universidade tuiuti do paranÁ medicina...
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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ
MEDICINA VETERINÁRIA
BRUNA ANDRADE SILVA
USO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NO
TRATAMENTO DE HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA
PELO EXERCÍCIO GRAU V EM EQUINO – RELATO DE
CASO.
CURITIBA – PR
2016
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BRUNA ANDRADE SILVA
USO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NO
TRATAMENTO DE HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA
PELO EXERCÍCIO GRAU V EM EQUINO – RELATO DE
CASO.
Trabalho de conc lusão de curso apresentado ao curso de Medic ina Veter inár ia da Univers idade Tuiut i do Paraná, como requis ito parcia l para obtenção
Or ientadora Acadêmica: Prof . Dra. Silvana Maris Cirio.
Orientadora Profissional: Dra. Michele Andrade de Barros.
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CURITIBA - PR
2016
UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ
REITOR
Prof. Luiz Guilherme Rangel Santos
PRÓ-REITOR ADMINISTRATIVO
Carlos Eduardo Rangel Santos
PRÓ-REITORA ACADÊMICA
Prof. Dra. Carmen Luiza da Silva
DIRETOR DE GRADUAÇÃO
Prof. Dr. João Henrique Faryniuk
COORDENADOR DO CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
Prof. Dr. Welington Hartmann
COORDENADOR DE ESTÁGIO CURRICULAR
Prof. Dr. Welington Hartmann
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TERMO DE APROVAÇÃO
BRUNA ANDRADE SILVA
USO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NO
TRATAMENTO DE HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA
PELO EXERCÍCIO GRAU V EM EQUINO – RELATO DE
CASO.
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado e aprovado para obtenção do título de Médica Veterinária pela Comissão Examinadora do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná.
Curitiba, 06 de junho de 2016
__________________________________________________________
Prof. Orientadora Silvana M. Cirio
UTP – Universidade Tuiuti do Paraná
__________________________________________________________
Dra. Michelle de Barros Andrade
Regenera Medicina Veterinária Avançada
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Dedico este trabalho de conclusão de curso
Primeiramente, a Deus que sempre esteve ao
meu lado, não me deixando cair em momentos
em que não fui forte o suficiente. A minha mãe
e meu padrasto, que tornaram possível a
realização de todos os meus sonhos e
sonharam comigo, fortalecendo sempre desejo
de me tornar uma profissional melhor a cada
dia. Aos meus tios e primos, por toda a
amizade, companheirismo e votos de cofiança
dados à minha sabedoria. E aos grandes
mestres envolvidos em minha graduação, os
quais sempre lecionaram com total sabedoria e
deram suporte em momentos de indecisões.
6
AGRADECIMENTOS
Foi uma longa jornada para conquistar o título de médica veterinária. Em
primeiro lugar, o meu agradecimentos é à Deus, que nunca me deixou caminhar
sozinha, e por muitas vezes me carregou no colo quando falhei.
Muito obrigada a minha mãe, meu maior tesouro! Muito obrigada por ter me
ensinado a nunca desistir dos meus objetivos, e ter lutado comigo! Seu amor com os
animais é o maior ensinamento que eu tenho na vida, dar amor a quem não tem
como retribuir, dar amor sem receber algo em troca. Ao meu padrasto, que assumiu
o papel de pai em minha vida, sempre e estimulando a aprender coisas novas, exigir
mais de mim mesma! Muito obrigada por sonhar este sonho comigo, muito obrigada
pelo incentivo e investimento em minha carreira.
Aos meus tios Juscelino e Marlene, que desde pequena sempre estiveram
muito próximos a mim, me aconselhando e me incentivando a sempre buscar o “algo
a mais” em minha vida. Ao meu primo Arnon, meu irmão de consideração, nós
prometemos desde crianças que nossos objetivos seriam alcançados, e que
chegaríamos ao topo juntos! Um sendo o orgulho do outro!
A minha orientadora Silvana Maris Cirio, por todo tempo dedicado a mim, por
toda paciência para me explicar ou questionar alguma questão. Sempre foi um
exemplo para mim como profissional. Ao professor Wellington Hartmann por ter nos
acolhido na Tuiuti e por se tornar um amigo para mim. A professora Jessea de
Fátima França e a professora Ana Laura D’Amico pelo tempo dedicado a este
trabalho de conclusão de curso, muito obrigada por toda atenção e auxílio em minha
vida acadêmica.
Agradeço imensamente a equipe da Regenera Medicina Veterinária
Avançada pela oportunidade de aprendizado e ensinamentos passados a mim.
Especialmente a Dra. Michele, Dr. Joffre, a Bruna, Paula e Alana, muito obrigada por
toda atenção e tempo gasto comigo!
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RESUMO
A HPIE é caracterizada pelo sangramento pulmonar após a realização de exercícios,
ocorrendo com frequência em equinos atletas. A causa da doença é multifatorial,
porém acredita-se que o aumento da pressão vascular ocasione falência dos
capilares, gerando epistaxe. Não há tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar
induzida pelo exercício, porém o tratamento com a terapia de células tronco
mesenquimais (CTM) vem se mostrando promissora, por realizar reparação tecidual,
redução de inflamação e por não apresentar efeitos adversos. Foram
correlacionadas revisões bibliográficas abrangendo a HPIE, e foi feito o
acompanhamento de um paciente, que fez o uso de duas terapias com células
tronco mesenquimais para tal doença. O quadro clínico do animal teve regressão de
grau cinco para grau zero, mostrando a terapia com CTM promissora para doenças
respiratórias em equinos.
Palavras-chave: doenças respiratórias. epistaxe. falência vascular.
8
ABSTRACT
The EIPH is characterized by pulmonary bleeding after performing exercises,
occurring frequently in equine athletes. The cause of the disease is multifactorial, but
it is believed that the increased vascular pressure entailing failure of capillaries,
generating epistaxis. There is no effective treatment for exercise-induced pulmonary
hemorrhage, but treatment with the mesenchymal stem cell therapy (CTM) is proving
promising for performing tissue repair, reducing inflammation and not have adverse
effects. literature reviews were correlated covering EIPH, and was made the
monitoring of a patient, which made the use of two therapies with mesenchymal stem
cells for this disease. The clinical picture of the animal had five degree of regression
to zero level, showing promising therapy CTM for respiratory diseases in horses.
Key-words: epistaxis. respiratory diseases. vascular failure.
9
ABREVIATURAS
% - Porcentagem
CTA – Células Tronco Adultas
CTM – Células Tronco Mesenquimais
CTS – Células Tronco Somáticas
EIPH – do inglês “Exercise-induced pulmonary hemorrhage”
HPIE - Hemorragia Pulmonar Induzida por Exercício
LBA – Lavado Broncoalveolar
LT – Lavado Traqueal
mmHg - Milímetros de mercúrio
MSC – do inglês “Mesenchymal Stem Cell”
ORVA – Obstrução Recorrente das Vias Aéreas
PSI – Puro Sangue Inglês
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NA CRIOPRESERVAÇÃO DE
CÉLULAS TRONCO (REGENERA®, CAMPINAS-SP, 2016) ...................................18
FIGURA 2 – EQUIPAMENTOS UTILIZADOS PARA INCUBAÇÃO E CULTIVO
CELULAR (REGENERA®, CAMPINAS-SP, 2016) ....................................................19
FIGURA 3 – SISTEMA DE INTERTRAVAMENTO (REGENERA®, CAMPINAS-SP,
2016) .........................................................................................................................20
FIGURA 4 – BOTIJÃO DE NITROGÊNIO .................................................................35
FIGURA 5 – CRIOTUBOS UTILIZADOS NA TERAPIA CELULAR ..........................36
FIGURA 6 – TUBOS CONTENDO TERAPIA CELULAR ..........................................37
11
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 – PRINCIPAIS TEORIAS PARA A PLASTICIDADE DAS CÉLULAS
TRONCO MESENQUIMAIS ......................................................................................26
QUADRO 2 - CRITÉRIO DA VARIAÇÃO DE CLASSIFICAÇÃO DA HEMORRAGIA
PULMONAR INDUZIDA POR EXERCÍCIO ...............................................................30
12
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 13
2. OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 15
3. DESCRIÇÃO DA UNIDADE CONCEDENTE DE ESTÁGIO .............................. 16
4. DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS........................................ 21
5. CASUÍSTICA ...................................................................................................... 22
6. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 23
6.1 CÉLULAS TRONCO ........................................................................................... 23
6.1.1 Obtenção .......................................................................................................... 24
6.1.2 Ação ................................................................................................................. 25
6.1.3 Aplicação .......................................................................................................... 27
6.2 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCÍCIO ................ 28
6.2.1 Fisiopatologia ................................................................................................... 28
6.2.2 Diagnóstico ....................................................................................................... 29
6.2.3 Ocorrência ........................................................................................................ 29
6.2.4 Classificação .................................................................................................... 30
6.2.5 Tratamento ....................................................................................................... 31
7. DESCRIÇÃO DO CASO CLÍNICO ..................................................................... 33
8 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 38
9 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 39
10 REFERÊNCIAS ............................................................................................... 40
13
1. INTRODUÇÃO
A hemorragia pulmonar induzida por exercício (HPIE) é caracterizada pelo
sangramento pulmonar após a realização de exercícios de intensidade. Esse
processo patológico ocorre com alta frequência em equinos atletas, com realizações
de diversas modalidades esportivas, não tendo predisposição exata para raça.
Segundo Raphael e Soma, 1982; Pascoe et al., 1981, 40 a 90% dos cavalos de
corrida apresentam esta doença.
Esse fator pode ocorrer por diversos motivos, entretanto a teoria de que o
aumento da pressão da vasculatura pulmonar gere falência por estresse dos
capilares, ocasionando casos de epistaxe, é atualmente a mais aceita.
O diagnóstico é feito rotineiramente com o auxílio de endoscópio, contudo o
exame confirmatório com lavado bronquioalveolar não deve ser descartado. A
classificação da HPIE é feita no momento do diagnóstico, em graus variando de zero
a cinco, é levado em conta a ausência de sangue visível, epistaxe e a presença de
sangue na traqueia e carina.
Não há tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar induzida por exercício,
porém a redução da severidade da hemorragia e suas sequelas são essenciais para
que o animal tenha uma melhor sobrevida.
Apesar de haver poucos estudos sobre o uso das células tronco no tratamento
de doenças que acometem o sistema respiratório dos equinos, seu mecanismo de
ação as submete como um promissor tratamento para essas afecções. Essa terapia
torna-se então, uma alternativa viável para a diminuição da ocorrência de
sangramentos induzidos por exercícios, bem como o agravamento que essa
situação pode trazer de maneira crônica.
Recentemente foi mostrado que as células tronco mesenquimais realizam a
reparação tecidual através de fatores parácrinos, pois estes favorecem o
crescimento e desenvolvimento celular, além de intervir na inflamação de tecidos
lesionados.
14
Em contra partida, ainda não se sabem os reais mecanismos de ação e efeitos
biológicos e cada fase dessa reparação ou até mesmo da cicatrização.
O tecido adiposo é a principal e mais disponível fonte de células tronco
mesenquimais (CTM), contendo o maior numero de células viáveis e com altas taxas
de migração, proliferação e diferenciação.
Não há relatos científicos do uso de células tronco mesenquimais no tratamento
de sangramento pulmonar induzido por exercício, por isso ainda não se sabem
exatamente os reais mecanismos de ação e efeitos biológicos em cada fase dessa
reparação ou cicatrização, o que torna necessária a realização de novas pesquisas
e publicações para estudos. Contudo, vale ressaltar que já é sabido que não há
efeitos adversos com o uso destas terapias (ZUK., 2010), o que as torna um método
promissor.
15
2. OBJETIVO GERAL
Acompanhar a utilização da terapia com células tronco mesenquimais derivadas
de tecido adiposo em um equino de 15 anos acometido por sangramento pulmonar
pós-exercício grau V, bem como avaliar os resultados e discutir possíveis
desdobramentos do tratamento.
16
3. DESCRIÇÃO DA UNIDADE CONCEDENTE DE ESTÁGIO
A Regenera® é uma empresa de biotecnologia que atua na área de medicina
veterinária regenerativa, trabalhando com pesquisas e desenvolvimento de
protocolos terapêuticos envolvendo células tronco mesenquimais para cães, gatos e
cavalos. A empresa tem a patente requerida no Brasil e em processo nos EUA e
Canadá de seus processos biotecnológicos e terapêuticos envolvendo diferentes
linhagens celulares estabelecidas a partir de tecido adiposo, polpa dentária e cordão
umbilical.
A estrutura física da Regenera® pode ser desmembrada em área administrativa
e área laboratorial. O primeiro setor citado, conta com uma sala destinada aos
profissionais que cuidam da administração da empresa e uma sala de reuniões.
O setor laboratorial é separado por de sistema de portas intertravadas e possui
monitoramento de temperatura e qualidade do ar, além de contar com gerador de
energia independente, seguindo todas as normas e quesitos preconizados pelo
CRMV-SP e alcançando nível de certificação requerido pelo MAPA (Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento).
A antessala é o primeiro ambiente ao entrar na área laboratorial, ela é destinada
exclusivamente para procedimentos de lavagem das mãos e paramentação. Em
seguida há um ambiente específico para controle de qualidade celular e outro
designado para cultivo e expansão das células, ambos possuem classificação ISO 7.
Estas salas são equipadas com: microscópio invertido, refrigeradores, duas
incubadoras com temperatura e concentração de CO2 controlados, duas
centrífugas, um fluxo de ar unidirecional vertical e outro horizontal, como mostra a
figura 2, e são integradas através do pass thru, onde é realizada a passagem de
material de uma para outra, como mostra a figura 3.
A criopreservação das células tronco é realizada em outro ambiente individual,
com climatização constante de 17ºC. O ultrafreezer utilizado para esta função
alcança uma temperatura média de -80ºC, como mostra a figura 1.
A empresa ainda conta com uma sala designada à esterilização de vidrarias e
materiais cirúrgicos. Nela está localizada a autoclave, estufa de secagem e estufa
17
bacteriológica, onde são realizados procedimentos periódicos para maior controle de
patógenos.
Para adquirir a terapia com células tronco mesenquimais, o médico veterinário
deve realizar um curso de capacitação e credenciamento disponibilizado pela própria
empresa. Posteriormente deve ser feito o contato entre o requerente da terapia e os
profissionais da Regenera®, com os dados do paciente a ser atendido (raça, idade,
peso, doença a ser tratada, e se houver, o grau de acometimento em que a mesma
se encontra). Em seguida é calculada a quantidade total de células necessárias e a
quantidade de vezes que a terapia deve ser aplicada em tal período de tempo. O
horário de atendimento da Regenera® é de segunda à sexta feira, das 08h00 às
18h00.
18
Figura 1 – Equipamentos utilizados na criopreservação de células tronco (Regenera®, Campinas-SP, 2016) (A) Ultrafreezer com marcador de temperatura (B) Gaveteiro do ultrafreezer, mostrando a disposição dos criotubos.
19
Figura 2– Equipamentos utilizados para incubação e cultivo celular (Regenera®, Campinas-SP, 2016) (A) Fluxo de ar unidirecional vertical (B) Microscópio invertido (C) Incubadora com marcador de temperatura e concentração de CO2.
20
Figura 3– Sistema de intertravamentos (Regenera®, Campinas-SP, 2016). (A) Pass Thru diferenciando a passagem de material limpo e contaminado (B) Pass Thru interligando sala de controle de qualidade e área de cultivo e expansão celular (C) Sistema de portas intertravadas.
21
4. DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
O estágio obrigatório foi realizado no período de 15 de fevereiro de 2016 a 23 de
maio 2016 (das 09h00 as 12h00 e das 14h00 as 17h00), na Regenera Medicina
Veterinária Avançada®, situada na Rua Baguaçu, 26, no município de Campinas,
estado de São Paulo. Sob a responsabilidade da médica veterinária Michele
Andrade de Barros e da biomédica Bruna Pereira de Morais. O estágio abrangeu a
rotina de preparação, cultivo e congelamento de células tronco de origem
mesenquimal, totalizando a carga horária de 400h.
O enfoque principal deste estágio foi na área laboratorial e no acompanhamento
de um caso clínico atendido por um médico veterinário credenciado.
A parte laboratorial envolveu o acompanhamento da preparação, cultivo e
congelamento de células tronco mesenquimais. Os estagiários eram responsáveis
pelo procedimento de lavagem e esterilização de vidrarias e materiais cirúrgicos,
preparo e montagem de kits de terapias celulares, organização laboratorial, controle
de estoque, preparo de soluções requisitadas e posteriormente, limpeza de
equipamentos.
No acompanhamento do caso do equino com sangramento pulmonar pós-
exercício grau V, a função era de auxílio na preparação da terapia celular, lavagem
do endoscópio, antes e depois de ser utilizado no animal em tratamento, e sua
contenção.
22
5. CASUÍSTICA
O estágio obrigatório foi realizado na Regenera Medicina Veterinária Avançada,
uma empresa laboratorial que tem como foco a pesquisa abrangendo o cultivo,
expansão, congelamento e aplicação de terapias com células tronco mesenquimais.
A empresa possui médicos veterinários credenciados que realizam as aplicações
destas terapias celulares, contudo apenas um caso clínico de estudo e equino foi
acompanhado.
23
6. REVISÃO DE LITERATURA
6.1 CÉLULAS TRONCO
As células tronco (CT) possuem duas características que as diferem das
demais células do organismo: a capacidade de realizar a autorrenovação, pelo
processo de divisão e formação de uma nova célula, e a diferenciação em novas
células maduras em um órgão no qual elas se encontram (AL-HAJJ e CLARKE
2004). O processo de divisão das células tronco pode ser realizado de duas
maneiras distintas: na chamada divisão simétrica, a célula tronco nomeada como
“mãe”, dá origem à duas células idênticas a ela. Já na divisão assimétrica a célula
tronco originará uma célula tronco idêntica à célula “mãe” (autorrenovação) e outra
célula especializada (WEBSTER et al., 2012). Outro fator interessantemente
relevável, é que essas células não apresentam uma função específica até que a
mesma seja “notificada” pelo ambiente em que se encontra, se diferenciando então,
em uma célula especializada (VALENTINI et al., 2010).
Dada a facilidade das células tronco se dividirem e se proliferarem, elas se
tornam as responsáveis pela manutenção e renovação dos tecidos adultos. Além do
mais, são consideradas como um potencial tratamento para as mais variadas
doenças rotineiras na clínica equídea, por sua capacidade de diferenciação celular e
integração em tecidos lesionados (DESANDO et al., 2013). Devido a sua capacidade
de secretar fatores de crescimento (VOSWINKEL et al., 2013), destaca-se então,
algumas habilidades das CT, dentre elas: a capacidade de regulação de
inflamações, a promoção da regeneração de tecidos e a prevenção da formação de
novas lesões (BORJESSON e PERONI., 2011).
As CT, de acordo com sua origem, podem ser classificadas em dois grupos
distintos: as células tronco embrionárias (CTE), que são células pluripotentes, ou
seja, possuem a capacidade de darem origem à células das três camadas
germinativas (endoderme, ectoderme e mesoderme) e as células tronco somáticas
ou também denominadas células tronco adultas (CTA), encontradas em diversos
tecidos e responsáveis basicamente pela homeostase dos tecidos (GAZIT et al.,
2011).
24
Tanto as CTE quanto as CTA são usadas como terapias celulares, contudo a
grande vantagem das células tronco adultas é sua obtenção, pois as CTE são
obtidas a partir da massa celular interna do blastocisto, e, portanto, envolvem
questões éticas, legais e religiosas em torno da sua utilização.
6.1.1 Obtenção
As CTA podem ser obtidas de várias fontes e possuem a capacidade de
originar diversos tipos celulares, sendo classificadas então como células
multipotentes. As células tronco mesenquimais (CTM) são células tronco adultas,
que podem ser progenitoras da mesoderme como osso, cartilagem e gordura
(MINGRONI-NETTO e DESSEN, 2006).
As fontes mais comuns de células tronco mesenquimais são o tecido adiposo
e a medula óssea. Estas são rotineiramente utilizadas em terapias envolvendo a
regeneração de diversos tecidos. Além do mais, são facilmente obtidas para
isolamento e cultivo na espécie equina (MAIA et al. 2013).
Com menor frequência, as CTM também podem ser obtidas a partir de outros
órgãos do organismo, dentre eles se destacam: membrana sinovial, músculos,
derme, dente decíduo, cordão umbilical e respectivas veias (ZUCCONI et al., 2010),
bem como placenta, fígado, baço e timo (MEIRELLES et al., 2006; CAPLAN, 2007).
Amostras do liquido amniótico dos equinos, colhidas durante o parto, também
são relatas para obtenção de células, entretanto a identificação destas foi descrita
apenas por Lovati et al. (2010), Park et al. (2011) e Lacono et al. (2012).
O método de isolamento das mesmas não segue devidamente um padrão,
podendo ser utilizados diferentes reagentes e/ou quantidades dos mesmos. Renzi et
al. (2012) ressalta a importância do aperfeiçoamento em procedimentos
laboratoriais, não apenas para sua produção, mas sim para que a mesma seja
mantida integralmente como quando foi retirada de um organismo vivo. A
criopreservação das células deve se manter em temperaturas inferiores a 80°C
negativos e, muitas vezes, abaixo de 140°C negativos, contudo pouco se sabe sobre
os efeitos dessa alteração de temperatura sobre a viabilidade da célula e questão.
Em uma análise das diversas fontes de CTM, Burk (2012) e Hong (2006),
descreveram que o tecido adiposo apresenta um maior número de células viáveis
25
com elevadas taxas de migração, e com melhor potencial de proliferação e
diferenciação, tornando-a assim uma conveniente fonte de células progenitoras.
Além disso, a obtenção de CTM se torna ainda mais favorável pela disponibilidade
em que esse tecido se encontra no corpo do animal, fator vantajoso para
isolamentos celulares para preparações de terapias (ZUK., 2010).
O tecido adiposo pode ser facilmente obtido em cavalos a partir de uma
pequena incisão cirúrgica na base da cauda, sem apresentar grandes danos ao
animal (VIDAL et al., 2007; MAMBELLI et al., 2009). Adicionalmente, Lubis e Lubis
(2012) ressaltam que independentemente de onde as CT sejam extraídas, as
mesmas são evidenciadas pela desenvoltura que induzem à diferenciação em
diversas linhagens de tecidos.
Barussi et al., 2015 preconizaram, em experimentos realizados, a utilização
de células mononucleares autólogas, administrado via intratraqueal, na melhora do
quadro inflamatório da obstrução recorrente das vias aéreas (ORVA) de forma
semelhante a dexametasona. Adicionalmente, Zuk (2010) enfatiza que não há
efeitos contrários ao uso dessa terapia, fator importante para se acreditar que é uma
questão de tempo para que novas publicações e estudos nesta área sejam
realizados.
6.1.2 Ação
Um estudo realizado por Yamada et al., (2013), descreveu várias
competências positivas à respeito das CT, como sua capacidade de expansão,
efeito quimiotáxico e a possibilidade de realizarem imunomodulação local.
Reposição celular e potencial de diferenciação sempre foram os pontos mais
ressaltados sobre a importância das CTM, porém suas ações autócrinas e
parácrinas hoje também são amplamente descritas (DESANDO et al., 2013).
Na ação autócrina, as células tronco residentes daquele tecido recebem
estímulos através da liberação de interleucinas pelas células de defesa e se tornam
capazes de substituir células antigas e as repor com células novas, fazendo deste
modo, a reparação tecidual. Esse processo é promovido pela capacidade de
autorrenovação e plasticidade das CTM (CAPLAN, 1991; CAPLAN e DENNIS 2006).
O quadro 1 a seguir descreve as principais teorias para a plasticidade das CTM:
26
Quadro 1 - Principais teorias para a plasticidade das células tronco mesenquimais.
TEORIA AÇÃO EXPLICAÇÃO
DIFERENCIAÇÃO
CT indiferenciadas, sob
determinado estímulo,
originam células
especializadas e funcionais
(TAKAHASHI et al., 2006).
Através de estímulos
bioquímicos, mediante
secreção de fatores de
crescimento produzidos pelas
células intrínsecas do
organismo ou in vitro por
suplementações e
condicionamentos específicos
as células indiferenciadas
adquirem função de algum
tecido específico (TAKAHASHI
et al., 2006).
TRANSDIFERENCIAÇÃO
Capacidade das CTM de se
diferenciarem em tipos
celulares diferentes do tecido
embrionário que as originaram
(RYU et al., 2009).
Ocorre espontaneamente em
resposta a algum tipo de lesão.
Isso se deve a habilidade que
uma CT oriunda de uma
linhagem embrionária tem de
se alterar para a formação de
outra (HERZOG et al., 2003).
FUSÃO
Capacidade da CTM em se
fundir a uma célula alvo,
assumindo a expressão gênica
desta célula (ACQUISTAPACE
et al., 2011)
A fusão celular é um fenômeno
biológico que ocorre
principalmente em células com
dois ou mais conjuntos de
cromossomos (DA SILVA
MEIRELLES et al., 2006).
27
Lai et al, (2011) relataram que as CT produzem e secretam fatores parácrinos
e moléculas bioativas, as quais estimulam o crescimento e o desenvolvimento das
células locais. Isso confere às CTM a capacidade de influenciar e incitar a ação de
outras CT e outros tecidos celulares (KAMIHATA et al., 2001). Através desta ação,
as CTM do organismo respondem às células inflamatórias nas fases iniciais da
regeneração tecidual, conferindo suporte fisiológico para o restante do processo de
resposta imune (CAPLAN e DENNIS, 2006; TAKAHASHI et al., 2006).
6.1.3 Aplicação
A terapia celular pode ser feita com células tronco autólogas, ou com células
tronco alogênicas.
No uso das células tronco alogênicas, as células são obtidas de um individuo
para aplicação em outro. Gala et al (2013) e Freitas (2012) avaliaram o uso destas
células, as transplantando em pacientes saudáveis e não obtiveram alterações
sugestivas de quadro inflamatório, garantindo uma boa vantagem para seu uso.
Na aplicação com células autólogas, se utilizam células do próprio indivíduo
que receberá a terapia. Ambas as células alogênicas e autólogas não resultam em
nenhum efeito prejudicial durante a implantação, como o aparecimento de tumores
locais (RICHARDSON et al., 2007). Contudo, o uso das células autólogas é mais
favorável para lesões crônicas, pois a expansão das CTM pela cultura, demora de
10 a 21 dias (CARRADE et al., 2011a).
Anderson e Bluestone (2005); Seo et al., (2006) e Frassoni et al., (2008)
descreveram o uso da terapia com células tronco mesenquimais em pacientes
portadores de doenças auto-imunes e notaram que estas células proporcionam
imunossupressão local e incitam os mecanismos de regeneração através da ação
parácrina, através de moléculas antiinflamatórias, imunorreguladoras e fatores de
crescimento angiogênicos.
É inevitável a ampliação de conhecimentos na correlação do uso das células
tronco mesenquimais com as mais relevantes afecções que acometem os equinos,
como a HPIE, por exemplo.
A terapia com células tronco, seja ela efetivamente para doença ou suas
sequelas, vêm se mostrando favorável para doenças em equinos. Porém, esse
28
tratamento ainda necessita de pesquisas mais abrangentes sobre as propriedades e
características destas células (PIGOTT et al., 2013).
Conclui-se então que o aprofundamento do estudo geral abrangendo as
células tronco mesenquimais obtidas a partir de tecido adiposo é necessário e
promissor, bem como sua aplicação em doenças pouco estudadas na clinica de
equinos, fator que abriria um novo leque de opções para afecções que não possuem
um tratamento único e efetivo, principalmente pelo fato de não apresentarem efeitos
adversos.
6.2 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCÍCIO
A respiração de equídeos é obrigatoriamente nasal. Indiferentemente se o
animal se encontra em alguma ação que demande de muitas trocas respiratórias,
este não consegue de forma alguma executar respiração oral (FRANKLIN , 2008;
ROBINSON, 2012a).
A hemorragia pulmonar induzida por exercício é descrita principalmente pelo
sangramento, como o próprio nome diz, de origem pulmonar. Este é evidenciado
após esforços realizados em atividades físicas intensas (BIAVA et al., 2011).
A principal característica desta doença é a presença de sangue na árvore
traqueobrônquica, podendo ocorrer em maior quantidade, chegando às cavidades
nasais e ocasionando epistaxe (TAKAHASI et al., 2001; DOUCET e VIEL, 2002a).
6.2.1 Fisiopatologia
Não existe uma causa principal para o acontecimento da HPIE, contudo
acredita-se na morte capilar, gerada pelo aumento da pressão da vasculatura pós-
exercício. A pressão da artéria pulmonar de equinos varia de 28 mmHg em
situações de descanso, 84 mmHg em galope rápido e ultrapassa os 120 mmHg em
situações de intensidade de exercício (ART et al., 2001; ERICKSON e POOLE,
2007). Contudo, não se é sabida a pressão arterial necessária para causar ruptura
destes capilares pulmonares por hipertensão (BIRKS et al., 1997; MOORE, 1996).
O deslocamento dorsal do palato é outra questão de predisponência para a
HPIE, por interromper o fluxo de ar das vias aéreas (COOK, 2002). Pascoe (2000)
29
também relatou a influência que as enfermidades alérgicas têm principalmente a
Obstrução Recorrente das Vias Aéreas (ORVA) na ocorrência desta doença.
A principal teoria aceita da ocorrência de HPIE em equinos é a falência dos
capilares pulmonares por estresse (BIRKS et al., 2003; SCHROTER et al., 1998).
A ação de agentes vasoconstritores no momento da realização de exercícios
está diretamente ligada ao aumento da pressão da vasculatura pulmonar. A principal
consequência do estresse dos capilares pulmonares é a sua falência, resultando no
extravasamento sanguíneo para o espaço alveolar, gerando resposta inflamatória,
podendo deixar sequelas crônicas ou até mesmo levar o animal ao óbito (BIAVA et
al., 2011).
6.2.2 Diagnóstico
O exame com o auxílio do endoscópio é o principal método de diagnóstico
para a HPIE (COSTA, 2004; NEWTON, et al., 2005). Com ele é possível visualizar
da presença de sangue ou de qualquer outro tipo de secreção, desde as narinas até
a traqueia e carina. A realização deste procedimento deve ser feito prioritariamente
de 30 a 120 minutos após a execução de atividade intensa, pois este é o tempo ideal
para o conteúdo sanguíneo ser eliminado das vias aéreas distais (BIAVA et al.,
2011).
6.2.3 Ocorrência
A hemorragia pulmonar induzida por exercício acontece rotineiramente na
clínica médica de equinos atletas, sem predisposição exata para raças. Tal doença
já foi discorrida em diversas intensidades de provas realizadas por cavalos
(PASCOE, 1996; BIRKS et al., 2003).
Os estudos realizados por Pascoe et al. (1981) e Raphael & Soma (1982),
revelaram que cerca de 40 a 90% dos cavalos de corrida (Puro Sangue Inglês)
foram confirmatórios para a HPIE. Biava et al. (2007) mostraram a incidência dessa
doença em duas provas realizadas por equinos da raça Quarto de Milha: cerca de
40% dos animais participantes de competições de seis balizas e uma média de 75%
foi demonstrada aos cavalos que praticam provas de três tambores. Moran et al.
(2003), demonstraram que cerca de 46% dos equinos praticantes de pólo no Chile
apresentam quadro de hemorragia pulmonar induzida por exercício. No Brasil são
30
poucos os estudos científicos sobre o episódio desta doença em equinos atletas
(COSTA, 2004), contudo é ressaltado que se existe uma relação com a idade do
equino atleta, diminuindo então a incidência dessa doença em animais jovens
(ROBINSON, 1987; BIRKS et al., 2003).
6.2.4 Classificação
A classificação da hemorragia pulmonar induzida por exercício é feita no
momento da realização do diagnóstico, na visualização direta das narinas e da
traqueia, com o auxílio de endoscópio. O grau de graduação dessa doença pode
variar de zero a cinco, e leva-se em conta a ausência de sangue visível até a
presença de epistaxe (THOMASSIAN, 2005).
O critério da variação de classificação da doença está descrito no quadro 2 a
seguir, segundo a descrição do trabalho de Pascoe et al. (1981):
Quadro 2 - Critério da variação de classificação da hemorragia pulmonar induzida por exercício.
GRAU DESCRIÇÃO
Grau 0 Não há a presença de sangue na traqueia
Grau 1 É notado traço de sangue na traqueia
Grau 2 É notada a presença de filete de sangue na traqueia
Grau 3 Presença de pouco sangue na traqueia
Grau 4 Acúmulo de sangue na traqueia
Grau 5 Epistaxe e/ou sangue acumulado da traqueia a orofaringe.
O lavado broncoalveolar (LBA) ou a citologia do lavado traqueal são métodos
de confirmação para a hemorragia pulmonar induzida por exercício por conferirem
maior especificidade e sensibilidade do que apenas o exame endoscópio, já que a
presença de hemácias ainda pode ser evidenciada uma semana depois do quadro
hemorrágico, e os produtos da quebra dessa hemoglobina ainda podem ser
observados cerca de três semanas ou mais da ocorrência da doença (MCKANE et
al. 1993).
31
6.2.5 Tratamento
Não há uma confirmação científica do que cause a HPIE, logo, não há um
tratamento único e efetivo para esta doença (PIOTTO, 2006). A redução da
severidade do sangramento pulmonar torna-se o principal objetivo para uma maior
sobrevida com qualidade do animal, bem como a minimização da inflamação e
fibrose intersticial e de vias aéreas, exemplos de consequências que essa doença
apresenta (BACCARIN, 2005).
A restrição de exercícios que requerem esforços é indicada por Thomassian
(2005), em animais que apresentam quadros de HPIE em graus acima do III ou com
piora gradativa da clínica, como começo essencial para o tratamento, contudo, ainda
o considera inconsistente. Por isso Piotto (2006) descreve a existência de
tratamentos alternativos e menos específicos, baseando-se em afecções
concomitantes que podem agravar e/ou induzir a doença em questão.
A furosemida é o diurético rotineiramente utilizado em quadros de hipertensão
no ser humano (PIOTTO, 2006). O uso da furosemida é recomendado como terapia
para casos de equinos acometidos pela hemorragia pulmonar induzida por
exercícios, pela queda de pressão sanguínea pulmonar e a liberação de E-
prostaglandina (broncodilatadora) pelos rins (ROBINSON, 1979). Contudo não há
comprovação científica de que há o impedimento ou atraso da evolução da doença
(PIOTTO, 2006). Baccarin (2005) ressalta a falta de estudos que expliquem o papel
da furosemida em casos de HPIE, apesar de um estudo realizado por Costa &
Thomassian (2003) ter demonstrado dados de diminuição de 20% na severidade da
hemorragia com o uso deste fármaco.
Esse medicamento vem se mostrando eficaz na redução da gravidade de
HPIE principalmente em animais com graus de hemorragia entre IV e V (OSELIERO
& PIOTTO, 2003).
Não se é sabido ao certo a ocorrência da inflamação das pequenas vias
aéreas, bem como a broncoconstrição na hemorragia pulmonar induzida pelo
exercício.
Contudo, é rotineiro o uso de terapias que reduzem essa inflamação das vias
posteriores e aliviam a broncoconstrição em equinos atletas.
32
“Broncodilatadores beta adrenérgicos como o clembuterol e albuterol são eficazes
na broncodilatação, porém sua eficácia em prevenir a HPIE não é conhecida”
(MANOHAR et al. 2000).
O resultado do uso da terapia com células tronco mesenquimais vem se
mostrando promissor para o tratamento de doenças em tecidos de origem não
mesodérmica, como o pulmão. O principal objetivo da associação desta terapia com
sangramento pulmonar induzido por exercício é a redução da inflamação causada
pelo extravasamento de sangue nos pulmões e a prevenção da formação de lesões
futuras. Adicionalmente, por não apresentarem efeitos adversos, as CTM seriam
uma nova alternativa para afecções que não possuem tratamento único e efetivo,
como a doença em questão.
Contudo, não se é sabido o exato número de células necessárias para o
tratamento do sangramento pulmonar induzido por exercício, qual a célula tronco de
predileção, a melhor via de administração e o número de vezes que a terapia deve
ser aplicada. Igualmente, não se tem certeza dos reais mecanismos de ação e
efeitos das CTM, principalmente na reparação tecidual (MAIA et al. 2013).
Há a carência de estudo abrangendo a associação das células tronco
mesenquimais obtidas a partir de tecido adiposo, com doenças que afetam o trato
respiratório dos equinos. A associação da terapia com fármacos já utilizados no
tratamento da hemorragia pulmonar induzida por exercício garantiria ao animal a
redução de sequelas adquiridas com a cronicidade, consequentemente uma melhor
qualidade de vida seria proposta para o animal.
33
7. DESCRIÇÃO DO CASO CLÍNICO
Foi atendido no Rancho Icaraí no município de Ibiúna – São Paulo, um cavalo da
raça Quarto de Milha. Macho, não castrado, 15 anos de idade, pesando 370 kg e
atleta realizador de prova de tambores.
O equino reside em um rancho com piso de terra compactada, possui água à
vontade, sua alimentação é balanceada com ração e feno e seu treinamento era
realizado rotineiramente. O responsável do animal relatou sangramento em ambas
às narinas após ser submetido à esforços em exercícios de intensidade.
O animal foi atendido por um médico veterinário da região, que indicou a
administração do diurético Furosemida® antecedente aos esforços (para evitar a
ocorrência de epistaxe) e indicou suplementação com ômega 3, suplemento de óleo
de alho fitoterápico e vitamina C. Concomitante à esses fármacos, também foi
indicado o uso do broncodilatador Pulmonil®, na quantidade de 20 ml, sendo
administrado uma vez de manhã e outra à noite.
Após não se mostrar responsivo ao tratamento convencional indicado, o equino
foi atendido pela Dra. Flavia Guerra e pelo Dr. José Joffre Bayeux. Após reavaliação
com auxílio de endoscópio, o diagnóstico foi de Sangramento Pulmonar pós
Exercício em Grau V, e lhe foi indicado o tratamento com células tronco
mesenquimais.
O animal foi submetido à tratamento profilático com o antibiótico Ceftiofur®, na
dose de 2,2 mg/kg, duas vezes ao dia, pelo período de 10 dias (antecessores ao dia
da aplicação da terapia celular).
As aplicações foram agendadas em duas etapas, com intervalo de
aproximadamente 30 dias entre elas, nas datas de 20/04/2016 e 23/05/2016. Para
ambas as aplicações o animal foi submetido a jejum alimentar e permaneceu
estabulado durante todo o período.
Para cada fase do tratamento foram utilizados cinco criotubos contendo células
tronco mesenquimais, como mostra a imagem 5. Os criotubos estavam
armazenados em botijão de nitrogênio a uma temperatura aproximada de 196ºC
negativos.
34
Após a retirada dos criotubos do botijão de nitrogênio, como mostra a imagem 4,
os mesmos foram colocados imediatamente em banho maria, à temperatura de
37ºC, por dois minutos.
Em seguida o conteúdo dos criotubos foi aspirado e duplamente lavados com o
auxílio de pipeta Pasteur, como mostra a imagem 6. Após esse procedimento, as
células foram diluídas em solução fisiológica, com o auxílio de uma seringa estéril de
20 mL.
Concomitante a essa preparação, foi realizada a desinfecção do endoscópio
com solução de glutaraldeído. O equino foi contido com o auxílio de um cachimbo e
então foi realizada a passagem do endoscópio através da narina esquerda. Não foi
notada a presença de secreções muco purulentas na traqueia do animal. Localizada
a carina, foi aplicado um conteúdo de 10 ml, de células tronco mesenquimais
diluídas, no brônquio esquerdo e em seguida, o mesmo foi realizado no brônquio
direito. Terminado todo o procedimento de aplicação, foi retirado o endoscópio e
fornecido feno ao animal.
Manteve-se o uso de suplementações e o uso do bronquiodilatador, até a
finalização de todas as aplicações da terapia celular. Foi indicado também que o
animal realizasse apenas exercícios leves, podendo ser exercício a passo (guiado
ou não), até o final do tratamento.
A segunda fase do tratamento com CTM seguiu exatamente os mesmos
protocolos da primeira. Após esta fase foi suspendido o uso de broncodilatador e o
animal retoma seus exercícios de maneira gradativa, com o uso de glicose a 50%.
35
Figura 4– Botijão de nitrogênio. (A) Botijão de nitrogênio utilizado para o armazenamento temporário da terapia celular (B) Botijão de nitrogênio expondo armazenador de criotubos.
36
Figura 5 – Criotubos utilizados terapia celular.
37
Figura 6 – Tubos contendo terapia celular. (C) Tubo de 15 ml contendo células tronco e solução de descongelamento (D) Tubo de 15 ml contendo células tronco em solução de lavagem.
38
8 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um mês após a primeira fase do tratamento, o animal não apresentava mais
quadro de epistaxe. Borjesson e Peroni (2011) descrevem algumas habilidades das
células tronco, dentre elas a regulação de inflamações. O repouso do animal
juntamente com a redução da inflamação pelas CTM foram essenciais para que a
epistaxe presente anteriormente cessasse.
Sabe-se que as células tronco mesenquimais atuam na manutenção e
renovação de tecidos lesionados (através de ação parácrina), além de auxiliarem na
prevenção da formação de novas lesões. Quinze dias após a segunda aplicação das
CTM no equino, não era possível visualizar secreções sanguinolentas na traqueia e
Carina. Acredita-se na redução de lesões bronquiais junto à diminuição prévia da
inflamação.
Os principais sinais clínicos da hemorragia pulmonar induzida por exercício
foram interrompidos com as duas aplicações de células tronco mesenquimais
impostas ao paciente. O efeito antiinflamatório e a capacidade de regeneração
tecidual impostos por estas células reduziram a severidade da doença, diminuindo
cronicidade da HPIE para o equino.
O animal segue trabalhando leve e não apresentou mais quadros de
sangramento. O prognóstico do tratamento se mostrou favorável, apesar da
cronicidade que a doença apresentava no início do tratamento e da idade do animal,
que interfere diretamente no tempo de reação pelo sistema do animal.
O uso da terapia de células tronco mesenquimais para o tratamento de
hemorragia pulmonar induzida por exercício, regrediu a cronicidade da doença de
grau 5 (epistaxe) para grau 0, ou seja, não foi notado nem mesmo a presença de
traços de sangue na traqueia do paciente, fornecendo ao animal qualidade de vida.
39
9 CONCLUSÃO
As células tronco mesenquimais vem atuando como uma terapia alternativa
para diversas doenças, principalmente para aquelas que não possuem um
tratamento efetivo e suas possíveis sequelas. Diversos pesquisadores relatam seu
uso nos mais diferentes tecidos e lesões, conferindo a essas células, um caráter
promissor na medicina veterinária. O resultado favorável obtido no relato de caso do
paciente mostra a vantagem do uso das CTM em uma doença respiratória da clínica
de equinos. Mostrando que o ramo de aplicação dessas células se estendem às
doenças que ainda não foram completamente estudadas, como o sangramento
pulmonar induzido por exercício.
Contudo vale ressaltar que o aprofundamento dos conhecimentos sobre a ação
das CTM abrangeria também a aplicação clínica desta terapia para diversas outras
afecções sem tratamento.
40
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