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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ
CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS
JÚLIA TEIXEIRA DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO IN VITRO DA MUTAGENICIDADE E ANTIMUTAGENICIDADE DO
FÁRMACO DIGOXINA
DIVINÓPOLIS-MG
JANEIRO-2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ
CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS
JÚLIA TEIXEIRA DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO IN VITRO DA MUTAGENICIDADE E ANTIMUTAGENICIDADE DO
FÁRMACO DIGOXINA
Orientador: Prof. Dr. Fabio Vieira dos Santos
DIVINÓPOLIS-MG
JANEIRO-2016
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade
Federal de São João Del Rei, como requisito parcial
para a obtenção do grau de Mestre.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me guiado ao longo do mestrado, me iluminando nos momentos mais
difíceis e concedendo tantas graças.
Ao meu noivo Jean que sempre foi meu maior incentivador, por ter acompanhado toda
essa caminhada sempre apoiando, compreendendo e não me deixando desistir nunca.
Obrigada por todo amor e dedicação. Te amo.
Aos meus pais, José e Rosângela, por nunca mediram esforços para me educar, sempre
ao meu lado, incentivando, aconselhando e orgulhosos com as minhas vitórias.
Aos meus irmãos, André e Luísa, pelo companheirismo e por sempre torcerem por
mim.
Ao meu orientador Prof. Dr. Fabio Vieira dos Santos por ter me dado a oportunidade
de desenvolver ciência e por ter me conduzido nos caminhos da pesquisa com paciência e
maestria.
À Universidade Federal de São João Del Rei e ao Laboratório de Biologia Celular e
Mutagênese pela disponibilização da estrutura física para a realização deste trabalho.
A CAPES por ter me concedido uma bolsa de estudo e à FAPEMIG e ao CNPq pelo
suporte financeiro para a execução desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Leandro Augusto de Oliveira Barbosa pelo fornecimento da molécula
analisada.
Aos companheiros do Laboratório de Biologia Celular e Mutagênese: Anna Luisa,
Ana Paula, Camila, Camila Marques, Daniela, Gabrielle, Isabella, Luíz Fernando, Maria
Cristina, Natália, Nathália e Taynara, obrigada pela colaboração nos experimentos e pela
amizade.
Às professoras, Dra. Mariana Campos da Paz, Dra. Luciana Lara e Dra Lilia Ribeiro,
participantes da banca de qualificação/defesa da presente dissertação que contribuíram muito
para a melhoria deste trabalho.
Aos amigos da IV Turma de Bioquímica da UFSJ e do mestrado, em especial a Ana
Paula, Bárbara e Mariana que tornaram esta jornada mais leve e que serão amigas para a vida
toda. Contem sempre comigo.
A todos os docentes do curso de Bioquímica e do Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde pelos ensinamentos que contribuíram muito para minha formação
acadêmica.
iii
À equipe do Núcleo de Pesquisa em Química Biológica pela troca de experiências e
grande aprendizado.
Agradeço também aos demais familiares, amigos e professores que contribuíram de
alguma forma para a realização deste trabalho.
Muito obrigada a todos!
iv
“As pessoas que acreditam em nossa capacidade fazem
mais do que apenas incentivar.
Elas criam para nós uma atmosfera que favorece nosso
sucesso”.
John Spalding
v
RESUMO
A indução de mutações ou proteção contra os danos ao material genético pode ser promovida
por muitas substâncias utilizadas como medicamentos. O fármaco digoxina é o glicosídeo
cardíaco mais utilizado no tratamento de insuficiência cardíaca. Complementarmente, a
digoxina tem sido descrita como um potencial agente antitumoral, o que pode ser observado
em estudos que avaliaram sua citotoxicidade em linhagens celulares derivadas de tumores
malignos humano. No entanto, o potencial farmacológico real de todo composto tem de ser
cuidadosamente avaliado e uma correlação entre os seus benefícios terapêuticos e os seus
efeitos colaterais deve ser realizada. Por outro lado, a análise da capacidade de proteger o
aparecimento de mutações após o contato com esse fármaco pode ser uma abordagem
promissora, considerando seu uso em tratamentos de longa duração. Deste modo, o objetivo
do presente estudo foi avaliar, in vitro, a citotoxicidade, a mutagenicidade e a
antimutagenicidade da digoxina em uma linhagem celular não-tumoral, CHO-K1, e em uma
tumoral, HeLa. O ensaio de viabilidade celular foi realizado utilizando o método
colorimétrico MTT para determinação das concentrações a serem testadas na análise de
mutagenicidade e antimutagenicidade. O ensaio do micronúcleo com bloqueio da citocinese
foi empregado para avaliar o potencial do fármaco em induzir mutações cromossômicas como
também seu potencial protetor do DNA das células tratadas com digoxina associada a
mutágenos conhecidos (MMC, DOX e MMS), em diferentes protocolos de tratamento (pré-
complexação, simultâneo, pré e pós-tratamento). Os resultados demonstram que a digoxina
apresentou citotoxicidade e mutagenicidade seletiva para a linhagem tumoral HeLa nas
concentrações cerca de 100 e 30 vezes maiores que a dose terapêutica (1,8 nM),
respectivamente. De maneira geral, uma ação antimutagênica foi observada
predominantemente no protocolo de pré-tratamento, na maior concentração da digoxina
(3nM), contra todos os agentes mutagênicos analisados. Já a menor concentração da digoxina,
0,7 nM, não apresentou atividade antimutagênica em nenhum protocolo de tratamento
avaliado. Dentre os mutágenos estudados, apenas contra a MMC a digoxina foi capaz de
proteger o material genético, de ambas as linhagens celulares, em três protocolos de
tratamentos distintos (pré-complexação, simultâneo e pré-tratamento). Com exceção do
MMS, no pós-tratamento não foi observado um efeito protetor ou potencializador da ação dos
mutágenos, em nenhuma das concentrações analisadas. O mecanismo antimutagênico da
digoxina provavelmente possa ser por desmutagênese visto que o efeito protetor foi observado
apenas nos tratamentos anteriores à indução de danos. Os resultados encontrados demonstram
vi
que o co-tratamento com digoxina apresentou potencial para ser utilizado como um agente
adjuvante de quimioterápicos ou um quimioprotetor, dependendo do tipo celular e protocolos
de tratamentos empregados.
Palavras-chave: Teste do Micronúcleo, desmutagênese, glicosídeo cardíaco, HeLa.
vii
ABSTRACT
The induction of mutations or protection against DNA damages can be promoted by many
substances used as medicines. Digoxin is the cardiac glycoside most widely used to treat heart
failure. Complementarily, digoxin has been correlated as a potential antitumor agent, which
could be observed in studies that evaluated their cytotoxicity in cell lines derived from
malignant tumors. However, the real pharmacological action of all drug substance must be
carefully evaluated and a correlation between its therapeutic benefits and side effects should
be performed. On the other hand, it is interesting analyze the ability to protect the appearance
of mutations after exposure. Thus, the aim of this study was to evaluate the cytotoxicity,
mutagenicity and antimutagenicity in vitro of digoxin in a non-tumoral cell line, CHO-K1,
and in a tumor cell line, HeLa. The cell viability assay was performed using the MTT,
colorimetric method. The cytokinesis-block micronucleus assay was performed in order to
evaluate the potential of this drug to induce chromosomal mutations as well as to protect the
DNA of cells treated with digoxin associated with known mutagens (MMC, DOX and MMS)
in different protocols of treatment (pre-complexation, simultaneous, pre and post-treatment).
The results showed that the digoxin had a selective cytotoxicity and mutagenicity for HeLa
cell line at concentrations of about 100 and 30 times higher than the therapeutic, respectively.
In general, an antimutagenic action was obtained in the pre-treatment protocol, in the highest
concentration of digoxin (3 nM), against all mutagens analyzed. The lowest concentration of
digoxin, 0.7 nM, did not show antimutagenic activity in any treatment protocol. Of the
analyzed mutagens, only against MMC digoxin was able to protect the genetic material of
both cell lines, in three different treatment protocols (pre-complexation, simultaneous and pre-
treatment). With the exception of MMS, in the post-treatment was not observed a protective
effect or potentialization of the action of mutagens in any of the analyzed concentrations. The
antimutagenic mechanism of digoxin can probably be seen by desmutagenic that the
protective effect was only observed in previous treatments inducing damage. The results
showed that co-treatment with digoxin has the potential to be used as a potentiator or
protective of the mutagens action, depending of the cell type employed and treatment
protocol.
Keywords: Micronucleus Assay, desmutagenic, cardiac glycoside, HeLa.
viii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................ x
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. xiii
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ xiv
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 10
1.1 USO DE PRODUTOS NATURAIS EM TRATAMENTOS MEDICINAIS ............... 10
1.2 GLICOSÍDEOS CARDÍACOS, Na, K-ATPASE E CÂNCER .................................... 11
1.3 DIGOXINA ................................................................................................................... 18
1.4 MUTAÇÃO E CÂNCER .............................................................................................. 20
1.5 ANTIMUTAGENCIDADE........................................................................................... 24
1.6 FERRAMENTAS PARA AVALIAÇÃO DE MUTAGENICIDADE E
ANTIMUTAGENICIDADE .................................................................................................... 28
1.7 TESTE DO MICRONÚCLEO ...................................................................................... 30
1.8 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE - MTT ................................................................... 34
2. JUSTIFICATIVA .............................................................................................................. 35
3. OBJETIVOS...................................................................................................................... 37
3.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 37
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 37
4. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 37
4.1 DIGOXINA ................................................................................................................... 37
4.2 CULTIVO CELULAR .................................................................................................. 38
4.3 ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR (MTT) ........................................................ 39
4.4 TESTE DO MICRONÚCLEO COM BLOQUEIO DA CITOCINESE ....................... 40
ix
4.4.1 TESTE DE MUTAGENICIDADE ............................................................................ 40
4.4.2 TESTE DE ANTIMUTAGENICIDADE .................................................................. 41
4.4.3 ÍNDICE DE DIVISÃO NUCLEAR (IDN) ............................................................... 43
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................... 43
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 44
6.1 VIABILIDADE CELULAR .......................................................................................... 44
6.2 MUTAÇÕES CROMOSSÔMICAS E MODULAÇÃO DA ATIVIDADE
PROLIFERATIVA ................................................................................................................... 47
6.3 ANTIMUTAGENICIDADE ......................................................................................... 54
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 66
8. PERSPECTIVAS .............................................................................................................. 67
9. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 67
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AL - Ácido lipóico
ANOVA - Análise de variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APAF- 1 - Fator de ativação de apoptose 1
ATP – Trifosfato de adenosina
BAX - Bcl-2 associated protein X
Proteína X associada a Bcl-2
Bcl-2 - B-cell lymphoma 2
Linfoma de células B 2
Bcl-xL - B-cell lymphoma-extra large
Linfoma de grandes células B
βCT - β-caroteno
Ca+2 - Íon cálcio
CBMN - Células Binucleadas Micronucleadas
CHO-K1- Chinese hamster ovary-K1
Células de ovário de hamster chinês-K1
CitoB - Citocalasina B
CO2 – Dióxido de carbono
DAPI - 4’,6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloreto
Dig - Digoxina
DMEM - Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - deoxyribonucleic acid
Ácido desoxirribonucleico
DOX - Doxorrubicina
EDTA - Ethylenediaminetetraacetic acid
Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGFR - Receptor do fator de crescimento epidérmico
EMA - European Medicines Agency
Agência Europeia de Medicina
ERK- Extracellular-signal-regulated kinase
Quinase regulada por sinalização extracelular
xi
EROs - Espécies reativas de oxigênio
FDA - Food and Drug Administration
Agência Americana de Regulamentação de Fármacos e Alimentos
FUNED - Fundação Ezequiel Dias
Gama-H2Ax - Histona H2Ax fosforilada
GCs - Glicosídeos cardíacos
IDN - Índice de Divisão Nuclear
INCA - Instituto Nacional do Câncer
IWGT- International Workshops on Genotoxicity Testing
Workshop Internacional sobre Testes de Genotoxicidade
K+ - Íon potássio
LaBCeM - Laboratório de Biologia Celular e Mutagênese do CCO/UFSJ
LOX - Lisil oxidase
Mcl-1 - Myeloid cell leukemia 1
Células de leucemia mielóide 1
Mg2+ - Íon magnésio
MMC - Mitomicina C
MMS - Metilmetanosulfonato
MN- Micronúcleo
MNs - Micronúcleos
MTT- brometo 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio
Na+ - Íon sódio
Na, K-ATPase - Bomba sódio-potássio
Nf-kβ - Fator nuclear kappa β
OECD - Organization for Economic Cooperation and Development
Organização de Cooperação e Desenvolvimento Econômico
OGG1- 8-oxoguanina glicosilase
OMS - Organização Mundial da Saúde
PARP - (Poli (ADP-Ribose) polimerase
PBS - Phophate Buffered Saline
Solução Salina Tamponada com Fosfato
PI3K- Fosfatidilinositol 3-quinase
PKA- Proteína quinase A
PKC- Proteína quinase C
xii
pRb - Proteína do retinoblastoma
Rb - Gene do retinoblastoma
RNA- Ácido Ribonucléico
Src - Tirosina quinase Src
TK - Timidina quinase
UFSJ - Universidade Federal de São João Del Rei
XPD - Enzima do xeroderma pigmentoso
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura molecular de glicosídeos cardíacos. 12
Figura 2: Mecanismos de morte celular induzidos por GCs. 15
Figura 3: Sinalização intracelular mediada pela Na, K-ATPase. 16
Figura 4: Mecanismos de ação de glicosídeos cardíacos. 17
Figura 5: Estrutura molecular da digoxina (C41H64O14). 19
Figura 6: Diferentes mecanismos de ação de mutágenos. 31
Figura 7: Fotomicrografia de células HeLa binucleadas coradas com DAPI (aumento de
1000x). 41
Figura 8: Esquema de tratamento do teste do micronúcleo para avaliação da
antimutagenicidade da digoxina. 42
Figura 9: Viabilidade celular obtida a partir do ensaio de MTT, para a linhagem CHO-K1,
após o tratamento com diferentes concentrações da digoxina em um tempo de 24 e 48h. 44
Figura 10: Viabilidade celular obtida a partir do ensaio de MTT para a linhagem HeLa, após o
tratamento com diferentes concentrações da digoxina em um tempo de 24 e 48h. 46
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Avaliação da mutagenicidade de três concentrações, próximas a terapêutica, da
digoxina na linhagem CHO-K1. 47
Tabela 2: Avaliação da mutagenicidade de três altas concentrações da digoxina na linhagem
CHO-K1. 48
Tabela 3: Avaliação da mutagenicidade de três concentrações, próximas a terapêutica, da
digoxina na linhagem HeLa. 48
Tabela 4: Avaliação da mutagenicidade de três altas concentrações da digoxina na linhagem
HeLa. 49
Tabela 5: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas à
MMC (4,8 µM) na linhagem CHO-K1. 55
Tabela 6: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada à MMC na linhagem CHO-K1. 55
Tabela 7: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas à
MMC (4,8 µM) na linhagem HeLa. 56
Tabela 8: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada à MMC na linhagem HeLa. 56
Tabela 9: Avaliação da antimutagenicidade três concentrações da digoxina associadas à DOX
(0,3 μM) na linhagem CHO-K1. 57
Tabela 10: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada à DOX na linhagem CHO-K1. 58
Tabela 11: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas à
DOX (0,3 μM) na linhagem HeLa. 58
Tabela 12: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada à DOX na linhagem HeLa. 59
Tabela 13: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas a
MMS (400 μM) na linhagem CHO-K1. 60
xv
Tabela 14: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada a MMS na linhagem CHO-K1. 60
Tabela 15: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas a
MMS (400 μM) na linhagem HeLa. 61
Tabela 16: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada a MMS na linhagem HeLa. 61
Tabela 17: Ação antimutagênica dos diferentes protocolos de tratamentos com digoxina
associada aos mutágenos MMC, DOX e MMS na linhagem CHO-K1. 63
Tabela 18: Ação antimutagênica dos diferentes protocolos de tratamentos com digoxina
associada aos mutágenos MMC, DOX e MMS na linhagem HeLa. 63
10
1. INTRODUÇÃO
1.1 USO DE PRODUTOS NATURAIS EM TRATAMENTOS MEDICINAIS
Produtos naturais, produzidos por microrganismos, plantas e animais, exibem, de
maneira geral, considerável diversidade estrutural. Os produtos de origem natural, quando
comparados a compostos orgânicos sintéticos, normalmente apresentam, sistemas de aneis
mais variados, menos heteroátomos, átomos de menor massa molecular e centros quirais.
Estas características dos compostos naturais os tornam um recurso inestimável de diversidade
estrutural e química e, assim, podem ser modelos para a otimização de métodos sintéticos
para o desenvolvimento de medicamentos ou ainda como produtos farmacologicamente ativos
em potencial com diferentes atividades biológicas (PAN et al., 2013).
A utilização de recursos naturais para fins terapêuticos é uma prática milenar. Desde a
antiguidade, produtos naturais de origem vegetal e animal são fundamentais para a saúde
humana. Vários exemplos da utilização desses recursos naturais na medicina, no controle de
pragas e como mecanismos de defesa contribuíram para o desenvolvimento das civilizações
orientais e ocidentais. Os povos primitivos e indígenas adquiriram, ao longo do tempo,
conhecimentos sobre os produtos oriundos da natureza que foram fundamentais para o
descobrimento de diversas substâncias tóxicas e medicamentosas. Suas descobertas também
trouxeram valiosas contribuições para o desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais
(JUNIOR et al., 2006; BRASIL, 2012; PARASURAMAN et al., 2014).
Dentre os produtos naturais, os derivados de plantas representam uma ampla variedade
de compostos com diferentes características estruturais, que vão desde moléculas
relativamente simples, às mais complexas. Os metabólitos secundários de plantas, em geral,
apresentam diferentes atividades biológicas e são frequentemente utilizados como fármacos
(STANIEK et al., 2014). Os terpenoides, alcaloides e compostos fenólicos são um dos
principais exemplos desses metabólitos e representam uma fonte alternativa quase inesgotável
de novas moléculas com potencial para serem usadas no controle de doenças (DOMINGUES
et al., 2011).
As plantas, além de possuírem grande importância na medicina popular com
finalidades terapêuticas, também têm contribuído, ao longo dos anos, para a obtenção de
vários medicamentos até hoje amplamente utilizados na clínica como, por exemplo, a
digoxina (SOUZA et al., 2015), a vincristina (FARO et al., 2009) e a colchicina (RAVAL et
11
al., 2015). Porém, também nos dias atuais, continuam sendo descritas na literatura novas
moléculas derivadas de plantas, algumas de relevante ação farmacológica como a forscolina,
o taxol (ZHANG et al., 2013) e a artemisinina (KLONIS et al., 2013).
Estima-se que 60% dos fármacos antitumorais já existentes no mercado ou sob ensaio
clínico são originados de produtos naturais (MELO; FORTICH, 2013). Nesse contexto, nas
últimas décadas, muitos estudos foram direcionados à medicina popular, com o objetivo de
identificar produtos naturais com essa propriedade terapêutica (ANTER et al., 2011;
KAIVALYA et al., 2011). Empresas privadas e organizações governamentais têm instituído
diversos projetos de pesquisa nesta área, mostrando que, nos últimos anos, o interesse na
pesquisa de novas substâncias ativas de origem vegetal tem aumentado significativamente
(CALIXTO, 2000).
Contudo, um dos principais problemas do uso de compostos naturais é a crença de que
eles são isentos de toxicidade. Apesar dos compostos naturais possuírem uma ação similar de
medicamentos alopáticos, eles podem também ter efeitos colaterais, sendo necessário reunir
conhecimentos populares e científicos para garantir a segurança e eficácia desses produtos. O
consumo de plantas com propriedades medicinais mostrou, ao longo dos anos, que certas
plantas eram constituídas por substâncias potencialmente nocivas a saúde, dentre elas,
alcaloides pirrolizidínicos, antraquinonas e lactonas sesquiterpênicas. Assim, o balanço entre
os efeitos tóxicos versus ação farmacológica de um determinado produto natural é um
parâmetro fundamental para verificar sua aplicação da terapêutica (WARGOVICH, 2001;
VEIGA-JÚNIOR et al., 2005).
A segurança no uso das plantas medicinais deve ser garantida através de extensas
pesquisas científicas, farmacovigilância, controle regulatório e melhor comunicação entre
pacientes e profissionais da saúde (ZHOU et al., 2004). Diante do exposto, evidencia-se a
importância e a necessidade de estudos farmacológicos e toxicológicos de produtos obtidos de
plantas medicinais, na perspectiva de encontrar alternativas terapêuticas seguras para o
tratamento de diversas doenças, dentre elas, o câncer.
1.2 GLICOSÍDEOS CARDÍACOS, Na, K-ATPASE E CÂNCER
Os glicosídeos cardíacos (GCs), também chamados de esteroides cardiotônicos,
compreendem uma grande família de compostos de origem natural derivados de planta ou
animal. Contêm uma estrutura molecular comum constituído por um núcleo esteroide, um
anel lactona insaturado na posição C-17 e um ou mais resíduos de glicose na posição C-3.
12
Quimicamente, podem ser divididos em dois subgrupos: cardenolídeos e bufodienolídeos
(Figura 1). Cardenolídeos possuem um anel lactona de cinco membros e bufodienolídeos são
caracterizados por um anel lactona insaturado de 6 membros. Os cardenolídeos mais comuns
e importantes incluem digoxina, digitoxina, digitoxigenina e ouabaína (BRENDAN et al.,
2015, SLINGERLAND et al., 2013).
Figura 1: Estrutura molecular de glicosídeos cardíacos. Adaptado de ZEINO et al., 2015.
Os GCs são compostos conhecidos há mais de 3.000 anos pelos egípcios e têm sido
utilizados no tratamento de doença cardíaca desde o século XIII (BESSEN, 1986; KANJI,
2012). A primeira planta introduzida na medicina ocidental foi a Digitalis purpurea, usada
por William Withering em 1785 para tratar hidropisia, edema causado por insuficiência
cardíaca congestiva (BABULA et al., 2013).
De um ponto de vista terapêutico, os GCs são utilizados em todo o mundo no
tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca, por serem os mais potentes agentes
inotrópicos (que aumentam a força de contração cardíaca) conhecidos. Seus efeitos são
mediados pela capacidade destes compostos em inibir a bomba sódio-potássio (Na, K-
ATPase) ao ligarem-se especificamente à subunidade α, na superfície extracelular da
membrana, bloqueando a função da enzima (CERELLA et al., 2013).
A Na, K-ATPase é um complexo enzimático presente na membrana celular de animais
com atividade de transporte de íons de sódio (Na+) e potássio (K+) através da membrana
plasmática com consumo de ATP. Para cada três íons de Na+ bombeados para fora da célula,
dois íons de K+ são bombeados para o interior (SKOU, 2004). Segundo Habiba e
colaboradores (2000), já foram identificadas diferentes isoformas da Na, K-ATPase tanto α
quanto β as quais são funcionalmente distintas e apresentam um padrão de expressão tecido
específico.
13
O mecanismo proposto para esse efeito inotrópico é iniciado com a inibição da Na, K-
ATPase, o que leva ao bloqueio do efluxo de Na+, causando um aumento na concentração
intracelular deste íon. Isto altera a atividade do trocador Na+/Ca+2, levando a uma elevação
transitória de cálcio citoplasmático e, portanto, maior contratilidade do músculo cardíaco.
Essa elevação da concentração intracelular de Ca+2 pode também ser a responsável pela
sintomatologia observada na intoxicação por estas drogas (WASSERSTROM; AISTRUP,
2005; CIRRI et al., 2011).
A Na, K-ATPase é uma isoenzima, resultante da combinação de múltiplas isoformas
das subunidades α (α 1, α 2, α 3 e α 4) que possuem função catalítica, β (β 1, β 2 e β 3) que
têm função estrutural e de maturação funcional da enzima e membros da família FXYD que
têm a capacidade de afetar as propriedades de transporte iônico da bomba (GABLE et al.,
2014).
Ao longo do desenvolvimento do organismo as quatro isoformas α são expressas
diferentemente nos tecidos. A isoforma α 1 é encontrada na maioria dos tecidos, já a α 2
ocorre, predominantemente, no músculo esquelético e, em menor quantidade, no cérebro e
coração. A isoforma α 3 está limitada essencialmente ao tecido nervoso e ao coração e a α 4 é
encontrada somente nos testículos e espermatozóides. Estas isoformas têm diferentes
propriedades funcionais com respeito à afinidade por ligantes como Na+ e GCs, embora a
função essencial de transporte de íons seja a mesma (DAI et al., 2013; BRENDAN et al.,
2015).
Os GCs correspondem a uma classe de compostos farmacologicamente ativos que
foram mais recentemente redescobertos para uso clínico em outras patologias. Originalmente
prescritos para tratar alterações cardíacas, também mostram atividades anticâncer. Estudos
epidemiológicos sugerem uma correlação direta entre a administração regular de GCs e uma
menor incidência de câncer (CERELLA et al., 2013).
Além disso, um risco reduzido de reincidência do tumor foi documentado para
pacientes em tratamento do câncer que já faziam uso de GCs (ZEINO et al., 2015), ou seja,
esses achados foram observados em concentrações não tóxicas (PONGRAKHANANON,
2013). Têm sido propostos muitos mecanismos anticâncer, seletivos para células cancerosas,
relacionados aos GCs e este processo tem sido extensivamente revisado (RIGANTI et al.,
2011; VAKLAVAS et al., 2011).
A capacidade dos GCs em induzir a morte celular foi relatada como seu principal
mecanismo anticâncer (PRASSAS; DIAMANDIS, 2008). Alterações na atividade e/ou
expressão da Na, K-ATPase, que cause mudanças na função enzimática, poderiam disparar a
14
apoptose (KO et al., 2015). A ouabaína (TAILLER et al., 2011), a digoxina (WINNICKA et
al., 2010), a digitoxina (HAUX, 1999), entre outros, induzem apoptose em diferentes modelos
de células cancerosas testadas.
Este processo se dá a partir da ativação, desencadeada pelos GCs, da via intrínseca da
apoptose (ou mitocondrial) (Figura 2). O desbalanço iônico causado pela inibição da Na, K-
ATPase pode induzir modificações no citoesqueleto, levando a uma parada do ciclo celular.
Essas alterações podem desencadear a via de degradação de Bcl-xL (linfoma de grandes
células B) e Mcl-1 (células de leucemia mielóide 1) (WERTZ et al., 2011) que atuam como
sequestradores de Bak/Bax (proteína X associada a Bcl-2). A baixa regulação de Mcl-1/Bcl-
xL atua como transdutor de sinal de extresse para ativação da morte celular. A liberação de
Bak/Bax leva a formação de poros na membrana mitocondrial, induzindo perda do potencial
de membrana e liberação de citocromo c. O citocromo c forma um complexo com APAF- 1
(fator de ativação de apoptose 1) e caspase-9, o chamado apoptossomo, que promove a
clivagem da pró-caspase-9, liberando a caspase-9, ativa. Uma vez ativada, a caspase-9 ativa a
caspase-3 que vai ocasionar a apoptose (HUANG et al., 2012; LHEUREUX et al., 2011).
A apoptose não é o único mecanismo de morte celular desencadeada por GCs. Estudos
descrevem que esses compostos também são capazes de induzir a morte celular por autofagia.
O Mcl-1 atua também como sequestrador de beclin-1 (GERMAIN et al., 2011), logo sua
baixa regulação leva a liberação de beclin-1 que é responsável pela formação de vesículas de
degradação, promovendo autofagia (GERMAIN; SLACK, 2011). Oleandrina e bufalina
induziram a morte celular mediada por autofagia em células de câncer pancreático e de cólon
humano, respectivamente (NEWMAN et al., 2007; XIE et al., 2011). O potencial citocida de
GCs por apoptose ou autofagia tem atraído muito interesse dos pesquisadores visto que,
podem atingir de maneira eficiente os tumores que são resistentes a agentes convencionais
indutores de morte celular (CERELLA et al., 2013).
15
Figura 2: Mecanismos de morte celular induzidos por GCs. (1) Via intrínseca da apoptose.
Alterações na progressão do ciclo celular induzem degradação de Mcl-1 e Bcl-xL que atuam
como sequestradores de Bak/Bax. A liberação de Bak/Bax leva a formação de poros na
membrana mitocondrial e liberação de citocromo c. Citocromo c ativa caspases que induzem
apoptose. (2) Autofagia. A baixa regulação de Mcl-1 induz liberação de beclin-1 que é
responsável pela formação de vesículas autofágicas. Adaptado de CERELLA et al., 2013.
Além da sua função na homeostasia iônica, a Na, K-ATPase também apresenta um
papel na sinalização intracelular (GABLE et al., 2014) (Figura 3). A função dessa bomba na
sinalização celular parece ter sido evolutivamente adquirida através da incorporação de
muitos domínios proteicos que interagem com outras proteínas e ligantes (XIE e CAI, 2003).
Esta enzima pode interagir, nas cavéolas, com diferentes proteínas de sinalização, incluindo
Src (GABLE et al., 2014), PKA (TERIETE et al., 2009), PKC (EL-ZEIN et al., 2015) e PI3K
(DAI et al., 2013), EGFR (Receptor do fator de crescimento epidérmico) (TRENTI et al.,
2014) e caveolinas (MORRILL et al., 2012).
16
Figura 3: Sinalização intracelular mediada pela Na, K-ATPase. A interação dos GCs com a
Na, K-ATPase ativa diferentes vias de sinalização que induzem formação de EROS e
alterações na expressão de genes envolvidos com proliferação, migração e morte celular.
Adaptado de ZEINO et al., 2015.
O estudo da ação de ligantes nas subunidades da Na, K-ATPase tem mostrado que, um
microdomínio de sinalização, denominado sinalossoma, é formado a partir da interação da
bomba com a quinase Src, EGFR e outras proteínas. Sendo que, esse processo de sinalização
é disparado em concentrações de GCs menores do que aquelas capazes de inibir a atividade da
bomba (NGUYEN et al., 2011; ZEINO et al., 2015).
Esses achados suportam a proposta de que a ativação do complexo Na, K-ATPase-Src
é o ponto inicial para a sinalização, a partir da interação de um GC com a enzima, para o
EGFR e outras vias de sinalização intracelular (Figuras 3 e 4). Sendo assim, a ligação do GC à
Na, K-ATPase regula a interação entre esta enzima e a caveolina, além de estimular a Src
citoplasmática. A Src ativada, transativa EGFR, o qual recruta proteínas adaptadoras, dando
seguimento à ativação da cascata Ras-Raf-Erk1/2 que induzem a alteração na expressão de
genes envolvidos com proliferação, migração e morte celular (WANG et al., 2004; LI; XIE,
2008). Além disso, a ativação de Src estimula outras vias, incluindo o aumento na produção
mitocondrial de espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo este considerado também um
importante passo na indução da apoptose (XIE; CAI, 2003).
17
Figura 4: Mecanismos de ação de glicosídeos cardíacos. (1) Alteração dos níveis iônicos
citosólico (2) Ativação de cascatas de sinalização via quinases (3) Interação com receptores
de membrana plasmática (4) Alteração da fluidez da membrana plasmática (5) Internalização
e interação direta com componentes e receptores intracelulares. Adaptado de CERELLA et
al., 2013.
Estes eventos resultam além das mudanças na expressão de múltiplos genes que
inibem o crescimento de células cancerosas, também estão envolvidos em processos de
regulação da concentração de Ca2+ intracelular (AIZMAN et al., 2001; LIU et al., 2010).
Alterações nas concentrações de Ca2+ no interior das células é uma etapa relevante para os
efeitos citotóxicos dos GCs. O Ca2+ é um íon que está envolvido em processos que
desencadeiam a morte celular (CERELLA et al., 2010). Oscilações de Ca+2 intracelular
ativam também Nf-kβ (fator nuclear kappa β). Este fator de transcrição pluripotente ativa
genes que modulam a proliferação celular, apoptose e desenvolve respostas do sistema imune
(MIYAKAWA-NAITO et al., 2003).
Além disso, devido ao seu núcleo esteroide, os GCs podem integrar com a membrana
celular e alterar sua fluidez, tendo como resultado alteração de conformação e função de
receptores e proteínas associados a ela (RIGANTI et al., 2011). E ainda, podem atravessar a
membrana plasmática e interagir diretamente com componentes e receptores intracelulares
(CERELLA et al., 2013).
Nas etapas iniciais da carcinogênese, ou seja, antes de evidências morfológicas do
tumor, os pacientes oncológicos já apresentam alterações na atividade da Na, K-ATPase
18
(SHEN et al., 1978). Alguns estudos científicos demonstram, inclusive, uma diminuição ou
superexpressão de isoformas da bomba, principalmente α1 e α3, de acordo com o tipo de
câncer. A expressão, por exemplo, de α1 seria estimulada em tumores malignos de pele,
pulmão e pulmão, e suprimida em câncer de intestino e bexiga; já α3 seria estimulada em
câncer de cólon e reto (SAKAI et al., 2004; MIJATOVIC et al., 2008).
Neste contexto, a Na, K-ATPase é um potencial alvo para a quimioterapia do câncer
(APERIA, 2007). O envolvimento da Na, K-ATPase em diferentes funções fisiológicas
suporta uma correlação entre alteração na atividade enzimática, por ação de fatores endógenos
ou exógenos, possa ter importante papel em muitos processos biológicos e patológicos, não só
modulação da contratilidade cardíaca ou na liberação de neurotransmissores (MACGREGOR;
WALKER, 1993; BUCKALEW, 2005) como também no tratamento do câncer (KO et al.,
2015).
1.3 DIGOXINA
A utilização de produtos naturais com ação medicamentosa, na sua forma pura, foi
descoberta pelos farmacêuticos, desde Galeno (129-199 D.C.). Exemplo relevante e histórico
do emprego de produtos naturais na medicina encontra-se entre os fármacos cardiotônicos. A
planta Digitalis, foi descrita em 1785 por Whitering e seu emprego como cardiotônico data de
1250. A digitoxina e a digoxina são os princípios ativos mais importantes encontrados nesta
planta, tais substâncias atualmente são classificadas como glicosídeos responsáveis pela
atividade cardiotônica. Embora tenham decorrido centenas de anos da identificação desses
compostos na Digitalis, ainda hoje, essa planta é a fonte desses glicosídeos cardioativos
(BARREIRO, 1990; TODD et al; 2015).
A digoxina (C41H64O14) é um GC da classe dos digitálicos, derivado da espécie vegetal
Digitalis lanata, que possui massa molecular de 780,92 Da (Figura 5). É o GC mais utilizado
no tratamento de falência cardíaca congestiva e fibrilação atrial. Os digitálicos são os
compostos mais antigos na medicina cardiovascular que continuam em uso em práticas
clínicas contemporâneas (LU et al., 2014; EICHHORN, GHEORGHIADE, 2002).
19
Figura 5: Estrutura molecular da digoxina (C41H64O14).
FONTE: http://www.drugbank.ca/drugs/APRD00098.
Sua aplicação em falência cardíaca foi aprovada em 1998 pela Food and Drug
Administration, mas seu uso tem diminuído com o aparecimento de novas terapias, como β-
bloqueadores, bloqueadores de receptor da angiotensina (ARBs, angiotensin receptor
blockers), bloqueadores de aldosterona e terapia de resincronização cardíaca (CRT, cardiac
resynchronization therapy). Contudo, ainda é usada em cerca de 30% dos pacientes com
falência cardíaca. É uma droga de baixo custo, sendo importante em países em
desenvolvimento onde os pacientes não têm acesso a terapias sofisticadas (GHEORGHIADE
et al., 2006; SOUZA et al., 2015).
A toxicidade dos digitálicos está entre os efeitos colaterais mais prevalentes
encontradas pelos médicos pois, possuem uma janela terapêutica muito estreita (ANDRÉS,
2000; LU et al., 2014). O metabolismo hepático da digoxina não é efetivo, visto que essa
droga é excretada em sua forma praticamente inalterada pelos rins (HAUX et al., 1999;
BAGROV et al., 2009). A incidência de intoxicação por esse fármaco aumenta em situações
onde a sua excreção pelos rins é impedida (SMITH et al., 1969; SANTORO et al., 2013).
Doses tóxicas de digoxina podem acarretar arritmias graves e fatais (CHAPMAN et al.,
2014). A concentração desse fármaco no soro não depende apenas da dose administrada, mas
também está relacionada com interações com outras medicações e às condições de saúde do
paciente (ANTMAN, SMITH, 1985; SOUZA et al., 2015).
Além disso, tem sido descrita na literatura uma potencial atividade anticâncer para a
digoxina com diferentes mecanismos de ação (VOGEL et al., 2015; GLUCK et al., 2015).
Sendo que, atualmente, a digoxina está sendo avaliada em estudos clínicos como um possível
fármaco destinado para o tratamento de tumores sólidos (UNWITH et al., 2015;
CLINICALTRIALS, 2015a; CLINICALTRIALS, 2015b; CLINICALTRIALS, 2015c).
20
1.4 MUTAÇÃO E CÂNCER
Embora as plantas medicinais sejam amplamente utilizadas no tratamento de doenças,
a pesquisa científica tem demonstrado que algumas substâncias presentes nessas plantas
podem apresentar propriedades indesejáveis, que podem restringir seu uso como agentes
terapêuticos, como mutagenicidade, carcinogenicidade e outros efeitos tóxicos relevantes
(CÂNDIDO-BACANI et al., 2013; MULAUDZI et al., 2013).
A identificação de compostos potencialmente danosos à estrutura e função do material
genético é uma preocupação nos dias atuais, pois os seres humanos estão expostos à inúmeras
substâncias, sintéticas ou naturais, com ação mutagênica (VARANDA, 2006). A genética
toxicológica é uma área da ciência que estuda os mecanismos de ação de compostos tóxicos
que são capazes de induzir alterações nos ácidos nucleicos, podendo resultar em danos
genéticos (MATSUMOTO; MARIN-MORALES, 2004).
O material genético dos organismos vivos está constantemente sujeito a diversos tipos
de danos que podem ser ocasionados por agentes exógenos ou endógenos, podendo levar a
mutações. As mutações são alterações permanentes na sequência do DNA que podem resultar
em mudanças hereditárias nas características dos sistemas vivos (SŁOCZYŃSKA et al.,
2014).
As mutações podem alterar um único gene, um conjunto de genes ou cromossomos
inteiros. As mutações mais comumente encontradas no genoma são as que afetam um ou
poucos nucleotídeos dentro de um gene e são denominadas mutações gênicas (pontuais). Tais
mutações podem ser divididas em três tipos principais: substituição de pares de bases (a partir
de transições ou transversões), deleção (perda de um ou mais pares de bases) e inserção
(adição de pares de bases adicionais na sequência do DNA). Quando as alterações no DNA
afetam a estrutura cromossômica (por deleções, duplicações, inversões e translocações) ou o
número de cromossomos (em decorrência de falhas na citocinese, por exemplo, por não
disjunção mitótica/meiótica) são denominadas mutações cromossômicas (SŁOCZYŃSKA et
al., 2014).
As mutações são geradas, principalmente, por fatores ambientais, incluindo agentes
físicos e químicos, denominados mutágenos. O termo mutágeno ou "agente mutagênico"
refere-se àquele agente que é capaz de induzir alterações herdáveis no material genético de
um organismo. Todavia, algumas mutações podem ocorrer sem a influência de agentes
externos, devido a erros na replicação do DNA, reparo e na divisão celular, por exemplo. Tais
alterações são denominadas mutações espontâneas e a frequência na qual elas ocorrem é
21
característica para cada organismo em particular (LEE; STEINERT, 2003; SŁOCZYŃSKA et
al., 2014). Estima-se que a média da frequência de mutações espontâneas por pares de bases
em células humanas seja de 10-8 a 10-10, sendo que essa frequência pode aumentar de 1 a 10
vezes quando há exposição a um agente mutagênico (AJITH; SOJA, 2006).
As consequências das interações mutágeno-alvo podem levar a diferentes tipos de
danos ao DNA (aductos de DNA, sítios alcali-lábeis, quebras de fitas) (MATEUCA et al.,
2006). Os agentes que interagem com o material genético e/ou com os componentes celulares
como fibras do fuso e enzimas são conhecidos como genotóxicos e podem ser classificados
como: agentes diretos (atuam diretamente sobre o DNA) e agentes indiretos (interagem com
alvos diferentes do DNA ou necessitam ser metabolizados para tornarem-se tóxicos)
(BENSON; LIAU, 2008; SŁOCZYŃSKA et al., 2014).
Os mecanismos indiretos de genotoxicidade também levam a efeitos genotóxicos, que
abrangem, essencialmente, a peroxidação lipídica e os aductos de proteínas. Várias pesquisas
também focam a inibição de enzimas de reparo (por exemplo, OGG1, XPD), proteínas de
controle do ciclo celular (por exemplo, p53, pRb, ciclinas), produtos gênicos relacionados à
apoptose (por exemplo, Bax, Bcl-2), proteínas de defesa contra danos oxidativos (glutationa),
enzimas de metabolização, tubulinas do fuso mitótico/meiótico (KIRSCH-VOLDERS et al.,
2003) entre outros.
Um agente genotóxico é aquele capaz de causar danos ao mateiral genético, sem que,
necessariamente, esse dano seja fixado na próxima geração celular, na forma de mutação. Este
dano ocasionado por esse agente, pode ser reparado pelo sistema de reparo de DNA e seu
efeito nocivo ser eliminado. Diferindo, dessa forma, do agente mutagênico que é capaz de
causar danos no DNA e esses danos não são reparados, sendo fixados nas células filhas na
forma de mutação herdável. Portanto, o efeito genotóxico nem sempre está relacionado a
mutações (MAURICI et al., 2005; TAYLOR; LADANYI, 2011).
As mutações podem ocorrer tanto em células somáticas como em células germinativas.
Mutações que ocorrem nas células germinativas podem ser transmitidas às gerações futuras e,
geralmente, não causam prejuízo ao portador, estando, contudo, relacionadas à baixa
fertilidade, má formação fetal e abortos. Mutações somáticas causam maior prejuízo ao
indivíduo afetado e apresentam um papel relevante na patogênese de doenças crônicas
degenerativas como, por exemplo, arteriosclerose e câncer (DE FLORA, 1998; WEAKLEY et
al., 2010; BORGES-OSÓRIO; ROBINSON, 2013).
O câncer é a principal causa de morte nos países desenvolvidos e a segunda causa nos
países em desenvolvimento, caracterizando-se como um importante problema de saúde
22
pública mundial. A estimativa da Organização Mundial da Saúde (OMS) é que em 2030 deve
haver 21 milhões de casos incidentes de câncer, 13 milhões de óbitos por câncer e 75 milhões
de pessoas vivas acometidas por ele no mundo. No Brasil, a estimativa é de que ocorram
aproximadamente 576 mil novos casos de câncer por ano. Os tipos mais incidentes serão os
cânceres de pele não melanoma, próstata, pulmão, cólon e reto e estômago para o sexo
masculino; e os cânceres de pele não melanoma, mama, colo do útero, cólon e reto e glândula
tireóide para o sexo feminino (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Embora não seja medida de carcinogenicidade, a análise de mutagenicidade é
frequentemente associada ao desenvolvimento do câncer (AZEVEDO et al., 2003) pois, o
processo de carcinogênese é resultante do acúmulo de lesões genéticas (DIAZ, 2005). A
conversão de células normais em células neoplásicas normalmente envolve vários passos,
sendo que uma das fases iniciais desse processo envolve a ação de um carcinógeno
genotóxico (INCA, 2015a).
Mutações que inativam genes supressores de tumor (por exemplo, TP53 e Rb) ou que
ativam proto-oncogenes e telomerases, podem estimular a proliferação e inibição da morte
celular. Além disso, outro fator agravante é a desregulação dos genes associados aos
processos de reparo de danos no DNA que podem elevar a taxa de mutação das células,
acelerando ainda mais o acúmulo de alterações moleculares importantes. Desta maneira, estas
alterações genéticas fornecem um grande estímulo na iniciação de um câncer (HAHN;
WEINBERG, 2002; OJOP; NETO, 2004).
A primeira etapa deste processo de carcinogênese é denominada estágio de iniciação,
em que as células se encontram geneticamente alteradas, porém não é possível detectar um
tumor clinicamente. No segundo estágio, chamado de estágio de promoção, as células
geneticamente alteradas são transformadas em células malignas e, geralmente, ocorre de
forma lenta e gradual. O último estágio, chamado de estágio de progressão se caracteriza pela
multiplicação descontrolada e irreversível das células alteradas. Nesse estágio surgem as
primeiras manifestações clínicas da doença (INCA, 2015a).
Atualmente, o tratamento para o câncer pode ser realizado a partir de diferentes
abordagens terapêuticas como através de hormonioterapia, imunoterapia, radioterapia,
quimioterapia, procedimento cirúrgico e transplante de medula óssea, bem como da
combinação de alguns desses procedimentos (SBOC, 2011). O papel de cada um desses
tratamentos depende do tipo de tumor e de seu estágio de desenvolvimento. Além dos tipos de
tratamentos citados, outras modalidades de tratamento, como a terapia fotodinâmica e a
hipertermia, têm sido utilizadas em combinação para o tratamento contra o câncer
23
(DOLMANS et al., 2003). De um modo geral, os objetivos do tratamento do câncer são curar
ou prolongar a vida do paciente, buscando propiciar uma melhor qualidade de vida (INCA,
2015a).
A quimioterapia refere-se à utilização de um ou mais agentes citotóxicos (por
exemplo, agentes alquilantes ou intercalantes de DNA), que eliminam as células neoplásicas,
diminuindo, assim, o crescimento da massa tumoral e a proliferação desordenada das células
(CHU; SARTORELLI, 2006; WHO, 2014). A indução de danos ao DNA, por agentes
quimioterápicos, tem sido explorada tradicionalmente no tratamento do câncer (KHAN et al.,
2014). Contudo, a quimioterapia induz danos ao material genético de forma indiscriminada
que afetam e matam tanto células normais como células cancerosas. Uma vez que estes
medicamentos não são seletivos para células cancerosas, pacientes com câncer sofrem de
efeitos colaterais adversos, como os efeitos genotóxicos em células não-tumorais, o que pode
resultar na formação de outros tumores malignos (KAWABE, 2004; INCA, 2015b).
A fim de melhorar a eficácia do tratamento e reduzir os efeitos colaterais, houve
avanços significativos no conhecimento da biologia do câncer e em pesquisas que buscam
moléculas que atuem com mecanismos específicos para cada um dos tipos desta enfermidade.
Por exemplo, inibidores da polimerização da tubulina, agentes que atuem no DNA,
bloqueadores enzimáticos (topoisomerases), microtúbulos celulares, indutores de apoptose,
inibidores da angiogênese, inibidores de sinais de transdução, anticorpos monoclonais e
terapia gênica (ALTMANN; GERTSCH, 2007; BRANDÃO et al., 2010; MAIONE et al.,
2004).
Novas estratégias vêm sendo estudadas na perspectiva de solucionar problemas da
quimioterapia antineoplásica, como a baixa concentração de antineoplásicos em tumores,
toxicidade sistêmica (EXTERMANN et al., 2002), ausência de seletividade para células
tumorais e células resistentes aos quimioterápicos (FRACASSO et al., 2000).
Apesar do grande progresso na terapia do câncer, como demonstrado pela ampla
diversidade farmacológica, muitos tumores ainda são de difícil remissão devido à resistência
às drogas (RIVA et al., 2012). Geralmente, a resistência ocorre ou porque as células
desenvolvem nova codificação genética (mutação) ou porque são estimuladas a desenvolver
tipos celulares resistentes ao serem expostas às drogas, o que lhes permitem enveredar por
vias metabólicas alternativas, com a síntese de novas enzimas (INCA, 2015c; LI et al., 2014).
Por se tratar de uma doença com elevado índice de mortalidade, que atinge anualmente
milhões de pessoas no mundo, a descoberta de fármacos antineoplásicos de fácil
administração, alta eficácia e com poucos ou insignificantes efeitos colaterais é uma das
24
principais metas a serem alcançadas pelos pesquisadores da área (COSTA-LOTUFO et al.,
2010).
1.5 ANTIMUTAGENCIDADE
Atualmente o homem está em contato contínuo com uma grande quantidade de
compostos que possuem capacidade de danificar o material genético. Algumas dessas
substâncias são provenientes de poluição do ar, alimentos industrializados, resíduos
industriais, entre outros. Assim, agentes que atuem de forma oposta, protegendo o DNA de
mutágenos, vêm ganhando bastante importância para tentar minimizar esses efeitos
(ESPANHA, 2014).
Diariamente, os indivíduos estão expostos a agentes mutagênicos e é natural que cada
organismo apresente mecanismos de defesa. Esses mecanismos incluem, por exemplo, a
inativação enzimática dos mutágenos pelas superóxido dismutases, catalases, glutationas
peroxidases e glutationas S-transferases. Complementarmente, processos não-enzimáticos,
por ação de micronutrientes, como as vitaminas C, E e β-caroteno (βCT) que, em conjunto,
atuam na estabilização de espécies altamente reativas que danificam o DNA, mantendo a
integridade funcional e estrutural das células (KITANI et al., 1999; VALKO et al., 2006).
Contudo, os mecanismos naturais de defesa, muitas vezes, acabam sendo intensamente
desafiados, o que enfatiza a importância das investigações por xenobióticos que possam evitar
ou reduzir os danos induzidos ao material genético (FERGUSON et al., 2004). Diante disso, a
prevenção do câncer e de doenças relacionadas às mutações pode ser alcançada ao evitar a
exposição a mutágenos conhecidos, ao reforçar os mecanismos de defesa ou aumentando a
exposição a fatores de proteção (antimutágenos) capazes de diminuir os danos causados pelos
agentes mutagênicos (BHATTACHARYA, 2011; DE FLORA, 1998).
Com a descoberta da estrutura do material genético, há mais de 60 anos, os
mecanismos para preservar a integridade do genoma vêm sendo amplamente investigados
(JACKSON; BARTEK, 2009). Estudos epidemiológicos têm demonstrado que produtos
naturais presentes na dieta podem modular o processo de tumorigênese a partir da indução do
sistema de defesa das células como, por exemplo, enzimas antioxidantes e do sistema de
detoxificação (PANA; HO, 2008). Muitas substâncias, além de suas propriedades
antimutagênica e anticarcinogênica, possuem outros efeitos benéficos, como a ativação do
sistema imune e/ou proteção contra outras doenças, como as cardiovasculares
(KNASMÜLLER et al., 2011).
25
A quimioprevenção do câncer pode ser definida como a prevenção da indução,
inibição ou a reversão da carcinogênese até o estágio pré-maligno pela administração de
fármacos adequados ou ingestão de metabólitos secundários, micro ou macronutrientes que
atuem como agentes antimutagênicos. Logo, esta abordagem terapêutica envolve a
administração sistêmica de um agente sintético, natural ou biológico para reduzir ou retardar a
ocorrência de malignidade (FERGUSON et al., 2005; NAMASIVAYAM, 2011).
Diversos estudos têm sido direcionados para essa área de pesquisa a partir do melhor
compreendimento do processo de carcinogênese e a identificação de potenciais alvos para
perturbá-lo (STEWARD, BROWN, 2013). Muitos pesquisadores têm buscado compostos
que, associados a tratamentos tradicionais, minimizem, inibam ou prevenam a incidência de
câncer (HANAUSEK et al., 2003). Os agentes quimiopreventivos podem ser subdivididos em
duas categorias de acordo com sua atuação: os agentes bloqueadores e os agentes supressores
(WATTENBERG, 1985).
Os agentes bloqueadores minimizam a formação e a ativação metabólica de
mutágenos que interagem com macromoléculas cruciais (DNA, RNA, proteínas, lipídios),
combatem EROs e potencializam o sistema de reparo do DNA. Dessa maneira, tornam-se
mais eficazes quando utilizados de maneira preventiva à exposição dos carcinógenos
(ARORA et al., 2010).
Por outro lado, os agentes supressores inativam etapas posteriores à ação do
cancerígeno, inibindo a manifestação da neoplasia. Estes agentes podem suprimir oncogenes,
estimular a ação de genes supressores de tumor, inibir o processo de angiogênese, induzir
apoptose e reduzir a proliferação de células iniciadas, prevenindo o acúmulo de danos
(ARORA et al., 2010).
Nos últimos anos, estudos sobre os mecanismos de ação de agentes quimiopreventivos
e também de agentes quimioprotetores do câncer têm sido intensificados, principalmente para
a identificação de substâncias com baixa ou nenhuma toxicidade e de fácil acesso para a
população. O processo de quimioproteção é subdividido, principalmente, em duas grandes
áreas: a antimutagênese e a antiprogressão/antiproliferação. A antimutagênese inclui a
inibição da absorção e da ativação de substâncias carcinogênicas, a obstrução da ligação
carcinógeno-DNA, a modificação na estrutura de carcinógenos e o aprimoramento do reparo
do DNA (NAMASIVAYAM, 2011).
A antiproliferação ou mecanismo anti-proliferativo envolve a inibição da promoção e
da progressão tumoral, bem como bloqueio de metástases. Estes mecanismos estão
relacionados, principalmente, a inibição da angiogênese e da ação de hormonios (DE FLORA,
26
1998; HEO et al., 2001) que levam ao controle da ação de fatores de crescimentos, promoção
da diferenciação celular, alterações na transdução de sinal, inibição de oncogenes, promoção
da apoptose, entre outros (NAMASIVAYAM, 2011).
Diferentes produtos de origem natural apresentam atividades quimioprotetoras
cientificamente comprovadas. Dentre eles destacam-se a curcumina, o resveratrol, o licopeno,
o ácido elágico e o eugenol. Acredita-se que esses levam à supressão do processo inflamatório
que poderia desencadear a iniciação da carcinogênse por meio da transformação e
hiperproliferação celular (AGGARWAL; SHISHODIA, 2006; SURH, 2003).
Originalmente, o termo agente antimutagênico foi utilizado a partir de estudos em
bactérias para descrever os compostos que reduzem a taxa de mutações espontâneas ou
induzidas, independentemente dos mecanismos de proteção envolvidos (NOVICK;
SZILARD, 1952; CLARKE; SHANKEL, 1975). Este grupo de agentes inclui tanto
compostos naturais quanto sintéticos.
Segundo Bhattacharya (2011) os agentes antimutagênicos podem ser classificados em
duas categorias gerais: aqueles que inibem a formação de lesões e são denominados
desmutagênicos, e aqueles que colaboram no reparo das lesões que já estão presentes no
DNA, classificados como bioantimutagênicos.
Os agentes desmutagênicos são compostos que atuam extracelularmente capazes de
inativar química, física ou enzimaticamente um agente mutagênico, bloqueando ou
modificando mutágenos antes que eles atuem junto ao DNA. As inativações químicas e físicas
acontencem a partir da ligação direta com o mutágeno, impossibilitando sua interação com o
material genético. A inativação enzimática de um agente mutagênico pode ocorrer por dois
mecanismos: a inativação por enzimas de fase I da biotransformação, como as enzimas da
família P450, ou a indução de enzimas de fase II, como a glutationa S-transferase (KADA et
al., 1982; KURODA et al., 1992; BHATTACHARYA, 2011; SŁOCZYŃSKA et al., 2014).
Já os agentes bioantimutagênicos podem modular os sistemas de reparo e de
replicação do material genético ao estimular o reparo livre de erros ou inibir o reparo sujeito a
erro. Assim, esses agentes bioantimutagênicos, participam da supressão da mutação após a
ocorrência dos danos ao DNA, atuando em nível celular ao aumentar a fidelidade na
replicação do material genético (KADA et al., 1982; KURODA et al., 1992;
BHATTACHARYA, 2011; SŁOCZYŃSKA et al., 2014).
As atividades antigenotóxicas e antioxidantes são fundamentais para a prevenção de
diversas doenças degenerativas (WOZNIAK et al., 2007). Por exemplo, a formação de
radicais livres é amplamente investigada como fator de iniciação do câncer e substâncias que
27
tenham a capacidade de impedir a formação destas EROs são de interesse médico e industrial.
As fontes pesquisadas são as mais variadas possíveis: frutos, folhas, caules e raízes de
vegetais, além de fungos, como cogumelos, que são utilizados na dieta e na medicina popular
(LAKASHMI et al., 2003).
A busca por compostos antimutagênicos representa um campo promissor nas
pesquisas sobre o câncer (EL-SAYED, HUSSIN 2013; SARAC et al., 2015). Nesse sentido, é
interessante que certos compostos apresentem natureza dual e possuam efeitos
antimutagênicos e mutagênicos (ZEIGER, 2003). O βCT pertence a este grupo de compostos,
sua natureza dupla pode ser atribuída principalmente ao fato de βCT possuir a capacidade
tanto de sequestrar quanto de produzir radicais livres (PAOLINI et al., 2003).
Como muitos agentes mutagênicos atuam através da geração de EROs, a remoção das
moléculas reativas representa uma estratégia importante no processo de antimutagênese
(SHAY et al., 2009; TIAN et al., 2012). Existem evidências de que os compostos com
propriedades antioxidantes podem remover radicais livres antes de reagirem com o DNA
(LEE et al., 2011; TIAN et al., 2012). Unal e colaboradores (2013) investigaram os efeitos
antigenotóxicos de ácido lipóico (AL) contra aberrações cromossômicas induzidas por
mitomicina-C e formação de micronúcleos em linfócitos humanos. Esse grupo de pesquisa
demonstrou que a exposição ao AL apresentou atividade anticlastogênica e antimutagênica.
Estes efeitos benéficos podem ser atribuídos principalmente à potência antioxidante de AL.
Além disso, foi sugerido que o AL melhora o sistema de reparo e síntese do DNA
(ROCHETTE et al., 2013).
Outro mecanismo de proteção importante contra a mutagênese está relacionado com a
interação química direta entre um composto antimutagênico e o mutágeno antes da ocorrência
de danos ao DNA. Por exemplo, o mutágeno 3-cloro-4 - (diclorometil)-5-hidroxi-2 (5H) –
furanona foi inativado usando vários compostos, tais como cisteína (WATANABE et al.,
1994). Agentes de bloqueio são também capazes de prevenir que os agentes mutagênicos
alcancem os locais que são alvos de danos. Por exemplo, nucleófilos podem ser capazes de se
ligarem ao DNA e, por conseguinte, protegerem o material genético de agentes mutagênicos
eletrofílicos (MARNEWICK et al., 2000).
Diante do exposto, plantas que possuem propriedades mutagênicas devem ser
consideradas potencialmente prejudiciais à saúde por induzir lesões ao DNA. Por outro lado,
plantas com atividades antimutagênicas podem ser consideradas interessantes para o uso na
terapêutica e suas atividades farmacológicas devem ser mais bem investigadas
(VERSCHAEVE; VAN STADEN, 2008; CHEN et al., 2011).
28
Por apresentarem uma eficiência muito significativa na detecção de agentes
mutagênicos e antimutagênicos, sistemas teste in vitro vêm sendo muito utilizados em estudos
de antimutagênese. Os sistemas amplamente empregados e que merecem destaque são os que
fazem o uso de culturas de células de mamíferos e que usam linhagens bacterianas para
identificação desses agentes (LEMIEUX et al., 2015; VIJAYAN et al., 2014). Em qualquer
um desses sistemas testes, o tratamento com o agente mutagênico, que induz as mutações, e o
antimutagênico, que poderá inibir o aparecimento de lesões no DNA, pode ocorrer
simultaneamente ou em momentos diferentes, por meio de pré ou pós-tratamento
(ANTUNES; ARAÚJO, 2000).
A avaliação da antimutagenicidade pode ser realizada nos diferentes passos de
interação do agente antimutagênico com o DNA ou com o mutágeno. Vários ensaios que
detectam componentes antigenotóxicos permitem identificar substâncias que protegem o
material genético. Logo, para se conhecer o potencial antigenotóxico de um determinado
composto, existem testes de antigenotoxicidade bem definidos e internacionalmente
reconhecidos pelas agências reguladoras (HAYASHI et al., 2000).
1.6 FERRAMENTAS PARA AVALIAÇÃO DE MUTAGENICIDADE E
ANTIMUTAGENICIDADE
Mesmo antes da descrição da estrutura do DNA, já era evidente que agentes químicos,
físicos e biológicos podiam interagir com o material genético resultando em mutações, as
quais estão intimamente associadas à instabilidade genômica e câncer (ARALDI et al., 2015).
Devido à grande variedade de alterações genéticas que podem ocorrer no genoma, vários
testes são projetados para avaliar os diferentes mecanismos de genotoxidade e mutagenicidade
(EASTMOND et al., 2009).
Os ensaios de genotoxicidade são frequentemente classificados pelos indicadores
biológicos que avaliam: lesão primária no DNA, genotoxicidade ou mutação cromossômica.
Esses testes têm como objetivo detectar agentes mutagênicos e carcinogênicos, além de
elucidar mecanismos de como ocorrem a formação de lesões no material genético e a origem
de mutações. Desta maneira, contribuem para revelar os riscos que determinado composto
poderia trazer à saúde humana (WASSON et al., 2008).
A indução de mutações também tem sido relacionada a muitas substâncias utilizadas
como fármacos, de modo que, atualmente, existe uma exigência, por parte de agências
reguladoras como, Food and Drug Administration (FDA), Agência Europeia de
29
Medicamentos (EMA) e Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, Brasil) de que
todo novo medicamento, antes de prosseguir para fase de pesquisa clínica para ser validado e
disponibilizado no mercado, seja avaliado quanto ao seu potencial genotóxico/mutagênico em
sistemas in vitro e in vivo (ARALDI et al., 2015).
Em geral, a avaliação da mutagenicidade pode ser dividida em três fases. A Fase 1
baseia-se em ensaios in vitro, que são realizados com as células bacterianas e de mamífero em
cultura; a Fase 2 envolve a avaliação da atividade mutagênica in vivo em células somáticas; e,
finalmente, a Fase 3 ensaios de rastreio de agentes mutagênicos em células germinativas
(EASTMOND et al., 2009; VALDIGLESIAS et al., 2010). Protocolos recomendados para os
testes de genotoxicidade/mutagenicidade adequados para cada tipo de avaliação de dano no
DNA são descritos nos guias de Organization for Economic Cooperation and Development
(OECD) e da International Workshops on Genotoxicity Testing (IWGT).
Uma bateria padronizada de ensaios de genotoxicidade é recomendada pelo FDA,
EMA e ANVISA para testar drogas em desenvolvimento, conforme descrita no guia S2 (R1)
– Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use
(ICH, 2012). O guia sugere duas opções de baterias de testes:
Opção 1 - Teste de mutação reversa em bactérias (por exemplo, Teste de Ames),
seguido de um ensaio in vitro de citogenética para avaliar os danos cromossômicos (aberração
cromossômica ou ensaio de micronúcleo). Ou testes de mutação genética, o ensaio TK
(timidina quinase) de linfoma de camundongo e um ensaio in vivo (aberração cromossômica
ou ensaio de micronúcleo);
Opção 2 – Teste in vitro de mutação reversa em bactérias e avaliação in vivo da
genotoxicidade em células hematopoiéticas (ensaio do micronúcleo) e outro, tal como o
ensaio cometa.
O guia apresenta situações onde a bateria de testes necessita de alterações (drogas que
são excessivamente tóxicas para bactérias e drogas que interferem com o sistema de
replicação de células de mamíferos). Nesses casos, recomenda-se utilizar duas diferentes
linhagens celulares de mamíferos, avaliando da mesma forma danos gênicos e
cromossômicos. Isso demostra que mutações, podendo ser de pequena ou grande escala, estão
correlacionadas com o processo de carcinogênese, apresentando riscos potenciais à saúde
humana. Dessa forma, estudos que visem identificar o potencial mutagênico de compostos
com promissora atividade terapêutica são de suma importância (ANVISA, 2013).
30
1.7 TESTE DO MICRONÚCLEO
O micronúcleo (MN) é um importante biomarcador, in vitro e in vivo, amplamente
utilizado na epidemiologia molecular e na análise de danos citogenéticos em populações
expostas a agentes genotóxicos (ARALDI et al., 2015). Os micronúcleos (MNs) são
indicativos de eventos de danos no genoma que podem aumentar o risco de desenvolvimento
de câncer e doenças degenerativas (FENECH et al., 2011).
De acordo com Kirsch-Volders e colaboradores (2011), o MN se constitui de uma
pequena massa de cromatina envolta por membrana nuclear separada do núcleo principal,
formada durante a telófase da mitose ou meiose. São massas cromossômicas que podem ser
originados de clastogênese (quebras cromatídicas) ou de aneugênese (cromossomos inteiros
que não foram incluídos no núcleo principal) (SAMANTA et al., 2012).
A clastôgenese pode ser originada também a partir de uma desregulação do aparelho
mitótico gerando pontes anáfasicas que estão relacionadas a quebras cromossômicas
formando os MNs (BIANCHI et al., 2015) (Figura 6). Portanto, os MNs estão associados a
perda de dose dos alelos de genes específicos, contribuindo para a carcinogênese
(TERRADAS et al., 2010).
31
Figura 6: Diferentes mecanismos de ação de mutágenos. Os agentes citotóxicos induzem uma
necrose precoce (1) que evolui para uma necrose (2). Os agentes genotóxicos causam danos
no DNA entre as fases G0 e S (3), que pode induzir apoptose (5), resultando na formação de
corpúsculos apoptóticos durante a apoptose tardia (6). Ou ainda o dano pode ser fixado na
forma de micronúcleos por clastogênese ou aneugênese (4) os quais podem ser eliminados por
apoptose (5 e 6) ou as células podem sobreviver e propagar o dano. Adaptado de ARALDI et
al., 2015.
Os MNs, também conhecidos como corpos de Howell-Jolly, foram originalmente
identificados e descritos em eritrócitos pelos hematologistas William Howell e Justin Jolly em
1891 e, mais tarde, foram associados com deficiências de vitaminas, como ácido fólico e
vitamina B12 (DAWSON; BURY, 1961).
O teste do MN foi introduzido em 1951 e relacionado com fragmentos acêntricos
expulsos do núcleo principal em estágios tardios da anáfase. Desde 1959, os MNs têm sido
propostos como marcadores de danos citogenéticos. No entanto, a análise de frequência de
MNs como um teste de citogenética só foi proposta em 1970 por Boller e Schimid e aplicado
em eritrócitos policromáticos de medula óssea e linfócitos (ARALDI et al., 2015).
Os MNs são observados nas células filhas, em decorrência de danos induzidos nas
células parentais (RIBEIRO, 2003). Recentemente, Crasta e colaboradores (2012)
demonstraram que os MNs formados persistem nas células por diversas gerações e que os
32
cromossomos nos MNs podem ser segregados para a próxima geração celular durante a
divisão. Demonstraram ainda que o DNA presente nos MNs pode ser incorporado ao genoma
e contribuir para o desenvolvimento de células cancerosas.
Rotineiramente, o teste do MN é usado como requisito para a avaliação da segurança
de compostos, sendo bastante utilizado na avaliação da mutagenicidade de novos produtos da
indústria farmacêutica e agropecuária. Tal teste apresenta alta sensibilidade e tem como
grande vantagem a capacidade de detectar tanto agentes clastogênicos como aneugênicos
(KIRKLAND et al., 2005; KIRSCH-VOLDERS et al., 2014).
Assim, utilizando anticorpos anti-centrômero é possível verificar se uma determinada
substância induz a formação de MNs via clastogênese ou aneugênese. Ausência de cinetócoro
nos MNs indica ação clastogênica, ao passo que a sua presença, representa ação aneugênica
(ARALDI et al., 2015).
O protocolo do MN foi normalizado por meio de um consórcio internacional entre as
empresas farmacêuticas Fritz Hoffmann-La Roche, Novartis, Rhône-Poulenc e Biologie
Servier. Este consórcio apontou o MN como indicador para a avaliação da genotoxicidade das
drogas (MILLER et al., 1997). Além disso, o MN foi eleito pela International Workshop on
Genotoxicity Test Procedures como teste padrão-ouro em mutagênese (KIRSCH-VOLDERS
et al., 2003).
Na sua versão in vivo, o teste do MN é realizado empregando células da medula óssea
e/ou sangue periférico de camundongos e, de acordo com Kirsch-Volders e colaboradores
(2014), essa metodologia é uma das mais bem estabelecidas como teste citogenético na área
da genética toxicológica.
O teste do MN in vitro é uma ferramenta muito utilizada na avaliação da
genotoxicidade de compostos (SUTIAKOVA et al., 2014), em função da simplicidade de
execução e ampla aplicabilidade em diferentes tipos celulares eucarióticos (JOSSÉ et al.,
2012). Além disso, o teste do MN está sendo utilizado em substituição do teste de aberração
cromossômica, uma vez que não requer a análise de cariótipo (MILLER et al., 1997).
Várias modificações experimentais são passíveis de serem realizadas durante a bateria
de testes, aumentando assim a aplicabilidade deste ensaio (SALVADORI et al., 2003). O teste
do MN in vitro, de acordo com a guia 487 da Organization for Economic Cooperation and
Development (OECD) pode ser realizado por dois protocolos diferentes: com ou sem o uso da
citocalasina B (citoB). O uso de citoB é uma modificação muito usada no teste no
micronúcleo in vitro e tem como finalidade aumentar a confiabilidade do teste.
33
A citoB é um metabólito isolado do fungo Drechslera dematioidea que inibe a
polimerização de actina que é fundamental para a formação do anel de microfilamentos,
impedindo a contração do citoplasma e a divisão celular em duas células-filhas (citocinese).
Dessa maneira, é possível observar um acúmulo de células binucleadas derivadas de células
que passaram por apenas um ciclo de divisão celular (FLETCHER et al., 1980; THIERENS,
VRAL, 2009).
A metodologia com citoB foi proposta por Fenech e colaboradores em 1985. Segundo
os autores, a adição de citoB antes da mitose permite a identificação e análise seletiva da
frequência de MNs, originados de aneugênese ou clastogênese, em células que já tenham
concluído uma mitose após o tratamento, uma vez que essas células se apresentam
binucleadas (com dois núcleos). Dessa forma, somente serão analisadas as células que já
passaram pelo processo de divisão celular, após o tratamento com os compostos testes
(OECD, 2010).
No protocolo do teste do MN com adição de citoB além da avaliação da formação de
MNs, é possível avaliar também a formação de pontes nucleoplasmáticas (Nucleoplasmic
Bridges), em células binucleadas. Esse evento caracteriza instabilidade genômica e ocorre
quando há a presença de cromossomos dicêntricos. Esses cromossomos são formados a partir
de quebras do DNA ou eventos de fusão de telômeros, indicando rearranjos cromossômicos
(ARALDI et al., 2015). O que geralmente ocorre é a fragmentação dessas pontes gerando a
formação de MNs. Assim, a identificação desse fenômeno pode juntamente com a análise da
presença de MNs ajudar a identificar o mecanismo de dano no material genético (CHEONG
et al., 2013).
Outro evento celular indicativo de instabilidade genômica é a presença de brotos
nucleares (Nuclear Buds), que podem ser originados a partir da eliminação de DNA
extracromossômico amplificado durante a interfase, restos de pontes nucleoplasmáticas
quebradas anteriormente e excesso de cromossomos de células aneuplóides. Tais brotos
nucleares ficam localizados em sítios específicos na periferia das células, são facilmente
identificados durante a análise e são frequentemente observados em processos de
oncogenética (SHIMIZU, 2011; SAMANTA et al., 2012). De acordo com Duan e
colaboradores (2009), esses brotos, assim como as pontes, são indicadores valiosos no
monitoramento do dano no DNA.
Já na técnica sem citoB, o tempo de divisão celular das células utilizadas deve ser
conhecido a fim de que se tenha garantia que as células analisadas já tenham passado pelo
processo de mitose (OECD, 2010; FENECH, 1993).
34
Esses eventos característicos de instabilidade genômica, como foram evidenciados
anteriormente, podem ser induzidos por estresse oxidativo, exposição a agentes clastogênicos
ou aneugênicos, defeitos genéticos nos genes de reparo e/ou de controle do ciclo celular, bem
como a uma deficiência nos nutrientes requeridos como cofatores no metabolismo do DNA e
na maquinaria de segregação cromossômica (MACGREGOR, 2005; FENECH et al., 2005).
Todos esses eventos que causam a formação do MN a partir de rearranjos cromossômicos,
expressão gênica alterada, ou aneuploidia são efeitos associados com a instabilidade
cromossômica geralmente observada no câncer (RAJAGOPALAN et al., 2004; AMES;
WAKIMOTO, 2002).
Experimentos que associam o ensaio do cometa com o teste do micronúcleo se
mostram adequados e úteis na avaliação tanto de dano como de reparo de DNA devido às suas
ações complementares (RAMOS et al., 2008; SERPELONI et al., 2008). Nesse contexto,
resultados positivos para genotoxicidade e negativos para mutagenicidade possibilitam, por
exemplo, inferências sobre os tipos de lesões geradas, danos mais simples que podem ser
reparados ou mais complexos, não passíveis de reparo e também permitem a avaliação de
indução do sistema de reparo (COLLINS et al., 1993).
O teste do MN também tem sido uma ferramenta importante na avaliação de
antimutagenicidade de compostos a partir da identificação, por exemplo, de fatores da dieta
que reduzem a instabilidade cromossômica com o objetivo principal de minimizar o risco de
desenvolvimento de patologias (THOMAS et al., 2011).
Embora o teste do MN tenha vantagens em relação aos testes de aberração
cromossômica e cometa, a genética toxicológica reforça a necessidade de mais do que um
teste mutagênico. Assim, a associação dos ensaios do cometa e MN pode ser considerada
como um padrão-ouro entre os testes mutagênicos, porque possuem alta sensibilidade, poder
estatístico, sendo simples, versátil e exigindo pouco investimento e tempo (CELIK et al.,
2014; ARALDI et al., 2014).
1.8 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE - MTT
Os testes de viabilidade celular são amplamente aplicados na verificação da toxicidade
de novos compostos e são importantes, principalmente, quando se está analisando sua
aplicabilidade como agente terapêutico. Além disso, são importantes para definir os limites de
concentrações a serem testados em experimentos de avaliação da mutagenicidade (MELO et
al., 2000). Por exemplo, para o teste do MN in vitro, o guideline da OECD (2010) padroniza
35
que, a substância química analisada deva ser testada, no mínimo, em três concentrações
diferentes com base em estudos preliminares de citotoxicidade.
De acordo com Lima e Ribeiro (2003), antes de se avaliar o potencial mutagênico de
uma substância é necessário testar doses variadas a fim de estabelecer concentrações não
citotóxicas, pois a citotoxicidade pode, eventualmente, estar associada à indução de danos
cromossômicos e morte celular. Esses testes medem a concentração da substância em estudo
com potencial de danificar componentes, estruturas ou vias bioquímicas das células a
situações análogas in vivo (BACON et al., 1990; FRESHNEY, 1994).
Entre os diferentes testes que podem ser utilizados na avaliação da citotoxicidade de
um composto, destaca-se o ensaio de MTT (brometo 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-
tetrazólio), proposto por Mosmann em 1983, com a grande vantagem de ser um teste rápido e
preciso. Este método consiste na clivagem do anel tetrazólio do reagente amarelo MTT
através da ação de redutases mitocondriais de células metabolicamente ativas.
Logo, a capacidade das enzimas mitocondriais em reduzirem o MTT fornece uma
indicação da integridade celular, que são interpretados como medidas de viabilidade celular.
O produto resultante desta quebra é o sal de formazan que possui uma coloração violeta que é
impermeável à membrana celular, portanto, se acumula nas células vivas. Assim, após a
exposição das células ao tratamento e ao MTT, as amostras são analisadas
espectrofotometricamente em um leitor de placas utilizando comprimento de onda de 570 nm,
permitindo quantificar as células viáveis (MOSMANN, 1983; VELLONEN et al., 2004).
2. JUSTIFICATIVA
A necessidade de se obter uma política de regulamentação de produtos naturais, bem
como normas para comercialização e seu uso seguro, é um fato preponderante. Neste sentido,
as pesquisas com plantas medicinais na área da genética toxicológica devem ser estimuladas e
intensificadas, com o intuito de contribuir para a segurança, qualidade e eficácia de
medicamentos delas derivados. Além disso, proporcionar a indicação de novos produtos com
diferentes propriedades farmacológicas, como uma forma alternativa de medicamentos, com
baixo custo e fácil acesso, se mostra de grande relevância científica e econômica.
As drogas antitumorais disponíveis atualmente não apresentam uma boa eficácia, visto
que muitos tumores apresentam resistência a diferentes medicamentos e a maioria
desencadeia toxicidade sistêmica (WÜRTH et al., 2014). Diante disso, cada vez mais se busca
36
a identificação e caracterização de moléculas farmacologicamente ativas já conhecidas que
possam atuar como antitumorais.
Nesse sentido, devido ao alto custo e longo período necessário para a Pesquisa &
Desenvolvimento (P&D) de novos fármacos como, agentes anticâncer, a descoberta de tal
potencial para medicamentos já conhecidos e utilizados clinicamente pode ser considerada um
atalho relevante, que pode, e muito, contribuir nesta área do setor farmacêutico (HUNG; LIU,
2012). Os cardenolídeos, tais como a digoxina, se enquadram nesta situação, já que a
investigação dessa classe de compostos em função de seu potencial antitumoral iniciou-se a
partir de evidências epidemiológicas em pacientes que faziam seu uso em tratamento de
insuficiência cardíaca e, somente mais tarde, ocorreram as investigações in vitro (DUEÑAS-
GONZÁLEZ et al., 2008).
É importante ressaltar que os agentes quimiopreventivos ou quimioprotetores podem
ser usados não somente para prevenir o câncer, mas também na terapêutica, pois muitos deles
podem ser usados em combinação com agentes quimioterápicos para intensificar o efeito com
o uso de menores doses e assim, minimizar a toxicidade induzida por eles (DORAI;
AGGARWAL, 2004). Por essa razão, existem grandes perspectivas em relação à aplicação na
saúde humana de espécies vegetais que possuem propriedades antimutagênicas (CHEN et al.,
2011). Entretanto, a utilização de agentes protetores só é possível com base na análise
cuidadosa da avaliação segura do risco-benefício após vários modelos experimentais em uma
variedade de testes in vitro, in vivo e clínicos (STEELE;KELLOFF, 2005), além de ser
fundamental estabelecer o mecanismo de ação inibidora (DE FLORA, 1998).
A ampla utilização desse medicamento, geralmente em tratamentos de longa duração,
e o pouco conhecimento acerca dos riscos genéticos associados a esse consumo, demonstra a
emergente necessidade de estudos mais aprimorados sobre este composto. E ainda, a
descoberta de compostos químicos conhecidos com outra atividade biológica é uma atividade
multidisciplinar, no qual os estudos sobre mecanismos de ação, potencial tóxico, genotóxico,
mutagênico e antimutagênico dependem de bioensaios fármaco-toxicológicos, in vitro e in
vivo, para que possam ser confirmadas as reais atividades dessa molécula frente a este
aspecto.
37
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar in vitro o potencial mutagênico e antimutagênico do fármaco digoxina nas linhagens
celulares CHO-K1 e HeLa.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Identificar o potencial citotóxico de diferentes concentrações da digoxina.
- Avaliar a capacidade da digoxina em induzir mutações cromossômicas.
- Verificar a influência da exposição das células a diferentes concentrações da digoxina, no
processo de proliferação celular.
- Identificar a capacidade da digoxina em proteger o material genético de células tratadas com
diferentes indutores de dano ao DNA (MMC, DOX e MMS), empregando protocolos de
tratamento simultâneo, pré-complexação, pré e pós-tratamento.
- Avaliar a influência da exposição das células a diferentes concentrações da digoxina e
mutágenos conhecidos (MMC, DOX e MMS), no processo de proliferação celular,
empregando protocolos de tratamento simultâneo, pré-complexação, pré e pós-tratamento.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 DIGOXINA
A digoxina (C41H64O14; CAS 20830-75-5) empregada no presente estudo foi
gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Leandro Augusto de Oliveira Barbosa, responsável pelo
laboratório de Bioquímica Celular do Campus Centro Oeste da Universidade Federal de São
João Del Rei.
Foram preparadas duas soluções estoques para os estudos aqui realizados, de modo
que, para uma delas, o composto testado foi solubilizado em 0,5% de DMSO
(dimetilsufóxido) (concentração final de 100 mM) e, para a outra, em PBS (solução salina
tamponada com fosfato), resultando em uma concentração final de 80 µM (limite de
solubilidade em meio aquoso). Posteriormente, as soluções foram diluídas em meio de cultura
sem soro fetal bovino até a concentração de 1 mM e 80 nM. As soluções foram esterilizadas
em filtro de 0,22 μm e mantidas em freezer a aproximadamente -20°C.
38
As concentrações deste fármaco testadas no ensaio de MN foram selecionadas com
base nos resultados obtidos através do teste de citotoxicidade (MTT) com as linhagens
celulares CHO-K1 e HeLa.
4.2 CULTIVO CELULAR
No presente estudo foram empregadas duas linhagens celulares de mamíferos: uma
linhagem não tumoral proveniente de hamster (CHO-K1) e uma linhagem tumoral humana
(HeLa).
CHO-K1
Nos ensaios de mutagenicidade e antimutagenicidade foi utilizada a linhagem celular
CHO-K1, proveniente de ovário de Hamster Chinês. As células utilizadas foram gentilmente
cedidas pela Profa. Dra. Ilce Mara de Syllos Cólus, da Universidade Estadual de Londrina
(UEL). As células foram cultivadas em garrafas de 75 cm2 contendo 10 ml de meio de cultura
Ham F12 (Sigma-Aldrich, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab,
Brasil), bicarbonato de sódio (17,86 mM), 1% de solução antibiótica-antimicótica contendo
penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (10 mg.ml-1) e anfotericina B (25 μg.ml-1)
(Sigma-Aldrich, EUA) e mantidas em estufa a 37°C, 5% de CO2 e 95% de umidade. O ciclo
celular da linhagem CHO-K1, nessas condições, é de aproximadamente 12 horas.
HeLa
A linhagem celular HeLa (ATCC CCL2) (carcinoma de colo de útero) foi obtida
através de parceria com o Laboratório de Biologia Celular e Inovação Tecnológica da
Fundação Ezequiel Dias (FUNED), sob coordenação da Pesquisadora Dra. Luciana Maria
Silva. As células HeLa possuem sequências do papilomavírus humano 18 (HPV-18) e
apresentam baixa expressão de p53 (SCHNEIDER-GÄDICKE e SCHWARZ, 1986;
SCHEFFNER et al., 1991). Todas as células foram cultivadas em garrafas de cultivo de 75
cm2 contendo 10 ml de meio de cultura DMEM (Sigma-Aldrich, EUA) suplementado com
10% de soro fetal bovino (Cultilab, Brasil), bicarbonato de sódio (17,86 mM), 1% de solução
antibiótica-antimicótica contendo penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (10 mg.ml-1) e
anfotericina B (25 μg.ml-1) (Sigma-Aldrich, EUA) e mantidas em estufa a 37°C, 5% de CO2 e
95% de umidade. O ciclo celular da linhagem HeLa, nessas condições, é de aproximadamente
20 horas.
39
4.3 ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR (MTT)
A viabilidade celular para as linhagens CHO-K1 e HeLa foi avaliada por análise
colorimétrica através do ensaio do MTT. Para esse teste, 2,5x104 células/poço foram
semeadas em placas de 96 poços em meio de cultura completo e incubadas por 24 h, a 37°C
em estufa (5% de CO2) e atmosfera úmida. Após este período, o meio de cultura foi
descartado, as células foram lavadas duas vezes com PBS livre de Ca2+ e Mg2+ (2,7 mM
cloreto de potássio, 1,5 mM fosfato monobásico de potássio, 137 mM cloreto de sódio, 8,10
mM fosfato dibásico de sódio anidro em água deionizada) e submetidas aos tratamentos com
digoxina. Foi estabelecido um grupo “branco” (sem células), um grupo controle negativo
(meio de cultura sem soro) e grupos tratados com diferentes concentrações da digoxina. Para a
linhagem CHO-K1 foram utilizadas as concentrações de 3,90; 7,81; 15,6; 31,3; 62,5; 125; 250
e 500 µM de digoxina. Para as células HeLa as concentrações utilizadas foram de 2, 10, 50 e
150 nM e 1, 10 e 100 µM. Cada grupo de tratamento foi realizado em sextuplicata e avaliado
em dois diferentes tempos de tratamento: 24 e 48 horas.
Transcorridos os tempos de tratamentos, o meio de cultura foi removido, as células
foram lavadas duas vezes com PBS e, em seguida, foram adicionados 50 µl/poço de solução
de MTT na concentração de 2,5 mg/ml (diluído em PBS e 50 µl/poço de meio de cultura
suplementado com soro fetal bovino. As placas foram incubadas por um período de 3 horas a
37°C. Os cristais de formazan formados a partir da metabolização do MTT foram dissolvidos
com a adição de 100 µl/poço do solvente orgânico DMSO). Após 20 min foi efetuada a leitura
da absorbância das placas em um leitor de microplacas Power Wave XS2 (BIOTEK)
utilizando filtro de 570 nm. Os ensaios de avaliação de viabilidade celular foram realizados
em triplicatas.
Visto que através da leitura espectrofotométrica os dados foram obtidos em valores de
absorbância, foi realizado um cálculo do índice de viabilidade celular VC (%). Para tanto, foi
obtida a média das absorbâncias (sextuplicatas) para cada tratamento e para o branco. Em
seguida foi aplicada a seguinte equação para a determinação da viabilidade celular:
40
4.4 TESTE DO MICRONÚCLEO COM BLOQUEIO DA CITOCINESE
4.4.1 TESTE DE MUTAGENICIDADE
Nos ensaios para verificar o potencial da digoxina em causar mutações
cromossômicas, três experimentos independentes foram realizados para todos os tratamentos
em células CHO-K1 e HeLa. Os experimentos foram conduzidos usando células que estavam
entre a terceira e a décima passagem após o descongelamento celular.
Para esse teste, 2,5x104 células/poço foram semeadas em placas de 24 poços em meio
de cultura completo e incubadas por 24 h a 37°C em estufa (5% de CO2) e atmosfera úmida.
Após esse período, o meio de cultura foi descartado e as células foram lavadas duas vezes
com PBS e submetidas aos diferentes tratamentos.
Para avaliação da mutagenicidade do fármaco digoxina foi estabelecido um grupo
controle-positivo (Metilmetanosulfonato-MMS – 400 μM), um grupo controle negativo (meio
de cultura sem soro fetal bovino) e 3 grupos tratados com diferentes concentrações,
selecionadas com base nos valores obtidos nos estudos para avaliação de citotoxicidade. A
linhagem CHO-K1 foi tratada com as concentrações de digoxina de 20, 35 e 50 μM e as
células HeLa com 25, 50 e 100 nM. Além disso, ambas as linhagens foram tratadas com
concentrações próximas as detectadas no plasma de pacientes que utilizam digoxina, que
foram 0,7; 1,5 e 3,0 nM.
Todos os tratamentos foram efetuados por um período de 3 horas em meio livre de
soro. Decorrido o tempo dos tratamentos, foi feita a retirada dos mesmos e as culturas
celulares foram lavadas com PBS à temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se 495 µl
de meio de cultura completo e 5 µl de citocalasina-B (3 μg/ml). Passadas 18 horas, para CHO-
K1, e 24 horas, para HeLa, do tratamento com citoB e consequente bloqueio da citocinese, as
culturas celulares foram lavadas com PBS e tripsinizadas com 400 µl de tripsina-EDTA
(0,125%).
Em seguida, o material foi centrifugado por 5 minutos a 400 g. O pellet foi
ressuspendido em solução hipotônica (citrato de sódio-1%) e homogeneizado delicadamente.
Foi realizada uma nova centrifugação por 5 minutos a 400 g e o pellet resultante foi
ressuspendido em solução fixadora (metanol/ácido acético (3:1 (volume/volume))). Após
nova centrifugação por 5 minutos o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido e
homogeneizado em 500 µl da solução fixadora. As lâminas utilizadas para disposição do
material celular estavam limpas, geladas e com um filme de água em sua superfície, onde
41
foram colocadas três gotas da suspensão celular. Foram preparadas 2 lâminas para cada
tratamento realizado.
No momento da análise, as lâminas foram coradas com DAPI (4', 6-diamidino-2-
fenilindol dihidrocloreto - 2,86 μM), um marcador intercalante do DNA e fluorescente, que
permite a coloração diferencial do núcleo em relação ao citoplasma, permitindo a clara
identificação dos micronúcleos (Figura 7). Foram analisadas 1000 células binucleadas por
tratamento, em um teste cego, para se estabelecer a frequência de células micronucleadas
(Microscópio Fluorescência Zeiss, Axioscope, Filtro de excitação 365 nm e filtro de barreira
445/450 nm). O critério para a identificação de MNs seguiu o estabelecido por Titenko-
Holland e colaboradores (1997).
Figura 7: Fotomicrografia de células HeLa binucleadas coradas com DAPI
(aumento de 1000x). Em (A) células binucleadas sem micronúcleos e em (B)
células binucleadas com micronúcleo presente (seta). Fonte: Arquivo
LaBCeM.
4.4.2 TESTE DE ANTIMUTAGENICIDADE
Os mesmos parâmetros utilizados no teste do micronúcleo para avaliação da
mutagenicidade foram utilizados nos ensaios de antimutagenicidade. A principal diferença
entre eles consistiu na condução dos tratamentos com a digoxina. Ou seja, em expor as
células, além das concentrações testadas da digoxina (0,7; 1,5 e 3,0 nM), a um agente
mutagênico conhecido: mitomicina C (MMC – 4,8 µM), doxorrubicina (DOX – 0,3 µM) ou
metilmetanosulfonato (MMS – 400 µM). Para essa análise, foram empregados diferentes
protocolos de tratamentos: tratamento simultâneo, tratamento de pré-complexação, pré-
tratamento e pós-tratamento (Figura 8).
42
No protocolo de tratamento simultâneo as linhagens celulares CHO-K1 e HeLa foram
tratadas simultaneamete com as diferentes concentrações da digoxina e de cada um dos
mutágenos. Já no tratamento de pré-complexação a digoxina foi incubada juntamente com o
agente mutagênico durante 1 h a 37°C e, posteriormente, foi realizado o tratamento. Para o
teste de antimutagenidade com pré-tratamento, as células foram expostas, primeiramente, às
diferentes concentrações da digoxina por 3 h, depois este tratamento foi removido e
adicionado o mutágeno por um período igual. Por fim, para o protocolo de pós-tratamento,
ambas as culturas celulares foram tratadas com o agente mutagênico durante 3 h, em seguida
este tratamento foi descartado e adicionaram-se as diferentes concentrações da digoxina por
um tempo de 3 h de duração.
Figura 8: Esquema de tratamento do teste do micronúcleo para avaliação da
antimutagenicidade da digoxina.
A atividade antimutagênica foi estimada através do percentual de redução de danos,
calculado para cada uma das concentrações de digoxina de acordo com a fórmula proposta
por Manoharan e Banerjee (1985) e Water e colaboradores (1990):
sendo A: células tratadas com controle positivo, B: células tratadas com controle positivo
mais composto a ser avaliado, C: células tratadas com controle negativo.
43
4.4.3 ÍNDICE DE DIVISÃO NUCLEAR (IDN)
Uma importante vantagem proporcionada pelo teste do micronúcleo é a possibilidade
de quantificação da extensão e do progresso da divisão nuclear numa população de células em
divisão, sendo esse parâmetro chamado de Índice de Divisão Nuclear (IDN).
Para a determinação da influência dos tratamentos com digoxina no processo de
divisão mitótica das linhagens celulares CHO-K1 e HeLa, as mesmas lâminas utilizadas no
teste do micronúcleo, para análise de mutações cromossômicas e antimutagenicidade, foram
utilizadas para a determinação do IDN.
O Índice de Divisão Nuclear (IDN) ou Nuclear Division Index (NDI) é calculado
baseando-se no número de células mononucleadas, binucleadas, trinucleadas e tetranucleadas
encontradas no total de 300 células contadas por tratamento. Esse índice fornece uma medida
do estado proliferativo das células viáveis, sendo assim, o menor valor possível de IDN é 1,0
o que ocorre quando todas as células não se dividiram ou não tiveram a citocinese bloqueada
e, portanto, estão todas mononucleadas. Se todas as células completaram um ciclo de divisão
e, portanto, estão todas binucleadas, o IDN será 2,0 (FENECH, 2000).
Foram analisadas aleatoriamente 300 células íntegras por tratamento utilizando
microscopia de fluorescência, tal como descrito no item 4.4.1. A frequência de células
binucleadas foi calculada como uma proporção de células que sofreram divisão celular
completa após a exposição aos tratamentos. O cálculo do IDN foi realizado de acordo com
Fenech (2007), usando a seguinte fórmula:
sendo M1-M4 o número de células com 1, 2, 3 e 4 núcleos, respectivamente, e N o número
total de células íntegras contadas.
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a análise estatística dos resultados obtidos através dos testes do MTT, do
Micronúcleo e o de Índice de Divisão Nuclear foi utilizado o Software INSTAT. Foi realizada
ANOVA (Análise de Variância) e, posteriormente, aplicado o teste de Tukey, para
comparações entre os grupos tratados e os controles negativos para os testes de viabilidade
celular e mutagenicidade. Para os testes de antimutagenicidade também foi realizada ANOVA
44
e em seguida aplicado o teste de Tukey (p<0,05), porém as comparações foram feitas entre os
grupos tratados e os controles positivos.
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 VIABILIDADE CELULAR
No presente estudo, análises preliminares de citotoxicidade foram realizadas a fim de
garantir que as concentrações testadas no teste do MN não iriam afetar a viabilidade celular, o
que poderia levar a resultados falso-negativos. Sendo assim, foram adotados valores de
concentrações não tóxicas, cumprindo, dessa forma, o que preconiza o guideline da OECD
487 (2010) que afirma que, para testar substâncias químicas usando o teste do MN in vitro,
devem ser avaliadas, no mínimo, três concentrações diferentes da droga e que estas deverão
ser escolhidas a partir dos dados obtidos de estudos preliminares sobre citotoxicidade,
conforme explicitado anteriormente.
Os resultados dos ensaios de viabilidade celular da linhagem CHO-K1 para a digoxina
demostraram que apenas as concentrações mais elevadas testadas, ou seja, 125, 250 e 500 µM
foram capazes de afetar a viabilidade celular de maneira significativa (p<0,05) nos tempos de
24 e 48 h de exposição (Figura 9). Sendo que estas três concentrações são mais de 100 mil
vezes maiores que a concentração plasmática terapêutica em humanos, que é de
aproximadamente 1,8 nM (BRUNTON et al.,2010).
Figura 9: Viabilidade celular obtida a partir do ensaio de MTT para a linhagem
CHO-K1, após o tratamento com diferentes concentrações da digoxina em um
tempo de 24 e 48h. * (p<0,05) e ** (p<0,001).
45
Os efeitos dos GCs são mediados pelo seu potencial em se ligar especificamente à
subunidade α da Na, K-ATPase e inibir a função da bomba (CERELLA et al., 2013). As
isoformas da subunidade α possuem propriedades funcionais distintas em relação à afinidade
por seus ligantes, como Na+ e GCs (DAI et al., 2013; BABULA et al., 2013, BRENDAN et
al., 2015).
Nesse sentido, em outros estudos foi relatado que, os GCs possuem maior afinidade
em se ligarem à subunidade α3 da Na, K-ATPase de roedores (LUCCHESI et al.,1991)
seguida da α2 e por fim a α1 (BLANCO; MERCER, 1998). Segundo O’brien e colaboradores
(1994) estas isoformas se diferenciam em relação à sensibilidade a GCs como também à
distribuição entre os tecidos. Por exemplo, a isoforma α1 de roedores (predominante no tecido
epitelial) é relativamente resistente a GCs, enquanto que α2 e α3 são bastante sensíveis
(BLANCO; MERCER, 1998).
Além disso, foi observado também que em cardiomiócitos de ratos, que expressam
apenas as subunidades α1 e α2, doses baixas de GCs inibiram α2 e produziram um efeito
inotrópico positivo. Enquanto que, apenas doses relativamente altas de GCs foram capazes de
inibir α1, as quais, consequentemente, induziram toxicidade (DOSTANIC et al., 2003;
XIONG et al., 2012).
Deste modo, os resultados obtidos nestes experimentos corroboram com a literatura,
uma vez que a linhagem celular CHO-K1 é obtida a partir de epitélio de ovário de hamster
chinês. Isso pode, portanto, favorecer a compreensão da baixa toxicidade para a digoxina, no
sistema empregado.
Logo, a identificação de fármacos que são capazes de discriminar entre as isoformas
que resultam no efeito inotrópico das que induzem toxicidade pode ser relevante para o
desenvolvimento de novas terapias farmacológicas e, possivelmente, uma redução de efeitos
colaterais.
Os resultados obtidos no teste de citotoxicidade da digoxina para células HeLa
demostraram que a partir da concentração de 150 nM a droga foi capaz de afetar a viabilidade
celular de maneira significativa (p<0,05) nos tempos de 24 e 48 h de exposição (Figura 10).
46
Figura 10: Viabilidade celular obtida a partir do ensaio de MTT para a linhagem
HeLa, após o tratamento com diferentes concentrações da digoxina em um tempo
de 24 e 48h. * (p<0,05) e *** (p<0,0001).
Há uma diferença importante e controvérsia entre as isoformas α da Na, K-ATPase e a
sua afinidade para os GCs, que é distinta entre várias espécies. Em humanos, alguns estudos
revelaram afinidades semelhantes a GCs entre as diferentes isoformas, enquanto outros têm
relatado que a afinidade de α1 a GCs é maior do que a de outras isoformas (ZEINO et al.,
2015). Esta diferença de afinidade de GCs a α1 de humanos e roedores explica, portanto, a
maior sensibilidade das células HeLa a digoxina se comparada a CHO-K1.
Diante do exposto, o efeito tóxico da digoxina, para ambas as linhagens celulares, foi
concentração dependente assim como observado em testes realizados com este fármaco em
outras condições experimentais (QIU et al., 2008; SEDIGH-ARDEKANI et al., 2013).
A utilização de modelos celulares na busca de novas terapias antitumorais torna-se
interessante, uma vez que as linhagens celulares possibilitam a obtenção de resultados mais
rápidos na prospecção de novos agentes antitumorais (ASSUNÇÃO, 2013).
Muitos quimioterápicos causam toxicidade sistêmica e desenvolvimento de neoplasias
secundárias, o que dificulta a cura e aumenta as recidivas. Assim, a busca por novos
antitumorais tem como objetivo principal aumentar a seletividade e a efetividade dessas
sustâncias, induzindo a morte de células tumorais e preservando as células normais
(ASSUNÇÃO, 2013). Dessa forma, apesar da toxicidade seletiva para a HeLa em
concentrações, aproximadamente, 1000x menor que em CHO-K1 vale ressaltar que se trata de
47
linhagens celulares de espécies diferentes e ainda a primeira dose que foi citotóxica para as
células cancerosas seria letal para seres humanos
6.2 MUTAÇÕES CROMOSSÔMICAS E MODULAÇÃO DA ATIVIDADE
PROLIFERATIVA
O teste do MN é amplamente empregado na análise do potencial mutagênico de novos
produtos de indústrias farmacêuticas. Esta metodologia possui uma importante vantagem que
é a capacidade de detectar agentes clastogênicos e aneugênicos (KIRSCH-VOLDERS et al.,
2014). Para medicamentos, esse processo de avaliação da genotoxicidade é realizado
minuciosamente, mais que em qualquer outro setor, pois, na maioria das vezes, a exposição
sistêmica à droga é elevada e, geralmente, necessita-se de altas doses para se chegar à eficácia
terapêutica (SNYDER, 2010; KIRSCH-VOLDERS et al., 2014).
Os resultados da avaliação do potencial da digoxina em induzir quebras
cromossômicas e/ou aneuploidias, bem como sua capacidade em afetar a proliferação celular
in vitro, estão apresentados nas tabelas 1,2,3 e 4.
Tabela 1: Avaliação da mutagenicidade de três concentrações, próximas a terapêutica, da
digoxina na linhagem CHO-K1.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas e
média do IDN, após 3 h de exposição em três experimentos independentes. CBMN: Células
Binucleadas Micronucleadas. IDN: Índice de Divisão Nuclear. X±D.P.: Média ± desvio
padrão. *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle negativo.
48
Tabela 2: Avaliação da mutagenicidade de três altas concentrações da digoxina na linhagem
CHO-K1.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas e
média do IDN, após 3 h de exposição em três experimentos independentes. CBMN: Células
Binucleadas Micronucleadas. IDN: Índice de Divisão Nuclear. X±D.P.: Média ± desvio
padrão. * (p<0,05), ** (p<0,001) e *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao
controle negativo.
Tabela 3: Avaliação da mutagenicidade de três concentrações, próximas a terapêutica, da
digoxina na linhagem HeLa.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas e
média do IDN, após 3 h de exposição em três experimentos independentes. CBMN: Células
Binucleadas Micronucleadas. IDN: Índice de Divisão Nuclear. Média ± desvio padrão. ***
(p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle negativo.
49
Tabela 4: Avaliação da mutagenicidade de três altas concentrações da digoxina na linhagem
HeLa.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas e
média do IDN, após 3 h de exposição em três experimentos independentes. CBMN: Células
Binucleadas Micronucleadas. IDN: Índice de Divisão Nuclear. X±D.P.: Média ± desvio
padrão. * (p <0,05) e *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle negativo.
No que diz respeito às drogas antitumorais, o processo de avaliação da mutagenicidade
tem que ser ainda mais detalhado e aprofundado, uma vez que a atividade antitumoral de
fármacos quimioterápicos é, em grande parte, diretamente relacionada com a capacidade para
induzir danos no DNA (ABBOTTS; THOMPSON; MADHUSUDAN, 2014).
Muitos estudos têm demonstrado que células micronucleadas podem ser eliminadas
por apoptose e que as caspases -9, -8, e -3 estão envolvidos neste processo (DECORDIER et
al., 2002). Assim, a identificação de um composto capaz de induzir a formação de MN
permite considerar o seu potencial para ativar os processos de apoptose, fornecendo
informações relevantes sobre o seu potencial como um candidato antitumoral (GONÇALVES
et al., 2014).
Uma atividade anticâncer com diferentes mecanismos de ação tem sido descrita na
literatura para a digoxina (LU et al., 2014; GLUCK et al., 2015), sendo que, este fármaco já
está sendo avaliado em estudos clínicos de fase II como um potencial medicamento destinado
para o tratamento de câncer de mama e de próstata (UNWITH et al., 2015;
CLINICALTRIALS, 2015a). Entretanto, existem poucos trabalhos envolvendo avaliação
mutagênica e genotóxica de GCs, inclusive para a digoxina.
50
Os dados das tabelas mostram que as concentrações próximas à concentração
terapêutica da digoxina (0,70; 1,50 e 3,00 nM) não foram mutagênicas, como também não
afetaram a proliferação celular das linhagens CHO-K1 e HeLa.
Para as células não tumorais CHO-K1, todas as maiores concentrações avaliadas (20,
35 e 50 µM) reduziram o índice de divisão nuclear e tiveram uma ação mutagênica,
demonstrando que a digoxina foi capaz de induzir clastogênese e/ou aneuploidias nessas
concentrações e, provavelmente, a redução da taxa proliferativa foi um reflexo desse efeito.
Em outro estudo (SEDIGH-ARDEKANI et al., 2013), empregando os testes de
quebras cromatídicas e de poliploidia, foi demonstrado que a frequência de células CHO-K1
com aberrações cromossômicas aumentou significativamente em função da elevação da
concentração da digoxina e que o índice mitótico foi correlacionado negativamente com as
concentrações da digoxina. Isto também foi observado no presente estudo, pois foi crescente a
ordem de concentração da digoxina que reduziu de maneira mais efetiva a proliferação
celular.
Para a linhagem tumoral humana HeLa, as concentrações de 50 e 100 nM
apresentaram efeitos mutagênicos e somente a maior concentração avaliada diminuiu a taxa
mitótica das células. Dessa forma, foi verificado que nessas condições experimentais as doses
mais elevadas resultaram em um aumento significativo da frequência de células binucleadas
micronucleadas e que as possíveis lesões ocorridas no DNA, devido ao tratamento com 50
nM de digoxina, não foram suficientes para afetar negativamente a proliferação celular.
Devido ao núcleo esteroide os GCs podem atravessar a membrana das células e
interagir diretamente com componentes (por exemplo, proteínas e enzimas) e receptores
intracelulares (CERELLA et al., 2013). Em estudos realizados por outros autores, foi
demonstrado que diferentes GCs, incluindo a digoxina, podem atuar como inibidores de
topoisomerase I e II (BIELAWSKI et al., 2006; WINNICKA et al., 2008; SLINGERLAND et
al., 2013). De acordo com Godard (2002) e Hajji (2005), os inibidores de topoisomerases
estão envolvidos com quebras de fita simples e de fita dupla no DNA, que podem estar
relacionadas com a formação de MNs observados neste trabalho.
Além disso, Lu e colaboradores (2014) demonstraram que a digoxina foi capaz de
causar danos no material genético da linhagem tumoral HeLa. Foi observado que com o
aumento do tempo de tratamento com digoxina houve um progressivo aumento da quantidade
de focos de histona H2Ax fosforilada (gama-H2Ax), que somente sofre fosforilação quando
ocorre quebras de fita dupla no DNA. Portanto, a formação dos MNs encontrados no presente
trabalho pode ter sido originada por clastogênese induzida por este fármaco.
51
Em situações celulares desfavoráveis, como em condições de altos níveis de danos no
material genético, as células retardam a transição entre as fases do ciclo celular, resultando em
uma redução dos níveis de proliferação celular. Os GCs incluindo a digoxina, frequentemente,
induzem a parada do ciclo celular de células cancerosas na fase S (XU et al., 2011; LU et al.,
2014) ou em G2/M (ZHAO et al., 2011; ELBAZ et al., 2012). No presente estudo, a dimuição
da taxa mitótica das células foi observada em baixa concentração de digoxina para HeLa se
comparada às concentrações que foram capazes de afetar a proliferação de CHO-K1. Isto
pode ser explicado pelo fato de que a resposta final da sinalização intracelular ativada por
GCs é dependente do tipo de tecido celular, tempo de exposição e concentração da droga
(MIJATOVIC, et al., 2007).
Outra hipótese, seria que GCs, inclusive a digoxina, diminuem a expressão das
proteínas p53, p21 e p16 (XU et al., 2011; LU et al., 2014). A função principal dos genes
supressores de tumor é bloquear a passagem da fase G1 para a S quando identificam qualquer
anormalidade no material genético. Quando esses genes não são funcionais as células passam
a acumular mutações em taxas mais altas que os níveis normais (TLSTY et al., 1995;
HAJJARI et al., 2014). Ou seja, defeitos nos genes reguladores dos pontos de checagem do
ciclo celular estão associados ao acúmulo de mutações e progressão tumoral, levando a célula
à proliferação contínua ou à reinicialização do ciclo celular (EVAN; VOUSDEN, 2001;
MALUMBRES; BARBACID, 2009).
Nesse sentido, uma característica importante nas linhagens celulares utilizadas é a
expressão do gene TP53, visto que a proteína p53 participa de pontos de checagem no ciclo
celular, monitorando a integridade do genoma replicado e tem a capacidade de atrasar a
replicação até que o reparo seja feito, ou induzir uma série de eventos que levarão à apoptose
quando o dano for muito extenso (BRÜSEHAFER et al., 2014; ASSUNÇÃO, 2013).
Dessa maneira, destaca-se a linhagem CHO-K1 que apresenta uma mutação no códon
211 (exon 6) do gene que codifica para a proteína p53 com alteração do aminoácido treonina
por lisina (HU et al., 1999). Logo, por possuir o gene TP53 mutante (inativo), essa linhagem
possui uma desregulação do ponto de checagem G1/S do ciclo celular (HU et al., 1999;
TAMIETI et al., 2007).
Já a linhagem HeLa tem como característica uma menor taxa de p53 ativa
(SCHEFFNER et al., 1991) e ainda assim a digoxina tem modulado a apoptose de células
HeLa através de via dependente de p53 (LU et al., 2014). Apesar do status de p53 diferente
para essas duas linhagens, tal característica pareceu não influenciar nos resultados, pois se
observou a ocorrência de mutagenicidade em ambas as linhagens celulares.
52
Salienta-se, dessa forma, a importância da realização dos ensaios do MN com duas
linhagens com diferentes padrões de expressão de TP53 pois, de acordo com Honma e
Hayashi (2011), modelos celulares com p53 inativa são, por vezes, mais sensíveis a agentes
genotóxicos, se comparadas às linhagens selvagens, o que pode favorecer a ocorrência de
resultados falso-positivos.
Além disso, a ativação de quinases, pelos GCs, que estão relacionadas com a
regulação do crescimento celular, tais como Erk ou Akt, parecem ser uma das vias de
sinalizações mais importantes relacionadas aos efeitos citostáticos e citotóxicos desses
compostos (PRASSAS; DIAMANDIS, 2008; RIGANTI et al., 2011). O efeito citostático é
comumente associado com o efeito citotóxico uma vez que as alterações na progressão do
ciclo celular muitas das vezes precedem a acumulação de células em G1 (FENG et al., 2010;
XIE et al., 2011).
Além disso, a parada do ciclo celular pode ser consequência da interferência na
organização do citoesqueleto causados por esses GCs como, digoxina, que tipicamente levam
a alterações na progressão do ciclo celular, principalmente durante a divisão celular
(BABULA et al., 2013; ARK et al., 2010). As pertubações no citoesqueleto podem estar
envolvidas com alterações nas fibras do fuso que, além de afetar a proliferação celular,
também estão relacionadas com a formação de MNs, como foi observado neste trabalho.
Desse modo, as células tratadas com digoxina poderiam adquirir uma predisposição
para o acúmulo de erros no DNA podendo ser fixados na forma de MNs, como foi observado
neste estudo. E, caso o nível de dano seja elevado, poderia induzir também a ativação de vias
de sinalização de morte celular. Isto foi evidenciado nos resultados dos tratamentos com altas
concentrações de digoxina em que houve redução da viabilidade celular e do IDN. Portanto,
caso seja realizado modificações na estrutura da digoxina para inativar sua ação inotrópica
sobre os cardiomiocitos, esse composto se tornará um promissor agente antitumoral.
Outro mecanismo sugerido para os efeitos anticâncer de GCs são as alterações na
composição iônica intracelular (CERELLA et al., 2010). Alterações nos níveis intracelulares
de Na+ e K+ podem gerar efeitos prejudiciais como modificação da conformação
tridimensional de proteínas e, por conseguinte, ativar os efetores de morte celular (XIAO et
al., 2002; ARK et al., 2010) por apoptose ou por autofagia (CERELLA et al., 2013; XIE et al.,
2011). Foi demonstrado que a digoxina foi capaz de induzir a morte por apoptose de HeLa a
partir do aumento da clivagem de PARP (Poli (ADP-Ribose) polimerase), o qual quando
fosforilado é um biomarcador de apoptose (LU et al., 2014).
53
Mudanças nas concentrações de Ca2+ no interior das células também poderiam ser
relevantes para os efeitos citotóxicos dos GCs. A digoxina tem sido descrita na literatura por
aumentar a concentração de cálcio intracelular (PONGRAKHANANON et al., 2013). O Ca2+
é um íon que está envolvido em processos que desencadeiam a morte celular, uma vez que
ativa endonucleases como, calmodulina a qual modula várias funções celulares, incluindo a
ativação de proteases (CERELLA et al., 2010). Sendo assim, esse pode ser um dos
mecanismos envolvidos na redução do índice mitótico observado em ambas as células.
Uma característica típica do câncer é a proliferação descontrolada de células. Além do
seu efeito sobre a viabilidade celular de células tumorais, os GCs assim como a digoxina têm
sido amplamente documentados como compostos que possuem a capacidade de inibir de
maneira seletiva o crescimento de células cancerosas (RIGANTI et al., 2011; VAKLAVAS et
al., 2011). Vários mecanismos podem ser responsáveis por seu efeito citostático como
descrito anteriormente. Em camundongos, a digoxina foi capaz de reduzir mais de 96% a
carga metastática de um tumor primário de mama para o pulmão, ao bloquear a ação da
enzima LOX (Lisil oxidase), que está envolvida em processos metastáticos (ZHANG et al.,
2012; WONG et al., 2012).
Apesar de um efeito comumente associado aos agentes quimioterápicos ser a morte de
células e tecidos normais e não apenas as cancerosas (KEYOMARSI; PARDEE, 2003), no
presente estudo a digoxina foi capaz de afetar a proliferação de células tumorais em
concentrações muito mais baixas em relação à linhagem de célula não tumoral CHO-K1.
Vários estudos têm demonstrado que GCs têm satisfatórios efeitos anticancerígenos sem
afetar as células saudáveis (PONGRAKHANANON et al., 2013). Porém, vale ressaltar, que a
célula não tumoral aqui utilizada não tem origem humana.
O grande interesse pelo fármaco digoxina é decorrente não apenas dos potentes efeitos
antiproliferativos, mas também por causa do efeito diferenciado em células saudáveis, em
relação às células tumorais. Estas e outras constatações justificam e incentivam a busca por
novos e potentes cardenolídeos com potencial atividade anticâncer (MIJATOVIC et al.,
2012). Entretanto, mesmo com o recente debate sobre os diferentes tipos de morte celular
induzidos pelos GCs (autofagia e apoptose) e suas características, do ponto de vista
terapêutico, faz-se necessário abordar a questão de maneira prática, buscando avaliar se o
objetivo final é alcançado (CERELLA et al., 2013; KREUZALER; WATSON, 2012) que é a
morte de células tumorais de maneira específica, como foi evidenciado neste trabalho.
54
6.3 ANTIMUTAGENICIDADE
Danos ao material genético são frequentemente associados com mutações, que estão
relacionadas com a iniciação e a progressão do câncer. A oncologia moderna, por sua vez,
está sendo desafiada a ampliar seu foco de tratamento anticâncer para a quimioprevenção, por
meio de agentes com diversas propriedades biológicas (AJITH; SOJA, 2006; SISMONDI et
al., 2015).
Uma boa estratégia para prevenir as doenças decorrentes das mutações é o consumo de
substâncias, naturais ou sintéticas, capazes de impedir a formação ou de reparar um dano já
constituído. Tem sido demonstrado que a absorção de substâncias químicas pode modular a
genotoxicidade de drogas mutagênicas e, dessa forma, reduzir as chances de desenvolvimento
de um tumor (SERRANO et al., 2015; KIM et al., 2015).
Portanto, se faz necessário e importante entender não apenas a eficácia e os
mecanismos de ação dos produtos naturais (MEHTA et al., 2010), mas, também, conhecer os
seus possíveis efeitos tóxicos e antigenotóxicos. Nesse sentido, os ensaios de
antimutagenicidade são fundamentais, uma vez que existe estreita relação entre o consumo de
compostos com potencial antimutagênico e prevenção do câncer (SERRANO et al., 2015),
agregando valor à abordagem terapêutica que emprega produtos de origem natural.
No presente estudo, o passo seguinte, após avaliação da mutagenicidade, foi a
identificação da capacidade antimutagênica do fármaco digoxina. Nessa metodologia,
concentrações não mutagênicas da digoxina foram associadas, em diferentes protocolos, ao
tratamento com mutágenos conhecidos. Dessa forma, foi possível verificar a atividade
protetora desse fármaco frente a danos induzidos ao DNA. As Tabelas 5 a 8 e as Figuras 11 a
14 reúnem os resultados obtidos para as linhagens CHO-K1 e HeLa nos diferentes protolocos
de tratamento de digoxina associada à MMC.
55
Tabela 5: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas à
MMC (4,8 µM) na linhagem CHO-K1 em diferentes protocolos de tratamento.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas,
após 3 h de exposição em três experimentos independentes. Dig: digoxina. X±D.P.: Média ±
desvio padrão. ** (p<0,001) e *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle
positivo.
Tabela 6: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada à MMC na linhagem CHO-K1.
IDN: Índice de Divisão Nuclear. Dig: digoxina. X±D.P.: Média ± desvio padrão.
56
Tabela 7: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas à
MMC (4,8 µM) na linhagem HeLa em diferentes protocolos de tratamento.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas,
após 3 h de exposição em três experimentos independentes. Dig: digoxina. X±D.P.: Média ±
desvio padrão. *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle positivo.
Tabela 8: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada à MMC na linhagem HeLa.
IDN: Índice de Divisão Nuclear. Dig: digoxina. X±D.P.: Média ± desvio padrão. ***
(p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle negativo.
Na análise das tabelas e gráficos acima verificou-se que, utilizando o mutágeno MMC,
a digoxina foi capaz de reduzir os danos causados ao DNA das células CHO-K1 nas duas
maiores concentrações testadas em todos os protocolos de tratamento, exceto no pós-
tratamento, no qual não foi observada diferença estatística em relação ao controle positivo. Os
mesmos resultados foram observados para a linhagem HeLa no pré e pós- tratamento. Nos
tratamentos simultâneo e pré-complexação, apenas a maior concentração (3,00 nM) do
fármaco teve ação antimutagênica.
Hickman e colaboradores (1992) afirmam que a interação entre o fármaco e seu alvo é
de fundamental importância na determinação do destino da célula. Desta forma, compostos
57
citotóxicos, utilizadas na quimioterapia, como a MMC, apresentam mecanismos de ação com
base em sua atividade genotóxica e/ou mutagênica, o que representa um risco potencial para
os pacientes.
A MMC possui alta citotoxicidade para as células sadias em seres humanos e animais
experimentais (SASAKI et al., 2006). Entretanto, no presente estudo foi demonstrado que o
tratamento com MMC e co-tratamento, simultâneo e de pré-complexação, com digoxina
apresentou efeito protetor específico para as células normais na concentração de 1,50 nM. E
ainda, houve redução do índice mitótico somente para a linhagem tumoral no tratamento de
pré-complexação, mostrando uma possível forma de tratamento para o câncer de maneira
seletiva.
Posteriormente, foi realizada a análise do potencial antimutagênico do fármaco
digoxina quando associado a um quimioterápico já estabelecido no mercado, a doxorrubicina,
nas culturas celulares CHO-K1 e HeLa (tabelas 9 a 12 e figuras 15 a 18).
Tabela 9: Avaliação da antimutagenicidade três concentrações da digoxina associadas à DOX
(0,3 μM) na linhagem CHO-K1 em diferentes protocolos de tratamento.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas,
após 3 h de exposição em três experimentos independentes. Dig: digoxina. X ± D.P.: Média ±
desvio padrão. * (p<0,05), ** (p<0,001) e *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao
controle positivo.
58
Tabela 10: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada à DOX na linhagem CHO-K1.
IDN: Índice de Divisão Nuclear. Dig: digoxina. X±D.P.: Média ± desvio padrão.
Tabela 11: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas à
DOX (0,3 μM) na linhagem HeLa em diferentes protocolos de tratamento.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas,
após 3 h de exposição em três experimentos independentes. Dig: digoxina. X ± D.P.: Média ±
desvio padrão. * (p<0,05), ** (p<0,001) e *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao
controle positivo.
59
Tabela 12: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada à DOX na linhagem HeLa.
IDN: Índice de Divisão Nuclear. Dig: digoxina. X±D.P.: Média ± desvio padrão. * (p<0,05),
** (p<0,001) e *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle negativo.
De acordo com os dados apresentados acima, as duas doses mais elevadas do fármaco
digoxina (1,5 e 3,0 nM) apresentaram atividade antimutagênica no pré-tratamento com o
indutor de danos genéticos DOX. Ou seja, houve diminuição da frequência de células
binucleadas micronucledas sem afetar o índice de divisão nuclear, de ambas as linhagens
celulares empregadas.
Entretanto, para a HeLa, nos protocolos de tratamentos simultâneo e de pré-
complexação, em baixas concentrações de digoxina, foi observado uma ação contrária, ou
seja, a digoxina aumentou os danos cromossômicos e reduziu a proliferação celular. Logo,
nessas condições experimentais, a digoxina foi capaz de potencializar os efeitos tóxicos do
quimioterápico DOX na linhagem cancerosa, mostrando uma possível ação anticâncer
seletiva.
Dessa forma, um possível mecanismo de atuação do fármaco digoxina, como um
potencial antitumoral, poderia ser a partir de sua administração como um adjuvante em
associação com o quimioterápico já estabelecido no mercado, doxorrubicina. Como a
digoxina intensificou os efeitos citotóxicos de DOX de maneira seletiva para a linhagem
tumoral, sua ação como um adjuvante poderia reduzir os efeitos colaterais, tornando o
tratamento mais efetivo.
Em seguida, o último passo deste trabalho foi realizar a análise da capacidade da
digoxina em proteger o material genético das linhagens CHO-K1 e HeLa contra a ação do
mutágeno metilmetanosulfonato. Os resultados estão resumidos nas tabelas 13 a 16 e nas
figuras 19 a 22.
60
Tabela 13: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas a
MMS (400 μM) na linhagem CHO-K1 em diferentes protocolos de tratamento.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas,
após 3 h de exposição em três experimentos independentes. Dig: digoxina. X ± D.P.: Média ±
desvio padrão. * (p<0,05) e *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle
positivo.
Tabela 14: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada a MMS na linhagem CHO-K1.
IDN: Índice de Divisão Nuclear. Dig: digoxina. X±D.P.: Média ± desvio padrão. ** (p<0,001)
e *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle negativo.
61
Tabela 15: Avaliação da antimutagenicidade de três concentrações da digoxina associadas a
MMS (400 μM) na linhagem HeLa em diferentes protocolos de tratamento.
Resultados expressos pelo número médio de MNs presentes em 1000 células binucleadas,
após 3 h de exposição em três experimentos independentes. Dig: digoxina. X ± D.P.: Média ±
desvio padrão. * (p <0,05), ** (p<0,001) e *** (p<0,0001): diferença estatística em relação ao
controle positivo.
Tabela 16: Índice de Divisão Nuclear e porcentagem de redução de danos após o tratamento
com diferentes concentrações da digoxina associada a MMS na linhagem HeLa.
IDN: Índice de Divisão Nuclear. Dig: digoxina. X±D.P.: Média ± desvio padrão. ***
(p<0,0001): diferença estatística em relação ao controle negativo.
Para o agente mutagênico MMS, a digoxina apresentou uma ação protetora para
ambas as linhagens no pré-tratamento. Sendo que, nos demais protocolos de tratamentos
houve tanto redução da taxa de células com MNs quanto da taxa de divisão celular seletiva
para as células HeLa. Portanto, a diminuição da frequência de células binucleadas
micronucleadas pode estar envolvida com um efeito tóxico e não antimutagênico.
É relatado que compostos extraídos de plantas podem modular a atividade genotóxica
de drogas anticâncer e assim reduzir efeitos colaterais (SIDDIQUE et al., 2009). Em todos os
tratamentos a atividade atimutagênica da digoxina foi dose dependente. A redução de dano foi
observada entre 24,46 – 92,00% quando comparado ao controle positivo. Dependendo do
62
protocolo de exposição, pode-se observar que nessas condições experimentais adotadas, como
concentrações do fármaco e protocolos de tratamentos, a redução de danos foi bastante
significativa. Houve um percentual de inibição superior a 60%, sendo considerado um agente
antimutagênico forte de acordo com classificação presente na literatura (NEIGI,
JAYAPRAKASHA, JENA, 2003).
Compostos antigenotóxicos e antimutagênicos podem ser usados para prevenir o
desenvolvimento do câncer induzidos pela ação de agentes clastogênicos e/ou aneugênicos.
Os compostos podem exibir a ação quimiopreventiva protegendo as células do estresse
oxidativo, melhorando os sistemas de reparação do DNA ou interagindo diretamente com o
DNA, evitando quebras cromossômicas (BERNI et al., 2012).
Assim, podemos discutir os resultados encontrados neste ensaio através do
conhecimento a respeito dos mecanismos de ação dos agentes antimutagênicos, os quais são
classificados em dois processos maiores, denominados desmutagênese e bioantimutagênese.
Na desmutagênese, os agentes protetores, ou antimutagênicos, atuam diretamente sobre os
compostos que induzem mutações no DNA, inativando-os química ou enzimaticamente,
inibindo a ativação metabólica de pró-mutagênicos ou sequestrando moléculas reativas. Na
bioantimutagênese, os antimutagênicos atuam sobre o processo que leva a indução de
mutações ou no reparo das lesões causadas no DNA (ANGELI et al., 2009; KADA et al.,
1978).
Em qualquer sistema-teste, o tratamento com os agentes mutagênicos, que induzem as
mutações, e com o antimutagênico, que poderá inibir o aparecimento de lesões no DNA, pode
ocorrer simultaneamente ou em momentos diferentes, por meio de pré ou pós-tratamento. Os
agentes antimutagênicos usados em tratamento simultâneo, pré-complexação ou pré-
tratamento podem atuar como agentes desmutagênicos. A efetividade do agente
antimutagênico no pós-tratamento sugere que ele esteja atuando pelo mecanismo de
bioantimutagênese e está relacionado ao processo de reparo das mutações.
Com base nos resultados obtidos neste estudo, a digoxina teve uma possível ação
desmutagênica pois, foi evidenciado uma redução de danos no DNA das células nos
tratamentos simultâneo, pré-complexação e pré-tratamento (Tabelas 17 e 18). E ainda, as
alterações na composição iônica intracelular têm sido sugeridas como um determinante
principal que conduz à neutralização dos efeitos de alguns agentes quimioterapêuticos
(LAWRENCE, 1988).
63
Tabela 17: Ação antimutagênica dos diferentes protocolos de tratamentos com digoxina
associada aos mutágenos MMC, DOX e MMS na linhagem CHO-K1.
Dig: digoxina. +: ação antimutagênica positiva. –: ação antimutagênica negativa.
Tabela 18: Ação antimutagênica dos diferentes protocolos de tratamentos com digoxina
associada aos mutágenos MMC, DOX e MMS na linhagem HeLa.
Dig: digoxina. +: ação antimutagênica positiva. –: ação antimutagênica negativa.
A administração de agentes anticâncer com menor toxicidade contra células saudáveis
para sensibilizar as células tumorais para a radioterapia é uma estratégia promissora. Foi
identificada uma condição na qual GCs podem desempenhar um papel importante como
agentes quimioadjuvante que seria sua combinação com terapia de radiação. Estudos
anteriores evidenciaram a capacidade de digitoxina em aumentar a sensibilidade de linhagens
de células de câncer de mama para a radioterapia (CERELLA et al., 2013).
Além disso, os GCs são capazes de potencializar também os efeitos de
quimioterápicos. A ação da oxaliplatina foi potencializada por digitoxina em células
cancerígenas do cólon humano e por bufalina no carcinoma hepatocelular (GAO et al., 2012).
64
A digoxina, por sua vez, já está sendo avaliada como um adjuvante de quimioterápicos em
estudo clínico de fase I para tratamento de câncer de mama (digoxina + lapatinibe) e em fase
II para carcinoma de pulmão de não pequenas células (digoxina + erlotinibe)
(CLINICALTRIALS, 2015b; CLINICALTRIALS, 2015c).
As subunidades α1 são os sítios de ligação dos GCs e foram descritas por serem sobre-
expressas em uma quantidade significativa em células cancerosas como de melanoma,
glioblastoma, câncer renal e de pulmão. A inibição da Na, K-ATPase por GCs parece ser uma
abordagem quimioterápica promissora, uma vez que vários membros dessa classe exerceram
atividade anticâncer em linhagens celulares quimiossensíveis, bem como multi-resistente
(ZEINO et al., 2015).
In vivo os GCs, incluindo a digoxina, foram identificados como inibidores da tradução
da proteína HIF-1α (fator 1 induzível por hipóxia) e da expressão do RNAm de HIF-2α (fator
2 induzível por hipóxia) de células cancerosas. Inibidores de HIF bloqueiam a expressão de
múltiplos fatores pró-angiogênicos, incluindo VEGF (fator de crescimentos endotelial
vascular), SDF-1 (fator derivado do estroma-1) e fator de células estaminais. A digoxina foi
relatada por dimunuir o crescimento de xenoenxertos de tumor, como também inibir, dentro
de uma semana, o crescimento de tumores já estabelecidos. Quando houve a expressão
forçada de HIF-1α por transfecção a digoxina não foi mais capaz de inibir o crescimento
celular, demonstrando que o HIF-1 é um dos alvos fundamentais da digoxina para a terapia do
câncer in vivo (ZHANG et al., 2008; BOURSI et al., 2014; MASOUD; LI, 2015).
O estado proliferativo das células também foi verificado a partir do Índice de Divisão
Nuclear, sendo esse um parâmetro importante na verificação da influência dos diferentes tipos
de tratamentos na divisão celular mitótica. O menor valor possível dessa análise é de 1,0, o
que representa que nenhuma das células em cultura se dividiu ou teve a citocinese bloqueada,
estando, portanto, todas mononucleadas. Caso todas as células venham a completar um ciclo
de divisão celular e, assim, estando binucleadas, o IDN será 2,0 (FENECH, 2000). Ainda
segundo Fenech (2007), para a análise dos MNs o percentual de células binucleadas ideal
deve ser superior a 35% (IDN>1,3), sendo este também um bom parâmetro para verificar a
influência na divisão celular mitótica.
No presente estudo observou-se que em certos protocolos de tratamento da digoxina
com o mutágeno houve redução da proliferação celular apenas para a linhagem tumoral HeLa,
sendo que em alguns casos o IDN ficou abaixo de 1,3. Isto pode ser explicado pelo fato de
que a linhagem HeLa ser mais quimiossensível a digoxina se comparada a CHO-K1, como foi
evidenciado pelos resultados anteriores.
65
Os GCs, inclusive a digoxina, podem afetar o crescimento de células, controlando o
metabolismo celular por perturbar a produção de ATP (trifosfato de adenosina). O aumento da
concentração intracelular de Na+ após a inibição de Na, K-ATPase, promove a atividade do
trocador de Na+/Ca2+ da mitocôndria, por conseguinte, leva a diminuição de cálcio
mitocondrial. Este, por sua vez, afeta a atividade de várias enzimas mitocondriais dependentes
de Ca2+ envolvidas na cadeia energética para produção de ATP. Isto causa uma queda de
NADH que pode levar à geração de EROs (KOHLHAAS et al., 2010), os quais estão
envolvidos com processos que induzem a morte celular.
E ainda, foi levantada a hipótese de que GCs poderiam afetar o metabolismo de
células cancerosas através da alteração do fluxo glicolítico em que a atividade e expressão de
enzimas glicolíticas seriam afetadas pelo desbalanço iônico causado pela inibição de Na, K-
ATPase (LOPEZ-LAZARO, 2007). Esta hipótese prevê também um forte argumento para a
seletividade de GCs para células cancerosas, que possuem uma demanda maior por glicose se
comparadas a células saudáveis com metabolismo normal (LEVINE; PUZIO-KUTER, 2010).
Além disso, um crescente número de estudos evidencia que a desregulação do pH
intracelular é um mecanismo adicional no combate a células derivadas de câncer (WEBB et
al., 2011). As células cancerosas apresentam um aumento do pH intracelular (≥7,4) versus um
pH extracelular reduzido (6,7-7,1) em comparação com células normais. Acredita-se que esta
condição está relacionada com o favorecimento de algumas características do câncer, como a
proliferação celular desregulada e resistência à apoptose. Apesar de sua maior atividade
metabólica e do alto consumo de glicose, as células de câncer não são submetidas a uma
acidificação. Em vez disso, a diminuição do pH é cuidadosamente evitada para manter um
fenótipo maligno por meio de mudanças nos padrões do gene e/ou expressão da proteína
(LOPEZ-LAZARO, 2007; WEBB et al., 2011).
Consequentemente, as condições que promovam a acidificação dessas células estão
sendo consideradas como uma potencial estratégia anticâncer. Especulou-se que as alterações
no Na+ intracelular, produzido pela inibição de Na, K-ATPase, podem alterar a função de
Na+/H+, por conseguinte, conduzir a acidificação intracelular (LOPEZ-LAZARO, 2007).
Sabe-se que muitos compostos químicos que apresentam atividades mutagênicas e
carcinogênicas, dependendo das condições experimentais, como do tipo celular ou protocolos
de tratamento, podem também exercer atividades antimutagênicas e anticarcinogênicas (VON
BORSTEL; HIGGINS, 1998; ZEIGER et al., 2003). Isto foi observado para o fármaco
digoxina, no qual sua ação foi diferente de acordo com a concentração, com a linhagem
celular (normal e tumoral) como também com os protocolos de tratamentos. Disso, pode-se
66
concluir que a prática corrente de identificação de antimutágenos e anticarcinógenos por suas
atividades contra químicos específicos em sistemas de testes específicos não é o suficiente
para sustentar a conclusão que a mesma substância será similarmente ativa em outros sistemas
(ZEIGER, 2003). Portanto, se faz necessário estudo também em sistemas vivos a fim de
determinar os reais mecanismos de proteção ao DNA e os benefícios da utilização da digoxina
em um tratamento do câncer.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Considerando o objetivo de avaliar in vitro a atividade mutagênica e antimutagênica
da digoxina contra os danos induzidos por diferentes mutágenos, os resultados obtidos
permitiram as seguintes conclusões:
- A digoxina apresentou citotoxicidade seletiva para a linhagem tumoral HeLa em
concentrações 100 vezes maiores que a terapêutica.
- Uma ação mutagênica do fármaco foi identificada para as células HeLa em concentrações
400 vezes menor que as observadas para CHO-K1, mostrando que a linhagem tumoral foi
muito mais sensível à ação da digoxina.
- A digoxina afetou de maneira específica a proliferação celular da linhagem tumoral em
concentrações relativamente baixas, ou seja, aproximadamente 200 vezes menor que a
primeira dose capaz de reduzir o IDN de CHO-K1.
- De maneira geral, uma ação antimutagênica da digoxina foi observada predominantemente
no protocolo de pré-tratamento, na maior concentração da digoxina (3nM), contra todos os
agentes mutagênicos analisados.
- Com exceção do MMS, no pós-tratamento não foi observado um efeito protetor ou
potencializador da ação dos mutágenos, em nenhuma das concentrações analisadas do
fármaco digoxina.
- Dentre os mutágenos estudados, apenas contra a MMC a digoxina foi capaz de proteger o
material genético, de ambas as linhagens celulares, em três protocolos de tratamentos distintos
(pré-complexação, simultâneo e pré-tratamento).
67
- No protocolo de tratamento de pré-complexação, a concentração de 1,5 nM da digoxina
apresentou uma ação protetora contra os danos causados pela MMC para a linhagem normal e
ainda diminuiu a taxa mitótica das células cancerosas.
- No tratamento simultâneo e de pré-complexação com DOX, a menor concentração da
digoxina potencializou, de maneira seletiva, os efeitos tóxicos do quimioterápico ao aumentar
os danos genéticos e reduzir o índice mitótico de HeLa.
- Em todos os protocolos de tratamento, exceto no pré-tratamento, a digoxina aumentou os
efeitos tóxicos do mutágeno MMS especificamente na linhagem tumoral.
- O mecanismo antimutagênico da digoxina pode ser por desmutagênese pois, o efeito
protetor foi observado apenas nos tratamentos anteriores a indução de danos: simultâneo, pré-
complexação e pré-tratamento.
Diante do exposto, a digoxina se mostra um potencial fármaco a ser utilizado na
terapia do câncer tanto na prevenção, a partir da ação quimiopreventiva, quanto no
tratamento, atuando como um adjuvante de quimioterápicos já estabelecidos.
Portanto, o presente estudo contribuiu para um maior esclarecimento da capacidade
mutagênica e antimutagênica do fármaco digoxina, além de sua ação sobre o ciclo celular.
Essa ação protetora ou potencializadora de quimioterápicos pode representar um risco ou uma
vantagem, dependendo da abordagem em um tratamento anticâncer, reforçando a necessidade
de estudos adicionais.
8. PERSPECTIVAS
- Avaliar a ocorrência da formação de complexos entre a digoxina e os mutágenos (MMC,
DOX e MMS) através da Espectrometria de Massas.
- Verificar a possível atividade genotóxica das concentrações próximas a terapêutica da
digoxina, empregando o teste do cometa.
- Caracterizar a atividade mutagênica (clastogênese ou aneugênese) da digoxina a apartir do
uso de anticorpos anti-cinetócoro no teste do Micronúcleo.
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