UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E

ENGENHARIA DE MATERIAIS

TESE DE DOUTORADO

Tratamento Térmico do Titânio e suas Consequências Sobre as Propriedades

Físico-químicas e de Biocompatibilidade

HAROLDO REIS ALVES DE MACÊDO

Orientador: Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior

Tese n° 99/PPGCEM

Natal, Fevereiro de 2012.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E

ENGENHARIA DE MATERIAIS

Haroldo Reis Alves de Macêdo

Tratamento Térmico do Titânio e suas Consequências Sobre as Propriedades

Físico-químicas e de Biocompatibilidade

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências e Engenharia de

Materiais do Centro de Ciências Exatas e da

Terra da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, como parte dos requisitos

para obtenção do título de Doutor em

Ciências e Engenharia de Materiais.

Orientador: Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior.

Natal, Fevereiro de 2012.

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila

Mamede

Macêdo, Haroldo Reis Alves de.

Tratamento térmico do titânio e suas conseqüências sobre as

propriedades físico-químicas e de biocompatibilidade / Haroldo Reis

Alves de Macêdo. – Natal, RN, 2012.

107 f.; il.

Orientador: Clodomiro Alves Júnior.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em

Ciência e Engenharia de Materiais.

1. Biologia celular – Tese. 2. Titânio – Tratamento térmico -Tese.

3. Resposta biológica – Tese. 4. Biocompatibilidade – Tese. I. Alves

Júnior, Clodomiro. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 576

Dedico este trabalho a minha família e à

minha esposa Marina pelo amor, compreensão,

carinho e incentivo nas dificuldades e a todos que

direta ou indiretamente contribuíram para sua

concretização.

Agradecimentos

A Deus pela sabedoria e saúde ....

A minha mãe Teresa Cristina e a meu pai Haroldo Macedo pelo incentivo

e apoio.

A minha esposa, Marina, pelo seu amor e por sempre ter me ajudado na

escrita dos trabalhos.

Ao professor Dr. Clodomiro Alves Júnior pela orientação deste trabalho,

pelo incentivo e pela amizade.

Ao professor Dr. Hugo Alexandre por ter cedido o laboratório, as células

utilizadas neste trabalho e principalmente pela orientação nos assuntos

relacionados à parte biológica, a seus alunos em especial a Raniere e a Moacir

pela colaboração na execução dos ensaios biológicos.

Ao professor Dr. Hamilton da UFC por ter cedido o laboratório de

microscopia para a realização da caracterização por EBSD e ao Flavio, técnico

deste laboratório que operou o equipamento na realização das análises.

Ao professor Dr. Jorge Lourenço do IFRN por ter cedido o forno para

realização dos tratamentos térmicos.

Ao professor Dr. Carlos Eduardo e ao HEMONORTE pela realização dos

ensaios com as integrinas.

Ao Erico, Artejose e Leopoldino, técnicos do NEPGN/UFRN que muito

contribuíram na realização das analises de DRX e MEV.

Ao professor Dr. Wanderson Santana pelos conhecimentos repassados

no que se refere às microestruturas decorrentes de tratamentos térmicos.

A todos os professores da Engenharia de Materiais pelo apoio e

competência em ministrar as disciplinas do curso.

Aos amigos Professores Dr. Ayrton de Sá Brandim, Dr. Marcio Cleto e

Dr. Luiz Fernando pela amizade, incentivo e apoio no meu aprimoramento

acadêmico.

A todos os integrantes do LABPLASMA pela convivência fraterna

durante os anos que estive no mesmo em especial aos que tive mais

proximidade: Marcio Willians, Narayanna, Duciane, Raquel, Jussier, Natalia,

etc.

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

Resumo

Macêdo, H.R.A, Tratamento Térmico do Titânio e suas Consequências

Sobre as Propriedades Físico-químicas e de Biocompatibilidade. 2012.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2012.

O titânio e suas ligas são amplamente utilizados como biomaterial em

dispositivos biomédicos e devido a isso pesquisas têm sido desenvolvidas

visando aperfeiçoar e/ou compreender melhor a interação biomaterial/meio

biológico. O processo de fabricação desses dispositivos de titânio geralmente

envolve uma série de processos térmicos e mecânicos e que têm

consequências no produto final. Os tratamentos térmicos são usualmente

utilizados para obtenção de propriedades diferenciadas para cada aplicação.

Com o intuito de entender a influência desses tratamentos sobre a resposta

biológica da superfície, foram realizados, no presente trabalho, diferentes

tratamentos térmicos em titânio e analisadas suas influências na morfologia,

adesão e proliferação de células pré-osteoblástica (MC3T3-E1). Para tanto os

discos de titânio tratados termicamente foram caracterizados por microscopia

ótica, ângulo de contato, energia de superfície, rugosidade, microdureza

Vickers, difração de raios-X e microscopia eletrônica de varredura através das

técnicas de EBS, EDS e EBSD. Para análise da resposta biológica foram

realizados teste de proliferação por MTT, adesão por cristal violeta e expressão

da integrina β1 por citometria de fluxo. Foi verificado que na presença de uma

microestrutura muito ordenada, definida através de um ataque químico, as

células tendem a se alongar no mesmo sentido da orientação microestrutural

do material. Quando essa ordem não acontece, o fator mais importante a

influenciar na proliferação celular é a tensão residual, indicada pela dureza do

material. Deste modo os discos que apresentaram maior estado de tensão

residual apresentaram também maior proliferação celular.

Palavras-chaves: Titânio, Microestrutura, Resposta Biológica,

Biocompatibilidade.

Abstract

Macêdo, H.R.A, Heat treatment of titanium and their consequence in

physicochemical and biocompatibility properties. 2012. Thesis (Doctoral) –

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2012.

The titanium and titanium alloys are widely used as biomaterial in

biomedical device and so research have been developed aiming to improve

and/or better to understand interaction biomaterial/biological environment. The

process for manufacturing of this titanium implants usually involves a series of

thermal and mechanical processes which have consequence on the final

product. The heat treatments are usually used to obtain different properties for

each application. In order to understand the influence of these treatments on

the biological response of the surface, it was done, in this work, different heat

treatments in titanium and analyzed their influence on the morphology,

adhesion and proliferation of the pre-osteoblastic cells (MC3T3-E1). For such

heat-treated titanium disks were characterized by optical microscopy, contact

angle, surface energy, roughness, microhardness, X-ray diffraction and

scanning through the techniques (BSE, EDS and EBSD). For the analysis of

biological response were tested by MTT proliferation, adhesion by crystal violet

and β1 integrin expression by flow cytometry. It was found that the presence of

a microstructure very orderly, defined by a chemical attack, cells tend to stretch

in the same direction of orientation of the material microstructure. When this

order does not happen, the most important factor influencing cell proliferation is

the residual stress, indicated by the hardness of the material. This way the disks

with the highest level state of residual stress also showed increased cell

proliferation.

Keywords: Titanium, Microstructure, Biological Response, Biocompatibility.

Lista de Figuras

Figura 2.1 Transformação alotrópica do titânio ................................ 24

Figura 2.2 Diagramas de fases do titânio de acordo com seus

elementos de liga: (a) α-estabilizador, (b) β-

estabilizador do tipo eutetóide, (c) β-estabilizador do

tipo isomorfo e (d) neutro ................................................. 25

Figura 2.3 Diagrama de fases para as ligas de titânio mostrando as

transformações martensita em função da temperatura e

da concentração de elementos estabilizadores de fase

baseado nas linhas de transformação martensita ........... 27

Figura 2.4 Diagrama parcial de fases de sistemas constituídos pelo

titânio e por elemento β-estabilizadores ......................... 29

Figura 2.5 Diagrama esquemático da formação da estrutura de

Widmanstäntten na liga Ti-6Al-4V ................................... 31

Figura 2.6 Diagrama TTT pra uma liga de titânio α+β ...................... 34

Figura 2.7 Microestrutura por microscopia ótica do titânio

comercialmente puro grau 2 sem tratamento .................. 35

Figura 2.8 Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura

da liga Ti17 tratada isotermicamente a 750°C por (a)

360s e (b) 9400s. αGB – contorno de grão e αWGB –

contorno de grão Widmanstätten. A morfologia αWGB é

composta por colônias de placas α paralelas

frequentemente com a mesma orientação, que crescem

a partir de αGB ................................................................................................... 35

Figura 2.9 Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura

da liga Ti-6Al-2Sn-4Zr-6Mo. São mostrados grãos β

delimitados por contornos de grãos α ............................. 36

Figura 2.10 Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura

da liga Ti-6Al-4Va. São mostrados grãos α e β ............... 36

Figura 2.11 Micrografia do Ti-cp temperado em ar a partir de 900°C

por 2h, mostrando a formação de núcleo martensítico 37

recoberto por camadas de oxinitreto e de óxido de

titânio ...............................................................................

Figura 2.12 Difratograma padrões para o titânio comercialmente

puro: (a) fase α, (b) fase β ............................................... 38

Figura 2.13 Propriedades dos materiais que estão relacionadas à

biocompatibilidade ........................................................... 39

Figura 2.14 Representação da superfície do implante e sua

interação com as moléculas do fluido tecidual. (A)

Implante. (B) Moléculas de água. (C) Camada

glicoprotéica. (D) Célula .................................................. 40

Figura 2.15 – (1) Interação da superfície do material com a água. (2)

Comportamento das proteínas de acordo com o

conjunto superfície-água. (3) Células em crescimento na

superfície ativa e em desnaturação na superfície inativa 42

Figura 2.16 Representação das proteínas celulares envolvidas na

adesão do biomaterial ..................................................... 43

Figura 2.17 Morfologia celular em discos de titânio após 2 dias de

cultura. (a) superfície rugosa e (b) superfície polida ....... 44

Figura 3.1 Organograma da realização do trabalho ......................... 47

Figura 3.2 Fotografia do forno utilizado – Laboratório de

tratamentos térmicos do IFRN – Natal/RN ...................... 49

Figura 3.3 Esquema dos tratamentos térmicos realizados ............... 49

Figura 3.4 Ilustração dos locais marcados para as análises ............ 51

Figura 3.5 Região de análise de EBSD ............................................ 53

Figura 3.6 Micrografias das marcações de microdureza em: (a)

marcações na superfície que delimitam a área de

análises futuras, (b) marcação na camada externa e (c)

marcação no núcleo ........................................................ 54

Figura 3.7 Esquema do goniômetro para medição do ângulo de

contato ............................................................................. 55

Figura 3.8 Gota de 10 µL de água depositada sobre um disco de

titânio. Medição do ângulo de contato por meio do

surftens ............................................................................ 56

Figura 3.9 Fotografia ilustrativa da placa de 24 poços utilizada na

cultura de células.............................................................. 57

Figura 3.10 Ilustração do contorno das células utilizado para

aquisição dos dados das células sobre os discos,

utilizando o software Image Pro Plus .............................. 59

Figura 3.11 Espectrofotômetro específico para leitura de placas de

96 poços – laboratório de genética do CB/UFRN ............ 60

Figura 4.1 Micrografias do disco de titânio sem tratamento. (a)

micrografia ótica e (b) micrografia por MEV com

medição dos tamanhos dos grãos ................................... 64

Figura 4.2 Micrografia por microscopia ótica da amostra temperada

em água (1100°C). Constituída de uma estrutura de

lamelas macladas e em alguns pontos uma estrutura

em forma de placas ........... 65

Figura 4.3 Micrografia por microscopia ótica da microestrutura de

uma amostra temperada a 950°C, em água ................... 66

Figura 4.4 Micrografia por microscopia ótica das microestruturas

das amostras envelhecidas a 500°C por 4h ................... 67

Figura 4.5 Micrografia por microscopia ótica das microestruturas

das amostras envelhecidas a 700°C por 4h .................... 67

Figura 4.6 Microscopia ótica do corte transversal mostrando as

diferentes estruturas dos discos temperados .................. 68

Figura 4.7 Medição por MEV da espessura das camadas formadas

durante a têmpera ........................................................... 69

Figura 4.8 EDS da borda dos discos temperados a 1100°C ............ 70

Figura 4.9 Difratogramas para as diferentes camadas presente nos

discos. (a) núcleo martensítico (b) camada 1 – oxinitreto

de titânio e (c) camada 2 – dióxido de titânio .................. 71

Figura 4.10 Difratogramas do núcleo dos discos de titânio

temperados - varredura de 20° a 80° .............................. 73

Figura 4.11 Imagens de EBSD na interface do núcleo martensítico

com a camada 1 do disco temperado a 1100°C (a)

região de análise (b) mapa de cores das estruturas 74

cristalinas, apresentando somente estrutura hexagonal

compacta .........................................................................

Figura 4.12 Mapas de cores para estruturas cristalográficas. Em

todas as condições de tratamento apresentaram

somente estrutura hexagonal compacta .......................... 75

Figura 4.13 Microdureza Vickers – corte transversal .......................... 76

Figura 4.14 Microdureza Vickers – Superficial ................................... 77

Figura 4.15 Ângulo de contato na superfície dos discos de titânio

para água e para o meio de cultura celular (alfa-MEM) .. 78

Figura 4.16 Energia de superfície e suas componentes polar e

dispersiva para as diferentes condições de tratamento .. 79

Figura 4.17 Microscopia ótica das células aderida no titânio –

Orientação das células conforme a microestrutura ......... 81

Figura 4.18 Número de células aderidas para as diferentes

condições, contadas a partir de análise de imagens ....... 84

Figura 4.19 Porcentagem de área coberta por células ....................... 85

Figura 4.20 Morfologia celular. Células arredondadas (<1,5), células

parcialmente espraiadas (>1,5 e <2) e totalmente

espraiadas (>2) ................................................................ 86

Figura 4.21 Proliferação por MTT ....................................................... 87

Figura 4.22 Adesão celular para 1, 2 e 3 horas de cultura ................. 88

Figura 4.23 Histograma da expressão da integrina β1 para as

diferentes condições de tratamento do titânio ................. 89

Figura 4.24 Razão IMF das amostras tratadas pelo controle

negativo/isotípico ............................................................. 89

Figura 4.25 Relação ângulo de contato e proliferação celular ............ 90

Figura 4.26 Comparação do comportamento dos gráficos da

proliferação com as componentes da energia de

superfície 91

Figura 4.27 Comparação do comportamento dos gráficos da

proliferação com a fração de polaridade ......................... 92

Figura 4.28 Comparação do comportamento dos gráficos da

proliferação com os parâmetros de rugosidade .............. 93

Figura 4.29 Relação microdureza e proliferação celular .................... 94

Figura 4.30 Mapa de orientação cristalográfica, onde cada cor

representa uma orientação cristalográfica ....................... 95

Lista de Tabelas

Tabela 2.1 Composição química de Ti-cp (% em peso) segundo a

ASTM. O Ti-cp grau 2 está grifado para indicar o grau

de pureza do Ti que foi utilizado neste trabalho ........... 22

Tabela 2.2 Propriedades do titânio comercialmente puro............... 23

Tabela 3.1 Composição química do titânio utilizado segundo

fornecedor. Discos de Ti ASTM F67 GR1Φ

15x1,50mm ................................................................... 48

Tabela 3.2 Simbologia e descrição dos tratamentos dos

tratamentos térmicos realizados .................................. 50

Tabela 3.3 Energia de superfície dos líquidos usados ................... 56

Tabela 4.1 Relação das distancias interplanares e da largura a

meia altura dos principais picos comuns nos

difratogramas ............................................................... 73

Tabela 4.2 Fração de polaridade calculada a partir das

componentes polar e dispersiva da energia de

superfície dos discos de Ti ......................................... 80

Tabela 4.3 Parâmetros de rugosidade dos discos de Ti ................ 80

Tabela 4.4 Valores de Intensidade média de fluorescência para

todas as condições utilizadas neste trabalho. Para

todas as condições tratadas o IMF é maior que o não

tratado e que todos são maiores que o controle

negativo/isotípico .......................................................... 88

Lista de Abreviaturas e Símbolos

ASTM – American society for testing and materials

HC – Estrutura hexagonal

CCC – Estrutura cúbica de corpo centrado

α – Fase alfa primaria de estrutura hexagonal

α’ – Fase martensita de estrutura hexagonal

α’’ – Fase martensita de estrutura ortorrômbica

β – Fase beta de estrutura cúbica de corpo centrado

TTT – Diagrama tempo, temperatura e transformação

Ti-cp – Titânio comercialmente puro

MEV – Microscopia eletrônica de varredura

ES – Elétrons secundários

BSE – Elétrons retroespalhados

EDS – Difração de elétrons secundários

EBSD – Difração de elétrons retoespalhados

DRX – Difratômetro de raios-X

GIDRX – Difração de raios-X em incidência rasante

Ra – Rugosidade média aritmética

Rp – Altura máxima do pico

Rv – Profundidade máxima do vale

Rz – Rugosidade média entre os cinco maiores picos e os cinco maiores vales

Rt – Altura máxima do pico mais alto e o vale mais profundo

θ – Ângulo de contato

– Energia superficial

– Componente polar da energia de superfície

– Componente dispersiva da energia de superfície

FP – Fração de polaridade

ALFA-MEM – Meio de cultura celular

SFB – Soro fetal bovino

β1 – Integrina de ligação célula-substrato

IMF – Intensidade média de fluorescência

PDF – Power difraction file – padrão de cartas para análise de DRX

Sumário

1 – Introdução .................................................................................. 18

2 – Revisão Bibliográfica .................................................................. 22

2.1 – Titânio ................................................................................ 22

2.1.1 – Elementos estabilizadores de alfa e beta ............ 24

2.1.1.1 – Ligas α .................................................... 26

2.1.1.2 – Ligas quase α ......................................... 27

2.1.1.3 – Ligas α+β ............................................... 28

2.1.1.4 – Ligas quase β ......................................... 28

2.1.1.5 – Ligas β .................................................... 29

2.1.2 – Tratamento Térmico .............................................. 30

2.1.2.1 – Têmpera e Revenimento ........................ 31

2.1.2 – Transformação Martensita do Titânio ................... 32

2.1.3 – Microestruturas do Titânio ..................................... 33

2.2 – Interação do Titânio com o Meio Biológico – O Titânio

como Biomaterial .............................................................................. 38

3 – Metodologia ................................................................................ 47

3.1 – Material de partida ............................................................ 48

3.2 – Tratamentos térmicos dos discos de titânio ...................... 48

3.3 – Preparação metalográfica ................................................. 50

3.4 – Caracterizações das amostras .......................................... 51

3.4.1 – Microscopia Ótica e Análise de Imagens .............. 51

3.4.2 – Microscopia Eletrônica de Varredura .................... 51

3.4.3 – Difração de Raios-X .............................................. 53

3.4.4 – Microdureza Vickers .............................................. 53

3.4.5 – Rugosidade ........................................................... 54

3.4.6 – Molhabilidade ....................................................... 54

3.4.6.1 – Ângulo de Contato ................................. 55

3.4.6.2 – Energia de Superfície ............................. 56

3.5 – Ensaio em Cultura de Células ........................................... 57

3.5.1 – Proliferação por microscopia ótica e análise de

imagens 58

3.5.2 – Proliferação MTT ................................................... 59

3.5.3 – Adesão .................................................................. 60

3.5.4 – Avaliação da Expressão de integrinas ................. 61

3.6 – Análise Estatística ............................................................. 62

4 – Resultados e discussões ........................................................... 64

4.1 – Caracterizações do Titânio ............................................... 64

4.1.1 – Microestruturas ...................................................... 64

4.1.2 – Fases ..................................................................... 70

4.1.2.1 – Difração de Raios-X .............................. 70

4.1.2.2 – Difração de elétrons retroespalhados 73

4.1.3 – Microdureza Vickers .............................................. 75

4.1.4 – Ângulo de Contato ................................................ 78

4.1.5 – Energia de Superfície ........................................... 78

4.1.6 – Rugosidade ........................................................... 80

4.2 – Caracterização da Resposta Biológica ............................. 81

4.2.1 – Orientação Celular ................................................ 81

4.2.2 – Proliferação e Morfologia por Análises de

Imagens ............................................................................................ 83

4.2.3 – Análise de Proliferação Celular ........................... 86

4.2.4 – Avaliação da Adesão Celular ................................ 87

4.2.5 – Expressão de Integrinas ....................................... 88

4.3 – Correlação dos Resultados Biológicos com as

Propriedades Obtidas para o Titânio ............................................... 90

4.3.1 – Ângulo de Contato X Proliferação .................... 90

4.3.2 – Energia de Superfície X Proliferação ................ 91

4.3.3 - Rugosidade X Proliferação ................................ 92

4.3.4 – Microdureza Vickers X Proliferação ................. 93

4.3.5 – Orientação Cristalográfica X Proliferação ......... 94

5 – Conclusões e Sugestões ........................................................... 96

5.1 – Conclusões ....................................................................... 97

5.2 – Sugestão de Trabalhos Futuros ........................................ 98

Lista de Trabalhos Publicados ......................................................... 99

Referências ...................................................................................... 100

Capítulo 1

Introdução

18

1 – Introdução

Com o advento de novos dispositivos para aplicações biomédicas, é

notória a utilização do titânio e suas ligas como biomaterial. Nesse sentido, o

conhecimento das suas características superficiais é de fundamental

importância, principalmente aquelas relacionadas com sua resposta quando

inseridas num meio biológico. Sabe-se que a fabricação de qualquer dispositivo

envolve uma série de processos térmicos, mecânicos e/ou químicos, que

podem influenciar a sua resposta quando inserido num meio biológico.

Algumas vezes esses processos são utilizados propositadamente para

modificar as propriedades físicas e/ou químicas da superfície. Outras vezes

eles são necessários durante a fundição, conformação, estampagem e

usinagem, entre outros. Nesse último caso o estado final da peça poderá

depender do processo de fabricação. Portanto, conhecer o quanto a resposta

biológica de uma superfície é sensível a essas variações de propriedades é de

fundamental importância para a confiabilidade do uso desses dispositivos. No

caso de implantes, por exemplo, há a necessidade de se definir uma superfície

compatível com uma boa resposta biológica, isto é imperativo na pesquisa

básica de implantes (Amarante e Lima, 2001). Qualquer implante, uma vez em

contato com o meio biológico, é caracterizado por mudanças dinâmicas em

suas propriedades superficiais envolvendo uma cascata de reações que ocorre

entre o meio biológico e o biomaterial formando um “filme de condicionamento”

que modula as respostas celulares (Puleo e Nanci, 1999).

Segundo Schneider (1994) e Macdolnad (2002) a molhabilidade e a

energia superficial exercem um importante papel na adsorção de proteínas,

aumentando a formação de adesões de osteoblastos na superfície do implante

(Schneider e Burridge, 1994; Macdonald et al., 2002). A rugosidade e a

molhabilidade interferem nos processos de adsorção de proteínas, com isso é

possível que células sejam fortemente influenciadas por ambos, se chegarem à

superfície do implante (Rupp et al., 2004). Macêdo (2011) por sua vez indica a

tensão residual como um forte influenciador da proliferação de células pré-

osteoblásticas.

Compreender como um processo de fabricação possa influenciar, bem

como quantificar o efeito de pequenas flutuações do processo sobre a resposta

19

biológica do dispositivo é o foco do presente trabalho. Na busca por superfícies

que supram a necessidade de obter uma resposta biológica mais rápida, várias

pesquisas têm sido desenvolvidas, modificando as propriedades de superfície

pelos mais variados processos (Silva et al., 2006) dentre os quais se destaca

os métodos mecânicos, químicos e físicos de tratamento de superfície, que

permitem obter os mais variados graus de texturas (Liu et al., 2004).

Os tratamentos utilizados neste trabalho foram do tipo térmico em forno

resistivo por ser um dos mais utilizados nas indústrias durante o processo de

fabricação dos implantes. Estes tratamentos também possibilitam diversas

combinações entre as propriedades mecânicas e de biocompatibilidade, uma

vez que geram modificações na estrutura interna dos materiais que, por

conseguinte modificam as propriedades se superfície afetando diretamente a

resposta biológica.

O presente trabalho teve como objetivo geral modificar a microestrutura

do titânio através de tratamentos térmicos e relacionar a influência dessa

microestrutura e das propriedades sobre a resposta biológica. Principalmente

no que se refere à proliferação de células pré-osteoblásticas, tendo para isso

os seguintes objetivos específicos:

Caracterizar as microestruturas e suas respectivas fases, obtidas por meio do

tratamento térmico comparativamente ao Ti na condição como recebido;

Determinar valores para as propriedades superficiais (rugosidade, ângulo de

contato, energia de superfície, dureza) que favoreçam a proliferação celular;

Avaliar a adesão, proliferação e morfologia as células sobre os discos de Ti;

Identificar qual a propriedade mais influencia na proliferação de células pré-

osteoblasticas.

Este estudo foi dividido em duas etapas a primeira dedicada à

caracterização do material antes e após os tratamentos térmicos utilizando

técnicas como: microscopia ótica, microscopia eletrônica, difração de raios-X,

ângulo de contato, energia de superfície e microdureza. Já a segunda etapa foi

dedicada à caracterização do comportamento das células quando cultivadas

sobre esses discos nas diferentes condições de tratamento. Estas foram

analisadas segundo os seguintes parâmetros: i) análise de imagens

(quantidade e morfologia celular, área ocupada por células, orientações

20

preferenciais), proliferação por MTT, adesão por cristal violeta e expressão da

integrina β1.

Capítulo 2

Revisão Bibliográfica

22

2 – Revisão Bibliográfica

2.1 – Titânio

O titânio é o quarto elemento metálico mais abundante no nosso planeta.

Pode ser encontrado em minérios ricos em óxidos de titânio, como o rutilo que

é rico em TiO2 ou como a ilmenita, rica em FeTiO3. Embora seja abundante na

natureza, relatos de sua extração e utilização são bastante recentes, tendo sido

obtido na forma metálica apenas em 1910 e somente na década de 1930 foi

obtido em volumes significativos com a concepção do processo Kroll e desde

então a produção, o emprego do titânio e de suas ligas vem crescendo nas

indústrias química, petroquímica, alimentícia, farmacêutica, aeronáutica,

espacial e médica (Lütjering e Willians, 2007).

O titânio é um metal de transição pertencente à família IVB da tabela

periódica, com número atômico 22, peso atômico 47,90 g/mol, raio atômico

0,1445 nm e densidade 4,45 g/cm3. Em termos de densidade, o titânio é 40%

mais leve que o aço e 60% mais pesado que o alumínio. O titânio possui

elevada resistência à corrosão que se deve à formação de um filme de óxido

protetor junto à sua superfície. Este filme, de óxido superficial, permite que o

titânio seja aplicado em condições adversas, como por exemplo, ambiente

salinos e meio biológico (Lütjering e Willians, 2007).

Em termos de classificação, a American Society for Testing and

Materials (ASTM) define que existem quatro classes principais de titânio

comercialmente puro (Ti-cp): ASTM Grau 1 a 4. Cada grau está associado a

um diferente teor de impurezas, sendo o grau 1 (um) o mais puro. Na tabela 2.1

são apresentadas as composições químicas do Ti-cp para os quatros graus de

pureza e na tabela 2.2 as respectivas propriedades (Donachie, 1988).

Tabela 2.1 – Composição química de Ti-cp (% em peso) segundo a ASTM. O Ti-cp grau 2 está grifado para indicar o grau de pureza do Ti que foi utilizado neste trabalho (Donachie, 1988).

Tipo de Ti

Fe C H N O Ti

Grau 1 Máx. 0,2 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,18 99,5 Grau 2 Máx. 0,3 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,25 99,2 Grau 3 Máx. 0,3 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,35 99,1 Grau 4 Máx. 0,5 Máx. 0,1 Máx. 0,015 Máx. 0,03 Máx. 0,4 99,0

23

Tabela 2.2 – Propriedades do titânio comercialmente puro (Mitsuo, 1998).

Tipo de Ti

Lim. Res.

(MPa)

Lim. Esc.

(MPa)

Along. (%)

Red. área (%)

Mód. Elast. (GPa)

Classe de

Liga

Grau 1 240 170 24 24 102,7 α Grau 2 345 275 20 20 102,7 α Grau 3 450 380 18 18 103,4 α Grau 4 550 485 15 15 104,1 α

Como o titânio é um elemento de transição que tem uma camada

incompleta em sua estrutura eletrônica no estado fundamental pode ocorrer a

formação de solução sólida com a grande maioria de elementos que possuem

raios atômicos com valores de até 15% de diferença. O processamento desse

metal é complexo, principalmente devido a sua susceptibilidade a elementos

intersticiais como oxigênio, nitrogênio, hidrogênio e carbono.

Quando puro, o titânio exibe duas formas alotrópicas. Até 882,5°C sua

estrutura cristalina é do tipo hexagonal compacta (HC), denominada de fase

α. Acima dessa temperatura, a estrutura cristalina é do tipo cúbica de corpo

centrado (CCC), definida como fase β. Tal arranjo cristalino é estável até a

fusão, em 1.672 °C conforme é mostrado na figura 2.1. Essa transformação de

fases pode ser eventualmente alterada a partir da adição de elementos de liga

ao titânio. Esses elementos podem estabilizar as fases: i) alfa, neste caso,

chamados de alfa-estabilizadores uma vez que aumentam a temperatura em

que é possível obter a fase alfa estável e/ou ii) beta, chamados de beta-

estabilizadores, estes elementos diminuem a temperatura em que é possível

obter a fase beta estável (Donachie, 1988; Lütjering e Willians, 2007).

24

Figura 2.1 – Transformação alotrópica do titânio (adaptado de Flower, 1990).

2.1.1 – Elementos alfa e beta-estabilizadores de fase do titânio

Os elementos classificados como α-estabilizadores envolvem metais

dos grupos IIIA e IVA (Al, Ga e Sn) e elementos intersticiais C, N e O. Por outro

lado, os metais de transição V, Ta, Nb, Mo, Mg, Cu, Cr, Fe e os metais nobres

são classificados como elementos β-estabilizadores. Dois tipos de elementos

β-estabilizadores são possíveis como resultados dos seus respectivos

diagramas de fase: os definidos como β-isomorfos e os β-eutetoides.

Existem ainda os elementos definidos como neutros, que não mudam a

temperatura de transformação alotrópica, como Zr. Os quatro tipos de

estabilizadores de fase do titânio têm seus respectivos diagramas de fase

esquematizados na figura 2.2 (Lütjering e Willians, 2007).

25

Figura 2.2 – Diagramas de fases do titânio de acordo com seus elementos de liga: (a) α-estabilizador, (b) β-estabilizador do tipo eutetóide, (c) β-estabilizador do tipo isomorfo e (d) neutro (Adaptado de Lütjering e Willians, 2007).

Embora o titânio puro seja largamente utilizado na indústria, em algumas

situações são necessárias combinações de propriedades às quais o titânio

puro não é aplicável. Para solucionar esse problema uma alternativa a ser

seguida é o uso de ligas de titânio.

As ligas de titânio são obtidas a partir da adição controlada de elementos

α e/ou β-estabilizadores ao titânio, com isso também é possível controlar a

estabilidade de fases, bem como as respectivas frações volumétricas de cada

fase à temperatura ambiente e consequentemente, suas propriedades

mecânicas. Assim obtém-se ligas versáteis, principalmente quanto ao

comportamento mecânico, uma vez que este depende fundamentalmente da

Al, O, N, C

Fe, Mn, Cr

Mo, V, Nb, Ta Zr (c)

(a) (b)

(d)

26

composição, da proporção entre as frações volumétricas das fases α e β e

finalmente, dos tratamentos térmicos e termomecânicos utilizados. De acordo

com as fases presentes à temperatura ambiente, as ligas de titânio podem ser

classificadas em cinco grupos, ligas alfa, ligas quase alfa, ligas alfa+beta, ligas

quase beta e ligas beta (Long e Rack, 1998).

2.1.1.1 – Ligas α

Ligas desse grupo exibem apenas fase α em temperatura ambiente.

Além do titânio comercialmente puro, nessa classe encontram-se ainda ligas

com elementos α estabilizadores, como os elementos mostrados na figura

2.2a. A presença de elementos estabilizadores da fase α, como soluto na

matriz de titânio eleva as linhas de transformação α/α+β e α+β/β, fazendo com

que, mesmo que uma liga α seja resfriada no campo α+β, a porção de fase

verificada esteja sempre à esquerda da linha Mi/Mf à temperatura ambiente,

sendo, então, termodinamicamente instável, transformando-se em α, conforme

a figura 2.3 (Donachie, 1988).

As ligas tipo α apresentam elevada resistência à fluência e por esta

razão, são adequadas ao uso em altas temperaturas. Como tais ligas não

exibem transição do tipo dúctil-frágil são indicadas para operar em ambientes

criogênicos. Além disso, essas ligas não exibem fases metaestáveis sujeitas à

transformação no resfriamento (Donachie, 1988).

27

Figura 2.3 – Diagrama de fases para as ligas de titânio mostrando as transformações martensíticas em função da temperatura e da concentração de elementos estabilizadores de fase baseado nas linhas de transformação martensítica (adaptado de Flower, 1990).

2.1.1.2 – Ligas quase α

As ligas quase α contêm elementos estabilizadores da fase α, além de

apresentar pequenos teores de elementos estabilizadores da fase β. A

presença de elementos estabilizadores da fase β na liga α, mesmo em

pequenas quantidades, faz com que o campo α+β aumente suficientemente

para permitir que uma pequena quantidade de fase β, em equilíbrio

metaestável, possa ficar retida em temperatura ambiente; permitindo assim, a

transformação martensítica da fase β em α’ (martensita de estrutura HC)

dentro de uma faixa muito limitada, obtida através das altas taxas de

resfriamento, a partir do campo α+β (Donachie, 1988).

28

2.1.1.3 – Ligas α+β

Tais ligas são formadas pelo titânio e por elementos β estabilizadores

em teor suficiente que permite a estabilização da fase β com fração

volumétrica entre 10 e 50% à temperatura ambiente. Dessa maneira, o efeito

dos elementos α e β estabilizadores resulta na formação de um campo de

coexistência das fases α e β que se estende até a temperatura ambiente

(Ahmed e Rack, 1998).

A combinação adequada de elementos de liga e de tratamentos térmicos

permite obter uma grande variedade de microestruturas, principalmente quando

as ligas α+β são comparadas às ligas α (Lütjering, 1998; Prasad e

Seshacharyulu, 1998). Em geral, a manutenção da fase β na estrutura conduz

à redução da resistência à fluência. Dessa forma, tais ligas não podem ser

aplicadas em temperaturas elevadas. A liga Ti-6Al-4V é o melhor exemplo de

ligas do tipo α+β (Qazi et al., 2003). Concebida inicialmente para ser

empregada na indústria aeronáutica, tornou-se o material de referência dentre

as ligas de titânio, sendo o material à base de titânio mais empregado na

fabricação de dispositivos para implante, sejam ortopédicos ou dentários. Com

o passar dos anos novas ligas α+β alternativas àquelas foram propostas,

sendo as principais representantes as ligas contendo Nb na composição, por

exemplo, Ti-6Al-7Nb (Long e Rack, 1998).

2.1.1.4 – Ligas quase β

São ligas com elementos estabilizadores da fase β em quantidade

suficiente para que as linhas de transformação martensítica passem abaixo da

temperatura ambiente e para que a linha β/α+β-transus fique bem abaixo da

temperatura de transformação alotrópica do titânio puro. Estas ligas podem

apresentar baixos teores de solutos estabilizadores da fase α, podendo assim

serem trabalhadas dentro do campo β à 800°C. A cinética da nucleação e

crescimento da fase estável α é bastante lenta, permitindo a manutenção da

fase β metaestável à temperatura ambiente, mesmo sem necessidade de

resfriamento rápido (Donachie, 1988).

29

2.1.1.5 – Ligas β

Ligas de titânio tipo β, são classificadas como metaestáveis ou estáveis,

apresentam elevada resistência mecânica, boa conformabilidade e são

endurecíveis através de tratamentos térmicos. Esta classe de ligas possibilita

combinar baixo módulo de elasticidade que é resultante da estabilização da

fase cúbica de corpo centrado, com elevada resistência mecânica. As ligas tipo

β são produzidas pela adição de elementos β estabilizadores em volume

suficiente que permite que a linha β-transus posicione-se bem abaixo da

temperatura de transformação alotrópica do titânio puro (Froes e Bomberger,

1985). No caso de ligas tipo β metaestáveis tem-se ligas com composição

dentro da faixa de β1 e β2 mostrada na figura 2.4 e que são obtidas através

do resfriamento rápido das mesmas.

Figura 2.4 – Diagrama parcial de fases de sistemas constituídos pelo titânio e por elemento β-estabilizadores (adaptado de Lütjering e Willians, 2007).

No caso de formação de estruturas contendo a fase β metaestável, é

possível a precipitação de outras fases como resultado de tratamentos térmicos

de envelhecimento. Ligas com teor de elementos β estabilizadores superior a

β2 são classificadas como estáveis e independem das condições de obtenção.

30

2.1.2 – Tratamentos Térmicos no Titânio

O titânio forma soluções sólidas intersticiais com elementos que

possuem raio atômico pequeno, pois possui como espaço intersticial

aproximadamente 26,5% do volume do reticulado cristalino para o α-Ti (HC) e

de 32% para o β-Ti (CCC). A estrutura α possui 4 posições intersticiais de raio

0,62 Å. Já a estrutura β possui 12 interstícios do tipo tetraédrico com raio 0,44

Å e 6 do tipo octaédrico (Bellinati, 1999).

A presença de elementos intersticiais tende a aumentar a dureza, a

resistência mecânica e diminuir a ductilidade do material. A maioria dos

produtos de titânio comercialmente puro contém traços alguns desses

elementos (Albrektsson, 1983).

Elementos estabilizadores de fase podem ser incorporados à estrutura

dos materiais formando soluções sólidas através de tratamentos térmicos. É na

manutenção de uma ou outra fase em equilíbrio termodinâmico que se baseia a

adição de elementos de liga e os tratamentos térmicos ou termomecânicos.

Durante o resfriamento a partir de temperaturas superiores a

temperatura β-transus (882°C) ocorre uma transformação alotrópica da

estrutura CCC para a estrutura HC no titânio comercialmente puro. A adição de

elementos de liga nesta temperatura modifica o equilíbrio entre os campos α e

β (Collings, 1984).

Os resfriamentos submetidos a altas taxas promovem a precipitação

mais fina da fase α’, resultando na estrutura Widmanstätten e, chegando estas

taxas de resfriamento a patamares mais elevados, a difusão atômica será

inibida gerando uma estrutura martensítica (Flower, 1990). A estrutura

Widmanstätten (α + β) é característica das ligas diluídas e se apresenta como

um emaranhado de agulhas paralelas em matriz de β (Brooks, 1982). A figura

2.5 mostra o diagrama esquemático da formação da estrutura de

Widmanstätten na liga Ti-6Al-4V.

31

Figura 2.5 – Diagrama esquemático da formação da estrutura de Widmanstäntten na liga Ti-6Al-4V (Brooks, 1982).

2.1.2.1 – Têmpera e Revenimento

A têmpera é o tratamento térmico que possui como objetivo aperfeiçoar

a relação entre microestrutura e as propriedades mecânicas. Basicamente, a

têmpera consiste em resfriar rapidamente o material, a partir da temperatura

elevadas a uma velocidade superior à velocidade crítica (Vc) para obter uma

estrutura denominada martensita. Essa velocidade (Vc) significa a menor taxa

de resfriamento que pode ser utilizada para que toda a estrutura obtida seja

martensítica (Moreira, 2008). A temperabilidade mede a habilidade de um

material sofrer um tratamento térmico que aumente a proporção de fase dura

(martensita). Normalmente, esse processo é complementado por outro

tratamento térmico, denominado revenimento.

32

Segundo Moreira e Lebrão (2008) são vários os meios utilizados para o

tratamento de têmpera de aços, dois destes meios frequentemente são

aplicados ao titânio, são eles: i) água –por meio de imersão, jatos, imersão ou

jatos com água aquecida, ou ainda, misturas de água com aditivos poliméricos

entre outros; ii) ar – este é um meio de tempera antigo, comum e barato. A

aplicação do ar como meio de têmpera é mais comum em metais não-ferrosos.

O revenimento tem como principal objetivo controlar a relação dureza e

tenacidade obtida após o processo de têmpera, reduzindo as tensões

produzidas durante esse processo e aumentando a ductilidade e a tenacidade.

O revenimento é realizado em temperaturas inferiores à de transformação

alotrópica com tempos de duração e velocidades de resfriamento controladas.

2.1.3 – Transformação Martensita do Titânio

Uma transformação martensítica, por definição, é uma transformação

que não envolve difusão de elementos de liga. A martensita é formada por

resfriamentos suficientemente rápidos (têmpera) para impedir a difusão e a

transformação em outras fases. Existem, basicamente, dois tipos de martensita

em ligas de titânio: martensita hexagonal (HC) e martensita ortorrômbica

(Lütjering e Willians, 2007).

Nas ligas de titânio contendo baixo teor de elementos β-estabilizadores,

a fase beta a altas temperaturas pode ser transformada em α’ (martensita de

estrutura HC) durante a têmpera acima da temperatura β-transus. Enquanto a

martensita ortorrômbica α’' pode ser formada durante a têmpera em ligas com

altas concentrações de elementos beta-estabilizadores. Esses diferentes tipos

de estruturas cristalinas da martensita do titânio estão relacionadas ao

deslocamento dos átomos por cisalhamento. Sendo que maiores taxas destes

deslocamentos favorecem à formação da martensita α’ (HC), enquanto que a

martensita α’’ (ortorrômbica) ocorrem quando estes deslocamentos são lentos

(Kim et al., 2007). A transformação martensítica em ligas de titânio tem

influência positivas sobre as propriedades de tensão e tenacidade à fratura das

ligas (Ouchi et al., 1999; Grosdidier e Philippe, 2000; Bhattacharjee et al., 2005)

33

tendo sido objeto de diversos estudos ( Margevicius e Cotton, 1998; Zhang et

al., 2005; Lin et al., 2011).

A transformação martensítica inicia com deslocamento do tipo

cisalhamento de átomos da fase β. A maior estabilidade da fase β se deve à

formação de ligações covalentes que são dificilmente quebradas e com isso

dificultam o cisalhamento dos átomos. A estabilidade desta fase afeta

significativamente a transformação martensita no titânio, assim como, a

formação e a quebra das ligações covalentes da estrutura unitária (Lin et al.,

2011).

Já que as ligações covalentes da α’’ são dificilmente formadas, o

cisalhamentos dos átomos pode ser limitado. Esta limitação pode favorecer à

formação desse tipo de martensita. Além disso, uma vez que as ligações

covalentes da martensita α’’ são formadas por têmpera ou por aplicações de

tensões, a dissolução destas ligações também é bastante difícil. Caso

contrário, onde ligações covalentes sejam facilmente formadas e/ou quebradas,

o cisalhamento dos átomos pode ser acelerado, resultando no aumento da

probabilidade de ocorrer a martensita α’ de estrutura HC (Lin et al., 2011).

2.1.4 – Microestruturas do Titânio

O titânio pode exibir uma grande variedade de estruturas dependendo

da composição química da liga, do processamento e do tratamento térmico

aplicado. Isto é possível porque o titânio e suas ligas exibem uma ampla faixa

de transformação de fases. Muitas dessas transformações se devem à

transformação alotrópica que ocorre de α para β outras, no entanto, se devem

à formação de fases de transição metaestáveis que se precipitam durante a

decomposição da fase β metaestável (Joshi, 2006).

O ponto chave da evolução microestrutural do titânio e de suas ligas é a

temperatura de transformação alotrópica. Ligas de titânio quando tratadas em

temperaturas acima da temperatura beta-transus apresentam-se como

monofásica β. Através do resfriamento a partir desta temperatura é possível

obter várias fases de equilíbrio e de não equilíbrio, dependendo da taxa de

resfriamento e da concentração de elemento de liga. Na figura 2.6 é

34

apresentado o diagrama TTT (tempo, temperatura e transformação) para uma

liga de titânio α+β (Joshi, 2006).

Figura 2.6 – Diagrama TTT pra uma liga de titânio α+β (Adaptado de Joshi, 2006).

A estrutura Widmanstätten pode mudar da forma de colônia de ripas

alinhadas para a forma basket-weave com o aumento da taxa de resfriamento

ou concentração de elementos de liga. Além disso, a estrutura lamelar se torna

mais fina quando a taxa de resfriamento é aumentada. Em resfriamentos mais

lentos a fase α esta presente nos contornos de grão β primário (Joshi, 2006).

Além dos produtos da transformação (α, α’, α’’), a microestrutura pode

reter pequenas quantidades de fase β, dependendo da composição da liga. A

quantidade de fase beta retida na microestrutura a partir do resfriamento no

campo β é maior para maiores concentrações de soluto na liga. A martensita α’

ou α’’ se decompõe sobre envelhecimentos subsequentes levando a um

aumento na resistência da liga (Joshi, 2006). A seguir nas figuras 2.7, 2.8, 2.9 e

2.10 são apresentadas diferentes microestruturas obtidas através do

processamento térmicos de ligas de titânio.

35

Figura 2.7 – Microestrutura por microscopia ótica do titânio comercialmente puro grau 2 sem tratamento (Pazos et al., 2010).

Figura 2.8 – Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura da liga Ti17 (Ti-5Al-4Cr-4Mo-2Sn-2Zr) tratada isotermicamente a 750°C por (a) 360s e (b) 9400s. αGB – contorno de grão e αWGB – contorno de grão Widmanstätten. A morfologia αWGB é composta por colônias de placas α paralelas frequentemente com a mesma orientação, que crescem a partir de αGB

(Teixeira et al., 2007).

36

Figura 2.9 – Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura da liga Ti-6Al-2Sn-4Zr-6Mo. São mostrados grãos β delimitados por contornos de grãos α (Bhattacharyya et al., 2003).

Figura 2.10 – Microestrutura por microscopia eletrônica de varredura da liga Ti-6Al-4V. Observa-se grãos α e β (Lütjering e Willians, 2007).

As microestruturas mostradas nas figuras 2.7 a 2.10 são resultados de

tratamentos térmicos realizados em diferentes ligas de titânio. Nos quais é

possível observar grãos do tipo equiaxiais e grãos lamelares tanto de fase beta

quanto de fase alfa. Esta variação do tipo de fase para uma mesma estrutura

granular se deve à composição química da liga. Entretanto, não somente as

ligas podem ter sua microestrutura alterada. O titânio comercialmente puro

também pode apresentar microestruturas que variam tanto no tamanho quanto

no formato dos grãos.

Contorno de grão alfa

α

β

37

Borgioli e colaboradores (2001) trataram termicamente Ti-cp grau 2 em

forno utilizando o ar como atmosfera de tratamento (Borgioli et al., 2001).

Verificaram que para as amostras temperadas a partir da temperatura de

900°C forma-se duas camadas na superfície das amostras: uma fina camada

de óxido e uma camada um pouco mais espessa com pequenas quantidades

de oxinitreto de titânio. Estas camadas são mais espessas quanto maior for à

temperatura e/ou o tempo de tratamento. A parte central do material consiste

de uma estrutura acícular α, conforme é mostrado na figura 2.11.

Figura 2.11 – Micrografia do Ti-cp temperado em ar a partir de 900°C por 2h (Adaptado de Borgioli et al., 2001).

A seguir, na figura 2.12 são apresentados difratogramas padrões para

titânio comercialmente puro (Villars, 1997). Em (a) é apresentado o

difratograma para o titânio α, hexagonal; e em (b) o difratograma fase β,

cúbica.

Oxinitreto

Óxido

Núcleo

38

Figura 2.12 – Difratograma padrões para o titânio comercialmente puro: (a) fase α, (b) fase β (Pinto, 2005).

2.2 – Interação do Titânio com o Meio Biológico – O Titânio como

Biomaterial

O titânio e suas ligas são os biomateriais metálicos mais indicados para

aplicações biomédicas devido às combinações de propriedades, como:

biocompatibilidade, alta resistência à biocorrosão, relação tensão/deformação e

relação resistência/peso entre outros. Muitos trabalhos na literatura relatam o

comportamento do titânio quando aplicado em meio biológico (Macêdo, 2008;

Sá, 2009; Alves Jr, 2005).

O termo biomaterial foi definido na Conferência do Instituto Nacional de

Desenvolvimento de Consenso em Saúde em 1982 como: “Qualquer

(a)

(b)

Fase α

Fase β

39

substância (outra que não fármaco) ou combinação de substâncias, sintética ou

natural em origem, que possa ser usada por um período de tempo, completa ou

parcialmente como parte de um sistema que trate, aumente ou substitua

qualquer tecido, órgão ou função do corpo” (Vaz, 2007). Os biomateriais devem

ser isentos de produzir qualquer resposta biológica adversa local ou sistêmica,

ou seja: o material deve ser não-tóxico, não-carcinogênico, não-antigênico e

não-mutagênico. Sendo classificados como: bioinertes, bioativos e bioreativos.

Os bioinertes são menos susceptíveis a causar uma reação biológica adversa

devido a sua estabilidade química em comparação com outros materiais. Os

materiais bioativos têm como propriedade formar tecido sobre a sua superfície

e estabelecer uma interface capaz de suportar cargas funcionais. Os materiais

bioreativos ficam no limite entre os materiais bioinertes e os bioativos (Trota

Filho, 2007).

Quando o biomaterial entra em contato com o meio biológico ocorre uma

série de reações físicas, químicas e biológicas que dependem principalmente

das propriedades da superfície do biomaterial. Estas propriedades determinam

a biocompatibilidade de um material, a figura 2.13 relaciona algumas destas

propriedades (Spencer e Textor, 2007).

Figura 2.13 – Propriedades dos materiais que estão relacionadas à biocompatibilidade (Spencer e Textor, 2007).

Os pesquisadores estudam o comportamento dos biomateriais com

diferentes focos. Alguns destes grupos estudam células isoladas sobre a

40

superfície do material através de técnicas que quantificam a força de adesão

celular (Anselme, 2000a; Bao e Suresh, 2003). Outros grupos, no entanto,

focam seus trabalhos na interação do material com populações de células após

alguns minutos ou horas de contato material/células (Thoumine et al., 1996;

García et al., 1997; Rezania et al., 1997; Yamamoto et al., 1998; Myrdycz et al.,

2002; Anselme e Bigerelle, 2005). Outros ainda consideram todas as fases da

diferenciação, proliferação e adesão em curto prazo e longo prazo (Hunter et

al., 1995; Anselme et al., 2000b; Nishio et al., 2000; Mustafa et al., 2001; Suh et

al., 2003; Lee et al., 2004).

Estudos in vivo e in vitro realizados com implantes têm demonstrado que

as propriedades físicas e químicas dos biomateriais são capazes de regular a

resposta tecidual inicial. Portanto, a interação biomaterial-célula depende das

propriedades superficiais incluindo microestrutura, topografia, rugosidade e

molhabilidade (Walboomers e Al, 1999; Ponsonnet et al., 2003; Winkelmann et

al., 2003).

Sabe-se que quando um biomaterial entra em contato com o meio

biológico, as primeiras moléculas a alcançarem a sua superfície (escala de

tempo de nanosegundos) são as de água. Em seguida, uma série de diferentes

substâncias encontradas nos fluidos teciduais tais como: íons e proteínas,

assim como células do tipo condroblastos, fibroblastos e osteoblastos reagem

com a superfície conforme mostrado na figura 2.14 (Ellingsen, 1998).

Figura 2.14 – Representação da superfície do implante e sua interação com as moléculas do fluido tecidual. (A) Implante. (B) Moléculas de água. (C) Camada glicoprotéica. (D) Célula (Adaptado de Kasemo, 2002).

41

Tem-se, portanto inicialmente, a formação de uma camada de proteínas

sobre a superfície do biomaterial, nos primeiros instantes após o contato com o

meio biológico. Essa camada é fruto das reações iniciais entre os constituintes

teciduais e a superfície do implante e governará as futuras reações,

determinando o tipo de resposta celular (Ellingsen, 1998).

Quando as células chegam à superfície, elas “encontram” uma superfície

coberta de proteínas cuja camada tem propriedades que foram inicialmente

determinadas pelas camadas de água pré-formada. Assim, quando se fala de

interações superfície-célula, é em ultima análise a interação entre as células e

as proteínas ligadas à superfície (Kasemo, 2002).

As propriedades da superfície do biomaterial irão proporcionar uma

maior ou menor interação com a água e, por consequência, influenciarão as

proteínas e outras moléculas que chegarão logo em seguida. A figura 2.15

esquematiza a interação de biomoléculas com a superfície de diferentes

materiais, e suas influencias para a adsorção de proteínas e adesão celular

(Kasemo, 2002).

42

Figura 2.15 – (1) Interação da superfície do material com a água. (2) Comportamento das proteínas de acordo com o conjunto superfície-água. (3) Células em crescimento na superfície ativa e em desnaturação na superfície inativa (adaptado de Kasemo, 2002).

As características da superfície determinarão quais moléculas irão

adsorver, ao passo que a natureza e orientação dessas biomoléculas terão

consequências diretas no recrutamento, ancoragem, proliferação e

diferenciação das células (Vaz, 2007).

As ligações células-superfície são da ordem de 10 a 15 nm e recebem o

nome de sítios de adesão ou contatos focais. Os contatos focais formam-se

essencialmente em células com baixa mobilidade, devido ao fato destas células

apresentarem receptores de superfície que reconhecem proteínas da matriz se

associar a elas e, por conseguinte fixam as células. A arquitetura do

43

citoesqueleto celular é essencial na manutenção da forma e na adesão das

células (Anselme et al., 2000c).

A interação osteoblasto-biomaterial depende de aspectos fundamentais

do material, tais como topografia, química e energia de superfície. Estas

características do material determinam como as moléculas serão adsorvidas e,

mais particularmente, determinam a orientação das moléculas adsorvidas, bem

como o comportamento da célula durante o contato (Boyan et al., 1996).

Células quando em contato com uma superfície primeiramente se ligam

para em seguida aderir e espraiar. A primeira etapa, ou seja, a ligação depende

de proteínas de adesão, tais como: selectinas, imunoglobulinas, caderinas e

integrinas. A qualidade da adesão influenciará a morfologia e a capacidade da

célula proliferar e diferenciar (Anselme et al., 2000b).

As integrinas são receptores transmembranicos e agem como uma

interface entre o compartimento intra e extracelular. Deste modo auxiliam a

troca de informações entre o meio externo e interno atuando na indução da

adesão, propagação e migração celular e, por consequência, participam do

crescimento e diferenciação celular (figura 2.16).

Figura 2.16 – Representação das proteínas celulares envolvidas na adesão do biomaterial (Anselme, 2000a).

44

Osteoblastos humanos cultivados expressaram altos índices de

integrinas α1β1, α3β1, α5β1 e α7β5 e níveis muito menores de integrinas α2β1,

α4β1, α7β1 e α7β3 (Hughes et al., 1993). Ao que tudo indica a integrina β1 é

um receptor predominante envolvido na adesão de osteoblastos (Gronthos et

al., 1997).

Comparando diferentes tipos de células em materiais semelhantes

verificou-se que a resposta celular é diretamente relacionada à rugosidade

superficial (Chesmel et al., 1995; Healy et al., 1996; Thomas et al., 1997).

Observações por microscopia eletrônica de células ósseas em materiais com

várias rugosidades tem demonstrado que as células se espraiam e formam

uma camada celular contínua de melhor forma em superfícies rugosas que em

superfícies lisas (Kieswetter et al., 1996; Anselme et al., 2000c).

O fenômeno de orientação de células osteoblasticas tem sido descrito.

Em superfícies lisas as células orientam-se aleatoriamente enquanto que em

superfícies rugosas, com rugosidade Ra acima de 0,5 µm as células orientam-

se paralelamente à direção da rugosidade (Chesmel et al., 1995). Eisenbarth et

al (2002) e Huang et al (2004) mostraram que células osteoblásticas seguem a

orientação da rugosidade, conforme pode ser observado na figura 2.17

(Eisenbarth et al., 2002a; Huang et al., 2004).

Figura 2.17 – Morfologia celular em discos de titânio após 2 dias de cultura. (a) superfície rugosa e (b) superfície polida (Eisenbarth et al., 2002a).

Estas células alinhadas, mostrando orientação com as ranhuras, tem

melhor comportamento de adesão quando comparadas às células menos

orientadas e às células de forma arredondada (Eisenbarth et al., 2002a).

45

As células orientadas tiveram alta densidade de contatos focais onde

tinham contato com a borda das ranhuras da rugosidade, tendo mostrado

melhor organização do citoesqueleto. Estas mudanças, na orientação das

células podem levar a uma maior aderência em superfícies rugosas que em

superfícies polidas (Eisenbarth et al., 2002b).

A distribuição dos contatos focais indica o modo de adesão de

osteoblastos em diferentes rugosidades. Em superfícies lisas, os contatos

focais ficam uniformemente distribuídos em toda a superfície da membrana os

quais estão em contato com o substrato. Nas superfícies rugosas os contatos

focais restringem-se às extremidades das extensões das células, onde a

membrana celular está em contato com o substrato (Anselme, 2000a).

Para a adesão celular um outro parâmetro de grande importância são as

características de hidrofilicidade e hidrofobicidade (Kieswetter et al., 1996;

Rupp et al., 2006), uma vez que a energia de superfície pode influenciar a

adsorção de proteínas e a reorganização estrutural das proteínas no material

(Boyan et al., 1996). Segundo Altankov (1994) a adesão celular é melhor em

superfícies hidrofílicas (Altankov e Groth, 1994).

Ponsonnet et al (2003) mostraram que a componente polar da energia

de superfície, ou um baixo valor da fração de polaridade, foram os melhores

parâmetros para a proliferação de fibroblastos (Ponsonnet et al., 2003).

Mostraram ainda, que embora a energia de superfície tenha sido o fator

dominante, a rugosidade pode afetar de forma considerável a relação energia

de superfície e proliferação.

Assim pode-se constatar que os processos biológicos são fortemente

influenciados pelas propriedades do material. A fim de melhorar estas

interações muitas ligas de Ti foram desenvolvidas ao longo do tempo. Portanto

este trabalho foi realizado com a finalidade de melhorar a interação do Ti-cp

com células. A utilização deste tipo de Ti se deu com o intuito de diminuir os

riscos futuros provenientes de elementos ligantes.

Capítulo 3

Metodologia

47

3 – Metodologia

O presente trabalho foi dividido em duas partes. A primeira parte

consiste na preparação e caracterização de amostras de titânio com diferentes

tratamentos térmicos. A segunda parte consiste na realização de ensaios

biológicos para determinar a adesão e a proliferação de células pré-

osteoblásticas sobre as superfícies previamente preparadas. A seguir na figura

3.1 é apresentado o organograma da realização do trabalho.

Figura 3.1 – Organograma da realização do trabalho

Tratamentos Térmicos

Parte 1: Metalografia

Parte 1: Caracterizações

do Titânio

Parte 2: Cultura de

Células

Parte 2: Caracterizações

Biológica

• MO

• MEV (EBS, EDS, EBSD)

• DRX / GIDRX

• Ângulo de Contato

• Energia de Superfície

• Microdureza (HV)

• Rugosidade

• Análise de Imagens

• MTT

• Adesão

• Expressão da integrina β1

• Lixamento

• Polimento

• Ataque químico

48

3.1 – Material de partida

Neste trabalho foram utilizados discos de titânio comercialmente puro

(Ti-cp grau 2), com 15mm x 1,5mm (diâmetro x espessura) e composição

química de acordo com a tabela 3.1 fornecidos pela empresa Realum Ind.

Com. de Metais Puros e Ligas LTDA.

Tabela 3.1 – Composição química do titânio utilizado segundo o fornecedor. Discos de Ti ASTM F67 GR1Φ 15x1,50mm.

Elementos N C H Fe O Ti

% 0,011 0,011 0,004 0,04 0,085 Balanço

3.2 – Tratamentos térmicos dos discos de titânio

Os tratamentos térmicos foram realizados em forno resistivo (figura 3.2)

utilizando o ar ambiente como atmosfera estática de trabalho. Colocou-se 15

amostras por vez para a realização da têmpera em 1100°C, 1000°C e 950°C

respectivamente, mantendo-se essa temperatura por 1h (uma hora) e em

seguida resfriando-se em água (volume de 6L) à temperatura ambiente,

aproximadamente 25°C. Estas temperaturas foram utilizadas por estarem

acima da temperatura beta transus e por possibilitarem a obtenção de

diferentes microestruturas (Macêdo, 2008).

Das 15 amostras temperadas de cada condição anteriormente descrita,

5 permaneceram no estado temperado, 5 foram envelhecidas a 500°C e 5

foram envelhecidas a 700°C, todas por 4h. No caso do envelhecimento, o forno

permaneceu fechado até atingir a temperatura ambiente de aproximadamente

25°C, conforme o esquema apresentado na figura 3.3 e descrição dada na

tabela 3.2.

49

Figura 3.2 – Fotografia do forno utilizado para realização dos tratamentos térmicos – Laboratório de Tratamentos Térmicos do IFRN – Natal/RN

Figura 3.3 – Esquema dos tratamentos térmicos realizados

50

Tabela 3.2 – Simbologia e descrição dos tratamentos térmicos realizados.

Simbologia Tratamento

11 Têmpera 1100°C (1h)

11R5 Têmpera 1100°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h)

11R7 Têmpera 1100°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h)

10 Têmpera 1000°C (1h)

10R5 Têmpera 1000°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h)

10R7 Têmpera 1000°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h)

95 Têmpera 950°C (1h)

95R5 Têmpera 950°C (1h) + Envelhecimento 500°C (4h)

95R7 Têmpera 950°C (1h) + Envelhecimento 700°C (4h)

ST Sem Tratamento (comercial)

3.3 – Preparação metalográfica

Uma amostra tratada de cada condição foi cortada transversalmente

utilizando disco diamantado. Em seguida essa amostra, assim como todos os

demais, foram embutidas em resina de poliéster e preparadas

metalograficamente, passando pelas etapas de lixamento (lixas de

granulometria variando de 80 # a 2000 #) até remover toda a camada formada

durante a têmpera e polimento utilizando uma solução de 40% de sílica coloidal

(1 micra) com 60% de peróxido de hidrogênio (30%).

Terminada a etapa de polimento os discos foram atacados

quimicamente para revelação microestrutural, utilizando a solução Kroll (95mL

de H2O + 10mL de HF + 5mL de HNO3). Em seguida os discos foram limpos

em banho ultrassônico utilizando detergente enzimático, álcool e água

destilada, nesta ordem, sendo 10min de lavagem para cada líquido.

Devidamente limpas as amostras foram secas e acondicionadas em

embalagens apropriadas para uso posterior.

51

3.4 – Caracterizações das amostras

3.4.1 – Microscopia Ótica e Análise de Imagens da superfície

A técnica de microscopia ótica foi utilizada para análise da superfície e

do perfil dos discos, bem como para a observação e análise das células

aderidas à superfície dos discos. Para tanto foi utilizado um microscópio ótico

de luz refletida da marca Olympus modelo BX 60M com uma câmera digital

acoplada e conectada a um computador.

Para aquisição das fotomicrografias utilizou-se o software Image Pro

Plus versão 6.0. As fotomicrografias da superfície das amostras foram obtidas

em seis regiões do disco distribuídas conforme ilustra a figura 3.4. A

delimitação dessas regiões foi feita utilizando microdureza Vickers (HV), de

forma que a cada conjunto de 3 marcações de microdureza representa uma

região a ser analisada (quadrantes e centro).

Figura 3.4 – Ilustração dos locais marcados para as análises das células sobre os discos.

3.4.2 – Microscopia eletrônica de Varredura (BSE, EDS e EBSD)

Foram utilizados dois microscópios eletrônicos de varredura – MEV,

ambos de marca PHILLIPS e modelo XL30. O primeiro equipado com detetores

de elétrons secundários (SE) e de elétrons retro-espalhados (BSE),

52

pertencente ao Núcleo de Estudos de Petróleo e Gás Natural – NEPGN da

UFRN. Este equipamento foi utilizado no modo BSE para aquisição de imagens

da microestrutura da borda dos discos temperados.

O segundo MEV utilizado pertence ao LACAM/DEMM da UFC e possui

além dos detetores SE e BSE, os detetores de energia dispersiva de raios-x

(EDS) de marca EDAX e de difração de elétrons retro-espalhados (EBSD) de

marca HKL. Este ultimo detetor foi utilizado para análise das fases presentes

após os tratamentos térmicos. O software utilizado na aquisição foi o Flamenco

Channel 5, já o processamento dos resultados foi realizado com os softwares

Tango e o Mango.

Para utilização da técnica de EBSD o porta amostra foi rotacionado de

70°. Esta técnica consiste em analisar a difração de elétrons retro-espalhados.

Como resultado obtém-se: mapas de orientação cristalográfica, no qual cada

orientação tem uma cor associada, mapas de contornos de grãos e de fases,

figuras de polo e figuras de polo inversa. Neste trabalho somente foi utilizado

os mapas de orientação e o de fases.

Para análise de EBSD foi delimitado uma área de aproximadamente

50% do campo de visão referente a um aumento de 100x, representada pela

área colorida da Figura 3.5. Durante o processamento dos resultados foi

definido que estruturas cristalinas hexagonais (referentes às fases α e α’ do

titânio) fossem coloridas de vermelho, estruturas ortorrômbicas (referentes à

fase α’’) de amarelo e estruturas cúbicas de corpo centrado (referentes à fase

β do titânio) de azul, para identificação das fases presentes.

53

Figura 3.5 – Região de análise de EBSD. A imagem cinza refere-se a uma ampliação de 100x e a colorida refere-se somente a parte analisada por EBSD.

3.4.3 – Difração de Raios-X (DRX)

Utilizou-se um difratômetro de raios-X da SHIMADZU modelo XRD-6000

pertencente ao Núcleo de Estudos de Petróleo e Gás Natural – NEPGN da

UFRN. Foram utilizadas duas configurações de incidência do feixe. A primeira

configuração utilizada foi a Brag-Bretano, ou θ~2θ para varredura entre 20° e

80° numa velocidade de 2°/min e para varredura de 33° a 43° numa velocidade

de 0,25°/min. A segunda configuração foi a de incidência rasante (GIDRX) para

o ângulo de 6° e varredura entre 20° e 80° numa velocidade de 2°/min esta

configuração foi utilizada com a finalidade de obter informações mais

superficiais possível.

3.4.4 – Microdureza Vickers

O equipamento utilizado neste ensaio foi um microdurômetro digital HVS

1000 da PANAMBRA. Foram realizadas 18 identações (impressões de

microdureza) distribuídas por toda a superfície da amostra conforme a figura

3.4 A carga aplicada foi de 100g durante 15s. Essas impressões de

500µm

54

microdureza na superfície também foram utilizadas para localização das

regiões de análise celular (figura 3.6a).

Testes de microdureza foram ainda realizados na secção transversal da

amostra. As impressões neste caso foram realizadas de forma a se ter uma

média para comparação do valor da microdureza na microestrutura da camada

figura 3.6b e na microestrutura do núcleo figura 3.6c.

Figura 3.6 – Micrografias das marcações de microdureza: (a) marcações na superfície que delimitam a área de análises futuras, (b) marcação na camada externa e (c) marcação no núcleo.

3.4.5 – Rugosidade

Para análise da rugosidade foi utilizado um rugosímetro TIME modelo

TR300 do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Piauí – IFPI.

Foram analisados os parâmetros: rugosidade média aritmética (Ra), altura

máxima do pico (Rp), profundidade máxima do vale (Rv), rugosidade média

entre os cinco maiores picos e os cinco maiores vales (Rz), distancia vertical

máxima entre o pico mais alto e o vale mais profundo (Rt). Calculou-se a razão

Rp/Rz para saber se os picos na superfície eram pontiagudos ou

arredondados. Os valores apresentados nos resultados foram uma média de 5

(cinco) medições paralelas aproximadamente equidistantes de 2 mm.

3.4.6 – Molhabilidade

Para o estudo da molhabilidade, utilizou-se o método da gota séssil. Os

líquidos utilizados foram água, formamida, glicerol e meio de cultura ALFA-

MEM, o volume das gotas foi de 10 µL. O goniômetro utilizado nesta análise foi

(a) (b) (c)

100x 400x 400x 50µm 50µm 50µm

55

desenvolvido no Laboratório de Processamento de Materiais por Plasma -

LabPlasma/UFRN e o esquema do mesmo é apresentado na figura 3.7.

Figura 3.7 – Esquema do goniômetro utilizado para medição do ângulo de contato.

3.4.6.1 – Ângulo de Contato

Para determinar o ângulo de contato, colocou-se a amostra sobre a base

do goniômetro e em seguida gotejou-se água e meio de cultura, enriquecido

com soro fetal bovino, sobre a superfície dos discos. Este procedimento foi

acompanhado em tempo real e os resultados foram armazenados através do

software Pinnacle Studio QuickStart versão 8. Em seguida, ainda usando o

Pinnacle Studio, isolou-se uma imagem referente ao instante de 60 segundos.

De posse destas imagens passou-se então a utilizar outro software, o

Surftens (versão demo). Com auxílio deste programa foram feitas 5 (cinco)

marcações gerando-se um circulo e sua respectiva tangente, conforme é

mostrado na figura 3.8. Os valores de ângulo de contato que serão

apresentados neste trabalho representam uma média das medições de três

imagens sendo que foram feitas cinco medidas para cada imagem, ou seja,

uma média de 15 medições.

56

Figura 3.8 – Gota de 10 µL de água depositada sobre um disco de titânio. Medição do ângulo de contato por meio do Surftens.

3.4.6.2 – Energia de Superfície

A Energia de superfície foi calculada utilizando a equação de Fowkes

(Equação 1) (Rajendra e Narendra, 2003). Para tanto, foram utilizados os

valores dos ângulos de contato medidos anteriormente e os valores das

componentes polar e dispersiva de cada uma dos líquidos, estes dados são

apresentados na tabela 3.3.

[

] [

√ ] √

√

√

(1)

Tabela 3.3 – Energia superficial dos líquidos usados.

Líquidos ( ⁄ )

( ⁄ ) ( ⁄ )

Água 72,8 51,0 21,8 Formamida 58,2 18,7 39,5

Glicerol 63,4 26,2 37,2

θ

57

3.5 – Ensaios em Cultura de Células

Após o processamento metalográfico reservou-se três amostras de cada

condição de tratamento e três não tratadas para realização das análises

biológicas. Estas amostras foram então levadas ao Laboratório de

Biotecnologia e Polímeros Naturais – BIOPOL no Centro de Biociências da

UFRN, para esterilização por autoclavagem a 120°C por 30min e realização

dos ensaios biológicos.

Posteriormente, às etapas de limpeza, o experimento seguiu em

ambiente estéril numa câmara de fluxo laminar. Os discos foram colocados

numa placa de cultura de 24 poços, sendo um disco por poço. Em seguida

adicionou-se 1mL de meio de cultura celular (ALFA-MEM) suplementado com

10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico juntamente com células pré-

osteoblásticas de linhagem MC3T3-E1 ( células por poço), figura 3.9. As

placas permaneceram em condição de cultura celular em câmara de CO2 a

37°C.

Figura 3.9 – Fotografia ilustrativa da placa de 24 poços utilizada na cultura de células.

58

3.5.1 – Proliferação por microscopia ótica e análise de imagens

Para realização do teste de proliferação analisado por microscopia ótica

de luz refletida os discos com as células permaneceram em condição de

cultura conforme descrito anteriormente por 24h. Após este período o meio de

cultura foi retirado, sendo então adicionado paraformaldeido a 4% por 15min,

em seguida foi realizado três lavagens com PBS e só então as células foram

fixadas em metanol.

As análises óticas das células aderidas ao substrato foram realizadas a

partir de imagens adquiridas nas mesmas regiões marcadas previamente. O

software Image Pro Plus foi novamente utilizado, desta vez para quantificar as

células sobre cada disco, analisar suas morfologias e área ocupada pelas

células. Tais medidas foram realizadas para cada uma das imagens referentes

às 6 regiões marcadas e, como estão em triplicata, totalizam 18 imagens para

cada condição de tratamento.

A área total de cada imagem no aumento utilizado (500x) é de

146609,7µm2. Sabendo este valor e a área total ocupada por células em cada

imagens, fez-se o cálculo segundo a equação 2.

(2)

Assim, obteve-se valores em porcentagem da área ocupada por células

para cada condição de tratamento. Na figura 3.10 é apresentado um exemplo

do contorno das células, feito utilizando o software image pro plus, nesta figura

é apresentado uma das 18 imagens da condição 11.

59

Figura 3.10 – Ilustração do contorno das células utilizado para aquisição dos dados das células sobre os disco, utilizando o software Image Pro Plus.

A morfologia das células foi analisada através do recurso chamado

“Aspect” do Image Pro Plus, este recurso calcula a razão entre o raio maior e o

raio menor da elipse equivalente à área demarcada ao redor da célula, de

forma que quanto mais aproximado de 1 (um) for o resultado desta razão, mais

arredondada é a célula.

A fim de classificar as células morfologicamente, utilizou-se a

classificação de Zhu e colaboradores (2004), onde células foram classificadas

como não espraiadas (arredondadas), parcialmente espraiadas e

completamente espraiadas (Zhu et al., 2004). Para tanto foi calculado a razão

de aspecto das imagens do trabalho de Zhu (2004), obtendo-se valores entre

1,1 e 1,7. Com base nesses valores padronizou-se as seguintes faixas: entre 1

e 1,5 células arredondadas (não espraiadas), entre 1,5 e 2 células parcialmente

espraiadas e para valores acima de 2 células completamente espraiadas.

3.5.2 – Proliferação MTT

A proliferação foi avaliada por um período de 24h de contato entre

célula e os discos. Decorrido esse tempo o meio de cultura foi retirado e

60

adicionado MTT (brometo de 3 - [4,5 - dimetil - tiazol - 2 il] – 2,5 difenil

tetrazólio) sendo novamente levado à câmara de cultura por mais 4h.

Completado este tempo os cristais foram solubilizados em metanol (PA). Em

seguida todo o líquido foi trocado de placa, retirado da placa de 24 poços e

colocados numa placa de 96 poços. A proporção de troca foi a seguinte: cada

poço da placa de 24 preencheu 3 poços da placa de 96. Esta troca foi

necessária para leitura em espectrofotômetro específico para leitura de placas

de 96 poços (figura 3.11). A leitura foi realizada utilizando um comprimento de

onda de 570nm. Os valores foram analisados em porcentagem de absorbância

em relação ao controle (poço sem disco). Considerou-se a absorção do

controle como 100%, em seguida fez-se a razão entre a absorção da condição

tratada pelo controle.

Figura 3.11 – Espectrofotômetro específico para leitura de placas de 96 poços – laboratório de genética do CB/UFRN.

3.5.3 – Adesão

Os discos foram colocados numa placa de cultura de 24 poços, sendo

um disco por poço. Em seguida adicionou-se 1mL de meio de cultura celular

(ALFA-MEM) e células pré-osteoblásticas de linhagem MC3T3-E1 (

células por poço), figura 3.9. As placas permaneceram em condição de cultura

celular (5% de CO2 e 37°C) por 1 h, 2 h e 3 h.

61

Após os tempos de incubação o meio foi aspirado e os discos lavados 2

vezes com PBS. Em seguida, as células foram fixadas em metanol (PA) gelado

por 5 min. Depois lavou-se mais 2x (duas vezes) com PBS para posterior

coloração com Cristal Violeta 0,2% em Metanol 2%. Passado 10 min, com o

cristal violeta os discos foram lavados exaustivamente em PBS até que todo o

cristal violeta tivesse sido retirado. O corante do interior das células foi

removido com uma solução de etanol 50% e citrato de sódio 0,1 M.

Em seguida todo o líquido foi passado para uma placa de 96 poços para

leitura em espectrofotômetro específico para placas de 96 poços. A leitura foi

realizada utilizando um comprimento de onda de 550 nm. Os valores foram

analisados em porcentagem de absorbância em relação ao controle (poço sem

disco).

3.5.4 – Avaliação da Expressão de integrinas

Para avaliar a influência dos tratamentos térmicos do Ti sobre a

expressão quantitativa de integrinas de osteoblastos humanos da linhagem

Host, foram realizados experimentos, nos quais adicionou-se 5x103 destas

células sobre cada um dos discos de Ti (3 discos para cada condição

apresentada na tabela 3.2). Estas células foram cultivadas por 3 horas,

utilizando meio de cultura (ALFA-MEM) suplementado com 10% de soro fetal

bovino (SFB), 100 UI/ml de penicilina e 100 µg de estreptomicina.

Após o tempo estabelecido, as células foram lavadas em PBS e

tripsinizadas. As células foram incubadas por 1 hora a 4°C com 2 mg/ml de

cada anticorpo contra as integrinas β1 uma vez que estas são as mais

importantes na adesão diferenciação para osteoblastos e produção de matriz

óssea (Gali et al., 2011). Decorrido esse tempo, após três lavagens em PBS,

as amostras foram fixadas em parafolmaldeído 0,5% até análise no citômetro

de fluxo. Um total de 50.000 eventos foram adquiridos no citômetro de fluxo

(FACScan, BD Biosciences, San Jose, USA) do Hemonorte (Hemocentro do

RN).

Os resultados da expressão de integrinas nos osteoblastos cultivados

sobre o titânio foram expressos em intensidade média de fluorescência (IMF)

62

calculada através do software WinMDI versão 2.8. O IMF é a razão entre a

intensidade de fluorescência para cada condição de tratamento e o controle

isotípico (sem marcação específica). Este fator permite identificar diferenças de

intensidade de fluorescência, mesmo quando há uma baixa população de

células marcadas.

3.5.5 – Análise Estatística

Para análise estatística utilizou-se o teste da ANOVA que mede a

variabilidade entre os valores e em seguida fez-se o teste t-student para avaliar

o nível de significância estatística para p<0,05.

Capítulo 4

Resultados e Discussões

64

4 – Resultados e discussões

4.1 – Caracterizações do Titânio

4.1.1 – Microestruturas

Os discos de titânio sem tratamento (ST) apresentaram uma

microestrutura semelhante àquela apresentada na figura 2.7 para o titânio

comercialmente puro conforme é mostrado na figura 4.1a. Os grãos α da

estrutura do titânio antes do tratamento térmico apresentam tamanho variados

desde ~10 µm até ~40 µm, conforme pode ser observado nas medições da

micrografia de MEV apresentada na figura 4.1b.

Figura 4.1 – Micrografias do disco de titânio sem tratamento. (a) micrografia ótica e (b) micrografia por MEV com medição dos tamanhos dos grãos.

Analisando a micrografia da superfície (figura 4.1a) observou-se que

alguns grãos apresentaram no seu interior regiões escuras e em formato de

agulhas e grãos sem essas estruturas. A diferença entre estes dois tipos de

grãos pode ser atribuída à presença de impurezas do tipo hidrogênio, por

exemplo (Boyer, 1985) ou ainda devido à sílica coloidal utilizada no polimento.

Os tratamentos térmicos mais severos de têmpera (1100°C e 1000°C)

permitiram a obtenção de microestruturas bem definidas constituídas

basicamente de ripas ou lamelas de martensita maclada e em alguns pontos

isolados, uma estrutura em forma de placas, conforme pode ser visualizado na

figura 4.2.

(a)

(b)

50µm 50µm

65

Figura 4.2 – Micrografia por microscopia ótica da amostra temperada em água (1100°C). Constituída de uma estrutura de lamelas macladas e em alguns pontos uma estrutura em forma de placas. A micrografia da condição 1000° é semelhante a esta.

Já na têmpera a 950°C, não houve uma completa transformação da

estrutura α primária numa estrutura temperada, conforme ilustrado na figura

4.3, resultado numa estrutura denominada alfa deformada. A partir do campo

de fase α+β é possível obter estrutura martensita, através de altas taxas de

resfriamentos, em menor quantidade quando comparada às amostras

temperadas a partir do campo de fase β (Poondla et al., 2009). Este

comportamento pode ocorrer, pois esta temperatura é muito próxima à de

transformação alotrópica, o que leva à formação de uma estrutura denominada

alfa deformada.

placas

maclas

300µm

66

Figura 4.3 – Micrografia por microscopia ótica da microestrutura de uma amostra temperada a 950°C em água.

O tratamento de envelhecimento a 500°C por 4h possibilitou a

transformação das estruturas martensítica de lamelas grossas e bem definidas

em estruturas em que as lamelas foram mais finas e menos definidas (figura

4.4). Esta modificação foi menos intensa nas amostras temperadas em maiores

temperaturas, ou seja, a 1100°C e 1000°C. Observou-se ainda que 4h a 500°C

não foi suficiente para “dissolver” as lamelas formadas na têmpera a 1100°C.

Para envelhecimentos a 700°C por 4h foi possível verificar que houve

mudança na microestrutura (figura 4.5) comparativamente aos

envelhecimentos a 500oC. Neste caso, as lamelas foram totalmente desfeitas

durante o tratamento resultando em uma estrutura rica em agulhas escuras,

que podem ter surgido em decorrência da contaminação devido ao ar no

interior do forno.

300µm

67

Figura 4.4 – Micrografia por microscopia ótica das microestruturas das amostras envelhecidas a 500°C por 4h.

Figura 4.5 – Micrografia por microscopia ótica microestrutura das amostras envelhecidas à 700°C por 4h.

11R5

10R5

95R5

11R7

10R7

95R7

50µm

50µm

50µm

50µm 50µm

50µm

68

Os tratamentos de têmpera utilizados neste trabalho permitiram a

obtenção de microestruturas diferenciadas em tamanho e forma de grãos,

conforme pode ser visto na figura 4.6, onde é apresentada uma micrografia

ótica do corte transversal das amostras temperadas. Pode-se observar uma

evolução microestrutural semelhante ao mostrado nas figuras 4.2 e 4.3.

Figura 4.6 – Micrografia por microscopia ótica do corte transversal mostrando as diferentes estruturas dos discos temperados.

Uma camada espessa ao redor de todo o disco foi formada durante os

tratamentos térmicos. Esta camada apresentou-se mais espessa para maiores

temperaturas de têmpera. Observando com mais detalhe por microscopia

eletrônica de varredura, observa-se que essas camadas possuem espessuras

de 201 µm, 49,8 µm e 46 µm, para temperaturas de 1100, 1000 e 950oC,

respectivamente (figura 4.7). Observa-se ainda na micrografia de MEV a

presença de uma segunda camada ainda mais externa com espessuras de 10

µm, 4,24 µm e 1,21 µm para as respectivas temperaturas.

300um

11

10

95

300um 300um

69

Figura 4.7 – Medição em microscopia eletrônica da espessura das camadas formadas durante a têmpera.

Analisado por EDS (figura 4.8) a amostras temperadas a 1100oC,

observou-se uma camada mais externa (camada 2) que possui alta

concentração de oxigênio, sugerindo ser uma camada de óxido de titânio. A

camada intermediária (camada 1) que é a camada observada também por

microscopia ótica, embora apresente microestrutura bastante diferenciada do

núcleo, apresentam a mesma composição quando analisada por EDS. Portanto

se fez necessário outra técnica para melhor definição do que seria esta

camada.

4,24um

11

10

95

20

1u

m

10um

49

,8u

m

1,21um

70

Figura 4.8 – EDS da borda dos discos temperados a 1100°C.

4.1.2 – Fases

4.1.2.1 – Difração de Raios-X (DRX)

A técnica utilizada para identificar as camadas mostradas anteriormente

foi a Difração de Raios-X Rasante (GIDRX) nas duas camadas, sendo

analisadas separadamente. Inicialmente a camada 2 e em seguida, após

remoção da camada 2 por procedimento metalográfico, apenas a camada 1.

Os resultados confirmaram que a segunda camada é de fato óxido de titânio,

ou mais precisamente dióxido de titânio na forma de rutilo, segundo a carta 77-

0441 do Power Difraction File (PDF). Já a camada 1 apresentou fases de óxido

de titânio (carta89-3074) e de nitreto de titânio (cartas 87-0626 e 17-0386). Na

figura 4.9 são mostrados os difratogramas referentes a cada uma das

fases/camadas da condição 11.

Ca

ma

da

1

Núcle

o

71

20 30 40 50 60 70 80

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

' e

' e In

ten

sid

ad

e (

u.a

.)

'

20 30 40 50 60 70 80

0

500

1000

1500

2000

Inte

nsid

ad

e (

u.a

.)

Ti2

NT

iN.7

6T

iO0.4

8

TiO

0.4

8, T

i2N

TiN

.76

TiO

0.4

8

TiN

.76

TiN

.76

Ti2

N

20 30 40 50 60 70 80

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500T

iO2

TiO

2

Inte

nsid

ad

e (

u.a

.)

TiO

2

TiO

2

TiO

2

TiO

2

TiO

2

TiO

2T

iO2

TiO

2 TiO

2

TiO

2

Figura 4.9 – Difratogramas para as diferentes camadas presente nos discos. (a) núcleo martensítico (b) camada 1 – oxinitreto de titânio e (c) camada 2 – dióxido de titânio.

A literatura relata a possibilidade de formação destas duas fases durante

o tratamento em temperaturas elevadas e com altas taxas de resfriamentos

Nú

cleo

C

amad

a 1

C

amad

a 2 Rutilo

72

quando o ar é utilizado como atmosfera de trabalho. Borgioli e colaboradores

em 2001 obtiveram camadas muito semelhantes às obtidas neste trabalho. Os

autores concluíram que para tratamento em forno usando o ar como atmosfera

de trabalho se obtém uma camada de TiO2 mais externa e uma camada

intermediária à de TiO2 e ao núcleo formada por TiNxOy, ou seja de oxinitreto

de titânio (Borgioli et al., 2001).

A técnica de difração de raios-X foi ainda utilizada para análise das fases

do núcleo dos discos, para tanto ambas as camadas 1 e 2 foram removidas por

procedimentos metalográficos já descritos no tópico 3.3.

Analisando os difratogramas obtidos numa varredura de 20° a 80° na

configuração θ-2θ (figura 4.10) observou-se pequenos deslocamentos para a

esquerda em todos os picos do difratograma, mostrados na tabela 4.1. Uma

varredura mais lenta (0,25° por segundo) foi realizada apenas nas posições 2θ

em que se encontram os três picos principais do titânio. Observou-se, além do

deslocamento do pico principal (posição 2θ de ~40°) para a esquerda, que

caracteriza a formação da fase martensita. Estes deslocamentos se devem às

tensões residuais que surgiram após os tratamentos de têmpera, uma vez que

este tipo de tratamento promove um grande número de tensões provenientes

da falta de tempo para que haja uma reorganização atômica de acordo com os

diagramas de fases existentes.

A retenção da difusão dos átomos proporciona a formação de uma fase

metaestável que é a estrutura martensita. No caso deste trabalho, a martensita

obtida é a α’ por se tratar de um titânio comercialmente puro, ou seja, sem a

presença de elementos β estabilizadores e foi obtida apenas nas condições

mais severas de têmpera, ou seja, 11 e 10.

Acredita-se que as estruturas obtidas nestas duas condições de

tratamento são martensita com base na análise das microscopias óticas

(estruturas em forma de agulha) em conjunto com os difratogramas, onde foi

observado que para estas condições houve um alargamento dos picos devido à

presença das duas fases α e α’. A largura dos picos (FWHM) pode ser

verificada na tabela 4.1.

73

20 30 40 50 60 70 80

ST

Inte

nsid

ad

e (

u.a

.)

2

11

10

95

Figura 4.10 – Difratogramas do núcleo dos discos de titânio temperados - varredura de

20° a 80°.

Tabela 4.1 – Relação das distancias interplanares e da largura a meia altura dos principais picos comuns nos difratogramas.

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

D

~35° 2,546 2,546 2,558 2,547 2,555 2,556 2,553 2,554 2,557 2,557

~40° 2,231 2,240 2,247 2,237 2,247 2,247 2,244 2,245 2,245 2,245

~52,9 1,727 1,729 1,731 1,725 1,728 1,728 1,728 1,727 1,727 1,727

FWHM

~35° 0,285 0,185 0,163 0,182 0,143 0,107 0,146 0,127 0,111 0,151

~40° 0,281 0,153 0,153 0,166 0,155 0,138 0,149 0,140 0,130 0,142

~52,9 0,179 0,168 0,153 0,165 0,154 0,120 0,142 0,131 0,121 0,140

4.1.2.2 – Difração de Elétrons Retroespalhados (EBSD)

Na figura 4.11 apresenta-se as imagens obtidas durante o ensaio de

EBSD na interface do núcleo com a camada 1. Esta análise foi realizada

exatamente na interface das estruturas, a fim de saber qual a estrutura

cristalina destas fases. Observou-se que ambas apresentam somente estrutura

hexagonal compacta caracterizada pela cor vermelho (figura 4.11b). Entretanto,

74

como visto nos difratogramas anteriores, a estrutura lamelar refere-se à fase

martensita hexagonal ou α’ e a estrutura equiaxial refere-se à fase TiNxOy, ou

seja, oxinitreto de titânio. Quanto à camada de TiNxOy essas pode ter sido

formada por contaminação na rede cristalina durante o aquecimento no forno.

Já a camada de TiO2 foi mais provavelmente formada no momento do

resfriamento.

Figura 4.11 - Imagens de EBSD na interface do núcleo martesitico com a camada 1 do disco temperado a 1100°C (a) região de análise (b) mapa de cores das estruturas cristalinas, apresentando somente estrutura hexagonal compacta.

Essa técnica foi utilizada na análise do núcleo dos discos, afim de

identificar as fases presentes. A partir dos mapas de cores para estruturas

cristalográficas foi verificado que em todas as condições de tratamento,

somente a estrutura hexagonal compacta (representada pela cor vermelho)

estava presente, conforme pode ser verificado através da figura 4.12.

Entretanto ambas as fases α e α’ apresentam estrutura hexagonal

compacta. Para diferir estas fases utilizou-se os padrões de qualidade de

imagens a partir dos quais obteve-se um histograma que sempre

apresentavam dois picos. Um desses picos foi tomado como sendo referente à

fase α e o outro à fase α’ ou alfa deformada. Observou-se que as condições 11

e 10 apresentaram fase α’ em maior quantidade quando comparada à fase α,

já para as demais condições de tratamento o segundo pico foi atribuído à fase

alfa deformada essa observação foi confirmada analisando comparativamente

as imagens de microscopia ótica.

(a)

(b)

100µm

75

Figura 4.12 – Mapas de cores para estruturas cristalográficas obtidas por EBSD. Em todas as condições de tratamento apresentaram somente estrutura hexagonal compacta.

4.1.3 – Microdureza Vickers

Através dos testes de microdureza Vickers (HV) realizados nas

amostras, verificou-se que as camadas de oxinitreto de titânio formadas

durante o processo de têmpera têm aproximadamente o dobro da dureza do

núcleo do material, mesmo esse núcleo tendo estrutura martensita no caso das

condições 11 e 10, esses altos valores de dureza se devem à presença da fase

nitreto (figura 4.13). Valores de dureza semelhantes aos encontrados neste

trabalho para a camada de oxinitreto de titânio foram encontrados por Borgioli,

2001.

200µm 200µm 200µm

200µm 200µm 200µm

200µm 200µm 200µm

76

Figura 4.13 – Microdureza Vickers – corte transversal. Os oxinitretos apresentam-se mais duros que as estruturas martensítica e alfa deformada.

Em primeiro momento o ensaio de microdureza foi realizado para avaliar

o quanto as propriedades mecânicas mudaram, no entanto este teste mostrou

ter relações com a proliferação de células pré-osteobláticas, conforme já

observado por Macêdo, 2011.

Os valores de microdureza Vickers obtidos na superfície das amostras

indicam que os tratamentos térmicos aumentaram consideravelmente a dureza

do material. O titânio sem tratamento apresenta valores de dureza semelhantes

aos da literatura conforme é mostrado na figura 4.14 (Lütjering e Willians,

2007). Os valores encontrados para a fase martensita não são comparados

com a literatura, porque não foram encontrados trabalhos que tenham obtido

estruturas semelhantes para o mesmo tipo de titânio utilizado neste trabalho.

Entretanto, para outras ligas α valores na ordem de 436 +/- 45 HV foram

obtidos (Pinto, 2005).

Kao e colaboradores (2005) estudaram a variação da dureza para

diferentes tratamentos térmicos do Ti-cp. Encontraram que para altas

temperaturas e altas taxas de resfriamento a dureza do material aumenta

consideravelmente quando comparada ao material de partida, por exemplo,

encontraram para tratamento de 750° por 4 horas resfriado em forno, dureza na

ordem de 180 vickers e para tratamento a 1000° por 4 horas dureza na ordem

0

200

400

600

800

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7

Mic

rod

ure

za

(H

V)

camada 1 núcleo martensítico

77

de 250 Vickers (Kao et al., 2005). Esse valores são semelhantes aos valores

obtidos para as condições 95R7 e 10 respectivamente.

Rocha et al em 2006, realizaram tratamentos térmicos em Ti-cp,

encontrando valores de dureza Vickers para discos tratados a 955°C por 1 hora

e em seguida envelhecidos a 620° por 2 horas, na ordem de 259,9 +/- 23,3

vickers (Rocha et al., 2006). Levando em consideração os desvios padrões

esse valor é semelhante ao obtido para as condições 95 e 95R5.

Figura 4.14 – Microdureza Vickers – Superficial.

Os valores mais elevados de dureza foram obtidos para as condições de

têmpera a 1100°C seguido dos seus respectivos envelhecimentos. Da mesma

forma para amostras temperadas a 1000° e seus envelhecimentos e só então

dos discos tratados a 950° e seus envelhecimentos (Figura 4.14). Isso se deve

à quantidade de martensita formada nas têmperas (1100°C, 1000°C e 950°C).

Durante o resfriamento rápido a partir do campo de fase beta, formam-se

muitas lamelas que no geral são finas e alongadas. Entretanto, para

temperaturas mais elevadas ou para tempos mais prolongados, estas lamelas

tornam-se mais largas. Os contornos de grãos destas lamelas impedem a

migração de discordâncias e isso faz com que a dureza do material aumente

(Kao et al., 2005).

0

100

200

300

400

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

Mic

rod

ure

za

(H

V)

78

4.1.4 – Ângulo de Contato

Neste trabalho os ângulos de contato foram analisados utilizando água e

meio de cultura (ALFA-MEM). Observou-se que todos os valores de ângulo de

contato para a água são maiores que os encontrados para o meio de cultura

(figura 4.15). Isto indica que o titânio interage melhor com o meio de cultura do

que com a água, no entanto, todos os tratamentos apresentaram-se

moderadamente molháveis para ambos os líquidos. Esta boa interação com

esses dois líquidos indica que estas superfícies devem responder de forma

favorável à adesão e à proliferação de células.

Figura 4.15 – Ângulo de contato na superfície dos discos de titânio para água e para o meio de cultura celular (ALFA-MEM).

4.1.5 – Energia de Superfície

A energia de superfície é um indicador da química da superfície, em

termos das interações que podem ocorrer. Sabe-se que a energia de superfície

afeta fortemente as interações biológicas, tais como a adesão, proliferação e a

morfologia celular. Ponsonnet e colaboradores (2003) relacionam a

30

40

50

60

70

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

Ân

gu

lo d

e C

on

tato

(θ)

ÁGUA ALFA-MEM

79

componente polar da energia de superfície com o comportamento de células

fibroblásticas (Ponsonnet et al., 2003).

A energia de superfície foi determinada a partir dos resultados dos

ângulos de contato medidos através da técnica da gota séssil na superfície dos

discos após a remoção da camada de oxinitreto, ou seja, a análise foi realizada

no núcleo (estrutura martensita). Observa-se que para as condições de

têmpera a 1100°C seguida dos seus respectivos envelhecimentos à 500°C e a

700°C, a energia total se comporta de forma semelhante e isto se repetiu com

as componentes polar e dispersiva, salvo o fato de que a componente

dispersiva foi muito maior que a polar nas três condições conforme pode ser

observado na figura 4.16.

Para as condições de tratamento de 1000°C e seus respectivos

envelhecimentos a 500°C e 700°C, o valor da energia total foi semelhante,

entretanto, observou-se uma mudança da característica dispersiva apresentada

na condição 10 para uma característica polar apresentada nas condições 10R5

e 10R7. Já para os discos temperados a 950°C e seus envelhecimentos

apresentaram característica mais dispersiva, dada pelos altos valores desta

componente quando comparadas à componente polar. Este comportamento

das componentes é semelhante ao encontrado para a condição ST.

Figura 4.16 – Energia de superfície e suas componentes polar e dispersiva para as diferentes condições de tratamento.

0

10

20

30

40

50

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

(m

J/m

^2)

ENERGIA TOTAL POLAR DISPERSIVA

80

A energia de superfície é a soma das componentes polar e dispersiva da

energia de superfície. Sabe-se da literatura que a componente polar da energia

de superfície influencia a adesão de fibroblastos tendo sido mostrado que a

adesão deste tipo de célula é máxima quando a fração de polaridade,

( )⁄ é igual a 0,3 (Ponsonnet et al., 2003). Mesmo não tendo sido

utilizado este tipo de célula neste trabalho, fez-se o calculo da FP, a fim de

encontrar uma possível relação entre este fator e a adesão de osteoblastos. Os

valores obtidos estão na tabela 4.2.

Tabela 4.2 – Fração de polaridade calculada a partir das componentes polar e dispersiva da energia de superfície dos discos de Ti.

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

FP 0,22 0,27 0,29 0,47 0,78 0,44 0,31 0,44 0,33 0,37

4.1.6 – Rugosidade

Verificou-se que para todas as condições o parâmetro de rugosidade Ra

foi semelhante (tabela 4.3). Isso confirma a necessidade de utilização de mais

parâmetros de rugosidade quando o objetivo é investigar a relação das

propriedades do material com a resposta biológica. A tabela 4.3 mostra além

do parâmetro Ra os parâmetros Rp, Rz, Rv e Rt e a razão Rp/Rz que fornece

a forma do picos, se arredondado ou pontiagudo.

Tabela 4.3 – Parâmetros de rugosidade dos discos de Ti.

Ra(µm) Rp(µm) Rz(µm) Rv(µm) Rt(µm) Rp/Rz

11 11R5 11R7

10 10R5 10R7

95 95R5 95R7

ST

81

Observando-se a tabela 4.3 acima, pode-se concluir que para todas as

condições os picos apresentam-se arredondados. Exceto as condições 11,

11R7 e 10 que se encontram no limite entre a condição arredondado e

pontiagudo. Para os demais parâmetros verifica-se que os menores valores

foram obtidos para os discos sem tratamento. Todavia, é importante salientar

que outros parâmetros além da rugosidade devem ser levados em

consideração no estudo da interação do biomaterial com o meio biológico, uma

vez que o Ra é um parâmetro pobre para este tipo de estudo, pois como visto

para Ra semelhantes foi obtido diferentes graus de proliferação celular.

4.2 – Caracterização da Resposta Biológica

4.2.1 – Orientação Celular

Na figura 4.17 são apresentadas as morfologias celulares representativa

de cada condição de tratamento. Observa-se que nas amostras não tratadas as

células apresentaram-se com aspecto arredondado enquanto que nas

superfícies tratadas, que apresentam estrutura lamelar, as células apresentam-

se espraiadas, orientando-se geralmente conforme a orientação das lamelas.

Já nos discos em que as lamelas foram desfeitas as células apresentam

morfologia semelhante à dos discos não tratados.

Figura 4.17 – Microscopia ótica das células aderida no titânio – Orientação das células conforme a microestrutura.

50 um

11R5

50 um

11

82

Figura 4.17 – Continuação

11R7

10

10R5

10R7

95

95R5

ST

95R7

50 um 50 um

50 um 50 um

50 um 50 um

50 um 50 um

83

De acordo com Chesmel (1995), células ósseas alinham-se

aleatoriamente em superfícies lisas. Quando existe rugosidade orientada maior

que 500 nm, as células percebem essa topografia e orientam-se obedecendo a

orientação topográfica da superfície (Chesmel et al., 1995). A rugosidade

média obtida foi de 0,58 um, ou seja, acima do limite estabelecido e

semelhante para todas as condições. No entanto, somente em algumas

condições (11, 11R5, 10 e 10R5) a estrutura estava orientada e nestas, as

células obedeceram a orientação.

No caso deste trabalho as diferentes topografias testadas são

provenientes de tratamentos térmicos que modificaram a estrutura do material.

Observou-se que as células apresentam-se com orientação mais definidas para

estruturas de lamelas mais grossas. Esta orientação diminui à medida que as

lamelas ficam mais finas, até que a espessura das lamelas bem como a

distância entre elas sejam tais que as células não distingam a orientação da

estrutura e passam, portanto, a comporta-se da mesma forma que na estrutura

equiaxial dos discos não tratados.

4.2.2 – Proliferação e Morfologia por Análises de Imagens

A partir das imagens apresentadas na figura 4.17 e de outras 17

imagens de cada uma das condições de tratamento, calculou-se o número de

células aderidas à superfície dos discos. Os valores apresentados no gráfico da

figura 4.18 representam a soma das células para as 18 (dezoito) imagens

obtidas.

84

Figuras 4.18 – Número de células aderidas aos discos tratados sob diferentes condições, contadas a partir de análise de imagens.

Neste resultado nota-se que as células aderem-se preferencialmente

aos discos temperados, na ordem de suas temperaturas – 1100°C, 1000°C e

950°C, respectivamente. Observa-se também que os discos não tratados tem

um maior número de células que os discos envelhecidos. Realizando testes

estatísticos verificou-se que a diferença na quantidade de células para as

diferentes condições é estatisticamente significante para p<0.001.

Ainda, através das análises de imagens foi possível quantificar em

termos de porcentagem a área dos discos que está coberta por células.

Observou-se que para as condições 11 e 10 cerca de 45% da área estava

coberta por células, este percentual diminui aproximadamente 38% para as

condições de menor tensão residual, discos 95R5 e 95R7 conforme pode ser

observado na figura 4.19.

Embora o raciocínio lógico inicial seja que, para uma maior quantidade

de células maior deve ser a área ocupada. Esta relação não é tão simples de

se afirmar uma vez que para as condições em que as células estão orientadas,

estas são mais estreitas e compridas seguindo a orientação da estrutura e

tendo menor área que nas demais condições nas quais as células não

encontram obstáculos e crescem aleatoriamente ocupando grandes áreas.

300

350

400

450

500

550

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

N°

de c

élu

las a

deri

das

85

Presume-se assim que a área ocupada por células nos discos não tratados

seja maior.

Figura 4.19 – Área dos discos de ti coberta por células (Porcentagem).

A morfologia das células foram analisadas, tomando-se 3 (três) padrões

morfológicos que levam em consideração a elipse equivalente ao contorno da

célula, conforme a figura 4.20. Observou-se que a quantidade de células

arredondadas em todas as condições é inferior à quantidade de células

parcialmente espraiadas. Da mesma forma, estas têm menor quantidade que

as completamente espraiadas ao que indica que para todos os casos houve

uma boa adesão dessas células. Observou-se também que os maiores valores

para a razão de aspecto foram obtidos para as células que estavam orientadas

segundo a orientação das lamelas da microestrutura.

30%

35%

40%

45%

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

86

Figura 4.20 – Morfologia celular. Células arredondadas (<1,5), células parcialmente espraiadas (>1,5 e <2) e totalmente espraiadas (<2)

4.2.3 – Análise de Proliferação Celular (MTT)

A proliferação analisada pelo método MTT teve comportamento

semelhante ao encontrado através de análise de imagens, conforme a figura

4.21. Os discos temperados (11, 10 e 95) foram os que apresentaram maior

proliferação celular seguido dos envelhecimentos a 500°C e dos

envelhecimentos a 700°C. Esses últimos não tiveram diferença estatística

significante, exceto a condição 95R7, quando comparados com os discos não

tratados.

O maior destaque se deu para a condição 11 onde o número de células

quase que triplicou em comparação à placa controle. As demais condições

apresentaram em torno de 1 a 1,5 vezes mais células que o controle, exceto a

condição 95R7 que não chegou nem a dobrar o número de células,

comparando o mesmo parâmetro.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

Fre

qu

ên

cia

de

Cé

lula

s

<1,5 >1,5 e <2 >2

87

Figura 4.21 – Proliferação por MTT – dados plotados em relação à placa controle.

4.2.4 – Avaliação da Adesão Celular

Conforme o esperado para superfícies biocompatíveis, a taxa de adesão

celular aumenta para todas as condições de tratamento. As morfologias

específicas desenvolvidas para cada microestrutura afetaram diretamente a

adesão celular.

Na figura 4.22 são mostrados os resultados da adesão para 1, 2 e 3

horas de cultura. Nos discos 11, 11R5, 11R7, 10R5 e 95 os sítios de adesão

foram preenchidos nas primeiras 2 horas de contato/incubação, a partir desse

momento houve uma estabilização, não havendo, portanto mais adesão em 3h,

possivelmente devido ao fato de que todos os sítios de adesão já estarem

preenchidos.

Já para as condições 10, 10R7, 95R5 e 95R7 ao que tudo indica os

sítios não foram totalmente preenchidos e por isso é perceptível um aumento

gradual no número de células aderidas para os três tempos estudados.

No entanto para os discos ST percebe-se não houve adesão na

primeira hora estudada e que entre 1h e 2h as células aderiram à superfície

possivelmente preenchendo todos os sítios de adesão disponíveis, pois para

3h a adesão foi à mesma que para 2h.

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

% d

e A

bso

rção

88

Figura 4.22 – Adesão celular para 1, 2 e 3 horas de cultura.

4.2.5 – Expressão de Integrinas

Foi observado que todas as condições de tratamento apresentavam

maior expressão de integrinas β1 quando comparada ao disco não tratado,

conforme pode ser observado na tabela 4.4 de intensidade média de

fluorescência para todas as condições utilizadas neste trabalho. Este resultado

indica que as superfícies têm propriedades que podem levar à uma boa

adesão. Quando comparadas ao controle negativo/isotípico verifica-se que em

todas as condições houve um elevado número de ocorrências de integrinas β1,

confirmando que estas superfícies são adequadas para aplicações em cultura

de células, a figura 4.23 mostra os resultados plotados para os controles

negativo e positivo do disco da condição 11. Essa imagem é semelhante as

demais condições.

Tabela 4.4 – Valores de Intensidade média de fluorescência para todas as condições utilizadas neste trabalho. Para todas as condições tratadas o IMF é maior que o não tratado e que todos são maiores que o controle negativo/isotípico.

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST Controle isotípico

59,27 48,34 47,98 53,66 47,91 45,43 50,47 45,55 44,74 44,59 7,44

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

% d

e A

bso

rção

1h 2h 3h

89

Figura 4.23 – Histograma da expressão da integrina β1 para as diferentes condições de tratamento do titânio.

A razão entre os IMFs das condições de tratamento pelo controle

negativo indica o quanto uma condição foi melhor que a outra. A figura 4.24

apresenta os resultados desta razão.

Figura 4.24 – Razão IMF das amostras tratadas pelo controle negativo/isotípico.

4,5

5,5

6,5

7,5

8,5

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

IMF

Controle

negativo ou

isotípico

Controle

positivo

Disco de Ti

Condição 11

90

4.3 – Comparação dos resultados biológicos com as propriedades obtidas

para o titânio

4.3.1 Ângulo de Contato X Proliferação

Observa-se que para ângulos de contato semelhante a proliferação é

bem diferente e que essa proliferação é as vezes maior para os maiores

valores de ângulo de contato como pode ser observado para a condição 11,

por exemplo na figura 4.25. Todas as superfícies analisadas neste trabalho

apresentaram-se moderadamente molháveis, esta condição de molhabilidade

implica que todos os discos tratamento são passíveis de uma boa interação

com o meio biológico.

Figura 4.25 - Relação ângulo de contato e proliferação celular

Analisando o gráfico anterior, verificou-se que os discos temperados a

1100°C e 1000°C e seus respectivos envelhecimentos, não apresentaram uma

relação direta entre ângulo de contato e proliferação. Esta relação pode ser

observada quando se analisa o ângulo de contato do meio de cultura e a

proliferação para as condições 95, 95R5 e 95R7. Estas condições, no entanto,

apresentam uma topografia mais homogênea sem a estrutura lamelar.

0,5

1

1,5

2

35

45

55

65

75

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

Pro

life

raçã

o -

MT

T (%

)

Ân

gulo

deC

on

tato

(θ

)

água alfa mem MTT

91

4.3.2 – Energia de Superfície X Proliferação

Ponsonet et al (2003) associaram a alta adesão obtida com a baixa

energia superficial, na ordem de ⁄ . Todos os valores obtidos neste

trabalho são ainda menores não chegando a ⁄ . No entanto bastante

semelhantes enquanto que a proliferação foi diferente.

Na figura 4.26 são mostrados os resultados da proliferação e das

componentes de energia de superfície. Não foram observadas relações diretas

entre as componentes e a proliferação, exceto para a componente que

apresentou comportamento semelhante aos dos discos temperados a 1100°C e

seus respectivos envelhecimentos.

Figura 4.26 - Comparação do comportamento dos gráficos da proliferação com as componentes da energia de superfície.

Verificou-se que a fração de polaridade (FP) estabelecido por Ponsonet

(2003) para uma boa adesão de células fibroblasticas não pode ser aplicada à

células osteoblsticas. E que não foi possível estabelecer um valor para o FP

que indique uma boa adesão uma vez que para proliferações semelhantes,

condições 10R5 e 95, por exemplo, o valor de FP é muito diferente, conforme

pode ser observado na figura 4.27.

0

0,5

1

1,5

2

0

10

20

30

40

50

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

Ener

gia

de

Sup

erfí

cie

(mJ/

m2)

Pro

life

raçã

o -

MT

T (%

)

MTT gsp gsd gs

92

Figura 4.27 - Comparação do comportamento dos gráficos da proliferação com o fração de polaridade.

4.3.3 - Rugosidade X Proliferação

Muitos estudos relatam que o sucesso dos implantes depende, não

somente das propriedades físico-químicas, tais como a energia superficial, mas

também da rugosidade (Webb et al., 1998; Redey et al., 1999; Hallab et al.,

2001). Entretanto, na maioria dos casos relata-se somente o parâmetro Ra.

Neste trabalho observou-se que para um mesmo valor de Ra, foram obtidos

diferentes graus de proliferação celular e que esta proliferação não foi

influenciada diretamente pela rugosidade Ra, mesmo levando-se em conta

outros parâmetros de rugosidade, tais como os apresentados na tabela 4.3.

Outra relação comumente encontrada na literatura diz respeito à relação

entre molhabilidade, rugosidade e proliferação. A partir das observações

realizadas neste trabalho pode-se verificar que há uma relação mais intensa

que esta relacionada à topografia e à proliferação. Como visto no tópico

anterior para valores semelhantes de ângulo de contato houve uma

proliferação bastante diferenciada, por exemplo, 11 e 11R7.

Estas duas condições diferenciam-se principalmente pela topografia,

devido à microestrutura que apresentam e à tensão residual. Entretanto,

quando se leva em consideração as demais condições de tratamento que

0

0,5

1

1,5

2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

Fraç

ão d

e P

ola

rid

ade

Pro

lifer

ação

- M

TT

(%)

MTT FP

93

apresentam topografia/microestrutura semelhantes o parâmetro que as

diferencia é a tensão residual proveniente dos tratamentos térmicos realizados.

Analisando os demais parâmetros de rugosidade verificou-se que estes

também têm valores muito próximos e que não estão diretamente relacionados

à proliferação (figura 4.28). Entretanto, as maiores proliferações foram obtidas

para as condições em que os picos apresentam-se pontiagudos.

Figura 4.28 - Comparação do comportamento dos gráficos da proliferação com os parâmetros de rugosidade.

4.3.4 – Microdureza Vickers X Proliferação

A microdureza é um bom indicativo do estado de tensão residual do

material quando este material não é ligado. Maiores valores de microdureza

indicam um maior estado de tensão residual. Comparando esse resultado com

o da proliferação celular observa-se que as células preferem superfícies mais

tensas. Foi observado uma maior proliferação nos discos temperados quando

comparados aos discos envelhecidos. A curva do gráfico de microdureza é

bastante semelhante ao da proliferação (figura 4.29). Resultados semelhantes

já foram observados em estudos anteriores (Macêdo, 2011).

0

0,5

1

1,5

2

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

11 11R5 11R7 10 10R5 10R7 95 95R5 95R7 ST

Pro

lifer

ação

- M

TT

(%)

Ru

gosi

dad

e (µ

m)

MTT Ra Rp Rv Rt Rz Rp/Rz

94

Figura 4.29 - Relação microdureza e proliferação celular.

4.3.5 – Orientações Cristalográficas X Proliferação

Foi observado que a maior proliferação celular se deu para a condição

11 e que a condição 95R7 foi a que apresentou menor proliferação celular.

Embora não sejam apresentadas quais as orientações cristalográficas estão

presentes em cada imagem, sabe-se que cada cor refere-se a uma destas

orientações. Comparando esses resultados com as orientações cristalográficas

apresentadas na figura 4.30 observou-se que não há uma correlação direta

entre a orientação cristalográfica e a proliferação celular, uma vez que para

número de células (proliferação) semelhantes são observadas colorações

(orientações cristalográficas) bem diferentes e que para cores iguais a

proliferação foi diferente.

Uma das ideias iniciais deste trabalho de que as orientações

cristalográficas teriam consequências superficiais e, portanto, afetariam a

adesão e consequentemente a proliferação de células foi contrariada. Pelo que

foi observado até então esta relação parece não existir e a resposta biológica

ao nível estudado foi mais influenciada pela tensão residual (indicada pela

microdureza) e pela topografia/microestrutura.

0

0,5

1

1,5

2

50

150

250

350

450

11 11R511R7 10 10R510R7 95 95R595R7 ST

Mic

rod

ure

za (

HV

)

Pro

life

raçã

o -

MT

T (%

)

MTT MicrodurezaHV

95

Figura 4.30 – Mapa de orientação cristalográfica, onde cada cor representa uma orientação cristalográfica.

200µm 200µm 200µm

200µm 200µm 200µm

200µm 200µm 200µm

Capítulo 5

Conclusões e Sugestões

97

5.1 – Conclusões

Foi possível obter martensita do tipo hexagonal em Ti-cp através de têmpera a

partir das têmperas 1100°C e 1000°C (campo de fase β) com resfriamento em

água;

Após a têmpera as únicas fases presentes são α’ no caso das condições 11 e

10 e alfa deformada para as demais condições;

O ângulo de contato foi influenciado pela topografia e não pela rugosidade Ra;

Não foi possível determinar um valor para Fração de Polaridade ideal para que

se tenha uma boa proliferação de células osteoblasticas sobre a superfície do

Ti tratado termicamente;

As células orientam-se conforme a topografia/orientação microestrutural

(orientação das lamelas). Neste caso, as células apresentam-se espraiadas, ou

seja, alongadas na direção da orientação das lamelas. E quando estas não são

definidas ou não existem, as células encontram-se arredondadas;

No geral existe mais células espraiadas que arredondadas. Essa diferença é

maior para os discos com estruturas lamelares;

Todas as condições apresentaram boa adesão celular e uma boa interação

com as integrinas β1;

Para o nível de análise utilizada neste trabalho, verificou-se que as orientações

cristalográficas não afetam a proliferação. Entretanto, a proliferação, assim

como a adesão, foram fortemente influenciadas pela topografia/microestrutura

e quando esta era muito semelhante acredita-se que o fator influenciador tenha

sido a tensão residual.

98

5.2 – Sugestão de Trabalhos Futuros

Realizar medidas quantitativas de tensão residual utilizando DRX.

Relacionar de forma direta a tensão residual com a proliferação celular.

Aumentar o tempo de proliferação.

Realizar os mesmos testes biológicos para outras ligas de titânio.

99

Lista de Trabalhos Publicados

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Alves Júnior. Estudo da Resposta Biológica no Ti-cp Tratado

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n.1 (2011) 17-26. ISSN 2236-1103

H. R. A. Macêdo, M. O. Cardoso, D. O. Freitas, C. Alves Júnior. Estudo da

Molhabilidade do Titânio Tratado Termicamente. Revista Eletrônica de

Materiais e Processos, v.5, n.2 (2010) 61-67. ISSN 1809-8797

Completo em Congressos

J. O. Vitoriano, H. R. A. Macêdo, M. O. C. Macêdo, C. Alves Junior. Effect of

Heat Treatment Annealing of Titanium in Wettability. 21st Brazilian Congress

of Mechanical Engineering. (2011).

H. R. A. Macêdo, M. O. C. Macêdo, C. Alves Junior. Tratamento Térmico em

Titânio: Estudo da Molhabilidade. The 6th Latin American Congress f Artificial

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H. R. A. Macêdo, V. M. Fonseca, C. Alves Junior. Influência da

Microestrutura do Titânio na Resposta Celular de Pre-Osteoblastos

MC3T3-E1. 21º Congresso Brasileiro de Engenharia Biomédica. p. 237-240

(2008) ISBN: 978-85-60064-13-7

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