vi simpósio abrapa são paulo – 15 de junho de 2007 silvana do couto jacob

PASSO A PASSO DO PROCESSO DE VALIDAÇÃO PARA MÉTODOS QUÍMICOS

VI Simpósio ABRAPA

São Paulo – 15 de junho de 2007

Silvana do Couto Jacob

Laboratório de Alimentos e Contaminantes - DQ

INCQS / FIOCRUZ

RESULTADO ANALÍTICO – PARA QUÊ?

Tomada de decisão nas diversas áreas.

Para isso temos que gerar “resultados aceitáveis”Ex. Limite máximo de Cd em solo = 5 mg / Kg

Resultado analítico Laboratório 1: 4,5 mg / Kg com incerteza de +/- 0,5Laboratório 2: 4,5 mg / Kg com incerteza de +/- 0,8Laboratório 2 incorrendo certo risco de erro ao afirmar que a amostra atende a

exigência prescrita em lei.

Resultado com apenas a média é difícil comparação, tomar a decisão. Com a incerteza podemos tomar a decisão correta.

METROLOGIA QUÍMICA

OBJETIVO: conseguir alta exatidão com mínimo de incerteza.

COMO ? Garantindo que todas as etapas de um procedimento químico sejam comparáveis a um padrão de medição de referência aceitável.

Medições químicas requerem vários estágios : amostragem, digestão, extração, etc. sendo essencial que se tenha o entendimento pleno das incertezas que são introduzidas em cada etapa do procedimento analítico.

MEDIR = COMPARAR

RASTREABILIDADE DAS MEDIÇÕES

Um dos temas mais importantes na química analítica – assegura que medições feitas em diferentes laboratórios e períodos sejam comparadas.

É a propriedade de um resultado de medição, o qual está relacionado a padrões apropriados, geralmente nacionais ou internacionais, por meio de uma cadeia contínua de comparações, todas tendo incertezas estabelecidas.

VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO

Comprovação através de evidência objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso específico pretendido foram atendidos

Quais métodos validar?

Não normalizados Criados/ desenvolvidos pelo laboratório Normalizados usados fora dos escopos para os

quais foram concebidos Ampliações e modificações de métodos

normalizados

PLANEJAMENTO DA VALIDAÇÃO

Definição da aplicabilidade do objetivo e do escopo do método

Definição de parâmetros de desempenho e critérios de aceitação – baseada no objetivo de cada método e no princípio básico de medição que este utiliza

custo X benefício (PM)

PARÂMETROS NECESSÁRIOS -escolhidos de acordo com o tipo de método

Linearidade Recuperação Limites de detecção e quantificação Exatidão Precisão Seletividade Controle do processo em rotina (garantia da

qualidade interna)

PARÂMETROS NECESSÁRIOS para validação – segundo (FDA -1995 / WHO - 20050

PARÂMETRO

TIPO / OBJETIVO DO MÉTODO

identificação Testes depureza

Dissolução,Conteúdo, Potência

Exatidão NÃO SIM NÃO SIM

Precisão – Repetitividade Intermediária

NÃONÃO

SIMSIM

NÃONÃO

SIMSIM

Especificidade SIM SIM SIM SIM

Limite de detecção Obs * NÃO SIM NÃO

Limite de quantificação NÃO SIM NÃO NÃO

Linearidade NÃO SIM NÃO SIM

Faixa de trabalho NÃO SIM NÃO SIM

Obs* necessária em análises de traços

Critérios de aceitação para os parâmetros estudados

Acordado pelo laboratório e cliente

No caso de testes estatísticos (hipóteses) estes critérios já estarão definidos dependendo do teste específico escolhido para um dado nível de confiança (1 - α) ou de significância (α)

(teste Fisher, t de student, análise de variâncias)

Outros casos estabelecer através da literatura , resultados interlaboratoriais, métodos similares ou experiência acumulada

Testes que usam kits ou imunoensaios – falso x positivo) obtido na literatura especializada.

PARÂMETRO DE DESEMPENHO

EXATIDÃO

Definição Concordância entre um resultado de um ensaio e

o valor de referência aceito como verdadeiro.

Procedimento e ou experimento sugerido

Concordância entre um resultado de um ensaio e

o valor de referência aceito como verdadeiro.

Ferramentas estatísticas para avaliação

Erro relativo; z score ou erro normalizado.


Precisãorepetitividade /reprodutibilidade e Precisão intermediária*

Definição Dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões em condições definidas.


Repetitividade: desvio padrão, mesmas condições.

Reprodutibilidade: desvio padrão - condições variadas.

Comparação entre métodos:

comparação de variâncias.Recuperação porcentual. Precisão intermediária.

(7 replicatas para cada concentração)


Limite de repetitividade "r" (95%); Limite de reprodutibilidade "R" (95%); Teste F (razão entre

variâncias)

* Não há necessidade de avaliação da precisão intermediária quando for realizado o teste da reprodutibilidade



Um mínimo de 9 determinações cobrindo a faixa específica para o procedimento (p. ex: 3 concentrações/3 replicatas cada, menor, intermediária e maior); ou

Um mínimo de 6 determinações a 100 % de concentração teste

Calcular o desvio padrão, o desvio padrão relativo ou coeficiente de variação ou a variância.

GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics evaluation and Research, November 1996 ICH.



REPETITIVIDADE

Um mínimo de 9 determinações cobrindo a faixa específica para o procedimento (p. ex: 3 concentrações/3 replicatas cada, menor, intermediária e maior); ou

Um mínimo de 6 determinações a 100 % de concentração teste

Calcular o desvio padrão, o desvio padrão relativo ou coeficiente de variação ou a variância.




PRECISÃO INTERMEDIÁRIAOs resultados dos dados obtidos em dias alternados, por um mesmo analista, usando um mesmo equipamento, mesmas concentrações e mesma metodologia, deverão ser o mesmo: pode ser comprovado por teste t, onde a hipótese a ser afirmada é que o resultado obtido em diferentes dias são significativamente iguais.

Hipótese a ser testada: Ho: 1= 2Teste t T=( - xmed)n/S

onde: =valor de referência, xmed=média dos valoresdos resultados de análise, n=número de resultados de análise e S=desvio padrão

O valor crítico (tabelado) varia em função do grau de liberdade () e do nível de confiança, sendo que: = n – 1 se: ttab > tcalc Ho é aceita ttab tcalc Ho é rejeitada




REPRODUTIBILIDADE

É o grau de concordância entre os resultados das medições de um mesmo mesurando, efetuadas sob condições variadas de medição(VIM).A reprodutibilidade não é um componente de validação de método executado por um único laboratório, é obtido em relação aos dados de validação obtidos através de comparação interlaboratorial (INMETRO, 2002).

INMETRO. Orientações sobre validação de métodos de ensaio químicos. VIM – Vocabulário Internacional de termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, 1995.


Especificidade / seletividade

Definição Capacidade de produzir respostas para apenas um analito / Capacidade de produzir respostas para vários

analitos podendo haver distinção entre os analitos


Comparações de resultados, variando as condições de medição e análise de pureza de sinal, que podem ser

usados para verificar que nenhum outro componente conhecido, ou desconhecido, esteja sendo determinado junto com o analito/Avaliação de dois grupos: um com a

matriz e outro sem, ambos com concentração idêntica do analito em cada nível de concentração de interesse.

(7 amostras em cada nível de conc.)


Se a matriz da amostra sem analito ou um grupo

satisfatório de amostras de referência estão disponíveis, podem ser aplicados o Teste F (homogeneidade de

variâncias); teste t (Student) de comparação de médias ou análise de desvios em relação aos valores de

referência.


Especificidade / seletividade

SELETIVIDADE

O cálculo do valor de t quando se comparam médias de duas amostras diferentes é dado pela expressão

21

21

/1/1 nnSa

xx

+

-

t =

Sa é a estimativa do desvio padrão agregado, calculado a partir das estimativas dos desvios-padrões das duas amostras

2

)1()1(

21

222

211

nn

SnSnSa =


Limite de Detecção

DefiniçãoMenor valor de concentração do analito ou da propriedade que pode ser detectado pelo método.


Replicatas do branco, ou branco da amostra, com adição da menor concentração aceitável do analito.

Material de referência diluído.

(7 replicatas )


Desvio padrão (variância) das medições em replicata

Para a validação de um método analítico, é normalmente suficiente fornecer uma indicação do nível em que a detecção do analito começa a ficar problemática.

Matriz: Branco da amostra

LD=+ ts onde:

ou

Matriz: Branco da amostra com adição da menor concentração aceitável do analito

LD=0 + ts onde:

Onde t valor de t de Student para (1-a)*100% de nível de confiança e (n-1) graus de liberdade.



O limite de detecção do equipamento (LDE) é definido como a concentração do analito que produz um sinal de três a cinco vezes a razão ruído/sinal do equipamento. O limite de detecção do método (LDM) é definido como a concentração mínima de uma substância medida e declarada com 95% ou 99% de confiança de que a concentração do analito é maior que zero.

O LDM é determinado através de análise completa de uma dada matriz contendo o analito.



O limite de detecção foi determinado analisando 6 vezes a menor concentração da curva analítica, e o desvio padrão foi multiplicado por 3, este limite é referente a alíquota de análise. Tem que se considerar o procedimento do método para se determinar o limite de detecção do método. Desvio padrão: é igual a raiz quadrada positiva da variância e tem a mesma dimensao da média aritmética

s = (xi – xmédio)2 x 1/(n-1)

THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835-855, 2002.


Limite de Quantificação

Definição Menor concentração do analito que pode ser determinada com um nível aceitável de precisão

e exatidão.


Replicatas do branco ou branco da amostra com adição de concentrações variadas do analito, próximas ao LD.

(7 replicatas)


Desvio padrão (variância) e média das medições em replicata

Alguns organismos internacionais (UKAS- 2002), consideram o LQM, o Limite inferior da curva analítica.


Limite de Quantificação

É a mais baixa concentração da substância em exame que pode ser

quantificada com certo limite de confiabilidade utilizando um

determinado procedimento experimental

Geralmente é o mais baixo ponto da curva analítica não deve ser determinado por extrapolação

UKAS PUBLICATION ref: LAB 27, United Kingdom Accreditation Service. www.ukas.com


Sensibilidade

Definição Variação da resposta em função da concentração do analito.


Inclinação da curva de regressão linear de calibração.


Curva de regressão linear


Sensibilidade

Descreve quanto a resposta varia com a variação da concentração do analito. Pode ser expressa como a inclinação da curva analítica (coeficiente angular), expresso pala equação S=dx/dc, onde:dx = variação da resposta, dc = variação da concentração

É medida ao mesmo tempo que testa a linearidadeDepende da natureza do analito e da técnica de detecção

BRUCE, P. , MINKKINEN, P. , RIEKKOLA, M. L. Practical Method Validation: Validation sufficient for an Analysis Method. Mikrochimica ACTA. V. 128, p. 93-106, 1998.


Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho

Definição Faixa de concentrações do analito ou valores da propriedade onde o método pode ser aplicado / faixa linear é o intervalo de concentrações onde o método

apresenta linearidade.


A faixa de trabalho deve cobrir a faixa de aplicação para a qual o ensaio vai ser usado. A concentração mais esperada da amostra

deve, sempre que possível, se situar no centro da faixa de trabalho. Os valores medidos obtidos têm que estar linearmente

correlacionados às concentrações. Isto requer que os valores medidos próximos ao limite inferior da faixa de trabalho possam ser distinguidos dos brancos dos métodos. Esse limite inferior

deve, portanto,ser igual ou maior do que o limite de detecção do método.(mais que 6 pontos)


Determinadas a partir da escolha de uma faixa preliminar que cubra a faixa de aplicação do ensaio.

Limite inferior: limitado pelos limites de detecção e quantificação.

Limite superior: depende do sistema de resposta do equipamento de medição.


Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho

A faixa de trabalho (FT) pode ser definida entre um décimo a dobro do limite de restrição (LR)

0,1 LR ≤ intervalo de trabalho ≤ 2 LRExemplo:

Como o limite máximo (de restrição) estabelecido para um dado contaminanteHg em pescado 0,5 mg / Kg,é a faixa de trabalho para se trabalhar deve ser de:

0,05 mg / Kg ≤ FT ≤ 1,0 mg / Kg

OBS. Considerar quanto de amostra será pesada e quanto será pipetada (injetada ) no aparelho.


Linearidade

Pode-se verificar se algum ponto de concentração desvia da linearidade da curva por meio do cálculo dos resíduos entre os valores medidos e os valores calculados a partir da equação da curva. Calcular um ponto duvidoso de uma curva analítica pelo valor de t.tcalculado= resíduo sr/nOnde:resíduo =|xmedido - xcalculado|sr=desvio padrão dos resíduos = (xmedido – xcalculado)2 n - 2


Linearidade

Coeficientes de correlação r e determinação R2

Homocedasticidade/heterocedasticidade

É a independência ou dependência da variância das respostas com as concentrações do analito

ATENÇÃO!!!!!

“Lack - of - fit” ( falta de ajuste) Avaliação se existe algum valor aberrante nos resíduos que são deslovamentos de Y em relação à curva analítica: deve-se verificar o ajuste ao modelo “normal” checar a não - linearidade em um gráfico de regressão.


Robustez

Definição Sensibilidade do método face a pequenas variações.


Ensaios são realizados para determinar os efeitos da variação de algumas etapas.

(8 ensaios)


Teste de Youden; Teste t para médias; Análise das variâncias (Homogeneidade)


robustez

Comparação de resultados ( médias) de resultados obtidos a partir de pequenas variações nos parâmetros do método como:

Temperatura,Tempo de pirólise - AASConcentração de um dado reagente usado para extraçãoQuantidade da amostra injetadaQuantidade de amostra pesada

Até quanto a modificação pode ocorrer e o método ser usado?


incerteza

Definição Parâmetro, associado ao resultado de uma medição, que caracteriza a dispersão dos valores que podem ser fundamentadamente atribuídos a um mensurando.


Combinação das incertezas padrão (desvios padrão) associados aos fatores de influência relevante no resultado de uma medição.

Ref. (POP/ INCQS - 65.1120.061) Ferramentas estatísticas para avaliação

Método relativo; de derivadas parciais ou Monte Carlo

INCERTEZA DE RESULTADOS

Avaliada por meios estatísticos através da variação dos fatores dos quais depende este resultado.

É um parâmetro associado ao resultado de uma medição, que caracteriza a dispersão dos valores que podem ser atribuidos a um mensurando como desvio padrão.

INCERTEZA = DÚVIDA

VERIFICAÇÃO DE PROBLEMAS - INCERTEZASdiagrama de causas e efeitos (diagrama de espinha de peixe)

Desvio do resultado analítico

Pessoalmétodo

Reagentes Equipamentos

qualificaçãotreinamento

Contaminaçãopadronização

Validaçãoadequação

Manutençãocalibração

Resultados analíticos

decisões importantes

Importante: qualidade do resultado garantir que a informação seja adequada

ISO 17025:1999

demostração da qualidade dos resultados

demonstrar da sua adequação aos fins a que se destinam

Química analítica

requisito formal para estabelecer a confiança nos resultados:resultado deve ser rastreável a uma dada referência (SI, MR ou um método empírico)

Incerteza da medição é a medida da confiança que pode-se

depositar no resultado analítico

é a medida da qualidade do resultado

Conceito à muito conhecido mas somente em 1993 a ISO em colaboração com outras organizações Publicou o “Guia para Expressão da Incerteza da Medição” 1995 – 1º edição do Guia da EURACHEM “Quantificação da Incerteza nas medições Analíticas”2000 – 2º edição do Guia da EURACHEM

INCERTEZA

Definição

Dúvida sobre um resultado, sobre sua validade, sobre sua exatidão

X ± U (p%)

Erros X Incertezas

Resultado de análise: 2,5 ± 0,8 mg / Kg

Valor certificado: 2,9 ± 0,2 mg / Kg

Erro: 2,9 – 2,5 = 0,4 mg / Kg

Incerteza: 0,8 mg / Kg

Erros X Incertezas

Errodiferença entre resultado individual e o valor verdadeiro

IncertezaUm parâmetro* associado com o resultado de uma medição, que

caracteriza a dispersão** dos valores que poderiam razoavelmente ser atribuidos ao mensurando

* mensurando: concentração do analito, pH, densidade, etc** dispersão: desvio padrão ou seus múltiplos, intervalo de confiança,

amplitude, etc.

Incerteza da medição

Um resultado pode estar muito próximo do valor “verdadeiro”

Existem erros aleatórios

Sem a expressão da incerteza o analista não sabe

quão próximo o resultado se encontra do valor esperado

DÚVIDA PARA APROVAR OU REPROVAR ITENS QUE SE ENCONTRAM COM VALORES PRÓXIMOS DOS LIMITES DE CONFORMIDADE

ZONA DE INCERTEZA

ZONA DE INCERTEZA

ZONA DECONFORMIDADE

ZONA DE NÃO CONFORMIDADE

ZONA DE NÃO CONFORMIDADE

Limite inferiorda especificação

Limite superiorDa especificação

DÚVIDA NA RESPOSTA ISO 14253-1- aplicada a metrologia dimensional

Zona de conformidade: tolerância da especificação subtraída da

incerteza da medição em cada extremidade

Zona de não conformidade: áreas externas à tolerância da especificação adicionando-se o valor da incerteza da medição em cada extremidade

Zona de incerteza: área onde a conformidade e não conformidade podem ser determinadas

Incerteza e limites de conformidade

Versão português Guia Eurachem 2º ed./COTAC

Resultado analítico

Estimativa confiável da incerteza são essenciais para a tomada de decisões

Deve ser acordado entre cliente e laboratório quais itens devem ser aprovados

SAÚDE PÚBLICA deve-se avaliar RISCO X BENEFÍCIO

SAÚDE PÚBLICA - RISCO X BENEFÍCIO

Exemplo: Determinação de timerosal em vacinas

Valor máximo permitido: 200 mg / Kg

Timerosal em excesso – risco à saúde

Timerosal em menor quantidade – afeta a qualidade do produto e assim, leva ao risco

Deve-se avaliar risco x eficácia

INCERTEZAS DOS RESULTADOS ANALÍTICOS E AVALIAÇÃO DO ENSAIO REALIZADO

ALIMENTOS:Declaração Nutricional Obrigatória – faixa de aceitabilidade ± 20%d.d.Aditivos intencionais - Teor máximo permitido

Pesticidas / contaminantes – limites máximos permitidos limite mínimo de desempenho requerido

MEDICAMENTOS:Teor dos princípios ativos - nas monografias Oficiais, a faixa de aceitabilidade dependente da substância ativa. Ex. ± 5% d.d. ± 10% d.d. ± 15% d.d.


THE COMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES

Objetivo : estabelecer normas para a comunidade europeia.

Decisões de 12 de agosto de 2002 (2002/657/EC)

•discutir e aprovar regras para os metodologias analíticas a serem usadas em testes de amostras oficiais e •especificar criterios comuns para a interpretação dos resultados analíticos dos laboratórios Oficiais de Controle


Assuntos tratados no documento:DefiniçõesAnalytical methodsMinimum required performance limitsQuality controlInterpretation of ResultsRepealTransitional provisionsData of applicationAddresses


“Power curve” – fornece informações sobre a capacidade de detecção do método num escolhido intervalo de concentração.

(Isto refere-se a um risco de beta –erro quando aplica-se tal método)

Permite calcular a capacidade de detecção para respectivas categorias de metodos para um um certo erro beta


erro alfa - probabilidade da amostra analisada ser conforme apesar de se ter obtido resultado não conforme (falso positivo)

erro beta - probabilidade da amostra analisada ser não conforme apesar de se ter obtido resultado conforme (falso negativo)

CCbeta - capacidade de detecção é o teor mais baixo que pode ser detectado , identificado ou quantificadocom uma probabilidade de erro “beta”.

Ccalfa - limite de decisão é o limite a partir do qual pode-se decidir se uma amostra é não conforme com uma probabilidade de erro “’alfa”.

ANÁLISE DE RESÍDUOSSUBSTÂNCIAS NÃO AUTORIZADAS

concentração

sinal CC CC

xB xS

2,33DP

1,64DP

Blank sample

Contaminatedsample

ANÁLISE DE RESÍDUOSSUBSTÂNCIAS AUTORIZADAS COM LMRs ESTABELECIDOS

concentração

CC

xLP

1,64

1,64DP

MRL / MPLContainingsample Contaminated

sample

Blank

sample

xB

CC sinal

xS

ETAPAS ENVOLVENDO PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE REFERÊNCIA ELEMENTAR

pesagem

pipetagem

diluição

resultado

VERIFICAÇÃO DE PROBLEMAS - INCERTEZASdiagrama de causas e efeitos (diagrama de espinha de peixe)

Desvio do resultado analítico

Pessoalmétodo

Reagentes Equipamentos

qualificaçãotreinamento

Contaminaçãopadronização

Validaçãoadequação

Manutençãocalibração

CARTAS DE CONTROLE DE QUALIDADE

A ISOP 8258 – 6 (seção 4) recomenda o uso de cartas de controle de Shewhart e CUSUM para a validação da estabilidade dos resultados dentro de um laboratório.

Permitem avaliar se há reagentes contaminados, se o gás carreador está impuro, condições instrumentais alteradas etc. e detecta mudanças sistemáticas e verificação da exatidão.

CARTAS DE CONTROLE DE Shewhart

São uma extensão de uma curva de distribuição normal

Amostra controle é analisada durante um período anterior ao uso do método.

Resultados (mínimo de vinte) são plotados

Linha central é o valor verdadeiro (valor médio pode representar o valor real )

Desvios padrão – calculo dos limites de controle e os limites de atenção

CARTA CONTROLE DE SHEWHART

X

2S

3S

2S

nº serie

Região de controleRegião de atenção

Linha de ação

99,7%95,5%

CARTAS DE CONTROLE DE Shewhart

não se pode apenas procurar as situações fora da região de controle, mas verificar a progressão geral dos valores fornecidos.

CRITÉRIOS PARA DETECTAR SITUAÇÕES FORA DO CONTROLE:

um único valor acima do “limite de controle”

dez valores consecutivos todos acima iou abaixo da linha central

sete valores consecutivos com tendência crescente ou decrescente

dois de três valores consecutivos fora da “linha de aviso”

CARTA DE CONTROLE CUSUM

Requer uma maior manipulação matemática porém é mais sensível para detectar mudanças sistemáticas no processo.

Calcula-se o valor médio da amostra controle (k) que será subtraído do valor médio durante a análise (Xi) e este resultado é adicionado a soma de todas as diferenças, incluindo seus sinais:

S1 = (X1 – k)S2 = S1 + (X2 – k)

.

.

.SN = Sn-1 + (Xn – k)

CARTA CONTROLE CUSUM

X

- 2

+2

Nº série

NECESSIDADES

BrancoBranco reagente - para avaliação da contribuição dos reagentes na medição do sinalamostra branco - matrizes sem analito para avaliação de possíveis interferências matriciais amostras reais – avaliação das respostas em análises de rotina

Material fortificado / soluções fortificadas – estudo da recuperaçãoPadrões – utilizado nos métodos comparativos como referência e em calibraçõesMaterial de Referência – materiais ou substãncias com um ou mais valores de propriedades bem

estabelecidosMaterial de Referência Certificado – material de referência acompanhado de certificados que estabelece sua rastreabilidade à obtenção exata da unidade na qual o valor certificado é acompanhado por uma incerteza para um nível de confiança estabelecido Equipamentos

verificados calibrados/qualificados/validados

procedimento sistemático de controle interno da qualidade analítica dos resultados

NECESSIDADES

Disponibilidade

Sensibilidade

Precisão

Rapidez

Custo

Experiência do analista

OBRIGADO! [email protected]

vi simpósio abrapa são paulo – 15 de junho de 2007 silvana do couto jacob

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