleta foi feita no Herbário Ático Seabra da Universidade Federal do Maranhão.

I.3.3 Obtenção do extrato bruto hidroalcoólico (EBH) das folhas de Chenopodium

ambrosioides

Folhas de C. ambrosioides L. (Chenopodiaceae) foram coletadas no Horto

Medicinal Berta Lages de Morretes e identificadas no Herbário Ático Seabra da

Universidade Federal do Maranhão, São Luís, MA, Brasil (nº 0998). O material foi seco

a uma temperatura de 37ºC à temperatura ambiente e em seguida as folhas foram

pulverizadas. A extração foi feita por maceração utilizando-se 200g do pó em 1L de

etanol 70% e foi agitado de 8 em 8 horas. Após 24h, o macerado foi filtrado e

novamente foi acrescentado 1L de etanol 70%, este procedimento de remaceração foi

repetido quatro vezes. O último filtrado foi levado ao um rotaevaporador sob pressão

29

reduzida para concentração do extrato. O rendimento final obtido foi de 10,4% (p/p).

Finalmente, o extrato foi seco. Para o uso foi sempre diluído em água apiogênica.

I.3.4 Modelos de inflamação

I.3.4.1 Indução de edema de pata por carragenina

Seguindo o modelo descrito por Winter et al. (1962), 50µL de carragenina a 1%

foram injetados no coxim plantar das patas traseiras esquerdas 1h após o tratamento

pelas vias subcutânea (SC), oral por gavagem ou intraperitoneal (IP) com 100µL do

EBH na dose de 5mg/kg do peso do animal. Os camundongos do grupo controle

receberam 100µL de água apiogênica. As medidas foram feitas no sentido dorso -

plantar da pata com um paquímetro digital, no tempo zero e após 1, 3, 6 e 24 horas de

injeção de carragenina 1%. A diferença entre o tamanho das patas foi considerada como

o edema formado.

I.3.4.2 Formação de granuloma por corpo estranho

O método adotado para formação de granuloma seguiu o descrito por Swingle e

Shideman (1972) com algumas modificações. Os animais foram previamente

anestesiados com solução de cloridrato de xilazina 2% (Rompum®) (20 mg/kg) e

Cloridato de ketamina 5% (Vetanarcol®) (25 mg/kg), na proporção de 2:1, via

intramuscular. Em seguida, foi feita uma pequena incisão na pele da região dorsal para a

introdução subcutânea de algodão, previamente esterilizado e pesado. No primeiro

experimento, os camundongos foram tratados com 100µL do EBH nas doses de 5mg/kg

ou água apiogênica pelas vias SC, oral ou IP, por 6 dias consecutivos.

30

No segundo experimento, os camundongos foram tratados com 100µL do EBH

nas doses de 5mg/kg e 50mg/kg ou água apiogênica, apenas por via oral durante 17 dias

consecutivos. Os sacrificados ocorrerem no 7º no primeiro experimento e 18º dia no

segundo experimento, quando os implantes de algodão foram retirados e pesados para

obtenção do peso úmido.

Após a obtenção do peso úmido, os implantes de algodão foram então

dessecados em estufa à 37ºC durante 24 horas e pesados novamente para avaliar o peso

seco do granuloma. A partir do peso final foi calculado o peso do granuloma utilizando

a seguinte fórmula:

Peso do granuloma (seco ou úmido) = Pf - Pi, onde Pf é o peso final e Pi é o

peso inicial da bola de algodão.

I.3.4.2.1 Determinação de citocinas no soro

Foram utilizados soros obtidos em grupos de camundongos tratados ou não

com o EBH. Os soros foram obtidos 17 dias após a indução do granuloma por corpo

estranho. A quantificação das citocinas foi realizada em placas de microtitulação com

96 poços de fundo chato (Costar), revestidas com 100µL de anticorpos primários: anti-

IL2; anti-IL4; anti-IL10 e anti-IFNγ e incubadas 18horas à 4ºC. Após incubação as placas

foram lavadas 6 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) + Tween 20

(300µL/poço) e bloqueadas com PBS 10% SFB (Soro Fetal Bovino) inativado a

200µL/poço durante 1 hora a temperatura ambiente. Os poços foram aspirados e lavados

mais 6 vezes com PBS+Tween. Os soros foram adicionados (100µL amostra/poço) e

incubados por 24 horas a 4ºC. Os poços foram aspirados e lavados 6 vezes com

PBS+Tween (300µL/poço). Após as 6 lavagens foram adicionados 100µL do anticorpo

31

de detecção conjugado a avidina por poço. As placas foram incubadas por 1 hora e em

seguida foram lavadas 6 vezes. Foram adicionados 100µL da solução de substrato. As

placas foram incubadas por 30 minutos no escuro. O bloqueio da reação por adição de

50µL de solução de NaOH 1N. A leitura da densidade óptica foi realizada em leitor

automático de ELISA com absorbância em 405nm (Dynatech) conforme descrito por

Avrameas et al, (1979) com algumas modificações propostas pelo fabricante

(Biosciences).

I.3.4.3 Peritonite induzida por lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli

O volume de 100µL do EBH na dose de 5mg/Kg ou de água apiogênica foi

administrado por via oral durante 3 dias após o dia zero. Do dia 1 ao 3, os camundongos

receberam por via IP 10µg de LPS diluído. No 4º dia, os animais foram sacrificados e a

cavidade peritoneal foi lavada com 5 mL de PBS estéril para obtenção das células que

foram contadas em Câmara de Neubauer com auxilio de microscópio óptico de luz

comum. Para a realização da contagem diferencial, foi feito um ajuste de células para 4

x 106 células/ml. Desse rendimento, uma alíquota de 200µL foi colocada em spin para a

preparação de lâminas com células peritoneais que foram posteriormente coradas e

contadas em microscópio de luz comum.

I.3.5 Determinação da liberação do peróxido de hidrogênio (H2O2)

A liberação de H2O2 foi determinada pelo método de oxidação do vermelho de

fenol dependente de peroxidase conforme descrito por Pick e Keisari (1980) modificado

por Russo et al. (1989). Alíquotas de 100µL da suspensão celular (2 x 106 células/mL),

32

em solução de vermelho de fenol, foram transferidas para cada poço da placa de cultura

de fundo chato (96 poços). Amostras individuais foram quadruplicadas. Em 2 destes

poços foram acrescentados 10ng/poço de acetato miristato de forbol (PMA) diluído em

dimetil sulfóxido (DMSO). A placa foi incubada à 37ºC em atmosfera úmida contendo

CO2 (5%) por 1 hora. Em seguida, a placa foi centrifugada e o sobrenadante transferido

para outra placa. A reação foi interrompida pela adição de 10µL de NaOH 1N por poço.

A absorbância foi determinada em leitor de ELISA (Titertek-Multiscan), com filtro de

620 nm. O branco foi constituído por solução de vermelho de fenol. Os resultados

obtidos em densidade óptica (D.O) foram transformados em µM de H2O2, mediante

equação de regressão linear com base nos valores obtidos na curva padrão feita com

concentrações conhecidas de peróxido de hidrogênio (5, 10, 20 e 40 µM de H2O2).

I.3.6 Análise estatística

Os dados foram expressos como a média + erro padrão da média (S.E.M.). A

análise estatística foi feita por ANOVA seguida do teste de comparação múltipla de

Tukey’s ou teste t de Student, sendo o nível de significância < 0,05.

33

I.4 RESULTADOS

I.4.1 EFEITO DO TRATAMENTO COM EBH POR DIFERENTES VIAS

SOBRE A RESPOSTA INFLAMATÓRIA

I.4.1.1 Efeitos sobre o edema de pata induzido por carragenina

O EBH na dose de 5 mg/kg quando administrado pelas vias IP, SC e oral (Figura

2A, B e C) inibiu significativamente o desenvolvimento do edema de pata 3 horas após

a injeção de 50µL de carragenina. A diminuição mais expressiva ocorreu no grupo

tratado por via oral (Figura 2C). No entanto, quando avaliamos o efeito do extrato após

24 horas da indução da inflamação observamos que o tratamento com EBH por

quaisquer vias inibiu a inflamação, sendo que o grupo IP apresentou maior inibição

(Figura 2A).

34

Figura 2 - Efeitos do tratamento por diferentes vias com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a indução de edema de pata por carragenina. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados com 100µL por via IP (A), SC (B) ou oral (C) nas doses de 5mg/Kg ou água apiogênica (grupo controle) 1 hora antes da indução do edema de pata. O edema foi induzido pela injeção de 50µL de carragenina 1% no coxim plantar da pata traseira esquerda. As patas foram medidas com paquímetro digital nos tempos 0, 1, 3, 6 e 24 horas após a indução. Os dados representam a média ± erro padrão da média de cinco animais/grupo. * p ≤ 0,05 em relação ao grupo controle.

A

B

C

35

I.4.1.2 Efeitos sobre a formação de granuloma por corpo estranho

O tratamento diário, por via IP ou oral, durante 6 dias, com 100µL de EBH

(5mg/kg) induziu aumento no extravasamento do exsudado inflamatório (Figura 3A e

C). No entanto, quando os animais foram tratados por via SC o EBH não apresentou

efeitos (Figura 3B).

Quando avaliamos o peso de células presente no granuloma observamos que, o

tratamento diário por via oral reduziu a formação do granuloma (Figura 3F). Nos grupos

tratados por via IP, ao contrário, ocorreu aumento no número de células no foco

inflamatório (Figura 3D). O tratamento via SC não induziu alterações em relação ao

grupo controle (Figura 3E).

36

CONTROLE EBH50.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

*G

ranulo

ma: Peso

úm

ido (g)

CONTROLE EBH50.000

0.005

0.010

0.015

0.020

*

Gra

nulo

ma: Peso

seco

(g)

CONTROLE EBH50.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

Gra

nulo

ma: Peso ú

mid

o (g)

CONTROLE EBH50.000

0.005

0.010

0.015

0.020

Gra

nulo

ma: Peso

seco

(g)

CONTROLE EBH50.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

*

Gra

nulo

ma: Peso

úm

ido (g)

CONTROLE EBH50.000

0.005

0.010

0.015

0.020

*

Gra

nulo

ma: Peso

seco

(g)

Figura 3 - Efeitos do tratamento por diferentes vias com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a formação de granuloma por corpo estranho. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados com 100µL por via IP (A e D), SC (B e E), ou oral (C e F) nas doses de 5mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica. Após 6 dias de tratamento os animas foram sacrificados e as pelotas de algodão foram retiradas e pesadas para obtenção do peso úmido (A, B e C), logo após as pelotas foram colocadas em estufa à 37°C para obtenção do peso seco (D, E e F). A diferença entre os pesos finais e as iniciais representou o granuloma formado. Os dados representam a média ± erro padrão da média de cinco animais/grupo. * p ≤ 0,05 em relação ao grupo controle.

A

B

C F

E

D

37

I.4.2 EFEITO DO TRATAMENTO COM EBH POR VIA ORAL

I.4.2.1 Efeitos sobre a indução de peritonite por lipopolissacarídeo (LPS)

Camundongos tratados via oral com EBH não apresentaram diferenças significativas

sobre a indução da peritonite provocada pela injeção de LPS. Ao avaliarmos a contagem

diferencial de células também não foi observada nenhuma diferença em relação ao

grupo controle (Figura 4)

Total Macrófago Linfócito Neutrófilo Eosinófilo Mastócito0

1

2

3

4

5

6

CONTROLE EBH

Núm

ero

de c

élu

las (x10

6/m

L)

Figura 4 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides no número de células peritoneais. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados via oral na dose de 5mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica 1 dia antes da indução de peritonite com LPS 10µg. Após 4 dias de tratamentos consecutivos, foi feita a quantificação de células totais da cavidade peritoneal e contagem diferencial. Os dados representam a média ± erro padrão de cinco animais/grupo em relação ao grupo controle.

38

I.4.2.2 Efeitos sobre a liberação de H2O2 pelas células peritoneais

Camundongos que desenvolveram peritonite pela injeção de LPS e tratados com

EBH via oral apresentaram produção espontânea de H2O2 com a mesma magnitude que

o grupo controle (Figura 5).

CONTROLE EBH50

20

40

60

80

µM

H

2O

2

Figura 5 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a liberação de H2O2. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados via oral na dose de 5mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica 1 dia antes da indução de peritonite com LPS 10µg. Após 4 dias de tratamentos consecutivos, foi feita a determinação da liberação H2O2. Os dados representam a média ± erro padrão de cinco animais/grupo em relação ao grupo controle. * p ≤ 0,05 em relação ao grupo controle.

39

I.4.2.3 Efeitos sobre a formação de granuloma por corpo estranho crônico

Após 17 dias de tratamento consecutivo com EBH5 ocorreu inibição da

formação do granuloma como um todo, tanto no peso úmido (Figura 6A) quanto no

peso seco (Figura 6B). O grupo EBH50 não apresentou diferença significativa da

formação do granuloma em relação ao grupo controle.

CONTROLE EBH5 EBH500.00

0.05

0.10

0.15

*

Peso

úm

ido (g)

CONTROLE EBH5 EBH500.00

0.01

0.02

0.03

0.04

*

º

Peso

seco (g)

Figura 6 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a formação de granuloma por corpo estranho. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados com 100µL pela via oral nas doses de 5mg/Kg (EBH5) ou 50mg/kg (EBH50), enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica. Após 17 dias de tratamento os animas foram sacrificados e as pelotas de algodão foram retiradas e pesadas para obtenção do peso úmido (A), logo após as pelotas foram colocadas em estufa à 37°C para obtenção do peso seco (B). A diferença entre os pesos finais e as iniciais representou o granuloma formado. Os dados representam a média ± erro padrão de cinco animais/grupo. * p ≤ 0,05 em relação ao grupo controle, º p ≤ 0,05 em relação ao grupo EBH5.

A

B

40

I.4.2.4 Efeitos sobre o peso e o número de células dos órgãos linfóides na

inflamação crônica

Animais do grupo EBH5 com inflamação crônica apresentaram aumento apenas

no peso do linfonodo inguinal, enquanto o grupo EBH50 apresentou aumento do peso

do baço e do linfonodo inguinal. No entanto, não houve alteração do peso do linfonodo

mesentérico em relação ao grupo controle (Figura 7).

CONTROLE EBH5 EBH500

50

100

150

*

Baço

(m

g)

CONTROLE EBH5 EBH500

5

10

15

20

* *

Lin

fonodo inguin

al (m

g)

CONTROLE EBH5 EBH500

5

10

15

20

Lin

fonodo m

ese

nté

rico

(m

g)

Figura 7 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o peso dos órgãos linfóides na inflamação crônica. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados via oral nas doses de 5mg/Kg ou 50mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica. Após 17 tratamentos diários, os animas com granuloma foram sacrificados, necropsiados e o baço (A), linfonodo inguinal (B) e linfonodo mesentérico (C) foram pesados. Os dados representam a média ± erro padrão de cinco animais/grupo. * p ≤ 0,05 em relação ao grupo controle.

A

B

C

41

O número de células da medula óssea, peritônio e linfonodo não foram

modificados pelo tratamento com EBH nas duas concentrações testadas, assim como no

grupo EBH5 do baço e EBH50 do linfonodo mesentérico. No entanto, houve diferenças

significativas no número total de células esplênicas no grupo EBH5 e linfóides no grupo

EBH50 (Figura 8).

CONTROLE EBH5 EBH500

5

10

15

20*º

Baço (

x10

8/m

L)

CONTROLE EBH5 EBH500

5

10

15

Medula

óssea (

x10

6/m

L)

CONTROLE EBH5 EBH500

2

4

6

8

Peritô

nio

(x10

6/m

L)

CONTROLE EBH5 EBH500

5

10

15

*

Lin

fonodo m

ese

nté

rico (x1

06/m

L)

CONTROLE EBH5 EBH500

2

4

6

8

Lin

fonodo inguin

al (x

10

6 /m

L)

Figura 8 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o número de células dos órgãos linfóides na inflamação crônica. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados via oral nas doses de 5mg/Kg; 50mg/Kg; 500mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica. Após 17 dias de tratamentos diários, foi feita a quantificação de células do baço (A), medula óssea (B), peritônio (C), linfonodo mesentérico (D) e linfonodo inguinal (E). Os dados representam a média ± erro padrão de cinco animais/grupo. * p ≤ 0,05 em relação ao grupo controle e º p ≤ 0,05 em relação ao grupo EBH5.

A

B C

D E

42

I.4.2.5 Efeitos sobre a determinação da liberação de H2O2 na inflamação crônica

Camundongos que desenvolveram processo inflamatório crônico apresentaram

inibição da produção espontânea de H2O2 quando tratados com EBH na dose de

50mg/kg em relação ao grupo controle (Figura 9).

CONTROLE EBH5 EBH500

5

10

15

20

*

µM

H2O

2

Figura 9 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a liberação de H2O2 na inflamação crônica. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados via oral nas doses de 5mg/Kg ou 50mg/kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica, durante 17 dias de tratamentos. No 18º dia foi feito lavado peritoneal e logo depois foi feita a determinação da liberação H2O2. Os dados representam a média ± erro padrão de cinco animais/grupo em relação ao grupo controle. * p ≤ 0,05 em relação ao grupo controle e º p ≤ 0,05 em relação ao grupo EBH5.

43

I.4.2.6 Efeitos sobre a produção e liberação de citocinas.

O tratamento com EBH inibiu a produção de IL-4 de forma dose dependente e

de IFN-γ nos grupos EBH5 e EBH50. A redução na produção de IL-2 foi observada

somente no grupo EBH5. Por outro lado, foi observado aumento significativo na

produção de IL-10 no grupo EBH50 (Figura 10).

CONTROLE EBH5 EBH500

20

40

60

80

*

*ºIL-4

(pg/m

L)

CONTROLE EBH5 EBH500

50

100

150

200

* *IFN

- γ (pg/m

L)

CONTROLE EBH5 EBH500

20

40

60

*

IL-2

(pg/m

L)

CONTROLE EBH5 EBH500

20

40

60

*º

IL-1

0 (pg/m

L)

Figura 10 - Efeitos do tratamento oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a produção e liberação de citocinas. Camundongos Swiss foram tratados, via oral, com 5mg/Kg ou 50mg/kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica, durante 17 dias. No 18º dia foi obtido soro dos animais para a determinação da liberação de citocinas IL-4 (A), IFN-γ (B), IL-2 (C) e IL-10 (D). Os dados representam a média ± erro padrão de cinco animais/grupo em relação ao grupo controle. * p ≤ 0,05 em relação ao grupo controle e º p ≤ 0,05 em relação ao grupo EBH5.

A B

C D

44

I.5 DISCUSSÃO

Chenopodium ambrosioides L. é largamente utilizado no Brasil para o

tratamento de problemas hepáticos, bronquite, tuberculose e hematomas (Di Stasi et al.,

1989). Essa utilização deve-se principalmente ao baixo custo, fácil acesso e

manipulação, entretanto, na maioria dos casos, é usada sem nenhuma comprovação

cientifica do seu real efeito (Oliveira, 2001).

Apesar deste vegetal apresentar estudos quanto sua atividade moluscicida

(Hmamouchi et al., 2000), fungicida (Delespaul et al., 2000), nematicida (Insunza et al.,

2001), larvicida (Morsy et al., 1998), alelopática (Osornio et al., 1996), antibacteriana

(Lall; Meyer, 1999), antitumoral (Nascimento et al., 2006) e antileishmanial (Bezerra et

al., 2006; Patrício et al., 2008), ainda não há dados que revelem a melhor via de

tratamento e seu efeito sobre o processo inflamatório agudo e crônico.

Os modelos inflamatórios como o modelo de indução de edema de pata (Winter

et al., 1962) e formação de granuloma por corpo estranho (Swingle; Shideman, 1972),

foram desenvolvidos para a avaliação dos mecanismos envolvidos no processo

inflamatório. Diante dessas ferramentas de pesquisas, podemos avaliar qual a via mais

eficaz de administração com fitoterápicos.

Neste estudo, o EBH das folhas de C. ambrosioides apresentou efeito anti-

edematogênico pelo modelo de edema de pata independentemente da via de tratamento.

Porém, esse efeito anti-inflamatório foi mais evidente nos grupos tratados por via oral,

tendo como referência a 3ª hora, onde ocorre pico máximo de edema nesse modelo.

Curiosamente, Ibironke e Ajiboye (2007) mostraram que o tratamento em ratos Wistar 1

hora antes, com extrato metanólico das folhas de C. ambrosioides induziu inibição do

edema quando utilizou a maior dose (700mg/kg) por via oral.

45

A administração por via IP apresenta maior alcance do produto à circulação

sanguínea, devido à alta vascularização da cavidade peritoneal, tendo uma rápida

absorção venosa do princípio ativo. Apesar disso, pode-se observar que para o modelo

de edema de pata induzido por carragenina aqui empregado, o EBH mesmo sendo

consumido em pequenas doses agiu na inflamação aguda, independente da via de

administração utilizada.

No entanto, resultados como os obtidos por Patrício et al. (2008) mostram que a

depender da via de administração e o tipo de inflamação, pode-se obter dados bem

diferentes. Eles mostraram que camundongos com patas infectadas com Leishmania

amazonensis apresentavam aumento de sua espessura quando tratados por via IP com

EBH de C. ambrosioides na dose de 5mg/kg. No entanto, quando tratados por via oral

havia diminuição do tamanho da espessura da pata, mesmo não estando relacionado à

carga parasitária presente, tendo um resultado dependente da via de administração.

A ação anti-edematogênica do EBH das folhas de C. ambrosioides

possivelmente não está relacionada a uma inibição dos processos iniciais da resposta

inflamatória, mas sim a inibição de mediadores químicos como prostaglandinas e

leucotrienos. Segundo Castro et al. (1968) e Di Rosa et al. (1971), o aumento da

permeabilidade vascular só é mantida até 2 horas e meia, após a indução da inflamação,

após isso e até as 6 horas seguintes, quando há produção de prostaglandinas,

leucotrienos e cininas, moléculas que estão intimamente associadas a migração de

leucócitos para o sitio inflamatório. Essa segunda fase do edema é sensível à maioria

dos antiinflamatórios (Smucker et al., 1967), como também ocorreu em nossos

experimentos.

Após 24 horas da indução do edema de pata o efeito anti-inflamatório foi mais

evidente nos grupos tratados por via IP. A inibição do tratamento pelas vias IP, oral e

46

SC possivelmente está relacionada à ação do EBH sobre a síntese de prostaglandinas E2

a partir do ácido araquidônico que é mediada pela ação da enzima cicloxigenase 2

(COX2) (Gilroy et al., 1999).

Dessa forma, investigamos se esse efeito inibitório também atingia outras fases

da resposta inflamatória, então verificamos o efeito do EBH sobre a formação do

granuloma induzido pela implantação de algodão. O EBH apresentou efeito pró-

edematogênico quando os animais foram tratados por 6 dias consecutivos, pelas vias IP

ou oral. Camundongos submetidos ao tratamento, via SC, não apresentaram diferenças

significativas quanto a formação do granuloma em relação ao grupo controle.

Quando foi analisada a ação do EBH sobre a migração celular e a formação do

granuloma com tratamentos pelas diferentes vias, somente a via oral apresentou ação

inibitória. Em contrapartida, quando os camundongos foram tratados por via IP ocorreu

um aumento na migração celular. O tratamento feito por via SC não foi capaz de

interferir nesse processo. Diante dos resultados obtidos, sugere-se que para o tratamento

de inflamações agudas e crônicas, a melhor via de administração do EBH seria a oral.

Então, buscamos avaliar o efeito do tratamento oral com diferentes doses sobre

processos inflamatórios crônicos e como essa ação pode interferir no balanço de

citocinas e liberação de H2O2.

O modelo de peritonite induzida por LPS, mostrou que o tratamento com EBH

não teve efeito quanto à migração celular ou liberação de H2O2. O LPS de Escherichia

coli é um agente flogógeno clássico que induz vasodilatação e aumento da

permeabilidade vascular devido à liberação de histamina, serotonina e principalmente

protaglandinas E2, seguida de migração celular (Chace et al., 1995). Nesse modelo, a

injeção consecutiva de 3 dias de LPS se faz necessário para que seja capaz de montar

uma resposta inflamatória. Os receptores que reconhecem LPS são encontrados em

47

células dendríticas e macrófagos e se associam a receptores de sinalização TLR-4 tipo

Toll, os quais ativam o fator de transcrição NFκB, que é responsável pela indução da

expressão de citocinas que estimulam a migração celular (Belz et al., 2002).

A partir desses dados obtidos, testamos o efeito de duas doses do EBH (5 e

50mg/kg) na inflamação crônica usando o modelo de granuloma. Após 17 dias de

tratamento consecutivos, por via oral, com EBH, ocorreu inibição da formação do

granuloma no grupo EBH5, tanto na primeira fase onde há participação da liberação de

histamina, serotonina e bradicinina. Quanto na segunda fase quando há ativação de

macrófagos e sua diferenciação em células gigantes e epitelióides, células que se

organizam em camadas concêntricas ao redor do corpo estranho (Kunkel et al., 1989).

O grupo EBH50 não apresentou diferença significativa da formação do

granuloma (peso úmido e seco) em relação ao grupo controle. Esse modelo como

relatado anteriormente, apresenta uma seqüência de eventos onde há estímulo da

resposta imunológica, produção de anticorpos, interleucinas e a formação de tecido

granulomatoso sobre o algodão (Ukwe, 1996). Suba et al. (2005) que avaliaram a

eficácia do extrato de Barleria lupulina, mostraram que esse vegetal, que é rico em

flavonóides foi capaz de inibir a formação do granuloma por corpo estranho, assim

como visto em nosso estudo.

Deve-se ressaltar que as espécies vegetais ricas em compostos fenólicos, como

taninos e flavonóides, são atualmente bastante investigados quanto a sua relação a

efeitos anti-inflamatórios (Feldman et al., 2002; Calixto et al., 2003; 2004). A avaliação

fitoquímica do EBH detectou a presença de flavonóides, o que poderia estar associado à

ação anti-inflamatória, por possuir efeitos inibitórios sobre proteínas que induzem

permeabilidade capilar, exsudação e migração de leucócitos (Pelzer et al., 1998). Além

disso, os flavonóides assim como alcalóides apresentam capacidade de inibir tanto as

48

vias da cicloxigenase quanto a 5-lipoxigenase do metabolismo do ácido araquidônico

que contribui para a atividade anti-inflamatória (Viji; Helen, 2008).

Wu et al. (2006) ao estudarem a atividade de flavonóides totais de Laggera

pterodonta mostraram efeito anti-inflamatório tanto no modelo de edema de pata quanto

no modelo de granuloma por corpo estranho. Esse efeito anti-inflamatório pode estar

relacionado primeiro a um possível mecanismo que envolve a inibição da formação de

prostaglandinas no local da inflamação, parcialmente associado a sua influência sobre

um sistema antioxidante (Defeudis et al., 2003; Takeoka; Dao, 2003), ou ainda pode

estar relacionado a ação sobre aos radicais de oxigênio, superprodução de óxido nítrico

(NO), que também desempenha um importante papel em diversos modelos de

inflamação (Cuzzocrea et al., 1998). No entanto, quando avaliamos a produção de NO

no modelo de granuloma crônico de 17 dias, não houve sua produção em nenhum dos

grupos tratados com C. ambrosioides e nem no grupo controle.

C. ambrosioides, além de flavonóides, também apresenta em sua composição

terpenóides (Defeudis et al., 2003; Takeoka; Dao, 2003). Segundo Channa et al. (2006),

Bacopa monniera apresenta triterpenos e ácido betulínico como responsáveis pela

atividade anti-inflamatória desse vegetal devido à inibição de prostaglandinas.

A inibição de mediadores inflamatórios como prostaglandinas que é um dos

responsáveis pela atração de células para o foco inflamatório se relacionou apenas a

ação do EBH5 na inibição de migração celular. No entanto, é necessário investigar se

C. ambrosioides também tem efeito sobre os mecanismos de proliferação e maturação

celular. Para isso, foram retirados órgãos linfóides como baço, linfonodo inguinal e

mesentérico, e medula óssea, além do lavado peritoneal.

Animais do grupo EBH5 apresentaram aumento do peso do linfonodo inguinal,

enquanto que o grupo EBH50 apresentou aumento do peso do baço e do linfonodo

49

inguinal em relação ao grupo controle. Quanto ao número de células totais verificamos

aumento significativo no número de células do linfonodo mesentérico (EBH5) e

esplênicas no grupo EBH50. Estes resultados indicam que C. ambrosioides

possivelmente pode ter estimulado a maturação de células linfóides inguinais por drenar

células provenientes da lesão no dorso nos grupos EBH5 e EBH50, e a proliferação de

células do linfonodo mesentérico que drena a região do trato gastrointestinal no grupo

EBH5.

No entanto, fica claro que no modelo de granuloma o EBH apresentou efeito

sistêmico já que foram verificadas alterações tanto na celularidade do baço como do

linfonodo mesentérico. Esse efeito sistêmico também pode ser comprovado pela

diferença encontrada quanto à liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2). Nesse caso

ocorreu redução na liberação espontânea de H2O2 no grupo EBH50. O H2O2 assim

como ânion superóxido, radicais hidroxila e outros reativos intermediários de oxigênio,

são radicais livres produzidos por neutrófilos e macrófagos (Bogdan et al., 2000).

A formação de granuloma é usualmente decorrente da presença de células

gigantes, oriundas da fusão de macrófagos e presença de células T auxiliares (Th2).

Essas células parecem participar de granulomas juntamente com células Th1, talvez

para regular a atividade e prevenir lesões tissulares disseminadas (Koguchi; Kawakami,

2002). As células Th1 atuam na ativação de macrófagos, células natural killer (NK),

células dendríticas, proliferação de células T e reações inflamatórias. Enquanto, as

células Th2 atuam na estimulação de linfócitos B, nas respostas alérgicas, anti-

helmínticas, além de inibir a diferenciação de células Th0 em Th2. Cada grupo de

citocinas produzido por um desses tipos celulares inibe a produção de citocinas pelo

outro tipo, de forma que Th1 e Th2 se auto-regulam (O’shea et al., 2002). As células

Th1 produzem, por exemplo, IFN-γ e IL-2, e as células Th2 auxiliam produzindo IL-4,

50

IL-5, IL-9 e IL-13, as quais vão estimular linfócitos B a produzirem anticorpos (O’shea

et al., 2002). Há ainda uma população de células denominadas Treg que são capazes de

produzir IL-10, que funciona como uma citocina anti-inflamatória (Kotenko, 2002).

Quando analisada a produção de citocinas, foi verificada inibição na produção

de IFN-γ e de IL-4, sendo que a inibição de IL-4 foi dose dependente nos grupos EBH5

e EBH50. Redução de IL-2 ocorreu apenas no grupo EBH5. A IL-4 quando presente

junto a IL-6 propicia a diferenciação de células T CD4 em Th2, e quando junto ou

separado da IL-10 inibem a geração de células Th1 (Moser; Murphy, 2000). A presença

de IFN-γ, por sua vez, resulta em ativação de macrófagos (Monney et al., 2002), e

enquanto que a IL-2 estimula a proliferação de células T efetoras (Koguchi; Kawakami,

2002). Como as células T efetoras são importantes para a formação de granuloma, é

razoável supor que o balanço de citocinas visto no grupo EBH5, não é capaz de

polarizar a resposta inflamatória para um padrão especifico Th1 ou Th2.

Todavia, nossos dados mostram aumento significativo na produção de IL-10 no

grupo EBH50. O aumento de IL-10 também pode estar relacionado ao aumento do

número de células totais do baço no grupo EBH50, já que as células B, assim como

células TCD4+, macrófagos e queratonócitos, são responsáveis pela expressão dessa

citocina. Além disso, a indução de IL-10 tem sido usada na imunoterapia (Van Scott et

al., 2000; Kunihiko et al., 2002), devido a sua importância no processo de modulação da

resposta inflamatória por sua atividade inibidora da diferenciação de células Th1

(Gonzalo et al., 2001). Esse mecanismo pode explicar a inibição de IFN-γ no grupo

EBH50, pois o IFN-γ é produzido por células Th1.

Nossos dados mostram que o EBH de C. ambrosioides quando aplicado por via

oral na concentração de 5mg/kg apresenta efeito anti-inflamatório, tanto para

inflamações agudas como crônicas, agindo possivelmente na produção de

51

prostaglandinas. Porém, não é capaz desviar a resposta imunológica para um padrão

Th2 de resposta.

52

I.6 CONCLUSÕES

- No modelo de edema de pata o EBH das folhas de C. ambrosioides na dose de 5mg/kg

apresentou efeito anti-edematogênico quando administrado pelas vias IP, SC e oral. No

entanto, em granulomas de 6 dias apenas o tratamento pela via oral apresentou efeito

anti-inflamatório, por outro lado, o tratamento IP apresentou efeito pró-inflamatório

nesse modelo.

- O tratamento oral com EBH (5mg/kg) apresentou efeito anti-inflamatório para

inflamações crônicas. O que não ocorreu com a dose de 50mg/kg.

- O tratamento oral com EBH (5mg/kg) não induziu alteração na produção e liberação

H2O2 em nenhum dos ensaios. Porém, o tratamento na maior dose para o modelo de

granuloma induziu inibição na produção e liberação de H2O2.

- O tratamento oral com EBH (5mg/kg) inibiu a produção de IL-4, IFN-γ e IL-2, mas

não alterou a concentração de IL-10. Entretanto, na dose de 50mg/kg promoveu inibição

de IL-4 e IFN-γ, e aumentou IL-10.

53

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60

61

II.1 INTRODUÇÃO

A importância das pesquisas com plantas medicinais como Chenopodium

ambrosioides no Brasil, um país em desenvolvimento, ocorre por diversos motivos,

dentre os quais, destacamos o fato desse país possuir uma das maiores biodiversidades

vegetais do mundo, e o crescimento de pesquisas nessa área serem inferiores a 10% ao

ano. Essa carência de informações adequadas sobre aspectos como eficácia e segurança

desses produtos, estimula a crescente exclusão de espécies nativas da medicina e dos

guias farmacêuticos oficiais (Brandão et al., 2006; 2008).

Apesar disso, há uma larga utilização de forma indiscriminada e alguns relatos

de toxicidade têm sido feitos (Chevallier, 1996, Ruffa et al., 2002), e descrevem o óleo

essencial extraído da espécie C. ambrosioides como tóxico para rins e fígado, induzindo

náuseas e vômitos, além de ser irritante para membranas de mucosas do trato

gastrointestinal. Esses efeitos podem ser comprovados quando analisadas a bioquímica

séricas de algumas proteínas. Entre elas, as enzimas transaminase glutâmico oxalacética

(TGO) e transaminase glutâmico pirúvica (TGP), que quando em níveis elevados,

revelam indicativo de que pode haver danos hepáticos (Paciornik, 1990; Burtis;

Ashwood, 1998; Lehninger, 2006).

Altas doses do óleo de C. ambrosioides têm causado efeitos tóxicos tanto para o

homem quanto para ratos (De Pascual et al., 1980). Entre os principais efeitos podemos

citar gastroenterites, alterações do sistema nervoso central, dor de cabeça, rubor facial,

visão embaçada e vertigem. Esses efeitos estão associados à presença de monoterpenos

como ascaridol, além da presença de peróxido terpênico, que corresponde a cerca de

70% dos compostos do óleo. Adicionalmente estão presentes limoneno,

62

transpiranocarveol, ascaridiol-glicol, aritasona, β-pineno, mirceno, felandreno, alcafor e

α-terpineol (De Pascual et al., 1980; Sagrero-Nieves; Bartley, 1995).

Além do óleo também já foi relatado o efeito tóxico provocado pelo consumo do

extrato de folhas de C. ambrosioides. Leão et al. (2007) demonstraram que o tratamento

oral com o extrato aquoso, em ratos Wistar, alterou a concentração de TGO e TGP,

além de ser capaz de causar discretas tumefações celulares no fígado.

No entanto, os efeitos tóxicos do extrato de C. ambrosioides são controversos,

pois a depender da dose consumida, este vegetal pode ter efeitos terapêuticos sem

causar danos à morfologia e funcionalidade de órgãos como fígado e rim. Por exemplo,

Patrício et al. (2008) demonstraram que camundongos C3H/HePas, infectados com

Leishmania amazonensis, quando tratados por 15 dias com extrato hidroalcoólico de

C. ambrosioides na dose de 5mg/kg não apresentaram alterações de peso e nem

evidências de alterações microscópicas em órgãos vitais.

Outros estudos relatam que tanto o óleo quanto o extrato das folhas de

C. ambrosioides apresentam efeitos terapêuticos importantes como ação anti-helmíntica

para Ancylostoma duodenale, Trichuris trichiura e Ascaris lumbricoides (Giove, 1996;

Macdonald et al., 2004), atividade anti-Trypanosoma cruzi (Kiuchi et al., 2002),

Plasmodium falciparum (Pollack et al., 1990) e anti-Leishmania amazonensis (Monzote

et al., 2006; Patrício et al., 2008). Além disso, as folhas de C. ambrosioides têm sido

usadas para o tratamento de ulcerações dérmicas causada por Leishmania (França et al.,

1996; Moreira et al., 2002).

Experimentalmente, já foi constatado que C. ambrosioides tem ação

estimulatória de linfócitos (Rossi-Bergamann et al., 1997; Cruz et al., 2007),

cicatrizante (Lisboa Neto et al., 1998; Pinheiro Neto et al., 2005) e anti-tumoral

(Nascimento et al., 2006). Possivelmente essas atividades estejam relacionadas à

63

presença de flavonóides e terpenóides que apresentam diversas propriedades

farmacológicas incluindo efeitos antioxidantes e anti-tumoral (Di Carlo et al., 1999;

Kiuchi et al., 2002; Liu, 2004).

Considerando os resultados de atividade anti-inflamatória observada, bem como

os demais efeitos biológicos observados por outros autores, faz-se necessária a

avaliação da segurança da utilização desse produto. Com base nisso, investigamos a

toxicologia subcrônica do EBH de C. ambrosioides sobre o sistema nervoso central e

periférico, utilizando análises das alterações comportamentais. Além de avaliar seu

efeito sobre a estrutura normal dos órgãos e sobre sua funcionalidade com base em

análises bioquímicas sanguíneas.

64

II.2 OBJETIVOS

II.2.1 Geral

Avaliar a toxicidade do tratamento subcrônico com extrato bruto hidroalcoólico

(EBH) das folhas de Chenopodium ambrosioides em camundongos.

II.2.2 Específicos

Avaliar a toxicidade do tratamento subcrônico com EBH em camundongos

Investigar as alterações bioquímicas sanguíneas devido ao tratamento subcrônico

com EBH em camundongos

65

II.3 MATERIAL E MÉTODOS

II.3.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss machos (5 animais/grupo), com 8 a 12

semanas de idade, pesando em média 25g, obtidos no Biotério Central da Universidade

Federal do Maranhão, São Luís, MA, Brasil. Os animais foram mantidos a temperatura

média de 26 + 2ºC e umidade relativa de 44-56%, sob ciclos normais de claro e noite de

12 horas. Os animais tiveram livre acesso a ração esterilizada e água acidificada. Todos

os procedimentos foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Maranhão (Protocolo: 012975/2008-43).

II.3.2 Obtenção do extrato bruto hidroalcoólico (EBH) das folhas de Chenopodium

ambrosioides

Folhas de C. ambrosioides L. (Chenopodiaceae) foram coletadas no Horto

Medicinal Berta Lages de Morretes e identificadas no Herbário Ático Seabra da

Universidade Federal do Maranhão, São Luís, MA, Brasil (nº 0998). O material foi seco

a uma temperatura de 37ºC à temperatura ambiente e em seguida as folhas foram

pulverizadas. A extração foi feita por maceração utilizando-se 200g do pó em 1L de

etanol 70% e foi agitado de 8 em 8 horas. Após 24h, o macerado foi filtrado e

novamente foi acrescentado 1L de etanol 70%, este procedimento de remaceração foi

repetido quatro vezes. O último filtrado foi levado ao um rotaevaporador sob pressão

reduzida para concentração do extrato. O rendimento final obtido foi de 10,4% (p/p).

Finalmente, o extrato foi seco. Para o uso foi sempre diluído em água apiogênica.

66

II.3.3 Análise toxicológica

Na avaliação da toxicidade subcrônica, os animais foram pesados e divididos em

quatro grupos experimentais com 5 animais/grupo. Os grupos receberam EBH por

gavagem, diariamente, durante 14 dias nas doses de 5mg/Kg (EBH 5), 50mg/Kg (EBH

50) ou 500mg/Kg (EBH 500). O grupo controle recebeu apenas água apiogênica.

Os animais foram acompanhados e avaliados por 24 horas, quanto a parâmetros

comportamentais e fisiológicos conforme tabela em anexo para detecção de possíveis

efeitos tóxicos sobre o sistema nervoso central e periférico (Almeida et al., 1999). A

partir do terceiro dia de tratamento, os animais foram avaliados diariamente para

acompanhamento da mortalidade. Após 15 dias do tratamento, os animais foram

pesados e mortos. Foi feita a necropsia, considerando o aspecto macroscópico e o peso

do pulmão, coração, fígado, rim, intestino, estômago e cérebro. Após a obtenção dos

pesos foi calculada a razão entre o peso do órgão e o peso do animal usando-se a

seguinte fórmula: (PO/PA), onde PO é o peso do órgão e PA é o peso do animal. Órgãos

como baço, linfonodo mesentérico e medula óssea foram também utilizados para

quantificação do número de células linfóides.

II.3.3.1. Quantificação das células peritoniais

Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e tiveram sua cavidade

peritoneal lavada com 5mL de PBS estéril. A suspensão celular obtida, por aspiração

com seringa e agulha, foi colocada em tubos de polipropileno de fundo cônico

(Costar®) e mantida à 4ºC até a realização dos ensaios.

67

Após a coleta, 90µL das suspensões celulares foram fixadas e coradas em 10 µL

de uma solução contendo 0,05% de cristal violeta diluído em ácido acético 30% em

tubos tipo eppendorf. As células foram contadas em câmara de Neubauer com auxílio de

um microscópio ótico de luz comum.

II.3.3.2 Quantificação das células da medula óssea

Ao final do tratamento as células da medula foram obtidas por perfusão do

fêmur com 1mL de PBS. 90µL da suspensão celular foram adicionados a 10µL solução

de cristal violeta 0,05% em ácido acético 30%. A quantificação foi feita em câmera de

Neubauer.

II.3.3.3 Quantificação das células do baço

Uma parte do baço foi pesada, triturada em 1mL de PBS. Em seguida, o material

obtido foi colocado em tubos de polipropileno com fundo cônico (Costar®). As células

foram coradas com solução de cristal violeta 0,05% em ácido acético 30% e contadas

em câmara de Neubauer com auxílio de microscópio óptico de luz comum.

II.3.3.4 Quantificação das células do linfonodo

O linfonodo mesentérico foi triturado em 1mL de PBS estéril, colocados em

eppendorfs e mantidos em banho de gelo (+ 4ºC) até a realização da contagem total de

células. As células foram coradas com solução de cristal violeta 0,05% em ácido acético

68

30% e contadas em câmara de Neubauer com auxílio de microscópio óptico de luz

comum.

II.3.3.5 Análise bioquímica

II.3.3.5.1 Dosagem de colesterol total

O colesterol total foi dosado pelo método enzimático colorimétrico com

colesterol-esterase, colesterol-oxidase e reação catalisada pela peroxidase. O ensaio

consistiu em adicionar 2,5 µL do soro a cuvetas contendo 240 mL do tampão de reação

(Tampão Fosfato 50mmol, pH 7.0, contendo: fenol 24mmol/L, colato de sódio 500

µmol/ml, azida sódica 15mmol/L, 4-aminoantipirina 500 µmol/L, colesterol esterase

250U/L, colesterol oxidase 250 U/L e peroxidase 1000U/L). As cuvetas foram

incubadas por 5 minutos à 37 ºC e a leitura foi realizada em espectrofotômetro a

500/670 nm de densidade ótica.

II.3.3.5.2 Dosagem de triglicerídeos

Os triglicerídeos foram determinados pelo método enzimático colorimétrico. O

ensaio consistiu em adicionar 2,5 µL de soro a cuvetas contendo 200 µL do tampão de

reação (Tampão Fosfato 50mmol, pH 6.9, contendo: acetato de magnésio 4mmol/L, 4-

cloranfenicol 5mmol/L, 4-aminoantipirina 300 µmol/L, atp 1 mmol/L, lipase da

lipoproteína 1400U/L, glicerolquinase 1000 U/L, glicerolfosfato oxidase 1500 U/L,

peroxidase 900 U/L, azida sódica 7mmol/L). As cuvetas foram incubadas por 5 minutos

á 37ºC e a leitura foi realizada em espectrofotômetro à 500/660 nm de densidade ótica.

69

II.3.3.5.3 Dosagem de proteínas totais

As proteínas totais foram determinadas a partir da reação de biureto (hidróxido

de sódio 600 mmol/L; sulfato de cobre 12mmol/L, estabilizador e antioxidante). Foram

utilizados 5 µL do soro para 250 µL do reagente. A seguir, foi feita uma incubação à 37º

C por 5 minutos e lido em filtro de 550 nm.

II.3.3.5.4 Dosagem de albumina

Foi realizada a partir da utilização de uma solução 2,5 mmol de verde

bromocresol em solução a 0,82 molar de ácido lático tamponado, pH 4. Foram

utilizados 5 µL do soro para 250 µL do reagente. Então se procedeu a incubação à 37º C

durante 3 minutos com posterior leitura em filtro de 550nm.

II.3.3.5.5 Dosagem de uréia

A uréia foi determinada pelo método enzimático da uréase. O ensaio consistiu

em adicionar 2,5µL de soro a cuvetas contendo 200µL do reagente R1(2-oxiglutarato

7mmol/L; ADP 0,6 mmol/L; Urease ≥ 6KU/L; Glutamato desidrogenase ≥ 1KU/L) e

50µL do reagente R2 ( NADH 0,25mmol/L). As cuvetas foram incubadas por 5 minutos

a 37ºC e a leitura realizada em espectrofotômetro à 340/380 nm de densidade ótica.

70

II.3.4 Avaliação ponderal

Os camundongos forma pesados em balança digital antes do desenvolvimento do

experimento (Pi= peso inicial) e após os 14 dias de tratamento (Pf= peso final). A

variação ponderal foi obtida pela diferença entre Pf e Pi.

Tanto o consumo a ração (g) quanto de água (mL) foram medidos no início do

experimento e no 15º dia, quanto se findou a análise toxicológica, para a obtenção dos

valores de consumo final.

II.3.5 Análise estatística

Os dados foram expressos como a média + erro padrão da média (S.E.M.). A

análise estatística foi feita por ANOVA seguida do teste de comparação múltipla de

Tukey’s, sendo o nível de significância < 0,05.

71

II.4 RESULTADOS

II.4.1 AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA

II.4.1.1 Efeitos sobre o comportamento e a fisiologia dos camundongos

Após o tratamento oral os animais avaliados quanto ao comportamento foi

verificado que os camundongos dos grupos EBH5 e EBH50 apresentaram apenas

alterações pontuais. Tremores finos foram evidentes após 30 min no grupo EBH5 e

ereção de cauda ocorreu após 8 horas de tratamento, no grupo EBH50. O grupo

EBH500 apresentou mais alterações comportamentais do que os demais, pois ocorreu

ereção de cauda uma hora após o primeiro tratamento, e 5 minutos após o segundo

tratamento. A piloereção ocorreu após 8 horas. Nesse grupo foram observadas ainda

diarréia 20 minutos após os tratamentos.

Tabela 1 - Efeito do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o comportamento e a fisiologia. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados via oral nas doses de 5mg/Kg; 50mg/Kg; 500mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica. Após 5, 10, 20, 30 min, 1, 4, 8 e 24 hr os animas foram acompanhados.

AÇÃO/PARÂMETROS CONTROLE EBH5 EBH50 EBH500

Lamber pata 05’ - 4h 10’ - 8h 05’ - 4h 5’ - 8h

Coçar focinho 05’ - 4h 05’ - 8h 05’ - 1h 5’ - 8h

Tremores finos 30’ 1 h 20’ 30’ 1-4h

Ereção de cauda 8 h 05’ 30’ 1 h

Piloereção 8 h

Diarréia 20’

↑ Urina 1 h

72

II.4.1.2 Efeitos sobre a variação ponderal

O grupo EBH500 apresentou a menor variação ponderal quando comparado aos

grupos controle, EBH5 e EBH50 (Figura 1A). No entanto, não houve diferença

significativa referente ao consumo de ração e da água (Figura 1B e C).

CONTROLE EBH5 EBH50 EBH500-4

-3

-2

-1

0

*º#

Variação p

ondera

l (g)

CONTROLE EBH5 EBH50 EBH5000

25

50

75

100

125

150

Consum

o d

e raçã

o (g)

CONTROLE EBH5 EBH50 EBH5000

50

100

150

Consu

mo d

e á

gua (m

L)

Figura 1 - Efeitos do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a variação ponderal. Camundongos da linhagem Swiss foram pesados e depois tratados via oral nas doses de 5mg/Kg; 50mg/Kg; 500mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica. Após 14 tratamentos diários, os animas foram pesados novamente para a obtenção da variação ponderal (A). O consumo de ração (B) e de água também foi avaliado para correlação com a variação ponderal (C). Os dados representam a média ± erro padrão de cinco animais/grupo. * p ≤ 0,05 em relação ao grupo controle, º p ≤ 0,05 em relação ao grupo EBH5 e # p ≤ 0,05 em relação ao grupo EBH50.

A

B C

73

II.4.1.3 Efeitos sobre o peso dos órgãos vitais

Os animais do grupo EBH5 apresentaram alterações pontuais quanto ao peso dos

órgãos. Ocorreu aumento no peso do cérebro e intestino. Houve diminuição do peso do

linfonodo mesentérico. Animais do grupo EBH50 apresentaram aumento no peso do

rim e diminuição no peso do linfonodo mesentérico e pulmão. O grupo EBH500

apresentou apenas diminuição no peso do linfonodo mesentérico em relação ao grupo

controle (Tabela 2).

Tabela 2 - Efeitos do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o peso dos órgãos vitais. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados via oral nas doses de 5mg/Kg; 50mg/Kg; 500mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica. Após 14 tratamentos diários, os animas foram sacrificados, necropsiados e seus órgãos vitais pesados.

Órgãos (mg) CONTROLE EBH5 EBH50 EBH500 Baço 2,8±0,1ªº 2,5±0,1 3,0±0,0 3,0±0,0 Coração 5,0±0,2 5,0±0,0 5,6±0,1 5,0±0,0 Cérebro 12,3±0,1 14,0±0,1* 13,0±0,1 12,6±0,1 Estômago 14,0±0,3 14,1±0,1 14,3±0,1 13,3±0,3 Fígado 44,5±0,4 42,2±0,2 42,2±0,3 43,7±0,1 Intestino 4,0±0,0 4,5±0,1* 4,0±0,0 4,0±0,0 Linfonodo mesentérico

0,8±0,1 0,3±0,1* 0,4±0,1* 0,5±0,1*

Rim 6,7±0,1 7,0±0,0 7,6±0,1* 7,0±0,0 Pulmão 6,6±0,1 6,3±0,1 6,0±0,0* 6,6±0,1 ª Média ± erro padrão de cinco animais/grupo. º Peso do órgão/peso corpóreo * p ≤ 0,05em relação ao grupo controle.

74

II.4.1.4 Efeitos sobre o número de células linfóides

Ocorreu aumento no número de células no linfonodo mesentérico nos grupos

EBH50 e EBH500. O número de células da medula óssea foi sempre maior nos grupos

tratados com EBH, independentemente da dose. Por outro lado, o número de células

peritoneais foi sempre menor do que o controle nos grupos tratados com o extrato

(Tabela 3).

Tabela 3 - Efeitos do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre o número de células dos órgãos linfóides. Camundongos da linhagem Swiss foram tratados via oral nas doses de 5mg/Kg; 50mg/Kg; 500mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica. Após 14 dias de tratamentos diários, foi feita a quantificação de células.

Órgãos (x106) CONTROLE EBH5 EBH50 EBH500 Baço 14,1±0,2ª 13,8±0,3 14,5±0,2 13,0±0,6 Linfonodo mesentérico

2,6±0,1 3,4±0,1 4,1±0,2* 5,2±0,1*

Medula óssea 7,4±0,1 8,8±0,3* 10,8±0,2* 14,7±0,1* Peritônio 6,9±0,1 5,5±0,1* 5,2±0,1* 5,7±0,1* ª Média ± erro padrão de cinco animais/grupo. * p ≤ 0,05em relação ao grupo controle.

75

II.4.1.5 Efeitos sobre a bioquímica sanguínea.

Após 14 dias de tratamento não foi observada nenhuma alteração significativa na

concentração de proteínas totais e da enzima transaminase oxalacética (AST). No

entanto, ocorreu redução na concentração de albumina no grupo EBH500. Quando

avaliada a concentração de triglicérides e VLDL foi observada redução significativa

desses parâmetros nos grupos EBH50 e EBH500 (Tabela 4).

Tabela 4 - Efeitos do tratamento subcrônico oral com EBH das folhas de C. ambrosioides sobre a bioquímica sanguínea: Camundongos da linhagem Swiss foram tratados via oral nas doses de 5mg/Kg; 50mg/Kg; 500mg/Kg, enquanto o grupo controle recebeu água apiogênica. Após 14 dias de tratamentos diários, foi feita a análise bioquímica.

Parâmetro Bioquímico

CONTROLE EBH5 EBH50 EBH500

Proteínas totais 7,6±0,0ª 7,5±0,1 7,6±0,0 7,6±0,0 Albumina 6,5±0,1 6,5±0,1 5,8±0,1 5,4±0,1* Colesterol 156,2±2,2 168,0±2,9 157,4±2,3 138,6±1,1 VLDL 42,6±1,4 43,8±1,8 20,0±0,8* 26,2±0,9* Triglicérides 213,4±7,2 219,4±8,7 99,2±4,2* 130,6±4,6* Uréia 68,0±1,1 73,0±0,6 81,4±1,6* 68,6±0,6 AST 231,6±4,9 241,6±5,5 202,4±2,7 226,8±3,3 ª Média ± erro padrão de cinco animais/grupo. * p ≤ 0,05em relação ao grupo controle.

76

II.5 DISCUSSÃO

A utilização indiscriminada de vegetais com fins terapêuticos (fitoterápicos) tem

sido crescente, tanto em países desenvolvidos, como em países em desenvolvimento,

sendo causa de grande preocupação, pois se sabe que a depender de como é

administrado, o vegetal, pode trazer sérios danos à saúde humana, pois muitas espécies

apresentam compostos químicos tóxicos.

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (WHO, 1992), são definidos

como fitoterápicos os produtos com fins medicinais que contém derivados ativos

obtidos das plantas. Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA,

2004), os fitoterápicos são caracterizados pelo conhecimento tanto da eficácia como dos

riscos de seu uso, assim como pela constância e reprodutibilidade de efeitos e controle

de sua qualidade. Essas definições de qualidade do uso de plantas são de extrema

importância principalmente para a indústria farmacêutica (Carvalho, 2005).

Alguns fitoterápicos causam toxicidade sistêmica após tratamento crônico

experimental, o que pode ser caracterizado principalmente pela redução na massa

corporal dos animais (Jahn; Günzel, 1997), alterações no comportamento e pela

alteração da massa relativa dos órgãos, alterações hematológicas e bioquímicas

sangüíneas (González; Silva, 2003).

Os riscos toxicológicos se devem a efeitos de substâncias presentes em plantas

podendo propiciar efeitos hepatotóxicos pela presença, por exemplo, de apiol, safrol,

lignanas e alcalóides pirrolizidínicos; a ação tóxica renal que pode ser causada por

espécies vegetais que contém terpenos e saponinas e alguns tipos de dermatites,

causadas por espécies ricas em lactonas sesquiterpênicas e produtos naturais do tipo

furanocumarinas. Substâncias isoladas do óleo de C. ambrosioides como ascaridol, p-

77

cymina, alfa-terpeno, isoascaridol e limoneno (Cavalli et al., 2004), considerados

medicinais possuem também atividades citotóxica (Ruffa et al., 2002) ou genotóxica

(Gadano et al., 2002; 2006).

No presente trabalho, o EBH nas concentrações de 5mg/kg (EBH5), 50mg/kg

(EBH50) ou 500mg/kg (EBH500), não induziu morte de nenhum camundongo, mesmo

quando o tratamento foi realizado diariamente durante 14 dias, por via oral. No entanto,

ao acompanharmos possíveis alterações comportamentais foram detectadas mudanças

pontuais na observação até 24ª hora após o tratamento.

Os camundongos dos grupos EBH5 apresentaram tremores finos após 30 min.

No grupo EBH50 ocorreu ereção da cauda após 8 horas de tratamento. O grupo

EBH500 apresentou mais alterações de comportamento como ereção de cauda após 1

hora do primeiro tratamento, e após 5 minutos, do segundo tratamento. A piloereção só

ocorreu após 8 horas. Nesse grupo, foram observadas ainda diarréia após 20 minutos, e

ainda foi verificada aumento da micção após 1 hora, no entanto, não foi medido. Essas

alterações mais expressivas no grupo EBH500 podem indicar possíveis sinais de

hepatoxicidade e disfunções renais provocadas pelo consumo do EBH em altas doses.

Quanto à variação ponderal, o tratamento subcrônico induziu alteração

significativa no ganho de peso dos animais apenas no grupo EBH500, onde houve

menor perda do peso. Nenhuma diferença quanto ao consumo de ração e água foi

verificada em todos os grupos tratados.

Não se pode dizer que a perda do peso observada é resultado de um efeito tóxico

do C. ambrosioides, já que a perda também foi mais evidente no grupo controle. O

efeito da administração na maior dose (500mg/kg) possibilitou menor perda de peso,

além de ter propiciado aumento da diarréia e urina, isso pode estar relacionado a um

possível efeito analgésico do EBH. Diferente dos resultados de Amole e Izegbu (2005)

78

que mostraram que ratos tratados oralmente ad libitum com extrato de C. ambrosioides

nas doses 12,31g/kg e 31,89g/kg apresentaram diminuição do peso corpóreo, em

contrapartida, foi visto que o grupo controle apresentou aumento de peso após 6

semanas de tratamento, nesse caso, puderam concluir efeito tóxico para as doses

empregadas no estudo. Ibironke e Ajiboye (2007) mostraram que o extrato metanólico

das folhas de C. ambrosioides em uma dose de 700mg/kg apresenta efeito analgésico

em ratos Wistar submetidos a testes de analgesia. O efeito analgésico pode estar

relacionado à presença de substâncias químicas como terpenóides (Defeudis et al.,

2003; Takeoka; Dao, 2003) que são responsáveis pela inibição da enzima

ciclooxigenase, que catalisa a conversão do ácido araquidônico em endoperóxidos, que

fornecem substratos intermediários para a síntese tissular especifica de uma variedade

de prostaglandinas biologicamente ativas (Katzung, 2003), aliviando dores leves e

moderadas.

Quando avaliamos o efeito do extrato no peso dos órgãos internos, o tratamento

com EBH5 induziu aumento no peso do intestino e do cérebro. No entanto, ocasionou

diminuição no peso do linfonodo mesentérico. No grupo tratado com EBH50 ocorreu

diminuição no peso do pulmão e do rim. Já no grupo tratado com EBH500 observou-se

diminuição no peso do linfonodo mesentérico.

A análise macroscópica mostrou que o tratamento com o extrato não ocasionou

alterações evidentes que sugerissem deformações morfológicas nos órgãos. As

diferenças de peso encontradas não demonstram um efeito tóxico do EBH por si só,

sendo necessárias análises histopatológicas.

Em nossos resultados verificamos que não houve diferença significativa nos

níveis séricos de proteínas totais em nenhum grupo experimental. No entanto, somente a

determinação da proteína total não reflete com precisão o estado do metabolismo

79

protéico, sendo de particular importância a determinação da albumina e da globulina

(Coles, 1984). Por isso, ao avaliarmos o nível de albumina, verificamos que no grupo

EBH500 houve diminuição significativa de albumina no soro, o que pode indicar

alteração funcional do fígado, mesmo sem que o peso do órgão tivesse sido afetado.

Diferentes situações podem resultar em alterações na concentração das proteínas

sangüíneas como ocorre durante processos infecciosos e inflamatórios. O decréscimo na

concentração das proteínas do sangue deve-se a: a dieta insuficiente; má absorção

protéica; deficiência na síntese de albumina pelo fígado; evasão da albumina para o

espaço tecidual, com o aumento da permeabilidade capilar nos processos inflamatórios

agudos, e nas enfermidades crônicas como nas neoplasias, além do estado fisiológico

geral (Coles, 1984).

A albumina, também conhecida como soroalbumina, é a mais abundante das

proteínas séricas (3,5 a 5,5 g/dL) e corresponde a cerca de 60% da concentração total de

proteínas (Mc Pherson, 1999). É sintetizada exclusivamente no fígado a uma taxa de

aproximadamente 12 g/dia, o que representa 25% da síntese protéica total do fígado e a

metade de toda a proteína exportada pelo órgão. Possui funções, como transporte de

diversas substâncias e manutenção da pressão oncótica (Mc Pherson, 1999). É uma das

menores moléculas protéicas e, em conseqüência disso, tende a se perder na urina

sempre que ocorre dano aos glomérulos renais (Miller; Gonçalves, 1988).

A hipoalbuminemia é uma condição inespecífica e acompanha inúmeras doenças

(Miller; Gonçalves, 1988). A redução na concentração de albumina tem sido

relacionada a síntese protéica prejudicada comum nos quadros de cirrose hepática e

hepatite viral; aumento do catabolismo durante infecções bacterianas graves, neoplasias

malignas, insuficiência cardíaca congestiva, doenças inflamatórias e infecciosas

crônicas; ingestão protéica inadequada e perdas por meio dos glomérulos renais e

80

intestinos (Larson, 1974; Mc Pherson, 1999), o que de certa forma pode responder a

hipótese de que a maior dose do extrato parece induzir hepatoxicidade.

A análise das enzimas aminotransferases séricas como AST (aspartato-

aminotransferase), a fosfatase alcalina e a ALT (alanina-aminotransferase) foi feita

porque estas são freqüentemente consideradas indicadores de lesões nas células

hepáticas (Martin et al., 1981). Porém, não foram verificadas alterações significativas

aos níveis AST em nenhum grupo experimental.

Neste estudo foi verificada alteração significativa nos níveis plasmáticos de

uréia no sangue apenas no grupo EBH50, podendo indicar uma alteração renal pontual

nesse grupo. Essa elevação da uréia fornece indícios de que há sobrecarga renal nesse

grupo, além de insuficiência renal aguda ou, ainda, de aumento no catabolismo protéico,

já que a síntese de uréia provém do mecanismo de excreção da amônia durante o

catabolismo de aminoácidos e a sua formação é uma reação que requer energia, e ocorre

quase que exclusivamente no fígado (Vijayalakshmi et al., 2000, Adebayo et al., 2003).

A taxa de formação da uréia depende da taxa de catabolismo protéico (Kaneko,

1989). Segundo Knottenbelt et al. (1998) as evidências clínicas e bioquímicas da

insuficiência renal estão presentes apenas quando mais de 75% do tecido renal

disponível está afuncional. Esse aumento de uréia junto ao aumento da massa do rim no

grupo EBH50 demonstra um possível efeito tóxico renal. Alguns dados obtidos por

Amole e Izegbu (2005) mostram que C. ambrosioides quando ingerido em doses altas

ocasiona necrose nos rins alterando assim sua funcionalidade. Porém, no grupo EBH5

não houve sinais de toxicidade nos rins, similar ao resultado obtido por Patrício et al.

(2008) quando trataram os camundongos com EBH de C. ambrosioides na dose de

5mg/kg.

81

Entretanto, foi visto que não só no grupo EBH5 como nos demais, houve

acúmulo de urina nas gaiolas, sugerindo que C. ambrosioides pode apresentar efeito

diurético, necessitando de estudos com gaiolas metabólicas que demonstre esse efeito.

Quanto aos níveis séricos de colesterol nos grupos experimentais não foi

observada nenhuma alteração em relação ao grupo controle. O colesterol é transportado

no sangue por meio de lipoproteínas, como a lipoproteína de muito baixa densidade

(VLDL), a lipoproteína de baixa densidade (LDL), e a lipoproteína de alta densidade

(HDL). Diferentemente da VLDL e LDL, a HDL não possui a apolipoproteína B-100,

que é reconhecida pelos tecidos, tendo, portanto comportamento e função totalmente

diferentes dessas outras.

O HDL é responsável pelo transporte reverso, que leva principalmente o

colesterol dos tecidos para o fígado (Santos et al., 2001) e, dessa forma, ajuda a proteger

o indivíduo contra o desenvolvimento doenças pelo acúmulo de lipídios nos tecidos

como a aterosclerose. Assim, se um indivíduo apresenta uma relação elevada entre

lipoproteínas de alta densidade e de baixa densidade, a probabilidade de desenvolver

aterosclerose fica consideravelmente diminuída (Rizos; Mikhailidis, 2001). Segundo o

estudo VAHIT (Veterans Affairs High Density Lipoprotein Cholesterol Intervention

Trial), uma redução de 1 mg/dl no HDL resulta em aumento de 3%-4% na incidência de

doença arterial coronariana (Rubins et al., 1999). Então como houve diminuição dos

níveis séricos de triglicérides e VLDL nos grupos EBH50 e EBH500 estes resultados

apontam C. ambrosioides como um possível adjuvante no tratamento de doenças como

aterosclerose, já que níveis elevados de triglicérides também estão associados à maior

incidência de doenças coronarianas por aterosclerose (Santos et al., 2001).

Assim, as concentrações plasmáticas de triglicérides e colesterol podem estar

relacionadas à absorção de lipídeos através da dieta, à sua mobilização a partir dos

82

tecidos, à sua utilização como fonte de energia e à capacidade de armazenamento. Após

um período de alimentação ou frente a uma condição em que seja necessária a

mobilização de gordura dos estoques de tecido adiposo, ocorre a liberação de glicerol e

ácidos graxos livres (AGL) na circulação; os AGL são transportados, via albumina

sérica, até o fígado e/ou outros tecidos metabolicamente ativos, sendo usada para

produção de energia, cetona, colesterol e/ ou triglicérides, dependendo da demanda

metabólica (Fernandes et al., 2001; Durham, 2006). Esse mecanismo de transporte dos

AGL para o fígado realizado pela albumina, responde o fato de encontrarmos níveis

baixos de triglicerídeos no soro dos camundongos pertencentes ao grupo EBH500, já

que nesse grupo também foi visto diminuição dos níveis séricos de albumina.

Quando analisamos os efeitos do EBH sobre o número de células totais de

órgãos linfóides observou-se que nos grupos EBH5, EBH50 e EBH500 houve aumento

estatisticamente significativo do número de células medulares de forma dose

dependente e diminuição no número de células peritoneais, mostrando que o EBH é

capaz de agir de forma sistêmica na proliferação de novas células hematopoiéticas, as

quais não migram para a cavidade peritoneal, mas sim para o linfonodo mesentérico,

sobretudo nos grupos EBH50 e EBH500. Provavelmente esse aumento se deve a

possíveis efeitos tóxicos nas vísceras que estão estimulando células dos linfonodos

mesentéricos que são órgãos drenantes da cavidade peritoneal.

Como os grupos tratados com EBH50 e EBH500 apresentaram sinais de

toxicidade sistêmica, determina-se que a dose ótima para o tratamento de processos

inflamatórios agudos e crônicos é a de 5mg/kg, já que a utilização da menor dose não

foi observada sinais de toxicidade e nem alterações bioquímicas sanguíneas.

83

II.6 CONCLUSÕES

- O tratamento subcrônico com EBH das folhas de C. ambrosioides não propiciou morte

de nenhum camundongo durante a avaliação toxicológica.

- O tratamento com EBH das folhas de C. ambrosioides na dose de 5mg/kg não

apresentou sinais de toxicidade, enquanto na dose de 50mg/kg houve sinais de

toxicidade renal e a dose de 500mg/kg induziu alterações de comportamento e sinais de

hepatoxicidade com base na análise bioquímica sanguínea.

84

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89

90

Tabela de avaliação da alteração comportamental e fisiológica.

Fonte: Almeida et al., 1999.

AÇÃO/PARÊMETROS controle 5’ 10’ 20’ 30’ 1h 4h 8h 24h >Motilidade >Freqüência respiratória Piloereção Exolftalmia Movimentos esteriotipados Lamber patas Coçar focinho Morder cauda Convulsão clônica Convulsão tônica Tremores finos Tremores grosseiros Sialorréia Fasciculações Midríase Ereção da cauda Tremor da cauda Diâmetro pupilar < Motilidade < Freqüência respiratória Sedação Catatonia Ptose palpebral Analgesia Anestesia Perda de ref. Corneano Diâmetro pupilar Dispnéia Passividade Alienação ambiente < Tônus dorsal Perda preensão pata Paralisia trem poste Palidez Cianose Hiperemia Diarréia Contorção Reação de fuga Agressividade Granidos ↑ urina ↓ urina

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