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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIA
TOXICIDADE, SINAIS CLÍNICOS, DETECÇÃO E PREVENÇÃO DAS MICOTOXINAS
DE
INFLUÊNCIA NA AVICULTURA DE CORTE NO BRASIL
ALUNA: MARLI ROCHEDO GUAHYBA
PORTO ALEGRE 2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIA
TOXICIDADE, SINAIS CLÍNICOS, DETECÇÃO E PREVENÇÃO DAS MICOTOXINAS
DE
INFLUÊNCIA NA AVICULTURA DE CORTE NO BRASIL.
Autor: Marli Rochedo Guahyba
Monografia apresentada à Faculdade de Veterinária como requesito parcial para obtenção do grau de Especialista em Análises Clínicas Veterinária
Orientador: Andréia Spanamberg
PORTO ALEGRE 2011
DEDICATÓRIA
Aos meus queridos filhos João, Rodrigo e Diogo Guahyba pela força que me dão
em tudo que me proponho a realizar. E a todas as pessoas que de uma maneira ou de outra
querem ver o meu crescimento pessoal e profissional.
AGRADECIMENTO
Agradeço a Deus, aos meus filhos João, Rodrigo e Diogo Guahyba, a minha irmã
Catharina, meus orientadores, aos mestres que tive durante o curso, aos colegas, aos funcioná-
rios, ao senhor Moacir Toledo pela colaboração na realização deste curso,aumentando meus
conhecimentos para melhor desempenhar minhas atividades profissionais como Médica
Veterinária.
RESUMO
A presença de micotoxinas nos grãos, que servem para alimento humano e animal é
uma realidade mundial, assim como sua toxicidade e determinação de enfermidades por
imuno-supressão, imunodepressão, efeitos carcinogênicos e teratogênicos, tanto no homem,
como nos animais. O que está determinando o aumento nas pesquisas científicas sobre
micotoxinas e os gêneros dos fungos, que as produzem, no mundo inteiro. A limitação
encontrada, porém, é serem as micotoxinas haptenos, o que dificultou até os anos 80 a sua
identificação através de análises clínicas. Sabemos hoje, que na avicultura de corte no
Brasil, as micotoxinas de maior importância são: aflatoxinas, ácido ciclopiazônico,
tricotecenos, fumonisinas e ocratoxina A, também que o método de análises clinicas mais
utilizado é o ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida (ELISA) , embora já
existam trabalhos sugerindo o uso de cromatografia, para confirmação deste, por ter maior
precisão de resultados. No Brasil, já existem kits baseados em cromatografia de afinidade.
Palavras chave: Detecção; micotoxinas, avicultura de corte, Brasil.
ABSTRACT
The presence of mycotoxins in grains that are used for human and animal food is a
global reality as well as its toxicity and determination of disease by immunosuppression,
carcinogenic and teratogenic effects, both in humans and animals. What is driving the
increase in scientific research on mycotoxins and the genera of fungi that produce them,
worldwide. The limitation found, however, is that the micotoxins are haptens, with hamperal
until 80 to be identified through clinical testing. We know today that in poultry production in
Brazil, the most important mycotoxins are aflatoxins, cyclopiazonic acid, trichothecenes,
fumonisins and ochratoxin A, beside that the method of clinical analysis most widely used is
the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), although there are studies suggesting the
use of chromatography for confirmation, by having more accurate results. In Brazil, there are
already kits based to affinity chromatography.
Keywords: Detection; mycotoxins, poultry production, Brazil
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................09
2. MICOTOXINAS...........................................................................................................10
2.1. Generalidades................................................................................................................10
2.2. Infestação dos grãos por micotoxinas..........................................................................12
3. MICOTOXICOSES......................................................................................................13
3.1. Fatores pré-disponentes................................................................................................14
4. DANOS CAUSADOS PELAS MICOTOXINAS.......................................................15
4.1. Perdas econômicas........................................................................................................15
4.2. Comprometimento na saúde humana.........................................................................15
5. MICOTOXINAS QUE CAUSAM IMPACTO NA AVICULTURA DE CORTE.16
5.1. Aflatoxinas.....................................................................................................................16
5.1.1. Mecanismo de ação.........................................................................................................17
5.1.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................18
5.1.3. Lesões pós –mortem.......................................................................................................20
5.2. Ácido ciclopiazônico.....................................................................................................20
5.2.1. Mecanismo de ação........................................................................................................20
5.2.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................20
5.2.3. Lesões pós-mortem.........................................................................................................20
5.3. Tricotecenos...................................................................................................................21
5.3.1. Mecanismo de ação.........................................................................................................22
5.3.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................22
5.3.3. Lesões pós-mortem.........................................................................................................22
5.4. Fumonisinas...................................................................................................................23
5.4.1. Mecanismo de ação.........................................................................................................24
5.4.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................24
5.4.3. Lesões pós-mortem.........................................................................................................25
5.5. Ocratoxina A.................................................................................................................25
5.5.1. Mecanismo de ação.........................................................................................................26
5.5.2. Toxicidade e sinais clínicos............................................................................................26
5.5.3. Lesões pós-mortem.........................................................................................................27
6. DIAGNÓSTICO DAS MICOTOXICOSES...............................................................28
8
7. MÉTODOS DE ANÁLISES CLÍNICAS UTILIZADOS PARA DIAGNÓSTICO
DE MICOTOXINAS.............................................................................................................. 29
7.1. Radioimunoensaio(RIA)..............................................................................................29
7.1.1. Radioimunoensaio direto.............................................................................................. 29
7.1.2. Radioimunoensaio de competição.................................................................................30
7.1.3. Radioimunoensaio de captura........................................................................................30
7.2. Ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida(ELISA).................................30
7.3. Cromatografia..............................................................................................................33
7.3.1. Cromatografia em camada delgada (CCD)....................................................................33
7.3.2. Cromatografia gasosa (CG) ..........................................................................................34
7.3.3. Cromatogrfia líquida de alta eficiência (CLAE)............................................................35
7.4. Espectometria de massa movida a gases....................................................................36
7.5. Nested-PCR...................................................................................................................36
7.6. Kits para análise de micotoxinas................................................................................36
7.6.1 Aflacheck.......................................................................................................................36
7.6.2. Afla Teste-P...................................................................................................................37
7.6.3. Afla Teste-B...................................................................................................................38
7.6.4. Afla Teste-WB...............................................................................................................38
7.6.5. DON Test HPLC............................................................................................................39
7.6.6. DONCheck.....................................................................................................................39
7.6.7. Fumoni test/Fumoni Test WB………............................................................................40
7.6.8. Fumoni Test 200............................................................................................................41
7.6.9. Ochra Test……………………………………………………………………………..41
7.6.10.Ochra Test WB………………………………………………………………………...42
7.6.11.AOZ HPLC …………………………………………………………………………...43
7.6.12.AflaOchra HPLC……………………………………………………………………....44
8. MANEJO PROFILÁTICO COM OS GRÃOS.........................................................46
9. CONCLUSÃO..............................................................................................................48
REFERÊNCIAS......................................................................................................................49
1. INTRODUÇÃO
Estudos demonstram que no Brasil os níveis de micotoxinas são superiores ao
permitido em alimentos e rações, devido a grande extensão do país, a qual dificulta o
controle de obediência as leis, que determinam a quantidade máxima de micotoxinas. As
micotoxinas reduzem a produção, impedem os agronegócios, impedem as exportações e
muitas vezes esses produtos não exportados são usados no país, colocando em risco à saúde
animal e humana. Elas podem entrar na dieta dos animais e do homem de forma direta, ou
seja, quando o alimento torna-se contaminado pelo fungo toxigênico, promovendo a produção
da toxina, ou indiretamente quando à micotoxina permanece no alimento, mesmo após o
processamento e a remoção do fungo produtor. Por isso a ocorrência de micotoxinas é grave,
pois processamentos dos grãos podem eliminar os fungos, mas não as micotoxinas. As
micotoxinas contaminantes podem passar do animal para o homem através da carne, ovo e
leite. O nível de uma micotoxina pode ser baixo, mas quando combinado a um nível também
baixo de outra micotoxina podem causar um efeito duplo que poderá ser desastroso (LEESON
et al., 1995).
A presença de micotoxina depende também do tipo de alimento, pois alguns grãos
são substratos mais aptos que outros para o crescimento de determinados fungos
(SANTURIO, 2000).
Segundo pesquisadores da EMBRAPA 25% dos grãos produzidos no mundo estão
afetados por micotoxinas (FAO, 2007; FREIRE et al., 2007; CORRÊA, 2007). Segundo Word
Bank Repor (1993) a redução na vida média das pessoas nos países em desenvolvimento
deve-se a doenças provocadas por micotoxinas (CORRÊA, 2007).
Este trabalho tem como objetivo demonstrar que através da toxicidade,
sintomatologia, detecção das micotoxinas (através das análises clínicas veterinária) e métodos
preventivos, que podemos evitar grandes perdas na produção de frango de corte, diminuir as
condenações de carcaça, manter e aumentar as exportações do Brasil. Reduzir o sofrimento
dos animais, que uma vez intoxicados por micotoxinas podem ter sua imunidade reduzida ou
suprimida, não reagindo assim a vacinação e contraindo doenças várias. E reduzir o risco de
intoxicação humana por ingestão de carcaças contaminadas por micotoxinas.
2. MICOTOXINAS
2.1. Generalidades
São substâncias tóxicas produzidas por fungos filamentosos resultante do seu
metabolismo. È, portanto, um metabólito. Ela ocorre após a fase de crescimento do fungo
produtor, por meio das vias metabólicas, catalisadas por reações enzimáticas
(CORRÊA,2007). Micotoxinas não são detectáveis pela visão, olfato ou paladar
(RUPLEY, 1999).São produzidas, principalmente, pelos fungos dos gêneros Aspergillus,
Fusarium e Penicillium (FREIRE et al., 2007).Substâncias essas, que podem ser ingeridas,
inaladas ou absorvidas pela pele. É resultado da atividade metabólica dos fungos e podem
estar no interior de esporos, em seus micélios ou serem liberados por estes nos alimentos.
Podem ter ação direta quando o produto é utilizado diretamente na alimentação dos animais
(SILVA, 2010). Estes ao ingerirem o alimento contendo os microorganismos permitem que
estes ou seus metabólitos invadam seus fluídos causando doenças graves. Podem ter ação
indireta quando subprodutos ou derivados são utilizados. As principais micotoxinas dos grãos
são: Aflatoxinas, Tricotecenos, Zearelenonas, Moniliforminas, Fumonisinas e Ocratoxinas.
Sendo que as que mais ocorrem no Brasil são: Aflatoxinas, Fumonisinas e Ocratoxinas
(CORRÊA, 2007).
Elas são produzidas em determinados ambientes, sobre determinados substratos e
por determinadas linhagens. Seus efeitos tóxicos podem ser agudos ou crônicos, como:
Citotoxidade;
Carcinogenicidade;
Teratogenicidade;
Fitotoxidade;
Mutagenicidade;
Fatores que favorecem a produção de micotoxinas podem ser:
Intrínsecos:
Tipo de alimento;
Conteúdo de umidade;
Sua composição.
Extrínseco:
11
Físico:
Temperatura;
Umidade relativa;
Danos mecânicos;
Luz.
Químico:
Fungicida;
pH;
composição do substrato;
variedades de grãos resistentes.
Biológico:
Peculiaridade biológica das linhagens de microorganismos inibidores e competidores;
Presença de insetos e ácaros (LABMICO, 2001; C0RRÊA, 2007).
No continente Sul-Americano são controladas por legislação as seguintes
micotoxinas:
Aflatoxina B1;
Aflatoxina B1/G1;
Aflatoxinas totais B1,B2,G1,G2;
Fumonisinas B1;
Desoxinivalenol;
Ocratoxina A;
Patulina;
Zearalenona;
Alcalóides ergóticos;
(FREIRE et al., 2007; CORRÊA, 2007; FONSECA, 2010).
Dependendo dos teores de micotoxinas ingeridas ou injetadas podem ter quatro
tipos básicos de toxidade:
Aguda;
Crônica;
12
Mutagênica;
Teratogênica
(CORRÊA, 2007).
2.2. Infestação dos grãos por micotoxinas
O micro-clima de superfície do grão tanto durante o cultivo, colheita, secagem,
transporte e estocagem favorecem à produção de micotoxinas pelos gêneros Alternaria,
Cladosporidium , Fusarium, Aspergillus e Penicillium (LABMICO, 2010).
Na armazenagem os fungos se desenvolvem quando o micro-clima da superfície
do grão criado pela troca de umidade entre este e o ar esteja em torno de 14 a 22 % de
umidade.
3. MICOTOXICOSES
É uma intoxicação por ingestão de micotoxinas, ou seja, estados patológicos
causados por toxinas fungicas presentes em alimentos em que os agentes se desenvolvem
(CORREA, 1982; CORREA, 1982). A micotoxicose pode causar no organismo do animal e
dos humanos danos no crescimento, quer seja, afetando as funções do organismo ou
desenvolvendo tumores.
Órgãos mais afetados são:
Fígado;
Rim;
Cérebro;
Músculos;
Sistema nervoso;
Pulmão (OLIVEIRA, 2010).
Doença não transmissível. Drogas e antibióticos não produzem efeitos sobre elas. Ocorrem
em surtos normalmente, pois estão associadas a alimentos ou rações. Deve-se retirar à
alimentação dos animais ou pessoas infectadas. As micotoxinas causam stress às células
imunológicas impedindo que desempenhem sua função normal, que é combater os agentes
infecciosos que invadem o organismo. Quando as micotoxinas são ingeridas em doses baixas
levam à morte prematura das células imunológicas (apoptose) aumentando assim à
suscetibilidade à infecção por microorganismos patogênicos (QUINABRA, 2006).
As micotoxicoses mais comumente observadas são:
Aflatoxicose (Aspergillus);
Ergotismo (Claviceps purpúrea e Claviceps paspalum).
O gênero Aspergillus pode vegetar em alimentos conservados por muito tempo,
ou mal conservados com teor de umidade favorecendo seu desenvolvimento, e produzindo
aflatoxina e sterigmatocistina, ainda mais tóxicas. Essas micotoxinas são muito estáveis,
resistindo à esterilização pelo calor, e são bastante absorvíveis pelo intestino. A aflatoxicose
pode ser crônica ou aguda, levando a insuficiência hepática e a cirrose.
Lesões por aflatoxicose crônica:
Necrose do centro globular no fígado (lagos cheios de sangue e sem hepatócitos);
Rim com necrose tubular na cortical;
14
Esteatose dos raios medulares;
Atrofia glomerular.
Pode haver regeneração nodular no fígado, formando hepatotomos (tumor
maligno em que as células parenquimatosas assemelham-se às células hepáticas).
Lesões por aflatoxicose aguda:
Mata principalmente animais jovens em aproximadamente 48 horas.
Apresenta:
Sinais encefálicos como apatia, irritação, marcha em círculo;
Sinais gastroentéricos como diarréia, às vezes sanguinolenta;
Icterícia.
Lesões de necropsia:
Gastroenterite hemorrágica;
Fígado congesto;
Às vezes necrose hepática;
Petéquias renais;
Petéquia e sufusão (extravasamento) hemorrágica pulmonares;
Cérebro amolecido por degeneração gordurosa, ou Síndrome de Reye (CORRÊA,
2007; FONSECA, 2010).
3.1. Fatores pré-disponentes
Ingestão, concentração de micotoxinas dos alimentos, tempo de exposição ao alimento
contaminado, suscetibilidade da espécie animal, idade, sexo, condições sanitárias.
4. DANOS CAUSADOS PELAS MICOTOXINAS
4.1. Perdas econômicas
Contaminação de produtos agrícolas;
Perdas de animais;
Diminuição da produtividade;
Custos indiretos em sistemas de controle;
Gastos na remoção de micotoxinas para recuperar o produto rejeitado, pela não
aceitação, pelo mercado importador.
4.2. Comprometimento da saúde humana
Pela ingestão direta das micotoxinas contidas nos produtos de origem vegetal e
animal;
Por contato direto
(LABMICO, 2010).
5. MICOTOXINAS QUE CAUSAM IMPACTO NA AVICULTURA DE CORTE NO
BRASIL
Segundo (FREITAS, 2007), o uso de múltiplas fontes de grãos para alimentação de
frangos de corte pode proporcionar o desenvolvimento de várias espécies de fungos ou
diferentes micotoxinas já sintetizadas. E as interações químicas entre as micotoxinas, podem
ocorrer através de diversos mecanismos, incluindo alterações de absorção, de ligação protéica,
de biotransformação ou de excreção de uma ou de ambas micotoxinas. A resposta do
organismo frente a tal associação pode ser aumentada ou diminuída conforme o sítio de ação
das micotoxinas. Pois os efeitos de duas micotoxinas simultaneamente podem produzir efeitos
sinérgicos ou aditivos.
5.1. Aflatoxinas
São micotoxinas produzidas pelos fungos Aspergillus flavus (50% de suas cepas) e
Aspergillus parasiticus e Aspergillus nomius. São identificadas como: B1, B2, G1, G2, M1,
M2 ( FREIRE et al., 2007; CORRÊA, 2007 ). Na influorescência a micotoxina B fica
azulada, enquanto a micotoxina G fica esverdeada, quando observada sob luz ultravioleta.
Produzem em torno de 17 micotoxinas, porém a micotoxina B1 (AFB1) é a mais
carcinogênica, mutagênica, possivelmente teratogênica e a de maior importância no Brasil (
CORRÊA, 2007; FONSECA, 2010). Os principais substratos são o amendoim, castanha,
nozes, milho e cereais em geral (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009) e
também farelo de peixe (CORRÊA, 2007). As aflatoxinas são absorvidas por difusão passiva
no trato gastrointestinal, principalmente no intestino delgado e daí vai à circulação porta-
hepática (FONSECA, 2010). São bastante solúveis em clorofórmio, metanol e
dimetilsulfóxido (DMSO). Pouco solúveis em água. São destruídas por autoclavação em
presença de amônia e por tratamento com hipoclorito (CORRÊA, 2007).
Dependendo da dose de aflatoxina ingerida a ave pode apresentar:
Se ingerir 0,25 ppm a imunogênese é deprimida;
Se ingerir 0,6 a 1 ppm apresentará resistência diminuída;
Se ingerir 1,5 2,5 ppm terá seu ganho de peso reduzido;
Se ingerir 1 a 10 ppm terá hemorragias, necrose hepática e morte súbita (CORRÊA,
2007).
17
Análises de aflatoxinas realizadas no Laboratório de Análises Micotoxicológicas
(LAMIC) da Universidade Federal de Santa Maria, entre os anos de 1986 e janeiro de 2000,
em 15.600 amostras de alimentos destinados principalmente ao consumo animal,
demonstraram que no milho analisado 41,9% das amostras estavam contaminadas por
aflatoxinas (SANTURIO,2000). Elas se desenvolvem entre 25° a 35°C e a uma umidade
acima de 15% (BREDEMEIER, 2006; MUNDSTOCK, 2006; FREITAS, 2007).
5.1.1. Mecanismo de ação
Por ligarem-se ao DNA das células as aflatoxinas inibem a síntese de proteínas,
enzimas, fatores de coagulação (vitamina K) e de ácidos graxos, além de inibirem o
metabolismo da glicose. Prejudica a síntese de colesterol. Além de serem oncogênicas e
imunosupressivas (SILVA, 2010). Depois de absorvidas as aflatoxinas são distribuídas pelo
organismo e podem ser encontradas no fígado (em maiores concentrações), nos músculos, rins
e tecido adiposo. É no fígado que as aflatoxinas sofrem maior biotransformação por ação das
enzimas microssomais. Sabe-se, que as aflatoxinas precisam sofrer uma ativação metabólica
para se tornarem tóxicas e que no organismo o sistema enzimático microssomal hepático é o
responsável por essa transformação, que é irreversível. Resultando compostos que são
excretados pela bile, urina, leite (aflatoxina M1) e gema do ovo (aflatoxina M1), assim como
aflatoxina B2a cuja principal função é inibir a atividade de enzimas tanto no fígado como em
outros tecidos. Sendo que o processo mais danoso na metabolização da aflatoxina B1 é o
produto resultante da epoxidação, ou seja, 8,9 epóxido de aflatoxina (ou AF-epóxido), mais
potente carcinógeno natural conhecido até o momento. Ele é altamente eletrolítico e capaz de
reagir rapidamente, através de ligações covalentes, com sítios nucleofílicos de
macromoléculas, como o ácido desoxirribonucléico (DNA), ácido ribonucléico (RNA) e
proteínas (WYATT, 1991). A ligação do composto AF-epóxido com o DNA modifica sua
estrutura e sua atividade biológica, originando os mecanismos básicos dos efeitos
mutagênicos e carcinogênicos da aflatoxina. Esta ligação entre o composto formado e o DNA
não é permanente, no entanto,quando desfeita,ocorre a retirada de um par de nucleotídeos do
código genético. Para suprir esta perda, um novo par é colocado no lugar. Entretanto, o par de
bases suprimido da seqüência dificilmente é substituído pelo mesmo par, o que determina a
ocorrência de uma mutação no código da célula.
As reações a que o sistema enzimático microssomal submete a aflatoxina é
irreversível. Entretanto, o sistema redutase citoplasmático converte a aflatoxina em
18
aflatoxicol, sendo que esta reação é reversível, tornando a reverter este composto em
aflatoxina (CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009). Além
disso, a ingestão de aflatoxinas determina a diminuição da atividade do sistema retículo-
endotelial, da atividade imunogênica, favorecendo a instalação de infecções, bloquear o
sistema complemento, diminuindo a fagocitose (CORRÊA, 2007).
5.1.2. Toxicidade e sinais clínicos
A sensibilidade aos efeitos tóxicos das aflatoxinas varia consideravelmente entre
indivíduos da mesma espécie e a relação dose-resposta pode variar de acordo com raça, sexo,
idade e composição da dieta, entre outros fatores. Os machos são mais susceptíveis que as
fêmeas e os jovens mais susceptíveis que os adultos (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009;
RAUBER, 2009). Entre as três principais linhagens de frangos de corte utilizadas no Brasil há
diferenças de desempenho, quando são alimentadas com ração contaminada com aflatoxinas
(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).As aflatoxicoses caracterizam-se por
destruição parenquimatosa do fígado, hemorragias, alterações das funções nervosas em
combinação com espasmos , nefrotoxidade e carcinomas (FONSECA). As aflatoxinas são
potentes agentes imunossupressores, principalmente em aves jovens, por suprimir diferentes
mecanismos da resposta imune e reduzir o tamanho dos órgãos linfóides, como Bursa de
Fabrício e timo. As aflatoxinas determinam imunosupressão por dois mecanismos: o primeiro
se relaciona com à imunogenese, ou seja, afeta às células T e o timo, os quais possuem
elevada sensibilidade a AFB1 e AFM1; e o segundo mecanismo está relacionado à baixa
resistência às infecções, ou seja, está relacionado com as atividades dos macrófagos e às
deficiências de substâncias humorais não específicas, tais como complemento e interferon
(CHEEKE,1998). As aflatoxinas tem habilidade de inibir a RNA polimerase in vivo e com
isso limitar a síntese protéica, inibindo a síntese de imunoglobulinas. As aflatoxinas também
causam um rápido aumento na atividade das enzimas lisossomais nos músculos esqueléticos e
no fígado das aves, estimulando a degradação lisossomal de imunoglobulinas. Também
inibem o processamento de antígenos, como conseqüência da inibição de células fagocíticas
do sistema retículo endotelial presentes em diversos órgãos e tecidos. Níveis de aflatoxinas
entre 5 a 10 ppm diminuem significativamente a porcentagem de atividade fagocítica de
monócitos, ou seja, em torno de 30% , quer seja, macrófagos maduros, ou seus precursores
monócitos imaturos. A regressão da Bursa de Fabrício e a supressão do processo de
hemaglutinação podem ser indicadores de que está ocorrendo falha vacinal ou infecções
19
secundárias antes mesmo que a ave apresente sinais clínicos de aflatoxicose. As aflatoxinas
tem demonstrado capacidade de aumentar a susceptibilidade de aves a salmonelose,
aspergilose, coccidiose e Marek, devido à imunodepressão que primeiramente envolve o
sistema imune mediado por células (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
Reprodutoras expostas à micotoxinas tem seus títulos de anticorpos circulantes diminuídos,
determinando a não transferência de imunidade passiva adequada para a progênie. Também
a variação dos níveis de anticorpos maternos, imposta por doses baixas de micotoxinas, que
podem ocasionar, muitas vezes, o aparecimento de infecções recorrentes no plantel. Animais
com micotoxicose não desenvolvem boa resposta imune, mesmo que vacinados (FREIRE,
1995). Nos animais jovens reduz o consumo de ração, reduz o crescimento por perda de peso
e podem levar à morte (QUINABRA, 2006). Aves com menos de 21 dias sob estresse são
afetadas por menores quantidades de aflatoxinas no que se refere à produção de carne
(DOERRet al., 1983; SANTURIO, 2000). Fatores como desbalanceamento nutricional, erros
de manejo, temperaturas extremas, camas velhas, qualidade dos pintos alojados favorecem
para que baixos níveis de aflatoxinas alterem o desenvolvimento das aves (SANTURIO,
2000). As aflatoxinas também reduzem o consumo de ração, reduzem a conversão alimentar,
reduzem o peso em 27%, determinam a síndrome da má absorção, esteatorréia com até dez
vezes mais gordura, diminuição da lípase pancreática (enzima digestiva das gorduras),
diminui os sais biliares (necessários à digestão e absorção das gorduras), aumentam o tempo
de coagulação sanguinea, podem causar hemorragias petequiais intestinais, reduzem a
imunidade, aumentam a gravidade das infecções, causam anemia, reduzem a capacidade de
metabolizar gorduras, amido e proteínas, causam intoxicação hepática, podendo levar à morte,
causam problemas nas pernas das aves, reduzem a pigmentação da pele, aglomeramento e
redução das penas aumentando os arranhões, cortes e hematomas, aumentam a sensibilidade
para mudanças extremas de meio ambiente, causam letargia, reduzem a fertilidade das
matrizes, reduzem a eficácia dos antibióticos, (SCHAEFER,1991;HAMILTON,1991;
LEESON et al.,1995; SANTURIO,2000; QUINABRA,2006; IMPERATORI,2008;
MALLMANN,2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
Na aflatoxicose crônica a má absorção dos alimentos se manifesta pela presença de
partículas de ração mal digeridas excretadas pelas aves, associada a uma esteatorréia. A qual
pode ser severa com incremento de até dez vezes no teor de gordura das fezes. Com
diminuição nas atividades específicas e totais da lípase pancreática e pela diminuição dos sais
biliares necessários para digestão e absorção das gorduras, levando a esteatose hepática, ou
20
seja, fígado gorduroso (SCHAEFER, 1991; HAMILTON, 1991; MALLMANN, 2009;
DILKIN, 2009; RAUBER 2009).
Os sintomas de aflatoxicose em aves são mais severos quando a dieta tem um baixo
nível protéico (SISK, 1972; CARLTON, 1972). Quando a dieta das aves tem um maior nível
do que o normal de proteínas isso confere a elas um efeito protetor contra aflatoxicoses
(SMITH et al., 1970). Aves contaminadas com aflatoxinas devem receber ração com altos
níveis de riboflavina e vitamina D e baixos níveis de vitamina B6 o qual força um aumento da
oxidação dos ácidos graxos depositados em excesso no fígado (SANTURIO, 2000).
5.1.3. Lesões pós-mortem
Aumento do tamanho do fígado até 68%;
Alteração da coloração do fígado (amarelado) por infiltração de gordura;
Fígado friável;
Tumores hepáticos (PATTERSON, 1983);
Hidropericárdio;
Ascite;
Palidez e congestão dos rins;
Bursa de Fabrício diminuída;
Timo diminuído;
Atrofia das vilosidades intestinais;
Necrose intestinal;
Fibrose intestinal;
Glândulas adrenais aumentadas e necrosadas
(MERKLEYet al., 1987; CRUZ,1995; SANTURIO, 2000; IMPERATORI, 2008;
MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
5.2.Ácido ciclopiazônico
O ácido ciclopiazônico (CPA) é produzido por algumas cepas de Aspergillus
flavus, Aspergillus vesicolor, Aspergillus tamarii, Penicillium cyclopium e Penicillium
commune (WYATT, 1991; CORRÊA, 2007). Seu substrato são o milho e o amendoim.
21
Ocorrem, geralmente, associados as aflatoxinas (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009;
RAUBER, 2009).
5.2.1. Mecanismo de ação
Intoxicação
(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
5.2.2. Toxicidade e sinais clínicos
O ácido ciclopiazônico causa no organismo dos frangos de corte degeneração e
necrose hepática, lesões hemorrágicas no miocárdio, lesões hemorrágicas no proventriculo,
lesões hemorrágicas na moela, lesões hemorrágicas no baço. Sendo os principais sinais
clínicos por intoxicação de ácido ciclopiazônico (CPA) a diminuição no ganho de peso,
vômito, opistótono ( estado no qual a cabeça e os membros inferiores estão recurvados para
trás, enquanto o tronco se arca anteriormente, por um espasmo tetânico dos músculos
dorsais) que é observado em casos de grave irritação meníngea e em outros estados
neurológicos pronunciados (BLAKISTON, 1982), hiperestesia, ou seja, sensibilidade
excessiva da pele (BLAKISTON, 1982), convulsão e morte (MALLMANN, 2009; DILKIN,
2009; RAUBER, 2009).
5.2.3. Lesões pós-mortem
Degeneração e necrose hepática;
Lesões hemorrágicas do miocárdio;
Lesões hemorrágicas do proventriculo;
Lesões hemorrágicas do baço;
Lesões hemorrágicas e erosões na moela (lesão mais característica)
(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
22
5.3. Tricotecenos
Os tricotecenos são um grupo de 100 micotoxinas imunosupressoras, as quais
possuem a mesma estrutura básica (tetracíclico 12,13-epoxitricoteceno). São divididos em
dois grupos, denominados macrolíticos e não macrolíticos A e B. São os tricotecenos não
macrolíticos, que contaminam alimentos e rações. Sendo que o tricoteceno não macrolítico A
é o mais tóxico. São produzidos por fungos dos gêneros Fusarium sp, Myrothecium sp,
Stachybotrys sp, Trichotecium sp, Trichoderma sp, Phomosis sp, Cephalosporium. Seus
substratos são o milho, trigo, cevada, aveia e centeio. A produção desta micotoxina ocorre sob
alta umidade e temperatura entre 6 a 24 °C (CORRÊA, 2007). São micotoxinas que contém
tricotecina. São os tricotecenos mais importantes o desoxinivalenol (DON), nivalenol (NIV),
toxina T2, Toxina HT2, diacetoxiscirpenol (DAS), neosonaliol, fusanonax, desoxivalenol
(FREIRE,2007). A toxina T2, porém, pode desenvolver-se a uma umidade de 25% e a baixas
temperaturas, ou seja, entre 8 a 15 °C (SANTURIO, 1997). Essas micotoxinas inibem a
síntese de proteína eucariótica, no seu estágio inicial, de alongamento e no término da
síntese, pois interferem na atividade da transferase peptídica ( STAFFORD, 1973;
MCLAUGHLIN, 1973; WEI et al., 1974; FREIRE, 2007; CORRÊA, 2007) determinando
alterações no sistema hematopoiético e linfático, aplasia medular nos casos graves e
imunosupressão. Agem, também, sobre as aminas biogênicas do cérebro, o que causa a recusa
de alimentação. Possuem potente ação irritante local, tanto na mucosa como na pele. Tem
atividade teratogênica, a qual já foi demonstrada em camundongos. No Brasil tem baixa
ocorrência (CORRÊA, 2007). A desoxinivalenol (DON) ocorre nos grãos trigo, centeio,
cevada. Causa náuseas, vômito, diarréia, recusa de alimentos e morte celular. É menos tóxica.
(MILLER et al., 2001; Freire, 2007). A desoxinivalenol (DON) e a T2 são encontradas no
Brasil em grãos de milho e trigo (FURLONG et al., 1995; PRADO et al., 1997; OLIVEIRA,
2001; SOARES, 2001; FREIRE, 2007).
O fungo Stachybotrys atra, tem tricoteceno macrolíticos que se localizam tanto nos
esporos (conídeos), como nos próprios fragmentos micelianos. Ocorrem nos fenos mofados e
causam hemossiderose, ou seja, depósito de hemossiderina ou ferro coloidal no pulmão
(BLAKISTON, 1982), que é insolúvel em água e só ocorre em estados mórbidos em excesso
no organismo. Nos agricultores que manipulam esse feno causam hemorragias nasais e
traqueais por pneumonia hemorrágica (FURLONG et al., 1995; PRADO et al., 1997;
OLIVEIRA, 2001; SOARES, 2001; FREIRE et al., 2007). Esse fungo degrada material rico
em celulose como o feno e se mantém em lugares úmidos.
23
Outros sintomas causados por tricotecenos são vômitos, recusa de alimentos (ATA-
aleucia tóxica alimentar), redução do ganho de peso, hemorragias, necrose de epiderme,
redução da produção de ovos, interferência no sistema imunológico e morte (FONSECA,
2010; FREIRE et al., 2007).
Os tricotecenos que atingem os frangos de corte são:
Toxina T2;
Diacetoxispernol (DAS);
Desoxinivalenol (DON ou vomitoxina).
Essas micotoxinas são produzidas por diversos gêneros de fungos, sendo o principal produtor
o gênero Fusarium (CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER,
2009). A toxina desoxinivalenol (DON) é a mais comum nos cereais, porém a toxina T2 é a
mais tóxica (CORRÊA, 2007). A ingestão de 4 ppm de toxina T2 já pode ocorrer necrose oral
e ganho de peso reduzido (CORRÊA, 2007).
5.3.1. Mecanismo de ação
Causam o decréscimo transitório dos níveis de hemoglobina por necrose do tecido
hematopoiético, inibem a rápida proliferação de células do sistema imune por necrose do
tecido linfóide determinando assim uma menor resposta na formação de anticorpos, causam
necrose da mucosa oral e fazem com que haja formação de peróxidos a partir dos lipídios,
diminuindo a concentração de vitamina E nas aves (CORRÊA, 2007; MALLMANN,
2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
5.3.2. Toxicidade e sinais clínicos
Os tricotecenos causam no organismo dos frangos de corte alteração de mucosa
oral (degeneração hidrópica, ou seja, acúmulo de água entre as células), depressão no
crescimento, distúrbios nervosos, redução da formação de anticorpos, inclusive pós-vacinais,
anemia (CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
Os frangos de corte apresentam sintomas como lesões orais de bico, palato e língua
(necrose de ponta de língua, erosões ou ulcerações na base da língua), recusa súbita de
alimentos, perda de peso, posição anormal das asas, diminuição dos reflexos, diminuição da
qualidade de plumagem (CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER,
2009).
24
5.3.3. Lesões pós-mortem
Necrose de ponta de língua;
Erosões ou ulcerações na base da língua;
Lesões orais de bico e palato;
Lesões de pele;
Soluções de continuidade;
Dermatopatias bacterianas (celulite, abcessos e flemegmões)
(CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
5,4, Fumonisinas
Descoberta em 1988, formam um grupo de metabólitos fúngicos secundários
produzidos principalmente pelo gênero Fusarium verticillióides (antes chamado
molliniforme) e Fusarium proliferatum. Também pelas espécies Fusarium nygama,
Fusarium napiforme, Fusarium subglutinans, Fusarium poliphialidium, Fusarium
oxysporum, Alternaria alternata (Fusarium lycopersici) (BEZUIDENHOU et al., 1988;
GELDERBLOM et al., 1988; POZZI et al., 2002; BENNET, 2003; KLICH, 2003;
FREIRE, 2007; CORRÊA, 2007). As fumonisinas conhecidas até 1999 eram 16 substâncias
B1 (FB1, FB2, FB3 e FB4), A1, A2, A3, AK1, C1, C3, C4, P1, P2, P3, PH1, PH1b
(MUSSER, 1997; PLATTNER, 1997; HÁ-SEO, 1999; WON LEE, 1999). Atualmente já se
identificou 28 fumonisinas. No entanto as contaminantes naturais do milho e derivados são
as fumonisinas B1 (FB1), B2(FB2), B3(FB3), sendo a mais tóxicas a B1 (FB1), constituíndo
70% do total das fumonisinas, que produzem metabólitos tóxicos aos animais e homem
(CORRÊA, 2007). Pouco se sabe sobre a temperatura ótima para produção de
fumonisinas.Seu principal substrato é o milho. As fumonisinas podem causar câncer de
esôfago em humanos (PERAICA et al., 1999;CORRÊA, 2007), leucoencefalomalacea em
eqüinos (LEME) e em coelhos (MARASA et al., 1988; BUCCI et al., 1996; FADOHAN et
al., 2003), edema pulmonar (HARRISON et al., 1990), hidrotórax (HARRISON et al.,
1990).As fumonisinas são hidrosolúveis, porém apresentam maior solubilidade em
acetonitrila-água. São insolúveis em solventes orgânicos (clorofórmio, metanol),
(BEZUIDENHOUT et al., 1988; SHIER, 1992; MERRIL et al.,1993; FREIRE, 2007;
25
CORRÊA, 2007). Não absorvem luz visível ou ultravioleta, pois não são fluorescentes,
precisando que haja derivação química para sua detecção. São estáveis ao calor O
aquecimento das fumonisinas a 100°C ou mais reduz os níveis de
micotoxina(CORRÊA,2007).As fumonisinas inibem a síntese de esfigolipídeos (são lipídeos
de qualquer região) acarretando enormes problemas nas atividades celulares, devido a essa
substância ser necessária para composição da membrana plasmática, para comunicação
célula à célula, para interação intracelular, para a formação da matriz celular e para formar
fatores de crescimento (SHIER, 1992; MERRIL et al., 1993; FREIRE, 2007). Causam um
aumento intracelular da concentração de esfinganina livre e uma diminuição da concentração
de esfingosina livre, isto ocorre devido a similaridade das fumonisinas com essas
substâncias, as quais são responsáveis pela formação da esfingomielina e
glicoesfingolipídeos (CORRÊA, 2007). As fumonisinas fusarenona, ácido fusárico, fusarina
c, moniliformina tem sido encontrada com elevada freqüência nos cereais, participando
principalmente, da cadeia alimentar das aves (SANTIN et al., 2001). O ácido fusarico, por
exemplo, interfere no consumo alimentar das aves, agindo na utilização do triptofano pelo
cérebro, além de atuar sinergicamente, aumentando a toxidade de outras micotoxinas
(BACON et al., 1996). As fumonisinas são caracterizadas como uma potente cardiotoxina
(NAGARA et al., 1996). A moniliformina pode afetar frangos de corte, reduzindo o ganho
de peso e aumentando o volume do coração (KUBENA et al., 1997). As fumonisinas que
afetam os frangos de corte são produzidas principalmente pelo gênero Fusarium
miniliforme. Sendo as de maior ocorrência B1 e B2. Menos de 50 ppm de B1 já causam
diminuição no ganho de peso (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
5.4.1. Mecanismo de ação
Determinam alteração na relação entre os níveis circulantes de esfingosina e
esfinganina, que são precursores dos esfingolipídeos (esfingomielina e glicoesfingolipídeos).
5.4.2. Toxicidade e sinais clínicos
As alterações que as fumonisinas determinam no organismo dos frangos de corte
são lesões orais, inapetência, menor ganho de peso, diminuição na concentração da albumina
sérica, acite, hidropericardite, edema, congestão renal, aumento de peso do fígado, aumento
26
do tempo de coagulação sangüinea, petéquias, diarréia e morte (ESPADA et al., 1997;
CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
5.4.3. Lesões pós-mortem
Coração pálido;
Rim congesto;
Fígado, proventriculo e moela com aumento relativo de peso
(CORRÊA, 2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
5.5. Ocratoxina A
Descoberta a ocratoxina A em 1965 como metabólito do Aspergillus ochraceus
(VAN DER MERWE et al., 1965). Produzida também pelos Aspergillus alucatos,
Aspergillus alliaceus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus carbonarius, Aspergillus meleus,
Aspergillus glaucus, Aspergillus auricomus e Aspergillus verrucosum (CIEGLER et al.,
1972; CHU, 1974; PIT, 1987; ABARCA et al., 1994; LARSEN et al., 2001; BAYMANET
et al., 2002; FREIRE, 2007). No Brasil as espécies que mais produzem ocratoxina A são
Aspergillus ochraceus e Penicillium verrucosum (CORRÊA, 2007). Encontra-se em
cereais, leguminosas e vinhos (MARQUARDT, 1992; FROHLICH, 1992; EGMOND,
1994; SPEIJERS, 1994; PITT, 2000; FREIRE, 2007). Esta toxina interfere na síntese de
RNA, DNA, na síntese protéica e no metabolismo dos carboidratos, principalmente na
gliconeogenese. Esta micotoxina une-se firmemente à albumina do soro, obtendo meia-
vida longa no organismo do frango de corte. O que provoca o aparecimento de resíduos nos
tecidos dos animais ou fluídos biológicos, incorporando-se a cadeia alimentar humana, se
esses animais forem utilizados na alimentação (CORRÊA, 2007). Promovem também
acúmulo de gordura no fígado, sérios danos renais, onde se acumulam alterando o fenótipo
e a função do rim. E são também imunosupressoras, teratogênica e carcinogênica
(KUIPER-OODDMAN, 1989; SCOTT, 1989; BEARDAL, 1994; MILLER, 1994;
PLÉSTINA, 1996; SCHLATTER et al., 1996; FREIRE, 2007). Causam morte das aves
(HAMILTON et al., 1982; BURNS, 1986; DWIVEDI, 1986; KROGH,
1987;FREIRE,2007). A ocratoxina A é uma substância cristalina, incolor à luz natural e
que sob luz ultravioleta assume fluorescência azul-esverdeada, pouco solúvel em água e
solúvel em clorofórmio e metanol. Seu ponto de fusão é entre 168 a 173°C e seu peso
27
molecular é de 403 (CORRÊA, 2007). Atingem o máximo de produção de 20 a 30°C em
grãos com umidade relativa de 39% ou em temperaturas inferiores a 15°C desde que
tenham umidade relativa de 52% (SANTIN, 2000; FREITAS, 2007). A ocratoxina A
(OTA) que atingem os frangos de corte são produzidas por seis espécies de Aspergillus e
seis espécies de Penicillium. São nefrotóxicos, fazem com que o rim aumente de tamanho e
perca a cor por acúmulo de ácido úrico (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER,
2009). A ocratoxina A tem efeito sinérgico com as aflatoxinas ,toxina T2 (tricoteceno),
ácido ciclopiazônico (CPA) e com as fumonisinas. Juntas produzem um efeito maior de
toxidez, reduzindo o ganho de peso ao dobro, ficando em torno de 40% e afetam as aves
entre duas a três semanas de idade (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER,
2009). A ocratoxina A tem interação antagônica com o diacetoxiscirpenol (DAS) que é um
tricoteceno (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
Dependendo da dose de ocratoxina A ingerida a ave pode apresentar:
Se ingerir 2 a 4 ppm ganho de peso reduzido;
Se ingerir 4 ppm nefropatia tóxica;
Se ingerir 4 a 16 ppm moléstia aguda ,diarréia e morte
(CORRÊA, 2007).
5.5.1. Mecanismo de ação
A ocratoxina A atua no organismo dos frangos de corte produzindo degeneração
e alteração estruturais do epitélio tubular renal dos túbulos proximais, acúmulo de ácido
úrico nos rins, aumento ácido úrico sérico, aumento de triglicerídeos séricos, reduz a
síntese de proteínas hepáticas reduzindo a albumina e as proteínas totais, interfere no
metabolismo dos carboidratos (gliconeogenese), interfere nas atividades dos órgãos
linfóides e interfer nas respostas imunes do frango de corte (SANTIN, 2000; CORRÊA,
2007; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009;RAUBER,2009).
5.5.2. Toxicidade e sinais clínicos
A ocratoxina causa aumento do tamanho do rim, perda da cor do rim pelo
acúmulo de ácido úrico, aumento da fragilidade intestinal (WAREN, 1980; HAMILTON,
1980; MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009). Quando associada com a
ação do ácido ciclopiazônico (CPA) causa alteração do peso relativo do rim, alteração do
28
peso relativo do pâncreas, alteração do peso relativo do proventriculo e alteração da
bioquímica sérica (MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAU BER,2009).
Os sintomas que apresentam são redução do ganho peso nas primeiras três
semanas de vida, aumento da ingestão de água, tremores, perda de reflexos, problemas
locomotores, danos hepáticos, enterite, redução da pigmentação da pele (por apresentar
menor absorção de pigmentos carotenóides presentes nos alimentos), ou seja, síndrome da
ave pálida. Dificulta a coagulação sanguinea, diminui a defesa do organismo dos animais
contra infecções e causa teratogênese (SANTIN, 2000; CORRÊA, 2007; MALLMANN,
2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
5.5.3. Lesões pós-mortem
Rim pálido;
Rim com aumento relativo de tamanho
(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
Quando associadas às aflatoxinas, toxinaT2, ácido ciclopiazônico (CPA) e
fumonisinas apresentam:
Aumento relativo do tamanho do rim;
Rim pálido;
Aumento relativo do tamanho do pâncreas;
Aumento relativo do tamanho do proventriculo;
Aumento relativo do tamanho do fígado;
Redução do tamanho do baço
(MALLMANN, 2009; DILKIN, 2009; RAUBER, 2009).
6. DIAGNÓSTICO DAS MICOTOXICOSES
O diagnóstico se dá pela análise de micotoxinas presentes nos alimentos. Pode-
se chegar erroneamente à conclusão de que a intoxicação não seja por micotoxinas, por
confundirmos os sinais clínicos com os produzidos por outras doenças, deficiências de
manejo, deficiências nutricionais. Por apresentarem redução da eficiência reprodutiva,
diminuição da conversão alimentar, diminuição da taxa de crescimento e de ganho de peso.
Além de que as micotoxinas podem provocar imunodepressão e imunosupressão
permitindo o surgimento de processos infecciosos e parasitários, bem como falhas vacinais
(CORRÊA, 2007). O diagnóstico das micotoxicoses se baseia no achado da micotoxina no
alimento ou no conteúdo intestinal. O fator agravante é que o alimento já tenha sido
consumido e não se encontre disponível para teste (RUPLEY, 1999).
Devemos enviar ao laboratório:
Amostra de ração ou matéria- prima;
Aves vivas ou em gelo (resfriada);
Fragmentos de órgãos em formol (fígado, rim, coração, intestino, baço,
proventriculo)
(FÁBIO, 2009; ROSSINI, 2009).
7. MÉTODOS UTILIZADOS PARA DIAGNÓSTICO DE MICOTOXINAS
Na atualidade a detecção de micotoxinas é realizada pela análise de grãos,
farelos ou rações através da incidência de luz ultravioleta onde se detecta coloração
característica emitida pela toxina em caso de positividade da amostra, mas vários são os
métodos utilizados para detecção e quantificação de micotoxinas em alimentos ou rações
utilizando tecidos, leite, urina, soro, fezes e sangue.
Esses métodos são;
Radioimunoensaio;
Ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida (ELISA);
Cromatografia em camada delgada (CCD);
Cromatografia gasosa;
Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);
Espectometria de massa;
Nested PCR.
7.1. Radioimunoensaio(RIA)
O radioimunoensaio é um dos métodos mais sensíveis para análise quantitativa das
reações antígeno-anticorpo, permitindo medidas rápidas e precisas mesmo em preparações
não purificadas. Apresenta limiar de detecção da ordem de nanogramas ou picogramas. Como
limitações destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional. Os
radioimunoensaios utilizam anticorpos conjugados com radioisótopos para quantificar os
ensaios. E os radioisótopos utilizados são iodo 125 ou 131, cobalto, trítio. Há muitas
variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antígeno ou
anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não marcado da amostra.
7.1.1. Radioimunoensaio direto
No radioimunoensaio direto, uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a
um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado,
misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contém concentrações
31
conhecidas do antígeno não marcado. Após um período de incubação, remove-se o antígeno
não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.
A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por
interpolação na curva.
7.1.2. Radioimunoensaio de competição
No radioimunoensaio de competição uma quantidade fixa de antígeno é mobilizada
em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpos marcado específico
misturado com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações
variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação o anticorpo marcado que não se
ligou à fase sólida e o antígeno solúvel são removidos por lavagem e faz-se à medida da
radioatividade da fase sólida.
A partir da resposta obtida a concentração do antígeno em teste é estimada por
interpolação na curva.
7.1.3. Radioimunoensaio de captura
No radioimunoensaio de captura uma quantidade fixa de anticorpos é imobilizada
em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções
padrão, com concentrações conhecidas de antígenos são adicionadas. Após incubação
remove-se o antígeno não ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o
antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida.
A partir da resposta obtida a concentração do antígeno em teste é estimada por
interpolação na curva.
Devido à meia-vida dos reagentes utilizados, o risco operacional, a necessidade de
medidas especiais, de elevado custo de biosegurança e descarte de material levam aos
laboratórios optarem por técnicas que empreguem reagentes de maior estabilidade
(TESTONI, 2009).
32
7.2. Ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida (ELISA)
O ELISA ( Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay), ou ensaio imunoenzimático
em suporte sólido é uma técnica baseada no princípio da interação específica entre anticorpo e
antígeno (aflatoxinas) (ZHENG et al., 2006).
A metodologia apresenta dois passos:
O primeiro passo é a reação entre o anticorpo e o antígeno;
O segundo passo é a revelação da reação pela hidrólise enzimática, que ocorre entre o
complexo antígeno-enzima e o substrato (AMARAL, 2006; JÚNIOR, 2006).
O ELISA pode ser feito com anticorpos policlonais ou monoclonais, porém os
monoclonais são mais específicos e reduzem as chances de ocorrência de falsos-positivos
(MOTTA, 2010; DUARTE, 2010). Os anticorpos são extraídos de cobaias (camundongos,
coelhos, galinha, cavalo, etc.) que são induzidos a produzirem anticorpos mediante
inoculação do antígeno. O ELISA é utilizado para detectar aflatoxinas devido a sua
sensibilidade, especificidade, rapidez e facilidade de manuseio ( WHITAKER et al., 1994;
SCOTT, 1995; OLIVEIRA et al., 2000; WHO, 2001; ZHENG et al., 2006; AMARAL, 2006;
JÚNIOR, 2006). É também uma técnica de baixo custo e que não exige mão de obra
especializada (WHO, 2001; ZHENG et al., 2006; LÚCIO et al., 2007).
Atualmente, a recomendação feita é que resultados positivos do teste de ELISA devem ser
acompanhados de técnicas cromatográficas instrumentais mais específicas para devida
confirmação (MOTTA, 2010; DUARTE, 2010). Trata-se de um método eficiente, capaz de
detectar concentrações de aflatoxinas a partir de 2,5ppb (ZHENG et al., 2006). Porém, tem
como desvantagem a alta incidência de falsos-positivos, variabilidade de resultados de 30 a
300%, baixa reprodutibilidade e possibilidade de resultado falso-negativo (AMARAL, 2006;
JÚNIOR, 2006).
O ELISA pode ser:
ELISA de competição ;
ELISA não competitivo.
No ELISA de competição ou competitivo, a substância a ser analisada, nesse
caso a aflatoxina, aparece em concentrações variáveis dentro da amostra a ser analisada, e
ao ser colocada em contato com o anticorpo específico, compete com uma quantidade
constante de aflatoxina previamente imobilizada na fase sólida. A concentração do
anticorpo deve ser limitada para garantir a eficácia da competição.
33
No ELISA não competitivo o anticorpo reage proporcionalmente com a
quantidade de aflatoxina contida na amostra.
Para detecção (revelação) do anticorpo ligado a aflatoxina utiliza-se a técnica
direta ou a técnica indireta (MOTTA, 2010; DUARTE, 2010).
Na técnica direta, o anticorpo específico com um título constante é fixado sobre
a placa ou tubo de microtitulação. Em seguida, a solução de amostra e uma quantidade
conhecida constante de conjugado micotoxina-enzima são incubados simultaneamente.
Depois da lavagem, a micotoxina-enzima ligada à placa por intermédio do anticorpo é
revelada por junção de um substrato cromogêneo específico de enzima. A cor obtida é
medida por fotometria ou apreciada visualmente. A intensidade da cor é inversamente
proporcional à concentração de aflatoxina na amostra (ZHENG, 2006).
Na técnica indireta, a revelação ocorre através de um anticorpo conjugado a
uma enzima. A solução da amostra a ser analisada é incubada simultaneamente com uma
quantidade constante de anticorpo conjugado. Se houver aflatoxina na amostra ela irá
reagir com o anticorpo previamente fixado no fundo da cubeta e o segundo anticorpo se
ligará a esse complexo (anticorpo-aflatoxina) e formará outro complexo (anticorpo-
aflatoxina-segundo anticorpo-enzima). Após a lavagem é adicionada uma solução que
reagirá com o complexo tornando o meio colorido. A intensidade da cor é diretamente
proporcional a concentração de aflatoxinas na amostra. Quando adquirimos um kit de
ELISA , a microplaca ou cubeta já vem com antígenos aderidos à parede da mesma.
As enzimas mais utilizadas são a catalase, a glucose-oxidade, a galactosidade,
a fosfatase alcalina e a peroxidase (MOTTA, 2010; DUARTE, 2010). É o ensaio
imunoenzimático de absorção em fase sólida (ELISA) competitivo direto o mais utilizado.
Principalmente na detecção de aflatoxinas. Devido a sua praticidade, rapidez e custo
reduzido (WHO, 2001; AMARAL, 2006; JÚNIOR, 2006; ZHENG et al., 2006). Embora
possa resultar falso-positivos por sua sensibilidade para com os compostos interferentes
da matriz ou por ¨deficiente¨ especificidade dos anticorpos (VAN PETEGHEM, 1992),
pois muitas micotoxinas tem estruturas químicas estreitamente afins e por isso, existe a
posibilidade de reações cruzadas entre anticorpos produzidos para uma determinada
aflatoxina, contra outras micotoxinas que podem aparecer ao mesmo tempo, dentro do
mesmo grupo (LINO et al., 1998). Em alguns dos equipamentos comerciais para
aflatoxinas, pode acontecer que o anticorpo mostre uma certa reactividade cruzada com
outras aflatoxinas, o resultado positivo não é seletivo no que se refere à concentração das
aflatoxinas separadas (AMADO, 2001).
34
Porém apresenta como vantagens:
A sua sensibilidade;
A enorme quantidade de amostras que se pode manipular num dia, o que se traduz
em baixos custos por análise;
A necessidade de pequenas quantidades de anticorpos diluído, podendo usar-se a
mesma quantidade para um grande número de amostras (AMADO, 2001).
7.3. Cromatografia
7.3.1. Cromatografia em camada delgada (CCD)
Consiste na separação de misturas de compostos moleculares através da
migração diferencial dos mesmos entre duas fases: uma fixa (estacionária) e outra móvel,
que desliza sobre a primeira. Ou também pode ser expresso como um procedimento de
separação microanalítico no qual os componentes de uma mistura são transportados para
diferentes distâncias em uma placa recoberta com uma fina camada de material poroso. A
espessura da camada pode variar de 100 a 250 mm. A placa que serve de suporte em geral
é de vidro, mas pode ser de plástico ou de alumínio. A camada que recobre a placa recebe
o nome de fase estacionária e em geral é constituída de sílica gel. O mecanismo de
transporte é um solvente, e é conhecido como fase móvel. Primeiro a amostra é dissolvida
em um solvente adequado, então, uma certa alíquota desta solução é aplicada na região de
partida e o conjunto é seco. A placa de TLC/HTLPC é então colocada em uma câmara de
desenvolvimento ou cuba, a qual contém solvente. Se inicía o que chamamos de
desenvolvimento cromatográfico onde os componentes da amostra são influenciados pela
ação de duas forças, opostas entre si:
Capilaridade que é a responsável pelo avanço do solvente ou fase móvel sobre a
fase estacionária que contém a amostra.
Interação tão logo se inicia a migração da fase móvel, a amostra é dissolvida e
começa a ser arrastada pela fase móvel. Neste momento aparecem forças de
interação entre os componentes da amostra e a fase estacionária. Estas forças de
interação se opõem à força de arraste da fase móvel (capilaridade) retardando o
avanço dos componentes da amostra. Este retardo não ocorre da mesma forma para
diversos constituintes presentes na amostra aplicada. Forças de interação como
35
dipolo induzido, pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals tomam parte neste
processo, fazendo ocorrer mecanismos de separação como adsorção, dispersão e
troca iônica (ZANELLA, 2011).
7.3.2. Cromatografia gasosa (CG)
A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica com poder de resolução excelente,
possibilitando a análise de várias substâncias em uma amostra.
A fase estacionária da cromatografia gasosa é um material, líquido ou sólido, que
propicia a separação da mistura através de processos físicos e químicos. A fase estacionária
líquida, é um líquido pouco volátil, que recobre um suporte sólido, separando as substâncias
presentes na amostra através das diferenças de solubilidade e volatilidade. Como fase móvel
é utilizado um gás, denominado gás de arraste, que transporta a amostra através da coluna de
separação até o detector, onde os compostos separados são detectados.
Os gases mais utilizados são o hélio (He), hidrogênio (H), nitrogênio (N) e argônio
(Ar). Como o He é de difícil obtenção e de alto custo é pouco utilizado no Brasil.
A cromatografia gasosa é uma técnica utilizada na separação de substâncias ou
gases, sendo a fase estacionária de estado sólido ou líquido e a fase móvel, um gás. Mesmo
substâncias, que à temperatura ambiente se apresentem líquidas, podem ser utilizadas nesta
técnica se forem volatilizáveis, ou seja, possam ser transformadas em vapor com o aumento
de temperatura. Essas substâncias se transformam em vapor logo que injetadas no aparelho,
por ação de um vaporizador. Assim, ao serem injetadas amostras líquidas no cromatógrafo,
passarão pelo vaporizador, que as transformam em uma espécie de spray, este por sua vez irá
atravessar a coluna cromatográfica. Mas o vapor não consegue atravessar a coluna apenas
com a força exercida pelo injetor. A fase móvel (um gás de arraste, geralmente hidrogênio,
hélio ou argônio) irá ¨empurrar¨ à amostra vaporizada ao longo da coluna contendo à fase
estacionária de acordo com as propriedades dos componentes da amostra, alguns irão ser
retidos na fase estacionária por tempo maior que os outros. Enfim, de acordo com o tempo
que cada componente leva para atingir o final da coluna, poderá ser determinada sua afinidade
pela fase estacionária, facilitando a sua caracterização e identificação. É importante, que a
fase móvel (o gás) não reaja com a amostra ou com a fase estacionária, além de se apresentar
com alto grau de pureza, impedindo assim que interferentes reajam com a fase estacionária ou
amostra.A coluna cromatográfica fica inserida em um forno que a contém, utilizado na
manutenção da temperatura ótima para o desenvolvimento cromatográfico. É preferível que
36
esse forno apresente uma ampla faixa de temperatura para se utilizar (desde à temperatura
ambiente até cerca de 400°C ), esta temperatura não deve ser influenciada por outras partes do
equipamento, que seja alcançada rapidamente e que se mantenha homogênea, ou seja,
constante em toda à região do forno.
Ao se injetar à amostra, o vaporizador adquire certa temperatura para vaporização,
contudo, esta não deve ser alta demais para não decompor o material. O ideal seria 50° C
acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil.
A partir das análises realizadas pode se identificar os componentes após terem
atingido a saída da coluna. Isso é conseguido com o uso de um aparelho que irá registrar essa
saída, num detector. Tem uma Eletrônica de Tratamento (amplificação) de Sina e o
registrador ou computador que registra a Sina. De acordo com o tempo de arraste poderá se
determinar quais são as substância presentes na amostra.
7.3.3. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
É um método de separação de substâncias de certa amostra. A cromatografia
líquida antigamente era utilizada apenas com uma coluna de vidro sob ação da gravidade.
Atualmente se utiliza bombas para operações a altas pressões e detectores cada vez mais
sensíveis, além do material diferenciado. Isso faz com que essa técnica moderna seja
considerada de alta eficiência.
A amostra a ser analisada deve ser solúvel na fase móvel (líquida), interagindo
tanto com esta, quanto com a fase estacionária.
A Cromatografia Líquida de Fase Sólida (CLAE) se desenvolveu muito nos
últimos anos, recebendo o nome de cromatografia líquida por que sua fase móvel é um
solvente. Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba, coluna cromatográfica,
detector e o registrador. É um método utilizado para separação de espécies iônicas ou
macromoléculas e compostos termolábeis.
A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas características
impostas por esse método analítico. A principal característica é que a fase móvel dissolva à
amostra sem qualquer interação química entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza
ou ser de fácil purificação, para que se poça fazer análises de alta sensibilidade, pois as
impurezas podem interferir na detecção do analíto por ultravioleta (UV). A fase móvel deve
ser compatível com o detector empregado e, também possuir polaridade adequada para
37
permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. Embora existam vários
solventes, três deles são mais utilizados: água, metanol e acetonitrila.
Está técnica possui aplicabilidade extensa como: em pesquisas científicas, análises
químicas, testes de controle de qualidade de medicamentos e outros compostos, controle de
qualidade do ar e da água, entre outras. É uma técnica altamente sensível; de alta resolução,
mesmo se a amostra possuir misturas complexas de componentes e é um método rápido e
preciso.
7.4. Espectrometria de massa movida a gases
A amostra deve ser uma substância volátil de baixo peso molecular, que é colocada
num sistema de injeção, onde o injetor é super aquecido indo de 40°C até 700°C,
temperatura. Essa que explode à amostra, a qual é canalizada para um sistema de coluna
capilar de vidro recheada de sílica. Medindo este em torno de 30 m. É nesta coluna que ocorre
a separação dos constituintes da amostra, os quais entram no espectômetro onde se dá a
determinação de massa pelo tamanho da resposta que essa massa produz em relação a sua
quantidade. O resultado é registrado num computador. O diagnóstico é feito por ampliação
dos picos e comparação com as quase um milhão de substâncias identificadas com suas
respectivas massas nesse banco de dados. Identificando assim as substâncias presentes na
amostra (MALLMANN, 2011).
7.5. Nested PCR
É o método mais usado. Ocorre a duplicação da parte mais variável da micotoxina
e esse material é usado como primers para uma segunda amplificação e assim garantindo uma
melhor detecção. A limitação existente é que para a micotoxinas de influência nos frangos de
corte apenas temos até o momento primers para amplificação de aflatoxinas e tricotecenos
(FUNGARO, 2011).
7.6. Kits para análise de micotoxinas
7.6.1. Aflcheeck
Este método baseia-se nas duas principais fases de procedimento analítico:
38
A extração /clean-up e a quantificação.
Na fase de extração /clean-up emprega-se as colunas de imunoafinidade, que são
cartuchos recheados de anticorpos monoclonais específicos para cada uma das principais
micotoxinas de interesse em saúde pública: aflatoxinas (B,G e M), DON (ou vomitoxina),
fumonisinas, ocratoxina A e zearalenona. O emprego dos anticorpos garante uma extração
mais específica, prática e rápida. O eluato obtido da coluna de imunoafinidade pode ser
quantificado por métodos cromatográficos ou por fluorimetria. Para fase de quantificação,
usa-se o fluorímetro série-4, que é um equipamento capaz de quantificar as micotoxinas do
eluato entre 1 e 5 minutos, fornecendo os resultados impressos em ppb ou ppm.
7.6.2. Afla Teste-P
Rápido. Menos de 10 minutos para prova (excluído a preparação da amostra).
Sensível, pois detecta níveis tão baixos como 0,1 ppb em CLAE (HPLC) e 1,0 ppb
em fluorímetro.
Amplo alcance, ou seja, pode medir até 300 ppb.
Conveniente, pois se utiliza o mesmo extrato e instrumento para análise de outras
micotoxinas.
Simples, pois não requer técnica especial, à prova pode ser realizada praticamente
qualquer instalação.
Seguro, pois requer menos materiais tóxicos que os métodos convencionais.
Não requer armazenagem especial, podendo ficar em temperatura ambiente até 30°C.
Tem vida média de 18 meses.
Pode ser usado com uma variedade de amostras.
Resultados numéricos precisos.
Metodologia:
Extração da amostra
Moer e pesar à amostra.
Misturar com sal e uma mistura de metanol com água.
Filtrar.
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Diluição e filtração
Passar o filtrado pela coluna de afinidade Afla Teste-P.
Passar água através da coluna.
Eluir as aflatoxinas da coluna com metanol e recolher em um tubo.
Quantificação
Ler as aflatoxinas em fluorímetro, CLAE (CHPL) ou CCD, sendo os resultados em
ppb.
7.6.3. Afla Test-B
Rápido, ou seja, leva-se menos de 10 minutos para sua realização (excluindo a
preparação da amostra).
Sensível, pois detecta níveis tão baixos como 1 ppb em fluorímetro e de 0,1 ppb em
sistema de CLAE (HPLC).
Tem amplo alcance, podendo medir até 300 ppb.
Conveniente, pois se utiliza o mesmo extrato e instrumento para análise de outras
micotoxinas.
Recuperação superior a 85%.
Seguro, pois requer menos materiais tóxicos que os métodos convencionais.
Não requer armazenagem especial, podendo ficar em temperatura ambiente até 30°C.
Tem vida média de 1 ano.
Pode ser usado com variedade de amostras.
Resultados numéricos precisos.
Usando o Afla Test-B as aflatoxinas B1 e B2 podem ser isoladas, e B1 pode ser
quantificada individualmente por CLAE (HPLC). Com o sistema de medidas por fluorímetria,
o total de B1 e B2 é relatado. Sabe-se que B1 é responsável por 755 do total de B1 e B2
medidos. Os resultados podem ser registrados em fluirímetro digital, em impressora
automática, em CLAE (HPLC) ou por análise em TLC.
40
7.6.4. Afla Test-WB
Rápido, menos de 10 minutos (excluindo a preparação da amostra).
Sensível, pois detecta em sistema CLAE (HPLC) níveis tão baixos quanto 0,03;
0,05; 0,05 e 0,11 ppb para as aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, respectivamente.
Armazenagem 30°C.
Vida média de 1 ano.
7.6.5. DON Test HPLC
Rápido.
Sensível, pois detecta níveis até de 0,1 ppm.
Amplo alcance até 10 ppm.
Armazenagem até 30°C.
Vida média de 1 ano.
Metodologia:
Extração da amostra
Moer e pesar a amostra.
Misturar a amostra com PEG/água.
Filtrar.
Cromatografia de afinidade
Passe uma porção do filtrado através da coluna de afinidade DON Test HPLC.
Lave a coluna com água.
Recupere a DON da coluna com metanol e colete em uma cubeta.
Quantificação
Evapore o metanol do eluato.
Ressuspenda na fase móvel adequada.
Injete em HPLC com detector UV.
Determine a concentração de DON pelo cromatograma.
41
7.6.6. DONCheck
Teste qualitativo para detecção da micotoxina desoxinivalenol (DON).
Resultado em 3 minutos.
Detecta DON acima de 1 ppm.
Podendo ser usado em qualquer lugar.
Longo prazo de validade.
Não requer refrigeração.
Pode ser utilizado em vários tipos de amostra.
7.6.7. FumoniTest/FumoniTest WB
Menos de 15 minutos para a prova (excluindo-se a preparação da amostra).
Detecta níveis tão baixos como 0,25 ppm em fluorímetro e 0.016 ppm em sistema
CLAE (HPLC).
Amplo alcance podendo medir níveis tão alto como 10 ppm.
Vida média de 1 ano.
Resultados numéricos precisos.
Metodologia:
Extração de amostra
Moer e pesar uma amostra de 50g.
Misturar a amostra com 5g de sal e 100 ml de uma mistura de metanol e água destilada
a 80%.
Filtrar.
Diluição e filtração
Diluir uma alíquota do extrato da amostra.
Filtrar.
Cromatografia de afinidade
42
Passar o filtrado pela coluna de afinidade Fumoni Test.
Lavar a coluna com buffer para lavado e água destilada.
Eluir as fumonisinas da coluna com 1ml de metanol e recolher em um tubo fluorimé-
trico.
Quantificação
Derivatizar as fumonisinas com o 0-ftaldiadeído (OPA) e 2-mercaptoetanol.
Colocar o tubo fluorimétrico em um fluorímetro calibrado, ou injetar direto em CLAE
(HPLC).
Ler os resultados.
7.6.8. Fumoni Test 200
Detecta níveis baixos de 0,50 ppm no fluorímetro.
Metodologia:
Extração da amostra
Como do Fumoni Test
Diluição e filtração
Como no Fumoni Test
Cromatografia de afinidade
Passar uma parte do filtrado pela coluna de afinidade Fumoni Test 200.
Lavar a coluna.
Eluir as fumonisinas da coluna com metanol e recolher em uma cubeta.
Quantificação
Adicionar revelador à cubeta e eftuar a medição em um fluorímetro calibrado. Ler os
resultados em PPM.
43
7.6.9. Ochra Test
Rápido. 10minutos (excluindo a preparação da amostra).
Sensível, pois detecta níveis tão baixos como 1 ppb no fluorímetro e 0,25 ppb em
sistema CLAE (HPLC).
Amplo alcance, pois mede nível tão alto quanto 100 ppb.
Não precisa mão de obra especializada.
Armazenagem em até 30°C.
Vida média de 1 ano.
Resultados numéricos precisos.
Metodologia:
Extração da amostra
Moer e pesar a amostra.
Misturar a amostra com sal e uma mistura de metanol e água.
Filtrar.
Diluição e filtração
Diluir uma alíquota do extrato da amostra com água.
Filtrar.
Cromatografia de afinidade
Passar parte do filtrado por uma coluna de afinidade Ochra Test.
Lavara coluna com diluente e depois com água.
Eluir as ochratoxinas da coluna com solução de hidróxido de sódio (fluorímetro) ou
metanol (HPLC) e recolher em um tubo fluorimétrico.
Quantificação
Colocar um tubo no fluorímetro calibrado ou injetar o extrato num HPLC.
Ler os resultados em ppb.
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7.6.10. Ochra Test WB
Semelhante ao Ochra Test, só que sua eluição é apenas com metanol e sua
quantificação é apenas no HPLC.
7.6.11. AOZ HPLV
Rápido, 15 minutos.
Sensível, pois detecta níveis médios de aflatoxinas tão baixos quanto 0,01
microgramas por Kg; 0,25 microgramas por Kg para OTA e 5,0 microgramas por Kg
para zearalenona.
Amplo alcance, pois pode alcançar níveis de 100 microgramas por Kg para aflatoxinas
e OTA, e 1000 microgramas por Kg par zearalenona.
Índice de recuperação maiores que 85%.
Vida média de 1 ano.
Resultados numéricos precisos.
AOZ HPLC emprega uma única coluna simultâneamente para isolamento de
aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, OTA e zearalenona. Usando uma coluna de imunoafinidade
monoclonal e um HPLC. Esta prova produz resultados numéricos precisos em microgramas
por quilograma (Kg) ou partes por bilhão ( ppb).
Metodologia:
Extração da amostra
Moer e pesar a amostra.
Misturar com solução de metanol/água.
Filtrar.
Diluição e filtração
Diluir uma alíquota do extrato com PBS/Tween.
Filtrar.
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Cromatografia de afinidade
Passar uma parte do extrato pela coluna de afinidade AOZ HPLC.
Lavar a coluna com PBS/Tween.
Lavar a coluna com água.
Eluir as aflatoxinas, ochratoxinas A e zearalenona da colunha com metanol.
Quantificação
Injetar o eluato em sistema CLAE (HPLC).
Determinar as concentrações das aflatoxinas, ochratoxina A e zearalenona.
AOZ HPLC
Leitura somente em HPLC.
Não exige armazenamento especial, nem refrigeração.
Leitura do total de aflatoxinas B1, B2, G1, G2, ochratoxina A e zearlenona.
Tem uma vida longa de prateleira.
Não afetado por calor e umidade até 30°C.
Pode ser usado com uma variedade de amostras incluindo: arroz, cevada, milho,
centeio, trigo e rações.
7.6.12. AflaOchra HPLC
Rápido, pois amostra fica pronta em menos de 10 minutos para análise em CLAE
(HPLC); excluindo a preparação da amostra.
Sensível, pois detecta níveis tão baixos como 0,25 ppb em CLAE (HPLC).
Amplo alcance, pois pode medir níveis tão altos como 100 ppm.
Recuperação maior que 70%.
Pode ficar à temperatura ambiente até 30°C.
Vida média de 1 ano.
Leitura total para os quatro tipos de aflatoxinas: B1, B2, G1, G2, e ochratoxina A e
seus estereoisomeros.
Resultados numéricos precisos.
Metodologia:
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Extração da amostra
Moer e pesar a amostra.
Misturar com sal e uma mistura de metanol com água.
Filtrar.
Diluição e filtração
Diluir uma alíquota do extrato da amostra com água.
Filtrar.
Cromatografia de afinidade
Passar o filtrado pela coluna de afinidade AflaOchra HPLC.
Lavar a coluna com água.
Eluir as aflatoxinas e ochratoxinas da coluna com metanol e recolher em tubo.
Quantificação
Injetar o eluato em CLAE (HPLC) e determinar a concentração de aflatoxina.
Injetar o eluato em CLAE (HPLC) e determinar a concentração de ochrtoxina A.
Após isolar as micotoxinas nas colunas de afinidade precisamos colocar as
amostras no fluorímetro para fazer a leitura por fluorescência em ppm ou ppb. Que é simples
de operar. Com um toque de um botão, identificamos a micotoxina a ser medida. O resultado
é impresso numa impressora integrada. De forma simples e eficiente, o flourímetro é capaz de
medir os níveis totais de micotoxinas em amostras preparadas usando as colunas de afinidade.
Une rapidez, sensibilidade e simplicidade de operação. Por conter um relógio interno,
monitora o tempo de sua última calibração e o alerta quando é necessária nova calibração.
Possui visor de electroluminiscência para guiar-nos na leitura. Pode ser usado a campo.
8. MANEJO PROFILÁTICO COM OS GRÃOS
Realizar a colheita, tão logo seja atingido o teor de umidade, que permita proceder a
operação.
Ajustar os equipamentos de colheita para proceder à máxima limpeza da massa dos
grãos e evitar danos mecânicos.
Desinfetar as instalações e os equipamentos de colheita. Limpar os silos e graneleiros
removendo pó, lixo e outros materiais.
Proceder de forma correta às operações de pré-limpeza e limpeza removendo impu-
rezas, grãos danificados, finos e materiais estranhos. Pois estes podem ser utilizados
como substrato no desenvolvimento dos fungos.
Proceder à operação de secagem de forma correta garantindo a redução e
uniformidade do teor de umidade a níveis que não permitam o desenvolvimento dos
fungos.
Monitorar a temperatura da massa de grãos e aerar sempre que necessário, para
uniformizar a temperatura.
Adotar técnicas para o controle de insetos e roedores, pois geralmente a proliferação
dos fungos está associada ao ataque dessas pragas.
Devemos considerar que as micotoxinas são termo estáveis, por isso são mais fáceis
de combatê-las do que os fungos que as produzem, uma vez, que ele se encontram em
abundância no ambiente.
Devemos usar plantas resistentes a colonização fúngica.
Tempo de estocagem dentro do limite de vitalidade dos grãos.
Irradiação dos grãos se necessário com radiação gama.
Uso de adsorventes de micotoxinas a base de aluminosilicatos de cálcio ou sódio,
bentonitas sódicas nas rações, que se unem a micotoxina e a impossibilita de ser
absorvida pelo tratogastrointestinal. E o uso de adsorventes mistos derivados de
saccharomyces cerevisae, zeolitas, que adicionados de enzimas como epoxidases e
lactonases, degradam as micotoxinas (SANTURIO, 1995; DAWEGOWDA et al.1998;
FREITAS, 2007).
Uso de certos polissacarídeos como adsorventes, os quais reduzem significativa-
mente a biodisponibilidade de muitas micotoxinas (DAWSON, 2004; FREITAS, 2007).
48
Degradação química, ou seja, uso de amônia gasosa sob elevadas temperaturas e
pressão, buscando detoxificar os grãos.
Degradação biológica, ou seja, utilização de bactéria flavumbacterium aurantiacum
que age removendo totalmente as aflatoxinas do milho.
Tratamento térmico. As aflatoxinas podem ser degradadas a certa porcentagem pelo
calor. A degradação é maior em ambiente úmido.
Remoção seletiva, que é a seleção eletrônica ou manual, que separa os grãos cujas
características estejam relacionadas à maior contaminação por aflatoxinas, como os
grãos descoloridos de amendoim. Mesas gravitacionais que separam os grãos mais
leves (contaminados).
Utilização de ácidos orgânicos (ácido propiônico e seus derivados os propionatos,
ácido acético, ácido sórbico e ácido benzóico) e seus sais de cálcio, sódio e potássio
(FREITAS, 2007; CORRÊA, 2007; SILVA, 2010).
A simples presença ou detecção das micotoxinas na ração de aves não determina
que ocorrerá intoxicação. A dose tóxica está relacionada com o grau de sensibilidade das aves
e com seu grau de conforto, como é o caso da aflatoxicose, ou seja, menos estresse suporta
níveis mais elevados de aflatoxinas (SANTURIO, 2000). A melhor maneira de controlar a
contaminação de micotoxinas nos alimentos é controlando o crescimento dos fungos. Até o
momento, os adsorventes existentes não tem capacidade de adsorver todas as micotoxinas e
nenhum adsorvente tem capacidade de adsorver micotoxinas de maneira significativa, quando
colocado diretamente sobre os grãos em silos, pois a adsorção ocorre em meio líquido
(FREITAS, 2007).
9. CONCLUSÃO
Devido à presença de micotoxinas nos grãos e em conseqüência nos farelos e rações
ser uma realidade brasileira, faz-se, necessário, alternativa, para controlar, se possível evitar, a
sua presença nos farelos e grãos de maneira mais precisa e a baixo custo. Pois a presença de
micotoxinas impede exportações e deixa para o mercado interno um produto, que irá compro-
meter a produção, o ganho dos produtores, a saúde dos animais e do homem. Por isso é
importante, que se realizem monitorias de qualidade em relação às condições de estressse dos
animais, adquirir grãos mais resistentes ao crescimento fúngico, armazenar e manejar os silos
adequadamente, usar inibidores ao crescimento fúngico (quando necessário e viável eco-
nomicamente) e realizar análises clínicas precisas. O que não era possível até os anos 80.
Segundo BERGERE, 1991 devido as micotoxinas serem haptenos, o que significa que não
são imunógenas, tendo que conjugar-se com uma proteína antes de ocorrer a imunização ,
para obter-se o antisoro. E estas conjugações podem complicar-se, porque a maioria das
micotoxinas não tem um grupo reactivo adequado na molécula, para se unirem à proteína
suporte. Por isso faz-se necessário maiores estudo sobre as micotoxinas, sua sintomatologia,
detecção e prevenção.
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