UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE – UFF FACULDADE DE MEDICINA

MESTRADO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

FABIANA GIL MELGAÇO

TIPAGEM DE PAPILOMAVÍRUS HUMANOS EM AMOSTRAS CERVICAIS DE PACIENTES CO-INFECTADAS PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA

Niterói

2009

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FABIANA GIL MELGAÇO

TIPAGEM DE PAPILOMAVÍRUS HUMANOS EM AMOSTRAS CERVICAIS DE PACIENTES CO-INFECTADAS PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas

Orientador(a): Profa. Dra. LEDY DO HORTO DOS SANTOS OLIVEIRA

Coorientador(a): Profa. Dra. SILVIA MARIA BAETA CAVALCANTI

Niterói

2009

Melgaço, Fabiana Gil

Tipagem de papilomavírus humanos em amostras cervicais de pacientes co-infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana / Fabiana Gil Melgaço – Niterói: [sn.], 2009

Dissertação (Pós-graduação em Ciências Médicas) – Universidade Federal Fluminense, 2009.

Bibliografia: f.

FABIANA GIL MELGAÇO

TIPAGEM DE PAPILOMAVÍRUS HUMANOS EM AMOSTRAS CERVICAIS DE PACIENTES CO-INFECTADAS PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas

Aprovada em ___________________ de 2009

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Maria Luiza Garcia Rosa Universidade Federal Fluminense

Profa. Dra. Isabel Cristina Chulvis do Val Universidade Federal Fluminense

Profa. Dra. Márcia Dutra Wigg Universidade Federal do Rio de Janeiro

Niterói

2009

Aos meus pais, José Maria e Patrícia, por estarem acompanhando todos os

momentos da minha vida e do meu trabalho.

A minha irmã Juliana pelo incentivo e por estar ao meu lado principalmente

nas horas mais difíceis.

A meus avós, Jocelym e Nicéa que mesmo sem entenderam a minha

ausência aos seus lados, demonstraram compreensão e carinho sempre.

AGRADECIMENTOS

A Deus pela minha existência e por não me abandonar nos momentos

de aflição e ansiedade.

A minha orientadora Ledy pela paciência e pelo auxílio no meu

crescimento profissional.

A minha coorientadora Sílvia e a toda a equipe envolvida na pesquisa

que foram fundamentais para a realização deste trabalho.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela bolsa de estudo de Mestrado.

A Pró-reitoria de pesquisa e pós-graduação (PROPP-UFF), ao

Conselho nacional de desenvolvimento científico e tecnológico (CNPq)

e a Fundação de amparo à pesquisa do Estado do Rio de Janeiro

(FAPERJ) pelo suporte financeiro.

Aos funcionários, professores e alunos do Laboratório de Virologia pela

amizade, companheirismo e dedicação.

As minhas companheiras de república pelo convívio e por respeitarem

meus momentos de estudo.

“Renda-se, como eu me rendi. Mergulhe no que você não conhece

como eu mergulhei. Não se preocupe em entender, viver ultrapassa

qualquer entendimento.” (Clarice Lispector)

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO, p. 18

1.1- HISTÓRICO, p. 18

1.2- PATOGÊNESE DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO, p. 19

1.3- PAPILOMAVÍRUS HUMANO, p. 20

1.4- DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA INFECÇÃO POR HPV, p. 23

1.5- VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA, p. 28

1.5.1- Características morfológicas e replicação do HIV, p. 28

1.5.2- Diagnóstico laboratorial da infecção por HIV, p. 30

1.6- RELAÇÃO ENTRE O VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA E

PAPILOMAVÍRUS HUMANO, p. 31

1.7- EPIDEMIOLOGIA DA CO-INFECÇÃO HPV-HIV, p. 33

1.8- PREVENÇÃO E TRATAMENTO, p. 35

1.9- VACINAS, p. 36

2- OBJETIVOS, p. 39

2.1- GERAL, p. 39

2.2- ESPECÍFICOS, p. 39

3- MATERIAL E MÉTODOS, p. 40

3.1- DESENHO DO ESTUDO, p. 40

3.2- POPULAÇÃO ESTUDADA, p. 40

3.3- CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E DE EXCLUSÃO, p. 40

3.3.1- INCLUSÃO, p. 40

3.3.2- EXCLUSÃO, p. 41

3.4- COLETA DE DADOS, p. 41

3.5- CLASSIFICAÇÃO DAS LESÕES, p. 41

3.6- PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS, p. 41

3.7- DADOS OBTIDOS DAS PACIENTES HIV POSITIVAS, p. 42

3.7.1- Contagem de Células CD4, p. 42

3.7.2- Determinação da Carga Viral , p. 42

3.8- DETECÇÃO DE HPV, p. 42

3.8.1- Extração de DNA (extração por fenol-clorofórmio), p. 42

3.8.2- Amplificação de HPV por reação de cadeia polimerase (PCR), p. 43

3.8.2.1- Análise do produto amplificado (“amplicons”), p. 44

3.8.3- Implementação da técnica de Polimorfismo dos fragmentos obtidos

por enzimas de restrição, p. 44

3.8.4- Tipificação de HPV, p. 45

3.9- ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 46

4- RESULTADOS, p. 47

4.1- PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE POLIMORFISMO DOS

FRAGMENTOS OBTIDOS POR ENZIMAS DE RESTRIÇÃO, p. 47

4.2- CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO DE ESTUDO, p. 50

4.3- FREQUÊNCIA DOS TIPOS DE HPV DETECTADOS POR RFLP, p. 52

4.4- FATORES DEMOGRÁFICOS, DE RISCO E CARGA VIRAL

RELACIONADOS COM A INFECÇÃO POR HPV, p. 55

4.5- RELAÇÃO ENTRE INFECÇÃO POR HPV E CITOLOGIA, p. 60

4.6- ESTADO IMUNE DE MULHERES HIV POSITIVAS EM RELAÇÃO À

INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANOS, p. 62

5- DISCUSSÃO, p. 63

6- CONCLUSÃO, p. 77

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 78

8- ANEXO, p. 90

8.1- TABELA COM PADRÃO DE CLIVAGEM DE CADA ENZIMA

UTILIZADA NA TÉCNICA DE RFLP PARA CADA SEQUÊNCIA DE DNA

DOS PRODUTOS DO PCR DA REGIÃO L1 DO GENOMA DE TIPOS

DIFERENTES DE HPV, AMPLIFICADO PELOS OLIGONUCLEOTÍDEOS

My09/My11 (450bp) (Bernard et al., 1994), p. 90

LISTA DE TABELAS

TABELA 1- Perfil sociodemográfico e citologia cervical de mulheres infectadas por HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 51 TABELA 2- Resultados associados à infecção por HIV e fatores de risco para infecção por HPV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 51 TABELA 3- Frequência de infecções por tipos de HPV de alto risco em mulheres portadoras de HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 54 TABELA 4- Frequência das mulheres soropositivas para HIV que apresentaram infecção por tipos de HPV de baixo risco. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 55 TABELA 5- Frequência de infecções simples e múltiplas em mulheres infectadas por HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 55

TABELA 6- Infecção de HPV de alto risco relacionada com fatores de risco, demográficos e carga viral em mulheres soropositivas para HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 57

TABELA 7- Fatores de risco, demográficos e carga viral em mulheres positivas para HIV relacionados com HPV de baixo risco. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 58

TABELA 8- Infecções múltiplas associadas a fatores de risco, dados demográficos e a carga viral em mulheres HIV positivas. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 59

TABELA 9- Frequência de HPV de alto risco e de baixo risco de acordo com resultados de citologia de mulheres HIV positivas. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 61

TABELA 10- Casos de lesões intraepiteliais de alto grau em pacientes portadoras de HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 61

TABELA 11- Frequência do tipo de HPV 16 em relação à citologia de pacientes HIV positivas. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005., p. 61

TABELA 12- Relação entre citologia e contagem de linfócitos T CD4 em mulheres infectadas por HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 61

TABELA 13- Infecção de HPV de alto risco de acordo com o estado imune de mulheres soropositivas para HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 62

TABELA 14- Relação entre contagem de células CD4 de pacientes infectadas por HIV e infecção por HPV de baixo risco. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005, p. 62

LISTA DE FIGURAS E QUADROS

Figura 1- A- Condilomas genitais (Monaghan, 1992) e B- Carcinoma Invasivo (Foto cedida com permissão e autorização de Dra. Maria Diva Lima, Ginecologista do HUAP), p. 20 Figura 2- Árvore filogenética de alguns tipos de HPV adaptada de Bernard et al., 1994, Chan SY et al., 1995 e De Villiers et al., 2004, p. 22

Figura 3- Representação da técnica de Polimorfismo dos Fragmentos de Restrição (RFLP) e da clivagem das enzimas de restrição. A- Adaptado de Vos et al., 1995. B- Disponível em www.mundovestibular.com.br/.../Paacutegina1.html, acesso em: 26 de abril de 2009, 12:07:14, p. 27

Figura 4- Padrões de restrição de uma amostra infectada com HPV 58 e marcador de peso molecular de 100bp visualizado em gel de poliacrilamida 8%, p. 48

Figura 5- Fragmentos de restrição do HPV 16 e marcador padrão de peso molecular de 50bp em gel de agarose 1,5%, p. 48 Figura 6- Padrões de restrição compatíveis com os tipos HPV 16, 42 e 53 e marcador de peso molecular (50bp) em gel de agarose 1,5%, p. 49

Figura 7- Gel de agarose 1,5% mostrando as bandas correspondentes ao plasmídeo de HPV 16 e o marcador padrão de peso molecular (50bp), p. 49 Figura 8- Infecção por HPV nas 140 amostras cervicais das pacientes infectadas por HIV, p. 53

Figura 9- Distribuição da frequência dos genótipos de HPV nas mulheres positivas

para HIV, p. 54

Quadro 1- Comparação dos tipos prevalentes de HPV entre os diferentes estudos, p.

64

Quadro 2- Prevalência do HPV 16 em diferentes localidades, p. 65

Quadro 3- Relação da frequência do HPV 58 apresentada por diversos autores, p.

65

Quadro 4- Presença do HPV 53 em lesões cervicais, p. 66

Quadro 5- Diferentes estudos mostrando a prevalência do HPV 53, p. 67

Quadro 6- Baixa prevalência do HPV 18 em mulheres portadoras de HIV, p. 67

Quadro 7- Relação de tipos menos frequentemente detectados, p. 68

Quadro 8- Prevalência do HPV 81 em diferentes regiões, p. 69

Quadro 9- Tipos de HPV presentes apenas em infecções múltiplas, p. 70

Quadro 10- Variáveis analisadas e relacionadas com infecção por HPV antes e após

tipificação, p. 71

Quadro 11- Comparação das variáveis analisadas no nosso e nos diferentes

estudos, p. 72

Quadro 12- Relação entre infecção por HPV e citologia nos seguintes trabalhos, p.

73

Quadro 13- Frequência de HSIL em imunossuprimidas infectadas por HPV de alto

risco de diferentes localidades, p. 74

Quadro 14- Diferentes trabalhos mostrando a presença do HPV 16 em lesões

cervicais, p. 74

Quadro 15- Relação do estado imune e infecção por HPV apresentada por autores

distintos, p. 75

LISTA DE SIGLAS

AGUS Células Glandulares Atípicas de Significância Indeterminada

AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AS04 Hidróxido de Alumínio e imunoestimulante Lipídeo Monofosforil A

ASCUS Células Escamosas Atípicas de Significância Indeterminada

candHPV89 Candidato a Papilomavírus Humano do tipo 89

CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CD4 Grupamento de Diferenciação 4

CDC Centers for Disease Control and Prevention/ Centro de Controle e

Prevenção de Doenças

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

DNA Ácido desoxirribonucléico

dNTP Desoxinucleotídeo Trifosfato

DST Doenças Sexualmente Transmissíveis

ECL Eletroquimioluminescência

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay/ Ensaio Imunoenzimático

Env Abreviação para envelope

G/A/T/C Guanina, Adenina, Timina e Citosina

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

HPV Papilomavírus humano

HSE Hospital dos Servidores do Estado

HSIL Lesão Intraepitelial de Alto Grau

IC Intervalo de Confiança

INCA Instituto Nacional de Câncer

Kb Quilo-base

Kits Conjunto de Reagentes

LCR Região de Longo Controle

LSIL Lesão Intraepitelial de Baixo Grau

LVX100 Luisa Villa X100

ml Mililitro

mm3 Milímetro cúbico

NIC Neoplasia Intraepitelial Cervical

ORF Open Reading Frame/ Sequências de Leitura Aberta

pb Pares de bases

PCR Reação de Cadeia Polimerase

PROPP Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação

pH Potencial de Hidrogênio

pRb Proteína do Retinoblastoma

RFLP Polimorfismo dos Fragmentos Obtidos por Enzimas de Restrição

RJ Rio de Janeiro

RNA Ácido ribonucléico

rpm Rotações por Minuto

SPF LiPA Short Fragment Polymerase Line Probe Assay

TBE Tris-base, Acido Bórico e Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

TE Tris-base e Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

TNF-α Fator de Necrose Tumoral

UFF Universidade Federal Fluminense

U.V. Luz Ultravioleta

VLP Virus Like Particles/ Partículas Semelhantes a Vírus

WHO World Health Organization/ Organização Mundial de Saúde

RESUMO

Os papilomavírus humanos (HPV) mucosotrópicos são potenciais agentes de possível lesões pré-malignas e malignas. O vírus da imunodeficiência humana (HIV), por diminuir a imunidade do hospedeiro, é um dos co-fatores que facilitam o desenvolvimento destas lesões. Um dos objetivos deste trabalho foi estabelecer a técnica de polimorfismo dos fragmentos obtidos por enzimas de restrição (RFLP) para detecção de genótipos de HPV em amostras cervicais de citologia de 140 pacientes infectadas por HIV atendidas no Serviço de Colposcopia do Hospital dos Servidores do Estado (HSE), Rio de Janeiro, no período de 2003 a 2005. A detecção e a tipificação de HPV foi realizada pela técnica de reação em cadeia pela polimerase, utilizando-se os oligonucleotídeos iniciadores My09/11, associada à técnica de polimorfismo dos fragmentos obtidos por enzimas de restrição (PCR-RFLP). Os produtos resultantes da amplificação por PCR, foram clivados por seis enzimas de restrição BamHI, DdeI, HaeIII, HinfI, PstI, RsaI. Os fragmentos gerados pela clivagem foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5%, corados com brometo de etídeo e visualizados sob luz U.V. Do total de 140 amostras, 83 (60,0%) foram positivas para o HPV. Vinte e quatro tipos diferentes de HPV foram detectados, com prevalência dos tipos de alto risco HPV 16 (16,4%), HPV 58 (7,5%) e HPV 53 (6,8%). A infecção por tipos oncogênicos de HPV apresentou uma associação significativa entre mulheres jovens (≤30 anos) (p=0,02), de etnia branca (p=0,004), com maior número de parceiros sexuais (p=0,06), com mais de um filho (p=0,06) e cujo diagnóstico para HIV foi conhecido há menos de quatro anos (p=0,001). A infecção por tipos de baixo risco foi associada a início da atividade sexual precoce (p=0,06). Genótipos oncogênicos ou não oncogênicos foram associados significativamente a alterações citológicas (p<0,001 e p=0,004, respectivamente). As pacientes que tinham contagem de células CD4 abaixo de 200/mm3 e 350/mm3 apresentaram maior probabilidade de desenvolver lesão cervical (p=0,009 e p=0,017, respectivamente) e de estarem infectadas por tipos de alto potencial oncogênico (p=0,025 e p=0,043, respectivamente). Concluímos que a implantação da técnica de PCR-RFLP permitiu a detecção de um grande número de genótipos distintos de HPV, como esperado em uma população HIV positiva. Considerando que nesta população, regularmente submetida a exames ginecológicos, foi encontrado um alto índice de lesões cervicais de alto grau, mas nenhum caso de câncer, ressaltamos a importância dos exames preventivos no controle desta doença.

Palavras-chave: Papilomavírus humano (HPV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), PCR-RFLP, genótipos oncogênicos, lesões cervicais.

ABSTRACT

Human papillomaviruses (HPV) are potential agents of pre-malignant and malignant lesions in the cervical mucosa. Human immunodeficiency virus (HIV) is able to decrease host immunity acting as a co-factor in the development of these cervical lesions. The present work aimed to establish the restriction fragment length polymorphism technique for the detection of HPV types in cervical samples from 140 HIV soropositive women attending the Cervical Pathology Service of Hospital dos Servidores de Estado (HSE), Rio de Janeiro, from 2003 to 2005. The HPV detection and typing was carried out by polymerase chain reaction (PCR), using My09/11 generic primers followed by restriction fragment length polymorphism method (PCR-RFLP). The PCR products were digested by six restriction enzymes (BamHI, DdeI, HaeIII, HinfI, PstI, RsaI) and the fragments were analyzed in 1,5% agarose gels stained by ethidium bromide and visualized on U.V. light. From the 140 studied samples, 83 (60,0%) were HPV positive. Twenty four different HPV genotypes were detected. Among them, the most prevalent were the high risk HPV types HPV 16 (16,4%), 58 (7,5%) and 53 (6,8%). The oncogenic HPV types infection were significantly associated with young female patients (≤30 years) (p=0,02), white ethnicity (p=0,004), high number of sexual partners (p=0,06), more one parities (p=0,06) and recent HIV diagnosis (less than 4 years) (p=0,001). The low-risk HPV types infection were associated with early first sexual intercourse (p=0,06). Both oncogenic and non oncogenic genotypes were associated with abnormal cytology (p<0,001 and p=0,004, respectively). The patients that presented CD4 count less than 200/mm3 and 350/mm3 were in the greatest risk to develop cervical lesions (p=0,009 and p=0,017, respectively), and to be infected by high-risk HPV types (p=0,025 and p=0,043, respectively). We concluded that the use of PCR-RFLP method allowed the detection of a large spectrum of distinct HPV genotypes, as expected for HIV-infected patients. Considering that among the studied population, submitted to ginecological exams regularly, was found a frequent diagnosis of high-grade cervical lesions, but no cervical cancer, we highlighted the importance of preventive exams in disease control.

Keywords: Human papillomavirus (HPV), human immunodeficiency virus (HIV), PCR-RFLP, oncogenic genotypes, cervical lesions

1- INTRODUÇÃO

1.1 – HISTÓRICO

A primeira descrição de associação do vírus HPV com o câncer cervical foi

realizada e publicada no final dos anos de 1970 por Zur Hausen (1977) (Zur Hausen,

1977). O carcinoma cervical é um dos maiores problemas de saúde pública no

mundo, apresentando 500 mil novos casos e 274 mil mortes a cada ano. É a

segunda doença maligna mais comum em mulheres de países em desenvolvimento

(WHO, 2007). Segundo dados do Instituto Nacional de Câncer, em 2003, foram

relatadas as maiores taxas de incidência de câncer de colo de útero em países da

América do Sul, Caribe, África sub-Saariana e no Sul e Sudeste da Ásia. Cerca de

80% de casos novos ocorrem em países emergentes, sendo que em algumas

regiões é o câncer mais encontrado entre as mulheres.

Nos anos de 1995 a 1999, o câncer cervical teve uma taxa de incidência de

18,86 e mortalidade de 4,31 para cada 100 mil mulheres brasileiras (Derchain et al.,

2005). Os maiores valores das taxas médias de incidência anuais, ajustadas por

idade para cada 100 mil brasileiras, foram encontrados no Distrito Federal (taxa de

50,7 nos anos de 1996 a 1998), em Goiânia, no período de 1996-2000 (taxa de 41,4)

e em Belém, onde nos anos de 1996 a 1998 foi estimada em 34,7. A menor taxa

(14,7) foi encontrada na cidade de Salvador, no período de 1997 a 2001 (INCA

2003). Em 2002, de acordo com os dados do Ministério da Saúde, a estimativa foi de

17600 casos de câncer cervical e 4005 mortes no território brasileiro (Camara et al.,

2003). No ano de 2008, foram notificados cerca de 18680 novos casos de câncer de

colo de útero em localização primária, apresentando uma taxa bruta de incidência de

19

19,18 para cada 100 000 brasileiras. Neste mesmo ano, a taxa bruta de incidência

estimada no Estado do Rio de Janeiro foi de 25,63 por 100 mil mulheres e, na capital

do Rio, esta situação não é diferente, com 860 novos casos de neoplasia cervical

observados e taxa de incidência de 25,05/100 mil cariocas (INCA, 2008).

De acordo com estimativas da incidência mundial de todos os tipos de

cânceres, o DNA de papilomavírus humano (HPV) está presente em cerca de 10%

do total de cânceres em humanos (Astori et al.,1997).

1.2 – PATOGÊNESE POR PAPILOMAVÍRUS HUMANO

A infecção por papilomavírus humano pode levar ao desenvolvimento do

câncer cervical mas, em princípio, sua progressão é evitável por apresentar uma

evolução lenta e de período longo, o que distingue esse tipo de carcinoma dos

demais. Existem muitas formas de intervenção visando ao combate das variadas

manifestações da doença, com métodos preventivos eficientes (Derchain et al.,

2005).

O câncer cervical está associado aos papilomavírus humanos da área genital,

que são transmitidos por via sexual, sendo portanto encontrados em mulheres

sexualmente ativas. A incidência do câncer de colo uterino torna-se evidente na

faixa etária de 20 a 29 anos e o risco aumenta ligeiramente ao atingir a faixa de 45 a

49 anos (INCA, 2003).

Os vários genótipos de HPV da área genital podem produzir uma infecção

persistente e progredir para uma doença neoplásica. A infecção por esse vírus no

trato genital pode ser assintomática ou se manifestar por vários tipos de lesões

genitais, de verrugas genitais a ligeiras lesões displásicas até carcinoma invasivo

(Figura 1). O termo neoplasia intraepitelial cervical (NIC) é proposto para designar os

níveis de anormalidade encontrados no epitélio do colo uterino, sendo classificados

como NIC I a neoplasia intraepitelial de nível leve com mudanças citológicas

induzidas pelo HPV, NIC II a displasia moderada e NIC III a displasia severa

(Boshart et al., 1984). A infecção na cérvice uterina ocorre inicialmente na zona de

transformação, onde o epitélio escamoso da ectocérvice e o epitélio colunar da

endocérvice se encontram (IARC, 2009).

20

Figura 1. A- Condilomas genitais (Monaghan, 1992) e B- Carcinoma Invasivo

(Foto cedida com permissão e autorização de Dra. Maria Diva Lima, Ginecologista do HUAP).

1.3 – PAPILOMAVÍRUS HUMANO

O primeiro tipo de papilomavírus foi isolado há cerca de 30 anos atrás. A

dificuldade de encontrar um sistema de cultura de células apropriado para a

propagação desse vírus limitou o estudo das funções virais e o estabelecimento de

uma taxonomia baseada nas propriedades biológicas. Em pesquisas realizadas no

período de 1970-80, com o surgimento de técnicas de Biologia Molecular, foi

realizado um acordo de classificação quanto a um sistema de numeração para

identificar um tipo como, por exemplo, HPV 6 que significa a abreviação de human

papillomavirus type 6 (De Villiers et al., 2004).

Os papilomavírus pertencem à família Papillomaviridae e os que infectam o

trato genital são classificados no gênero Alpha-papillomavirus. Apresentam capsídeo

icosaédrico não envelopado, possuindo 55nm de diâmetro. O genoma desse vírus é

composto de DNA circular dupla fita com aproximadamente 7900 pares de bases,

que codificam pelo menos oito proteínas precoces e duas tardias. A expressão do

gene viral é modulada por 800 pares de bases da região de longo controle (LCR),

21

específica para o tecido epitelial e regulada por sinais fisiológicos (Damin et al.,

2007). Os HPV mucosotrópicos possuem duas proteínas estruturais (tardias): L1 e

L2, que fazem parte do capsídeo viral e 5 a 7 proteínas não-estruturais (precoces):

E1-E7 (Leggatt & Frazer, 2007). L1 ORF é o gene mais conservado do genoma e é

usado para identificação de novos tipos de HPV. As proteínas E1, E2, L1 e L2 são

codificadas pela região precoce e pela região tardia da ORF, respectivamente

(Bonds et al., 2002).

O efeito carcinogênico do papilomavírus humano se dá em estágios múltiplos,

sendo a primeira etapa dependente da integração do DNA viral com o genoma das

células hospedeiras com consequente expressão de oncoproteínas E6 e E7

(Farthing & Vousden, 1994). Estas oncoproteínas são produtos dos genes precoces

desses vírus que inativam proteínas supressoras tumorais da célula como a p53,

que perde sua função devido à E6, e a pRb que é inativada pela proteína E7 (Clarke

& Chetty, 2002).

Alguns tipos de papilomavírus humanos são caracterizados como de alto risco

devido à sua associação com o carcinoma cervical invasivo. Os classificados como

de baixo risco diferem por não progredirem à neoplasia intraepitelial cervical (NIC)

ou carcinoma invasivo (Agorastos et al., 2005). Os tipos de HPV considerados de

baixo risco são HPV -6, -11, -32, -40, -42, -43, -44, -54, -55, -57, -61, -62, -64, -69, -

70(CP141), -72, -74, -91, -81(CP8304), -71(CP8061), -89(CP6108), -84(MM8), -

83(MM7). Os tipos de HPV -16, -18, -26, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53 -56, -58,

-59, -66, -67, -68, -73(MM9), -82(MM4) e subtipo -82(IS039) podem ser considerados

como agentes carcinogênicos ou de alto risco oncogênico, sendo o HPV-16 o mais

prevalente (De Villiers et al., 2004, Ferreccio et al., 2008) (Figura 2).

Os tipos de HPV de baixo e alto risco são classificados quanto a diferentes

espécies filogenéticas. Os tipos de alto potencial oncogênico são categorizados nas

espécies A5 (HPV 26 e 51), A6 (HPV 53, 30, 56 e 66), A7 (HPV 18, 39, 45, 59, 68,

70 e cand85), A9 (HPV 16, 31, 33, 35, 52, 58 e 67) e A11 (HPV 34 e 73). Os de

baixo risco nas espécies A1 (HPV 32 e 42), A3 (HPV 61, cand62, 72, 81, 83, 84,

cand86, cand87 e cand89), A8 (HPV 40, 43 e cand91), A10 (HPV 6, 11, 13, 44 e 74),

A13 (HPV 54), A14 (cand90) e A15 (HPV 71) (De Villiers et al., 2004).

22

Figura 2. Árvore filogenética de alguns tipos de HPV adaptada de Bernard et al., 1994, Chan et al., 1995 e De Villiers et al., 2004. Em vermelho estão representados os tipos de alto risco e em azul os tipos de baixo risco, 82b é o subtipo 82 (IS039).

O papilomavírus humano invade as células do epitélio através de microlesões,

resultando numa infecção que pode ser transitória ou persistente (Slattery et al.,

1989). A transcrição e a replicação dos papilomavírus ocorrem pela participação de

proteínas virais E1 e E2 e mais de 100 proteínas de células hospedeiras. Esses

vírus não lisam suas células hospedeiras para serem liberados para o meio

extracelular, mas são liberados através da desintegração da superfície inerente às

células epiteliais (Zur Hausen, 1996).

O HPV é frequentemente detectado em grande número de mamíferos e tem-

se mostrado altamente espécie-específico. Os tipos de HPV são definidos pela

análise de sequência de DNA e os genótipos representantes. Existem mais de 100

diferentes tipos de papilomavírus humanos e aproximadamente 40 tipos já foram

detectados em lesões genitais (Zur Hausen, 1996). Os tipos de HPV são

classificados com base na sequência de nucleotídeos do DNA viral, especificamente

na sequência de nucleotídeos do gene L1 (Camara et al., 2003).

23

Variantes dos tipos de HPV apresentam, no genoma, uma variação da

sequência de nucleotídeos menor que 2%, de acordo com a referência da sequência

do DNA de origem. Diferenças de 2% a 10% do DNA de um tipo conhecido definem

um subtipo. Os genomas que apresentam uma divergência de nucleotídeos maior

que 10% de todos os tipos de HPV descritos podem ser classificados como tipos

novos (De Villiers et al., 2004).

1.4 - DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA INFECÇÃO POR HPV

O método diagnóstico comumente realizado para avaliar a lesão causada pela

infecção por HPV é o teste de Papanicolaou ou colpocitologia oncológica, que

detecta células epiteliais com características morfológicas anormais, características

da infeccção pelo HPV. O exame consiste na coleta do material do colo uterino, do

qual é retirada uma amostra da ectocérvice e uma da endocérvice. Ela é realizada

introduzindo-se um espéculo vaginal fazendo a escamação ou esfoliação das

superfícies externas e internas do colo através de uma espátula e de uma escova

endocervical (INCA, 2008). Este teste é muito simples, mas precisa de uma boa

infra-estrutura laboratorial e de profissionais competentes para ser realizado e ter um

resultado satisfatório da sua eficiência. Em alguns casos, é necessário realizar uma

colposcopia que permite obter uma biópsia dirigida à lesão, considerada padrão ouro

para definir o grau da lesão, mas é um procedimento de custo elevado (Derchain et

al., 2005).

O diagnóstico confirmatório da infecção pelo HPV apenas é possível por

métodos de biologia molecular, como o teste de Captura Híbrida. Este teste

discrimina apenas os tipos de HPV de alto dos de baixo risco, não informando o

genótipo viral específico (Aedo et al., 2007). O teste de Captura Híbrida é

comercialmente utilizado na forma de kits, os quais contém sondas de RNA

compatíveis com DNA de HPV de alto e baixo risco. Inicialmente, as moléculas de

DNA da amostra e de RNA das sondas são desnaturadas por aquecimento ou por

adição de substâncias que alterem o pH, formando fitas simples de DNA que são

hibridizadas com as fitas das sondas de RNA. Cada reação contém uma mistura do

híbrido RNA-DNA que são transferidos para um recipiente que contenha um

anticorpo de captura que se liga aos híbridos, imobilizando-os. Em seguida é

24

adicionado um novo anticorpo anti-híbrido conjugado com uma enzima. Finalmente é

colocado o complexo do substrato enzimático e cromógeno luminescente. A

luminescência emitida é medida por aparelho Luminômetro (Digene, EUA). As

amostras que apresentam cor ou luz são consideradas positivas e as que não

apresentam são negativas (Carestiato et al., 2006).

Em laboratórios de pesquisa científica, é muito utilizada a reação em cadeia

da polimerase (PCR), um método sensível para detecção dos genótipos virais que

usa pares de primers genéricos, My11/My09 ou PGMy09/PGMy11 que reconhecem

sequências específicas do DNA viral, como a região L1 do gene do HPV e

amplificam um fragmento de 450pb, indicando presença ou ausência do vírus na

amostra (Manos et al., 1989, Gravitt et al., 1998). Existem ainda outros pares de

primers genéricos como GP5/GP6 que também reconhecem a região L1, porém

amplificam um fragmento de 155pb (Snijders et al., 1990). Para identificação de

alguns tipos de HPV através dessa técnica são utilizados oligonucleotídeos

iniciadores de tipos específicos que amplificam a região E6 do gene do DNA de HPV

para detectar os seguintes tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35 e 58 que produzem os

fragmentos de 230, 89, 134, 119, 97, 132, 186 e 100pb, respectivamente (Tinos &

Manos, 1990).

Existem outras técnicas utilizadas em pesquisa científica para detecção dos

genótipos virais a partir dos produtos gerados pela reação em cadeia da polimerase

como a hibridização por Microarray, SPF Lipa, Southern Blot e a técnica de

Polimorfismo dos Fragmentos Obtidos por Enzimas de Restrição (RFLP) (Aedo et

al., 2007). SPF Lipa consiste na técnica que utiliza um grupo de par de primers

(SPF10) que amplifica um pequeno fragmento de 65pb da região L1 do HPV. Sondas

de oligonucleotídeos específicas para tipos diferentes de HPV são aplicadas em fitas

de membranas de nitrocelulose dispostas em linhas paralelas. Os produtos do PCR

SPF10 marcados com biotina são desnaturados em condições alcalinas e

adicionados às membranas em tampão apropriado para hibridização. Depois de

etapas de lavagem, os híbridos formados são detectados adicionando-se um

conjugado com streptavidina-fosfatase alcalina e um substrato, formando um

precipitado roxo na fita da sonda correspondente a cada tipo de HPV, podendo

identificar 25 genótipos diferentes (Gasperov et al., 2008). A metodologia de

Microarray consiste em sondas específicas para tipos de HPV que são ligadas a

uma superfície sólida (lâminas de microscópio) revestida com streptavidina. Um

25

fragmento dupla fita gerado por PCR tem uma das fitas marcada com biotina, que é

imobilizada na lâmina, e a outra fita é marcada com digoxigenina para visualização.

Depois da reação de hibridização e etapas de lavagens, a imagem de hibridação

pode ser visualizada por fluorescência do híbrido formado através de um

equipamento específico (Klaassen et al., 2004). Na técnica de Southern Blot, o DNA

da amostra é digerido por enzimas de restrição e os fragmentos são separados por

eletroforese. Posteriormente, os fragmentos são transferidos do gel para uma

membrana de nitrocelulose, onde são fixados por aquecimento ou irradiação com

ultravioleta (Abbas & Lichtman, 2005).

A técnica de polimorfismo dos fragmentos obtidos por enzimas de restrição

(RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphism) foi proposta em 1980, por Ray

White e outros pesquisadores, para mapeamento do genoma humano, sugerindo a

sua utilização no Projeto Genoma Humano, iniciado em 1990. Alec Jeffreys, em

1985, foi quem desenvolveu a metodologia RFLP utilizada atualmente. Ele elaborou

a técnica com a finalidade de detectar sequências específicas do DNA humano,

utilizada na época para testes de paternidade (Tilstone et al., 2006). O

desenvolvimento da RFLP apresentou uma importante função no auxílio da perícia

criminal, na determinação de paternidade (Tilstone et al., 2006) e na localização de

genes relacionados com doenças genéticas (Saiki et al., 1985). Em 1994, Bernard e

colaboradores utilizaram e padronizaram a técnica de RFLP para detecção de

diferentes genótipos de papilomavírus humanos, estabelecendo os diferentes

padrões de restrição para cada genótipo de HPV.

Esta técnica também é utilizada na clivagem do DNA viral por enzimas de

restrição. Entretanto, o tratamento é feito, não mais em todo o genoma viral, mas em

produtos amplificados pela PCR-My, em fragmentos de pesos moleculares

específicos para cada tipo de enzima de restrição. Essas enzimas são produzidas

por bactérias e reconhecem regiões específicas do DNA para a clivagem. As

sequências de DNA reconhecidas pelas enzimas são chamadas de sequências

palindrômicas, que são repetições invertidas. Existe uma variedade de tamanhos

dos fragmentos de DNA gerados pela digestão das enzimas de restrição, devido à

variabilidade das sequências de DNA. O comprimento médio do fragmento da

molécula de DNA é determinado, em grande parte, pelo número de bases

específicas reconhecidas por cada enzima. Geralmente, essas enzimas reconhecem

4, 6 ou 8 sequências de bases nitrogenadas (Jawetz et al., 2000). A técnica de RFLP

26

permite a identificação de grande número de tipos virais, dependendo do número de

enzimas utilizadas na reação que resulta na discriminação dos muitos tipos de

papilomavírus humanos conhecidos (Ruche et al., 1998). Um grupo de seis enzimas

de restrição BamHI, DdeI, HaeIII, HinfI, PstI, RsaI é utilizado para discriminar os

diferentes genótipos de HPV, que clivam as seguintes sequências palindrômicas do

DNA: BamHI 5’ G/GATC C3’ - 3’C CTAG/G 5’, DdeI 5’ G/GATC C3’ - 3’C CTAG/G 5’,

HaeIII 5’ G/GATC C3’ - 3’C CTAG/G 5’, HinfI 5’G/ANTC 3’ - 3’C TNA/G 5’, PstI

5’G/ANTC 3’ - 3’C TNA/G 5’, RsaI 5’ GT/AC 3’ - 3’CA/TG 5’, onde N representa

qualquer uma das quatro bases (Figura 3). A determinação de muitos tipos virais

com apenas uma reação de amplificação pela técnica de PCR-RFLP é uma grande

vantagem comparada com as demais metodologias que utilizam iniciadores

específicos (“primers”). Entretanto, sua maior desvantagem está na eficiência em

definir, em alguns casos, os genótipos de HPV em infecções múltiplas, que

frequentemente produzem padrões de restrição confusos (Aedo et al., 2007). Os

padrões de cada tipo de papilomavírus humanos encontrados estão representados

no Anexo 8.1, p. 90.

27

Figura 3. Representação da técnica de Polimorfismo dos Fragmentos Obtidos por Enzimas de Restrição (RFLP) e da clivagem das enzimas de restrição. A- Adaptado de Vos et al., 1995. B- Disponível em www.mundovestibular.com.br/.../Paacutegina1.html, acesso em: 26 de abril de 2009, 12:07:14

A BAA BB

Fonte: Adaptado de Vos et al., 1995

Amostras

Enzima de

restrição

Enzima de

restrição

Extremidades livres

Fragmentos

obtidos

A BAA BB

Fonte: Adaptado de Vos et al., 1995

Amostras

A BAA BB

Fonte: Adaptado de Vos et al., 1995

Amostras

Enzima de

restrição

Enzima de

restrição

Extremidades livres

Fragmentos

obtidos

A implementação da reação de PCR associada à técnica de polimorfismo dos

fragmentos obtidos por enzimas de restrição é importante para o nosso trabalho

porque possibilita a tipificação de uma grande diversidade de genótipos diferentes

de HPV que infectam o trato genital. Kaneshima et al., (2001) implementaram a

mesma técnica para tipificar vinte amostras de pacientes HIV negativas, que

apresentaram anormalidades cervicais, atendidas no Laboratório de Ensino e

Pesquisa em Análises Clínicas na cidade de Maringá-PR e detectaram 18 genótipos

diferentes. Pesquisadores chilenos utilizaram a mesma metodologia para detectar o

vírus HPV em 55 mulheres com alterações citológicas atendidas em uma policlínica

de Patologia Cervical do Hospital Hernan Henríquez Aravena. Eles identificaram 13

tipos distintos em 53 amostras positivas para HPV (Aedo et al., 2007).

28

1.5 - VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA

Estes vírus pertencem à família Retroviridae e são causadores da síndrome

da imunodeficiência adquirida (AIDS) (Gallo & Montagnier, 2003). Em 1981, foi

identificado o primeiro paciente com AIDS e, a partir deste período, essa doença

disseminou-se rapidamente tornando-se uma pandemia. A classificação do HIV é

baseada na sua distribuição geográfica, podendo ser classificado em dois tipos HIV-

1 e HIV-2, sendo ambos transmitidos da mesma forma (Gao et al., 1994). A

transmissão viral acontece através da exposição a células associadas ao vírus e por

partículas virais livres, através de seringas ou produtos com sangue contaminado,

via sexual, transmissão de mãe para o filho no útero, durante o nascimento ou na

amamentação (Levy, 1993). A grande variabilidade genética, altas taxas de mutação

e recombinação têm permitido uma classificação desses vírus em três grupos

relacionados como: grupo principal (M), grupo “outlier” (O) e um grupo distinto não-M

e não-O (N). O grupo M, que predomina na pandemia da AIDS, é subdividido em 9

linhagens diferentes chamados de subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J e K), e ainda

existem os sub-subtipos (A1, A2, A3, A4, F1, F2) e mais de 40 formas

recombinantes em circulação (Toni et al., 2005).

A carga viral é determinada pela quantidade de partículas virais (RNA viral) no

sangue, que é o maior indicador do estágio da doença. Durante uma infecção

primária, os níveis de RNA viral são altos e diminuem durante a fase assintomática.

Níveis elevados da replicação viral e o aumento da carga viral estão relacionados à

deteriorização rápida do sistema imune (Ministério da Saúde, Manual de Carga Viral

HIV-1, 2009).

A avaliação do estado imune do indivíduo é medida através da contagem de

células T CD4+. Um indivíduo normal apresenta um nível de células T CD4+ entre

800 e 1200/mm3 e quando o indivíduo apresenta um número de 200/mm3 ou menor,

sugere uma condição de imunodeficiência (Stoddart & Reyes, 2006).

1.5.1 - Características morfológicas e replicação do HIV

O HIV tem como material genético o ácido ribonucléico (RNA) de

aproximadamente 9kb e o seu genoma codifica nove ORF. Três sequências de

29

leitura aberta codificam os polipeptídeos Gag, Pol e Env, que são proteolisados em

outras proteínas comuns aos retrovírus. O polipeptídeo Gag é proteolisado em três

proteínas, MA (matriz, p17), CA (capsídeo, p24), NC (nucleocapsídeo, p6) e o Env

em duas proteínas, SU (superfície ou gp120) e TM (transmembrana ou gp41), que

são proteínas estruturais que fazem parte do capsídeo e da membrana de envelope

viral. O terceiro polipeptídeo, Pol é clivado em PR (protease), RT (transcriptase

reversa) e IN (integrase), estas possuem função enzimática e estão no interior do

capsídeo viral. Esse vírus codifica ainda outras seis proteínas, chamadas proteínas

acessórias Vif, Vpr, Nef e Vpu e proteínas que possuem a função regulatória dos

genes, Tat e Rev (Frankel & Young, 1998).

A etapa inicial da replicação do HIV ocorre pela interação de glicoproteínas

do envelope (gp120) com receptores da superfície celular (receptor CD4). Depois da

fusão do envelope viral com a membrana da célula hospedeira, os vírions (dentro da

célula) sofrem desnudamento. Após a entrada do vírus na célula, o RNA é

convertido, no citoplasma, em uma dupla fita de DNA complementar pela enzima

transcriptase reversa. O complexo da transcriptase reversa apenas é liberado no

citoplasma após o desnudamento do nucleocapsídeo. Este complexo consiste em

RNA genômico diplóide, RNAt, enzimas virais: transcriptase reversa e integrase,

proteína matriz, proteína do capsídeo, Vpr e proteínas do hospedeiro (Santos et al.,

2008).

Realizada a transcrição reversa, o complexo de pré-integração é formado,

possuindo: DNA dupla fita, integrase, proteína matriz, Vpr, transcriptase reversa e

proteína celular. O complexo de pré-integração precisa atravessar a membrana

nuclear pra haver a inserção do DNA viral no genoma das células hospedeiras.

Então, o DNA viral sofre uma compactação para atravessar o canal hidrofílico do

poro nuclear. Passando para o núcleo, DNA viral se integra ao genoma celular

através de uma outra enzima viral, a integrase, e então se torna um provírus. No

núcleo, três tipos de RNA viral são sintetizados pela RNA polimerase II da célula

utilizando o DNA proviral como modelo. O acido ribonucléico viral produzido sintetiza

os polipeptídeos Gag e Gag-Pol e, após sofrer splicing forma dois RNAs

subgenômicos, um deles codifica gp160 e as proteínas Vif, Vpr e Vpu e o outro

traduz as proteínas Tat, Rev e Nef. A quantidade de RNAs que sofrem ou não

splicing é regulada pelo gene Rev. Outros RNAs mensageiros, após vários splicing,

traduzem as proteínas regulatórias e acessórias. As proteínas de envelope (gp120 e

30

gp41) são produzidas pela proteólise de gp160. A p17 está associada com a

proteína Nef, ela fica aderida na superfície interior da membrana plasmática (Santos

et al., 2008).

Duas cópias do RNA viral, proteína p24, nucleoproteína p6, integrase,

transcriptase reversa, protease e Vpr formam o nucleocapsídeo. E então, partículas

virais imaturas e não infecciosas, já podem sair das células por brotamento. Durante

o processo de brotamento, o HIV pode incorporar no envelope distintas proteínas

presentes na membrana celular. Apenas no meio extracelular, após auto-ativação da

protease do precursor Gag-Pol, que ocorre a maturação viral, ou seja, as partículas

virais irão se tornar partículas infecciosas e, deste modo, podem infectar outras

células e reiniciar o ciclo de replicação (Santos et al., 2008).

1.5.2 - Diagnóstico laboratorial da infecção por HIV

Os primeiros diagnósticos da infecção por HIV foram realizados pelo teste

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), que detecta anticorpos contra o

HIV. No teste original utilizava-se um lisado viral e as amostras positivas eram

confirmadas pela técnica de Western Blot (padrão ouro). A segunda e a terceira

geração de ELISA utilizam proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos que

aumentam a especificidade e sensibilidade do teste, podendo detectar anticorpos

anti-HIV em um intervalo de tempo menor entre a infecção e a produção de

anticorpos contra o retrovírus (janela imunológica) (WHO, 2004).

Os testes confirmatórios para o diagnóstico de HIV são a Imunofluorescência

e o Western Blot (padrão ouro), que também detectam anticorpos anti-HIV no soro

dos pacientes e são os mais utilizados em função de suas especificidades. Os dois

testes são realizados após a detecção de amostras positivas pelo teste de ELISA

(Ministério da Saúde, 1997).

Com o avanço da tecnologia, uma variedade de testes rápidos para detecção

de anticorpos anti-HIV foram desenvolvidos apresentando resultado em

aproximadamente trinta minutos, permitindo análise de sangue, urina e saliva. Os

testes rápidos consistem em antígenos virais (lisado viral, peptídeos sintéticos,

proteínas recombinantes ou a combinação destes) fixados a um suporte sólido como

membrana de celulose, látex ou em cartelas plásticas, separados em embalagens

31

individuais permitindo a testagem individual das amostras. A vantagem que esses

testes apresentam é um sistema de revelação visual sem necessidade de utilizar

equipamentos laboratoriais para sua realização (Ministério da Saúde, 1997). Estes

testes vêm sendo utilizados para detecção do HIV facilitando o diagnóstico e

tratamento de doenças sexualmente transmissíveis e a prevenção de transmissão

de mãe para filho, principalmente em regiões onde o acesso a facilidades

laboratoriais são escassas (Ferreira et al., 2005; Hosaka et al., 2009).

Entretanto, esses testes rápidos apresentam especificidade e sensibilidade

inferiores aos dos testes imunoenzimáticos convencionais. O ideal é a utilização de

um teste rápido combinado com um teste confirmatório (Ministério da Saúde, 1997).

Existem técnicas laboratoriais que podem medir a carga viral de HIV, ou seja,

a quantidade de RNA viral presente no plasma sanguíneo de pacientes HIV

positivos. Para tanto, utiliza-se a técnica de amplificação NASBA-Nuclisens HIV-QT

(Biomérieux).

1.6 - RELAÇÃO ENTRE O VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA E

PAPILOMAVÍRUS HUMANO

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o papilomavírus humano (HPV)

são dois dos agentes causadores de doenças virais sexualmente transmissíveis

(DST). A alta prevalência da infecção por HPV entre mulheres soropositivas para

HIV é devida a fatores de riscos epidemiológicos comuns a doenças sexualmente

transmissíveis como idade sexual precoce, parceiros múltiplos, baixas condições

socioeconômicas e pouco uso de contraceptivos (Clarke & Chetty, 2002) .

As lesões geradas pelo HPV aparecem mais precocemente em mulheres

positivas para HIV do que em mulheres negativas para este vírus (Mougin et al.,

2001). Moscicki et al. (2004), em estudo com adolescentes infectadas pelo HPV,

positivas e negativas para HIV, observaram que jovens HIV negativas controlavam a

expressão do papilomavírus humano, neutralizando-o, em um período de tempo

bem menor do que as jovens HIV positivas.

Na população geral, a infecção por papilomavírus humano está associada à

co-fatores biológicos e ambientais comuns aos do HIV; entretanto, em mulheres que

são portadoras do HIV, o estado imunológico desempenha um fator adicional na

32

susceptibilidade à infecção (Palefsky, 2007). Muitos estudos apresentam resultados

controversos quanto à diminuição de lesões provocadas pelo HPV associada com a

terapia antiretroviral. Alguns trabalhos descrevem uma correlação inversa entre

manifestações clínicas causadas por HPV e a contagem de linfócitos CD4+ em

pacientes tratados com terapia antiretroviral, e outros não confirmam estes

resultados (Heard et al., 1998, Lillo et al., 2001, Heard et al., 2002).

Alguns estudos relatam a associação do vírus da imunodeficiência humana

tipo 1 com alguns tipos de HPV específicos. Estudos in vitro mostram que atividades

integradas do HIV-1 com o HPV-18 induzem à síntese da proteína de capsídeo L1

desse tipo viral e ainda, produtos de genes do HIV-1 são capazes de interagir com a

oncoproteína E6 do HPV-16, modificando o ciclo celular de células cervicais,

facilitando o acúmulo de mutações e aumentando, dessa forma, a susceptibilidade

de mulheres HIV positivas em desenvolver câncer cervical (Spinillo et al., 2001).

Sun et al., (1997) e Hillemanns et al., (1996) encontraram altos níveis de DNA

do papilomavírus humano (2 a 3 vezes mais) em amostras cervicais e prevalência

até 15 vezes superior em amostras de swabs anais em mulheres soropositivas para

o HIV-1 do que em mulheres soronegativas. Além disso, altos níveis de RNA de HIV-

1 foram encontrados no plasma de pacientes com infecção cervical ocasionada por

HPV oncogênicos (Luque et al., 1999).

A infecção latente causada pelo HPV pode ser ativada em indivíduos

transplantados com depressão do sistema imune, podendo progredir à neoplasia,

pois esses indivíduos são mais susceptíveis a infecções virais, como demonstrado

em alguns estudos com pacientes renais transplantados que eram 17 vezes mais

propensos a desenvolverem lesões por HPV do que os não transplantados (Tweddel

et al., 1994). Já foi relatado que mulheres HIV positivas têm o curso da infecção por

papilomavírus humano alterado, com um decréscimo das taxas de regressão da

doença e uma progressão rápida para altos níveis de lesões invasivas (Clarke &

Chetty, 2002).

Mulheres imunocompetentes apresentam uma frequência menor (2% a 2,5%)

de infecções múltiplas do que mulheres HIV positivas, que apresentam uma

frequência maior (42% a 52%), o que pode ser consequência de atividade sexual

sem proteção e demais fatores de risco que essa população apresenta (Levi et al.,

2004, Luque et al., 2006). Sun et al., (1995) descreveram a ocorrência de infecções

múltiplas por HPV com maior frequência em mulheres soropositivas do que em

33

mulheres soronegativas, relatando ainda a alta prevalência da doença cervical e a

infecção latente causada pelo papilomavírus humano em mulheres soropositivas. Na

região central do Brasil, a infecção por HPV foi detectada em 81,3% das mulheres

HIV positivas que apresentavam exames citológicos normais ou com alterações

benignas (Cerqueira et al., 2007). Estudos realizados com mulheres infectadas pelo

HIV na cidade de Santos em São Paulo, observaram que 45% dessas mulheres

apresentavam infecção por mais de dois tipos de HPV, confirmando alta frequência

de infecções múltiplas em brasileiras portadoras do HIV, assim como alta

diversidade de tipos e aparecimento de tipos raros (Levi et al., 2004).

1.7 – EPIDEMIOLOGIA DA CO-INFECÇÃO HPV-HIV

Os fatores de risco relacionados à infecção causada pelo papilomavírus

humano são: maior número de parceiros sexuais, início de atividade sexual precoce

e infecção por outras DSTs (Galloway, 2003). Outros possíveis co-fatores seriam:

deficiência nutricional e co-fatores ligados ao vírus como tipos virais e variantes

genéticas de vários tipos de HPV (Bosch et al., 1995).

Os fatores relacionados com a persistência e a evolução da lesão causada

pelo HPV são: uso de contraceptivos hormonais orais, paridade, aborto, tabagismo e

consumo de bebidas alcoólicas (Galloway, 2003).

A infecção por ambos os vírus, HPV e HIV, apresenta fatores de risco

similares por apresentarem a mesma forma de transmissão. Dentre eles, parceiros

sexuais múltiplos, idade precoce da primeira relação sexual, relação com parceiros

que tem parceiras sexuais múltiplas e ausência de contraceptivos. Um aumento na

incidência de lesão intraepitelial escamosa em pacientes HIV positivas vem sendo

relatado. Mulheres soropositivas para HIV apresentam lesões cervicais pré-invasivas

caracterizadas com progressão rápida, apresentando uma ocorrência alta dessas

lesões mesmo sob tratamento (Clarke & Chetty, 2002).

A média de idade em que as mulheres portadoras de HIV são infectadas pelo

vírus HPV é distinta nas diferentes populações do mundo, sendo que a maior

prevalência ocorre em mulheres jovens de 25 a 30 anos, havendo um declínio após

os 30 anos, e de modo geral, a probabilidade de se infectar por HPV diminui um

pouco em mulheres com mais de 40 anos (Hankins et al., 1999, Gonçalves et al.,

34

2008). Em mulheres HIV negativas que apresentam citologia normal, a prevalência

de HPV é alta em jovens com menos de 25 anos, diminuindo em mulheres maduras

(35 a 44 anos) e pode apresentar um pequeno aumento em indivíduos mais idosos

(acima de 55 anos) (Sanjosé et al., 2007). Na França, mais da metade (52,3%) das

mulheres HIV positivas sob tratamento antiretroviral, com média de idade de 33

anos, tem neoplasia intraepitelial cervical (NIC) de baixo ou de alto grau, e destas,

47,6% apresentam regressão espontânea. As pacientes que inicialmente

apresentavam NIC de alto grau (7,5%) tiveram uma regressão para NIC de baixo

grau e 34,1% apresentaram regressão total. Das que iniciaram com neoplasia de

baixo grau, 38,8% tiveram regressão total da lesão. Entretanto, 22,7% das NIC de

baixo grau tiveram uma progressão para NIC de alto grau (Heard et al., 2002).

Na região central do Brasil, um estudo com 159 pacientes de três hospitais

públicos do Distrito Federal mostrou que 73,6% das mulheres apresentavam lesões

do tipo NIC II, NIC III, carcinoma de célula escamosa e adenocarcinoma e 26,4%

apresentavam lesões NIC I, infecção sugestiva por HPV, células escamosas e

células glandulares atípicas de significância indeterminada (ASCUS e AGUS). Os

tipos de HPV mais frequentes nessa população foram HPV 16, 31 e 58 (alto risco),

sendo os tipos HPV 16 e 58 mais encontrados nas lesões de NIC I, HPV, ASCUS e

AGUS enquanto nas lesões de NIC II e III, carcinoma de célula escamosa e

adenocarcinoma, foram os tipos HPV16 e 31 (Camara et al., 2003). Outro estudo

com 150 brasileiras infectadas por HIV, na mesma região, encontrou uma frequência

maior dos tipos HPV 16 e 52, de alto risco e HPV 81, de baixo risco. Nas pacientes

que apresentaram alterações celulares benignas ou resultados normais, os

genótipos de HPV encontrados com maior frequência foram HPV 81 e 52 e os tipos

que apareceram em lesões com citologia alterada sugerindo infecção por HPV,

ASCUS e NIC I, II e III mais frequentes foram HPV 11, 39 e 70 (Cerqueira et al.,

2006). Pesquisadores estudando 623 mulheres da América do Sul, soronegativas

para HIV e com citologia normal, observaram a prevalência dos seguintes tipos de

HPV de alto risco: 16 (3,3%), 58 (1,4%) e 18 (1,2%) (Sanjosé et al., 2007).

A prevalência dos diferentes tipos de HPV em pessoas portadoras do HIV,

apresenta uma grande diversidade geográfica. Na Itália, mulheres HIV positivas com

média de idade de 29 anos apresentaram infecção prevalente pelos tipos de alto

risco HPV 33, 58 e 70 e de baixo risco HPV81 e, na África, jovens com menos de 25

anos eram infectadas mais frequentemente apenas por tipos HPV de alto risco 16,

35

18, 51 e 52 (Tornesello et al, 2007, Banura et al., 2008). Um estudo com uma

população de 1778 mulheres HIV positivas de diferentes regiões dos Estados

Unidos relatou maior prevalência dos tipos HPV 61 (7,9%), de baixo risco e 58

(7,1%), de alto risco (Palefsky et al., 1999).

No Brasil, a diversidade dos tipos de HPV que infectam a população feminina

HIV positiva não é muito diferente da população mundial. Em São Paulo, os tipos

mais frequentes são HPV 16 e 52, de alto risco (Levi et al., 2002, Levi et al., 2004).

Na Bahia também predominam os tipos HPV 16 e 52; entretanto, aparecem outros

tipos de alto risco como HPV 33, 51, 53 e 58 (Queiroz et al., 2004).

1.8 - PREVENÇÃO E TRATAMENTO

Por se tratar de um vírus transmitido por via sexual, um método primário de

prevenção é a utilização de preservativos durante a relação sexual (INCA, 2008). A

detecção precoce de lesões precursoras do câncer de colo uterino provocadas pelo

papilomavírus humano é uma das principais formas de prevenção secundária e

controle da incidência e mortalidade por câncer cervical invasivo. O exame citológico

de Papanicolaou, realizado periodicamente, é amplamente utilizado como método

preventivo na maioria dos países (Health Protection Agency, 2009).

Outros métodos de prevenção acessíveis têm surgido nesses últimos anos,

como métodos moleculares que detectam infecção por genótipos oncogênicos de

HPV e as vacinas contra alguns tipos de HPV (Wheeler et al., 2009).

Com relação ao tratamento da infecção por HPV, não existe nenhum fármaco

específico atuando contra o vírus, ou seja, não existem antivirais para o

papilomavírus humano como existem para o HIV. A forma de tratamento utilizada

consiste na destruição das células infectadas por processos físicos, químicos ou

cirúrgicos. As terapias cirúrgicas consistem na excisão da zona de transformação,

conização com alça diatérmica, cauterização a laser e eletrocauterização. A escolha

do método cirúrgico depende do tamanho e da distribuição da lesão (Derchain et al.,

2005, Rogazy, 2007).

A crioterapia é um tratamento de processo físico que consiste no

congelamento direto da lesão com crio-sondas geradas por um fino spray de

36

nitrogênio líquido, produzindo necrose epidérmica e dérmica. Esta terapia é muito

utilizada na excisão de condilomas (Rogazy, 2007).

As terapias químicas comumente utilizadas são podofilina, imiquimod e ácido

tricloroacético. A podofilina é uma base forte e apresenta efeito antimitótico. Ela é

utilizada como pomada e, por sua característica química, provoca necrose das

lesões. Imiquimod é um análogo de nucleotídeos, também aplicado de forma tópica

e atua como modificador da resposta imune, induzindo à produção de α-interferon e

do fator de necrose tumoral (TNF-α). O ácido tricloroacético é utilizado juntamente

com o ácido bicloroacético atuando como agentes cáusticos que destroem as

verrugas por coagulação química das proteínas e destruição direta das células

infectadas (Rogazy, 2007).

1.9 - VACINAS

Atualmente, estão sendo produzidas vacinas profiláticas capazes de induzir

anticorpos genótipo-específicos contra o vírus em questão. Duas vacinas foram

desenvolvidas e estão sendo utilizadas em muitos países. Ambas são preparadas

com partículas semelhantes a vírus (VLP), produzidas por tecnologia recombinante,

administradas por via intramuscular e aplicadas em um esquema de três doses,

sendo a segunda dose aplicada após um ou dois meses da primeira dose e a

terceira após 6 meses da dose inicial.

Uma das vacinas é quadrivalente (Merck), foi a primeira a ser aprovada nos

Estados Unidos e na Europa e é denominada Gardasil. A vacina contém VLP L1 dos

tipos HPV-6, HPV-11, HPV-16 e HPV-18, com 20, 40, 40 e 20µg da proteína L1 de

cada tipo, respectivamente. A proteína de capsídeo L1 é produzida por

Saccaromyces cerevisiae recombinante e esta vacina é administrada com o

adjuvante sulfato hidroxifosfato de alumínio (Lepique et al., 2009). A outra vacina é

bivalente, denominada Cervarix (GSK) e contém VLP L1 de dois tipos HPV-16 e

HPV-18, com 20 µg da proteína L1 de cada tipo. A Cervarix é administrada com o

adjuvante AS04, uma mistura de hidróxido de alumínio e um imunoestimulante

lipídeo monofosforil A. As células do baculovírus Trichoplusnia ni são vetores que

expressam a proteína L1 desta vacina. As VLP estimulam a resposta imune humoral

37

no hospedeiro, resultando em altos títulos de anticorpos neutralizantes (WHO, 2007,

Tovar et al., 2008, Satyaprakash et al., 2009).

A Gardasil está sendo implementada em vários países do mundo, e está em

uso em alguns países em desenvolvimento como Brasil, Chile, México e Peru

(Lepique et al., 2009). No Brasil, foi licenciada no ano de 2006 pela ANVISA. Ela foi

aprovada tanto na Europa, Brasil e Estados Unidos para mulheres na faixa etária de

9 a 26 anos, mas pode ser recomendada para mulheres com idade superior

(Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2006). Os grupos alvo recomendados

para vacinação são crianças e jovens que não iniciaram a atividade sexual e que

não tenham tido contato com o HPV (WHO, 2007). Em mulheres que não

apresentam sorologia ou evidência do DNA de HPV dos tipos 16 e 18, a vacina

quadrivalente apresentou eficácia de 100% na prevenção de NIC II e III. Esta

mesma vacina foi também eficaz na prevenção de verrugas genitais (Palefsky,

2007).

Outras vacinas, tanto profiláticas como terapêuticas, estão sendo

desenvolvidas. Ensaios clínicos vêm sendo realizados com vacinas que possuem

um número maior de VLP de tipos de HPV oncogênicos, como uma vacina

octovalente que protege contra a infecção por mais outros quatro tipos diferentes.

Outros ensaios analisam a possibilidade de imunização profilática através da menor

proteína de capsídeo L2, incorporando-a nas VLP junto com a proteína L1. Embora

a proteína L2 seja localizada no interior do capsídeo, uma pequena porção dela fica

exposta na superfície do capsídeo, sendo acessível aos anticorpos (Satyaprakash et

al., 2009).

Vacinas terapêuticas experimentais têm apresentado uma redução na

incidência de câncer cervical atuando nos estágios precoces e/ou tardios da

infecção. Os genes precoces E6 e E7, que são expressos nos tecidos pré-malignos

e malignos são os alvos ideais para as vacinas terapêuticas. A utilização de

peptídeos como o lipopeptídeo E7 do HPV-16 vem sendo analisada como outro

possível alvo em ensaios clínicos de vacinas terapêuticas. Este antígeno tem

demonstrado resposta imune celular em pacientes com câncer cervical avançado,

entretanto ainda não existem dados de sucesso clínico desta vacina (Satyaprakash

et al., 2009).

Com a grande heterogeneidade dos tipos de HPV, detectados nas infecções

cervicais, o desenvolvimento de novas vacinas profiláticas pode conferir proteção

38

cruzada contra muitos tipos de HPV, protegendo contra diversos tipos em apenas

uma vacina, prevenindo a infecção por diferentes tipos prevalentes nas diferentes

regiões geográficas (Tornesello et al., 2007).

2- OBJETIVOS

2.1 - GERAL

Estudar a relação dos aspectos virológicos e epidemiológicos entre as

mulheres HIV positivas e negativas e os diferentes genótipos de HPV.

2.2 – ESPECÍFICOS

Implantar a técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

para diagnóstico virológico no Laboratório de Virologia da Universidade Federal

Fluminense (UFF).

Detectar tipos de papilomavírus humanos em mulheres infectadas pelo vírus

da imunodeficiência humana pela técnica de PCR-RFLP.

Investigar a associação entre os tipos de HPV de alto e baixo risco para

câncer cervical com alterações citológicas cervicais, estado imune, fatores

demográficos e fatores de risco para o câncer cervical.

3- MATERIAL E MÉTODOS

3.1 - DESENHO DO ESTUDO Trata-se de um estudo epidemiológico transversal.

3.2 - POPULAÇÃO ESTUDADA

As amostras cervicais são de 140 pacientes, soropositivas para o vírus da

imunodeficiência humana, atendidas no Serviço de Patologia Cervical do Hospital

dos Servidores do Estado (HSE), Rio de Janeiro, Brasil, para a realização de

exames cervicais preventivos de rotina e foram coletadas no período de 2003 a

2005.

3.3 - CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E DE EXCLUSÃO

3.3.1 – INCLUSÃO

Os pacientes selecionados para este estudo eram do sexo feminino,

portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV), submetidas rotineiramente a

exames preventivos.

41

3.3.2 – EXCLUSÃO

As pacientes que não possuíam o resultado de citologia foram excluídas

deste estudo.

3.4 - COLETA DE DADOS

Um questionário foi aplicado às pacientes incluindo fatores demográficos,

comportamento sexual, história reprodutiva, idade, cor, estado civil, tabagismo, uso

de drogas, álcool, doenças sexualmente transmissíveis (DST), número de parceiros

e história familiar. As pacientes deram consentimento por escrito, sendo o projeto

aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da UFF sob o número

149/03.

3.5 - CLASSIFICAÇÃO DAS LESÕES

Os laudos citológicos foram baseados no sistema de Bethesda (2001). As

lesões foram classificadas como Normal, ASCUS (células escamosas atípicas de

significado indeterminado), infecção por HPV, lesão intraepitelial de baixo grau

(LSIL- NIC I), lesão intraepitelial de alto grau (HSIL- NIC II e III).

3.6 - PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

As amostras foram coletadas da cérvice uterina e colocadas em tubos com

tampão Tris-EDTA (Tris 10mM pH7,4; EDTA 0,5M pH8,0). Elas foram estocadas à

temperatura de -20ºC para posterior realização dos experimentos.

42

3.7 – DADOS LABORATORIAIS OBTIDOS DAS PACIENTES HIV POSITIVAS

3.7.1 - Contagem de Células CD4

A contagem de linfócitos T CD4+ foi realizada por citometria de fluxo de

acordo com protocolos padronizados. Os testes foram feitos em laboratório

participante do Programa Nacional de DST e AIDS (Ministério da Saúde, 2009).

3.7.2 - Determinação da Carga Viral

Os níveis de RNA do HIV-1 no plasma foram medidos em laboratórios de

virologia com certificado de segurança de qualidade de acordo com o mesmo

Programa, utilizando-se a técnica de amplificação baseada na sequência dos ácidos

nucléicos (NASBA-Nuclisens HIV-QT, Biomérieux), com sensibilidade mínima de

detecção de 80 cópias/ml de sangue (Ministério da Saúde, 2009).

3.8 - DETECÇÃO DE HPV

3.8.1 - Extração de DNA (extração por fenol-clorofórmio)

A extração de DNA das amostras utilizadas nos experimentos foi realizada

pelo método de fenol-clorofórmio. Amostras de esfregaços do material cervical foram

transferidas para eppendorfs novos com 200µL de tampão TE. Mais 700µL do

tampão TE (10mM Tris-HCl pH 7,4; EDTA 0,5M pH8,0) foram adicionados em cada

tubo eppendorf contendo a amostra. A seguir foram colocados em cada tubo 50µL

de Tween 20 (0,5%) e 50µL de enzima Proteinase K Invitrogen® (2mg/ml de

concentração final). Os tubos eppendorfs foram invertidos uma vez e as amostras

foram levadas ao banho-maria a uma temperatura de 56ºC por aproximadamente 2

horas. As amostras foram tratadas com 1mL de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico

(25:24:1), agitadas por 5 minutos e centrifugadas a 5000-10000rpm por 7 minutos

43

para precipitação de proteínas. A fase aquosa foi transferida (aproximadamente

500µL) para um tubo novo e a operação foi repetida até obter-se uma fase aquosa

limpa.

Para precipitar o DNA foi adicionado ao sobrenadante, um volume de 1/10 do

acetato de sódio 3M pH 6,0 e 2,5 volumes de etanol absoluto Merck, ou seja, para

cada 500µl da amostra de DNA, foi adicionado 50µl de acetato e 2ml de etanol. As

amostras foram homogeneizadas e deixadas a -20ºC overnight. Depois foram

centrifugadas a 140000rpm por 30 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi removido e o

sedimento foi lavado com 1mL de etanol 70% gelado para retirar o sal. Os tubos

foram centrifugados a 140000rpm durante 5 a 15 minutos a 4ºC sendo o

sobrenadante descartado. A reação foi seca para retirada do etanol, os tubos

eppendorfs foram vertidos em papel absorvente, deixando escorrer todo o etanol.

Este processo foi realizado dentro da capela. O sedimento, então, foi suspenso em

50µL de água destilada estéril, homogeneizado e estocado a -20ºC.

3.8.2 - Amplificação de HPV por reação em cadeia da polimerase (PCR)

Para amplificação do DNA do HPV foram utilizados os oligonucleotídeos

iniciadores genéricos My11 – 5’ GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG 3’ e My09 – 5’

CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC 3’, onde M= A + C, R= A + G, W= A + T, Y= C +

T. Esses oligonucleotídeos amplificam a região L1 do HPV, que corresponde a 450

pares de base (Manos et al., 1989). Para a realização das reações foram usados

5µL das amostras de DNA extraído, uma solução (5µl para cada amostra) de tampão

concentrado 1x (10 mM Tris-HCl pH 8,0 , 1mM de EDTA, 10mM de NaCl

Invitrogen®), solução de dNTP Invitrogen® contendo os quatro desoxinucleotídeos

trifosfato, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxicitidina, desoxiguanosina (40µM

cada dNTP, 1µl da solução por amostra), oligonucleotídeos genéricos My11/My09

(1pM cada e 1µl de cada por amostra), 2,5 unidades (0,5µl em cada amostra) de Taq

polimerase Invitrogen® e 4µL de cloreto de magnésio Invitrogen®. O controle

negativo continha somente água deionizada (5µl), sem DNA. A reação, com volume

total de 50µl, foi amplificada em termociclador DNA Thermal Cycler, Perkin Elmer

Cettus (Applied System) com desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguida de

44

35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 55ºC por 2 minutos, 72ºC por 2 minutos e um

período final de extensão a 72ºC por 10 minutos.

3.8.2.1 - Análise do produto amplificado (“amplicons”)

Os produtos da amplificação, com tamanho aproximado de 450 pares de base

(pb), foram submetidos à eletroforese de 80 volts por aproximadamente 1 hora em

gel de agarose 1,5% Invitrogen® utilizando-se uma cuba horizontal em tampão Tris-

base, ácido bórico e EDTA 0,5M pH 8,0 (TBE 0,5X pH 8,3). Em cada poço foram

aplicados 10µL do “amplicon” e 2µL do corante azul de bromofenol (Azul de

Bromofenol, Xileno Cianol, Glicerol 30%). Como referência para o tamanho do

“amplicon” foi utilizado um marcador padrão de peso molecular (Ladder) de 50pb

Invitrogen®. O gel foi corado com solução de brometo de etídio durante 15 minutos e

posteriormente lavado com água durante 5 minutos. Os “amplicons” foram

visualizados em transiluminador de luz ultravioleta. As amostras que apresentaram

bandas com tamanho de 450pb foram consideradas positivas.

3.8.3 – Implementação da técnica de Polimorfismo dos fragmentos obtidos

por enzimas de restrição

Inicialmente, a reação de digestão das amostras, amplificadas por PCR, com

as seis enzimas de restrição (BamHI, DdeI, HaeIII, HinfI, PstI e RsaI) foi realizada à

temperatura de 370C por 1 hora (Bernard et al., 1994). Após esse período, a reação

foi interrompida pela inativação das enzimas à temperatura de 970C durante 5

minutos no termociclador. Os produtos gerados (10µL para cada enzima) foram

adicionados a 30µL de corante em cada eppendorf e 20µL foram aplicados em um

gel de poliacrilamida 8% Invitrogen®, sendo o restante armazenado a 40C. Um

padrão de peso molecular de 100pb (3µL) foi aplicado no gel (Bernard et al., 1994).

Os produtos foram submetidos à eletroforese de 100V por cerca de 2 horas

utilizando-se uma cuba vertical. A visualização do gel foi realizada por coloração

pela prata. O gel foi fixado em ácido acético 7,5% por 10 minutos, lavado com água

deionizada 3X, durante 5 minutos cada, corado por prata em 3 minutos em 10%

etanol, 3 minutos em 1% de ácido nítrico, 10 a 60 minutos em solução de

45

impregnação (0,15g de nitrato de prata e 150µL de formolaldeído em 100ml de

água). Em seguida foi lavado com água deionizada 1X por 20 segundos, revelado

em 3g de carbonato de sódio, 150µL de formaldeído e 40µg de tiossulfato de sódio

em 100ml de água e fixados em ácido acético 7,5% durante trinta segundos a 5

minutos aproximadamente. Todos os reagentes foram preparados em água mili-Q,

água duplamente deionizada.

A leitura do gel foi realizada da seguinte maneira: primeiro foram identificados

os números de bandas e, posteriormente, foram identificados os tamanhos dos

fragmentos gerados por enzima, comparando-se o resultado com os padrões de

restrição de cada tipo apresentado no Anexo 8.1, p. 90.

A metodologia utilizada em seguida foi alterada: o tempo de incubação das

amostras com as endonucleases foi realizado a 370C por 4 horas. Os 10µL dos

produtos gerados foram adicionados a 3µL de corante em cada eppendorf e foram

aplicados em um gel de agarose 1,5% Invitrogen®. Um padrão de peso molecular de

50pb também foi aplicado no gel. Os produtos da digestão foram submetidos à

eletroforese (120V) por aproximadamente duas horas, utilizando-se uma cuba

horizontal. O gel foi corado com solução de brometo de etídio por 15 minutos e

lavado com água por 5 minutos. Os padrões de restrição foram visualizados em

transiluminador de luz ultravioleta. Posteriormente, uma outra alteração na

metodologia foi feita no tempo de incubação das amostras com as enzimas, sendo

realizado durante duas horas (Kado et al., 2001).

Após a padronização da metodologia, foi realizada a definição dos padrões de

identificação dos tipos de HPV. Um plasmídio contendo DNA de HPV conhecido

(HPV-16) e DNA celular de Caski (40pg) com cerca de 50 cópias de DNA integrado

foram amplificados por PCR e posteriormente incubados com as enzimas de

restrição, sendo utilizado como controle positivo para a identificação. Os fragmentos

obtidos foram visualizados no gel de agarose 1,5% e a identificação do tipo de HPV-

16 foi realizada, finalizando a padronização da técnica.

3.8.4 - Tipificação de HPV

Todas as amostras que se apresentaram positivas na amplificação por PCR

de DNA do HPV foram analisadas pela técnica de RFLP. Uma alíquota de 3µL dos

46

produtos do PCR do gene L1 (DNA das amostras) foi usada para digestão com 2

unidades das endonucleases de restrição BamHI, DdeI, HaeIII, HinfI, PstI e RsaI

(10U/µL-2µL) Invitrogen® e colocada em tubos eppendorfs separadamente. Para a

realização da digestão enzimática foram adicionados à reação 1µL de tampão

correspondente a cada enzima e 4µL de tampão TE (Tris 0,5M pH7,4; EDTA 0,5M

pH8,0), em volume total de 10µL para cada tubo eppendorf. A reação foi incubada a

37ºC por 2 horas (Bernard et al., 1994, Kado et al., 2001). O volume total da amostra

adicionados a 3µL de corante xilenocianol-azul de bromofenol foram aplicados no

gel de agarose 1,5% Invitrogen® e o mesmo padrão de peso molecular (50pb)

descrito anteriormente também foi aplicado. Os produtos dessa digestão foram

submetidos à eletroforese (120V por aproximadamente 2 horas) utilizando-se uma

cuba horizontal. O gel foi corado com solução de brometo de etídio durante 15

minutos e lavado com água durante 5 minutos. Os fragmentos gerados pela digestão

foram visualizados em transiluminador de luz ultravioleta (Bernard et al., 1994). As

amostras foram identificadas e tipificadas. Aquelas que apresentaram infecção por

mais de um tipo de HPV foram classificadas como alto risco se apresentassem pelo

menos um tipo de alto risco. As amostras que apresentaram infecção apenas por

tipos de baixo risco foram classificadas como baixo risco.

3.9 - ANÁLISE ESTATÍSTICA

Um banco de dados com as variáveis estudadas foi gerado para compilação e

análise dos resultados no programa EPIINFO, versão 3.5.1, 2008, CDC. A análise

estatística dos dados foi realizada pelo teste Qui-quadrado, com 95% de intervalo de

confiança (IC) e até 5% de grau de significância (p≤ 0,05).

4 – RESULTADOS

4.1 – PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE POLIMORFISMO DOS

FRAGMENTOS OBTIDOS POR ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

O estabelecimento desta técnica no laboratório foi bem sucedida após a

padronização do sistema de visualização e do tempo de atuação das enzimas sobre

os produtos amplificados. O gel de poliacrilamida a 8% foi substituído por gel de

agarose a 1,5%, melhorando a leitura dos resultados. Após testarmos diferentes

intervalos de tempo, verificamos que duas horas foi o período ideal para a clivagem

total do DNA amplificado por todas endonucleases (Figuras 4, 5 e 6). Para confirmar

a identificação dos tipos, foi testado um plasmídeo contendo DNA do HPV 16,

finalizando a padronização da técnica (Figura 7).

48

Figura 4- Bandas correspondentes a 100pb, 200pb, 300pb, 400pb. B=BamHI, D=DdeI, Ha=HaeIII, Hi=HinfI, P=PstI, R=RsaI, L=Ladder (100pb). Gel de poliacrilamida 8%, identificação do HPV 58. A enzima RsaI não apresentou clivagem correspondente ao tipo identificado e as bandas do padrão de peso molecular estão disformes.

Figura 5- L=Ladder (50bp), B=BamHI, D=DdeI, Ha=HaeIII, Hi=HinfI, P=PstI, R=RsaI. Gel de agarose 1,5%, amostra identificada como HPV 16, infecção simples.

49

Figura 6- L=Ladder (50bp), B=BamHI, D=DdeI, Ha=HaeIII, Hi=HinfI, P=PstI, R=RsaI. Gel de agarose 1,5%, amostra identificada como HPV 16, 42 e 53, infecção múltipla.

Figura 7- L=Ladder (50bp), B=BamHI, D=DdeI, Ha=HaeIII, Hi=HinfI, P=PstI,

R=RsaI. Gel de agarose 1,5%, plasmídeo de HPV 16, as linhas envolta das bandas indicam os fragmentos correspondentes ao HPV 16.

50

4.2 - CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO DE ESTUDO

As pacientes estudadas pertenciam a uma faixa etária variando de 14 a 59

anos, com média de 32,2 anos de idade. Entre as mulheres analisadas, 41,4% eram

jovens, tinham idade inferior a 30 anos. Mais da metade (56,8%) tinha completado o

ensino fundamental e cursaram mais anos de estudo enquanto as demais 43,2%

não tinham completado o ensino fundamental. Apresentavam uma baixa condição

econômica, sendo 79% desempregadas ou com renda mensal de até dois salários

mínimos. Do total de mulheres participantes, 52,1% eram casadas, tinham um

companheiro ou eram viúvas e 47,9% eram solteiras ou separadas. Quanto à etnia,

51,4% das mulheres se declararam não brancas e 48,6% se consideraram brancas.

Em relação à paridade, 64,3% das mulheres tinham mais de um filho e 35,7%

tinham apenas um filho ou não tinham filhos (Tabela 1).

Os resultados citológicos mostraram que 57,1% das mulheres exibiam

citologia normal ou inflamatória e 42,9% apresentaram alterações citológicas (HPV,

LSIL e HSIL, ASCUS, AGUS) (Tabela 1). Nesta população, não foram encontrados

casos de câncer cervical.

Mais da metade (56,4%) das mulheres tinham conhecimento do diagnóstico

de soropositividade por HIV há menos de 4 anos. Entre as pacientes participantes

do estudo, 68 (48,6%) apresentaram carga viral detectável e 71 (50,7%) não tinham

presença de RNA viral no sangue. Em relação ao estado imune, 92,1% das

pacientes tinham mais do que 200 células CD4/mm3 e 47,1% tinham menos do que

350 células CD4/mm3. A maioria (98,6%) das mulheres estava sob tratamento

antiretroviral (Tabela 2).

Todas as pacientes tinham vida sexual ativa, 92% delas tinham história de

relação sexual com mais de um parceiro e setenta por cento tiveram o início da vida

sexual antes dos 17 anos de idade (Tabela 2). Entre as participantes, 49,3%

sofreram pelo menos um aborto. De todas as pacientes estudadas, 26,6%

consumiam bebidas alcoólicas, 26,4% eram fumantes e 11,7% eram usuárias de

drogas ilícitas. Além da co-infecção por HIV e HPV, em 63,5% das pacientes foram

observadas lesões genitais provocadas pelo vírus herpes (no momento da coleta)

(Tabela 2).

51

Tabela 1 – Perfil sociodemográfico e citologia cervical de mulheres infectadas por HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

Tabela 2 – Resultados associados à infecção por HIV e fatores de risco para infecção por HPV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

Variáveis N (%)

Tempo de diagnóstico de HIV ≤ 4 anos 79(56,4) >4 anos 61(43,6) Terapia antiretroviral Sim 138(98,6) Não 2(1,4) Contagem CD4/ mm3 0-200 11(7,9) 201-349 74(47,1) 350-500 107(76,4) ≥ 501 33(23,6) Carga Viral

Não detectável 71(50,7) ≥ 80 cópias/ml 68(48,6)

Número de parceiros 0-1 11(8,0)

Variáveis N (%)

Idade ≤ 30 anos 58(41,4) >30 anos 82(58,6) Nível de escolaridade Ensino fundamental completo e mais anos de estudo

79(56,8)

Ensino fundamental incompleto 60(43,2) Renda familiar

>2 salários mínimos 25(21,0) 0-1 salário mínimo 94(79,0)

Estado Civil Casada, com companheiro ou viúva

73(52,1)

Solteira ou Separada 67(47,9) Etnia Brancas 68(48,6) Não brancas 72(51,4) Paridade 0-1 filho 61(35,7)

> 1 filho 79(64,3) Citologia

Normal, inflamatório 80(57,1) HPV, LSIL e HSIL, ASCUS, AGUS

60(42,9)

52

>1 126(92,0) Sexarca <17 anos 98(70,0)

≥18 anos 42(30,0) Aborto Sim 69(49,3) Não 71(50,7) Tabagismo

Sim 37(26,4) Não 103(73,6)

Uso de drogas Sim 16(11,7) Não 121(88,3)

Consumo de bebidas alcoólicas Sim 37(26,6) Não 102(73,4)

Herpes* Sim 33(63,5) Não 19(36,5)

*Lesões genitais herpéticas. O percentual está relacionado ao total de outras DSTs, além

de HPV e HIV.

4.3 - FREQUÊNCIA DOS TIPOS DE HPV DETECTADOS POR RFLP

Das 140 amostras analisadas, 83 (60,0%) apresentaram positividade para o

vírus HPV (Figura 8). Entre os 24 genótipos detectados pela técnica de RFLP, foram

identificados 9 tipos de HPV de baixo risco e 14 tipos de alto risco para o câncer

cervical (Figura 9).

Quando analisamos a distribuição dos tipos de HPV na população estudada

observamos uma maior prevalência dos tipos HPV 16 (16,4%), HPV 58 (7,5%) e

HPV 53 (6,8%) do total de tipos diferentes de HPV detectados. Na época do estudo,

o tipo LVX100 ainda não tinha sido classificado quanto ao risco para lesões

malignas. Não foi possível tipificar 2 (2,1%) amostras dessas pacientes (Figura 9).

O genótipo de baixo risco mais frequente na população foi HPV 71(CP8061)

(5,5%) (Figura 9). Os tipos que apresentaram uma menor frequência (0,7%) foram

os de alto risco HPV 69, 39, 51, e os de baixo risco HPV 40, 44, 81(CP8304). O tipo

ainda não classificado LVX100 também apresentou a frequência de 0,7%. Os tipos

42, 32, 56, 35, 44, 81, LVX100 foram encontrados apenas em casos de infecções

múltiplas.

53

As frequências dos tipos de HPV de alto e baixo risco na população indicaram

que 66 (47,1%) mulheres apresentaram infecção por pelo menos um tipo de HPV de

alto risco (Figura 8 e Tabela 3) e 15 (10,7%) apresentaram infecção apenas por tipos

de baixo risco (Figura 8 e Tabela 4).

Uma prevalência de 28 (20,0%) casos de infecção por mais de um tipo de

HPV foi encontrada na população (Tabela 5), sendo 27 casos com infecção por dois

tipos diferentes e somente um caso com infecção por três tipos. Em todos os casos

de infecções múltiplas detectados, pelo menos um tipo de HPV era de alto risco

(Figura 8).

Figura 8 – Infecção por HPV nas 140 amostras cervicais das pacientes infectadas por HIV.

57 HPV-83 HPV+ 2 não tipificadas

140

15 Baixo Risco

81 tipificadas

66 (pelo menos 1 tipo Alto Risco)

38 inf. simples 28 inf. múltiplas

27 com 2 tipos virais 1 com 3 tipos virais

57 HPV-83 HPV+ 2 não tipificadas

140

15 Baixo Risco

81 tipificadas

66 (pelo menos 1 tipo Alto Risco)

38 inf. simples 28 inf. múltiplas

27 com 2 tipos virais 1 com 3 tipos virais

57 HPV-83 HPV+ 2 não tipificadas

140140

15 Baixo Risco15 Baixo Risco

81 tipificadas

66 (pelo menos 1 tipo Alto Risco)66 (pelo menos 1 tipo Alto Risco)

38 inf. simples 28 inf. múltiplas

27 com 2 tipos virais 1 com 3 tipos virais

54

Figura 9 – Distribuição da frequência dos genótipos de HPV nas mulheres

positivas para HIV.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

16

58

53

67

52

71

31 6

56

61

18

32

33

45

42

11

35

40

44

69

39

51

LVX100

81

Fre

qu

ên

cia

(%

)

Genótipos de HPV

S/ ban

das

Alto risco

Baixo risco

Não classificado

Sem resultado

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

16

58

53

67

52

71

31 6

56

61

18

32

33

45

42

11

35

40

44

69

39

51

LVX100

81

Fre

qu

ên

cia

(%

)

Genótipos de HPV

S/ ban

das

Alto risco

Baixo risco

Não classificado

Sem resultado

Tabela 3 – Frequência de infecções por tipos de HPV de alto risco em

mulheres portadoras de HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

HPV No de amostras

Frequência (%)

Alto Risco 66 47,1

Negativo, baixo risco ou indeterminado

74 52,9

Total 140 100

55

Tabela 4 – Frequência das mulheres soropositivas para HIV que apresentaram infecção por tipos de HPV de baixo risco. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

HPV No de amostras

Frequência (%)

Baixo Risco 15 10,7

Negativo ou não tipificado 56 40,0

Alto risco ou não classificado

69 49,3

Total 140 100

Tabela 5 – Frequência de infecções simples e múltiplas em mulheres

infectadas por HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

Infecção No de amostras

Frequência (%)

Simples 56 40,0

Múltipla 28 20,0

Total 84 60,0

4.4 - FATORES DEMOGRÁFICOS, DE RISCO E CARGA VIRAL

RELACIONADOS COM A INFECÇÃO POR HPV

Em estudos anteriores com a mesma população, uma associação positiva foi

observada entre a infecção por HPV e o tempo de conhecimento do diagnóstico de

infecção por HIV inferior a 4 anos (OR=2,69; IC 95%, 1,26-5,75, p=0,004); idade da

primeira relação sexual (≤17 anos), (OR=2,49; IC 95%, 1,19-5,23; p=0,01); pacientes

jovens (≤30 anos), (OR=3,14; IC 95%, 1,49-6,59; p=0,02); brancas (OR=2,04; IC

95%, 1,01-4,00; p=0,03) e entre mulheres que consumiam bebidas alcoólicas

(OR=2,13; IC 95%, 0,93-4,86; p=0,05) (Oliveira et al., 2008).

Dando continuidade ao trabalho anterior, neste estudo observamos uma

associação positiva entre mulheres que conheciam o diagnóstico positivo para HIV

há menos de quatro anos e infecção por HPV de alto risco (OR 3,33; IC 95%, 1,61-

6,66; p=0,001). Podemos observar que também houve uma relação positiva entre

mulheres brancas (p=0,004) e jovens (≤30 anos) (p=0,02) infectadas por tipos

oncogênicos de HPV (Tabela 6). Entretanto, a associação entre estas variáveis

(diagnóstico recente de HIV, etnia branca e idade abaixo de 30 anos) não foi

56

observada quanto à infecção por tipos de HPV de baixo risco (Tabela 7). Nenhum

dos fatores analisados foi associado à infecção múltipla por HPV (Tabela 8).

Também foi observada uma associação positiva entre mulheres infectadas por tipos

de HPV de alto risco e que relataram ter se relacionado com um maior número de

parceiros sexuais e que tinham mais de um filho (p=0,06) (Tabela 6). A mesma

relação não foi observada quando essas mulheres eram infectadas por tipos de

baixo risco ou apresentaram infecção por múltiplos genótipos (Tabelas 7 e 8).

Em relação ao início da atividade sexual foi observada uma relação positiva

entre mulheres que eram infectadas por tipos de baixo risco (OR 4,39; IC 95%, 0,90-

21,34; p=0,06) (Tabela 7). Não houve associação significativa quando relacionamos

a mesma variável com pacientes infectadas por tipos de alto risco (Tabela 6) e por

genótipos múltiplos de HPV (Tabela 8).

Estado civil, nível de escolaridade, renda familiar, tabagismo, uso de drogas e

bebidas alcoólicas, assim como carga viral de HIV não foram fatores de risco para

infecções por HPV de alto ou baixo risco ou casos de infecções múltiplas (Tabelas 6,

7 e 8). Na análise da relação entre mulheres com presença de lesões provocadas

pelo vírus herpes e infecção por tipos de HPV de baixo ou alto risco, nenhuma

associação foi observada, bem como quando as mulheres apresentavam infecção

múltipla (Tabelas 6, 7 e 8).

Não houve significância estatística entre infecção por tipos oncogênicos de

HPV, infecção por genótipos múltiplos ou por HPV de baixo risco e mulheres que

relataram aborto (Tabelas 6, 7 e 8).

57

Tabela 6 – Infecção de HPV de alto risco relacionada com fatores de risco, demográficos e carga viral em mulheres soropositivas para HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

HPV* : HPV negativo, de baixo risco ou indeterminado.

Variáveis

HPV de alto risco No (%)

HPV* No (%)

OR (95 % IC) P valor

Tempo de diagnóstico de HIV 3,33(1,61-6,66) 0,001 ≤ 4 anos 47(71,2) 32(43,2) >4 anos 19(28,8) 42(56,8) Etnia 2,85(1,43-5,67) 0,004 Brancas 41(62,1) 27(36,5) Não-brancas 25(37,9) 47(63,5) Idade 2,21(1,11-4,39) 0,02 ≤ 30 anos 34(51,5) 24(32,4) > 30 anos 32(48,5) 50(67,6) Número de parceiros sexuais 4,35(0,90-20,98) 0,06 >1 62(96,9) 64(87,7) 0-1 2(3,1) 9(12,3) Paridade 1,97(0,99-3,90) 0,06 > 1 filho 43(65,2) 36(48,6) 0-1 filho 23(34,8) 38(51,4) Estado Civil 1,17(0,60-2,28) 0,73 Casada,c/ companheiro,viúva 33(50,0) 40(54,1) Solteira ou separada 33(50,0) 34(45,9) Nível de escolaridade 1,11(0,57-2,18) 0,86 Ensino fundamental completo e mais anos de estudo

36(55,4) 43(58,1)

Ensino fundamental incompleto 29(44,6) 31(41,9) Renda familiar 1,23(0,51-3,03) 0,66 0-1 salário mínimo 44(77,2) 50(80,6) > 2 salário mínimo 13(22,8) 12(19,4) Sexarca 1,69(0,80-3,54) 0,19 < 17 anos 50(75,8) 48(64,9) ≥ 18 anos 16(24,2) 26(35,1) Lesão genital herpética 1,61(0,50-5,12) 0,56 Sim 16(69,6) 17(58,6) Não 7(30,4) 12(41,4) Aborto 1,05(0,54-2,05) 1,00 Sim 33(50,0) 36(48,6) Não 33(50,0) 38(51,4) Carga viral 1,08(0,55-2,11) 0,86 Não detectável 33(50,0) 38(52,1) ≥ 80 cópias/ml 33(50,0) 35(47,9)

Fumante 1,08(0,51-2,30) 0,85

Sim 18(27,3) 19(25,7)

Não 48(72,7) 55(74,3)

Consumo de bebidas alcoólicas 1,49(0,70-3,17) 0,33

Sim 20(30,8) 17(23,0)

Não 45(69,2) 57(77,0)

Uso de drogas 2,04(0,66-6,25) 0,28

Sim 5(7,9) 11(14,9)

Não 58(92,1) 63(85,1)

58

Tabela 7 - Fatores de risco, demográficos e carga viral em mulheres soropositivas por HIV relacionados com HPV de baixo risco. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

HPV*: HPV negativo.

Variáveis Baixo Risco No(%)

HPV* No(%)

OR (95 % IC)

P valor

Sexarca 4,39(0,90-21,34) 0,06 <17 anos 13(86,7) 34(59,6) ≥18 anos 2(13,3) 23(40,4) Tempo diagnóstico HIV 1,17(0,36-3,73) 1,00 ≤ 4 anos 6(40,0) 25(43,9) > 4 anos 9(60,0) 32(56,1) Etnia 1,14(0,35-3,66) 1,00 Branca 6(40,0) 21(36,8) Não branca 9(60,0) 36(63,2) Idade 2,05(0,64-6,58) 0,23 ≤ 30 anos 7(46,7) 17(29,8) > 30 anos 8(53,3) 40(70,2) Estado Civil 1,03(0,33-3,22) 1,00 Solteira ou separada 7(46,7) 27(47,4) Casada, com companheiro ou viúva

8(53,3) 30(52,6)

Nível de Escolaridade 1,29(0,41-4,06) 0,77 Ensino fundamental completo e mais anos de estudo

8(53,3) 34(59,6)

Ensino fundamental incompleto 7(46,7) 23(40,4) Renda familiar 3,27(0,37-28,21) 0,42 >2 salários mínimos 1(8,3) 11(22,9) 0-1 salário mínimo 11(91,7) 37(77,1) Numero de parceiros sexuais 1,28(0,23-7,14) 0,67 0-1 2(13,3) 6(10,7) >1 13(86,7) 50(89,3) Paridade 1,56(0,49-5,00) 0,56 0-1 filho 9(60,0) 28(49,1) > 1 filho 6(40,0) 29(50,9) Lesão genital herpética 1,46(0,11-18,29) 1,00 Sim 2(66,7) 15(57,7) Não 1(33,3) 11(42,3) Aborto 1,56(0,49-5,00) 0,56 Sim 6(40,0) 29(50,9) Não 9(60,0) 28(49,1) Carga Viral 1,31(0,42-4,13) 0,77 Não detectável 7(46,7) 30(53,6) ≥ 80 cópias/ml 8(53,3) 26(46,4) Fumante 1,56(0,38-6,66) 0,74 Sim 3(20,0) 16(28,1) Não 12(80,0) 41(71,9) Consumo de bebidas alcoólicas 3,13(0,90-10,80) 0,084 Sim 6(40,0) 10(17,5) Não 9(60,0) 47(82,5) Uso de drogas 3,03(0,35-33,33) 0,43 Sim 1(6,7) 10(17,5) Não 14(93,3) 47(82,5)

59

Tabela 8 – Infecções múltiplas associadas a fatores de risco, dados demográficos e a carga viral em mulheres HIV positivas. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

Variáveis Infecções múltiplas

No(%)

Infecções simples

No(%)

OR (95 % IC)

P valor

Tempo diagnóstico HIV 2,70(0,92-7,69) 0,08 ≤ 4 anos 22(78,6) 32(58,2) > 4 anos 6(21,4) 23(41,8) Etnia 1,61(0,63-4,11) 0,35 Branca 18(64,3) 29(52,7) Não branca 10(35,7) 26(47,3) Idade 1,20(0,48-3,03) 0,81 ≤ 30 anos 13(46,4) 28(50,9) > 30 anos 15(53,6) 27(49,1) Estado Civil 1,77(0,68-4,31) 0,25 Solteira ou separada 16(57,1) 24(43,6) Casada, com companheiro ou viúva

12(42,9) 31(56,4)

Nível de escolaridade 1,31(0,51-3,33) 0,64 Ensino fundamental completo e mais anos de estudo 16(59,3)

29(52,7)

Ensino fundamental incompleto 11(40,7) 26(47,3) Renda familiar 2,17(0,66-7,14) 0,22 >2 salários mínimos 7(28,0) 7(15,2) 0-1 salário mínimo 18(72,0) 39(84,8) Sexarca 1,61(0,55-4,76) 0,41 <17 anos 20(71,4) 44(80,0) ≥18 anos 8(28,6) 11(20,0) Numero de parceiros sexuais 1,11(1,02-1,20) 0,16 0-1 0 5(9,3) >1 27(100,0) 49(90,7) Paridade 1,63(0,62-4,24) 0,35 0-1 filho 9(32,1) 24(43,6) > 1 filho 19(67,9) 31(56,4) Lesão genital herpética 4,45(0,44-44,41) 0,36 Sim 7(87,5) 11(61,1) Não 1(12,5) 7(38,9) Aborto 1,38(0,55-3,57) 0,64 Sim 12(42,9) 28(50,9) Não 16(57,1) 27(49,1) Carga Viral 1,66(0,66-4,16) 0,35 Não detectável 16(57,1) 25(45,5) ≥ 80 cópias/ml 12(42,9) 31(54,5)

Fumante 1,69(0,61-4,70) 0,42

Sim 9(32,1) 12(21,8)

Não 19(67,9) 43(78,2)

Consumo de bebidas alcoólicas 1,02(0,38-2,73) 1,00

Sim 9(33,3) 18(32,7)

Não 18(66,7) 37(67,3)

Uso de drogas 2,08(0,39-11,09) 0,40

Sim 3(11,1) 3(5,7)

Não 24(88,9) 50(94,3)

60

4.5 - RELAÇÃO ENTRE INFECÇÃO POR HPV E CITOLOGIA

Uma associação positiva foi observada em um trabalho anterior do nosso

grupo, realizado com a mesma população, entre infecção por HPV e mulheres

portadoras de HIV que apresentavam alterações citológicas (p<0,001) (Oliveira et

al., 2008). Quando analisamos mulheres HIV positivas que apresentaram citologia

alterada (HPV, LSIL, HSIL, ASCUS, AGUS) e infecção por HPV de alto risco uma

associação positiva também foi observada (OR 3,64; IC 95%, 1,80-7,37; p<0,001)

(Tabela 9).

Uma prevalência de 11 (7,9%) casos de lesões intraepiteliais de alto grau

(HSIL) foi observada na população. Do total de casos de HSIL, 66,7% das mulheres

apresentaram contagem de células CD4 até 349/mm3 e eram infectadas por tipos de

HPV de alto risco (Tabela 10).

Das 24 (16,4%) mulheres infectadas pelo tipo HPV 16, 17 (70,8%)

apresentaram citologia alterada e tinham mais chance de desenvolver lesões

cervicais do que aquelas que estavam infectadas por outros tipos de HPV (OR 4,12;

IC 95%, 1,58-10,74; p=0,003) (Tabela 11). Da mesma forma, mulheres infectadas

apenas por tipos de baixo risco tinham maior probabilidade de desenvolver

anormalidades citológicas do que o restante da população (OR 6,13; IC 95%, 1,80-

20,89; p=0,004) (Tabela 9).

Mulheres com citologia alterada tiveram uma relação positiva com contagem

de células CD4 até 200/mm3, sendo seis vezes maior a chance de desenvolver lesão

cervical (OR 6,88; IC 95%, 1,42-33,15; p=0,009). Uma associação positiva também

foi observada entre citologia anormal e contagem de células CD4 até 349/mm3

(p=0,017). Não foi observada relação entre mulheres que apresentaram contagem

de células até 500/mm3 ou superior a 500/mm3 (p=0,42) e citologia (Tabela 12).

61

Tabela 9 – Frequência de HPV de alto risco e de baixo risco de acordo com resultados de citologia de mulheres HIV positivas. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

HPV1 : HPV negativo, de baixo risco ou indeterminado. HPV2: HPV negativo.

Tabela 10 – Casos de lesões intraepiteliais de alto grau em pacientes portadoras de HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

HPV* : HPV negativo, de baixo risco ou indeterminado.

Tabela 11 - Frequência do tipo de HPV 16 em relação à citologia de pacientes HIV positivas. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

Citologia Normal,inflamatório No(%)

HPV, LSIL, HSIL, ASCUS, AGUS No(%)

OR (95 % IC)

P valor

HPV16 7(29,2) 17(70,8) 4,12(1,58-10,74) 0,003

HPV* 73(62,9) 43(37,1)

HPV*: Qualquer outro tipo de HPV exceto o HPV16.

Tabela 12 - Relação entre citologia e contagem de linfócitos T CD4 em mulheres soropositivas para HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

Contagem de CD4/mm3

Normal, inflamatório

No(%)

HPV, LSIL, HSIL, ASCUS, AGUS

No(%)

OR (95 % IC)

P valor

0-200 2(2,5) 9(15,0) 6,88(1,42-33,15) 0,009

> 201 78(97,5) 51(85,0)

202-349 35(43,8) 39(65,0) 2,38(1,19-4,76) 0,017

> 349 45(56,3) 21(35,0)

350-500 59(73,8) 48(80,0) 1,42(0,63-3,18) 0,42

> 500 21(26,3) 12(20,0)

Citologia Normal, inflamatório

No(%)

HPV, LSIL, HSIL, ASCUS, AGUS

No(%)

OR (95 % IC)

P valor

HPV Alto Risco 27 (40,9) 39(59,1) 3,64 (1,80-7,37) <0,001

HPV1 53 (71,6) 21 (28,4)

HPV Baixo Risco 6 (40,0) 9 (60,0) 6,13 (1,80-20,89) 0,004

HPV2 46 (80,7) 11 (19,3)

HSIL 202-349/mm3 No(%)

> 349/mm3 No(%)

HPV Alto Risco 6 (66,7) 3 (33,3)

HPV* 2 (100,0) 0

62

4.6 - ESTADO IMUNE DE MULHERES HIV POSITIVAS EM RELAÇÃO À

INFECÇÃO POR PAPILOMAVÍRUS HUMANOS

Uma associação significativa foi observada entre a infecção por HPV e

contagem de células CD4 até 200/mm3 (p=0,02), assim como entre o número de

células CD4 até 350/mm3 (p=0,06) (Oliveira et al., 2008). Os resultados deste estudo

indicaram que a chance de mulheres com contagem de células CD4 até 200/mm3

estarem infectadas por tipos de HPV de alto risco foi cinco vezes maior do que

mulheres que apresentaram contagem de CD4 maior que 200/mm3 (OR 5,68; IC

95%, 1,18-27,35; p=0,025). Houve uma associação positiva entre as mulheres que

possuíam contagem de CD4 até 349/mm3 e infecção por genótipos de alto risco

(p=0,043) (Tabela 13). Nos casos de infecção por tipos de baixo risco não houve

associação com a contagem de células T CD4 (Tabela 14).

Tabela 13 – Infecção de HPV de alto risco de acordo com o estado imune de mulheres soropositivas para HIV. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

Contagem de CD4/ mm3

HPV Alto risco No (%)

HPV* No(%)

OR (95 % IC) P valor

0-200 9 (13,6) 2 (2,7) 5,68 (1,18-27,35) 0,025 > 201 57 (86,4) 72 (97,3)

202-349 41 (62,1) 33 (44,6) 2,03 (1,03-4,00) 0,043 > 349 25 (37,9) 41 (55,4)

350-500 55 (83,3) 52 (70,3) 2,11 (0,93-4,78) 0,076 > 500 11 (16,7) 22 (29,7)

HPV* : HPV negativo, de baixo risco ou indeterminado.

Tabela 14 – Relação entre contagem de células CD4 de pacientes infectadas por HIV e infecção por HPV de baixo risco. Serviço de Patologia Cervical, HSE/RJ, 2003-2005.

Contagem de CD4/mm3

HPV Baixo Risco No(%)

HPV* No(%)

OR (95 % IC)

P valor

0-200 1(6,7) 0 5,26(3,22-8,33) 0,20 > 201 14(93,3) 57(100,0) 202-349 7(46,7) 24(42,1) 1,20(0,38-3,77) 0,77 > 349 8(53,3) 33(57,9) 350-500 11(73,3) 39(68,4) 1,26(0,35-4,53) 1,00 > 500 4(26,7) 18(31,6)

HPV*: HPV negativo.

5 – DISCUSSÃO

A análise do perfil das mulheres estudadas revelou uma população

predominantemente mais velha (>30 anos), não branca e de baixa condição

econômica. Entretanto, a maioria delas estava sob tratamento médico, fazia exames

preventivos regularmente e 98% faziam o uso de antiretrovirais. A procura pelo

tratamento provavelmente ocorreu devido ao aparecimento de doenças associadas

à infecção por HIV, como tuberculose, lupus, herpes e outras doenças sexualmente

transmissíveis. A gratuidade do tratamento antiretroviral seria outro motivo pela

procura de atendimento médico.

Uma prevalência de 58,3% (14/24) de tipos de HPV de alto potencial

oncogênico foi observada no nosso estudo, comparada com a de 37,5% encontrada

para tipos não oncogênicos. Outros trabalhos também ressaltam maior prevalência

de tipos de alto risco em relação aos tipos de baixo risco entre mulheres co-

infectadas por HIV-HPV (Spinillo et al., 2001, Dames et al., 2009). Ng`andwe et al.,

(2007) estudaram mulheres africanas positivas e negativas para HIV e observaram

maior prevalência de tipos de HPV de alto risco (78,0%) do que de baixo risco

(22,0%) nas mulheres HIV positivas comparado com as mulheres HIV negativas. Os

resultados sugerem que mulheres infectadas por HIV são mais expostas à infecção

por tipos oncogênicos, por possuírem comportamento sexual promíscuo e se

relacionarem com parceiros que tenham parceiras múltiplas, do que mulheres HIV

negativas.

Do total de mulheres co-infectadas por HPV e HIV, os tipos de HPV mais

prevalentes foram o HPV 16 (16,4%), 58 (7,5%) e 53 (6,8%). Grinsztejn et al.,

(2009), estudando 112 brasileiras HIV positivas, encontraram HPV 68 (47%), 58

64

(41%) e 39 (24%) entre 31 tipos diferentes detectados. Um estudo realizado no Rio

de Janeiro, com 150 mulheres HIV negativas atendidas em uma clínica particular de

Maricá e 150 atendidas em uma clínica pública de Itaboraí, observou maior

prevalência dos tipos HPV 16 (5,3% e 10%, respectivamente) e HPV 18 (1,3% e

4,7%, respectivamente) (Silva et al., 2006). Luque et al., (2006) encontraram, entre

os genótipos mais frequentes em uma população de 202 americanas portadoras de

HIV, os mesmos tipos encontrados em nossos resultados, como o HPV 53 (20,2%),

16 (13,8%) e 58 (11,3%). No estudo realizado na África, com 82 mulheres

soropositivas para HIV (atendidas no Serviço de Saúde de uma Clínica para

adolescentes em Kampala), os tipos mais frequentes foram os HPV 52 (20,7%) e 33

(19,5%) entre os 25 tipos de HPV identificados (Banura et al., 2008). Estes estudos

salientam a diversa distribuição de tipos de papilomavírus humanos entre as

mulheres HIV positivas e negativas de diferentes regiões geográficas (Quadro 1).

Quadro 1. Comparação dos tipos prevalentes de HPV entre os diferentes estudos.

O genótipo mais prevalente detectado em nossos estudos foi o HPV 16

(16,4%), um tipo de alto risco predominante no Brasil e em outros países, tanto em

mulheres HIV negativas quanto em mulheres HIV positivas (Pereira et al., 2007;

Fontaine et al., 2008). Resultados similares da prevalência do HPV 16 (14,1%) foram

encontrados em um estudo na região Central do Brasil com mulheres portadoras de

HIV (Cerqueira et al., 2007). No estado de São Paulo foram observados resultados

contraditórios quanto à prevalência do HPV16. Um estudo apresentou uma alta

prevalência (30,9%) em 223 pacientes soropositivas para HIV (Levi et al, 2004) e

outro revelou uma prevalência menor entre 138 mulheres infectadas por HIV (9,4%)

(Gonçalves et al., 2008). Del Mistro et al., (2004) detectaram uma alta prevalência do

HPV 16 (20,0%) entre 155 italianas positivas para HIV. Um estudo realizado com

1739 pacientes, de diferentes nacionalidades e soronegativas para HIV, com câncer

RJ, Brasil Estudo HIV positiva HPV 16 (16,4%), 58 (7,5%) e 53 (6,8%)

RJ, Brasil Grinsztejn et al ., (2009) HIV positiva HPV 68 (47%), 58 (41%) e 39 (24%)

RJ, Brasil Silva et al. , (2006) HIV negativa HPV 16 (5,3% e 10%) e HPV 18 (1,3% e 4,7%)

EUA Luque et al., (2006) HIV positiva HPV 53 (20,2%), 16 (13,8%) e 58 (11,3%)

África Banura et al ., (2008) HIV positiva HPV 52 (20,7%) e 33 (19,5%)

65

cervical e 259 infectadas por HPV também relatou uma alta prevalência do HPV 16

(58,9%) (Muñoz et al., 2003) (Quadro 2).

Quadro 2. Prevalência do HPV 16 em diferentes localidades.

Outro genótipo de alto risco prevalente neste estudo, o HPV 58 (7,5%), devido

ao aprimoramento de técnicas para tipificação, vem apresentando alta prevalência

entre a população feminina infectada por HIV ou negativa para HIV no Brasil e no

mundo. Uma alta frequência dos tipos HPV 16 (43,8%) e HPV 58 (12,5%) foi

detectada entre 159 brasileiras HIV negativas (Camara et al., 2003). Pesquisadores

italianos observaram uma alta frequência dos tipos HPV 16 (36,7%) e 58 (14,3%),

sendo estes tipos os mais prevalentes entre as 49 pacientes soropositivas para HIV

(Tornesello et al., 2008). Na China uma alta frequência do HPV 58 (16,2%) foi

encontrada em 154 mulheres soronegativas para HIV entre os tipos de

papilomavírus humanos detectados (Lin et al., 2008). Molano et al., (2002) também

relataram valores significativos da prevalência dos tipos de HPV 16 (16,3%) e HPV

58 (6,2%) entre 276 mulheres HIV negativas da Colômbia (Quadro 3).

Quadro 3. Relação da frequência do HPV 58 apresentada por diversos

autores.

Moscicki et al., (2004) sugerem que a alta prevalência do HPV 16, observada

tanto em mulheres positivas ou negativas para HIV, indica que este tipo de HPV

possui maior capacidade de escapar do sistema imune do que os outros tipos,

RJ, Brasil Estudo HIV positiva HPV 16 (16,4%), mais prevalente

Brasília Cerqueira et al ., (2007) HIV positiva HPV 16 (14,1%)

SP, Brasil Levi et al , (2004) HIV positiva HPV 16 com alta prevalência (30,9%)

SP, Brasil Gonçalves et al. , (2008) HIV positiva prevalência menor (9,4%)

Itália Del Mistro et al. , (2004) HIV positiva HPV 16 (20,0%)

África, América do Sul, Muñoz et al. , (2003) HIV negativa HPV 16 (58,9%)

Ásia, Espanha

RJ, Brasil Estudo HIV positiva HPV 58 (7,5%)

DF, Brasil Camara et al. , (2003) HIV negativa HPV 16 (43,8%) e HPV 58 (12,5%)

Itália Tornesello et al. , (2008) HIV positiva HPV 16 (36,7%) e 58 (14,3%)

China Lin et al. , (2008) HIV negativa HPV 58 (16,2%)

Colômbia Molano et al. , (2002) HIV negativa HPV 16 (16,3%) e HPV 58 (6,2%)

66

principalmente quando o indivíduo se encontra debilitado (como no caso de

pacientes HIV positivas), confirmando os resultados encontrados no nosso e em

outros trabalhos.

O terceiro tipo mais frequente, o HPV 53 (6,8%), é classificado por alguns

pesquisadores como de baixo risco (Ferreccio et al., 2008, Bello et al., 2009) e por

outros como provável tipo de alto risco, pois foi detectado tanto em lesões benignas

como pré-malignas, mas nunca, até então, em câncer (de Villiers et al., 2004,

Szostek et al., 2008, Mejlhede et al., 2009). No nosso trabalho, classificamos o HPV

53 como de alto risco de acordo com a classificação de De Villiers et al, (2004),

considerando aspectos epidemiológicos e filogenéticos. Nós o detectamos em 10

casos (11,9%), sendo três deles oriundos de pacientes com lesão de baixo grau e os

demais não estavam associados com anormalidades cervicais. Meyer et al., (2001)

detectaram o HPV 53 em 5 amostras de 288 mulheres soronegativas para HIV que

apresentavam lesão de alto grau, 3 amostras de 130 que apresentavam lesão de

baixo grau e nenhuma entre as pacientes com câncer (Quadro 4).

Quadro 4. Presença do HPV 53 em lesões cervicais.

Gonçalves et al., (2008) também revelaram uma frequência maior do HPV 53

(9,4%) entre os tipos encontrados. Um estudo com 1778 pacientes portadoras de

HIV apresentou alta prevalência do tipo HPV 53 (8,5%) entre os diversos genótipos

de papilomavírus humanos detectados (Palefsky et al., 1999). Os resultados

mostrados neste trabalho e de outros pesquisadores sugerem que o HPV 53 parece

apresentar menor capacidade de promover a progressão de uma lesão cervical no

indivíduo infectado, quando comparado com outros genótipos de alto risco (Quadro

5).

Estudo Meyer et al. , (2001)

RJ, Brasil Alemanha

HIV positiva HIV negativa

HPV 53 - 10 casos (11,9%) HPV 53 - 16 casos (5,5%)

3 casos - LSIL 3 casos - LSIL

Não associados Nenhum câncer

67

Quadro 5. Diferentes estudos mostrando a prevalência do HPV 53.

O HPV 18, de alto risco oncogênico, apresentou baixa frequência (2,1%)

concordando com outros trabalhos brasileiros (4,7%) com mulheres HIV positivas

(Cerqueira et al., 2007). Na Itália, um estudo realizado com pacientes HIV positivas

também relatou uma frequência baixa do HPV 18 (1,8%) (Lillo et al., 2001). A

circulação deste tipo viral foi semelhante ao encontrado em outros estudos (Queiroz

et al., 2004, Cerqueira et al., 2007). Contudo, sabe-se que este tipo é detectado com

maior frequência quando há presença de lesões cervicais malignas, como câncer

cervical e adenocarcinomas, o que não foi observado na população analisada no

nosso trabalho, concordando com resultados de outros estudos (Videla et al., 2009)

(Quadro 6).

Quadro 6. Baixa prevalência do HPV 18 em mulheres portadoras de HIV.

Os tipos de HPV considerados de baixo risco mais frequentes na população

em geral são HPV 6 (2,7%) e 11 (1,4%); entretanto, esses tipos apresentaram

menor prevalência em relação ao tipo de baixo risco que apareceu com maior

frequência em nosso estudo: 71(CP8061) (5,5%). Um estudo brasileiro mostrou

baixa prevalência (≤2,5%) dos tipos HPV 6, 11 e 71(CP8061) entre mulheres

positivas para HIV (Cerqueira et al., 2007). Resultados opostos aos do nosso estudo

foram observados por outros pesquisadores, com menor frequência do tipo HPV 71

(1,4%) detectado em amostras cervicais de uma população HIV positiva (Gonçalves

et al., 2008). Luque et al., (2006) realizaram um trabalho com mulheres HIV positivas

e também encontraram baixa frequência dos tipos HPV 6 (2,9%) e 11 (1,9%) entre

os tipos de HPV de baixo risco identificados, prevalecendo em 10,8%, outros tipos

como o 83(MM7) e o 84(MM8). Na Itália, um estudo realizado com 912 mulheres

soronegativas para HIV mostrou uma prevalência maior dos tipos HPV 6 (17,8%) e

RJ, Brasil Estudo HIV positiva HPV 53 (6,8%)

SP, Brasil Gonçalves et al. , (2008) HIV positiva HPV 53 (9,4%)

EUA Palefsky et al. , (1999) HIV positiva HPV 53 (8,5%)

RJ, Brasil Estudo HIV positiva HPV 18 (2,1%)

Brasília Cerqueira et al. , (2007) HIV positiva HPV 18 (4,7%)

Itália Lillo et al. , (2001) HIV positiva HPV 18 (1,8%)

68

11 (11,6%), entre os tipos com baixo potencial oncogênico (Bello et al., 2009).

Banura et al., (2008) e Levi et al., (2004) também encontraram alta frequência dos

tipos de HPV 6 (15,9% e 16,1%, respectivamente) e 11 (17,1% e 15,7%,

respectivamente) entre os tipos de baixo risco detectados entre mulheres HIV

positivas. A baixa prevalência dos tipos de HPV de baixo risco (HPV 6 e 11),

encontrada no nosso trabalho e nos de outros autores, em mulheres soropositivas

para HIV, pode ser explicada pela maior frequência de tipos raros e incomuns como

uma característica importante na infecção por HPV em pacientes imunossuprimidas,

sendo estes tipos raros, tipos virais verdadeiramente oportunistas (Cerqueira et al.,

2007).

Em relação ao total de genótipos de HPV detectados no nosso estudo, uma

menor frequência (0,7%) também foi observada entre os tipos de alto risco HPV 39,

51 e 69 e de baixo risco HPV 40, 44 e 81(CP8304). Alguns estudos mostraram

resultados semelhantes em relação aos tipos incomuns de papilomavírus humanos

encontrados em mulheres infectadas por HIV. Levi et al., (2004) observaram menor

frequência dos tipos de alto risco HPV 39 (7,6%) e 51 (13,9%) em relação aos

genótipos de HPV detectados. Gonçalves et al., (2008) revelaram menor prevalência

do HPV 39(0,7%) e 69(1,4%) em amostras cervicais de pacientes HIV positivas.

Outros pesquisadores brasileiros também relataram uma frequência baixa do HPV

69, detectando apenas um caso em um estudo com 1425 mulheres soronegativas

para HIV (Franco et al., 1999). Contrapondo aos resultados apresentados, alguns

estudos relataram que o HPV 69 foi um genótipo muito prevalente detectado em

verruga plantar de pacientes HIV positivos (Whitaker et al., 2009). A prevalência do

HPV 69 observada sugere que este tipo desenvolve melhor lesões epiteliais

benignas do que lesões intraepiteliais cervicais tanto em pacientes HIV positivos

quanto em HIV negativos (Quadro 7).

Quadro 7. Relação de tipos menos frequentemente detectados.

Em relação aos tipos incomuns de HPV de baixo risco, Levi et al., (2004)

encontraram o HPV 40 com menor frequência em relação aos outros tipos

Estudo HPV 39 HPV 51 HPV 69 HIV positivo

Levi et al. , (2004) HPV 39 (7,6%) HPV 51 (13,9%) HIV positiva

Gonçalves et al., (2008) HPV 39 (0,7%) HPV 69 (1,4%) HIV positiva

Franco et al ., (1999) HPV 69 (0,1%) HIV negativa

69

identificados. O HPV 44 foi detectado com menor prevalência em um estudo com

amostras cervicais de mulheres HIV negativas (Szostek et al., 2008). Os genótipos

(HPV 40 e 44) apresentados com menor frequência, neste e em outros trabalhos,

ressaltam a necessidade de se obter informação quanto à prevalência de tipos

incomuns de HPV em mulheres portadoras de HIV.

Outros pesquisadores encontraram baixa prevalência do HPV 81 em

mulheres soropositivas para HIV, concordando com os nossos resultados (Luque et

al., 2006). Resultados controversos foram descritos por Cerqueira et al., (2007), que

encontraram o HPV 81 (14,1%) como tipo de baixo risco mais prevalente entre

mulheres infectadas por HIV. Tornesello et al., (2008) também identificaram o HPV

81 (16,3%) como segundo tipo mais frequente entre 49 italianas HIV positivas.

Alguns estudos realizados com mulheres HIV negativas de diferentes localidades

geográficas detectaram uma alta prevalência do HPV 81 (Meyer et al., 2001, Molano

et al., 2002, Lin et al., 2008). As diferenças geográficas podem explicar as

disparidades encontradas na prevalência de tipos incomuns, como o HPV 81,

encontradas no nosso trabalho e entre os diferentes estudos (Quadro 8).

Quadro 8. Prevalência do HPV 81 em diferentes regiões.

O genótipo LVX100 é representado dessa forma porque foi identificado por

Luisa Villa X100 (Bernard, 2005). Ele é um tipo raro que também apresentou uma

frequência baixa (0,7%) na população estudada confirmando resultados encontrados

por outros autores (Chan et al., 2002, Deluca et al., 2004). No nosso trabalho, o

LVX100 foi considerado como classificação não conhecida. Entretanto, um estudo

recente classificou este genótipo como de baixo risco oncogênico (Howe et al.,

2009).

Alguns tipos de HPV (32, 35, 42, 44, 56, 81, LVX100) foram detectados

somente em casos de infecção múltipla, semelhante ao encontrado por outros

pesquisadores. O tipo HPV 35 foi encontrado em pacientes HIV positivas somente

RJ, Brasil Estudo HIV positiva HPV 81 (0,7%)

Brasília Cerqueira et al ., (2007) HIV positiva 14,10%

EUA Luque et al. , (2006) HIV positiva 2,40%

Itália Tornesello et al. , (2008) HIV positiva 16,30%

Alemanha Meyer et al. , (2001) HIV negativa 4,16%

Colômbia Molano et al. , (2002) HIV negativa 3,60%

China Lin et al. , (2008) HIV negativa 16,30%

70

quando apresentaram infecção múltipla (Levi et al., 2004). Outros pesquisadores

encontraram os tipos HPV 56 e 42 em mulheres HIV positivas (Tornesello et al.,

2007, Levi et al., 2004). Molano et al., (2002) encontraram os tipos HPV 35, 43, 44 e

89(CP6108) apenas em infecções por genótipos múltiplos de HPV em mulheres

soronegativas para HIV. Uma alta prevalência (20,0%) de infecção por mais de um

genótipo de HPV foi encontrada na população estudada comparada com um estudo

de São Paulo que detectou uma prevalência menor (2,2%) analisando 1425

mulheres HIV negativas (Franco et al., 1999). Outros estudos retificam a alta

prevalência de infecções múltiplas em mulheres infectadas por HIV (Hankins et al.,

1999, Lillo et al., 2001, Luque et al., 2006). Os resultados apresentados nesse e em

outros trabalhos explicam a possibilidade das mulheres com deficiência imune não

conseguirem controlar e erradicar uma infecção por genótipos múltiplos de HPV,

como as mulheres imunocompetentes (Quadro 9).

Quadro 9. Tipos de HPV presentes apenas em infecções múltiplas.

No estudo anterior, verificamos que uma mesma amostra analisada em um

mesmo momento deste estudo, a infecção por HPV apresentou uma associação

positiva quando relacionada com o diagnóstico recente de infecção por HIV, idade

da primeira relação sexual, consumo de bebidas alcoólicas, mulheres jovens e

brancas (Oliveira et al., 2008). Neste trabalho, após tipificação do HPV, uma

associação semelhante foi observada quando houve infecção por genótipos de HPV

de alto risco relacionados com diagnóstico recente de HIV, mulheres brancas e

jovens. Considerando a maior prevalência de tipos oncogênicos detectados, estes

resultados eram esperados. Entretanto, também encontramos uma relação positiva

entre número de parceiros sexuais e paridade e infecção por HPV de alto risco.

Provavelmente isto ocorreu porque o maior número de parceiros sexuais e de filhos

Estudo Levi et al. , (2004) Tornesello et al. , (2007) Molano et al ., (2002)

HPV 32 HPV 35 HPV 42 HPV 35

HPV 35 HPV 42 HPV 56 HPV 43

HPV 42 HPV 56 HPV 44

HPV 44 HPV 89(CP6108)

HPV 81

LVX100

HIV positiva HIV positiva HIV positiva HIV negativa

RJ, Brasil SP, Brasil Itália Colômbia

71

são fatores de risco que permitem maior exposição do indivíduo à infecção por tipos

oncogênicos de HPV (Quadro 10).

Em relação à infecção por tipos de baixo risco, observamos uma associação

positiva em mulheres que apresentaram início da atividade sexual precoce,

semelhante ao resultado encontrado quando foi analisada apenas infecção por HPV.

Existe a possibilidade de essas pacientes terem se infectado logo após a primeira

relação sexual, e devido à deficiência do sistema imune, serem mais susceptíveis à

persistência da infecção por estes tipos, sendo detectados em idade adulta (Quadro

10).

Quadro 10. Variáveis analisadas e relacionadas com infecção por HPV antes

e após tipificação.

Levi et al., (2002) observaram uma alta prevalência de infecção por genótipos

de alto risco entre mulheres jovens HIV positivas. Uma associação positiva entre

brasileiras jovens infectadas por HIV (<30 anos) e infecção por tipos de alto risco

também foi encontrada por Grinsztejn et al., (2009). Estes fatos podem estar

relacionados ao comportamento sexual de risco apresentado por mulheres jovens

portadoras de HIV.

Asiimwe et al., (2008) estudaram 314 mulheres africanas co-infectadas por

HIV e HPV e também observaram uma associação positiva entre infecção por tipos

de HPV de alto risco e diagnóstico recente de HIV. Alguns autores relatam que a

maioria das mulheres é infectada por HPV nas primeiras relações sexuais, ou seja,

no início da sua vida sexual (Moscicki et al., 2001). Por esta razão é difícil

determinar se a infecção por HPV ocorreu antes ou depois da infecção por HIV nas

pacientes participantes do estudo. Além disso, mulheres infectadas por tipos

Oliveira et al. , (2008)

Infecção por HPV Infecção por Alto Risco Infecção por Baixo Risco

Diagnóstico recente de HIV Diagnóstico recente de HIV

Mulheres brancas Mulheres brancas

Mulheres jovens Mulheres jovens

Idade da primeira relação sexual Idade da primeira relação sexual

Consumo de bebidas alcoólicas

Maior n. de parceiros

Maior n. de filhos

Estudo

RJ, Brasil

72

oncogênicos de HPV, que fazem uso de preservativos, apresentam um menor risco

de serem reinfectadas comparadas com aquelas que não usam camisinha (Epstein,

2005). Os resultados apresentados sugerem a possibilidade de mulheres que

tiveram o conhecimento do diagnóstico da infecção por HIV por mais tempo terem

feito uso de preservativos com maior frequência do que as mulheres que tiveram o

conhecimento recente, evitando dessa forma, uma reinfecção por outros tipos de

HPV, principalmente por tipos oncogênicos.

Grinsztejn et al., (2009) relataram uma associação positiva entre maior

número de parceiros sexuais durante a vida sexual e infecção por tipos oncogênicos

em pacientes soropositivas para HIV. Um estudo indiano, com 86 mulheres

infectadas por tipos de HPV de alto risco, revelou uma relação positiva entre

infecção por tipos oncogênicos e alta paridade (p=0,04) (Gupta et al., 2009).

Contrapondo os resultados apresentados, Ng’andwe et al., (2007) observaram maior

prevalência de tipos de alto risco do que de baixo risco entre as mulheres HIV

positivas que apresentaram início da atividade sexual precoce (≤15 anos). Os

resultados deste e de outros estudos ressaltam a forte relação entre os fatores de

risco (número de parceiros sexuais, paridade e início da atividade sexual) e

aquisição de infecção por tipos de HPV de alto ou baixo risco em indivíduos HIV

positivos (Quadro 11).

Quadro 11. Comparação das variáveis analisadas no nosso e nos diferentes

estudos.

Observamos uma alta prevalência de infecções múltiplas; entretanto, não

encontramos associação positiva com as variáveis analisadas (idade, tempo de

diagnóstico de HIV, etnia, número de parceiros e paridade) como foi observado entre

os genótipos de alto risco.

Em estudo anterior com a mesma amostra analisada neste trabalho, uma

associação positiva foi encontrada entre infecção por HPV e alterações citológicas

Estudo Levi et al. , (2002) Grinsztejn et al. , (2009) Asiimwe et al. , (2008) Gupta et al. , (2009)

Diagnóstico recente de HIV Associação positiva

Mulheres jovens Alta prevalência Relação positiva

Maior n. de parceiros Associação positiva

Maior n. de filhos Relação positiva

HIV positiva HIV positiva HIV positiva HIV positiva HIV negativa

RJ, Brasil SP, Brasil RJ, Brasil África Índia

73

(Oliveira et al., 2008). No nosso trabalho, encontramos a mesma associação entre

infecção por tipos de alto risco e citologia alterada, como o esperado, pois esses

tipos promovem alterações citológicas. Um estudo realizado no Rio de Janeiro com

152 mulheres imunocompetentes também observou uma maior prevalência de

infecção por tipos de alto risco em pacientes com citologia alterada (Pereira et al.,

2007). Nos Estados Unidos, Luque et al., (1999) observaram maior prevalência de

tipos oncogênicos relacionados com citologia cervical anormal em mulheres HIV

positivas. Resultados semelhantes foram encontrados em um estudo recente em

Bahamas, onde uma forte correlação foi observada entre a presença de HPV de alto

risco e anormalidades cervicais das 67 pacientes HIV positivas (Dames et al., 2009)

(Quadro 12).

Quadro 12. Relação entre infecção por HPV e citologia nos seguintes

trabalhos.

Observamos uma alta prevalência de lesões intraepiteliais de alto grau (HSIL)

(7,9%) em mulheres com contagem de linfócitos T CD4 menor que 349/mm3

infectadas por tipos oncogênicos de HPV. Outros estudos com 219 mulheres HIV

positivas, possuindo contagem de células T CD4 menor do que 200/mm3, também

demonstraram uma alta prevalência (20,0%) de HSIL em pacientes infectadas por

tipos de alto risco (Yamada et al., 2008). A prevalência de HSIL (12,5%) em

mulheres HIV positivas infectadas por tipos de HPV de alto risco e com contagem de

células CD4 200-500/µL foi semelhante à de outra pesquisa (Tornesello et al., 2008).

Os resultados mostrados no nosso estudo e em outros trabalhos ressaltam que

indivíduos imunossuprimidos não conseguem controlar a expressão e a replicação

do HPV, aumentando o potencial oncogênico de HPV de alto risco, e

consequentemente o desenvolvimento de lesões cervicais de alto grau (Tweddel et

al., 1994) (Quadro 13).

Oliveira et al. , (2008) Estudo Luque et al. , (1999) Dames et al. , (2009)

HPV HPV de Alto risco Alto risco Alto risco

Alterações citológicas Alterações citológicas Alterações citológicas Alterações citológicas

HIV positiva HIV positiva

E.U.A. BahamasRJ, Brasil

HIV positiva

74

Quadro 13. Frequência de HSIL em imunossuprimidas infectadas por HPV de

alto risco de diferentes localidades.

Uma associação positiva foi observada quando relacionamos o genótipo HPV

16 com alterações citológicas. Autores brasileiros relataram alta prevalência do tipo

HPV 16, em pacientes negativas para HIV, com citologia alterada (Camara et al.,

2003). Ruche et al., (1998), também observaram uma associação positiva entre o

HPV 16 e alterações citológicas encontradas em 211 mulheres HIV positivas da

Costa do Marfim. Um outro estudo encontrou 61% das amostras cervicais de

pacientes com alterações citológicas infectadas pelo HPV 16 (Luque et al., 2006)

(Quadro 14). Os nossos resultados podem ser explicados por esse tipo ser um

genótipo fortemente oncogênico e, portanto, associado a lesões cervicais, como

seria esperado. Os outros tipos oncogênicos não foram significativos para lesões

cervicais, nestas pacientes.

Quadro 14. Diferentes trabalhos mostrando a presença do HPV 16 em lesões

cervicais.

As mulheres infectadas por tipos de baixo potencial oncogênico apresentaram

uma chance maior de desenvolver lesões cervicais. Nossos resultados são

semelhantes aos encontrados por Luque et al., (2006) que relataram maior

probabilidade de desenvolvimento de anormalidades cervicais em pacientes HIV

positivas, com depressão imune, infectadas por tipos de HPV de baixo risco do que

em mulheres não infectadas por HPV. Estas observações sugerem que os tipos de

Estudo Yamada et al. , (2008) Tornesello et al. , (2008)

HPV de Alto Risco Alto risco Alto risco

HSIL (7,9%) 20,0% 12,50%

linfócitos T CD4 <349/mm3 T CD4<200/mm3

T CD4 200-500/µL

HIV positiva HIV positiva HIV positiva

RJ, Brasil Quênia Itália

Estudo Camara et al. , (2003) Luque et al. , (2006) Ruche et al. , (1998)

HPV 16 HPV 16 HPV 16 HPV 16

Alterações citológicas Alterações citológicas Alterações citológicas Alterações citológicas

HIV positiva HIV negativa HIV positiva HIV positiva

RJ, Brasil DF, Brasil E.U.A Costa do Marfim

75

HPV de baixo potencial oncogênico podem progredir lesões cervicais em pacientes

imunossuprimidas. As lesões cervicais apresentadas por essas pacientes devem ser

estudadas, pois possivelmente são lesões benignas, mas se tratando de mulheres

HIV positivas, essas lesões podem se desenvolver para patologias pouco

conhecidas.

Uma associação positiva foi observada entre mulheres com contagem de

células até 200/mm3 e até 349/mm3 com alterações citológicas. Não observamos

associação entre mulheres com contagem de CD4 até 500/mm3 ou superior a

500/mm3 e citologia. Resultados semelhantes foram encontrados em outros estudos

onde um aumento das lesões cervicais é observado em pacientes com sistema

imune deprimido. Spinillo et al., (2001) e Lillo et al., (2001) encontraram um maior

número de casos com anormalidades citológicas em pacientes que possuíam

contagem de células menor do que 200/µL e entre 200-500/µL, comparado com as

pacientes que tinham contagem de células maior do que 500/µL.

Oliveira et al., (2008) encontraram uma associação significativa entre as

mesmas mulheres participantes deste trabalho que apresentavam contagem de

células CD4 0-200/mm3 e 202-349/mm3 e infecção por HPV. No presente estudo,

após tipificação de HPV, também foi observada uma relação positiva entre mulheres

infectadas por genótipos de alto risco com a mesma contagem de linfócitos TCD4.

Levi et al., (2002) encontraram uma correlação positiva entre pacientes infectadas

por tipos de alto risco com contagem de linfócitos TCD4 menor que 100/µL. Em

outro estudo uma associação significativa também foi observada entre mulheres que

apresentaram contagem de células CD4 <200/mm3 e 200-499/mm3 infectadas por

HPV de alto risco oncogênico (Palefsky et al., 1999). Os resultados apresentados no

nosso trabalho e por outros autores ressaltam que mulheres imunossuprimidas

apresentam maior probabilidade de serem infectadas por tipos oncogênicos de HPV

(Quadro 15).

Quadro 15. Relação do estado imune e infecção por HPV apresentada por

autores distintos.

Oliveira et al. , (2008) Estudo Levi et al. , (2002) Palefsky et al. , (1999)

HPV HPV de Alto risco Alto risco Alto risco

células CD4 0-200/mm3

células CD4 0-200/mm3

T CD4 <100/µL T CD4 <200/mm3

e 0-349/mm3

e 0-349/mm3

e 200-499/mm3

SP, Brasil EUARJ, Brasil

76

Vacinas recentemente comercializadas podem ser utilizadas como métodos

profiláticos contra a infecção por HPV (Banura et al., 2008). No Brasil, uma vacina

tetravalente (Gardasil), que previne a infecção pelos quatro tipos mais comuns de

HPV 6, 11, 16 e 18, foi aprovada pela ANVISA, em 2006. Estudos observaram a

existência de uma proteção cruzada pelos tipos presentes na vacina e por outros

tipos relacionados filogeneticamente, a saber: HPV 31, 33, 52, 58 (Brown et al.,

2009). Entretanto, dada à diversidade dos tipos oncogênicos detectados na área

geográfica onde foi realizado o estudo, é possível que esta vacina selecione tipos de

alto risco pouco frequentes e aumente a sua prevalência.

Outros métodos de controle e monitoramento da progressão da doença

podem ser utilizados em mulheres que já foram infectadas por esses tipos de HPV,

como o teste de Papanicolaou e demais diagnósticos clínicos e laboratoriais.

Concluindo, encontramos uma prevalência de diferentes tipos de HPV

distribuídos entre as mulheres HIV positivas, demonstrando a variedade de tipos de

HPV circulantes no Rio de Janeiro. Com a implantação da técnica de polimorfismo

dos fragmentos obtidos por enzimas de restrição foi possível identificar esses

diversos tipos, assim como a detecção de tipos novos e incomuns de HPV, como era

o esperado em uma população infectada por HIV. A alta prevalência dos genótipos

de alto risco e as relações positivas entre as variáveis analisadas nesta população

ressaltam a importância de maior atenção no monitoramento das pacientes para a

progressão das lesões cervicais e surgimento de câncer cervical.

Relatamos uma alta prevalência de HSIL em mulheres com contagem de

células CD4 menor que 350/mm3 e infectadas por HPV de alto risco, no entanto não

havia casos de câncer na população. Isto ocorreu, provavelmente, porque essas

pacientes faziam exames preventivos regularmente, possibilitando a identificação e

o tratamento das lesões antes de progredirem ao câncer.

Uma relação positiva foi observada entre os tipos de HPV de baixo risco e o

início da atividade sexual precoce e a presença de alterações citológicas, entretanto

esses tipos apresentam menor probabilidade de desenvolver lesões. Ressaltamos

que a associação observada pode ter existido devido à população analisada ser HIV

positiva e, portanto, imunodeficiente. Por terem iniciado a vida sexual precocemente,

apresentavam o colo uterino propício ao estabelecimento de uma infecção por esses

tipos virais tornando-se persistente, provocando o aparecimento de lesões cervicais.

6 – CONCLUSÃO A implantação da técnica de polimorfismo dos fragmentos obtidos por

enzimas de restrição (RFLP) foi bem sucedida após a sua padronização, realizada

no Laboratório de Virologia da Universidade Federal Fluminense (UFF).

Com a utilização do método RFLP, foi possível detectar 24 tipos diferentes de

papilomavírus humanos, sendo quatorze tipos de alto risco oncogênico e nove tipos

de baixo risco. Além disso, detectamos tipos raros e incomuns, como normalmente é

encontrado em mulheres infectadas por HIV.

Os tipos de HPV de alto risco foram os mais prevalentes nesta população,

associados significativamente a mulheres jovens, brancas, com diagnóstico recente

de infecção por HIV, com maior número de parceiros sexuais, com mais de um filho

e citologia alterada. A infecção por tipos de baixo risco também foi associada a início

da atividade sexual precoce e lesões cervicais.

Mulheres com contagens de linfócitos T CD4 abaixo de 350/mm3 tinham maior

probabilidade de serem infectadas por tipos de alto risco.

Considerando que nesta população, regularmente submetida a exames

ginecológicos, foi encontrado um alto índice de lesões cervicais de alto grau mas

nenhum caso de câncer, ressaltamos a importância dos exames preventivos no

controle desta doença.

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8- ANEXO

8.1 - TABELA COM PADRÃO DE CLIVAGEM DE CADA ENZIMA UTILIZADA NA

TÉCNICA DE RFLP PARA CADA SEQUÊNCIA DE DNA DOS PRODUTOS DO PCR DA REGIÃO L1 DO GENOMA DE TIPOS DIFERENTES DE HPV, AMPLIFICADO PELOS OLIGONUCLEOTÍDEOS My09/My11 (450bp) (Bernard et al., 1994).

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