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Estudo fitoquímico e atividades biológicas de extratos e constituintes isolados de sâmaras de

Austroplenckia populnea Reissek (Celastraceae) __________________________________________________

CAROLINA MILAGRES CANESCHI

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

ESCOLA DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS - CIPHARMA

CAROLINA MILAGRES CANESCHI

_________________________________________________________________________________

Estudo fitoquímico e atividades biológicas de extratos e

constituintes isolados de sâmaras de

Austroplenckia populnea Reissek (Celastraceae) ________________________________________________________________________________

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas - CiPharma da Universidade Federal de Ouro Preto como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Sidney Augusto Vieira Filho – UFOP

Co-orientador: Prof. Charles Spillane – NUI - Galway, Irlanda

Co-orientador: Prof. Dr. Orlando David Henrique dos Santos – UFOP

Ouro Preto 2011

Catalogação: [email protected]

C212e Caneschi, Carolina Milagres.

Estudo fitoquímico e atividades biológicas de extratos e constituintes isolados de sâmara de Austroplenckia populnea Reissek (Celastraceae). / Carolina Milagres Caneschi. - 2011.

xii, 109f. : il.; grafs.; tabs.

Orientador: Prof. Dr. Sidney Augusto Vieira Filho.

Co-orientador: Orlando David Henrique dos Santos.

Charles Spillane

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas (CIPHARMA).

1. Alelopatia. 2. Química orgânica. 3. Austroplenckia populnea. 4. Células-Proliferação. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

CDU: 581.524 CDU: 669.162.16

Aos meus pais Rosângela e Pedro Paulo, por terem me ensinado

tudo que sei e feito de mim quem sou.

À minha irmã Clarissa, por partilhar comigo as tristezas e

alegrias que encontrei pelo caminho.

Ao Matheus, por me fazer tão feliz e me inspirar coragem de ir

à frente sem medo de novos desafios.

Amo Vocês!

AGRADECIMENTOS

A Deus por me conceder vida, saúde e sabedoria, para realização deste trabalho.

À Universidade Federal de Ouro Preto.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – CiPharma.

Ao Prof. Dr. Sidney Augusto Vieira Filho (Bibo), pela acolhida como sua orientanda, pela amizade, ensinamentos, paciência, confiança e incentivos.

Ao Prof. Dr. Orlando David Henrique dos Santos pela co-orientação, ensinamentos, confiança e apoio.

Ao Prof. Charles Spillane e Mohan kumar Muniyappa do “Genetics and biotechnology lab, National University of Ireland- Galway”, por terem me recebido, e pela oportunidade de aprendizado e execução de experimentos.

À Profª. Drª. Lucienir Pains Duarte, da UFMG pela contribuição na elucidação e identificação dos espectros de RMN 1H e RMN 13C.

Ao Prof. Dr. Valdenir José Belinelo, da UFES pela realização dos testes de alelopatia.

Ao Marcos pelo auxílio no tratamento estatístico dos dados.

À banca examinadora do exame de qualificação desta dissertação, composta pelos professores Dr. Gustavo Henrique Bianco de Souza, Dr. Elísio Alberto Evangelista e Dra. Andrea Mendes do Nascimento, pela relevância das contribuições e reflexões proporcionadas.

À banca examinadora desta pesquisa, Prof. Dr. Elísio Alberto Evangelista e Profa. Dra. Roqueline Rodrigues Silva de Miranda, cujas observações foram igualmente imprescindíveis e pelas brilhantes considerações que guiaram a confecção final deste trabalho.

Aos meus amigos e amigas que sempre estiveram presentes me aconselhando e incentivando com carinho e dedicação.

Aos meus familiares que sempre me deram amor e força, valorizando meus potenciais.

À Sofia, por me fazer companhia durante todo o tempo de escrita deste trabalho.

A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a execução deste trabalho.

Muito obrigada!!!

"Se não houver frutos, valeu a beleza das flores; se

não houver flores, valeu a sombra das folhas; se não houver

folhas, valeu a intenção da semente."

Henfil

SUMÁRIO

RESUMO .............................................................................................................................. i

ABSTRACT ......................................................................................................................... ii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ................................................. iii

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... vi

LISTA DE TABELAS ......................................................................................................... xi

I. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................. 1

II. OBJETIVOS DO TRABALHO .................................................................................... 5

III. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 7

III. 1. A família Celastraceae................................................................................... 8

III. 2. Austroplenckia populnea (Reissek) LUNDELL ........................................... 9

IV. ESTUDO FITOQUÍMICO ........................................................................................... 15

IV. 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 16

IV. 2. EXPERIMENTAL ........................................................................................ 18

IV. 2.1. Material vegetal ................................................................................... 19

IV. 2.2. Obtenção dos extratos ......................................................................... 19

IV. 2.3. Fracionamento dos extratos ................................................................. 21

IV. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 26

V. EFEITO DE CONSTITUINTES DE SÂMARAS DE Austroplenckia populnea

SOBRE PROLIFERAÇÃO CELULAR ............................................................. 49

V. 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 50

V. 2. EXPERIMENTAL ......................................................................................... 52

V. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 56

V. 3.1. Efeito de extratos brutos de sâmaras de Austroplenckia populnea sobre

proliferação celular ........................................................................................... 57

V. 3.2. Efeito de constituintes isolados de Austroplenckia populnea sobre

proliferação celular ........................................................................................... 60

VI. ATIVIDADE ALELOPÁTICA DE CONSTITUINTES DE SÂMARAS DE

Austroplenckia populnea........................................................................................ 63

VI. 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 64

VI. 2. EXPERIMENTAL ........................................................................................ 66

VI. 2.1. Preparo das amostras .......................................................................... 66

VI. 2.2. Esterilização das sementes de picão-preto .......................................... 66

VI. 2.3. Estudo da atividade alelopática. .......................................................... 66

VI. 2.4. Parâmetros analisados ......................................................................... 67

VI. 2.5. Análise estatística ................................................................................ 67

VI. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 68

VI. 3.1. Efeito dos extratos de sâmaras de A. populnea na germinação de

sementes de Bidens pilosa L. ............................................................................ 68

VI. 3.2. Efeito dos extratos de sâmaras de A. populnea no crescimento de

radículas e plântulas de Bidens pilosa L. .......................................................... 71

VI. 3.3. Efeito de fridelina na germinação de sementes e no crescimento de

radículas e plântulas de Bidens pilosa L. .......................................................... 74

VII. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 77

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 80

ANEXOS .............................................................................................................................. 89

RESUMO

A família Celastraceae abrange 98 gêneros e cerca de 1264 espécies que podem ser

encontradas principalmente em regiões tropicais e subtropicais em todo o mundo. Muita

importância tem sido dada a estas espécies por apresentarem uma grande variedade de

atividades farmacológicas. Austroplenckia populnea (Reiss), planta brasileira pertencente à

família Celastraceae, é uma árvore que pode atingir até dez metros de altura. É popularmente

conhecida como “Mangabarana”, “Mangabeira brava”, “Marmelo do campo”, “Marmelinho

do campo” e “Piúva-branca”. Suas folhas e raízes são utilizadas na medicina popular para o

tratamento de doenças do trato gastrintestinal, como antidisentérico e anti-reumático.

Este trabalho tem como objetivo contribuir com o estudo fitoquímico associado à

avaliação das atividades biológicas (proliferação celular e alelopatia) de extratos e

constituintes isolados de sâmaras de A. populnea. A partir do extrato hexânico de sâmaras de

A. populnea, foram isolados o flavonóide 3,5,7,4’-tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilflavanona, o

sesquiterpeno 4-hidroxi-1,6,15-tri-acetiloxi-8,9-di-benzoiloxi-agarofurano e a amida

undecanamida. As substâncias isoladas foram identificadas através de espectrometria de RMN

de 1H e de 13C e de massas. Extratos brutos de sâmaras A. populnea induziram a proliferação

das quatro linhagens celulares testadas (MCF7, A549, HS578T, HEK293), enquanto as

substâncias proantocianidina A e 4’-O-metil-epigalocatequina não apresentaram impacto

significativo sobre as linhagens celulares cancerígenas (MCF7, A549, HS578T), mas

causaram diminuição da proliferação celular sobre a linhagem de células normais (HEK293).

Além disso, os constituintes de sâmaras de A. populnea mostraram ter significante efeito

alelopático sobre picão-preto (Bidens pilosa L.). Este estudo se justifica por abrir uma linha

de pesquisa de frutos e sementes de outras espécies brasileiras pertencentes à família

Celastraceae.

Palavras-chave: Celastraceae, Austroplenckia populnea, proliferação celular, alelopatia.

ii

ABSTRACT

The Celastraceae family includes 98 genus and about 1264 species which can be found

mainly in tropical and subtropical regions in the world. Much importance has been given to

these species because they have a wide variety of pharmacological activities. Austroplenckia

populnea (Reiss), is a Brazilian plant that belongs to Celastraceae family. It is a tree that can

reach ten meters and it is popularly known as "Mangabarana", "Mangabeira brava," "Marmelo

do campo", "Marmelinho do campo" and "Piúva-branca." Its leaves and roots are used in folk

medicine for the treatment of diseases of the gastrointestinal tract, as antidysenteric and

antirheumatic.

This work aims to contribute to the phytochemical study associated with the

evaluation of biological activity (cell proliferation and allelopathy) of extracts and isolated

constituents of samaras of A. populnea. From the hexane extract of samaras of A. populnea

were isolated the flavonoid 3,5,7,4’-tetrahydroxy-6-methoxy-8-prenilflavanone, the

sesquiterpene 4-hydroxy-1,6,15-tri-acetiloxy-8 ,9-di-benzoiloxy-agarofurano and amide

undecanamide. The isolated compounds were identified by 1H and 13C NMR and mass

spectroscopy. Crude extracts of A. populnea samaras induced proliferation of four cell lines

tested (MCF7, A549, HS578T, HEK293), while substances proanthocyanidin A and 4'-O-

methyl-epigallocatechin showed no significant impact on cancer cell lines (MCF7, A549,

HS578T), but they caused decrease in cell proliferation on the normal cell line (HEK293). In

addition, the constituents of samaras of A. populnea showed to have significant allelopathic

effect on picão-preto (Bidens pilosa L.). These findings are justified by an open line of

research fruits and seeds of other Brazilian species of the family Celastraceae.

Keywords: Celastraceae, Austroplenckia populnea, cell proliferation, allelopathy.

iii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

% Porcentagem

%G Porcentagem de germinação

Comprimento de onda

Deslocamento químico

Número de ondas (cm-1)

µg Micrograma(s)

µL Microlitro(s)

µm Micrometro(s)

A549 Linhagem celular de carcinoma de pulmão humano

ATCC “American Type Culture Collection”

ax Axial

CC Cromatografia em coluna de sílica gel

CCD Cromatografia em camada delgada de sílica gel

CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa

CG Cromatografia gasosa

COSY “Correlation Spectroscopy”

CP Comprimento das plântulas (mm)

CR Comprimento das radículas (mm)

DEPT “Distortionless enhancement by polarization transfer”

DMEM “Dulbecco’s Modified Eagle Medium”

DMSO Dimetilsulfóxido

EM Espectrometria de massas

Fig. Figura(s)

g Grama

h Hora(s)

HEK293 Linhagem celular embrionária de rim humano

HMBC “Heteronuclear multiple bond correlation”

HMQC “Heteronuclear simple quantum correlation”

HS578T Linhagem celular de carcinoma de mama humano

Hz Hertz

iv

IVG Índice de velocidade de germinação

J Constante de acoplamento escalar

L Litro

Lit. Literatura

M Molar

m/z Razão entre a massa do fragmento e sua carga elétrica

MCF7 Linhagem celular de adenocarcinoma de mama humano

mg Miligrama

MHz Megahertz

mL Mililitro

MM Massa molecular

mm milímetro (s)

mM Milimolar

MS Massa seca (mg)

nd Não detectado

nm Nanômetro(s)

NOESY “Nuclear overhauser enhancement spectroscopy”

NUI “National University of Ireland”

ºC Graus Celsius

P.A. Pureza analítica

p/v peso por volume

PBS Tampão fosfato salino

PF Ponto de fusão

Pg. Página(s)

pH Potencial hidrogeniônico

p-NPP p-nitrofenil fosfato

RESÍDUO-SAP Resíduo vegetal (torta) obtido das sâmaras de Austroplenckia populnea

após todos os processos de extração com solventes orgânicos

Rf Fator de retenção, em cromatografia em camada delgada

RMN de 13C Ressonância magnética nuclear de carbono-13

RMN de 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

RPM Rotações por minuto

SAPEAE Sâmaras de A. populnea extrato acetato-etílico

SAPEC Sâmaras de A. populnea extrato clorofórmico

v

SAPEE Sâmaras de A. populnea extrato etanólico

SAPEH Sâmaras de A. populnea extrato hexânico

SFB Soro fetal bovino

TMS Tetrametilsilano

TTPC Triterpeno pentacíclico

u.m.a. Unidade de Massa Atômica

v/v Volume por volume

W Watts

vi

LISTA DE FIGURAS

III. REVISÃO DE LITERATURA Figura III. 1. Distribuição da família Celastraceae em todo o mundo. 8

Figura III. 2 A). Mapa da rota das expedições feitas por Martius pelo Brasil.

Fonte: (CRIA, 2005).

10

Figura III. 2. B). Gravura feita por Martius para A. populnea detalhando-se

flor, inflorescências, sâmaras e galho. Fonte: (CRIA, 2005).

10

Figura III. 3. Foto da árvore de Austroplenckia populnea Reiss.

Fonte: http://www.plantsystematics.org/imgs/shimizu/r/

Celastraceae_Plenckia_populnea_39901.html

11

Figura III. 4. Foto da flor, folha e sâmara de Austroplenckia populnea

Reiss.

12

IV. ESTUDO FITOQUÍMICO

Figura IV. 2.1. Fluxograma do processo de obtenção dos extratos de

sâmaras de Austroplenckia populnea e seus respectivos

rendimentos percentuais.

21

Figura IV. 2.2. Fluxograma do processo de separação do extrato hexânico

de sâmaras de Austroplenckia populnea e respectivos

rendimentos percentuais.

22

Figura IV. 2.3. Fluxograma do processo de fracionamento de SAPEH-O

obtido do extrato hexânico de sâmaras de Austroplenckia

populnea.

23

Figura IV. 3.1. Estrutura química de TC6 (3,5,7,4´-tetrahidroxi-6-metoxi-8-

prenilflavanona).

26

Figura IV. 3.2. Espectro de RMN de 13C obtido para TC6 (CDCl3, 50

MHz).

28

Figura IV. 3.3. Sub-espectro DEPT-135 obtido para TC6 (CDCl3, 50 MHz). 29

Figura IV. 3.4. Espectro de RMN de 1H obtido para TC6 (CDCl3, 200

MHz).

30

vii

Figura IV. 3.5. Estrutura química da undecanamida proposta para CM16 e

CM17.

33

Figura IV. 3.6. Espectro de RMN de 1H obtido para CM17 (Acetona-D3,

200 MHz). Acima, expansão entre H 3,5 a H 8,5.

34

Figura IV. 3.7. Espectro RMN 13C obtido para CM17 (Acetona-D3, 50

MHz).

35

Figura IV. 3.8. Sub-espectro DEPT-135 obtido para CM17 (Acetona-D3, 50

MHz).

36

Figura IV. 3.9. Estrutura química proposta para CM18 (4-hidroxi-1,6,15-

tri-acetiloxi-8,9-di-benzoiloxi-agarofurano).

37

Figura IV. 3.10. Espectro de RMN de 1H obtido para CM18 (Acetona-D3,

200 MHz).

38

Figura IV. 3.11. Espectro RMN 13C obtido para CM18 (Acetona-D3, 50

MHz).

39

Figura IV. 3.12. Ampliação do espectro RMN 13C obtido para CM18

(Acetona-D3, 50 MHz), entre C 15,00 a C 95,00 e entre C

13,00 a C 175,00.

40

Figura IV. 3.13. Sub-espectro DEPT-135 obtido para CM18 (Acetona-D3, 50

MHz).

41

Figura IV. 3.14. Esqueleto básico de um agarofurano e possíveis grupos

substituintes (hidroxila, metila, acetila e benzoíla) de CM18

42

Figura IV. 3.15. Estrutura básica de um diidroagarofurano. 42

Figura IV.3.16. Reissantinas F-H 1, 2 e 3 isoladas de Reissentia Buchananii

(Chang et al., 2006).

43

Figura IV.3.17. Cromatograma de CM18, obtido por CG-EM. 45

Figura IV. 3.18. Espectro de massas do constituinte de CM18 de tr = 39,19

min.

46

Figura IV. 3.19. Espectro de massas do constituinte de CM18 de tr = 20,38

min.

47

viii

Figura IV. 3.20. Estrutura proposta para o constituinte de CM18, de tr =

20,38 min., contendo MM = 572. As posições dos grupos

acetiloxi e benzoiloxi em C-8 e C-9 podem estar invertidas.

47

Figura IV. 3.21. Espectro de massas relativo ao constituinte de CM18, de tr

= 3,82 min.

48

Figura IV. 3.22. Espectro e estrutura do ácido hexadecanóico sugerida pelo

banco de dados NIST Search 2.0. aparelho Agilent GC-

MSD 5975

48

V. EFEITO DE CONSTITUINTES DE SÂMARAS DE Austroplenckia populnea

SOBRE PROLIFERAÇÃO CELULAR

Figura V.2.1. Esquema de distribuição de extratos e compostos nas

microplacas de cultura celular de 96-poços.

54

Figura V.3.1. Porcentagem de proliferação celular referente às diferentes

concentrações do extrato clorofórmico de sâmaras de

Austroplenckia populnea para cada linhagem celular testada

A) em 24 horas de exposição ao extrato B) em 48 horas de

exposição ao extrato.

57

Figura V. 3.2. Porcentagem de proliferação celular referente às diferentes

concentrações do extrato acetato etílico de sâmaras de




58


concentrações do extrato etanólico de sâmaras de




59


concentrações de proantocianidina A para cada linhagem

celular testada. A) em 24 horas de exposição ao constituinte.

B) em 48 horas de exposição ao constituinte.

60

ix


concentrações de 4’-O-metil-epigalocatequina para cada

linhagem celular testada. A) em 24 horas de exposição ao

constituinte. B) em 48 horas de exposição ao constituinte.

61


Austroplenckia populnea

Figura VI. 3.1. Porcentagem de germinação de sementes de Bidens pilosa L.,

tratadas com soluções dos extratos hexânico (SAPEH),

clorofórmico (SAPEC), acetato-etílico (SAPEAE) e etanólico

(SAPEE) obtidos de sâmaras de Austroplenckia populnea

(Celastraceae), nas concentrações 0,00; 31,25; 62,50; 125,00;

250,00; 500,00; 750,00 e 1000,00 mg/L.

69

Figura VI. 3.2. Efeito dos extratos hexânico (SAPEH), clorofórmico

(SAPEC), acetato-etílico (SAPEAE) e etanólico (SAPEE)

obtidos de sâmaras de Austroplenckia populnea

(Celastraceae) nas concentrações 0,00; 31,25; 62,50; 125,00;

250,00; 500,00; 750,00 e 1000,00 mg/L, sobre o índice de

velocidade de germinação (IVG) de sementes de Bidens

pilosa L.

70





250,00; 500,00; 750,00 e 1000,00 mg/L, sobre o

comprimento das radículas de Bidens pilosa L.

72





250,00; 500,00; 750,00 e 1000,00 mg/L, sobre o

comprimento de plântulas de Bidens pilosa L.

73

Figura VI. 3.5. Estrutura molecular de fridelina 75

x

Figura VI. 3.6. Efeito de fridelina nas concentrações 0,00; 6,25; 12,50; 25,00;

50,00; 100,00; 200,00 e 400,00 mg/L, sobre o comprimento

de radículas (CR), comprimento de plântulas (CP),

porcentagem de germinação (%G) e índice de velocidade de

germinação (IVG) de Bidens pilosa L.

76

xi

LISTA DE TABELAS

III. REVISÃO DE LITERATURA

Tabela III. 1. Classificação botânica, aceita para Austroplenckia

populnea. Fonte: Vieira Filho, 2002

11


Tabela IV. 2.1. Siglas adotadas na identificação de extratos de sâmaras de


20

Tabela IV. 3.1. Dados obtidos da espectrometria de RMN de 1H e 13C de

TC6 (400 e 100 MHz; CDCl3, ppm)

32

Tabela IV. 3.2. Valores observados na curva de integração no espectro de

RMN de 1H de CM17 e respectivas proporcionalidades em

termos de número de hidrogênios e de carbonos

33

Tabela IV. 3.3. Comparação dos deslocamentos químicos de carbono (C)

de CM18, com dados do anel agarofurânico de

Reissantinas F-H 1, 2 e 3

44

Tabela IV. 3.4. Tempo de retenção dos constituintes de CM18 e

respectivas porcentagens, determinados através do

cromatograma obtido por CG-EM

46



Tabela VI. 3.1. Valores médios para porcentagem de germinação de

sementes de picão-preto em função das diferentes

concentrações dos extratos de sâmaras de A. populnea

68

Tabela VI. 3.2. Valores médios para o índice de velocidade de germinação

(IVG) de sementes de picão-preto em função das diferentes

concentrações dos extratos de sâmaras de A. populnea

70

xii

Tabela VI. 3.3. Valores médios para o comprimento da radícula (mm) de

picão-preto em função das diferentes concentrações dos

extratos de sâmaras de A. populnea

71

Tabela VI. 3.4. Valores médios para o comprimento das plântulas (mm) de

picão-preto em função das diferentes concentrações dos

extratos de sâmaras de A. populnea

73

Tabela VI. 3.5. Valores médios obtidos para porcentagem de germinação

(%G), índice de velocidade de germinação (IVG),

comprimento das radículas (CR) comprimento das

plântulas (CP) de picão-preto em função das diferentes

concentrações de fridelina

75

I. INTRODUÇÃO GERAL

I. Introdução Geral

2

I. INTRODUÇÃO GERAL

Produtos naturais vêm sendo utilizados pela humanidade desde a época primitiva com

o objetivo de aliviar e curar doenças, principalmente através da ingestão ou uso tópico de

folhas de ervas. Atualmente, muitas espécies e preparados vegetais medicinais são estudados

na busca pelo entendimento do seu mecanismo de ação e no isolamento de princípios ativos

(Viegas Jr et al., 2006). Além disso, produtos naturais têm sido úteis como “compostos-

modelos” para a obtenção de novos fármacos (Copping e Duke, 2007).

Apesar do desenvolvimento nas áreas de síntese orgânica, microbiologia industrial e

biologia molecular, parte dos fármacos permanece sendo obtida a partir de matérias-primas

vegetais, seja pela dificuldade em obter sinteticamente moléculas com a mesma

estereoquímica, seja pela inviabilidade econômica, no caso de substâncias para as quais a

síntese total já foi desenvolvida em laboratório. Em muitas outras situações, envolvendo

fármacos que não ocorrem na natureza, a sua obtenção foi facilitada, ou tornou-se

economicamente viável apenas a partir da descoberta de substâncias que puderam ser

utilizadas como precursores na sua síntese. Grande parte dos adjuvantes farmacêuticos

empregados nos dias de hoje são de origem vegetal (Simões et al., 2004).

Aproximadamente 25% dos agentes terapêuticos prescritos são derivados de plantas e,

dos 252 medicamentos considerados como básicos e essenciais pela Organização Mundial de

Saúde (OMS), 11% são exclusivamente originários de plantas e um número significativo

deles são compostos sintéticos obtidos de precursores naturais. Nas últimas décadas, o

desenvolvimento de medicamentos a partir de recursos naturais ganhou novo impulso por

interesse tanto da sociedade científica quanto da indústria farmacêutica (Rates, 2001). Este

fato deve-se ao moderno contexto social e econômico, onde se constata que entre 65 e 80% da

população mundial faz uso de plantas para cuidados médicos primários (Calixto e Yunes,

2001). Estima-se que apenas 23% da população brasileira tenham acesso ao consumo de

medicamentos comercializados, dos quais 80% são importados. Por esse motivo, o uso de

remédios caseiros feitos a partir de plantas constitui a principal opção para cuidados médicos

primários (Elisabetsky e Shanley, 1994). Considerando o quadro mundial do uso de

medicamentos naturais, a OMS, considera a fitoterapia como parte do seu programa de saúde

e sugere procedimentos básicos para a validação de agentes medicamentosos originados a

partir de plantas (Rates, 2001).


3

Diante da magnitude do reino vegetal ainda tem-se muito que descobrir e a aprender.

É possível, então, afirmar que ainda por muitos anos as plantas continuarão fornecendo aos

pesquisadores inúmeros produtos para investigação, tais como: agentes de uso potencial para

a prevenção e tratamento de doenças como câncer, malária, esquistossomose,

tripanossomíase, desordens dos sistemas cardiovascular e nervoso, e infecções virais, como a

síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e outras (Vieira Filho, 2002).

Os países do terceiro mundo apresentam grande abundância em variedades genéticas

vegetais. Entretanto é limitada a capacidade de exploração plena destes recursos, de maneira

produtiva e contínua. Por outro lado, os países industrializados, embora carentes de recursos

naturais, dispõem de sofisticada tecnologia a serviço da crescente demanda de novas drogas e

de outros produtos químicos de interesse comercial. Como o estudo sobre a variedade

genética de plantas assume crescente importância internacional para a bioindústria, recursos

naturais vêm sendo estrategicamente explorados, com vantagens para os países menos

desenvolvidos (Paes, 1993).

O interesse nos recursos naturais brasileiros é grande, especialmente em relação às

plantas, já que o país possui uma das maiores biodiversidades do mundo, estimada em torno

de 20% do total das espécies animais e vegetais existentes. Segundo descrito no Atlas da

Biodiversidade, o estado de Minas Gerais é um dos mais ricos em biodiversidade do país.

Porém, reconhece-se que, apesar da variedade de formações, a flora mineira ainda é pouca

estudada. Tendo em vista o pequeno conhecimento a respeito dela, a ameaça de extinção pode

estar sendo subestimada (Brandão, 2003).

O estudo desta grande e importante biodiversidade depende de uma abordagem

específica e direcionada para as substâncias que a compõe. Sendo assim a química de

produtos naturais representa um elo dentro da área de pesquisa de plantas medicinais, à

medida que somente por meio dos métodos utilizados nessa área é possível realizar tanto o

isolamento e a purificação de novos compostos, como efetuar a correta determinação

estrutural e posterior síntese total ou parcial do constituinte de maior interesse. Os avanços

nessa área são enormes, especialmente nas últimas décadas onde se observou a inserção de

novos experimentos de espectroscopia de ressonância magnética nuclear e espectrometria de

massas. É fácil concluir que o futuro das descobertas de novos medicamentos passa

obrigatoriamente por esse campo da ciência (Di Stasi, 1995). É importante destacar ainda que

apesar do desenvolvimento da química de sínteses, o estudo de substâncias naturais presentes


4

em plantas oferece sempre novos modelos de estruturas químicas para estudos farmacológicos

e para o desenvolvimento de novos medicamentos (Pinheiro, 1980).

Sabe-se que algumas substâncias provenientes do metabolismo secundário de plantas

apresentam grande potencial farmacológico. Portanto, esses constituintes podem se tornar

futuros fármacos. Constata-se que a composição química de espécies vegetais, ainda está

longe de ser descrita em sua totalidade. Esse fato mostra que uma grande quantidade de

constituintes naturais não foi isolada ainda e devidamente estudada sob o ponto de vista

químico. Por outro lado, inúmeros compostos, já isolados e com estruturas químicas

determinadas, ainda não foram estudados quanto às potencialidades de sua utilização para

outras finalidades, especialmente a de interesse terapêutico. Apenas um grupo restrito de

substâncias possui suas propriedades farmacológicas plenamente determinadas. Assim, a

ciência ainda tem um longo caminho a percorrer no sentido de elucidar o papel desses

compostos na atividade biológica e completar o quadro de substâncias químicas disponíveis

nas espécies vegetais (Di Stasi, 1995).

Este trabalho justifica-se pelo fato de ainda serem escassos na literatura, registros

relacionados à constituição química e possíveis atividades biológicas de sâmaras de

Austroplenckia populnea. O estudo desta parte da planta poderá contribuir com a

caracterização de novos compostos químicos, atividades biológicas e com o enriquecimento

do acervo de bibliografias científicas no âmbito da química de produtos naturais.

II. OBJETIVOS DO TRABALHO

II. Objetivos

6

II. OBJETIVOS DO TRABALHO

OBJETIVO GERAL

A proposta deste trabalho consistiu na realização do estudo fitoquímico associado à

avaliação das atividades biológicas, proliferação celular e alelopatia, de extratos e

constituintes isolados de sâmaras de Austroplenckia populnea.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Os estudos tiveram início pela avaliação fitoquímica das sâmaras de A. populnea e,

posteriormente, os extratos e constituintes químicos isolados foram submetidos aos testes

biológicos, dando continuidade ao estudo das relações entre constituição química e

propriedades terapêuticas no gênero Austroplenckia, e de outras espécies da família

Celastraceae.

Os experimentos utilizados neste trabalho envolveram:

Obtenção de extratos brutos de sâmaras de A. populnea por extração contínua em

aparelho Soxhlet usando solventes de polaridades crescentes;

Fracionamento dos extratos por meio de processos cromatográficos;

Purificação de constituintes químicos através de diferentes processos

cromatográficos;

Elucidação estrutural de substâncias e possíveis derivados utilizando técnicas de

ressonância magnética nuclear de 1H e de 13C, DEPT-135 e de espectrometria de

massas (EM);

Avaliação do efeito de extratos e constituintes químicos isolados de sâmaras da

A. populnea sobre três linhagens celulares humanas cancerígenas – MCF-7

(adenocarcinoma ductal de mama), A549 (câncer de pulmão), HS578T

(carcinoma ductal de mama) – e uma linhagem celular humana não cancerígena

– HEK293 (embrionárias de rim);

Avaliação do efeito alelopático de extratos e constituintes químicos isolados de

sâmaras da A. populnea em diferentes concentrações de uso, sobre a germinação

e crescimento das sementes de picão-preto (Bidens pilosa L.).

III. REVISÃO DA LITERATURA

III. Revisão da Literatura

8

III. REVISÃO DE LITERATURA

III. 1. A família Celastraceae

A Família Celastraceae abrange 98 gêneros com aproximadamente 1264 espécies e

é considerada nativa de regiões sub-tropicais e tropicais do mundo, incluindo o norte da

África, América do Sul, e muitas partes do leste da Ásia, particularmente da China (Spivey

et al., 2002). No Brasil a família Celastraceae é representada por quatro gêneros: Maytenus

Juss., Goupia Reiss., Austroplenckia Lund. e Franhofera Mart. As plantas desta família

ocorrem de norte a sul do país, havendo espécies endêmicas e outras de ocorrência mais

generalizada, como se pode observar na Figura III. 1.

Figura III. 1. Distribuição da família Celastraceae em todo o mundo.

Os membros da família Celastraceae são árvores, arbustos ou lianas e apresentam

caules e folhas resinosas. Geralmente as flores são pequenas e regulares, sendo que a maioria

delas são pentâmeras e radialmente simétricas. Os frutos são carnudos, capsulares, ou

capsulares indeiscentes, bagas, aquenóides ou sâmaras. As sementes usualmente são aladas ou

foliáceas e contém um embrião bem diferenciado, clorofiloso e estreito e apresentam dois

cotilédones; largos, foliáceos (Cronquist, 1988; Lawrence, 1971).

As plantas da família Celastraceae têm sido valorizadas desde a antiguidade em razão

de seus extratos possuírem úteis propriedades medicinais. É surpreendente a quantidade de

propriedades atribuídas aos extratos dessas plantas na medicina e agricultura tradicional,

incluindo atividades tais como estimulante, bloqueador de apetite, sedativo, emético,

purgativo, restaurador de memória, contraceptivo masculino, antitumoral, antileucêmico, anti-

bacteriano, inseticida e repelente de insetos (Spivey et al., 2002).Várias substâncias isoladas

de membros da família Celastraceae apresentam atividade biológica (Brüning and Hilderbert,

1978; Duarte, 2000; Kupchan et al., 1972; Meléndez-Salazar, 2005; Silva, 1990). Dentre as

Celastraceae


9

substâncias obtidas de celastráceas, a maitansina, obtida de Maytenus ovatus Loes. apresentou

excepcional atividade inibitória in vitro contra carcinomas humanos, o que ajudou muito a

promover a química dos produtos desta família (Spivey et al., 2002).

Nos últimos trinta anos um grande número de metabólitos secundários bioativos têm

sido extraído de espécies da família Celastraceae, em especial dos gêneros Austroplenckia

(Vieira-Filho, 2002), Maytenus (Oliveira et al., 2006; Oliveira, 2007) e Salacia (Duarte et al.,

2009). Além de numerosos terpenóides, incluindo a classe dos quinonametídeos e dos

triterpenos pentacíclicos, que representam os constituintes de maior incidência nestas espécies

em quantidade e variedade estrutural, vários compostos bioativos como fenilalquilaminas,

maitansinóides e flavonóides têm sido isolados (Spivey et al., 2002). O aumento do interesse

pelo estudo desta família também se deveu à descoberta da ação antitumoral apresentada

também pela tingenona, um quinonametídeo de natureza triterpênica pentacíclica, encontrado

em espécies da família Celastraceae (Marine-Bettòlo, 1974).

Espécies desta família são de grande importância científica, uma vez que possuem

comprovada atividade biológica, tais como propriedade antitumoral, antimalárica e

antioxidante, entre outras (Jeller et al., 2004; Subhadhirasakul et al., 2008).

III. 2. Austroplenckia populnea (Reissek) LUNDELL

Considerações taxônomicas

O Gênero Plenckia foi inicialmente descrito no Brasil por Carl Friedrich Philipp von

Martius (1794-1868), no trabalho intitulado “Flora Brasiliensis”. Nesta obra, composta por 15

volumes, o autor descreve, juntamente com August Wilhelm Eichler e Ignatz Urban e com a

participação de 65 especialistas de vários países, 22767 espécies pertencentes à flora brasileira

pesquisadas em expedições pelo Brasil durante os anos de 1817-1820 (Henriques, 2008).

Dentre as espécies relatadas, encontra-se Plenckia populnea, nome apresentado segundo a

grafia e classificação utilizadas na obra para Austroplenckia populnea. Na Figura III. 2 estão

apresentadas em A) destacada em vermelho, a rota das expedições feitas por Martius pelo

Brasil. As expedições partiram do Rio de Janeiro, seguiram para São Paulo, Minas Gerais,

Goiás, atravessaram a Bahia, Pernambuco, Piauí e Maranhão. A seguir, partindo de Belém do

Pará, subiram o rio Amazonas e terminaram a viagem em Santarém, de onde Martius

embarcou para a Europa. Em B) visualiza-se a gravura feita por Martius para A. populnea na

qual observa-se flor, inflorescências, sâmaras e galho.


10

Figura III. 2. A) Mapa da rota das expedições feitas por Martius pelo Brasil B) Gravura feita

por Martius para A. populnea detalhando-se flor, inflorescências, sâmaras e galho. Fonte:

(CRIA, 2005).

Com o avanço de estudos recentes em ultra-estruturas, número de cromossomos, sítios

de restrições de DNA, e dados morfológicos, constantemente as espécies costumam ser

reenquadradas taxonomicamente e, portanto, dependendo do autor seguido, pode apresentar

taxonomias diferentes (Trevisan, 2010). De acordo com a literatura, Austroplenckia populnea

pode ser classificada como pertencente à subclasse Archiclamidae (Duarte, 2000; Engler,

1964; Silva, 1990) ou à subclasse Rosidae (Cronquist, 1988). Em função disto, são

apresentadas na Tabela 1, duas classificações aceitas na atualidade pelos Botânicos. Este

trabalho adotou a nomenclatura científica: Austroplenckia populnea (Reissek) – Lundell

(Celastraceae).

O gênero Austroplenckia é constituído por uma única espécie, o que lhe confere uma

característica muito peculiar, visto que esta espécie se torna um marco referencial para

estudos de rotas biossintéticas, para estudos quimiotaxonômicos e outros (Vieira Filho, 2002).

A) B)


11

Tabela III. 1: Classificação botânica, aceita para Austroplenckia populnea.

Classificação Engler, A., 1964 Cronquist, A., 1988

Divisão Angioepermae Magnoliophyta

Classe Dycotiledonae Magnoliopsida

Subclasse Archiclamydeae Rosidae

Ordem Celastrales Celastrales

Subordem Celastrinea

Família Celastraceae Celastraceae

Subfamília Tripterygioideae

Tribo Elaedendra

Gênero Plenckia

Subgênero Austroplenckia

Espécie populnea

Variedade Bela ovata

Fonte: Vieira Filho, 2002

Características botânicas

A. populnea é uma árvore que pode atingir até dez metros de altura (Figura III. 3). A

sua casca, ao sofrer algum corte mostra uma coloração vermelha intensa na sua parte mais

externa e uma cor amarela na parte interna (Lorenzi, 1992).

Figura III. 3. Foto da árvore de Austroplenckia populnea Reiss.

Fonte: http://www.plantsystematics.org/imgs/shimizu/r/ Celastraceae_Plenckia_populnea_39901.html


12

As flores da A. populnea são esverdeadas ou branco-amareladas, dispostas em

cimeiras axilares ou subterminais. Na região de Minas Gerais, as flores surgem durante os

meses de outubro a novembro. O fruto é uma sâmara grande, pendente e de cor esverdeada

(Figura III. 4). Após o amadurecimento as sâmaras ressecam e adquirem uma coloração

amarelada. O comprimento destas varia de 2 a 5 cm, e a largura de 0,5 a 1,5 cm. Cada sâmara

é provida de um apêndice mais ou menos tênue, membranoso e em forma de asa, e contém

apenas uma semente com o embrião axial, reto (Martius et al., 1865). As folhas são alternas,

oblongas, longo pecioladas, com as bordas serrilhadas, e a extremidade é puntiforme. As

folhas apresentam uma coloração verde-amarelada e brilhante ao sol; bem característica.

Figura III. 4. Foto da flor, folha e sâmara de Austroplenckia populnea Reiss.

É naturalmente encontrada nas regiões do cerrado brasileiro, principalmente nos

estados da Bahia e de Minas Gerais. Apresenta uma madeira bem resistente e adequada para

trabalhos de torneamento. Esta característica transforma esta planta num bom material para

uso em trabalhos de marcenaria (Vieira-Filho, 2002).

No Estado de Minas Gerais a Austroplenckia populnea é popularmente conhecida

como Mangabarana, Mangabeira Brava, Marmelo do Campo, Marmelinho do Campo, Piúva-

branca (Duarte, 2000; Lorenzi, 1992; Silva, 1990).

Situação atual da Austroplenckia populnea e perspectivas futuras

Devido às freqüentes queimadas, que acontecem nos campos, principalmente nos

períodos de seca, que em Minas Gerais ocorrem entre os meses de julho a setembro; e


13

também aos desmatamentos que são realizados de forma indiscriminada; existe a

possibilidade de acontecer a extinção desta espécie. Para evitar que isto ocorra sugere-se

controlar os fatores acima e desenvolver técnicas de cultivo da Austroplenckia populnea,

seguidas de projetos de plantio desta em grande escala (Vieira-Filho, 2002).

Em função da Organização Mundial da Saúde (OMS) estar recomendado o

aproveitamento do conhecimento tradicional do uso de plantas medicinais, é o momento de se

ter em conta e dar o real valor ao conhecimento etnofarmacológico, através da validação do

uso feito pelas populações, principalmente as indígenas. Esta planta é utilizada na medicina

popular na forma de bebida aquosa feita por cocção de folhas frescas ou secas, para o

tratamento de doenças do trato gastrintestinal como úlcera, gastrite, acidez crônica e outras

afecções do gênero. O decocto das raízes desta planta é usado tradicionalmente como

antidisentérico e anti-reumático e tiveram sua eficácia comprovada por Correa, 1969 e

Gonzalez et al., 1982 respectivamente (Andrade et al., 2007; Brüning and Hilderbert, 1978;

Vieira Filho et al., 2002).

Durante os últimos vinte anos, tem-se estudado sistematicamente aspectos

fitoquímicos e biológicos de Austroplenckia populnea. Extratos de folhas desta planta

exibiram atividade larvicida contra Strongyloides stercoralis (de Sousa et al., 2006), efeitos

antiulcerogênico e analgésico em ratos (Seito et al., 2002), além de terem efeitos

contraceptivos sobre a reprodução de ratos machos (Mazaro et al., 2002; Mazaro et al., 2000).

Vieira Filho et al., 2002 sugeriram que a presença significativa dos triterpenos pentacíclicos

friedelina, β-friedelinol e 28-hidroxi-friedelina neste extrato seja responsável pela atividade

antiespermatogênica observada nos experimentos.

Zanoni et al., 2005 avaliaram o potencial mutagênico de extratos da casca do caule de

A. populnea e observaram efeito clastogênico em células de medula óssea de ratos Wistar,

efeito este que não foi observado por Pugliesi et al., 2007 para extratos de folhas.

Extratos, frações e o ácido populnóico obtidos da casca de A. populnea, foram

investigados por Andrade et. al., 2007 e apresentaram atividade antiinflamatória e analgésica,

corroborando com o uso deste extrato pela população no tratamento de úlceras.

Pesquisas revelam a presença de grande variedade de sesquiterpenos e triterpenos

pentacíclicos em A.populnea (Vieira-Filho et al., 2001) com atividades biológicas diversas

como a atividade antitumoral do ácido pulpônico relatada por Monache, 1972. Além disso,

Duarte et al., 2002 relataram a atividade anti-tripanossomicida dos triterpenos pentacíclicos

20α-hidroxitingenona e ácido epicatônico, isolados de A. populnea, utilizando o tripanossoma


14

do subgênero Schizotrypanum isolado de morcego, que mostrou ser um modelo adequado

para uma seleção preliminar de compostos anti. T. (S.) cruzi.

Vieira Filho et. al., 1999 e Miranda et. al., 2009 avaliaram a atividade antibacteriana

de extratos de folhas, galhos e raízes, e dos triterpenos abruslactona A, 3-epi-abruslactona,

fridelina, 28-hidroxifridelano (canoflol), 3β-fridelinol, ácido catonônico, ácido epicatônico,

ácido populnílico, ácido populnínico, ácido populnônico , pristimerina e α-amirina, isolados

de A. populnea e dos seus produtos transformados, metil populnoato, metil catotonato e metil

epicatonato, em relação a Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermides e Salmonella sp. Os resultados destes

trabalhos mostraram que os constituintes com características mais polares apresentam melhor

atividade antibacteriana.

Assim, o que se propõe nesse trabalho, é a continuidade do estudo fitoquímico e

biológico de extratos e constituintes de sâmaras de Austroplenckia populnea, abrindo uma

linha de pesquisa de frutos e sementes de outras espécies brasileiras pertencentes à família

Celastraceae. Os estudos contribuirão para aumentar o conhecimento químico desse vegetal e

também para fundamentar perspectivas de exploração racional do seu potencial em áreas

como farmacologia, ecologia, agricultura e outras.

IV. Introdução

16

IV. 1. INTRODUÇÃO

Produtos naturais são historicamente a maior fonte de agentes farmacêuticos. Um

grande número de plantas medicinais tem sido submetido a investigações químicas

detalhadas, e isso tem levado ao isolamento de moléculas bioativas que são avaliadas

farmacologicamente, com o objetivo de descoberta de novas drogas juntamente com novas

aplicações (Tantry, 2009). Este processo tem uma abordagem multidisciplinar, e depende da

interação entre ciências como botânica, química e farmacologia, incluindo toxicologia. Outros

campos do conhecimento também podem estar envolvidos, como por exemplo, antropologia,

agronomia e biotecnologia, dependendo do objetivo do estudo (Rates, 2001).

O desenvolvimento de medicamentos a partir de recursos vegetais demanda

experiência e paciência. O procedimento se inicia a partir da seleção de uma planta adequada

para o estudo farmacológico, o que pode ser feito baseando-se no uso tradicional, conteúdo

químico, seleção de toxicidade, randomizados ou uma combinação de vários critérios. A

estratégia mais comum para a escolha de uma planta é a observação do seu uso na medicina

popular, o que é conhecido como etnobotânica ou etnofarmacologia. Uma vez que a planta

medicinal é escolhida, o próximo passo é a sua recolha e identificação botânica. É importante

que a coleta da planta seja feita por um taxonomista profissional que é capaz de identificar

corretamente a espécie e preparar parte do material para a preservação em herbário a fim de se

ter um material de referência (exsicata). Preferencialmente, o local e a data de recolhimento

devem ser registrados e as informações mantidas, caso seja necessária coleta posterior. O

material vegetal é sujeito a um processo de estabilização, geralmente secagem à sombra, à

temperatura ambiente e com fluxo de ar controlado. O material vegetal seco ou estabilizado

deve ser, em pó, submetido a um processo de extração adequado. Para a obtenção de

compostos isolados, os extratos vegetais são analisados qualitativamente por métodos

cromatográficos seguido da determinação da estrutura destes compostos através de métodos

espectroscópicos (UV, infravermelho, espectros de massas ou RMN), então se faz uma

triagem para determinar a atividade biológica ou para obter uma avaliação geral destas

atividades. Com a estrutura química dos compostos e atividades biológicas definidas parte-se

para a síntese parcial ou total e a produção destes em larga escala. Após execução destas

etapas é necessária uma avaliação farmacológica e toxicológica do produto objetivando o uso

terapêutico (Ferry and Baltassat-Millet, 1977; Hamburger and Hostettmann, 1991; Rates,

2001; Soejarto, 1996; Tantry, 2009; Verpoorte, 1989; Williamson et al., 1996).

IV. Introdução

17

Entre várias plantas com utilização popular para fins farmacológicos, destacam-se as

espécies da família Celastraceae das quais várias substâncias isoladas apresentam atividades

biológicas (Brüning and Hilderbert, 1978; Da Silva, 1990; Duarte, 2000; Kupchan et al.,

1972; Meléndez-Salazar, 2005). Maytenus ilicifolia Reiss., conhecida popularmente como

“espinheira-santa” é atualmente um fitoterápico indicado para o tratamento de doenças

gastrointestinais, além de atividades antitumorais e anti-leucêmica encontradas em triterpenos

maytansinóides e quinonametídeos isolados desta e de outras espécies do mesmo gênero. A

investigação de constituintes químicos da espécie Austroplenckia populnea também merece

considerável atenção, já que relatos populares indicam o uso de folhas e raízes desta planta,

sob a forma de decocto, para o tratamento de disenterias e doenças de caráter inflamatório,

como o reumatismo, atividades estas que foram comprovadas em estudos anteriores (Andrade

et al., 2007). Além disto, outras atividades de extratos e compostos isolados foram estudadas

(Duarte et al., 2002; Mazaro et al., 2002; Mazaro et al., 2000; Miranda et al., 2009; Seito et

al., 2002; Vieira-Filho, 2002; Vieira Filho et al., 2002; Vieira Filho et al., 1999), porém ainda

são poucos os registros na literatura, da composição química, e possíveis atividades biológicas

de frutos e sementes desta espécie. Este trabalho teve prosseguimento com o objetivo de isolar

e identificar os compostos ativos de sâmaras de A. populnea para que, posteriormente, sejam

avaliadas as atividades sobre a proliferação celular e alelopática dos mesmos, contribuindo

assim com o estudo quimiotaxonômico do gênero Plenckia e de espécies de outros gêneros da

família Celastraceae.

IV. Experimental

18

IV. 2. EXPERIMENTAL

Os experimentos foram realizados no Núcleo de Estudo de Plantas Medicinais

(NEPLAM), Departamento de Química, Universidade Federal da Minas Gerais, Belo

Horizonte – MG, Brasil e Laboratório de Síntese de Substâncias Bioativas e Produtos, Escola

de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto – MG, Brasil

Foram adotados como critérios de pureza, a visualização de uma única mancha em

cromatoplaca de cromatografia em camada delgada (CCD) utilizando eluentes de diferentes

polaridades, o número de sinais no espectro de RMN de 13C e uma estreita faixa de fusão.

Métodos cromatográficos

Nos processos de cromatografia em coluna (CC), foi utilizada sílica gel (Merck 60 –

70-230 Mesh) em suporte de vidro com diâmetro interno adequado para cada caso. Adotou-se

a proporção aproximada de 1 g de amostra para 30 g de fase estacionária.

Para a cromatografia em camada delgada (CCD), utilizou-se suspensão de sílica gel

(Merck 60 G) em água (0,5% (p/v)) formando camada de 0,25 ou 0,50 mm de espessura,

sobre suporte de vidro de 3x10, 5x10 ou de 10x10 cm. Após secagem parcial em temperatura

ambiente as placas foram ativadas em estufa a 100 ºC durante 1 hora.

Todos os solventes utilizados nos processos de cromatografia foram de grau analítico

(P.A.).

Reveladores cromatográficos

As cromatoplacas foram colocadas em uma câmara fechada e submetida à irradiação

com luz ultravioleta ( = 254 ou 365 nm) para observação de possível fluorescência, e/ou

colocadas em uma cuba de vidro fechada em contato com vapores de iodo até a revelação das

mesmas.

Pontos de fusão

Pontos de fusão, obtidos em graus Celsius, foram determinados em aparelho Metler

FP82 equipado com processador Metler FP800.

Métodos espectrométricos

Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram obtidos em espectrômetro Brucker

AVANCE DRX-400 ou em Brucker AVANCE DPX-200 MHz utilizando como referencial

interno, o sinal relativo ao tetrametilsilano (TMS) para o qual o deslocamento químico do

IV. Experimental

19

hidrogênio (H) é igual ao do carbono (C = 0,00). Os deslocamentos químicos () são

expressos em partes por milhão (ppm) e as constantes de acoplamento (J), em Hertz (Hz).

Solventes deuterados utilizados são indicados em cada caso.

Espectros de RMN de 13C teóricos foram calculados utilizando o programa ACD -

“Advanced Chemistry Development - Visionary Software for Scientists” – Versão 4.5.

Espectros de massas foram obtidos utilizando o espectrômetro de massas Agilent GC-

MSD 5975, do Laboratório de Cromatografia, do Departamento de Química do CEFET-MG

com o apoio da Profa. Dra. Adriana Akemi Okuma.

Dados da literatura

Para a obtenção de dados relacionados às substancias isoladas, foi utilizado o

programa SciFinder, que se encontra disponível para a UFOP e outras universidades

conveniadas em http://www.cas.org/products/sfacad/index.html.

IV. 2.1. Material vegetal

As sâmaras de Austroplenckia populnea utilizadas neste trabalho foram coletadas entre

os meses de junho e julho de 2007, nas proximidades da Lagoa do Miguelão, município de

Nova Lima, Minas Gerais. Neste período as sâmaras se mostram amadurecidas apresentando

uma coloração amarelo-palha e um aspecto de secura.

Para a confirmação da autenticidade botânica, uma amostra da espécie foi

adequadamente preparada e comparada com a exsicata de número 10.473, no Museu de

Historia Natural da UFMG.

As sâmaras foram devidamente selecionadas e logo a seguir submetidas à secagem. O

material foi respectivamente espalhado sobre folhas de papel “Kraft” e deixado ao ar livre

para o término da secagem. A seguir, submeteu-se o material à fragmentação em moinho de

facas.

IV. 2.2. Obtenção dos extratos

As sâmaras de Austroplenckia populnea previamente secas e moídas (286,97 g), foram

submetidas à extração exaustiva em aparelho Soxhlet utilizando-se sequencialmente, hexano,

clorofórmio, acetato de etila e etanol como solventes extratores. Ao término de cada extração,

o resíduo vegetal foi submetido à secagem em estufa a 37 ºC e posteriormente recolocado na

câmara do aparelho de Soxhlet para ser submetido a uma nova extração com um solvente de

IV. Experimental

20

maior polaridade. Os solventes utilizados nas extrações foram separados do correspondente

extrato, com auxílio de um evaporador rotatório, à pressão reduzida e mantendo-se a

temperatura situada entre 40 e 50 ºC. Após sua recuperação, o solvente foi re-utilizado em

novo processo de obtenção de extratos. Para o restante da secagem, o resíduo obtido do

evaporador rotatório foi rotulado como extrato e armazenado em dessecador à vácuo.

Para a identificação dos extratos obtidos, foram adotadas as letras “S” para codificar

sâmaras, “A” para Austroplenckia, “P” para populnea, “EH” para extrato hexânico, “EC” para

extrato clorofórmico, “EAE” para extrato acetato-etílico, “EE” para extrato etanólico e a

palavra “RESÍDUO - SAP” para representar o resíduo vegetal obtido após todo o processo de

extração com os diferentes solventes. Então, têm-se as siglas e extratos correspondentes na

Tabela IV. 2.1.

Tabela IV. 2.1. Siglas adotadas na identificação de extratos de sâmaras de


Sigla

Material obtido à partir de

sâmaras de


SAPEH Extrato hexânico

SAPEC Extrato clorofórmico

SAPEAE Extrato acetato-etílico

SAPEE Extrato etanólico

RESÍDUO – SAP

Resíduo vegetal obtido após

todos os processos de extração

com solventes orgânicos

A partir de cinco repetições da sequência de extrações contínuas para a obtenção dos

extratos, determinou-se o rendimento médio percentual para cada um dos extratos e para o

resíduo vegetal final. Considerou-se a massa inicial das sâmaras secas e fragmentadas, 286,97

g, como 100%. Um fluxograma do processo de obtenção dos extratos é representado na

Figura IV. 2.1 com seus respectivos rendimentos percentuais.

IV. Experimental

21

Figura IV. 2.1. Fluxograma do processo de obtenção dos extratos de sâmaras de

Austroplenckia populnea e seus respectivos rendimentos percentuais.

IV. 2.3. Fracionamento dos extratos

EXTRATO HEXÂNICO (SAPEH)

Durante o processo de eliminação do hexano em evaporador rotatório, observou-se a

formação de um precipitado viscoso. Tornou-se necessária a adição de acetato de etila ao

extrato parcialmente concentrado e resfriado (temperatura ambiente) para realizar a separação

do precipitado que, posteriormente, foi filtrado em funil de Büchner e lavado com acetato de

IV. Experimental

22

etila. O acetato de etila foi eliminado em evaporador rotatório juntamente com o hexano

residual, restando no balão um resíduo oleoso e de cor escura.

O extrato hexânico forneceu então uma parte sólida e outra oleosa, às quais foram

atribuídas as siglas SAPEH-S e SAPEH-O respectivamente. O rendimento percentual

verificado para estes produtos foi determinado, como pode-se observar no fluxograma

representado na Figura IV. 2.2.

Figura IV. 2.2. Fluxograma do processo de separação do extrato hexânico de sâmaras

de Austroplenckia populnea e respectivos rendimentos percentuais.

Fracionamento da parte sólida (SAPEH-S)

Após análise por cromatografia em camada delgada, SAPEH-S foi submetida ao

fracionamento por cromatografia em coluna utilizando como eluentes hexano, clorofórmio,

acetato de etila e metanol. Foram obtidas 304 frações de 100 mL que foram reunidas quando

semelhantes. Posteriormente, constatou-se que as frações eram constituídas por misturas

complexas e, tentativas de purificação pelos métodos disponíveis somente contribuíram para

torná-las ainda mais complexas (possivelmente devido a processos de decomposição). Então

se optou pelo armazenamento destas frações.

IV. Experimental

23

Fracionamento da parte oleosa (SAPEH-O)

18,0 g de SAPEH-O foram submetidos à coluna cromatográfica filtrante utilizando

como eluentes hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. Foram coletadas 100 frações

de 250 mL respectivamente rotuladas como SAPEH-O 1, SAPEH-O 2, ..., SAPEH-O 100. Os

eluentes foram removidos em evaporador rotatório e as frações foram analisadas por

cromatografia em camada delgada e reunidas quando apresentaram perfil cromatográfico

semelhante. A Figura IV. 2.3 apresenta o fluxograma do processo de fracionamento da parte

oleosa obtida do extrato hexânico de Austroplenckia populnea.

Figura IV. 2.3. Fluxograma do processo de fracionamento de SAPEH-O obtido do

extrato hexânico de sâmaras de Austroplenckia populnea.

Embora classificadas como grupos, algumas frações não foram misturadas em um

único frasco.

Estudos anteriores das frações obtidas

Estudos realizados anteriormente por Vieira Filho, 2002, mostraram que o material

sólido esbranquiçado obtido das frações 01-10 de SAPEH-O, se tratava de uma mistura de

IV. Experimental

24

hidrocarbonetos com faixa de fusão entre 50 e 60 ºC. Este material foi identificado através de

análise por cromatografia gás-líquido (CGL) e por espectroscopia na região do infravermelho.

Identificou-se neste mesmo estudo (Vieira Filho, 2002) o composto Fridelina. Obtido

da parte sólida das frações 49-52, esta substância apresentou ponto de fusão entre 259 e 264

ºC e teste de Lieberman-Burchard positivo para triterpenos pentacíclicos.

Fração 55 de SAPEH-O

Na tentativa de isolamento de constituintes, a fração SAPEH-O 55 foi submetida à

cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) utilizando como eluentes hexano,

clorofórmio, acetato de etila e etanol puros ou em misturas de polaridade crescente, e revelada

em UV/Vis onde se pôde notar a presença de três substâncias, aqui nomeadas como TC5 (8,0

mg), TC6 (8,0 mg) e TC7 (9,0 mg).

Notou-se também que ao dissolver a fração 55 em acetona, houve a formação de um

material sólido, então nomeado TC8.

As substâncias (TC5, TC6, TC7 e TC8) foram submetidas à espectrometria de RMN

de 1H e de 13C e, posteriormente à espectrometria de massas.

Fração 59 de SAPEH-O

A fração SAPEH-O 59 (0,625 g) foi submetida a cromatografia em coluna de sílica gel

utilizando-se como eluentes hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol, puros ou em

misturas de polaridade crescente. Foram obtidas 26 frações de aproximadamente 30 mL cada.

As frações foram respectivamente rotuladas como CM01, CM02,..., CM26.

A análise por CCD seguida por exposição à luz ultravioleta indicou que as frações

CM01 a CM13 e CM19 a CM26 representavam misturas complexas e devido a baixa

quantidade disponível, foram descartadas. Por outro lado, CM14, CM15, CM16, CM17 e

CM18 apresentavam manchas únicas em cromatoplaca mesmo com a variação da polaridade

dos eluentes. Após análise por CCD, variando a polaridade dos eluentes, constatou-se que

cada uma destas frações estava constituída por um único componente, e que devido à variação

do fator de retenção (Rf) possivelmente se tratava de cinco compostos diferentes. Em função

desse resultado estas frações foram submetidas à espectrometria de RMN de 1H e de 13C e de

massas.

IV. Experimental

25

EXTRATO CLOROFÓRMICO (SAPEC), EXTRATO ACETATO-ETÍLICO

(SAPEAE) E EXTRATO ETANÓLICO (SAPEE)

Comparativamente aos extratos hexânicos e ao etanólico, os extratos clorofórmico e

acetato-etílico foram obtidos em quantidades menores, o que, limitou os estudos destes

extratos. Além disso, a análise por CCD de SAPEC, SAPEAE e SAPEE mostrou que se

tratavam de misturas complexas, contendo substâncias que apresentam valores de Rf muito

próximos. Estes extratos continuaram sendo submetidos a processos de fracionamento na

tentativa de isolamento de frações com grau de pureza adequado, porém não foram obtidos

resultados satisfatórios.

IV. Resultados e Discussão

26

IV. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Determinação estrutural de constituintes isolados de sâmaras de Austroplenckia populnea

Através de métodos cromatográficos aplicados às frações obtidas de extratos de

sâmaras de Austroplenckia populnea, foi possível efetuar a identificação de três compostos.

Da fração TC6 obtida do fracionamento de SAPEH-O 55 foi identificado o flavonóide

3,5,7,4’-tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilflavanona. As frações CM16, CM17 e CM18 obtidas

de SAPEH-O 59 foram caracterizadas como sendo, CM16 e CM17 uma amida de cadeia

longa, a undecanamida e CM18 um sesquiterpeno da classe dos agarofuranos, posteriormente

identificado como o 4-hidroxi-1,6,15-tri-acetiloxi-9,10-di-benzoiloxi-agarofurano.

As estruturas químicas destas substâncias foram identificadas através da análise dos

dados obtidos de espectros de RMN 1H e 13C e por espectrometria de massas. A comparação

dos registros disponíveis na literatura para as substâncias identificadas neste estudo foram

fundamentais para estabelecer as respectivas estruturas químicas.

TC6: 3,5,7,4’-Tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilflavanona.

Figura IV. 3.1. Estrutura química de TC6

(3,5,7,4´-tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilflavanona).

TC6 (Figura IV.3.1.) foi isolado através de cromatografia em camada delgada

preparativa (CCDP) da fração 55 de SAPEH-O utilizando-se como eluente a mistura de

hexano, clorofórmio e acetato de etila na proporção de 3,5: 5,0: 1,5; sob a forma de um

OHO

CH3O OH

OH

OH O

2

35

7 91´

4´1´´

3´´


27

material sólido, amorfo e com faixa de fusão de 85-88 ºC. Uma única mancha foi observada

quando este material foi analisado por CCD, mesmo utilizando eluentes de diferentes

polaridades. Em função deste resultado TC6 foi submetido à espectrometria de RMN de 1H e

de 13C.

Através da análise do espectro de RMN de 13C (Figura IV. 3.2.) e do sub-espectro

DEPT-135 (Figura IV. 3.3.) de TC6 constatou-se a presença de três sinais de grupos metila

(um oximetílico), um metilênico, sete metínicos e dez sinais correspondentes a carbono não

hidrogenado. O sinal em C 195,91 foi atribuído a uma carbonila de cetona e os sinais em C

126,94 e em C 130,09 foram atribuídos a uma dupla ligação. No espectro de RMN de 1H

(Figura IV. 3.4.) foram identificados os sinais de hidrogênios aromáticos na região entre H

6,00 e H 8,00, sinal em torno de H 3,97 que foi atribuído a grupo hidroxila ligado a CH (C

73,34).


28

Figura IV. 3.2. Espectro de RMN de 13C obtido para TC6 (CDCl3, 50 MHz).


29

Figura IV. 3.3. Sub-espectro DEPT-135 obtido para TC6 (CDCl3, 50 MHz).


30

Figura IV. 3.4. Espectro de RMN de 1H obtido para TC6 (CDCl3, 200 MHz).

Por meio de pesquisa de dados na literatura disponível e utilizando o programa

SciFinder Scholar, foi observada uma similaridade entre os dados de RMN de TC6 com os da


31

3,5,7,2’-tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilflavananona isolada de Dioclea grandiflora (Lemos et

al., 2002). A análise comparativa dos dados desta flavanona contribuiu para o estabelecimento

da estrutura química de TC6. Os dados de RMN correspondentes aos hidrogênios e carbonos

da flavananona isolada de Dioclea grandiflora e de TC6 encontram-se listados na Tabela IV.

3.1.

Com base nos perfis espectrométricos (Figuras IV. 3.2. a Figura IV. 3.4.) e dos dados

da Tabela IV. 3.1, foi proposta para TC6 a estrutura do 3,5,7,4’-tetrahidroxi-6-metoxi-8-

prenilflavanona (C21H22O7, MM = 386) (Figura IV. 3.1.).

Através do programa SciFinder Scholar, (Acessado em 05/11/2011) não foram

encontrados dados a respeito deste composto, o que permite concluir que TC6 ou 3,5,7,4´-

tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilflavanona é uma substância ainda inédita na literatura.


32

Tabela IV. 3.1. Dados obtidos da espectrometria de RMN de 1H e 13C de TC6 (400 e

100 MHz; CDCl3, ppm)

*3,5,7,2’-Tetrahidroxi-6-metil-8-prenil flavananona (Lemos et al., 2002).

POSIÇÃO C DEPT H C

(Literatura)*

2 79,009 CH 6,99 79,2

3 73,338 CH 5,43 72,6

4 195,917 C - 199,6

5 151,609 C 11,19 (OH) 153,9

6 128,722 C - 129,9

7 156,820 C - 158,7

8 108,249 C - 108,4

9 155,597 C - 156,4

10 100,381 C - 101,4

1’ 124,109 C - 124,9

2’ 126,941 CH 7,26 157,3

3’ 130,093 CH 7,09 116,3

4’ 153,968 C - 129,9

5’ 121,469 CH 7,03 119,5

6’ 118,253 CH 7,55 129,0

1’’ 21,094 CH2 3,27 22,4

2’’ 121,301 CH 5,43 123,4

3’’ 132,548 C - 130,8

4’’ 17,763 CH3 1,66 17,7

5’’ 25,766 CH3 1,25 25,7

OCH3 61,094 CH3 3,30 60,2


33

CM16 e CM17: Undecanamida

H3C (CH2)13 CH2 CO

NH2

Figura IV. 3.5. Estrutura química da undecanamida proposta para CM16 e CM17.

As frações CM16 e CM17 foram obtidas através de cromatografia em coluna de sílica

gel da fração SAPEH-O 59, eluída de forma isocrática com mistura de clorofórmio e acetato

de etila (6:4). Em função da similaridade observada na cromatoplaca revelada com vapores de

iodo, essas frações foram reunidas e denominadas CM17. Após a evaporação do eluente

obteve-se um material pastoso e de aspecto esbranquiçado. Por apresentar um único

componente observado através de análise por CCD, esse material foi submetido à

espectrometria de RMN de 1H e de 13C incluindo experimento DEPT-135.

No espectro de RMN de 1H (Figura IV. 3.6.) o sinal em torno de H 0,80 foi atribuído

a hidrogênio de grupo metila e os sinais intensos na região de H 1,20 a H 1,90 foram

atribuídos a hidrogênios de grupos metílicos pertencentes à cadeia longa.

No espectro de RMN de 13C (Figura IV. 3.7.) foi observado uma predominância de

sinais na região entre C 10,00 a C 35,00 correspondentes a grupos metilênicos e metílicos,

confirmados através do sub-espectro DEPT-135 (Figura IV. 3.8.). O sinal C 14,75 foi

atribuído a um grupo metílico. Os sinais intensos observados na região entre C 28,16 a C

33,02 foram associados a grupos metilênicos de cadeia longa. O sinal em C 175,10 foi

atribuído a uma carbonila de amida. Baseando-se nos valores observados a partir da curva de

integração no espectro de RMN de 1H de CM17 foi feita uma correspondência entre o número

de hidrogênios e de carbonos (Tabela IV. 3.2.). Foi estabelecida a presença de 16 carbonos.

Tabela IV. 3.2. Valores observados na curva de integração no espectro de RMN de 1H de

CM17 e respectivas proporcionalidades em termos de número de hidrogênios e de carbonos

Integração 1,00 1,474 1,794 1,834 8,749 4,406 6,867 34,218 6,208

Atribuição 1H 1H 2H 2H 4H 2H 3H 16H 3H

NH2 1C 1C 2C 1C 2C 8C 1C


34

Figura IV. 3.6. Espectro de RMN de 1H obtido para CM17

(Acetona-D3, 200 MHz). Acima, expansão entre H 3,5 a H 8,5.


35

Figura IV. 3.7. Espectro RMN 13C obtido para CM17 (Acetona-D3, 50 MHz).


36

Figura IV. 3.8. Sub-espectro DEPT-135 obtido para CM17 (Acetona-D3, 50 MHz).

Com base nos dados encontrados propõe-se para esse constituinte a estrutura da amida

de cadeia longa undecanamida (Figura IV. 3.1.).


37

CM18: 4-Hidroxi-1,6,15-tri-acetiloxi-9,10-di-benzoiloxi-agarofurano.

O

O

O

OH

OO

O

O

O

O

O

1

37

89

11

12

13

14

15

Figura IV.3.9. Estrutura química proposta para CM18

(4-hidroxi-1,6,15-tri-acetiloxi-8,9-di-benzoiloxi-agarofurano).

Assim como CM16 e CM17, o composto CM18, também foi isolado a partir da

cromatografia em coluna da fração SAPEH-O 59. Após a evaporação do eluente obteve-se

uma substância sólida, amorfa, de cor esbranquiçada e que apresentou faixa de fusão de 148-

152 ºC.

No espectro de RMN de 1H (Figura IV. 3.10) foi observado um conjunto de sinais

entre H 1,26 e H 1,67 e outro entre H 2,08 e H 2,11 correspondentes a hidrogênios de

carbono alifático. Foram notados também sinais entre H 7,38 a H 7,67, e entre H 7,93 a H

8,15, correspondentes a hidrogênios ligados a carbono aromático. Simpletos foram

observados em H 1,47, H 1,52, H 2,11, H 2,08, H 2,26. Pelas respectivas curvas de

integração foi possível constatar que estes sinais correspondiam a grupos metila ligados

respectivamente a carbonos quaternários. A curva de integração do sinal de hidrogênio em H

1,56 mostrou que este correspondia a duas metilas.

Através da análise do espectro de RMN de 13C (Figuras IV. 3.11. e Figura IV. 3.12) e

do sub-espectro DEPT-135 (Figura IV. 3.13) de CM18 observou-se a presença de oito sinais

de grupos metila, sete metilênicos, onze metínicos e doze sinais correspondentes a carbono

não hidrogenado. O sinal observado em C 79,00 foi atribuído à ligação C-O. Foi identificado,

nos perfis dos espectros de RMN de 1H e de 13C de CM18, um sinal em H 4,01 atribuído a

um grupo hidroxila ligado a CH. Observou-se uma similaridade com os espectros do 4-


38

hidroxi-1,2,6,15-tetra-acetiloxi-9-benzoiloxiagarofurano ou populnano, isolado de folhas de

A. populnea (Vieira Filho, 2002).

Figura IV. 3.10. Espectro de RMN de 1H obtido para CM18 (Acetona-D3, 200 MHz).


39

Figura IV. 3.11. Espectro RMN 13C obtido para CM18 (Acetona-D3, 50 MHz).


40

Figura IV. 3.12. Ampliação do espectro RMN 13C obtido para CM18 (Acetona-D3, 50

MHz), entre C 15,00 a C 95,00 e entre C 13,00 a C 175,00.


41

Figura IV. 3.13. Sub-espectro DEPT-135 obtido para CM18 (Acetona-D3, 50 MHz).


42

Considerando o esqueleto básico dos agarofuranos e de acordo com os dados obtidos

através de RMN, principalmente de 13C, incluindo experimento DEPT-135 foi possível

estabelecer a existência de grupos substituintes, tais como hidroxila, metila, acetila e benzoíla

na estrutura química de CM18 (Figura IV. 3.14).

O

2

37

9

OH

CH3

O

O

CH3

O

O

Figura IV. 3.14. Esqueleto básico de um agarofurano e possíveis grupos substituintes

(hidroxila, metila, acetila e benzoíla) de CM18

Sesquiterpenóides agarofurânicos ocorrem sob a forma de triciclos poli-oxigenados

baseados em um esqueleto de núcleo C15 conhecido como diidroagarofurano. Este esqueleto

compreende os anéis A e B na forma de uma trans-decalina axialmente dimetilada, fundida

axialmente a um grupo (CH3)2C-O, constituindo assim o tetraidrofuranil, ou o anel C (Spivey

et al., 2002). O sistema de anéis diidroagarofurano esquematizado sob a forma plana e com

estereoquímica cadeira-cadeira indica como o anel C está encaixado na molécula (Figura IV.

3.15.). De acordo com Spivey (2002) o anel C, na face superior da molécula, corresponde à

apresentação convencional de estruturas de terpenóides e esteróides.

O

1

37

9

1112

13

AB

C

O Face

Face

Figura IV. 3.15. Estrutura básica de um diidroagarofurano.


43

Do extrato hexânico obtido de folhas de Austroplenckia populnea foi isolado o 4-

hidroxi-1,2,6,15-tetra-acetiloxi-9-benzoiloxiagarofurano (Vieira-Filho, 2002). Em função

disto, foi feito um levantamento de outros agarofuranos isolados de espécies da família

Celastraceae. Constatou-se que, Chang (2006), ao estudar a espécie Reissantia buchananii,

também da família Celastraceae, isolou agarofuranos, por ele denominados de reissantinas F-

H 1, 2 e 3 (Figura IV.3.16.). Em função da similaridade de alguns grupos substituintes

efetuou-se uma comparação dos dados de RMN publicados para os agarofuranos reissantinas

F-H 1, 2 e 3 (Chang et al., 2006), com os deslocamentos químicos de 13C observados para

CM-18 (Tabela IV. 3.3.).

OOH

OAc

OO

O

OAc

2

37

9

O

N

O

O

O

O

1

O OH

OAcOHO

AcO

O

O

2

O

N

O

O OH

O

O

O

O

N

O

O

O

O

OH

3

Figura IV. 3.16. Reissantinas F-H 1, 2 e 3 isoladas de Reissentia Buchananii

(Chang et al., 2006).


44

Tabela IV. 3.3. Comparação dos deslocamentos químicos de carbono (C) de CM18, com

dados do anel agarofurânico de Reissantinas F-H 1, 2 e 3

Carbono Número Atribuição C

CM-18

C de reissantinas isolados de Reissantia

buchananii (Chang et al., 2006) 1 2 3

1 CH 74,10 76,39 77,32 -

2 CH2 23,38 25,06 27.49 -

3 CH2

38,43 37,99 39,11 39,84

4 C 71,88 70,22 70,95 70,16

5 C 92,83 92,51 91,32 93,87

6 CH 79,00 75,11 78,54 74,87

7 CH 54,19 52,07 53,71 53,74

8 CH 74,00 75,50 68,74 70,88

9 CH 76,06 75,04 72,68 -

10 C 53,10 50,71 51,08 -

11 C 83,34 83,97 84,47 83,82

12 CH3 25,71 25,79 30,41 24,00

13 CH3 28,77 29,62 26,51 29,37

14 CH3 23,45 23,41 23,78 23,29

15 CH2 61,49 61,03 - -

Benzoila ligado ao C8

C=O 165,53 165,62 165,69 166,27

C1 (C) 131,09 128,38 128,83 129,28

C2 e C6 (CH) 129,40 129,02 129,90 130,16

C3 e C5 (CH) 129,49 128,38 128,67 128,82

C4 (CH) 134,23 133,35 133,31 133,82

Benzoila ligado ao C9

C=O 165,52

C1 130,63

C2 e C6 130,43

C3 e C5 130,63

C4 134,36

Acetila ligada ao (C6)

C=O 170,55 169,82 169,24 -

CH3 21,46 21,43 20,80 -


45

Através desta comparação e juntamente com análise feita utilizando o programa

Advanced Chemistry Development - Visionary Software for Scientists, envolvendo variação da

posição dos grupos substituintes seguida da obtenção da respectiva projeção do espectro de 13C, foi possível propor para CM18 a estrutura do 4-hidroxi-1,6,15-tri-acetiloxi-8,9-di-

benzoiloxi-agarofurano (Figura IV.3.9.).

Para confirmar esta proposta, CM18 foi analisada por cromatografia a gás, acoplada a

espectrometria de massas (CG-EM) em equipamento Agilent GC-MSD 5975. As condições

de análise foram:

T (injetor) = 240 °C

Volume injetado = 1 uL, Split 100:1

Solvent delay = 2,3 min

Pressão = 1,4 psi

Programa de T do forno: 200 °C (isoterma 1 min), 20 °C/min até 280 °C (isoterma 40

min) = 45 min de análise

Intervalo de massas = 25 a 750 u.m.a.

No cromatograma obtido para CM18 (Figura IV. 3.17) foi observado a presença de

três constituintes em maior proporção [tr = 3,83 min (11,33 %), tr = 20,38 min (23,30 %) e tr

= 39,19 min (46,02 %)] (Tabela IV. 3.4.).

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 00

2 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0 0

1 6 0 0 0 0 0

1 8 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

T im e - ->

A b u n d a n c e

T I C : C M -1 8 . D \ D A T A . M S

Figura IV. 3.17. Cromatograma de CM18, obtido por CG-EM.


46

Tabela IV. 3.4. Tempo de retenção dos constituintes de CM18 e respectivas porcentagens,

determinados através do cromatograma obtido por CG-EM

Tempo de retenção (Minutos) Área Área (%) Quantidade (%)

3,831 31455515 5,721 11,330

4,664 8310225 1,511 2,993

4,997 5384853 0,979 1,940

15,918 12586207 2,289 4,533

18,031 10677968 1,942 3,846

19,606 11274674 2,051 4,061

20,389 64715712 11,770 23,309

39,197 127791443 23,242 46,028

277639112 50,495 100,000

Para os três constituintes presentes em maior porcentagem, foi obtido o

correspondente espectro de massas (ionograma). No espectro de massas do constituinte de tr =

39,19 min., (Figura IV. 3.18 a Figura IV. 3. 20.) foi observado o pico de relação m/z = 592,

que foi associado a [M+ - ácido acético] e o pico m/z = 105, relativo a perda de C7H5O (-

CO.) e também o pico m/z = 43 correspondente a CH3C=0, que são condizentes com a

estrutura proposta para CM18.

5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 00

5 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

6 5 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 4 5 2 7 ( 3 9 . 1 5 5 m in ) : C M - 1 8 . D \ D A T A . M S1 0 5 . 0

4 3 . 01 6 4 . 0

2 4 6 . 14 8 8 . 22 0 5 . 0 5 3 0 . 23 0 6 . 1 3 9 7 . 13 5 1 . 1 5 9 2 . 24 4 6 . 2

Figura IV. 3.18. Espectro de massas do constituinte de CM18 de tr = 39,19 min.


47

5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 00

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

5 0 0 0 0

6 0 0 0 0

7 0 0 0 0

8 0 0 0 0

9 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0

1 3 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0

1 6 0 0 0 0

1 7 0 0 0 0

1 8 0 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 2 2 1 6 ( 2 0 . 3 8 5 m in ) : C M - 1 8 . D \ D A T A . M S1 0 5 . 0

5 7 . 1

1 6 4 . 0

2 0 7 . 02 4 6 . 1

4 8 8 . 1 5 3 0 . 23 0 6 . 1 3 7 7 . 0 4 2 7 . 0 5 7 2 . 2

Figura IV. 3.19. Espectro de massas do constituinte de CM18 de tr = 20,38 min.

No espectro de massas do constituinte de tr = 20,38 min. (Figura IV. 3.19.), foi

observado o pico de relação m/z = 572, que foi associado à estrutura proposta, porém há um

grupo acetiloxi na posição C-8 ou C-9 do anel agarofurano, ao invés do grupo benzoiloxi

(Figura IV. 3.20.).

OO

O

O

O

O

OH

OO

O

O

O

8

9

Figura IV. 3.20. Estrutura proposta para o constituinte de CM18, de tr = 20,38 min.,

contendo MM = 572. As posições dos grupos acetiloxi e benzoiloxi em C-8 e C-9 podem

estar invertidas.

No espectro de massas do constituinte de tr = 3,82 min., (Figura IV.3.21.) foi

observado o pico de relação m/z = 256. Para este espectro, o “software” do banco de dados

NIST MS Search 2.0 instalado no aparelho Agilent GC-MSD 5975 utilizado, indicou tratar-se

do ácido hexadecanóico, cujo espectro é bastante similar (Figura IV. 3.22.).


48

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 3200

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

m/ z-->

Abundanc e

Sc an 177 (3.824 min): CM -18.D \ D AT A.M S73.0

43.0

129.0

97.1213.1

157.1 185.1256.1

281.0 326.8

Figura IV. 3.21. Espectro de massas relativo ao constituinte de CM18, de tr = 3,82 min.

(replib) n-Hexadecanoic acid

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 3400

50

100

43

60 73

8397

115

129

143157 171 185

199

213

227 241

256

OH

O

Figura IV. 3.22. Espectro e estrutura do ácido hexadecanóico sugerida pelo banco de dados

NIST Search 2.0. aparelho Agilent GC-MSD 5975

Espectros de RMN em duas dimensões foram obtidos para CM18 e encontram-se em

anexo.

V. EFEITO DE CONSTITUINTES DE

SÂMARAS DE Austroplenckia populnea

SOBRE PROLIFERAÇÃO CELULAR

V. Introdução

50

V. 1. INTRODUÇÃO

A procura por novas opções terapêuticas para tratamento dos diferentes tipos de

câncer é um dos assuntos de maior interesse da pesquisa de produtos naturais. Com o objetivo

de se encontrar extratos vegetais e compostos purificados com atividade inibitória sobre os

tipos de câncer, vários trabalhos vêm sido desenvolvidos. A principal área de pesquisa,

conforme definido pelo número de publicações que descrevem compostos bioativos derivados

de plantas nos últimos anos, são fármacos anti-tumorais, antibióticos, compostos contra

doenças tropicais, anticoncepcionais, anti-inflamatórios, imunomoduladores protetores de rim

e medicamentos para uso psiquiátrico (Mesquita, 2009; Rates, 2001).

Diversas classes de compostos foram relatadas em estudos anteriores com apreciável

atividade anticâncer, dentre elas podemos citar terpenos (sesquiterpenos, diterpenos e

triterpenos), alcalóides, cumarinas, lignanas, flavonóides, taninos, curcuminóides e

polissacarídeos. Existem também relatos de famílias de plantas, que já tiveram seus extratos

e/ou seus compostos isolados testados com atividade anticâncer (Filho, 2008).

Maitansina, composto isolado no início de 1970 da espécie Maytenus ovatus Loes.,

mostrou ser extremamente potente como agente citotóxico em testes in vitro e trouxe

esperanças para sua utilização no tratamento do câncer. No entanto, infelizmente, sua

atividade muito promissora não se traduziu em eficácia quando feitos ensaios clínicos de fase

II em seres humanos, devido a sua toxicidade dose-limitante. Uma vez que o composto foi

eficaz em animais, a aparente toxicidade em seres humanos pode ser devido a diferenças no

metabolismo. Contudo, por causa de sua potência extremamente alta, maitansina e seus

congêneres continuam representando moléculas interesse (Cassady et al., 2004; Cragg and

Newman, 2005; Kupchan et al., 1972).

Costa et al. (2008) e González et al. (2000) também relatam atividade anticâncer de

compostos isolados de Celastráceas. Nestes estudos, pristimerina e sesquiterpenos isolados de

espécies Maytenus sp. foram testados frente a linhagens celulares cancerígenas humanas e se

mostram potentes agentes antiproliferativos.

Além de compostos isolados, extratos brutos de espécies da família Celastraceae

foram estudados. Monks et al. (2002) avaliaram a atividade de 145 extratos de plantas

brasileiras contra linhagens celulares humanas de tumor e dentre as plantas testadas, cinco

espécies são pertencentes a família Celastraceae (Maytenus boaria, Maytenus cassiniformis,

Maytenus dasyclada, Maytenus ilicifolia e Maytenus robusta). Através deste estudo, foi

verificado que três das cinco espécies do gênero Maytenus sp. testadas apresentam atividade

V. Introdução

51

citotóxica frente as linhagens celulares HT29 (adenocarcinoma de cólon humano) e NCI-

H460 (carcinoma de células pulmonares humanas) (Monks et al., 2002). Este trabalho

continua em andamento para isolar e identificar os componentes ativos dessas espécies.

Diante dos resultados promissores obtidos através de estudos de espécies da família

Celastraceae no desenvolvimento de terapêuticos para tratamento de câncer, no presente

trabalho foram avaliados extratos e constituintes isolados (proantocianidina A e 4’-O-metil-

epigalocatequina) de sâmaras de Austroplenckia populnea frente a três linhagens celulares

humanas cancerígenas (MCF7, A549, HS578T) e uma linhagem celular humana normal

(HEK293) através do ensaio de fosfatase ácida.

Proantocianidinas são compostos da classe dos flavonóides e estão presentes em

inúmeras plantas. Estes compostos são essenciais como parte da dieta humana e são

comumente encontrados em chás, vinho tinto, frutas, vegetais e sementes (Middleton and

Theoharides, 2000). Estudos mostram a grande variedade de bioatividades destes compostos

como, por exemplo: antibacteriana, antiviral, (De Bruyne T, 1999), anti-carcinogênica

(Carnésecchi S, 2002; De Bruyne T, 1999; Jang M, 1997; Ye X, 1999) antiinflamatória (Li

WG, 2000; Subarnas A, 2000) e anti-alérgica (Mao TK, 2000; Middleton E, 2000; Pearce F,

1984). Proantocianidinas foram também relatadas como redutoras da concentração de

especies reativas de oxigênio (Bagchi D, 1997), e da oxidação de lipoproteínas de baixa

densidade (Fremont L, 1999).

4’-O-metil-epigalocatequina é uma catequina polifenólica e um antioxidante natural

presente em alguns extratos de plantas. Recentes estudos revelaram que epigalocatequinas

podem atuar sinergicamente, sensibilizando células de câncer de mama para o paclitaxel in

vitro e in vivo (Jiang et al., 2010). Para a epigalocatequina metilada também foi mostrada a

propriedade de inibir tipos I e IV de alergias de forma mais eficaz que epigalocatequinas não

metiladas. No entanto, ainda se aguarda um completo entendimento dos mecanismos

envolvidos nas atividades biológicas destes compostos (LIN, 2005).

V. Experimental

52

V. 2. EXPERIMENTAL

Os experimentos descritos aqui foram conduzidos no “Genetics and Biotechnolgy Lab,

Botany & Plant Science”, “National University of Ireland” – Galway, Irlanda.

Neste trabalho foram utilizadas três linhagens de células tumorais, A549 (carcinoma

de pulmão humano), HS578T (carcinoma de mama humano), MCF7 (adenocarcinoma de

mama humano) e uma linhagem não tumoral, HEK 293 (embrionária de rim humano),

fornecidas por “American Type Culture Collection” (ATCC), EUA.

A câmara de segurança biológica (Safe fast elite - Faster) e todos os utensílios

utilizados, foram limpos com 70% de álcool etílico industrial (IMS), antes e após o uso. Todo

o trabalho com células foi realizado em ambiente estéril respeitando técnica asséptica

rigorosa.

Durante todo o período experimental as culturas de células foram mantidas em estufa

(New Brunswick Galaxy - Eppendorf) de atmosfera úmida, a 37 ºC com suplementação de

5% (v/v) de dióxido de carbono (CO2).

Utilizou-se como meio de cultura, o “Dulbecco’s Modified Eagle Medium”

(DEMEM) (Sigma), suplementado com soro fetal bovino (SFB) (Sigma) 10% v/v e

penicilina-estreptomicina (Sigma) 1% v/v, pré-aquecido a 37 ºC em banho-maria

(Fisherbrand).

Para a tripsinizaçao das células aderentes foi utilizada solução de 0.25% v/v de

tripsina contendo 0.01% de EDTA em PBS e, a seguir, meio de cultura foi utilizado para a

inativação da tripsina.

A solução de substrato para o ensaio de fosfatase ácida foi preparada a partir de 10mM

de p-nitrofenol fosfato (Sigma) em 0.1M acetato de sódio (Sigma) e 0.1% triton X-100 (BDH)

com pH 5.5.

Soluções termoestáveis e vidrarias foram esterilizadas em autoclave horizontal a 121

ºC por 20 minutos sob pressão de 1 bar (1,02 kgf/cm²). Soluções termolábeis foram filtradas

em filtros estéreis de 0,22 µm (Sigma).

Descongelamento de linhagens celulares

As linhagens celulares A549, HS578T, MCF7 e HEK 293, inicialmente armazenadas

em nitrogênio líquido, foram descongeladas em ambiente estéril através da adição de

DEMEM, suplementado com 10% v/v de SFB e 1% v/v de penicilina-estreptomicina, pré-

aquecido à 37ºC. As suspensões celulares foram transferidas para frascos de cultura onde

V. Experimental

53

tiveram os respectivos volumes de meio de cultura ajustados e foram cuidadosamente

homogeneizadas. Os frascos foram mantidos a 37 ºC até formação da monocamada celular.

Trocou-se o meio de cultura a cada 24h. As células foram sub-cultivadas quando atingiram de

60 a 80% da densidade de saturação.

Subcultura de células aderentes

As células foram observadas em microscópio de fase invertida (Olympus CKX41)

para avaliar o grau de confluência e confirmar a ausência de contaminações. Posteriormente, o

meio de cultura foi removido dos frascos de cultura e as células foram tripsinizadas. As

suspensões celulares foram centrifugadas à 1000 RPM durante 5 minutos (Centrífuga 5804

Eppendorf) e após a remoção dos respectivos sobrenadantes, as células foram re-suspensas em

meio de cultura fresco e mantidas a 37 ºC.

Contagem celular

As células foram novamente tratadas com tripsina, seguida por centrifugação e adição

de meio de cultura fresco, como feito anteriormente. A densidade celular foi então

determinada utilizando-se placas de contagem descartáveis preenchidas com o corante vital

Azul Tripan 0,4% p/v (Sigma) homogeneizado com uma alíquota da respectiva suspensão de

células. A concentração de cada suspensão celular foi acertada, e 100,0 µL das suspensões

celulares obtidas foram distribuídas em cada orifício das microplacas de cultura celular de 96

poços chegando-se então a uma concentração de 1x105 células/mL em cada orifício. As

microplacas foram incubadas por 24 horas a 37 ºC para a formação e a adesão da

monocamada celular nos poços.

Preparo das amostras

Os procedimentos utilizados para a obtenção dos extratos de sâmaras de

Austroplenckia populnea foram previamente descritos em “IV. 2.2. Obtenção dos extratos”.

Os compostos, proantocianidina A e 4’-O-metil-epigalocatequina, utilizados nos testes de

proliferação celular, foram obtidos em estudos anteriores por Vieira Filho (2002) e Silva

(1990) respectivamente.

As soluções estoque dos extratos de sâmaras de A. populnea foram preparadas a cada

experimento utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente. A seguir, estas foram

adequadamente diluídas em meio de cultura suplementado, obtendo-se como concentrações

finais a serem testadas: 125µg/mL; 250µg/mL; 500µg/mL e 1000µg/mL. Evitou-se exceder

1% (v/v) de DMSO na solução de maior concentração testada. Como controle, utilizou-se

V. Experimental

54

soluções de DMSO diluído em meio de cultura suplementado nas concentrações: 0.125%

(v/v); 0.25% (v/v); 0.5% (v/v) e 1% (v/v).

Soluções estoque de proantocianidina A e 4’-O-metil-epigalocatequina, ambos

isolados de extratos de A. populnea, foram preparadas a cada experimento utilizando meio de

cultura suplementado como solvente. Estas soluções foram adequadamente diluídas em meio

de cultura suplementado, obtendo-se as concentrações finais: 500µg/mL; 250µg/mL;

100µg/mL e 50µg/mL. Como controle foi utilizado meio de cultura suplementado.

Aos poços das microplacas contendo as células já aderidas, foram distribuídos 100µL

das soluções dos extratos e dos compostos isolados em concentrações crescentes e em

triplicatas, conforme esquema representado na Figura V. 2.1. As microplacas foram mantidas

a 37 ºC por 24 e 48 horas.

Figura V.2.1. Esquema de distribuição de extratos e compostos nas microplacas de

cultura celular de 96-poços.

Ensaio de proliferação celular – Fosfatase ácida

Após exposição das células aos compostos de investigação durante o tempo

determinado, as microplacas foram lavadas duas vezes com tampão fosfato salino (PBS) e

100 L de solução de substrato recém preparada, foram adicionados a cada poço das

microplacas; estas foram mantidas a 37 ºC por 2 horas em ausência de luz. 50 µL de

hidróxido de sódio 1.0 mol/L foram adicionados a cada poço das microplacas e, as respectivas

absorbâncias foram determinadas em leitor de microplaca (“Modulus Microplate Multimode

Reader”) a 405 nm.

V. Experimental

55

Com a média das absorbâncias determinadas para cada concentração dos extratos e

substâncias isoladas, foi possível calcular as porcentagens de proliferação celular pela

Equação V. 2.1.

% Proliferação celular = (AA x 100) / AC Eq.V.2.1.

Onde AA representa o valor médio das absorbâncias de cada diluição das amostras e,

AC o valor médio das absorbâncias apresentadas pelos respectivos controles.

Para análise estatística dos dados obtidos, utilizou-se Teste-t de Student, em níveis de

5 %, 1% e 0.1% de probabilidade, sendo indicados nos gráficos, para cada experimento como

* (p-valor < 0.05), ** (p-valor < 0.01), *** (p-valor < 0.001) respectivamente.

V. Resultados e Discussão

56

V. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O ensaio de fosfatase ácida foi utilizado para a avaliação do crescimento celular frente

aos extratos hexânico (SAPEH), clorofórmico (SAPEC), acetato etílico (SAPEAE) e

etanólico (SAPEE) de sâmaras de Austroplenckia populnea, além das substâncias

proantocianidina A e 4’-O-metil-epigalocatequina.

Fosfatases ácidas são enzimas hidrolíticas capazes de promover a desfosforilação do

substrato em pH abaixo de 7. Assim, o ensaio de fosfatase ácida consiste em um método

colorimétrico baseado na conversão do substrato p-nitrofenil fosfato (p-NPP) em p-nitrofenol,

o qual, ao final do processo, apresenta cor amarela e absorbância em 405 nm (Reação V. 3.1.).

A quantidade de p-nitrofenol produzida é proporcional ao número de células vivas presente

(Yang, et al. 1996). O

O

P

HO

OH

NO2

H2O

OH O

OH H2O

NO2 NO2

H3PO4

p-NITROFENIL FOSFATO(pNPP)

p-NITROFENOL p-NITROFENOLATO

(amarelo)

FOSFATASE ÁCIDA

Reação V. 3.1. Adaptado de http://www.gbiosciences.com/PhosphataseAssay-desc.aspx

(Acessado 16/11/2011)

Através de observação em microscópio de fase invertida, foi possível perceber que os

extratos de sâmaras de A. populnea e as substâncias isoladas não induziram mudanças

citomorfológicas nas linhagens celulares.

Nesta triagem, SAPEH mostrou-se incompatível com o ensaio de fosfatase ácida, já

que exibiu aparência incolor ao final do experimento, dificultando a leitura da sua

absorbância. Assim, deu-se seguimento aos experimentos utilizando-se os extratos SAPEC,

SAPEAE e SAPEE, e as substâncias proantocianidina A e 4’-O-metil-epigalocatequina.

A partir dos dados obtidos através da Equação V. 2.1., foram construídos gráficos de

porcentagem de proliferação celular para cada linhagem celular correspondente às respectivas

amostras (Figura V. 3.1. a Figura V. 3.5.).


57

V. 3.1. Efeito de extratos brutos de sâmaras de Austroplenckia populnea sobre

proliferação celular

Na Figura V. 3.1 está representado o efeito de SAPEC, em diferentes concentrações,

sobre as quatro linhagens celulares. Nota-se, para a linhagem celular MCF7, que a

porcentagem de proliferação celular para as concentrações 250, 500 e 1000 µg/mL após 24h é

significantemente maior que o controle. O aumento da proliferação celular é observado para

as concentrações 250 e 1000 µg/mL após 48h de tratamento.

Sob as mesmas condições experimentais, foi observado para a linhagem celular A549,

significante diminuição da proliferação celular na concentração 250 µg/mL após 24h. Após

48h de exposição à SAPEC, observou-se o aumento da proliferação celular em 125, 250 e

1000 µg/mL. Além disto, na concentração 250 µg/mL, o extrato aumentou a proliferação

celular, o que sugere o efeito da dosagem com o tempo de exposição.

Para a linhagem celular HS578T, observou-se significante diminuição da proliferação

celular para a concentração de 250 µg/mL após 24h de exposição à SAPEC. Após 48h, houve

um aumento da proliferação celular para todas as concentrações, sugerindo um efeito da

dosagem com o aumento do tempo de exposição.

HEK293, linhagem celular não cancerígena, mostrou aumento da proliferação para

125 µg/mL em 24h, o que se mostrou contrário após 48h de tratamento. O aumento da

proliferação celular também foi observado para 250, 500 e 1000 µg/mL após 24h, o que se

tornou mais evidente após 48h de exposição ao extrato acetato etílico (Figura V. 3.1.).

0

50

100

150

200

250

MCF7 A549 HS578T HEK293

Pro

life

raçã

o c

elu

lar (

%)

Linhagem celular

EXTRATO CLOROFÓRMICO - 24h

125µg/mL

250µg/mL

500µg/mL

1000µg/mL

* * **

***

*

*

*

0

50

100

150

200

250


Pro

life

raçã

o c

elu

lar (

%)

Linhagem celular

EXTRATO CLOROFÓRMICO - 48h

125µg/mL

250µg/mL

500µg/mL

1000µg/mL

***

***

** **

****

*** ***

*****

*

A B

Figura V.3.1. Porcentagem de proliferação celular referente às diferentes concentrações do

extrato clorofórmico de sâmaras de Austroplenckia populnea para cada linhagem celular

testada. A) em 24 horas de exposição ao extrato. B) em 48 horas de exposição ao extrato.


58

Na Figura V. 3.2. foram plotados os resultados obtidos para SAPEAE frente às quatro

linhagens celulares testadas. Para a linhagem celular MCF7 notou-se significante aumento da

proliferação após 24h de exposição ao extrato nas concentrações 250µg/mL, 500µg/mL e

1000µg/mL. Após 48h de tratamento, observou-se significativa mudança apenas para a

concentração 1000µg/mL, o que sugere que SAPEAE apresenta maior efeito com o aumento

do tempo de exposição das células ao mesmo.

Notou-se para A549, que SAPEAE não apresentou resultados significativos após 24h

de tratamento. Mas quando este tempo foi aumentado para 48h, todas as concentrações deste

extrato se mostraram indutoras da proliferação celular. O que indicou um maior efeito

causado pelo aumento do tempo de exposição ao extrato. As linhagens celulares HS578T e

HEK293 mostram efeito oposto, pois foi notado um significante aumento da proliferação

celular à 24h de exposição a este extrato em todas as concentrações para ambas as linhagens

celulares. Efeito ainda mais intenso foi observado após 48h (Figura V. 3.2).

0

50

100

150

200

250


Pro

life

raçã

o c

elu

lar (

%)

Linhagem celular

EXTRATO ACETATO ETÍLICO - 24h

125µg/mL

250µg/mL

500µg/mL

1000µg/mL

* **

**

** *

*

*

*

0

50

100

150

200

250


Pro

life

raçã

o c

elu

lar (

%)

Linhagem celular

EXTRATO ACETATO ETÍLICO - 48h

125µg/mL

250µg/mL

500µg/mL

1000µg/mL

*

*****

***

** **

****

***

***

**

**

**

**

*****

A B

Figura V. 3.2. Porcentagem de proliferação celular referente às diferentes concentrações do

extrato acetato etílico de sâmaras de Austroplenckia populnea para cada linhagem celular

testada. A) em 24 horas de exposição ao extrato. B) em 48 horas de exposição ao extrato.

Na Figura V.3.3. estão representados os resultados dos efeitos de SAPEE sobre as

quatro linhagens celulares testadas. Inicialmente, quando em contato com este extrato, a

linhagem celular MCF7 mostrou o aumento da proliferação em todas as concentrações

testadas. Apenas para a concentração de 1000µg/mL de SAPEE foi observado proliferação

mais intensa.


59

Não foram observados resultados significativos após 24h para a linhagem celular

A549, mas após 48h o extrato induziu a proliferação celular em todas as concentrações

testadas.

A linhagem celular HS578T sofreu indução de proliferação celular por SAPEE em

todas as concentrações após 24h de tratamento, e este efeito foi ainda mais significativo após

48h de exposição ao extrato.

Foi observado para a linhagem celular HEK293, que o extrato SAPEE aumentou seu

processo de proliferação, após 24h em todas as concentrações. Porem, após 48h de

tratamento, notou-se para as concentrações de 125µg/mL e de 500µg/mL uma diminuição da

proliferação celular quando comparada com resultados obtidos para 24h.

0

50

100

150

200

250


Pro

life

raçã

o c

elu

lar (

%)

Linhagem celular

EXTRATO ETANÓLICO - 24h

125µg/mL

250µg/mL

500µg/mL

1000µg/mL

****

***

**

****

**

*

**

***

0

50

100

150

200

250


Pro

life

raçã

o c

elu

lar (

%)

Linhagem celular

EXTRATO ETANÓLICO - 48h

125µg/mL

250µg/mL

500µg/mL

1000µg/mL

**

****

***

***

***

*****

**

*

***

***

***

****

A B

Figura V. 3.3. Porcentagem de proliferação celular referente às diferentes concentrações do

extrato etanólico de sâmaras de Austroplenckia populnea para cada linhagem celular testada.

A) em 24 horas de exposição ao extrato. B) em 48 horas de exposição ao extrato.

De um modo geral, os extratos brutos de sâmaras de A. populnea induziram a

proliferação das quatro linhagens celulares (MCF7, A549, HS578T, HEK293), sendo este

efeito intensificado após 48 horas de tratamento. Também foi observado que o aumento da

proliferação celular após o tratamento com os extratos de A. populnea exibe efeito dose-

resposta, ou seja, as maiores concentrações dos extratos provocaram níveis mais elevados de

proliferação celular.


60

V. 3.2. Efeito de constituintes isolados de Austroplenckia populnea sobre

proliferação celular

Na Figura V. 3.4. estão representadas graficamente as porcentagens de proliferação

celular de concentrações crescentes de proantocianidina A observadas para as quatro

linhagens celulares utilizadas nos experimentos.

Para a proantocianidina A não foram verificados efeitos significativos sobre a

proliferação da linhagem celular MCF7, mesmo após 48h de tratamento.

Nas concentrações 100 e 250 µg/mL foi observado para a linhagem celular A549, uma

significativa diminuição da proliferação celular após 48 horas de tratamento com

proantocianidina A. Em relação à linhagem celular HS578T, significativa diminuição da

proliferação celular foi observada ao se utilizar as concentrações 50, 100 e 250 µg/mL.

Curiosamente, este efeito não foi observado para a concentração mais alta 500 µg/mL.

Um aumento acentuado na proliferação celular foi observado para a linhagem

HEK293 após 48 horas em relação ao tempo de 24 horas, no entanto, esse aumento não foi

significativo quando comparado ao tratamento controle.

Figura V. 3.4. Porcentagem de proliferação celular referente às diferentes concentrações de

proantocianidina A para cada linhagem celular testada. A) em 24 horas de exposição ao

constituinte. B) em 48 horas de exposição ao constituinte.


61

Em relação à 4’-O-metil-epigalocatequina não se observou um impacto significativo

sobre a proliferação celular de MCF-7 após 24 e 48horas de tratamento em todas as

concentrações testadas (50, 100, 250 e 500 µg/mL) (Figura V. 3.5.). Em contraste, a linhagem

celular A549 sofreu uma diminuição significativa de sua proliferação em 24 horas, quando

tratada com 4’-O-metil-epigalocatequina nas concentrações 50 e 250 µg/mL e após 48 horas

essa queda foi exacerbada (Figura V. 3.5.).

Após 24 horas de tratamento com 4’-O-metil-epigalocatequina, a linhagem celular

HS578T também sofreu significativa diminuição em sua proliferação quando exposta a

concentração de 100 µg/mL. Novamente um decréscimo adicional significativo da

proliferação celular foi notado após 48 horas de tratamento sob as concentrações 50, 100 e

250 µg/mL.

Por outro lado, HEK293 sofreu um significativo aumento da proliferação celular sob

efeito de 4’-O-metil-epigalocatequina quando comparados os tempos de tratamento 48 horas

em relação a 24 horas, principalmente sob as concentrações 100 e 500 µg/ mL, embora estes

valores não sejam significativos comparação aos controles.

Figura V. 3.5. Porcentagem de proliferação celular referente às diferentes concentrações de

4’-O- metil-epigalocatequina para cada linhagem celular testada. A) em 24 horas de exposição

ao constituinte. B) em 48 horas de exposição ao constituinte.

Em contraste com o efeito indutor da proliferação celular causado por extratos brutos

de sâmaras de A. populnea em todas as linhagens celulares estudadas, não foi observado para

os constituintes isolados, proantocianidina A e 4’-O-metil-epigalocatequina, significativo

impacto sobre as linhagens celulares cancerígenas (MCF7, A549, HS578T), porém estes

constituintes causaram significativa diminuição da proliferação celular sobre a linhagem de


62

células normais (HEK293), efeito oposto ao dos extratos brutos. Este resultado pode ser

explicado pelas baixas concentrações de compostos ativos presentes nos extratos e também

pela possibilidade de interação entre estes compostos.

VI. ATIVIDADE ALELOPÁTICA DE

CONSTITUINTES DE SÂMARAS DE


VI. Introdução

64

VI. 1. INTRODUÇÃO

O termo alelopatia foi criado pelo pesquisador alemão Hans Molisch em 1937 e

segundo ele, “alelopatia é a capacidade das plantas superiores ou inferiores produzirem

substâncias químicas que, liberadas no ambiente de outras, influenciam de forma favorável ou

desfavorável o seu desenvolvimento”. É atualmente definida pela “International Allelopathy

Society” como processos que envolvem a produção de metabólitos secundários por plantas e

microrganismos que influenciam no crescimento e desenvolvimento de sistemas biológicos

com efeitos positivos e negativos (Mano, 2006; Trevisan, 2010).

As substâncias alelopáticas, denominadas aleloquímicos, estão presentes em todos os

tecidos das plantas, incluindo folhas, flores, frutos, raízes, rizomas, caules e sementes, porém,

a quantidade e o caminho pelos quais são emitidos diferem de espécie para espécie (Friedman,

1995; Gatti et al., 2004). Os aleloquímicos pertencem a várias classes como terpenos,

alcalóides, compostos fenólicos, esteróides, ácidos graxos de cadeia longa e lactonas

insaturadas, no entanto, as informações sobre como estas substâncias atuam nas plantas ainda

são pouco conhecidas (Einhellig, 1995). A liberação de substâncias envolvidas na alelopatia

se dá através da decomposição de folhas e outras partes da planta; exsudação de metabólitos

pelas raízes; lixiviação e volatilização. Estas substâncias atuam em diversos processos do

organismo vegetal, afetando funções como a absorção de nutrientes, a regulação do

crescimento, a fotossíntese, a respiração, a permeabilidade da membrana, a síntese protéica ou

a atividade enzimática (Belinelo, 2009; Medeiros, 1990).

A utilização de herbicidas tem se apresentado como única ferramenta no controle de

algumas espécies de plantas infestantes. O uso indiscriminado destes produtos tem despertado

uma grande preocupação por parte de diversos países devido a conseqüências ambientais e a

contaminação dos alimentos (Carvalho et al., 2002). Pesquisas recentes sugerem o uso da

alelopatia como uma alternativa no manejo de plantas daninhas. Existe um grande interesse

em reduzir invasões de plantas ditas infestantes, pois estas representam um dos principais

problemas da produção agrícola. Um manejo inadequado dessas plantas pode provocar a

perda da qualidade das lavouras e a diminuição da produtividade, em decorrência da

competição por água, luz e nutrientes, podendo ainda hospedar ou transmitir pragas e

doenças, além de dificultar a aplicação de tratos culturais e fitossanitários (Mano, 2006).

Uma das espécies que se destaca entre as plantas infestantes é picão-preto (Bidens

pilosa L.). Esta espécie é originária da América tropical, largamente dispersa em várias

regiões do mundo, ocorrendo em maior quantidade na América do Sul. No Brasil, é

VI. Introdução

65

encontrada em praticamente todo o território, com maior concentração nas áreas agrícolas da

Região Centro-Sul, onde se constitui uma das mais importantes plantas infestantes (Kissman,

1991).

Estudos de atividade alelopática têm como princípio a determinação do efeito de uma

planta doadora sobre uma planta receptora (Trevisan, 2010). Uma das principais variáveis

analisadas nos testes alelopáticos é a germinação. Os testes de germinação são simples de

serem realizados, no entanto, há uma série de cuidados que devem ser tomados para que se

possam ter respostas reproduzíveis. A temperatura, o substrato e a umidade influenciam

bastante sobre a germinação e, por isso, devem ser controlados (Mano, 2006).

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência dos extratos hexânico (SAPEH),

clorofórmico (SAPEC), acetato etílico (SAPEAE) e etanólico (SAPEE), além do constituinte

isolado, friedelina, obtidos de sâmaras de Austroplenckia populnea, na germinação de

sementes, no desenvolvimento e no crescimento de plântulas de picão-preto (Bidens pilosa L.)

em condições de laboratório.

VI. Experimental

66

VI. 2. EXPERIMENTAL

Os experimentos descritos aqui foram conduzidos no Laboratório de Análises de

Fertilizantes, Águas, Minérios, Resíduos, Solos e Plantas (LAFARSOL), Departamento de

Ciências da Saúde, Biológicas e Agronomia, Universidade Federal do Espírito Santo, São

Mateus, ES, Brasil.

VI. 2.1. Preparo das amostras

Para a avaliação da atividade alelopática de Austroplenckia populnea, foram utilizados

os extratos brutos de sâmaras (SAPEH, SAPEC, SAPEAE, SAPEE) e fridelina. Os

procedimentos utilizados para a obtenção dos extratos foram previamente descritos no

capítulo 1; já o composto fridelina, foi obtido por Vieira Filho (2002), a partir do extrato

hexânico de folhas de A. populnea.

Os extratos foram solubilizados nos solventes correspondentes e as concentrações

finais foram: 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 750 e 1000 mg/L para os extratos SAPEH, SAPEC,

SAPEAE, SAPEE e 6.25, 12.50, 25, 50, 100, 200 e 400 mg/L para fridelina.

VI. 2.2. Esterilização das sementes de picão-preto

Todas as sementes utilizadas neste experimento foram previamente esterilizadas por

imersão, durante, 10 minutos, em solução aquosa de hipoclorito de sódio 2%.

VI. 2.3. Estudo da atividade alelopática

Para a realização dos experimentos, foram utilizadas sementes de picão-preto (Bidens

pilosa L.) coletadas na fazenda experimental do Centro Universitário Norte do Espírito Santo

(CEUNES).

Os experimentos foram conduzidos de acordo com método descrito por Einhellig et al,

1983. As amostras foram embebidas em duas folhas de papel de filtro e colocadas em placas

de Petri de 10 cm de diâmetro. Este conjunto foi deixado à temperatura ambiente até completa

evaporação do solvente. Após este processo, cada placa recebeu doze sementes de picão-preto

e 3 mL de água destilada. Para experimento controle foram adicionados 3 mL de água

destilada e dez sementes de picão-preto. As placas foram incubadas a 25ºC, sob luz

fluorescente (8 x 40 W) com fotoperíodo de 12 horas, por um período de 12 dias.

VI. Experimental

67

VI. 2.4. Parâmetros analisados

Ao final do período experimental (doze dias), foram avaliados o comprimento das

plântulas (CP), o comprimento das radículas (CR), a porcentagem de germinação (%G) e o

índice de velocidade de germinação (IVG) para cada repetição dos tratamentos. O IVG foi

calculado segundo Maguire 1962, utilizando-se o número de sementes germinadas, dividido

pelo dia da germinação e somando-se até o último dia de germinação, de acordo com a

Equação 3.2.1.

Onde N1, N2, N3 e Nn representam o número de sementes germinadas até o enésimo

dia. D1, D2, D3 e Dn representam o número de dias em que a germinação das sementes foi

avaliada.

As porcentagens de inibição foram calculadas com base nos dados obtidos nos

experimentos de controle, realizados sem extratos e mantidas as outras condições descritas.

VI. 2.5. Análise estatítica

Os resultados experimentais foram submetidos à análise de variância e, as variáveis

significativas pelo teste de F foram submetidas à análise de regressão e ao teste de médias,

comparadas pelo Teste de Scott-Knott (1974). O delineamento experimental foi inteiramente

casualizado (DIC) com os tratamentos dispostos em esquema fatorial (4 X 7), sendo quatro

extratos (SAPEH, SAPEC, SAPEAE e SAPEE ) e sete concentrações (0,00; 31,25; 62,50;

125,00; 250,00; 500,00; 750,00 e 1000,00 mg/L), com cinco repetições. Os dados foram

analisados utilizando software de Sistema de Análise de Variância para Dados Balanceados

SISVAR (Ferreira, 1999).

N1/ D1 + N2/ D2+ N3/ D3+ .... + Nn/ Dn Eq. VI. 2.1

VI. Resultados e Discussão

68

VI. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

VI. 3.1. Efeito dos extratos de sâmaras de A. populnea na germinação de sementes

de Bidens pilosa L.

Porcentagem de germinação

Neste estudo foi observado que a porcentagem de germinação das sementes de picão-

preto foi reduzida em função do tratamento com extratos de sâmaras de A. populnea, sendo o

efeito fitotóxico mais acentuado para os extratos hexânico (SAPEH) e acetato-etílico

(SAPEAE) (Figura VI. 3.1). Os extratos SAPEE e SAPEC apresentaram maior porcentagem

de germinação e, portanto menor efeito inibidor sobre as sementes de picão-preto, não

havendo diferenças estatísticas entre estes extratos (Tabela VI. 3.1). Resultados similares de

redução na porcentagem de germinação também foram observados em estudos anteriores

desenvolvidos por Hoffmann et al. (2007), Azambuja et al. (2010) e Haida et al. (2010)

utilizando sementes de picão-preto.

Tabela VI. 3.1. Valores médios para porcentagem de germinação de sementes de picão-preto

em função das diferentes concentrações dos extratos de sâmaras de A. populnea

Concentração mg/L

Porcentagem de germinação SAPEAE SAPEC SAPEE SAPEH

0 81,68 Ba 88,32 Aa 90,02 Aa 83,32 Ba 31,25 80,00 Ba 86,66 Aa 88,36 Aa 73,36 Ba 62,50 70,00 Bb 83,34 Ab 85,00 Ab 71,66 Bb 125 68,32 Bb 80,00 Ab 83,36 Ab 70,00 Bb 250 66,66 Bb 76,66 Ab 81,66 Ab 66,66 Bb 500 60,00 Bc 73,34 Ac 79,98 Ac 61,68 Bc 750 58,34 Bc 70,00 Ac 78,34 Ac 51,66 Bc 1000 50,00 Bc 70,00 Ac 73,36 Ac 41,68 Bc

** Médias seguidas da mesma letra, sendo esta minúscula na coluna e maiúscula na linha,

não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% significância.

A germinação é menos sensível aos aleloquímicos que o crescimento das plântulas e

radículas, porém a sua quantificação experimental é muito mais simples, pois para cada

semente o fenômeno é discreto, germina ou não germina (Ferreira e Aquila, 2000). De acordo

com Santana et al. (2006), apesar da porcentagem final de germinação não ser

significativamente afetada pela ação de aleloquímicos, o padrão de germinação é modificado


69

por diferenças na velocidade e na sincronia de germinação das sementes expostas a tais

substâncias.

Figura VI. 3.1. Porcentagem de germinação de sementes de Bidens pilosa L., tratadas com

soluções dos extratos hexânico (SAPEH), clorofórmico (SAPEC), acetato-etílico (SAPEAE) e

etanólico (SAPEE) obtidos de sâmaras de Austroplenckia populnea (Celastraceae), nas

concentrações 0,00; 31,25; 62,50; 125,00; 250,00; 500,00; 750,00 e 1000,00 mg/L.

Índice de Velocidade de Germinação (IVG)

Na Tabela VI. 3.2. estão representadas as análises estatísticas obtidas para os índices

de velocidade de germinação (IVG) das sementes de picão-preto, sob a ação dos extratos de

sâmaras de A. populnea. Os cálculos foram feitos segundo sugerido por Maguire (1962).

Pode-se observar também, na Figura VI. 3.2., o efeito alelopático para picão-preto em

baixas concentrações dos extratos (31,25 mg/L), dos quais o hexânico (SAPEH) e acetato-

etílico (SAPEAE) inibiram a velocidade de germinação das sementes de forma mais

significativa quando comparados aos outros extratos.


70

Tabela VI. 3.2. Valores médios para o índice de velocidade de germinação (IVG) de

sementes de picão-preto em função das diferentes concentrações dos extratos de sâmaras de

A. populnea

Concentração mg/L

IVG SAPEAE SAPEC SAPEE SAPEH

0 19,78 Ba 23,26 Aa 21,88 Aa 20,70 Ba 31,25 18,46 Bb 21,24 Ab 20,56 Ab 18,88 Bb 62,50 17,14 Bb 21,30 Ab 21,32 Ab 18,06 Bb 125 15,92 Bb 19,26 Ab 19,90 Ab 17,94 Bb 250 14,40 Bc 18,32 Ac 19,68 Ac 16,70 Bc 500 13,24 Bc 17,68 Ac 18,66 Ac 15,94 Bc 750 14,10 Bd 16,04 Ad 18,74 Ad 13,12 Bd 1000 12,20 Bd 17,34 Ad 16,78 Ad 10,60 Bd



Figura IV. 3.2. Efeito dos extratos hexânico (SAPEH), clorofórmico (SAPEC), acetato-

etílico (SAPEAE) e etanólico (SAPEE) obtidos de sâmaras de Austroplenckia populnea

(Celastraceae) nas concentrações 0,00; 31,25; 62,50; 125,00; 250,00; 500,00; 750,00 e

1000,00 mg/L, sobre o índice de velocidade de germinação (IVG) de sementes de Bidens

pilosa L.


71

VI. 3.2. Efeito dos extratos de sâmaras de A. populnea no crescimento de

radículas e plântulas de Bidens pilosa L.

Comprimento das radículas

O extrato hexânico de sâmaras de A. populnea apresentou intenso efeito alelopático

sobre o comprimento das radículas das sementes de picão-preto (Bidens pilosa L.) a partir de

baixas concentrações (62,50 mg/L) pelo modelo quadrático (Figura VI. 3.3.). Observou-se

que SAPEH se comportou de forma significativamente diferente dos outros extratos e que sua

atividade é ainda maior com o aumento da sua concentração. Em relação aos extratos SAPEC

e SAPEE não foram observadas diferenças significativas quanto aos seus efeitos alelopáticos,

porém notou-se que foram significativamente diferentes de SAPEAE (Tabela VI. 3.3.).

Segundo Gussman et al. (1994) e Hoffmann et al. (2007), o alongamento da parte aérea e das

raízes é dependente de divisões celulares, formação de câmbio e de vasos xilemáticos. Essas

estruturas vegetais são dependentes da captação e partição de nutrientes pela plântula. Em

função disso, o sistema radicular das plantas é o mais sensível à ação de aleloquímicos, assim,

quanto menor o indice de velocidade de germinação (IVG), maior a dificuldade para a planta

se alongar, conforme o observado neste trabalho (Figura VI. 3.2.). Como para o picão-preto

houve redução das raízes, conclui-se que estas estruturas foram afetadas por fitoconstituintes

presentes no extrato. Os resultados encontrados corroboram com estudos anteriores de Alves

et al. (2004), em relação ao comprimento da radícula de plântulas de alface obtidas de

sementes tratadas com óleos de canela, alecrim-pimenta e capim-citronela.

Tabela VI. 3.3. Valores médios para o comprimento da radícula (mm) de picão-preto em

função das diferentes concentrações dos extratos de sâmaras de A. populnea

Concentração mg/L

Comprimento da radícula (mm) SAPEAE SAPEC SAPEE SAPEH

0 30,96 Ba 37,96 Aa 36,12 Aa 28,54 Ca 31,25 30,54 Ba 37,14 Aa 35,68 Aa 28,08 Ca 62,50 29,26 Bb 36,82 Ab 34,52 Ab 23,86 Cb 125 29,26 Bb 35,98 Ab 33,22 Ab 21,14 Cb 250 29,20 Bb 35,34 Ab 32,64 Ab 21,04 Cb 500 26,88 Bc 32,06 Ac 31,44 Ac 20,70 Cc 750 26,32 Bc 31,92 Ac 29,84 Ac 19,42 Cc 1000 25,76 Bc 30,32 Ac 29,56 Ac 18,76 Cc




72

Figura VI. 3.3. Efeito dos extratos hexânico (SAPEH), clorofórmico (SAPEC), acetato-



1000,00 mg/L, sobre o comprimento das radículas de Bidens pilosa L.

Comprimento das plântulas

Os extratos hexânico (SAPEH) e acetato-etílico (SAPEAE) de sâmaras de A. populnea

não apresentam diferenças significativas entre si quanto à atividade alelopática e mostram

redução do comprimento da parte aérea de picão-preto a partir de baixas concentrações (62,50

mg/L) (Tabela VI. 3.4.). SAPEC e SAPEE apresentam comportamento similar e também não

se diferem estatisticamente, porém apresentam menor efeito alelopático quando comparados

aos outros extratos.


73

Tabela VI. 3.4. Valores médios para o comprimento das plântulas (mm) de picão-preto em

função das diferentes concentrações dos extratos de sâmaras de A. populnea

Concentração mg/L

Comprimento da plântula (mm) SAPEAE SAPEC SAPEE SAPEH

0 50,10 Ba 65,72 Aa 63,16 Aa 58,06 Ba 31,25 44,32 Bb 63,54 Ab 61,74 Ab 41,00 Bb 62,50 40,94 Bc 62,70 Ac 60,48 Ac 37,00 Bc 125 40,80 Bc 60,82 Ac 59,08 Ac 36,64 Bc 250 39,66 Bc 60,54 Ac 58,10 Ac 36,12 Bc 500 37,56 Bc 60,76 Ac 57,28 Ac 35,56 Bc 750 37,44 Bc 58,54 Ac 56,92 Ac 35,22 Bc 1000 36,02 Bd 50,54 Ad 48,66 Ad 33,22 Bd



Figura VI. 3.4. Efeito dos extratos hexânico (SAPEH), clorofórmico (SAPEC), acetato-



1000,00 mg/L, sobre o comprimento de plântulas de Bidens pilosa L.


74

Através da análise de variância dos dados experimentais foi possível notar que houve

diferença significativa entre as amostras (extratos das sâmaras de A. populnea) e entre as

concentrações utilizadas, ou seja, existe no mínimo, diferença entre duas amostras e também

existe no mínimo diferença entre duas concentrações. Porém, pôde-se observar que não

existiu uma interação dupla entre Amostra X Concentração em nenhuma das variáveis

respostas avaliadas (comprimento da radícula, comprimento da plântula, índice de velocidade

de germinação e porcentagem de germinação), pois estas não apresentaram diferença

significativa quanto à interação dos fatores, o que é demonstrado através dos gráficos (Figuras

VI. 3.1. a Figura VI. 3.4.) onde é observada uma similaridade em termos de tendência, e

tabelas (Tabela VI. 3.1 a Tabela VI. 3.4) em que os diferentes extratos e as diferentes

concentrações mantêm as mesmas letras.

A pesquisa de produtos naturais, por meio de métodos de extração, isolamento,

purificação e identificação, têm contribuído para um conhecimento mais apurado de inúmeros

compostos secundários, que podem atuar como potentes aleloquímicos (Ferreira e Aquila,

2000). O presente trabalho corrobora com a importância da pesquisa destas plantas, para se

investigar seus efeitos alelopáticos e abrir perspectivas para a produção de substâncias

naturais que possam ser utilizadas no controle de plantas daninhas.

VI. 3.3. Efeito de fridelina na germinação de sementes e no crescimento de

radículas e plântulas de Bidens pilosa L.

Waller (1999) apontam triterpenos e triterpenóides como um dos principais grupos de

compostos secundários com atividade alelopática. A fridelina (Figura VI. 3.5), composto

pertencente a esta classe, foi relatada por Santos et al. (2008) como sendo um potente

aleloquímico quando utilizado juntamente com epifridelinol contra as plantas daninhas

malícia (Mimosa pudica) e mata-pasto (Senna obtusifolia). A importância de se estudar este

efeito reside no fato do desenvolvimento de resistência ou tolerância aos metabólitos

secundários que funcionam como aleloquímicos ser mais ou menos específica, e à existência

de espécies mais sensíveis que outras (Ferreira e Aquila, 2000).


75

1

3

6

10

12

15

19

22

28

O

29

Figura VI. 3.5. Estrutura molecular de fridelina.

Na Tabela VI. 3.5. estão representados os valores médios obtidos para os parâmetros

avaliados em relação à alelopatia de fridelina em sementes de Bidens pilosa L.. Notou-se que

fridelina reduz a porcentagem germinação das sementes de picão-preto mesmo quando em

baixas concentrações (12,50 mg/L) e este efeito também foi verificado para o índice de

velocidade de germinação (25 mg/L).

Quanto ao desenvolvimento das sementes, observou-se que as plântulas e radículas

tiveram comportamento similar (Figura VI. 3.6.), porém quando comparadas ao controle, as

plântulas apresentaram diferenças significativas apenas sob concentrações elevadas (a partir

de 50 mg/L), já as radículas não sofreram diferenças significativas, o que se deve a alta

sensibilidade deste parâmetro (Tabela VI. 3.5).

Tabela VI. 3.5. Valores médios obtidos para porcentagem de germinação (%G), índice de

velocidade de germinação (IVG), comprimento das radículas (CR) comprimento das plântulas

(CP) de picão-preto em função das diferentes concentrações de fridelina

Concentração mg/L

Parâmetro avaliado %G IVG CR CP

0 85,00 A 17,00 A 45,60 A 44,14 A 6,25 76,66 A 17,04 A 44,32 A 42,10 A 12,50 58,34 B 15,62 A 41,90 A 42,10 A

25 58,32 B 11,60 B 38,96 A 39,76 A 50 58,34 B 15,62 A 38,92 A 35,50 B 100 56,64 B 12,02 B 33,86 A 33,00 B 200 53,34 B 12,42 B 33,70 A 31,96 B 400 41,66 B 9,90 B 33,02 A 31,54 B

* Médias seguidas da mesma letra, sendo esta maiúscula na mesma coluna, não diferem

entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% significância.


76

Figura VI. 3.5. Efeito de fridelina nas concentrações 0,00; 6,25; 12,50; 25,00; 50,00; 100,00;

200,00 e 400,00 mg/L, sobre o comprimento de radículas (CR), comprimento de plântulas

(CP), porcentagem de germinação (%G) e índice de velocidade de germinação (IVG) de

Bidens pilosa L.

Através da análise dos dados revelados neste trabalho, foi possível concluir que

fridelina apresentou atividade inibitória da germinação de sementes de picão-preto, porém

este efeito não foi tão significativo sobre o desenvolvimento das sementes.

É importante salientar que o estudo sobre a atividade dos aleloquímicos sobre a

germinação e/ou desenvolvimento da planta é somente uma sinalização secundária de efeitos

ocorridos a nível molecular e celular inicialmente. Há ainda relativamente poucas

informações sobre os mecanismos de ação dos aleloquímicos (Ferreira e Aquila, 2000).

VII. CONCLUSÃO

VII. Conclusão

78

VII. CONCLUSÃO

O estudo fitoquímico das sâmaras de Austroplenckia populnea Reiss., gerou

resultados satisfatórios em relação aos compostos isolados e no fornecimento de dados

analíticos de relevância para um melhor entendimento e avaliação do potencial químico-

farmacológico dessa planta. A partir do extrato hexânico, foram isoladas três substâncias de

grupos fitoquímicos distintos, as quais duas tiveram suas estruturas totalmente elucidadas e

uma foi identificada por análise dos dados espectrométricos. Na relação destas substâncias

consta do flavonóide 3,5,7,4’-tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilflavanona; a amida undecanamida

e o sesquiterpeno 4-hidroxi-1,6,15-tri-acetiloxi-8,9-di-benzoiloxi-agarofurano. Até o

momento não foram encontrados relatos na literatura a respeito dos compostos 3,5,7,4’-

tetrahidroxi-6-metoxi-8-prenilflavanona e de 4-hidroxi-1,6,15-tri-acetiloxi-8,9-di-benzoiloxi-

agarofurano, o que permite supor tratarem-se de substâncias inéditas. Do ponto de vista

químico apenas parte da fração hexânica foi estudada, sendo interessante a continuidade do

estudo desta fração além das frações clorofórmica, acetato-etílica e etanólica.

Extratos de sâmaras de A. populnea (SAPEC, SAPEAE, SAPEE) induziram a

proliferação celular das quatro linhagens testadas (MCF7, A549, HS578T, HEK293), sendo

este efeito intensificado após 48 horas de tratamento e com o aumento das concentrações

destes extratos. Proantocianidina A e 4’-O-metil-epigalocatequina, não apresentaram

significativo impacto sobre as linhagens celulares cancerígenas (MCF7, A549, HS578T),

porém estes constituintes causaram diminuição da proliferação celular sobre a linhagem de

células normais (HEK293). Devido aos resultados encontrados no ensaio de proliferação

celular, faz-se necessária uma investigação mais aprofundada dos fitocomponentes bioativos

presentes nos extratos de sâmaras de A. populnea, pois, visto que folhas e raízes desta planta

são consumidas sob a forma de decocção para o tratamento de doenças como disenterias e

reumatismo, há a necessidade de estudos sobre a segurança do uso desta planta na medicina

popular.

Quanto aos testes de atividade alelopática, os extratos de sâmaras de A. populnea

(SAPEH, SAPEC, SAPEAE e SAPEE) mostraram resultados positivos, atuando tanto na

inibição da germinação de sementes de picão-preto quanto no desenvolvimento da planta.

Fridelina apresentou efeito alelopático sobre a germinação das sementes em baixas

concentrações (12,50 mg/L), porém não foi tão eficaz quanto à inibição do crescimento de

picão-preto. Através destes resultados concluiu-se que constituintes de A. populnea podem ser

VII. Conclusão

79

uma alternativa de manejo e controle de Bidens pilosa L. visando a redução do uso de

herbicidas.

Considerando os resultados obtidos neste trabalho, permite-se concluir que a

continuidade do estudo de Austroplenckia populnea é promissor. Com a perspectiva de

isolamento de novos compostos químicos de interesse, e continuidade do estudo

quimiotaxonômico desta planta, será possível que outros metabólitos sejam encontrados em

estudos futuros e outras atividades biológicas sejam descobertas, aumentando assim a

contribuição para o estudo da flora brasileira.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referências Bibliográficas

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alves, M. d. C. S., Filho, S. M., Innecco, R., Torres, S. B., 2004. Alelopatia de extratos

voláteis na germinação de sementes e no comprimento da raiz de alface. Pesquisa Agropecuária Brasileira 39, 1083-1086.

Andrade, S. F., Cardoso, L. G., Carvalho, J. C., Bastos, J. K., 2007. Anti-inflammatory and antinociceptive activities of extract, fractions and populnoic acid from bark wood of Austroplenckia populnea. J Ethnopharmacol 109, 464-471.

Azambuja, N., Hoffmann, C. E. F., Neves, L. A. S. d., Goulart, E. P. L., 2010. Potencial alelopático de Plectranthus barbatus Andrews na germinação de sementes de Lactuca sativa L. e de Bidens pilosa L. Revista de Ciências Agroveterinárias, 9, 66-73.

Bagchi D, G. A., Krohn R. L., Bagchi M, Tran M. X., Stohs S. J., 1997. Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E, and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro. . Res Commun Mol Pathol Pharmacol 95, 179-189.

Belinelo, V. J., Vieira Filho, S. A., Almeida, M. S., Ferreira-Alves, D. L., Piló-Veloso, D., 2009. Potencial fitotóxico de Pterodon polygalaeflorus BENTH (LEGUMINOSAE) sobre Acanthospermum australe (LOEFL.) O. KUNTZE e Senna occidentalis (L.) LINK. Revista Caatinga 22, 108-115.

Brandão, M. G. L., 2003. Plantas Medicinais & Fitoterapia. Editora: O Lutador, Belo Horizonte-MG.

Brüning, R., Hilderbert, W., 1978. Übersicht Über Die Celastraceen-Inhaltsstffe: Chimie, Chemotaxonomie, Biosynthese, Pharmakologie. Phytochemistry 17, 1821-1858.

Calixto, J. B., Yunes, R. A., 2001. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna, 1a ed. Argos Editora Universitária, UNOESC, Chapecó -SC.

Carnésecchi S, S.Y., Lazarus AS, Coehlo D, Gossé F, Raul F, 2002. Flavanols and procyanidins of cocoa and chocolate inhibit growth and polyamine biosynthesis of human colonic cancer cells. . Cancer Lett 175, 147-155.

Carvalho, G. J., Fontanetti, A., Cançado, C. T., 2002. Potencial alelopático do feijão de porco (Canavalia ensiformes) e da mucuna preta (Stilozobium aterrimum) no controle da tiririca (Cypeurs rotundus). Ciência Agrotécnica 26, 647-651.

Cassady, J.M., Chan, K.K., Floss, H.G., Leistner, E., 2004. Recent developments in the maytansinoid antitumor agents. Chem Pharm Bull (Tokyo) 52, 1-26.

Chang, F.-R., Cheng, I., Liao, S.-C., Issa, H.H., Hayashi, K.-I., Nosako, K., Wu, Y.-C., Lee, K.-H., 2006. Planta Medica. 72, 92-96.


Copping, L. G., Duke, S. O., 2007. Natural products that have been used commercially as crop protection agents. Pest Management Science 63, 524-554.

Costa, P.M., Ferreira, P.M., Bolzani Vda, S., Furlan, M., de Freitas Formenton Macedo Dos Santos, V.A., Corsino, J., de Moraes, M.O., Costa-Lotufo, L.V., Montenegro, R.C., Pessoa, C., 2008. Antiproliferative activity of pristimerin isolated from Maytenus ilicifolia (Celastraceae) in human HL-60 cells. Toxicol in Vitro 22, 854-863.

Cragg, G.M., Newman, D.J., 2005. Plants as a source of anti-cancer agents. J Ethnopharmacol 100, 72-79.

CRIA - Centro de Referência em Informação Ambiental, 2005. http://florabrasiliensis.cria.org.br/index.

Cronquist, A., 1988. The Evolution and Classification of Flowering Plants, 2a ed. The New York Botanical Garden. Allen Press Inc. USA., New York.

Da Silva, M.G., 1990. Análise da Constituição Química de Raiz e Folhas de Maytenus myrsinoides, Departamento de Química. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.

De Bruyne T, P.L., Witvrouw M, De Clercq E, Vanden Berghe D, Vlietinck AJ., 1999. Biological evaluation of proanthocyanidin dimers and related polyphenols. J Nat Prod 62, 954-958.

de Sousa, J. R., Silva, G. D., Miyakoshi, T., Chen, C. L., 2006. Constituents of the root wood of Austroplenckia populnea var. ovata. J Nat Prod 69, 1225-1227.

Di Stasi, L. C., 1995. Plantas Medicinais: Arte e Ciência. Editora da Universidade Estadual Paulista, São Paulo - SP.

Duarte, L. P., 2000. Estudo Químico, estrutural e da atividade antibacteriana de triterpenos pentacíclicos isolados dos galhos e raízes de Austroplenkia populnea, Departamento de Química. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.

Duarte, L. P., Miranda, R. R. S. d., Rodrigues, S. B. V., Silva, G. D. F., Vieira Filho, S. A., Knupp, V. F., 2009. Stereochemistry of 16a-Hydroxyfriedelin and 3-Oxo-16-methylfriedel-16-ene Established by 2D NMR Spectroscopy. Molecules 14, 598-607.

Duarte, L.P., Vieira-Filho, S.A., Silva, G.D.d.F., Sousa, J.R.d., Pinto, A.d.S., 2002. Anti-trypanossomal activity of pentacyclic triterpenes isolated from Austroplenckia populnea (Celastraceae). Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo 44, 109-112.

Einhellig, F. A., 1995. Plant x plant allelopathy: biosynthesis and mechanism of action. In: Congresso Brasileiro de Fisiologia Vegetal. Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG, 59-74.


Einhellig, F. A., Schan, M. K., Rasmunsem, J. A., 1983. Synergistic effects of four cinnamic acid compounds again sorghum. Plant Growth Regulators, 251-257.

Elisabetsky, E., Shanley, P., 1994. Ethnopharmacology in the Brazilian Amazon. Pharmacology & Therapeutics 64, 201-214.

Engler, A., 1964. Syllabes der Pflanzenfamilien, 12a ed. Gerbruder Borntraeger (Ed.), Berlim.

Ferreira, A. G., Aquila, M. E. A., 2000. Alelopatia: Uma área emergente da ecofisiologia. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal 12, 175-204.

Ferreira, D. F., 1999. Sistema Para Análise de Variância Para Dados Balanceados (SISVAR). Universidade Federal de Lavras. Lavras-MG.

Ferry, S., Baltassat-Millet, F., 1977. La prospection des plantes medicinales. Lyon Pharmaceutique 28, 257-260.

Filho, J. d. M., 2008. Pesquisa de atividade antitumoral e mutagênica in vitro de produtos naturais Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara - SP.

Fremont L, B. L., Delpal S., 1999. Antioxidant activity of resveratrol and alcohol-free wine polyphenols related to LDL oxidation and polyunsaturated fatty acids. Life Sci 64, 2511-2521.

Friedman, J., 1995. Allelopathy, autotoxicity, and germination. In: Kegel, J.e.G., G. (Ed.), Seed development and germination. Marcel Dekker Inc., New York, 629-644.

Gatti, A. B., Perez, S. C. J. G. A., Lima, M. I. S., 2004. Atividade alelopática de extratos aquosos de Aristolochia esperanzae O. Kuntze na germinação e no crescimento de Lactuca sativa L. e Raphanus sativus L. Acta Botanica Brasílica 18, 459 - 472.

González, A.G., Tincusi, B.M., Bazzocchi, I.L., Tokuda, H., Nishino, H., Konoshima, T., Jiménez, I.A., Ravelo, A.G., 2000. Anti-tumor promoting effects of sesquiterpenes from Maytenus cuzcoina (Celastraceae). Bioorganic & Medicinal Chemistry 8, 1773-1778.

Gussman, A.B., Pitelli, R.A., Dias, S.M., 1994. Efeito do citronelol sobre a germinação e desenvolvimento do amendoim bravo (Euphorbia heterophila L.) II. Semina: Ciências Agrícola 15, 14-22.

Haida, K.S., Coelho, S.R.M., Haas-Costa, J., Viecelli, C.A., Alekcevetch, J.C., Barth, E.F., 2010. Efeito alelopático de Achillea millefolium L. sobre sementes de Lactuca sativa L. Revista em Agronegócios e Meio Ambiente 3, 101-109.

Hamburger, M., Hostettmann, K., 1991. Bioactivity in plants: the link between phytochemistry and medicine. Phytochemistry 30, 3864-3874.


Henriques, R. P. B., 2008. A viagem que revelou a biodiversidade do Brasil ao mundo, Ciência Hoje, 252 ed, http://cienciahoje.uol.com.br/banco-de-imagens/lg/protected/ch/252/vonmartius252.pdf/view.

Hoffmann, C. E. F., Neves, L. A. S. d., Barros, C. F., Wallau, G. d. L., 2007. Atividade alelopática de Nerium Oleander L. e Dieffenbachia picta schott em sementes de Lactuca Sativa L. e Bidens pilosa L. Revista de Ciências Agroveterinárias, 6, 11-21.

Jang M, C. L., Udeani G. O., Slowing K. V., Thomas C. F., Beecher C. W., Fong H. H., Farnsworth N. R., Hinghorn A. D., Mehta R. G., Moon R. C, Pezzuto J. M., 1997. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes. Science 275, 218-220.

Jeller, A. H., Silva, D. H. S., Lião, L. M., Bolzani, V. S., Furlan, M., 2004. Antioxidant phenolic and quinonemethide triterpenes from Cheiloclinium cognatum. Phytochemistry 65, 1977-1982.

Jiang, Y.F., Luo, T., Wang, J., Yin, Y.C., Hua, H., Jing, J., Sun, X.M., Li, M.J., Zhang, Y., 2010. (-)-Epigallocatechin gallate sensitizes breast cancer cells to paclitaxel in a murine model of breast carcinoma. Breast Cancer Res 12.

Kissman, K. G., 1991. Plantas infestantes e nocivas. BASF: Brasileira, São Paulo.

Kupchan, S. M., Komoda, Y., Court, W. A., Thomas, G. J., Smith, R. M., Karim, A., Gilmore, C. J., Haltiwanger, R. C., Bryan, R. F., 1972. Maytansine, a novel antileukemic ansa macrolide from Maytenus ovatus. J Am Chem Soc 94, 1354-1356.

Lawrence, G. H. M., 1971. Taxonomy of vascular plants. The MacMillan Company, New York.

Lemos, V. S., Santos, M. H. d., Rabelo, L. A., Côrtes, S. F., 2002. Total assignments of 1H and 13C NMR spectra of a new prenylated flavanone from Dioclea grandiflora. Magnetic Resonance in Chemistry 40, 793-794.

Li WG, Z.X., Wu YJ, Tian X., 2000. Anti-inflammatory effect and mechanism of proanthocyanidins from grape seeds. Acta Pharmacol Sin 22, 1117-1120.

Lin, F.-L.C.A.J.-K., 2005. HPLC Analysis of naturally occurring methylated catechins, 3¢¢- and 4¢¢-methyl-epigallocatechin gallate, in various fresh tea leaves and commercial teas and their potent inhibitory effects on inducible nitric oxide synthase in macrophages. j. agric. food chem 53, 7035-7042.

Lorenzi, H., 1992. Árvores Brasileiras – Manual de identificação e Cultivo de Plantas Arbóreas Nativas do Brasil. Editora Plantarum Ltda.

Maguire, J.D., 1962. Speed of germination-aid in selection evaluation for seedling emergence and vigour. Crop Science 2, 176-177.


Mano, A. R. d. O., 2006. Efeito alelopático do extrato aquoso de sementes de cumaru (Amburana cearensis S.) sobre a germinação de sementes, desenvolvimento e crescimento de plântulas de alface, picão-preto e carrapicho. Universidade Federal do Ceará, Fortaleza- CE.

Mao TK, P.J., Van De Water, Keenz CL, Schmitz HH, Hammerstone JF, Gershwin ME., 2000. The effect of cocoa procyanidins on the transcription and secretion of interleukin1 beta in peripheral blood mononuclear cell. . Life Sci 66, 1377-1386.

Marine-Bettòlo, G. B., 1974. La Chimie des Principes Actifes de Celastraceae-Hippocrateaceae. Il Farmaco 29, 531-533.

Martius, C. F. P. v., Eichler, A. W., Urban, I., 1865. Flora Brasiliensis. Enumeratiom Plantarum in Brasília, Alemanha.

Mazaro, R., Di Stasi, L., De Grava Kempinas, W., 2002. Effects of the hydromethanolic extract of Austroplenckia populnea (Celastraceae) on reproductive parameters of male rats. Contraception 66, 205-209.

Mazaro, R., Di Stasi, L.C., Vieira Filho, S.A., De Grava Kempinas, W., 2000. Decrease in sperm number after treatment of rats with Austroplenckia populnea. Contraception 62, 45-50.

Medeiros, A. R. M., 1990. Alelopatia – importância e suas aplicações. Horti sul.

Meléndez-Salazar, G. D. C., 2005. Maytenus truncata Reissek: Estudo fitoquímico, análises histológica e da capacidade sortiva de folhas e avaliação de atividade biológica de extratos, Departamento de Química. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.

Mesquita, M. L. d., 2009. Potencial antitumoral de substâncias isoladas de plantas do Cerrado brasileiro: estudos preliminares do mecanismo de ação da atividade citotóxica, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas. Universidade de Brasília, Brasília - DF.

Middleton E, K.C., Theoharides TC, 2000. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: Implications for inflammation, heart disease, and cancer. . Pharmacol Rev 52, 673-751.

Miranda, R. R. S. d., Duarte, L. P., Silva, G. D. d. F., Vieira Filho, S. A., Carvalho, P. B. d., Messas, A. C., 2009. Evaluation of antibacterial activity of “Mangabarana” Austroplenckia populnea Reissek (Celastraceae). Revista Brasileira de Farmacognosia 19, 370-375.

Monache, F. D., 1972. Populnonic acid, a new triterpenic acid with friedelane carbon skeleton. Gazz Chim Italian 102, 636-646.


Monks, N.R., Bordignon, S.A.L., Ferraz, A., Machado, K.R., Faria, D.H., Lopes, R.M., Mondin, C.A., Souza, I.C.C.d., Lima, M.F.S., Rocha, A.B.d., Schwartsmann, G., 2002. Anti-tumour Screening of Brazilian Plants. Pharmaceutical Biology 40, 603-616.

Oliveira, D. M., Silva, G. D. F., Duarte, L. P., Vieira Filho, S. A., 2006. Chemical constituents isolated from roots of Maytenus acantophylla Reissek (Celastraceae). Biochemical Sistematics and Ecology 34, 661-665.

Oliveira, M. L. G., 2007. Estudo fitoquímico de folhas de Maytenus gonoclada Martius (Celastraceae) e obtenção de derivados nitrogenados da friedelina, Departamento de Química. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.

Paes, H. C. S., 1993. Triterpenos Pentacíclicos e Triterpenolactonas isolados de Cerne de Austroplenckia populnea. Departamento de Química. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte - MG.

Pearce F, B. A., Bienenstock J., 1984. Mucosal mast cells, effects of quercetin and other flavonoids on antigen-induced histamine secretion from rat intestinal mast cells. . J Allergy Clin Immunol 73, 819-823

Pinheiro, J. A., 1980. Análise da Constituição Química da Madeira de Maytenus guianenses Klotzch. Departamento de Química. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte-MG.

Pugliesi, G. d. C., Andrade, S. F. d., Bastos, J. K., Maistro, E. L., 2007. In vivo clastogenicity assessment of the Austroplenckia populnea (Celastraceae) leaves extract using micronucleus and chromosome aberration assay. Cytologia 72, 1-6.

Rates, S. M. K., 2001. Plants as source of drugs. Toxicon 39, 603-613.

Santana, D. G., Ranal , M. A., Mustafa, P. C. V., Silva, R. M. G., 2006. Germination meansurements to evaluate allelopathic interactions. Allelopathy Journal 17, 43-52.

Seito, L. N., Mazaro, R., Di Stasi, L. C., 2002. Antiulcerogenic and analgesic effects of the Austroplenckia populnea extracts in mice. Phytother Res 16, 193-196.

Silva, G. D. F., 1990. Constituintes químicos de Austroplenckia populnea: estrutura molecular e de cristal e ensaios farmacológicos, Departamento de Química. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.

Simões, C. M. d. O., Schenkel, E. P., Gosmann, G., Mello, J. C. P. d., Mentz, L. A., Petrovick, P. R., 2004. Farmacognosia: da planta ao medicamento, 5a ed. Editora UFRGS/Editora UFSC, Porto Alegre/ Florianópolis-SC.

Soejarto, D. D., 1996. Biodiversity prospecting and benefit-sharing: perspectives from the field. Journal of Ethnopharmacology 51, 1-16.


Spivey, A.C., Weston, M., Woodhead, S., 2002. Celastraceae sesquiterpenoids: biological activity and synthesis. Chem Soc Rev 31, 43-59.

Subarnas A, W.H., 2000. Analgesic and anti-inflammatory activity of the proanthocyanidin shellegueain A from Polypodium feei METT. Phytomedicine 7, 401-405

Subhadhirasakul, S., Keawpradub, N., Promwong, C., Yuenyongsawad, S., 2008. Free radical scavenging and cytoprotective activity of Salacia euphlebia Merr. Natural Product Communications 3, 211-214.

Tantry, M. A., 2009. Plant natural products and drugs: a comprehensive study. Asian Journal of Traditional Medicines 4, 241-249.

Trevisan, R. R., 2010. Estudo fitoquímico e avaliação das atividades biológicas das cascas de Celtis iguanaea (Jacq.) Sargent ULMACEAE. Universidade Federal do Paraná, Curitiba-PR.

Verpoorte, R., 1989. Some phytochemical aspects of medicinal plant research. Journal of Ethnopharmacology 25, 43-59.

Viegas Jr, C., Bolzani, V. d. S., Barreiro, E. J., 2006. Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Química Nova 29, 326-337.

Vieira Filho, S. A., 2002. Estudo fitoquímico em folhas e sâmaras de Austroplenckia populnea, avaliação da atividade antiespermatogênica do extrato hexânico das folhas e estudo fotoquímico em triterpenos pentacíclicos. Departamento de Química. Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte - MG.

Vieira Filho, S. A., Duarte, L. P., Silva, G. D. F., Mazaro, R., Di Stasi, L. C., 2002. Constituintes químicos e atividade antiespermatogênica em folhas de Austroplenckia populnea (Celastraceae). . Revista Brasileira de Farmacognosia 12, 123-124.

Vieira Filho, S.A., Duarte, L.P., Paes, H.C.S., G.D.F., S., Sousa, J.R., Lanna, M.C.S., 1999. Antibacterial activity of pentacyclic triterpenes from Austroplenckia populnea. Acta Horticulturae 501, 199-203.

Vieira-Filho, S. A., Duarte, L. P., Silva, G. D. F., Lula, I. S., Santos, M. H. d., 2001. Total assignment of 1H and 13C NMR spectra of two 3,4-secofriedelanes from Austroplenckia populnea. Magnetic ressonance in chemistry 39, 746-748.

Waller, G. R., 1999. Recent advances in allelopathy, Cadiz.

Williamson, E., Okpako, D.T., Evans, F.J., 1996. Selection, Preparation and Pharmacological Evaluation of Plant Material. Wiley, Chichester.

www.gbiosciences.com/PhosphataseAssay-desc.aspx (acessado em 18/05/2011)


www.plantsystematics.org/imgs/shimizu/r/ Celastraceae_Plenckia_populnea_39901.html (acessado em 19/02/2011)

Yang, Te-tuan, Sinai, P., Kain, S. R., 1996. An acid phosphatase assay for quantifying the growth of adherent and nonadherent cells. Analytical Biochemistry 241, 103–108.

Ye X, K.R., Liu W, Joshi SS, Kuszynski CA, McGinn TR, Bagchi M, Preuss HG, Stohs SJ, Bagchi D., 1999. The cytotoxic effects of a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract on cultured human cancer cells. Mol Cell Biochem 196, 99-108

Zanoni, F. D., Andrade, S. F., Bastos, J. K., Maistro, E. L., 2005. Clastogenicity of the Austroplenckia populnea (Celastraceae) bark wood extract in Wistar rat bone marrow cells. Cytologia 70, 303-308

ANEXOS

Anexo

ESPECTROS DE RMN EM 2D DE TC6

ESPECTRO DE MASSAS TOTAL DE TC6

ESPECTROS DE RMN EM 2D DE CM18

volume 1 - repositorio.ufop.br · preparo das amostras ..... 66 . vi. 2.2. esterilização das...

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