universidade vale do rio doce especializaÇÃo...

UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE

FACULDADE DE CIENCIAS DA SAÚDE

ESPECIALIZAÇÃO LATU SENSO – ANALISES CLINICAS E GESTÃO DE LABORATORIO

Pedro Henrique Ferreira Marçal

CITOCINAS INTRACITOPLASMATICAS EM PACIENTES COM HANSENIASE E CONTATOS INTRA E EXTRADOMICILIARES: ESTUDO DE CASO

Governador Valadares

2011

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Pedro Henrique Ferreira Marçal

CITOCINAS INTRACITOPLASMATICAS EM PACIENTES COM HANSENIASE E CONTATOS INTRA E EXTRADOMICILIARES: ESTUDO DE CASO

Trabalho de Conclusao de curso para Obtenção de grau de especialista em analyses clinicas,

Apresentada a faculdade de ciencias da saude da Universidade vale do Rio doce

Oritentador (a): Dra. Lúcia Alves de Oliveira Fraga

Governador Valadares 2011

3

RESUMO

A hanseníase é uma doença infecciosa crônica que afeta principalmente a pele e nervos

periféricos (Lockwood, 2004), com manifestações clinicas que dependem da resposta imune do

hospedeiro ao Mycobacterium leprae (SARNO et al., 1988).

Atualmente não existe nenhum teste laboratorial sensível e específico para o diagnóstico

da infecção assintomática pelo Mycobacterium leprae ou para prever a progressão para

hanseníase entre indivíduos expostos (STEFANI, 2008; ARAOZ et al., 2006). Esses testes,

devem requerer tanto os ensaios baseados em anticorpos, como ensaios de células T (DUTHIE et

al., 2007; DUTHIE et al., 2008). Recentemente vários antígenos inéditos de Mycobacterium

leprae têm sido testados como reagentes diagnósticos para hanseníase (GELUK et al., 2005;

GELUK, OTTENHOFF, 2006; GELUK et al., 2008; REECE et al., 2006; SPENCER et al.,

2005).

Produção de INF-γ induzida por Mycobacterium leprae em células mononucleares do

sangue periférico, tem sido usado para mensurar resposta immune celular (SAMPAIO, 1991).

Produção de IL4 e IL10, levam a ativação de linfócitos B e produção de anticorpos contra

antígenos do Mycobacterium leprae, sendo o bacilo intracelular obrigatório, a imunidade humoral

instalada, conduz ao polo de susceptibilidade à enfermidade (SARNO et al., 1988).

A proposta deste estudo inicial foi avaliar o perfil imunológico de individuos

diagnosticados com hanseníase, e contatos intradomiciliares, residentes em Governador

Valadares – MG, através da análise do padrão de citocinas intracitoplasmáticas IFN-γ, IL-4, IL-

10 em populações de leucócitos do sangue periférico dos mesmos, após incubação com antígenos

específicos do M. leprae, auxiliando na compreensão dos mecanismos imunológicos associados a

variações na susceptibilidade à infecção pelo M. leprae,

Os resultados mostraram que, frente a estímulo com M. leprae, paeientes multibacilares e

um contato de paciente multibacilar apresentaram alta porcentagem de células T CD3+IL4+

(0,98%; 0,86% e 0,77%), respcctivamente, bem como células T CD3+IL10+ (0,72%, 0,81% e

0,7%), respectivamente. Quanto à produção de IFN-γ, pacientes paucibacilares, um contato de

paciente multibacilar e um contato de paciente paucibacilar, apresentaram alta porcentagem de

células produtoras (1,32%; 1,02%, 1,1% e 0,92%), respectivamente. Interressantemente, o

contato extracomiciliar, que apresentara alta frequência de linfócitos T CD3+IL4+IL10+, durante

4

o experimento controle (sem estimulo) e com o estímulo de PHA, quando suas células entraram

em contato com o antigeno M.leprae, houve uma modulação da resposta, ocorrendo uma

diminuição na frequencia de células produtoras de IL4 e IL10 (0,42% e 0,39%), respectivamente,

e um aumento na porcentagem de linfócitos T CD3+ IFN-γ+ (0,78%).

Palavras-chave: Hanseníase, Mycobacterium Leprae, citocinas intracitoplasmáticas.

5

Dedico este trabalho ao Grande Deus

Que em todo tempo permanence com

Suas maos estendidas sobre nós.

6

AGRADECIMENTOS

A Dra. Lúcia, que não mede esforços para o crescimento na pesquisa nesta universidade e

em seus alunos;

Aos amigos e tecnicos do NPqImuno, cujo auxílio foi excencial para a finalização dos

resultados;

Aos familiares amigos, por acreditarem em mim, durante todo o tempo.

7

SUMÁRIO

I INTRODUÇAO…………………………………………………………………………9

II REVISAO DA LITERATURA……………………………………………………...11

2.1 HANSENIASE……………………………………………………………………….11

2.2 ETIOLOGIA………………………………………………………………………….11

2.3 CELULAS DE SHWAN……………………………………………………………..12

2.4 FORMAS CLINICAS………………………………………………………………..13

2.5 IMUNOLOGIA………………………………………………………………………14

2.6 DIAGNOSTICO……………………………………………………………………...15

2.7 TRATAMENTO……………………………………………………………………...16

2.8 CITOMETRIA DE FLUXO APLICADA A HANSENIASE………………………..16

III METODOLOGIA…………………………………………………………………...20

3.1 GRUPO POPULACIONAL DO ESTUDO………………………………………….20

3.2 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO………………………..21

3.3 COLETA DE SANGUE PARA OS ENSAIOS IMUNOLOGICOS………………...21

3.4 DETECÇAO DE CITOCINAS INTRACITOPLASMATICAS……………………..21

3.5 OBTENÇAO DE DADOS NO CITOMETRO DE FLUXO E ANALISE DOS

RESULTADOS…………………………………………………………………………..21

IV RESULTADOS E DISCUSSAO……………………...………………………….…24

4.1 PRODUÇÃO DE CITOCINAS INTRACELULARES (IL4, IL10 E INF-Γ) EM

LINFÓCITOS T CD3+ DE INDIVÍDUOS MULTIBACILARES, PAUCIBACILARES,

CONTATOS E SADIO APÓS CULTURA IN VITRO SEM

ESTIMULAÇÃO................................................................................................................24



CONTATOS E SADIO APÓS CULTURA IN VITRO COM ESTÍMULO DE

SEB.....................................................................................................................................26



8


MYCOBACTERIUM LEPRAE...........................................................................................29

V CONCLUSAO………………………………………………………………………..33

VI REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS……………………………………………..34

9

I INTRODUÇÃO

A hanseníase, uma das mais antigas doenças humanas, ainda é um importante problema

de saúde pública para muitos países endêmicos, como o Brasil (COLE et al., 2001).

O agente causador da hanseníase, o Mycobacterium leprae foi o primeiro patógeno

bacteriano a ser identificado como causa de uma doença infecciosa humana há mais de 130 anos

(SCOLLARD et al., 2006).

A doença é transmitida de pessoa a pessoa através do convívio de indivíduos susceptíveis

com doentes das formas contagiantes, sem tratamento, com um período médio de incubação, de 2

a 5 anos, tendo como principal via de eliminação dos bacilos, a via aérea superior. É uma

patologia que apresenta um amplo espectro clínico-imunológico, variando dos pólos

imunologicamente estáveis tuberculóide e lepromatoso ao dimorfo, imunologicamente instável,

dependendo da resposta imune do indivíduo (SAPKOTA, et al., 2009).

As características imunológicas das formas espectrais da hanseníase incluem pacientes

tuberculóides que apresentam baixos títulos de anticorpos para o Mycobacterium leprae e forte

resposta imune celular específica (RIC) do tipo Th1 caracterizada por produção de citocinas

como interferon gama (IFN-γ), a doença é localizada e o paciente apresenta poucos bacilos e

lesões limitadas (até cinco lesões na pele). Pacientes com a forma clínica Virchoviana, se

encontram no pólo de extrema suscetibilidade ao M. leprae, no qual a proliferação disseminada

do bacilo resulta em lesões da pele, difusamente distribuídas, associadas a uma potente resposta

imune humoral com produção de níveis elevados de anticorpos anti-M. Leprae (SCOLLARD et

al., 2006; LYON, et al. 2008). Em outras formas clínicas, tais como dimorfos, dimorfos-

tuberculóide, dimorfos-dimorfos e dimorfos-virchovianos, a progressiva redução da resposta

imune mediada por célula é acompanhada por lesões de pele e nervos, aumento da carga bacilar e

dos níveis de anticorpos (OTTENHOFF, 1994a; OTTENHOFF, 1994b).

Os esforços da Organização Mundial da Saúde para eliminar a hanseníase até o ano 2000

foram baseados em importantes avanços na terapia antimicobacteriana na década de 80. Apesar

do grande declínio na prevalência observado na maioria dos países endêmicos na última década, a

detecção de casos novos permanece alta (WHO, 2010). O desenvolvimento de testes diagnósticos

aplicáveis em situação de campo é uma prioridade em pesquisa, visto que o diagnóstico da

hanseníase é baseado principalmente em manifestações clínicas e a escassez de sintomas no

10

início da doença pode contribuir para erros no diagnóstico ou para o sub-diagnóstico (STEFANI,

2008).

Atualmente não existe nenhum teste laboratorial sensível e específico para o diagnóstico

da infecção assintomática pelo Mycobacterium leprae ou para prever a progressão para

hanseníase entre indivíduos expostos (STEFANI, 2008). Esses testes, devem requerer tanto os

ensaios baseados em anticorpos, como ensaios de células T. Recentemente vários antígenos

inéditos de Mycobacterium leprae têm sido testados como reagentes diagnósticos para hanseníase

(ARAOZ et al., 2006; DUTHIE et al., 2007; DUTHIE et al., 2008; GELUK et al., 2005; GELUK,

OTTENHOFF, 2006; GELUK et al., 2008; REECE et al., 2006; SPENCER et al., 2005).

O principal objetivo desse estudo inicial foi avaliar indicadores imunológicos associados à

proteção e/ou adoecimento, em pacientes com hanseníase e seus contatos intradomiciliares,

residentes em Governador Valadares-MG, que possam servir de ferramenta para estratégias de

controle da doença.

Sabendo-se que nas doenças transmissíveis a distribuição de casos não ocorre ao acaso na

população, estando os casos agregados em territórios definidos como consequência da

transmissão; torna-se relevante a busca de novos casos e consequentemente o investimento em

métodos complementares de diagnóstico.

A avaliação de parâmetros imunológicos neste estudo irá auxiliar na compreensão dos

mecanismos imunológicos associados a variações na susceptibilidade à infecção pelo M. leprae,

através da análise do padrão de citocinas intracitoplasmáticas IFN-γ, IL-4, IL-10 em populações

de leucócitos do sangue periférico dos casos e indivíduos comunicantes, após incubação com

antígenos específicos do M. leprae.

11

II REVISAO DA LITERATURA

2.1 HANSENÍASE

A hanseníase é uma doença infecciosa sistêmica de curso crônico, que afeta

principalmente os nervos periféricos, a pele e a mucosa das vias aéreas superiores. Admite-se que

a via de entrada do Mycobacterium leprae é o trato respiratório superior, por onde atinge a

mucosa e dissemina-se pelo organismo. A hipótese da via de transmissão aérea é confirmada pela

grande quantidade de bacilos íntegros isolados de secreções nasais de pacientes. Também é

considerada uma doença incapacitante, uma vez que ocorre dano neural causado pela invasão do

M. leprae e comprometimento do sistema nervoso periférico, irreversível em vários casos

(GALLO et al., 2005).

Dados oficiais da Organização Mundial de Saúde mostram que mais de 213.000 pessoas

estão infectadas, principalmente na Ásia e na África, com aproximadamente 249.000 novos casos

relatados em 2008. Áreas como: Brasil, Angola e Índia apresentam alta endemicidade da doença.

O Brasil encontra-se como o primeiro país com maior taxa de incidência da doença (WHO,

2009).

A resposta imune do hospedeiro frente ao bacilo determina a evolução clínica na

hanseníase. Acredita-se que mais de 99% da população apresenta resposta imune adequada contra

a hanseníase e não desenvolve a doença (SPIERINGS, 2000). Entre os sintomáticos, a doença

pode se manifestar em diferentes formas clínicas.

2.2 ETIOLOGIA

O M. leprae, agente causador da hanseníase, é um patógeno intracelular obrigatório que

infecta predominantemente macrófagos e células de Schwann (BLOOM, 1986). Possui a forma

de um bastonete reto ou ligeiramente encurvado, de 1,5 a 8 micra de comprimento por 0,2 a 0,5

mícron de largura. Cora-se em vermelho pela fucsina e não se descora pela lavagem com álcool

ácido, é, portanto, um bacilo álcool-ácido resistente (BAAR) (REES, 1984). É uma bactéria de

crescimento lento, fazendo uma divisão binária a cada 12-14 dias (WHO, 1987).

12

Compartilha com outras micobactérias características como a abundância de lipídios na

forma de ácidos micólicos (ácidos graxos de elevado peso molecular) e lipoarabinomanana

(LAM) em seu envelope celular. Além disso, mais externamente, estão localizados glicolipídieos,

como o PGL-1 (glicolipídeo fenólico-1), encontrado exclusivamente no M. leprae. Sua estrutura

é composta de um trissacarídeo, fenol, fitiocerol e de ácido micoseossídico (HUNTER &

BRENNAN, 2001). Estudos anteriores já mostraram que o PGL-1 pode ser encontrado em

tecidos, no sangue circulante e na urina de doentes multibacilares. Além disso, ele também foi

detectado em tatus infectados com o M. leprae (HUNTER, STEWART & BRENNAN, 1985).

Este antígeno não apresenta reação cruzada com M. tuberculosis ou outras microbactérias e

estimula uma potente resposta IgM que é proporcional a carga bacteriana nos pacientes (CHO et

al., 1983).

Desde sua descoberta em 1873 por Armauer Hansen todas as tentativas para cultivar este

microorganismo falharam (HUNTER, 2001). Entretanto, em 1962, foi demonstrado por Shepard

que o coxim plantar de camundongos infectados com 103 a 104 bacilos promovia uma lesão

localizada de hanseníase durante 9 a 12 meses (Shepard, 1962). Outra fonte de M. leprae

utilizada para estudos é o tatu nove bandas (Dasypus novencinctus). Ele permite o crescimento do

bacilo de forma disseminada durante 18 a 24 meses comprometendo pele, nervos periféricos,

medula óssea, fígado, baço, linfonodos, pulmões, meninges e olhos. Após a purificação os bacilos

podem ser usados vivos por até uma semana ou letalmente irradiados (KIRCHHEIMER &

STORRS, 1971).

O genoma do M. leprae foi completamente seqüenciado em 2001 e gerou grande

expectativa sobre o conhecimento de sua funcionalidade na patogenia da hanseníase. Apenas

49,5% do genoma do M. leprae (1605 genes) contêm genes que codificam proteínas sendo o

restante constituído de pseudogenes ou genes degenerados (COLE et al., 2001). Quando

comparado ao M. tuberculosis percebe-se uma perda maciça de genes pelo M. leprae, o que

poderia explicar o seu longo tempo de geração e sua incapacidade de multiplicação in vitro

(VISSA & BRENNAN, 2001).

2.3 CÉLULAS DE SHWAN

13

Célula de Schwann é um tipo de célula glial que produz a mielina que envolve os axónios

dos neurónios no sistema nervoso periférico, isolando eletricamente os nervos e assim permitindo

a propagação rápida de potenciais de ação (SAPKOTA, et al., 2009).

Cada célula de Schwann envolve um segmento de um axónio, enrolando-se em volta

deste e de si própria, até cem vezes. A sua membrana celular contém lipídeos e glicoproteínas

produzidas na célula com propriedades especificas para as necessidades de isolamento dos

neurónios (RAMBUKKANA et al., 2002).

As células de Schwann (SC) são um importante alvo para a infecção por M. leprae, o que

induz à lesão do nervo, desmielinização e conseqüente incapacidade física. Experimentos

realizados com culturas de tecido nervoso (in vitro) e modelos animais (in vivo) confirmaram o

tropismo do M. leprae pelos nervos periféricos. A ligação do M. leprae induz a desmielinização

das SCs e perda axonal da condutância (RAMBUKKANA et al., 2002).

2.4 FORMAS CLINICAS

A doença apresenta um amplo espectro, variando do polo tuberculóide ao lepromatoso

com formas no boderline imunologicamente instáveis, dependendo da resposta imune do

indivíduo (SAPKOTA, et al., 2009). O teste de intradermoreação de Mitsuda utilizado no

diagnóstico é positivo para a forma clínica tuberculóide (Paucibacilar-PB), doença localizada,

com vigorosa resposta imune celular, poucos bacilos e lesões limitadas (até cinco lesões no

corpo). O teste é negativo nos pacientes com a forma clínica Virchoviana (Multibacilar-MB), o

pólo de extrema suscetibilidade ao M. leprae, no qual a proliferação disseminada do bacilo

resulta lesões da pele, difusamente distribuídas, associadas a uma potente resposta imune

humoral com produção de níveis elevados de anticorpos anti-M. Leprae (LYON, et al. 2008). Em

outras formas clínicas, tais como dimorfos, dimorfos-tuberculóide, dimorfos-dimorfos e

dimorfos-virchovianos, a progressiva redução da resposta imune mediada por célula é

acompanhada por lesões de pele e nervos, aumento da carga bacilar e dos níveis de anticorpos

(OTTENHOFF, 1994 a; OTTENHOFF, 1994b).

A imunidade humoral presente no pólo virchoviano, exibe altos títulos de anticorpos

contra antígenos do M. Leprae, principalmente o glicolipídeo-fenólico1(PGL-1), sem, contudo

conferir proteção significativa, pois o indivíduo elimina bacilos e contribui para disseminação

14

bacilar (YAMAMURA, et al., 1991; CHIN, et al., 1992; HARBOE, 1985; SIELING, 1992).

Ocorre nesses pacientes, aumento dos níveis de anticorpos dos isotipos IgM, IgG, IgE e IgA,

especialmente contra a proteína PGL-1 (CUNHA, 1998; FOSS et al., 1993; KLATSER, 1994;

BUHRER-SÉKULA et al., 2007; LYON etal., 2008). A imunidade celular, presente no polo

tuberculóide, é caracterizada pela presença de citocinas do tipo 1 (IFN-γ, IL-2 e linfotoxina) e

confere ao indivíduo resistência ao bacilo. Macrófagos e linfócitos ativados por citocinas,

formam granulomas, com a presença de células TCD4+ no centro e, linfócitos TCD8+ na periferia

(MODLIN, et al., 1988; GOULART & GOULART, 2009).

2.5 IMUNOLOGIA

Patógenos intracelulares tais como as micobactérias, são reconhecidos por células

fagocitárias da imunidade inata, direta ou indiretamente via diferentes receptores. A ativação

celular através do receptor Toll pode contribuir para os mecanismos de defesa do hospedeiro

regulando a fagocitose e ativando mecanismos antimicrobianos, tais como, a indução de

linfócitos Th1. Não existe um consenso com relação aos fatores de risco para a indução de uma

maior susceptibilidade ou resistência ao bacilo. Entretanto, alguns autores têm demonstrado que

fatores genéticos, tais como, variações nas regiões promotoras de certos genes (PARK2,

PCARG), poderiam estar associados ao desenvolvimento da forma clínica lepromatosa da

hanseníase (CHER et al., 1987).

A avaliação da imunidade celular através da detecção de citocinas intracitoplasmáticas em

células TCD4+ e TCD8+ de pacientes hansenianos indicou a aplicação testa técnica para

avaliação imunológica de indivíduos contatos de pacientes (ANTAS et al., 2004).

Como descrito anteriormente, a imunidade mediada por célula representa um fator

importante no controle da infecção pelo M. Leprae. As células Th1 produzem IFN-γ que ativa

macrófago e IL-2 que estimula o crescimento de células T antígeno-específicas, resultando na

redução da carga bacilar ou cura. Células Th2 produzem IL-4, IL-5 e IL-10 e ampliam a resposta

humoral. IL-4 estimula a produção de IgE, e ambas IL-4 e IL-10 estimulam células B e inibem a

ativação de macrófago resultando em infecção progressiva (CHER et al., 1987; SIELING et al.,

1994a).

15

Acentuando o fenômeno da imunoregulação na doença em questão, a presença da IL-10

nas lesões suprime a produção de citocinas do tipo 1 por células TCD4, com uma redução

significativa de IFN-γ e IL-2, resultando em uma resposta ineficiente aos antígenos de M. leprae

(MISRA et al., 1995). É importante salientar que, uma produção crônica de IL-10 pode levar a

uma diferenciação de células T CD4, originando uma subpopulação de células T reguladoras

(Tr1) que produzem altos níveis de IL-10 mantendo a supressão da resposta imune antígeno-

específica (ASSEMAN, 1998). Tem sido também investigado o papel imunomodulador do fator

transformador do crescimento-beta1 (TGF-β1) na hanseníase por GOULART et.al (1996). Estes

autores detectaram grande quantidade de células macrofágicas positivas para TGF- β 1 no

infiltrado virchoviano, e ao contrário, constataram ausência dessa citocina no granuloma da

forma tuberculóide. Tem sido demonstrada também, a produção de TGF- β1 ativo em

sobrenadantes de cultura de macrófagos, de portadores de hanseníase com uma produção

significativamente maior naqueles, da forma virchoviana, quando comparados com os pacientes

da forma tuberculóide (GOULART. et al, 1996; GOULART. et., 1999; GOULART. et al., 2000;

GOULART. et al., 2009 ). O TGF- β1 contrapõe os efeitos do IFN-γ na ativação da atividade

antimicrobiana mediada pelo óxido nítrico (NO) e inibe a síntese de TNF-α, dessa forma

contribuindo para a manutenção da infecção (BERMUDEZ, 1993; GRENN et al., 1994,

NELSON et al., 1991).

Recentemente, SAVAGE et al. 2008 apud STEFANI, 2008, demonstrou a presença de

macrófagos no sangue periférico capazes de induzir células T reguladoras do tipo

Foxp3+GITR+CD25+. Estes autores, reforçam a importância da compreensão dos mecanismos

derivados da atuação desses macrófagos, considerando que estas células apresentam um papel

especial no controle e exacerbação das doenças inflamatórias crônicas, como é o caso da

hanseníase. Dentro desse contexto, postula-se que a indução precoce do TGF- β 1 seria essencial

para estabelecer o curso da infecção hansênica na ausência de IFN- γ, levando a proliferação

descontrolada do bacilo dentro do macrófago, o que promoveria o desenvolvimento do padrão de

resposta do tipo 2, que é encontrada na forma virchoviana, com inibição da resposta do tipo 1

(GOULART et. al, 2002).

2.6 DIGNÓSTICO

16

O diagnóstico de hanseníase é essencialmente clínico e baseado em um ou mais dos três

sinais: manchas hipocrômicas ou avermelhada com perda de sensibilidade, nervos

periféricosespessados e bacilo álcool-ácido resistente detectado em esfregaços de pele ou biópsia

de material (WALKER, LOCKWOOD, 2006). Identificação do bacilo é feita através da

coloração do esfregaço de raspado dérmico e biópsias de pele (baciloscopia). O índice

baciloscópico (IB) é uma escala logarítimica (variando 1-6 +) quantificando a densidade de M.

leprae em esfregaços de raspado dérmico e é utilizado para avaliar a carga bacteriana para

classificação e resposta ao tratamento (PINHEIRO, 2011).

É portanto um diagnóstico baseado principalmente em manifestações clínicas e a escassez

de sintomas no início da doença pode contribuir para erros no diagnóstico ou para o

subdiagnóstico. O diagnóstico precoce e a introdução do tratamento específico são importantes

para reduzir fontes de transmissão e para prevenir doença grave com incapacidade e deficiência

física (STEFANI, 2008).

A avaliação da imunidade celular através da detecção de citocinas intracitoplasmáticas em

células TCD4+ e TCD8+ de indivíduos com hanseníase indicou a aplicação desta técnica para

avaliação imunológica de indivíduos contatos de pacientes, uma vez que permite prever a

resposta immune desse indivíduo frente ao estímulo específico com ML (ANTAS et al., 2004).

2.7 TRATAMENTO

A doença é curável e tratada com poliquimioterapia (PQT). Segundo WHO, 2010, a

rifampicina (600mg, uma vez por mês), clofazimina (300mg, uma vez por mês e 50mg / dia) e

dapsona (100mg por dia) são usadas para o tratamento de pacientes MB, por um período de um

ano. Para os pacientes PB, apenas a rifampicina (600mg, mensal) e dapsona (100mg por dia) são

empregados por seis meses.

Em indivíduos impossibilitados de tomar clofazimina ou dapsona, outros agentes como,

fluoroquinolonas, ofloxacina, moxifloxacina ou pefloxacina, ciclinamino e o macrolídeo

claritromicina, são ativos contra o M. leprae e podem potencialmente ser usados como agentes de

segunda linha (BRITTON, LOCKWOOD, 2004).

2.8 CITOMETRIA DE FLUXO APLICADA Á HANSENÍASE

17

De acordo com Shapiro 2003, a citometria de fluxo é um processo no qual são medidas

características físicas e/ou químicas de células ou de outras partículas. Possui utilidade em

diversas áreas como a Imunologia, a Hematologia, a Oncologia, a Anatomia Patológica e a

Biologia Celular. Esta técnica permite a análise de diversas características, tais como o tamanho

celular, a complexidade citoplasmática, a expressão de antígenos celulares, assim como pode ser

realizado o estudo do ciclo celular, na contagem absoluta de células e na separação de populações

celulares com fenótipos específicos (“sorting”), e o estudo de diversos parâmetros celulares como

a concentração do Ca²+ intracelular, o pH intracelular e a apoptose (BROWN e WITTWER

2000; ORFAO e BUITRAGO 1995).

Antes do uso da citometria de fluxo, as células eram visualizadas com um microscópio de

fluorescência. Embora os citômetros de fluxo estivessem disponíveis no comércio desde o início

dos anos 70, o seu uso era em primeiro lugar para a investigação, devido à raridade, ao elevado

custo e à complexidade do seu funcionamento (NICHOLSON, 2002).

É uma tecnologia com uma velocidade de análise superior à outras, visto que se consegue

ler entre 500 a 5.000 células por segundo. O citômetro de fluxo possui um computador acoplado,

o qual recebe os sinais que posteriormente serão convertidos em dados digitais para serem

representados através de gráficos monoparamétricos e biparamétricos.

A técnica consiste em uma suspensão celular que é injetada no citômetro, dirigindo-se

para o núcleo central contido na câmara de fluxo. Nesta câmara existe um líquido de

envolvimento (Sheath fluid) que não se mistura com a suspensão celular (Figura 1). No núcleo

central as células formam um fluxo laminar que mantém hidrodinâmicamente, as células

alinhadas de forma que estas passem uma a uma em frente ao feixe (RIBEIRO, 2010).

18

FIGURA 1 – A focagem hidrodinâmica forma uma fila única de células.

FONTE: RIBEIRO, 2010

A interação das células ou das partículas com o feixe luminoso origina sinais que vão ser

alcançados por detectores adequados. A informação recolhida pode agrupar-se em dois tipos

fundamentais: a que é originada pela dispersão da luz e a que está relacionada com a emissão de

luz por fluorocromos presentes na célula ou na partícula, ao serem excitados pela fonte luminosa

(Figura 2).

A dispersão da luz é um processo físico em que uma célula interage com a luz incidente e

muda a direção da luz. As características celulares que contribuem para a dispersão da luz são o

tamanho celular, a membrana celular, o núcleo e o material granular do interior da célula.

A luz não se dispersa de igual forma em todas as direções. A luz que dispersa para frente

(“forward scatter”, FSC) é uma medida do tamanho celular, enquanto a luz que é dispersa em

ângulo reto (“side scatter”, SSC) depende da complexidade celular (ORFÃO E BUITRAGO

1995).

FIGURA 2 – Esquema de funcionamento de um citômetro de fluxo.

FONTE: RIBEIRO, 2010.

19

A fluorescência é indicada como a emissão de energia luminosa pelos compostos

fluorescentes que se encontram ligados aos anticorpos monoclonais. Estes compostos absorvem

energia, fazendo com que um elétron passe a um nível energético superior. No momento em que

esse elétron regressa ao seu estado de repouso, emite um fóton e libera energia (Orfão e Buitrago

1995).

Os sinais vão depois ser convertidos em dados digitais para serem representados através

de gráficos monoparamétricos e biparamétricos (ORFÃO E BUITRAGO 1995).

Toda esta tecnologia aumenta a sensibilidade e a especificidade da identificação de

moléculas de superfície celular que atuam como marcadores fenotípicos que podem ser

associados às funções celulares.

Dessa forma, a citometria de fluxo apresenta grande aplicabilidade, uma vez que aumenta

o conhecimento ciêntífico, com relação à resposta imune de um grupo específico de indivíduos

frente e estímulos específicos como o Mycobacterium leprae.

20

III. METODOLOGIA

3.1 GRUPO POPULACIONAL DO ESTUDO

Foram incluídos neste estudo 4 casos novos de hanseníase, 4 contatos intradomiciliares, 1

contato extradomiciliar (professional de saúde que trabalha a 31 anos no CREDEN-PES) e 1

indivíduo sadio como controle negativos, residentes no município de Governador Valadares –

MG. Dois (2) dos casos novos de hanseníase eram multibacilares e foram chamados de M1 e M2,

os outros dois (2) casos novos eram paucibacilares, sendo chamados de P1 e P2. A tabela 1,

apresentada informações importantes sobre esses individuos. Dois (2) dos contatos

intradomiciliares eram contatos dos pacientes multibacilares, chamados de CM1 e CM2, já os

outros dois (2), eram contatos dos pacientes paucibacilares, CP1 e CP2. O contato extradomiciliar

foi chamado de CE e o paciente sadio de S.

Tabela 1: Características dos casos novos de hanseníse diagnosticados, participantes

do estudo.

Para fins operacionais, deve-se considerar como contato intradomiciliar toda e qualquer

pessoa que resida ou tenha residido nos últimos cinco anos com o doente. Os dados referentes à

identificação dos casos novos e contatos intradomiciliares que fizaram parte desse estudo foram

fornecidos pelo SINAN (Sistema Nacional de Agravos de Notificação) e prontuários clínicos.

Os contatos intradomiciliares foram submetidos a exame dermato-neurológico por

clínicos experientes para confirmar estar este, sem sintomas de hanseníase.

Pacientes Forma

clínica

Classificação

Operacional

Índice

Baciloscópio

(IB)

Data do

diagnóstico

Tempo de

tratamento

M1 Multibacilar Virchowiano 2,5 27/09/2010 3 meses

M2 Multibacilar Dimorfo 1,5 19/08/2010 4 meses

P1 Paucibacilar Tuberculóide 0 30/08/2010 4 meses

P2 Paucibacilar Tuberculóide 0 08/11/2010 1 mês

21

3.2 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO

O Consentimento pós-informado (TCLE) foi obtido de todos os participantes. Em caso de

menores, a inclusão só será feita após assinatura do consentimento pelos pais ou guardião.

3.3 COLETA DE SANGUE PARA OS ENSAIOS IMUNOLÓGICOS.

O sangue dos indivíduos participantes do estudo foi coletado por profissionais

qualificados da área de saúde, no CREDEN-PES, respeitando as técnicas de biossegurança, tais

como uso de luvas, material estéril e descartável. Foram coletados cerca de 30 ml de sangue

utilizando tubos heparinizados, estéreis a vácuo e descartáveis (VACUTAINER, Grand Island,

NY, USA), para mensuração de citocinas intracitoplasmáticas.

3.4 DETECÇÃO DE CITOCINAS INTRACELULARES

O sangue dos indivíduos foi colocado em RPMI-suplementado e em contato com o

antígeno ML por tempo variável. Brefeldina A (10ng/ml) foi adicionada 4 horas antes do final da

cultura. As células foram lavadas com PBS e incubadas por 30 minutos, ao abrigo da luz, a

temperatura ambiente, com anticorpos monoclonais de superfície, a saber CD3FITC. Em seguida,

as amostras foram lavadas com PBS por centrifugação (400g, 7 minutos) e o sobrenadante

desprezado. Após lise das hemácias, fixação e permeabilização com solução de lise, formaldeído

(4%) e solução de soponina (0.5%), respectivamente, as células foram incubadas com anticorpos

monoclonais anti-citocinas (IL4, IL10 e INF-γ), marcados com PE por 30 minutos, ao abrigo da

luz, a temperatura ambiente. Após incubação as células foram lavadas com PBS e, em seguida

adicionada solução fixadora (MFF- 10g/L). A leitura foi realizada em Citometro de Fluxo

Beckman Coulter EPICS XL-MCL.

3.5 OBTENÇAO DE DADOS NO CITOMETRO DE FLUXO E ANALISE DOS

RESULTADOS

22

As amostras foram analisadas em citômetro de fluxo Beckman Coulter EPICS XL-MCL.

A aquisição dos dados e análise dos resultados foi realizada utilizando-se o software do

equipamento denominado EXPO 32. Foram coletados 50.000 eventos para a análise após

estímulação in vitro. A identificação das populações celulares de interesse, bem como a

determinação do valor percentual de populações celulares e das citocinas produzidas foi feita

através de um sistema de computador acoplado ao citômetro. A Figura 3 mostra de forma

esquemática a seqüência de procedimentos necessários para a análise dos dados do fenótipo

celular e perfil de citocinas após estimulação in vitro. O primeiro passo consiste na identificação

da população de leucócitos em estudo: os linfócitos (L). Na figura 3A temos um gráfico do tipo

pontual (“dot plot”) onde pode-se avaliar o tamenho celular (FSC) versus a granulosidade (SSC).

Após a seleção da região de interesse, a mesma é analisada utilizando-se a intensidade de

fluorescência apresentada pelas células presentes na região selecionada, em gráficos de

fluorescência 1 (FL1- fluorescência verde obtida pela marcação com isotiocianato de fluoresceína

– FITC) versus fluorescência 2 (fluorescência laranja obtida pela marcação com ficoeritrina –PE).

No exemplo apresentado na Figura 3B temos CD- FITC versus IL- PE.

Figura 3: Análise de leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. A Figura

1a representa um perfil celular de tamanho versus granulosidade, obtido após cultivo celular com

CD4-FITC

Ant

i IL-

10 P

E

B

4,33 %1,20%

Tamanho

Gra

nulo

sida

de

Linfócitos

A

Tamanho

Gra

nulo

sida

de

Linfócitos

A

CD3-‐FITC

23

o antígeno ML. A Figura 3b representa um perfil celular obtido em um gráfico de fluorescência

1 (CD3-FITC) versus fluorescência 2 (IL-10-PE).

24

IV RESULTADOS E DISCUSSAO

A apresentação dos resultados foi realizada em duas partes: a primeira parte se refere aos

dados obtidos na análise do perfil de citocinas intracelulares de leucócitos do sangue periférico

após cultura in vitro sem estímulo (meio de cultura), a segunda aos dados obtidos em condições

diferentes de estimulação (estimulação com mitógeno inespecífico – SEB, e antígeno específico –

Mycobacterium leprae), também in vitro dos leucócitos do sangue periférico. Os resultados são

expressos sob a forma de média do percentual de células positivas, simultaneamente tanto para o

marcador de superfície celular quanto para a citocina de interesse.

Avaliou-se a população linfócitos T CD3+, para se traçar um perfil geral de citocinas

presentes nos indivíduos participantes do estudo. Para estudar diferenças no padrão imunológico

entre os sujeitos selecionados, analisou-se inicialmente o perfil de células positivas para citocinas

intracelulares do tipo 1 (IFN-g) e do tipo 2 (IL-4 e IL-10) utilizando leucócitos em culturas-

controle (na presença do meio de cultura RPMI). A segunda avaliação foi da cultura de leucócitos

na presença dos antígenos já citados. Essa análise teve como objetivo estudar a resposta imune,

pela produção de citocinas pelos linfócitos T CD3+, dos indivíduos mediante a estimulações

específicas.



CONTATOS E SADIO APÓS CULTURA IN VITRO SEM ESTIMULAÇÃO.

Os resultados a seguir se referem ao perfil total de citocinas (quadrantes 1 e 2 do gráfico

de fluorescência 1 versus fluorescência 2: anticorpos marcados com FITC e PE respectivamente,

representado na figura 3b expresso por linfócitos T CD3+ dos pacientes participantes do estudo.

O principal objetivo foi verificar a porcentagem de linfócitos T CD3+ produtoras das

citocinas de IL4, IL10 e INF-γ. Essa análise torna-se importante no sentido de que permite a

visualização da produção basal das citocinas citadas.

25

Figura 4: Porcentagem de linfócitos T CD3+, produtores de IL4, em cultura controle (sem

estímulo), em pacientes multibacilares, paucilares, contatos intra e extradomiciliares e indivíduo

sadio.

Figura 5: Porcentagem de linfócitos T CD3+, procutores de IL10, em cultura controle

(sem estímulo), em pacientes multibacilares, paucilares, contatos intra e extradomiciliares e

indivíduo sadio.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

M1 M2 P1 P2 CM1 CM2 CP1 CP2 CE S CD3 -‐ IL4 0.33 0.32 0.15 0.16 0.11 0.3 0.12 0.15 0.24 0.1

% linfócitos T CD3+ IL4+

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

M1 M2 P1 P2 CM1 CM2 CP1 CP2 CE S CD3 -‐ IL10 0.29 0.37 0.1 0.19 0.13 0.21 0.11 0.12 0.21 0.09


26

Figura 6: Porcentagem de linfócitos T CD3+, procutores de IFN-gama, em cultura

controle (sem estímulo), em pacientes multibacilares, paucilares, contatos intra e

extradomiciliares e indivíduo sadio.

As figuras 4, 5 e 6, representam a porcentagem de linfócitos T CD3+, produtores de IL4,

IL10 e INF-gamma, respectivamente. Em relação á produção da citocina IL4, observa-se um

maior percentual de células T CD3+ nos pacientes M1 (0,33%), M2 (0,32%), CM2 (0,30%) e CE

(0,24%). O mesmo perfil é observado para a produção de IL10, onde os pacientes M1, M2, CM2

e CE, se destacam na porcetam de células T CD3+ produtoras. Por outro lado, a observação do

gráfico que representa a produção de INF-gamma, permite visualizar que os pacientes que

apresentam maior percentual de células produtoras são P2, P1 e CM1.



CONTATOS E SADIO APÓS CULTURA IN VITRO COM ESTÍMULO DE SEB.

O objetivo desta parte experimental do estudo foi verificar a porcentagem de linfócitos T

CD3+ produtoras das citocinas de IL4, IL10 e INF-γ, frente a um estímulo inespecífico. Utilizou-

se o SEB, que é um superantígeno do Staphilococcos aureus. Essa análise torna-se importante no

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

M1 M2 P1 P2 CM1 CM2 CP1 CP2 CE S CD3 -‐ IFN 0.21 0.22 0.35 0.64 0.3 0.16 0.21 0.19 0.15 0.11

% linfóticos T CD3+ IFN-‐gam

a+

27

sentido de que permite a verificação da positividade dos experimentos, uma vez que o SEB é um

mitógeno inespecífico, ocorre indução da liberação de citocinas de forma exacerbada,

funcionando assim como um controle positivo do experimento.

Figura 7: Porcentagem de linfócitos T CD3+, produtores de IL4, com estímulo de um

mitógeno inespecífico (SEB – superantígeno do Staphylococcos aureus, que funciona como

mitógeno inespecífico), em pacientes multibacilares, paucilares, contatos intra e extradomiciliares

e indivíduo sadio.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

M1 M2 P1 P2 CM1 CM2 CP1 CP2 CE S CD3+ IL4+ 1.04 0.7 0.2 0.27 0.15 0.64 0.17 0.19 0.56 0.12

% linfócitos T CD3+IL4+

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


% linfócitos CD3+IL10+

28

Figura 8: Porcentagem de linfócitos T CD3+, produtores de IL10, com estímulo de um

mitógeno inespecífico (SEB – superantígeno do Staphylococcos aureus, que funciona como

mitógeno inespecífico), em pacientes multibacilares, paucilares, contatos intra e extradomiciliares

e indivíduo sadio.

Figura 9: Porcentagem de linfócitos T CD3+, produtores de IFN-gamma, com

estímulo de um mitógeno inespecífico (SEB – superantígeno do Staphylococcos aureus, que

funciona como mitógeno inespecífico), em pacientes multibacilares, paucilares, contatos intra e


Os resultados permitem observar, que o estímulo com o PHA, permitiu um aumento na

porcentagem de células produtoras para todas as citocinas, quando comparado com a cultura sem

estímulo. Apesar disso, os pacientes M1 (1,04%), M2 (0,7%), CM2 (0,64%) e CE (0,56%),

continuam como os maiores produtores de IL4 (1,04%; 0,7%; 0,64%; 0,56%) e IL10 (0.75%;

0,9%; 0,4% e 0,47%). Os pacientes P2 (1,49%), P1 (0,92%) e CM1 (0.95%), continuam como

aqules com maior porcentagem de linfócitos T CD3+IFN-gama+.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

M1 M2 P1 P2 CM1 CM2 CP1 CP2 CE S CD3+IFN+ 0.41 0.52 0.92 1.49 0.95 0.45 0.81 0.34 0.62 0.32

% linfócitos T CD3+ INF-‐gm

a+

29




MYCOBACTERIUM LEPRAE.

Os próximos resultados, referem-se à porcentagem de citocinas produzidas por linfócitos

T CD3+, após estimulo específicos com antígeno bruto do Mycobacterium leprae. Esses

resultados cumprem a finalização de um dos principais objetivos do estudo, que é prever a

resposta imune dos indíduos, na presença do bacilo, o que permite avaliar o perfil de resistência

ou susceptibilidade o bactéria já citada.

Figura 10: Porcentagem de linfócitos T CD3+, produtores de IL4, com estímulo

especifico (Mycobacterium leprae), em pacientes multibacilares, paucilares, contatos intra e


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1



30

Figura11: Porcentagem de linfócitos T CD3+, produtores de IL10, com estímulo

de um antígeno específico (Mycobacterium leprae), em pacientes multibacilares, paucilares,

contatos intra e extradomiciliares e indivíduo sadio.

Figura 12: Porcentagem de linfócitos T CD3+, produtores de IL4, com estímulo

especifico (Mycobacterium leprae), em pacientes multibacilares, paucilares, contatos intra e


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


% linfócitos T CD3+IL10+

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

M1 M2 P1 P2 CM1 CM2 CP1 CP2 CE S CD3+IFN+ 0.21 0.27 1.02 1.32 1.1 0.34 0.92 0.28 0.78 0.24

% linfócitos T CD3+ IFN+

31

Estudos utilizando sangue periférico, tem também demonstrado um perfil de citonas

específico para pacientes com hanseníase. Mutis et al.(32), estudando o padrão de citocinas

produzidas pelos linfócitos T do sangue periférico em hansenianos, encontraram linfócitos com

atividades semelhantes aos Th1 (helper 1) e Th2 (helper 2). Segundo os autores, na forma

Tuberculóide (paucibacilar) os bacilos estimulariam os linfócitos Th1 a produzirem altos níveis

de IFN-y, responsáveis pela manutenção da resposta imune celular. Já na forma Virchowiana

(multibacilar), a estimulação dos linfócitos Th2 levaria e produção das citocinas IL-4, IL-5, IL-6

e IL-10. A IL-4 e IL-10 são supressoras da atividade macrofágica, e a 1L-4, paralelamente,

estimula linfócitos B a produzirem anticorpos. Assim, o aumento dessas citocinas possibilitaria a

persistência e replicação do M. leprae no interior do fagócito.

Pelos resultados apresentados acima, o estudo realizado segue o mesmo padrão de resposta.

Nota-se que 3 dos 10 individuos apresentaram produção de IL4 e IL10 de forma mais

pronunciada. Os pacientes multibacilares e um dos contatos de paciente multibacilar (CM2),

mostraram alta porcentagem de linfócitos T CD3+IL4+ e IL10+. Segundo GOULARD et al,

2002, células T que produzem IL-4, IL-5 e IL-10, chamadas Th2, aumentam a resposta humoral,

IL-4 estimula a produção de IgE e ambas, IL-4 e IL-10 estimulam células B e inibem ativação de

macrófago resultando em infecção progressiva.

Interressantemente o individuo contato extradomiciliar (CE), manteve produção alta de IL4

e IL10 pela cultura sem estímulo e com SEB, mas quando os leucocitos do sangue perifico desse

paciente foram colocados em contato com o antigeno do Mycobacterium leprae, houve uma

modulação da resposta, e a porcentagem de células T CD3+IFN+ aumentou, diminuindo a

porcentagem de células T CD3+IL4+IL10+.

Quanto a produção de IFN, pacientes P2, P1, CM1 e CP1, mantiveram alta porcentagem de

células produtoras em todos os experimentos. Segundo Goulard et al, 2002. Células T que

produzem interleucina 2 (IL-2) e interferon γ (IFN-γ), chamadas Th1,aumentam a imunidade

mediada por células7. IFN-γ ativa macrófago e IL-2 estimula o crescimento de células T

antígeno-específicas, resultando em doença mais branda ou cura.

Num estudo realizado por SARNO et al., 2002, foi feito mensuração de INF-γ no

sobrenadante de cultura de leucócitos de num grupo de contatos intradociliares de pacientes com

hanseníase, com estímulo de M.leprae, esse grupo foi acompanhado durante dois anos, e parte

dos contatos que não respondiam ao antigeno com produção dessa citocina durante os dois anos,

32

ao final desse period desenvolveu hanseníase. Diferentemente de outra parte dos contatos que

desde o inicio do estudo, vinha apresentando alta produção de INF-γ, nesses, em grande parte,

não houve relato de desenvolvimento da doença, e, nos que houve, ela se desenvolveu de maneira

mais branda, com excelente prognóstico.

33

V CONCLUSAO

Diante do exposto, e com relação a outros estudos, conclui-se que a participação das

citocinas esta diretamente envolvida no curso da infecção pelo Mycobacterium leprae. Já esta

muito bem evidenciado na literatura que o desenvolvimento da doença nas formas mais graves,

relacionadas a grande proliferação bacilar, se dá pela ativação de linfícitos Th2, pela

predisposição na produção de IL4, IL10, dentre outras citocinas. O INF-γ, aparece nesse contexto

como fator de proteção ao bacilo, se sentido de que leva a uma ativação de imunidade celular,

capaz de destrui-lo.

Assim, torna-se relevante o uso de tecnicas para mensuração de citocinas, com o objetivo

de prever questões relacionadas a resistência ou susceptibilidade ao Mycobacterium leprae, em

individuos constatemente exposto ao bacilo, chamados de contatos intra ou extradomiciliares.

A tecnica de mensuração de citocinas intracitoplasmáticas, com usa da citomentria de

fluxo, contribui em muito, no entendimento desse processo imunitário, uma vez que responde a

pergunta de qual o tipo celular é capaz de produzir determinada citocina.

São nccessários novos prolongados, que permitem um acompanhamente continuo desses

pacientes, para verificar o desenvolvimento ou não da enfermidade, mas desde já, baseando-se

em dados da literature, pode-se pressupor que os individuos desses estudo, que apresentaram alta

porcentagem de células produtoras de INF-γ, apresentam capacidade em responder ao bacilo com

resposta imune celular (hipersesibilidade do tipo IV), e portando resistencia no densenvolvimento

da doença, e o contrario também é verdadeiro, individuos que responderam ao bacilo com

produção de IL4 e IL10, apresentam susceptibilidade e maior predisposição no denvolvimento de

hanseníase.

34

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