UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE

DESENVOLVIMENTO DE CANDIDATOS A PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS

ANTIVIRAIS PARA OS VÍRUS DA DENGUE E HEPATITE C SINTETIZADOS

A PARTIR DO ISOSORBÍDEO

ALINE CORDEIRO PORTELA

NITERÓI

2014

ALINE CORDEIRO PORTELA

DESENVOLVIMENTO DE CANDIDATOS A PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS

ANTIVIRAIS PARA OS VÍRUS DA DENGUE E HEPATITE C SINTETIZADOS

A PARTIR DO ISOSORBÍDEO

Dissertação apresentada no Curso de Pós-

graduação em Ciências Aplicadas a Produtos

para Saúde, nível Mestrado, pela

Universidade Federal Fluminense, como

requisito necessário para a obtenção do grau

de mestre. Área de concentração: Pesquisa e

monitoramento de produtos para a saúde.

Campo de confluência: Desenvolvimento de

produtos para saúde.

Orientadora: Profª.Dra. Estela Maris Freitas Muri

Co-orientadora: Profª.Dra. Thalita Gonçalves Barros

2014

Niterói

P843 Portela, Aline Cordeiro

Desenvolvimento de candidatos a protótipos de fármacos antivirais

para os vírus da dengue e hepatite C sintetizados a partir do isomanídeo / Aline

Cordeiro Portela; Orientadora: Estela Maris Freitas Muri. – Niterói, 2014.

114f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2014.

1. Dengue 2. Hepatite C 3. Serina protease I. Muri, Estela Maris Freitas

II. Título.

CDU 616.91852

ALINE CORDEIRO PORTELA

DESENVOLVIMENTO DE CANDIDATOS A PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS

ANTIVIRAIS PARA OS VÍRUS DA DENGUE E HEPATITE C SINTETIZADOS A

PARTIR DO ISOSORBÍDEO

Dissertação apresentada no Curso de Pós-

graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para

Saúde, nível Mestrado, pela Universidade Federal

Fluminense, como requisito necessário para a

obtenção do grau de mestre. Área de

concentração: Pesquisa e monitoramento de

produtos para a saúde. Campo de confluência:

Desenvolvimento de produtos para saúde.

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Carlos Alberto Manssour Fraga

Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) – Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)

Dr. José Celestino de Barros Neto

Centro de Desenvolvimento Tecnológico em Saúde – Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)

Profª.Dra. Luiza Rosária Sousa Dias

Faculdade de Farmácia – Universidade Federal Fluminense (UFF) – membro suplente e

revisora

Profª.Dra. Estela Maris Freitas Muri

Faculdade de Farmácia – Universidade Federal Fluminense (UFF) – orientadora e

presidente da banca

2

“Sonho que se sonha só é só um sonho que se

sonha só, mas sonho que se sonha junto é

realidade”.

(Raul Seixas)

3

AGRADECIMENTOS

Agradeço às minhas orientadora e co-orientadora, respectivamente, Profa.

Dra. Estela Maris Freitas Muri e Profa. Dra. Thalita Gonçalves Barros pelos

ensinamentos, amizade, paciência e apoio, desde minha iniciação em ciência até a

conclusão deste trabalho. Minha eterna gratidão a vocês.

À CAPES pela concessão da bolsa.

À coordenadora deste programa de pós-graduação, Profa. Dra Kátia Gomes

de Lima Araújo, pelo empenho na coordenação.

Aos técnicos do LaReMN-UFF e do IV-UFF pelas análises realizadas.

Ao Prof. Ronaldo Mohana-Borges (Biofísica/UFRJ) e seu grupo de pesquisas

pelos ensaios biológicos.

Aos professores, alunos e ex-alunos do LQMed, em especial à Profª. Dra.

Luiza Rosária Sousa Dias e aos alunos e ex-alunos Bárbara Abrahim-Vieira, Pedro

Henrique Azevedo, Letícia Oliveira e Maríllia Cardoso pela amizade e apoio ao

desenvolvimento deste trabalho.

A todos os amigos da pós-graduação.

Ao meu marido Thiago Oliveira por todo amor, companheirismo e apoio

incondicional.

Aos meus pais Cláudia e Elpídio, pelo amor e apoio e, principalmente, por me

proporcionarem a mais preciosa herança: a educação.

i

SUMÁRIO

INDICE DE FIGURAS.................................................................................................iii

INDICE DE TABELAS.................................................................................................v

INDICE DE ESQUEMAS.............................................................................................vi

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS......................................................................vii

RESUMO.....................................................................................................................ix

ABSTRACT..................................................................................................................x

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

2. OBJETIVOS ............................................................................................................ 2

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 4

3.1 A DENGUE ........................................................................................................ 6

3.1.1 A TRANSMISSÃO DA DENGUE ................................................................ 7

3.1.2 EPIDEMIOLOGIA DA DENGUE NO BRASIL E NO MUNDO ..................... 8

3.1.3 O VÍRUS DA DENGUE (DENV) ................................................................ 10

3.1.4 TERAPIA ANTI-DENV ............................................................................... 11

3.2 A HEPATITE C ................................................................................................ 12

3.2.1 A TRANSMISSÃO DA HEPATITE C ........................................................ 14

3.2.2 EPIDEMIOLOGIA DA HEPATITE C NO BRASIL E NO MUNDO ............. 14

3.2.3 O VÍRUS DA HEPATITE C (HCV) ............................................................. 15

3.2.4 TERAPIA ANTI-HCV ................................................................................. 16

3.3 SERINA PROTEASES .................................................................................... 19

3.3.1 INIBIDORES DE SERINA PROTEASES .................................................. 21

3.3.2 PEPTIDEOMIMÉTICOS INIBIDORES DE SERINA PROTEASES ........... 22

3.4 DERIVADOS DO ISOMANÍDEO ..................................................................... 28

3.5 DERIVADOS DO ISOSORBÍDEO ................................................................... 32

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 34

4.1 ESTRATÉGIA SINTÉTICA ................................................................................. 35

4.2 PREPARAÇÃO DO INTERMEDIÁRIO-CHAVE: AMINA O-BENZILADA 34 . 37

4.3 PREPARAÇÃO DA SÉRIE DE PRODUTOS FINAIS 28a-c ............................ 41

ii

4.3.1 SÍNTESE DOS REAGENTES OXAZOLÔNICOS 38a-c PARA

OBTENÇÃO DE 28a-c ....................................................................................... 41

4.3.2 SÍNTESE DOS PRODUTOS FINAIS 28a-c ............................................... 43

4.4 PREPARAÇÃO DA SÉRIE DE PRODUTOS FINAIS 29a-g ........................... 44

4.5 PREPARAÇÃO DA NOVA SÉRIE DE PRODUTOS FINAIS 42a-e ................ 49

4.6 RESULTADOS FARMACOLÓGICOS ............................................................. 55

4.6.1 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DAS SÉRIES 28a-c E 29a-g EM

ENSAIOS DE INIBIÇÃO DA SERINA PROTEASE DO DENV-2. ...................... 56

4.6.2 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DAS SÉRIES 28a-c E 29a-g EM

ENSAIOS DE INIBIÇÃO DA SERINA PROTEASE DO HCV-1b. ...................... 56

4.6.3 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DA NOVA SÉRIE 42a-e EM ENSAIOS

DE INIBIÇÃO DA SERINA PROTEASE DO HCV-1b. ....................................... 59

4.7 MODELAGEM MOLECULAR ......................................................................... 60

4.7.1 ESTUDOS DE DOCKING MOLECULAR .................................................. 60

5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 63

6. EXPERIMENTAL .................................................................................................. 65

6.1 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 65

6.2 SÍNTESE .......................................................................................................... 66

6.3 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA................................................................... 97

6.3.1 ENSAIO DE ATIVIDADE DE INIBIÇÃO DA PROTEASE

RECOMBINANTE NS3PRO/4A DO HCV .......................................................... 97

6.3.2 METODOLOGIA UTILIZADA NA DOSAGEM DA CAPACIDADE

INIBITÓRIA DOS COMPOSTOS ....................................................................... 97

6.3.3 PURIFICAÇÃO E EXPRESSÃO DA NS3/4A PROTEASE ....................... 98

6.4 MODELAGEM MOLECULAR ......................................................................... 98

6.4.1 REDOCKING ............................................................................................. 98

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 100

iii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estruturas gerais dos compostos objetivados no trabalho .................. 3

Figura 2. Fêmea adulta do mosquito Aedes aegypti .............................................. 8

Figura 3. Distribuição mundial do risco de transmissão da dengue .................... 8

Figura 4. Média anual de casos de dengue e dengue hemorrágica notificados à

OMS e número médio de países notificadores ....................................................... 9

Figura 5. Morfologia do vírus da dengue .............................................................. 10

Figura 6. Poliproteína do DENV ............................................................................. 11

Figura 7. Progressão clínica após a exposição ao HCV ...................................... 13

Figura 8. Representação esquemática do genoma do HCV e os produtos de

clivagem da poliproteína viral ................................................................................ 15

Figura 9. Ciclo replicativo do HCV ......................................................................... 16

Figura 10. Estrutura tridimensional do INF-α 2b .................................................. 17

Figura 11. Estrutura química dos compostos 1a e 1b ......................................... 18

Figura 12. Estrutura química dos compostos 2a e 2b ......................................... 18

Figura 13. Estrutura química dos compostos 3 .................................................... 19

Figura 14. Estrutura química dos compostos 4,5 e 6 ........................................... 24

Figura 15. Estrutura química dos compostos 7 e 8 .............................................. 26

Figura 16. Estrutura química dos compostos 9 .................................................... 27

Figura 17. Estrutura química dos compostos 10, 11 e 12 .................................... 27

Figura 18. Estrutura química dos compostos 13 e 14 .......................................... 28

Figura 19. Estrutura química do isomanídeo ........................................................ 29

Figura 20. Estrutura química dos compostos 16, 17 e 18 .................................... 30

Figura 21. Compostos com melhor perfil de atividade biológica desenvolvidos

pelo grupo ................................................................................................................ 32

Figura 22. Estrutura química do composto 27 ...................................................... 33

Figura 23. Sinais e bandas características do composto 29a nos espectros de

RMN1H e IV ............................................................................................................... 48

Figura 24. Planejamento estrutural da série de compostos 42a-e ...................... 49

Figura 25. Resultados de inibição enzimática da protease do DENV-2 pelos

compostos 28a-c e 29a-g ........................................................................................ 56

iv

Figura 26. Inibição enzimática dos compostos 28a-c e 29a-g frente à HCV

protease ................................................................................................................... 57

Figura 27. Curva dose-resposta para os compostos 20a e 28a frente à inibição

da enzima NS3/4A protease do HCV ...................................................................... 58

Figura 28. Inibição enzimática dos compostos 28a e 42a-e frente à HCV

protease ................................................................................................................... 59

Figura 29. (A) Estrutura química do inibidor HU1. (B) Sobreposição da melhor

pose de docking do inibidor (em rosa) e da conformação de raios-X (em

amarelo), RMSD=1,09Å ........................................................................................... 61

Figura 30. (A) Docking molecular do composto 28a no sítio ativo da NS3/NS4

protease do HCV visualizado no programa PyMOL. (B) Interações entre a

proteína em estudo e a pose obtida no docking gerada pelo programa

PoseView.................................................................................................................. 62

Figura 31. Composto 28a na cavidade da enzima serina protease do HCV ....... 62

Figura 32. Planejamento estrutural da série de compostos 42a-e ...................... 64

v

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Os arbovírus mais importantes causadores de doença humana ......... 4

Tabela 2: Os mais importantes membros da família Flaviviridae ......................... 5

Tabela 3: Caracterização dos compostos finais 28a-c ........................................ 44

Tabela 4. Síntese e características físicas dos peptideomiméticos 29a-g ........ 47

Tabela 5. Caracterização dos compostos finais 42a-d ........................................ 53

vi

ÍNDICE DE ESQUEMAS

Esquema 1. Mecanismo catalítico da serina protease ......................................... 20

Esquema 2. Compostos desenvolvidos pelo grupo contendo o cerne derivado

do isomanídeo ........................................................................................................ 31

Esquema 3. Modificação estrutural para o planejamento das séries 28 e 29 .... 34

Esquema 4. Modificação estrutural para o planejamento da série 42 ................ 35

Esquema 5. Estratégia sintética para obtenção dos intermediários-chave 34 e

47 .............................................................................................................................. 36

Esquema 6. Estratégia sintética para obtenção das séries 28a-c, 29a-g e 42a-e

.................................................................................................................................. 36

Esquema 7. Reação de tosilação do isosorbídeo ................................................ 37

Esquema 8. Síntese do intermediário benzilado 32 ............................................. 38

Esquema 9. Síntese da azida 33 ............................................................................. 39

Esquema 10. Obtenção do líquido iônico [bmim]+BF4 ......................................... 40

Esquema 11. Síntese da amina 34 ......................................................................... 41

Esquema 12. Obtenção da N-benzoilglicina (41) .................................................. 41

Esquema 13. Síntese das oxazolonas 38a-c ......................................................... 42

Esquema 14. Síntese dos produtos finais 28a-c .................................................. 43

Esquema 15. Mecanismo de formação do anidrido carboxílico por reação com

DCC .......................................................................................................................... 45

Esquema 16. Reação de formação da ligação peptídica entre o anidrido

carboxílico e a amina .............................................................................................. 46

Esquema 17: Síntese das oxazolonas 38d-f ......................................................... 49

Esquema 18. Obtenção da p-cloro-N-benzoilglicina (43) ..................................... 50

Esquema 19. Obtenção da oxazolona 38g ............................................................ 51

Esquema 20. Síntese dos compostos finais 42a-d ............................................... 52

Esquema 21. Síntese do intermediário 45 ............................................................. 54

Esquema 22. Rota sintética para obtenção da amina 47 ..................................... 54

Esquema 23. Síntese do produto final 42e ........................................................... 55

vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Asp Ácido aspártico

Bn Benzila

Boc Carbonato de terc-butila

BVDV-1/2 Vírus da diarreia bovina viral 1/2

d Dupleto

DC Dengue clássica

dd Duplo dupleto

DENV Vírus da dengue

DST Doença sexualmente transmissível

FDA Food and Drug Administration

FHD Febre hemorrágica da dengue

HCV Vírus da hepatite C

HIV Vírus da imunodeficiência humana (Human Immunodeficiency Virus)

His Histidina

IC50 Concentração inibitória mínima para inibir 50% da atividade in vitro

IV Infravermelho

IFN-α Intereron alfa

JEV Vírus da Encefalite Japonesa (Japanese Encephalitis Virus)

Ki Constante de inibição enzimática

Lis Lisina

m Multipleto

OMS Organização Mundial de Saúde

PEG-INF Interferon peguilado

p.f. Ponto de fusão

RBV Ribavirina

RMN Ressonância magnética nuclear

RNA Ácido ribonucleico

RNAm Ácido ribonucleico mensageiro

s Simpleto

SAR Estudo de relação estrutura-atividade

SCD Síndrome do Choque da Dengue

viii

Ser Serina

t Tripleto

t.a. Temperatura ambiente

TBAB Brometo de tetra-n-butilamônio

TBEV-EU Vírus da Encefalite transmitida por carrapato, Subtipo Europeu

(Tickborne Encephalitis Virus, European Subtype)

TBEV-FE Vírus da Encefalite transmitida por carrapato, Subtipo Extremo Oriente

(Tickborne Encephalitis Virus Far Eastern)

WNV Vírus do Oeste do Nilo (West Nile Virus)

YFV Vírus da Febre Amarela (Yellow Fever Virus)

ix

RESUMO

A dengue é um problema de saúde pública mundial, acometendo cerca de 50

milhões de pessoas por ano. O HCV é a principal causa de hepatite crônica e

estima-se que 200 milhões de pessoas estejam infectadas no mundo. A terapia atual

contra o HCV apresenta eficácia limitada e baixa tolerância, enquanto que para a

dengue não existe um tratamento antiviral específico. Com o objetivo de explorar

essa demanda, o presente trabalho descreve a síntese para a obtenção de quinze

compostos peptideomiméticos inéditos, contendo o cerne rígido proveniente do

isosorbídeo, como potenciais agentes inibidores da enzima NS3 protease de ambos

os vírus. A estratégia de síntese dos peptideomiméticos consistiu inicialmente na

obtenção de dez compostos inéditos, das séries 28a-c (derivada de oxazolonas) e

29a-g (derivada de aminoácidos N-protegidos). Os compostos foram inicialmente

testados frente à inibição da protease do DENV-2, os quais não apresentaram

resultados significativos. Entretanto, os resultados de inibição enzimática dos

compostos frente à NS3/4A do HCV-1b foram mais satisfatórios, sendo o composto

28a (1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-2-(benzoilamino)-1-oxo-3-(2-tienil)-2-propen-1-il]amino]

-2-deoxi-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol, o mais ativo, com IC50 = 88µm. Estudos de docking

molecular foram realizados para avaliar o modo de interação dos ligantes com a

serina protease NS3/4A do HCV. Dentre os compostos sintetizados, 28a foi

considerado protótipo para o desenvolvimento de novos compostos com potencial

de inibição da enzima em questão. A partir de 28a, a nova série de compostos

inéditos 42a-e foi proposta e obtida. Os resultados dos ensaios farmacológicos

frente à NS3/4A do HCV-1b permitiram-nos inferir que a substituição do tiofeno de

28a pelo furano e 3-metiltiofeno em 42b e 42c, respectivamente, resultou em um

aumento de cerca de 30% no perfil de inibição enzimática, com inibição de 70%

dessa enzima viral. Dessa forma, podemos identificar esses dois novos compostos

como protótipos para o planejamento de futuras moléculas potencialmente inibidoras

da enzima serina protease do vírus da Hepatite C.

Palavras-chave: Serina protease; isosorbídeo; peptideomiméticos; dengue; hepatite

C.

x

ABSTRACT

Dengue fever is a worldwide public health concern, affecting approximately 50

million people per year. HCV is the main cause of chronic hepatitis and it is estimated

that 200 million people are infected worldwide. Current therapy against HCV has

limited efficacy and low tolerance, and there is no specific antiviral treatment for

dengue fever. In order to exploit this demand, this work describes the synthesis for

obtaining fifteen novel peptidemimetic compounds, isosorbide derivatives as potential

inhibitory agents of the NS3 protease enzyme of both viruses. Initially the synthetic

strategy of peptidemimetics consisted in obtaining ten novel compounds: 28a-c

(derived from oxazolones) and 29a-g (derived from N-protected amino acids) series.

The compounds were initially tested on the inhibition of protease DENV-2 , which

results were not significant. However, the results of enzymatic inhibition of the

compounds against the NS3/4A HCV-1b was more satisfactory, and the compound

28a (1,4 : 3,6- dianhydro -5 - [[( 2Z ) -2- ( benzoylamino) -1 -oxo- 3- (2- thienyl) -2 -

propen -1- yl] amino] -2- deoxy -2- O- ( phenylmethyl ) -D- iditiol) , the most active ,

presenting IC50 = 88μm. Molecular docking studies were performed to assess the

compounds mode of interaction with the serine protease NS3 / 4A HCV. Among the

compounds synthesized, 28a was considered a prototype for the development of

new compounds with a potential inhibition of the enzyme in question. Staring from

28a as a prototype the 42a-e serie was proposed and obtained. The results of

pharmacological tests against the NS3/ 4A HCV -1b allowed us to conclude that

substitution of the 28a furan thiophene and 3- methylthiophene in 42b and 42c

respectively resulted in an increase of 30 % in the profile enzyme inhibition , with

inhibition of 70 % of the viral enzyme . Thus , we can identify these new compounds

as prototypes for planning future potentially molecule inhibitors of serine protease

enzyme of the Hepatitis C virus.

Keywords: Serine protease; isosorbide; peptidemimetics; dengue fever; hepatitis C.

1

1. INTRODUÇÃO

Os vírus da dengue e da hepatite C, pertencentes à família Flaviviridae, são

causadores de doenças que acometem grande parte da população mundial.

Entretanto, sabe-se que para a dengue não existe tratamento antiviral específico,

enquanto que para a hepatite C a terapia atual apresenta baixa tolerância e eficácia

limitada (SIMMONS, 2012); (GHANY, 2009).

Com o objetivo de responder a essa demanda, diversos trabalhos do grupo

vêm demonstrando com sucesso a obtenção de moléculas quirais inéditas,

derivadas do isomanídeo, as quais têm apresentado algum perfil de inibição da

protease NS3 do HCV e do DENV (ABRAHIM-VIEIRA,2014); (BARROS,2012);

(BARROS,2010); (BARROS, 2009); (MURI,2007); (MURI, 2005); (MURI, 2004).

Sabe-se que a formação de complexos entre estruturas quirais e enzimas ou

receptores estereoespecíficos pode levar a respostas biológicas diferentes,

dependendo da estereoquímica do ligante. O número crescente de estudos

relacionando propriedades biológicas com quiralidade molecular confirma a

crescente demanda pelo assunto (BARREIRO, 1997); (BONATO, 2005).

Considerando essa demanda e com o intuito de analisar a influência da

mudança da estereoquímica na atividade biológica dos compostos

peptideomiméticos, o grupo decidiu investigar a estrutura e reatividade do 1,4:3,6-

dianidro-D-glucitol ou isosorbídeo (27), um diastereoisômero do isomanídeo.

2

2. OBJETIVOS

O planejamento de inibidores peptideomiméticos sintéticos consiste em uma

alternativa ao uso de peptídeos naturais, já que podem fornecer melhor seletividade

e biodisponibilidade oral, além de outras vantagens a serem discutidas.

Baseando-se na credibilidade dos compostos peptideomiméticos respaldada

pela comercialização de vários fármacos com esse tipo de estrutura, este trabalho

tem como objetivos principais: o planejamento, síntese e avaliação biológica de

compostos peptideomiméticos, derivados do isosorbídeo (27), como potenciais

inibidores da serina protease presente nos vírus da dengue e hepatite C.

Nesse contexto, os objetivos específicos deste trabalho consistem no:

Planejamento e síntese de compostos peptideomiméticos derivados do

isosorbídeo (27), representados pelas séries 28a-c e 29a-g (Figura 1); e

posteriormente da série 42a-e.

Caracterização estrutural de todos os compostos obtidos sinteticamente;

Avaliação biológica do potencial de inibição dos peptideomiméticos

sintetizados frente às serina proteases do DENV e HCV.

Realização de estudos de docking molecular a fim de se estabelecer a

relação estrutura-atividade e compreender o modo de interação destas

substâncias com a serina protease.

3

Figura 1. Estruturas gerais dos compostos objetivados no trabalho.

4

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Os arbovírus constituem um dos maiores grupos virais existentes,

apresentando distribuição mundial. O termo arbovírus é uma contração da frase em

inglês “arthropod-borne virus”, adotado para designar os vírus transmitidos por

artrópodes hematófogos. Sendo assim, esse termo não constitui uma classificação

taxonômica, apesar disso, essa designação apresenta enorme importância prática.

As arboviroses são alguns dos principais problemas de saúde pública do mundo no

início do terceiro milênio. Há atualmente 534 vírus registrados no Catálogo

Internacional de Arbovírus, dentre os quais, 25% são conhecidamente causadores

de doenças em humanos. As principais famílias de arbovírus são: Togaviridae,

Flaviviridae e Bunyaviridae (GUBLER, 2001) (Tabela 1).

Tabela 1: Os arbovírus mais importantes causadores de doença humana.

Família/vírus Vetores Hospedeiros vertebrados

Togaviridae

Chikungunya mosquitos humanos e primatas

Ross River mosquitos humanos e marsupiais

Mayaro mosquitos pássaros

Flaviviridae

Dengue mosquitos humanos e primatas

Febre amarela mosquitos humanos e primatas

Encefalite japonesa mosquitos pássaros e porcos

Encefalite transmitida por

carrapatos

carrapatos pássaros e roedores

Bunyaviridae

Encefalite da Califórnia mosquitos roedores

Febre hemorrágica

Crimean-Congo

carrapatos roedores

(Adaptado de GUBLER, 2001)

5

A família Flaviviridae compreende mais de 70 vírus, distribuídos entre os

gêneros: Flavivírus, Pestivírus e Hepacivírus. Os vírus do gênero Pestivírus são

considerados patógenos de animais, enquanto o gênero Hepacivírus é formado

apenas pelo vírus da hepatite C (HCV). O gênero Flavivírus é considerado de

grande importância, pois é constituído por muitos patógenos humanos, como os

vírus da dengue (DENV), da Febre Amarela, do Oeste do Nilo, da Encefalite

Japonesa, entre outros (LINDENBACH, 2007) (Tabela 2).

Tabela 2: Os mais importantes membros da família Flaviviridae.

Unidade taxonômica Exemplos representativos

Flavivírus

Transmitidos por carrapatos:

Grupo transmitido por carrapatos a

mamíferos (15)

Grupo transmitido por carrapatos a aves

marinhas (4)

Vírus da Encefalite transmitida por

carrapato, Subtipo Europeu (TBEV-EU);

e Subtipo Extremo Oriente (TBEV-FE)

Vírus Tyuleniy

Transmitidos por mosquitos:

Grupo Aroa vírus (4)

Grupo do vírus da Dengue (5)

Grupo da Encefalite Japonesa (10)

Grupo do vírus da Febre Amarela (9)

Aroa vírus

Vírus da Dengue, tipos 1-4 (DENV-1 a

DENV-4)

Kedougou vírus

Vírus da Encefalite Japonesa (JEV)

Vírus do Oeste do Nilo (WNV)

Vírus da Febre Amarela (YFV)

Vírus com nenhum vetor conhecido:

Grupo do vírus do Rio Bravo (7) Vírus do Rio Bravo

Pestivirus

Vírus da diarreia bovina viral 1 (BVDV-

1),quatro sorotipos

Vírus da diarreia bovina viral 2 (BVDV-

2), dois sorotipos

Hepacivirus

Vírus da Hepatite C (HCV), seis

sorotipos

(Adaptado de LINDENBACH, 2007)

6

Dentre os vírus da família Flaviviridae, o vírus da dengue e o vírus da hepatite

C são considerados de grande importância, pois são causadores de doenças que

constituem problemas de saúde pública mundial (GUBLER, 2001).

3.1 A DENGUE

A dengue é uma das doenças negligenciadas mais difundidas no mundo. A cada

ano, cem milhões de pessoas infectam-se com o DENV, principalmente nas cidades

e zonas urbanas tropicais, enquanto cerca de 2,5 bilhões de pessoas sofrem com

risco de infecção (NOGUEIRA, 1999).

A dengue é uma doença febril aguda, de etiologia viral com quatro diferentes

sorotipos: DEN-1-4. Essa doença pode se manifestar clinicamente de quatro

maneiras diferentes: infecção inaparente, dengue clássica (DC), febre hemorrágica

da dengue (FHD) ou síndrome do choque da dengue (SCD). A evolução do quadro

clínico pode ser benigna, quando a doença se manifesta na forma clássica e grave

quando se apresenta na forma hemorrágica (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).

A dengue clássica é a forma mais comum de manifestação da doença,

caracterizada inicialmente por febre alta (39-40ºC), de início abrupto, associada a

diarreia, prostração, mialgia, artralgia, dor retro-orbitária, exantema maculopapular

acompanhado ou não de prurido. No final do período febril, podem surgir

manifestações hemorrágicas como epistaxe, petéquias, gengivorragia, metrorragia e

outros. Em casos mais raros, podem existir sangramentos maiores como

hematêmese, melena ou hematúria. A presença de manifestações hemorrágicas não

é exclusiva da febre hemorrágica da dengue e quadros com plaquetopenia

(<100.000/mm3) podem ser observados, com ou sem essas manifestações

(SIMMONS, 2012).

Os sintomas da dengue hemorrágica são os mesmos da dengue clássica,

todavia, entre o terceiro e sétimo dia do seu início, quando da defervescência da

febre, surgem sinais e sintomas mais graves como vômitos, dor abdominal intensa,

hepatomegalia dolorosa, desconforto respiratório, letargia, derrames cavitários.

Estes sinais de alarme precedem as manifestações hemorrágicas, que podem ser

fatais em 5% dos casos (RIGAU-PÉREZ, 1998).

7

A evolução da dengue hemorrágica pode levar a um quadro de síndrome do

choque da dengue, que se caracteriza por importantes alterações da permeabilidade

capilar e grande extravasamento de plasma, que atingem órgãos como o fígado,

pulmão, coração, rins e que podem trazer complicações neurológicas (RIGAU-

PÉREZ, 1998).

3.1.1 A TRANSMISSÃO DA DENGUE

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), a dengue é hoje a

arbovirose mais importante que afeta o homem, constituindo um sério problema de

saúde pública no mundo, principalmente em países tropicais, onde as condições do

meio ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do Aedes aegypti,

principal mosquito vetor (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).

Considerando que a vida média do mosquito Aedes aegypti é de 45 dias,

nesse período, um único mosquito pode contaminar até 300 pessoas

(BULUGAHAPITIYA, 2007). A transmissão se faz pela picada da fêmea do mosquito

hematófago Aedes aegypti (Figura 2), no ciclo homem – mosquito – homem, sendo

um mosquito de hábitos diurnos. Após um repasto com sangue infectado, ocorre

uma infecção das células epiteliais do intestino do mosquito, que se propaga através

da lâmina basal do intestino para a circulação e infecta as glândulas salivares do

vetor. O período de incubação intrínseca é de 8-12 dias, após o qual o mosquito

poderá transmitir o vírus. Ao picar o hospedeiro, a fêmea do mosquito regurgita a

saliva, na qual encontram-se substâncias anticoagulantes evitando a coagulação

durante a alimentação, e por conseguinte o vírus é introduzido dentro da corrente

sanguínea da vítima (McBRIDE, 2008).

A transmissão mecânica também é possível, quando o repasto de sangue

infectado é interrompido e o mosquito, imediatamente, se alimenta num hospedeiro

suscetível próximo (RIGAU-PÉREZ, 1998).

O homem infectado é capaz de transmitir o vírus ao mosquito durante o

período de viremia, que começa um dia antes da febre e perdura até o sexto dia da

doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).

8

Figura 2. Fêmea adulta do mosquito Aedes aegypti.

(Adaptado de BULUGAHAPITIYA, 2007).

3.1.2 EPIDEMIOLOGIA DA DENGUE NO BRASIL E NO MUNDO

Nos últimos 50 anos, a incidência da dengue aumentou 30 vezes. Este

aumento foi acompanhado da expansão geográfica da doença para países sem

antecedentes de infecção e, nesta última década, de áreas urbanas para áreas

rurais. Cerca de 50 milhões de infecções pelo DENV ocorrem anualmente e

aproximadamente 2,5 bilhões de pessoas vivem em países endêmicos (WHO, 2009)

(Figura 3).

Figura 3. Distribuição mundial do risco de transmissão da dengue.

(Adaptado de SIMMONS, 2012).

A dengue é uma doença que tem sido relatada há mais de 200 anos. A FHD

foi relatada pela primeira vez na década de 1950, durante as epidemias de dengue

nas Filipinas e Tailândia, e em 1970, nove países já haviam relatado epidemia de

9

dengue hemorrágica. Esses números vêm aumentando a cada ano, atingindo mais

de 50 países na década de 2010 (WHO, 2009) (Figura 4).

Figura 4. Média anual de casos de dengue e dengue hemorrágica notificados à

OMS e número médio de países notificadores.

(Adaptado de WHO, 2009).

No Brasil, as primeiras referências de epidemias são do ano de 1916, no

estado de São Paulo, e em 1923, em Niterói-RJ, sem diagnóstico laboratorial

comprovatório. A primeira epidemia documentada clínica e laboratorialmente ocorreu

em 1981-1982 em Boa Vista (RR), causada pelos sorotipos DENV-1 e DENV-4

(ROCCO, 2012).

A partir de 1986, foram registradas epidemias em diversos estados com a

introdução do sorotipo DENV-1. A introdução dos sorotipos DENV-2 e DENV-3 foi

detectada no estado do Rio de Janeiro em 1990 e em 2000, respectivamente. O

sorotipo DENV-3 apresentou uma rápida dispersão para 24 estados do país no

período de 2001-2003. Em 2003, apenas os estados do Rio Grande do Sul e Santa

Catarina não apresentavam transmissão autóctone da doença. As maiores

epidemias detectadas até o momento ocorreram nos anos de 1998 e 2002, com

cerca de 530 mil e 800 mil casos notificados, respectivamente. Os primeiros casos

de FHD foram registrados em 1990 no estado do Rio de Janeiro, após a introdução

do sorotipo DENV-2 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010).

10

Em agosto de 2010, os primeiros casos de dengue causados pelo sorotipo

DENV-4 foram registrados em Boa Vista (RR). Subsequentemente, o vírus foi

detectado no norte (estados do Amazonas e Pará) e no nordeste (estados da Bahia,

Pernambuco e Piauí) do país. No sudeste, o primeiro episódio notificado ocorreu no

Rio de Janeiro em 2011. A presença do sorotipo DENV-4 no Brasil é causa de maior

preocupação, pois uma vez que este sorotipo não circulava no país por 30 anos, sua

reintrodução em um território que já convive com a transmissão de outros 3 sorotipos

aumenta a possibilidade de casos mais graves da doença (ROCCO, 2012).

3.1.3 O VÍRUS DA DENGUE (DENV)

3.1.3.1 Morfologia viral

A estrutura do DENV consiste em um genoma de fita simples de RNA positivo

e três proteínas estruturais: a proteína C (capsídeo), a proteína prM (membrana) e a

glicoproteína E (envelope). Além disso, o vírus apresenta sete proteínas não

estruturais: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a e NS4b e NS5 (MELINO, 2007). A

partícula viral é esférica, envelopada, com diâmetro de cerca de 50 nm. A superfície

do vírus maduro é lisa, com as proteínas do envelope alinhadas em pares paralelos

à superfície. A glicoproteína E modula adesão celular e fusão e é também o principal

alvo de anticorpos protetores. Ela é dividida em três domínios estruturais ou

funcionais: o domínio central; o domínio de dimerização que apresenta um peptídeo

de fusão e o domínio de ligação ao receptor (Figura 5) (WHITEHEAD, 2007).

Figura 5. Morfologia do vírus da dengue.

(Adaptado de WHITEHEAD, 2007).

11

3.1.3.2 Ciclo reprodutivo

A ligação da proteína E (proteína de adesão viral) com o receptor da célula

alvo do hospedeiro consiste na primeira etapa do processo infectivo (LESCAR,

2008). Após esse reconhecimento, ocorre a fusão das membranas virais e celulares

e a entrada do vírus na célula. O genoma viral dissocia-se do nucleocapsídeo e

entra no citoplasma onde funciona como RNA mensageiro, que é traduzido em uma

grande poliproteína. A poliproteína é posteriormente processada nas três proteínas

estruturais e sete proteínas não estruturais do vírus (WHITEHEAD, 2007);

(GUZMAN, 2010) (Figura 6).

Figura 6. Poliproteína do DENV.

(Adaptado de GUZMAN, 2010).

Esse processamento ocorre pela participação de proteases da célula

hospedeira e de uma serina protease (NS3pro), proveniente da partícula viral, cuja

atividade é essencial para o sucesso de replicação viral (NOBLE, 2010). Por esse

motivo, a NS3pro constitui um alvo de interesse para o desenvolvimento de

abordagens terapêuticas para o tratamento da dengue (BARROS, 2010).

3.1.4 TERAPIA ANTI-DENV

Até o momento não existe uma terapia específica para a dengue, havendo

somente o tratamento dos sintomas decorrentes da patologia. A medicação

sintomática deve ser feita com analgésicos e antitérmicos (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

12

2002). A possibilidade de evolução da DC para a FHC ou SCD, doenças de alta

letalidade, demonstra a necessidade de desenvolvimento de terapias específicas

contra a doença.

Em resposta a essa demanda, grandes esforços estão sendo empregados ao

redor do mundo para o desenvolvimento de vacinas e fármacos contra o DENV.

Desde a década de 70, a OMS tem patrocinado diversos estudos que ampliam os

conhecimentos sobre a imunidade dos sorotipos e a fisiopatologia da FHD/SCD, que

são essenciais para o desenvolvimento de vacinas seguras e efetivas contra a

dengue (INNIS, 2003). Como consequência, o campo de pesquisa sobre a dengue

foi revigorado na última década, alimentado pelo crescente reconhecimento da

importância da doença juntamente com a perspectiva de uma vacina contra a

mesma (SIMMONS, 2012). De acordo com a base de dados mundial sobre estudos

clínicos em andamento, disponível no site http://clinicaltrials.gov, em junho de 2014,

23 ensaios clínicos estão em andamento visando o desenvolvimento de vacinas e

testes diagnósticos contra a doença. É importante enfatizar que nenhum desses

estudos se trata do desenvolvimento de um fármaco contra a doença e que a

dengue é considerada uma doença negligenciada pela OMS, o que constitui uma

lacuna a ser explorada pela ciência.

Além disso, embora o ritmo de desenvolvimento de vacinas tenha aumentado

recentemente, os desafios que se colocam ao desenvolvimento de uma vacina

aceitável ainda são significativas. Pouco se sabe sobre o potencial de interferência

na replicação entre os componentes de um vírus vivo atenuado de uma vacina

tetravalente, em especial no contexto dos vacinados com níveis variáveis de

imunidade pré-existente (WHITEHEAD, 2007). Além disso, outro problema é a falta

de um modelo animal para a testagem das vacinas. Embora os modelos mais

utilizados, ratos e macacos, sejam infectados pelo DENV, esses animais não

apresentam uma patologia semelhante à dos humanos, elevando assim os custos

das pesquisas devido à dificuldade para se avaliar a proteção vacinal (GIBBONS,

2002); (GUY,2010).

3.2 A HEPATITE C

Hepatite constitui um termo geral que significa doença inflamatória que atinge

os hepatócitos, levando a uma inflamação generalizada no fígado. As hepatites

13

podem ser causadas por agentes infecciosos, tóxicos ou por doenças auto-imunes.

As hepatites causadas por agentes infecciosos virais são as de maior importância

clínica, já que acometem o maior número de pacientes. As hepatites virais podem

ser causadas por vários vírus como os das hepatites A, B, C, D e E (COREL, 2011).

A infecção aguda pelo HCV é geralmente assintomática e silenciosa. Neste

estágio é dificilmente detectada, mas caso seja, é passível de tratamento. Alguns

pacientes eliminam o vírus espontaneamente, através de mecanismos ainda não

esclarecidos, mas 60-85% dos mesmos tornam-se cronicamente infectados. A maior

parte dos portadores crônicos não desenvolve doença hepática significativa, todavia,

entre 20-30% irá desenvolver cirrose em um período de 20 anos. A progressão da

doença do fígado pode durar várias décadas e fatores como consumo de álcool,

diabetes, infecção por HIV ou outros vírus no fígado, além de ter contraído a hepatite

C em idade avançada, contribuem para acelerar a evolução da doença (COREL,

2011) (Figura 7).

Figura 7. Progressão clínica após a exposição ao HCV. (COREL, 2011).

14

3.2.1 A TRANSMISSÃO DA HEPATITE C

A transmissão do HCV ocorre pelo contato com sangue infectado pela: exposição

através da pele (contato de instrumentos pérfuro-cortantes), transfusão de sangue

e/ou hemoderivados, compartilhamento de equipamentos para uso de drogas,

confecção de tatuagens e colocação de piercing, compartilhamento de objetos de

uso pessoal como pedicure/manicure e transplantes de órgãos de doadores

infectados. A transmissão sexual pode ocorrer quando não houver o uso de

preservativos. A presença de alguma doença sexualmente transmissível (DST),

incluindo o HIV, facilita a transmissão do vírus (SHARARA, 1996).

3.2.2 EPIDEMIOLOGIA DA HEPATITE C NO BRASIL E NO MUNDO

Um levantamento epidemiológico preciso é dificultado pelo fato da hepatite C se

apresentar, na maioria dos casos, como uma doença silenciosa. Normalmente, o

relato da doença só é possível quando ocorre a evolução para um quadro

sintomático ou quando o paciente passa por procedimento médico em que a

pesquisa de anticorpos contra o HCV é realizada. Por esse motivo, todos dos dados

epidemiológicos da doença se baseiam em estimativas (SHEPARD, 2005).

De acordo com a OMS, estima-se que cerca de 3% da população mundial

seja portadora do vírus e que cerca de 170 milhões de pessoas sejam portadores

crônicos em risco de desenvolvimento de cirrose hepática e/ou câncer de fígado

(MAO, 2008). No Brasil, foram confirmados 69.952 casos de hepatite C no período

de 1999 a 2010. Destes, 47.830 provêm da Região Sudeste e 15.095 da Região Sul,

que juntas concentram 90% dos casos confirmados no país. A maior proporção de

casos de hepatite C confirmados entre 1999 e 2010 encontra-se na faixa etária de

40 a 59 anos, que detém 54,4% dos eventos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).

15

3.2.3 O VÍRUS DA HEPATITE C (HCV)

3.2.3.1 Morfologia viral

O HCV é um vírus envelopado, constituído por uma fita única positiva de

RNA, com um genoma de aproximadamente 9.600 nucleotídeos. Seu RNA é

codificado em uma poliproteína que é processada por proteases virais e da célula

hospedeira, resultando em 5 proteínas virais estruturais (C, E1, E2, P7 e 2) e 6

proteínas não-estruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) (Figura 8)

(MELINO,2007).

Figura 8. Representação esquemática do genoma do HCV e os produtos de

clivagem da poliproteína viral.

(Adaptado de BARTENSCHLAGER, 2000).

Os genótipos de 1-6 deste vírus são os mais importantes, sendo os mesmos

subdivididos em mais de 50 subtipos (1a, 1b, 2a, etc). Os genótipos chegam a

apresentar 30 a 50% de diferença no seu RNA, o que constitui grande variabilidade

genética entre as cepas. Esta divisão é importante porque cada subtipo tem

características próprias de agressividade e resposta ao tratamento. Genótipos 1 e 4

apresentam maior resistência ao tratamento com interferon do que os genótipos 2 e

3, por exemplo (McOMISH, 1994).

Essas variações genotípicas entre os subtipos induzem respostas muito

específicas do sistema imunológico, o que dificulta a produção de vacinas. Além

disso, a existência de vários subtipos que respondem de maneiras variadas aos

16

limitados tratamentos existentes amplia a necessidade de desenvolvimento de novos

fármacos contra o vírus.

3.2.3.2 Ciclo replicativo

O ciclo do HCV é semelhante ao do DENV, sendo a partícula viral endocitada

pela superfície da célula hospedeira através de receptores ainda não bem

conhecidos (PILERI, 1998). Após a endocitose, ocorre o processo de fusão da

membrana viral (controlado pelas glicoproteínas E1 e E2) com a membrana

endossomal, levando à formação do poro lipídico que libera o nucleocapsídeo no

citoplasma. Com a desmontagem dos nucleocapsídeos, há a liberação do RNA viral

no citoplasma, que é então traduzido em uma grande poliproteína precursora que se

insere na membrana do retículo endoplasmático. Nesta etapa, ocorre a clivagem da

poliproteína pelas proteases do hospedeiro e pelas proteases virais NS2 e NS3/4a,

provenientes da própria partícula viral (Figura 9) (BARTENSCHLAGER,2000).

Figura 9. Ciclo replicativo do HCV. (Adaptado de FLYING PUBLISHER, 2013).

3.2.4 TERAPIA ANTI-HCV

O tratamento tem como objetivo a supressão sustentada da replicação do

vírus, prevenindo a progressão da doença e consiste no uso de interferon-α (INF-α),

17

interferon peguilado (PEG-INF) ou um destes agentes combinados com a ribavirina

(RBV) (1b) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011). Entretanto, o uso da terapia

combinada, INF-α mais RBV, trouxe melhores taxas de resposta viral sustentada

(38-43%) em comparação com a monoterapia com INF-α (10-19%), introduzida nos

anos 90 (GHANY, 2009); (HAYASHI, 2006).

O INF-α é uma proteína produzida endogenamente para proteger o organismo

de agentes externos como vírus, bactérias ou células tumorais. O INF-α age

diretamente contra o vírus inibindo a replicação viral e aumentando a resposta

imune, além de bloquear a síntese do genoma do HCV por inibição da enzima NS5B

polimerase, em culturas de hepatócitos humanos (CASTET, 2002). Na terapêutica, o

INF-α é administrado intravenosamente e possui meia-vida de 2-4 horas (RANG,

2007) (Figura 10).

Figura 10. Estrutura tridimensional do INF-α 2b. (DRUGBANK, 2014).

O PEG-INF (1a) é o resultado de uma conjugação do interferon clássico com

moléculas de polietilenoglicol (PEG), processo conhecido como peguilação. As

moléculas de PEG são praticamente inertes no organismo, apresentando velocidade

lenta de eliminação. Então, através da peguilação, converte-se um interferon

clássico em um medicamento com maior tempo de meia-vida, permitindo que a

administração do mesmo ocorra em intervalos maiores (CALICETI, 2004).

A RBV (1b) é um nucleosídeo sintético, com estrutura similar à guanosina.

Acredita-se que seu mecanismo de ação se baseie na interferência da síntese do

RNAm viral (RANG, 2007). Além disso, foi observado que a RBV leva a altas taxas

de mutações no RNA viral levando à inviabilidade do genoma viral (CROTTY, 2001).

18

Figura 11. Estrutura química dos compostos 1a e 1b.

Apesar desses tratamentos serem largamente utilizados, eles mostram baixa

eficácia clínica por insuficiente inibição da replicação do vírus, baixa tolerabilidade e

número elevado de contra-indicações, demonstrando urgência no desenvolvimento

de fármacos antivirais mais efetivos (GHANY, 2009).

Em 2011, o FDA (Food and Drug Administration) aprovou dois novos

medicamentos, inibidores de protease viral, o boceprevir (2a) (Victrelis®) e o

telaprevir (2b) (Incivek/Incivo®), ambos também já aprovados pela ANVISA (Agência

Nacional de Vigilância Sanitária) (PERNI, 2006). Apesar da boa atividade contra o

genótipo 1 do HCV, a monoterapia com esses agentes resultou em rápida seleção

de variantes droga-resistentes. Estudos de fase II e III mostraram que a combinação

desses protótipos com PEG-INF e RBV levou a uma substancial redução na

frequência de mutantes resistentes (BACON, 2011) (HÉZODE, 2009). Assim, eles

são empregados como um terceiro medicamento no tratamento de pacientes com

hepatite C crônica (infectados com o genótipo 1), junto com o PEG-INF e RBV,

visando a obtenção de maior resposta terapêutica (OMS, 2011); (SOCIEDADE

BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA, 2011).

Figura 12. Estrutura química dos compostos 2a e 2b.

19

Em 2013, o FDA aprovou o medicamento sofosbuvir (3) (Sovaldi/Virunon®),

um análogo de nucleotídeo usado em combinação com outras drogas para o

tratamento da hepatite C. Comparado com tratamentos prévios, os regimes de

tratamentos baseados no sufosbuvir apresentam maiores taxas de cura e diminuição

dos efeitos adversos e tempo de tratamento, além da não necessidade de co-

administração de interferon (FDA, 2013). O medicamento já se encontra em fase de

aprovação no Brasil e espera-se que esteja disponível na rede pública dentro de

dois anos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).

Figura 13. Estrutura química dos compostos 3.

3.3 SERINA PROTEASES

Proteases são enzimas com importantes papéis fisiológicos, envolvidas em

processos biológicos essenciais como a coagulação sanguínea, morte celular,

diferenciação de tecidos, entre outros. Essas enzimas catalisam a hidrólise de

ligações peptídicas presentes em proteínas ou peptídeos, liberando peptídeos de

tamanho variável ou aminoácidos livres (SALAGA, 2013).

As proteases podem ser classificadas quanto à natureza química do sítio

catalítico/mecanismo de ação, são elas: i) serina proteases; ii) cisteína proteases; iii)

aspártico proteases; iv) treonina proteases e v) metaloproteases. Cada classe de

proteases tem seu conjunto particular de aminoácidos no sítio ativo. É importante

ressaltar que as serina proteases, enzimas de especial interesse deste trabalho,

20

apresentam a tríade catalítica composta por Ser139, His57 e Asp81 (numeração dos

resíduos referente à serina protease do HCV) (POLGÁR, 2005).

O mecanismo catalítico da serina protease se inicia pela ativação da cadeia

lateral da Ser139 (-CH2-OH), por uma catálise básica mediada por Asp81 e His57

através de interações por ligação hidrogênio. A carbonila amídica do substrato é

atacada pela serina do sítio ativo (nucleófilo ativado), formando um intermediário

oxiânion tetraédrico. É importante mencionar que a formação do intermediário

oxiânion tetraédrico é considerada a etapa lenta da reação. A transferência de um

próton da His leva à formação de um aminoácido e de um intermediário acil-enzima,

com consequente rompimento do intermediário tetraédrico. Posteriormente, ocorre a

liberação do aminoácido, ligado à His por ligação de hidrogênio, o qual é substituído

por uma molécula de água. O oxigênio da molécula de água ataca a carbonila do

intermediário acil-enzima, o que libera o fragmento C-terminal do substrato e

regenera a enzima. (DRAG, 2010). É importante destacar que o Asp, por ser um

resíduo ácido, tem importante papel de neutralização, através de interações

eletrostáticas, da carga positiva gerada no intermediário durante a catálise (RANEY,

2010) (Esquema 1).

Esquema 1. Mecanismo catalítico geral de serina proteases. (Adaptado de RANEY, 2010).

21

Conforme previamente discutido, o vírus da dengue e o vírus da hepatite C

pertencem à mesma família viral, Flaviviridae. Por esse motivo, eles apresentam

uma enzima serina protease em comum, necessária para a replicação viral. Essa

enzima é responsável pelo processamento pós-traducional da região NS3/NS5 da

poliproteína viral, gerando os componentes necessários para a replicação de ambos

os vírus (LESCAR, 2008).

Para atingir a atividade proteolítica ótima, a serina protease do vírus da

dengue requer cofatores que são supridos pela proteína NS2B (LEUNG, 2001). O

cofator essencial para a ação proteolítica da NS3 do HCV é a NS4A. Esse cofator

apresenta alguns dos resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, cuja função é ancorar o

complexo enzimático na membrana exterior do retículo endoplasmático (DE

FRANCESCO, 2007).

3.3.1 INIBIDORES DE SERINA PROTEASES

Como descrito anteriormente, até o momento não existe tratamento específico

para a dengue e, em relação à hepatite C, há uma urgência no desenvolvimento de

fármacos antivirais mais efetivos para o tratamento da doença. Portanto, a pesquisa

e desenvolvimento de medicamentos para essas doenças, tornaram-se uma questão

estratégica em saúde pública.

Uma das abordagens mais promissoras para uma terapia antiviral eficaz para

ambas as doenças é o desenvolvimento de moléculas inibidoras da serina protease

viral (NS3), a qual é um componente essencial para a maturação da poliproteína de

ambos os vírus (CHANPRAPAPH, 2005).

Considerando que o substrato natural das serina proteases virais discutidas é

uma poliproteína viral, um inibidor competitivo teoricamente ideal para esta enzima

deve ter estrutura química semelhante a uma proteína, a fim de que haja afinidade

pelo sítio catalítico da enzima.

Muito embora peptídeos naturais possuam características farmacodinâmicas

e farmacocinéticas que permitiriam seu uso terapêutico, este não é um fenômeno

comum para esta classe de compostos. Isto porque, a reduzida estabilidade

química, a baixa biodisponibilidade e a suscetibilidade frente a proteases os tornam

fracos candidatos para o uso terapêutico. Além disso, a alta flexibilidade

22

conformacional dos peptídeos naturais é um grande empecilho para utilização

terapêutica destes como inibidores enzimáticos, já que permite que estes assumam

estruturas tridimensionais de baixa afinidade pelo sítio catalítico da enzima

(FROKJAER, 2005).

3.3.2 PEPTIDEOMIMÉTICOS INIBIDORES DE SERINA PROTEASES

Uma estratégia para contornar essa limitação no uso de peptídeos naturais

consiste no desenvolvimento de compostos peptideomiméticos. Esses compostos

são estruturalmente semelhantes ao peptídeo natural, porém apresentam

modificações de modo a conferir menor flexibilidade conformacional, maior

seletividade por determinado sítio catalítico enzimático, o que diminui a

suscetibilidade frente às demais proteases (KHARB, 2011). Todavia, para que um

derivado peptídeomimético seja planejado é crucial compreender o papel

desempenhado pelos suas diversas subunidades estruturais (STEFANUCCI, 2011);

(VAGNER, 2008).

As cadeias laterais dos aminoácidos do ligante, por exemplo, encontram-se

fortemente associadas à afinidade pelo receptor. Essas interações ocorrem entre os

aminoácidos da cadeia lateral do ligante e os grupamentos de caráter complementar

na estrutura do receptor, através de interações tanto de natureza eletrostática,

quanto interações mais fortes, como ligações de hidrogênio, dipolo-dipolo e Van der

Waals (HRUBY, 1993).

Desta maneira, um peptideomimético pode ser obtido através da alteração do

esqueleto básico peptídico, constituído por ligações amídicas (peptídicas)

intercaladas por uma unidade metilênica ou metínica, desde que mantidas as

cadeias laterais nas posições adequadas para a interação com o receptor. A

alteração de ligações peptídicas por outras enzimática e quimicamente mais

estáveis confere maior resistência dos peptideomiméticos frente a proteases, o que

torna esta estratégia crucial para o planejamento de inibidores de proteases

(KHARB, 2011).

23

3.3.2.1 Peptideomiméticos inibidores da protease do DENV

Até o momento, poucas moléculas de natureza peptideomimética têm sido

descritas na literatura como inibidores da NS3 protease do vírus da dengue. Com

exceção da aprotinina (um antifibrinolítico natural), um inibidor padrão de serina

protease, que apresentou um IC50=65 nM contra serina protease recombinante do

DENV-2 (LEUNG, 2001). A protease do DENV tem preferência de clivagem em

resíduos dibásicos dos substratos, como por exemplo, Lis e/ou Arg. Dentre esse tipo

de substrato encontram-se várias classes de inibidores de serina protease, como as

-ceto-amidas, amidas, aldeídos e trifluorometilcetonas (GAO, 2010); (LESCAR,

2008); (YIN, 2006); (YANG, 2011).

Muitas estratégias têm sido utilizadas na busca por inibidores da NS2/NS3

protease do DENV com vários graus de êxito. Dentre elas podem ser citadas a

síntese racionalmente planejada de peptideomiméticos e ciclopeptídeos, screening

virtual baseado na estrutura, screening de produtos naturais, entre outras. Todavia,

apenas poucos inibidores estruturalmente pequenos e de natureza peptideomimética

são descritos (DENG, 2012); (YANG, 2011); (NOBLE, 2010).

Dentro da estratégia de síntese planejada de peptideomiméticos, o composto

do tipo aldeído 4 foi sintetizado por Yin e colaboradores, apresentando um Ki de

inibição igual a 5,8 M contra a NS3 protease do DENV-2, e mostrando ser um

inibidor reversível e competitivo. Com o intuito de encontrar novos inibidores, um

estudo de relação estrutura-atividade (SAR) foi realizado (YIN, 2006); (PARKINSON,

2010).

Como resultado dos estudos de SAR foi obtido o tripeptídeo 5, mais ativo,

mostrando um Ki=1,5 M. Dentro deste estudo, o composto 4 serviu como protótipo

para o desenvolvimento de novas estruturas de natureza peptideomiméticas e para

o entendimento das interações inibidor-enzima, as quais confirmaram a preferência

da enzima por resíduos básicos de Arg na porção terminal, especialmente na

posição P2.

Dentro da estratégia de screening virtual baseado na estrutura, Frecer e

Miertus (2010) realizaram um estudo de modelagem molecular, utilizando a estrutura

3D da NS2B/NS3pro do DENV e técnicas combinatórias para desenhar uma

biblioteca virtual de compostos peptideomiméticos. Nesse trabalho, mais de 9.000

24

compostos foram desenhados, tendo como protótipo o aldeído 4 e resíduos de

aminoácidos não naturais nas posições P1 à P4, os quais foram testados in silico.

O composto 6, foi considerado o mais promissor da busca virtual realizada,

apresentando um Ki cerca de 50 vezes menor (Kipre=0,1µM) do que o composto

modelo 4 e foi analisado em termos de interação enzima-inibidor e propriedades

físico-químicas relacionadas a absorção, distribuição, metabolismo e excreção

(ADME).

Figura 14. Estrutura química dos compostos 4,5 e 6.

Apesar de alguns inibidores já terem sido descritos na literatura com valores

de IC50 em uma faixa menor que micromolar, as indesejadas características físico-

químicas e alta toxicidade dos mesmos não permitiram posterior desenvolvimento.

25

Assim, uma inibição seletiva da protease do DENV ainda não foi obtida e até o

momento compostos para ensaios clínicos ainda não estão disponíveis.

3.3.2.2 Peptideomiméticos inibidores da protease do HCV

A serina protease NS3/4A do HCV tem sido alvo de intensos estudos para a

descoberta de inibidores seletivos e potentes para a terapia de pacientes com

hepatite C, desde a sua identificação, em 1993.

Proteases virais podem ser excelentes alvos para o desenho de novos

fármacos baseados na estrutura química, vide o sucesso do desenvolvimento de

inibidores da HIV protease.

Todavia, em se tratando da serina protease do HCV, a busca por estruturas

químicas, potentes candidatas a um novo fármaco, bioativas por via oral, têm sido

parcialmente dificultada pelo fato do sítio da ligação ao substrato ser razoavelmente

plano e marcadamente hidrofóbico. Apesar disso, significantes progressos têm sido

feitos nos últimos anos para a identificação de novos inibidores da serina protease

NS3/4A (FROKJAER, 2005).

Os inibidores da protease do HCV podem ser divididos em covalentes e não

covalentes. Dentro dessa classificação eles podem ainda estar subdividos em

lineares ou macrocíclicos.

3.3.2.2.1 Inibidores não covalentes

a) Inibidores peptídicos lineares

Inicialmente, as buscas por um potente inibidor de HCV protease utilizaram a

estratégia de planejamento de fármacos baseada na estrutura. Essa estratégia

considerava a significante inibição da enzima pelos produtos peptídicos N-terminal,

que são liberados da clivagem enzimática de vários substratos.

Dessa forma, diversos inibidores foram obtidos, como o hexapeptídeo 7, que

apresentou um Ki=0,04 µM. Partindo desse composto, compostos menores e menos

carregados foram desenvolvidos, tal como o composto tripeptídico 8, que apresentou

um Ki=0,6 µM (CHEN, 2009).

26

Figura 15. Estrutura química dos compostos 7 e 8.

b) Inibidores peptídicos macrocíclicos

Na tentativa de melhoramento do perfil farmacocinético dos inibidores

peptídicos, vários métodos de despeptidização têm sido utilizados, tais como, o uso

de aminoácidos não-naturais, uso de isósteros peptídicos e a macrociclização. Além

de serem menos susceptíveis à hidrólise por protease, os macrocíclicos, com

estrutura e tamanho de anéis apropriados, podem se ligar mais fortemente a uma

enzima de uma maneira rígida e pré-organizada (TYNDALL, 2001).

Análises da estrutura de raios-X da enzima NS3 protease demonstrou que as

porções S1 e S3 têm localização bem próxima. Dessa forma, vários inibidores

macrocíclicos foram obtidos através da ciclização dos resíduos P1 e P3, os quais

apresentaram bons perfis pré-clínicos que os levaram aos testes clínicos. O

ciluprevir (9) (BILN 2061 - Boehringer Ingelheim), um macrocíclo de 15 membros, foi

o primeiro composto inibidor de protease do HCV avaliado em testes clínicos. Os

primeiros resultados obtidos foram promissores, já que o composto proporcionou um

rápido declínio da carga viral plasmática em todos os pacientes com HCV genótipo

tipo 1 tratados. Porém, resultados posteriores apresentaram certa toxicidade

cardíaca em altas doses (LAMARRE, 2003). Adicionalmente, em testes in vitro, o

composto apresentou eficácia reduzida contra os genótipos 2 e 3, sendo, dessa

forma, retirado do estudo (NAGGIE, 2010). Entretanto, apesar dos resultados

clínicos desfavoráveis, estudos da relação estrutura-atividade (SAR) mostraram que

a presença do aminoácido com cadeia ciclopropilvinila em P1 apresentou o melhor

encaixe com a superfície da enzima, o que passou a ser um elemento fundamental

na estrutura de inibidores análogos posteriormente relatados.

27

3.3.2.2.2 Inibidores covalentes

a) Inibidores macrocíclicos

Muitos inibidores macrocíclicos têm sido descritos pela Schering-Plough.

Nesses compostos, a cadeia lateral P2 foi ciclizada com o grupamento da

extremidade P3, originando os chamados macrocíclicos P2-P3, bem como aqueles

denominados P1-P3. Os compostos 10 e 11, macrocíclicos P2-P3, se mostraram

menos potentes nos testes celulares com replicon, apesar de elevada potência em

testes enzimáticos. Já o composto 12, um macrocíclico P1-P3, apresentou melhor

perfil de atividade no replicon celular (CHEN, 2006); (CHEN, 2008).

Figura 16. Estrutura química dos compostos 9.

Figura 17. Estrutura química dos compostos 10, 11 e 12.

28

b) Inibidores lineares

Na classe de inibidores covalentes lineares, destacam-se os compostos do

tipo ácido borônico/boronatos e os derivados do tipo α-cetoamidas, cujas funções

têm sido estudadas como eletrófilos que, possivelmente, poderiam interagir com a

hidroxila nucleofílica da serina do sítio ativo. Alguns exemplos do primeiro tipo

desenvolvidos pela Schering-Plough são os compostos 13 e 14 (VENKATRAMAN,

2009).

Figura 18. Estrutura química dos compostos 13 e 14.

Dentro da classe das α-cetoamidas têm-se o telaprevir (3) e o boceprevir (2),

(apresentados no item 1.2.4), ambos já empregados como um terceiro fármaco no

tratamento de pacientes com hepatite C crônica (infectados com o genótipo 1), junto

com o interferon peguilado e a ribavirina, visando a obtenção de maior resposta

terapêutica, conforme previamente discutido.

Muitos outros compostos inibidores da protease NS3/4A estão em diferentes

fases de testes clínicos, o que aumentará consideravelmente as opções de

tratamento em um futuro próximo.Sabendo que o verdadeiro sucesso de uma terapia

anti-HCV consistirá em uma terapia capaz de inibir todas as variantes virais e

prevenir a emergência de cepas mutantes. Talvez a combinação de diversos

agentes antivirais, em que cada um atinja diferentes alvos no ciclo replicativo viral,

seja necessário para controlar a infecção e o aparecimento da resistência.

3.4 DERIVADOS DO ISOMANÍDEO

Considerando que a incorporação de aminoácidos com ângulos corretos de

torção pode ser fundamental para a atividade e seletividade, muitos esforços têm

29

sido feitos no sentido de desenvolver estratégias de planejamento e síntese de

moléculas peptídicas e peptideomiméticas com conformações específicas, tais

como, α-hélice, folhas β ou estendida.

Atualmente, observa-se um maior enfoque voltado para o planejamento,

síntese e utilização de aminoácidos conformacionalmente restritos, para a

incorporação dos mesmos nas estruturas de inibidores enzimáticos

peptideomiméticos (TRABOCCHI, 2008).

Em resposta a essa demanda, nosso grupo de pesquisa decidiu, então, pelo

estudo e utilização do composto 1,4:3,6-dianidro-D-manitol, também denominado

isomanídeo (15), como cerne estrutural para o desenvolvimento de potenciais

inibidores da serina protease viral.

O composto 15 é um carboidrato, obtido industrialmente pela desidratação do

D-manitol e comercialmente disponível. A estrutura simétrica do composto do tipo

C2, bicíclica, apresentando duas hidroxilas na posição endo, o torna um cerne

estrutural atrativo para aplicações sintéticas, além do fato de ser um reagente de

baixo custo (FAUCONIER, 1882) (FAUCONIER, 1884); (WIGGINS, 1945).

O isomanídeo e seus derivados já vêm sendo utilizados por vários grupos de

pesquisa, como catalisadores de transferência de fases em síntese assimétrica,

como ligantes e auxiliares quirais, na síntese de líquidos iônicos quirais, bem como

produtos de partida para a síntese de compostos de interesse farmacêutico (MURI,

2010); (CARCEDO, 2004); (LOUPY, 1996).

Figura 19. Estrutura química do isomanídeo.

A escolha do isomanídeo como cerne estrutural ocorreu por conta de sua

estrutura de éter bicícico, conformacionalmente restrita do tipo em “U” e de

30

estereoquímica definida, além do fato de apresentar simetria C2. Essas

características estruturais poderiam mimetizar uma estrutura natural do tipo folha β

presente em determinado alvo molecular. (HANESSIAN, 2008). Uma inversão de

configuração em um dos grupamentos hidroxila levaria a uma manipulação estrutural

relativamente fácil é muito importante no planejamento de novos compostos, em

particular de derivados peptideomiméticos. A idéia do planejamento de compostos

do tipo éter cíclico surgiu da observação de vários compostos bioativos com esse

padrão estrutural, tal como o darunavir (16), um inibidor da protease do HIV, além de

produtos naturais como o antibiótico monensina (17) e o antagonista do fator de

ativação plaquetária, o ginkgolídeo B (18). Esses compostos não sofrem de

problemas de biodisponibilidade oral (GHOSH, 2008).

Figura 20. Estrutura química dos compostos 16, 17 e 18.

Algumas séries de compostos desenvolvidas pelo nosso grupo de pesquisas,

utilizando o isomanídeo como produto de partida para síntese de compostos

peptideomiméticos com potencial de inibição da serina protease dos vírus DENV e

HCV, são mostradas no Esquema 2 (MURI, 2004); (MURI, 2005).

Dentre os trabalhos mais relevantes destacamos as séries 19 e 20, derivadas

do isomanídeo e de diferentes oxazolonas (em vermelho). Esses compostos foram

testados em um ensaio baseado em células do replicon de HCV, no qual o composto

3,4-metilenodioxi 19a (Figura 21) foi o mais ativo com um EC50% igual a 20 μM, mas

infelizmente o mesmo também foi o mais citotóxico com um CC50% = 20 μM. Dentre

os compostos da série 20, destacou-se o composto 20a (Figura 21) com um EC50%

na faixa de 35 μM (BARROS, 2009); (BARROS, 2010).

31

Em outro trabalho, Barros e colaboradores (2012) sintetizaram séries de

novos ésteres e amidas 25 e 26, respectivamente, provenientes do acoplamento da

amina derivada de 15 com diferentes aminoácidos protegidos. A avaliação biológica

destes derivados mostrou uma atividade de 45% de inibição enzimática para o

composto 100 µM do composto 26a (Figura 21), um derivado amida com cadeia

lateral N-Boc-N-di-CBz-L-Arg. Esse composto foi submetido a estudos de docking

molecular no sítio ativo na enzima NS3/4A, os quais mostraram sua localização na

fenda hidrofóbica S1, onde há interação entre o resíduo de arginina com os resíduos

enzimáticos Ile132, Leu135, Lis136, Gli137, Ser139 e Phe154. Além disso,

observou-se a existência de seis ligações hidrogênio, sendo duas entre o anel

isomanídeo e a enzima, e quatro entre o resíduo arginina e os aminoácidos

enzimáticos His57 e Arg155. Ki = 45% (100 µM do composto).

Esquema 2. Compostos desenvolvidos pelo grupo contendo o cerne derivado do isomanídeo.

(Adaptado de MURI, 2014)

32

Abrahim-Vieira e colaboradores (2014) desenvolveram a síntese de novos

peptideomiméticos, provenientes de 15, incorporando o cerne do ácido tartárico (em

verde) acoplado com diversos aminoésteres (Série 22, Esquema 2). Após ensaios

biológicos desta série, o composto 22a (Figura 21), derivado do ácido D-tartárico e o

aminoéster da valina, apresentou o melhor perfil de inibição frente NS3/4A do HCV,

com IC50 na faixa de 70 μM.

Ainda tendo em mente a substituição de ligações peptídicas por subunidades

isostéricas não hidrolisáveis, Zorzanelli e colaboradores (2013) apresentaram uma

rota inédita para a síntese de novos compostos portadores do cerne estatina (Série

21, Esquema 2, em lilás). Estes compostos encontram-se ainda em fase de

avaliação biológica.

Figura 21. Compostos com melhor perfil de atividade biológica desenvolvidos pelo

grupo.

3.5 DERIVADOS DO ISOSORBÍDEO

O 1,4:3,6-dianidro-D-glucitol, também denominado isosorbídeo (27), assim

como o isomanídeo, é um carboidrato, disponível comercialmente e obtido

33

industrialmente pela desidratação do D-sorbitol. Ele é composto de dois anéis

tetraidrofuranos fundidos em cis, apresentando uma estrutura em forma de cunha

com uma hidroxila na posição C-5-endo e outra em C-2-exo (KAGAN, 1992).

Figura 22. Estrutura química do composto 27.

A importância do isosorbídeo (27) como bloco de construção quiral tem

aumentado devido a sua configuração absoluta e a presença de duas hidroxilas com

configurações e reatividades diferentes, por conta da ausência do elemento de

simetria presente no isomanídeo. O isosorbídeo, assim como o isomanídeo, vem

sendo bastante explorado em diferentes áreas químico-farmacêuticas. Dentre elas

destaca-se a área da química de polímeros e síntese de poliésteres, policarbonatos

e poliamidas quirais derivados de 27 (MEDIMAGHA, 2013); (RISTIĆ, 2012);

(CHANG, 2014).

O composto 27 também vem sendo bastante utilizado na síntese de líquidos

iônicos quirais, os quais são utilizados em diversas reações químicas, como por

exemplo, em reações assimétricas de aza Diels-Alder (BUU, 2009).

Na área farmacêutica, 27 é amplamente usado na sua forma éster de

dinitrato, como vasodilatador na angina de peito e outras patologias associadas

(BRUNTON, 2012). O dinitrato de isosorbídeo é comercializado nos EUA sob o

nome comercial de Dilatrate-SR® e Isordil®.

34

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os compostos peptideomiméticos das séries 28 e 29, objetivados neste

trabalho, foram planejados para serem sintetizados a partir de 27. As séries de

compostos 20 e 26 foram escolhidas como séries protótipos, pois apresentaram

compostos derivados do isomanídeo com melhor perfil de inibição enzimática

(Esquema 3).

A modificação estrutural nas séries de compostos protótipos 20 e 26,

respectivamente, envolveu a mudança da esteroquímica do carbono 2, de endo para

exo. As cadeias laterais provenientes da abertura de oxazolonas e do acoplamento

com aminoácidos protegidos, foram mantidas nas séries 28 e 29 (Esquema 3).

Esquema 3. Modificação estrutural para o planejamento das séries 28 e 29.

35

A partir de resultados preliminares positivos, o composto 28a foi considerado

protótipo para a síntese da série de compostos 42 (Esquema 4).

Esquema 4. Modificação estrutural para o planejamento da série 42.

4.1 ESTRATÉGIA SINTÉTICA

A estratégia sintética empregada na primeira fase de obtenção dos

compostos peptideomiméticos 28a-c, 29a-g e 42a-e é mostrada no Esquema 5. Na

primeira etapa de obtenção dos intermediários-chave O-benzilados, o composto 27

sofre uma reação de tosilação seletiva, se convertendo no composto 31. O

composto 31 é, então, submetido a reações de benzilação com cloreto de benzila e

cloreto de 4-metoxibenzila, levando aos produtos 32 e 45, respectivamente. Na

sequência, ambos os produtos formados sofrem uma reação de substituição

nucleofílica com inversão de configuração, com azida de sódio, originando os

produtos 33 e 46. Por fim, os compostos 33 e 46 sofrem reação de redução da

função azida, formando os intermediários-chave 34 e 47.

O intermediário-chave 34 é crucial para obtenção da série de compostos

peptiodemiméticos 28a-c, através da exploração da reação de Erlenmeyer de

abertura de oxazolonas, além da série 29a-g, através da exploração de reações com

aminoácidos protegidos. Entretanto, para a obtenção da série 42a-e, foram utilizados

o intermediários 34, na obtenção dos compostos 42a-d e o intermediário 47, na

obtenção do composto 47e. Todos os compostos da série 42a-e foram obtidos

através da exploração da reação de Erlenmeyer de abertura de oxazolonas, assim

como os compostos da série 28a-c (Esquema 6).

36

Esquema 5. Estratégia sintética para obtenção dos intermediários-chave 34 e 47.

Esquema 6. Estratégia sintética para obtenção das séries 28a-c, 29a-g e 42a-e.

37

4.2 PREPARAÇÃO DO INTERMEDIÁRIO-CHAVE: AMINA O-BENZILADA 34

Explorando a diferença de reatividades entre as duas hidroxilas, nas posições

2-exo e 5-endo, do isosorbídeo (27) (TAMION, 1993); (BUCK, 1966), a primeira

etapa da síntese do intermediário-chave, a amina O-benzilada 34, consistiu na

tosilação seletiva da hidroxila C-5-endo. A reação foi realizada usando cloreto p-

toluenossulfonila e piridina e o produto desejado 31 foi purificado por coluna

cromatográfica em gel de sílica (eluente: hexano e acetato de etila, em polaridade

crescente) sendo obtido em 40% de rendimento. Apesar do baixo rendimento

encontrado, o mesmo está de acordo com a literatura (LEMIEUX, 1960);

(BACHMANN, 1998). Nesta etapa de tosilação, apesar da metodologia utilizada

favorecer a formação do produto endo-tosilado 31 em maior rendimento, foram

obtidos como produtos minoritários o produto tosilado na hidroxila C-2-exo (9%) 30a

e o produto di-tosilado 30b (2%) (Esquema 7) (KUROCHKINA, 2004).

A maior reatividade da hidroxila 5-endo em relação a 2-exo frente a reações

de esterificação pode ser atribuída à ligação de hidrogênio formada por esse grupo

com o oxigênio do biciclo vizinho (ver Figura 22 mostrada no item 3.5, pág 33).

Desta forma, o oxigênio da 5-OH endo estaria com um caráter nucleofílico mais

acentuado para atacar o enxofre do TsCl, com posterior saída do átomo de cloro.

Posteriormente o hidrogênio da hidroxila seria abstraído pela base do meio reacional

(GOODWIN, 1980).

Esquema 7. Reação de tosilação do isosorbídeo.

O composto 31 foi caracterizado espectroscopicamente por RMN e IV e está

de acordo com a literatura. O espectro de RMN 1H, apresentou dois dupletos em

7,84 ppm e 7,36 ppm relativos aos hidrogênios do anel aromático, bem como um

sinal simples em 2,45 ppm relativo aos hidrogênios do grupamento metila. No

38

espectro de IV destaca-se a banda em 1360 cm-1 referente ao estiramento da

ligação S=O do grupo sulfônico do grupamento tosila.

Apesar da semelhança estrutural, os compostos 30 e 31 foram diferenciados

entre si tanto pela avaliação de suas características físico-químicas, quanto pela

análise dos espectros de RMN 1H. O composto 30 foi obtido como um sólido branco

(p.f.110ºC) e 31 como um óleo incolor, o que está de acordo com dados encontrados

na literatura (KUROCHKINA, 2004).

Além disso, o espectro de RMN1H de 30 apresentou os sinais em 3,49 (dd,

1H/H3a, J = 5,9Hz); 3,85-3,82 (m, 1H/H3b); 4,29-4,27 (m, 1H/H2); 4,93 (d, 1H/H5, J

= 3,2Hz) com boa correspondência ao encontrados na literatura (3,51; 3,85; 4,28;

4,94 ppm) para os mesmos hidrogênios respectivamente. Paralelamente, o espectro

de RMN1H de 31 apresentou os sinais em 3,88 ppm (m, 2H/H6a,H6b); 4,30 ppm (sl,

1H/H5); 4,89 (ddd, 1H/H2, J =1,2; 6,3Hz) também de acordo aos sinais encontrados

na literatura (3,91; 4,30; 4,89 ppm) para os mesmos hidrogênios, respectivamente.

O tratamento de 31 com o cloreto de benzila, em meio alcalino, na presença

de brometo de tetra-n-butilamônio (TBAB) como catalisador de transferência de

fases, forneceu o composto benzilado na hidroxila exo 32, como um óleo amarelo,

em 95% de rendimento, após purificação por coluna cromatográfica em sílica gel

(eluente: hexano e acetato de etila, em gradiente de polaridade crescente)

(Esquema 8) (LOUPY, 1996).

Esquema 8. Síntese do intermediário benzilado 32.

O espectro de RMN 1H de 32 apresentou principalmente um sinal duplo em

7,82 ppm e um sinal múltiplo em 7,36-7,27 ppm correspondentes aos 9 hidrogênios

39

aromáticos, além de um singleto em 4,53 ppm, atribuído aos hidrogênios

diastereotópicos do grupo -CH2 da posição benzílica.

Na sequência, o composto 32 sofreu uma reação de substituição nucleofílica

com azida de sódio em líquido iônico tetrafluoroborato de N-benzil-N-metil-imidazol

([bmim]+BF4-) como solvente, por 12h a 110ºC originando a azida 33. O produto bruto

foi purificado por coluna cromatográfica em gel de sílica (eluente: hexano e acetato

de etila, em polaridade crescente), fornecendo um óleo incolor em 70% de

rendimento (Esquema 9) (LOUPY, 2002).

É importante destacar que na tentativa de obtenção de 33, uma metodologia,

que adota DMSO como solvente foi utilizada, todavia não foram obtidos resultados

satisfatórios (TAMION, 1993).

Esquema 9. Síntese da azida 33.

Esta reação de substituição nucleofílica (SN2) ocorre com inversão da

estereoquímica da posição C-5. Isso se deve ao fato do nucleófilo (N3-) se aproximar

da molécula pelo lado oposto ao grupo de saída (TsO-). Dessa forma a

estereoquímica de C-5 muda de endo para exo (MCMURRY, 2006).

A azida 33 foi caracterizada espectroscopicamente onde se verificou no

espectro de RMN1H, a mudança de multiplicidades dos sinais de H-5: em 32 o sinal

de H5 em 4,85 ppm é um duplo duplo duplete (ddd, J = 1,5 e 6,6 ppm), enquanto

que para 33, o hidrogênio H-5 mostrou-se como um sinal duplo em 4,08 ppm. Além

disso, nota-se o desaparecimento dos sinais característicos ao grupo tosila: o sinal

dos hidrogênios da metila (simpleto em 2,44 ppm) e os sinais duplos dos hidrogênios

do anel aromático (7,84 e 7,36 ppm). No espectro de IV observa-se o

desaparecimento da banda em 1360 cm-1 (estiramento da ligação S=O) e o

aparecimento do sinal em 2100 cm-1, característico de grupamento azida (N3).

40

Apesar da necessidade de sintetizá-lo, o emprego do líquido iônico

[bmim]+BF4- apresenta muitas vantagens em relação aos solventes orgânicos, uma

vez que não possuem pressão de vapor mensurável à temperatura ambiente, e

mesmo a temperaturas bastante elevadas degradam apenas acima de 400°C,

podendo ser usados em vácuo sem que haja perda de solvente. Além disso, são

reutilizáveis (CHIAPPE, 2003).

A obtenção do líquido iônico foi possível pela reação do N-metil-imidazol 35

com o bromobutano, formando o [bmim]+Br- 36 (um sal de amônio quaternário), que

por troca iônica com NaBF4 deu origem ao produto [bmim]+BF4- 37. O líquido iônico

foi purificado por coluna cromatográfica em sílica gel, utilizando diclorometano como

eluente, e obtendo o produto puro como um óleo levemente amarelado em 83% de

rendimento (Esquema 10) (LANCASTER, 2002).

Esquema 10. Obtenção do líquido iônico [bmim]+BF4.

A redução da função azida de 33 foi efetuada por reação de hidrogenação

catalítica, empregando-se Pd/C 5% como catalisador, etanol absoluto como

solvente, a temperatura ambiente e a uma pressão de 40 psi por 4 horas, formando

a amina 34, em rendimento quantitativo (Esquema 11) (BACHMANN, 2004)

(LOUPY, 2002). O produto foi caracterizado por RMN e IV, onde nesse último ficou

evidenciado o desaparecimento da banda em 2100 cm-1 referente ao estiramento da

função azida e o aparecimento de uma pequena banda em 3371 cm-1 referente ao

grupo amina. Cabe mencionar que a metodologia utilizada seria, teoricamente,

capaz de retirar o grupamento benzila do composto 33. Todavia, trabalhos anteriores

do grupo mostraram que essa desproteção não ocorre na prática, por razões a

serem ainda elucidadas (BARROS, 2009), (BARROS, 2010), (BARROS 2012).

41

Esquema 11. Síntese da amina 34.

4.3 PREPARAÇÃO DA SÉRIE DE PRODUTOS FINAIS 28a-c

4.3.1 SÍNTESE DOS REAGENTES OXAZOLÔNICOS 38a-c PARA OBTENÇÃO DE

28a-c

Para a síntese das oxazolonas 38a-c, inicialmente foi realizada a obtenção da

N-benzoilglicina (41) através da reação da glicina (39) com cloreto de benzoíla (40),

em solução aquosa de NaOH. Após o término da adição do cloreto de benzoíla, a

reação foi neutralizada com HCl concentrado e o precipitado formado foi filtrado e

lavado com água gelada. O produto suficientemente puro foi obtido como um sólido

branco (p.f. 188 °C / p.f. literatura 188-189 °C) em 95% de rendimento (Esquema

12) (MESAIK, 2004).

Esquema 12. Obtenção da N-benzoilglicina (41).

Pode-se destacar no espectro de RMN1H do composto 41 sinais multipletos

na região de aromáticos (8,80-8,75 ppm e 8,50-8,30 ppm) referentes aos 5

hidrogênios aromáticos da molécula, além de um sinal simpleto referente aos

hidrogênios do –CH2 em 5,0 ppm.

42

No espectro de IV destaca-se a banda em 3073 cm-1 referente ao estiramento

da ligação N-H do grupo amida.

Após a obtenção da N-benzoilglicina (41), partiu-se para a obtenção das

oxazolonas (também conhecidas como azalactonas). A reação de Erlenmeyer é o

método mais utilizado para a preparação desses compostos, pois apresenta

vantagens como: pequeno número de etapas, reagentes de baixo custo e de fácil

acesso. Esse método consiste no aquecimento de aldeídos aromáticos (R-CHO)

com a N-benzoilglicina (41), na presença de anidrido acético e acetato de sódio,

gerando exclusivamente o isômero Z, termodinamicamente mais estável. Dessa

forma, 41 reagiu, respectivamente, com os aldeídos: tiofeno 2-carbaldeído, 3,4-

metilenodioxibenzaldeído e benzaldeído gerando os compostos 38a-c, em

rendimento de 60-70% (Esquema 13) (MESAIK, 2004).

Esquema 13. Síntese das oxazolonas 38a-c.

Os compostos 38a-c foram caracterizados espectroscopicamente por RMN e

I.V, e estão de acordo com as análises já descritas por nosso grupo de pesquisa

(BARROS, 2009).

Nos espectros de RMN 1H, os compostos 38a-c apresentaram sinais relativos

aos hidrogênios vinílicos na região de 6,8-7,2 ppm. No espectro de IV é possível

verificar a presença de bandas na região de 1780-1790 cm-1 e 1650 cm-1

características dos grupos C=O de lactona e C=N, respectivamente. Além disso, é

possível observar o desaparecimento das bandas em 1600 cm-1 e 3341 cm-1,

referentes, aos estiramentos das ligações N-H do grupo amida e O-H do grupo ácido

carboxílico, respectivamente, presentes da N-benzoilglicina (41).

43

4.3.2 SÍNTESE DOS PRODUTOS FINAIS 28a-c

A etapa final para a síntese dos compostos 28a-c consistiu em uma reação de

abertura de anel das oxazolonas substituídas 38a-c com a amina O-benzilada 34,

em acetato de etila e refluxo. Após o tempo necessário de cada reação, esta foi

resfriada a temperatura ambiente e o produto precipitado foi filtrado e seco. Os

produtos foram purificados por coluna cromatográfica em gel de sílica (eluente:

hexano e acetato de etila, em gradiente de polaridade crescente), e obtidos com 35-

79% de rendimento (Esquema 14) (BARROS, 2009).

Esquema 14. Síntese dos produtos finais 28a-c.

As estruturas dos compostos 28a-c foram completamente caracterizadas e na

Tabela 3 são mostrados os dados mais relevantes.

44

Tabela 3. Caracterização dos compostos finais 28a-c.

Nº X Aspecto p.f. (ºC)

Rendimento (%)

RMN1H (ppm) IV (cm-1)

28a

Sólido branco

180-181

35 6,80 (H-vinílico); 8,11

(H-arom. vizinho ao S)

3226, 3061 (N-H); 2924 (C-Harom.); 1653; 1639

(C=O amida)

28b

Sólido branco

173-174

42 6,91 (H-vinílico); 5,99

(-CH2 metilenodioxi)

3240 (N-H); 1642, 1650

(C=O amida)

28c

Sólido branco

160-161

79 6,92 (H-vinílico); 7,55-

6,92 (H- arom.)

3234, 3424 (N-H); 2869 (C-Harom.); 1642, 1629

(C=O amida)

Os procedimentos de obtenção de 28a e 28b foram realizados apenas uma

vez, enquanto que a reação de obtenção de 28c duas vezes, com a primeira

tentativa proporcionando um rendimento de cerca de 40%. Este fato pode explicar a

discrepância nos rendimentos obtidos para os três produtos, já que no caso de 28c

houve aperfeiçoamento da técnica de obtenção e purificação.

4.4 PREPARAÇÃO DA SÉRIE DE PRODUTOS FINAIS 29a-g

Para a síntese da série de produtos finais 29a-g, a amina O-benzilada 34

reagiu com diversos aminoácidos N-protegidos, obtidos de fonte comercial, pela

reação de acoplamento e formação de ligação peptídica usando o sistema

DCC/DMAP. Entre os reagentes de reação de acoplamento e formação de ligação

45

peptídica, a N,N '-dicicloexilcarbodiimida (DCC) é bastante utilizada por apresentar

uma boa atividade desidratante e por ser razoavelmente barato (BARROS, 2012);

(HAN, 2004).

O mecanismo da reação de acoplamento com o sistema DCC/DMAP é, de

maneira geral, possível pela formação de um anidrido simétrico. Esse anidrido é

formado pela reação de dois equivalentes do substrato ácido carboxílico com um

equivalente de DCC. Inicialmente, ocorre a desprotonação do ácido carboxílico por

um dos nitrogênios do DCC. O nucleófilo formado ataca o carbono central do DCC

com movimentação de uma ligação dupla para o nitrogênio carregado positivamente,

formando uma O-acil-isouréia. Esta é ativada pela protonação do nitrogênio da

imina. O substituinte uréia protonada resultante se torna um excelente grupo de

saída. O intermediário O-acil-isouréia é atacado pelo íon carboxilato formando o

anidrido simétrico e a dicicloexiluréia (DCU), a qual é separada do meio por filtração

ou por cromatografia por coluna “flash” em gel de sílica (Esquema 15)

(MONTALBETTI, 2005).

Esquema 15. Mecanismo de formação do anidrido carboxílico por reação com DCC.

(MONTALBETTI, 2005).

46

Após a formação do anidrido carboxílico, esse reage com a amina formando a

ligação peptídica catalisada pela 4-dimetilaminopiridina (DMAP). Com a formação do

peptídeo, um equivalente do ácido carboxílico da reação é restituído (Esquema 16)

(MONTALBETTI, 2005).

Esquema 16. Reação de formação da ligação peptídica entre o anidrido carboxílico e a amina.

(MONTALBETTI, 2005).

Os produtos finais peptideomiméticos 29a-g, provenientes da reação de

acoplamento e formação da ligação peptídica entre amina O-benzilada 34 e os

aminoácidos N-protegidos, empregando o sistema DCC/ DMAP, são apresentados

na Tabela 4.

O acoplamento da amina 34 com a N-Boc-L-Prolina (reagente comercial)

empregando-se o sistema DCC/DMAP forneceu o peptideomimético 29a, como um

óleo amarelado em 50% de rendimento, após purificação por coluna cromatográfica

em sílica gel (hexano e acetato de etila, em gradiente de polaridade crescente).

Cabe ressaltar que os compostos 29a-g foram obtidos com rendimentos similares

aos seus respectivos protótipos, os quais são derivados do isomanídeo (BARROS,

2012).

Na análise do espectro de RMN1H de 29a destacam-se os seguintes sinais

referentes à incorporação da porção N-Boc-Prolina: sinal largo em 4,05 ppm

atribuído a H-13, sinal múltiplo em 3,49-3,39 ppm referente a H-16, dois sinais largos

em 1,86 ppm e 1,64 ppm atribuídos a H-14 e H-15, além do sinal simples em 1,46

ppm, referente aos hidrogênios metílicos do grupo terc-butila. No espectro de IV do

composto foi observada uma banda em 1694 cm-1, referente aos estiramentos das

carbonila de carbamato (Figura 23). No espectro de RMN13C de 29a, observa-se o

aparecimento dos sinais referentes à carbonila do carbamato em 155,0 ppm e à

carbonila amídica em 171,6 ppm.

47

Tabela 4. Síntese e características físicas dos peptideomiméticos 29a-g.

Produto Aminoácido

N-protegido X Rendimento

(%) Aspecto/p.f.

(ºC)

29a

N-Boc-L-Pro

50

óleo incolor

29b

N-Boc-L-Treo

50

sólido

amarelo/128

-130

29c

N-Boc-L-Met

60

sólido

branco/106-

107

29d

N-Boc-O-Benzil-

L-Ser

64

sólido

branco/135-

136

29e

N-Boc-N-Cbz-L-

Lis

65

óleo

amarelo

29f

N-Boc-L-Trp

70

sólido

branco/74-

75

29g

N-Boc-N-di-Cbz-

L-Arg

70

sólido

branco/115-

116

48

Figura 23. Sinais e bandas características do composto 29a nos espectros de

RMN1H e IV.

Os demais compostos da série foram completamente caracterizados e seus

assinalamentos espectroscópicos estão de acordo com os compostos protótipos

descritos por Barros e colaboradores (BARROS, 2012).

Os dez compostos finais das séries 28a-c e 29a-g, foram testados

biologicamente para avaliação de suas atividades inibitórias da enzima NS3

protease do vírus DENV-2 e do HCV. Os resultados dos testes são detalhadamente

descritos na seção 4.6. No momento é importante ressaltar que o composto 28a

apresentou-se como o mais ativo no teste de inibição da enzima NS3/4A do HCV-1b.

A partir dessa triagem biológica preliminar e dos estudos de modelagem

molecular (ver item 4.7, pagina 61) foi proposta a síntese de uma nova série de

compostos, 42a-e, tendo 28a como protótipo.

Os novos compostos 42a-e foram planejados a partir de modificações em

determinados grupamentos do protótipo 28a (Figura 24). A partir do conceito de

bioisosterismo clássico de anéis, o tiofeno foi substituído pelo anel furano,

resultando assim no composto 42b (em azul). Além disso, o anel tiofênico foi

substituído pelos anéis 2-benzotiofeno e 3-metiltiofeno (em azul), no intuito de inserir

grupamentos mais lipofílicos na molécula, resultando assim nos compostos 42a e

42c, respectivamente. Ainda com esse intuito, foi introduzido um grupamento metóxi

49

no anel benzênico da subunidade benzílica da molécula (em roxo), dando origem a

42e e um halogênio (-Cl) no anel benzênico da cadeia lateral (em vermelho),

formando o composto 42d (THOMAS, 2003); (BARREIRO, 2008).

Figura 24. Planejamento estrutural da série de compostos 42a-e.

4.5 PREPARAÇÃO DA NOVA SÉRIE DE PRODUTOS FINAIS 42a-e

Para a síntese dessa nova série foi necessário preparar quatro oxazolonas

38d-g, de acordo com a mesma metodologia de Erlenmeyer utilizada para a síntese

das oxazolonas 38a-c, descritas anteriormente no Esquema 13. A síntese das

oxazolonas 38d-f está demonstrada no Esquema 17.

Esquema 17: Síntese das oxazolonas 38d-f.

50

As oxazolonas 38d-f foram caracterizadas espectroscopicamente por RMN1H

e IV, os quais estão de acordo com a literatura (BARROS, 2009). Nos espectros de

RMN1H, os compostos 38d-f apresentaram sinais relativos aos hidrogênios vinílicos

na região de 6,6-7,3 ppm. Cabe ressaltar que o composto 38f difere da oxazolona

protótipo 38a pela presença de um grupo metila na posição 3 do anel tiofênico, o

qual foi evidenciado pelo aparecimento do sinal em 2,47 ppm (s, 3H) no seu

espectro de RMN1H. Além disso, no espectro de IV é possível verificar o

desaparecimento das bandas em 1600 e 3341 cm-1, referentes, respectivamente,

aos estiramentos das ligações N-H do grupo amida e O-H do grupo ácido carboxílico

da N-benzoilglicina (41). Também observam-se bandas de absorção da carbonila de

lactona em 1786, 1789 e 1784 cm-1 para os compostos 38d-f, respectivamente.

As três oxazolonas foram obtidas como sólidos amarelos (p.f. 216-218, 169-

171 e 165-166ºC), em 64, 55 e 60% de rendimentos, respectivamente.

Diferentemente das oxazolonas 38d-f, as quais apresentaram modificações

no anel tiofênico, a oxazolona 38g apresenta um átomo de cloro na posição 4 do

anel benzênico da N-benzoilglicina (41). Objetivando a síntese de 38g, inicialmente

foi realizada a obtenção do composto p-cloro-N-benzoilglicina (43), realizada através

da reação da glicina (39) com cloreto de p-clorobenzoíla (44), em solução aquosa de

NaOH. Após o término da adição do cloreto de p-clorobenzoíla, a reação foi

neutralizada com HCl concentrado e o precipitado formado foi filtrado e lavado com

água gelada. O produto foi obtido suficientemente puro como um sólido branco (p.f.

144-146°C), em 90% de rendimento (Esquema 18) (MESAIK, 2004); (PEIYUAN,

2011).

Esquema 18. Obtenção da p-cloro-N-benzoilglicina (43).

Pode-se destacar no espectro de RMN1H do composto 43, a presença de dois

dupletos distorcidos na região dos aromáticos (7,86-7,81 ppm, 2H e 7,54-7,49 ppm,

51

2H), relativos ao padrão AB típico de benzenos p-di-substituídos. Além disso,

destaca-se um sinal em 4,00 ppm (s, 2H) referente aos hidrogênios metilênicos.

No espectro de infravermelho destaca-se a banda em 1595 cm-1 referente ao

estiramento da ligação N-H do grupo amida, além das bandas em 1091 cm-1,

referente ao estiramento da ligação C-aromático-Cl.

Após a obtenção da p-cloro-N-benzoilglicina (43), partiu-se para a obtenção

da oxazolona 38g, através da reação de Erlenmeyer, previamente discutida

(Esquema 19) (MESAIK, 2004).

Esquema 19. Obtenção da oxazolona 38g.

Pode-se destacar no espectro de RMN1H do composto 38g sinais múltiplos na

região 8,11-7,49 ppm, indicando a presença dos sete hidrogênios aromáticos da

molécula, além de um sinal em 7,18-7,16 ppm (dd, 1H, J= 5,0 Hz), referente ao

hidrogênio alélico.

A etapa final para a síntese dos compostos 42a-d consistiu em uma reação

de abertura de anel das oxazolonas 38d-g com a amina O-benzilada 34 em acetato

de etila em refluxo, por 24 horas. Após o término reação, o produto bruto foi

resfriado em banho de gelo, formando um precipitado o qual foi filtrado. Os produtos

foram purificados por coluna cromatográfica em gel de sílica (eluente: hexano e

acetato de etila, em gradiente de polaridade crescente), sendo obtidos com 54-80%

de rendimento (Esquema 20) (BARROS, 2009).

52

Esquema 20. Síntese dos compostos finais 42a-d

As estruturas dos compostos 42a-d foram completamente caracterizadas e na

Tabela 5 são mostrados os dados mais relevantes.

O último produto final 42e, o qual apresenta um grupamento metóxi no anel

benzênico da porção benzílica, pôde ser obtido pela modificação do reagente na

segunda etapa da rota sintética. Dessa forma, o isosorbídeo monotosilado 31 foi

benzilado com cloreto de 4-metoxibenzila nas mesmas condições reacionais já

descritas anteriormente (LOUPY, 1996). Após purificação por coluna cromatográfica

em sílica gel (eluente: hexano: acetato de etila), o produto 45 foi obtido como um

sólido branco (p.f. 171-173ºC), em 50% de rendimento (Esquema 21).

Cabe ressaltar que o composto 42e difere do seu análogo 28a pela presença

de um grupo metoxi na posição 4 do anel benzênico. Por esse motivo, tem-se como

principal evidência da confirmação da síntese de 45 o aparecimento de um sinal

3,79 ppm (s, 3H) referente aos hidrogênios desse grupo no espectro de RMN1H.

53

Tabela 5. Caracterização dos compostos finais 42a-d.

Nº Subst. H Subs. Y

Aspecto p.f. (ºC)

Rend. (%)

RMN1H (ppm)

IV (cm-1)

42a

H Sólido branco

159-162

54 7,37-7,29 (H-vinílico)

3238 (N-H); 2873 (C-Harom.);

1660; 1641 (C=O

amida)

42b

H Sólido branco

183 (dec.)

80 6,57-6,50 (H-vinílico);

8,27 (H-arom.

vizinho ao O)

3231 (N-H); 2927 (C-Harom.);

1647, 1637 (C=O

amida)

42c

H Sólido branco

180-182

78 6,96 (H-vinílico);

2,35 (-CH3)

3221 (N-H); 1641 (C=O

amida)

42d

Cl Sólido branco

178-180

65 7,10 (H-vinílico);

7,64-7,61 (H-arom.

do benzeno subst.)

3236 (N-H); 2927 (C-Harom.);

1641 (C=O amida)

Subst. = Substituinte / Rend. = Rendimento

54

Esquema 21. Síntese do intermediário 45.

Dando prosseguimento à rota sintética para obtenção da amina 47, cabe

mencionar que todas as demais reações foram realizadas conforme metodologia já

discutidas para a amina 34 (Esquema 22).

Esquema 22. Rota sintética para obtenção da amina 47.

Após purificação por coluna cromatográfica em sílica gel (eluente: hexano:

acetato de etila), o produto 46 foi obtido como um óleo amarelo, em 70% de

rendimento. Pode-se destacar no espectro de RMN1H da azida 46 dois dupletos na

região de aromáticos, indicando a presença dos quatro hidrogênios aromáticos da

molécula, confirmando a perda do grupo tosila. A perda desse radical também foi

confirmada no espectro de IV, já que observamos o desaparecimento da banda em

1376 cm-1 referente ao estiramento da ligação S=O do grupo sulfônico.

A amina 47 foi obtida, por redução da função azida de 46, como um óleo

amarelado em rendimento quantitativo. A formação do produto foi evidenciada

principalmente a partir do desaparecimento da banda em 2102 cm-1 referente ao

estiramento da função azida no espectro de IV e o aparecimento de uma pequena

55

banda em 3403 cm-1, referente ao aparecimento do grupo amina na molécula. Vale

ressaltar que as estruturas de 45, 46 e 47 não foram encontradas na literatura.

A etapa final para a síntese do composto 42e consistiu na reação de abertura

de anel da oxazolona 38a com a amina O-benzilada 47, em acetato de etila em

refluxo, por 24 horas. Após o término da reação, o meio foi resfriado em banho de

gelo, com formação de um precipitado, o qual foi filtrado. Esse precipitado foi

purificado por coluna cromatográfica em gel de sílica (eluente: hexano: acetato de

etila), obtendo o produto puro como um sólido branco (p.f. 169-171ºC) em 50 % de

rendimento (Esquema 23) (BARROS, 2009).

Esquema 23. Síntese do produto final 42e.

O composto 42e teve sua estrutura completamente caracterizada,

apresentando, no espectro de IV, bandas de absorção de ligações N-H em 3220 e

3047 cm-1, além de uma banda em 1641 cm-1 atribuída ao estiramento da ligação

C=O do grupo amida.

4.6 RESULTADOS FARMACOLÓGICOS

Os ensaios biológicos desse trabalho foram realizados pelo grupo de

pesquisa coordenado pelo Prof. Dr. Ronaldo Mohana-Borges (Biofísica/UFRJ).

56

4.6.1 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DAS SÉRIES 28a-c E 29a-g EM ENSAIOS DE INIBIÇÃO DA SERINA PROTEASE DO DENV-2.

Os compostos das séries 28a-c e 29a-g foram inicialmente testados frente à

inibição da protease do DENV-2, onde os derivados não apresentaram resultados

significativos. Apenas o composto 28c apresentou cerca de 20% de atividade

inibitória enzimática em uma concentração de 100 µM (Figura 25).

Figura 25. Resultados de inibição enzimática da protease do DENV-2 pelos

compostos 28a-c e 29a-g.

4.6.2 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DAS SÉRIES 28a-c E 29a-g EM ENSAIOS

DE INIBIÇÃO DA SERINA PROTEASE DO HCV-1b.

Os resultados da inibição enzimática das séries 28a-c e 29a-g frente à

NS3/4A do HCV-1b são mostrados abaixo (Figura 26A). O composto 28a mostrou-

se o mais ativo apresentando das duas séries, com IC50 = 88 µM (inibidor padrão

IC50 = 0,6 µM), calculado pela curva dose-resposta (Figura 26B). Na Figura 26C

observam-se as percentagens de inibição de 28a frente às proteases mutantes

(R155K, A156V, D168S e V170A) bem como àquela sem mutação (WT, wild type,

alelo selvagem). O gráfico mostra que tanto 28a, quanto o inibidor padrão foram

57

capazes de inibir (~100%) a atividade proteolítica da enzima sem mutação. Além

disso, 28a foi capaz de diminuir a atividade proteolítica da enzima mutante A156V a

cerca de 20%, enquanto o inibidor padrão a cerca de 70%. Entretanto, a

concentração do inibidor padrão (20µM) foi 10 vezes menor que o composto 28a

(200µM) (Figura 26C).

Figura 26. Inibição enzimática dos compostos 28a-c e 29a-g frente à HCV protease.

(A) Atividade residual da enzima na presença dos compostos testados, (B) Curva

dose-resposta de 28a, (C) Inibição de 28a frente às cepas virais mutantes R155K,

A156V, D168S e V170A, e à cepa WT (sem mutação), (D) Estrutura do composto

mais ativo 28a.

Os compostos 28a e 20a (20a foi previamente sintetizado pelo grupo,

mostrado na Figura 21, com EC50 = 35μM), foram testados juntamente na mesma

placa, para avaliação do perfil de inibição da HCV protease. Ressalta-se que esses

dois compostos diferem somente pela estereoquímica do carbono 2.

58

Pelo gráfico mostrado na Figura 27, observa-se que 20a levou a um aumento

da atividade proteolítica da enzima em altas concentrações, enquanto que 28a

mostrou um bom perfil de inibição enzimática, com um IC50 = 67µM. Cabe destacar

que, estatisticamente, não há diferença de valores de IC50 do composto 28a, IC50 =

88 µM ± 11/ Figura 26 e IC50 = 67 µM ± 21,6/ Figura 27, portanto, os resultados

encontrados para o composto 28a são coerentes. Outro fator que deve ser descrito

é a diferença dos resultados biológicos obtidos para 20a. O mesmo apresentou um

valor inicial de EC50 = 35 µM, onde foi testado em células, ao passo que na Figura

27, o ensaio foi realizado com a enzima isolada, mostrando que 20a não apresentou

inibição enzimática satisfatória. Este fato nos leva a crer que o composto 20a pode

estar agindo por outro mecanismo diferente da inibição da enzima protease.

Logo, de acordo com os dados discutidos e considerando-se o fato de que

20a é proveniente do cerne rígido derivado do isomanídeo, enquanto 28a é

proveniente do cerne rígido derivado do isosorbídeo, sugere-se que a utilização do

cerne isosorbídeo para síntese dos compostos peptideomiméticos é mais vantajosa

do que a utilização do cerne isomanídeo. Outros testes mais elucidativos necessitam

ser realizados para confirmar essa hipótese.

Figura 27. Curva dose-resposta para os compostos 20a e 28a frente à inibição da

enzima NS3/4A protease do HCV.

59

4.6.3 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DA NOVA SÉRIE 42a-e EM ENSAIOS DE INIBIÇÃO DA SERINA PROTEASE DO HCV-1b.

A nova série de compostos 42a-e, sintetizada tendo o composto 28a como

protótipo, foi testada frente à inibição da atividade protease do HCV. Os resultados

são apresentados na Figura 28.

Analisando os resultados obtidos para a série 42a-e, pode-se identificar os

compostos 42b e 42c como os mais ativos da série. Além disso, Observa-se que

houve um aumento nas percentagens de inibição enzimática para esses dois

compostos (em torno de 70%), em relação ao protótipo 28a (em torno de 42%).

Esses resultados sugerem que a substituição isostérica do grupo tiofeno de 28a

pelos grupos furano e 3-metiltiofeno de 42b e 42c, respectivamente, possa ter

beneficiado o perfil de inibição enzimática dos mesmos. Comparando o resultado

obtido para 42d e 42e (em torno de 40% e 50% de inibição) com 28a, observa-se

que não houve mudança significativa na atividade inibitória ao inserir um substituinte

halogenado (cloro) no anel benzênico proveniente da oxazolona, em 42d, e um

grupamento metóxi no anel benzênico da porção benzílica, em 42e. Mas ao

comparar 42d e 42e com os mais ativos 42b e 42c, observa-se uma redução nas

percentagens de inibição.

Figura 28. Inibição enzimática dos compostos 28a e 42a-e frente à HCV protease.

60

4.7 MODELAGEM MOLECULAR

4.7.1 ESTUDOS DE DOCKING MOLECULAR

O docking molecular consiste na avaliação da conformação e orientação de

um ligante no sítio de ligação da molécula-alvo, predizendo o curso natural da

interação entre o ligante e o receptor pela via de menor energia através da

complementaridade química entre as estruturas em estudo (KITCHEN, 2004). Os

principais objetivos desta metodologia são: a modelagem estrutural precisa e a

estimativa da atividade de um ligante.

A estrutura do complexo formado entre a macromolécula biológica e o ligante

fornece informações importantes sobre o modo de interação e sobre as potenciais

interações que ocorrem no sítio ativo tais como, interações hidrofóbicas,

eletrostáticas e ligações hidrogênio no complexo enzima/inibidor (ERICKSON,

2004).

O objetivo desses estudos foi avaliar o modo de interação do composto mais

ativo 28a com a serina protease do HCV, possibilitando identificar os principais

grupos de interação de 28a com a enzima pela análise das conformações dos

ligantes no complexo enzima-ligante.

Nos estudos de docking molecular foi utilizado o programa AutoDock 4.2. O

AutoDock é um conjunto de programas gratuitos, desenvolvido pelo grupo de Arthur

J. Olson da Universidade da Califórnia (San Diego, EUA) que permite a predição da

interação entre ligante-macromolécula. Para identificar as possíveis combinações

entre ligante-macromolécula, o programa possui 3 opções de algoritmos: SA

(Simulated Annealing), GA (Genetic Algorithm) e LGA (Lamarckian Genetic

Algorithm). Nesse trabalho, o algoritmo de busca utilizado foi o algoritmo genético

Lamarckiano (LGA), o qual apresenta os melhores resultados na busca do mínimo

global (MORRIS, 1998).

Para a validação do método e avaliação da capacidade preditiva do

programa, foi realizado o redocking do ligante HU1 com a proteína NS3/NS4

protease do vírus HCV, sob o código 2OC0, retirados do PDB (Protein Data Bank),

utilizando o AutoDockTools (A descrição da metodologia utilizada encontra-se na

parte experimental). A confiabilidade do protocolo de docking foi verificada

61

analisando as melhores soluções a partir das soluções com menores valores de

energia de docking no cluster que tinha o maior número de poses, avaliando a

similaridade da conformação final e a configuração de menor energia (Figura 29).

Resultados do redocking mostraram um valor de RMSD de 1,09 Å, sugerindo que o

processo de docking pode ser utilizado para prever o modo de ligação dos

compostos do conjunto sob investigação. De acordo com a literatura, um valor limiar

de RMSD de 2,0 Å é amplamente aceito como a distinção entre o sucesso e o

fracasso na reprodução de um modo conhecido de ligação (DILMURAT YUSUF,

2008).

(A)

(B)

Figura 29. (A) Estrutura química do inibidor HU1. (B) Sobreposição da melhor pose

de docking do inibidor (em rosa) e da conformação de raios-X (em amarelo),

RMSD=1,09Å.

Nos estudos de docking molecular do composto 28a (Figura 30) foram

analisadas as conformações do cluster mais populoso de menor energia. Também

foi realizada uma inspeção visual das soluções possíveis, visando analisar os

contatos entre os resíduos altamente conservados dentro do sítio ativo.

Os resultados obtidos para o docking do 28a indicaram que o composto

realiza interações importantes, tais como: a carbonila da função amida interage por

ligação hidrogênio com o resíduo de Ser139A (da cadeia A da proteína), bem como o

anel tiofênico interage por interações hidrofóbicas com o resíduo de His57A (Figuras

30 e 31). Desta forma, esses resultados indicam que o composto 28a se localiza nas

cavidades próximas a cavidade catalítica, conferindo uma provável inibição

competitiva.

62

(A)

(B)

Figura 30. (A) Docking molecular do composto 28a no sítio ativo da NS3/NS4

protease do HCV visualizado no programa PyMOL. (B) Interações entre a proteína

em estudo e a pose obtida no docking gerada pelo programa PoseView.

Com o intuito de realizar modificações estruturais no composto 28a para

aprimoramento da atividade, sugerem-se, principalmente, substituições do anel por

bioisósteros, a fim de proporcionar maior interação com residuos, como His57A.

Aumentos na lipofilicidade do anel podem resultar em maior interação com o

ambiente protéico, levando a uma acomodação na cavidade catalítica (Figura 31).

Figura 31. Composto 28a na cavidade da enzima serina protease do HCV.

(As setas mostram os principais locais de interação com os resíduos. Em destaque a

posição dos resíduos His57 e Ser139).

His57

Ser139

63

5. CONCLUSÃO

Neste trabalho foram sintetizados quinze compostos peptideomiméticos

contendo o cerne rígido proveniente do isosorbídeo (27), sendo todos inéditos na

literatura.

A estratégia de síntese dos peptideomiméticos das séries 28a-c, 29a-g e 42a-

e, aplicando metodologias clássicas, mostrou-se satisfatória, permitindo a obtenção

das moléculas-alvo, em rendimentos globais que variaram entre 10% (28a) e 22%

(42b).

De acordo com os dados comparativos discutidos para 20a, proveniente do

cerne rígido derivado do isomanídeo, e 28a, proveniente do cerne rígido derivado do

isosorbídeo, sugere-se que a utilização do isosorbídeo para síntese dos compostos

peptideomiméticos é mais vantajosa do que a utilização do cerne isomanídeo.

Entretando, outros testes mais elucidativos necessitam ser realizados para confirmar

essa hipótese

Os estudos de docking molecular foram realizados para avaliar o modo de

interação dos ligantes com serina protease NS3/4A do HCV. Dentre os compostos

sintetizados, das séries 28a-c e 29a-g, 28a foi considerado como protótipo para o

desenvolvimento de novos compostos com potencial de inibição da enzima em

questão.

Os resultados dos ensaios farmacológicos da série 42a-e sugerem que a

substituição do tiofeno de 28a pelo furano e 3-metiltiofeno nos compostos 42b e 42c,

respectivamente, tenha aumentado o perfil de inibição enzimática em 30%. Dessa

forma, podemos identificar dois novos compostos protótipos para o planejamento de

futuras moléculas potencialmente inibidoras da enzima serina protease do vírus da

hepatite C.

64

Figura 32. Estrutura química do compostos 42b e 42c.

65

6. EXPERIMENTAL

6.1 MATERIAIS E MÉTODOS

O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Química Medicinal (LQMed),

localizado na Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense (UFF).

Os solventes e reagentes utilizados foram devidamente tratados quando

necessário. Diclorometano, acetato de etila e piridina foram tratados adicionando

hidreto de cálcio, agitados por uma noite e destilados em seguida. O cloreto de p-

toluenossulfonila foi tratado adicionando a ele clorofórmio, em seguida filtrado e ao

líquido recolhido adicionado éter de petróleo. Após adicionar carvão ativo ficou

agitado por 4 horas, depois foi filtrado e evaporado no evaporador rotatório.

As análises de RMN foram realizadas em um aparelho Varian VNMRS

(500MHz e 300MHz para RMN1H e 75MHz para RMN13C). Os valores de

deslocamento químico são atribuídos em unidade (ppm) em relação ao solvente

deuterado utilizado na análise e as constantes de acoplamento (J) foram expressas

em Hertz (Hz). As multiplicidades (s-simpleto; sl-sinal largo; d-dupleto; t-tripleto; dd-

duplo dupleto; m-multipleto) e o número de hidrogênios (deduzido por integração

relativa) estão entre parêntesis.

Os espectros de IV foram obtidos em um espectrofotômetro Perkin-Elmer

modelo Spectrum One, utilizando filmes em diclorometano ou pastilhas de KBr. Os

valores de absorção foram registrados em número de onda, sendo a unidade o

centímetro recíproco (cm-1).

Os pontos de fusão foram medidos em aparelho Unit- Melt / Thomas Hoover /

Capillary Melting Point Apparatus (Arthur H. Thomas Company. Philadelphia PA,

USA) e não foram corrigidos.

A visualização de substâncias cromatografadas analiticamente foi feita com

lâmpada ultravioleta (254 e 365 nm).

66

As análises de foram realizadas no aparelho ACATEC - Polarimetro

Digital Automatico PDA 9300.

6.2 SÍNTESE

6.2.1 - 5-(4-metilbenzenossulfonato)-1,4:3,6-dianidro-D-glucitol (31) e 2-(4-metilbenzenossulfonato)-1,4:3,6-dianidro-D-glucitol (30)

À uma solução de isosorbídeo (27) (2 g; 13,68 mmol) em piridina destilada (20

mL) foi adicionado cloreto de tosila (5,2 g; 27,36 mmol; 2eq.) a 0ºC. A mistura foi

agitada por 40h a t.a. Após esse tempo a piridina foi evaporada e o óleo resultante

foi dissolvido em diclorometano (150 mL) e a solução foi lavada com HCl 1N (3 x 20

mL) e solução saturada de NaCl (3 x 20 mL). A fase orgânica foi seca com Na2SO4,

filtrada e evaporada. O produto foi purificado por coluna cromatográfica em sílica gel

(eluente: hexano/acetato de etila), obtendo o produto endo tosilado 31 (1,6 g) em

40% como um óleo incolor e o produto exo tosilado 30 (0,387 g) em 9% de

rendimento como um sólido branco (p.f.109-110ºC). O produto ditosilado foi obtido

em 2% (0,130 g).

RMN1H (CDCl3, 300MHz) (ppm): 7,84 (d, 2H/H-arom., J = 8,3 Hz); 7,36 (d, 2H/H-

arom., J = 8,3 Hz); 4,89 (ddd, 1H/H-2, J = 1,2; 5,1; 6,3 Hz); 4,64 (t, 1H/H-1, J = 4,5

Hz); 4,38 (d, 1H/H-4, J = 4,2 Hz); 4,30 (sl, 1H/H-5); 3,89-3,88 (m, 2H/H-6a e H-6b);

3,86-3,82 (m, 1H, H-3b); 3,71 (dd, 1H/H-3a, J = 9,6, 6,3 Hz); 2,45 (s, 3H/-CH3).

(Anexo, p. 2)

67

RMN13C (75MHz ,CDCl3) δ (ppm): 145,1 (C-7); 133,1 (C-10); 129,8 (C-arom.); 127,9

(C-arom.); 87,9 (C-1); 79,6 (C-4); 78,7 (C-5); 76,1 (C-2); 75,8 (C-3); 69,4 (C-6); 21,6

(CH3). (Anexo, p. 4)

IV (KBr) cm-1: 3435, 2951, 2880, 1925, 1598, 1454, 1401, 1360, 1308, 1293, 1190,

1175, 1094, 1043, 1008, 972, 849, 703. (Anexo, p. 5)

RMN1H (CDCl3, 300MHz) (ppm): 7,81 (d, 2H/H-arom., J = 8,3 Hz); 7,38 (d, 2H/H-

arom., J = 8,3 Hz); 4,93 (d, 1H/H5, J = 3,2 Hz); 4,61(t, 1H/H3, J = 4,8 Hz); 4,48 (d,

1H/H4, J = 4,3 Hz); 4,29-4,27 (m, 1H/H2); 4,10 (d, 1H/H6b, J = 11 Hz); 3,91(d,

1H/H6a, J = 3,4 Hz); 3,85-3,82 (m, 1H/H3b); 3,49 (dd, 1H/H3a, J = 9,4; 5,9 Hz); 2,49

(s,3H/-CH3); (Anexo, p. 6)

RMN13C (75MHz, CDCl3) δ (ppm): 145,3 (C-7); 133,1 (C-10); 130,0 (C-arom.); 127,8

(C-arom.); 85,4 (C-1); 83,6 (C-4); 81,9 (C-5); 73,4 (C-6 ou C-3); 73,1 (C-6 ou C-3);

72,1 (C-2); 21,6 (CH3). (Anexo, p. 8)

68

6.2.2 – 5-(4-metilbenzenossulfonato)-1,4:3,6-dianidro-2-O-(fenilmetil)-D-glucitol (32)

À uma solução do composto 31 (0,298 g; 0,993 mmol) em diclorometano (8

mL), sob agitação, foram adicionados solução aquosa de KOH 50% (0,5 mL), TBAB

(0,028 g) e BnCl (0,34 mL; 2,98 mmol). A reação ficou em agitação por 3 dias. Após

esse tempo a mistura foi diluída com água, a fase orgânica foi separada e a fase

aquosa extraída com diclorometano (3x 20 mL). As fases orgânicas combinadas

foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e evaporadas. O resíduo foi purificado por

coluna cromatográfica em sílica gel (eluente: hexano/acetato de etila), obtendo o

produto 32 (0,367 g) em 95% de rendimento como um óleo incolor.

RMN1H (CDCl3, 300MHz) (ppm): 7,82 (d, 2H/H-arom., J = 8,3 Hz); 7,36-7,27 (m,

7H/H-arom.); 4,85 (ddd, 1H/H-5, J = 1,5; 5,1; 6,6 Hz); 4,59 (t, 1H/H-1, J = 4,7 Hz);

4,53 (s, 2H/-CH2); 4,49 (d, 1H/H-4, J = 4,5 Hz); 4,04 (sl, 1H/H-2); 4,00-3,96 (m, 1H/H-

6a ou 6b); 3,90 (d, 1H/ H-6a ou 6b, J = 4,0 Hz); 3,87-3,84 (m, 1H/ H-3a ou 3b); 3,72

(dd, 1H/ H-3a ou 3b, J = 7,2 Hz); 2,44 (s, 3H/-CH3). (Anexo, p. 9)

RMN13C (75MHz, CDCl3) δ (ppm): 145,0 (C-7); 137,3 (C-10); 133,2 (C-13); 129,8 (C-

arom.); 128,4 (C-arom.); 127,9 (C-arom.); 127,8 (C-arom.); 127,6 (C-arom.); 86,0 (C-

4); 83,2 (C-1); 80,1 (C-2); 78,6 (C-5); 73,4 (C-12); 71,4 (C-6); 69,2 (C-3); 21,6 (-CH3).

(Anexo, p. 11)

69

IV (KBr) cm-1: 3435, 3092, 3063, 2951, 2880, 2691, 2591, 2532, 2413, 2306, 2192,

1925, 1812, 1731, 1632, 1494, 1454, 1401, 1360, 1308, 1293, 1271, 1190, 1175,

1094, 1043, 1008, 972, 951, 849, 816, 703, 643. (Anexo, p. 12)

+78.8 (c 0,6, CH2Cl2).

6.2.3 – 5-(4-metilbenzenossulfonato)-1,4:3,6-dianidro-2-O-((4-metilfenil)metil)-D-glucitol (45)

À uma solução do composto 31 (0,832 g; 2,77 mmol) em diclorometano (15

mL), sob agitação, foram adicionados solução aquosa de KOH 50% (1,4 mL), TBAB

(0,008 g) e cloreto de 4-metoxibenzila (0,96 mL; 3,22 mmol). A reação ficou em

agitação por 17 horas. Após esse tempo a mistura foi diluída com água, a fase

orgânica foi separada e a aquosa extraída com diclorometano (3x 20 mL). As fases

orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e evaporadas. O

resíduo foi purificado por coluna cromatográfica em sílica gel (eluente:

hexano/acetato de etila), obtendo o produto 45 (0,700 g) em 61% de rendimento

como um sólido branco (p.f.171-173ºC).

RMN1H (CDCl3, 300MHz) (ppm): 7,83 (d, 2H/H-arom., J = 4,8 Hz); 7,34 (d, 2H/H-

arom., J = 4,8 Hz); 7,22 (d, 2H/H-arom., J = 5,1 Hz); 6,87 (d, 2H/H-arom., J = 5,4

Hz); 4,86 (ddd, 1H/H-5, J = 1,5; 5,1;6,4 Hz); 4,57 (t, 1H/H-1, J = 3,0 Hz); 4,47-4,46

70

(m, 3H/H-4 e -CH2); 4,02 (sl, 1H/H-2); 3,96-3,94 (m, 1H/ H-6a ou 6b); 3,88-3,87 (m,

1H/H-6a ou 6b); 3,86-3,85 (m, 1H, H-3a ou 3b); 3,79 (s, 3H/-OCH3); 3,72 (dd, 1H/ H-

3a ou 3b, J = 4,2 Hz); 2,44 (s, 3H, -CH3). (Anexo, p. 13)

RMN 13C δ ppm (75MHz, CDCl3) δ (ppm): 159,3 (C-16); 145,0 (C-7); 133,2 (C-10);

129,8 (C-arom.); 129,4 (C-13); 129,3 (C-arom.); 127,9 (C-arom.); 113,8 (C-arom.);

86,0 (C-4); 82,9 (C-1); 80,9 (C-2); 78,6 (C-5); 73,4 (C-12); 71,1 (C-6); 69,2 (C-3);

55,2 (-OCH3); 21,6 (-CH3). (Anexo, p. 15)

IV (KBr) cm-1: 1613, 1512, 1376, 1365, 1245, 1176, 1138, 1105, 973, 915, 818,

716, 658. (Anexo, p. 16)

+62.75 (c 0,8, CHCl3).

6.2.4 – 5-azido-1,4:3,6-dianidro-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol (33)

O composto 32 (2,64 g; 6,77 mmol) foi dissolvido em [Bmim+][BF4-] (8,22 mL;

6 eq.) previamente preparado e seco sob vácuo. NaN3 (2,2 g; 5 eq.) foi adicionada e

a mistura permaneceu em agitação a 120ºC por 20h. Ao final desse tempo, a mistura

foi resfriada à t.a. e água foi adicionada à mistura reacional. A fase aquosa foi

extraída com éter etílico (3x 30 mL) e as fases orgânicas combinadas foram secas

com Na2SO4 anidro, filtradas e evaporadas. O resíduo obtido foi purificado por

coluna cromatográfica em sílica gel (eluente: hexano/acetato de etila), obtendo o

produto 33 (1,2 g) em 68% de rendimento como um óleo incolor.

RMN1H (CDCl3, 300MHz) (ppm): 7,37-7,30 (m, 5H/H-arom.); 4,68 (d, 1H/H-4, J =

10,2 Hz); 4,67 (d, 1H/H-1, J = 5,7 Hz); 4,60 (q, 2H/-CH2, J = 7,2 Hz); 4,08 (d, 1H/H-5,

J = 2,7 Hz); 4,02 (d, 1H/H-2, J = 2,1 Hz); 3,95-3,91 (m, 2H/H6a e H6b); 3,87 (dd,

1H/H3a ou H3b, J = 2,4 Hz); 3,83 (dd, 1H/H3a ou H3b, J = 2,4 Hz). (Anexo, p. 17)

71

RMN13C (75MHz, CDCl3) 75MHz δ (ppm): 137,4 (C-8), 128,5 (C-arom.), 127,9 (C-

arom.), 127,7 (C-arom.), 85,9 (C-1), 85,7 (C-4), 82,7 (C-2), 72,6 (C-7), 71,6 (C-6),

71,3 (C-3), 65,7 (C-5). (Anexo, p. 19)

IV (KBr) cm-1: 2944, 2875, 2100, 1455, 1339, 1254, 1079, 915, 843, 739, 699.

+58.7 (c 0,6, CH2Cl2). (Anexo, p. 20)

6.2.5 – 5-azido-1,4:3,6-dianidro-2-O-((4-metilfenil)metil)-D-iditiol (46)

O composto 45 (0,700 g; 1,67 mmol) foi dissolvido em [Bmim+][BF4-] (2,02

mL; 6 eq.) previamente preparado e seco sob vácuo. NaN3 (0,54 g; 5 eq.) foi

adicionada e a mistura permaneceu em agitação a 120ºC por 20h. Ao final desse

tempo, foi adicionada água à mistura reacional. A fase aquosa foi extraída com éter

etílico (3x 30 mL) e as fases orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4 anidro,

filtradas e evaporadas. O resíduo obtido foi purificado por coluna cromatográfica em

sílica gel (eluente: hexano/acetato de etila), obtendo o produto 46 (0,306 g) em 63%

de rendimento como um óleo incolor.

RMN1H (CDCl3, 300MHz) (ppm): 7,24 (d, 2H/H-arom., J = 5,4 Hz); 6,89 (d, 2H/H-

arom., J = 5,4 Hz); 4,65 (d, 1H/H-4, J = 8,7 Hz); 4,63 (d, 1H/H-1, J = 3,9 Hz); 4,52 (q,

2H/-CH2, J = 15,0; 7,0 Hz); 4,05 (sl, 1H/H-5); 4,02 (d, 1H/H-2, J = 2,1 Hz); 3,92-3,90

(m, 2H//H6a e H6b); 3,87 (dd, 1H/H3a ou H3b, J = 2,4 Hz); 3,82 (dd, 1H/H3a ou H3b,

J = 2,4 Hz); 3,80 (s, 3H/-OCH3). (Anexo, p. 21)

RMN13C (75MHz, CDCl3) δ (ppm): 159,4 (C-11), 129,4 (C-8), 129,3 (C-arom.), 113,9

(C-arom.), 85,8 (C-1), 85,7 (C-4), 82,4 (C-2), 72,6 (C-7), 71,3 (C-6), 70,9 (C-3), 65,7

(C-5), 55,2 (-OCH3). (Anexo, p. 23)

IV (KBr) cm-1: 3437, 2938, 2102, 1613, 1514, 1302, 1248, 1174, 1086, 1034.

(Anexo, p. 24)

72

+42.75 (c 0,8, CHCl3).

6.2.6 - 5-amino-1,4:3,6-dianidro-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol (34)

À uma solução da azida 33 (1,3 g; 4,98 mmol) em EtOH (30 mL) foi

adicionado Pd/C 10% (0,49 mmol) e a mistura foi hidrogenada sob 40 psi à

temperatura ambiente por 4h. Após este período, a suspensão foi filtrada com paple

de filtro e algodão, até retirada de todo o paládio e lavada com etanol. O solvente foi

evaporado fornecendo o produto como um óleo incolor, sem necessidade de

purificação, em rendimento quantitativo.

RMN1H (CDCl3, 300MHz) (ppm): 7,36-7,28 (m, 5H/H-arom.); 4,71 (d, 1H/H-4, J =

2,4Hz); 4,60 (q, 2H/-CH2, J = 15,0; 7,2 Hz); 4,44 (d, 1H/H-1, J = 2,4 Hz); 4,05 (sl,

1H/H-5); 3,87 (m, 3H/H-2, H6a e H6b); 3,68 (d, 1H/H3a ou H3b, J = 2,4 Hz); 3,54 (d,

1H/H3a ou H3b, J = 2,4 Hz); 1,84 (s, 2H/-NH2). (Anexo, p. 25)

RMN13C (75MHz, CDCl3) δ (ppm): 137,6 (C-8), 128,4 (C-arom.), 127,8 (C-arom.),

127,7 (C-arom.), 89,0 (C-1), 85,3, (C-4), 83,1 (C-2), 74,5 (C-7), 72,3 (C-6), 71,5 (C-

3), 57,8 (C-5). (Anexo, p. 27)

IV (KBr) cm-1: 3371, 3032, 2938, 2873, 1605, 1455, 1267, 1167, 1077, 912, 737,

699. (Anexo, p. 28)

+33.7 (c 0.8, CH2Cl2).

73

6.2.7 – 5-amino-1,4:3,6-dianidro-2-O-((4-metilfenil)metil)-D-iditiol (47)

À uma solução da azida 46 (0,1 g; 0,34 mmol) em EtOH (10 mL) foi

adicionado Pd/C 10% (0,44 mmol) e a mistura foi hidrogenada sob 40 psi à

temperatura ambiente por 4h. Após esse período, a suspensão foi filtrada com papel

de filtro e algodão, até retirada de todo o paládio e lavada com etanol. O solvente

evaporado fornecendo o produto como um óleo incolor em rendimento quantitativo.

RMN1H (CDCl3, 300MHz) (ppm): 7,24 (d, 2H/H-arom.); 6,88 (d, 2H/H-arom.); 4,67

(d, 1H H-4, J = 2,4Hz); 4,50 (q, 2H/-CH2, J = 15,6; 6,9 Hz); 4,39 (d, 1H/H-1, J =

2,4Hz); 4,03 (sl, 1H/H-5); 3,87-3,84 (m, 3H/H-2, H6a e H6b); 3,80 (s, 3H/-OCH3);

3,64 (d, 1 H/H3a ou H3b, J = 5,4 Hz); 3,51 (sl, 1H/H3a ou H3b); 1,54 (sl, 2H/-NH2).

(Anexo, p. 29)

RMN13C (75MHz, CDCl3) δ (ppm): 159,2 (C-11), 129,6 (C-arom.), 129,5 (C-arom.),

129,3 (C-8), 113,8 (C-arom.), 86,0 (C-1), 84,5 (C-4), 82,2 (C-2), 72,6 (C-7), 71,1 (C-

6), 70,2 (C-3), 63,0 (C-5), 55,2 (-OCH3). (Anexo, p. 31)

IV (KBr) cm-1: 3403, 2924, 1713, 1610, 1512, 1463, 1301, 1246, 1175, 1079, 1031,

910, 819, 772. (Anexo, p. 32)

+27,5 (c 0.96, CHCl3).

74

6.2.8 – N-benzoilglicina (41)

A glicina (133,0 mmol, 10 g) foi dissolvida em uma solução de NaOH 10%

(100 mL) e, em seguida, cloreto de benzoíla (186,0 mmol, 21,6 mL) foi adicionado

lentamente sob agitação vigorosa. Posteriormente, foi adicionado gelo picado e HCl

concentrado lentamente, até que o pH da reação atingisse 2-3. A mistura foi, então,

filtrada em funil de Büchner e lavada com água gelada. O produto 41 foi obtido como

um sólido branco (p.f.197ºC), em 95% de rendimento.

RMN1H (CD3OD, 300MHz) (ppm): 8,80-8,75 (m, 2H/H-arom.); 8,50-8,30 (m, 3H/H-

arom.); 5,00 (s, 2H/H-2). (Anexo, p. 34)

RMN13C (CD3OD, 75MHz) δ (ppm): 173,4 (C-1), 170,7 (C-3); 135,3 (C-4), 133,1 (C-

arom.), 129,8 (C-arom.), 128,6 (C-arom.), 42,5 (C-2). (Anexo, p. 35)

IV (KBr) cm-1: 3341, 3073, 2938, 2478, 1745, 1600, 1557, 1416, 1181, 723, 693.

(Anexo, p. 36)

6.2.9 – N-(4-clorobenzoil)-glicina (43)

75

A glicina (5 g, 66.61 mmol) foi dissolvida em uma solução de NaOH 10% (50

mL) e, em seguida, cloreto de 4-cloro-benzoíla (12 mL, 93 mmol) foi adicionado

lentamente com agitação vigorosa. Posteriormente, foi adicionado gelo picado e HCl

concentrado lentamente, até que o pH da reação atingisse 2-3. A mistura foi, então,

filtrada em funil de Büchner e lavada com água gelada. O produto foi obtido como

um sólido branco (p.f. 138-140º C), em 90% de rendimento.

RMN1H (DMSO-d6, 300MHz) (ppm): 8,82 (t, 1H/-NH, J = 5,7 Hz); 7,86-7,81 (m,

2H/H-arom.); 7,54-7,49 (m, 2H/H-arom.); 4,00 (s, 2H/H-2). (Anexo, p. 37)

RMN13C (75MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 171,6 (C-1), 166,1 (C-3), 136,6 (C-7), 132,8

(C-4), 129,9 (C-arom.), 128,7 (C-arom.), 41,8 (C-2). (Anexo, p. 39)

IV (KBr) cm-1: 3296, 2973, 2548, 1913, 1708, 1636, 1595, 1542, 1486, 1404, 1317,

1234, 1182, 1091, 1046, 1014, 925, 879, 847, 761, 644, 618. (Anexo, p. 40)

6.2.10 – Metodologia geral para síntese das oxazolonas (38a-g)

Uma mistura de N-benzoilglicina (2,0 g, 11,17 mmol), o respectivo aldeído

(11,70 mmol) e anidrido acético (3 mL) foi aquecida sob agitação até a dissolução

dos reagentes, e, logo após, foi adicionado acetato de sódio anidro (11,17 mmol). Ao

adicionar o acetato de sódio, formou-se uma mistura pastosa, à qual foi necessária

nova adição de anidrido acético (3 mL). A mistura permaneceu a 60o C por 3h. Após

o término desse tempo, a reação foi resfriada a temperatura ambiente e água foi

adicionada (5 mL). O precipitado formado foi filtrado em funil de Büchner e lavado

com água gelada. O produto bruto foi recristalizado em etanol.

6.2.10.1 – (4Z)-2-fenil-4-(2-tienil-metileno)-5(4H)-oxazolona (38a)

76

Aspecto: sólido amarelo.

p.f.: 176-178ºC

Rendimento: 70%.

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,18-8,16 (m, 2H/H-arom.); 7,72 (d, 1H/H-arom.,

J = 3,6 Hz); 7,63 (d, 1H/H-arom., J = 2,1 Hz); 7,61-7,58 (m, 1H/H-arom.); 7,54-7,51

(m, 2H/H-arom.); 7,48 (s, 1H/H-arom.); 7,16 (dd, 1H/H-8, J = 3 Hz). (Anexo, p. 41)

IV (KBr) cm-1: 3423, 3087, 3069, 3035, 1828, 1792, 1771, 1644, 1450, 1415, 1328,

1295, 1167, 1154, 1050, 860, 721, 695, 684. (Anexo, p. 43)

6.2.10.2 – (4Z)-4-(1,3-benzodioxol-5-il-metileno)-2-fenil-5(4H)-oxazolona (38b)

Aspecto: sólido amarelo.

p.f.:198-200ºC

Rendimento: 60%.

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,19-8,10 (m, 3H/H-arom.); 7,23-7,44 (m, 4H/H-

arom.); 7,16 (s, 1H/H-arom.); 6,89 (d, 1H/H-8., J = 8,1 Hz); 6,07 (s, 2H/H-15).

(Anexo, p. 44)

77

IV (KBr) cm-1: 3444, 2908, 1780, 1763, 1646, 1615, 1486, 1450, 1266, 1167, 1096,

1035, 984, 928, 865, 699. (Anexo, p. 45)

78

6.2.10.3 – (4Z)-2-fenil-4-(fenilmetileno)-5(4H)-oxazolona (38c)

Aspecto: sólido amarelo.

Rendimento: 60%.

p.f.: 168-170ºC

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,30-8,10 (m, 4H/H-arom.); 7,70-7,40 (m, 6H/H-

arom.); 7,26 (s, 1H/H-8). (Anexo, p. 46)

IV (KBr) cm-1: 3444, 3040, 1794, 1769, 1652, 1596, 1553, 1490, 1449, 1363, 1328,

1295, 1231, 1164, 1095, 1070, 984, 928, 887, 866, 767, 751, 699, 686. (Anexo, p.

47)

6.2.10.4 – (4Z)-4-(benzo[b]tien-2-il-metileno)-2-fenil-5(4H)-oxazolona (38d)

Aspecto: sólido amarelo.

Rendimento: 60%.

79

p.f.: 216-218ºC.

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,22-8,20 (m, 2H/H-arom.); 7,85 (d, 1H/H-arom.,

J = 4,5 Hz); 7,84 (d, 1H/H-arom., J = 4,2 Hz); 7,79 (s, 1H/H-arom.); 7,64-7,60 (m,

1H/H-arom.); 7,56-7,53 (m, 3H/H-arom.); 7,44-7,40 (m, 1H/H-arom.); 7,39-7,37 (m,

1H/H-8). (Anexo, p. 48)

IV (KBr) cm-1: 3427, 3051, 1961, 1786, 1646, 1592, 1552, 1498, 1448, 1346, 1324,

1299, 1237, 1181, 1130, 1098, 1067, 980, 931, 872, 773, 738, 692. (Anexo, p. 50)

6.2.10.5 – (4Z)-4-(2-furanilmetileno)-2-fenil-5(4H)-oxazolona (38e)

Aspecto: sólido amarelo.

Rendimento: 50%.

p.f.: 169-171ºC.

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,16-8,14 (m, 2H/H-arom.); 7,67 (d, 1H/H-arom.,

J = 0,9 Hz); 7,61-7,58 (m, 1H/H-arom.); 7,56 (d, 1H/H-arom., J = 2,1 Hz); 7,52 (t,

2H/H-arom., J = 4,5 Hz); 7,17 (s, 1H/H-arom.); 6,66-6,65 (m, 1H/H-8). (Anexo, p. 51)

IV (KBr) cm-1: 3430, 3134, 3107, 3063, 1789, 1654, 1599, 1558, 1492, 1465, 1454,

1329, 1297, 1233, 1156, 1024, 940, 883, 861, 757, 699, 684. (Anexo, p. 53)

80

6.2.10.6 - (4Z)-4-((3-metil-2-tienil)metileno)-2-fenil-5(4H)-oxazolona (38f)

Aspecto: sólido amarelo.

Rendimento: 55%.

p.f.: 165-166ºC.

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,17-8,15 (m, 2H/H-arom.); 7,64 (d, 1H/H-arom,

J = 3 Hz); 7,55-7,50 (m, 4H/H-arom.); 6,97 (d, 1H/H-8, J = 3 Hz); 2,47 (s, 3H/-CH3).

(Anexo, p. 54)

IV (KBr) cm-1: 2923, 2853, 2067, 1784, 1760, 1638, 1595, 1552, 1514, 1489, 1448,

1412, 1330, 1293, 1256, 1184, 1085, 980, 921, 884, 856, 774, 735, 695, 615.

(Anexo, p. 56)

6.2.10.7 – (4Z)-2-(4-clorofenil)-4-(tienilmetileno)-5(4H)-oxazolona (38g)

Aspecto: sólido amarelo.

81

Rendimento: 65%.

p.f.: 145-147ºC.

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,11-8,08 (m, 2H/H-arom.); 7,73 (d, 1H/H-arom.,

J = 3,3 Hz); 7,63 (d, 1H/H-arom., J = 2,4 Hz); 7,51-7,49 (m, 3H/H-arom.); 7,18-7,16

(dd, 1H/H-8, J = 5,0 Hz). (Anexo, p. 57)

IV (KBr) cm-1: 1796, 1646, 1487, 1407, 1405, 1154, 1098, 979, 848, 718. (Anexo,

p. 59)

6.2.11 – Metodologia geral para síntese dos produtos finais (28a-c) e (42a-e)

Á uma solução da amina O-benzilada 34 ou 47 (0,88 mmol) em AcOEt (10

mL) foi adicionada a respectiva oxazolona 38 (0,88 mmol). A mistura ficou em refluxo

por 24h, quando foi resfriada em banho de gelo. O precipitado formado foi filtrado e

lavado com AcOEt. O produto foi purificado por coluna cromatográfica em sílica gel

(eluente: hexano/acetato de etila).

6.2.11.1 – 1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-2-(benzoilamino)-1-oxo-3-(2-tienil)-2-propen-1-il]amino]-2-deoxi-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol (28a)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 35%.

p.f.: 180-181ºC.

+75.0 (c 0,2, CH2Cl2).

82

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,11 (sl, 1H/-NH), 8,02 (d, 2H/H-arom., J = 7,1

Hz); 7,59-7,46 (m, 4H, H-arom.); 7,37 (d, 1H/H-arom., J = 4,8 Hz); 7,34-7,27 (m,

5H/H-arom.); 7,17 (sl, 1H/-NH); 7,02 (m, 1H/H-arom.); 6,80 (sl, 1H/H-19); 4,57 (s,

2H/H-4 e H-1); 4,52 (q, 2H/-CH2, J = 28,3; 11,9 Hz); 4,41 (sl, 1H/H-5); 3,99 (sl, 1H/H-

2); 3,88 (dd, 1H/H-6a ou H-6b, J = 4,8 Hz); 3,83-3,76 (m, 2H/H-3a e 3b); 3,73-3,68

(m, 1H/H-6a ou 6b). (Anexo, p. 60)

RMN13C (DMSO-d6, 75 MHz) δ (ppm): 166,7 (C-14), 165,2 (C-12), 137,5 (C-8), 136,1

(C-20), 132,7 (C-15), 132,4 (C-arom.), 132,4 (C-arom.), 129,5 (C-arom.), 128,8 (C-

arom.), 128,4 (C-arom.), 127,8 (C-arom.), 127,7 (C-arom.), 127,6 (C-arom.), 127,3

(C-arom.), 125,5 (C-13), 125,2 (C-19), 86,5 (C-1), 85,7 (C-4), 83,0 (C-2), 72,1 (C-7),

71,8 (C-6), 71,4 (C-3), 56,7 (C-5). (Anexo, p. 62)

IV (KBr) cm-1: 3226, 3061, 2924, 2872, 2853, 2362, 1653, 1639, 1622, 1566, 1509,

1501, 1466, 1441, 1424, 1382, 1310, 1270, 1217, 1092, 1050, 904, 857, 841, 784,

743, 697, 685, 629. (Anexo, p. 63)

6.2.11.2 – 1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-3-(benzodioxol-5-il)-2-(benzoilamino)-1-oxo-2-propen-1-il]amino]-2-deoxi-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol (28b)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 50%.

p.f.: 173-174ºC.

+92,0 (c 0,2, CH2Cl2).

83

RMN1H (DMSO-d6, 300 MHz) δ (ppm): 9,72 (sl, 1H/-NH); 8,14 (sl, 1H/-NH), 7,97 (d,

2H/H-arom., J = 7,64 Hz); 7,62-7,48 (m, 3H/H-arom.); 7,38-7,26 (m, 5H/H-arom.);

7,15 (sl, 1H/H-arom.); 7,09-7,06 (m, 2H, H-arom.); 6,91 (d, 1H/H-19, J = 8,17 Hz);

5,99 (s, 2H/H-24); 4,59-4,55 (m, 4H/H-4, H-1, -CH2); 4,21 (sl, 1H/H-5); 4,04-4,02 (m,

1H/H-2); 3,91 (dd, 1H/H-6a ou H-6b, J = 5,6 Hz); 3,83 (d, 2H/H-3a e 3b, J = 2,8 Hz);

3,70 (dd, 1H/H-6a ou H-6b, J = 3,57 Hz). (Anexo, p. 64)

RMN13C (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 165,8 (C-14), 165,6 (C-12), 147,6 (C-25),

147,2 (C-23), 138,0 (C-8), 133,7 (C-15), 131,7 (C-arom.), 128,7 (C-arom.), 128,4 (C-

arom.), 128,36 (C-arom.), 128,31 (C-13), 127,8 (C-arom.), 127,68 (C-arom.), 127,63

(C-arom.), 124,9 (C-19), 108,5 (C-arom.), 108,4 (C-arom.), 101,3 (C-24), 86,3 (C-1),

85,3 (C-4), 82,6 (C-2), 71,6 (C-7), 71,4 (C-6), 70,5 (C-3), 56,7 (C-5).

(Anexo, p. 66)

IV (KBr) cm-1: 3240, 1731, 1681, 1650, 1642, 1564, 1557, 1519, 1504, 1484, 1445,

1344, 1255, 1241, 1069, 1028, 1005, 929, 898, 818, 698, 631. (Anexo, p. 67)

6.2.11.3 – 1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-2-(benzoilamino)-1-oxo-3-fenil-2-propen-1-il]amino]-2-deoxi-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol (28c)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 79%.

p.f.: 160-161ºC.

+65,0 (c 0,2, CH2Cl2).

84

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,14 (sl, 1H/H-arom.), 7,82 (d, 2H/H-arom., J =

7,2 Hz); 7,56-7,50 (m, 1H/H-arom.); 7,45-7,29 (m, 12H/H-arom.); 6,92 (s, 1H/H-19);

6,75 (d, 1H/H-arom., J = 6,78 Hz); 4,64-4,60 (m, 2H/H-4 e H-1); 4,55 (d, 2H/-CH2);

4,41 (sl, 1H/H-5); 4,04 (t, 1H/H-2, J = 3,46 Hz); 3,91-3,86 (m, 3H/H-6a, H-6b e H-3a

ou H-3b); 3,80 (dd, 1H/H-3a ou H3b, J = 1,7 Hz). (Anexo, p. 68)

RMN13C (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 166,4 (C-14), 165,7 (C-12), 137,6 (C-8), 133,5

(C-20), 132,7 (C-15), 132,3 (C-arom.), 129,5 (C-13), 129,1 (C-arom.), 129,0 (C-

arom.), 128,8 (C-arom.), 128,7 (C-arom.), 128,4 (C-arom.), 127,8 (C-arom.), 127,6

(C-arom.), 127,5 (C-arom.), 127,2 (C-19), 86,3 (C-1), 85,8 (C-4), 83,2 (C-2), 72,3 (C-

7), 71,9 (C-6), 71,5 (C-3), 56,8 (C-5). (Anexo, p. 70)

IV (KBr) cm-1: 3424, 3234, 2869, 1642, 1629, 1554, 1482, 1210, 1080, 878, 693.

(Anexo, p. 71)

6.2.11.4 – 1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-3-benzo[b]tien-2-il-2-(benzoilamino)-1-oxo-2-propen-1-il]amino]-2-deoxi-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol (42a)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 54%.

p.f.: 159-162ºC.

[]D20 +65,75 (c 0,8, DMSO).

RMN1H (DMSO-d6, 300 MHz) δ (ppm): 9,90 (sl, 1H/-NH), 8,39 (d, 1H/H-arom., J =

6,8 Hz); 8,11 (d, 2H/H-arom., J = 7,4 Hz); 7,86 (t, 2H/H-arom., J = 8,6 Hz); 7,75 (s,

1H/H-arom.); 7,64-7,56 (m, 4H/H-arom.); 7,37-7,29 (m, 6H/H-arom. e H-19); 4,59 (m,

2H/H-4 e H-1); 4,55 (s, 2H/-CH2); 4,23 (sl, 1H/H-5); 4,04 (sl, 1H/H-2); 3,92 (dd, 1H/

85

H-6a ou H-6b, J = 5,7 Hz); 3,85-3,83 (m, 2H/H3a e H3b); 3,70 (dd, 1H/H6a ou H6b, J

= 3,2 Hz). (Anexo, p. 72)

RMN13C (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 166,2 (C-14), 164,6 (C-12), 140,4 (C-20),

138,0 (C-27), 137,9 (C-22), 137,0 (C-8), 133,6 (C-15), 131,7 (C-arom.), 129,3 (C-13),

128,5 (C-arom.), 128,3 (C-arom.), 128,2 (C-arom.), 127,9 (C-arom.), 127,5 (C-arom.),

127,4 (C-arom.), 125,5 (C-19), 124,7 (C-arom.), 124,6 (C-arom.), 123,9 (C-arom.),

122,1 (C-arom.), 86,2 (C-1), 85,1 (C-4), 82,5 (C-2), 71,4 (C-7), 71,3 (C-6), 70,3 (C-3),

56,6 (C-5). (Anexo, p. 74)

IV (KBr) cm-1: 3238, 2873, 1641,1620,1530, 1520, 1480, 1455, 1287, 1081.

(Anexo, p. 75)

6.2.11.5 – 1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-2-(benzoilamino)-3-(2-furil)-1-oxo-2-propen-1-il]amino]-2-deoxi-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol (42b)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 80%.

p.f.: 183ºC (dec.)

+54,25 (c 0,8, DMSO).

RMN1H (DMSO-d6, 300 MHz) δ (ppm): 9,74 (s, 1H/H-NH), 8,27 (d, 1H/H-arom., J =

6,9 Hz); 8,03 (d, 2H/H-arom., J = 7,5 Hz); 7,74 (sl, 1H/H-arom.); 7,59 (t, 1H/H-arom.,

J = 7,3 Hz); 7,52 (t, 2H/H-arom., J = 7,3 Hz); 7,36-7,27 (m, 4H/H-arom.); 7,04 (s,

1H/H-arom.); 6,69 (d, 1H/H-arom., J = 3,4 Hz); 6,57-6,56 (m, 1H/H-19); 4,58-4,56 (m,

2H/H-4 e H-1); 4,54 (s, 2H/-CH2); 4,21 (sl, 1H/H-5); 4,02 (sl, 1H/H-2); 3,90 (dd, 1H/

86

H-6a ou H-6b, J = 5,7 Hz); 3,83-3,82 (m, 2H/H3a e H3b); 3,69 (dd, 1H/H6a ou H6b, J

= 3,4 Hz). (Anexo, p. 76)

RMN13C (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 165,3 (C-14), 164,5 (C-12), 149,6 (C-20),

144,2 (C-arom.), 137,8 (C-8), 133,6 (C-15), 131,4 (C-arom.), 128,17 (C-arom.),

128,10 (C-arom.), 127,7 (C-arom.), 127,4 (C-arom.), 127,3 (C-arom.), 127,2 (C-13),

116,5 (C-19), 113,5 (C-arom.), 112,0 (C-arom.), 86,1 (C-1), 86,0 (C-4), 82,4 (C-2),

71,3 (C-7), 71,2 (C-6), 70,2 (C-3), 56,5 (C-5). (Anexo, p. 78)

IV (KBr) cm-1: 3231, 2927, 1657, 1637, 1569, 1505, 1486, 1451, 1091,1081,

1051,699. (Anexo, p. 79)

6.2.11.6 – 1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-2-(benzoilamino)-1-oxo-3-(2-tienil)-2-propen-1-il]amino]-2-deoxi-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol (42c)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 78%.

p.f.: 180-182ºC.

+59,5 (c 0,8, DMSO).

RMN1H (DMSO-d6, 300 MHz) δ (ppm): 9,68 (s, 1H/-NH), 8,24 (d, 1H/H-arom., J = 6,9

Hz); 8,07 (d, 2H/H-arom., J = 7,1 Hz); 7,61-7,52 (m, 5H/H-arom.); 7,36-7,28 (m,

4H/H-arom.); 6,96 (d, 1H/ H-19, J = 5,1 Hz); 4,57 (s, 2H/H-4 e H-1); 4,55 (s, 2H/-

CH2); 4,22 (sl, 1H/H-5); 4,03-4,02 (m, 1H/H-2); 3,92 (dd, 1H/H-6a ou H-6b, J = 5,8

Hz); 3,84-3,83 (m, 2H/H3a e H3b); 3,69 (dd, 1H/H6a ou H6b, J = 3,6 Hz); 2,35 (s,

3H/-CH3). (Anexo, p. 80)

87

RMN13C (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 165,3 (C-14), 164,7 (C-12), 140,1 (C-21),

137,8 (C-8), 133,8 (C-15), 131,4 (C-arom.), 130,3 (C-20), 129,6 (C-arom.), 128,5 (C-

arom.), 128,1 (C-arom.), 127,8 (C-arom.), 127,4 (C-arom.), 127,3 (C-arom.), 125,9

(C-13), 122,6 (C-19), 86,2 (C-1), 85,1 (C-4), 82,4 (C-2), 71,3 (C-7), 71,2 (C-6), 70,2

(C-3), 56,6 (C-5), 14,0 (-CH3). (Anexo, p. 82)

IV (KBr) cm-1: 3221, 1641, 1555, 1514, 1484, 1298, 1246, 1076, 1053, 702.

(Anexo, p. 83)

6.2.11.7 – 1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-2-(p-clorobenzoilamino)-1-oxo-3-(2-tienil)-2-propen-1-il]amino]-2-deoxi-2-O-(fenilmetil)-D-iditiol (42d)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 65%.

p.f.: 178-180ºC.

+54,25 (c 0,8, CHCl3).

RMN1H (DMSO-d6, 300 MHz) δ (ppm): 9,80 (s, 1H/-NH), 8,25 (d, 1H/H-arom., J = 6,8

Hz); 8,09 (d, 2H/H-arom., J = 8,4 Hz); 7,64-7,61 (m, 4H/H-arom.); 7,43 (d, 2H/H-

arom., J = 3,3 Hz); 7,36-7,28 (m, 4H/H-arom.); 7,10 (dd, 1H/H-19, J = 3,7 Hz); 4,57-

4,56 (m, 2H/H-4 e H-1); 4,55 (s, 2H/-CH2); 4,24-4,21 (m, 1H/H-5); 4,03 (sl, 1H/H-2);

3,91 (dd, 1H/H-6a ou H-6b, J = 5,8 Hz); 3,84-3,83 (m, 2H/H-3a e H-3b); 3,68 (dd,

1H/H-6a ou H6b, J = 3,6 Hz). (Anexo, p. 84)

RMN13C (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 164,9 (C-14), 164,4 (C-12), 137,8 (C-8), 136,5

(C-18), 136,4 (C-20), 132,5 (C-15), 132,0 (C-arom.), 129,9 (C-arom.), 129,7 (C-

arom.), 128,2 (C-arom.), 128,1 (C-arom.), 127,4 (C-arom.), 127,3 (C-arom.), 126,8

88

(C-arom.), 126,4 (C-13), 125,0 (C-19), 86,2 (C-1), 85,1 (C-4), 82,4 (C-2), 71,3 (C-7),

71,2 (C-6), 70,2 (C-3), 56,6 (C-5). (Anexo, p. 86)

IV (KBr) cm-1: 3236, 2927, 1641, 1596, 1556, 1464, 1271, 1095, 1051, 698.

(Anexo, p. 87)

6.2.11.8 – 1,4:3,6-dianidro-5-[[(2Z)-2-(benzoilamino)-1-oxo-3-(2-tienil)-2-propen-1-il]amino]-2-deoxi-2-O-(p-metoxifenilmetil)-D-iditiol (42e)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 65%.

p.f.: 169-171ºC.

+39,5 (c 0,8, CHCl3).

RMN1H (DMSO-d6, 300 MHz) δ (ppm): 9,71 (s, 1H/-NH), 8,20 (d, 1H/H-arom., J = 6,8

Hz); 8,06 (d, 2H/H-arom., J = 7,4 Hz); 7,63-7,59 (m, 3H/H-arom.); 7,55-7,52 (m,

2H/H-arom.); 7,42 (d, 1H/H-arom., J = 3,2 Hz); 7,25 (d, 2H/H-arom., J = 8,6 Hz); 7,10

(dd, 1H/H-19., J = 3,7 Hz); 6,91 (d, 2H/H-arom., J = 8,6 Hz); 4,54 (s, 2H/H-4 e H-1);

4,46 (s, 2H/-CH2); 4,23-4,20 (m, 1H/H-5); 3,99 (t, 1H/H-2, J = 2,8 Hz); 3,90 (dd,

1H/H-6a ou H-6b, J = 5,8 Hz); 3,80 (d, 2H/H3a e H3b, J = 2,9 Hz); 3,74 (s, 3H/-

OCH3); 3,69 (dd, 1H/H6a ou H6b, J = 3,5 Hz). (Anexo, p. 88)

RMN13C (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 165,9 (C-14), 164,5 (C-12), 158,6 (C-11),

136,6 (C-20), 133,7 (C-15), 131,8 (C-arom.), 131,5 (C-arom.), 129,8 (C-arom.), 129,7

(C-8), 129,1 (C-arom.), 128,1 (C-arom.), 127,8 (C-arom.), 126,79 (C-arom.), 126,71

89

(C-13), 124,8 (C-19), 113,5 (C-arom.), 86,2 (C-1), 85,1 (C-4), 82,0 (C-2), 71,3 (C-7),

71,2 (C-6), 69,9 (C-3), 56,5 (C-5), 54,9 (-OCH3). (Anexo, p. 90)

IV (KBr) cm-1: 3220, 3047, 2930, 2869, 1720, 1621, 1641, 1553, 1513, 1482, 1373,

1296, 1245, 1073, 1036, 933, 898, 819, 698, 654. (Anexo, p. 91)

6.2.12 – Metodologia geral para síntese dos produtos finais (29a-g)

A uma solução da amina O-benzilada 34 (0,083g; 0,35mmol) em CH2Cl2 (5

mL) foi adicionado o respectivo aminoácido protegido (0,35mmol) previamente

dissolvido em CH2Cl2, e a 0ºC, foram adicionados DCC (0,072g; 0,35mmol) e DMAP

(0,005g; 0,035mmol). Após agitação por 12h a temperatura ambiente, a mistura foi

filtrada e o filtrado foi evaporado. O produto bruto foi purificado em coluna

cromatográfica em sílica gel (Eluente: hexano/acetato de etila).

6.2.12.1 – 1,4:3,6-dianidro-2-O-(benzil)-5-N-(N-t-butoxicarbonil-L-prolina)-D- iditiol (29a)

Aspecto: óleo amarelado.

Rendimento: 50%.

-9,4 (c 1.0, CH2Cl2).

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7,35-7,28 (m, 5H/H-arom.); 4,60-4,53 (m, 4H/H-

4, H-1 e –CH2); 4,38 (sl, 1H/H-5); 4,24 (sl, 1H/H-2); 4,05 (sl, 1H/H-13); 3,89-3,86 (m,

3H/H-6a, H-6b, H-3a ou H-3b); 3,71 (d, 1H/H-3a ou H-3b, J = 9,5 Hz); 3,49-3,39 (m,

90

2H/H-16); 1,86 (sl, 2H/H-14 ou H-15); 1,64 (sl, 2H/H-14 ou H-15); 1,46 (s, 9H/-CH3).

(Anexo, p. 93)

RMN13C (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171,7 (C-12), 154,3 (C-17), 137,5 (C-8), 128,4

(C-arom.), 127,8 (C-arom.), 127,6 (C-arom.), 86,4 (C-1), 85,7 (C-4), 83,0 (C-2), 80,7

(C-18), 72,4 (C-7), 72,2 (C-6), 71,5 (C-3), 60,2 (C-13), 56,0 (C-5), 47,1 (C-16), 29,6

(C-14), 28,3 (-CH3), 25,4 (C-15) . (Anexo, p. 95)

IV (KBr) cm-1: 3302, 2957, 2874, 1694, 1651, 1548, 1454, 1403, 1247, 1162, 1084,

914, 896, 734. (Anexo, p. 96)

6.2.12.2 – 1,4:3,6-dianidro-2-O-(benzil)-5-N-(N-t-butoxicarbonil-L-treonina)-D-iditiol (29b)

Aspecto: sólido amarelo.

Rendimento: 50%.

p.f.: 128-130ºC.

+37.0 (c 0.2, CH2Cl2).

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7,37-7,28 (m, 5H/H-arom.); 6,87 (sl, 1H/-NH);

5,48 (sl, 1H); 4,62-4,61 (m, 1H/H-13); 4,58-4,56 (m, 3H/H-4, H-1 e H-14); 4,40-4,35

(m, 2H/-CH2); 4,22 (dd, 1H/H-5, J = 3,4; 5,7 Hz); 4,07-4,05 (m, 1H/H-2); 3,99-3,96

(m, 1H/H-6a ou H-6b); 3,94-3,85 (m, 2H/H-3a e H-3b); 3,69 (m, 1H/H-6a ou H-6b);

1,46 (s, 9H/-CH3); 1,18 (d, 3H/-CH3, J = 6,4 Hz). (Anexo, p. 97)

RMN13C (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171,4 (C-12), 156,7 (C-16), 137,5 (C-8), 128,5

(C-arom.), 127,8 (C-arom.), 127,7 (C-arom), 86,4 (C-1), 85,8 (C-4), 83,0 (C-2), 80,7

91

(C-17), 72,4 (C-7), 72,1 (C-6), 71,6 (C-3), 66,4 (C-14), 57,4 (C-13), 56,1 (C-5), 28,2 (-

CH3) 18,3 (-CH3). (Anexo, p. 99)

IV (KBr) cm-1: 3376, 2924, 2853, 1699, 1646, 1604, 1445, 1399, 1217, 1110.

(Anexo, p. 100)

6.2.12.3 – 1,4:3,6-dianidro-2-O-(benzil)-5-N-(N-t-butoxicarbonil-L-metionina)-D-iditiol (29c)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 60%.

p.f.: 106-107ºC.

+21,2 (c 0,.8, CH2Cl2).

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7,37-7,28 (m, 5H/H-arom.); 6,50 (sl, 1H/H-NH);

5,12 (sl, 1H); 4,61-4,60 (m, 1H/H-13); 4,57 (d, 2H/-CH2, J = 4,2 Hz); 4,54-4,52 (m,

1H/H-4); 4,41-4,37 (m, 1H/H-1); 4,24-4,17 (m, 1H/H-5); 4,15-4,08 (q, 1H/H-2, J = 7,1

Hz); 4,08-4,05 (m, 1H/H-6a ou H-6b); 3,92-3,87 (m, 2H/H3a, H3b); 3,71 (dd, 1H/H-6a

ou H-6b, J = 1,6; 9,6 Hz); 2,60-2,46 (m, 2H/H-15); 2,10 (s, 3H/S-CH3); 2,08-2,06 (m,

2H/H-14); 1,44 (s, 9H/-CH3). (Anexo, p. 101)

RMN13C (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171,2 (C-12), 155,7 (C-16), 137,4 (C-8), 128,4

(C-arom.), 127,8 (C-arom.), 127,6 (C-arom.), 86,3 (C-1), 85,7 (C-4), 83,0 (C-6), 80,3

92

(C-17), 72,4 (C-7), 71,9 (C-6), 71,5 (C-3), 56,1 (C-5), 53,3 (C-13), 31,2 (C-15), 30,3

(C-14), 28,2 (-CH3), 15,2 (S-CH3). (Anexo, p. 103)

IV (KBr) cm-1: 3305, 2975, 2928, 2874, 2368, 1659, 1504, 1455, 1366, 1249, 1167,

1084, 912, 738. (Anexo, p. 104)

6.2.12.4 – 1,4:3,6-dianidro-2-O-(benzil)-5-N-(N-t-butoxicarbonil-O-benzil-L-serina)-D-iditiol (29d)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 64%.

p.f.: 135-136ºC.

+38,7 (c 0.8, CH2Cl2).

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7,38-7,27 (m, 10H/H-arom.); 6,56 (sl, 1H/-NH);

5,34 (sl, 1H); 4,58-4,53 (m, 3H/H-4 e –CH2); 4,51-4,47 (m, 3H/H-1 e H-15); 4,42-4,38

(m, 1H/H-13); 4,15 (q, 1H/H-5, J = 7,2 Hz); 4,04-4,02 (m, 1H/H-2); 3,90-3,85 (m,

4H/H-14, H-6a e H-6b); 3,69 (dd, 1H/H-3a ou H-3b, J = 1,7; 9,6 Hz); 3,53 (dd, 1H/H-

3a ou H-3b, J = 6,9; 9,2 Hz); 1,44 (s, 9H/-CH3). (Anexo, p. 105)

RMN13C (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 170,0 (C-12), 155,4 (C-16), 137,4 (C-8 ou C-19),

137,2 (C-8 ou C-19), 128,5 (C-arom.), 128,4 (C-arom.), 128,0 (C-arom.), 127,8 (C-

arom.), 127,7 (C-arom.), 127,6 (C-arom.), 86,2 (C-1), 85,6 (C-4), 82,9 (C-2), 80,4 (C-

17), 73,5 (C-7), 72,3 (C-15), 71,9 (C-6), 71,4 (C-14), 69,7 (C-3), 56,1 (C-5), 53,8 (C-

13), 28,2 (-CH3). (Anexo, p. 107)

93

IV (KBr) cm-1: 3380, 3285, 2929, 2881, 1702, 1656, 1528, 1512, 1473, 1362, 1244,

1133, 912. (Anexo, p. 108)

6.2.12.5 – 1,4:3,6-dianidro-2-O-(benzil)-5-N-(Nα-t-butoxicarbonil-Nε-carbobenziloxi-L-lisina)-D-iditiol (29e)

Aspecto: óleo amarelo.

Rendimento: 65%.

+18,3 (c 0.8, CH2Cl2).

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 7,35-7,28 (m, 10H/H-arom.); 6,50 (sl, 1H/-NH);

5,12-5,06 (m, 3H/H-19); 4,85 (sl, 1H/H-13); 4,61-4,59 (m, 1H/H-4); 4,55 (m, 3H/H-1 e

–CH2); 4,40-4,37 (m, 1H/H-5); 4,05 (m, 1H/H-2); 3,91-3,86 (m, 3H/ H-6a, H-6b e H-3a

ou H-3b); 3,73 (d, 1H/H-3a ou H-3b, J = 9,1 Hz); 3,18 (m, 2H/H-17); 1,89-1,82 (m,

2H/H-14); 1,55-1,49 (m, 2H/H-16); 1,43 (s, 9H/-CH3); 1,39-1,36 (m, 2H/H-15).

(Anexo, p. 109)

RMN13C (75 MHz, acetona-d6) δ (ppm): 173,9 (C-12), 158,2 (C-20 ou C-18), 157,4

(C-20 ou C-18), 140,3 (C-8), 139,5 (C-23), 130,2 (C-arom.), 130,1 (C-arom.), 129,6

(C-arom.), 129,5 (C-arom.), 129,4 (C-arom.), 129,3 (C-arom.), 88,4 (C-1), 87,3 (C-4),

85,1 (C-2), 80,2 (C-21), 73,7 (C-7), 73,5 (C-6), 72,7 (C-3), 67,4 (C-19), 58,2 (C-13),

56,3 (C-5), 42,1 (C-17), 34,0 (C-16), 29,5 (-CH3), 27,3 (C-14), 24,6 (C-15). (Anexo, p.

111)

94

IV (KBr) cm-1: 3315, 3064, 2935, 2869, 1713, 1651, 1538, 1505, 1455, 1366, 1249,

1168, 1083, 912, 736. (Anexo, p. 112)

6.2.12.6 – 1,4:3,6-dianidro-2-O-(benzil)-5-N-(N-t-butoxicarbonil-L-triptofano)-D-iditiol (29f)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 74%.

p.f.: 74-75ºC.

+52.5 (c 0.5, CH2Cl2).

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 8,27 (sl, 1H/-NH); 7,65 (d, 1H/-NH, J = 7,7 Hz);

7,40-7,27 (m, 7H/H-arom.); 7,20-7,10 (m, 2H/H-arom.); 6,99 (d, 1H/H-arom., J = 2,3

Hz); 5,75 (d, 1H, J = 8,1 Hz); 5,33 (sl, 1H/H-13); 4,51 (d, 2H/-CH2, J = 3,6 Hz); 4,26

(sl, 1H/H-4); 3,92-3,88 (m, 3H/H-1, H-5 e H-2); 3,80-3,73 (m, 2H/H-6a e H6b); 3,69

(dd, 1H/H-3a ou H3b, J = 4,5; 9,8 Hz); 3,51-3,44 (m, 1H/H-3a ou H-3b); 3,25 (dd,

1H/H-14, J = 5,4; 13,8 Hz); 3,12 (dd, 1H/H-14, J = 9,0; 13,9 Hz); 1,44 (s, 9H/-CH3).

(Anexo, p. 113)

RMN13C (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171,3 (C-12), 155,3 (C-15), 137,5 (C-8), 136,2

(C-17), 128,5 (C-arom.), 127,9 (C-arom.), 127,5 (C-arom.), 127,0 (C-18), 123,2 (C-

arom.), 122,3 (C-arom.), 119,8 (C-arom.), 118,7 (C-arom.), 111,3 (C-arom.), 110,5

(C-19), 86,0 (C-1), 85,0 (C-4), 82,9 (C-2), 80,1 (C-16), 72,2 (C-7), 71,4 (C-6), 71,3

(C-3), 65,8 (C-, 55,6 (C-5), 49,1 (C-13), 28,9 (C-14), 28,3 (-CH3). (Anexo, p. 115)

95

IV (KBr) cm-1: 3315, 2975, 2928, 1693, 1657, 1525, 1498, 1456, 1366, 1248, 1168,

1080, 909, 741. (Anexo, p. 116)

6.2.12.7 – 1,4:3,6-dianidro-2-O-(benzil)-5-N-(Nα-t-butoxicarbonil-Nδ,Nω-di-carbobenziloxi-L-arginina)-D-iditiol (29f)

Aspecto: sólido branco.

Rendimento: 70%.

p.f.: 115-116ºC.

+22,5 (c 0.8, CH2Cl2).

RMN1H (CDCl3, 300 MHz) δ (ppm): 9,42 (d, 2H/-NH), 7,42-7,28 (m, 15H/H-arom.);

6,69 (sl, 1H/-NH); 5,58 (sl, 1H); 5,29 (s, 1H-13); 5,23 (sl, 2H/H-19); 5,21 (q, 2H/H-23,

J = 12 Hz); 4,58 (q, 2H/-CH2, J = 12 Hz); 4,40-4,37 (m, 2H/H-4 e H-1); 4,27-4,22 (m,

2H/H-5 e H-2); 4,04-3,99 (m, 3H/H-6a, H-6b e H3a ou H-3b); 3,78 (dd, 1H/ H3a ou H-

3b, J = 7,5; 9,0 Hz); 3,47-3,45 (m, 2H/H-16); 1,77-1,68 (m, 4H/H-14 e H-15);1,43 (s,

9H/-CH3). (Anexo, p. 117)

RMN13C (75 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171,8 (C-12), 163,5 (C-17), 160,8 (C=O), 155,6

(C=O), 137,7 (C-8), 136,6 (C-20 ou C-24), 134,5 (C-20 ou C-24), 128,9 (C-arom.),

128,8 (C-arom.), 128,5 (C-arom.), 128,4 (C-arom.), 128,3 (C-arom.), 127,9 (C-arom.),

127,8 (C-arom.), 127,6 (C-arom.), 86,9 (C-1), 80,0 (C-22), 79,9 (C-4), 78,8 (C-2),

96

72,9 (C-7), 72,3 (C-6), 70,4 (C-3), 68,9 (C-23), 67,0 (C-19), 56,9 (C-5), 49,0 (C-13),

43,9 (C-16), 28,4 (C-14), 28,2 (-CH3), 24,8 (C-15). (Anexo, p. 119)

IV (KBr) cm-1: 3388, 3327, 2926, 2851, 1723, 1651, 1611, 1520, 1455, 1380, 1254,

1088, 737, 697. (Anexo, p. 120)

97

6.3 AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA

6.3.1 ENSAIO DE ATIVIDADE DE INIBIÇÃO DA PROTEASE RECOMBINANTE

NS3PRO/4A DO HCV

A avaliação da atividade proteolítica do HCV foi realizada com o kit

SensoLyte®520 HCV Protease Assay Kit *Fluorimetric* (AnaSpec, CA, USA). Este

ensaio possibilita realizar a triagem de inibidores anti-HCV-NS3pro/4A com maior

eficiência e sensibilidade, baseado no fenômeno de FRET (fluorecence ressonance

energy transfer), no qual o peptídeo derivado do sítio de clivagem NS4A/NS4B

encontra-se marcado com fluoróforo 5-FAM/QXLTM520, sendo a fluorescência do 5-

FAM suprimida pela QXLTM520. A quantificação da atividade proteolítica ocorre

quando o peptídeo FRET sofre a clivagem em dois fragmentos pela NS3pro/4A, com

isso, a fluorescência do 5-FAM pode ser monitorada em excitação/emissão igual a

490 nm/520 nm.

6.3.2 METODOLOGIA UTILIZADA NA DOSAGEM DA CAPACIDADE INIBITÓRIA

DOS COMPOSTOS

Os compostos liofilizados foram resuspendidos em DMSO (100%) a uma

concentração de 20 mM. Posteriormente, 200 μM dos compostos foram

préincubados a 25ºC por 15 min com 30 ng da enzima HCV-NS3pro/4A em volume

final de 50μL do tampão de reação do kit SensoLyte®520 HCV Protease Assay Kit

*Fluorimetric* (AnaSpec, CA, USA), seguindo o protocolo do fabricante. A reação foi

iniciada com a adição do substrato Peptídeo 5-FAM/QXL™520 FRET, cuja clivagem

do peptídeo foi monitorada no leitor de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices)

em excitação/emissão igual a 490 nm/ 520 nm medindo a fluorescência gerada a

cada 30 segundos por 60 min.

Os parâmetros cinéticos de velocidade inicial (Vi) das reações foram

calculados por regressões linear e/ou polinomial de 3ª ordem utilizando-se o

programa SigmaPlot versão 10.0 e Excel 2007, respectivamente, sendo os valores

de Vi convertidos em atividade residual (%).

98

6.3.3 PURIFICAÇÃO E EXPRESSÃO DA NS3/4A PROTEASE

O plasmídeo recombinante pET21dHT-NS3pro/4A foi transformado em E. coli

da cepa BL21 [DE3] e a expressão da proteína quimérica 6xHis-tev-NS3pro/4A foi

induzida utilizando o isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside (IPTG). As células foram

centrifugadas e o sedimento de bactérias foram lisados para a purificação da

6xHistev-NS3pro/4A utilizando colunas de afinidade HisTRAP (GE-Healthcare),

seguido de excisão da cauda de 6xHis-tev da NS3pro/4A com a enzima TEV

protease.

6.4 MODELAGEM MOLECULAR

6.4.1 REDOCKING

A preparação da proteína NS3/NS4 protease do vírus HCV, sob o código

2OC0, bem como o seu ligante HU1, retirados do PDB (Protein Data Bank), foi

realizada no AutoDockTools. Os átomos de hidrogênio polares foram adicionados e

os átomos de hidrogênio não-polares foram mesclados com os respectivos átomos

de carbono. Cargas atômicas parciais Gasteiger foram assinaladas. Todas as

ligações rotacionáveis dos ligantes foram mantidas livres.

A fim de verificar a precisão do protocolo proposto, foi realizado o redocking

entre 2OC0 e HU1 em seu local de ligação. Os protocolos foram avaliados com base

na capacidade do AutoDock em reproduzir o modo de ligação do 2OC0 e HU1 como

observado na estrutura de cristal correspondente. É geralmente medido por cálculo

da distância de raiz quadrada média (RMSD) entre os átomos, exceto hidrogênios,

do ligante na estrutura de cristal e os átomos correspondentes da conformação

gerada.

Caixa de grade de tamanho idêntico (60X60X60 pontos) foram centradas no

ligante e foram calculados com espaçamento 0,375 Å.

Várias opções de carga disponíveis nos parâmetros do AutoDock 4.2 foram

sistematicamente variadas para determinar a condição ótima. O número de

execuções de ancoragem foi fixado em 50, tamanho da população foi definida para

150, número máximo de indivíduos superiores que automaticamente sobrevivem

99

tinha 10 anos, e o nível de detalhe para a saída utilizada foi o algoritmo genético. A

posição inicial especificada pelo usuário não foi aleatória, assim como deslocamento

diedro inicial relativo relativa nos parâmetros do ligante.

A confiabilidade do protocolo de docking foi verificada analisando as melhores

soluções a partir das soluções com menores valores de energia de docking no

cluster que tinha o maior número de poses, avaliando a similaridade da conformação

final e a configuração de menor energia

Resultados do redocking mostraram um valor de RMSD de 1,09 Å, sugerindo

que o processo de docking pode ser utilizado para prever o modo de ligação dos

compostos do conjunto sob investigação. De acordo com a literatura, um valor limiar

de RMSD de 2,0 Å é amplamente aceito como a distinção entre o sucesso e o

fracasso na reprodução de um modo conhecido de ligação.

100

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABRAHIM-VIEIRA, B; DA COSTA, E. C. B.; AZEVEDO,P. H. R. DE A; PORTELA, A.

C.; DIAS, L. R. S.; PINHEIRO, S.; TANURI, A.; CAPACCIA, A. M.; VENTURA, G. T.;

MOHANA-BORGES, R.; DE SOUZA, A. M. T.; MURI, E. M. F. Novel isomannide-

based peptide mimetics containing a tartaric acid backbone as serine protease

inhibitors. Med. Chem. Res., 2014, DOI 10.1007/s00044-014-1058-1.

BACHMANNA, F.; REIMER, J.; RUPPENSTEIN, M; THIEM, J. Synthesis of a novel

starch-derived AB-type polyurethane. Macromol. Rapid Commun., 1998, 19, 21-

26.

BACON, B.R.; GORDON, S.C.; LAWITZ, E.; MARCELLIN, P.; VIERLING, J.M.;

ZEUZEM, S.; POORDAD, F.; GOODMAN, Z.D.; SINGS, H.L.; BOPARAI, N.;

BURROUGHS, M.; BRASS, C.A.; ALBRECHT, J.K.; ESTEBAN, R. Boceprevir for

previously treated chronic HCV genotype 1 infection. N. Engl. J. Med., 2011,

364, 1207-17.

BARREIRO, E.J. A Química Medicinal e o paradigma do composto-protótipo.

Rev. Virtual Quim., 2009, 1, 26-34.

BARREIRO, E.J.; FERREIRA, V.F.; COSTA, P.R.R. Substâncias

enantiomericamente puras (SEP): A questão dos fármacos quirais. Quím. Nova,

1997, 20, 647-656.

BARROS, T. G. ; PINHEIRO, S. ; WILLIAMSON, J. ; TANURI, A. ; PEREIRA, H. ;

BRINDEIRO, R. ; NETO, J. ; ANTUNES, O. ; MURI, E. Novel Peptide Mimetic

Inhibitors of Hepatitis C Serine Protease Derived from Isomannide. Synthesis,

2009, 4, 620-626.

101

BARROS, G.T.; PINHEIRO, S.; WILLIAMSON, J.S.; TANURI, A.; JR GOMES, M.;

PEREIRA, H.S.; BRINDEIRO, R.M.; NETO, J.B.A.; ANTUNES, O.A.C.; MURI, E.M.F.

Pseudo-peptides derived from isomannide: inhibitors of serine proteases.

Amino acids, 2010, 38, 701-709.

BARROS, T.G.; ZORZANELLI, B.C.; PINHEIRO, S.; BRITO, M.A.; TANURI, A.;

COSTA, E.C.B.; MOHANA-BORGES, R.S.; RODRIGUES, C.R.; SOUZA, A.T.M.;

FERREIRA, V.F.; MURI, E.M.F. Novel Peptide Mimetics Based on N-protected

Amino Acids Derived from Isomannide as Potential Inhibitors of NS3 Serine

Protease of Hepatitis C Virus. Lett. Org. Chem., 2012, 9, 239-249.

BARTENSCHLAGER, R; LOHMANN,V. Replication of hepatitis C vírus. Journal of

General Virology, 2000, 81, 1631-1648.

BONATO, P. S.; JABOR, V. P. A. Análise enantiosseletiva de fármacos:

contribuições da cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar.

Quim. Nova, 2005, 28, 683-691.

BRUNTON, L.L.; CHABNER, B.A.; KNOLLMANN, B. C. As Bases Farmacológicas

da Terapêutica de Goodman & Gilman. Rio de Janeiro: McGraw-Hill, 12ª ed.,

2012, 753.

BUCK, K. W.; DUXBURY, J. M.; FOSTER, A. B.; PERRY, A. R.; WEBBER, J. M.

Observations on esterification reactions. Carbohydrate Res., 1966, 2, 122-131.

BULUGAHAPITIYA, U., SIYAMBALAPITIYA, S.; SENEVIRATNE, S.L.; FERNANDO,

D.J.S. Dengue fever in travellers: A challenge for European physicians.

European Journal of Internal Medicine, 2007, 18, 185-192.

BUU, O.N.V.; AUPOIX, A.; VO-THANH, G. Synthesis of novel chiral imidazolium-

based ionic liquids derived from isosorbide and their applications in

asymmetric aza Diels-Alder reaction. Tetrahedron, 2009, 65, 2260-2265.

102

CALICETI, P. Pharmacokinetics of pegylated interferons: What is misleading?

Digestive and Liver Disease, 2004, 36, 334-339.

CASTET, V.; FOURNIER, C.; SOULIER, A.; BRILLE, R.; COSTE, J.; LARREY, D.;

DHUMEAUX, D.; MAUREL, P.; PAWLOTSKY, J.M. Alpha interferon inhibits

Hepatitis C Virus replication in Primary Human Hepatocytes Infected in vitro. J.

Virol., 2002, 76, 8189-8199.

CARCEDO, C.; DERVISI, A.; FALLIS, I. A.; OOI, L.; MALIK, K. M. A. A concise

synthesis of a rigid isomannide-based diphosphine ligand and structural

characterisation of an alkoxyphosphonium intermediate. Chem. Comm., 2004,

1236-1237.

CHANG, R.; QIN, J.; GAO, J. Fully biobased epoxy from isosorbide diglycidyl

ether cured by biobased curing agents with enhanced properties. J Polym Res,

2014, 501-522.

CHANPRAPAPH, S.; SAPARPAKORN, P.; SANGMA, C.; NIYOMRATTANAKIT, P.;

HANNONGBUA S., ANGSUTHANASOMBAT, C.; KATZENMEIER, G. Competitive

inhibition of the dengue virus NS3 serine protease by synthetic peptides

representing polyprotein cleavage sites. Biochemical and Biophysical Research

Communications, 2005, 330, 1293-1246.

CHEN, K.X.; NJOROGE, F.G. A review of HCV protease inhibitors. Curr. Op.

Investig. Drugs, 2009, 10, 821-837.

CHEN, K.X.; NJOROGE, F.G.; ARASAPPAN, A.; VENKATRAMAN, S.; VIBULBHAN, B.;

YANG, W.; PAREKH, T.N.; PICHARDO, J.; PRONGAY, A.; CHENG, K.C.;

BUTKIEWICZ, N.; YAO, N; MADISON, V.; GIRIJAVALLABHAN, V. Novel potent

hepatitis C virus NS3 serine protease inhibitors derived from proline-based

macrocycles. J. Med. Chem., 2006, 49, 995-1005.

CHEN, K. X.; VIBULBHAN, B.; YANG, W.; CHENG, K-C.; LIU, R.; PICHARDO, J.;

BUTKIEWIEZ, N.; NJOROGE, F. G. Potent and selective small molecule NS3

103

serine protease inhibitors of Hepatitis C virus with dichlorocyclopropylproline

as P2 residue. Bioorg. Med. Chem., 2008, 16, 1874-1883.

CHIAPPE, C.; PIERACCINI, D.; SAULLO, P. Nucleophilic Displacement

Reactions in Ionic Liquids:  Substrate and Solvent Effect in the Reaction of

NaN3 and KCN with Alkyl Halides and Tosylates. J. Org. Chem., 2003, 68, 6710–

6715.

COREL, L. NASH, K.L. Hepatitis C. Medicine, 2011, 39, 550-555.

CROTTY, S.; CAMERON, C.E.; ANDINO, R. RNA virus error catastrophe: direct

molecular test by using ribavirin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001, 98, 6895-

900.

DE FRANCESCO, R.; CARFÍ, A. Advances in the development of new

therapeutic agents trageting the NS3-4A serino protease or the NS5B RNA

dependent RNA polymerase of the hepatitis C virus. Adv Drug Deliv Rev, 2007,

59, 1242-1262.

DENG, J.; LI, N.; LIU, H.; ZUO, Z.; LIEW, O.W.; XU, W.; CHEN, G.; TONG, X.;

TANG, W.; ZHU, J.; ZUO, J.; JIANG, H.; YANG, C.G.; LI, J. ZHU, W. Discovery of

Novel Small Molecule Inhibitors of Dengue Viral NS2B-NS3Protease Using

Virtual Screening and Scaffold Hopping. J. Med. Chem., 2012, 55, 6278-6293.

DILMURAT YUSUF, A. M. D., GERARD J. KLEYWEGT, AND STEFAN SCHMITT. An

Alternative Method for the Evaluation of Docking Performance: RSR vs RMSD.

J. Chem. Inf. Model., 2008, 48, 1411-1422..

DRAG, M. E; SALVESEN, G. S. Emerging principles in protease-based drug

discovery. Nat. Rev. Drug Discovery, 2010, 9, 690.

DRUGBANK. Estrutura tridimensional do INF-α 2b. Disponível em: <

http://www.drugbank.ca/drugs/DB00105 >. Acesso em: 01/06/2014.

104

ERICKSON, J. A; JALAIE, M; ROBERTSON, D. H; LEWIS, R. A; VIETH, M.

Lessons in Molecular Recognition: The Effects of Ligand and Protein Flexibility

on Molecular Docking Accuracy. J. Med. Chem., 2004, 47, 45-55.

FAUCONNIER, A. Second anhydride of mannitol. Bull. Soc. Chim. Fr., 1884, 41,

18-20.

FAUCONNIER, A.C.R. Mannitic anhydride. Acad. Sci., 1882, 95, 991.

FAD. FDA approves Sovaldi for chronic hepatitis C. Disponível em:

http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm377888.htm.

Acesso em: 25/10/2014.

FLYING PUBLISHER. Short Guide to Hepatitis C. 2013. Disponível em <

http://pdf.flyingpublisher.com/HepatitisC_Guide_2013.pdf>. Acesso em: 01/05/2014.

FRECER, V.; MIERTUS, S. Design, structure-based focusing and in silico

screening of combinatorial library of peptidomimetic inhibitors of Dengue virus

NS2B-NS3 protease. J. Comput. Aid. Mol. Des., 2010, 24, 195–212.

FROKJAER, S.; OTZENT, D. E. Protein drug stability: a formulation challenge.

Nat. Rev. Drug Discovery , 2005, 4, 298-306.

GAO, Y.; CUI, T.; LAM, Y. Synthesis and disulfide bond connectivity-activity

studies of a kalata B1-inspired cyclopeptide against dengue NS2B-NS3

protease. Bioorg. Med. Chem., 2010, 18, 1331-1336.

GIBBONS, R.V.; VAUGHN, D.W. Dengue: an escalating problem. British medical

journal. 2002, 324, 1563-1566.

105

GHANY, M. G.;STRADER, D. B.; THOMAS, D. L. ; SEEFF, L. B. Diagnosis,

Management, and Treatment of Hepatitis C:An Update. Hepatology, 2009, 49,

1335-1374.

GHOSH, A.K.; SRIDHAR, P.R.; LESHCHENKO, S.; HUSSAIN, A.K.; LI, J.F.;

KOVALEVSKY, A.Y.; WALTERS, D.E.; WEDEKIND, J.E.; GRUM-TOKARS, V.; DAS, D.;

KOH, Y.; MAEDA, K.; GATANAGA, H.; WEBER, I.T.; MITSUYA, H. Structure-based

design of novel HIV-1 protease inhibitors to combat drug resistance. J. Med.

Chem., 2006, 49, 5252-5261.

GOODWIN, J. C.; HODGE, J. E.; WEISLEDER, D. Carbohydrate Res., 1980, 79,

133-141.

GUBLER, D.J. Human Arbovirus Infections Worldwide. Annals of the New York

Academy of Sciences, 2001, v.951.

GUY, B., SAVILLE, M., LANG, J. Development of Sanofi Pasteur tetravalent

dengue vaccine. Human Vaccines, 2010, 9, 696-705.

GUZMAN, M.G; HALSTEAD, S.B.; ARTSOB, H.; BUCHY, P.; FARRAR,

J.; GUBLER, D.J.; HUNSPERGER, E.; KROEGER, A.; MARGOLIS, H.S.;

MARTÍNEZ, E.; NATHAN, M.B.; PELEGRINO, J.L.; SIMMONS, C.; YOKSAN,

S.; PEELING, R.W. Dengue: a continuing global threat. Nat Rev Microbiol, 2010,

8, 7-16.

HAN, S.-Y.; KIM, Y. A. Recent development of peptide coupling reagents in

organic synthesis. Tetrahedron, 2004, 60, 2447–2467.

HANESSIAN, S.; AUZZAS, L. The Practice of Ring Constraint in

Peptidomimetics Using Bicyclic and Polycyclic Amino Acids. Acc. Chem. Res.,

2008, 41, 1241-1251.

HAYASHI, N.; TAKEHARA T. Review: Antiviral therapy for chronic hepatitis C:

past, present, and future. J. Gastroenterol., 2006, 41, 17-27.

106

HÉZODE, C.; FORESTIER, N.; DUSHEIKO, G.; FERENCI, P.; POL, S.; GOESER,

T.; BRONOWICKI, J.P.; BOURLIÈRE, M.; GHARAKHANIAN, S.; BENGTSSON, L.;

MCNAIR, L.; GEORGE, S.; KIEFFER, T.; KWONG, A.; KAUFFMAN, R.S.; ALAM, J.;

PAWLOTSKY, J.M.; ZEUZEM, S. Telaprevir and peginterferon with or without

ribavirin for chronic HCV infection. N. Engl. J. Med. 2009, 360, 1839-1850.

HRUBY, V.J. Conformational and topographical considerations in the design of

biologically active peptides. Biopolymers, 1993, 33, 1073-1082.

INNIS, B.L.; ECKELS, K.H. Progress in development of a live-attenuated,

tetravalent dengue virus vaccine by the United States Army Medical Research

and Materiel Command. Am. J. Trop. Med. Hyg., 2003, 69, 1-4.

KAGAN, H.B.; RIANT, O. Catalytic asymmetric Diels Alder reactions. Chem. Rev.,

1992, 92, 1007-1019.

KHARB, R.; RANA, M.; SHARMA, P.C.; YAR, M.S. Therapeutic importance of

peptidomimetics in medicinal chemistry. J. Chem. Pharm. Res., 2011, 3, 173-186.

KITCHEN, D. B; DECORNEZ, H; FURR, J. R. AND BAJORATH, J. Docking And

Scoring In Virtualscreening For Drug Discovery: Methods And Applications.

Nature Reviews. Drug Discovery, 2004, 3, 935-49.

KUROCHKINA, G.; BRATASH, G.; SOBOLEVA, N.; VASYANINA, L.; GRACHEV, M.;

NIFANT'EV, E. Controlled tosylation of 1,4:3,6-Dianhydro-Dmannitol and D-

sorbitol. Russian Journal of General Chemistry, 2004, 74, 1739-1742.

LAMARRE, D.; ANDERSON, P. C.; BAILEY, M.; BEAULIEU, P.; BOLGER, G.;

BONNEAU, P.; BOS, M.; CAMERON, D.R.; CARTIER, M.; CORDINGGLEY, M.G.;

FAUCHER, A.-M.; GOUDREAU, N.; KAWAI, S.H.; KUKOLJ, G.; LAGACÉ, L.;

LAPLANTE, S.R.; NARJES, H.; POUPART, M.-A.; RANCOURT, J.; SENTJENS,

107

R.E. An NS3 protease inhibitor with antiviral effects in humans infected with

hepatitis C virus. Nature, 2003, 426, 186-189.

LANCASTER, N. L.; SALTER, P. A.; WELTON, T.; YOUNG, G. B. Nucleophilicity in

ionic liquids. 2.1 Cation effects on halide nucleophilicity

in a series of bis(trifluoromethylsulfonyl)imide ionic liquids. J. Org. Chem.,

2002, 67, 8855-8861.

LEMIEUX, R. U.; MCINNES, A. G. The preferencial tosylation of the endo-5-

hydroxyl group of 1,4:3,6-dianhydro-D-glucitol. Can. J. Chem., 1960, 38, 136-

140.

LESCAR, J.; LUO, D.; XU, T.; SAMPATH, A.; LIM, S. P.; CANARD, B.;

VASUDEVAN, S. G. Towards the design of antiviral inhibitors against

flaviviruses: the case for the multifunctional NS3 protein from Dengue virus as

a target. Antiviral Res., 2008, 80, 94-101.

LEUNG, D.; SCHRODER, K.; WHITE, H.; FANG, N-X.; STOERMER, M. J.;

ABBENANTE, G.; MARTIN, J. L.; YOUNG, P. R.; AND FAIRLIE, D. P. Activity of

recombinant Dengue 2 Virus NS3 protease in the presence of a truncated NS2B

co-factor, small peptide substrates and inhibitors. J Biol Chem, 2001, 29, 45762-

45771.

LINDENBACH, B.D.; THIEL, H.; RICE, C. M. Flaviviridae: The Viruses and Their

Replication. In: KNIPE, D. M.; HOWLEY, P. M. Fields Virology. 5ª edição.

Filadélfia: Lippincott-Raven Publishers, 2007, cap.33.

LOUPY, A.; MONTEUX, D. Asymmetric Diels-Alder: Monobezylated isosorbide

and isomannide as highly effective chiral auxiliares. Tetrahedron Lett., 1996, 37,

7023-7026.

LOUPY A, MONTEUX D.A. Isomannide and isosorbide as new chiral auxiliaries

for the stereoselective synthesis of tertiary α-hydroxy acids.Tetrahedron, 2002,

58, 1541-49.

108

MAO, S. S.; DIMUZIO, J.; MCHALE, C.; BURLEIN, C.; OLSEN, D.; CARROLL, S.S.

A time-resolved, internally quenched fluorescence assay to characterize

inhibition of hepatitis C virus nonstructural protein 3–4A protease at low

enzyme concentrations. Anal. Biochem, 2008, 373, 1-8.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Boletim Epidemiológico: Hepatites Virais. Ano 11, n.01,

p. 28-30,Brasília:2011. Disponível em:

<http://www.aids.gov.br/sites/default/files/anexos/publicacao/2011/50073/boletim_he

patites2011_pdf_64874.pdf> Acesso em 15/06/2014.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. GUIA DE BOLSO. Doenças Infecciosas e Parasitárias.

Série B: Textos Básicos de Saúde, 8a ed., cap.14 e 36, Brasília: 2010. Disponível em

<

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/doencas_infecciosas_parasitaria_guia_bo

lso.pdf>. Acesso em: 13/06/2014.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. GUIA DE BOLSO. Dengue: aspectos epidemiológicos,

diagnóstico e tratamento. Brasília,2002. Disponível em <

http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/dengue_aspecto_epidemiologicos_diagn

ostico_tratamento.pdf >. Acesso em: 13/06/2014.

McBRIDE, J.H; BIELEFELDT-OHMANN, H. Dengue viral infections; pathogenesis

and epidemiology. Microbes and Infection, 2000, 2, 1041−1050.

McMURRY, J. Química Orgânica. Rio de Janeiro: LTC, 7a ed., 2011, 338-387.

McOMISH, F.; YAP, P.L.; DOW, B.C.; FOLLETT, E.A.; SEED, C.; KELLER,

A.J.; COBAIN, T.J.; KRUSIUS, T.; KOLHO, E. ; NAUKKARINEN, R. Geographical

distributuion of hapatitis C virus genotypes in blood donors: an International

collaborative survey. J Clin Microbiol., 32, 1994, 884-892.

MEDIMAGHA, R.; MGHIRBI, S.; SAADAOUI, A.; FILDIER, A.; DESLOIR-

BONJOUR, D.; RAFFIN, G.; KRICHELDORF, H.R.; CHATTI, S. Synthesis of

109

biosourced polyether-amides from 1,4-3, 6-dianhydrohexitols: Characterization

by NMR and MALDI–ToF mass spectrometry. C. R. Chimie, 2013, 16, 1127–1139.

MELINO, S.; PACI, M. Progress for dengue virus diseases. Towards the NS2B-

NS3pro inhibition for a therapeutic-based approach. FEBS Journal, 2007, 274,

2986-3002.

MESAIK, M. A.; RAHAT, S.; KHAN, K. M.; ZIA-ULLAH,CHOUDHARY, M. I.; MURAD,

S.; ISMAIL, Z.; ATTA-UR-RAHMAN; AHMAD, A. Synthesis and

immunomodulatory properties of selected oxazolone derivatives. Bioorg. Med.

Chem., 2004, 12, 2049–2057.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Ministério da Saúde propõe novo tratamento para hepatite

C. Disponível em: http://www.brasil.gov.br/saude/2014/10/ministerio-da-saude-

propoe-novo-tratamento-para-hepatite-c. Acesso em: 25/10/2014.

MONTALBETTI, C.A.G.N.; FALQUE, V. Amide bond formation and peptide

coupling. Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852.

MORRIS, G. M., GOODSELL, D. S., HALLIDAY, R.S., HUEY, R., HART, W. E.,

BELEW, R. K. AND OLSON, A. J. Automated Docking Using a Lamarckian

Genetic Algorithm and and Empirical Binding Free Energy Function. J. Comput.

Chem., 1998, 19, 1639-1662.

MURI, E.M.F. Proteases virais: importantes alvos terapêuticos de compostos

peptideomiméticos. Quim. Nova, 2014, 37, 308-316.

MURI, E.M.F.; ABRAHIM, B.A.; BARROS, T.G.; WILLIAMSON, J.S.; ANTUNES,

O.A.C. Isomannide and Derivatives. Chemical and Pharmaceutical Applications.

Mini-Rev. Org. Chem., 2010, 7, 75-83.

110

MURI, E. M. F. ; GOMES, M. ; ALBUQUERQUE, M. G. ; DA CUNHA, E. F. F. ; DE

ALENCASTRO, R. B. ; WILLIAMSON, J. S. ; ANTUNES, O. A. C. Pseudo-peptides

derived from isomannide as potential inhibitors of serine proteases. Amino

Acids, 2005, 28, 413-419.

MURI, E. M. F. ; M. GOMES JR. ; COSTA, J.S ; ALENCAR, F.L. ; JR., A.S ;

BASTOS, M.L ; HERNANDEZ-VALDES, R. ; WILLIAMSON, J. S. ; ANTUNES, O.A.C

. N-t-Boc-Amino Acid esters of Isomannide. Potential Inhibitors of Serine

Proteases. Amino Acids, 2004, 27, 153-159.

NAGGIE, S.; PATEL, K.; MCHUTCHISON, J. Hepatitis C virus directly acting

antivirals: current developments with NS3/4A HCV serine protease inhibitors. J.

Antimicrob. Chemother., 2010, 65, 2063-2069.

NOBLE, C. G.; CHEN, Y-L; DONG, H.; GU, F.; LIM, S. P.; SCHUL, W.; WANG, Q-Y.;

SHI, P-Y. Strategies for development of dengue virus inhibitors. Antivir Res,

2010, 85, 450–462.

NOGUEIRA, R.M., MIAGOSTOVICH, M.P., CUNHA, R.V., ZAGNE, S. M., GOMES,

F.P., NICOL, A.F., COELHO, J.C.; SCHATZMAYR, H.G. Fatal primary dengue

infections in Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.,1999, 93, 418.

PARKINSON T.; PRYDE, D.C. Small molecule drug discovery for dengue and

west nile viroses: applying experience from hepatitis C virus. Fut. Med. Chem.,

2010, 2, 1181-1203.

PEIYUAN, W.; NADUTHAMBI, D.; MOSLEY, R.T.; NIU,C.; FURMAN, P.A.; OTTO,

M.J.; SOFIA, M.J. Phenylpropenamide derivatives: Anti-hepatitis B virus activity

of the Z isomer, SAR and the search for novel analogs. Bioorganic & Medicinal

Chemistry Letters, 2011, 21,4642–4647.

PERNI, R.B.; ALMQUIST, S.J.; BYRN, R.A.; CHANDORKAR, G. PRAVIN, R.;

CHATURVED, P.R.; COURTNEY, L.F.; DECKER, C.J.; DINEHART, K.; GATES,

111

C.A.; HARBESON, S.L.; HEISER, A.; KALKERI, G.; KOLACZKOWSKI, E.; LIN, K.;

LUONG, Y.-P.; RAO, B.G.; TAYLOR, W.P.; THOMSON, J.A.; TUNG, R.D.; WEI, Y.;

KWONG, A.D.; LIN, C. Preclinical profile of VX-950, a potent, selective, and

orally bioavailable inhibitor of hepatitis C virus NS3-4A serine protease.

Antimicrob. Agents Chemother, 2006, 50, 899–909.

PILERI, P., UEMATSU, Y., CAMPAGNOLI, S., GALLI, G., FALUGI, F., PETRACCA,

R., WEINER, A. J., HOUGHTON, M., ROSA, D., GRANDI, G.; ABRIGNANI, S.

Binding of hepatitis C virus to CD81. Science, 1998, 282, 938–941.

POLGÁR, L. The catalytic triad of serine peptidases.Cellular and Molecular Life

Sciences, 2005, 62, 2161–2172.

RANEY, K. D.; SHARMA, S. D.; MOUSTAFA, I. M.; CAMERON, C. E. Hepatitis C virus

Non-structural Protein 3 (HCV NS3): A multifuncional antiviral target. Biol.

Chem., 2010, 285, 22725-22731.

RANG, H.P.; DALE, M.M.; RITTER, J.M.; GARDNER, P. Farmacologia. Rio de

Janeiro: Elsevier, 6ª ed. , 2007, 685.

RIGAU-PÉREZ,J. G., CLARK, G.G.; GUBLER, D.J.; REITER, P.; SANDERS, E.J.;

VORNDAM, A.V. Dengue and dengue haemorrhagic fever. The Lancenet,1998,

352, 971-977.

RISTIC´, I.S.; VUKIC´, V.; CAKIC´,S.; SIMENDIC´, V.; RISTIC´, O.; BUDINSKI-

SIMENDIC, J. Synthesis and Characterisation of Polyester Based on Isosorbide

and Butanedioic Acid. J Polym Environ, 2012 20:519–527.

ROCCO, I.M.; SILVEIRA, V.R.; MAEDA, A.Y.; SILVA, S.J.S.; SPENASSATTO, C.;

BISORDI, I.; SUZUKI, A. First isolation of dengue 4 in the state of São Paulo,

Brazil, 2011. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 2012, 54, 46-51.

112

SALAGA, M.; SOBCZAK, M.; FICHNA, J. Inhibition of proteases as a novel

therapeutic strategy in the treatment of metabolic, inflammatory and functional

diseases of the gastrointestinal tract. Drug Discovery Today, 2013, 18, 708-715.

SHARARA, A.I.; HUNT, C.M., HAMILTON, J.D. Hepatitis C. Annals of Internal

Medicine, 1996, 125, 658-668.

SHEPARD, C. W.; FINELLI, L.; ALTER, M. J. Global epidemiology of hepatitis C

infection. Lancet Infect, 2005, 5, 558-567.

SIMMONS, C.P. Dengue. New England Journal of Medicine, 2012, 366, 1423-1432.

SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA. Brasil aprova novos remédios

antivirais para tratar hepatite. 2011. Disponível em: <

http://www.sbhepatologia.org.br/sbh-na-midia?id=82>. Acesso em: 20/05/2014.

STEFANUCCI, A.; PINNEN, F.; FELICIANI, F.; CACCIATORE, I.; LUCENTE, G.;

MOLLICA, A. Conformationally constrained histidines in the design of

peptidomimetics: strategies for the χ-space control. Int. J. Mol. Sci., 2011, 12,

2853-2890.

TAMION, R.; MARSAIS, F.; RIBEREAU, P.; QUEGUINER, G.; ABENHAIM, D.;

LOUPY, A.; MUNNIER, L. Synthesis of new chiral auxiliaries derived from

isosorbide .Tetrahedron:Asymetry, 1993, 4,1879-1890.

THOMAS, G. Química medicinal uma introdução. Rio de Janeiro: Guanabara

Joogan, 2003, 32-36.

TRABOCCHI, A.; SCARPI, D.; GUARNA, A. Structural Diversity of Bicyclic Amino

Acids. Amino Acids, 2008, 34, 1–24.

113

TYNDALL, J.D.; FAIRLIE, D.P. Macrocycles mimic the extended peptide

conformation recognized by aspartic, serine, cysteine and metallo proteases.

Curr. Med. Chem., 2001, 8, 893-907.

VAGNER, J.; QU, H.; HRUBY, V.J. Peptidomimetics, a synthetic tool of drug

discovery. Curr. Op. Chem Biol., 2008, 12, 292–296.

VENKATRAMAN, S.; WU, W.; PRONGAY, A.; GIRIJAVALLABHAN, V.; NJOROGE,

F.G. Potent inhibitors of HCV-NS3 protease derived from boronic acids. Bioorg.

Med. Chem. Lett., 2009, 19, 180–183.

WHITEHEAD, S. S.; BLANEY, J. E.; DURBIN, A. P. ; MURPHY, B. R. Prospects for

a dengue virus vaccine. Nature Reviews – Microbiology, 2007, 5, 518-528.

WIGGINS, L.F. The anhydrides of polyhydricalcohols.1. The constitution of

isomannide. J. Chem. Soc., 1945, 4-7.

WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Approval of Victrelis (boceprevir) a

direct acting antiviral drug (DAA) to treat hepatitis C virus (HCV) and Approval

of Incivek (telaprevir), a direct acting antiviral drug (DAA) to treat hepatitis C

(HCV). 2011. Disponível em: <

http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/ForPatientAdvocates/ucm255413.htm

>. Acesso em: 16/06/2014.

WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Dengue guidelines for diagnosis,

treatment, prevention and control: new edition 2009. 2009, cap. 01. Disponível

em:

<http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/44188/1/9789241547871_eng.pdf>. Acesso

em: 26/07/2014.

YANG, C-C.; HSIEH, Y-C.; LEE, S-J; WU, S-H; LIAO, C-L.; TSAO, C-H; CHAO, Y-S;

CHERN, J-H; WU, C-P; YUEH, A. Novel Dengue Virus-Specific NS2B/NS3

114

Protease Inhibitor, BP2109, Discovered by a High-Throughput Screening

Assay. Antimicrob. Agents Chemother., 2011, 55, 229–238.

YIN, Z.; PATEL, S.J.; WANG, W-L; WANG, G.; CHAN, W-L.; RAO, K.R.R.; ALAM, J.;

JEYARAJ, D.A.; NGEW, X.; PATEL, V.; BEER, D.; LIM, S.P.; VASUDEVAN, S.G.;

KELLER, T.H. Peptide inhibitors of dengue virus NS3 protease. Part 1:

Warhead. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 36-39.

ZORZANELLI, B. C. Novos potenciais antivirais inibidores de serina protease

derivados do isomanídeo e estatina. Dissertação (Mestrado em Química) -

Instituto de Química, Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2013.

0

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE

DESENVOLVIMENTO DE CANDIDATOS A PROTÓTIPOS DE FÁRMACOS ANTIVIRAIS PARA OS VÍRUS DA DENGUE

E HEPATITE C SINTETIZADOS A PARTIR DO ISOSORBÍDEO

ALINE CORDEIRO PORTELA

ANEXO

NITERÓI

2014

1

Série das Aminas O-benziladas 34 e 47

2

(31) – (CDCl3, RMN1H -300MHz)

3

(31) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

4

(31) – (CDCl3, RMN13C - 75MHz)

5

(31) – (IV (KBr) cm-1)

6

(30a) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

7

(30a) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

8

(30a) – (CDCl3 ,RMN13C -75MHz)

9

(32) – (CDCl3,RMN1H - 300MHz)

10

(32) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

11

(32) – (CDCl3, RMN13C - 75MHz)

12

(32) – (IV (KBr) cm-1)

13

(45) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

14

(45) – (CDCl3,RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

15

(45) – (CDCl3, RMN13C -75MHz)

16

(45) – (IV (KBr) cm-1)

17

(33) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

18

(33) – (CDCl3 ,RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

19

(33) – (CDCl3, RMN13C - 75MHz)

20

(33) – (IV (KBr) cm-1)

21

(46) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

22

(46) – (CDCl3, RMN1H -300MHz) – Expansão do espectro

23

(46) – (CDCl3, RMN13C - 75MHz)

24

(46) – (IV (KBr) cm-1)

25

(34) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

26

(34) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

27

(34) – (CDCl3, RMN13C - 75MHz)

28

(34) – (IV (KBr) cm-1)

29

(47) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

30

(47) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

31

(47) – (CDCl3, RMN13C - 75MHz)

32

(47) – (IV (KBr) cm-1)

33

Série dos produtos finais 28a-c e 42a-e

34

(41) – (CD3OD, RMN1H - 300MHz)

35

(41) – (CD3OD, RMN13C - 75MHz)

36

(41) – (IV (KBr) cm-1)

37

(43) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz)

38

(43) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

39

(43) – (DMSO-d6, RMN13C -75 MHz)

40

(43) – (IV (KBr) cm-1)

41

(38a) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

42

(38a) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

43

(38a) – (IV (KBr) cm-1)

44

(38b) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

45

(38b) – (IV (KBr) cm-1)

46

(38c) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

47

(38c) – (IV (KBr) cm-1)

48

(38d) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

49

(38d) – (CDCl3, RMN1H -300MHz) – Expansão do espectro

50

(38d) – (IV (KBr) cm-1)

51

(38e) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

52

(38e) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

53

(38e) – (IV (KBr) cm-1)

54

(38f) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

55

(38f) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

56

(38f) – (IV (KBr) cm-1)

57

(38g) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

58

(38g) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

59

(38g) – (IV (KBr) cm-1)

60

(28a) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

61

(28a) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

62

(28a) – (CDCl3, RMN13C – 75 MHz)

63

(28a) – (IV (KBr) cm-1)

64

(28b) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz)

65

(28b) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

66

(28b) – (DMSO-d6, RMN13C - 75MHz)

67

(28b) – (IV (KBr) cm-1)

68

(28c) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

69

(28c) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

70

(28c) – (CDCl3, RMN13C - 75MHz)

71

(28c) – (IV (KBr) cm-1)

72

(42a) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz)

73

(42a) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

74

(42a) – (DMSO-d6, RMN13C - 75MHz)

75

(42a) – (IV (KBr) cm-1)

76

(42b) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz)

77

(42b) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

78

(42b) – (DMSO-d6, RMN13C - 75MHz)

79

(42b) – (IV (KBr) cm-1)

80

(42c) – (DMSO-d6, 1H-RMN - 300MHz)

81

(42c) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

82

(42c) – (DMSO-d6, RMN13C – 75 MHz)

83

(42c) – (IV (KBr) cm-1)

84

(42d) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz)

85

(42d) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz)– Expansão do espectro

86

(42d) – (DMSO-d6, RMN13C – 75 MHz)

87

(42d) – (IV (KBr) cm-1)

88

(42e) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz)

89

(42e) – (DMSO-d6, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

90

(42e) – (DMSO-d6, RMN13C – 75 MHz)

91

(42e) – (IV, KBr)

92

Série dos produtos finais 29a-g

93

(29a) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

94

(29a) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

95

(29a) – (CDCl3, RMN13C - 75 MHz)

96

(29a) – (IV, KBr)

97

(29b) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

98

(29b) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)– Expansão do espectro

99

(29b) – (CDCl3, RMN13C – 75 MHz)

100

(29b) – (IV, KBr)

101

(29c) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

102

(29c) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)– Expansão do espectro

103

(29c) – (CDCl3, RMN13C –75 MHz)

104

(29c) – (IV, KBr)

105

(29d) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

106

(29d) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

107

(29d) – (CDCl3,13C-RMN – 75 MHz)

108

(29d) – (IV, KBr)

109

(29e) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

110

(29e) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

111

(29e) – (acetona-d6, RMN13C – 75 MHz)

112

(29e) – (IV, KBr)

113

(29f) – (CDCl3, RMN1H -300MHz)

114

(29f) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

115

(29f) – (CDCl3, RMN13C – 75 MHz)

116

(29f) – (IV, KBr)

117

(29g) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz)

118

(29g) – (CDCl3, RMN1H - 300MHz) – Expansão do espectro

119

(29g) – (CDCl3, RMN13C – 75 MHz)

120

(29g) – (IV, KBr)