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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LABORATÓRIO MULTIDISCIPLINAR DE PESQUISA
Capacidade antioxidante in vitro e avaliação da toxicidade
aguda in vivo de extratos de folhas de Licania rigida Benth.,
Licania tomentosa (Benth.) Fritsch e Couepia impressa Prance
(Chrysobalanaceae)
JOSÉ BENILSON MARTINS MACÊDO
NATAL/RN2011
JOSÉ BENILSON MARTINS MACÊDO
Capacidade antioxidante in vitro e avaliação da toxicidade
aguda in vivo de extratos de folhas de Licania rigida Benth.,
Licania tomentosa (Benth.) Fritsch e Couepia impressa Prance
(Chrysobalanaceae)
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas como requisito para a obtenção do Grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profª Drª Maria das Graças Almeida Coorientador: Prof. Dr. Jorge Alberto López Rodríguez
NATAL/RN2011
CATALOGAÇÃO NA FONTE
M141c Macêdo, José Benilson Martins.
Capacidade antioxidante in vitro e avaliação da toxicidade aguda in vivo de extratos de folhas de Licania rigida Benth., Licania tomentosa (Benth.) Fritsch e Couepia impressa Prance (Chrysobalanaceae) / José Benilson Martins Macêdo. Natal, 2011.
104f. Orientadora: Profª. Drª. Maria das Graças Almeida. Dissertação (Mestrado) Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. Plantas medicinais Dissertação. 2. Licania rigida Capacidade antioxidante Dissertação. 4. Licania tomentosa Dissertação. I. Almeida, Maria das Graças. II. Título.
RN-UF/BS-CCS CDU: 615.89 (043.3)
O importante não é o ponto onde vos encontrais, mas sim a direção em que caminhais com os vossos passos e a vida que vos propondes seguir. O ambiente que vos rodeia, o ponto de onde partistes e o trecho do caminho já percorrido, não são tão importantes como atitude mental com que vos resolveis continuar a marchar e o rumo que haveis de dar.
Oliver Wendell Holmes (1809-1894)
Dedico aos meus pais, Benedito Avelino de Macedo (in memorian) e Terezinha Martins de Macedo, pelo exemplo, amor e apoio incondicional.
AGRADECIMENTOS
A Deus, porque tudo o que existe existe em Deus, e sem Deus nada pode existir nem ser concebido. À Profª Drª Maria das Graças Almeida, pela orientação e pelo incentivo e exemplo de profissionalismo. Ao Prof. Dr. Jorge Alberto López Rodríguez, Curso de Biotecnologia, Centro de Ciências Biológicas e de saúde, Pontifícia Universidade Católica do Paraná – PUCPR, pela coorientação, atenção e visão globalizada da pesquisa científica. À coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – UFRN, na pessoa da Profª Drª Adriana Augusto de Rezende, pela importância da ética e seriedade na pesquisa. Ao Centro de Ciências da Saúde (CCS) – UFRN, na pessoa do Dr. Juarez Ferreira da Costa, pelo apoio ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – UFRN. Ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas – UFRN, na pessoa da Profª Drª Telma Maria Araújo Moura Lemos, pelo apoio. Aos laboratórios da Faculdade de Farmácia da UFRN: Laboratório de Toxicologia, Laboratório de Farmacognosia, Laboratório de Sistema Disperso e Laboratório de Hematologia. À Profª Drª Maria Iracema Bezerra Loiola, Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia da UFRN, pela presteza na identificação botânica. Aos professores, Prof. Dr.Carlos Roberto Oliveira Souto e Profª Drª Maria de Fátima Vitória de Moura, Departamento de Química da UFRN, pela ajuda e disponibilidade de seus laboratórios. À Profª Renata Mendonça Araújo, Departamento de Química da UFRN e ao Prof. Edilberto Rocha Silveira, Centro Nordestino de Aplicação e Uso da RMN, Laboratório de Fitoquímica de Plantas Medicinais, Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Centro de Ciências da UFCE, pelo fracionamento dos extratos e análise por RMN. Às amigas e companheiras Maria Aparecida do Nascimento, Naira Josele Neves de Brito e Elizabeth Cristina Gomes dos Santos, pelo carinho e dedicação incansável na realização deste trabalho. Ao amigo Gabriel Araujo Silva, pela ajuda nos ensaios de sequestro do radical DPPH das frações e de toxicidade aguda.
Aos alunos de iniciação científica, Luciane de Lira Teixeira, Hugo Thiago de Holanda Oliveira, Maria Larissa Pereira da Costa e Taiza Nayara da Silva Caridade, pela amizade e, sobretudo, pela grande ajuda na realização deste trabalho. Aos funcionários do Biotério Central do CCS, Ana Auxiliadora Fernandes de Vieira e Washington Fernandes da Rocha, pela amizade e pelos cuidados especiais dispensados aos animais. Às funcionárias da Secretaria da Pós-Graduação, Maria Aureliana do Nascimento e Fábia Cristina de Miranda de Araújo Freire, pela constante atenção e presteza. À minha irmã Maria Josenilda Martins de Macedo Bruno, ao meu cunhado Joilson Mendes Bruno e à minha adorável sobrinha Camila Martins Bruno, pelas preces que me fortalecem. Ao meu irmão, Jailson Martins de Macedo, pelo incentivo e apoio incondicional. Aos meus primos, Simone Martins Félix pela ajuda nas dúvidas em informática e Sílvio Martins Félix na formatação do texto. Às amigas de trabalho, Esúlia Maria Farias de Lima, Fanny Cassandra da Silva, Iracilda Maciel de Medeiros, Jacione Arcanjo de Paiva, Lúcia de Fátima Cavalcanti, Maria Marques Silva da Câmara e todas as pessoas do Laboratório de Análises Clínicas da Unidade Mista de Felipe Camarão – Secretaria Municipal de Natal, pela amizade e a força que sempre me dispensaram. Enfim, a todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho. Com eles divido a alegria desta conquista.
RESUMO
Licania rigida Benth., Licania tomentosa (Benth.) Fritsch, e Couepia impressa
Prance (família Chrysobalanaceae) são plantas utilizadas pela medicina
popular do Nordeste do Brasil, sob a forma de extratos e infusões para o
tratamento do diabetes e reumatismo, doenças degenerativas com
envolvimento de espécies reativas de oxigênio (ERO). O objetivo deste estudo
foi avaliar a capacidade antioxidante dos extratos aquoso, etanólico e
hidroetanólico das folhas dessas espécies, utilizando vários sistemas de ensaio
in vitro (poder redutor, capacidade de sequestro do DPPH●, o sistema β-
caroteno/ácido linoleico e a inibição da peroxidação lipídica em homogenato de
cérebro de ratos, utilizando as substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico -
SRAT). A toxicidade oral aguda dos extratos aquosos também foi avaliada in
vivo. Os resultados revelaram extratos com alto poder redutor, capacidade de
sequestro do DPPH● e de proteção no sitema β-caroteno/ácido linoleico, bem
como a capacidade de impedir a formação de SRAT em homogenato de
cérebro de ratos, de maneira concentração-dependente. Quanto à toxicidade
oral aguda in vivo dos extratos aquosos, nenhum efeito tóxico foi observado em
relação às avaliações fisiológica, hematológica e bioquímica. A presença de
elevado teor de compostos fenólicos e flavonoides foi determinada
principalmente no extrato etanólico. Entretanto, o extrato hidroetanólico de C.
impressa, fracionado com hexano, clorofórmio e acetato de etila para a análise
por RMN 1H, mostrou resultados mais eficientes do que o antioxidante de
referência Carduus marianus. As classes de compostos orgânicos
determinados foram fenólicos na fração acetato de etila e terpenos nas frações
hexânica e clorofórmica. A fração acetato de etila apresentou o maior teor de
flavonoides e maior capacidade de sequestro do DPPH●, possivelmente pela
presença de compostos fenólicos. Portanto, uma detalhada investigação da
composição fitoquímica e estudo in vivo do extrato hidroetanólico de C.
impressa é sugerida para caracterizar os compostos ativos da espécie.
Palavras-chave: Licania rigida, Licania tomentosa, Couepia impressa,
compostos fenólicos, flavonoides, capacidade antioxidante.
ABSTRACT
Licania rigida Benth., Licania tomentosa (Benth.) Fritsch, and Couepia impressa
Prance (Chrysobalanaceae family) plants have long been used medicinally by
the people from Northeastern Brazil. Crude extracts and infusions of these
plants have been applied in the treatment of several conditions such as
diabetes and rheumatism, degenerative diseases with involvement of reactive
oxygen species (ROS). The aim of this study was to evaluate the aqueous,
ethanolic, and hydroethanolic leaves extracts antioxidant capacity of these
species, using several in vitro assay systems (reducing power, DPPH●
scavenging, the β-carotene linoleate model system and lipid peroxidation
inhibition in rat brain homogenate, using thiobarbituric acid reactive substances
- TBARS). The oral acute toxicity of aqueous extracts was also evaluated in
vivo. Results revealed that these extracts possess a potent reducing power and
DPPH scavenging ability, as well as the ability to prevent TBARS formation in
rat brain homogenate in a concentration-dependent manner. Regarding in vivo
oral acute toxicity of the aqueous species extracts, no toxic effects were
observed upon evaluating physiological, hematological and biochemical
parameters. The presence of high levels of phenolics and flavonoids was
determined mainly in the ethanol extract. However, the C. impressa
hydroethanolic extract, fractionated with hexane, chloroform and ethyl acetate
for analysis by NMR 1H, showed more efficient results than the reference
antioxidant Carduus marianus. The classes of organics compounds were
determined were phenolics in the fraction of ethyl acetate and terpenes in
chloroform and hexane fractions. The ethil acetate fraction had the highest
content of flavonoids and increased scavenging capacity of DPPH●, possibly by
the presence of phenolic compounds. Therefore, a detailed investigation of the
phytochemical composition and in vivo study of the C. impressa hydroethanolic
extract is suggested to characterize the active compounds of the species.
Keyswords: Licania rigida, Licania tomentosa, Couepia impressa, phenolic
compounds, flavonoids, antioxidant capacity.
LISTA DE ABREVIATURAS
CAT Catalase
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CDCl3 Clorofórmio Deuterado
δ Deslocamento Químico
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DPPH● Radical Livre DPPH
DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil
DPPH-H 1,1-difenil-2-picrilhidrazina
DP Desvio Padrão
ERO Espécies Reativas de Oxigênio
ERN Espécies Reativas de Nitrogênio
FA Fração Acetato de Etila
FC Fração Clorofórmica
FH Fração Hexânica
fOH Antioxidante Fenólico
fO• Radical Semiquinona
GSH Glutationa Reduzida
GSSG Glutationa Oxidada
GPx Glutationa Peroxidase
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
HOO• Radical Hidroperoxil
L• Radical Alquil Lipídico
LH Ácidos Graxos Poliinsaturados
LOO• Radical Peroxil Lipídico
LOOH Hidroperóxido Lipídico
MDA Malonildialdeído
MeOD Metanol Deuterado
MHz Megahetz
NO Óxido Nítrico 1O2 Oxigênio Singlet
O2•¯ Radical Ânion Superóxido
•OH Radical Hidroxil
ppm Partes por Milhão
rf Rádio Frequência
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
ROO• Radical Peroxil
SOD Superóxido-dismutase
SRAT Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
SRL Sequestro de Radical Livre
T Tesla
TBA “Thiobarbituric acid” (Ácido Tiobarbitúrico)
TCA “Trichloroacetic acid” (Ácido Tricloroacético)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema da peroxidação lipídica, resultando na formação
em cadeia de inúmeros radicais lipídicos .................................... 26
Figura 2 – Estrutura básica dos flavonoides e de diferentes subgrupos
de flavonoides ................................................................................ 29
Figura 3 – Distribuição geográfica da família Chrysobalanaceae na
Mata Atlântica ................................................................................. 31
Figura 4 – Licania rigida. Detalhes de folhas (A), flores (B) e frutos (C) .... 33
Figura 5 – Licania tomentosa. Detalhes de flores (A) e frutos e folhas
(B) ................................................................................................... 34
Figura 6 – Couepia impressa. Detalhes de folhas e flores (A) e frutos
(B) ................................................................................................... 35
Figura 7 – Exsicatas das espécies estudadas, depositadas no Herbário
do Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) .............. 45
Figura 8 – Esquema para a detecção de substâncias químicas com
capacidade antioxidante................................................................ 48
Figura 9 – Fluxograma da determinação do teor de fenólicos totais .......... 49
Figura 10 – Fluxograma da determinação do teor de flavonoides totais ...... 50
Figura 11 – Fluxograma da inibição da oxidação no sistema β-
caroteno/ácido linoleico ................................................................ 53
Figura 12 – Fluxograma da determinação da peroxidação lipídica em
cérebro de rato ............................................................................... 55
Figura 13 – Detecção de substâncias antioxidantes reveladas com
solução β-caroteno ........................................................................ 59
Figura 14 – Detecção de substâncias fenólicas reveladas com solução
de ferricianeto de potássio/ cloreto férrico .................................. 60
Figura 15 – Detecção de substâncias redutoras reveladas com solução
de nitrato de prata amoniacal ....................................................... 60
Figura 16 – Curva de calibração da catequina para determinar o
conteúdo de substâncias fenólicas .............................................. 61
Figura 17 – Curva de calibração da quercetina para determinar o
conteúdo de flavonoides ............................................................... 63
Figura 18 – Capacidade de redução do ferro (Fe3+) pelos extratos
aquoso, etanólico e hidroetanólico de L. rigida. ......................... 64
Figura 19 – Capacidade de redução do ferro (Fe3+) pelos extratos
aquoso, etanólico e hidroetanólico de L. tomentosa .................. 65
Figura 20 – Capacidade de redução do ferro (Fe3+) pelos extratos
aquoso, etanólico e hidroetanólico de C. impressa .................... 66
Figura 21 – Capacidade de sequestro do DPPH pelos extratos aquoso,
etanólico e hidroetanólico de L. rigida ......................................... 67
Figura 22 – Capacidade de sequestro do DPPH pelos extratos aquoso,
etanólico e hidroetanólico de L. tomentosa ................................ 67
Figura 23 – Capacidade de sequestro do DPPH pelos extratos aquoso,
etanólico e hidroetanólico de C.impressa ................................... 68
Figura 24 – Inibição da oxidação no sistema β-Caroteno/ácido linoleico
pelos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de L.
rigida ............................................................................................... 70
Figura 25 – Inibição da oxidação no sistema β-Caroteno/ácido Linoleico
pelos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de L.
tomentosa ....................................................................................... 70
Figura 26 – Inibição da oxidação no sistema β-Caroteno/ácido Linoleico
pelos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de
C.impressa ...................................................................................... 71
Figura 27 – Inibição da produção de SRAT pelos extratos aquoso,
etanólico e hidroetanólico de L. rigida ......................................... 73
Figura 28 – Inibição da produção de SRAT pelos extratos aquoso,
etanólico e hidroetanólico de L. tomentosa. ............................... 74
Figura 29 – Inibição da produção de SRAT pelos extratos aquoso,
etanólico e hidroetanólico de C.impressa. .................................. 74
Figura 30 – Capacidade de sequestro do DPPH pelas frações hexânica,
clorofórmica e acetato de etila do extrato hidroetanólico de
C.impressa ...................................................................................... 76
Figura 31 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, MeOD/CDCl3) da FH ................... 78
Figura 32 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, MeOD/CDCl3) da FC ................... 79
Figura 33 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, MeOD/CDCl3) da FA,
destacando-se a região referente aos hidrogênios
aromáticos. ..................................................................................... 81
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Endemismos da família Chrysobalanaceae na Mata Atlântica. ...... 31
Tabela 2 – Teor de fenólicos totais nos extratos das espécies analisadas ..... 61
Tabela 3 – Teor de flavonoides totais nos extratos brutos analisados ............ 63
Tabela 4 – Teor de flavonoides totais nas frações hexânica, clorofórmica e
acetato de etila do extrato hidroetanólico de C. impressa ............. 75
Tabela 5 – Resultados do consumo de ração e água e peso dos animais ....... 82
Tabela 6 – Resultados dos parâmetros hematológicos ..................................... 84
Tabela 7 – Resultados dos parâmetros bioquímicos ......................................... 86
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 – Moléculas isoladas de algumas espécies da família
Chrysobalanaceae. ........................................................................ 38
QUADRO 2 – Parâmetros utilizados para avaliar alguns aspectos de
toxicidade dos extratos das plantas em estudo nos animais
tratados. .......................................................................................... 56
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 19
2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 23
2.1 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO .......................................................... 24
2.2 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA ............................................................................. 25
2.3 SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE .................................................... 26
2.4 ANTIOXIDANTES NATURAIS ....................................................................... 28
2.5 FAMÍLIA CHRYSOBALANACEAE ................................................................. 30
2.5.1 Licania rigida Benth. .......................................................................... 32
2.5.2 Licania tomentosa (Benth.) Fritsch ................................................... 33
2.5.3 Couepia impressa Prance .................................................................. 34
2.6 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FAMÍLIA CHRYSOBALANACEAE ................. 36
2.7 ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DA FAMÍLIA CHRYSOBALANACEAE ....... 39
2.8 ESTUDO DA TOXICIDADE ........................................................................... 39
2.8.1 Toxicidade aguda ............................................................................... 40
3. OBJETIVOS ................................................................................................... 41
3.1. GERAL .......................................................................................................... 42
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 42
4 METODOLOGIA .................................................................................................. 43
4.1 REAGENTES QUÍMICOS .............................................................................. 44
4.2 MATERIAL VEGETAL ................................................................................... 44
4.2.1 Obtenção dos extratos ....................................................................... 44
4.2.2 Fracionamento por partição líquido/líquido do extrato
hidroetanólico de C. impressa .......................................................... 45
4.3 ANIMAIS ........................................................................................................ 46
4.3.1 Coleta de material ............................................................................... 46
4.3.2 Preparação do homogenato de cérebro de rato .............................. 46
4.4 DETECÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS COM CAPACIDADE
ANTIOXIDANTE ........................................................................................... 47
4.4.1 Cromatografia em Camada Delgada ................................................. 47
4.4.2 Determinação do teor de fenólicos totais ......................................... 48
4.4.3 Determinação do teor de flavonoides totais .................................... 49
4.4.4 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de
Hidrogênio (RMN 1H) das frações hexânica, clorofórmica e
acetato de etila do extrato hidroetanólico de C. impressa ............. 50
4.5 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO ........................ 51
4.5.1 Determinação do poder redutor ........................................................ 51
4.5.2 Sequestro do radical livre DPPH ....................................................... 51
4.5.3 Atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido linoleico ....... 52
4.5.4 Inibição da peroxidação lipídica em cérebro de rato ...................... 53
4.6 TESTE DE TOXICIDADE AGUDA DOS EXTRATOS AQUOSOS EM
RATOS ......................................................................................................... 55
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................ 56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 57
5.1 DETECÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS COM CAPACIDADE
ANTIOXIDANTE ........................................................................................... 58
5.1.1 Cromatografia em Camada Delgada ................................................. 58
5.1.2 Determinação de fenólicos totais ................................................................ 61
5.1.3 Determinação de flavonoides totais ................................................. 62
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE NOS EXTRATOS
BRUTOS IN VITRO ...................................................................................... 64
5.2.1 Determinação do poder redutor ........................................................ 64
5.2.2 Sequestro do radical livre DPPH ....................................................... 66
5.2.3 Inibição da oxidação no sistema β-caroteno/ácido linoleico.......... 69
5.2.4 Inibição da peroxidação lipídica em homogenato de cérebro ........ 72
5.3 AVALIAÇÃO DAS FRAÇÕES FH, FC E FA DO EXTRATO
HIDROETANÓLICO DE C. IMPRESSA IN VITRO ....................................... 75
5.3.1 Determinação do teor de flavonoides totais nas frações FH, FC
e FA do extrato hidroetanólico de C. impressa ............................... 75
5.3.2 Sequestro do radical livre DPPH nas frações FH, FC e FA do
extrato hidroetanólico de C. impressa ............................................. 76
5.3.3 Análise espectroscópica das frações FH, FC e FA do extrato
hidroetanólico de C. impressa por RMN 1H ..................................... 77
5.4 TOXICIDADE AGUDA DOS EXTRATOS AQUOSOS EM RATOS................ 82
5.4.1 Parâmetros fisiológicos ..................................................................... 82
5.4.2 Parâmetros hematológicos ................................................................ 83
5.4.3 Parâmetros bioquímicos .................................................................... 85
6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 88
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANEXOS
ANEXO A − Identificação botânica das plantas
ANEXO B − Aprovação do Projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
Universitário Onofre Lopes (CEP-HUOL)
19
1 INTRODUÇÃO
_______________________________________________________________
20
Os produtos naturais são utilizados pela humanidade desde tempos
imemoriais. A busca por alívio e cura de doenças através da ingestão de
plantas talvez seja uma das primeiras formas de utilização de produtos
naturais. A medicina popular, portanto, é o resultado do acúmulo secular de
conhecimentos empíricos da ação de diversos grupos étnicos. O resgate
desses conhecimentos tradicionais e dos valores culturais tem sido alcançado
pela etnofarmacologia, a qual é definida como a exploração científica
interdisciplinar de agentes biologicamente ativos, empregados ou observados
pelo homem (RODRIGUES; CARLINI, 2003).
Um estudo etnofarmacológico precisa ter: componentes etnográficos
(descrição de povos, língua, raça e religião); detalhes sobre a parte usada do
vegetal, usos, tipo de preparação medicinal, dosagem e modo de
administração; uma exsicata do material com nome do coletor, números da
coleção e do depósito em herbário, como uma base para identificação
taxonômica e futuras referências de uma dada planta (SOEJARTO, 2005).
O uso de plantas medicinais não se restringe a zonas rurais ou a regiões
desprovidas de assistência médica e farmacêutica, mas ao meio urbano, como
forma alternativa ou complementar à medicina oficial, sendo um fenômeno
social da atualidade, caracterizado pelas inter-relações biológicas, sociais,
culturais e econômicas. Tudo isso concatenado às ciências da pós-
modernidade, que ressaltam uma mudança de paradigma, saindo do modelo
cartesiano e reducionista para um modelo holístico com a valorização do todo,
em que se incluía a relação do homem com a natureza e a utilização de
recursos naturais de forma sustentável. Assim, o uso de plantas medicinais e
medicamentos fitoterápicos são estimulados, principalmente por movimentos
sociais, em decorrência do baixo custo e do não acesso aos serviços de saúde
por usuários do Sistema Único de Saúde.
Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (WHO, 2010),
85% da população mundial utilizam plantas medicinais para o tratamento
primário da saúde. No Brasil, 82% da população fazem uso de produtos à base
de plantas. Assim, o setor fitoterápico movimenta anualmente R$ 1 bilhão em
21
toda a sua cadeia produtiva, empregando mais de 100 mil pessoas (ABIFISA,
2004).
Dentre os medicamentos comercializados no mundo, cerca de 40% têm
origem direta ou indireta em fontes naturais; 78% e 74% de medicamentos
antibacterianos e antitumorais, respectivamente, são derivados de produtos
naturais (SIANI; MICHILES, 2005). Por exemplo, substâncias isoladas de
Catharanthus roseus são utilizadas no tratamento da leucemia infantil e da
doença de Hodgkin, sem que haja conhecimento médico de sua origem
(VIEGAS JÚNIOR et al., 2006).
As informações referentes ao modo tradicional de preparo, quando
analisadas sob o ponto de vista químico, podem contribuir fortemente para
estabelecer hipóteses quanto à identidade dos princípios ativos, visando
elucidar a ação farmacológica (NUNES, 1996). Atualmente, uma das atividades
mais pesquisadas é o poder antioxidante de plantas. As moléculas com ação
antioxidante estão presentes em todas as partes da planta. Dentre as várias
moléculas sintetizadas pelas plantas durante o metabolismo secundário, de
grande ocorrência, podem ser citados os polifenóis, constituídos de ácidos
fenólicos e flavonoides (MANCINI-FILHO, 2003), que estão sendo utilizadas em
várias doenças, inibindo a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e
nitrogênio (ERN) (RATNAM et al., 2006; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
Portanto, é importante que a seleção de espécies vegetais para
pesquisa e desenvolvimento, fundamentada na alegação de um dado efeito
terapêutico em humanos, possa constituir um valioso atalho para a descoberta
de fármacos, pois o uso tradicional pode ser encarado como uma pré-triagem
quanto à utilidade terapêutica em humanos (ELISABETSKY, 2007). Nesse
contexto, insere-se o aproveitamento da diversidade da flora regional e o
conhecimento popular do emprego de L. rigida Benth., L. tomentosa (Benth.)
Fritsch e C. impressa Prance no tratamento do diabetes e reumatismo,
doenças degenerativas com envolvimento de espécie reativas do oxigênio.
Diante do exposto, o presente estudo avaliou a capacidade antioxidante
in vitro dos extratos aquoso, hidroetanólico e etanólico de L. rigida Benth., de L.
tomentosa (Benth.) Fritsch e de C. impressa Prance. Também foi realizado um
22
estudo in vivo com os extratos aquosos das referidas plantas para avaliar a
toxicidade aguda, visando a um melhor conhecimento do potencial e do
aproveitamento racional dessas espécies, tendo em vista a sua provável
aplicação fitoterápica, considerando a ampla gama de empregos na medicina
popular.
23
2 REVISÃO DA LITERATURA
_______________________________________________________________
24
2.1 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
Atualmente, há um grande interesse no estudo de biomoléculas com
ação antioxidante devido, principalmente, às descobertas sobre o efeito dos
radicais livres no organismo. A oxidação é essencial para muitos organismos
vivos para a produção de energia, utilizada como combustível nos processos
biológicos, transformando lipídios em ácidos graxos poliinsaturados, gerando
espécies reativas de oxigênio (ERO), espécies reativas de nitrogênio (ERN) e
radicais livres (SARIKURKCU et al., 2008).
Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbio, cerca de 95%
do oxigênio participa das reações intracelulares; o restante (5%) passa por um
processo de redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando
na formação de H2O. Durante esse processo formam-se intermediários
reativos, como o ânion superóxido (O2•¯), o radical hidroperoxil (HOO•), o
radical hidroxil (•OH) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) (LETELIER et al.,
2008).
O O2•¯ é gerado continuamente por diversos processos celulares (cadeia
de transporte de elétrons na mitocôndria, no microssomo, através de enzimas
como xantina oxidase e NADPH oxidase), ou pela redução monoeletrônica de
O2. É um forte agente redutor e um fraco agente oxidante, porém pode formar
ERO (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). Em fagócitos, como neutrófilos e
macrófagos, é um dos microbicidas mais importantes na defesa contra as
infecções (HATHERILL; TILL; WARD, 1991).
O HOO• representa a forma protonada do ânion superóxido, ou seja,
possui o próton hidrogênio. Há evidências indicando que o hidroperoxil é mais
reativo que o superóxido, devido à maior facilidade em iniciar a destruição de
membranas biológicas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
O •OH é o mais reativo e mais lesivo radical conhecido e para o qual,
uma vez formado, o organismo humano não dispõe de mecanismo de defesa,
causa modificação no DNA (com modificação das bases e quebras das fitas),
danos nas proteínas, inativação enzimática e peroxidação lipídica. Ele é gerado
principalmente por radiação ionizante e em reação com metais de transição, a
partir da reação de Fenton ou de Haber-Weiss, ou ainda pode surgir como
25
produto da reação entre o radical ânion superóxido e peróxido de hidrogênio
(VASCONCELOS et al., 2007).
O H2O2 é um Intermediário formado pela reação de dismutação do
O2•¯catalisada pela enzima SOD, pela redução de 2 elétrons na molécula de O2
e pela ação de diversas enzimas oxidases in vivo, localizadas nos
peroxissomas. É um fraco agente oxidante e um fraco agente redutor, reage
lentamente com tióis, com sais de ferro e cobre reduzidos, com proteínas heme
e peroxidases para iniciar reações radicalares e peroxidações lipídicas
(YOSHIDA; CAMPOS, 2005).
O oxigênio singlet (1O2) é a forma excitada do oxigênio molecular e não
possui elétrons desemparelhados em sua última camada, sendo importante em
vários eventos biológicos, porém poucas doenças foram relacionadas à sua
presença (KARIHTALA; SOINI, 2007).
A formação de ERO é uma consequência natural do metabolismo
aeróbico e é importante para manter a homeostase de oxigênio nos tecidos.
Entretanto, um aumento significativo na produção de ERO leva ao desequilíbrio
entre pró- e antioxidantes em favor dos primeiros, o que acarreta a ruptura da
sinalização e o controle redox e/ou dano molecular, resultando no
envelhecimento e em doenças degenerativas, tais como, aterosclerose,
diabetes, câncer e cirrose (SCHNEIDER; OLIVEIRA, 2004).
2.2 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
A oxidação de lipídios depende de várias reações, cujos mecanismos
são extremamente complexos, relacionados ao tipo de estrutura lipídica e ao
meio onde este se encontra. O tipo de interface entre os lipídios e o oxigênio
(fase lipídica contínua, dispersa ou em emulsão), a exposição à luz e ao calor,
a presença de pró-oxidantes (e.g., íons metálicos de transição) ou de
antioxidantes são fatores determinantes para a estabilidade dos lipídios e,
consequentemente, para as membranas celulares (GALLEANO, 2010).
As ERO (e.g., •OH, O2•¯e ROO•) causam danos ao DNA e podem
oxidar lipídios e proteínas. Essas espécies atacam as cadeias de ácidos graxos
poliinsaturados (LH) de fosfolipídios e do colesterol, e, ao sequestrar um
26
hidrogênio do grupo metileno bis-alílico, iniciam o processo de peroxidação
lipídica nas membranas celulares (OMONI; ALUKO, 2005). Essa sequência de
reações leva à formação do L• (radical alquil lipídico). A figura 1 mostra a
propagação, o L• que reage rapidamente com o O2, resultando em LOO•
(radical peroxil lipídico), que, por sua vez, ao sequestrar um hidrogênio do
ácido graxo poliinsaturado, forma um novo L•. O término da peroxidação
lipídica ocorre quando os radicais (L• e LOO•), produzidos nas etapas
anteriores, combinam-se e geram espécies não-radicalares (GALLEANO,
2010).
Figura 1 – Esquema da peroxidação lipídica, resultando na formação em cadeia de
inúmeros radicais lipídicos (Adaptado de FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
2.3 SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE
Um antioxidante é qualquer substância que, quando presente em baixa
concentração, comparada à do substrato oxidável, regenera o substrato ou
previne significativamente a oxidação deste (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
2007).
Os antioxidantes constituem uma gama de substâncias que agem em
diferentes níveis, protegendo os sistemas biológicos dos efeitos deletérios de
processos ou de reações de oxidação de macromoléculas (proteínas, lipídios,
carboidratos e DNA). Inibem a formação de ERO, ERN ou de seus precursores;
reduzem hidroperóxidos, peróxidos orgânicos e inorgânicos e capturam íons
metálicos ou removem radicais livres, reparando os danos ocasionados. Além
. .
. .
. .
. .
. .
LH + OH L + H2O INICIAÇÃO
L + O2 LOO PROPAGAÇÃO
LH + LOO L + LOOH PROPAGAÇÃO
LOO + L LOOL TERMINAÇÃO
LOO LOO+ LOOL + O2 TERMINAÇÃO
27
disso, alguns antioxidantes têm a capacidade de induzir a biossíntese de outros
antioxidantes ou enzimas de defesa (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
Em sistemas aeróbicos, o equilíbrio entre agentes óxido-redutores (e.g.,
ERO) e o sistema de defesa antioxidante é essencial. Assim, muitos
organismos possuem sistemas de defesa antioxidante enzimático (superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) e não-
enzimático, como a glutationa (GSH), principal composto antioxidante
intracelular. Antioxidantes provenientes da dieta, como o α-tocoferol (vitamina
E), β-caroteno (pro-vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C) e flavonoides são
substâncias utilizadas para essa finalidade, por atuarem na redução de radicais
livres, sendo as moléculas mais estudadas (WU et al., 2005).
A SOD corresponde a uma família de enzimas com diferentes grupos
prostéticos em sua composição. Em eucariontes, há duas formas de SOD, a
SOD-cobre-zinco e a SOD-manganês, presentes no citosol e na mitocôndria,
respectivamente. Essa enzima também tem papel antioxidante ao catalisar a
dismutação do radical ânion superóxido em H2O2 e O2, na presença do próton
H+ (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
A CAT, uma hemeproteína citoplasmática, catalisa a redução do H2O2 a
H2O e O2. Essa enzima é encontrada no sangue, medula óssea, mucosas, rins
e fígado. Embora essa enzima seja capaz de decompor H2O2, é praticamente
inativa frente a hidroperóxidos orgânicos, diferentemente da GPx, que é
altamente ativa contra esses compostos (VASCONCELOS et al., 2007).
A GPx catalisa a redução do H2O2 e peróxidos orgânicos para seus
correspondentes alcoóis pela conversão da GSH a GSSG. Embora a GPx
tenha ação fundamentalmente citosólica, in vitro ela é capaz de reduzir
hidroperóxidos de membrana (SHARADAMMA et al., 2011).
A glutationa reduzida (GSH, L-"-glutamil-L-cisteinil-glicina), presente na
maioria das células, é o antioxidante mais abundante no meio intracelular. Sua
capacidade redutora é determinada pelo grupamento -SH, presente na cisteína.
A glutationa reduzida (GSH) age como um agente sequestrante de radical com
ação redox, e ao reagir com oxidantes, produz, consequentemente, a glutationa
oxidada (GSSG), via enzima GPx, que a utiliza como substrato para eliminar
peróxidos. A exposição da GSH ao agente oxidante provoca sua oxidação à
GSSG (VASCONCELOS et al., 2007).
28
A regeneração da GSH é feita pela enzima glutationa redutase (GR),
uma etapa essencial para manter íntegro o sistema de proteção celular. A GR é
uma flavoproteína NADPH-dependente e, portanto, dependente da integridade
da via das pentoses. A diminuição do fornecimento de NADPH, por exemplo,
no jejum e na deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), prejudica
a função da GR (YOSHIDA; CAMPOS, 2005).
Além dos antioxidantes citados, o α-tocoferol confere proteção à
membrana celular ao sequestrar os oxidantes produzidos durante a
lipoperoxidação. Essa molécula é um importante antioxidante lipofílico, cuja
função pode estar limitada em situações de sobrecarga de ferro. O β-caroteno
interage com as ERO especialmente quando ocorrem baixas tensões de O2,
enquanto a vitamina E mostra-se mais eficiente quando há altas tensões de O2
no meio. A vitamina C, ou ascorbato, é um antioxidante hidrossolúvel que pode
neutralizar diretamente as ERO; porém, em altas concentrações ou quando
exposta a um metal, pode agir como pró-oxidante provocando lipoperoxidação
(OSIECKI et al., 2010).
2.4 ANTIOXIDANTES NATURAIS
Produtos naturais com atividade antioxidante utilizados para auxiliar o
sistema protetor endógeno têm despertado o interesse na pesquisa por
moléculas antioxidantes derivadas de plantas. As propriedades curativas de
plantas medicinais e a sabedoria popular contribuem para o conhecimento do
uso terapêutico, comprovados por estudos farmacológicos (KARAGÖZLER et
al., 2008).
Os antioxidantes naturais são essencialmente substâncias de natureza
polifenólica que podem estar presentes em todas as partes da planta. As
plantas superiores sintetizam e acumulam uma grande diversidade dessas
moléculas em decorrência do metabolismo secundário, desde moléculas
simples como os ácidos fenólicos, até moléculas altamente polimerizadas,
como os taninos condensados (GALLEANO et al., 2010).
Um dos principais grupos de antioxidantes fenólicos são os flavonoides
biossintetizados a partir da via dos fenilpropanoides e do acetato, precursores
de vários grupos de substâncias, como aminoácidos alifáticos, terpenoides,
29
ácidos graxos, dentre outros. Quimicamente, os flavonoides são definidos
como uma família de polifenóis que têm uma estrutura básica de dois anéis
aromáticos (A e B) ligados através de três carbonos que frequentemente
formam um heterociclo oxigenado (anel C). Diferentes arranjos de grupos
carbonila e/ou hidroxila e duplas ligações carbono-carbono na estrutura básica
definem os diferentes subgrupos de flavonoides, como mostrado na Figura 2
(CROZIER et al., 2009).
Figura 2 – Estrutura básica dos flavonoides e de diferentes subgrupos de flavonoides (MARÇO et al., 2008).
Os flavonoides participam de importantes funções no crescimento,
desenvolvimento e na defesa dos vegetais contra o ataque de patógenos,
estando presentes na maioria das plantas, principalmente em sementes, frutos,
cascas, raízes, folhas e flores. As plantas medicinais contendo flavonoides são
utilizadas há milhares de anos na medicina oriental, porém são pouco
empregadas terapeuticamente na medicina popular ocidental, embora possuam
atividade antioxidante em termos de proteção e no tratamento de doenças
degenerativas mediadas por estresse oxidativo (DORNAS et al., 2007).
A atividade antioxidante dos flavonoides deve-se, possivelmente, a sua
propriedade redox através da absorção e da neutralização de radicais livres ou
da decomposição de peróxidos, podendo vir a apresentar efeitos
farmacológicos, como anti-histamínico (NITTA et al., 2007), antibacteriano
(ROMERO et al., 2007), cardiovascular (LORENZ et al., 2007), dentre outros.
30
Todavia, os mecanismos fisiológicos ligados às características químicas
antioxidantes dos polifenóis com seus efeitos sobre a saúde ainda estão
sujeitos a discussão (GALLEANO et al., 2009).
A busca de moléculas antioxidantes fundamenta-se principalmente em
plantas usadas pela medicina popular. Há diversos exemplos de plantas cujos
extratos ou moléculas isoladas possuem atividade antioxidante in vitro
comprovada. Como exemplos podem ser citados marcela (Achyrocline
satureioides (Lam.) D.C.) (DESMARCHELIER et al., 1997), e pariparoba
(Pothomorphe umbellata L.), da qual foi isolado o 4-nerolidilcatecol (BARROS
et al, 1996). Ainda nesse contexto, pode ser citado o extrato de folhas e flores
de Carduus marianus, utilizado no tratamento de distúrbios hepáticos
(STICKEL; SCHUPPAN, 2007), e os extratos de Turnera ulmifolia L., com
potencial antioxidante maior que o α-tocoferol (NASCIMENTO et al., 2006).
2.5 FAMÍLIA CHRYSOBALANACEAE
Chrysobalanaceae, ordem Rosales e superordem Rosiflorae, é uma
família com distribuição pantropical, principalmente nas Américas Tropical e
Subtropical, na África e na Ásia, incluindo 20 gêneros e mais de 500 espécies
(HEWOOD et al., 2007). Essa família é constituída de árvores, arbustos ou
raramente subarbustos. Suas folhas são simples, alternas, com estípulas
frequentemente caducas, enquanto as flores são actinomorfas ou zigomorfas,
diclamídeas, heteroclamídeas, 5- ou 4-meras, monoclinas, oligo-, iso- ou
polistêmones, hipóginas; androceu com filetes livres ou unidos na base,
anteras com deiscência longitudinal; gineceu unilocular com 2 óvulos basais
eretos ou bilocular com 1 óvulo por lóculo, estilete geralmente ginobásico. O
fruto é uma drupa, seca ou carnosa; sementes com endosperma escasso e
embrião conspícuo (GIULIETTI et al., 2009).
No Brasil, ocorrem sete gêneros e cerca de 250 espécies, a maioria na
região amazônica, junto às florestas de terras baixas (SOUZA; LORENZI,
2008), exaustivamente estudadas por Prance (1972, 1976, 1989). Na Mata
Atlântica, encontram-se seis gêneros e 59 espécies, sendo 80% delas
endêmicas. Os gêneros Coeupia e Licania são os melhores representantes em
número de endemismos (Tabela 1), cuja maior riqueza é encontrada no
31
Corredor Central da Mata Atlântica, entre o Espírito Santo e o sul da Bahia
(Figura 3).
Tabela 1 – Endemismos da família Chrysobalanaceae na Mata Atlântica.
Gênero
Número de espécies
Mundo Brasil Mata Atlântica
Total Endêmicas
Chrysobalanus 03 01 01 00 Couepia 71 57 16 16 Exellodendron 05 06 02 01 Hirtella 107 62 14 09 Licania 214 110 21 15 Parinari 039 012 05 04
Fonte: Departamento de Botânica/ICB/UFMG, 2008.
Figura 3 – Distribuição geográfica da família Chrysobalanaceae na Mata Atlântica. Fonte: Departamento de Botânica/ICB/UFMG, 2008.
32
Na região Nordeste do Brasil, algumas dessas espécies estão
amplamente distribuídas, como é o caso de L. rigida Benth. L. tomentosa
(Benth.) Fritsch e C. impressa Prance.
2.5.1 Licania rigida Benth.
L. rigida Benth. (Figura 4) popularmente conhecida como oiticica [F.: oiti
+ - cica, do tupi ï'sika], é uma árvore que atinge até 15 metros de altura, com
tronco grosso, ramificando-se a pouca distância do solo, cujos galhos, quando
jovens, são lanosos a tomentosos, tornando-se depois glabros e lenticulados.
Suas folhas (Figura 4A) são oblongas e elípticas, 6 a 13 cm de comprimento,
2,8 a 6,5 cm de largura, coriáceas, arredondadas a retusas no ápice,
arredondadas a cordifoliadas na base, glabras e brilhantes na parte superior, a
superfície inferior com nervações reticuladas profundas, descrevendo as
cavidades estomáticas, com pubescência lanosa entre as nervações, mas não
sobre estas; nervura central ligeiramente levantada, pelos muito finos para a
base quando jovens; 11 a 16 pares de veias primárias, proeminentes na
superfície inferior, ligeiramente virada para cima, pecíolos com 5 a 8 cm de
comprimento, tomentosos quando jovens, tornando-se glabracentes com a
idade, seção transversal circular, com duas glândulas sésseis. Suas estípulas
são lineares, com 10 mm de comprimento, membranosas e caducas, e suas
inflorescências racemosas (panículas), com raques e ramos tomentosos-cinza.
As flores (Figura 4B) são amarelas, com 2,5 a 3,5 mm de comprimento, em
pequenos grupos, sésseis em ramos primários da inflorescência, com brácteas
e bractéolas com 1,5 a 2,5 mm de comprimento, ovais, tomentosas no exterior,
persistente, toda serrilhada e sem glândulas e um receptáculo campanulado,
tomentoso-cinza no exterior, tomentoso por dentro; pedicelo com 0,5 mm de
comprimento. O cálice possui lobos agudos, tomentosos no exterior e
tomentosos por dentro. As flores apresentam 5 pétalas, densamente
pubescentes e 14 estames, igualando aos filamentos dos lobos do cálice,
conatos sobre cerca da metade da base, densamente pubescentes. O ovário
acompanha a base do receptáculo, vilosidades. O estilete é igual aos lobos do
cálice, quase no ápice das vilosidades (PRANCE, 1972). Os frutos (Figura 4C)
dessa planta são drupáceos elípticos, 4 a 5,5 cm de comprimento; epicarpo
33
liso, seco e verde, mesmo quando maduro, mas se torna marrom esverdeado
quando seco; mesocarpo fino, fibroso, frágil e fibras dispostas
longitudinalmente, promovendo deiscência longitudinal, esparsamente
pubescente por dentro e semente única de igual formato em relação ao fruto
(LORENZI; MATOS, 2002).
Figura 4 – Licania rigida. Detalhes de folhas (A), flores (B) e frutos (C). Fonte: Galeria pública do Núcleo de Ensino e Estudos em Forragicultura – NEEF/DZ/CCA/UFC.
2.5.2 Licania tomentosa (Benth.) Fritsch
L. tomentosa (Benth.) Fritsch (Figura 5), denominada oiti, oiti-da-praia,
oiti-cagão ou oiti-mirim [F.: do tupi, de or. contrv., posv. gwi'ti], é uma árvore
frondosa de cerca de 20 m de altura, ramos jovens tomentosos-lanosos, logo
se tornando glabros, cujas folhas oblongo-elípticas a oblongo-lanceoladas,
cartáceas, possuem de 4,5 a 12 cm de comprimento, 1,5 a 4,5 cm de largura,
apiculada-acuminada no ápice, com acúmen de 2 a 4 mm de comprimento,
cuneifoliado a subcuneifoliado na base, farináceas-lanosas em ambas as
superfícies quando jovens, tornando-se glabras com a idade; a base da lâmina
com duas glândulas, mas outras glândulas paliçadas estão ausentes; nervura
central ligeiramente levantada para cima, lanosas-pubescentes quando jovens,
7 a 10 pares de veias primárias, finas, ligeiramente levantadas para cima
abaixo do nível, ou quase isso, e acima imperceptível; pecíolos com 4 a 6 mm
de comprimento, lanosos quando jovens, tornando-se glabros com a idade,
34
com duas glândulas, canaliculadas pouco profundas. Suas estípulas são
caducas, lineares, membranosas e intrapeciolares, de inflorescência pouco
ramificada, racemosa (racemos ou panículas), predominantemente axilares, a
raque escassamente tomentosa-cinza. Suas flores (Figura 5A) são brancas,
com 3 mm de comprimento, solitárias, mas densamente povoadas ao longo da
raque, cujo receptáculo é campanulado, escassamente tomentoso-cinza no
exterior, tomentoso por dentro; pedicelo com 1 a 2 mm de comprimento. O
cálice possui lobos agudos, tomentosos no exterior e pelos muito finos por
dentro. As flores apresentam 5 pétalas, quase glabras, com margens ciliadas e
30 estames inseridos em um círculo completo; filamentos muito superiores aos
lobos do cálice, conatos ligeiramente na base. Seu ovário está inserido na base
do receptáculo, lanoso. O hirsuto do estilete é maior que o seu comprimento,
igualando ou excedendo os filamentos (PRANCE, 1972). Seus frutos (Figura
5B) são drupáceos oblongos; epicarpo liso, seco e marrom, amarelo quando
maduro; pericarpo espesso, frágil, fibroso, glabro por dentro, de cheiro
desagradável e com semente grande (PIO CORREA, 1974).
Figura 5 – Licania tomentosa. Detalhes de flores (A) e frutos e folhas (B). Fonte: Fotos de E. Giacon e A. Mezzono.
2.5.3 Couepia impressa Prance
C. impressa Prance (Figura 6), largamente distribuída na Mata Atlântica
do Nordeste do Brasil, é conhecida vulgarmente como goiti. Essa espécie, de
35
hábito arbóreo, tem ramos jovens glabros com estípulas de cerca de 2 mm de
comprimento, subuladas e decíduas. Suas folhas (Figura 6A) são alternas,
pecioladas; pecíolos de 6 a 12 mm de comprimento, glabros,
supracanaliculados e sem glândulas; lâminas oblongas a oblongo-lanceoladas,
11 a 18,5 cm de comprimento, 4 a 6 cm de largura, ápice com acúmen de 3 a 7
mm de comprimento abruptamente reduzido, base rotunda ou arredondada,
supraglabras, súbitas, esparsas e pubescentes; nervura central glabra; 18 a 23
cortes secundários, súbitos, proeminentes e supraimpressos. As flores (Figura
6A) estão dispostas em panículas terminais, densas e griseo-pubescentes, com
brácteas e bractéolas ovais de 2 a 3,5 mm de comprimento e um receptáculo
subcampanulado com 6 a 7mm de comprimento, curvado para cima, exterior
griseo-púbere, subabertura interior com pelos longos, deflexos, densos e
tomentosos, contra uma base glabra. O cálice tem 5 lobos e acúleo, 5 pétalas,
decíduas e com margens curtas ciliadas, 15 a 17 estames, dispostos na ordem
de 2/3 da base e curtos conatos. O ovário está inserido na base do
receptáculo, vilosidades. Seu estilete está saltado na base do ovário, meio
pubescente (PRANCE, 1972). Seu fruto (Figura 6B) é oval com pericarpo pardo
amarelado, verrucoso, pouco espesso, unido a uma massa granulosa,
espessa, doce-ácida, adstringente, de cor amarela, de sabor agradável e com
semente grande (PIO CORREA, 1974).
Figura 6 – Couepia impressa. Detalhes de folhas e flores (A) e frutos (B). Fonte: Fotos de J. B. M. Macêdo.
36
2.6 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA FAMÍLIA CHRYSOBALANACEAE
Quanto à composição química, diversas moléculas têm sido isoladas de
espécies dessa família (QUADRO 1). Os estudos químicos são ainda
incipientes, contudo flavonoides, terpenoides (diterpenos e triterpenos),
esteroides e taninos têm sido isolados (CASTILHO et al., 2000). Do gênero
Licania, estudos mostraram, principalmente, o isolamento de flavonóides e
triterpenoides. Os flavonoides foram isolados de Licania densiflora, L.
heteromorpha, L. carii e L. pittieri e são, em sua maioria derivados do
campferol, quercetina e miricetina (BRACA et al., 1999a; BRACA et al., 1999b;
BILIA; MENDEZ; MORELLI, 1996; MENDEZ et al., 1995). Já os triterpenoides
são do tipo oleanano, ursano e lupano. De L. licaniaeflora isolaram-se ácido
oleanólico, ácido maslínico, ácido 3-O-arabinosídeo-oleanólico, ácido
betulínico, arjunetina, ácido tormêntico, ácido pomólico, entre outros (BRACA et
al., 2001). Já em L. heteromorpha isolaram-se ácido betulínico, derivados do
ácido alfitólico e do ácido maslínico (BRACA et al., 2000). Em L. carii isolaram-
se os ácidos betulínico, ursólico e maslínico (BILIA; MENDEZ; MORELLI, 1996)
e em L. pyrifolia, ácido 11α-hidroxibetulínico e ácido 6β-hidroxibetulínico (BILIA;
MORELLI, 1996). O estudo químico de L. tomentosa, uma espécie vegetal que
não apresenta pesquisas quanto a sua composição química, levou ao
isolamento e à caracterização de hidrocarbonetos, esteroides e triterpenos,
revelando assim uma quantidade grande de derivados da via do acetato-
mevalonato, na forma de triterpenos ácidos com esqueletos do tipo oleanano,
ursano e lupano, muito característicos do gênero Licania e da família
Chrysobalanaceae. Além de um licanolídeo, triterpeno inédito do tipo lupano
CASTILHO; KAPLAN (2008).
Quimicamente, o gênero Couepia não é muito estudado, porém de C.
paraensis foram isolados sitosterol, ácido oleanólico, ácido 3-acetiloleanólico,
naringenina, quercetina, rutina, ácido espinósico, 5-hidróxi-2,8-dimetil-6,7-
dimetóxicromona e 5-hidróxi-8-dimetil-6,7-desmetóxibenzopirano-4-ona
(SANDUJA; ALAM; EULER, 1983; SANDUJA et al., 1982).
37
ESPÉCIE PARTE USADA EXTRATO COMPOSTOS ISOLADOS REFERÊNCIA Licania rigida Sementes Óleo Ácido licânico (ácido γ-keto-Δθκµ-octa-decatrienóico)
BROWN; FARMER (1935)
Licania pittieri Folhas Triterpenos e flavonóides (ácido ursólico; ácido oleanólico; catequina; epicatequina, quercetina; quercitrina, isoquercetina, hiperina e quercetina-3-arabinopiranosídeo)
MENDEZ; BILIA; MORELLI (1995)
Licania carii Cardozo Folhas - Triterpenos e flavonóides (ácido ursólico; ácido betulínico; 2 α-hidroxi ursólico ácido; ácido maslínico; β-sitosterol-3-O-glicosídeo; miricetina-3-(2”-xilosil) ramnosídeo; quercetina-3-(2”-xilosil) ramnosídeo; quercetina-3-glicosídeo; quercetina-3-galactosídeo; miricetina-3-glicosídeo; miricetina-3-galactosídeo; rutina; miricetina-3’-metil-3-rutinosídeo e miricetina-3-rutinosídeo)
BILIA MENDEZ; MORELLI (1996)
Licania pyrifolia Folhas - Triterpenos (ácido 11α-hidroxibetulínico; ácido 6β-hidroxibetulínico; ácido 2α, 3β-diidroxiup-12-en-28-óico 3-(éster 3’,4’-diidroxibenzoil) e ácido 2α, 3β, 27-triidroxiup-12-en-28-óico 3-( éster 3’,4’-diidroxibenzoil)
BILIA; MORELLI (1996)
Licania tomentosa Frutos Aroma 1-hexanol; 4-heptanol; butanoato de 3-metilbutila; hexanal; mirceno e butanoato de etenila (principais constituintes) e outros
ANDRADE et al. (1998)
Licania densiflora Folhas - Flavonóides (8-hidroxi-naringerina-4’-metil éter; miricetina 3’,4’-dimetil éter 3-O- β-D-glicopiranosídeo e 3-O-α-L-(2”-O-α-L-ramnopiranosídeo)-ramnopiranosídeo)
BRACA et al. (1999a)
Licania heteromorpha Partes aéreas Metanólico Flavonóides (miricetina 3,4’-di-O-α-L-ramnopiranosídeo; miricetina 7-metil éter 3,4’-di-O-α-L-ramnopiranosídeo e miricetina 4’-metil éter 3-O-β-D-galactopranosídeo)
BRACA et al. (1999b)
Licania heteromorpha Folhas e galhos jovens
- Triterpenos (ácido betulínico; ácido alfitólico; ácido alfitólico 3 beta-O-trans-p-coumaroil; ácido alfitólico 3 beta-O-cis-p-coumaroil; ácido maslínico 3 beta-O-trans-p-coumaroil e ácido maslínico 3 beta-O-cis-p-coumaroil)
BRACA et al. (2000)
Licania licaniaeflora (Sagot) Blake
Folhas - Triterpenos (ácido oleanólico; ácido maslínico; ácido olenólico 3-O-arabinosídeo; ácido betulínico; arjunetina; ácido tormêntico glicosil éster; ácido pomólico e oleano-12-en-2α,3β-diol)
BRACA et al. (2001)
Licania densiflora Folhas - Miricetinas glicosídicas (miricetina 3’-metil éter-3-O-glicosídeo; miricetina 3’-metil éter-3-O-galactosídeo; miricetina 4’-metil éter-3-O-ramnosídeo; miricetina 3’,5’-dimetil éter-3-O-glicosídeo e miricetina 3’,5’-dimetil éter-3-O-ramnosídeo)
BRACA et al. (2001)
38
Licania intrapetiolaris Raiz Metanólico Diterpenos clerodanos (intrapetacina A e intrapetacina B) e triterpeno (cucurbitacina B)
OBERLIES et al. (2001)
Licania michauxii Prance Raiz - Diterpenos ent kaurenos (ácido licamichauxiióico-A e ácido licamichauxiióico-B)
CHAUDHURI et al. (2002)
Couepia ulei Casca Metanólico Compostos fenólicos ativos (eritro-2,3-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-3-etoxipropano-1-ol e evofolina-B) e inativos (ácido betulínico, ácido oleanólico, ácido pomólico, (±)-siringaresinol e ácido ursólico)
JANG et al. (2004)
Licania tomentosa Frutos Hexânico e metanólico
Lactona triterpênica (licanolídeo 3β-hidroxilupano-20,28-olídeo)
CASTILHO; OLIVEIRA; KAPLAN (2005)
Licania arianeae Prance Folhas - Cromonas (quatro 5,7-diidroxi-2-alquilcromonas, quatro 5,7-diidroxi-6-alquilcromonas e duas 5,7-diidroxi-6,8-dicloro-2-alquilcromonas)
CARVALHO et al. (2005)
Chrysobalanus icaco Folhas Hidroetanólico Flavonóides (miricetina 3-O-glucuronídeo (miricitrina) e quercitrina) e outros derivados minoritários de miricetina
BARBOSA et al. (2006)
Licania tomentosa Frutos
Folhas
Hexânico
Hexânico Metanólico
Triterpenos ácidos (ácido betulínico; licanolídeo, uma nova lactona triterpênica; ácido oleanólico; lupeol) e ácidos graxos (ácido palmitoléico e ácido hexadecanóico). Lupeol e uma mistura de estigmaterol e sitosterol. Uma mistura de ácido tormêntico, ácido ursólico e ácido betulínico.
CASTILHO; KAPLAN (2008)
Licania arianeae Prance Folhas e Casca
- Triterpenos ácidos (ácido oleanóico e ácido ursânico) e Saponinas triterpênicas
CARVALHO et al. (2008)
Licania arianeae Prance Madeira
Folhas
- -
Ácido flavona-6-sulfônico (4’-O-metil-5,7-diidroxi-flavona-6-sulfonato, conhecido como niruriflavona) Saponina (ácido 3-O-[6’-O-4-hidroxibenzoil]-β-D-galactopiranosil-ursa-12-en-28-óico)
CARVALHO et al. (2009)
Licania tomentosa Frutos Óleo Hexanol; 3-hexanona-2-ol e hexanal (principais constituintes) e outros
CASTILHO; KAPLAN (2010)
QUADRO 1 – Moléculas isoladas de algumas espécies da família Chrysobalanaceae.
39
2.7 ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DA FAMÍLIA CHRYSOBALANACEAE
Na medicina popular, espécies dessa família são utilizadas para diversos
fins. Na África, espécies do gênero Parinari são empregadas no tratamento da
malária (GESSLER et al., 1995), enquanto no Brasil, Chrysobalanus icaco e L.
rigida, para o tratamento do diabetes, cujos efeitos hipoglicemiantes e
diuréticos têm comprovação farmacológica (PRESTA; PEREIRA, 1987).
Os diterpenos encontrados nessa família mostram uma ampla
diversidade farmacológica; os obtidos de Parinari curatellifolia apresentam
citotoxicidade (LEE et al., 1996), enquanto os de C. icaco e P. capensis têm
potencialidade para o tratamento da AIDS (GUSTAFSON et al., 1991) e ação
antifúngica (GARO et al., 1997), respectivamente.
Do gênero Licania, L. tomentosa (BRAGA, 1960) é utilizada para o
tratamento empírico do diabetes (AGRA; FREITAS; BARBOSA-FILHO, 2007).
Miranda et al. (2002) mostraram que o extrato das sementes de L. tomentosa
inibiram a atividade do vírus herpes-simples. Os triterpenos (ácidos betulínico,
oleanólico e pomólico) isolados das folhas e frutos dessa planta apresentaram
atividade antitumoral contra linhagens de células leucêmicas (FERNANDES et
al., 2003; FERNANDES et al., 2005), o ácido oleanólico, isolado dos seus
frutos, também apresentou atividade leishmanicida (DELORENZI et al., 2003).
Com outras espécies, os flavonoides de L. licaniaeflora mostraram atividade
antioxidante (BRACA et al., 2002), enquanto o extrato metanólico de folhas e
raízes de L. michauxii induziu a apoptose (BADISA et al., 2000).
Estudos com folhas de C. grandiflora Benth. indicaram que essa planta
brasileira possui um grande potencial terapêutico, pois seus extratos
apresentaram atividade citotóxica, antioxidante e antibacteriana (ZUQUE et al.,
2004).
2.8 ESTUDO DA TOXICIDADE
A avaliação das possíveis propriedades tóxicas, de quaisquer
substâncias a que o homem está exposto, é de suma importância. No caso de
substâncias de origem natural, nota-se que o consumo de fitoterápicos vem
sendo impulsionado através da confiabilidade e inocuidade que o termo
"natural" exerce sobre as pessoas em geral. Embora propalados como naturais
40
e, portanto, associados à ausência de efeitos adversos, os fitoterápicos podem
apresentar sérios efeitos tóxicos. A toxicidade de uma planta, em muitos casos,
é devida à própria natureza do vegetal, que, ao longo do caminho evolutivo,
incorpora ao seu código genético a capacidade de produzir substâncias para
vencer os desafios do ambiente e, assim, cumprir sua função de reproduzir-se
e manter-se em seu meio. O uso de plantas medicinais está baseado, na
maioria das vezes, em conhecimentos empíricos que são passados através
das gerações. No entanto, pouco se conhece sobre as possíveis propriedades
toxicológicas existentes nos extratos vegetais, cujas relações causa-efeito são
geralmente complexas e de difícil reconhecimento na população usuária dos
chás, infusões ou tinturas de plantas (LAPA et al., 2007).
2.8.1 Toxicidade aguda
Um dos primeiros testes realizados para a avaliação do potencial tóxico
de quaisquer substâncias é o teste de toxicidade aguda. A dose letal mediana
(DL50) e outros efeitos tóxicos podem ser determinados após administração
aguda por uma ou mais vias (rota de exposição) em uma ou mais espécies
(ratos e camundongos são as espécies mais frequentemente usadas). Os
estudos são realizados em animais adultos de ambos os sexos, e verifica-se o
número de animais que morrem durante o período de observação de 14 dias. A
avaliação dos resultados permite conhecer a espécie ou o sexo mais sensível.
Além de dados de mortalidade e peso corporal, podem ser avaliados outros
parâmetros, como sinais de intoxicação, letargia, mudanças comportamentais,
morbidade e alteração no consumo de alimento. Os testes de toxicidade aguda
fornecem: 1) uma estimativa quantitativa de toxicidade aguda em comparação
com outras substâncias; 2) a identificação dos órgãos-alvo ou outras
manifestações clínicas agudas; 3) o estabelecimento do caráter reversível das
respostas tóxicas; e 4) um guia de doses para outros estudos (OECD, 2001;
BRASIL, 2004).
41
3. OBJETIVOS
_______________________________________________________________
42
3.1. GERAL
Avaliar a capacidade antioxidante in vitro e a toxicidade aguda in vivo de
extratos de folhas de L. rigida Benth., L. tomentosa (Benth.) Fritsch e C.
impressa Prance (Chrysobalanaceae).
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Prospecção fitoquímica dos extratos aquoso, hidroetanólico e etanólico
das plantas em estudo pela cromatografia em camada delgada;
2. Quantificar teores de fenólicos e flavonoides totais nos extratos brutos;
3. Determinar a capacidade antioxidante dos extratos brutos mediante o
sistema β-caroteno/ácido linoleico, o poder redutor e o sequestro do
radical livre DPPH;
4. Avaliar a capacidade dos extratos brutos em inibir a peroxidação lipídica
espontânea em homogenato de cérebro de rato;
5. Avaliar a toxicidade aguda dos extratos aquosos das plantas em estudo,
utilizando-se parâmetros fisiológicos, hematológicos e bioquímicos;
6. Fracionar por partição líquido/líquido o extrato bruto que apresentar a
melhor capacidade antioxidante;
7. Quantificar teores de flavonoides totais nas frações do extrato bruto que
apresentar a melhor capacidade antioxidante;
8. Determinar o sequestro do radical livre DPPH nas frações do extrato
bruto que apresentar a melhor capacidade antioxidante;
9. Analisar por Espectroscopia de RMN 1H as frações do extrato bruto que
apresentar a melhor capacidade antioxidante.
43
4 METODOLOGIA
_______________________________________________________________
44
4.1 REAGENTES QUÍMICOS
Ácido tiobarbitúrico (TBA), ácido tricloroacético (TCA), ácido linoleico, β-
caroteno, catequina, quercetina, Carduus marianus (silimarina), 1,1-difenil-2-
picrilhidrazil (DPPH), reagente de Folin-Ciocalteu e Tween 20 foram adquiridos
da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Todos os outros reagentes
químicos utilizados foram de grau analítico.
4.2 MATERIAL VEGETAL
Folhas das espécies L. rigida Benth., L. tomentosa (Benth.) Fritsch e C.
impressa Prance (Família Chrysobalanaceae) foram identificadas
taxonomicamente pela Profª Drª Maria Iracema Bezerra Loiola (Anexo A) e um
exemplar de cada espécie foi depositado no Herbário do Departamento de
Botânica, Ecologia e Zoologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte -
UFRN (Figura 7). As folhas foram coletadas entre os meses de Março e Abril
de 2009 no Estado do Rio Grande do Norte, conforme a seguinte descrição:
Planta Nº da exsicata Local de coleta
L. rigida Benth. 8206 Florânia, Microrregião da Serra de
Santana, Mesorregião do Central
Potiguar
L. tomentosa (Benth.)
Fritsch
8207 Natal, Microrregião de Natal,
Mesorregião do Leste Potiguar C. impressa Prance 8205
4.2.1 Obtenção dos extratos
As folhas das espécies coletadas foram selecionadas, secas a 40ºC em
estufa com circulação de ar (Hydrosan, Brasil), trituradas em moinho de faca
tipo Willy (AmericanLab, mod. SL-031, Brasil) e acondicionadas à temperatura
ambiente e ao abrigo da luz até sua utilização. Os extratos foram preparados a
10%, sendo o aquoso preparado por decocção (20 min), enquanto os extratos
etanólico e hidroetanólico (1:1, v/v) foram preparados por maceração durante
10 dias com agitação periódica. Após filtração, os extratos foram concentrados
45
em rotaevaporador sob pressão reduzida (Fisatom®, mod. 550, Brasil), e o teor
do resíduo seco foi calculado por gravimetria e armazenado a -20ºC.
Figura 7 – Exsicatas das espécies estudadas, depositadas no Herbário do Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Fonte: Fotos de J. B. M. Macêdo.
4.2.2 Fracionamento por partição líquido/líquido do extrato hidroetanólico
de C. impressa
As frações hexânica, clorofórmica e de acetato de etila foram obtidas
pelo método de partição líquido-líquido, utilizando como solvente hexano,
clorofórmio e acetato de etila, respectivamente. Para isso, o extrato
hidroetanólico de Couepia Impressa foi colocado em um funil de separação,
juntamente com 200 mL de hexano, a partir disto separou-se a fração hexânica
A. Licania rigida Benth (nº 8206)
B. Licania tomentosa (Benth.) Fritsch (nº 8207)
C. Couepia impressa Prance (nº 8205)
46
(m = 12,0 mg). Em seguida, adicionou-se à fase aquosa 200 mL de clorofórmio,
então se separou a fração clorofórmica (m = 55,0 mg). Removida essa fração,
adicionou-se ao funil 200 mL de acetato de etila, separando então a última
fração (m = 85,0 mg); parte aquosa (m = 42,0 mg). Após a conclusão desse
processo, as frações tiveram o solvente evaporado em rotaevaporador sob
pressão reduzida (Fisatom®, mod. 550, Brasil).
4.3 ANIMAIS
Ratos machos Wistar (180-240 g) foram utilizados. Os animais foram
mantidos sob condições controladas de temperatura (22 ± 3ºC), fotoperíodo de
12h, com água e ração (Labina-Purina, São Paulo, Brasil) ad libitum, no
Biotério do Centro de Ciências da Saúde, UFRN. A experimentação animal foi
conduzida conforme as recomendações do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA, 2009) e do Comitê de Ética em Pesquisa de
Animais do Hospital Universitário Onofre Lopes, UFRN (Protocolo nº 268/08-
CEP/HUOL/UFRN) (Anexo B).
4.3.1 Coleta de material
Todos os animais foram anestesiados com Tiopental (3 a 4 mg/kg) e
sacrificados por deslocamento cervical, sendo em seguida submetidos a
laparotomia com retirada do cérebro para posterior preparação do homogenato.
4.3.2 Preparação do homogenato de cérebro de rato
O homogenato de cérebro de ratos Wistar adultos foi preparado em
tampão fosfato-salina pH 7,4 a 4ºC (fosfato de sódio 40 mM e NaCl 140 mM),
na proporção de 1:5 (Homogeneizador tipo Potter–Elvehjem). Após
centrifugação (1000g/15min/4ºC) (mod. IEC Multi RF-Thermo Electron
Corporation®, USA), o sobrenadante obtido foi imediatamente diluído (1:4) com
o mesmo tampão.
47
4.4 DETECÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS COM CAPACIDADE
ANTIOXIDANTE
4.4.1 Cromatografia em Camada Delgada
A triagem dos extratos foi feita por Cromatografia em Camada Delgada –
CCD (DUVE; WHITE, 1991). Após ativação a 100ºC/15 min das placas de
sílica-gel G, tipo 60 (0,25 mm), 100 µg dos extratos foram aplicados às placas,
e o desenvolvimento cromatográfico foi realizado utilizando o sistema de
solventes n-butanol:ácido acético:água (5:1:4, v/v/v). Após esta etapa, a
detecção dos grupos químicos foi efetuada, conforme mostrado na Figura 8. As
placas foram nebulizadas com solução de β-caroteno (22,5 mg de β-caroteno
em 7,5 mL de clorofórmio, 15 mL de etanol e 10 μL de ácido linoleico) e
expostas à luz natural por 24 horas. A permanência da coloração laranja após
12 horas indica a presença de substâncias antioxidantes no extrato. Para
detectar a presença de grupos fenólicos, as placas foram nebulizadas com
solução de ferricianeto de potássio (K3Fe(CN)6) a 1% e cloreto férrico (FeCl3) a
1% (1:1), enquanto uma solução de prata amoniacal (hidróxido de amônia
(NH4OH) a 30% e nitrato de prata (AgNO3) a 3,4%), na proporção de 1:1, foi
utilizada na detecção de substâncias redutoras. Catequina e Carduus marianus
foram utilizados como padrões de referência na mesma concentração dos
extratos.
48
Figura 8 – Esquema para a detecção de substâncias químicas com capacidade
antioxidante.
4.4.2 Determinação do teor de fenólicos totais
O teor de fenólicos totais nos extratos foi determinado através do
método colorimétrico de Folin-Ciocalteu descrito por Georgé et al. (2005),
conforme fluxograma mostrado na Figura 9. Uma alíquota de 0,5 mL de cada
extrato, nas concentrações de 25 a 125 μg/mL, foi misturada com 2,5 mL do
reagente de Folin-Ciocalteu em água (1:10,v/v). Após 2 minutos de incubação à
temperatura ambiente, 2,0 mL de Na2CO3 a 7,5% foram adicionados, e a
mistura foi incubada em banho de água a 50°C por 15 minutos. A absorbância
foi determinada a 745 nm (Shimadzu – UV-VISIBLE mod. 1650 PC, Kioto,
Japão), utilizando-se como branco (água ultrapura contendo todos os
reagentes, menos os extratos). Catequina (5 a 65 μg/mL), dissolvida em água
destilada, foi utilizada como padrão para obter a curva de concentração. As
determinações foram realizadas em triplicata, e os resultados foram expressos
como mg de equivalentes de catequina por g de amostra.
49
Figura 9 – Fluxograma da determinação do teor de fenólicos totais.
4.4.3 Determinação do teor de flavonoides totais
O conteúdo de flavonoides foi avaliado conforme descrito por Miliauskas
et al. (2004) (Figura 10). Uma alíquota de 1 mL da diluição de cada extrato a 10
mg/mL foi misturada com 1 mL da solução etanólica de AlCl3 (20 mg/mL, p/v) e
o volume aferido para 25 mL com etanol. Após agitação, a mistura foi incubada
por 40 minutos à temperatura ambiente. A absorbância foi mensurada a 415
nm (Shimadzu UV-VISIBLE mod. 1650 PC, Kioto, Japão), utilizando-se como
branco 1 mL da diluição de cada extrato, 1 gota de ácido acético glacial,
aferindo-se para 25 mL com etanol. Quercetina, nas concentrações de 50, 100,
150, 250, 350, 500, 1000, 1500 µg/mL, sob as condições já descritas, foi
utilizada para construir a curva padrão. As determinações foram realizadas em
triplicata, e os resultados foram expressos como equivalentes de quercetina
(mg de quercetina/g de extrato).
50
Figura 10 – Fluxograma da determinação do teor de flavonoides totais.
4.4.4 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
(RMN 1H) das frações hexânica, clorofórmica e acetato de
etila do extrato hidroetanólico de C. impressa
Os espectros de RMN 1H foram obtidos em espectrômetros Bruker
modelo Avance DRX-500, pertencentes ao Centro Nordestino de Aplicação e
Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal do Ceará
(CENAUREMN-UFC), sob cooperação com a Profª Renata Mendonça Araújo e
o Prof. Edilberto Rocha Silveira.
O aparelho Bruker Avance DRX-500 aplica uma frequência de 499,8
MHz (1H) sob um campo magnético de 11,5 T, utilizando sonda multinuclear de
5 mm com detecção inversa. As amostras foram dissolvidas em alíquotas de
0,6 mL de solvente deuterado: metanol (MeOD) e clorofórmio (CDCl3),
comercializados pelas companhias Merck ou Aldrich.
Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão
(ppm) e referenciados, no caso dos espectros de hidrogênio, pelos picos dos
51
hidrogênios pertencentes às moléculas residuais não-deuteradas dos solventes
deuterados utilizados: metanol (δ 3,31) e clorofórmio (δ 7,27).
As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H
foram indicadas segundo a convenção: s (simpleto), d (dupleto), dd (duplo
dupleto), t (tripleto), q (quarteto), m (multipleto).
4.5 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO
4.5.1 Determinação do poder redutor
A técnica de redução do ferro é frequentemente usada como um
indicador de atividade de doação de elétrons, um importante mecanismo de
ação de antioxidantes fenólicos que pode ser fortemente correlacionado com
outras propriedades antioxidantes (DORMAN et al., 2003).
O poder redutor dos extratos foi determinado de acordo com Oyaizu
(1986). Nesse método, a coloração amarela da solução em análise muda de
tonalidades, do verde ao azul, dependendo do poder de redução de cada
substância, ou seja, a presença de agentes redutores (antioxidantes) reduz o
complexo Fe3+/ferricianeto para a forma ferrosa (Fe2+), sendo a concentração
de Fe2+ monitorada a 700 nm.
Alíquotas de 2,5 mL de extratos em concentrações variando de 12,5 a
200 µg/mL, preparadas em tampão fosfato de sódio 0,2 M pH 6,6, foram
misturadas com 2,5 mL de ferricianeto de potássio a 1%. Após incubação
(50°C/20 min), 2,5 mL de TCA a 10% foram adicionados para parar a reação. A
mistura foi centrifugada a 650g por 10 minutos (Centrífuga Sigma 2k15,
Alemanha). O sobrenadante (2,5mL) foi misturado com 2,5 mL de água
destilada e com 0,5 mL de cloreto férrico a 0,1%. A absorbância foi
determinada a 700 nm (Shimadzu UV-VISIBLE mod. 1650 PC, Kioto, Japão). A
maior absorbância indicou um maior poder de redução.
4.5.2 Sequestro do radical livre DPPH
O DPPH é um radical livre estável que aceita um elétron ou átomo de
hidrogênio, resultando numa molécula não-radicalar DPPH-H (KOLEVA et al.,
2002). O sequestro de radicais livres (SRL) foi avaliado pelo método do 1,1-
52
difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), como descrito por Cuendet et al. (1997), que se
fundamenta no descoramento de uma solução de DPPH (coloração púrpura), a
qual na presença de um antioxidante, muda para uma cor amarelada,
resultando na diminuição da absorbância.
Alíquotas de 3,9 mL de DPPH 60µM em etanol foram misturadas com
0,1 mL de amostras (62,5 a 1000 µg/mL). Após incubação no escuro
(temperatura ambiente/30 min), a absorbância foi mensurada a 515 nm
(Shimadzu – UV-VISIBLE mod. 1650 PC, Kioto, Japão). Catequina e C.
marianus foram utilizados como padrões, sob as mesmas condições. As
análises foram realizadas em triplicata, e os resultados, expressos em %SRL,
calculados através da equação:
, onde Abs corresponde à absorbância.
4.5.3 Atividade antioxidante no sistema β-caroteno/ácido linoleico
A atividade antioxidante foi avaliada pelo modelo de inibição da oxidação
no sistema β-caroteno/ ácido linoleico, conforme descrito por Marco (1968) e
Miller (1971). No sistema β-caroteno/ácido linoleico, o β-caroteno sofre
descoloração rápida na ausência de antioxidante, devido a radicais livres
gerados pela oxidação do ácido linoleico e de outros radicais livres, como
radicais peroxil, produtos primários da oxidação, produzidos pelo próprio
sistema. Estes atacam as duplas ligações do β-caroteno, cuja subsequente
oxidação provoca a perda da coloração deste cromóforo, evidenciado através
do desaparecimento da cor laranja característica.
O sistema (20 mg de β-caroteno em 1,0 mL de clorofórmio, 20 mg de
ácido linoleico e 60 mg do emulsificador Tween 20) foi evaporado à secura, e
ressuspendido com 100 mL de água e submetido a agitação vigorosa. A
emulsão, de aparência límpida, apresentou absorbância entre 0,6 a 0, 7, a 470
nm (Espectrofotometro Shimadzu UV-VISIBLE mod. 1650 PC, Kioto, Japão).
Alíquotas de 2,95mL da emulsão foram adicionadas a tubos de ensaio
contendo 50µL do extrato em diferentes concentrações (50; 100; 150; 200; 250
µg/mL). Uma primeira leitura de absorbância a 470 nm foi efetuada
imediatamente (tempo zero) e, em seguida, os tubos foram mantidos em banho
53
de água (50ºC/2 h), até efetuar-se a segunda leitura. As determinações (em
triplicata) foram comparadas a um controle (sem adição de antioxidantes).
Catequina e C. marianus foram utilizados como padrões, sob as mesmas
condições antes descritas (Figura 11). A atividade antioxidante foi calculada
como percentual de inibição da oxidação em relação ao controle, conforme a
equação:
, onde Abs corresponde à absorbância.
Figura 11 – Fluxograma da inibição da oxidação no sistema β-caroteno/ácido linoleico.
4.5.4 Inibição da peroxidação lipídica em cérebro de rato
A inibição da peroxidação lipídica em homogenatos de cérebro de ratos
foi avaliada colorimetricamente como o percentual de inibição de substâncias
reagentes com o ácido tiobarbitúrico (SRAT), dentre elas o malonildialdeído
(MDA), pelo procedimento de Fee e Teitelbaum (1972), mostrado na figura 12.
Alíquotas de 3 mL do homogenato foram incubadas com 50 µL de extratos
54
dissolvidos em solução salina (concentrações finais: 1,04; 2,08; 4,16; 8,33 e
16,66 µg/mL). Ao tubo controle foram adicionados 50 µL de solução salina.
Alíquotas de 1mL do meio reacional foram transferidas para tubos de centrífuga
(T0), e o conteúdo restante, incubado em banho de água sob agitação (37ºC/60
min) (Dubnoff-Gefran-500 mod. 232 Nova Técnica, Piracicaba, Brasil). Então,
alíquotas de 1mL foram retiradas e transferidas para tubos (T60), adicionando-
se 1 mL de TCA a 5% aos tubos T0 e T60. Após centrifugação (825 g/15 min), o
sobrenadante (1 mL) foi transferido para outro tubo, adicionando-se 1mL de
TBA a 0,67%, sendo incubados sucessivamente em banho de água a 100°C e
banho de gelo por 20 minutos. A absorbância do complexo formado entre o
MDA – TBA (cor rosa) foi mensurada a 535 nm, após 20 minutos, à
temperatura ambiente (Espectrofotômetro Shimadzu UV-VISIBLE mod. 1650
PC, Kioto, Japão). As determinações (em triplicata) foram expressas em
percentual de inibição da produção de SRAT, calculado conforme a equação:
onde T60 (amostra e controle) são as leituras após 60 minutos de incubação, e
T0 (amostra e controle) são as medições feitas sem incubação, na presença e
ausência dos extratos, respectivamente.
55
Figura 12 – Fluxograma da determinação da peroxidação lipídica em cérebro de rato.
4.6 TESTE DE TOXICIDADE AGUDA DOS EXTRATOS AQUOSOS EM
RATOS
O teste de toxicidade aguda de dose única foi realizado segundo
protocolos experimentais da ANVISA (BRASIL, 2004) e da OECD (2001). Para
o desenvolvimento desse teste, foram utilizados 21 animais divididos por pesos
aproximados em sete grupos de três animais para cada dose (500 e 2000
mg/kg) e para o controle, sendo utilizada a média de 3 animais para preparar a
concentração e o volume adequados do extrato para cada grupo. Os extratos
foram administrados por gavage aos animais em dose única, não excedendo 1
mL/100 g de peso corporal. O grupo controle recebeu água destilada.
Nas primeiras 12 horas, foram realizadas observações comportamentais
sistemáticas, conforme o screening hipocrático (frênito vocal, piloereção,
hiperatividade, tremores, espasmos abdominais, diarreia e número de óbitos) a
cada 30 minutos. A partir do segundo dia, a observação foi feita a cada 6 horas
e depois no mínimo duas vezes por dia. Além disso, o consumo de água, de
ração e o peso dos animais foram verificados em intervalos de dois dias.
No 14º dia, os animais foram anestesiados com Tiopental e sacrificados
por deslocamento cervical, sendo em seguida submetidos à laparotomia para
56
coleta de sangue por punção cardíaca e evisceração. O QUADRO 2 mostra os
parâmetros utilizados na avaliação da toxicidade aguda dos extratos em
estudo. Além desses parâmetros, os animais sobreviventes foram autopsiados
e, caso fossem observadas alterações nas autópsias, estudos histopatológicos
dos órgãos acometidos deveriam ser realizados.
Parâmetros
Fisiológicos Hematológicos Bioquímicos
Peso dos animais Hemograma Uréia (UR)
Consumo de água Creatinina (CT)
Consumo de ração Alanina amino transferase (ALT)
Aspartato amino transferase (AST)
Gama glutamil transferase (GGT)
Bilirrubina total (BT) e frações (BD e BI)
Amilase (AMI) Proteínas totais (PT) Albumina (ALB) Glicose (GLI) Colesterol (COL) Triglicérides (TRIG)
QUADRO 2 – Parâmetros utilizados para avaliar alguns aspectos de toxicidade dos
extratos das plantas em estudo nos animais tratados.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos através da média ± desvio padrão
(Média ± DP). O tratamento estatístico foi efetuado através da análise de
variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey,
usando software estatístico R (R Development Core Team, 2008), sendo
considerado um nível de significância de 5%.
57
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
_______________________________________________________________
58
Face ao crescente interesse na busca de antioxidantes naturais em
plantas, devido ao seu potencial em prevenir os efeitos deletérios das ERO
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007), torna-se necessário executar um conjunto
de ensaios para explicar os diferentes mecanismos de ação dessas
substâncias e avaliar a atividade antioxidante de extratos e/ou moléculas contra
espécies oxidantes (HUANG et al., 2005).
Nesse sentido, o presente estudo foi conduzido inicialmente visando à
caracterização química dos extratos aquoso, hidroetanólico e etanólico, usando
a técnica de cromatografia em camada delgada e a determinação do teor de
fenólicos e flavonoides totais. A capacidade antioxidante foi avaliada mediante
ensaios para detectar o poder redutor, o sequestro do radical livre DPPH, a
inibição da oxidação no sistema β-caroteno/ácido linoleico e inibição da
peroxidação lipídica em homogenato de cérebro de ratos. Além disso,
considerando o uso popular de L.rigida, L. tomentosa e C. impressa, foi
avaliada a toxicidade aguda somente do extrato aquoso das referidas plantas.
5.1 DETECÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS COM CAPACIDADE
ANTIOXIDANTE
5.1.1 Cromatografia em Camada Delgada
A CCD, como técnica de triagem de extratos brutos, permite obter várias
informações sobre determinadas substâncias em um curto espaço de tempo e
com pouca quantidade de amostra. Assim, foi possível detectar substâncias de
natureza antioxidante nos extratos analisados, as quais foram capazes de
proteger o β-caroteno da oxidação após revelação com uma solução de β-
caroteno, evidenciadas por manchas alaranjadas (Figura 13).
A permanência das manchas após 24 horas de exposição à luz natural é
devida à ação de antioxidantes naturais, que estabilizaram o β-caroteno,
impedindo sua descoloração, uma vez que os carotenoides são pigmentos
fotorreceptores (MOREIRA; SHAMI, 2004). Sua oxidação, induzida
principalmente pela luz natural, leva ao desaparecimento gradual da coloração
laranja (MELÉNDEZ-MARTINEZ et al., 2004).
59
Figura 13 – Detecção de substâncias antioxidantes reveladas com solução de β- caroteno. Fase estacionária: placas de sílica-gel G, tipo 60 (0,25 mm) e fase móvel: n-butanol:ácido acético:água (5:1:4, v/v/v).
1 Catequina 2 C.marianus 3 Ext. Aq. L. rígida 4 Ext. Et. L. rigida 5 Ext. Het. L. rigida 6 Ext. Aq. L. tomentosa 7 Ext. Et. L. tomentosa 8 Ext. Het. L. tomentosa 9 Ext. Aq. C. impressa 10 Ext. Et. C. impressa 11 Ext. Het. C. impressa 10 Ext. Et. C. impressa
Esses resultados permitiram investigar a presença de substâncias
fenólicas e redutoras, que podem ser responsáveis pela inibição da oxidação
do β-caroteno. Assim, as manchas de coloração azul, reveladas com solução
de ferricianeto/cloreto férrico foram semelhantes àquelas reveladas com
solução de β-caroteno, indicando, portanto, a natureza polifenólica dessas
substâncias (Figura 14).
A reação com nitrato de prata amoniacal indicou a presença de
substâncias redutoras pelo aparecimento de manchas castanhas, pretas e
cinzas, como mostrado na figura 15.
60
Figura 14 – Detecção de substâncias fenólicas reveladas com solução de ferricianeto de potássio/ cloreto férrico. Fase estacionária: placas de sílica-gel G, tipo 60 (0,25 mm) e fase móvel: n-butanol:ácido acético:água (5:1:4, v/v/v).
1 Catequina 2 C.marianus 3 Ext. Aq. L. rígida 4 Ext. Et. L. rigida 5 Ext. Het. L. rigida 6 Ext. Aq. L. tomentosa 7 Ext. Et. L. tomentosa 8 Ext. Het. L. tomentosa 9 Ext. Aq. C. impressa 10 Ext. Et. C. impressa 11 Ext. Het. C. impressa 10 Ext. Et. C. impressa
Figura 15 – Detecção de substâncias redutoras reveladas com solução de nitrato de prata amoniacal. Fase estacionária: placas de sílica-gel G, tipo 60 (0,25 mm) e fase móvel: n-butanol:ácido acético:água (5:1:4, v/v/v).
1 Catequina 2 C.marianus 3 Ext. Aq. L. rígida 4 Ext. Et. L. rigida 5 Ext. Het. L. rigida 6 Ext. Aq. L. tomentosa 7 Ext. Et. L. tomentosa 8 Ext. Het. L. tomentosa 9 Ext. Aq. C. impressa 10 Ext. Et. C. impressa 11 Ext. Het. C. impressa 10 Ext. Et. C. impressa
61
5.1.2 Determinação de fenólicos totais
O teor de fenólicos totais nos extratos de L. rigida, L. tomentosa e C.
impressa, obtidos com os diferentes solventes, foi determinado por interpolação
da absorbância das amostras contra uma curva de calibração construída com o
padrão catequina (y = 0,0107x; R² = 0,9987), como mostrado na figura 16.
Figura 16 – Curva de calibração da catequina para determinar o conteúdo de substâncias fenólicas
A tabela 2 apresenta os resultados referentes ao teor de compostos
fenólicos nos diferentes extratos analisados. Os extratos etanólicos de folhas
de L. rigida (149,68±0,27 mg de eq. de catequina/g de extrato ) e de C.
impressa (96,26±1,24 mg de eq. de catequina /g de extrato), seguido do extrato
aquoso de L. tomentosa (70,95±0,36 mg de eq. de catequina /g de extrato),
foram aqueles que apresentaram os maiores teores desses compostos. Os
resultados sugerem que essas substâncias são componentes importantes
dessas plantas e, provavelmente, algumas de suas ações farmacológicas
podem ser atribuídas à presença desses constituintes.
Tabela 2 – Teor de fenólicos totais nos extratos das espécies analisadas
Planta Fenólicos totais (mg de eq. de catequina/ g de extrato)
Ext. aquoso Ext. etanólico Ext. hidroetanólico
L. rigida 39,25±0,87 149,68±0,27* 36,60±0,27
L. tomentosa 70,95±0,36 63,65±0,18 60,74±1,53
C. impressa 60,90±0,97 96,26±1,24 86,68±0,23
Os valores são expressos em média ± DP de triplicatas. * Indica o maior teor de fenólicos (ρ < 0,001)
y = 0,0107x
R2 = 0,9987
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 20 40 60 80
Concentração (µg de catequina/mL)
Ab
s(7
4 5
nm
)
62
Os polifenóis constituem as principais substâncias com atividade
antioxidante de plantas, largamente distribuídos em frutos, legumes, grãos,
sementes, folhas e raízes. Essa atividade pode estar associada,
principalmente, a sua propriedade redox, que desempenha um papel
importante na adsorção e neutralização de ERO, no sequestro de oxigênio
singlet e triplet ou na decomposição de peróxidos (KAROU et al., 2005).
Portanto essas moléculas são capazes de retardar o envelhecimento, aumentar
a defesa imunológica e diminuir o risco de doenças degenerativas
(SÄÄKSJARVI et al., 2008).
A variação no teor de fenólicos totais em diferentes plantas relatados na
literatura é devida à natureza complexa desse grupo de substâncias, além dos
métodos de extração e de análises (KALT et al., 2001). Ainda, o conteúdo de
substâncias fenólicas em plantas é influenciado por diversos fatores, alguns
intrínsecos à natureza (gênero, espécie e cultivo), e outros extrínsecos
(ambientais, agronômicos, manuseio e armazenagem) (TOMAS-BARBERAN;
ESPIN, 2001).
Poucos são os estudos quanto à composição de fenólicos na família
Chrysobalanaceae, no entanto algumas avaliações fitoquímicas evidenciaram a
presença de taninos, flavonoides, saponinas, esteroides livres e quinonas no
extrato hidroetanólico da casca de L. macrophylla (GOMES et al., 2006), e de
cromonas em folhas de L. arianeae Prance (CARVALHO et al., 2005).
5.1.3 Determinação de flavonoides totais
Os flavonoides, um grupo de substâncias polifenólicas naturalmente
presentes em plantas, são os constituintes responsáveis pelas colorações
amarelada, vermelha e azul dos frutos (ERLUND, 2004). Na atualidade, a
importância dos flavonoides deve-se aos múltiplos benefícios proporcionados à
saúde, evidenciados por estudos clínicos e epidemiológicos que contribuem na
prevenção e no tratamento de doenças cardiovasculares, neurodegenerativas,
osteoporose e câncer do pulmão (YAO et al., 2004; LAMPILA et al., 2009).
O teor de flavonoides foi determinado por interpolação da absorbância
das amostras contra uma curva de calibração construída com o padrão
quercetina (y = 0,001x; R² = 0,9975), representada na figura 17.
63
Figura 17 – Curva de calibração da quercetina para determinar o conteúdo de flavonoides
A análise dos extratos brutos em estudo (Tabela 3) mostra que os
extratos etanólicos foram aqueles que apresentaram os maiores teores de
flavonoides (L. rigida: 96,71±1,32; L. tomentosa: 38,97±0,52 e C. impressa:
34,92±2,66 mg de eq. de quercetina / g de extrato).
Tabela 3 – Teor de flavonoides totais nos extratos brutos analisados
Planta Flavonoides totais (mg de eq. de quercetina/g de extrato)
Ext. aquoso Ext. etanólico Ext. hidroetanólico
L. rigida 7,85±0,19 96,71±1,32* 11,52±0,34
L. tomentosa 10,75±0,04 38,97±0,52 21,54±0,24
C. impressa 2,58±1,17 34,92±2,66 2,73±0,03
Os valores são expressos em média ± DP de triplicatas. * Indica o maior teor de flavonóides (ρ < 0,001)
Os resultados indicam que o etanol foi o solvente mais eficiente na
extração dos flavonoides, para as plantas em estudo. O extrato etanólico de L.
rigida apresentou o mais alto teor de substâncias de natureza polifenólica
devido, principalmente, à grande variedade de moléculas de caráter hidrofílico
presentes na família Chrysobalanaceae, tais como flavonoides e taninos
(CASTILHO et al.,2000). Assim, sugere-se que a atividade antioxidante dos
extratos deve-se à propriedade redox dessas moléculas envolvidas na
adsorção e na neutralização de radicais livres e/ou na decomposição de
peróxidos (KAROU et al., 2005).
y = 0,0013xR² = 0,9975
0 500 1000 1500 2000
Concentração (µg de quercetina/mL)
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Ab
s(4
15
nm
)
64
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE NOS EXTRATOS BRUTOS
IN VITRO
Considerando que a capacidade antioxidante é um parâmetro
amplamente empregado para determinar substâncias bioativas, diferentes
metodologias analíticas foram utilizadas para avaliar a referida capacidade
antioxidante nos extratos das plantas em estudo, tais como poder redutor,
capacidade de sequestro do radical livre DPPH, inibição da oxidação no
sistema β-caroteno/ácido linoleico e inibição da peroxidação lipídica.
5.2.1 Determinação do poder redutor
As Figuras 18, 19 e 20 mostram a capacidade redutora dos extratos,
avaliada através do aumento da absorbância e sua correlação com o aumento
da atividade antioxidante. Os extratos apresentaram um poder redutor
concentração-dependente.
Os extratos aquoso (0,137±0,003) e etanólico (0,868±0,014) de L. rigida
(Figura 18), nas concentrações de 25 µg/mL e 200 µg/mL, respectivamente,
apresentaram resultados mais significativos que o extrato hidroetanólico e C.
marianus, utilizado como controle positivo.
Figura 18 – Capacidade de redução do ferro (Fe3+) pelos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de L. rigida.
a = difere sig. do extrato aquoso de L. rigida b = difere sig. do extrato etanólico de L. rígida c = difere sig. do extrato hidroetanólico de L. rigida d = difere sig. da catequina e = difere sig. de C. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
a'b'c'e'a'b'c'e'
a'b'c'e'
a'b'c'e'
a'b#c'e'
a#b'c#
a'b'c'a'b'c'
e#b'c'e'
c*
c*
e#c'e'
c#
a#c'
e*0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
12,5 25 50 100 200
Ab
s (7
00 n
m)
Concentração (μg/mL)Catequina C. marianus L. rigida Aq. L. rigida Et. L. rigida HEt.
65
Na espécie L. tomentosa, o extrato aquoso foi estatisticamente
significativo, diferindo dos demais extratos e C. marianus (ρ < 0,001) (Figura
19).
Dentre todos os extratos, o extrato hidroetanólico de C. impressa
(0,119±0,007 a 0,958±0,058) foi aquele que apresentou a melhor capacidade
redutora na concentração de 200 µg/mL, mas não difere estatisticamente da
catequina e do extrato aquoso nessa mesma concentração (Figura 20).
Os extratos avaliados apresentaram como já foi mencionado, um
expressivo poder redutor concentração-dependente. As propriedades redutoras
estão associadas à presença de substâncias de natureza fenólica nesses
extratos, as quais exercem atividade antioxidante ao estabilizar e bloquear as
reações da cadeia radicalar ao doar elétrons (SHIMADA et al., 1992).
Figura 19 – Capacidade de redução do ferro (Fe3+) pelos extratos aquoso, etanólico e
hidroetanólico de L. tomentosa.
a = difere sig. do extrato aquoso de L. tomentosa
b = difere sig. do extrato etanólico de L. tomentosa
c = difere sig. do extrato hidroetanólico de L. tomentosa d = difere sig. da catequina e = difere sig. de C. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
a'b'c'e'a'b'c'e'
a'b'c'e'
a'b'c'e'
a#b'c'e'
b'c#
b'
b'
b'c'e#
b'c'e'
b'c'e'
b#
a'b' b*
b#
b'e'
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
12,5 25 50 100 200
Ab
s (7
00 n
m)
Concentração (μg/mL)
Catequina C. marianus L. tomentosa Aq. L. tomentosa Et. L. tomentosa HEt.
66
Figura 20 – Capacidade de redução do ferro (Fe3+) pelos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de C. impressa.
a = difere sig. do extrato aquoso de C.impressa
b = difere sig. do extrato etanólico de C.impressa
c = difere sig. do extrato hidroetanólico de C.impressa d = difere sig. da catequina e = difere sig. deC. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
5.2.2 Sequestro do radical livre DPPH
Considerando a capacidade dos antioxidantes em sequestrar radicais
livres, a metodologia baseada no sequestro do DPPH é largamente utilizada
para detectar a capacidade antioxidante de extratos vegetais.
A atividade de sequestro de radical livre (SRL) dos extratos em estudo
apresentou um comportamento concentração-dependente, mostrando uma
capacidade superior, diferindo estatisticamente dos valores observados para C.
marianus, um antioxidante de uso clínico (Figuras 21 a 23). Para os extratos de
L. rigida (Figura 21), o etanólico apresentou o melhor %SRL na concentração
de 500 µg/mL (72,62±0,78%), em relação aos extratos aquoso e hidroetanólico,
enquanto os valores de SRL para os extratos aquoso e hidroetanólico de L.
tomentosa foram similares, diferindo estatisticamente dos resultados do extrato
etanólico (Figura 22).
a'b'c'e'
a'b'c'e'
a'b'c'e'
a'b'e'
a'b'c'd'
e#
b'e'
e#
e'
a'c'd'
a'b'e'
a'b'e'
a'b'e'
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
12,5 25 50 100 200
Ab
s (7
00 n
m)
Concentração (μg/mL)Catequina C. marianus C. impressa Aq. C. impressa Et. C. impressa Het.
67
Figura 21 – Capacidade de sequestro do DPPH pelos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de L. rigida.
a = difere sig. do extrato aquoso de L. rigida b = difere sig. do extrato etanólico de L. rigida
c = difere sig. do extrato hidroetanólico de L. rigida d = difere sig. da catequina e = difere sig. de C. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
Figura 22 – Capacidade de sequestro do DPPH pelos extratos aquoso, etanólico e
hidroetanólico de L. tomentosa.
a = difere sig. do extrato aquoso de L. tomentosa b = difere sig. do extrato etanólico de L. tomentosac = difere sig. do extrato hidroetanólico de L. tomentosa d = difere sig. da catequina e = difere sig. de C. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
e* e# e#e'
a*e' e'e'
a'e' a'e'
e'
a'c#e'a'e'
e' d'e' d'e'
0
20
40
60
80
100
Catequina C. marianus L.rigida Aq. L. rigida Et. L. rigida HEt.
SR
L (
%)
62,5 µg/mL 125 µg/mL 250 µg/mL 500 µg/mL 1000 µg/mL
b'e' b'e'
b'e'
e#
b'e'
b'e'
e'
b'e'
d#e'e'
d#e'
0
20
40
60
80
100
Catequina C. marianus L. tomentosa Aq. L. tomentosa Et. L. tomentosaHEt.
SR
L (
%)
62,5 µg/mL 125 µg/mL 250 µg/mL 500 µg/mL 1000 µg/mL
68
Figura 23 – Capacidade de sequestro do DPPH pelos extratos aquoso, etanólico e
hidroetanólico de C.impressa.
a = difere sig. do extrato aquoso de C.impressa b = difere sig. do extrato etanólico de C.impressa c = difere sig. do extrato hidroetanólico de C.impressa d = difere sig. da catequina e = difere sig. deC. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
O SRL apresentado pelo extrato hidroetanólico de C. impressa foi o
maior percentual de SRL observado, com valores oscilando entre 86,99±2,30 e
88,51±0,76%, nas concentrações de 500 e 1000 µg/mL, respectivamente
(Figura 23). Esse resultado foi significante quando comparado aos obtidos com
os extratos das outras espécies.
Sendo o DPPH um radical estável, apenas agentes redutores fortes são
capazes de reagir com esses radicais (SCHWARZ et al., 2001). Portanto pode-
se inferir que a atividade antioxidante dos extratos é decorrente da presença de
agentes redutores, que ao doar hidrogênio para as espécies radicalares mais
reativas, geram outras menos reativas. As moléculas redutoras também podem
atuar na etapa final da cadeia radicalar (CZINNER et al., 2000).
Os resultados apresentados corroboram dados da literatura que
mostram a capacidade de extratos de folhas de C. grandiflora e de L.
licaniaeflora em sequestrar radicais livres, inclusive o DPPH, devido à presença
de flavonoides e de moléculas, tais como a flavanona 8-hidoxi-naringenina e
canferol 3-O-α-raminosídeo, respectivamente (BRACA et al., 2002; ZUQUE et
al., 2004).
a'b'e'b'e'
e'
a'b'e'
b*e'
e'
a'b'e'd'e' d#e' d'e'
0
20
40
60
80
100
Catequina C. marianus C. impressa Aq. C. impressa Et. C. impressa Het.
SR
L (
%)
62,5 µg/mL 125 µg/mL 250 µg/mL 500 µg/mL 1000 µg/mL
69
A propriedade antioxidante de polifenóis é um parâmetro importante na
avaliação da capacidade de extratos de plantas de inibirem ou de retardarem a
degradação oxidativa de lipídios, especialmente a reação em cadeia, em
emulsões ou homogenatos de tecidos. Assim, os valores de SRL determinados
experimentalmente são justificados pela presença de substâncias de natureza
antioxidantes (polifenóis e flavonoides totais), como mostrado nos itens 5.1.2 e
5.1.3.
5.2.3 Inibição da oxidação no sistema β-caroteno/ácido linoleico
A inibição da oxidação no sistema β-caroteno/ácido linoleico mensurada
por meio da descoloração do β-caroteno, apresentada nas figuras 24, 25 e 26,
mostrou um aumento da capacidade antioxidante concentração-dependente
dos extratos, que foram eficientes ao retardar a oxidação do β-caroteno. Os
resultados obtidos com os extratos aquosos de L. rigida (Figura 24), L.
tomentosa (Figura 25) e C. impressa (Figura 26) apresentaram os melhores
potenciais antioxidantes.
Contudo o extrato aquoso de C. impressa foi aquele que apresentou o
maior potencial antioxidante, entre 15,64±8,10 e 86,63±2,95% (ρ < 0,001),
quando comparado à inibição da oxidação observada com os outros extratos,
e, ainda, com a inibição obtida com os padrões de referência, catequina
(10,98±4,49 a 50,20±2,62%) e C. marianus (23,14±2,70 a 66,42±3,13%).
70
Figura 24 – Inibição da oxidação no sistema β-Caroteno/ácido linoleico pelos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de L. rigida
a = difere sig. do extrato aquoso de L. rigida
b = difere sig. do extrato etanólico de L. rigida
c = difere sig. do extrato hidroetanólico de L. rigida d = difere sig. da catequina e = difere sig. de C. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
Figura 25 – Inibição da oxidação no sistema β-Caroteno/Ácido Linoleico pelos
extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de L. tomentosa
a = difere sig. do extrato aquoso de L. tomentosa b = difere sig. do extrato etanólico de L. tomentosa
c = difere sig. do extrato hidroetanólico de L. tomentosa d = difere sig. da catequina e = difere sig. deC. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
a#c#e*
a# a*c*e#
a'c'e#
e*
a*c*a#c#e#
a'c*a*e* a'c'e'
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
50 100 150 200 250
Inib
ição
da
oxi
daç
ão (%
)
Concentração (μg/mL)
Catequina C. marianus L.rigida Aq. L. rigida Et. L. rigida HEt.
e*
a* a*
a#e#
a'c#e'a#d#
0
10
20
30
40
50
60
70
80
50 100 150 200 250
Inib
ição
da
oxi
daç
ão (
%)
Concentração (μg/mL)Catequina C. marianus L. tomentosa Aq. L. tomentosa Et. L. tomentosa Het.
71
Figura 26 – Inibição da oxidação no sistema β-Caroteno/Ácido Linoleico pelos
extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de C.impressa
a = difere sig. do extrato aquoso de C.impressa
b = difere sig. do extrato etanólico de
C.impressa c = difere sig. do extrato hidroetanólico de C.impressa d = difere sig. da catequina e = difere sig. deC. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
Segundo Hassimotto et al. (2005), a capacidade antioxidante é
classificada em níveis de inibição da oxidação como alta (>70%), intermediária
(40 a 70%) ou baixa (<40%). Comparando-se os resultados obtidos com esses
índices, o percentual de inibição da oxidação dos extratos das espécies em
estudo está acima de 70%, portanto podem ser classificados no nível de alta
inibição da oxidação. Consequentemente, a eficiência desses extratos em inibir
a oxidação é um reflexo do potencial de interação entre o extrato e os
componentes da emulsão, além da complexidade da composição dos extratos,
cujos compostos podem agir sinergicamente devido às diferenças na
reatividade com os diferentes oxidantes, gerando uma melhor proteção do
sistema.
Em se tratando de extratos de plantas, a complexa mistura de
substâncias, com diferentes modos de ação, pode gerar interações que tornam
os extratos muito mais efetivos. O sinergismo pode ser também devido à
interação direta entre os antioxidantes (MORTENSEN, SKIBSTED, 1997). De
acordo com Lila e Raskin (2005), a potencialização sinérgica ou aditiva ocorre
a'c' a'c'a'c'
c*
b# a'c' a#b#c#e#
a#b'c#d*
a#b*e*
a'c' a'c'
a'c'
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
50 100 150 200 250
Inib
ição
da
oxi
daç
ão (
%)
Concentração (μg/mL)
Catequina C. marianus C. impressa Aq. C. impressa Et. C. impressa Het.
72
em termos de endointerações ou interações na parte interna da planta, que
podem modificar os efeitos farmacológicos, e por exointerações, que são
interações entre os componentes relacionados da planta e/ou as drogas.
5.2.4 Inibição da peroxidação lipídica em homogenato de cérebro
A peroxidação lipídica é uma reação em cadeia, na qual átomos de
hidrogênio são abstraídos de ácidos graxos poli-insaturados (LH), produzindo
radicais alquil lipídicos (L∙) que, ao reagirem com o oxigênio molecular, geram
radicais peroxil lipídicos (LOO∙). Na ausência de antioxidantes de quebra de
cadeia, os radicais peroxil abstraem átomos de hidrogênio do substrato lipídico
oxidado, resultando em um novo radical alquil lipídico (L∙), e, portanto,
propagando a reação em cadeia. Os hidroperóxidos (LOOH) são produzidos
concomitantemente e reduzidos por metais de transição ou reação de Fenton,
radicais alcoxil instáveis e, eventualmente, produtos de oxidação secundária
(e.g., malonildialdeído). Contudo a reação entre os radicais peroxil lipídicos e
os lipídios oxidados é relativamente lenta, proporcionando aos antioxidantes
fenólicos (fOH) a oportunidade de interceptar os radicais peroxil, interrompendo
a propagação da reação em cadeia (LAMBERT; ELIAS, 2010). Isso depende
da entalpia de dissociação dos antioxidantes, e como a ligação O-H do grupo
hidroxila é mais fraca, a reação com o radical peroxil é mais rápida (WRIGHT et
al., 2001). Além disso, o radical semiquinona (fO∙) resultante pode ser
relativamente estável, reagindo lentamente com os lipídios oxidados, o que é
conseguido mediante estabilização da ressonância dos radicais fO∙ (MORAN et
al., 1997).
A inibição da peroxidação lipídica em homogenato de cérebro pelos
extratos das plantas em estudo apresentou resultados que indicaram uma
maior eficiência quando comparados às substâncias utilizadas como referência.
Os resultados mostraram que os extratos aquoso (83,65±4,32 a
101,96±0,96%) e etanólico (82,21±4,80 a 101,96±0,94%) de L. rigida
apresentaram a maior capacidade em inibir a peroxidação lipídica (%SRAT),
estatisticamente significativa em relação aos demais extratos (Figura 27),
enquanto que com L. tomentosa e C.impressa apenas os extratos aquosos
apresentaram uma diferença estatística significante, como mostrado nas
figuras 28 e 29, respectivamente.
73
Os resultados da inibição da oxidação do sistema β-caroteno/ácido
linoleico obtidos com os extratos foram confirmados pela inibição da produção
de SRAT em homogenato de cérebro de rato. Todos os extratos analisados
diminuíram a formação de produtos da autoxidação no homogenato, mostrando
uma efetividade na atividade antioxidante in vitro de maneira concentração-
dependente em relação aos controles. Os maiores efeitos inibitórios da
peroxidação lipídica foram observados com os extratos aquoso e etanólico de
L. rigida, e os aquosos de L. tomentosa e de C. impressa.
A inibição da peroxidação lipídica de todos os extratos foi maior que a
apresentada pela catequina e por C. marianus, utilizados como controles
positivos. Portanto os extratos de L. rigida, de L. tomentosa e de C. impressa
podem agir como potenciais supressores ou inibidores da peroxidação lipídica.
Os resultados experimentais apontam efeitos benéficos antioxidantes, ao
retardar o início da autoxidação, e ao sequestrar produtos primários e
secundários. Assim, ocorreu inibição ou retardamento em uma ou mais etapas
da reação em cadeia de radicais livres.
Figura 27 – Inibição da produção de SRAT pelos extratos aquoso, etanólico e
hidroetanólico de L. rigida. a = difere sig. do extrato aquoso de L. rigida
b = difere sig. do extrato etanólico de L. rigida
c = difere sig. do extrato hidroetanólico de L. rigida d = difere sig. da catequina e = difere sig. de C. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
c#d'e' c*d'e'
d'e'
d'e'd'e' d'e'
d'e' d'e' d'e'd'e' d'e' d'e'd'e* d'e#
d#
0
20
40
60
80
100
120
Catequina C. marianus L.rigida Aq. L. rigida Et. L. rigida HEt.
SR
AT
(%
)
1,04 µg/mL 2,08 µg/mL 4,16 µg/mL 8,33 µg/mL 16,66 µg/mL
74
Figura 28 – Inibição da produção de SRAT pelos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de L. tomentosa.
a = difere sig. do extrato aquoso de L. tomentosa b = difere sig. do extrato etanólico de L. tomentosa c = difere sig. do extrato hidroetanólico de L. tomentosa d = difere sig. da catequina e = difere sig. de C. marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
Figura 29 – Percentual de inibição da produção de SRAT pelos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico de C.impressa.
a = difere sig. do extrato aquoso de C.impressa b = difere sig. do extrato etanólico de C.impressa c = difere sig. do extrato hidroetanólico de C.impressa d = difere sig. da catequina e = difere sig. deC. Marianus * ρ< 0,05; #ρ< 0,01; ‘ ρ< 0,001
b'c'd'e'
d'e'b*c#d'e'
d'e'
d'e'
d'e'b#d'e'
d'e' b#d'e'd'e' d'e' d'e'd'e* d'e* d'e*
0
20
40
60
80
100
120
Catequina C. marianus L. tomentosaAq.
L. tomentosa Et. L. tomentosaHet.
SR
AT
(%
)
1,04 µg/mL 2,08 µg/mL 4,16 µg/mL 8,33 µg/mL 16,66 µg/mL
c'd'e'
d'e'
c#d'e'
b*d'e'
d'e'
b*d'e'd'e' d'e'd'e'd'e' d'e' d'e'd'e# d'e* d'e#
0
20
40
60
80
100
120
Catequina C. marianus C. impressa Aq. C. impressa Et. C. impressaHet.
SR
AT
(%
)
1,04 µg/mL 2,08 µg/mL 4,16 µg/mL 8,33 µg/mL 16,66 µg/mL
75
5.3 AVALIAÇÃO DAS FRAÇÕES FH, FC E FA DO EXTRATO
HIDROETANÓLICO DE C. IMPRESSA IN VITRO
Com a finalidade de determinar o composto bioativo do extrato
hidroetanólico de C. impressa, que mostrou a melhor capacidade antioxidante
entre todas as espécies analisadas, o extrato hidroetanólico foi fracionado por
partição líquido-líquido com solventes em ordem crescente de polaridade,
obtendo-se as frações hexânica, clorofórmica e acetato de etila, FH, FC e FA,
respectivamente. Estas foram testadas frente ao teor de flavonoides totais e
radical livre DPPH e, posteriormente, analisadas espectroscopicamente por
RMN 1H.
5.3.1 Determinação do teor de flavonoides totais nas frações FH, FC e FA
do extrato hidroetanólico de C. impressa
A Tabela 4 mostra os teores de flavonoides nas frações em estudo,
destacando-se a fração acetato de etila, que apresentou o maior teor de
flavonoides totais (271,11±4,90 mg de eq. de quercetina / g de extrato).
Tabela 4 – Teor de flavonoides totais nas frações hexânica, clorofórmica e acetato de
etila do extrato hidroetanólico de C. impressa
Fração Flavonoides totais (mg de eq. de quercetina/g de extrato)
Ext. hidroetanólico de C. impressa
Hexânica 91,49±18,25
Clorofórmica 153,21±16,56
Acetato de etila 271,11±4,90*
Os valores são expressos em média ± DP de triplicatas. * Indica o maior teor de flavonoides (ρ < 0,001)
Jang (2004) isolou da fração de acetato de etila do extrato hidroetanólico
da casca de Couepia ulei um novo produto natural, eritro-2,3-bis(4-hidroxi-3-
metoxifenil)-3-etoxipropano-1-ol, e um composto já conhecido, a evofolina-B.
Enquanto Pires (2009), utilizando o mesmo tipo de fração, detectou a presença
de três flavonoides (2R, 3R-taxifolina 3-O-β-D-xilopiranosídeo, miricetina 3-O-α-
L-ramnopiranosídeo e quercetina 3-O-α-L-ramnopiranosídeo) no extrato
hidroetanólico de folhas de Licania octandra.
76
5.3.2 Sequestro do radical livre DPPH nas frações FH, FC e FA do extrato
hidroetanólico de C. impressa
De forma geral, verifica-se que a fração acetato tem um comportamento
melhor que a fração clorofórmica e a fração hexânica, principalmente em
relação às concentrações 250 µg/ml e 500 µg/ml, em que a diferença é
estatisticamente significativa (Figura 30).
Figura 30 – Capacidade de sequestro do DPPH pelas frações hexânica, clorofórmica e acetato de etila do extrato hidroetanólico de C.impressa.
a = difere sig. da fração hexânica d = difere sig. da Catequina
b = difere sig. da fração clorofórmica e = difere sig. de C. marianus
c = difere sig. da fração acetato de etila * ρ < 0,05; # ρ < 0,01; ‘ ρ < 0,001
Em relação à evidente atividade antioxidante da fração acetato de etila,
a literatura também relata que outras espécies como Mangifera indica
(BADMUS et al., 2011), Enhydra fluctuans (SANNIGRAHI et al., 2010),
Tephrosia procumbens (PATWEKAR et al., 2010), Convolvulus arvensis
(THAKRAL et al., 2010) e Euphorbia hirta (KANDALKAR et al., 2010)
apresentaram uma maior atividade de sequestro do radical livre DPPH,
atividade esta confirmada pela presença de flavonoides.
a'b' a#b#
a'b'c'e'
a# a'
a#
a'b'c*e'
a'b#e'
a'b*e'
e'
a'e'
a'b#e'e' e'
e' e'
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
Catequina C. marianus Fração Hexânica Fração Clorofórmica Fração Acetato de Etila
SR
L (
%)
62,5 µg/mL 125 µg/mL 250 µg/mL 500 µg/mL 1000 µg/mL
77
5.3.3 Análise espectroscópica das frações FH, FC e FA do extrato
hidroetanólico de C. impressa por RMN 1H
As frações FH, FC e FA foram analisadas por RMN 1H, para determinar
as possíveis classes de compostos orgânicos presentes em cada fração,
baseados na teoria do deslocamento químico.
O espectro de RMN 1H da fração FH (Figura 31) apresentou sinais entre
δ 0,5 - 2,5 ppm, referentes a hidrogênios ligados a carbonos sp3 não
oxigenados e sinais entre δ 5,0 - 5,5 ppm, indicativos da presença de duplas
ligações, característicos da presença de esqueletos terpênicos na fração. Esse
espectro apresentou ainda sinal largo e intenso em δ 1,20 ppm referente a
vários carbonos sp3 metilênicos ( -CH2-), que indica grande quantidade de
ácidos graxos na fração.
O espectro da fração FH não apresentou nenhum sinal referente a
hidrogênios aromáticos, que foram visualizados apenas nos espectros das
frações clorofórmica (FC) e acetato de etila (FA). No espectro de RMN 1H da
fração FC (Figura 32), também foram observados os sinais característicos da
presença de terpenos e ácidos graxos, mas em menor quantidade que na
fração hexânica. Nesse espectro foi possível observar sinais entre δ 3,0 - 5,0
ppm, relacionados a carbonos sp3 oxigenados, indicativos da presença de
unidades carboidráticas na fração clorofórmica.
78
Figura 31 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, MeOD/CDCl3) da FH.
79
Figura 32 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, MeOD/CDCl3) da FC.
80
No espectro de RMN 1H da fração FA (Figura 33), foram observados
inúmeros sinais entre δ 5,5 - 8,0 ppm, referentes a hidrogênios ligados a
carbonos sp2, característicos da presença de núcleos aromáticos. Ainda nesse
espectro, foram observados sinais em δ 8,9 e 9,2 ppm, que sugerem a
presença de compostos fenólicos, ratificados pelos sinais em δ 5,5 - 6,0 ppm
característicos de hidrogênios aromáticos protegidos, possivelmente pelas
hidroxilas fenólicas. Foram observados ainda sinais referentes a açúcar, ácidos
graxos e compostos terpênicos em menor proporção que as demais frações.
Esses resultados são compatíveis com os dados da atividade
antioxidante pelo sequestro do radical DPPH das frações, que foram mais
promissores para a fração acetato de etila, quando comparados com as demais
frações, possivelmente pela presença dos compostos fenólicos, bastante
reportados na literatura por possuir essa propriedade. Esse fato também foi
comprovado pela constatação de maior teor de flavonoides na fração acetato
de etila em relação às outras frações.
81
Figura 33 – Espectro de RMN 1H (500 MHz, MeOD/CDCl3) da FA, destacando-se a região referente aos hidrogênios aromáticos.
82
5.4 TOXICIDADE AGUDA DOS EXTRATOS AQUOSOS EM RATOS
Diante dos resultados da capacidade antioxidante in vitro, a avaliação da
toxicidade aguda foi efetuada com os extratos aquosos de L. rigida, de L.
tomentosa e de C. impressa, considerando a existência de poucos relatos na
literatura e, ainda, por eles serem mais empregados na medicina popular.
5.4.1 Parâmetros fisiológicos
Os parâmetros fisiológicos, tais como consumo de ração e de água, e o
peso dos animais dos grupos tratados com 500 mg/kg e 2000 mg/kg de extrato
e do grupo controle, foram determinados no primeiro, sétimo e décimo quarto
dia de experimento, como mostrados na tabela 5. Durante o período
experimental, foi observado um equilíbrio no peso corpóreo entre animais do
mesmo grupo, embora tenha ocorrido um discreto ganho de peso.
Tabela 5 – Resultados do consumo de ração e água e peso dos animais
1° dia 7° dia 14° dia
Ração Água
Peso (g)
Ração Água
Peso (g)
Ração Água
Peso (g)
C 82 170 318±31,04 69 120 330±26,66 69,25 110 334±21,54
G1 64 135 295±8,08 68 105 303±8,50 73,35 125 313±15,94
G2 72 140 303±2,64 70,75 120 310±1 63,25 110 317±5,50
G3 85,5 170 313±5,19 69,5 112,5 315±1,52 66,5 117,5 319±4
G4 53,3 100 275±9,29 49,5 77,5 267±20,03 54,45 87,5 275±24,57
G5 64,4 135 277±1 55 95 280±8,50 65 117,5 282±3,05
G6 55 100 281±4,58 61,7 97,5 290±7,50 60,5 95 293±6,02
C- controle G1- L. rigida 500 mg/kg G2- L. tomentosa 500 mg/kg G3- C. impressa 500mg/kg
G4- L. rigida 2000 mg/kg G5- L. tomentosa 2000 mg/kg G6- C. impressa 2000mg/kg
Os valores são expressos em média ± DP de triplicatas.
83
5.4.2 Parâmetros hematológicos
O tratamento com os extratos aquosos na concentração de 500 mg/kg e
2000 mg/kg, durante 14 dias consecutivos, não induziu modificações no perfil
hematológico dos ratos (Tabela 6). Entretanto, os valores da contagem global
de hemácias (RBC), hemoglobina (HGB) e hematócrito (HCT), importantes
indicadores na determinação das anemias, apresentaram uma diminuição nos
grupos G4 e G5 tratados com a dose de 2000 mg/kg dos extratos de L. rigida e
L. tomentosa, respectivamente, quando comparados ao grupo controle,
sugerindo indícios de possível anemia durante o período de tratamento.
A contagem diferencial de leucócitos (L), monócitos (M) e granulócitos
(G) apresentou-se semelhante entre os grupos (Tabela 3). A monocitose
observada nos grupos tratados com o extrato (500 mg/kg e 2000 mg/kg) pode
ser caracterizada como inespecífica, pois a contagem global de leucócitos não
apresentou modificações. Segundo Klaassen e Watkins (2001), nem a
monocitose nem a monocitopenia parecem ser especificamente induzidas por
agressões químicas.
84
Tabela 6 – Resultados dos parâmetros hematológicos
Grupos HEMOGRAMA
RBC (106/mm3)
HGB (g/dL)
HCT (%)
WBC (103/mm3)
L (%)
M (%)
G (%)
PLT (103/mm3)
C 8,4±0,21 16±0,28 47,5±0,98 7,6±0,84 89,2±1,76 8,9±1,41 1,85±0,35 865±9,89
G1 8,4±0,85 16,1±2,15 45,4±5,91 11,2±4,31 86,6±1,36 10,5±0,11 2,8±1,24 854,6±146
G2 7,6±1,49 14,5±2,72 47,7±3,97 7,9±3,85 75,5±6,56 15,2±2,92 9,2±3,93 645,6±211
G3 8,7±0,51 16,2±0,11 52,1±8,97 11,2±4,30 81,6±8,78 13,2±5,33 5,0±3,49 830,6±71,5
G4 5,1±1,95 11,8±2,90 34,9±7,84 5,0±1,55 80,6±1,43 14,7±0,92 4,6±1,35 489,6±359
G5 6,4±2,35 12,9±4,49 38,6±14,53 6,3±1,56 83,7±7,06 11,4±4,37 4,8±2,85 616,6±178
G6 9,0±3,84 21,7±7,52 42,9±10,23 8±6,84 81,9±7,79 12,9±4,76 5,1±3,06 813,3±608
C- controle G1- L. rigida 500 mg/kg G2- L. tomentosa 500 mg/kg G3- C. impressa 500mg/kg
G4- L. rigida 2000 mg/kg G5- L. tomentosa 2000 mg/kg G6- C. impressa 2000mg/kg
Os valores são expressos em média ± DP de triplicatas.
RBC- Contagem global de hemácias; HGB- Hemoglobina; HCT- Hematócrito; WBC- Contagem global de leucócitos;
L %- Percentual relativo de linfócitos; M %- Percentual relativo de monócitos; G%- Percentual relativo de granulócitos;
PLT- Plaquetas.
85
5.4.3 Parâmetros bioquímicos
A análise das enzimas aminotransferases (AST e ALT) mostrou um
aumento nos níveis séricos de AST para os grupos controle e o G2 (L.
tomentosa, 500 mg/kg) (Tabela 7).
Ainda em relação aos valores de creatinina entre os grupos controle e
G2 (L. tomentosa, 500 mg/kg), foi observada uma diferença que pode sugerir
diminuição na filtração glomerular.
A diminuição da filtração glomerular, de forma geral, leva ao aumento
das concentrações de ureia e creatinina. Em ratos, níveis séricos alterados
para ureia não são bons indicadores de lesão renal, mas alterações na
creatinina podem ser um indicador confiável para avaliar a presença de lesão,
pois seu nível sérico não é influenciado pela dieta, idade e sexo.
Os extratos aquosos das espécies avaliadas não ofereceram risco
toxicológico, uma vez que, durante o período experimental, nenhum animal foi
a óbito. Esses extratos apresentaram uma boa capacidade antioxidante in
vitro.
Ao término do período de observação, os animais foram sacrificados e
autopsiados. De acordo com a Resolução nº 90 da ANVISA (BRASIL, 2004),
como não foram observadas alterações nas autópsias, estudos
histopatológicos dos órgãos não foram realizados.
86
Tabela 7 – Resultados dos parâmetros bioquímicos
PB GRUPOS
C G1 G2 G3 G4 G5 G6
UR 54,5±7,77 44,3±7,23 75±4,24 40,5±2,12 55±7,93 44,3±0,57 47,3±4,04
CT 0,6±0,07 0,6±0,1 0,75±0,07 0,5±0,07 0,6±0,05 0,6±0,11 0,7±0,00
ALT 97±4,24 80,3±16,25 93,5±17,67 75,5±2,12 95±11,53 80,3±6,65 90±25,51
AST 250±23,33 182±21,96 301±109 182±22,62 233±10,69 173±12,28 209±15,30
GGT 12±1,41 3,7±5,40 0,7±0,00 0,6±0,14 06±0,00 0,6±0,05 0,6±0,05
BT 0,38±0,26 0,31±0,02 0,28±0,14 0,20±0,007 0,38±0,15 0,24±0,06 0,20±0,13
BD 0,10±0,007 0,10±0,01 0,16±0,11 0,15±0,02 0,09±0,01 0,12±0,01 0,10±0,09
BI 0,28±0,26 0,20±0,02 0,18±0,11 0,05±0,01 0,29±0,14 0,11±0,05 0,13±0,09
AMI 1029±3,53 824±158 1039±72,8 749±98,28 758±147 707±8,38 803±66,52
COL 54,5±36,06 33,6±26,83 51±11,31 31±29,69 32±21,65 30,3±12,22 22±18,19
PT 6,6±0,00 6,4±1,28 7,2±0,91 5,9±0,84 6,8±0,26 6,3±0,45 6,73±0,60
ALB 3,1±0,42 2,7±0,45 3,1±0,28 2,6±0,21 2,69±0,37 2,9±0,3 2,6±0,3
GLO 3,5±0,42 3,7±0,83 4,1±0,63 3,2±0,63 4,1±0,11 3,4±0,69 4,1±0,55
GLI 122±21,92 152±26,35 136±77,0 130±50,2 101±32,50 163±54,5 125±12,50
TRIG 53±5,65 66,6±13,6 81±15,55 35,5±2,12 48,6±4,50 62,3±20,23 68,6±34,38
C- controle G1- L. rigida 500 mg/kg G2- L. tomentosa 500 mg/kg G3- C. impressa 500mg/kg
G4- L. rigida 2000 mg/kg G5- L. tomentosa 2000 mg/kg G6- C. impressa 2000mg/kg
Os valores são expressos em média ± DP de triplicatas.
PB- Parâmetros bioquímicos; UR-Uréia (mg/dL); CT- Creatinina (mg/dL); ALT- Alanina amino transferase (U/L); AST- Aspartato amino transferase (U/L); GGT- Gama glutamil transferase (U/L); BT- Bilirrubina total (mg/dL); BD- Bilirrubina direta (mg/dL);BI- Bilirrubina indireta (mg/dL); AMI- Amilase (U/L); PT- Proteínas totais (g/dL); ALB- Albumina (g/dL); GLO- Globulina (g/dL); GLI- Glicose (mg/dL); COL- Colesterol (mg/dL); TRIG- Triglicérides (mg/dL).
87
Alguns estudos fitoquímicos na família Chrysobalanaceae têm mostrado
a predominância de substâncias de natureza fenólica (BRACA et al., 2002;
CASTILHO, KAPLAN, 2008; GARO et al., 1997.; GUSTAFSON et al., 1991;
LEE et al., 1996). Devido às suas propriedades antioxidantes, essas
substâncias recebem grande atenção, por exercerem vários efeitos por meio de
diferentes funções, como, por exemplo, a supressão da formação de ERO,
ERN ou seus precursores; redução de hidroperóxidos e de peróxidos orgânicos
e inorgânicos; sequestro de íons metálicos; remoção de radicais livres ativos
com reparo e/ou remoção do dano. Além disso, alguns antioxidantes induzem a
biossíntese de outros antioxidantes ou enzimas (NOGUSSHI; NIKI, 2000).
Com base nas eficientes atividades antioxidantes observadas nos
sistemas avaliados, pode-se inferir que as moléculas presentes nos extratos
apresentam características hidrofílicas. Embora os estudos referentes a essas
espécies sejam escassos, esses resultados indicam que L. rigida, L. tomentosa
e C. impressa devem ser investigadas in vivo, face ao seu potencial
antioxidante, especificamente o extrato hidroetanólico de C. impressa, visando
o desenvolvimento de um medicamento fitoterápico e, portanto, à validação de
seu uso popular.
88
6 CONCLUSÃO
_______________________________________________________________
89
Considerando os resultados experimentais anteriormente expostos,
pode-se concluir que:
1. a prospecção fitoquímica preliminar dos extratos de L. rigida., L. tomentosa
e C. impressa indica a presença de substâncias de natureza fenólica;
2. as capacidades antioxidantes dos extratos das plantas em estudo, e
especificamente o extrato hidroetanólico de C. impressa, avaliadas por
meio de várias metodologias foram superiores àquela apresentada por C.
marianus, um fitoterápico de conhecida atividade antioxidante;
3. a capacidade antioxidante detectada in vitro corrobora o uso popular destas
plantas no tratamento de doenças nas quais há envolvimento de espécies
reativas de oxigênio (e.g., diabetes e reumatismo);
4. a avaliação da toxicidade aguda em dose única demonstrou que os
extratos aquosos das espécies estudadas não oferecem risco toxicológico;
5. com base no anteriormente exposto, este estudo abre perspectivas de
estudos in vivo com estas plantas e especificamente com o extrato
hidroetanólico de C. impressa, visando a validação de um uso etnomédico.
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ANEXOS _______________________________________________________________
ANEXO A − Identificação botânica das plantas
ANEXO B − Aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (CEP-HUOL)