ursula castro de oliveira
TRANSCRIPT
URSULA CASTRO DE OLIVEIRA
Eimeria spp. de coelho e galinha
domésticos: desenvolvimento de
ensaios moleculares e
caracterização filogenética
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Parasitologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo,
para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
São Paulo 2011
URSULA CASTRO DE OLIVEIRA
Eimeria spp. de coelho e galinha
domésticos: desenvolvimento de
ensaios moleculares e
caracterização filogenética
São Paulo 2011
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro.
Orientador: Prof. Dr. Arthur Gruber
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
reprodução não autorizada pelo autor
Oliveira, Ursula Castro.
Eimeria spp. de coelho e galinha domésticos: desenvolvimento de ensaios moleculares e caracterização filogenética. / Ursula Castro Oliveira. -- São Paulo, 2010.
Orientador: Gruber, Arthur. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Parasitologia. Área de concentração: Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro. Linha de pesquisa: Biologia Molecular de Eimeria ssp. Versão do título para o inglês: Eimeria spp. of domestic rabbit and fowl: development of molecular assays and phylogenetic characterization. Descritores: 1. Eimeria spp. 2. Diagnóstico Molecular 3. Oryctolagus cuniculus 4. Gallus gallus 5.Filogenia Molecular 6. Evolução I. Gruber, Arthur II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Parasitologia. III. Título.
ICB/SBIB0174/2010
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
_____________________________________________________________________________________________________
Candidato(a): Ursula Castro Oliveira.
Título da Tese: Eimeria spp. de coelho e galinha domésticos: desenvolvimento de ensaios moleculares e
caracterização filogenética.
Orientador(a): Arthur Gruber.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão
pública realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................... Nome: ............................................................................................ Instituição: .....................................................................................
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................... Nome: ............................................................................................ Instituição: .....................................................................................
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................... Nome: ............................................................................................ Instituição: .....................................................................................
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................... Nome: ............................................................................................ Instituição: .....................................................................................
Presidente: Assinatura: .................................................................................... Nome: ............................................................................................ Instituição: .....................................................................................
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Arthur Gruber, primeiramente por me aceitar como aluna, por permitir
que transitasse por vários laboratórios aprendendo novas técnicas. Agradeço por
seu laboratório ter uma infraestrutura muito autossuficiente, fazendo com que
sejamos independentes. Agradeço pela orientação durante todos esses anos.
Ao Dr. Michal Pakandl (Academy of Sciences, República Tcheca), pelas amostras de
Eimeria de coelho doméstico, sem as quais seria impossível o desenvolvimento
deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Paolo Zanotto (ICB-USP), pelo auxílio nas análises filogenéticas deste
trabalho, sempre solicito e disposto a ensinar.
À Profª Drª Alda Madeira pela ajuda com o sequenciamento, e diversas
colaborações nas dúvidas veterinárias, coordenando o nosso Laboratório junto com
o Arthur em tempos difíceis, mas sempre confiante.
Ao Prof. Dr. Paulo Lee Ho, meu orientador da iniciação científica que despertou meu
interesse pela biologia molecular. Aqueles quase seis anos foram a melhor
lembrança do que era estar em um laboratório onde tínhamos a possibilidade de
aprender tudo, tudo era novidade. Orientador que ensinou a base científica, a qual
me permitiu inúmeras novas experiências profissionais.
Aos meus queridos pais, Bernadete e Ariovaldo por fazerem apaixonar-me pela
ciência desde muito cedo, através de nossas viagens pelo Brasil afora.
Ao meu irmão, Emiliano pelos diversos esclarecimentos sobre paleontologia e ser o
técnico de plantão dos computadores de casa. À minha cunhada Gabriela pela sua
determinação e companhia.
Às minhas queridas avós, Reny e Aparecida por me ensinarem o que é ser forte e
nunca desistir de aprender. Aos meus queridos avôs Sebastião ( in memorian) e
Francisco (in memorian).
À minha tia Beatriz por ser minha amiga, por sua companhia e conselhos em todos
os momentos.
Ao Fernando, meu amor e companheiro que me deu força, coragem e determinação
nos momentos mais difíceis. Por suportar os momentos de loucura e estresse
durante todo meu doutorado. Por até aprender biologia molecular, parasitologia e
filogenia para discutir comigo em casa. Pelo precioso auxílio na formatação desta
tese.
Aos meus queridos sogros Bernadete e Arnaldo pelo apoio e pela acolhida em uma
nova família.
À Dra. Jeniffer Novaes, minha amiga, companheira de bancada e comadre por
sempre estar pronta para uma boa discussão filosófica sobre Ciência e sobre a Vida.
Por ajudar-me nos momentos difíceis da minha vida e das etapas deste Doutorado.
À Alessandra Popov(a) por sempre estar pronta a ajudar no laboratório e fora dele,
compartilhando todas as dificuldades de um doutorado.
À Alessandra Fratus minha amiga e fotógrafa oficial, por me escutar e fazer-me ver a
vida de um modo mais leve.
As minhas amigas e amigos do colégio Isis, Vivian, Tatu, Menfis, Daniel, Fabiana
que perduram firmemente até hoje, e suas famílias que acabaram se tornando um
pouco minha também.
À Laureana por permitir que eu desse tanto palpite na sua iniciação científica, por
ser tão culta e atrapalhada ao mesmo tempo.
Ao Thibério e André pela ajuda em bioinformática e pelas conversas divertidas.
À nossa técnica Érika por nos ajudar a colocar o laboratório em ordem e estar
sempre a disposição para nos ajudar.
À faculdade de Ciências Farmacêuticas e Bioquímica da Universidade de São Paulo
pela formação durante a graduação e incentivo ao desenvolvimento da pesquisa na
Universidade.
Ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, pela formação
durante a pós-graduação.
Ao Departamento de Parasitologia por ter nos acolhido e permitido o
desenvolvimento desse trabalho. Aos seus professores pelos conselhos, disciplinas
e avaliações.
À Granja Kunitomo, pela doação das aves utilizadas na propagação das espécies de
Eimeria de galinha.
À CAPES e ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo suporte financeiro.
RESUMO
Oliveira UC. Eimeria spp. de coelho e galinha domésticos: desenvolvimento de
ensaios moleculares e caracterização filogenética. [tese (Doutorado em Parasitologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo; 2011.
Protozoários parasitas do gênero Eimeria infectam uma ampla variedade de
hospedeiros e causam doenças entéricas conhecidas genericamente como
coccidioses. O presente estudo teve dois objetivos gerais: (1) desenvolver ensaios
moleculares para a detecção e discriminação das onze espécies de Eimeria de
coelho doméstico; (2) estudar as relações evolutivas entre espécies de Eimeria de
hospedeiros mamíferos e aves. Visando o primeiro objetivo, realizamos o
sequenciamento de DNA da região ITS1 do cistron ribossômico de todas as
espécies de Eimeria de coelho. A partir das sequências, foram desenhados
iniciadores espécie-específicos e os ensaios foram testados quanto à sua
especificidade, não sendo observadas reatividades cruzadas. O limite de detecção
variou entre 500 fg a 1 pg, o que corresponde a 0,8 a 1,7 oocistos esporulados. Para
o estudo filogenético, sequenciamos quatro marcadores moleculares distintos de
espécies de Eimeria de galinha e de coelho. Os dados foram analisados em
conjunto com sequências já existentes de Eimeria de outros hospedeiros utilizando
vários métodos de reconstrução filogenética. A utilização de um conjunto
concatenado de genes permitiu obter árvores filogenéticas de Eimeria com maior
congruência entre os diferentes métodos de reconstrução filogenética e maior grau
de suporte nos nós. E. maxima apresentou uma aceleração de sua taxa de evolução
em relação a outras espécies de Eimeria, fato que se correlaciona com sua maior
diversidade antigênica e imunológica. As análises filogenéticas indicaram que as
espécies de Eimeria são em geral monofiléticas em relação aos seus hospedeiros,
mas, ocasionalmente, são observadas parafilias. A topologia das árvores também
demonstrou que a especificidade do hospedeiro parece ser mais relevante do ponto
de vista das relações evolutivas dos parasitas do gênero Eimeria do que o caractere
de presença/ausência do resíduo do oocisto, como se considerava na literatura. A
análise demográfica indicou que múltiplos eventos de invasão de hospedeiros
mamíferos e aves devem ter ocorrido ao longo do processo evolutivo. Em termos
ecológicos, foi observada ainda uma correlação entre as relações evolutivas das
diferentes espécies de Eimeria e os hábitos alimentares e habitats de seus
hospedeiros. Finalmente, a hipótese de co-evolução entre parasitas do gênero
Eimeria e seus hospedeiros não foi suportada devido às seguintes evidências: (1) há
relatos experimentalmente comprovados de mudança de hospedeiros em espécies
de Eimeria de roedores; (2) as datações da invasão de roedores, galinha e coelho
apontam para uma divergência das espécies de Eimeria muito mais recente do que
a dos respectivos hospedeiros; e (3) a árvore dos parasitas não pode ser
reconciliada com a árvore dos respectivos hospedeiros.
Palavras-chave: Eimeria. Coelho doméstico. Reação em cadeia da polimerase.
ITS1. Diagnóstico molecular. Filogenia molecular. Evolução.
ABSTRACT
Oliveira UC. Eimeria spp. of domestic rabbit and fowl: development of molecular
assays and phylogenetic characterization [Ph. D. thesis (Parasitology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2011.
Protozoan parasites of the genus Eimeria infect a wide range of hosts, and cause
enteric diseases generically known as coccidioses. This work presented two main
objectives: (1) development of molecular assays for the detection and discrimination
of the eleven Eimeria species of domestic rabbit; (2) study of the evolutionary
relations among Eimeria species of mammals and birds. Aiming at the first goal, we
sequenced the ITS1 of the ribosomal cistron of the eleven Eimeria species of
domestic rabbit and designed species-specific primers. The assays were tested in
regard to their specificity and no cross-reactivity has been observed. The detection
threshold varied from 500 fg to 1 pg, which corresponds to 0.8 to 1.7 sporulated
oocysts. For the phylogenetic analysis, we sequenced four distinct molecular markers
of Eimeria species of domestic fowl and rabbit. An overall analysis comprising our
data and public sequences of Eimeria of other hosts has been performed, and we
used several distinct methods for the phylogenetic reconstruction. A concatenated
multiple gene dataset permitted to generate phylogenetic trees with the best
congruence across different methods and the highest node support values. E.
maxima showed an accelerated evolution rate when comparing to other Eimeria
species, which correlates with its known higher antigenic and immunological
diversity. The phylogenetic analyses indicated that Eimeria species are often
monophyletic in regard to their hosts, but paraphylies are sometimes observed. Tree
topology also demonstrated that host specificity is more relevant in reflecting the
phylogenetic relationships than is the presence/absence of the oocyst residuum. The
demographic analysis indicated that multiple events of invasion of mammal and bird
hosts might have occurred along the evolutionary process. In terms of ecology, we
observed a correlation between the evolutionary relationships of different Eimeria
species and the feeding habits and habitats of their respective hosts. Finally, the
hypothesis of co-evolution of Eimeria parasites and their hosts could not be
supported due to the following evidences: (1) there are experimental reports of host-
switching events among rodent Eimeria species; (2) the estimated divergence time of
Eimeria species is much more recent than the divergence time of their respective
vertebrate hosts; and (3) the parasite and host trees cannot be reconciled.
Keywords: Eimeria. Domestic rabbit. Polymerase chain reaction. Molecular
diagnosis. ITS1. Molecular phylogeny. Evolution.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Amplificação da região ITS1 do cistron ribossômico. ......................... 64
Figura 2 - Teste de especificidade dos ensaios para diagnóstico de Eimeria
spp. de coelho ....................................................................................... 65
Figura 3 - Teste de sensibilidade de detecção de Eimeria spp. de coelho ......... 66
Figura 4 - Teste de sensibilidade de detecção de E. magna e E. piriformis
com diferentes enzimas ....................................................................... 67
Figura 5 - Mapeamento de verossimilhança obtido com o programa
Tree-Puzzle ........................................................................................... 69
Figura 6 - Mapeamento de verossimilhança para o conjunto de dados
concatenado .......................................................................................... 70
Figura 7 - Filograma obtido por neighbor-joining da SSU de rRNA nuclear das
espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos........................ 72
Figura 8 - Filograma obtido por máxima parcimônia do conjunto de dados
concatenado das espécies de Eimeria de coelho e galinha .............. 75
Figura 9 - Filograma obtido por neighbor-joining do conjunto de dados
concatenado das espécies de Eimeria de coelho e galinha ............... 76
Figura 10 - Filograma obtido por máxima verossimilhança do conjunto de
dados concatenado das espécies de Eimeria de coelho e galinha .. 77
Figura 11 - Filograma obtido por máxima verossimilhança do conjunto de
dados concatenado das espécies de Eimeria de coelho, galinha e
roedores .............................................................................................. 80
Figura 12 - Filograma obtido por máxima verossimilhança da SSU de rRNA
nuclear para as espécies de Eimeria de diversos hospedeiros........ 83
Figura 13 - Distribuição de valores de posteriores ao longo do comprimento
da cadeia............................................................................................. 87
Figura 14 - Árvore de máxima credibilidade dos clados obtida através dos
dois métodos utilizados no BEAST, utilizando quatro marcadores
moleculares (SSU, LSU, citocromo b e ORF470) concatenados
para as espécies de Eimeria de galinha, coelho e roedores. ........... 88
Figura 15 - Estimativas Bayesianas do TMRCA e distribuição da
probabilidade posterior marginal usando os modelos demográficos
Yule e birth-and-death. ...................................................................... 90
Figura 16 - Cladograma da análise das substituições nos códons da ORF470
em espécies de Eimeria de galinha, coelho e roedores ................... 93
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Origem geográfica das amostras de Eimeria spp. utilizadas neste
trabalho. ................................................................................................ 46
Tabela 2 - Sequências nucleotídicas de iniciadores utilizados para
amplificação dos ITS1 específicos de cada uma das onze espécies
de Eimeria de coelho doméstico ......................................................... 51
Tabela 3 - Alvos moleculares e sequências dos iniciadores utilizados para
amplificação dos quatro marcadores filogenéticos.............................. 53
Tabela 4 - Alvos moleculares e sequências dos iniciadores utilizados para
fechamento do sequenciamento dos marcadores filogenéticos ......... 54
Tabela 5 - Código de acesso das sequências públicas utilizadas nas análises
filogenéticas .......................................................................................... 57
Tabela 6 - Resultados estatísticos da análise com o programa BEAST
utilizando os modelos demográficos de bsl, Yule e birth-and-death .. 85
Tabela 7 - Análises pareadas de verossimilhanças marginais dos modelos
utilizados para o estudo demográfico das espécies de Eimeria de
diferentes hospedeiros ......................................................................... 86
Tabela 8 - Datas estimadas em torno das quais podem ter ocorrido as
invasões dos ancestrais de cada grupo de hospedeiro obtidos
através dos métodos de Yule e birth-and-death .................................. 91
LISTA DE ABREVIATURAS
ACT – (auto-correlation time) tempo de auto-correlação
Água Milli-Q – água purificada por osmose reversa, deionizada e tratada com luz
UV (Sistema RiOs e Milli-Q Synthesis da Millipore)
bd – birth-and-death
bsl – Bayesian skyline
CI – índice de consistência
cox-1 – citocromo oxidase 1
DNA – ácido desoxirribonucleico
DNAse – desoxirribonuclease
dNTP – abreviação coletiva para desoxinucleosídios trifosfato (dATP, dCTP, dGTP
e dTTP)
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
ESS – (effective sample size) tamanho efetivo da amostragem
HCl – ácido clorídrico
LSU – (Large Sub Unit) subunidade grande do ribossomo
MCMC – (Markov and Monte Carlo chain) cadeia de Markov e Monte Carlo
MAA – milhões de anos atrás
NCBI – (National Center for Biotechnology Information) Centro Nacional de
Informação em Biotecnologia - EUA
ORF – (Open Reading Frame) fase aberta de leitura
p/v – peso por volume
PCR – (Polymerase Chain Reaction) Reação em Cadeia da Polimerase
pH – -log [H+]
RAPD – (Random Amplified Polymorphic DNA) polimorfismo de DNA amplificado
randomicamente
RNA – ácido ribonucléico
RNAse - ribonuclease
SDS – dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
SNPs – (Single nucleotide polymorphism) polimorfismo de nucleotídeo único
spp. – espécies
SSU – (Small Sub Unit) subunidade pequena do ribossomo
TBE – solução tampão Tris-borato-EDTA
TE – solução tampão Tris-EDTA
TM – temperatura de fusão (de um primer)
tmrca ou TMRCA – (time to most recent commom ancestor) tempo para o ancestral
comum mais recente
Tris – Tris[hidroxmetil]aminometano
rRNA – RNA ribossômico
UV – ultravioleta
v/v – volume por volume
LISTA DE UNIDADES
oC – grau Celsius
cm – centímetro
g – aceleração da gravidade
g – grama
h – hora
kb – quilobase
kDa – quilodalton - 1.000 unidades de massa atômica (1 dalton = 1 u.m.a. = 1,66 x
10-24 g)
L – litro
M – molar
mg - miligrama
mL – mililitro
mM – milimolar
N – normal
ng – nanogramas
nM – nanomolar
bp – (base pair) pares de bases
pmoles – picomoles
U – unidades
g – micrograma
pg – picograma
fg – fentograma
L – microlitro
M – micromolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 23
1.1 Aspectos gerais dos parasitas do gênero Eimeria ................................... 24
1.1.1 O filo apicomplexa.e o gênero Eimeria ........................................................ 24
1.1.2 O ciclo de vida dos parasitas do gênero Eimeria ........................................ 26
1.2 A coccidiose em coelho (Oryctolagus cuniculus) e galinha
(Gallus gallus) ....................................................................................................... 27
1.2.1 Características das espécies de Eimeria de coelho doméstico
(Oryctolagus cuniculus) .......................................................................................... 27
1.2.2 Características das espécies de Eimeria de galinha doméstica
(Gallus gallus) ......................................................................................................... 28
1.2.3 Formas de controle da coccidiose ................................................................ 30
1.3 Diagnóstico de parasitas do gênero Eimeria ............................................. 32
1.3.2 Diagnóstico das espécies de Eimeria de galinha doméstica ...................... 33
1.3.2 Diagnóstico das espécies de Eimeria de coelho doméstico ....................... 35
1.4 Filogenia molecular do gênero Eimeria ...................................................... 37
2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 40
2.1 Objetivos gerais ............................................................................................. 41
2.2 Objetivos específicos .................................................................................... 41
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 43
3.1 Preparo das soluções .................................................................................... 44
3.2 Soluções .......................................................................................................... 44
3.3 Propagação dos parasitas ............................................................................ 45
3.3.1 Amostras de Eimeria de galinha doméstica ................................................. 45
3.3.2 Amostras de Eimeria de coelho doméstico .................................................. 45
3.4 Purificação dos oocistos e esporulação .................................................... 47
3.4.1 Oocistos de Eimeria de galinha doméstica .................................................. 47
3.4.1 Oocistos de Eimeria de coelho doméstico ................................................... 48
3.5 Tratamento dos oocistos com hipoclorito de sódio ................................. 48
3.6 Purificação do DNA genômico das espécies de Eimeria de galinha
e coelho ................................................................................................................. 49
3.7 Quantificação de DNA ................................................................................... 49
3.8 Desenho dos iniciadores .............................................................................. 50
3.9 Amplificação do DNA..................................................................................... 50
3.9.1 Amplificação do ITS1 das onze espécies de Eimeria de coelho
doméstico ............................................................................................................... 50
3.9.2 Amplificação de marcadores moleculares para estudo filogenético ........... 52
3.10 Sequenciamento do DNA ............................................................................ 52
3.11 Análise da qualidade das sequências e montagem ................................ 53
3.12 Ensaios diagnósticos para Eimeria spp. de coelho ................................ 55
3.12.1 Desenho de iniciadores espécie-específicos ............................................. 55
3.12.2 Amplificação do DNA .................................................................................. 55
3.13 Análises filogenéticas ................................................................................. 56
3.13.1 Marcadores moleculares e sequenciamento ............................................. 56
3.13.2 Conjuntos de dados .................................................................................... 57
3.13.3 Análises por distância (neighbor-joining), máxima parcimônia e máxima
verossimilhança ...................................................................................................... 59
3.13.4 Mapeamento da verossimilhança ............................................................... 60
3.13.5 Análise de recombinação (RDP) ................................................................ 61
3.13.6 Análise demográfica das espécies de Eimeria .......................................... 61
3.13.7 Análise da evolução de caracteres nas proteínas ORF470 ...................... 62
4 RESULTADOS .................................................................................................... 63
4.1 Diagnóstico molecular de Eimeria spp. de coelho .................................... 64
4.2 Análises filogenéticas de parasitas do gênero Eimeria ........................... 68
4.2.1 Avaliação do sinal filogenético por mapeamento de verossimilhança ........ 68
4.2.2 Análises preliminares com diferentes marcadores e critérios de
optimalidade ........................................................................................................... 70
4.2.3 Análises preliminares com conjunto de dados concatenados e diferentes
critérios de optimalidade ........................................................................................ 73
4.2.4 Análise de recombinação entre marcadores ............................................... 78
4.2.5 Reconstrução filogenética com marcadores concatenados ........................ 78
4.2.6 Reconstrução filogenética com máxima amostragem de taxa .................... 80
4.2.7 Análise demográfica das espécies de Eimeria ............................................ 84
4.2.8 Análise da substituição nas sequências codificantes de proteínas ............ 92
5 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 94
5.1 Discriminação de Eimeria spp. de coelho e suas implicações ............... 95
5.2 Reconstrução filogenética................................................................................ 98
5.2.1 Árvores de genes e árvores de espécies ..................................................... 98
5.2.2 Aspectos evolutivos da presença de resíduo de oocisto em Eimeria ......... 101
5.2.3 Eimeria spp. e as invasões dos hospedeiros ............................................... 105
5.2.4 Aspectos ecológicos da relação parasita-hospedeiro no gênero Eimeria .. 110
5.2.5 Alta taxa de evolução e diversidade antigênica em E. maxima .................. 122
6 CONCLUSÕES ................................................................................................... 125
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 127
ANEXOS ................................................................................................................. 148
ANEXO A – Artigo em periódico ........................................................................... 149
ANEXO B – Teste de especificidade dos ensaios para diagnóstico de
Eimeria spp. de coelho ........................................................................................... 150
ANEXO C – Comandos para execução dos paupblocks para as análises
filogenéticas utilizando o programa PAUP, comandos para ModelTest
e RAxML ................................................................................................................. 154
ANEXO D – Filogramas das análises dos marcadores individuais utilizando
os três critérios de optimalidade (neighbor-joining, máxima parcimônia e
máxima verossimilhança)....................................................................................... 156
1 INTRODUÇÃO
Ursula Castro de Oliveira Introdução 24
1.1 Aspectos gerais dos parasitas do gênero Eimeria
1.1.1 O filo Apicomplexa e o gênero Eimeria
Os parasitas do gênero Eimeria pertencem ao filo Apicomplexa, o qual
compreende um grande número de protozoários intracelulares obrigatórios. Este filo
é considerado bastante antigo e diverso, sendo composto por mais de 5.000
espécies, entre os quais se encontram patógenos humanos de grande impacto na
saúde publica (Roos, 2005). O gênero Plasmodium compreende espécies
causadoras da malária humana, doença devastadora que é responsável por cerca
de 850 mil mortes por ano segundo estatísticas da Organização Mundial da Saúde
(Kappe et al., 2010). O Toxoplasma gondii é responsável por várias manifestações
clínicas em humanos adultos, especialmente indivíduos imunossuprimidos, além de
provocar malformações em fetos, abortamentos e diferentes níveis de
comprometimento intelectual (Tenter et al., 2000; Elmore et al., 2010). Finalmente,
Cryptosporidium e Cyclospora podem causar enterites severas (Chako et al., 2010;
Ortega et al., 2010). Outros gêneros pertencentes ao filo Apicomplexa apresentam
grande importância na medicina veterinária devido aos graves prejuízos que causam
na produção animal. O gênero Eimeria, por exemplo, causa prejuízos para indústria
avícola estimados em 800 milhões a 3 bilhões de dólares por ano (Allen e Fetterer.
2002; Shirley et al., 2004). Outros exemplos de importantes patógenos animais
incluem Cystoisospora, que acomete animais domésticos e humanos (Lindsay et al.,
1994; Lindsay et al., 1997), Theileria, responsável pela febre da costa leste em gado
(Morrison, 2009), e a Babesia, que infecta ruminantes, cães e humanos, levando a
quadros de anemia e aumento de volume esplênico (Chauvin et al., 2009; Vannier et
al., 2008). Os organismos do filo Apicomplexa são caracterizados por apresentar o
complexo apical, um conjunto de organelas (roptrias, micronemas e conoides) que
estão envolvidos com os processos de adesão e invasão na célula hospedeira
(Roos, 2005; Striepen et al., 2002; Sibley, 2004). Além disso, a maioria destes
protozoários apresenta duas organelas contendo genoma próprio, a mitocôndria e o
apicoplasto ou plastídio (Wilson et al., 1997). A mitocôndria possui um genoma
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado 25
concatamérico linear e composto por unidades repetidas em série de 6 kb. Este
genoma caracteriza-se pela presença de apenas três genes, citocromo b, citocromo
oxidase 1 e citocromo oxidase 3, além de sequências fragmentadas de RNA
ribossômico (Hikosaka et al., 2010a,b). O apicoplasto ou plastídio possui um
genoma circular de 35 kb composto por 60 genes: tRNAs, subunidades maior e
menor de rRNA, e genes codificadores de proteínas (Cai et al., 2003; Kalanon et al.,
2010).
O gênero Eimeria foi proposto por Schneider em 1875, levando em
consideração o aspecto morfológico do oocisto esporulado, composto por quatro
esporocistos contendo dois esporozoítos cada um. Acredita-se que Eimeria stiedai
tenha sido um dos primeiros organismos observados no século XVII (1674) por
Leeuwenhoek, quando este pesquisador utilizou seu recém-desenvolvido
microscópio para examinar a bile de coelho (cf. Hammond et al., 1973). Os
organismos do gênero Eimeria pertencem à classe Coccidia, e estão amplamente
distribuídos em uma grande variedade de hospedeiros invertebrados e vertebrados,
de anelídeos a mamíferos (Current et al., 1990; Hammond et al., 1973; Shirley et al.,
2000). Esses protozoários causam de doenças de grande importância econômica
em animais de produção, conhecidas genericamente como coccidioses. Em geral as
enfermidades causadas por parasitas do gênero Eimeria afetam o trato intestinal,
causando enterites de grau variável, podendo variar de lesões quase imperceptíveis
até danos significativos e profundos na mucosa, podendo levar a hemorragias e
necrose. Em geral a morbidade da doença é muito alta em animais confinados, mas
a mortalidade é relativamente baixa, geralmente associada a infecções bacterianas
secundárias. Algumas espécies de Eimeria podem colonizar outros órgãos além do
intestino, como no caso de E. stiedai de coelho, que coloniza o epitélio dos dutos
biliares, causando lesões hepáticas (Pakandl, 2009).
Os protozoários do gênero Eimeria possuem um ciclo de vida bastante
complexo, com fases de reprodução assexuada e sexuada. Esses parasitas se
caracterizam por apresentar um ciclo de vida monoxênico e, em geral, uma alta
especificidade de hospedeiros. Assim um hospedeiro pode se infectado por mais de
uma espécie de Eimeria, mas a maioria das espécies conhecidas do gênero
somente infecta uma única espécie de hospedeiro (Hammond et al., 1973; Shirley et
al., 2005).
Ursula Castro de Oliveira Introdução 26
1.1.2 Ciclo de vida dos parasitas do gênero Eimeria
O ciclo de vida de parasitas do gênero Eimeria inicia-se pela ingestão de um
oocisto esporulado por um hospedeiro susceptível. Em aves como a galinha
doméstica (Gallus gallus), a parede do oocisto é rompida mecanicamente pela ação
da musculatura da moela e da abrasão de detritos ingeridos. Em mamíferos, a
simples digestão por proteases como a tripsina e sais biliares é capaz de
desencadear a ruptura da parede do oocisto, liberando os esporocistos. No intestino
delgado dos hospedeiros aves ou mamíferos, os esporozoítos, na presença de
tripsina e sais biliares, sofrem um processo denominado excistação, pelo qual os
parasitas exteriorizam-se ativamente. Uma vez liberados, os esporozoítos invadem
células epiteliais do intestino e células da lâmina própria. Esta invasão pode ocorrer
no próprio sítio da colonização (que é específico para cada espécie de Eimeria).
Alternativamente, pode ocorrer uma migração posterior dos esporozoítos através da
mucosa para o local específico de seu desenvolvimento.
Em sítios específicos do intestino, os esporozoítos invadem as células da
mucosa e se diferenciam em esquizontes ou merontes. Os esquizontes realizam
uma reprodução assexuada através de multiplicação por fissão múltipla
(esquizogonia ou merogonia). Após o amadurecimento dos esquizontes, ocorre sua
ruptura e a consequente liberação de formas merozoítas na luz intestinal, os quais
podem infectar novas células do hospedeiro. Algumas espécies invadem células
linfoides intraepiteliais e são transportados até o sítio final de colonização através da
lamina propria.
Após um ou mais ciclos de esquizogonia, o parasita sofre uma diferenciação
para macrogametócitos e microgametócitos. Os microgametócitos se rompem e
liberam os microgametas, formas biflageladas capazes de se locomover até os
macrogametas, fecundando-os e produzindo zigotos. Cada zigoto resulta na
formação de um oocisto não esporulado, e este é o único estágio do ciclo de vida no
qual o parasita é diplóide. Após a ruptura das células intestinais, os oocistos não
esporulados são eliminados no ambiente juntamente com as fezes. Esta forma do
parasita, contudo, não é infectante. Em condições adequadas de temperatura,
umidade e oxigenação, o oocisto não esporulado sofre uma meiose seguida de duas
mitoses, gerando um oocisto esporulado. Esse processo de reprodução assexuada
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado 27
é denominado esporogonia ou esporulação. O oocisto esporulado e infectante, e
possui no seu interior quatro esporocistos contendo dois esporozoítos cada um. O
ciclo de vida é completado quando um novo hospedeiro não imune ingere o oocisto
esporulado (Hammond et al., 1973, McDougald et al., 1997; Min et al., 2004; Shirley
et al., 2005).
1.2 A coccidiose em coelho (Oryctolagus cuniculus) e galinha (Gallus gallus)
1.2.1 Características das espécies de Eimeria de coelho doméstico (Oryctolagus
cuniculus)
Um total de onze espécies de Eimeria podem infectar o coelho doméstico
(Oryctolagus cuniculus): E. coecicola (íleo e ceco), E. exigua (íleo), E. flavescens
(jejuno e íleo), E. intestinalis (íleo, ceco e colón), E. irresidua (íleo), E. magna (jejuno
e íleo), E. media (duodeno e jejuno), E. perforans (jejuno), E. piriformis (ceco, colón
e reto), E. stiedai (dutos biliares) e E. vejdovskyi (íleo) (Courdet et al., 1979;
Jelínková et al., 2008; Licois et al., 1992; Licois et al., 1995; Norton et al., 1979;
Owen, 1970; Pakandl, 1988; Pakandl, 1989; Pakandl e Jelínková, 2006). Uma
característica única das espécies de Eimeria que infectam o coelho doméstico é a de
possuir merozoítos polinucleados (exceto E. irresidua), mas não se sabe ao certo a
função deste estágio (Pakandl, 2009). O período de pré-patência pode variar entre
4,5 a 14 dias, para E. media e E. stiedai, respectivamente. A infecção mais severa é
causada por E. intestinalis e E. flavescens que resultam em inibição do crescimento,
piora da conversão alimentar, diarréia severa, e podem gerar altos índices de
mortalidade. E. coecicola, por outro lado, é considerada uma espécie pouco
patogênica, e o animal infectado não apresenta sinais clínicos da doença (Hammond
et al., 1973; Pakandl, 2009).
A imunidade desenvolvida é espécie-específica, ou seja, o animal infectado
com uma espécie torna-se imune somente para infecções com parasitas da mesma
espécie. Os animais mais novos não são protegidos pelos anticorpos maternos
presentes no leite, mas somente se tornam susceptíveis 21 dias após o nascimento,
Ursula Castro de Oliveira Introdução 28
enquanto que os animais mais velhos são mais sensíveis à infecção (Pakandl et al.,
2007; Pakandl et al., 2008a,b). Rose (1973) sugeriu que a imunidade dos animais
mais jovens era devida à presença de ácido para-aminobenzóico (PABA) no leite
materno. Dürr et al. (1969) determinaram que a infecção de animais mais jovens
(menos de 21 dias) é menos eficiente por algum mecanismo relacionado ao bloqueio
da excistação, fato confirmado por Pakandl et al. (2007) e Pakandl et al. (2008b).
Animais com idade superior a 21 dias, mesmo que ainda sob aleitamento, mas que
já tenham iniciado a ingestão de outro tipo de alimento, teriam o ambiente do seu
trato gastrintestinal alterado, permitindo a excistação dos esporozoítos e posterior
invasão das células do epitélio intestinal.
1.2.2 Características das espécies de Eimeria de galinha doméstica (Gallus gallus)
Existem sete diferentes espécies de Eimeria que causam a coccidiose em
galinha doméstica: E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E.
praecox e E. tenella. As espécies mais relevantes em termos dos prejuízos
econômicos que causam na produção avícola são E. tenella, a E. maxima e a E.
acervulina (Shirley et al., 2004). Semelhantemente ao observado em Eimeria de
coelho, os locais de infecção são específicos para cada espécie. Assim, E.
acervulina e E. praecox infectam a porção anterior do intestino delgado, E. maxima e
E. necatrix infectam a porção média do intestino delgado, sendo que em E. necatrix
a terceira esquizogonia e a gametogonia ocorre nos cecos. A E. tenella infecta os
cecos. Em E. brunetti a infecção inicia-se no terço médio do intestino delgado, mas a
gametogonia ocorre na porção posterior do intestino delgado entre a região ileocecal
e o reto. E. mitis infectam a porção inferior do intestino delgado (Tyzzer, 1929;
Levine, 1942; Levine, 1961). A patogenicidade também varia quanto à espécie,
sendo que E. tenella e E. necatrix são as mais patogênicas, enquanto E. mitis é a
menos patogênica (Long et al., 1984; Eckert et al., 1995). Os prejuízos diretos
causados pela coccidiose aviária incluem o menor ganho de peso, aumento de
mortalidade, aumento de infecções secundárias e custos com o tratamento com
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado 29
quimioterápicos. Os custos indiretos estão relacionados com o uso de drogas e/ou
vacinas na prevenção da infecção (Shirley et al., 2005).
A imunidade é espécie específica onde antígenos únicos a cada espécie e a
cada estágio do ciclo de vida forneceram diferentes informações ao sistema imune
do hospedeiro. Um hospedeiro infectado com uma determinada espécie está
protegido (imune) a uma nova infecção por aquela mesma espécie e cepas
derivadas desta espécie, com exceção de E. maxima. Essa espécie de Eimeria de
galinha, é a mais imunogênica, tendo sido demonstrado que uma infecção com
apenas 25 oocistos é capaz de conferir imunidade protetora (Long e Millard,1979b).
Contudo, E. maxima, comparada com as outras espécies de Eimeria de galinha,
apresenta um menor grau de proteção cruzada entre cepas. Essa característica é
devida à maior diversidade antigênica observada nessa espécie (Fitz-Coy, 1992;
Long e Millard, 1979b; Martin et al., 1997; McDonald et al., 1986; Norton e Hein,
1976; Shirley e Bellatti, 1988). As respostas imunológicas das diferentes cepas
foram estudadas frente ao posterior desafio de galinhas imunizadas com cepas
heterólogas (Long e Millard,1979b; Martin et al., 1997), tendo sido observado que as
cepas somente conferem imunidade total contra infecções homólogas. Em
infecções heterólogas, o grau de proteção observado é de grau variável. Além disso,
também foi demonstrado que a linhagem de galinha utilizada nos experimentos tem
influência na resposta imune para as infecções com E. maxima (Smith et al., 2002).
1.2.3 Formas de controle da coccidiose
Os principais métodos de controle da coccidiose são o uso preventivo de
drogas anticoccidianas na ração animal, e a vacinação com cepas vivas dos
parasitas. O uso de doses sub-ótimas de anticoccidianos misturados à ração elimina
a maior parte da população dos parasitas, mas mantém ainda uma pequena fração
de parasitas viáveis. Estes parasitas são capazes de infectar o hospedeiro e induzir
uma resposta imune protetora, mas devido à baixa carga infectante, ou por um
processo de atenuação, não causam sinais clínicos ou perdas na produtividade. No
caso da vacinação, os produtos comercialmente disponíveis são formulados com
Ursula Castro de Oliveira Introdução 30
suspensões de oocistos viáveis de uma combinação de espécies. Existem dois tipos
de formulações vacinais: as vacinas compostas por cepas virulentas utilizadas em
baixa dose, e aquelas compostas por cepas selecionadas para o caractere de
precocidade, as quais têm uma atenuação da virulência (Chapman et al., 2002;
Dalloul e Lillehoj, 2005; Shirley et al., 2007).
As cepas precoces são selecionadas para o desenvolvimento de um ciclo de
vida precoce, isto é, para um período de pré-patência mais curto. O processo de
seleção consiste na coleta dos primeiros oocistos eliminados na patência e uma
subsequente passagem em novos animais para propagação. Repetindo-se essa
abordagem seguidamente, consegue-se reduzir gradualmente o período de pré-
patência a cada passagem, até a estabilização em desse período. O encurtamento
do período pré-patente ocorre devido a uma redução de um ou mais ciclos de
esquizogonia durante a fase assexuada da infecção intestinal, reduzindo-se assim o
grau de multiplicação dos parasitas e, por consequência, gerando lesões muito mais
leves no hospedeiro (Jeffers, 1975; McDougald e Jeffers, 1976). O objetivo final é,
novamente, se obter uma infecção ativa pouco patogênica, mas efetiva do ponto de
vista de geração de imunidade. Vários produtos comerciais estão atualmente
disponíveis no mercado internacional e no Brasil, tanto com o uso de cepas
virulentas em baixas doses, quanto com o uso de cepas precoces.
Das espécies de Eimeria de coelho doméstico, existem somente seis
espécies para as quais foram desenvolvidas cepas precoce: E. coecicola (Courdet et
al., 1995), E. flavescens (Pakandl, 2005), E. intestinalis (Licois et al., 1990), E.
magna (Licois et al., 1995), E. media (Licois et al., 1994) e E. piriformis (Pakandl e
Jelínková, 2006). Existem algumas diferenças na obtenção das cepas precoces de
coccídeos de galinha e coelho. Diferentemente do observado em Eimeria de galinha,
algumas diferenças morfológicas podem ser evidenciadas entre as cepas parentais
e precoces de Eimeria de coelho (Pakandl et al., 2001). Uma das características do
oocisto esporulado de cepas precoces é a presença do corpo refrátil nos
esporocistos. Nos oocistos esporulados das cepas precoces de E. magna e E.
media o corpo refrátil é maior do que nas cepas parentais. No caso de E. intestinalis,
dois dos quatro esporocistos apresentam o corpo refrátil maior que o da cepa
parental, enquanto os outros dois esporozoítos não os possuem. Essas diferenças
morfológicas permitem a diferenciação de cepas precoces das parentais através de
características morfológicas (Pakandl et al., 2001; Pakandl, 2009). Mesmo
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado 31
apresentando estas diferenças morfológicas, as cepas precoces e parentais de
Eimeria de coelho não apresentaram diferenças de padrões de bandas em estudos
de RAPD (Ceré et al., 1997).
O controle da infecção por Eimeria em coelhos de produção é essencialmente
feito através do uso de quimioterápicos como a sulfadimetoxina e toltrazuril, sendo
também comum o uso de antibióticos ionóforos como salinomicina, monensina e
lasalocida. A sulfadimetoxina atua inibindo a recaptura de ácido fólico e ácido para-
aminobenzóico, consequentemente bloqueando a síntese de pirimidinas (Pakandl,
2009). O toltrazuril é um anticoccidiano de amplo espectro usado em coelhos, é
efetivo nos estágios de esquizontes e gamontes (Peeters et al., 1986). Os ionóforos
(salinomicina, monensina e lasalocida) são moléculas que perturbam o transporte de
íons através da membrana celular, aumentando a permeabilidade celular, sendo a
salinomicina mais eficiente na redução da produção de oocistos em coelhos
(Pakandl, 1986). Testes laboratoriais utilizando cepas precoces foram feitos para
visando o desenvolvimento de uma vacina viva para o controle da coccidiose em
coelhos, mas não existe até o presente momento nenhum produto comercial
disponível (Pakandl, 2009). De fato, testes preliminares com vacinas de cepa
precoces em Eimeria de coelho doméstico foram descritas para E. magna, onde
animais imunizados com oocistos da cepa precoce mostraram-se imunes à infecção
com a cepa parental, com redução da perda de peso e diminuição da excreção de
oocistos. Para E. magna foram feitos experimentos de dispersão de oocistos da
cepa precoce nas gaiolas de criação. Uma dose de quarenta mil oocistos para
coelhos com idade de 25 dias mostrou-se eficiente. Os animais vacinados não
tiveram perda de peso significativa e a excreção de oocistos diminuiu (Drouert-Viard
et al.,1997a,b).
Outra forma de controle seria o uso de vacinais de subunidades. Contudo,
pouco foi desenvolvido nesta área para Eimeria de coelho. Hanada et al. (2003a,b)
descreveram um antígeno solúvel encontrado na bile de coelhos infectados com
Eimeria stiedai, com tamanho de 49 kDa, localizado no micronema, e específico de
merozoítos. Infecções experimentais realizadas com animais imunizados com esse
antígeno demonstraram uma redução da eliminação de oocistos e da quantidade de
parasitas encontrados nos dutos biliares (Hanada et al., 2003a,b).
Ursula Castro de Oliveira Introdução 32
1.3 Diagnóstico de parasitas do gênero Eimeria
1.3.1 Diagnóstico das espécies de Eimeria de galinha doméstica
A identificação das espécies de Eimeria tem sido classicamente feita
utilizando-se como parâmetros a espécie do hospedeiro, o local da infecção, aspecto
das lesões, período de pré-patência, período mínimo de esporulação, morfologia do
oocisto esporulado, proteção cruzada, entre outros. Contudo, as características
biológicas listadas acima podem apresentar sobreposição entre as espécies. Assim,
vários grupos de pesquisa passaram a desenvolver ensaios moleculares para a
discriminação de espécies e cepas do parasita. Para a identificação de Eimeria de
galinha doméstica, foram desenvolvidos vários testes. A análise eletroforética de
isoenzimas foi uma das primeiras formas de identificação inter e intra-específica
(Shirley, 1975; Shirley, 1978). A separação de proteínas por eletroforese em SDS-
PAGE foi outra técnica utilizada para a discriminação das espécies de Eimeria de
galinha (Sutton et al., 1989; Eckert et al., 1995). Com o avanço das técnicas de
biologia molecular, vários outros testes foram desenvolvidos. A análise de
polimorfismo de fragmentos de DNA gerados pela ação de enzimas de restrição, o
RFLP (polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição), permitiu identificar
três espécies, E. tenella, E. acervulina e E. necatrix, e algumas cepas de E. tenella
(Ellis e Bumstead, 1990; Shirley, 1994).
Técnicas moleculares baseadas na reação em cadeia da polimerase, a PCR,
permitiram o avanço dos testes diagnósticos. Apenas uma pequena quantidade de
DNA é necessária para que um determinado produto seja amplificado
exponencialmente e de forma específica, fazendo com que a sensibilidade seja
muito maior do que a obtida em outras técnicas (Mullis e Faloona, 1987). Stucki et
al. (1993), utilizando como alvo um fragmento de 560 pb da região intergênica do
gene da subunidade ribossômica 5S, desenvolveram um ensaio eficiente para a
detecção de E. tenella. Outra técnica que foi utilizada no diagnóstico molecular de
espécies de Eimeria que infectam a galinha doméstica foi o RAPD (polimorfismo de
DNA amplificado randomicamente). Essa técnica, diferentemente de outras, não
exige o conhecimento prévio de qualquer informação do genoma do organismo. O
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado 33
RAPD é uma técnica baseada em PCR que utiliza iniciadores arbitrários (geralmente
decâmeros) em condições de baixa estringência. O resultado obtido é um perfil de
bandas específico daquela espécie, conhecido como impressão digital de DNA (DNA
fingerprinting). Esses perfis permitem diferenciar espécies e até mesmo cepas.
Ensaios de RAPD demonstraram, conforme esperado, que o polimorfismo entre
espécies é bastante superior ao observado entre cepas (Procunier et al., 1993).
Contudo, a técnica permite a diferenciação de cepas de uma mesma espécie
(Fernandez et al., 2003a; Shirley e Bumstead, 1994).
O primeiro ensaio molecular baseado em PCR com iniciadores específicos,
capaz de identificar cada uma das sete espécies de Eimeria que infectam a galinha
doméstica, foi descrito por Schnitzler et al. (1998, 1999). Esse ensaio molecular
utilizou como alvo o ITS1 (espaçador interno transcrito 1) do cistron de RNA
ribossômico. Foi demonstrado que o ITS1 possui variações interespecíficas que
permitiram discriminar as sete espécies de forma específica e com alta sensibilidade.
Recentemente, a mesma abordagem foi feita para 6 espécies de Eimeria que
infectam os bovinos (Kawahara et al., 2010).
O nosso grupo desenvolveu ensaios diagnósticos para as sete espécies de
Eimeria de galinha baseados em RAPD (Fernandez et al., 2003a). Em um trabalho
posterior, as bandas espécie-específicas tiveram seu DNA extraído e sequenciado e,
a partir desses dados, foi possível desenvolver um conjunto de marcadores SCAR
(Sequence Characterized Amplified Region), os quais são altamente específicos e
reprodutíveis (Fernandez et al., 2004). Além disso, a partir de sete marcadores
SCAR, específicos para cada uma das espécies de Eimeria de galinha, foi
desenvolvido um ensaio de PCR multiplex (Fernandez et al., 2003b). Nesse ensaio,
todas as espécies podem ser detectadas e identificadas em uma reação conjunta
realizada em um único tubo, facilitando enormemente o diagnóstico de amostras de
campo. Além dos métodos moleculares de diagnóstico, nosso grupo também
desenvolveu um sistema de identificação de oocistos de Eimeria de galinha baseado
em reconhecimento de padrões de imagem (Castañón et al., 2007). Foram
consideradas várias características morfológicas do oocisto esporulado como a
curvatura, tamanho e estruturas internas, para diferenciar as sete espécies de
Eimeria que infectam a galinha doméstica. Assim foi criada uma interface web na
qual o usuário pode submeter fotos de amostras para análise e diagnóstico de
Ursula Castro de Oliveira Introdução 34
espécies de Eimeria de galinha e de coelho em tempo real
(http://www.coccidia.icb.usp.br/ uploadoocyst/uploadimg.php).
Para a análise quantitativa, Blake et al. (2008) descreveram o primeiro ensaio
de PCR em tempo real para a detecção e quantificação de amostras de E.
acervulina, E. maxima, E. necatrix e E. tenella, espécies que infectam a galinha
doméstica. Os autores utilizaram como sequências-alvo uma região do gene que
codifica a proteína de micronema 1 (Blake et al., 2006), e sequências espécie-
específicas de SCARs que haviam sido previamente descritas pelo nosso grupo
(Fernandez et al., 2004). Vrba et al. (2010) desenvolveram um teste de PCR em
tempo real para as outras quatro espécies de Eimeria completando o trabalho inicial
de Blake et al. (2008). Este trabalho também utilizou sequências espécie-específicas
de SCARs (Fernandez et al., 2004). Kawahara et al. (2008) descreveram uma PCR
em tempo real para a identificação e quantificação de cinco espécies de Eimeria de
galinha: E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. necatrix e E. tenella. Como alvo
foram usadas sequências do ITS1, exceto para E. maxima, onde os autores
modificaram os iniciadores previamente desenvolvidos por Lew et al. (2003).
Kirkpatrick et al. (2009) apresentaram um novo método baseado no ITS2 de rRNA
para a detecção e identificação das sete espécies de Eimeria de galinha, utilizando
PCR em tempo real com posterior separação dos produtos em eletroforese capilar e
análise da curva de melting de alta resolução. Morgan et al. (2009) desenvolveram
sete ensaios de PCR em tempo real para a detecção e quantificação das espécies
de Eimeria que infectam a galinha doméstica na Austrália, a partir de amostras de
fezes, usando como alvo a região do ITS2.
1.3.2 Diagnóstico das espécies de Eimeria de coelho doméstico
O diagnóstico das espécies de Eimeria de coelho tem sido feito classicamente
através da morfologia dos oocistos e parâmetros biológicos da infecção,
semelhantemente ao procedimento descrito acima para as espécies que infectam a
galinha. Em termos diagnóstico molecular, contudo, não existe até o presente
momento nenhum método disponível para a detecção e identificação das onze
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado 35
espécies de Eimeria de coelho doméstico. Ceré et al. (1995) descreveram um teste
de RAPD para nove espécies, incluindo quatro cepas de E. media e duas de E.
intestinalis, não tendo sido incluídas no estudo as espécies E. stiedai e E. irresidua.
A técnica do RAPD permitiu distinguir as nove espécies, porém, dado o alto grau de
semelhança entre os perfis de amplificação devido ao baixo polimorfismo, diferentes
cepas somente puderam ser divididas em dois grupos. O mesmo já havia sido
observado em espécies de Eimeria de galinha doméstica para cepas de E. tenella e
E. acervulina (Procunier et al., 1993). Ceré et al. (1996) também desenvolveram
marcadores espécie-específicos para a identificação e diagnóstico de E. media
através de RAPD. A marcação com digoxigenina e posterior hibridização aumentou
consideravelmente a sensibilidade para amostras com poucos oocistos em amostras
coletadas diretamente das fezes. Uma comparação por RAPD de cepas precoces
com as parentais para E. magna e E. intestinalis não identificou nenhuma diferença
entre essas cepas (Ceré et al., 1997). O RAPD, embora seja uma técnica
relativamente fácil e que não requer conhecimento prévio da sequência dos DNAs
alvo, apresenta uma série de desvantagens para fins de diagnóstico, especialmente
para uso universal. Como a técnica utiliza iniciadores arbitrários em baixa
estringência a reprodutibilidade é muito baixa. Assim, enzimas de amplificação e
termocicladores de marcas diferentes podem resultar em perfis de amplificação
muito discrepantes, ainda que os iniciadores e condições de ciclagem sejam os
mesmos. Isso significa que a técnica funciona razoavelmente bem dentro de um
mesmo laboratório, mas é de difícil aplicação entre laboratórios distintos. Outro
aspecto bastante negativo da técnica é que, ao invés de uma PCR convencional que
gera um único produto de amplificação, o RAPD resulta em um perfil de múltiplas
bandas. Isso é particularmente desvantajoso em amostras mistas, uma vez que a
sobreposição de bandas impede a correta identificação das espécies presentes.
Os genes ribossômicos nucleares ou genes de rRNA de eucariotos são
compostos de repetições arranjadas em repetições seriadas (tandem). Cada uma
destas repetições contém as subunidades de rRNA 18S, 5.8S e 28S, além dos
espaçadores externos transcritos ETS1 e ETS2 e espaçadores internos transcritos
ITS1 e ITS2. As subunidades pequena (SSU ou 18S) e grande (LSU ou 28S) do
rRNA têm sido empregadas para análises filogenéticas de espécies devido ao seu
alto grau de conservação em organismos ao longo de toda a escala evolutiva. As
regiões espaçadoras, por outo lado, não serem utilizadas funcionalmente, não
Ursula Castro de Oliveira Introdução 36
sofrem grande pressão de seleção e apresentam, portanto, maior grau de
divergência. Essas regiões são mais indicadas para estudos de populações, usando-
se as variações intra-específicas como caracteres discriminantes. Outra aplicação
dos ITSs é no desenvolvimento de ensaios diagnósticos por PCR. Utilizando-se, por
exemplo, iniciadores dirigidos contra as regiões flanqueadoras do ITS1, presentes
em regiões altamente conservadas das subunidades SSU (18S) e 5.8S, consegue-
se amplificar com sucesso o ITS1 de muitas espécies, e até mesmo de gêneros
distintos. Uma vez sequenciados os produtos de amplificação, pode-se desenhar
pares de iniciadores específicos para uma ou mais espécies em estudo. Essa
abordagem foi utilizada com sucesso para o desenvolvimento de ensaios
diagnósticos em vários organismos, incluindo as sete espécies de Eimeria de
galinha doméstica (Schnitzler et al., 1998; Schnitzler et al., 1999).
Os dados de sequenciamento do genoma de Eimeria tenella indicam que o
cistron ribossômico apresenta cerca de 140 cópias
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/E_tenella/), o que o torna um excelente alvo para
amplificação com uma boa sensibilidade de detecção. Dada a importância da
coccidiose na criação de coelhos, e a ausência de ensaios moleculares para
diagnóstico que permitam a detecção e discriminação das onze espécies de Eimeria
de coelho doméstico, decidimos desenvolve no presente trabalho um conjunto de
ensaios moleculares baseados em PCR para as onze espécies de Eimeria de
coelho, utilizando o ITS1 como alvo de amplificação.
1.4 Filogenia molecular do gênero Eimeria
Para o gênero Eimeria existem poucos estudos de filogenia molecular que
demonstram as relações evolutivas entre as espécies. Reduker et al. (1987)
realizaram um estudo pioneiro baseado em análises cladística e fenética, no qual os
autores utilizaram um conjunto de características morfológicas dos oocistos, história
de vida dos parasitas e padrões isoenzimáticos. Os resultados permitiram agrupar
as diferentes espécies de Eimeria de quatro gêneros de roedores cricetídeos em
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado 37
dois clados. Esses clados podiam estar associados à presença ou ausência de um
corpo residual no oocisto. Kheysin (1971) descreveu este resíduo como sendo um
grânulo de lipídeos que é eliminado do citoplasma do zigoto durante o processo de
esporogonia. Contudo, algumas espécies de Eimeria possuem este resíduo
enquanto outras não, e sua função ainda é desconhecida. As espécies de Eimeria
de galinha não possuem esse resíduo de oocisto. Outros grupos, utilizando dados
moleculares, também observaram a correlação de espécies de Eimeria de roedores
filogeneticamente relacionadas com o caractere do resíduo do oocisto.
Zhao e Duszynski (2001a) utilizaram sequências da SSU de rRNA nuclear e
da ORF470 de apicoplasto para estudar as relações filogenéticas entre dez espécies
de Eimeria que infectam roedores silvestres, e sua correlação com a morfologia do
oocisto esporulado e a especificidade de hospedeiro. As árvores obtidas nesse
estudo, com ambos os marcadores, mostraram o agrupamento dessas espécies em
dois clados, cujos oocistos esporulados apresentavam ou não a presença do
resíduo. Como o agrupamento das espécies de Eimeria mostrou correlação com
esta característica morfológica, e não pelos respectivos hospedeiros, os
pesquisadores concluíram que as diferenças morfológicas, mais do que a
especificidade de hospedeiro, estariam associadas a essas duas linhagens. Em
outro estudo (Zhao e Duszynski, 2001b), os autores utilizaram a LSU de rRNA de
apicoplasto e a SSU de rRNA nuclear para analisar as relações filogenéticas entre
16 espécies de Eimeria que infectam roedores. Assim como no primeiro trabalho
(Zhao e Duszinski, 2001a), as relações estre as espécies foram comparadas quanto
à especificidade de hospedeiro e caracteres morfológicos do oocisto esporulado.
Nesse estudo, as árvores obtidas refletiram, novamente, dois clados, um contendo
as espécies que possuem oocisto com resíduo e outro sem resíduo. Desta forma,
Zhao e Duszynski (2001b) argumentam que o resíduo de oocisto seria um caractere
morfológico altamente associado com as relações filogenéticas entre as espécies de
Eimeria de roedores.
Zhao et al. (2001) utilizaram sequências parciais da SSU de rRNA nuclear e
LSU de rRNA de apicoplasto para estudar a relação filogenética entre duas espécies
de Eimeria de morcegos (E. antrozoi e E. rioarribaensis) e cinco espécies de Eimeria
de roedores. As árvores filogenéticas obtidas com a análise dos dois marcadores
moleculares, individuais ou concatenados, mostraram que as espécies de Eimeria
de roedores não formam um grupo monofilético em relação aos seus hospedeiros.
Ursula Castro de Oliveira Introdução 38
As espécies de Eimeria de morcegos agruparam-se com espécies de Eimeria de
roedores morfologicamente similares. Segundo os autores, estes resultados
sugerem que as espécies de Eimeria de morcegos teriam divergido das espécies de
Eimeria de roedores como resultado de transferência lateral deste parasita entre
estes hospedeiros.
Barta et al. (1997) usaram a SSU de rRNA para estudar as relações
filogenéticas de espécies de Eimeria de galinha doméstica. Esse estudo demonstrou
que E. tenella e E. necatrix formam um clado separado das outras espécies, com
alto grau de suporte. Esse agrupamento pode ser correlacionado com algumas
características biológicas dessas espécies, como a sua alta patogenicidade, a forma
e tamanho semelhante de seus oocistos, a geração de enterites hemorrágicas e
colonização dos cecos. As outras cinco espécies que infectam o trato intestinal
superior foram agrupadas em três clados, um somente com E. acervulina; o segundo
com E. brunetti, E. maxima e E. praecox; e o último com E. mitis e E. mivati, uma
espécie cuja validade é controversa. Contudo, o suporte da árvore obtida foi alto
somente na definição do nó entre os ramos de E. tenella e E. necatrix. Os demais
nós entre as outras cinco espécies apresentaram menores valores de suporte.
Morrison et al. (2004) utilizaram a SSU de rRNA nuclear para a reconstrução
filogenética de um grande número de organismos da classe Coccidia. Neste estudo,
observaram que na família Eimeriidae a SSU de rRNA apresenta uma baixa
variabilidade, comparado com outras famílias (Sarcocystidae) da classe Coccidia.
Essa pequena variabilidade resulta em um sinal filogenético fraco, o que pode
explicar os baixos níveis de suporte observados em vários nós das árvores. O baixo
sinal filogenético da SSU de rRNA foi observado mesmo quando o alinhamento
múltiplo de sequências considerou dados da estrutura secundária do rRNA. Entre as
sugestões desses autores para melhorar a congruência das árvores filogenéticas
estava o uso de outros marcadores como genes codificadores de proteínas.
(Morrisson et al., 2004).
Recentemente, a reconstrução filogenética das onze espécies de Eimeria de
coelho também foi feita usando-se a SSU de rRNA (Kvičerová et al., 2008).
Semelhantemente ao que foi observado para Eimeria de roedores (Zhao et al., 2001;
Zhao e Duszynski, 2001a,b), as espécies de Eimeria de coelho formaram dois
clados, representando os grupos com e sem o resíduo de oocisto. Nenhuma
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado 39
correlação maior, contudo, pôde ser feita com outras características biológicas,
como sítio da lesão ou período pré-patente.
Power et al. (2009) descreveram estudos filogenéticos entre isolados de E.
trichosuri, uma espécie de Eimeria de marsupial, (gambá - Thricosurus vulpecula) e
outras espécies de Eimeria de mamíferos e aves. Nestes estudos os autores
especularam que as espécies de Eimeria de galinha originaram-se a partir de
espécies de Eimeria de mamíferos placentários. Além disso, também sugeriram que
as espécies de Eimeria teriam co-evoluído com seus hospedeiros.
Na inferência filogenética de uma dada espécie não é recomendado utilizar
um único gene, mas, sim, um conjunto de genes que reflita melhor a história
evolutiva da espécie. A utilização de apenas um marcador filogenético implica na
obtenção de uma árvore que reflete mais a história evolutiva desse marcador nas
diferentes espécies analisadas, do que a história evolutiva das próprias espécies. O
uso de um maior número de marcadores dilui eventuais variações individuais entre
as taxas de evolução de cada marcador e pode reduzir a incongruência de
topologias entre eles. Desde que um número razoável de marcadores fosse
utilizado, tomando-se o cuidado de não incluir sequências transferidas lateralmente,
as árvores poderiam ser consideradas como árvores filogenéticas das espécies
analisadas (species trees). Rokas et al. (2003) utilizaram genomas de diferentes
espécies do gênero Saccharomyces e selecionaram 106 genes ortólogos para um
estudo filogenético. Os autores concluíram que conjuntos de dados contendo um ou
poucos genes podiam gerar árvores topologicamente incongruentes, ainda que cada
uma delas apresentasse alto suporte. Entretanto, quando os dados utilizados
consistiram de genes concatenados, qualquer combinação de vinte genes resultava
em árvores perfeitamente congruentes e com alto suporte. Essas árvores, portanto,
podiam ser consideradas como árvores de espécies.
Assim, decidimos no presente trabalho estender o estudo das relações
filogenéticas de espécies do gênero Eimeria utilizando todas as espécies conhecidas
do parasita de um hospedeiro ave (galinha) e de um mamífero (coelho). Visando
ainda obter árvores com maior suporte, que reflitam melhor a evolução das espécies
do parasita, decidimos empregar um conjunto de quatro marcadores moleculares
distintos, originados de três compartimentos celulares: núcleo, mitocôndria e
apicoplasto.
2 OBJETIVOS
Ursula Castro de Oliveira Objetivos
41
2.1 Objetivos genéricos
Desenvolver ensaios moleculares para a discriminação das onze espécies de
Eimeria de coelho;
Realizar estudos de reconstrução filogenética das espécies de Eimeria de
coelho e de galinha utilizando múltiplos marcadores, visando uma melhor
compreensão das relações evolutivas entre esses organismos.
2.2 Objetivos específicos
Desenvolver um sistema de diagnóstico por PCR das onze espécies de
Eimeria de coelho doméstico (Oryctolagus cuniculus) e realizar testes de
validação quanto à especificidade e sensibilidade dos ensaios;
Amplificar e determinar a sequência nucleotídica de marcadores moleculares
de espécies de Eimeria de coelho (SSU de rRNA nuclear, LSU de rRNA e
ORF470 de plastídio, e citocromo b mitocondrial) e de galinha (LSU rRNA e
ORF470 de apicoplasto)1;
Realizar análises filogenéticas, procurando responder as seguintes questões:
o Quais aspectos biológicos apresentam maior associação com as
relações filogenéticas das espécies de Eimeria: morfologia do oocisto
do parasita, especificidade do hospedeiro, ou o habitat dos
hospedeiros e seus parasitas?
1 No caso de Eimeria de galinha, foram usadas sequências da SSU de rRNA (18S), disponíveis
publicamente, e sequências de citocromo b previamente determinadas pelo nosso grupo (Romano, 2004).
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
42
o As árvores filogenéticas de hospedeiros e parasitas podem ser
reconciliadas, implicando num processo de co-evolução?
o Em quais possíveis datas teriam ocorrido as invasões dos hospedeiros
por parasitas do gênero Eimeria?
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
44
3.1 Preparo e tratamento das soluções
Todas as soluções foram preparadas utilizando-se água purificada por
osmose reversa, deionizada e tratada com luz UV através do Sistema RiOs e Milli-Q
Synthesis da Millipore (água Milli-Q). As soluções foram autoclavadas a 121 °C por
20 minutos para a eliminação de possíveis contaminações.
Para reagentes termossensíveis, utilizou-se água previamente autoclavada e
as soluções resultantes foram esterilizadas por filtração (filtro Millex 0,2 m,
Millipore).
3.2 Soluções
- Tampão de Amostra tipo II, 6X concentrado - 15% (p/v) Ficoll (tipo 400) em H2O;
0.25% (p/v) azul de bromofenol; 0,25% (p/v) xileno cianol FF.
- Tampão de amostra 6X concentrado - 15% (p/v) Ficoll (tipo 400) em H2O; 0,25%
(p/v) azul de bromofenol.
- Tampão de Extração - 10 mM Tris-HCl pH 8,0; 50 mM EDTA pH 8,0.
- Tampão de sequenciamento 2,5X concentrado - 200 mM Tris-HCl pH 9,0; 5,0
mM MgCl2.
- TBE 10X concentrado - 900 mM Tris-borato; 20 mM (p/v) EDTA; pH 8,0.
- TE - 10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
45
3.3 Propagação dos parasitas
3.3.1 Amostras de Eimeria de galinha doméstica
Foram utilizadas amostras das sete espécies de Eimeria que infectam a
galinha doméstica, a Tabela 1 indica a origem de cada uma delas. Os parasitas
foram propagados em machos de postura da linhagem Bovans White (Hendrix
Poultry Breeders), cedidos pela Granja Kunitomo (Mogi das Cruzes, SP). Os pintos
de um dia foram alojados em gaiola do tipo bateria, com bebedouro automático e
aquecimento. As aves foram mantidas com água e ração livre de anticoccidianos ad
libitum em ambiente com ventilação constante. Na idade de 3 a 4 semanas, as aves
foram transferidas para uma sala de infecção e alojadas em gaiolas de 50 x 50 x 50
cm na densidade de até 4 aves por gaiola. Cada ave foi infectada com a dose
apropriada (Long et al., 1976) de oocistos esporulados de Eimeria spp. por via oral
até o papo, utilizando-se uma sonda conectada a uma seringa. As fezes,
depositadas sobre folhas de papel, foram coletadas durante o período de patência e
utilizadas para a purificação dos oocistos.
No caso de Eimeria tenella os oocistos foram purificados através do método
utilizado por Long et al. (1976) com algumas variações. Após o sétimo dia de
infecção, as aves foram sacrificadas por deslocamento cervical e os cecos
coletados. Os cecos foram abertos longitudinalmente, a mucosa dos cecos foi
raspada, com auxílio de uma lamínula de vidro, e lavada com água destilada.
3.3.2 Amostras de Eimeria de coelho doméstico
Foram utilizadas amostras das onze espécies de Eimeria de coelho
doméstico. Todas as amostras (Tabela 1) foram cedidas pelo Dr. Michal Pakandl
(Instituto de Parasitologia, Academia de Ciências da República Tcheca), colaborador
científico desse trabalho. As amostras de Eimeria de coelho foram propagadas no
laboratório de origem em coelhos brancos SPF da linhagem New Zealand, criados
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
46
em biotério apropriado. Os animais foram mantidos em ambiente livre de coccídias
com renovação de ar e filtração através de filtros HEPA. Todas as gaiolas, ração e
água foram previamente esterilizadas, tendo sido usada uma ração livre de
anticoccidianos. Para a propagação dos parasitas, os animais foram infectados
oralmente com os oocistos, e as fezes coletadas durante o período de patência de
cada espécie de Eimeria. A manipulação dos animais seguiu as normas do comitê
de ética local da Academia de Ciências da República Tcheca.
Tabela 1 - Origem geográfica das amostras de Eimeria spp. utilizadas neste trabalho.
Amostra/Espécie Origem Geográfica
E. acervulina H Institute for Animal Health, Reino Unido
E. brunetti C São Paulo, Brasil
E. coecicola České Budĕjovice, República Tcheca
E. exígua Nouzilly, França
E. flavescens České Budĕjovice, República Tcheca
E. intestinalis Nouzilly, França
E. irresidua České Budĕjovice, República Tcheca
E. magna Nouzilly, França
E. maxima 191 República Tcheca
E. media Nouzilly, França
E. mitis CR República Tcheca
E. necatrix C São Paulo, Brasil
E. perforans Nouzilly, França
E. piriformis České Budĕjovice, República Tcheca
E. praecox D United States Department of Agriculture – Estados Unidos
E. stiedai České Budĕjovice, República Tcheca
E. tenella H Institute for Animal Health, Reino Unido
E. vejdovskyi České Budĕjovice, República Tcheca
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
47
3.4 Purificação de oocistos e esporulação
3.4.1 Oocistos de Eimeria de galinha doméstica
Para purificação de oocistos de Eimeria spp. de galinha doméstica, as fezes
foram coletadas durante o período de patência para cada espécie. Logo após a
coleta, as fezes foram homogeneizadas em um volume de água destilada,
utilizando-se um agitador mecânico com hélice (tipo naval). Em seguida, as fezes
foram peneiradas através de uma tela de aço inoxidável com malha de 40 mesh
(tamanho de poro aproximadamente 425 m), e lavadas por 3 a 4 vezes com volume
de água destilada.
Os oocistos foram então purificados empregando-se um método de flutuação
em solução salina (Long et al., 1976). O material purificado foi então centrifugado a
2.000 g por 5 minutos, sem desaceleração (centrífuga Sorvall, modelo Super T-21,
rotor ST-H750). Em seguida o sobrenadante foi descartado e o sedimento
ressuspenso em solução salina saturada. Após uma nova centrifugação a 2.000 g
por 5 minutos, a fase superior constituída de oocistos foi cuidadosamente removida
com uma seringa com agulha 40x12 mm. Os oocistos obtidos foram diluídos em
água e sedimentados através de centrifugação nas mesmas condições acima
descritas.
No caso de E. tenella, as aves infectadas foram sacrificadas 168 horas após a
infecção e os oocistos foram obtidos através de raspagem da mucosa dos cecos
com lamínula de vidro e água destilada. Em seguida, o material foi peneirado em
uma tela de aço inoxidável de 40 mesh para remoção de debris. A suspensão de
oocistos foi então centrifugada a 2.500 g por 5 minutos.
Após a purificação, os oocistos foram ressuspensos em solução 2% (p/v) de
dicromato de potássio para uma concentração final de 5 x 105 oocistos/mL. A
esporulação foi realizada à temperatura de 28 oC em uma câmara de incubação
B.O.D. (modelo 347CD, Fanem, Brasil). Os oocistos foram mantidos sob oxigenação
forçada, através de borbulhamento de ar por 72 horas. Em seguida, o volume foi
reduzido e as amostras de oocistos foram estocadas a 4 oC.
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
48
3.4.2 Oocistos de Eimeria de coelho doméstico
Assim como na etapa de propagação (item 3.3.2) a purificação dos oocistos
das espécies de Eimeria de coelho foi realizada pelo Dr. Michal Pakandl (Academy
of Sciences, República Tcheca) seguindo-se o protocolo descrito por Coudert et al.
(1995). O sedimento contendo os oocistos foi ressuspenso em solução 2% (p/v) de
dicromato de potássio para uma concentração máxima de 1 x 106 oocistos/mL. Os
oocistos obtidos de cada uma das espécies foram esporulados a 26 oC por 24 horas
para E. exigua e E. perforans e 48 horas para as demais nove espécies
(considerando 80% de oocistos esporulados). Ao contrário das espécies de Eimeria
de galinha, a temperatura deve ser menor que 28 °C para não comprometer a
viabilidade dos oocistos (Coudert et al., 1995). A esporulação foi feita em um banho
termostatizado com agitação.
3.5 Tratamento dos oocistos com hipoclorito de sódio
Visando a remoção de impurezas e bactérias contaminantes, as amostras
foram tratadas com hipoclorito de sódio. Para isso, a suspensão de oocistos foi
centrifugada a 3.500 g por 5 minutos e o sedimento lavado duas vezes com água
destilada para a remoção do dicromato de potássio. Em seguida, o sedimento foi
ressuspenso em 10 mL de hipoclorito de sódio 10-12% (cloro ativo) e incubado por
10 minutos em gelo. Após este período, a amostra foi diluída 10 vezes em água
destilada, centrifugada e lavada por pelo menos três vezes nas mesmas condições
citadas acima.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
49
3.6 Purificação do DNA genômico das espécies de Eimeria de galinha e coelho
Para a purificação do DNA das espécies de Eimeria de coelho, os oocistos
foram ressuspensos em tampão de extração (Tris-HCl 10 mM pH 8.0; EDTA 50 mM
pH 8.0) contendo SDS (0,5%) e Proteinase K (100 g/ml), e incubados por 2 horas a
50 ºC. Essa etapa teve como objetivo facilitar a quebra posterior dos oocistos,
aumentando assim o rendimento final de DNA. Em seguida, os oocistos foram
lavados três vezes com tampão de extração e centrifugação 2.500 g por 5 minutos.
A partir dessa etapa, os oocistos de Eimeria de galinha e de coelho foram
processados de forma idêntica. Assim, os oocistos foram ressuspensos em tampão
de extração (Tris-HCl 10 mM pH 8.0; EDTA 50 mM pH 8.0) e rompidos totalmente
com o uso de agitador de tubos tipo vortex (Daigger Vortex Genie 2™, A. Daigger &
Co, Inc., EUA) com meio volume de pérolas de vidro (0,4 mm de diâmetro, Sigma-
Aldrich Corp., EUA). A quebra dos oocistos e esporocistos foi monitorada por
microscopia. Após uma centrifugação a 12.000 g por 10 minutos, o sobrenadante foi
recolhido, adicionado de RNAse A (20 g/ml final) e incubado a 37 oC por 1 hora. A
seguir foram adicionados SDS (0,5% p/v final) e Proteinase K (100 g/ml final), e a
amostra foi incubada a 50 oC por 2 horas. A extração de DNA foi feita por meio de
extrações com um volume de fenol, um volume de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico
(25:24:1) um volume de clorofórmio/álcool isoamílico (25:1). O DNA foi precipitado
pela adição de 2,5 volumes de etanol absoluto e acetato de amônio (2,5 M final) a -
20°C por uma hora. O DNA precipitado foi centrifugado a 10.000 g a 4 °C por 30
minutos, e o sedimento lavado com etanol 70%. O sedimento de DNA foi seco a
vácuo e ressuspenso em solução de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8.0; EDTA 1mM pH
8.0).
3.7 Quantificação de DNA
A quantificação das amostras de DNA foi feita por fluorimetria com o uso do
sistema Quant-iT™ High-Sensitivity dsDNA do QubitTM (Invitrogen Corp., Carlsbad,
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
50
Califórnia, EUA). Esse sistema permite uma quantificação precisa e específica, pois
a molécula ligante é específica para DNA de fita dupla, mesmo na presença de
contaminantes como RNA e proteínas.
3.8 Desenho dos iniciadores
Todos os iniciadores utilizados neste trabalho foram desenhados
manualmente com o programa OLIGO 4.0 Primer Analysis Software (Wojciech
Rychlik). O programa permite analisar características dos oligonucleotídeos tais
como à temperatura de fusão (Tm, Temperatura de melting), complementaridade
entre o par de iniciadores, falsos sítios de pareamento, formação de estruturas tipo
grampo de cabelo (hairpins), entre outros. As Tabelas 2, 3 e 4 mostram os pares de
iniciadores utilizados neste trabalho.
3.9 Amplificação do DNA
3.9.1 Amplificação do ITS1 das onze espécies de Eimeria de coelho doméstico
A reação de amplificação foi feita utilizando-se 10 ng de DNA molde para
cada espécie de Eimeria de coelho, 1U of Platinum® Taq DNA Polymerase High
Fidelity (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia,EUA), 1x High Fidelity PCR
Buffer, 1,5 mM MgCl2, 200 M dNTP mix,400 nM dos iniciadores ITS1-F e ITS1-R
(Tabela 2). Após uma etapa inicial de 2 minutos a 94 ºC para denaturação, a
amplificação foi conduzida por 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1 minuto a 58 ºC e 1
minuto a 72 ºC, com uma etapa de extensão final de 7 minutos a 72 ºC. Os produtos
da amplificação foram analisados em gel de agarose 1,5% corados com 0,5 g/mL
de brometo de etídio. Os produtos das amplificações foram observados rapidamente
com o auxílio de uma lâmpada portátil de UV de onda longa, e excisadas do gel. A
purificação foi feita em colunas (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, GE
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
51
Healthcare Biosciences, Pittsburgh, EUA) e eluídas com TE (10 mM Tris-HCl pH 7.4;
1 mM EDTA).
Tabela 2 - Sequências nucleotídicas de iniciadores utilizados para amplificação dos ITS1 específicos de cada uma das onze espécies de Eimeria de coelho doméstico.
Espécie de Eimeria Nome do iniciador
Sequência do iniciador
Todas as espécies de Eimeria de coelho
ITS1-F
ITS1-R
GGGAAGTTGCGTAAATAGA CTGCGTCCTTCATCGAT
E. coecicola Ecoe-ITS1-F
Ecoe-ITS1-R
AGCTTGGTGGGTTCTTATTATTGTAC CTAGTTGCTTCAACAAATCCATATCA
E. exigua Eexi-ITS1-F
Eexi-ITS1-R
GAATAAGTTCTGCCTAAAGAGAGCC
TATATAGACCATCCCCAACCCAC
E. flavescens Efla-ITS1-F
Efla-ITS1-R
GAATATTGTTGCAGTTTACCACCAA
CCTCAACAACCGTTCTTCATAATC
E. intestinalis Eint-ITS1-F
Eint-ITS1-R
TGTTTGTACCACCGAGGGAATA
AACATTAAGCTACCCTCCTCATCC
E. irresidua Eirr-ITS1-F
Eirr-ITS1-R
TTTGGTGGGAAAAGATGATTCTAC
TTTGCATTATTTTTAACCCATTCA
E. magna Emag-ITS1-F
Emag-ITS1-R
TTTACTTATCACCGAGGGTTGATC
CGAGAAAGGTAAAGCTTACCACC
E. media Emed-ITS1-F
Emed-ITS1-R
GATTTTTTTCCACTGCGTCC
TTCATAACAGAAAAGGTAAAAAAAGC
E. perforans Eper-ITS1-F
Eper-ITS1-R
TTTTATTTCATTCCCATTTGCATCC
CTTTTCATAACAGAAAAGGTCAAGCTTC
E. piriformis Epir-ITS1-F
Epir-ITS1-R
ACGAATACATCCCTCTGCCTTAC
ATTGTCTCCCCCTGCACAAC
E. stiedai Esti-ITS1-F
Esti-ITS1-R
GTGGGTTTTCTGTGCCCTC
AAGGCTGCTGCTTTGCTTC
E. vejdovskyi Evej-ITS1-F
Evej-ITS1-R
GTGCTGCCACAAAAGTCACC
GCTACAATTCATTCCGCCC
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
52
3.9.2 Amplificação de marcadores moleculares para estudo filogenético
Foram utilizados quatro marcadores moleculares para o estudo filogenético:
subunidade pequena (SSU) do rRNA nuclear, subunidade grande (LSU) do rRNA de
apicoplasto, ORF470 de apicoplasto, e o citocromo b mitocondrial. Foram utilizados
alguns iniciadores já descritos e outros desenhados neste trabalho. Esta informação,
bem como as sequências dos iniciadores, temperaturas de pareamento e
concentrações de cloreto de magnésio utilizadas nas amplificações estão
apresentadas na Tabela 3.
As reações de amplificação foram feitas utilizando-se 10 ng de DNA molde
para cada espécie de Eimeria, 1U of BIOLASE™ DNA Polymerase (Bioline, Londres,
Reino Unido), 1x NH4 Buffer, 200 M dNTP mix, 25 pmoles de cada iniciador e
cloreto de magnésio (conforme Tabela 3). Após uma desnaturação inicial de 5
minutos a 94 ºC, a amplificação foi conduzida por 30 ciclos, consistindo de 1 minuto
a 94 ºC, 1 minuto na temperatura de pareamento (ver Tabela 3), 1 minuto a 72 ºC,
comum a etapa de extensão final de 7 minutos a 72 ºC. Os produtos da amplificação
foram analisados em gel de agarose1,5% corados com 0,5 g/mL brometo de etídio.
Os produtos das amplificações foram excisadas do gel e purificados como descrito
anteriormente (item 3.9.1).
3.10 Sequenciamento do DNA
O sequenciamento do DNA foi feito utilizando-se o kit ABI PRISM Big Dye ™
Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia,
EUA). Cada reação utilizou 2,0μL do mix do kit de BigDye; 6,0μL de Tampão de
Sequenciamento 2,5x concentrado (200 mM Tris-HCl pH 9.0; 5,0 mM MgCl2); 3,2
pmol/μL de iniciador e cerca de 30 ng de DNA (produto de PCR purificado), em um
volume final de 20 μL. As reações de sequenciamento consistiram em 40 ciclos de
96 oC por 20 segundos, 52 oC por 20 segundos e 60 oC por 4 minutos. Após a
reação, os terminadores não incorporados foram removidos por precipitação
diferencial conforme instruções do fabricante (PE Applied Biosystems, 1998). As
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
53
amostras foram aplicadas em um sequenciador automático de DNA modelo ABI
3100 com o uso do polímero POP-6. Cada produto amplificado foi sequenciado em
ambas as fitas, num total de cinco replicatas para cada uma das espécies de
Eimeria spp.
Tabela 3 - Alvos moleculares e sequências dos iniciadores utilizados para amplificação dos quatro marcadores filogenéticos.
Alvo molecular Nome do iniciador
Sequência do iniciador Temp.
Paream.(oC)
[MgCl2] (mM)
aSSU nuclear
(18S)
18S-F
18S-R
GCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGC CGGAAACCGTGTTACGACTTTTG
55,0 1,5
bCitocromo b
mitochondrial
cytb-F
cytb-R
ACAAAGTCCCAGCAGTAGCGG GTAAATACCTAATTCTTTATGGTTTGC
50,0 1,5
bLSU de
plastídeo parcial (23S)
23S-F
23S-R
CCCTAGAGTAACTTTTATWCGTT CCTTTAAARAGTGCGTWAWAGCT
50,0 2,5
dORF470 de
plastídeo parcial
ORF470-F
ORF470-R
GATGATATATCTTATTATTCAATTCCTT TCCAATATGTAACATTTTATTTCC
50,0 2,5
aORF470 de
plastídeo parcial
ORF470-Fmax
ORF470-Rmax
ATTTAAACAGCCAGATTGGTG AAATTAATAAAGGTACTTCTAATTCTAATT
49,0 2,5
aIniciadores desenhados neste trabalho.
bRomano (2004)
cModificado de Zhao e Duszynski(2001b)
dZhao e Duszynski(2001a)
3.11 Análise da qualidade das sequências e montagem
Todas as sequências geradas foram submetidas a um processamento seriado
(pipeline) utilizando-se o sistema EGene (Durham et al., 2005). Os eletroferogramas
foram analisados pelo programa Phred (Ewing et al., 1998; Ewing et al., 1998)
quanto à qualidade, as sequências tiveram os respectivos iniciadores utilizados na
amplificação mascarados e as pontas aparadas. Em seguida, as sequências foram
submetidas a um filtro de qualidade e montadas com o uso do programa CAP3
(Huang et al., 1999). Ao final, as montagens foram inspecionadas no programa
Consed (Gordon et al., 1998). As montagens foram consideradas terminadas
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
54
segundo os seguintes critérios: índice Phred acima de 20 (correspondente a uma
estimativa de erro de 1:100) em todas as bases da sequência consenso; leitura de
todas as bases em ambas as fitas; leitura de todas as bases no mínimo três vezes;
consenso de todas as bases obtido a partir de leituras de ambas as fitas. Quando
necessário, foram desenhados iniciadores adicionais para cobrir regiões mais
internas dos produtos de amplificação (ver Tabela 4).
Tabela 4 - Alvos moleculares e sequências dos iniciadores utilizados para fechamento do sequenciamento dos marcadores filogenéticos.
Ao final, foram geradas sequências consenso em formato FASTA, usando-se
a mesma orientação da sequência para todas as espécies. As sequências
nucleotídicas da região ITS1 do cistron ribossômico foram submetidas ao GenBank,
tendo recebido os códigos de acesso HM768881 a HM768891. As sequências dos
marcadores filogenéticos receberam os códigos HQ173828 a HQ173892.
Alvo molecular Iniciador Sequência
SSU rRNA
18S-INT-F
18S-INT-R
18S-EXT-F
18S-EXT-R
CCATGCACCACCACCCATAGA
CGCGGTAATTCCAGCTCCAA
ACCGTCGAAAGCTGATAGGTCAG
CTTCTTAGAGGGACTTTGCGTGTC
Citocromo b mitochondrial
cytb-1000-F
ACTTCTAAGTGAGGTTCGATCACT
LSU rRNA de plastídeo
23S-F1
23S-R1
23S-F2
23S-R2
ATACTAAGGAGTACGAAATAACTTT
ACCGTTATAGTTACAGCCGCC
GGACAGAAAGACCCTATGAAGCT
TTACAGYAHAGGGAADTTTAACC
ORF470 de plastídeo ORF470-F1
ORF470-R1
TCAGAAGATTTTGCTCAATTTGA
CTTTCAAATTGAGCAAAATCTTC
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
55
3.12 Ensaios diagnósticos para Eimeria spp. de coelho
3.12.1 Desenho de iniciadores espécie-específicos
As sequências nucleotídicas obtidas para a região ITS1 das onze espécies de
Eimeria de coelho, organizadas na mesma orientação da fita, foram submetidas a
um alinhamento múltiplo utilizando-se o programa ClustalX versão 2.0 (Thompson et
al., 1997; Larkin et al., 2007). O alinhamento múltiplo foi salvo no formato ALN e
editado no programa BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). As
regiões polimórficas específicas de cada espécie foram identificadas manualmente,
e os iniciadores desenhados utilizando-se o programa Oligo versão 4
(http://www.oligo.net). Dentro do possível, os iniciadores foram desenhados de forma
a não apresentar estruturas internas do tipo “grampo de cabelo” (hairpin) e nem
formar dímeros entre si ou com o segundo iniciador da amplificação. A Tabela 2
contém os iniciadores ITS1 específicos.
3.12.2 Amplificação do DNA
A reação de amplificação foi feita utilizando-se 10 ng de DNA molde para
cada espécie de Eimeria; 1U de AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (Applied
Biosystems); 1x Gene Amp PCR Buffer II; 200μMdNTPmix; 400 nM de cada um dos
iniciadores; cloreto de magnésio na concentração de 1,5 mM. Após um ciclo inicial
de 5 minutos a 95 ºC para desnaturação do DNA e ativação da enzima (hot start), o
fragmento foi amplificado por 30 ciclos consistindo de 45 segundos de desnaturação
a 95 ºC, 45 segundos de pareamento a 54 °C e 1 minuto de extensão a 72 ºC. A
reação de amplificação foi finalizada com um ciclo de extensão por 7 minutos a 72
ºC. As amostras foram separadas em géis de agarose 1,5% e fotografadas
digitalmente sob luz UV (Alpha Innotech Corp. Santa Clara, Califórnia, EUA).
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
56
3.13 Análises filogenéticas
3.13.1 Marcadores moleculares e sequenciamento
Conforme descrito no item 3.9.2, foram utilizados os seguintes marcadores
moleculares de Eimeria spp. para o estudo: subunidade pequena (SSU) do rRNA
nuclear, subunidade grande (LSU) do rRNA de apicoplasto, ORF470 de apicoplasto,
e o citocromo b mitocondrial (cytb).No caso do citocromo b, as sequências
nucleotídicas das onze espécies de coelho foram determinadas neste trabalho. Para
as espécies de galinha doméstica, foram utilizadas sequências previamente geradas
pelo nosso grupo (Romano, 2004). As sequências do SSU (18S) do cistron
ribossômico de Eimeria de galinha foram descritas por Barta et al. (1997), foram
obtidas a partir de bases de dados públicas (GenBank). No caso das espécies de
Eimeria de coelho, sequências da SSU (18S) foram descritas por Kvičerová et al.
(2008) quando este trabalho estava em andamento e, portanto, utilizamos para as
análises subsequentes as sequências geradas em nosso laboratório. Para a
ORF470 e LSU (23S), foram utilizadas as sequências nucleotídicas determinadas
neste trabalho a partir das amostras de Eimeria de galinha e de coelho, totalizando
18 espécies. Além das sequências nucleotídicas geradas neste trabalho e
depositadas no GenBank (ver item 3.11), foram utilizadas várias sequências de
outros grupos depositadas em bancos públicos, conforme listado na Tabela 5. Como
grupo externo, foi escolhido o Toxoplasma gondii, uma vez que é um organismo
relativamente próximo ao gênero Eimeria e também pertence à classe Coccidia.
Nesse caso, foram utilizadas sequências públicas disponíveis para os quatro
marcadores moleculares de T.gondii: SSU de rRNA nuclear (L37415), citocromo b
mitocondrial (AF015627), LSU de rRNA e ORF470 de apicoplasto (U87145 –
correspondente ao genoma completo de apicoplasto).
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
57
3.13.2 Conjuntos de dados
As sequências nucleotídicas de cada marcador molecular, obtidas como
descrito anteriormente (item 3.11) e também a partir de bancos públicos, foram
utilizadas para as análises filogenéticas. Inicialmente, foram feitos alinhamentos
múltiplos das sequências de cada marcador, de forma independente, usando-se o
programa ClustalX 2.0 (Thompson et al., 1997; Larkin et al., 2007). Para cada
marcador, foram empregadas as sequências das onze espécies de Eimeria de
coelho e das sete espécies de Eimeria de galinha. Após a obtenção de cada
alinhamento, foi criado um perfil (profile) a partir do mesmo e, em seguida,
procedeu-se a um segundo alinhamento adicionando-se as sequências de T. gondii
(grupo externo). Essa abordagem foi feita para não perturbar o alinhamento inicial
das espécies de Eimeria, visto que T. gondii é filogeneticamente mais distante.
Tabela 5 – Código de acesso das sequências públicas utilizadas nas análises filogenéticas (continua)
Organismo Abrev. Hospedeiro SSU rRNA LSU rRNA ORF470
E. acervulina Eace Gallus gallus U67115 - -
E. adenoeides Eade Meleagris gallopavo AF324212 - -
E. ahsata Eahs Ovis aries AF338350 - -
E. albigulae Ealb Neotoma albigula AF307880 AF307885 AF311630
E. antrozoi Eant Antrozous pallidus AF307876 - -
E. arizonensis Eari Reithrodontomys spp. AF307878 AF307883 AF311631
E. arnyi Earn Diadophis punctatus
arnyi AY613853 - -
E. bovis Ebov Bos taurus EBU77084 - -
E. brunetti Ebru Gallus gallus U67116 - -
E. catronensis Ecat Myotis lucifugus AF324213
E. chaetodipi Echa Chaetodipus hispidus AF339489 - -
E. chobotari Echo Dipodomys merriami AF324214 - -
E. crandallis Ecra Ovis aries AF336339 - -
E. dipodomysis Edip Dipodomys phillipsii AF339490 - -
E. falciformis Efal Mus musculus AF080614 AF307887 AF311632
E. faurei Efau Ovis aries AF345998 - -
E. gruis Egru Grus monacha e
G. vipio AB205165 - -
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
58
Tabela 5 - Código de acesso das sequências públicas utilizadas nas análises filogenéticas.
(conclusão)
Organismo Abrev. Hospedeiro SSU rRNA LSU rRNA ORF470
E. langebarteli Elan Reithrodontomys
megalotis AF311640 AF332528 AF311639
E. leucopi Eleu Peromyscus leucopus AF339491 - -
E. maxima Emax Gallus gallus U67117 - -
E. meleagrimitis Emel Meleagris gallopavo AF041437 - -
E. mitis Emit Gallus gallus U67118 - -
E. necatrix Enec Gallus gallus U67119 - -
E. nieschulzi Enie Rattus novergicus U40263 AF307886 AF311633
E. onychomysis Eony Onychomys
leucogaster AF307879 AF307884 AF311634
E. ovinoidalis Eovi Ovis aires AF345997 - -
E. papillata Epap Mus musculus AF311641 AF332531 AF311635
E. peromysci Epero Peromyscus truei AF339492 - -
E. pilarenses Epil Myotis ciliolabrum AF324215 - -
E. polita Epol Sus scrofa domesticus AF279667 - -
E. porci Epor Sus scrofa domesticus AF279666 - -
E. praecox Epra Gallus gallus U67120 - -
E. ranae Eran Rana temporaria EU717219 - -
E. reedi Eree Perognathus flavus AF311642 AF332533 AF311636
E. reichenowi Erei Grus monacha e
G. vipio AB205170 - -
E. rioarribaensis Erio Myotis ciliolabrum AF307877 - -
E. scabra Esca Sus scrofa domesticus AF279668 - -
E. scholtysecki Esch Dipodomys agilis AF324216 - -
E. separata Esep Rattus novergicus AF311643 AF332535 AF311637
E. sevilletensis Esev Onychomys arenicola AF311644 AF332536 AF311638
E. telekii Etel Lemniscomys striatus AF246717 - -
E. tenella Eten Gallus gallus U67121 - -
E. trichosuri Etri Trichosurus vulpecula FJ829323 - -
E. tropidura Etro Tropidurus delanonis AF324217 - -
Eimeria spp. DAM-2009
E_Dmar Dryocopus martius FN298443 - -
E. weybridgensis Ewey Ovis aires AY028972 - -
Eimeria spp. de M. gallopavo
E_Mgal Meleagris gallopavo HM117016 - -
Eimeria spp. de P.colchicus
E_Pcol Phasianus colchicus HM117010 - -
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
59
Os alinhamentos foram editados manualmente nos programas Seaview
(Galtier et al., 1996) e/ou Se-Al (Rambaut, 1996). Para os marcadores de genes
ribossômicos SSU (nuclear) e LSU (de apicoplasto), a edição manual utilizou
modelos estruturais (Gagnon et al., 1996; Gutell et al., 1993) como moldes. Assim,
procurou-se editar o alinhamento de forma a conservar as estruturas secundárias de
hastes (stems), deixando a maior parte dos polimorfismos para as regiões de alças
(loops). No caso dos marcadores que codificam proteínas, ORF470 e citocromo b,
as sequências nucleotídicas foram traduzidas conceitualmente com o programa
TRANSEQ do pacote EMBOSS (Rice et al., 2000). Utilizou-se o código genético da
Tabela 4 do NCBI, no qual o códon UGA codifica triptofano, ao invés de representar
um códon de terminação. As sequências proteicas foram então submetidas a um
alinhamento múltiplo com o programa ClustalX e posteriormente este alinhamento foi
editado com o programa Seaview. O alinhamento múltiplo editado, juntamente com
as sequências nucleotídicas em formato FASTA, foram usados como entrada para o
programa CodonAlign 2.0 (Hall, 2001). Este programa, baseado no alinhamento
proteico, gera o alinhamento correspondente de sequências nucleotídicas.
Finalmente, procedemos à exclusão de algumas regiões de caracteres que
continham trechos de sequências presentes somente em T. gondii, sem similaridade
com as sequências de Eimeria. Por outro lado, caracteres presentes nas sequências
de todas as espécies de Eimeria, mas ausentes em T. gondii foram tratadas como
ausentes (missing) nesse organismo (Barta, 1997). Finalmente, os alinhamentos dos
foram concatenados com o programa Se-Al (Rambaut, 1996).
3.13.3 Análises por distância (neighbor-joining), máxima parcimônia e máxima
verossimilhança
Inicialmente, utilizou-se o programa PAUP* version 4.0b10 (Swofford, 2002)
para as análises filogenéticas preliminares. Foram usados para efeito de
comparação, três critérios de optimalidade: distância por neighbor-joining, máxima
parcimônia e máxima versossimilhança. Em todos os casos, foi feita ao final uma
análise de bootstrap com 1000 replicatas para avaliar a topologia das árvores,
utilizando-se a regra do consenso da maioria (>50%).
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
60
No caso do critério de distância, foi utilizado o método de neighbor-joining
com mínima evolução. Para a reconstrução com máxima parcimônia, empregou-se
uma busca heurística usando-se o método tree-bisection-reconnection (TBR) como
algoritmo de branch-swapping. Para a reconstrução filogenética por máxima
verossimilhança, primeiramente foi executado um teste hierárquico com o programa
Modeltest v.3.7 (Posada et al., 1998). Este programa testa os dados frente a 56
modelos de substituição de nucleotídeos, visando a seleção do modelo evolutivo que
melhor se ajusta a esse conjunto de dados. A seleção do modelo mais adequado foi
feita para cada um dos marcadores moleculares em separado e, posteriormente,
para os conjuntos concatenados. Os valores estimados pelo programa Modeltest
para as matrizes de substituição, assim como os de alfa e proporção de sítios
invariantes, foram então utilizados no PAUP* para realizar as análises de máxima
verossimilhança. Procedeu-se a uma busca heurística usando-se uma árvore obtida
por máxima parcimônia para a topologia inicial.
Alternativamente ao PAUP*, foram também feitas análises de máxima
verossimilhança com o programa RAxML (Stamatakis, 2006). O tempo de
processamento para uma análise com 1.000 replicatas de “bootstrap” neste
programa é bem menor se comparado com o tempo do programa PAUP*. Os
comandos utilizados para as análises encontram-se no ANEXO C.
Todas as árvores geradas de todos os marcadores e do conjunto
concatenado foram visualizadas com o programa NJPlot (Perrière et al., 1996) e
editadas no FigTree (não publicado - disponível em
http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree).
3.13.4 Mapeamento da verossimilhança
Visando avaliar o sinal filogenético do conjunto de dados, foi realizado um
teste de mapeamento de verossimillhança (likelihood mapping), utilizando o método
dos quartetos, implementado no programa Tree-Puzzle (Schmidt et al., 2002).
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
61
3.13.5 Análise de recombinação (RDP)
O programa RDP3 (Recombination Detection Program) (Martin et al., 2010)
usa diferentes algoritmos para detectar sequências recombinantes e pontos de
recombinação. Foram utilizados os seguintes métodos para a detecção de
recombinação: RDP, GENECONV, Bootscan, MaxChi, Chimaera, SiScan e 3Seq.
Para a análise, consideramos um p-valor aceitável maior do que 0,05 e usamos uma
correção de Bonferroni. A detecção positiva de recombinação em pelo menos cinco
métodos é necessária para se considerá-la válida.
3.13.6 Análise demográfica das espécies de Eimeria
Para a análise demográfica, utilizou-se o alinhamento concatenado de
marcadores (SSU de rRNA nuclear, LSU de rRNA de apicoplasto, citocromo b
mitocondrial e ORF470 de apicoplasto) de espécies de Eimeria de galinha, coelho e
roedores. Esse conjunto de dados foi utilizado para a datação dos nós das árvores
para obter-se a estimativa do tempo para o ancestral comum mais recente (TMRCA
– Time to Most Recent Common Ancestor) de cada grupo monofilético. Para isso, as
análises foram feitas utilizando-se um conjunto de programas do pacote BEAST
v1.4.8 – Bayesian Evolutionary Analysis Sampling Trees (Drummond e Rambaut,
2007). Utilizou-se como modelo evolutivo o GTR+I+ (General Time-Reversible), o
estima a frequência de bases e assume seis taxas de substituição diferentes (A↔T,
A↔C, A↔G, C↔T, G↔T e C↔G). Além disso, o modelo assume uma proporção
de sítios invariantes (parâmetro I), estimada a partir dos dados, e uma distribuição
gama para as variações de taxas entre sítios (parâmetro G), a qual foi utilizada com
10 categorias. Utilizou-se ainda um modelo de relógio molecular estrito (strict clock)
com uma taxa fixa de substituição por sítio de 4,43 x 10-9 por ano. Essa taxa foi um
valor médio calculado a partir de valores de taxas de substituição estimados para
parasitas do gênero Plasmodium (Rich et al., 1998; Hughes e Verra, 2001; Mu et al.,
2005; Hayakawa et al., 2008; Ricklefs e Outlaw, 2010). Para a hipótese a priori (Tree
Ursula Castro de Oliveira Materiais e Métodos
62
Prior) da árvore, consideramos o modelo Skyline Bayesiano coalescente
(Coalescent: Bayesian Skyline - bsl), que é um modelo para genealogias intra-
específicas e, adicionalmente, os modelos de co-especiação de Yule e de birth-and-
death (bd), que são mais adequados para processos inter-específicos.
A análise foi feita em quatro corridas independentes com comprimentos de
cadeia de 50 milhões de gerações, e amostragem a cada 5.000 estados, totalizando
10.000 árvores armazenadas no final. Os arquivos de saída (log) de cada corrida
independente, gerados pelo programa BEAST, foram inspecionados com o
programa Tracer. Em seguida os arquivos log foram combinados com o programa
LogCombiner. Nessa etapa, do total de 40.000 estados amostrados nas quatro
corridas, foram eliminados os primeiros 1.000 (burnin) de cada uma. Finalmente, os
arquivos log combinados com o LogCombiner de cada um dos modelos testados
(bsl, Yule e bd) foram então carregados no Tracer e submetidos a uma análise de
verossimilhança para a comparação via fator de Bayes. O programa LogCombiner
também foi usado para combinar os arquivos de árvores *.trees gerados pelo
BEAST. Nesse caso, o arquivo de saída do LogCombiner foi carregado no programa
TreeAnnotator para sumarizar a informação e gerar uma árvore anotada contendo
dados relativos a comprimento e tempo dos ramos, probabilidades posteriores, etc.
Finalmente, essa árvore de máxima credibilidade de clados (MCC) foi inspecionada
no programa FigTree.
3.13.7 Análise da evolução de caracteres nas proteínas ORF470 e citocromo b
Visando estudar a evolução de caracteres nas sequências das proteínas
ORF470 e citocromo b nas diferentes espécies de Eimeria, utilizou-se o programa
MacClade 4: Analysis of Phylogeny and Character Evolution v4.06 (Maddison et al.,
1992). Esse programa utiliza máxima parcimônia para gerar cladogramas que
permitem uma fácil inspeção da evolução dos caracteres, a identificação de
homoplasias, sinapomorfias e outros eventos, além da reconstrução dos estados
ancestrais.
4 RESULTADOS
Ursula Castro de Oliveira Resultados
64
4.1 Diagnóstico molecular de Eimeria spp. de coelho
Visando o desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecção e
discriminação das onze espécies de Eimeria de coelho, procedeu-se ao
sequenciamento da região ITS1 do cistron ribossômico. Para isso, foram
desenhados iniciadores (ver item 3.8) dirigidos contra regiões conservadas que
flanqueiam a região ITS1 a partir de uma sequência pública (código de acesso
AF026388). Amostras de DNA das onze espécies de Eimeria de coelho foram então
utilizadas para amplificar o ITS1, conforme descrito no item 3.9.1. Os produtos de
amplificação apresentaram tamanhos variando entre 400 e 600 pb (Figura 1).
Figura 1 - Amplificação da região ITS1 do cistron ribossômico. Produtos de amplificação de ITS1 de Eimeria de coelho doméstico separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo. As reações de amplificação foram feitas com os iniciadores ITS1-F e ITS1-R (Tabela 2). As espécies de Eimeria de coelho utilizadas estão indicadas, assim como o controle positivo contendo DNA de E. tenella (de galinha), controle negativo sem DNA, e marcador de tamanho molecular em escada de 100 pb(100 bp DNA Ladder, Invitrogen).
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
65
Cada um dos produtos da amplificação foi sequenciado (item 3.10), as
sequências obtidas foram montadas (item 3.11) e submetidas a um alinhamento
múltiplo (item 3.12.1). A partir deste alinhamento foram desenhados iniciadores
espécie-específicos (Tabela 2). Em seguida os iniciadores foram testados frente a
amostras de DNA homóloga. O tamanho dos fragmentos amplificados variou entre
166 a 289 pb (dados não mostrados). Todas as reações foram padronizadas de
forma a obtermos o máximo rendimento de produto e usando-se uma temperatura
de pareamento semelhante para todas as reações. Finalmente, foram feitos testes
de especificidade utilizando-se os iniciadores frente a amostras de todas as espécies
de Eimeria de coelho. Conforme pode ser visto na Figura 2, não foram observadas
reações cruzadas entre as diferentes espécies.
Figura 2 - Teste de especificidade dos ensaios para diagnóstico de Eimeria spp. de coelho. Amostras de DNA das onze espécies de Eimeria de coelho foram amplificadas por PCR utilizando-se pares de iniciadores homólogos e heterólogos. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em géis de agarose 1,5% corados com brometo de etídeo. Controles negativos sem DNA também estão indicados. Faixas horizontais dos géis estão mostradas na figura para economia de espaço. Nenhuma banda adicional de amplificação foi observada nas áreas remanescentes dos géis (ver ANEXO B).
Ursula Castro de Oliveira Resultados
66
Uma vez padronizadas as condições de amplificação, e confirmada a
especificidade de amplificação para todas as espécies, foram feitos testes de
sensibilidade individualmente para cada espécie. Assim, amostras de DNA de cada
espécie, variando de 1 ng até 10 fg, foram amplificadas nas condições previamente
padronizadas. Como pode ser visto na Figura 3, a sensibilidade observada nos
diferentes ensaios variou de 1 pg a 50 fg de DNA, sendo 500 fg a sensibilidade para
o conjunto de todas as espécies. Foram feitas ainda alterações dos programas de
amplificação como, por exemplo, tempo de rampagem entre as fases de pareamento
e extensão, touchdown. Essas alterações, entretanto, não mostraram diferenças
significativas na sensibilidade ou especificidade.
Figura 3 - Teste de sensibilidade de detecção de Eimeria spp. de coelho. Amostras de DNA
das onze espécies de Eimeria de coelho foram diluídas seriadamente e amplificadas por PCR. As espécies de Eimeria e massas de DNA utilizadas em cada reação estão apresentadas. Controles negativos sem DNA também estão indicados.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
67
Finalmente, decidiu-se testar se a sensibilidade era afetada pela marca da
polimerase de amplificação. Assim, além da enzima AmpliTaq Gold® DNA
Polymerase (Applied Biosystems, EUA), foram utilizadas também as enzimas Taq
DNA polimerase de dois outros fabricantes: BIOLASE™ DNA polymerase(Bioline,
Reino Unido) e Taq DNA polymerase recombinant (Fermentas International Inc.,
Canadá).Procedeu-se então a um teste de sensibilidade, como descrito
anteriormente, para duas espécies de Eimeria de coelho: E. piriformis e E. magna. A
Figura 4 mostra que a despeito de variações no rendimento de produto amplificado
entre as enzimas, o limiar de detecção observado foi semelhante: 500 fg de DNA.
Figura 4 - Teste de sensibilidade de detecção de E. magna e E. piriformis com diferentes
enzimas. As espécies de Eimeria, enzimas e massas de DNA utilizadas em cada reação estão apresentadas. Controles negativos sem DNA também estão indicados.
Ursula Castro de Oliveira Resultados
68
4.2 Análises filogenéticas de parasitas do gênero Eimeria
As análises filogenéticas das espécies de Eimeria de galinha e de coelho
foram realizadas utilizando-se quatro marcadores moleculares: subunidade pequena
(SSU) do rRNA nuclear, subunidade grande (LSU) do rRNA de apicoplasto,
ORF470 de apicoplasto, e o citocromo b mitocondrial (cytb). Assim, as análises
foram feitas com marcadores de genes codificadores de proteínas (cytb e ORF470),
e de subunidades ribossômicas SSU e LSU. Além disso, a escolha dos marcadores
levou em consideração o fato de serem originados de três diferentes genomas e
compartimentos celulares: nuclear, mitocondrial e de apicoplasto. Com esta
abordagem, procurou-se utilizar marcadores que tivessem diferentes histórias de
pressão de seleção e taxas de evolução, mas, que no seu conjunto, refletissem a
evolução dos organismos.
4.2.1 Avaliação do sinal filogenético por mapeamento de verossimilhança
Visando avaliar se os conjuntos de dados dos quatro marcadores
apresentavam sinal filogenético, decidiu-se submetê-los a um teste de mapeamento
de verossimilhança (Strimmer e von Haeseler, 1997) com o uso do programa Tree-
Puzzle. Este teste permite verificar o sinal filogenético dos dados, estimando a
confiança dos ramos internos das árvores obtidas. Através da análise dos quartetos,
as probabilidades posteriores são colocadas num sistema de coordenadas em três
dimensões, onde todos os pontos obtidos são lançados na superfície de um
triângulo. Assim, podemos analisar a informação filogenética dos dados através de
diagramas que permitem visualizar a quantidade de quartetos não resolvidos que
ficam na região central do triângulo. Conforme pode ser visto na Figura 6, todos os
quatro marcadores apresentaram no mínimo 90% de quartetos resolvidos, os quais
podem ser visualizados como pontos nos vértices do triângulo. Em função desse
resultado, decidiu-se por fim avaliar o sinal filogenético dos quatro marcadores
moleculares concatenados em um único conjunto de dados. Conforme pode ser
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
69
visto na Figura 7, o sinal filogenético melhorou em relação ao dos marcadores
individuais, obtendo-se 97,6% de quartetos resolvidos.
A B
C D
Figura 5 - Mapeamento de verossimilhança obtido com o programa Tree-Puzzle. Os conjuntos de dados dos marcadores estão indicados: SSU rRNA nuclear (A), LSU rRNA de apicolplasto (B), citocromo b mitocondrial (C) e ORF470 de apicoplasto (D).
Ursula Castro de Oliveira Resultados
70
Figura 6 - Mapeamento de verossimilhança para o conjunto de dados concatenado. Esse
mapeamento foi obtido com o programa Tree-Puzzle para o conjunto de dados composto pela concatenação dos marcadores SSU rRNA nuclear, LSU rRNA de apicoplasto, citocromo b mitocondrial e ORF470 de apicoplasto.
4.2.2 Análises preliminares com diferentes marcadores e critérios de optimalidade
Inicialmente, foram utilizados os quatro marcadores moleculares individuais
para análises de distância (neighbor-joining), máxima parcimônia e máxima
verossimilhança. Os conjuntos de dados empregados nessas análises preliminares
incluíram sete espécies de Eimeria de galinha e onze de coelho. As reconstruções
filogenéticas foram feitas como descrito no item 3.13.3. No caso da máxima
verossimilhança, foi realizada uma avaliação do melhor modelo evolutivo usando-se
o programa ModelTestv.3.7 (Posada et al., 1998). Os modelos evolutivos de
substituição de nucleotídeos mais adequados aos dados foram: GTR+I+ para a
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
71
SSU, ORF470 e cytb, e TVM+I+ para a LSU. Para o conjunto de dados dos quatro
marcadores concatenados, o modelo selecionado foi o GTR+I+. O modelo GTR
(General Time-Reversible) assume seis taxas distintas de substituições (ver
explicação no item 3.13.5). O modelo TVM (transversional model with unequal base
frequencies) estima a frequência de bases e assume cinco taxas de substituição
distintas. Assim, esse modelo discrimina as taxas de todos os tipos de transversões,
mas assume que as taxas de transições A↔G e C↔T são iguais. Ambos os
modelos acima estimam a proporção de sítios invariantes (parâmetro I) e assumem
uma distribuição gama para as variações de taxas entre sítios (parâmetro ). Estes
modelos foram utilizados na análise de verossimilhança de cada um dos
marcadores, bem como para o conjunto concatenado.
Uma comparação entre as árvores geradas com os marcadores individuais
revelou que a despeito de algumas variações de topologia entre árvores, obtidas por
diferentes marcadores e/ou critério de optimalidade, de modo geral as topologias
foram bastante semelhantes. Assim, essas análises demonstraram que as espécies
de Eimeria são monofiléticas em relação aos seus hospedeiros galinha e coelho
domésticos, independentemente do marcador e método utilizados. A Figura 5 mostra
uma árvore obtida por neighbor-joining para o marcador SSU rRNA, e exemplifica a
topologia tipicamente observada para essas espécies de Eimeria. Para efeito
comparativo, as árvores obtidas com o uso de outras combinações de critérios de
optimalidade e marcadores moleculares estão apresentadas no ANEXO D.
Ursula Castro de Oliveira Resultados
72
Figura 7 – Filograma obtido por neighbor-joining da SSU de rRNA nuclear das espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos. Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros representam os dois diferentes hospedeiros: galinha em azul e coelho em verde. As espécies de Eimeria de coelho que estão marcadas em azul possuem oocisto com corpo residual, as demais espécies não possuem corpo residual nos seus oocistos.
Outro resultado observado em todas as análises é que alguns clados são
muito evidentes e reprodutíveis. Nas espécies de Eimeria de coelho são evidentes
dois clados, sendo o primeiro composto por E. exigua, E. irresidua, E. flavescens e
E. piriformis, e o segundo pelas sete demais espécies (Figura 5 e ANEXO D). Um
aspecto morfológico interessante e que está correlacionado com esses dois clados é
que todas as sete espécies do segundo clado apresentam uma estrutura no oocisto
denominada corpo residual ou resíduo do oocisto, ao passo que nenhuma das
espécies do primeiro clado apresentam essa estrutura. Esse segundo clado não
apresenta muita consistência, observando-se várias politomias e valores de suporte
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
73
frequentemente baixos, especialmente quando se analisa marcadores individuais
(ANEXO D). Ainda assim, um par de espécies, E. perforans e E. media, sempre
forma o mesmo clado, o qual por sua vez está sempre próximo a E. magna.
Contudo, as demais espécies de Eimeria de coelho desse grupo, E. stiedai, E.
intestinalis, E. coecicola e E. vejdovskyi não formaram topologias consistentes.
As espécies de Eimeria de galinha doméstica também apresentaram
consistência quando comparados os resultados de diferentes marcadores ou
métodos de análise. Assim, E. tenella e E. necatrix consistentemente formam um
clado separado das outras cinco espécies, independentemente do marcador e do
método utilizado na análise filogenética (Figura 7 e ANEXO D – Figuras D1 a D12).
Essas duas espécies mostram-se mais divergentes das demais espécies de Eimeria
de galinha, e essa característica na topologia das árvores geradas também está de
acordo com dados descritos na literatura com SSU rRNA e genomas mitocondriais
(Barta et al., 1997; Romano, 2004). No segundo grupo de espécies, E acervulina e
E. mitis formam um clado separado na maioria das análises. Por outro lado, as
relações entre E. maxima, E. brunetti e E. praecox não são tão claras e consistentes,
mas essas três espécies em geral foram um clado.
4.2.3 Análises preliminares com conjunto de dados concatenados e diferentes
critérios de optimalidade
Em função dos resultados descritos acima, decidiu-se testar um alinhamento
dos quatro marcadores concatenados com os três critérios de optimalidade. As
figuras 8, 9 e 10 mostram as árvores obtidas por máxima parcimônia, neighbor-
joining, e máxima verossimilhança, respectivamente Pode-se observar pela
comparação dessas árvores que a congruência dos resultados é ainda maior do que
quando se compara os dados obtidos com marcadores individuais. Por exemplo, as
árvores obtidas por máxima parcimônia para os marcadores individuais apresentam
algumas diferenças topológicas (ver ANEXO D). Contudo, o uso do conjunto
concatenado resultou numa árvore (Figura 8) cuja topologia é extremamente
Ursula Castro de Oliveira Resultados
74
congruente com as árvores obtidas por neighbor-joining (Figura 9) e máxima
verossimilhança (Figura 10) para o mesmo conjunto de dados. Além disso, os
valores de suporte dos nós, em sua maioria, são bastante altos e certamente
maiores do que os obtidos com o uso dos marcadores individuais.
Contudo, o conjunto de quatro genes concatenados utilizado neste trabalho
ainda não foi capaz de elucidar totalmente as relações de algumas espécies. Assim,
as relações entre E. intestinalis, E. vejdovskyi, E. coecicola, e E. stiedai, no clado
das espécies de Eimeria de coelho, e entre E. maxima, E. brunetti e E. praecox, no
clado das espécies de Eimeria de galinha, ainda são bastante indefinidas. Uma
característica evidente em Eimeria maxima é que seu ramo nas árvores obtidas sob
diferentes métodos de reconstrução é muito mais longo do que o das demais
espécies. Isso pode significar que essa espécie tenha uma taxa de evolução distinta
em relação as demais espécies.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
75
Figura 8 - Filograma obtido por máxima parcimôniado conjunto de dados concatenado. Marcadores moleculares utilizados: SSU de rRNA nuclear, LSU de rRNA de apicoplasto, citocromo b mitocondrial e ORF470 de apicoplasto. As espécies de Eimeria de galinha e coelho estão indicados. Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. As espécies de Eimeria contendo resíduo do oocisto estão marcadas em azul. Os quadros coloridos indicam os diferentes hospedeiros.
Ursula Castro de Oliveira Resultados
76
Figura 9 - Filograma obtido por neighbor-joining do conjunto de dados concatenado. Marcadores moleculares utilizados: SSU de rRNA nuclear, LSU de rRNA de apicoplasto, citocromo b mitocondrial e ORF470 de apicoplasto. As espécies de Eimeria de galinha e coelho estão indicados. Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. As espécies de Eimeria contendo resíduo do oocisto estão marcadas em azul. Os quadros coloridos indicam os diferentes hospedeiros.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
77
Figura 10 - Filograma obtido por máxima verossimilhança do conjunto de dados concatenado de SSU de rRNA nuclear, LSU de rRNA de apicoplasto, citocromo b mitocondrial e ORF470 de apicoplasto. As espécies de Eimeria de galinha e coelho estão indicados. Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. As espécies de Eimeria contendo resíduo do oocisto estão marcadas em azul. Os quadros coloridos indicam os diferentes hospedeiros.
Ursula Castro de Oliveira Resultados
78
4.2.4 Análise de recombinação entre marcadores
A análise de recombinação entre as espécies estudadas foi feita com o
conjunto concatenado das espécies de Eimeria de galinha e coelho e,
posteriormente, foram incluídos dados de espécies de Eimeria de roedores. A
analise feita através dos métodos RDP, GENECONV, Bootscan, MaxChi, Chimaera,
SiScan e 3Seq não evidenciou eventos de recombinação nos conjuntos de dados.
4.2.5 Reconstrução filogenética com marcadores concatenados
Conforme apresentado anteriormente, os quatro marcadores moleculares
testados apresentaram um bom sinal filogenético no teste de mapeamento de
verossimilhança, e a concatenação dos alinhamentos individuais resultou num
conjunto de dados com sinal filogenético ainda melhor (item 4.2.1 e Figuras 5 e 6).
As reconstruções filogenéticas realizadas com cada marcador individual, sob
diferentes critérios de optimalidade, resultaram em árvores com topologias
relativamente congruentes, confirmando, também, a consistência dos dados (item
4.2.2, Figura 7 e ANEXO D). Essa conclusão foi confirmada pelo uso de um conjunto
de dados concatenado em que se observou uma maior congruência de topologias
das árvores obtidas por diferentes critérios de optimalidade (item 4.2.3 e Figuras 8, 9
e 10). Finalmente, uma análise de recombinação demonstrou não haver evidência
de eventos de recombinação entre os distintos marcadores (item 4.2.4).
Em função dos resultados acima, decidiu-se utilizar nas análises filogenéticas
subsequentes apenas o conjunto de dados concatenado dos quatro marcadores.
Assim, com a disponibilidade em bancos públicos de sequências desses marcadores
em espécies de Eimeria de uma ampla gama de hospedeiros, decidiu-se ainda
agregar o maior número possível de espécies de Eimeria no conjunto de dados.
Fazendo-se uma busca no GenBank, identificou-se um total de dez espécies de
Eimeria de roedores silvestres que continham sequências para a SSU nuclear, LSU
de apicoplasto e ORF470 (Tabela 5). Assim construímos um alinhamento
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
79
concatenado contendo dados das sete espécies de Eimeria de galinha, onze de
coelho e dez de roedores silvestres. No caso do citocromo b, não havia sequências
públicas disponíveis para as espécies de Eimeria de roedores silvestres, tendo sido
seus caracteres tratados como ausentes (missing) para estas espécies. Este
conjunto de dados representa um compromisso entre o maior número disponível de
marcadores moleculares (evidência global) com a maior amostragem possível de
taxa (máxima amostragem).
Esse conjunto de dados foi submetido a uma análise de máxima
verossimilhança. Primeiramente, procedeu-se a um teste de modelos evolutivos
usando-se os programas PAUP* e ModelTest, conforme descrito no item 3.13.3. O
modelo mais adequado aos dados foi o GTR+I+. Assim, usando esse modelo,
utilizou-se o programa RaxML para realizar a reconstrução filogenética com máxima
verossimilhança e a análise de bootstrap com 1.000 replicatas. Conforme pode ser
visto na árvore apresentada na Figura 11, as espécies de Eimeria de roedores
formaram dois clados, claramente definidos pela presença ou ausência do resíduo
do oocisto. De fato, essa observação já havia sido descrita por Zhao e Duszynski
(2001a,b) utilizando de forma individual os marcadores SSU de rRNA nuclear, LSU
de rRNA de apicoplasto e ORF470. Similarmente ao que foi descrito por esse grupo,
observamos que a presença do resíduo foi mais importante para a definição dos
clados do que as espécies de hospedeiros dos parasitas. O grupo das espécies de
Eimeria de coelho também apresentou dois clados, compreendendo espécies com e
sem presença de resíduo do oocisto, tal como relatado por Kvičerová et al. (2008)
com uso da SSU de rRNA nuclear. O caractere da presença do resíduo de oocisto
está claramente associado com a formação de clados distintos nas espécies de
Eimeria de roedores e de coelho. Contudo, ao contrário da parafilia que se observa
nas espécies de Eimeria de roedores em relação aos seus hospedeiros, no caso do
coelho, as espécies de Eimeria formaram um clado monofilético em relação a esse
hospedeiro. Nosso trabalho representa a primeira análise conjunta de espécies de
Eimeria de coelho, roedores e galinha, usando simultaneamente quatro marcadores.
Conforme será apresentado na Discussão, essa análise integrada permitiu identificar
evidências mais concretas sobre e evolução das espécies do gênero Eimeria.
Ursula Castro de Oliveira Resultados
80
Figura 11 - Filograma obtido por máxima verossimilhança dos quatro marcadores moleculares concatenados para as espécies de Eimeria de galinha, coelho e roedores. Marcadores moleculares utilizados: SSU, LSU, citocromo b e ORF470. Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. As espécies de Eimeria contendo resíduo do oocisto estão marcadas em azul. Os quadros indicam os diferentes hospedeiros.
4.2.6 Reconstrução filogenética com máxima amostragem de taxa
Visando a obtenção de um panorama evolutivo mais amplo em termos de
hospedeiros, decidimos construir um novo conjunto de dados utilizando o maior
número possível de espécies de Eimeria, oriundas de uma maior gama de
hospedeiros. Nesse caso, foi utilizado um único marcador molecular, a SSU de rRNA
nuclear e incluiu-se no conjunto as sequências nucleotídicas maiores do que 1.000
pb. Esse conjunto de dados de máxima amostragem de taxa incorporou em relação
ao conjunto de dados anterior (máxima evidência) várias espécies de Eimeria de
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
81
aves (peru, faisão, pica-pau e garça), ruminantes (ovino e bovino), suínos, várias
espécies adicionais de roedores, marsupial, morcegos, répteis e de um anfíbio. O
alinhamento foi feito conforme descrito no item 3.13.2, utilizando-se dados
estruturais do rRNA para guiar a edição manual. Semelhantemente à análise
descrita anteriormente, utilizou-se o programa RAxML com o modelo evolutivo
GTR+I+ para a reconstrução filogenética com máxima verossimilhança. A Figura 12
apresenta a árvore filogenética obtida para um total de 60 espécies distintas de
Eimeria.
Em relação às espécies de Eimeria de aves, observou-se que E. tenella e E.
necatrix apresentam-se mais próximas de duas espécies de Eimeria de perus do
que das cinco demais espécies de Eimeria de galinha. Uma dessas espécies de
peru é E. adenoeides, cuja relação próxima com E. tenella e E. necatrix já havia sido
demonstrada por Morrison et al. (2004) usando o mesmo marcador. A outra amostra
refere-se a um isolado de Eimeria de peru não caracterizado em termos de espécie
(código de acesso HM117016 – Miska et al., 2010). Uma amostra de Eimeria isolada
de faisão, e também não caracterizada em termos de espécie (código de acesso
HM117010 – Miska et al., 2010), se mostrou mais próxima das cinco outras espécies
de Eimeria de galinha do que de E. tenella e E. necatrix. Concluindo, essas
amostras de Eimeria de peru e faisão sugerem a ocorrência de parafilia das
espécies de Eimeria de aves. Contudo, esse dado deve ser tomado com precaução
pelo fato de ter sido determinado para um único marcador (SSU de rRNA nuclear), e
dos valores de suporte dos nós serem relativamente baixos. Finalmente, as espécies
de Eimeria de garças (Gruiformes) se mostraram filogeneticamente muito distantes,
estando mais próximas das amostras do anfíbio e dos répteis, e da raiz da árvore.
Em relação às espécies de Eimeria de coelho, não houve ocorrência de
parafilia, e a topologia observada foi semelhante à descrita anteriormente (Figuras 8
a 11). Embora as ordens Lagomorpha e Rodentia sejam filogeneticamente próximas,
as espécies de Eimeria de coelho se mostraram bem mais relacionadas com
espécies de ruminantes e suínos do que com espécies de Eimeria de roedores. Os
parasitas de suínos e de ruminantes (bovino e ovino), por sua vez, formaram clados
distintos. Contudo, observou-se parafilia em relação ao hospedeiro ovino, com a
inclusão de uma espécie de Eimeria de boi no mesmo clado. Ao lado deste grupo
temos vários clados de hospedeiros onívoros. O próximo clado separado dos demais
Ursula Castro de Oliveira Resultados
82
é composto por espécies de Eimeria de suínos. Estas espécies também não
possuem resíduo de oocisto.
No caso dos roedores, os dois clados observados anteriormente (Figura 11)
se mantiveram com a incorporação das espécies adicionais de Eimeria. Assim como
observado por Zhao et al. (2001), o grupo das espécies de Eimeria de roedores se
mostrou parafilético, com duas espécies de Eimeria de morcegos (E. antrozoi, com
resíduo de oocisto, e E. rioarribaenses, sem resíduo de oocisto) formando um clado
conjuntamente com espécies de roedores. Próximo ao grupo acima, contudo um
pouco mais externo encontram-se duas espécies de Eimeria de quirópteros, E.
pilarenses (Duszynski et al., 1999) e E. catronensis (Seville e Gruver, 2004), que não
possuem resíduo de oocisto e formam um clado. O gênero do morcego hospedeiro
destas duas espécies é Myotis, o mesmo que alberga a E. rioarribaenses. É preciso
ressaltar que os valores de suporte para os ramos das espécies de Eimeria de
morcegos foram todos muito baixos, o que significa que essa topologia não é
necessariamente a verdadeira, e isso poderia explicar a parafilia do clado de
espécies de Eimeria de roedores e quirópteros.
O próximo grupo mais externo aos descritos acima, é o que contem espécies
de Eimeria de anfíbios (ordem Anura) e de répteis (ordem Serpentes), E. ranae e E.
arnyi, respectivamente (Jirků et al., 2009; Upton e Oppert, 1991). Em seguida,
aparece um ramo correspondente a E. trichosuri (Power et al., 2009), uma espécie
de Eimeria de marsupial (gambá – Trichosurus vulpecula) da Oceania. Mais
externamente aparece um clado formado por E. reichenowi e E. gruis (Matsubayashi
et al., 2005), duas espécies de Eimeria que infectam aves da ordem Gruiformes.
Finalmente, mais proximamente da raiz, está E. tropidura, uma espécie que infecta
um lagarto do gênero Tropidurus no arquipélago de Galápagos (Couchet al., 1996).
83
83
Figura 12 - Filograma obtido por máxima verossimilhança da SSU de rRNA nuclear para as espécies de Eimeria de diversos hospedeiros. Os valores de
bootstrap encontram-se indicados nos nós. As espécies de Eimeria contendo resíduo do oocisto estão marcadas em azul. Os quadros indicam os diferentes hospedeiros.
Ursula Castro de Oliveira Resultados
84
4.2.7 Análise demográfica das espécies de Eimeria
Com o objetivo de testar a hipótese de que tenha ocorrido co-especiação
entre as espécies de Eimeria e seus hospedeiros, foram feitas análises Bayesianas
para a determinação do tempo para o ancestral comum mais recente (TMRCA –
Time to Most Recent Common Ancestor) de cada grupo monofilético (item 3.13.6).
Para isso, foi utilizado como conjunto de dados o alinhamento concatenado de
marcadores (SSU de rRNA nuclear, LSU de rRNA de apicoplasto, citocromo b
mitocondrial e ORF470 de apicoplasto) de espécies de Eimeria de galinha, coelho e
roedores. Utilizou-se o programa BEAST sob o modelo GTR+I+ modelo de
relógio molecular estrito (strict clock) com uma taxa fixa de substituição por sítio.
Como não existem registros fósseis de parasitas do gênero Eimeria, e não existem
pontos de calibração óbvios para o relógio molecular desses parasitas, utilizamos
uma taxa de evolução de 4,43 x 109 substituições por sítio por ano, a qual foi
baseada numa média de estimativas obtidas para o gênero Plasmodium (ver item
3.13.6).
Foram testados vários modelos de história demográfica, os quais definem
as probabilidades a priori de cada análise. Inicialmente utilizou-se o modelo Skyline
Bayesiano coalescente (Coalescent: Bayesian Skyline - bsl), que é mais apropriado
para genealogias intra-específicas. Por essa razão, decidiu-se empregar também os
modelos de Yule e birth-and-death. O modelo birth-and-death considera o
nascimento e morte de linhagens ao longo do tempo. Por sua vez, o modelo de co-
especiação de Yule é um método estocástico no qual as taxas de especiação variam
com o tempo e com número de espécies. A Tabela 6 mostra que resultados das
probabilidades posteriores foram bastante semelhantes entre os três diferentes
modelos demográficos.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
85
Tabela 6 - Resultados estatísticos da análise com o programa BEAST utilizando os modelos demográficos de bsl, Yule e birth-and-death (bd). Conjunto de dados: alinhamento concatenado de marcadores (SSU de rRNA nuclear, LSU de rRNA de apicoplasto, citocromo b mitocondrial e ORF470 de apicoplasto) de espécies de Eimeria de galinha, coelho e roedores.
Contudo, decidimos ainda realizar com o programa Tracer uma comparação
pareada dos modelos demográficos através do cálculo do fator de Bayes, e
identificar qual deles (Yule, birth-and-death e bsl) seria mais adequado para
representar os dados. Para isso, o programa Tracer calcula a média harmônica do
valor de verossimilhança (posterior) dos resultados de dois modelos e,
posteriormente, determina o valor da diferença no espaço logarítmico. Valores de BF
superiores a 20 são considerados suficientemente altos para favorecer fortemente
um modelo em comparação com o outro
(http://beast.bio.ed.ac.uk/Model_comparison). Conforme pode ser visto na Tabela 7,
a comparação dos modelos bd contra bsl, e Yule contra bsl resultou em valores
muito altos, acima de 100, demonstrando que o modelo bsl é muito menos
adequado aos nossos dados do que os modelos bd e Yule. A comparação dos
modelos bd e Yule gerou valores em torno de 1, o que demonstra que nenhum
desses modelos apresenta vantagem significativa em relação ao outro, para esse
conjunto de dados. Em função desses resultados, serão mostrados daqui para frente
apenas os resultados obtidos com esses dois modelos nas análises subsequentes.
Resultado estatístico bsl bd Yule
Média -25.498,51 -25.265,62 -25.265,67
Desvio padrão 2,27 2,03 0,12
Mediana -25.495,86 -25.263,33 -25.265,22
Probabilidade posterior inferior 95% -25.508,29 -25.273,00 -25.274,56
Probabilidade posterior superior 95% -25.483,58 -25.254,60 -25.256,39
Tempo de auto-correlação (ACT) 40.118,09 40.000 44.714,02
Tamanho efetivo da amostra (ESS) 4.486,75 4.500 4.025,58
Ursula Castro de Oliveira Resultados
86
Tabela 7 - Análises pareadas de verossimilhanças marginais dos modelos utilizados para o estudo demográfico das espécies de Eimeria de diferentes hospedeiros.
Abreviações: S.E. – smoothed estimate.
As análises demográficas realizadas com o uso dos modelos bd e Yule
apresentaram resultados convergentes. A Figura 13 mostra um gráfico da
distribuição dos valores de verossimilhança nas quatro diferentes corridas de cada
modelo. A aparência do gráfico, usualmente denominada “lagarta peluda” (hairy
caterpillar), pode ser considerada um resultado muito bom em termos de análise
Bayesiana, visto que houve convergência de resultados entre as diferentes cadeias
de cada modelo, e entre os distintos modelos. Além disso, não foram observadas
grandes flutuações e nem tendências no gráfico, o que demonstra a estabilidade da
MCMC (cadeia de Markov Monte Carlo).
As árvores filogenéticas obtidas com os modelos bd e Yule apresentaram
topologias idênticas (dados não mostrados). Em função disso, os resultados de
ambos os modelos foram combinados com o programa LogCombiner e através do
programa TreeAnnotator foi determinada a árvore de máxima credibilidade de clados
(maximum clade credibility tree), ou seja, a árvore com o maior produto de
probabilidades posteriores de clados (Figura 14). Pode-se ver nesta árvore que as
espécies de Eimeria de mamíferos formam um clado separado do clado das
espécies de aves, contendo, por sua vez, dois grupos de espécies: as espécies que
infectam roedores (Rodentia) e as espécies que infectam coelhos (Lagomorpha).
Além disso, observa-se que cada um dos grupos acima ainda se subdivide em
clados de espécies contendo ou não o resíduo do oocisto.
Modelo ln P(modelo|data) S.E. Fator de Bayes
bd bsl Yule
bd -25.271,94 +/- 0,22 - 102,74 1,14
bsl -25.508,51 +/- 0,37 -102,74 - -101,60
Yule -25.274,55 +/- 0,32 -1,14 101,60 -
87
87
Figura 13 - Distribuição de valores de posteriores ao longo do comprimento da cadeia. O gráfico apresenta os resultados de quatro cadeias independentes para cada modelo testado (bd e Yule).
88
Figura 14 - Árvore de máxima credibilidade dos clados obtida através dos dois métodos utilizados no BEAST, utilizando quatro marcadores moleculares
(SSU, LSU, citocromo b e ORF470) concatenados para as espécies de Eimeria de galinha, coelho e roedores. Os valores de posteriores encontram-se indicados nos nós. As espécies de Eimeria de coelho e roedores marcadas em azul possuem oocisto com corpo residual, as demais espécies não possuem corpo residual nos seus oocistos. Os quadros indicam os três diferentes grupos de hospedeiros.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
89
Finalmente, determinou-se o tempo para o ancestral comum mais recente
(TMRCA) dos grupos de espécies que infectam galinhas, coelhos e roedores. Para
isso, usou-se o programa LogCombiner para combinar os arquivos de saída das
quatro corridas independentes, feitas com cada um dos modelos demográficos (Yule
e bd). Os arquivos com os dados combinados foram então carregados no programa
Tracer e usados para gerar um gráfico das densidades marginais posteriores de
cada um dos três hospedeiros. Conforme pode ser visto na Figura 15, observam-se
claramente ondas de invasão com TMRCAs distintos para os diferentes
hospedeiros. Além disso, é possível notar que houve congruência das curvas
obtidas com os dois modelos. Esses dados sugerem que os hospedeiros sofreram
diferentes ondas de invasão por parte dos parasitas. A Tabela 8 apresenta os dados
numéricos detalhados da análise, incluindo as datas estimadas para a invasão de
cada hospedeiro. Assim, a primeira onda de invasão do ancestral dos roedores teria
ocorrido ao redor de 14 milhões de anos atrás, seguida da invasão do ancestral da
galinha em torno de 12 milhões e, por último, da invasão do ancestral do coelho
cerca de 7 milhões de anos atrás. A Figura 16 apresenta as datas de divergências
estimadas em 15 milhões para os ancestrais de Eimeria, já a divergência entre
ancestrais de Eimeria e T. gondii parece ter ocorrido em torno de 61 milhões de
anos atrás.
Ursula Castro de Oliveira Resultados
90
Figura 15 - Estimativas Bayesianas do TMRCA e distribuição da probabilidade posterior
marginal usando os modelos demográficos Yule e birth-and-death. Os organismos hospedeiros estão indicados.
91
91
Tabela 8 - Datas estimadas em torno das quais podem ter ocorrido as invasões dos ancestrais de cada grupo de hospedeiro obtidos através dos métodos de Yule e birth-and-death.
Estatística Yule_roedores bd_roedores Yule_galinhas bd_galinhas Yule_coelhos bd_coelhos
Média 14,48 E6 14,48 E
6 11,82 E
6 11,82 E
6 7,00 E
6 6,98 E
6
Desvio padrão 10.133,27 10.595,40 8.176,95 8.496,69 6.203,05 6.510,15
Mediana 14,46 E6 14,47 E
6 11,81 E
6 11,81 E
6 6,99 E
6 6,98 E
6
Média geométrica 14,46 E6 14,45 E
6 11,81 E
6 11,79 E
6 6,99 E
6 6,97 E
6
Probabilidade posterior inferior 95% 13,25 E6 13,27 E
6 10,80 E
6 10.776 E
6 6,24 E
6 6,17 E
6
Probabilidade posterior superior 95% 15,78 E6 15,73 E
6 12,91 E
6 12,86 E
6 7,82 E
6 7,80 E
6
Tempo de auto-correlação (ACT) 42.675,38 44372,87 40.000 40.000 40.000 41.417,04
Tamanho efetivo da amostra (ESS) 4.217,89 4.056,53 4.500 4.500 4.500 4.346,04
Ursula Castro de Oliveira Resultados
92
4.2.8 Análise da substituição nas sequências codificantes de proteínas
Com o objetivo de evidenciar o tipo e número de substituições que ocorreram
na proteína ORF470, foi feita uma análise cladística (Figura 16). Foram utilizadas
sequências geradas em nosso laboratório para espécies de Eimeria de galinha e
coelho, assim como sequências públicas para espécies de Eimeria de roedores. A
reconstrução filogenética obtida permite claramente observar que duas espécies, E.
maxima (hospedeiro galinha) e E. langebartelli (hospedeiro Reithrodontomys –
cricetídeo), apresentam ramos muito mais longos, contendo uma grande número de
substituições quando comparadas às demais espécies de Eimeria. E. maxima
apresentou um número de autapomorfias muito maior do que qualquer outra
espécie, seguida de E. langebartelli e E. albigulae (hospedeiro Neotoma–
cricetídeo). Esse resultado sugere que E. maxima possa estar sofrendo uma
aceleração da taxa de evolução em relação às outras espécies, a qual possa estar
sendo causada por uma adaptação ao nicho. Outro aspecto que se destaca é o alto
número de substituições homoplásicas, especialmente em E. brunetti (hospedeiro
galinha) e E. langebartelli. Comparando-se E. maxima (20 substituições) e E.
langebartelli (21 substituições), observa-se que a primeira apresenta 14
autapomorfias e 6 homoplasias para fora, enquanto a segunda contém 9
autapomorfias e 12 homoplasias para fora. Esse resultado sugere que E.
langebartelli está sofrendo uma evolução convergente. Em relação à presença de
resíduo de oocisto, existem duas sinapormorfias que definem em Eimeria de
roedores o clado, composto pelas espécies E. albigulae, E. onychomysis, E.
arizonensis e E. reedi. No caso das espécies de Eimeria de coelho, o clado das
espécies de Eimeria que contém resíduo de oocisto também é definido por duas
sinapomorfias.
93
93
Figura 16 - Cladograma obtido para sequências da proteína ORF470 de espécies de Eimeria de galinha, coelho e roedores. O comprimento dos ramos é
proporcional ao número de substituições reconstruídas. Os hospedeiros estão indicados pelos quadros coloridos. O tipo de substituição e os índices de consistência relativos a cada sítio também estão indicados.
28: T→I
79: I→V
102: F→Y
26: S→G
54: T→A
136: N→D
137: S→F
165: V→I
205: S→C
230: Y→H
9: T→V
11: T→A
19: I→V
25: E→D
36: V→I
44: V→I
59: I→V
70: Y→H
78: T→V
81: S→P
104: A→K
132: L→I
140: V→I
164: L→F
167: N→D
171: L→I
172: N→D
183: D→N
203: N→H
204: A→S
208: W→R
230: Y→N
41: V→I
136: N→S
209: V→I
27: N→H
93: I→T
167: N→D
74: S→L
226: L→I
233: S→R
11: T→A
203: N→D
219: W→R
34: V→I
78:T→M233: S→R
135: S→G
49: N→S
59: I→M
70: Y→S
136: N→S
13: N→K
14: S→G
21: L→Q
230: Y→V
47: I→V
65: I→L
139: S→T
24: Q→K
67: Y→C
203: K→N
230: Y→C
23:T→A
232: S→A
36: V→L
67: Y→F
9: T→G
10: N→C
11: T→C
12: F→I
13: N→T
16: L→S
21: L→V
28: T→M
121: S→A
204: A→S
230: Y→H
19: I→V
102: F→Y
17: E→K
31: T→K
54: T→I
88:A→S
104:A→T
138:A→S
140:V→A
185:S→T
205:S→L
209:V→I
230:Y→F
2: F→Y
5: K→E
10: N→H
78: T→S
247: S→A
135: G→S
230: Y→S
19: V→A199:W→C
204: A→S
227: I→V
28: T→I
29: I→F
44: V→I
59: I→L
135: G→N
215: S→A
230: Y→S
14: S→L135: N→S
6: E→D
24: Q→K
28: I→V
207: D→N
230: S→F
5: K→E
7: I→T
202: K→T
227: I→V
23: T→A
21: L→V
170: I→T
230: S→Y23:T→A
199: R→K
5: K→E
12: F→L
49: N→T
170: I→T
209: V→I
27: N→K
28: T→L
34:V→I
69:P→S
139:S→Y
205: S →L
7: I→S
135: S→D
81: S→P
54: T→N
187: E→D
41: V→I
52: I→L
209: V→I
229: N→D
247: S→A
10: N→I
29: I→V
30: S→L
31: T→V
32: L→S
56: I→V
80: V→I
81: S→L
118: R→K
137: S→F
141: I→S
167: E→N
169: G→S
181: R→Y
201: L→F
204: A→S
216: A→I
223: S→T
232: S→I
244: M→L
59: I→M
2: F→I
10: N→L
36: I→V
74: L/S→M
78: T→V
135: S→N
141: I→V
158: V→I
165: V→I
181: R→H
185: S→L
205: L→I
76: I→V
17: N→K
23: N→M
136: I/T→F
167: E→N
201: L→F10: N→T
29: I→V
6: K→E
9: N→T
15: I→L
102: F→Y
135: S→N56: I→V
69: S→P
E.
ma
xim
a
E.
bru
ne
tti
E.
mitis
E.
ace
rvu
lina
E.
pra
eco
x
E.
ne
ca
trix
E.
ten
ella
T.
go
nd
ii
E.
irre
sid
ua
E.
pir
ifo
rmis
E.
fla
ve
sce
ns
E.
exig
ua
E.
ve
jdo
vskyi
E.
pe
rfo
ran
s
E.
stie
da
i
E.
me
diaE.
ma
gn
a
E.
inte
stin
alis
E.
co
ecic
ola
E.
alb
igu
lae
E.
ari
zo
ne
nsis
E.
ree
di
E.
falc
ifo
rmis
E.
se
vill
ete
nsis
E.
nie
schu
lzi
E.
pa
pill
ata E
. se
pa
rata
E. langebarte
li
Índice de Consistência (CI):
0,0-0,090,10-0,190,20-0,290,30-0,390,40-0,490,50-0,590,60-0,690,70-0,790,80-0,890,90-0,991,0
único, uniforme acima
mudança acima, não fora
homoplasia acima
homoplasia fora
homoplasia dentro e fora
19: I→L
E.
on
ych
om
ysis
Coelho
Roedores
Hospedeiros:
Galinha
5 DISCUSSÃO
Ursula Castro de Oliveira Discussão
95
5.1 Discriminação de Eimeria spp. de coelho e suas implicações
A coccidiose é a principal doença parasitária de aves e outros animais de
produção, incluindo o coelho. Um total de onze espécies de Eimeria infectam o
coelho doméstico, sendo que dez delas colonizam o trato intestinal e uma espécie,
E. stiedai infecta os dutos biliares do fígado (Coudert, 1989; Licois e Coudert, 1982).
A despeito dos avanços das técnicas moleculares, a coccidiose dos coelhos tem
sido pouco abordada. Em função disso, a discriminação das onze espécies de
Eimeria ainda tem sido feita por parâmetros biológicos como morfologia dos
oocistos, sítios de colonização, localização, aspecto e profundidade das lesões,
período de pré-patência, etc. (Eckert et al., 1995).
Com relação a testes moleculares, somente ensaios de RAPD para a
diferenciação de nove das onze espécies foram descritos (Cere et al., 1995, 1996,
1997). O RAPD foi um método muito usado na década de 90 pelo fato de não
requerer nenhuma informação acerca das sequências nucleotídicas das moléculas-
alvo da amplificação. Contudo, a contrapartida dessa vantagem é que a técnica é
baseada no uso de iniciadores arbitrários sob uma estringência muito baixa. Com
isso, ao invés de obtermos uma única banda de amplificação, o resultado é um perfil
de bandas que constitui uma impressão digital da amostra (fingerprint). Essa
característica inviabiliza o uso de RAPD em amostras mistas, uma condição muito
frequente em espécimes coletados no campo, uma vez que a sobreposição de
diferentes perfis torna a leitura do resultado praticamente impossível. Finalmente,
dada à baixa estringência da amplificação, o método é muito afetado por possíveis
contaminações, e sua reprodutibilidade entre laboratórios é bastante baixa.
Em função da situação descrita acima, decidimos desenvolver um conjunto de
ensaios moleculares para a detecção e discriminação das onze espécies de Eimeria
que infectam o coelho. Como alvo molecular, foi escolhido o ITS1, um marcador que
apresenta um polimorfismo inter-específico relativamente alto, mas com baixa
variabilidade intra-específica. Essa característica o torna um alvo muito adequado
para o desenvolvimento de ensaios de discriminação de espécies. De fato, esse
marcador foi empregado com sucesso para o desenvolvimento de ensaios para a
discriminação de espécies de Eimeria de galinha doméstica (Schnitzler et al., 1998,
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
96
1999). Decidimos então utilizar a mesma abordagem para o desenvolvimento de um
método de diferenciação de espécies de Eimeria de coelho.
O desenvolvimento dos ensaios consistiu em uma primeira etapa em que
utilizamos iniciadores dirigidos contra sequências flanqueadoras conservadas,
visando à amplificação do ITS1 de todas as espécies. Em uma segunda etapa,
foram desenhados iniciadores direcionados para regiões polimórficas espécie-
específicas. Inicialmente foram observadas algumas reações cruzadas, tendo sido
detectadas E. media e E. intestinalis em algumas amostras de outras espécies. Após
novas propagações das cepas, a partir de oocistos individuais, nenhuma reatividade
cruzada foi observada, confirmando-se assim a especificidade de todos os ensaios.
O encontro de contaminação de amostras com E. intestinalis é bastante comum,
visto que esta espécie apresenta um alto potencial reprodutivo, e pode rapidamente
ultrapassar outras espécies de Eimeria durante uma infecção experimental.
Com relação à sensibilidade, todas as espécies apresentaram bandas de
amplificação até o limite de 500 fg a 1 pg. Se considerarmos que cada célula
(esporozoíto) contém 75 fg de DNA, conforme determinado por Cornelissen et al.
(1984), o nosso protocolo de diagnóstico molecular é capaz de detectar 0,8 a 1,7
oocistos esporulados. Esse resultado é similar ou melhor do que resultados típicos
descritos na literatura. Schnitzler et al. (1998) reportaram um limite de detecção de
25 oocistos para E. brunetti usando um ensaio baseado em PCR do ITS1. Utilizando
o ITS2 como alvo, Gasser et al. (2001) observaram um limite de detecção de 5 a 10
pg de DNA para Eimeria de galinha. Fernandez et al. (2003b) obtiveram uma
sensibilidade de 1 pg usando marcadores SCARs múltiplos ou individuais para
galinha doméstica. Todos esses estudos utilizaram diluições seriadas de DNA para
calcular a sensibilidade, porém condições de ensaio na vida real podem apresentar
uma sensibilidade menor. De fato, nosso grupo observou para oocistos de Eimeria
de galinha que o rendimento de purificação de DNA não é linear em relação à
quantidade de oocistos da amostra (Fernandez et al., 2003b). Amostras com baixas
quantidades de oocistos, possivelmente apresentam uma menor eficiência de
quebra, o que se traduz na obtenção de quantidades de DNA dramaticamente
menores. Esse fato resulta numa redução de sensibilidade em cerca de uma ordem
de magnitude. Vários métodos químicos ou mecânicos/químicos têm sido propostos
para o rompimento dos oocistos, mas acreditamos que ainda não exista um método
reprodutível para a quebra dos oocistos com altos rendimentos de DNA. Apesar
Ursula Castro de Oliveira Discussão
97
desta limitação, a sensibilidade do nosso teste ainda é suficientemente alta para a
detecção de quantidades de parasitas inferiores às que causariam sinais clínicos e
perdas econômicas.
Uma sensibilidade alta é importante para se detectar espécies de Eimeria que
ainda estejam em concentrações sub-clínicas, mas que devido à sua alta
capacidade de reprodução, casos de E. intestinalis e E. vejdovskyi (Pakandl, 2009),
possam tornar-se clinicamente relevantes. No caso de E. intestinalis, por exemplo,
foi demonstrado que a inoculação de coelhos não imunes pode resultar na produção
de 3-5 x 108 oocistos por animal, com 50% de mortalidade (Coudert et al., 1995).
Assim, mesmo a presença de quantidades muito pequenas dessa espécie deveria
ser prontamente detectada em amostras de campo, antes que sinais clínicos e
perdas de produção se tornassem perceptíveis. Uma aplicação prática importante de
um ensaio de alta sensibilidade é a monitoração da pureza de amostras de Eimeria
utilizadas em pesquisas laboratoriais, bem como em testes de campo. Tais amostras
deveriam ser regularmente testadas contra contaminações cruzadas, especialmente
para aquelas espécies de Eimeria cujas populações são altamente prevalentes,
crescem rapidamente, e podem facilmente ultrapassar as espécies originalmente
presentes nas amostras. Essa aplicação se reveste de uma importância ainda maior
no caso de linhagens de Eimeria destinadas à composição de possíveis vacinas
multivalentes no futuro. A identificação acurada de espécies de Eimeria também é
importante na prática de campo por causa da alta variabilidade de patogenicidade
entre as diferentes espécies. Por exemplo, E. coecicola e E. perforans são não
patogênicas ou pouco patogênicas, enquanto outras espécies, como E. intestinalis e
E. flavescens, são altamente patogênicas (Coudert et al., 1995). Portanto, os
ensaios descritos neste trabalho podem contribuir para revelar a etiologia precisa de
surtos de coccidiose em coelhos.
Concluindo, desenvolvemos com êxito um conjunto de ensaios de diagnóstico
molecular que permitem discriminar com eficiência as onze espécies de Eimeria que
infectam o coelho doméstico. Esses ensaios poderão permitir a realização de
levantamentos de populações de parasitas com alta especificidade e sensibilidade,
contribuindo para uma melhor compreensão da epidemiologia desse importante
grupo de parasitas.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
98
5.2 Reconstrução filogenética
5.2.1 Árvores de genes e árvores de espécies
Um dos grandes desafios na análise filogenética é a obtenção de resultados
acurados. Entre os fatores mais importantes para uma reconstrução filogenética
acurada estão o número de genes amostrados, a amostragem de taxa, e o método
de reconstrução utilizado. Um grande número de trabalhos de reconstrução
filogenética têm sido feitos com a utilização de marcadores clássicos como os genes
da SSU e LSU de rRNA nuclear, citococromo b mitocondrial, entre outros. Uma vez
que diferentes marcadores moleculares sofrem diferentes pressões de seleção,
podem haver variações muito importantes na história evolutiva entre eles. Assim, a
análise filogenética de qualquer marcador isolado não descreve a história evolutiva
de uma dada espécie, mas, sim, daquele marcador em particular, e a árvore obtida é
considerada uma “árvore do gene” (gene tree). Isso explica porque reconstruções
filogenéticas, realizadas com marcadores distintos, frequentemente apresentam
incongruências entre si, e as árvores resultantes contêm diferenças de topologias
(Pamilo e Nei, 1988). Visando reduzir o efeito das diferentes histórias evolutivas de
cada gene, surgiu a ideia de se usar conjuntos de dados compostos de vários genes
distintos. A inferência filogenética de tais conjuntos de dados resultaria em uma
árvore de espécies (species tree). Um dos primeiros trabalhos e avaliar esta
abordagem em escala genômica foi relatado por Rokas et al. (2003). Utilizando
dados de genomas completos de sete espécies do gênero Saccharomyces, esses
autores selecionaram 106 genes ortólogos para um estudo filogenético. Os autores
concluíram que conjuntos de dados contendo um ou poucos genes podiam gerar
árvores topologicamente incongruentes, ainda que cada uma delas apresentasse
valores de suporte relativamente altos. Contudo, usando genes concatenados, os
autores verificaram que qualquer combinação de vinte genes era capaz de gerar
árvores perfeitamente congruentes, e com valores de suporte superiores a 95%. O
uso de um maior número de marcadores diluiria eventuais variações individuais
entre as taxas de evolução de cada marcador e poderia assim dirimir sinais
Ursula Castro de Oliveira Discussão
99
conflitantes entre eles. Essas árvores podem ser consideradas como árvores de
espécies (species trees).
Conclusões semelhantes foram obtidas por Kuo et al. (2008), quando
analisaram 268 genes de cópia única, compartilhados em parasitas do filo
Apicomplexa. Utilizando genes individuais na inferência filogenética, os autores
observaram um total de 48 topologias distintas. Ao utilizar um conjunto de dados
consistindo dos genes concatenados, os autores obtiveram uma árvore com a
mesma topologia do que aquela obtida a partir do consenso das 48 topologias, em
todos os métodos testados (neighbor-joining, máxima parcimônia e máxima
verossimilhança). Os valores de suporte da árvore obtida com os genes
concatenados foram de 100% para todos os nós. Comparando-se com o uso de
genes individuais, a topologia mais frequentemente observada foi suportada por
apenas 19% dos genes. Esses resultados claramente demonstram que há um alto
grau de incongruência topológica entre árvores geradas a partir de diferentes genes,
mas que a utilização de um conjunto de genes concatenados resulta numa árvore de
espécies com altos valores de suporte.
Contudo, a utilização de uma quantidade razoável de genes para resolver
possíveis conflitos de sinal entre eles, não é necessariamente uma condição
suficiente para obter-se uma boa acurácia da reconstrução filogenética. De fato,
Collins et al. (2005) demonstraram que a não estacionariedade dos dados pode
resultar em diferenças composicionais as quais, por sua vez, podem levar à
interpretação errônea de que dois taxa são irmãos. Outro fator que pode resultar em
topologias erradas é a atração por ramos longos, que ocorre quando há uma taxa de
evolução muito rápida e múltiplas substituições podem ter ocorrido em cada
caractere. Hedtke et al. (2006) utilizaram um conjunto de oito genes e reestudaram
os taxa abordados por Rokas et al. (2003) num contexto muito maior de
amostragem, incluindo um total de 78 espécies. Os autores demonstraram que a
amostragem de taxa parece ser tão importante para a acurácia da inferência
filogenética quanto o número de genes. De fato, a utilização de 40 taxa resultou em
valores de bootstrap de 100% com apenas quatro genes. Uma das explicações
desse resultado é que uma alta amostragem de taxa poderia neutralizar os efeitos
da atração de ramos longos.
No gênero Eimeria, os estudos filogenéticos disponíveis até o momento foram
feitos empregando-se como marcadores moleculares genes ribossômicos e de
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
100
apicoplasto (Barta et al., 1997; Jirků et al., 2009; Kvičerová et al., 2008;
Matsubayashi et al., 2005; Power et al., 2009; Zhao e Duszynski, 2001a,b; Zhao et
al., 2001). Nestes trabalhos, os marcadores foram utilizados individualmente,
gerando árvores que possuem grande número de nós com baixo suporte. No caso
da SSU de rRNA, os trabalhos nos levam a concluir, assim como já mostrado por
Morrison et al. (2004), que esse marcador possui um baixo sinal filogenético para
Eimeria devido ao seu alto grau de conservação dentro desse gênero.
Considerando-se os aspectos discutidos acima, relativos à utilização de múltiplos
genes e amostragem de taxa, decidimos no presente trabalho utilizar quatro genes
derivados de três compartimentos celulares: núcleo (gene SSU de rRNA),
mitocôndria (citocromo b) e apicoplasto (genes LSU de rRNA e ORF470). A escolha
dos marcadores moleculares foi baseada em dois aspectos: (1) a existência de
sequências públicas para alguns desses genes em espécies do gênero Eimeria
(Barta et al., 1997; Kvičerová et al., 2008; Morrison et al., 2004; Romano, 2004; Zhao
e Duszynski, 2001a,b); e (2) dados de literatura que mostravam a viabilidade dessa
estratégia. De fato, o primeiro trabalho a utilizar marcadores derivados de genomas
de diferentes compartimentos celulares em Apicomplexa, incluindo uma sequência
(ATPase ClpC) derivada do apicoplasto, foi relatado por Rathore et al. (2001) para a
reconstrução filogenética de nove espécies de Plasmodium. Esses autores
utilizaram, além da ClpC, o citocromo b e a SSU de rRNA nuclear. As análises
filogenéticas realizadas com os marcadores individuais revelaram uma congruência
relativamente alta. Tenter et al. (2002) também sugeriram o uso de marcadores
derivados de diferentes compartimentos, visando, nesse caso, a obtenção de uma
filogenia mais acurada dos organismos da classe Coccidia.
Para se avaliar o sinal filogenético dos marcadores individuais e
concatenados, realizamos uma análise de mapeamento de verossimilhança (item
4.2.1). Os resultados mostraram que a concatenação dos quatro marcadores levou a
um aumento do sinal filogenético quando comparado ao sinal obtido em qualquer um
dos marcadores individuais. Esse resultado foi confirmado pela observação de que a
concatenação dos marcadores filogenéticos aumentou muito o grau de suporte dos
diferentes nós. Além disso, as árvores geradas com o conjunto concatenado através
de métodos de parcimônia (Figura 8), distância (Figura 9) e verossimilhança (Figura
10) demonstraram topologias muito mais semelhantes entre si (item 4.2.3) do que
com os marcadores individuais, bem como valores de suporte de nós muito maiores.
Ursula Castro de Oliveira Discussão
101
5.2.2 Aspectos evolutivos da presença de resíduo de oocisto em Eimeria
Algumas espécies de Eimeria possuem uma estrutura granular no interior de
seus oocistos conhecida como resíduo de oocisto. Kheysin (1971) descreveu este
resíduo como sendo um grânulo de lipídeos que é eliminado do citoplasma do zigoto
durante o processo de esporogonia. Não existem descrições sobre sua possível
função, e é possível que essa estrutura represente apenas um subproduto do
processo de esporulação. Embora a literatura relate apenas a presença ou ausência
do resíduo do oocisto nas distintas espécies de Eimeria, há diferenças morfológicas
importantes.
Nas espécies de Eimeria de roedores, coelhos e morcegos (E. antrozoi),
utilizadas em nosso estudo, o resíduo de oocisto apresenta-se como uma estrutura
nitidamente globular e compacta, contendo um grande número de grânulos lipídicos
agregados (Norton et al., 1977; Reduker e Duszynski, 1985; Duszynski et al.,
1999a). Essa morfologia também é observada em Eimeria de mamíferos da ordem
Scadentia (Duszynski et al., 1999b). Contudo, há várias descrições na literatura em
que o resíduo pode apresentar morfologias diferentes. Assim, há várias espécies de
Eimeria de mamíferos da ordem Insectivora (ex. Eimeria titthus de Parascalops
breweri – “toupeira de cauda peluda”), na qual o resíduo de oocisto é descrito como
um conjunto de grânulos dispersos. Outras espécies de Eimeria desta ordem de
hospedeiros possuem ainda um resíduo descrito com tendo forma irregular
(Duszynski e Upton, 2000). Uma compilação de espécies de Eimeria de mamíferos
da ordem Chiroptera (Duszynski, 2002) apresenta várias descrições de espécies de
Eimeria contendo um resíduo de oocisto com formas e tamanhos irregulares, ou,
ainda, com grânulos dispersos.
A maioria das espécies de Eimeria de aves descritas na literatura não
apresenta resíduo de oocisto, como é o caso das espécies utilizadas em nosso
trabalho. No caso das espécies em que a presença do resíduo é relatada, a
documentação fotográfica é em sua maioria ausente ou de baixa qualidade. Ainda
assim, as descrições apresentam o resíduo como um conjunto de grânulos lipídicos
esféricos ou sub-esféricos, dispersos ou agrupados de forma irregular, como em
espécies de Eimeria de codorna (Bashtar et al., 2010), faisão (Musaev et al., 1998),
pombo doméstico (Alyousif et al., 2009), pomba do Arquipélago de Galápagos
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
102
(McQuistion, 1991), papagaio-do-mar (Leighton e Gajadhar, 1986), gaivota prateada
(Gajadhar e Leighton, 1988), e corvo-marinho-de-orelhas (Yabsley et al., 2002).
Nas espécies de Eimeria de répteis e anfíbios, as descrições do resíduo de
oocisto são bastante variadas (Duszynski, 1969; Duszynski et al., 2007; McAllister e
Upton, 1990; Segade et al., 2006; Siroký et al., 2006). Das espécies que possuem o
resíduo de oocisto, existem aquelas nas quais o resíduo de oocisto é globular,
compacto, e com grânulos lipídicos esféricos. Em algumas outras espécies, o
resíduo do oocisto apresenta grânulos grosseiros agregados ou circundando uma
área vacuolar, ou, ainda, é composto de grânulos dispersos ou que formam uma
massa irregular. Existe ainda um tipo de morfologia em espécies de Eimeria de
anfíbios em que os grânulos lipídicos são circundados por uma membrana. Em
peixes também há espécies de Eimeria que possuem oocistos com e sem resíduo.
Eimeria lepidosirenis, que infecta a piramboia (Lepidosiren paradoxa), apresenta um
resíduo cuja morfologia consiste em uma massa esférica composta de uma mistura
de grânulos pequenos e grandes envoltos de uma fina membrana (Lainson, 2006).
Reduker et al. (1987) descreveram pela primeira vez que o resíduo de
oocisto permitia classificar as espécies de Eimeria roedores da família Cricetidae
(ratos, camundongos e hamsters) em dois clados. Para a análise cladística, os
autores utilizaram a morfologia de oocistos, características do ciclo de vida e padrão
de migração eletroforética de enzimas. Os autores propuseram uma hipótese na
qual esses grupos de Eimeria de roedores cricetídeos teriam se originado a partir de
duas linhagens ancestrais, as quais teriam evoluído independentemente sob dois
possíveis cenários. No primeiro cenário, as duas linhagens já estariam presentes
como taxa irmãos no ancestral dos roedores e, com a posterior divergência e
radiação dos hospedeiros, as linhagens de Eimeria teriam evoluído de forma
independente e concordante. No segundo cenário possível, as linhagens teriam se
originado de dois processos separados de invasão, em tempos diferentes dessa
relação hospedeiro-parasita. Assim, ancestrais de cada uma das linhagens,
presentes em hospedeiros distantes, porém sintópicos, teriam tido sucesso em
invadir e se adaptar em cricetídeos. A partir daí, ancestrais de cada uma dessas
linhagens teriam divergido e sofrido a especiação, explorando novos hospedeiros
cricetídeos. Esse foi o primeiro trabalho a mostrar de forma muito clara a existência
de dois clados de Eimeria de roedores, caracterizados principalmente pela presença
ou ausência de resíduo de oocistos.
Ursula Castro de Oliveira Discussão
103
Zhao e Duszynski (2001a), utilizando os marcadores ORF470 e rRNA 18S
(SSU) em dez espécies de Eimeria de roedores, obtiveram árvores com dois clados
associados à presença ou ausência do resíduo. Esse resultado foi posteriormente
confirmado com o uso de marcadores de rRNA 18S (SSU) nuclear e rRNA 23S
(LSU) de apicoplasto, em um conjunto de 16 espécies de Eimeria de roedores (Zhao
e Duszynski, 2001b). Em outro trabalho do grupo (Zhao et al., 2001), usando os
rRNAs 18S nuclear e 23S de apicoplasto, os autores incluíram duas espécies de
Eimeria de morcegos, E. antrozoi (com resíduo) e E. rioarribaensis (sem resíduo).
Os resultados demonstraram que essas duas espécies se agruparam com as
espécies de Eimeria de roedores com base na presença/ausência do resíduo, e não
pelos respectivos hospedeiros. O conjunto desses resultados levaram os autores a
concluir que as diferenças morfológicas (presença ou ausência de resíduo) dos
oocistos esporulados refletiam mais as relações filogenéticas e evolutivas dos
parasitas e hospedeiros do que a especificidade de hospedeiros das diferentes
espécies de Eimeria.
Os resultados da nossa análise filogenética, utilizando os diferentes
marcadores de forma individual (Figura 7 e ANEXO D - Figuras D1 a D12) ou
concatenada (Figuras 8 a 10), mostraram de forma congruente e inequívoca que as
espécies de Eimeria de galinha e coelho são monofiléticas em relação a esses dois
hospedeiros. No grupo das espécies de Eimeria de coelho, existe uma clara divisão
em dois clados, contendo ou não o resíduo de oocisto. Esse resultado está de
acordo com os resultados já descritos na literatura para espécies de Eimeria de
coelho (Kvičerová et al., 2008) e de outros roedores (Zhao e Duszynski, 2001a,b).
Quando o conjunto de marcadores concatenados incluiu os taxa de Eimeria de
roedores, nossos resultados demonstraram a ocorrência de dois clados mais
externos em relação às espécies de Eimeria de galinha e coelho (Figura 11), e
caracterizados pela presença ou ausência do resíduo do oocisto, semelhantemente
ao que havia sido observado por Zhao e Duszynski (2001a,b).
Os resultados do nosso trabalho, contudo, claramente rejeitam a hipótese de
Zhao et al. (2001), de que o resíduo do oocisto seria filogeneticamente mais
relevante do que a especificidade do hospedeiro. Comparada aos dados de Zhao e
Duszynski (2001a, b) e Zhao et al. (2001), nossa análise incorporou todas as
espécies de Eimeria de dois hospedeiros (galinha e coelho), num total de dezoito
espécies, aumentando significativamente a amostragem de taxa. É importante
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
104
mencionar ainda que os valores de suporte observados em nossa análise foram
claramente superiores àqueles obtidos pelo uso de marcadores individuais em
Eimeria de roedores (Zhao e Duszynski, 2001a,b) e de coelho (Kvičerová et al.,
2008). Assim, se a presença do resíduo do oocisto fosse um caractere
filogeneticamente mais importante do que a especificidade de hospedeiro, deveria
se encontrar uma parafilia das espécies de Eimeria de coelho. No entanto, o que
claramente observamos é o oposto, isto é, as espécies de Eimeria de coelho e
roedores são parafiléticas em relação à presença do resíduo de oocisto.
Acreditamos que a conclusão de Zhao et al. (2001) foi baseada em um número
relativamente pequeno de espécies de Eimeria, caracterizadas por uma relação de
baixa especificidade natural em relação aos seus hospedeiros.
A menor especificidade de hospedeiros em Eimeria de roedores (Duszynski,
1986; Hnida e Duszynski, 1999b; Kvičerová et al., 2007), poderia explicar porque
esse grupo é monofilético em relação ao resíduo de oocisto (uma característica da
linhagem ancestral de Eimeria), mas parafilético em relação aos seus hospedeiros.
No caso do coelho, até onde se sabe, a especificidade de hospedeiro é alta (Levine
e Ivens, 1972), e isso pode ter contribuído para uma maior divergência e
especialização dos parasitas neste animal. Assim, a especificidade de hospedeiro
passaria a representar um caractere filogenético mais importante do que o resíduo
do oocisto. Isso explicaria porque as espécies de coelho que contém resíduo não
formaram um clado com as espécies de Eimeria de roedores com resíduo.
Finalmente, é importante mencionar que embora a literatura considere o
resíduo do oocisto como um caractere binário (ausente/presente), o fato é que do
ponto de vista evolutivo talvez devessem ser considerados múltiplos estados. Assim,
quando presente, o caractere poderia ser classificado em pelo menos três
categorias: compacto/disperso, regular/ irregular e envolto/não envolto (por
membrana). Outro aspecto é que embora não tenhamos encontrado descrições de
resíduos de oocistos globulares compactos em espécies de Eimeria de aves, é
provável que isto talvez tenha ocorrido devido ao baixo número de descrições na
literatura. Possivelmente a característica de ter ou não resíduo de oocisto é muito
antiga neste gênero de protozoário, sendo encontrada em espécies de Eimeria de
organismos hospedeiros pertencentes a uma grande diversidade de animais. Seria
muito interessante, no futuro, obtermos dados moleculares de espécies de Eimeria
que representassem os diferentes grupos de morfologia de resíduo de oocisto, bem
Ursula Castro de Oliveira Discussão
105
como dados biológicos relativos à especificidade de hospedeiro dessas espécies.
Esses dados, aliados aos já disponíveis, poderiam nos fornecer um panorama mais
completo quanto à relevância dos caracteres de especificidade de hospedeiro e
presença/morfologia do resíduo do oocisto nas relações evolutivas de parasitas do
gênero Eimeria.
5.2.3 Eimeria spp. e as invasões dos hospedeiros
Power et al. (2009), baseados em uma análise filogenética de um conjunto de
espécies de Eimeria derivado de uma ampla gama de hospedeiros, especularam
que as espécies de Eimeria de galinha poderiam ter sido originadas de um ancestral
que infectava mamíferos placentários. Essa hipótese se baseava no fato de as
espécies de Eimeria de galinha formarem um clado interno em um grande grupo que
abrange espécies de Eimeria de mamíferos placentários. Nossos resultados (Figura
12), usando o mesmo marcador (SSU de rRNA nuclear), mostram de fato a mesma
topologia. Para essa hipótese ser verdadeira, contudo, seriam necessárias algumas
condições: (1) ocorrência de múltiplos eventos de invasão dos parasitas nos seus
hospedeiros ao longo da evolução; (2) convivência temporal e geográfica de
hospedeiros mamíferos e aves em um mesmo habitat; (3) ocorrência de eventos de
transmissão cruzada e mudança de hospedeiros pelos parasitas; e (4) ausência de
co-evolução entre os hospedeiros e parasitas, exceto quando a especificidade de
hospedeiro já estivesse plenamente consolidada.
Visando testar a primeira premissa, de que possam ter ocorrido múltiplos
eventos de invasão, empregamos uma análise Bayesiana para determinar as
possíveis datas de invasão dos hospedeiros roedores, coelhos e galinhas e da
radiação destas espécies de Eimeria. Para que a análise demográfica tivesse maior
consistência, e refletisse preferencialmente a evolução das espécies, e não a dos
seus genes individuais, utilizamos o conjunto dos quatro genes concatenados (ver
item 4.2.7). Para as datações, assumimos uma taxa fixa de substituição por sítio de
4,43 x 10-9 por ano (ver item 3.13.6). Nossos resultados (Figuras 14 e 15; Tabela 8)
mostram que os ancestrais dos roedores teriam sido invadidos em torno de 14
milhões atrás, os ancestrais da galinha ao redor de 12 milhões, e o ancestral do
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
106
coelho há cerca de 7 milhões de anos atrás. Também podemos inferir que o
ancestral de Eimeria e T. gondii teria divergido em torno de 61 milhões de anos
atrás. Essas datas de invasões foram congruentes quando comparados os
resultados dos dois modelos demográficos utilizados (bd e Yule), conforme pode ser
visto na Tabela 8.
Power et al. (2009) defenderam a hipótese de co-evolução para parasitas do
gênero Eimeria e seus hospedeiros. A co-evolução é uma hipótese bem
estabelecida em vários modelos hospedeiro/parasita. Contudo, a falta de registros
fósseis de parasitas protozoários impede uma definição de uma escala de tempo
que permita comparar a divergência de linhagens de hospedeiros e seus parasitas.
O uso de dados moleculares tem, contudo, permitido testar essa hipótese com
razoável grau de confiabilidade. Jongwutiwes et al. (2005) examinaram 106
genomas mitocondriais de P. vivax para estudar sua expansão. Para a calibração do
relógio molecular foram utilizadas duas datas, de 5 e 7 MAA para a divergência de
homem e chimpanzé. Os autores estimaram o ancestral comum mais recente de P.
vivax e P. falciparum em torno de 200.000 a 300.000 anos atrás. As datas obtidas
corroboram que estas duas espécies de Plasmodium foram parasitas de linhagens
hominídeas antes do surgimento do homem moderno (Homo sapiens) e, neste caso,
as populações de parasitas e hospedeiros teriam se expandido conjuntamente.
Hayakawa et al. (2008), utilizando sequências das três proteínas codificadas pelo
genoma mitocondrial de 21 espécies de Plasmodium, observaram a existência de
dois grupos de espécies com taxas de substituição de aminoácidos e estimaram a
radiação desses grupos em 16-24 e 26-38 milhões de anos atrás (MAA). Essas
datas são muito mais recentes do que a divergência das linhagens de seus
hospedeiros, avaliadas em 75 MAA para a divergência entre primatas e roedores e
310 MAA para mamíferos/aves. Esses autores concluíram que essa grande
discrepância de datas de divergência entre parasitas e hospedeiros exclui a
possibilidade de co-divergência com os hospedeiros. Assim, a divergência dos
parasitas teria se iniciado por meio de eventos de mudança de hospedeiro (host
switching). Outros autores (Hughes e Verra, 2001; Mu et al., 2005; Rich et al., 1998;
Ricklefs e Outlaw, 2010) também calcularam a divergência do gênero Plasmodium e
resultados bastante semelhantes foram encontrados.
Em nossa análise, utilizamos uma taxa baseada na média das taxas de
substituição calculadas por diferentes métodos para Plasmodium. Contudo,
Ursula Castro de Oliveira Discussão
107
sabemos que os parasitas do gênero Plasmodium têm algumas particularidades,
como, por exemplo, a variação antigênica, e não são filogeneticamente tão próximos
de Eimeria quanto T. gondii. Su et al. (2003) determinaram uma taxa de evolução
para T. gondii. Para isso, os autores primeiramente utilizaram uma taxa de 0,85 x
10-10, estimada para a evolução do gene da SSU de rRNA nuclear (Escalante e
Ayala, 1995), determinando assim a data de divergência entre os gêneros
Toxoplasma e Neospora em 12,7 MAA. Essa data foi usada como ponto de
calibração do relógio molecular e, com base num conjunto de dados composto de
ITS1 e introns de genes, os autores estimaram a taxa média de evolução de T.
gondii em 2,12 x 10-8 substituições/sítio/ano.
A simples aplicação dessa taxa em Eimeria não seria em nossa opinião
adequada. Primeiramente, T. gondii apresenta uma estrutura populacional muito
particular e diferente de Eimeria, composta por três linhagens extremamente
homogêneas, denominadas I, II e III, e algumas linhagens mais discrepantes,
conhecidas como “exóticas”. As três linhagens apresentam um alto grau de
homogeneidade genética, que se acredita ter sido originada por uma adaptação à
infectividade oral direta (Su et al., 2003), caracterizada por uma varredura seletiva
(selective sweep) sob forte pressão seletiva positiva, o que permitiu a fixação
simultânea de um conjunto de genes pelo efeito de hitchhiking e a propagação de
linhagens praticamente clonais. Esse trato genético permite que animais carnívoros
e onívoros se infectem com cistos teciduais de T. gondii com muito maior frequência
do que pela contaminação com oocistos liberados pelos hospedeiros definitivos
felinos. Com isso, o parasita pode se perpetuar e propagar na população de
hospedeiros usando majoritariamente a reprodução assexuada. Eimeria, por outro
lado, apresenta um ciclo direto monoxênico em que a etapa de reprodução sexuada
é obrigatória.
Outro aspecto do trabalho de Su et al. (2003) é que os autores utilizaram a
taxa de Escalante e Ayala (1995) para calcular a data de divergência entre os
gêneros Neospora e Toxoplasma, data essa que foi usada para calibrar o relógio.
Essa taxa, embora tenha sido originalmente usada para datações no gênero
Plasmodium, é muito lenta (no mínimo uma ordem de grandeza) do que as
estimativas determinadas por trabalhos posteriores para o gênero Plasmodium (Rich
et al., 1998; Hughes e Verra, 2001; Mu et al., 2005; Hayakawa et al., 2008; Ricklefs
e Outlaw, 2010). Como a divergência entre Neospora e Toxoplasma é um evento
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
108
relativamente recente (12,7 MAA), e a radiação das linhagens é muito mais recente
ainda (cerca de 1000 a 10000 anos atrás), o erro incorrido por esses autores por
utilizar a taxa de Escalante e Ayala (1995) não foi provavelmente muito grande.
Em nosso caso, não há pontos muito óbvios de calibração do relógio
molecular. No caso de Eimeria não há um taxon irmão com dados moleculares
disponíveis, que permita estabelecer uma data de divergência como foi o caso de
Toxoplasma e Neospora. Além disso, tampouco é possível estabelecer datas de
divergência entre hospedeiros como um marco temporal, como foi feito entre
humanos e chimpanzés para P. falciparum e P. reichenowi (Hughes e Verra, 2001).
Em função desse fato, decidimos utilizar a taxa média derivada dos estudos em
Plasmodium. Como discutiremos adiante, mesmo que consideremos que a taxa de
evolução em Eimeria possa ser várias vezes maior ou menor, as conclusões do
nosso trabalho não seriam alteradas.
Dados fósseis indicam que a divergência entre o ancestral das aves
(dinapsídio) e mamíferos (sinapsídio), ocorreu entre 312 a 330 milhões de anos
atrás (± 1,1 milhões de anos) (Donoghue e Benton, 2007; Benton e Donoghue, 2007;
Bromham et al., 1999; Kumar e Hedges, 1998; Nei et al., 2001). Ainda, as radiações
de roedores e Lagomorpha teriam ocorrido há 65 e 90 MAA, respectivamente
(Benton e Donoghue, 2007; Kumar e Hedges, 1998). Nossa análise demográfica
(ver item 4.2.7) estimou que parasitas do gênero Eimeria teriam invadido roedores,
galinha e coelho há 14, 12 e 7 MAA, respectivamente. Esses resultados indicam,
portanto, que a invasão e divergência das espécies de Eimeria foram posteriores à
divergência dos seus hospedeiros. Além disso, o fato de a galinha ter sido invadida
após os roedores, mas anteriormente ao coelho, sugere a possibilidade de que
possa ter havido uma mudança de hospedeiro de um mamífero para uma ave.
Finalmente, a árvore filogenética das espécies de Eimeria (Figura 12), demonstra
que as espécies de Eimeria de galinha, coelho e ruminantes compartilham um
ancestral comum. Assim, a galinha teria sido invadida por um ancestral que já
infectava mamíferos, conforme já havia sido sugerido por Power et al. (2009).
Assim, a despeito da invasão dos roedores pelos parasitas ser bem mais
antiga (14 milhões de anos) do que a do coelho (7 milhões de anos atrás), de acordo
com nossos resultados (ver item 4.2.7; Figura 15, Tabela 8), a especificidade de
hospedeiro parece não ter se restringido em roedores tanto quanto em Lagomorpha.
A baixa especificidade de hospedeiro em Eimeria de roedores pode ter persistido
Ursula Castro de Oliveira Discussão
109
devido à co-habitação de um mesmo habitat por múltiplos hospedeiros por um longo
período de tempo. Por outro lado, em Lagomopha, os hábitos dos diferentes
hospedeiros são bastante diferentes, com o coelho sendo uma espécie gregária,
enquanto as lebres são animais tipicamente solitários. Isso pode ter contribuído para
a definição de habitats distintos para os hospedeiros, e uma maior especialização
dos parasitas.
Em nossa análise (item 3.13.6), utilizamos o modelo de relógio molecular
estrito, com uma taxa de substituição fixa por sítio e, portanto, assumimos que a
mesma taxa de evolução tenha se aplicado a todos os taxa. De fato, há espécies
como E. maxima, entre outras, que demonstraram ramos muito mais longos do que
as demais espécies (Figuras 11 e 16; item 5.2.5). Contudo, quando testamos
modelos de relógio relaxado, entretanto, os resultados não convergiram. A taxa de
evolução que utilizamos foi obtida a partir de uma média de determinações feitas em
Plasmodium. Como não sabemos o quanto esta taxa utilizada difere da taxa real de
evolução do gênero Eimeria, resolvemos refazer a análise demográfica utilizando
taxas cinco vezes mais rápidas (2,21 x 10-8 substituições/sítio/ano) ou mais lentas
(8,86 x 10-10 substituições/sítio/ano). As datas estimadas para as invasões de
roedores, galinha e coelho passaram a ser 1,4, 2,8, 2,4 MAA, respectivamente,
assumindo a taxa mais rápida. Para a taxa mais lenta, os valores foram,
respectivamente, 70, 60 e 35 MAA. Considerando-se que a divergência entre
mamíferos e aves data de 312-330 MAA, nossos dados sugerem fortemente que a
divergência das espécies de Eimeria é muito posterior à de seus hospedeiros.
Finalmente, se analisarmos a árvore filogenética dos hospedeiros (como por
exemplo, no projeto Tree of Life (http://tolweb.org/tree/) e a árvore das espécies de
Eimeria, não é possível reconciliá-las, o que fortemente rejeita a hipótese de co-
evolução.
Assim, nossos dados, juntamente com os reportados na literatura, permitem-
nos concluir que a hipótese de co-evolução entre parasitas do gênero Eimeria e
seus hospedeiros não é suportada devido principalmente às seguintes evidências:
(1) há relatos experimentalmente comprovados de mudança de hospedeiros em
espécies de Eimeria de roedores; (2) as datações da invasão de roedores, galinha e
coelho apontam para uma divergência das espécies de Eimeria muito mais recente
do que a dos respectivos hospedeiros; e (3) a árvore dos parasitas não pode ser
reconciliada com a árvore dos respectivos hospedeiros.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
110
Entretanto, uma vez que uma especialização muito grande do parasita em
relação a um hospedeiro tenha sido estabelecida, resultando numa alta
especificidade de hospedeiro, a co-evolução passa a ser mais provável. Contudo,
ainda nos dias de hoje, esse fenômeno deve ser restrito a algumas espécies de
Eimeria, como, por exemplo, as de galinha, que apresentam altíssima especificidade
de hospedeiro. Já no caso das espécies de Eimeria de roedores, que sabidamente
ainda estão mudando de hospedeiros, a co-evolução não pode ser considerada.
5.2.4 Aspectos ecológicos da relação parasita-hospedeiro no gênero Eimeria
Um dos aspectos chave para uma melhor compreensão da evolução de
parasitas é o conhecimento de suas relações com o ambiente e seus hospedeiros. A
co-existência de populações de diferentes espécies de hospedeiros em um dado
habitat, denominada sintopia (ou simpatria, quando relacionada a uma escala
geográfica maior), representa uma das condições necessárias para que um parasita
possa invadir um novo hospedeiro. O grau de especificidade de hospedeiro, quando
muito alto, pode implicar num processo de co-evolução entre parasita e hospedeiro.
Quando a especificidade é relativamente baixa, há a possibilidade de ocorrência de
eventos de mudança de hospedeiro pelo parasita. Em malária, estudos relacionados
a esses aspectos estão mais avançados, e já existem fortes evidências científicas de
que houve eventos de mudança de hospedeiro em várias espécies de Plasmodium.
Mu et al. (2005) demonstraram através de estudos de frequência de haplótipos de
genoma mitocondrial, padrões de migração dos parasitas, história demográfica e
mapeamento de co-filogenia, que a infecção humana por P. vivax teria se originado
de macacos rhesus asiáticos através de um evento de mudança de hospedeiro .
Escalante et al. (2005), utilizando três genes nucleares e um de apicoplasto, também
concluíram que P. vivax teria se tornado um parasita humano quando o homem
iniciou suas migrações pela Ásia e houve uma mudança de hospedeiro a partir de
macacos. Singh et al. (2004) encontraram infecções naturais de um parasita de
Macaca spp. (P. knowlesi) em humanos na Malásia e Bornéo, abrindo a
possibilidade de que eventos de mudança de hospedeiro possam ter ocorrido entre
macacos rhesus e humanos.
Ursula Castro de Oliveira Discussão
111
Os parasitas do gênero Eimeria que infectam aves têm sido classicamente
considerados altamente específicos em relação a seus hospedeiros (Fernando,
1990; Joyner, 1982; Maquardt, 1973). Essa característica vem sendo utilizada,
juntamente com dados morfológicos e biológicos, para se classificar as espécies do
parasita. Vários artigos na literatura descrevem testes de infecção cruzada in vitro e
in vivo. Ensaios de infecção cruzada in vitro, utilizando esporozoítos de E. tenella em
cultura primária de células de rim de várias espécies de aves, demonstraram a
presença de vários estágios endógenos em células de galinha, faisão, perdiz e peru,
mas o ciclo completo, com formação de oocisto, foi observado apenas em galinha e
faisão (Doran, 1971). Posteriormente, Doran e Augustine (1973) descreveram o
desenvolvimento endógeno completo de E. tenella em células de peru, faisão,
perdiz, codorna e galinha d’Angola. Esses resultados sugeriam que pelo fato de os
parasitas poderem se desenvolver in vitro, talvez fosse possível a ocorrência de
transmissão cruzada e desenvolvimento do ciclo in vivo. Várias tentativas foram
relatadas na literatura para tentar comprovar essa hipótese, sendo que na maioria
das vezes não se conseguiu evidenciá-la. Vetterling (1976) utilizou E. tenella para a
infecção de faisão, peru, galinha d'Angola, codorna e perdiz, não tendo observado
patência em nenhuma dessas espécies. Por outro lado, todas as linhagens de
galinha testadas apresentaram desenvolvimento completo do ciclo, ainda que com
diferentes níveis de susceptibilidade. Embora o desenvolvimento completo de E.
tenella não tenha sido evidenciado em outros hospedeiros, foi demonstrado que
formas esporozoítas são capazes de invadir a mucosa intestinal dos diferentes
hospedeiros (Doran, 1978; Long e Millard, 1979a).
Experimentos de infecção cruzada utilizando espécies de Eimeria de peru
também foram feitas. Steward (1947) demonstrou que E. meleagridis é capaz de
infectar galinha, mas não outas aves como codornas, faisões, perdiz e galinha
d'Angola. Alguns relatos também mostraram que Eimeria dispersa é capaz de
infectar galinha, codorna, faisão e perdiz (Tyzzer, 1929; Doran, 1978). Chapman
(2008), em uma recente revisão sobre Eimeria de peru, compilou as diferentes
tentativas de transmissão cruzada e nenhum outro trabalho adicional foi relatado.
Alguns testes de imunidade cruzada utilizando E. adenoeides em galinhas
demonstraram que ocorre o desenvolvimento de imunidade parcial contra E. tenella
(Augustine e Danforth, 1990). Em outro relato (Augustine et al., 1991), foi observado
que a infecção de galinha com E. adenoeides e E. meleagrimitis conferiu proteção
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
112
parcial contra E. tenella e E. acervulina, mas não contra E. necatrix. Por outro lado, a
infecção de perus por E. tenella e E. acervulina não conferiu imunidade contra E.
adenoeides (Augustine e Danforth, 1995). Em nenhum dos relatos acima, contudo,
foi observada patência, o que indica que a imunidade cruzada deve ter sido gerada a
partir de formas intracelulares presentes no início do ciclo. Esse resultado sugere
que as espécies de Eimeria heterólogas conseguem eventualmente invadir as
células intestinais, mas em alguma etapa subsequente o ciclo é interrompido,
conforme se observa na maioria das tentativas em cultura de células.
As infecções cruzadas de espécies de Eimeria de aves em hospedeiros não
nativos, se ocorrem, são eventos muito raros. Os poucos resultados supostamente
positivos (Tyzzer, 1929; Steward, 1947; Doran, 1978) são muito antigos, e é possível
que os isolados utilizados para as infecções cruzadas não fossem totalmente puros,
e que eventuais contaminações não tivessem sido detectadas. Outro aspecto a ser
considerado, é que todas as tentativas de transmissão cruzada foram feitas em
gêneros diferentes de hospedeiros, mas não em diferentes espécies de um mesmo
gênero. É possível que a barreira de especificidade seja restrita ao gênero, mas não
a espécies, como será discutido abaixo para espécies de Eimeria de roedores.
Finalmente, é importante mencionar que transmissões cruzadas não são observadas
na natureza em galinhas, mesmo em locais aonde há criações mistas com várias
espécies de aves. É possível ainda que na natureza, além de um mecanismo de
especificidade intrínseco do hospedeiro, ocorra também uma exclusão de nicho, por
competição com as espécies nativas de Eimeria.
Um dos aspectos interessantes observados na reconstrução filogenética com
a máxima amostragem de taxa (Figura 12), usando o marcador SSU rRNA, é a
posição das espécies de Eimeria de peru e de faisão. Aparentemente, as espécies
de Eimeria de galinha, peru e faisão são parafiléticas em relação aos seus
hospedeiros. Assim, E. tenella e E. necatrix (originadas de galinha) são
filogeneticamente mais próximas de E. adenoeides (de peru) e um outro isolado de
peru, de espécie não identificada (Miska et al., 2010), do que das demais cinco
espécies de Eimeria de galinha. Semelhantemente, essas outras espécies de
Eimeria de galinha estão mais próximas de uma Eimeria de faisão do que do clado
que contém E. necatrix e E. tenella. Esse resultado está de acordo com os dados
reportados por Morrison et al. (2004), que estudaram relações filogenéticas de
organismos da classe Coccidia com a SSU rRNA, e também obtiveram o mesmo
Ursula Castro de Oliveira Discussão
113
posicionamento para E. adenoeides. Miska et al. (2010), utilizando como
marcadores a SSU rRNA e o gene cox-1 (citocromo c1), também observaram que E.
tenella e E. necatrix formam um clado com isolados de Eimeria de peru e faisão. E.
meleagrimitis (uma outra espécie de Eimeria de peru), e um isolado de Eimeria de
pica-pau, posicionam-se externamente aos clados das demais espécies de Eimeria
de galinha, peru e faisão (Figura 12). Analisando-se os dados, está claro que
existem aparentemente dois clados principais de Eimeria nessas espécies de
hospedeiros. Esses dois clados apresentam uma correlação com o sítio intestinal de
colonização, sendo um grupo com maior número de espécies que infectam
diferentes porções do intestino delgado e, o segundo grupo, composto de E. tenella,
E. necatrix, E. adenoeides e uma espécie de Eimeria de peru não identificada (Miska
et al., 2010), as quais colonizam preferencialmente os cecos em pelo menos um
estágio de desenvolvimento.
Acredita-se que as atuais linhagens de galinha doméstica tenham se
originadas da galinha vermelha da selva (red jungle fowl), do Sudeste Asiático.
Como não se sabe se as atuais espécies de Eimeria de galinha infectavam esse
animal antes da domesticação, foram feitos alguns estudos usando a galinha da
selva do Ceilão (Gallus lafayettei) e a galinha da selva da Malásia (Gallus gallus
spadiceus). Várias espécies de Eimeria foram identificadas nesses hospedeiros,
sendo algumas delas capazes de infectar a galinha doméstica, mas nenhuma delas
produzindo oocistos nos cecos (revisado em Barta et al., 1997). Por outro lado,
perus apresentam várias espécies de Eimeria capazes de colonizar os cecos, entre
elas E. adenoeides, a qual forma um clado com E. tenella e E. necatrix (Morrison et
al., 2004; Figura 12 deste trabalho), duas espécies de Eimeria de galinha doméstica.
Com base nesses dados, Barta et al. (1997) especularam que as atuais espécies
cecais de Eimeria de galinha, E. tenella e E. necatrix, poderiam ter se originado de
uma mudança de hospedeiro pelos parasitas, do peru para a galinha, uma vez que a
domesticação pelo homem teria criado oportunidades de co-habitação desses dois
animais. Contudo, se considerarmos que o peru é um animal originário da América
do Norte, a possível convivência com galinhas somente poderia ter ocorrido a partir
da descoberta da América, há pouco mais de 500 anos. Esse período de tempo
seria curto demais para ocorrer uma divergência tão grande quanto a que se
observa entre as espécies de Eimeria de galinha e peru, mesmo entre aquelas que
colonizam os cecos desses hospedeiros. Parece muito mais provável que os
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
114
trabalhos originais com galinhas da selva não encontraram espécies de Eimeria de
ceco devido à baixa amostragem. Por exemplo, um dos trabalhos da época
(Fernando e Remmler, 1973) utilizou apenas quatro exemplares de galinha da selva
do Ceilão para o levantamento de espécies de Eimeria. O que parece mais provável
é que as atuais espécies de Eimeria de galinha e peru (e talvez de outras aves)
tenham se originado a partir de duas linhagens ancestrais, cujos sítios preferenciais
de colonização já se haviam se diferenciado em intestino delgado e cecos.
Os nosso resultados e os de Morrison et al. (2004) devem, entretanto, ser
tomados com precaução, uma vez que foram obtidos para um único marcador (SSU
de rRNA nuclear), o qual apresenta baixo sinal filogenético para a família Eimeriidae
(Morrison et al., 2004). Recentemente, Miska et al. (2010) observaram resultados
similares usando de forma individual os genes da SSU de rRNA e o cox-1
mitocondrial, o que parece confirmar a proximidade filogenética entre as espécies
cecais de Eimeria de galinha e peru. De qualquer forma, a amostragem de taxa
ainda é baixa para as espécies de Eimeria de aves, com exceção daquelas de
galinha. De fato, no caso do peru, admite-se a existência de pelo menos cinco
espécies distintas de Eimeria e duas outras cuja validade ainda requer confirmação
(Chapman, 2008). No caso do faisão, a identificação do número de espécies ainda
não é clara, dado o baixo número de trabalhos com este hospedeiro. Se
considerarmos que o faisão e o pica-pau tenham pelo menos quatro espécies cada
um, então a amostragem de taxa empregada é de fato muito pequena. Se todas as
espécies de Eimeria de cada um desses hospedeiros fossem empregadas,
certamente teríamos maior segurança em relação à parafilia observada.
Em relação aos Lagomorpha, o coelho (Oryctolagus cuniculus) pode ser
infectado por onze espécies diferentes de Eimeria (Pakandl, 2009). Da mesma
forma, outros gêneros de hospedeiros Lagomorpha também são infectados por
parasitas do gênero Eimeria. Aoutil et al. (2005) fizeram um levantamento de
espécies de Eimeria em lebres europeias (Lepus europaeus e L. granatensis) e
descreveram um total de 21 espécies ou subespécies, sendo algumas delas
encontradas nas duas espécies de hospedeiros. Levine e Ivens (1972) mostraram
que o coelho não pode ser infectado experimentalmente com espécies de Eimeria
de Lepus, mas em alguns casos raros pode sofrer infecção por Eimeria de
Sylvilagus. Apesar disso, considera-se que a especificidade de hospedeiro em
Lagomorpha seja alta.
Ursula Castro de Oliveira Discussão
115
Diferentemente do observado em espécies de Eimeria de galinha e
Lagomorpha, em roedores há numerosos trabalhos que relatam a possibilidade de
transmissão cruzada entre hospedeiros de diferentes gêneros e até mesmo de
famílias distintas. Mayberry et al. (1982) observaram que Eimeria separata
(hospedeiro Rattus norvegicus) foi capaz de completar o ciclo em três de um total de
sete linhagens distintas de camundongo, sugerindo que existem componentes
genéticos associados à susceptibilidade do hospedeiro à infecção. Esse fato
também já foi observado na relação das espécies de Eimeria com o hospedeiro
galinha (revisado por Long, 1973). Assim, qualquer conclusão acerca da
incapacidade de uma espécie de hospedeiro de albergar o ciclo completo de uma
Eimeria não deveria ser baseada em infecções experimentais de apenas uma
linhagem desse hospedeiro. Levine e Ivens (1988) estudaram diversas combinações
de infecções cruzadas entre: roedores/roedores, roedores/Lagomorpha,
roedor/carnívoro e roedor/ave, num total de 169 infecções. Entre as espécies de
roedores, observou-se que 80% das infecções entre espécies de um mesmo gênero
tiveram sucesso, mas apenas 12,5% das infecções entre espécies de gêneros
distintos foram bem sucedidas. Não foram observadas, contudo, infecções cruzadas
de Eimeria de roedores para carnívoros, aves e Lagomorpha. Em roedores
silvestres, vários estudos têm demonstrado que enquanto algumas espécies de
Eimeria são hospedeiro-especificas, outras podem infectar hospedeiros de outras
espécies e mesmo de gêneros diferentes. E. langerbarteli, por exemplo, pode
infectar hospedeiros como Peromyscus leucopus e P. truei, mas não P. maniculatus
(Hnida e Duszynski, 1999b). E. arizonensis, por outro lado, é capaz de infectar
espécies de roedores dos gêneros Peromyscus e Reithrodontomys (Hnida e
Duszynski, 1999b; Upton et al., 1992). Eimeria cahirinensis também é capaz de
infectar uma ampla gama de espécies de roedores, porém restritas ao gênero
Acomys (Kvičerová et al., 2007). Segundo a hipótese de Duszynski (1986), estes
hospedeiros sintópicos podem ter compartilhado habitats por longos períodos de
tempo, permitindo o surgimento de condições para a transmissão cruzada de
parasitas de uma espécie de hospedeiro para outra.
Zhao et al. (2001) observaram em seus estudos filogenéticos utilizando a SSU
rRNA nuclear e LSU de rRNA de apicoplasto, que espécies de Eimeria de morcego
(E. antrozoi e E. rioarribaenses) formam um clado com E. arizonensis, E. albigulae e
E. onychomysis, espécies de Eimeria de roedores morfologicamente similares.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
116
Esses resultados foram interpretados pelos autores como uma evidência que a
similaridade morfológica dos oocistos poderia refletir melhor as relações
filogenéticas dos hospedeiros/parasitas do que a especificidade de hospedeiro.
Morrison et al. (2004), utilizando as sequências da SSU de rRNA nuclear e uma
grande amostragem de taxa (39 espécies de Eimeria), não conseguiram reproduzir
este resultado. Em nosso trabalho, também utilizando maior número de taxa (60
espécies de Eimeria) e o mesmo marcador, também não conseguimos definir um
clado das espécies derivadas de morcegos. A árvore obtida (Figura 12) mostra que
E. antrozoi (com resíduo de oocisto) e E. rioarribaensis (sem resíduo) estão no
mesmo clado das espécies de Eimeria de roedores que possuem resíduo de oocisto.
Contudo, os valores de suporte dos nós são bastante baixos, similarmente ao que foi
observado por Morrison et al. (2004). Assim, utilizando esse marcador, qualquer
conclusão filogenética deve ser tomada com grande precaução. As outras duas
espécies de Eimeria de quirópteros (E. pilarenses e E. catronenses) analisadas, que
não têm resíduo, formaram um clado externo ao das espécies de Eimeria de
roedores, com valor de bootstrap de 62% (Figura 12). Assim, acreditamos que uma
maior amostragem de taxa e um maior número de genes seriam necessários para se
elaborar hipóteses filogenéticas mais sólidas acerca desse grupo de espécies.
A baixa especificidade de hospedeiro e a possibilidade de ocorrência de
eventos de transmissão cruzada poderiam explicar o agrupamento de espécies de
Eimeria de hospedeiros distintos em um mesmo clado. Zhao et al. (2001) que E.
antrozoi e E. rioarribaensis poderiam ter sido originadas a partir de espécies de
Eimeria de roedores, como resultado de transferência lateral entre estes dois
hospedeiros. Algumas observações que correlacionaram os hábitos dos hospedeiros
destas espécies apontaram que E. antrozoi poderia ter divergido de E. arizonensis
(Scott e Duszynski, 1997). O morcego A. pallidus, hospedeiro da E. antrozoi, se
alimenta de artrópodes terrestres como escorpiões, besouros e centopeias, o que
facilitaria o contato com fezes de roedores contaminadas com oocistos de Eimeria.
Por outro lado, esta hipótese não se aplica a E. rioarribaenses, cujo morcego
hospedeiro, do gênero Myotis, possui habitats diferentes (árvores, arbustos e fendas
em rochas).
Eventos de transmissão cruzada entre espécies de Eimeria de diferentes
hospedeiros parecem ocorrer ou ser facilitados por múltiplos fatores. Hospedeiros
filogeneticamente próximos, por apresentarem características bioquímicas parecidas
Ursula Castro de Oliveira Discussão
117
(presença de receptores de membranas, hormônios, etc.) poderiam ser mais
suscetíveis a infecções cruzadas por Eimeria. Assim, poucas mutações dentro de
uma população do parasita poderiam levar a uma adaptação de alguns indivíduos ao
novo hospedeiro. Contudo, a ocorrência espontânea dessas mutações não é
condição suficiente para a mudança de hospedeiro. A sintopia de hospedeiros, ou
seja, o compartilhamento de um habitat comum ao mesmo tempo, é também uma
das condições chave para permitir a transmissão cruzada de parasitas.
Observando-se a árvore filogenética com maior amostragem de espécies de
Eimeria (Figura 12), parece haver uma correlação entre as relações evolutivas das
diferentes espécies de Eimeria e os hábitos alimentares e habitats de seus
hospedeiros. Assim, o primeiro clado da árvore, representado pelas espécies de
Eimeria de aves Galliformes (galinha, peru e faisão) e Piciformes (pica-pau),
apresenta um clado irmão composto por sua vez por dois subclados,
compreendendo as espécies de Eimeria que infectam hospedeiros da ordem
Lagomorpha e subordem Ruminantia, respectivamente (Figura 12) . As espécies de
parasitas que infectam o coelho formam um clado monofilético, enquanto o clado
dos hospedeiros ruminantes compreende um grupo parafilético de espécies de
Eimeria que infectam ovelhas, contendo ainda uma espécie que infecta bovinos (E.
bovis).
Duas características importantes e comuns aos hospedeiros representados
por aves Galliformes e mamíferos Lagomorpha e Ruminantia, é que esses animais
são terrestres e preferencialmente herbívoros. Embora tecnicamente os Galliformes
sejam considerados animais onívoros, pois podem incorporar em sua alimentação
pequenos insetos e anelídeos, sua fonte primária de alimentação são grãos de
vegetais, daí serem consideradas aves granívoras. O gênero Eimeria compreende
parasitas com ciclo de vida com transmissão oral-fecal. Essa característica implica
que animais terrestres apresentam muito maior oportunidade de contaminação.
Além disso, animais herbívoros e granívoros, devido aos seus hábitos de
alimentação, acabam tendo muito maior contato com o solo e plantas
potencialmente contaminados com oocistos do que animais predadores. Assim, é
possível que a maior proximidade filogenética entre as espécies de Eimeria de
Galliformes, Lagomorpha e Ruminantia esteja relacionada com o compartilhamento
de habitats e hábitos alimentares, sugerindo que eventos de mudança de
hospedeiros possam ter ocorrido ao longo da evolução. Um contraponto a essa
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
118
hipótese é a presença de uma espécie de Eimeria de pica-pau no clado das
espécies de hospedeiros Galliformes. O pica-pau alimenta-se majoritariamente de
larvas de insetos e, portanto, não se enquadra nas definições acima. Contudo, é
preciso salientar que a amostragem de taxa nesse caso se limita a essa única
espécie. A coleta e análise de um maior número de amostras de espécies de
Eimeria de aves de outras ordens poderiam elucidar esse ponto, e eventualmente
corroborar nossa hipótese. O grupo imediatamente mais basal aos três clados
referidos acima é o que contem as espécies de Eimeria de suínos, animais com
hábitos alimentares tipicamente onívoros. A esse grupo se seguem dois clados de
espécies de Eimeria de roedores, animais que também apresentam alimentação
onívora. Dentro desse clado ainda fazem parte duas espécies de Eimeria de
morcegos (E. antrozoi e E. rioarribaenses), sendo que, conforme discutido acima, o
hospedeiro de E. antrozoi compartilha o mesmo habitat que alguns roedores
selvagens da América do Norte.
Mais externamente aos clados dos roedores está o clado de outras duas
espécies de Eimeria de quirópteros, E. pilarensis e E. catronensis, cujos hospedeiros
são morcegos insetívoros do gênero Myotis, encontrados no Continente Americano.
Em seguida encontramos um clado formado por E. ranae (Jirků et al., 2009), uma
espécie que infecta rãs, e E. arnyi (Upton e Oppert, 1991), que tem como hospedeiro
uma serpente norte-americana. Em hospedeiros anfíbios, Jirků et al. (2009)
demonstraram que E. ranae é capaz de infectar indistintamente duas espécies de
rãs terrestres, Rana temporaria e Rana dalmatina, mas não Pelophylax kl.
esculentus, um ranídeo semi-aquático, híbrido entre Rana lessonae e Rana
ridibunda, e classificado em outro subgênero. Esse parece ser mais um caso em que
uma espécie de Eimeria pode infectar duas espécies de hospedeiros do mesmo
gênero que vivem sintopicamente, mas não é capaz de infectar outra espécie que
apresenta um habitat diferente.
Seguindo-se em direção à base da árvore filogenética (Figura 12), encontra-
se E. trichosuri (Power et al., 2009) cujo hospedeiro é um gambá da Oceania
(Trichosurus vulpecula). A posição dessa espécie de Eimeria, distante das espécies
de Eimeria de outros mamíferos, e próxima das espécies que infectam aves, répteis
e anfíbios, pode ser explicada pelo fato de os marsupiais serem uma das linhagens
mais antigas de mamíferos, e devido ao isolamento geográfico imposto por sua
localização na Oceania. Power et al. (2009), também utilizando a SSU de rRNA,
Ursula Castro de Oliveira Discussão
119
observaram que E. trichosuri divergiu antes do clado formado pelas espécies de
Eimeria de mamíferos placentários e aves. Os autores concluíram que E. trichosuri,
por ter supostamente divergido antes do clado que contém espécies de espécies de
Eimeria de mamíferos placentários, seria uma evidência de co-evolução entre os
hospedeiros e parasitas. O problema dessa conclusão é que as espécies de Eimeria
de aves Galliformes formam um clado interno ao grande clado que inclui as espécies
de mamíferos placentários. Segundo os autores, isso seria uma forte evidência de
que as espécies de Eimeria de galinha teriam se originado de uma espécie ancestral
presente em um mamífero placentário. Em nossa reconstrução filogenética, E. ranae
(isolada de rã) e E. arnyi (isolada de serpente) formam um clado que se interpõe
entre E. trichosuri e o grande clado que engloba as espécies de Eimeria de
mamíferos placentários e aves Galliformes e Piciformes. Tanto nos nossos dados,
quanto nos de Power et al. (2009), os valores de suporte do ramo de E. trichosuri
são relativamente baixos, da ordem de 50-60%. Em nossa opinião, certamente são
necessários estudos mais profundos, abrangendo maior amostragem de espécies de
Eimeria de outros marsupiais, répteis e anfíbios, além de mais marcadores, antes de
formular uma hipótese tão ampla. Finalmente, é importante mencionar que a
hipótese de Power et al. (2009) de que as espécies de Eimeria de galinha teriam se
originado de um ancestral residente em um mamífero placentário é altamente
contraditória com a outra hipótese dos autores, de que teria havido co-evolução
entres os parasitas do gênero Eimeria e seus hospedeiros.
Com posição ainda mais basal na árvore da Figura 12, encontramos as
amostras de Eimeria de garças (E. gruis e E. reichenowi), resultado que está de
acordo com o trabalho original de Matsubayashi et al. (2005). Um aspecto
interessante é que as espécies de Eimeria de garças apresentam características
biológicas bastante distintas das observadas em hospedeiros Galliformes e
Piciformes. A infecção inicia-se no intestino, mas propaga-se para diferentes tecidos
e órgãos, causando uma coccidiose visceral disseminada. Outro aspecto importante,
é que os hospedeiros da ordem Gruiformes são filogeneticamente bastante distantes
daqueles da ordem Galliformes. As aves Gruiformes têm um com comportamento
migratório e uma alimentação extremamente variada. Dessa forma, esses
hospedeiros não compartilham nichos com outros animais por longos períodos, o
que sugere que poderia haver uma menor oportunidade para a ocorrência de
eventos de transmissão cruzada de espécies de Eimeria com outras aves. Assim, E.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
120
gruis e E. reichenowi teriam divergido relativamente cedo das demais espécies de
Eimeria, o que parece explicar a grande distância filogenética em relação às
espécies de Eimeria de outras aves. Finalmente, na posição mais basal da árvore,
está presente uma outra espécie de Eimeria de réptil, cujo hospedeiro é o lagarto da
lava, do gênero Tropidurus do arquipélago de Galápagos (Couch et al., 1996). Neste
caso, o isolamento geográfico é possivelmente responsável pela grande divergência
desta espécie em relação a todas demais.
Um dos aspectos mais interessantes em relação à gama de hospedeiros de
parasitas do gênero Eimeria diz respeito ao número muito pequeno de relatos
comprovados de infecção em mamíferos da ordem Carnivora (Duszynski et al.,
1995). Por outro lado, esse grupo de animais é infectado por coccídias da família
Sarcocystidae como Toxoplasma, Neospora, Hammondia e Cystoisospora. Da
mesma forma, uma parte significativa das aves é infectada apenas por coccídias do
gênero Cystoisospora, mas não por Eimeria, e as razões desse fato ainda são
desconhecidas. Os parasitas do gênero Eimeria são monoxênicos e não formam
cistos teciduais, enquanto as coccídias da família Sarcocystidae utilizam-se de
hospedeiros intermediários, nos quais formam cistos teciduais. Os hospedeiros
intermediários exercem um papel fundamental no ciclo de vida dos Sarcocystidae,
uma vez que permitem a disseminação dos parasitas, e oferecem uma via
alternativa de contaminação dos hospedeiros definitivos através da predação.
Assim, além da contaminação direta oral-fecal com oocistos eliminados por outros
hospedeiros, a predação e consequente ingestão de cistos teciduais é uma eficiente
forma de contaminação dos hospedeiros definitivos. No caso do Toxoplasma gondii,
animais onívoros também podem se infectar com cistos teciduais, através da
predação ou pela ingestão de carcaças de animais mortos. Contudo, como são
incapazes de realizar a fase sexual do ciclo, esses animais também são
considerados hospedeiros intermediários. No caso de Cystoisospora, ao menos para
algumas espécies como C. felis, C. rivolta, and C. ohioensis, já se sabe que o ciclo
de vida envolve facultativamente hospedeiros de transporte ou paratênicos. Nesses
hospedeiros, ocorre a acumulação de cistos monozóicos em tecidos extraintestinais,
sem a ocorrência de reprodução assexuada dos parasitas (Mehlhorn, 2008).
Hospedeiros carnívoros, ao predar animais infectados por Eimeria como aves
Galliformes, coelhos e ruminantes, entre outros, acabam ingerindo esses parasitas,
mas não sofrem infecção. Esse fato sugere que, a despeito da sintopia de
Ursula Castro de Oliveira Discussão
121
predadores e presas, não há casos conhecidos em que tenham ocorrido eventos de
mudança de hospedeiro da presa para o predador. As poucas descrições de
espécies de Eimeria em carnívoros não são suficientemente detalhadas e
experimentalmente embasadas para excluir a possibilidade da coccídia encontrada
ser originada a partir de animais predados ao invés do próprio animal carnívoro
(Tenter et al., 2002). Essa situação gera um pergunta: por que os parasitas do
gênero Eimeria não teriam invadido hospedeiros da ordem Carnivora?
A resposta a esta pergunta pode estar em alguns aspectos relativos ao
comportamento e hábitos alimentares desse grupo de animais. Os felinos, com
exceção dos leões, são animais que vivem na maior parte de sua vida de forma
solitária. Esse comportamento implica numa baixa densidade de animais, o que
dificulta a transmissão de uma doença cujo ciclo é direto e a contaminação,
puramente pela via oral-fecal. Outros mamíferos carnívoros como canídeos e
morsas vivem em grupos com comportamento social bem definido e, portanto, a
questão da densidade não se aplicaria a esses animais. Uma questão que parece,
assim, mais importante é que os carnívoros, embora sejam animais terrestres, não
mantém um contato tão direto e íntimo com o solo como animais herbívoros,
granívoros e alguns insetívoros. Aves Galliformes como perus, galinhas e faisões
são granívoras e têm o hábito de ciscar o solo, aumentando a possibilidade de entrar
em contato com oocistos eliminados por outros indivíduos. Animais herbívoros como
lagomorfos e ruminantes alimentam-se predominantemente de folhas verdes, brotos
e ervas, os quais são arrancados diretamente a partir do solo. Essas plantas
rasteiras podem facilmente sofrer contaminação por oocistos eliminados com as
fezes de animais, funcionando dessa forma como via de transmissão de Eimeria.
Roedores e suínos, a despeito de serem animais onívoros, também mantém contato
muito íntimo com o solo, alimentando-se com frequência de vegetais rasteiros e
sementes.
Concluindo, a análise da árvore filogenética da SSU de rRNA nuclear de
Eimeria mostra correlações dos clados observados com os habitats e hábitos
alimentares dos hospedeiros. Embora hajam casos em que essas correlações não
são aparentes, acreditamos que uma amostragem de taxa mais ampla teria que ser
feita para se ter uma figura mais abrangente e consistente. Além disso, ao lado dos
dados moleculares, seria necessário se realizar testes de infecção cruzada entre
hospedeiros. Um dos aspectos que limitam os estudos evolutivos de Eimeria é a
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
122
pouca quantidade de trabalhos que descrevam precisamente as informações
geográficas da coleta das amostras, tipo de habitat dos hospedeiros, a morfologia
dos oocistos, e o encontro de estágios intracelulares do parasita. Esse último
aspecto é particularmente importante em animais predadores, pois os oocistos de
suas presas podem atravessar o trato digestório de forma intacta e serem
erroneamente assumidos como parasitas desses predadores. Assim, a
comprovação da relação parasita-hospedeiro somente pode ser assumida pelo
encontro de formas intracelulares e/ou por infecções experimentais. Infecções
experimentais também são fundamentais para se determinar a especificidade de
hospedeiros de cada espécie de Eimeria. Esses aspectos e vários outros problemas
relacionados à taxonomia de parasitas coccídias foram relatados e discutidos por
Tenter et al. (2002).
5.2.5 Alta taxa de evolução e diversidade antigênica em E. maxima
Nossa análise cladística, utilizando a proteína ORF470, revelou que E.
maxima apresenta os ramos mais longos entre todas as espécies analisadas (Figura
16). Um total de 14 autapomorfias foram evidenciadas, sugerindo uma pressão de
seleção que provocou uma aceleração da taxa evolutiva. Embora esse resultado
esteja baseado na análise de apenas uma única proteína, a ocorrência de ramos
longos em E. maxima também foi observada em todas as outras análises
filogenéticas (ver Figuras 8-11 e ANEXO D). Esse resultado também já havia sido
observado por Barta et al. (1997) e Power et al. (2009), usando a SSU de rRNA
nuclear. A razão pela qual E. maxima apresenta um comportamento tão distinto em
relação às demais espécies de Eimeria de galinha não é conhecido, mas é possível
que esta espécie ainda esteja sob um processo evolutivo de adaptação de nicho.
Do ponto de vista biológico, sabe-se que E. maxima também apresenta um
comportamento diferente em relação às demais espécies de Eimeria de galinha. E.
maxima é a espécie mais imunogênica, tendo sido observado que uma infecção com
apenas 25 oocistos pode conferir imunidade total (Long e Millard, 1979b). Além
disso, E. maxima apresenta uma grande diversidade antigênica e imunológica.
Vários relatos da literatura (Fitz-Coy, 1992; Long e Millard, 1979b; Martin et al.,
Ursula Castro de Oliveira Discussão
123
1997; McDonald et al., 1986; Norton e Hein, 1976; Shirley e Bellatti, 1988)
descrevem a ocorrência de uma diversidade imunológica entre diferentes cepas de
E. maxima, o que tem como consequência um nível muito mais reduzido de proteção
cruzada do que o observado entre cepas das outras espécies de Eimeria de galinha.
De fato, a imunização de aves com cepas de E. maxima e posterior desafio com
outras cepas revela diferentes níveis de imunidade cruzada (Long e Millard, 1979b;
Martin et al., 1997; Smith et al., 2002). Outro aspecto interessante é que a linhagem
de galinha utilizada nos experimentos influencia a resposta imune para as infecções
com E. maxima. Smith et al. (2002) demonstraram que a imunidade cruzada pode
eventualmente ser unidirecional, isto é, o grau de proteção cruzada entre duas
cepas pode ser muito diferente dependendo de qual delas tenha sido usada na
infecção imunizante ou no desafio subsequente. A existência de variabilidade na
resposta imunológica já foi descrita em outros parasitas do filo Apicomplexa, como
Plasmodium falciparum (Bonelo et al., 2000) e Theileria parva (Morrison, 2007),
onde cepas diferentes da mesma espécie não conferem imunidade cruzada.
Contudo, os mecanismos envolvidos em Plasmodium, como variabilidade antigênica,
não foram encontrados em E. maxima. Possivelmente, E. maxima deve ter possuir
um conjunto de antígenos compartilhados entre as cepas, os quais são capazes de
induzir uma resposta imune que confere proteção cruzada entre várias cepas. Outro
grupo de antígenos mais restritos poderiam conferir uma proteção mais efetiva,
porém cepa-específica (Blake et al., 2005). Em nosso laboratório, desenvolvemos
conjuntos de marcadores microssatélites para E. maxima, E. acervulina e E. tenella.
O polimorfismo alélico observado nas três espécies foi bastante baixo (média de 2,4
a 3,1 alelos por locus), mas E. maxima apresentou um grau de heterozigosidase
(0,44) nitidamente maior do que E. acervulina (0,37) e E. tenella (0,32) (dados não
publicados). Esse resultado sugere que E. maxima possa ter uma taxa de
recombinação maior durante a meiose e, com isso, aumenta o grau de
heterozigosidase da população. Se esse fato for extrapolado para os antígenos
imunoprotetores do parasita, poderia explicar, ao menos em parte, a maior
diversidade antigênica que se observa em E. maxima, quando comparada à de
outras espécies de Eimeria de galinha. Contudo, resta ainda compreender melhor o
os possíveis mecanismos responsáveis pela maior taxa de evolução de E. maxima,
e que contribuem para a maior diversidade antigênica observada nessa espécie.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
124
Duas espécies de Eimeria de roedores (E. langhebarteli e E. albigulae)
também apresentam um maior número de substituições em relação às demais
espécies (Figura 16). Contudo, pouco se sabe ainda acerca da biologia desses
parasitas, o que nos impede de tentar correlacionar essa característica com outros
aspectos do ciclo de vida. O fato de E. langebarteli apresentar uma grande
proporção de homoplasias para fora pode sugerir que essa espécie esteja sofrendo
uma pressão de seleção que a está levando a um processo de evolução
convergente.
6 CONCLUSÕES
Ursula Castro de Oliveira Conclusões
126
Desenvolvemos um ensaio de diagnóstico molecular que permite
discriminar com eficiência as onze espécies de Eimeria que infectam o
coelho doméstico.
A utilização de um conjunto concatenado de genes permitiu obter árvores
filogenéticas de Eimeria com maior congruência entre os diferentes
métodos de reconstrução filogenética e maior grau de suporte nos nós.
A especificidade do hospedeiro parece ser mais relevante do ponto de
vista das relações evolutivas dos parasitas do gênero Eimeria do que o
caractere de presença/ausência do resíduo do oocisto.
As análises filogenéticas indicam que as espécies de Eimeria são em geral
monofiléticas em relação aos seus hospedeiros, mas, ocasionalmente, são
observadas parafilias.
A análise demográfica sugere a ocorrência de múltiplos eventos de
invasão de hospedeiros mamíferos e aves ao longo do processo evolutivo.
A hipótese de co-evolução entre parasitas do gênero Eimeria e seus
hospedeiros não é suportada devido às seguintes conclusões: (1) há
relatos experimentalmente comprovados de mudança de hospedeiros em
espécies de Eimeria de roedores; (2) as datações da invasão de roedores,
galinha e coelho apontam para uma divergência das espécies de Eimeria
muito mais recente do que a dos respectivos hospedeiros; e (3) a árvore
dos parasitas não pode ser reconciliada com a árvore dos respectivos
hospedeiros.
Parece haver uma correlação entre as relações evolutivas das diferentes
espécies de Eimeria e os hábitos alimentares e habitats de seus
hospedeiros.
E. maxima apresenta uma aceleração de sua taxa de evolução em relação
a outras espécies de Eimeria, fato que se correlaciona com sua maior
diversidade antigênica e imunológica.
REFERÊNCIAS
Ursula Castro de Oliveira Referências
128
REFERÊNCIAS*
Allen PC, Fetterer RH. Recent advances in biology and immunobiology of Eimeria
species and in diagnosis and control of infection with these coccidian parasites of poultry. Clin Microbiol Rev. 2002 Jan;15(1):58-65.
Alyousif MS, Al-Shawa YR, Al-Asiri SS. Eimeria livialissp.n.(Apicomplexa:Eimeriidae) from the domestic pigeon, Columba livia domestica in Saudi Arabia. J Egypt Soc
Parasitol. 2009 Aug;39(2):383-8.
Aoutil N, Bertani S, Bordes F, Snounou G, Chabaud A, Landau I. Eimeria (Coccidia: Eimeridea) of hares in France: description of new taxa. Parasite. 2005 Jun;12(2):131-44.
Barta JR, Martin DS, Liberator PA, Dashkevicz M, Anderson JW, Feighner SD, et al. Phylogenetic relationships among eight Eimeria species infecting domestic fowl
inferred using complete small subunit ribosomal DNA sequences. J Parasitol. 1997 Apr;83(2):262-71.
Barta JR. Investigating phylogenetic relationships within the Apicomplexa using
sequence data: the search for homology. Methods. 1997 Oct;13(2):81-8.
Bashtar AR, Abdel-Ghaffar F, Al-Rasheid KA, Mehlhorn H, AlNasrI. Light microscopic study on Eimeria species infecting Japanese quails reared in Saudi Arabian farms. Parasitol Res. 2010 Jul;107(2):409-16.
Benton MJ, Donoghue PC. Paleontological evidence to date the tree of life. Mol Biol
Evol. 2007 Jan;24(1):26-53.
Blake DP, Hesketh P, Archer A, Carroll F, Shirley MW, Smith AL. The influence of immunizing dose size and schedule on immunity to subsequent challenge with antigenically distinct strains of Eimeria maxima. Avian Pathol. 2005 Dec;34(6):489-
94.
Blake DP, Shirley MW, Smith AL. Genetic identification of antigens protective against coccidia. Parasite Immunol. 2006 Jul;28(7):305-14.
*De acordo com: International Committee of Medical Journal. Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to Biomedical Journal: sample references. Available from: http://www.icmje.org [2007 May 22].
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
129
Blake DP, Qin Z, Cai J, Smith AL. Development and validation of real-time polymerase chain reaction assays specific to four species of Eimeria. Avian Pathol.
2008 Feb;37(1):89-94.
Bonelo A, Valmori D, Triponez F, Tiercy JM, Mentha G, Oberholzer J, et al. Generation and characterization of malaria-specific human CD8(+) lymphocyte
clones: effect of natural polymorphism on T cell recognition and endogenous cognate antigen presentation by liver cells. Eur J Immunol. 2000 Nov;30(11):3079-88.
Cai X, Fuller AL, McDougald LR, Zhu G. Apicoplast genome of the coccidian Eimeria tenella. Gene. 2003 Dec 4;321:39-46.
Castañón CAB, Fraga JS, Fernandez S, Gruber A, Costa LD. Biological shape
characterization for automatic image recognition and diagnosis of protozoan parasites of the genus Eimeria. Pattern Recognition. 2007 Jul;40(7):1899-910.
Ceré N, Licois D, Humbert JF. Study of the inter- and intraspecific variation of Eimeria spp. from the rabbit using random amplified polymorphic DNA. Parasitol Res.
1995;81(4):324-8.
Ceré N, Humbert JF, Licois D, Corvione M, Afanassieff M, Chanteloup N. A new approach for the identification and the diagnosis of Eimeria media parasite of the
rabbit. Exp Parasitol. 1996 Mar;82(2):132-8.
Ceré N, Licois D, Humbert JF. Comparison of the genomic fingerprints generated by the random amplification of polymorphic DNA between precocious lines and parental strains of Eimeria spp. from the rabbit. Parasitol Res. 1997;83(3):300-2.
Chako CZ, Tyler JW, Schultz LG, Chiguma L, Beerntsen BT. Cryptosporidiosis in people: it's not just about the cows. J Vet Intern Med. 2010 Jan-Feb;24(1):37-43.
Chapman HD, Cherry TE, Danforth HD, Richards G, Shirley MW, Williams RB. Sustainable coccidiosis control in poultry production: the role of live vaccines. Int J
Parasitol. 2002 May;32(5):617-29.
Chapman HD.Coccidiosis in the turkey. Avian Pathol. 2008 Jun;37(3):205-23. Chauvin A, Moreau E, Bonnet S, Plantard O, Malandrin L. Babesia and its hosts:
adaptation to long-lasting interactions as a way to achieve efficient transmission. Vet Res. 2009 Mar-Apr;40(2):37.
Ursula Castro de Oliveira Referências
130
Collins TM, Fedrigo O, Naylor GJ. Choosing the best genes for the job: the case for
stationary genes in genome-scale phylogenetics. Syst Biol. 2005 Jun;54(3):493-500.
Cornelissen AW, Overdulve JP, van der Ploeg M. Determination of nuclear DNA of five eucoccidian parasites, Isospora (Toxoplasma) gondii, Sarcocystis cruzi, Eimeria tenella, E. acervulina and Plasmodium berghei, with special reference to
gamontogenesis and meiosis in I. (T.) gondii. Parasitology. 1984 Jun;88(Pt 3):531-
53.
Couch L, Stone PA, Duszynski DW, Snell HL, Snell HM. A survey of the coccidian parasites of reptiles from islands of the Galápagos Archipelago: 1990-1994. J
Parasitol. 1996 Jun;82(3):432-7. Coudert P, Licois D, Streun A. Characterization of Eimeria species. I. Isolation and study of pathogenicity of a pure strain of Eimeria perforans(Leuckart, 1879; Sluiter
and Swellengrebel, 1912). Z Parasitenkd. 1979 Sep;59(3):227-34.
Coudert P. Some peculiarities of rabbit coccidiosis. In: Yvore P. (Ed.), Coccidia and
Coccidiomorphs, Vth International Coccidiosis Conference, Tours, France, 17–20 October. Les Colloques de l’INRA series, vol. 49, INRA, Paris, 1989. p. 481–8.
Coudert P, Licois D, Drouvet-Viard F. Eimeria species and strains of rabbits. In:
Eckert J, Braun R, Shirley MW, Coudert P. COST. 89/820. Biotecnology: guidelines on techniques in coccidiosis research. Luxembourg: Office for Official Publications of
the European Communities; 1995. p. 52-73.
Current WL, Upton SJ, Long PL. Taxonomy and life cycles. In: Long PL (Ed.) Coccidiosis of man and domestic animals. Boca Raton, FL: CRC Press, Inc.; 1990. p. 1-16
Dalloul RA, Lillehoj HS. Recent advances in immunomodulation and vaccination
strategies against coccidiosis. Avian Dis. 2005 Mar;49(1):1-8.
Donoghue PC, Benton MJ. Rocks and clocks: calibrating the Tree of Life using fossils and molecules. Trends Ecol Evol. 2007 Aug;22(8):424-31.
Doran JD. Comparative development of Eimeria tenella in primary cultures of kidney
cells from the chicken, pheasant, partridge, and turkey. J Parasitol. 1971
Dec;57(6):1376-7.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
131
Doran DJ. The life cycle of Eimeria dispersa Tyzzer 1929 from the turkey in
gallinaceous birds. J Parasitol. 1978 Oct;64(5):882-5. Doran DJ, Augustine PC. Comparative development of Eimeria tenella from
sporozoites to oocysts in primary kidney cell cultures from gallinaceous birds. J Protozool. 1973 Nov;20(5):658-61.
Drouet-Viard F, Coudert P, Licois D, Boivin M. Acquired protection of the rabbit (Oryctolagus cuniculus) against coccidiosis using a precocious line of Eimeria magna: effect of vaccine dose and age at vaccination. Vet Parasitol. 1997a
May;69(3-4):197-201.
Drouet-Viard F, Coudert P, Licois D, Boivin M. Vaccination against Eimeria magna
coccidiosis using spray dispersion of precocious line oocysts in the nest box. Vet Parasitol. 1997b Jun;70(1-3):61-6.
Drummond AJ, Rambaut A. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC Evol Biol. 2007;7:214.
Durham AM, Kashiwabara AY, Matsunaga FT, Ahagon PH, Rainone F, Varuzza L, et
al. EGene: a configurable pipeline generation system for automated sequence analysis. Bioinformatics. 2005 Jun 15;21(12):2812-3.
Dürr U, Pellerdy L. Oxygen consumption of coccidiosis-oocystes during sporulation. Acta Vet Acad Sci Hung. 1969;19(3):307-10.
Duszynski DW. Host specificity in the coccidia of small mammals: Fact or fiction? In: Berecky M. Advances in Protozoological Research. Symposia Biologica Hungarica.
Budapest: Akadémiai Kiadó; 1986. vol. 33. p. 325-37.
Duszynski DW, Couch L, Upton SJ. The Coccidia of the World. Available from: http://www.k-state.edu/parasitology/worldcoccidia/ [2010 jul 15].
Duszynksi DW. Two new coccidia (Protozoa: Eimeriidae) from Costa Rican lizards with a review of the Eimeria from lizards. Journal of Protozoology. 1969;16:581-5.
Duszynski DW, Scott DT, Aragon J, Leach A, Perry T. Six new Eimeria species
from vespertilionid bats of North America. J Parasitol. 1999a Jun;85(3):496-503.
Ursula Castro de Oliveira Referências
132
Duszynski DW, Wilson AU, Wade D, Upton SJ, Levine ND. Coccidia (Apicomplexa:
Eimeriidae) in the Primates and the Scandentia. International Journal of Primatology. 1999b 20(5):761-97.
Duszynski DW, Upton SJ. Coccidia (Apicomplexa: Eimeriidae) of the mammalian order Insectivora. Special publication of the Museum of Southwestern Biology, N. 4.
Albuquerque: The University of New Mexico; 2000.
Duszynski DW. Coccidia (Apicomplexa: Eimeriidae) of the mammalian order Chiroptera. Special publication of the Museum of Southwestern Biology, N. 5, Albuquerque: The University of New Mexico; 2002.
Duszynski DW, Bolek MG, Upton SJ. Coccidia (Apicomplexa: Eimeriidae) of
amphibians of the world. Zootaxa 1667. 2007.
Eckert J, Braun R, Shirley MW, Coudert P. COST. 89/820. Biotecnology: guidelines on techniques in coccidiosis research. Luxembourg: Office for Off icial Publications of the European Communities; 1995. 300 p.
Ellis J, Bumstead J. Eimeria species: studies using rRNA and rDNA probes.
Parasitology. 1990 Aug;101(1):1-6. Elmore SA, Jones JL, Conrad PA, Patton S, Lindsay DS, Dubey JP. Toxoplasma
gondii: epidemiology, feline clinical aspects, and prevention. Trends Parasitol. 2010
Apr;26(4):190-6.
Escalante AA, Ayala FJ. Evolutionary origin of Plasmodium and other Apicomplexa
based on rRNA genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Jun20;92(13):5793-7.
Escalante AA, Cornejo OE, Freeland DE, Poe AC, Durrego E, Collins WE, Lal AA. A monkey's tale: the origin of Plasmodium vivax as a human malaria parasite. Proc Natl
Acad Sci U S A. 2005 Feb 8;102(6):1980-5.
Ewing B, Hillier L, Wendl MC, Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Res. 1998 Mar;8(3):175-85.
Ewing B, Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error
probabilities. Genome Res. 1998 Mar;8(3):186-94.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
133
Fernandez S, Costa AC, Katsuyama AM, Madeira AM, Gruber A. A survey of the inter- and intraspecific RAPD markers of Eimeria spp. of the domestic fowl and the
development of reliable diagnostic tools. Parasitol Res. 2003a Apr;89(6):437-45.
Fernandez S, Pagotto AH, Furtado MM, Katsuyama AM, Madeira AM, Gruber A. A multiplex PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of the seven Eimeria species that infect domestic fowl. Parasitology. 2003b Oct;127(Pt 4):317-25.
Fernandez S, Katsuyama AM, Kashiwabara AY, Madeira AM, Durham AM, Gruber A. Characterization of SCAR markers of Eimeria spp. of domestic fowl and construction of a public relational database (The Eimeria SCARdb). FEMS Microbiol Lett. 2004
Sep 1;238(1):183-8. Fernando MA, Remmler O. Four new species of Eimeria and one of Tyzzeria from the Ceylon jungle fowl Gallus lafayettei. J Protozool. 1973 Feb;20(1):43-5.
Fitz-Coy SH. Antigenic variation among strains of Eimeria maxima and E. tenella of
the chicken. Avian Dis. 1992 Jan-Mar;36(1):40-3.
Gagnon S, Bourbeau D, Levesque RC. Secondary structures and features of the 18S, 5.8S and 26S ribosomal RNAs from the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Gene. 1996 Sep 16;173(2):129-35.
Gajadhar AA, Leighton FA. Eimeria wobeseri sp. n. and Eimeria goelandi sp. n. (Protozoa: Apicomplexa) in the kidneys of herring gulls (Larus argentatus). J Wildl
Dis. 1988 Jul;24(3):538-46.
Galtier N, Gouy M, Gautier C. SEAVIEW and PHYLO_WIN: two graphic tools for
sequence alignment and molecular phylogeny. Comput Appl Biosci. 1996 Dec;12(6):543-8.
Gasser RB, Woods WG, Wood JM, Ashdown L, Richards G, Whithear KG. Automated, fluorescence-based approach for the specific diagnosis of chicken
coccidiosis. Electrophoresis. 2001 Oct;22(16):3546-50.
Gordon D, Abajian C, Green P. Consed: a graphical tool for sequence finishing. Genome Res. 1998 Mar;8(3):195-202
Gutell RR, Gray MW, Schnare MN. A compilation of large subunit (23S and 23S-like) ribosomal RNA structures: 1993. Nucleic Acids Res. 1993 Jul 1;21(13):3055-74.
Ursula Castro de Oliveira Referências
134
Hall BG. CodonAlign 2.0, Rochester, NY. 2001. Available from:
http://www.sinauer.com/hall/2e/ [2009 Jan 20]. Hammond DM, Long PL. The Coccidia: Eimeria, Isospora, Toxoplasma, and Related
Genera. London: Baltimore & Butterworths: University Park Press; 1973. 539 p.
Hanada S, Omata Y, Umemoto Y, Kobayashi Y, Furuoka H, Matsui T, et al. Relationship between liver disorders and protection against Eimeria stiedai infection
in rabbits immunized with soluble antigens from the bile of infected rabbits. Vet Parasitol. 2003a Feb 13;111(2-3):261-6.
Hanada S, Umemoto Y, Omata Y, Koyama T, Nishiyama K, Kobayashi Y, Furuoka H, Matsui T, Maeda R, Saito A. Eimeria stiedai merozoite 49-kDa soluble antigen
induces protection against infection. J Parasitol. 2003b Jun;89(3):613-7.
Hayakawa T, Culleton R, Otani H, Horii T, Tanabe K. Big bang in the evolution of extant malaria parasites. Mol Biol Evol. 2008 Oct;25(10):2233-9.
Hedtke SM, Townsend TM, Hillis DM. Resolution of phylogenetic conflict in large data sets by increased taxon sampling. Syst Biol. 2006 Jun;55(3):522-9.
Hikosaka K, Watanabe Y, Tsuji N, Kita K, Kishine H, Arisue N, Palacpac NM,Kawazu S, Sawai H, Horii T, Igarashi I, Tanabe K. Divergence of the mitochondrial genome structure in the apicomplexan parasites, Babesia and Theileria. Mol Biol Evol. 2010a
May;27(5):1107-16
Hikosaka K, Nakai Y, Watanabe YI, Tachibana SI, Arisue N, Palacpac NM, Toyama T, Honma H, Horii T, Kita K, Tanabe K. Concatenated mitochondrial DNA of the coccidian parasite Eimeria tenella. Mitochondrion. 2010b Oct 31; [Epub ahead of
print]. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/journal/15677249.
Hnida JA, Duszynski DW. Cross-transmission studies with Eimeria arizonensis, E. arizonensis-like oocysts and Eimeria langebarteli: host specificity at the genus and
species level within the Muridae. J Parasitol. 1999b Oct;85(5):873-7.
Huang X, Madan A. CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Res. 1999 Sep;9(9):868-77.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
135
Hughes AL, Verra F. Very large long-term effective population size in the virulent human malaria parasite Plasmodium falciparum. Proc Biol Sci. 2001 Sep
7;268(1478):1855-60.
Jeffers TK. Attenuation of Eimeria tenella through selection for precociousness. J
Parasitol. 1975 Dec;61(6):1083-90.
Jelínková A, Licois D, Pakandl M. The endogenous development of the rabbit coccidium Eimeria exigua Yakimoff, 1934. Vet Parasitol. 2008 Oct 1;156(3-4):168-72.
Jirků M, Jirků M, Oborník M, Lukes J, Modrý D. A model for taxonomic work on homoxenouscoccidia: redescription, host specificity, and molecular phylogeny of Eimeria ranae Dobell, 1909, with a review of anuran-host Eimeria (Apicomplexa:
Eimeriorina). J Eukaryot Microbiol. 2009 Jan-Feb;56(1):39-51.
Jongwutiwes S, Putaporntip C, Iwasaki T, Ferreira MU, Kanbara H, Hughes AL. Mitochondrial genome sequences support ancient population expansion in Plasmodium vivax. Mol Biol Evol. 2005 Aug;22(8):1733-9.
Joyner LP. Host and Site Specificity. In: Long PL. The Biology of the Coccidia.
Baltimore: University Park Press; 1982; p. 35-62. Kalanon M, McFadden GI. Malaria, Plasmodium falciparum and its
apicoplast.Biochem Soc Trans. 2010 Jun;38(3):775-82.
Kappe SH, Vaughan AM, Boddey JA, Cowman AF. That was then but this is now: malaria research in the time of an eradication agenda. Science. 2010 May 14;328(5980):862-6.
Kawahara F, Taira K, Nagai S, Onaga H, Onuma M, Nunoya T. Detection of five avian Eimeria species by species-specific real-time polymerase chain reaction assay.
Avian Dis. 2008 Dec;52(4):652-6.
Kawahara F, Zhang G, Mingala CN, Tamura Y, Koiwa M, Onuma M, Nunoya T. Genetic analysis and development of species-specific PCR assays based on ITS-1 region of rRNA in bovine Eimeria parasites. Vet Parasitol. 2010 Nov 24;174(1-2):49-
57.
Kheysin EM. Life cycles of coccidian of domestic animals. Translated by: Plous FK Jr. Baltimore: University of Park Press; 1971.
Ursula Castro de Oliveira Referências
136
Kirkpatrick NC, Blacker HP, Woods WG, Gasser RB, Noormohammadi AH. A
polymerase chain reaction-coupled high-resolution melting curve analytical approach for the monitoring of monospecificity of avian Eimeria species. Avian Pathol. 2009
Feb;38(1):13-9.
Kuo CH, Wares JP, Kissinger JC. The Apicomplexan whole-genome phylogeny: an
analysis of incongruence among gene trees. Mol Biol Evol. 2008 Dec;25(12):2689-98.
Kvičerová J, Ptácková P, Modrý D. Endogenous development, pathogenicity and host specificity of Eimeria cahirinensis Couch, Blaustein, Duszynski, Shenbrot and
Nevo, 1997 (Apicomplexa: Eimeriidae) from Acomys dimidiatus (Cretzschmar 1826)
(Rodentia: Muridae) from the Near East. Parasitol Res. 2007 Jan;100(2):219-26.
Kvičerová J, Pakandl M, Hypsa V. Phylogenetic relationships among Eimeria spp.
(Apicomplexa, Eimeriidae) infecting rabbits: evolutionary significance of biological
and morphological features. Parasitology. 2008 Apr;135(4):443-52. Lainson R, Ribeiro L. Eimeria lepidosirenis n.sp. (Apicomplexa:Eimeriidae) of the South American lungfish Lepidosiren paradoxa (Osteichthyes:Dipnoi) from
Amazonian Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006 May;101(3):327-9.
Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 2007 Nov 1;23(21):2947-8.
Law AE, Mullineaux CW, Hirst EM, Saldanha J, Wilson RJ. Bacterial orthologues
indicate the malarial plastid gene ycf24 is essential. Protist. 2000 Dec;151(4):317-27. Leighton FA, Gajadhar AA. Eimeria fraterculae sp. n. in the kidneys of Atlantic puffins (Fratercula arctica) from Newfoundland, Canada: species description and lesions. J
Wildl Dis. 1986 Oct;22(4):520-6.
Levine PP. A new coccidium pathogenic for chickens. Eimeria brunetti n. sp.
(Protozoa: Eimeriidae). Cornell Veterinarian. 1942;32:430-9.
Levine ND. Protozoan Parasites of Domestic Animals and of Man. Minneapolis: Burgess Publishing Company; 1961. p. 158-253.
Levine ND, Ivens V. Cross-transmission of Eimeria spp. (Protozoa, Apicomplexa) of
rodents--a review. J Protozool. 1988 Aug;35(3):434-7.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
137
Lew AE, Anderson GR, Minchin CM, Jeston PJ, Jorgensen WK. Inter- and intra-strain
variation and PCR detection of the internal transcribed spacer 1 (ITS-1) sequences of Australian isolates of Eimeria species from chickens. Vet Parasitol. 2003 Feb
28;112(1-2):33-50.
Licois P, Coudert P. Coccidioses et diarrhées dulapin à 343 l’engraissement. Bull.
GTV. 1982(5):109–22.
Licois D, Coudert P, Boivin M, Drouet-Viard F, Provot F. Selection and characterization of a precocious line of Eimeria intestinalis, an intestinal rabbit
coccidium. Parasitol Res. 1990;76(3):192-8.
Licois D, Coudert P, Bahagia S, Rossi GL. Endogenous development of Eimeria
intestinalis in rabbits (Oryctolagus cuniculus). J Parasitol. 1992 Dec;78(6):1041-8.
Licois D, Coudert P, Drouet-Viard F, Boivin M. Eimeria media: selection and
characterization of a precocious line. Parasitol Res. 1994;80(1):48-52.
Licois D, Coudert P, Drouet-Viard F, Boivin M. Eimeria magna: pathogenicity,
immunogenicity and selection of a precocious line. Vet Parasitol. 1995 Nov;60(1-
2):27-35. Lindsay DS, Blagburn BL. Biology of mammalian Isospora.Parasitol Today. 1994
Jun;10(6):214-20. Lindsay DS, Dubey JP, Blagburn BL. Biology of Isospora spp. from humans,
nonhuman primates, and domestic animals. Clin Microbiol Rev. 1997 Jan;10(1):19-34.
Long PL, Millard BJ, Joyner LP, Norton CC. A guide to laboratory techniques used in
the study and diagnosis of avian coccidiosis. Folia Vet Lat. 1976 Jul-Sep;6(3):201-17. Long PL, Millard BJ. Rejection of Eimeria by foreign hosts. Parasitology. 1979a
Apr;78(2):239-47.
Long PL, Millard BJ. Immunological differences in Eimeria maxima: effect of a mixed
immunizing inoculum on heterologous challenge. Parasitology. 1979b Dec;79(3):451-
7.
Ursula Castro de Oliveira Referências
138
Long PL, Joyner LP. Problems in the identification of species of Eimeria. J Protozool.
1984 Nov;31(4):535-41.
Maddison WP, Maddison DR. MacClade: analysis of phylogeny and character evolution. Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates; 1992.
Marquardt WC. Host and Site Specificity in the Coccidia. In: Hammond DM, Long PL. The Coccidia. Baltimore & Butterworths, London: University Park Press; 1973; p. 23-
43.
Mayberry LF, Marquardt WC, Nash DJ, Plan B. Genetic dependent transmission of Eimeria separata from Rattus to three strains of Mus musculus, an abnormal host. J
Parasitol. 1982 Dec;68(6):1124-6.
Martin AG, Danforth HD, Barta JR, Fernando MA. Analysis of immunological cross-
protection and sensitivities to anticoccidial drugs among five geographical and temporal strains of Eimeria maxima. Int J Parasitol. 1997 May;27(5):527-33.
Martin DP, Lemey P, Lott M, Moulton V, Posada D, Lefeuvre P. RDP3: a flexible and fast computer program for analyzing recombination. Bioinformatics. 2010 Oct
1;26(19):2462-3. McAllister CT, Upton SJ. The coccidia (Apicomplexa: Eimeriidae) of Crocodilia, with descriptions of two new species from Alligator mississippiensis (Reptilia:
Alligatoridae), from Texas. Journal of Parasitology. 1990;76:332-6.
McDonald V, Shirley MW, Bellatti MA. Eimeria maxima: characteristics of attenuated
lines obtained by selection for precocious development in the chicken. Exp Parasitol.
1986 Apr;61(2):192-200. McDougald LR, Jeffers TK. Eimeria tenella (Sporozoa, Coccidia): Gametogony
following a single asexual generation. Science. 1976 Apr 16;192(4236):258-9.
McDougald LR, Reid WM. Coccidiosis. In: Calnek BW, Barnes HJ, Beard CW, McDougald LR, Saif YM. Diseases of Poultry. 10th ed. Ames: Iowa State University
Press; 1997. p. 865-83. McQuistion TE. Eimeria palumbi, a New Coccidian Parasite (Apicomplexa: Eimeriidae) from the Galapagos Dove (Zenaida galapagoensis). TRANS. AM.
MICROSC. Soc. 1991 Apr;110(2):178-81.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
139
Mehlhorn H. Encyclopedia of Parasitology. 3rd ed. Heidelberg: Springer; 2008.
Min W, Dalloul RA, Lillehoj HS. Application of biotechnological tools for coccidia
vaccine development. J Vet Sci. 2004 Dec;5(4):279-88.
Miska KB, Schwarz RS, Jenkins MC, Rathinam T, Chapman HD. Molecular characterization and phylogenetic analysis of Eimeria from turkeys and gamebirds:
implications for evolutionary relationships in Galliform birds. J Parasitol. 2010
Oct;96(5):982-6.
Morgan JA, Morris GM, Wlodek BM, Byrnes R, Jenner M, Constantinoiu CC, et al. Real-time polymerase chain reaction (PCR) assays for the specific detection and quantification of seven Eimeria species that cause coccidiosis in chickens. Mol Cell
Probes. 2009 Apr;23(2):83-9.
Morrison DA, Bornstein S, Thebo P, Wernery U, Kinne J, Mattsson JG. The current status of the small subunit rRNA phylogeny of the coccidian (Sporozoa). Int J Parasitol. 2004 Mar 29;34(4):501-14.
Morrison WI. The biological and practical significance of antigenic variability in protective T cell responses against Theileria parva. Vet Parasitol. 2007 Aug
19;148(1):21-30. Morrison WI. Progress towards understanding the immunobiology of Theileria
parasites. Parasitology. 2009 Oct;136(12):1415-26.
Mu J, Joy DA, Duan J, Huang Y, Carlton J, Walker J, Barnwell J, Beerli P,Charleston MA, Pybus OG, Su XZ. Host switch leads to emergence of Plasmodium vivax malaria
in humans. Mol Biol Evol. 2005 Aug;22(8):1686-93.
Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-50.
Musaev M, Gaibova G, Ismailova G, Alieva F, Iskenderova N. The Coccidia of the Gallinaceous Birds in Azerbaijan. Tr. J. of Veterinary and Animal Sciences.
1998;22:409-13. Norton CC, Hein HE. Eimeria maxima: a comparison of two laboratory strains with a
fresh isolate. Parasitology. 1976 Jun;72(3):345-54.
Ursula Castro de Oliveira Referências
140
Norton CC, Catchpole J, Rose ME. Eimeria stiedai in rabbits: the presence of an
oocyst residuum. Parasitology. 1977 Aug;75(1):1-7. Norton CC, Catchpole J, Joyner LP. Redescriptions of Eimeria irresidua Kessel & Jankiewicz, 1931 and E. flavescens Marotel & Guilhon, 1941 from the domestic
rabbit. Parasitology. 1979 Oct;79(2):231-48.
Ortega YR, Sanchez R. Update on Cyclospora cayetanensis, a food-borne and
waterborne parasite. Clin Microbiol Rev. 2010 Jan;23(1):218-34. Owen D. Life cycle of Eimeria stiedae. Nature. 1970 Jul 18;227(5255):304.
Pakandl M. Efficacy of salinomycin, monensin and lasalocid against spontaneous Eimeria infection in rabbits. Folia Parasitol (Praha). 1986;33(3):195-8.
Pakandl M. Description of Eimeria vejdovskyi sp.n. and redescription of Eimeria media Kessel, 1929 from the rabbit. Folia Parasitol(Praha). 1988;35(1):1-9.
Pakandl M. Life cycle of Eimeria coecicola Cheissin, 1947. Folia Parasitol (Praha).
1989;36(2):97-105. Pakandl M, Licois D, Coudert P. Electron microscopic study on sporocysts and sporozoites of parental strains and precocious lines of rabbit coccidian Eimeria intestinalis, E. media and E. magna. Parasitol Res. 2001 Jan;87(1):63-6.
Pakandl M. Selection of a precocious line of the rabbit coccidium Eimeria flavescens
Marotel and Guilhon (1941) and characterization of its endogenous cycle. Parasitol
Res. 2005 Sep;97(2):150-5. Pakandl M, Jelínková A. The rabbit coccidium Eimeria piriformis: Selection of a
precocious line and life-cycle study. Vet Parasitol. 2006 Apr 30;137(3-4):351-4.
Pakandl M, Hlaskova L. The reproduction of Eimeria flavescens and Eimeria intestinalis in suckling rabbits. Parasitol Res. 2007 Oct;101(5):1435-7.
Pakandl M, Hlásková L, Poplstein M, Neveceralová M, Vodicka T, Salát J, Mucksová
J. Immune response to rabbit coccidiosis: a comparison between infections with Eimeria flavescens and E. intestinalis. Folia Parasitol (Praha). 2008a Mar;55(1):1-6.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
141
Pakandl M, Hlásková L, Poplstein M, Chromá V, Vodicka T, Salát J, Mucksová J.
Dependence of the immune response to coccidiosis on the age of rabbit suckling. Parasitol Res. 2008b Nov;103(6):1265-71.
Pakandl M. Coccidia of rabbit: a review. Folia Parasitol (Praha). 2009 Sep;56(3):153-66.
Pamilo P, Nei M. Relationships between gene trees and species trees. Mol Biol Evol.
1988 Sep;5(5):568-83.
Peeters JE, Geeroms R. Efficacy of toltrazuril against intestinal and hepatic coccidiosis in rabbits. Vet Parasitol. 1986 Nov;22(1-2):21-35.
Perrière G, Gouy M. WWW-Query: An on-line retrieval system for biological sequence banks. Biochimie. 1996;78:364-9.
Posada D, Crandall KA. MODELTEST: testing the model of DNA substitution.
Bioinformatics. 1998;14(9):817-8. Power ML, Richter C, Emery S, Hufschmid J, Gillings MR. Eimeria trichosuri:
phylogenetic position of a marsupial coccidium, based on 18S rDNA sequences. Exp Parasitol. 2009 Jun;122(2):165-8.
Procunier JD, Fernando MA, Barta JR. Species and strain differentiation of Eimeria
spp. of the domestic fowl using DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers.
Parasitol Res. 1993;79(2):98-102.
Rambaut, A. Se-Al v2.0: Sequence alignment editor. 1996. Available from: http://tree.bio.ed.ac.uk/software/seal/ [2009 jan 20].
Rambaut A, Drummond AJ. Tracer v1.4. 2007. Available from: http://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer/ [2010 jan 10].
Reduker DW, Duszynski DW. Eimeria ladronensis n. sp. and E. albigulae
(Apicomplexa: Eimeriidae) from the woodrat, Neotoma albigula (Rodentia:
Cricetidae). J Protozool. 1985 Aug;32(3):548-50.
Reduker DW, Duszynski DW, Yates TL. Evolutionary relationships among Eimeria
spp. (Apicomplexa) infecting cricetid rodents. Can J Zool. 1987;65:722-35.
Ursula Castro de Oliveira Referências
142
Rice P, Longden I, Bleasby A. EMBOSS: the European Molecular Biology Open
Software Suite. Trends Genet. 2000 Jun;16(6):276-7.
Rich SM, Licht MC, Hudson RR, Ayala FJ. Malaria's Eve: evidence of a recent population bottleneck throughout the world populations of Plasmodium falciparum.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Apr 14;95(8):4425-30.
Ricklefs RE, Outlaw DC. A molecular clock for malaria parasites. Science. 2010
Jul 9;329(5988):226-9.
Rokas A, Williams BL, King N, Carroll SB. Genome-scale approaches to resolving incongruence in molecular phylogenies. Nature. 2003 Oct 23;425(6960):798-804.
Romano CM. Caracterização Molecular e análise comparativa de genomas mitocondriais de Eimeria spp. de galinha doméstica. [dissertação (Mestrado em
Parasitologia)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2004.
Roos DS. Genetics. Themes and variations in apicomplexan parasite biology. Science. 2005 Jul 1;309(5731):72-3.
Rose ME. Immunity. In: Hammond DM, Long PL. The coccidia. Baltimore: University Park Press; 1973. p. 295–341.
Schmidt HA, Strimmer K, Vingron M, von Haeseler A. TREE-PUZZLE: maximum
likelihood phylogenetic analysis using quartets and parallel computing. Bioinformatics. 2002 Mar;18(3):502-4.
Schnitzler BE, Thebo PL, Mattsson JG, Tomley FM, Shirley MW. Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenic Eimeria
species of the chicken. Avian Pathol. 1998;27(5):490-7.
Schnitzler BE, Thebo PL, Tomley FM, Uggla A, Shirley MW. PCR identif ication of chicken Eimeria: a simplified read-out. Avian Pathol. 1999 Feb;28(1):89-93.
Scott DT, Duszynski DW. Eimeria from bats of the world: two new species from Myotis spp. (Chiroptera: Vespertilionidae). J Parasitol. 1997 Jun;83(3):495-501.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
143
Segade P, Crespo C, Ayres C, Cordero A, Arias MC, García-Estévez JM, Iglesias Blanco R. Eimeria species from the European pond turtle, Emys orbicularis (Reptilia:
Testudines), in Galicia (NW Spain), with description of two new species. J Parasitol. 2006 Feb;92(1):69-72.
Seville RS, Gruver J. Species of Eimeria (Apicomplexa: Eimeriidae) from bats
(Chiroptera: Vespertilionidae) in central Wyoming. J Parasitol. 2004Apr;90(2):348-51. Shirley MW. Enzyme variation in Eimeria species of the chicken. Parasitology. 1975
Dec;71(3):369-76.
Shirley MW. Electrophoretic variation of enzymes: a further marker for genetic studies of the Eimeria. Z Parasitenkd. 1978 Sep 4;57(1):83-7.
Shirley MW, Bellatti MA. Live attenuated coccidiosis vaccine: selection of a second
precocious line of Eimeria maxima. Res Vet Sci. 1988 Jan;44(1):25-8. Shirley MW, Bumstead N. Intra-specific variation within Eimeria tenella detected by
the random amplification of polymorphic DNA. Parasitol Res. 1994;80(4):346-51.
Shirley MW. Coccidial parasites from the chicken: discrimination of different populations of Eimeria tenella by DNA hybridization. Res Vet Sci. 1994 Jul;57(1):10-
4.
Shirley MW. The genome of Eimeria spp., with special reference to Eimeria tenella--a
coccidium from the chicken. Int J Parasitol. 2000 Apr 10;30(4):485-93.
Shirley MW, Ivens A, Gruber A, Madeira AM, Wan KL, Dear PH, Tomley FM. The Eimeria genome projects: a sequence of events. Trends Parasitol. 2004
May;20(5):199-201.
Shirley MW, Smith AL, Tomley FM. The biology of avian Eimeria with an emphasis
on their control by vaccination. Adv Parasitol. 2005;60:285-330.
Shirley MW, Smith AL, Blake DP. Challenges in the successful control of the avian coccidia. Vaccine. 2007 Jul 26;25(30):5540-7.
Sibley LD. Intracellular parasite invasion strategies. Science. 2004 Apr 9;304(5668):248-53.
Ursula Castro de Oliveira Referências
144
Singh B, Kim Sung L, Matusop A, Radhakrishnan A, Shamsul SS, Cox-Singh J, Thomas A, Conway DJ. A large focus of naturally acquired Plasmodium knowlesi
infections in human beings. Lancet. 2004 Mar 27;363(9414):1017-24.
Siroký P, Kamler M, Modrý D. Eimeria lokuma n. sp. (Apicomplexa: Eimeriidae), a new coccidium from the African helmeted turtle Pelomedusa subrufa (Lacépède)
(Testudines: Pelomedusidae). Syst Parasitol. 2006 Sep;65(1):73-6. Smith AL, Hesketh P, Archer A, Shirley MW. Antigenic diversity in Eimeria maxima
and the influence of host genetics and immunization schedule on cross-protective immunity. Infect Immun. 2002 May;70(5):2472-9.
Stamatakis A. RAxML-VI-HPC: maximum likelihood-based phylogenetic analyses
with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics. 2006 Nov 1;22(21):2688-90.
Striepen B, White MW, Li C, Guerini MN, Malik SB, Logsdon JM, Jr., et al. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr
30;99(9):6304-9.
Strimmer K, von Haeseler A. Likelihood-mapping: a simple method to visualize phylogenetic content of a sequence alignment. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jun 24;94(13):6815-9.
Su C, Evans D, Cole RH, Kissinger JC, Ajioka JW, Sibley LD. Recent expansion of Toxoplasma through enhanced oral transmission. Science. 2003 Jan
17;299(5605):414-6.
Sutton CA, Shirley MW, Wisher MH. Characterization of coccidial proteins by two-dimensional sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis. Parasitology. 1989;99(2):175-87.
Stucki U, Braun R, RoditiI. Eimeria tenella: characterization of a 5S ribosomal RNA
repeat unit and its use as a species-specific probe. Exp Parasitol. 1993 Feb;76(1):68-75.
Swofford DL. PAUP. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4beta10. Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates; 2002.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
145
Tenter AM, Heckeroth AR, Weiss LM. Toxoplasma gondii: from animals to humans.
Int J Parasitol. 2000 Nov;30(12-13):1217-58.
Tenter AM, Barta JR, Beveridge I, Duszynski DW, Mehlhorn H, Morrison DA,Thompson RC, Conrad PA. The conceptual basis for a new classification of the coccidia. Int J Parasitol. 2002 May;32(5):595-616.
Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG. The CLUSTAL_X
windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 1997; Dec 15;25(24):4876-82.
Tyzzer EE. Coccidiosis in gallinaceous birds. Am J Epidemiol. 1929 Sep 10(2): 269-383.
Upton SJ, Reduker DW, Current WL, Duszynski DW. Taxonomy of North American
fish Eimeriidae, NOAA Technical Report NMFS 11. 1984. p. 18. Upton SJ, Oppert CJ. Description of the oöcysts of Eimeria arnyi n. sp. (Apicomplexa: Eimeriidae) from the eastern ring neck snake Diadophis punctatus arnyi (Serpentes:
Colubridae). Systematic Parasitology 1991; 20:195-7.
Upton SJ, McAllister CT, Brillhart DB, Duszynski DW, Wash CD. Cross-transmission studies with Eimeria arizonensis-like oocysts (Apicomplexa) in New World rodents of the Genera Baiomys, Neotoma, Onychomys, Peromyscus, and Reithrodontomys
(Muridae). J Parasitol. 1992 Jun;78(3):406-13.
Vannier E, Gewurz BE, Krause PJ. Human babesiosis. Infect Dis Clin North Am.2008
Sep;22(3):469-88, viii-ix. Vetterling JM. Eimeria tenella: host specificity in gallinaceous birds. J Protozool. 1976
Feb;23(1):155-8.
Vrba V, Blake DP, Poplstein M. Quantitative real-time PCR assays for detection and quantification of all seven Eimeria species that infect the chicken. Vet Parasitol. 2010
Dec;174(3-4):183-90.
Wilson RJ, Williamson DH. Extrachromosomal DNA in the Apicomplexa. MicrobiolMolBiol Rev. 1997 Mar;61(1):1-16.
Ursula Castro de Oliveira Referências
146
Yabsley MJ, Gottdenker NL, Fischer JR. Description of a new Eimeria sp. and
associated lesions in the kidneys of double-crested cormorants (Phalocrocorax auritus). J Parasitol. 2002 Dec;88(6):1230-3.
Zhao X, Duszynski DW. Phylogenetic relationships among rodent Eimeria species
determined by plastid ORF470 and nuclear 18S rDNA sequences. Int J Parasitol.
2001a May 15;31(7):715-9.
Zhao X, Duszynski DW. Molecular phylogenies suggest the oocyst residuum can be used to distinguish two independent lineages of Eimeria spp in rodents. Parasitol
Res. 2001b Aug;87(8):638-43
Zhao X, Duszynski DW, Loker ES. Phylogenetic position of Eimeria antrozoi, a
bat coccidium (Apicomplexa: Eimeriidae) and its relationship to morphologically similar Eimeria spp. from bats and rodents based on nuclear 18S and plastid 23S
rDNA sequences. J Parasitol. 2001 Oct;87(5):1120-3.
ANEXOS
Ursula Castro de Oliveira Anexos
149
ANEXO A – Artigo em periódico. Oliveira UC, Fraga JS, Licois D, Pakandl M, Gruber
A. Development of molecular assays for the identification of the eleven Eimeria species of the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus). Vet
Parasitol. 2010 Nov 4. [Epub ahead of print].
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
150
ANEXO B - Teste de especificidade dos ensaios para diagnóstico de Eimeria spp.
de coelho.
(continua)
Figura B.1- Teste de especificidade dos ensaios para diagnóstico de Eimeria spp. de coelho. Amostras de DNA das onze espécies de Eimeria de coelho foram amplificadas por PCR utilizando-se pares de iniciadores homólogos e heterólogos. Os produtos de amplificação foramseparados por eletroforese em géis de agarose 1,5% corados com brometo de etídeo. Controles negativos sem DNA e marcador de tamanho molecular em escada de 100 pb (100 bp DNA Ladder, Invitrogen) também estão indicados.
Ursula Castro de Oliveira Anexos
151
(continua)
Figura B.1- Teste de especificidade dos ensaios para diagnóstico de Eimeria spp. de coelho. Amostras de DNA das onze espécies de Eimeria de coelho foram amplificadas por PCR utilizando-se pares de iniciadores homólogos e heterólogos. Os produtos de amplificação foramseparados por eletroforese em géis de agarose 1,5% corados com brometo de etídeo. Controles negativos sem DNA e marcador de tamanho molecular em escada de 100 pb (100 bp DNA Ladder, Invitrogen) também estão indicados.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
152
(continua)
Figura B.1-Teste de especificidade dos ensaios para diagnóstico de Eimeria spp. de coelho. Amostras de DNA das onze espécies de Eimeria de coelho foram amplificadas por PCR utilizando-se pares de iniciadores homólogos e heterólogos. Os produtos de amplificação foramseparados por eletroforese em géis de agarose 1,5% corados com brometo de etídeo. Controles negativos sem DNA e marcador de tamanho molecular em escada de 100 pb (100 bp DNA Ladder, Invitrogen) também estão indicados.
Ursula Castro de Oliveira Anexos
153
(conclusão)
Figura B.1-Teste de especificidade dos ensaios para diagnóstico de Eimeria spp. de coelho. Amostras de DNA das onze espécies de Eimeria de coelho foram amplificadas por PCR utilizando-se pares de iniciadores homólogos e heterólogos. Os produtos de amplificação foramseparados por eletroforese em géis de agarose 1,5% corados com brometo de etídeo. Controles negativos sem DNA e marcador de tamanho molecular em escada de 100 pb (100 bp DNA Ladder, Invitrogen) também estão indicados.
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
154
ANEXO C - Comandos para execução dos paupblocks para as análises filogenéticas
utilizando o programa PAUP, comandos para ModelTest e RAxML.
Neigbour-joining #NEXUS
BEGIN PAUP;
log start=yes file=NJ_arquivo.log replace=yes;
set autoclose=yes warnreset=no increase=auto;
outgroup;
set criterion=distance;
NJ;
Savetrees BrLens=yes MaxDecimals=3 from=1 to=1 file=NJ_arquivo.tre
format=phylip;
bootstrap search = NJ nreps=1000 conlevel=50;
root;
savetrees from=1 to=1 file=NJboot_arquivo.tre format=phylip
savebootp=nodelabels maxDecimals=1 replace=yes;
log stop;
end;
Máxima Parcimônia #NEXUS
BEGIN PAUP;
log start=yes file=Parsi_arquivo.log replace=yes;
set autoclose=yes warnreset=no increase=auto;
outgroup;
set criterion=parsimony;
hsearch;
savetrees BrLens=yes MaxDecimals=3 from=1 to=1
file=Parsi_arquivo.tre format=phylip;
bootstrap search = heuristic nreps=1000 conlevel=50;
root;
savetrees from=1 to=1 file=Parsiboot_arquivo.tre format=phylip
savebootp=nodelabels maxDecimals=1 replace=yes;
log stop;
end;
Ursula Castro de Oliveira Anexos
155
Máxima verossimilhança #NEXUS
BEGIN PAUP;
log start=yes file=ML_parsi_arquivo.log replace=yes;
set autoclose=yes warnreset=no increase=auto;
outgroup;
set criterion=parsimony;
hsearch;
set criterion=likelihood;
Lset Base=(valores Modeltest)Nst= valores Modeltest
Rmat= (valores Modeltest) Rates= valores Modeltest
Shape= valores Modeltest Pinvar= valores Modeltest;
lscores 1;
lset rmatrix=(valores Modeltest) basefreq=(valores Modeltest) rates=
valores Modeltest shape=valores Modeltest;
hsearch start=1;
savetrees BrLens=yes MaxDecimals=3 from=1 to=1
file=MLparsi_arquivo.tre format=phylip;
bootstrap search = heuristic nreps=1000 conlevel=50;
root;
savetrees from=1 to=1 file=MLparsiboot_arquivo.tre format=phylip
savebootp=nodelabels maxDecimals=1 replace=yes;
log stop;
end;
ModelTest exe modelblockPAUPb10
Arquivos de saída: modelscores e modelfit.
Executar o ModelTest: modeltest3.7 -a0.01 <model.scores>bestmodel
RAxML raxmlHPC -f a -s arquive.fasta.phylip -n arquive_saida -m GTRGAMMAI
-x 1234 -# 1000
Ursula Castro de Oliveira Tese de Doutorado
156
ANEXO D - Filogramas das análises dos marcadores individuais utilizando os três critérios de optimalidade (neighbor-joining, máxima parcimônia e máxima
verossimilhança).
157
Figura D.1 - Filograma obtido por neighbor-joining da SSU de rRNA nuclear de espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos. Os
valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
158
Figura D.2 - Filograma obtido por máxima parcimônia da SSU de rRNA nuclear de espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos. Os
valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
159
Figura D.3 - Filograma obtido por máxima verossimilhança da SSU de rRNA nuclear de espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos. Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
160
Figura D.4 - Filograma obtido por neighbor-joining da LSU de rRNA do apicoplasto de espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos. Os
valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
161
Figura D.5 - Filograma obtido por máxima parcimônia da LSU de rRNA do apicoplasto de espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos.
Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
162
Figura D.6 - Filograma obtido por máxima verossimilhança da LSU de rRNA do apicoplasto de espécies de Eimeria de coelho e galinha
domésticos. Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
163
Figura D.7 - Filograma obtido por neigbor-joining do citocromo b mitocondrial de espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos. Os
valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
164
Figura D.8 - Filograma obtido por máxima parcimônia do citocromo b mitocondrial de espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos. Os
valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
165
Figura D.9 - Filograma obtido por máxima verossimilhança do citocromo b mitocondrial de espécies de Eimeria de coelho e galinha
domésticos. Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
166
Figura D.10 - Filograma obtido por neigbor-joining da ORF470 de apicoplasto de espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos. Os
valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
167
Figura D.11 - Filograma obtido por máxima parcimônia da ORF470 de apicoplasto de espécies de Eimeria de coelho e galinha domésticos. Os
valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.
168
Figura D.12 - Filograma obtido por máxima verossimilhança da ORF470 de apicoplasto de espécies de Eimeria de coelho e galinha
domésticos. Os valores de bootstrap encontram-se indicados nos nós. Os quadros em tons de cinza representam os dois hospedeiros. As espécies de Eimeria com oocisto contendo ou não o corpo residual estão indicadas pelas barras horizontais.