UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI – UFSJ

CAMPUS CENTRO OESTE DONA LINDU – CCO

PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E

BIOLOGIA MOLECULAR

KAMILLA MONTEIRO DOS SANTOS

Estudos in vitro e in vivo da atividade de extratos de Bauhinia

sobre o desenvolvimento tumoral

Divinópolis 2017

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI – UFSJ

CAMPUS CENTRO OESTE DONA LINDU – CCO

PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E

BIOLOGIA MOLECULAR

KAMILLA MONTEIRO DOS SANTOS

Estudos in vitro e in vivo da atividade de extratos de Bauhinia

sobre o desenvolvimento tumoral

Tese apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de São João Del Rei, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor. Orientadora: Profa. Dra. Rosy Iara Maciel Azambuja Ribeiro. Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Luiza Vilela Oliva.

Divinópolis 2017

FOLHA DE APROVAÇÃO

AGRADECIMENTOS

Este trabalho é resultado de contribuições de inúmeras pessoas que

colaboraram direta ou indiretamente de forma fundamental para a sua construção.

Consciente de que é impossível listar todos que acrescentaram conhecimentos e

experiências essenciais, que tornaram possível a execução deste trabalho e que ao

decorrer dos anos engradeceram minha profissão e maneira de ver o mundo, preciso

expressar meu agradecimento à:

Minha orientadora Profa. Dra. Rosy Iara Maciel de Azambuja Ribeiro, por

depositar sua confiança em mim e me proporcionar oportunidades e aprendizados que

realmente mudaram a minha vida. À minha co-orientadora Profa. Dra. Maria Luiza

Vilela Oliva, pelas contribuições intelectuais e práticas, me recebendo em seu

laboratório para a execução de parte do trabalho. Aos componentes das bancas de

qualificação Profa. Dra. Hérica de Lima Santos, Prof. Dr. Hélio Batista Santos, e Prof.

Dr. Renato J. S. Oliveira e aos componentes da banca de defesa da tese Prof. Dr.

Geovanni Dantas Cassali, Profa. Dra. Maria Lucia Zaidan Dagli, Profa. Dra. Miriam

Teresa Paz Lopes e Prof. Dr. Rui Manuel Vieira Reis pelas tão valiosas sugestões.

Aos meus colegas do Laboratório de Patologia Experimental (Lapatex), pela

convivência diária e amizade construída ao longo dos anos. Muitos já não trabalham

mais lá, terminaram suas dissertações e TCCs, outros, permaneceram na “Família

Lapatex” e foi maravilhoso podermos crescer juntos. Por me auxiliarem com suas

experiências e contribuírem com o meu crescimento pessoal, e pela amizade, quero

expressar meu agradecimento à Damiana Nunes, Gabriela Francine, Izabela Faria,

Natália Ribeiro, Flavia Medeiros, Aline Coelho, Gabriela Alves, Tamara Longatti,

Carolina Correa, Leonardo Matos, Karini Avelar, Natane Carvalho, Stephanie Corsino,

Alessandra Sousa, Caio Baeta, Thais Barbosa, Bruna Pimenta, Lohanna França,

Lucas Azevedo, Patrik Vital, Ana Gabriela, Mylane Matos, Gilvânia Rabelo, Lorena

Raspanti, Maria Juliana Passos, Edilene Santos Elias Raad, Luís Ribeiro e José

Antônio. Também agradeço ao Programa Multicêntrico de Pós Graduação em

Bioquímica e Biologia Molecular, por me proporcionar a conclusão de um sonho, me

sinto honrada em compor a primeira turma de Doutores deste programa.

Um trabalho com tantas técnicas executadas somente foi possível graças às

instituições parcerias que eu gostaria de agradecer: ao laboratório de Petroleômica e

Forense da Universidade Federal do Espírito Santo, no qual foi realizado a

espectrometria de massas, coordenado pelo Prof. Dr. Wanderson Romão, e suas

alunas Fernanda Endringer e Heloá Santos, por me acolher e ensinar a interpretação

dos gráficos. Ao Laboratório de Oncologia Molecular do Hospital do Câncer de

Barretos, coordenado pelo Prof. Dr. Rui Reis e ao Biologista responsável pela cultura

de células Prof. Dr. Renato J. S Oliveira, por realizar os experimentos com as células

de mama humanas e pelos testes de Western Blot, além das inúmeras dicas e

sugestões de ambos. À Universidade Federal de São Paulo, em especial à minha Co-

orientadora Profa. Dra. Maria Luiza Vilela Oliva e seus alunos Fabricio Pereira Batista

e Nathalia Neto por me receberem em seu laboratório para a realização de parte dos

testes e pela amizade construída em tão poucos dias. Também quero agradecer aos

professores da Universidade Federal de São João del Rei, que de alguma forma me

auxiliaram nessa caminhada, sendo em parceria com uso de equipamentos ou

compartilhamento de experiências: Prof. Dr. Rafael Chagas, Prof. Dr. Hélio Batista,

Prof. Dr. Ralph Thomé e Profa. Dra. Danyelle Rios. Além destes gostaria de agradecer

aos técnicos de laboratório e funcionários da Pós-graduação que sempre me

auxiliaram quando necessário.

Por fim, quero deixar o meu agradecimento especial aos meus familiares que

foram o meu apoio emocional durante essa caminhada, entenderam as minhas

ausências, inclusive nos fins de semana, e sempre estiveram ao meu lado me

incentivando a seguir em frente. Eles são os meus alicerces e minhas inspirações,

deixo o meu agradecimento, amor incondicional e dedico esse trabalho à: Alisson de

Sousa Dias, Keila Monteiro Barbosa, Daniella Barbosa Monteiro dos Santos, Antônio

Anacleto dos Santos Neto, Antônio Marcio dos Santos e Venuza Monteiro Barbosa.

Obrigada Deus, por mais essa conquista e por guiar a minha vida sempre!

RESUMO Entre os tipos de câncer existentes, o câncer de mama tem se destacado por ser o mais comum entre as mulheres e o segundo tipo mais prevalente em toda a população. A principal causa de morte de pacientes com câncer de mama é devido a metástase, que para ocorrer, necessita da remodelação do microambiente tumoral. Assim, é evidente a importância da busca por novas fontes de terapias antitumorais e antimetastáticas, que muitas vezes têm sido encontradas no reino vegetal. O gênero Bauhinia é amplamente utilizado na medicina tradicional como antidiabético e agente antioxidante. Neste trabalho, foram avaliadas as atividades antitumoral e antimetastática das frações ID7, IA19, IID10 e IIIA32, produzidas a partir dos caules de três espécies de Bauhinia sobre a linhagem de câncer de mama murino 4T1. Estas frações apresentaram 100% de inibição de metaloproteinases de matriz (MMP-2 e MMP-9) em estudo prévio. A viabilidade celular foi avaliada utilizando MTT, vermelho neutro e azul de tripano, em 24, 48 e 72 horas de tratamento, nas concentrações de 5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL sobre 4T1 e carcinoma cervical humano (HeLa). Em seguida foram determinadas as seletividades das frações pelas linhagens tumorais. Assim, com os valores de IC50 e tempos de tratamento obtidos pelo ensaio de MTT, foram realizados os testes de migração celular por fechamento de ferida e Boyden chamber, invasão celular usando Matrigel e adesão celular. Também foram quantificadas as células em apoptose por fluorescência. As gelatinases e o óxido nítrico presentes no sobrenadante das células 4T1 foram quantificados por zimograma e por quimioluminescência, respectivamente. A fração mais seletiva foi escolhida para avaliar os demais ensaios, como a expressão das proteínas de via de morte celular PARP, caspase-7 e caspase-8 por western blot. Também foi avaliada a atividade da fração mais seletiva sobre linhagens tumorais de câncer de mama humano BT-20, MDA-MB-231 e MCF-7 por MTS. Também foi avaliada a ação desta fração sobre camundongos inoculados com 4T1. Foram realizadas análises histológicas dos tumores primários, fígados e pulmões extraídos dos animais. A fração mais seletiva foi caracterizada por espectrometria de massa (MS-ESI-). As frações estudadas diminuíram a viabilidade das linhagens 4T1 (IC50 ID7: 23,47; IA19 33,7; IID10 11,19; IIIA32 82,31) e HeLa (IC50 ID7 23,02; IA19 55,59 e IID10 31,85) pelo método usando MTT (72h). ID7 foi a mais seletiva (IS 2,27 e 1,84 quando avaliada sobre esplenócitos murinos e leucócitos mononucleares humanos). Além disso, todas as frações testadas diminuíram a viabilidade de membrana das células 4T1 pelo método usando azul de tripano (IC50<5; 72h). Todas as frações utilizadas aumentaram apoptose tardia (>30%, p=0,0324), diminuíram a porcentagem de células viáveis (>50% p=0,0002) e inibiram a migração das células 4T1 pelo ensaio de fechamento de ferida (>60%, p=0,0001). Todas as frações também aumentaram a adesão das células 4T1 aos componentes da membrana basal (>60%, p=0,0001), além de diminuir a presença de gelatinases ativas secretadas (>75% p<0,005). As frações IID10 e IA19 inibiram a migração pelo ensaio Boyder chamber, (65% e 76%, p=0,0027) e ID7, IID10 e IIIA32 diminuíram a invasão celular (55%, 50%, 52%, p=0,001). O tratamento com ID7 aumentou a expressão de PARP (100%, p=0,001), caspase-7 (300%, p=0,001) e caspase-8 (100%, p=0,001) e se mostrou seletivo para a linhagem de câncer de mama triplo negativo (CMTN) MDA-MB-231 (IC50 10,2 µg/mL). No ensaio in vivo com camundongos inoculados com 4T1, ID7 diminuiu o volume (20%, p=0,0204) e peso (35%, p=0,0354) dos tumores coletados e diminuiu a metástase pulmonar (40%, p=0,0239). Além disso ID7 aumentou a área de necrose (32%, p= 0,0031) dos tumores

e diminuiu a inflamação no fígado (60%, p=0,001). A caracterização por MS-ESI- evidenciou principalmente ácidos graxos, um flavonoide e um diterpeno na constituição de ID7. Assim, constatou-se que as frações de Bauhinia testadas, em especial a fração ID7, apresentam atividade antitumoral seletiva e sobre vários mecanismos da metástase do câncer de mama in vitro. Sugere-se que as classes de ácidos graxos, flavonoides e diterpernos estejam correlacionados com tais atividades. Palavras-chave: câncer de mama triplo negativo, plantas medicinais, metástase,

viabilidade celular, 4T1.

ABSTRACT Among the existent cancer types, breast cancer has been highlighted as being more

common among women and the second most prevalent type in the entire population.

The main cause of death of cancer patients is due to metastasis, which requires the

remodeling of the tumor microenvironment. Thus, the importance of the search for new

sources of antitumor and antimetastatic therapies, which have often been found in the

plant kingdom, is evident. The genus Bauhinia is widely used in traditional medicine as

antidiabetic and antioxidant agent. In this work the antitumor and antimetastatic

activities of ID7, IID10, IA19 e IIIA32 fractions of the stems of three species of Bauhinia

on the murine breast cancer line 4T1. These fractions showed 100% inhibition of matrix

metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9) in a previous study. Cell viability was

assessed by the MTT assays, neutral red and trypan blue at 24, 48 and 72 hours of

treatment at 5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL concentrations, on 4T1 and human cervical

carcinoma. Then, the selectivity of the fractions by the tumor lines was determined.

Thus, with the IC50 values and treatment time obtained by this assay, cell migration

tests by wound closure and Boyden chamber, invasion using Matrigel and cell

adhesion were performed. Also, they were quantified the apoptotic cell by fluorescence

assay. Gelatinases and nitric oxide present in the supernatant of 4T1 cells were also

quantified. The most selective fraction was chosen to evaluate the other assays, such

as the expression of PARP, caspase-7 and caspase-8 cell death pathway proteins by

western blot. It was also evaluated the activity of the most selective fraction on BT-20,

MDA-MB-231 and MCF-7 human breast cancer tumor lines, by MTS, and on mice

inoculated with 4T1. Histological analyzes of the tumors, livers and lungs extracted

from the animals were performed. The most selective fraction was characterized by

MS-ESI- spectrometry. The fractions studied reduced the 4T1 viability (IC50 ID7: 23,47;

IA19 33,7; IID10 11,19; IIIA32 82,31) and HeLa (IC50 ID7 23,02; IA19 55,59 and IID10

31,85), by MTT assay. The fractions increased late apoptosis (>30%, p=0,0324),

decreased the percentage of viable cells (>50% p=0,0002) and inhibited the 4T1

migration by the wound closure assay (>60%, p=0,0001). All fractions increased the

4T1 adhesion to basement membrane components (>60%, p=0,0001), in addition to

decreasing the presence of secreted active gelatinases (>75%, p= 0,005). IID10 and

IA19 fractions inhibited migration by the Boyder Chamber assay (65% e 76%,

p=0,0027), and ID7, IID10 and IIIA32 decreased invasion cell (55%, 50%, 52%,

p=0,0001). Treatment with ID7 increased the expression of PARP (100%, p=0,001),

caspase-7 (300%, p=0,001) and caspase-8 (100%, p=0,001) and was selective for the

MDA-MB-231, triple negative breast cancer lineage (IC50 10,2 µg/mL). In the in vivo

assay with mice inoculated with 4T1, ID7 decreased the volume (20%, p=0,0204) and

weight (35%, p=0,0354) of the tumors after withdrawn and decreased lung metastasis

(40%, p=0,0239). In addition, ID7 increased the necrosis area of tumors (32%, p=

0,0031) and decreased the inflammation in the liver (60%, p=0,001). The

characterization showed mainly fatty acids, flavonoid and diterpene in the ID7

constitution. Thus, it was found that the Bauhinia fractions tested, especially the ID7

fraction, exhibit selective antitumor on various mechanisms of breast cancer

metastasis activity. It is suggested that fatty acids, flavonoids and diterpenes are

correlated with such activities.

Keywords: triple negative breast cancer, medicinal plants, metastasis, cell viability,

4T1.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................16

1.1 CÂNCER….......................................................................................................16

1.2 METÁSTASE...................................................................................................19

1.3. CANCER DE MAMA........................................................................................22

1.4 CLASSIFICAÇAO DOS TUMORES DE MAMA X TERAPIA DEPENDENTE..23

1.5 PRINCIPAIS TRATAMENTOS DO CÂNCER ..................................................24

1.6 PESQUISAS ENVOLVENDO O CÂNCER: O USO DE LINHAGENS

CELULARES....................................................................................................26

1.7 O USO DE PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DO CÂNCER...........27

1.8 O GÊNERO BAUHINIA....................................................................................29

2 OBJETIVOS............................................................................................................33

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................................33

3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................34

3.1 DESENHO EXPERIMENTAL...........................................................................34

3.2 AMOSTRAS.....................................................................................................34

3.3 OBTENÇÃO DE EXTRATOS BRUTOS E PARTIÇÕES..................................35

3.4 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA................................................36

3.5 CROMATOGRAFIA EM COLUNA POR GRAVIDADE....................................36

3.6 CÉLULAS TUMORAIS E CONDIÇÕES DE CULTURA..................................37

3.7 OBTENÇÃO DE LEUCÓCITOS MONONUCLEARES HUMANOS.................38

3.8 OBTENÇÃO DE ESPLENÓCITOS MURINOS................................................39

3.9 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR....................................................39

3.9.1 Viabilidade celular pelo método usando o MTT................................39

3.9.2 Viabilidade celular pelo método usando o azul de tripano................40

3.9.3 Viabilidade celular pelo método usando o vermelho neutro.............41

3.9.4 Índice de seletividade...........................................................................42

3.10 MORFOLOGIA E MORTE CELULAR USANDO FLUORESCÊNCIA...........42

3.11 MIGRAÇÃO CELULAR PELO ENSAIO DE FECHAMENTO DE FERIDA.....43

3.12 ENSAIO DE MIGRAÇÃO USANDO INSERTOS BOYDER CHAMBER.........44

3.13 ENSAIO DE INVASÃO...................................................................................46

3.13.1 Montagem dos insertos......................................................................46

3.13.2 Fixação das células............................................................................47

3.13.3 Coloração.............................................................................................47

3.14 ENSAIO DE ADESÃO CELULAR..................................................................48

3.15 ANÁLISE DE GELATINASES NO SOBRENADANTE CELULAR................49

3.15.1 Coleta do sobrenadante.....................................................................49

3.15.2 Zimograma..........................................................................................49

3.16 ANÁLISE DE ÓXIDO NÍTRICO (ON).............................................................50

3.17 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE MORTE CELULAR

POR WESTERN BLOT.................................................................................50

3.18 VIABILIDADE DE CÉLULAS DE CANCER DE MAMA HUMANO................52

3.19 ENSAIO IN VIVO...........................................................................................52

3.20 ANÁLISES HISTOLÓGICAS........................................................................54

3.21 ESPECTROMETRIA ATÔMICA DE MASSAS – ESI....................................54

3.22 ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................................55

4. RESULTADOS.......................................................................................................56

4.1 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 DIMINUEM A VIABILIDADE DAS

CÉLULAS 4T1 E HELA PELO MÉTODO USANDO MTT.....................................57

4.2 O MÉTODO USANDO AZUL DE TRIPANO DETECTOU DIMINUIÇÃO DA

VIABILIDADE DAS CÉLULAS 4T1 QUANDO TRATADAS COM AS

FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10...........................................................................62

4.3 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 NÃO ATINGEM IC50 NO

TRATAMENTO DAS CÉLULAS 4T1 ATRAVÉS DO ENSAIO USANDO

VERMELHO NEUTRO...................................................................................64

4.4 AS FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10 DIMINUEM A VIABILIDADE DAS CÉLULAS

4T1 COM IC50 MAIS BAIXOS PELO MÉODO USANDO AZUL DE

TRIPANO.........................................................................................................68

4.5 A FRAÇÃO ID7 É A MAIS SELETIVA SOBRE A VIABILIDADE DAS

CÉLULAS TUMORAIS.....................................................................................69

4.6 AS FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10 INDUZEM APOPTOSE TARDIA E

MODIFICAM A MORFOLOGIA CELULAR.......................................................70

4.7 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A MIGRAÇÃO DE

CÉLULAS 4T1 IN VITRO..................................................................................72

4.8 AS FRAÇÕES ID7, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A INVASÃO DE CÉLULAS 4T1

IN VITRO...........................................................................................................75

4.9 AS FRAÇÕES ID7, ID19, IID10, E IIIA32 AUMENTAM A ADESÃO DE

CÉLULAS 4T1 À MOLÉCULAS DA MATRIZ EXTRACELULAR, IN VITRO......77

4.10 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A PRESENÇA DE

GELATINASES ATIVAS NO SOBRENADANTE CELULAR.........................78

4.11 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 NÃO ALTERARAM A LIBERAÇÃO

DE OXIDO NÍTRICO DE CÉLULAS 4T1 IN VITRO........................................79

4.12 ID7 ATUA SOBRE A MORTE CELULAR PELA VIA EXTRÍNSICA................79

4.13 ID7 É SELETIVO PARA LINHAGEM DE CANCER DE MAMA

MDA-MB-231..................................................................................................81

4.14 A FRAÇÃO ID7 INIBIU O CRESCIMENTO TUMORAL E A PERDA DE PESO

DE ANIMAIS INOCULADOS COM 4T1..........................................................81

4.15 ID7 DIMINUIU O VOLUME E O PESO DO TUMOR 4T1 RETIRADO DO

ANIMAL..........................................................................................................82

4.16 ID7 DIMINUIU A ÁREA DE NECROSE DOS TUMORES...............................83

4.17 ID7 DIMINUIU A METÁSTASE PARA OS PULMÕES....................................85

4.18 ID7 DIMINUI OS FOCOS DE INFILTRADO INFLAMATÓRIO NOS

FÍGADOS........................................................................................................87

4.19 CARACTERIZAÇÃO DE CONSTITUINTES DA FRAÇÃO ID7......................89

5 DISCUSSÃO...........................................................................................................91

6 CONCLUSÃO........................................................................................................104

ANEXO 1..................................................................................................................105

ANEXO 2..................................................................................................................109

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………..……………………………..110

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Papéis das MMPs na progressão do câncer...............................................18

Figura 2: Incidência de novos casos de câncer de mama no ano de 2012.................20

Figura 3: B. variegata: A: esxicata; B: flor de B. variegata; C: flor de B. variegata

cândida.......................................................................................................................28

Figura 4: B. ungulata: A: esxicata; B: árvore; C: flor..................................................29

Figura 5: Separação de leucócitos mononucleares humanos..................................36

Figura 6: Esquema de produção de ferida para ensaio de migração usando células.41

Figura 7: Inserto Boyden Chamber para ensaio de migração....................................42

Figura 8: Inserto Boyden Chamber com Matrigel para ensaio de invasão.................44

Figura 9: Camundongo com tumor de células 4T1 induzido no flanco esquerdo.......49

Figura 10: Viabilidade de células tumorais tratadas com ID7, através do teste usando

MTT............................................................................................................................55

Figura 11: Viabilidade de células tumorais tratadas com IA19, através do teste usando

MTT............................................................................................................................56

Figura 12: Viabilidade de células tumorais tratadas com IID10, através do teste

usando MTT................................................................................................................57

Figura 13: Viabilidade de células tumorais tratadas com IIIA32, através do teste

usando MTT................................................................................................................58

Figura 14: Viabilidade de células 4T1 tratadas com ID7, através do teste usando azul

de tripano....................................................................................................................59

Figura 15: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IA19, através do teste usando azul

de tripano....................................................................................................................60

Figura 16: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IID10, através do teste usando

azul de tripano............................................................................................................60

Figura 17: Viabilidade de células 4T1 tratadas com ID7, através do teste usando

vermelho neutro..........................................................................................................61

Figura 18: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IA19, através do teste usando

vermelho neutro..........................................................................................................62

Figura 19: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IID10, através do teste usando

vermelho neutro..........................................................................................................63

Figura 20: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IIIA32, através do teste usando

vermelho neutro.........................................................................................................64

Figura 21: Viabilidade das células 4T1 tratadas com as frações de Bauhinia, a partir

do teste de fluorescência............................................................................................66

Figura 22: Ensaio de migração por fechamento de ferida de células

4T1.............................................................................................................................68

Figura 23: Ensaio de migração Boyden Chamber de células 4T1..............................69

Figura 24: Ensaio de invasão Boyden Chamber de células 4T1.................................70

Figura 25: Porcentagem de células 4T1 viáveis aderidas aos componentes colágeno

I, colágeno IV, fibronectina e laminina........................................................................72

Figura 26: Gelatinases ativas presentes no sobrenadante de células 4T1 tratadas com

as frações de Bauhinia...............................................................................................73

Figura 27: Teor de óxido nítrico presente no sobrenadante de células 4T1 tratadas

com as frações de Bauhinia........................................................................................73

Figura 28: Expressão das proteínas de vias de morte celular em células 4T1 tratadas

com ID7 e Cisplatina...................................................................................................74

Figura 29: Viabilidade de linhagens de câncer humano tratadas com ID7, através do

teste usando MTT.......................................................................................................75

Figura 30: Crescimento tumoral e peso, do tumor 4T1 em

camundongos.............................................................................................................76

Figura 31: Volume e peso dos tumores extraídos dos camundongos inoculados com

células 4T1.................................................................................................................77

Figura 32: Análise de necrose em tumores 4T1 extraídos de camundongos tratados

com ID7 e grupo controle............................................................................................78

Figura 33: Pulmões extraídos de animais inoculados com 4T1..................................80

Figura 34: Análise de metástases pulmonares dos camundongos com 4T1 do grupo

controle e tratados com ID7........................................................................................80

Figura 35: Análise de infiltrado inflamatório nos fígados de camundongos com tumor

4T1 tratados com ID7 e grupo controle.......................................................................82

Figura 36: Perfil de ID7 por espectrometria de massas MS-ESI- com os sinais de maior

intensidade.................................................................................................................83

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Nomenclatura dos extratos de Bauhinia................................................34

TABELA 2 - Índice de seletividade de frações de Bauhinia à células tumorais e não

tumorais......................................................................................................................65

TABELA 3 - Índice de seletividade de frações de Bauhinia às células tumorais em

72 horas de tratamento..............................................................................................65

TABELA 4 - Moléculas identificadas por MS-ESI na fração ID7 de Bauhinia...........84

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ATP – Adenosina Tri-Fosfato

BME – Extrato de Membrana Basal

BSA – Albumina de Soro Bovina

cis-DDP – Cisplatina

CBDCA – Carboplatina

CCD – Cromatografia em Camada Delgada

CMTN – Câncer de Mama Triplo Negativo

CRC1 – Câncer de Colo-Retal tipo 1

CRC 5 – Câncer de Colo-Retal tipo 2

DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

IC50 – Concentração inibitória mínima

INCA – Instituto Nacional do Câncer

IS – Índice de Seletividade

LA - laranja de acridina

MMPs – Metaloproteinases de Matriz

MMP-2 - Metaloproteinase 2

MMP-9 – Metaloproteinase 9

MEC- Matriz Extracelular

MTT - (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolio).

MTS - 2-[(5-Fluoresceinyl)aminocarbonyl]ethyl methanthiosulfonate

EROs – Espécies reativas de oxigênio

SFB – Soro Fetal Bovino

s/p - estreptomicina/penicilina

PBS - phosphate buffered solution

IP - iodeto de protídeo

ON – Óxido Nítrico

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 CÂNCER

O termo câncer é a tradução latina da palavra grega carcinoma (de karkinos =

crustáceo, caranguejo). Este termo foi usado pioneiramente por Galeno

(aproximadamente 138 a 201 d C.) para indicar um tumor maligno da mama no qual

as veias superficiais apresentavam formato que assemelhava às patas de um

caranguejo. Este termo generalizou-se e hoje é usado para indicar qualquer neoplasia

maligna (BRASILEIRO-FILHO, 2011).

O câncer é uma das principais causas de morte dos seres humanos e é

caracterizado como a proliferação e propagação no organismo de células

transformadas (KANNAN et al., 2016). Esta patologia ocorre devido à diferenciação

celular anormal, em que mesmo quando interrompido o estímulo, a proliferação não

cede (HANAHAN e WEINBERG, 2011). O câncer pode surgir devido a alterações no

DNA (fatores genéticos) ou em mecanismos que controlam a expressão gênica

(fenômenos epigenéticos) em um ou mais locus envolvidos no controle da divisão e

da diferenciação celulares (BRASILEIRO-FILHO, 2011). Na maioria das vezes, a

ocorrência dessas mutações acarreta a morte da célula por apoptose ou indução de

senescência. Entretanto, em alguns casos, as células conseguem sobreviver, visto

que as mutações alteram a indução da morte celular. Com isso, estas células,

eventualmente adquirem um potencial ilimitado e descontrolado de proliferação

(HANAHAN e WEINBERG, 2011).

Estima-se que 14,1 milhões de novos casos de câncer tenham ocorrido no

decorrer de um ano entre a população mundial. As avaliações indicam que estes

índices estão aumentando cada vez mais, devido ao envelhecimento da população

assim como à crescente exposição à fatores de risco como tabagismo, excesso de

peso e o sedentarismo (GLOBOCAN, 2012). Além destes fatores, o consumo de

álcool, infecções por Helicobacter pylori, hepatite B e C, contato com luz ultravioleta,

poluentes ambientais (por exemplo, metais pesados) e mutações genéticas também

são possíveis precursores do desenvolvimento do câncer (FUTREAL et al., 2004;

PARK et al., 2008).

17

Os tumores podem ser classificados de acordo com vários critérios, como por

exemplo, pelo comportamento clínico (benignos ou malignos), pelo aspecto

microscópico (critério histornorfológico) e pela origem da neoplasia (critério

histogenético). Nem sempre esses elementos são usados na denominação da lesão,

sendo comuns alguns epônirnos, corno tumor de Wilms, linfoma de Hodgkin, tumor

de Burkitt, etc. tumores invasivos ou câncer, que apresentam alta atipia celular,

necroses, degenerações, hemorragias e ulcerações, devido principalmente à

multiplicação rápida das células podendo, inclusive, gerar metástase (BRASILEIRO-

FILHO, 2011).

Existem diversos mecanismos que estão envolvidos na evolução de uma célula

normal para uma célula potencialmente maligna (HAHN e WEINBERG, 2002), muitos

desses ocorrem devido a aquisição de vantagens de crescimento e sobrevivência,

através de mudanças genéticas e epigenéticas, permitindo a expansão clonal (HE et

al., 2013). O sequenciamento do genoma do câncer indicou que a maioria dos

canceres existentes exigem pelo menos cinco mudanças genéticas para evoluir para

a patologia do tipo maligna (WOOD et al., 2007). Além disso, as células tumorais

também exibem interações cruzadas com células inflamatórias, como os macrófagos,

no microambiente do tumor (MANTOVANI et al., 2008; GRIVENNIKOV et al., 2010).

Em tecidos em inflamação crônica (devido à infecção, tabagismo ou obesidade por

exemplo) os macrófagos atuam criando um ambiente que promova aquisição celular

de hits mutacionais tumorigênicos (GRIVENNIKOV et al., 2010). Além disso, os

tumores estabelecidos também ativam essas células para auxiliar na promoção e

progressão do tumor, facilitando a angiogênese, promovendo proliferação e invasão,

e suprimindo a imuno-resistência (GUO et al., 2017).

A maioria das alterações genéticas interferem no ciclo e no metabolismo

celular. Com isso, diversos modos de ação para a busca de anti-neoplásicos envolvem

a indução da morte das células sobre estes eventos. A morte celular pode ocorrer, por

exemplo, por apoptose, que é um mecanismo regulado principalmente por duas vias

de sinalização, a intrínseca e a extrínseca. Essas vias induzem a ativação de

caspases, que por sua vez desencadeiam as alterações celulares que caracterizam a

apoptose, como quebra da membrana nuclear, hipercondensação da cromatina e

degradação proteolítica das estruturas nucleares e citoplasmáticas (PARRISH et al.,

2013). Uma vez que a alteração dos processos de proliferação celular e a supressão

da apoptose constituem suporte para a progressão neoplásica comum a todos os tipos

18

de câncer, estas alterações metabólicas têm sido exploradas terapeuticamente no

controle e tratamento desta patologia (EVAN e VOUSDEN 2001).

Por outro lado, os quimioterápicos também podem agir por induzir necrose

tumoral. A morte celular por necrose ocorre em resposta à possíveis injúrias que as

células podem sofrer. É caracterizada morfologicamente pelo aumento citoplasmático,

ruptura da membrana plasmática e pela liberação do conteúdo extracelular. Nesse

evento ocorre um influxo descontrolado de Ca2+ que pode desencadear uma

sobrecarga mitocondrial e colapso na produção de ATP, interferindo na função da

bomba Na+/K+, levando assim à tumefação celular devido ao aumento de Na+

citosólico. Além disso, a diminuição da atividade mitocondrial, consequentemente,

interfere na ativação de capsases além de inibição de endonucleases (CURTIN et al.,

2002). Em conjunto com os demais fatores descritos, o aumento de espécies reativas

de oxigênio induzem a ruptura da membrana plasmática, com consequente indução

do extravasamento do conteúdo celular, sinalizando a migração e ativação de

resposta inflamatória do sistema imune (MCCONKEY, 1998).

Outro mecanismo de indução de morte de células tumorais é a autofagia. Esse

evento, que ainda não está totalmente elucidado, pode atuar sustentando o

desenvolvimento do tumor, uma vez que proporciona resistência das células tumorais

contra o estresse oxidativo e reduz a sensibilidade à estímulos de morte, permitindo

que a célula cancerosa sobreviva (WHITE et al., 2015). Com isso, o bloqueio da

autofagia impede a sobrevivência das células tumorais em condições de estresse

oxidativo e metástase, revelando assim, um promissor caminho terapêutico contra o

câncer (MIZUSHIMA, 2011).

Por fim, as células tumorais podem produzir óxido nítrico que também está

relacionado ao mecanismo de morte celular. Esse componente, comumente presente

no início da carcinogênese e na neovascularização do tumor, se em excesso, pode

levar à morte das células e à danos teciduais (COSTA et al., 2003).

Assim, embora as neoplasias envolvam muitos outros processos que também

apresentam alvos para a terapia do câncer, em quase todos os casos, a proliferação

celular descontrolada e a morte celular servem como principais alvos terapêuticos

(EVAN e VOUSDEN 2001).

19

1.2 METÁSTASE

A metástase consiste na migração das células do tumor primário para outros

tecidos e órgãos distantes. É responsável por 90% das mortes causadas por câncer

(TANSIA et al., 2016), visto que reduz enormemente as chances de sucesso de

qualquer terapia, devastando rapidamente o organismo, causando resistência às

terapias (NICÁCIO, 2009). Se um tumor for erradicado antes de produzir a metástase,

a sobrevida do indivíduo é aumentada consideravelmente. Porém, a presença de

células metastáticas que rapidamente geram implantes tumorais em outros órgãos e

posteriormente tumores secundários de difícil tratamento, inviabilizando as potenciais

retiradas cirúrgicas (HANAHAN E WEINBERG, 2011).

O mecanismo de migração das células tumorais durante a metástase é

bastante complexo. As células precisam vencer algumas barreiras fisiológicas

impostas pelo organismo como modificar suas propriedades de adesão, promovendo

a migração local, invadir o sistema circulatório (sanguíneo ou linfático) e,

posteriormente, sair da circulação para se inserir em outro tecido do organismo. Estes

processos de migração, invasão, adesão e a metástase são dependentes do

microambiente em torno do tumor (GIALELI et al., 2014). A remodelação do

microambiente tumoral está intimamente ligada às enzimas metaloproteinases de

matriz (MMPs), as quais têm sido relacionadas à cânceres de mama invasivos

(GOLUBNITSCHAJA et al., 2016; LOU et al., 2016).

As MMPs pertencem a uma família de zinco endopeptidases dependentes de

cálcio, composta por pelo menos vinte membros que degradam a matriz extracelular,

em processos patológicos e fisiológicos (MAHECHA e WANG, 2017). Podem ser

classificadas em sete grupos, com base nas suas estruturas e especificidade aos

substratos: (colagenases, metaloproteinases de matriz do tipo de membrana,

gelatinases, estromelisinas, matrilisinas, furano ativas e outras MMPs, que não se

enquadram em nenhuma destas classes) (TIAN-BIAO et al., 2011).

Entre essas enzimas, as MMP-2 e MMP-9 (gelatinases A e B, respectivamente)

têm um papel central na progressão do câncer, pois clivam componentes da matriz

extracelular como o colágeno I e IV, fibronectina e laminina, permitindo que as células

tumorais penetrem no estroma da matriz adjacente (DERYUGINA e QUIGLEY, 2015)

e, por isso, estão correlacionadas com o mau prognóstico do paciente com câncer de

20

mama (TZONEVA et al., 2016). Além disso, a identificação de novas funções

biológicas das MMPs, também em fases tardias do câncer, tem demonstrado a

relevância destas enzimas na sua progressão, além das funções clássicas já

conhecidas. Entre essas funções adicionais destacam-se a ativação de fatores de

crescimento, a supressão de células tumorais em apoptose, a destruição de

gradientes de quimiocinas desenvolvidos por resposta imune do hospedeiro e a

liberação de fatores angiogênicos (figura 1) (EGEBLAD e WERB, 2002; HOJILLA et

al., 2003).

Figura 1: Papéis das MMPs na progressão do câncer.

Fonte: Adaptado de GIALELI et al., 2011.

Como descrito, para realizar a invasão, as células tumorais precisam degradar

componentes da matriz extracelular e a membrana basal do ambiente tumoral. Essa

membrana basal é uma fina matriz que é encontrada em tecidos normais próxima às

células epiteliais, músculo liso, células adiposas e células de Schwann. É composta

principalmente por laminina, colágeno IV, proteoglicano de heparano sulfato, entactina

e vários fatores de crescimento. Diversos tumores produzem quantidades

significativas de matriz e de membrana basal e interagem com ela particularmente

durante a metástase (BENTON et al., 2011).

21

Atualmente, tem sido possível criar experimentos in vitro que mimetizem esses

processos de invasão, a partir da produção de um extrato de membrana basal

derivado de tumor. Esse extrato de membrana basal (conhecido como BME ou

Matrigel) foi primeiramente isolado a partir de um tumor murino, como uma mistura

bruta de proteínas em estado líquido a 4°C e que gelifica em condições fisiológicas a

24-37 °C (KLEINMAN e MARTIN, 2005). Estes hidrogéis contêm todos os

componentes encontrados na membrana basal e por isso possibilitam o estudo da

invasão de células tumorais (HUGHES et al., 2010).

Além da invasão, sabe-se que as interações adesivas das células tumorais

desempenham um papel crítico no processo de disseminação do tumor metastático,

uma vez que as moléculas de adesão atuam como moduladores positivos ou

negativos deste processo. Na metástase, as células tumorais presentes na corrente

sanguínea inicialmente se aderem às células endoteliais de determinados órgãos, a

partir de um processo mediado por integrinas. Em seguida, as células tumorais

metastáticas se aderem a elementos da membrana basal subendotelial, tais como

laminina e colágeno tipo IV e V, também mediada por integrinas beta 1 e beta 4.

Finalmente, as células tumorais metastáticas realizam a adesão a elementos de tecido

conjuntivo, tais como fibronectina e colágeno tipo I, para a movimentação para o

estroma subendotelial e subsequente crescimento nesses novos sítios (ZETTER,

1993). Além disso para se tornarem células tumorais metastáticas, as células do tumor

primário precisam se desprender destas moléculas de adesão presentes no tecido de

origem. Muitas vezes, uma diminuição na adesão célula-célula e/ou célula-matriz no

tumor primário tem sido correlacionada à invasão tumoral e metástase (CAVALLARO

e CHRISTOFORI, 2001). Assim, a adesão aos componentes do tecido conjuntivo

colágenos I e IV, fibronectina e laminina pode atuar positivo ou negativamente, agindo

isoladamente ou em conjunto para metástase (OKEGAWA et al., 2004).

Além disso, para ocorrer a metástase, as células malignas destacam-se do

tumor primário e adquirem as propriedades necessárias para implantar-se em um

determinado órgão, promovendo alterações nestes órgãos preparando-os para

receber as células que irão implantar-se. Atualmente, tem-se admitido que as células

tumorais adquirem as propriedades de implantar-se em outros sítios já na fase

precoce do desenvolvimento de um tumor. Assim, as células deixam o tumor primário

muito precocemente, instalam-se em locais distantes e sofrem alterações genéticas e

epigenéticas distintas em diferentes sítios secundários, até originar subclones

22

capazes de formar metástases. Deste modo as metástases são formadas por células

com perfil genético diferente daquele do tumor primário. Com isso, o tumor primário e

as metástases podem apresentar desenvolvimento paralelo (BRASILEIRO-FILHO,

2011).

1.3 CÂNCER DE MAMA

Entre os tipos de câncer existentes atualmente o câncer de mama é o mais

difundido entre as mulheres em todo o mundo, tanto nas regiões mais desenvolvidas

(794.000 casos em 2012) quanto nas regiões menos desenvolvidas (883.000 casos

em 2012) (GLOBOCAN, 2012) (figura 2). É o segundo câncer mais prevalente em toda

a população, com mais de um milhão de casos notificados a cada ano (INCA, 2016).

No Brasil, cerca de 25% dos cânceres são de mama e estima-se que cerca de 58 mil

novos casos desta doença ocorreram em 2016. Esta patologia não é exclusiva das

mulheres, podendo ocorrer em homens, com uma prevalência de 1% entre os casos

relatados (INCA, 2016).

Figura 2: Incidência de novos casos de câncer de mama no ano de 2012.

Fonte: Adaptado de Globocan, 2012.

Este tipo tumoral ocorre em mulheres de todas as idades, embora, quanto

maior a idade, mais alto é o risco do surgimento. As mulheres com as idades entre 20

23

e 29 anos representam apenas 0,3% dos casos de câncer de mama. Já entre

mulheres com idade entre 30 e 50 anos este índice aumenta para 20%, e em mulheres

com 65 anos ou mais a incidência chega à 50% (MILLER et al., 2012).

1.4 CLASSIFICAÇAO DOS TUMORES DE MAMA X TERAPIA DEPENDENTE.

Já se sabe que o câncer de mama é uma patologia heterogênea, classificada

em quatro subtipos de acordo com características das células tumorais, e que estes

subtipos apresentam diferenças moleculares, comportamento biológico, prognóstico,

padrão de metástase e resposta a tratamentos (LAMBERTINI et al., 2016). Assim o

câncer de mama foi classificado em A e B, Her 2 positivo e triplo negativo (CMTN). No

entanto, na prática clínica, a questão-chave não é a separação dos subtipos

intrínsecos molecularmente definidos, mas a discriminação entre os pacientes uma

vez que estes subtipos apresentam distintas respostas aos tratamentos (DE

LAURENTIIS et al., 2010).

Os cânceres de mama luminais representam cerca de 60 a 90% dos tipos de

câncer de mama, apresentam receptores de hormônios femininos com um padrão de

expressão gênica parecido aos das células normais que revestem os ductos e

glândulas mamárias. Esse subtipo responde a tratamentos hormonais como

Tamoxifen, Anastrozol, Letrozol. O câncer de mama luminal A é caracterizado como

de baixo grau e tem o crescimento mais lento que o luminal B (HON et al., 2016).

Esses tipos de tumores de mama, com receptores de estrogênio (RE), possuem uma

grande heterogeneidade, porém já se sabe que os níveis de RE constituem um

importante preditor da sobrevivência da doença e um forte indício de melhor resposta

à terapia endócrina (COATES et al., 2015).

Já o câncer classificado como Her2 positivo, possui inúmeras cópias do gene

Her2 e, consequentemente, o receptor Her2 em excesso em sua membrana

plasmática o que proporciona a proliferação celular acelerada. O tratamento para este

tipo de câncer é especifico, sendo utilizados atualmente bloqueadores do Her2 como

o Trastuzumab, Lapatinib, Pertuzumab e o TDM1. Esses cânceres tendem a crescer

e se espalhar de forma mais agressiva do que outros tipos de câncer de mama

(COATES et al., 2015).

24

O subtipo conhecido como triplo negativo ou basal representa

aproximadamente 15% dos tipos de câncer de mama, não apresenta receptores

hormonais e possui quantidades normais do receptor de membrana Her2. Devido a

esses fatos as terapias descritas anteriormente não são eficazes para esse subtipo

tumoral, sendo necessário o tratamento à base de quimioterapia (GLUZ et al., 2009).

Os padrões de expressões genéticas deste subtipo de câncer são semelhantes aos

padrões das células das camadas mais basais dos ductos e glândulas mamárias,

sendo este tipo mais comum entre pacientes com mutações no gene BRCA1 e entre

mulheres mais jovens e negras (CARSTEN-DENKERT et al., 2016). Assim,

atualmente existem muitas pesquisas sendo feitas para desenvolver novos

medicamentos para o câncer de mama triplo negativo, como os inibidores de PARP e

os bloqueadores do receptor de androgênio (CAREY et al., 2010).

Devido a esses fatores certos tipos de câncer são difíceis de tratar, apresentam

alto custo e apesar dos avanços alcançados na clínica, a baixa especificidade e alta

toxicidade dos tratamentos existentes atualmente corroboram com a necessidade de

encontrar melhores terapias (FRIESE et al., 2017).

1.5 PRINCIPAIS TRATAMENTOS DO CÂNCER

Existem três tipos principais de tratamento para o câncer: cirurgia, radioterapia

e quimioterapia. Também tem sido usada a terapia de fotorradiação com derivados

hematoporfirínicos e a imunoterapia (ALMEIDA et al., 2005). A cirurgia remove o tumor

de forma eficaz, desde que não ocorra metástase. Já a radioterapia é usada em

conjunto com as técnicas cirúrgicas. Entretanto, mesmo com o uso de métodos que

visam diminuir os efeitos colaterais, o tratamento por radiação é sujeito à severas

limitações (MURAD e KATZ, 1996).

A utilização destes métodos consegue curar cerca de um terço dos pacientes

com câncer. Nos demais casos, a neoplasia caracteriza-se pelo desenvolvimento

precoce de micrometástases, necessitando tratamentos com abordagem sistêmica,

que na maioria das vezes utiliza a quimioterapia (OLIVEIRA et al., 2002).

A maioria dos agentes quimioterápicos usados atualmente atuam de forma não-

específica, agindo sobre as células malignas e também sobre as células normais.

25

Entre eles os agentes alquilantes são os mais estudados e utilizados. Eles são

capazes de formar ligações interfilamentares com o DNA das células e necessitam

ser metabolizados pelas fosfamidases (enzimas microssomais hepáticas), para que

seus metabólitos possam exercer o efeito alquilante celular (GILMAN e PHILLIPS,

1990). Um exemplo de quimioterápico alquilante é o Melfalan, usado no tratamento

do câncer de mama.

Os antineoplásicos formados por compostos a base de platina, como a

Cisplatina (cis-DDP, comercialmente Platinil®, ou Platinol®) e Carboplatina (CBDCA,

Paraplatin®) também alquilam o DNA (MACHADO, 2000). As propriedades citotóxicas

destes compostos, assim como de numerosos análogos, têm sido atribuídas às suas

habilidades de formar ligações cruzadas do tipo inter ou intrafilamentares (HAHN e

WEINBERG, 2002). Contudo, apesar da ampla utilização clínica dos agentes

quimioterápicos antineoplásicos, especialmente os agentes alquilantes, estes

compostos são altamente tóxicos podendo acarretar danos e efeitos colaterais

(ALMEIDA et al., 2005).

Em contrapartida, atualmente, existem evidências que as atividades

antitumorais de medicamentos à base de plantas ou compostos de origem vegetal são

obtidos, principalmente, por modulação do estresse oxidativo e/ou reprogramação do

ambiente extracelular tumoral em vários tipos de câncer (CHENG et al., 2016),

atuando assim sobre a iniciação e resistência tumoral.

Para o câncer de mama, as terapias disponíveis atualmente resumem-se em

clínicos e cirúrgicos. O cirúrgico foi inicialmente descrito por Halsted no final do século

XIX, chamado de mastectomia radical, a partir da retirada de toda a glândula mamária,

da pele sobrejacente, dos músculos grande e pequeno peitoral, seguida do

esvaziamento axilar (HALSTED, 1894). Atualmente, se for concluído que há a

necessidade de se fazer uma cirurgia para a retirada do nódulo, esta pode ser

conservadora, as chamadas quadrantectomia ou tumorectomia ou, em casos mais

avançados, a mastectomia radical (ALMEIDA, 2006). Já os tratamentos clínicos

envolvem quimioterápicos e hormonioterápicos, e, em alguns casos a combinação

desses, cada qual com sua função e efeito colateral. Além disso, no tratamento do

câncer de mama também é utilizada a radioterapia que é comumente indicada logo

após o tratamento cirúrgico (MBAH et al., 2018).

Apesar destes protocolos de tratamento mostrarem resultados promissores,

ainda apresentam inconvenientes como efeitos colaterais tóxicos e a supressão do

26

sistema imunológico (MBAH et al., 2018; DIWANAY et al., 2004). As cirurgias, em

especial a mastectomia radical, ocasionam transformações dolorosas na vida das

mulheres, como alterações da autoimagem, da autoestima e comprometimento da

sexualidade (ALMEIDA, 2006), o que reforça a importância da busca por compostos

antineoplásicos que minimizem estes efeitos. Além disso, geralmente, o tratamento

do câncer é muito oneroso, exigindo instalações e medicamentos de alto custo e

equipe de saúde altamente especializada. Deste modo, encontrar agentes

antitumorais eficazes com menos efeitos colaterais nos sistemas vivos é um desafio

fundamental (MATHUR e JOSHI, 2013; NANDA et al., 2013).

1.6 PESQUISAS ENVOLVENDO O CÂNCER: O USO DE LINHAGENS

CELULARES

Diversas pesquisas buscando novas drogas antitumorais utilizam linhagens

celulares neoplásicas, pois promovem bases biológicas para o estudo do

desenvolvimento e progressão do câncer apresentando boa reprodutibilidade dos

resultados. Além dos testes in vitro, diversos estudos também avaliam o potencial

antitumoral de extratos vegetais usando modelos animais (RAJANI; ASHOK, 2009;

RUDNICK-GLICK, 2016), uma vez que apresentam a vantagem do fornecimento de

informações sobre o organismo como um todo, o que não é alcançado com outros

métodos (CHORILLI et al., 2007).

Entre as linhagens tumorais atualmente utilizadas na pesquisa do câncer de

mama estão as células 4T1 que são provenientes de adenocarcinoma mamário

murino em estágio IV, altamente tumorigênico e invasivo. Esse tipo tumoral tem a

capacidade de produzir metástases pela via hematógena para fígado, pulmões, ossos

e cérebro (HEPPNER et al., 2000), desenvolvendo-se de forma semelhante ao câncer

de mama em humanos. Além disso, essa linhagem tumoral é facilmente transplantável

e capaz de crescer em outras regiões anatômicas de camundongos BALB-c, como

quando inoculado nos flancos, na região subcutânea, o que facilita a avaliação do

crescimento tumoral. Este fato também possibilita que o tumor seja facilmente

removido cirurgicamente, de modo que a doença metastática possa ser estudada em

um ambiente animal comparável à situação clínica (PULASKI e OSTRAND-

27

ROSENBERG, 2001). Além disso, essa linhagem de câncer de mama murina

apresenta-se como um bom modelo de estudo in vivo pois se assemelha com o câncer

de mama triplo negativo humano (SILVA et al., 2016). Todas estas características

tornam a linhagem tumoral 4T1 muito utilizada para o estudo da progressão do câncer,

do processo metastático e de terapias antitumorais e antimetastáticas (HEPPNER et

al., 2000).

As linhagens de câncer de mama BT-20, MCF-7 e MDA-MB-231 também são

linhagens bem caracterizadas e amplamente usadas como modelos de estudo do

câncer (CARL et al., 1993). A linhagem MCF-7, do tipo histológico ductal é

considerada tipo luminal A, visto que é positiva para os receptores de estrogênio (RE+)

e receptores de progesterona (RP+) e é negativa para o receptor Her2. Já a linhagem

BT-20 é considerada do tipo Her2 pois apresenta esse receptor de membrana e é RE

e RP negativos (FRAPPAR, et al., 1989). Por fim, a linhagem MDA-MB-231 é uma

linhagem de câncer de mama ductal considerada triplo negativo visto que não

apresenta nenhum desses receptores (MACEDO, 2014).

Além da ação sobre a patologia estudada, uma potencial molécula bioativa

contra o câncer necessita passar por testes de toxicidade, a fim de avaliar a sua

atuação sobre outros tipos celulares presentes no organismo. Isto se torna muito

importante uma vez que o surgimento de efeitos colaterais ocorre principalmente

devido à não seletividade da molécula estudada (HUANG et al., 2010). A partir da

divisão do valor da IC50 do possível fármaco sobre as células não tumorais pelo valor

da IC5O sobre a linhagem tumoral obtém-se o índice de seletividade (IS). Valores desta

correlação acima de 1 são considerados tratamentos seletivos às linhagens tumorais

(RODRÍGUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2017). O cálculo do IS pode ser feito utilizando

culturas primárias de células não tumorais, como as de leucócitos ou esplenócitos,

que permitem a manutenção celular em condições e concentrações de tratamento

controladas por um certo período (ALVES e GUIMARÃES, 2016).

1.7 O USO DE PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DO CÂNCER

Desde a década de 70 a utilização de terapias alternativas tem se popularizado

em todo o mundo, com um crescimento em aproximadamente 2 a 3% ao ano,

28

passando a ser utilizada por vários grupos, entre eles os pacientes oncológicos. A

procura por práticas complementares de saúde se dá principalmente pela insatisfação

com a medicina convencional, devido aos efeitos colaterais e a busca de afinidades

pela utilização de produtos naturais (JACONODINO, 2008). Assim, a população

também pode optar por tratamentos muitas vezes mais baratos e de fácil aquisição,

como as plantas medicinais, para poderem solucionar ou amenizar seus problemas

de saúde.

As terapias alternativas consistem em técnicas que buscam suprir as

necessidades dos indivíduos, tanto na prevenção como no tratamento ou cura,

considerando-os em todos os seus aspectos, em sua multidimensionalidade (HILL,

2003), sendo utilizada na maioria das vezes de forma complementar ao tratamento.

Entre as terapias alternativas existentes atualmente tem-se destacado o uso de

plantas medicinais (BARNES et al., 2008) que atuam em diversas esferas do

tratamento do câncer.

Segundo dados recentes, as populações em tratamento de câncer que mais

buscam terapias alternativas ou complementares são crianças e adolescentes

(SHENG-YU e EISER, 2009), mulheres com câncer de mama (PEREIRA e LIPPI,

2009) e indivíduos em cuidados paliativos (MANSKY e WALLERSTEDT, 2006). Um

levantamento com pacientes com câncer revelou que 89% dos entrevistados

conhecem algum tipo de terapia alternativa, sendo que 38% destes pacientes citaram

a fitoterapia. Além disto, 89% dos pacientes são favoráveis à utilização de práticas

complementares e, entre estes 69% já fazem o uso destas (JACONODINO, 2008).

O reino vegetal é amplamente utilizado, de forma popular, no tratamento de

diversas doenças há centenas de anos, como por exemplo no tratamento da

hipertensão (PETKOV, 1979), gripes e resfriados, e doenças do trato digestivo e

estomacal (CALIXTO, 2000). Assim, é considerado uma das principais fontes para a

descoberta de novos compostos bioativos (SARAYDIN et al., 2012). Os compostos

naturais derivados de plantas, como os clássicos exemplos vincristina, vinblastina,

etoposido, paclitaxel, camptotecina, topotecano e irinotecano são utilizados para o

tratamento de diversos tipos de câncer (HUA et al., 2017). Assim, cada vez mais

medicamentos de origem vegetal ou produtos naturais derivados de plantas têm sido

analisados e apresentado atividades contra o câncer de mama in vitro e in vivo, sendo

que, as folhas são as partes vegetais mais estudadas. Plantas como Glycyrrhiza

glabra, Uncaria tomentosa, Camellia sinensis, Panax ginseng, Prunus armenaica,

29

Allium sativum, Arctium lappa e Curcuma longa têm sido reportadas com potencial

ação sobre o câncer de mama e têm sido utilizadas no tratamento desta doença em

diversas partes do mundo (BARAYA et al., 2016). Ostad et al. (2016) mostraram que

o extrato em clorofórmio de Centaurea bruguierana foi citotóxico sobre carcinoma de

mama. Além disso, a combinação de fármacos antitumorais e extratos derivados de

plantas pode oferecer uma vantagem significativa na eficácia dos tratamentos

existentes e na superação da resistência induzida por fármaco em pacientes com

câncer (CHENG et al., 2016; SANTOS et al., 2015).

Assim, a procura por novas e eficazes terapias antitumorais e também contra a

disseminação metastática, com baixo custo e mínimos efeitos colaterais, tem se

tornado cada vez mais primordial. Há que se destacar que muitas destas pesquisas

têm buscado moléculas ativas provindas de vegetais (SHARMA e ZAFAR, 2015).

1.8 O GÊNERO BAUHINIA

O gênero Bauhinia está incluído na família Fabaceae, de acordo com a lista de

espécies da flora do Brasil (VAZ, 2010) e é conhecido popularmente como Pata-de-

vaca, devido ao formato bilobado de suas folhas, em razão do crescimento parcial dos

folíolos que se assemelham à forma da pata de uma vaca (figura 3A) (LUSA e BONA,

2009). Esta família possui distribuição cosmopolita, incluindo cerca de 300 espécies

em todo o mundo, representando uma das maiores famílias das Angiospermas.

Os extratos de espécies do gênero Bauhinia apresentam comprovadas

atividades terapêuticas como as ações antibacteriana, antiulcerativa, antifúngica,

nefro-protetora, antimutagênica e também a ação contra o crescimento de tumores

hepáticos induzidos em ratos (RAJKAPOOR et al., 2006; PANDEY e AGRAWAL,

2009; PANI et al., 2011).

A espécie Bauhinia variegata L. é uma árvore de médio porte, caducifólia, de

origem asiática, mas muito cultivada no Brasil, ocorrendo desde o Piauí até o Rio

Grande do Sul (NASCIMENTO et al., 2005). Em algumas variações podem apresentar

flores brancas (figura 3C), sendo neste caso, denominadas Bauhinia variegata

candida (Aiton) Buch.-Ham (LUSA e BONA, 2009). A Bauhinia variegata é muito

utilizada para fins ornamentais devido à beleza das flores sendo muito difundida em

30

arborização de ruas. Esta espécie também apresenta propriedades biológicas como

a ação hipoglicemiante, que foi determinada a partir do isolamento de uma proteína

de cloroplasto dos extratos de suas folhas, com massa molecular e função

semelhantes à insulina (AZEVEDO et al., 2006). Outra ação terapêutica importante foi

comprovada em um estudo realizado por Oliva e Sampaio (2009), que demonstraram

que extratos hexânicos de folhas de B. variegata apresentam inibidores de enzimas

proteolíticas da cascata de coagulação do sangue. Estudos também já demonstraram

que o extrato etanólico desta espécie apresenta atividade antitumoral sobre o linfoma

ascítico de Dalton, em camundongos (RAJANI e ASHOK, 2009).

Avaliações fitoquímicas de extratos de B. variegata demonstraram a presença

de alcaloides, esteroides, flavonoides, taninos, naftoquinonas e terpenoides (DUARTE

et al., 2007). Dentre os esteroides, já foram identificados o sitosterol, o triterpenoide

lupeol, e os flavonoides narigenina-5.7-dimetoxi-4-ramnoglicosídeo, caempferol-3-

galactosídeo e caempferol-3-ramno-glucosídeo. Porém, ações terapêuticas destes

compostos não estão totalmente elucidadas (MARTÍNEZ et al., 2011; PAARAKH,

2009).

Figura 3: B. variegata: A: esxicata; B: flor de B. variegata; C: flor de B. variegata candida. Fonte: Santos (2011).

31

A B. ungulata L. é outra espécie deste gênero que apresenta altura entre 5 a

15 metros. Suas flores se desenvolvem durante a estação seca, em um período de

seis a sete meses, possuindo pétalas do tipo linear-lanceoladas de coloração rósea

(figura 4). Essa espécie é a única do gênero que apresenta ampla distribuição, sendo

encontrada na Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica e Amazônica (NETO et al., 2008).

Estudos fitoquímicos dos extratos das sementes dessa espécie demonstraram a

presença de inibidores de enzimas proteolíticas e grande quantidade de compostos

de interesse terapêutico em suas folhas. Dentre estes, os flavonoides e alcaloides são

os que estão presentes em maior quantidade (CECHINEL-FILHO, 2009; NETO et al.,

2008).

Figura 4: B. ungulata: A: esxicata; B: árvore; C: flor. Fonte: Santos (2011).

Através da busca por moléculas bioativas, estudos recentes do nosso grupo de

pesquisa mostraram que as frações de Bauhinia ungulata apresentam potencial

atividade antimetastática, uma vez que inibiram completamente a atividade de

metaloproteinases 2 e 9 in vitro (SANTOS et al., 2015). Também já foi relatado que

extratos de Bauhinia variegata apresentam atividade contra linhagens tumorais como

32

câncer renal, melanoma, câncer de cólon (Colo-320), de pulmão (A-540) e leucemia

monocítica aguda (THP-1) e acredita-se que o flavonoide 5,7,4-trimetoxyflavona seja

o componente ativo responsável por esta atividade (RAJKAPOR, 2009; TARIQ et al.,

2015).

Portanto, tendo em vista o potencial biológico que extratos de espécies de

Bauhinia apresentam e a importância da identificação de plantas com atividade

antitumoral e antimetastática eficazes, neste trabalho foi investigada a atividade de

frações de caules de três espécies de Bauhinia (B. variegata, B. variegata candida e

B. ungulata). Essas frações foram selecionadas em trabalhos anteriores por inibirem

totalmente a atividade gelatinolítica de MMP-2 e MMP-9, sobre eventos in vitro

(SANTOS et al., 2015).

33

2 OBJETIVOS

Avaliar as atividades antitumoral e antimetastática de frações dos caules de

três espécies de Bauhinia (Bauhinia variegata L., Bauhinia variegata candida (Aiton)

Buch.-Ham e Bauhinia ungulata L.) sobre o câncer de mama.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Avaliar os efeitos das frações ID7, IA19, IID10 e IIIA32 de Bauhinia sobre a

viabilidade das linhagens celulares tumorais de mama murina (4T1) e de colo uterino

humana (HeLa), assim como sobre esplenócitos murinos e leucócitos mononucleares

humanos.

2. Determinar a seletividade das frações de Bauhinia para células tumorais.

3. Obter a porcentagem de células 4T1 viáveis, em apoptose inicial e em apoptose

tardia, tratadas com as frações de Bauhinia.

4. Determinar a ação das frações de Bauhinia sobre a migração e sobre a invasão de

células 4T1.

5. Avaliar a ação das frações de Bauhinia sobre a adesão de células 4T1 à

componentes da matriz extracelular.

6. Analisar a atividade das gelatinases do sobrenadante de células 4T1, tratadas com

as frações de Bauhinia.

7. Avaliar os efeitos as frações de Bauhinia sobre a produção de óxido nítrico pelas

células 4T1.

8. Avaliar a expressão de proteínas de morte celular das células 4T1 tratadas com a

fração de Bauhinia mais seletiva.

9. Avaliar a ação da fração de Bauhinia mais seletiva sobre a viabilidade de linhagens

de câncer de mama humanas MCF-7, MDA-MB-231 e BT20.

10. Avaliar o potencial antitumoral e anti-metastático da fração mais seletiva das

espécies de Bauhinia em modelo tumoral 4T1 inoculado em camundongos BALB/c.

11. Realizar análises histológicas dos tumores, fígados e pulmões extraídos dos

camundongos.

12. Reconhecer as principais moléculas presentes na fração mais seletiva.

34

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 DESENHO EXPERIMENTAL

Organograma sobre o desenho experimental realizado na execução deste trabalho.

3.2 AMOSTRAS

As amostras de folhas, flores, ramos e frutos foram coletadas em maio de

2014, de uma árvore de cada espécie de B. variegata, B. variegata candida e B.

ungulata, apresentando como coordenadas geográficas de localização -20.150386 e

-44.888163; -20.1439 e -44.902899; -20.149716 e -44.886227, respectivamente. As

três espécies foram identificadas pelo professor Doutor Guilherme Araújo Lacerda

(CRBio 44480/04-D) e depositadas no Herbário fiel depositário do Departamento de

35

Botânica da Universidade Federal de Minas Gerais, sob os códigos: BHCB161588 (B.

ungulata L.), BHCB161589 (B. variegata L.) e BHCB161590 (B. variegata candida

(Aiton) Buch-Ham).

As plantas tiveram suas partes separadas (folhas, flores, ramos e frutos) para

que pudessem ser lavadas em água corrente e então, secas em temperatura

ambientes por sete dias. Em seguida, foram trituradas em um liquidificador industrial

(PANI et al., 2011).

3.3 OBTENÇÃO DE EXTRATOS BRUTOS E PARTIÇÕES

A obtenção dos extratos brutos foi realizada por maceração exaustiva a partir

da adição de 100 g de cada uma das amostras trituradas em 500 mL de solução hidro

alcoólica (etanol, 70%), sendo levemente agitados e, posteriormente, deixados em

repouso em frascos âmbar, por sete dias. Após este período, o macerado foi filtrado,

sendo adicionados mais 500 mL de solução hidro alcoólica (etanol, 70%) na amostra

residual. Este procedimento foi repetido até que o extrato proveniente do macerado

apresentasse coloração verde claro transparente. Os macerados totais foram

congelados em ultrafreezer à -80°C e liofilizados (Liofilizador modelo K 105, Liobrás

®) até a obtenção das amostras totalmente secas.

Para a realização das partições, os extratos brutos foram pesados (1 g) e

solubilizados em 45 mL de solução hidro alcoólica (etanol, 70%). Esta solução foi

transferida para um funil de separação juntamente com 45 mL de hexano, sendo o

funil agitado manualmente para mistura dos dois solventes. Aguardado repouso para

separação das fases, foi recolhida a porção hexânica (menos densa). A adição de

hexano e seu recolhimento foram repetidos por mais duas vezes. Este procedimento

também foi realizado com clorofórmio e acetato de etila. Ao final do experimento, a

partição hidro alcoólica residual foi recolhida. As partições obtidas A (hidro alcoólica –

etanol 70%), B (hexano), C (clorofórmio) e D (acetato de etila) foram congeladas a

-80 °C e em seguida liofilizadas (CECHINEL-FILHO, 2009). O procedimento foi

realizado repetidas vezes até a obtenção de massa, de cada uma das partições,

suficiente para a realização dos posteriores métodos.

36

3.4 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

Para a definição dos eluentes iniciais a serem utilizados nas colunas

cromatográficas de separação, foram preparadas placas de cromatografia em camada

delgada (CCD). Para isto, 7 g de sílica em pó para CCD foram acrescentadas em 17,5

mL de água destilada. Esta solução foi agitada vigorosamente e, em seguida, aplicada

em lâminas de 2,5 x 5 cm, que foram ativadas em estufa à 100ºC, durante 30 minutos.

Em seguida, aproximadamente 20 µL de cada partição foram aplicados na base

das placas de CCD. A eluição das placas foi realizada com a seguinte escala de

solventes, de polaridades crescentes (v/v): hexano, hexano/clorofórmio 1:1,

clorofórmio, clorofórmio/acetato de etila 1:1, acetato de etila, acetato de etila/metanol

1:1 e metanol. Seguindo esta ordem de eluição, o solvente de menor polaridade capaz

de iniciar o arraste da amostra em CCD foi selecionado para iniciar a coluna

cromatográfica.

3.5 CROMATOGRAFIA EM COLUNA POR GRAVIDADE

Para a realização da coluna cromatográfica, cerca de 0,5 g de cada amostra

das partições foram adicionados a uma bureta contendo 15 g de sílica gel 60G (0,05-

0,2 mm). A eluição da coluna ocorreu com a adição de solventes orgânicos de

polaridade crescente, iniciando com o solvente determinado pela eluição da CCD.

Foram aplicados 400 mL de cada eluente, e estes foram coletados sob gotejamento

constante em frascos de 50 mL cada. Após coletadas, as frações foram concentradas

por liofilização e agrupadas de acordo com o perfil fitoquímico determinado por CCD.

Neste trabalho foram utilizadas as frações nomeadas como ID7, IA19, IID7 e

IIIA32. As amostras utilizadas neste estudo foram selecionadas de acordo com

ensaios prévios em que estes extratos foram capazes de inibir totalmente a atividade

gelatinolítica das MMP-2 e MMP-9 em testes in vitro (SANTOS et al., 2015). Os

extratos foram provenientes dos caules de três espécies de Bauhinia, sendo que

foram codificados de acordo com nomenclatura padronizada no Laboratório de

37

Patologia Experimental (Tabela 1), constando de parte da planta, tipo de solvente

utilizado na partição e ordem da eluição da fração na coluna.

TABELA 1 - Nomenclatura dos extratos de Bauhinia

Legenda Descrição

I Bauhinia variegata

II Bauhinia variegata candida

III Bauhinia ungulata

A Partição hidroalcoólica (etanol 70%)

D Partição acetato de etilia

7 Ordem de eluição da fração da coluna

10 Ordem de eluição da fração da coluna

19 Ordem de eluição da fração da coluna

32 Ordem de eluição da fração da coluna

3.6 CÉLULAS TUMORAIS E CONDIÇÕES DE CULTURA

As células de adenocarcinoma cervical humano (HeLa) foram gentilmente

cedidas pelo Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular do Hospital do Câncer de

Barretos. As células foram mantidas em meio de cultura DMEM suplementado com

10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor e com 1% de

estreptomicina/penicilina (s/p), a 37°C, em uma atmosfera de ar umidificado

enriquecido com 5% (v/v) de CO2.

As células de adenocarcinoma mamário murino (4T1) foram adquiridas

do Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ). Estas células foram mantidas em meio

de cultura RPMI-1640 suplementado com soro 10% de fetal bovino (SBF) e 1% de s/p

em estufa de CO2 (5%), 37ºC.

Os experimentos realizados com as células BT-10, MCF-3 e MDA-MB-

231 foram realizados no Laboratório de Oncologia Molecular do Hospital do Câncer

de Barretos, sendo que as células BT-20, MCF-7 e MDA-MB-231 foram mantidas em

meio de cultura DMEM suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB)

38

inativado pelo calor e com 1% de estreptomicina/penicilina (s/p), a 37°C, em uma

atmosfera de ar umidificado enriquecido com 5% (v/v) de CO2.

3.7 OBTENÇÃO DE LEUCÓCITOS MONONUCLEARES HUMANOS

Os leucócitos mononucleares humanos foram utilizadas para avaliar o índice

de seletividade das frações de Bauhinia a partir do método usando MTT.

O sangue periférico humano (40 mL) foi obtido de dois voluntários com

históricos saudáveis, livres de doenças crônicas e com valores normais de

hemograma (eritrócitos: 3,9 a 5,03 milhões/L; hemoglobina: 12 a 16 g/dL; hematócrito:

35 a 45%; VCM 87 a 103 fL; plaquetas 150 a 450 milhões/L; leucócitos 4,5 a 11 mil/L

em mulheres e eritrócitos: 4,32 a 5,52 milhões/L; hemoglobina: 13,5 a 18 g/dL;

hematócrito: 40 a 50 %; VCM 87 a 103 fL; plaquetas 150 a 450 milhões/L; leucócitos

4,5 a 11 mil/L em homens. Os voluntários somente participaram do trabalho após

lerem e assinarem o termo de consentimento livre e esclarecido. Esta metodologia foi

aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos, da Universidade

Federal de São João del Rei, campus Dona Lindu, sob número de parecer 2.007.582

(anexo 1). Devido ao alto volume necessário, as coletas foram realizadas em dois

momentos distintos, com intervalo de 15 dias entre uma coleta e outra. O sangue

coletado dos voluntários foi distribuído em tubos de 5 mL contendo anticoagulante

heparina (5000 UI). Em seguida, o sangue foi transferido para tubos contendo Ficoll-

Paque (2:1 v/v) que foram centrifugados durante 40 minutos, a 1400 rpm, à

temperatura ambiente. A parte branca na camada acima do Ficoll-Paque foi recolhida

(figura 5).

Figura 5: Separação de leucócitos mononucleares humanos.

Fonte: Santos, 2015.

39

As células colhidas foram suspensas em meio de cultura DMEM suplementado

(10% de SFB e 1% de s/p) e adicionadas a frascos de plástico esterilizadas. Após 24

horas de incubação, o meio foi removido e as células foram lavadas com solução PBS

(phosphate buffered solution). As células aderentes foram consideradas leucócitos

mononucleares (PARISI, 2014).

3.8 OBTENÇÃO DE ESPLENÓCITOS MURINOS

Estas células foram utilizadas para avaliar o índice de seletividade das frações

de Bauhinia a partir do método usando MTT. Para isto, dois camundongos BALB/c

sadios, sendo um macho e uma fêmea, com dois meses de vida e peso entre 25 e

30g, foram anestesiados e eutanasiados por deslocamento cervical. Em seguida,

foram realizadas as dissecações dos animais em condições assépticas, sob chama

de bico de Bunsen e retirada a totalidade do baço de cada camundongo. Estes órgãos

foram levados à câmara de fluxo laminar onde os tecidos foram macerados utilizando

uma pinça estéril em solução salina (NaCl 0,9%) para a obtenção das células. Em

seguida, o material celular foi centrifugado à 2000 rpm, por 5 minutos e o

sobrenadante desprezado. Foram realizadas mais duas centrifugações usando

solução salina e por último as células foram suspensas em meio de cultura DMEM

suplementado com 10% de SFB e 1% de s/p.

3.9 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR

3.9.1 Viabilidade celular pelo método usando o MTT

Foram realizados ensaios de viabilidade celular utilizando o corante MTT (3-

(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolio), que é um composto

hidrossolúvel, de coloração amarelo pálido que rapidamente é incorporado por células

viáveis e reduzido pelas desidrogenases mitocondriais. A partir desta redução é

formado o formazan, que apresenta coloração púrpura e é insolúvel em água, ficando

40

na forma de cristais no citoplasma celular (RISS et al., 2013). Para a realização do

teste, as garrafas contendo as linhagens tumorais (HeLa e 4T1) e não tumorais

(esplenócitos murinos e leucócitos mononucleares humanos) foram lavadas com PBS

e tripsinizadas com 500 µL de tripsina (2,5%). Após aguardados aproximadamente 2

minutos, as células foram retiradas das garrafas e centrifugadas à 2000 rpm, por 5

minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e as células foram

ressuspensas em 1 mL de meio de cultivo suplementado com 10% de SFB.

Em seguida, 20 µL desta suspensão de células foram solubilizados em 180 µL

de líquido de Turk (ácido acético 0,04% e azul de metileno 1% em água destilada) e

adicionados em Câmara de Neubauer para a contagem das células.

Após isso, foram adicionadas 2x104 células/mL em cada poço de placas de 96

poços, que foram mantidas a 37 °C e 5 % de CO2 por 24 horas. Após esse período o

meio de cultivo foi retirado e as células foram lavadas para a adição dos tratamentos.

Os tratamentos consistiram nas frações vegetais liofilizadas, que foram diluídas (1%

de DMSO) nas concentrações: 5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL em 100 μL de meio de

cultivo sem SFB, para 24 horas de tempo de tratamento e em 200μL de meio de cultivo

sem SFB, para 48 e 72 horas de tratamento. Decorridos os tempos de incubação das

células, 100 µL de MTT (2,5 mg/mL) foram adicionados em cada poço e após 3 horas,

foram aspirados e adicionados 100 μL de DMSO para a solubilização dos cristais de

formazam. Em seguida a absorbância da coloração púrpura formada foi avaliada por

espectrofotometria, a 570 nm (OLIVEIRA, 2011). Este ensaio foi realizado em

triplicata.

3.9.2 Viabilidade celular pelo método usando o azul de tripano

O ensaio de viabilidade celular por azul de tripano visa avaliar a toxicidade de

compostos a partir do dano à membrana celular, em que a célula somente se cora de

azul quando a membrana celular perde sua integridade (MASSON-MEYERS, 2016).

Para isto as células tumorais foram tripsinizadas e contadas usando solução de Turk

e Câmara de Neubauer de forma a serem adicionadas 2x104 células/poço em placas

de 96 poços, as quais foram mantidas a 37°C e 5% de CO2, por 24 horas. Os

41

tratamentos também consistiram nas mesmas frações vegetais e concentrações

utilizadas nos ensaios usando MTT (5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL). Após o período

de tratamento com os extratos, cada poço foi lavado com 100 µL de PBS e tripsinizado

com 40 µL de tripsina a 2,5%. Após o desprendimento das células, as placas foram

centrifugadas à 2000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. Em seguida,

as células foram diluídas em 30 µL de azul de tripano a 0,04% (g/v em água) e as

células viáveis (não coradas pelo azul de tripano) foram contadas em Câmara de

Neubauer e microscópio óptico no aumento de 400x. Este ensaio foi realizado em

triplicata.

3.9.3 Viabilidade celular pelo método usando o vermelho neutro

O ensaio de viabilidade celular por vermelho neutro (3-amino-7-Dimetilamino-

2-metilfenazina) visa avaliar a toxicidade de compostos a partir do acúmulo deste

corante em lisossomos celulares (FOTAKIS e TIMBRELL, 2006). Para isto, as células

tumorais foram tripsinizadas e contadas usando solução de líquido de Turk em

Câmara de Neubauer de forma a serem adicionadas 2x104 células/poço em placas de

96 poços, que foram mantidas a 37°C e 5% de CO2 por 24 horas. Os tratamentos

também consistiram das mesmas frações e concentrações (1% de DMSO) utilizadas

nos ensaios usando MTT e azul de tripano (5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL), por 24, 48

e 72 horas. Após o período de incubação os poços foram lavados com 100 µL de PBS

e em seguida, foram adicionados 200 µL de solução de vermelho neutro (40 µg/mL

em PBS) em cada poço. As placas contendo as células com o vermelho neutro foram

incubadas por 3h e em seguida, o sobrenadante foi retirado e foram adicionados 200

µL de CaCl2 (1%) em formaldeído (0,5%, v/v). Após cinco minutos, o sobrenadante foi

aspirado e foram adicionados 100 µL de solução álcool ácido (1% v/v de ácido acético

em 50% de álcool etílico absoluto) em cada poço para a solubilização do corante. Em

seguida, a absorbância foi avaliada em leitor de microplacas a 540 nm (FRANÇA,

2008). Este ensaio foi realizado em triplicata.

42

3.9.4 Índice de seletividade

Para determinar o índice de seletividade (IS) foram calculadas as razões entre

as concentrações citotóxicas de cada fração para os esplenócitos e leucócitos

mononucleares humanos e os valores de IC50 atingidos para as linhagens 4T1 e HeLa

em 72 horas de tratamento. Foram comparados os valores de IC50 de linhagens

humanas (leucócitos mononucleares humanos/HeLa) e animais (esplenócitos/4T1)

separadamente. Foi considerado seletivo o tratamento com valor de IS igual ou maior

que 1,0 (SUFFNESS e PEZZUTO, 1991).

3.10 MORFOLOGIA E MORTE CELULAR USANDO FLUORESCÊNCIA

Os estágios de apoptose tardia e inicial foram contados por coloração com

iodeto de protídeo (IP) e laranja de acridina (LA) e examinados por microscopia de

fluorescência.

Para isto, as células 4T1 foram semeadas (2x104 células/poço) em placas

contendo 96 poços com meio de cultura RPMI-1640, suplementado com SBF 10% e

s/p 1%. Para isto, 20 µL desta suspensão de células foram solubilizados em 180 µL

de azul de tripano e adicionado à Câmara de Neubauer para a contagem das células.

Após 24 horas, o meio de cultura suplementado foi retirado, os poços foram

lavados com PBS e foram adicionados meio de cultura com as frações de Bauhinia

nas concentrações de tratamento que proporcionaram IC50 pelo teste usando MTT.

Assim, as frações ID7, IA19 e IID10 foram aplicadas nas concentrações: 25 µg/mL, 50

µg/mL e 25 µg/mL (1% de DMSO), respectivamente. Após 72 horas de tratamento, o

meio contendo os extratos foi aspirado, as células foram lavadas com PBS e

tripsinizadas com 40 µL de tripsina por poço. Em seguida, as células foram

centrifugadas a 2000 rpm por 5 minutos, ressuspendidas em 50 µL e PBS e coradas

com 10 µL de Iodeto de Propídeo (IP 10 µg/mL) e 10 µL de Laranja de Acridina (LA

10 µg/mL). Também foi aplicado Cisplatina (30 µg/mL) como controle positivo. As

células coradas foram aplicadas em lâminas de vidro e a morfologia das células foi

avaliada utilizando microscópio de fluorescência usando o filtro FITC e aumento de

43

400X. Foram obtidas 20 imagens em campos aleatórios e as células presentes foram

contadas. As células foram classificadas em viáveis, em apoptose inicial ou em

apoptose tardia. Para o cálculo de porcentagem em cada uma das etapas, foi

realizada regra de três simples considerando o número total de células encontradas

como 100%. O corante Iodeto de Propídeo é um marcador nuclear utilizado para

distinguir células em apoptose tardia. Como apresenta alto peso molecular, o IP

somente penetra em células que apresentam alterações na permeabilidade da

membrana, evento este que ocorre nos estágios finais da apoptose. Assim, a

marcação de vermelho alaranjado do IP foi considerada representativa de apoptose

tardia (DELPHI et al., 2015). O Laranja de Acridina marca as células em verde, sendo

que as células viáveis aparecem com núcleos esféricos, brilhantes e bem delimitados,

e por fim, as células em apoptose inicial apresentam fragmentos e vacúolos (BEHZAD

et al., 2016). Este ensaio foi realizado em duplicata.

3.11 MIGRAÇÃO CELULAR PELO ENSAIO DE FECHAMENTO DE FERIDA

Para avaliar o potencial dos extratos selecionados em inibir a migração celular,

as células da linhagem 4T1 foram adicionadas em placas de 24 poços (5x105 células

por poço) em meio de cultivo RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB e 1% de s/p

e deixadas para aderir por 24 horas. Para isso 20 µL da suspensão de células

tripsinizadas foram solubilizados em 180 µL de azul de tripano e adicionado em

Câmara de Neubauer para a contagem das células a serem adicionadas em cada

poço. Após atingir 95% de confluência, as células foram lavadas com PBS e duas

feridas foram produzidas na monocamada de cada poço a partir da raspagem com

uma pipeta de plástico estéril (p100) (figura 6).

44

Figura 6: Esquema de produção de ferida para ensaio de migração usando células.

Fonte: LOPES, 2015.

As concentrações de tratamento utilizadas foram aquelas capazes de

proporcionar IC50 nos testes de MTT em 72 horas. As imagens das feridas após 0, 12,

24, 48 e 72 horas foram capturadas, sempre na mesma região da ferida, utilizando

microscópio invertido AXIO VERT A1 FL (CARL ZEISS®) com aumento de 400x e a

porcentagem de fechamento das feridas foi calculada pela seguinte fórmula:

Porcentagem de fechamento de feridas (%) = 100 (A - B) / A

Onde A é a largura das feridas antes da incubação, e B é a largura das feridas

após a incubação das células (MARTINHO et al., 2015). Este ensaio foi realizado em

duplicata.

3.12 MIGRAÇÃO CELULAR USANDO INSERTOS BOYDER CHAMBER

Com a intenção de avaliar a migração das células por quimiotaxia, foi realizado

o teste de migração Boyder chamber. Para isso, as células 4T1 foram tripsinizadas e

contadas com auxílio do corante azul de tripano e Câmara de Neubauer. Em seguida,

foram adicionadas 4x104 células em cada inserto.

45

Em cada poço de uma placa de 24 poços foi depositado um inserto com poros

de 5 µm e dentro de cada inserto foram adicionados 250 µL do preparado de células

com o meio de cultura contendo as frações de Bauhinia nas concentrações de IC50

obtidas em 72 horas pelo método de viabilidade celular usando MTT. Em seguida,

foram adicionados 300 µL de meio de cultivo RPMI-1640, contendo 2% de SFB, no

lado externo de cada inserto, para funcionar como quimioatrativo (figura 7). Em

seguida, as células foram incubadas por 24 horas a 37ºC e 5% CO2.

Figura 7: Inserto Boyden Chamber para ensaio de migração.

Fonte: Adaptado de Merck, 2016.

Após 24 horas em incubação, os insertos e os poços foram lavados

cuidadosamente com PBS. Em seguida, foram adicionados 250 µL de metanol dentro

do inserto e 250 µL de metanol dentro do poço (nas laterais do inserto). A placa foi

colocada na câmara fria e aguardados 30 minutos para a fixação das células.

Após o período de fixação, o metanol foi retirado e os poços e os insertos foram

lavados novamente com PBS. Em seguida, foram adicionados 250 µL de azul de

toluidina (1% m/v de azul de toluidina e 1% de tetraborato de sódio m/v diluído em

PBS) e aguardados 30 minutos em temperatura ambiente para a coloração. O lado de

dentro dos insertos foi limpo com o auxílio de hastes com pontas de algodão para

retirar as células que não migraram. Finalmente, imagens dos insertos foram obtidas

utilizando câmara fotográfica acoplada a um microscópio invertido (CARL-ZEISS®) em

46

aumento de 200X e as células foram contadas manualmente. Este ensaio foi

realizado, em duplicata.

3.13 ENSAIO DE INVASÃO

3.13.1 Montagem dos insertos

A Matrigel é uma mistura de proteínas comercializadas que se assemelha ao

ambiente extracelular encontrado em muitos tecidos e é usada junto ao sistema

Boyden chamber (poros de 5 µm) para mimetizar a invasão metastática de células

tumorais. Para o preparo da Matrigel, 1100 µL de PBS gelado foram adicionados à

220 µL de Matrigel. Em seguida, em uma placa de 24 poços, foram depositados um

inserto em cada poço e dentro de cada inserto foram adicionados 80 µL da Matrigel.

Após 30 minutos, foram adicionados, dentro de cada inserto, 250 µL da solução de

células contendo a diluição das frações (4x104 de células 4T1 por inserto). Para isso,

20 µL desta suspensão de células foram solubilizados em 180 µL de azul de tripano e

adicionados à Câmara de Neubauer para a contagem das células. Em seguida, foram

adicionados 300 µL de meio RPMI-1640 com 2% de SFB do lado externo dos insertos,

para agir como quimioatrativo (figura 8). Após isto, as células foram incubadas por 24

horas a 37ºC, 5% CO2.

47

Figura 8: Inserto Boyden Chamber com Matrigel para ensaio de invasão.

Fonte: Adaptado de Merck, 2016.

3.13.2 Fixação das células

Após 24 horas em incubação, o sobrenadante e a Matrigel dentro dos insertos

foram retirados usando hastes com pontas de algodão. Os insertos e os poços foram

lavados cuidadosamente com PBS. Após lavados foram adicionados 250 µL de

metanol dentro dos insertos e 250 µL de metanol dentro dos poços. A placa foi

colocada na câmara fria e aguardados 30 minutos para a fixação das células.

3.13.3 Coloração

Após o período de fixação o metanol foi retirado e os poços e os insertos foram

lavados novamente com PBS. Em seguida, foram adicionados 250 µL de azul de

toluidina. A coloração ocorreu por 30 minutos em temperatura ambiente e

posteriormente, os insertos foram lavados com PBS para a retirada do excesso de

corante. Por fim, imagens das células que realizaram invasão foram obtidas em

48

microscópio óptico invertido (CARL ZEISS®) e contadas manualmente. Este ensaio foi

realizado em duplicata.

3.14 ENSAIO DE ADESÃO CELULAR

Em cada poço de uma placa de 96 poços foram aplicados 100 µL de solução

das moléculas de adesão colágeno I (0,08 µg/mL), colágeno IV (0,04 µg/mL),

fibronectina (0,04 µg/mL) e laminina (0,04 µg/mL), sendo que colágeno I e IV foram

diluídos em ácido acético (PA) e a laminina e a fibronectina foram diluídas em PBS. A

placa foi deixada na câmara fria durante a noite. No outro dia, os poços foram

bloqueados com BSA a 1% (100 µL/poço) durante 1 h, a 37 °C. Após a incubação, o

BSA foi removido e os poços foram lavados por três vezes com 200 µL/poço de PBS.

As frações ID7, IA19, IID10 e IIIA32 de Bauhinia foram incubadas com as células 4T1

(5x104 células por poço) em meio RPMI-1640 contendo 2% SFB durante 30 min e à

temperatura ambiente. Para isto 20 µL desta suspensão de células foram solubilizados

em 180 µL de azul de tripano e adicionado em Câmara de Neubauer para a contagem

das células. Foram utilizadas as concentrações que proporcionaram a IC50 no teste

de viabilidade celular usando o MTT em 72 horas. Em seguida, as suspensões

celulares contendo as frações foram adicionadas aos poços e incubadas por 3 h.

Subsequentemente, as células não aderentes foram removidas por lavagem com PBS

(100 µL/poço), e as células aderentes foram fixadas com metanol PA (100 µL/poço)

durante 5 min e coradas com azul de toluidina 1% (100 µL/poço), por 5 min. As células

foram lavadas por quatro vezes com PBS (200 µL/poço), e o corante retido pelas

células foi liberado, por lise das células, através da incubação com solução de SDS

1%, durante 20 min, a 37°C. As absorbâncias foram mensuradas em

espectrofotômetro à 620 nm. Este ensaio foi realizado em duplicata.

49

3.15 ANÁLISE DE GELATINASES NO SOBRENADANTE CELULAR

3.15.1 Coleta do sobrenadante

As células 4T1 foram plaqueadas (5x105 células/poço) em placas de 24 poços

até atingir 90% de confluência. Posteriormente as frações de Bauhinia ID7, IID10, IA19

e IIIA32 foram aplicadas nas concentrações de IC50 obtidas pelo teste de viabilidade

celular usando MTT (25 µg/mL; 50 µg/mL; 75 µg/mL; 100 µg/mL, respectivamente) e

permaneceram por 24 horas. O controle consistiu do veículo de diluição dos extratos

(meio de cultura RPMI-1640 com 1% de DMSO). Após este período, o sobrenadante

foi coletado e mantido refrigerado.

3.15.2 Zimograma

Foram realizados dois minis géis de poliacrilamida, 7,5% e gelatina 0,2% (TRIS

HCl 8,8, 1,5 M), copolimerizado com dodecil sulfato de sódio (SDS). A eletroforese

(BioRad Protean II®) foi realizada em condições não redutoras (0,025 M de Tris-

hidroximetil-aminometano (Tris), 0,192 M de glicina e 0,1% de SDS (pH 8,5), a 125 V

constantes por 2,5 h, a 4°C. Após a eletroforese, os géis foram lavados durante uma

hora, sob agitação constante em solução de Triton X-100 (2,0 g%, m/v) para remoção

do SDS e, em seguida, submersos em tampão de ativação (0,05 M Tris-HCl, CaCl2

0,6 g%, m/v, pH 8,0), também sob agitação durante 18 horas, à temperatura ambiente.

Logo após os géis foram corados (azul de Comassie R-250 0,25%, metanol 45% e

ácido acético 10%) durante uma hora e descorados (etanol 30%, ácido acético10%

em água destilada, v/v) durante uma hora. Os zimogramas foram realizados em

duplicata.

Os géis obtidos nas eletroforeses, foram digitalizados em um scanner de mesa e

analisados pelo software Image J. O contraste das bandas claras no fundo escuro do

gel demostram a atividade gelatinolítica das gelatinases e foram quantificadas em

pixels pelo mesmo programa.

50

A fórmula utilizada para calcular a inibição foi:

Inibição % = [(100% × a) ÷ b] − c

a = resultado da análise enzimática da fração

b = resultado da análise enzimática do controle

c = percentual de atividade do controle

3.16 ANÁLISE DE ÓXIDO NÍTRICO (ON)

As células 4T1 foram plaqueadas em um número de 1x105 células/poço em

uma placa de 24 poços. Em seguida, em cada poço foi adicionado 1 mL de meio

RPMI-1640 (2% SFB) contendo uma das frações de Bauhinia. Foram utilizadas as

concentrações que proporcionarem IC50 no teste de viabilidade celular. As células

foram incubadas a 37ºC e 5% de CO2, por 24 horas. Após este período, as dosagens

de ON foram realizadas utilizando-se o sistema Nitric Oxide Analyser (NOATM 280i-

Sievers), que emprega o método de quimiluminescência pela conversão de nitrato ou

nitrito a óxido nítrico. Após o tratamento das células com as frações de Bauhinia, 20

μL do sobrenadante, mantido em condições refrigeradas e em presença de um agente

redutor (1% p/v de iodeto de sódio em ácido acético glacial), foram utilizados para

dosagem de NO. A reação do ozônio com o iodeto de sódio emite fótons de luz

vermelha, que são detectados pelo sistema. A concentração de ON foi calculada por

comparação com uma curva com concentrações conhecidas de NaNO3-. Este ensaio

foi realizado em duplicata.

3.17 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE MORTE CELULAR POR

WESTERN BLOT

As células 4T1, em meio de cultivo RPMI-1640, foram tratadas por 24 horas

com ID7 nas concentrações de 15, 25 e 40 μg/mL e com Cisplatina nas concentrações

51

de 15 e 20 μg/mL. Após esse período, as células foram lisadas com um tampão

contendo 50 mM de Tris, pH 7, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1 mM de Na3VO4,

10 mM de NaF, 10 mM de pirofosfato de sódio, 1% de NP-40 e solução de inibidores

de protease contendo 10 μg/mL de Leupeptina e Aprotinina, 1mM de DTT e PMSF e

0,01 M de EDTA, e então incubadas no gelo por 1 hora. Em seguida as amostras

foram submetidas à centrifugação a 13000 rpm, a 4°C, por 15 minutos. Após a

quantificação das proteínas totais usando o reagente Bradford (SIGMA-ALDRICH),

quantidades semelhantes de proteínas de cada amostra foram utilizadas para o

ensaio de acordo com a protocolo do fabricante (SIGMA-ALDRICH). Para a separação

das proteínas, foi utilizado SDS-PAGE 15% e a corrida foi realizada em sistema

BIORAD por aproximadamente 2 horas, à 110V. Após a eletroforese, as proteínas do

gel foram transferidas (Semi-Dry Transfer Unit, TE 70 PWR, GE Healthcare) para uma

membrana de nitrocelulose (Amersham Protram, 0,45 μm NC, GE Healthcare)

utilizando o tampão com 25 mM de Tris, 193 mM de glicina e 20% de metanol (v/v).

Posteriormente, o bloqueio da membrana foi realizado em tampão TBST 1X (Tris-HCl,

pH 7.6, Tween 20 0,1%) com 5% de leite Molico®, por 1 hora, à temperatura ambiente

e então a membrana foi lavada por imersão e agitação com TBST 1X. Logo após a

lavagem, as membranas foram incubadas com o anticorpo primário diluído em TBST

1X contendo 5% de BSA (SIGMA-ALDRICH) durante 1 hora, sob agitação e então a

membrana foi lavada 3 vezes com TBST 1X por 5 minutos. Foram avaliadas as

expressões de PARP clivada e total (#4967), caspase-8 clivada e total (#9746) e

caspase-7 clivada e total (#9492). Todos os anticorpos foram diluídos e incubados, de

acordo com as recomendações do fabricante (1/1000, v/v). Após a lavagem com TBS-

T, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário, conjugado com

peroxidase (#7074) diluído à uma proporção de 1:5000 (v/v). Em seguida, a

membrana foi revelada por quimiluminescência (ECL, Western Blotting detective

reagents, RPN2109; GE Healthcare, Piscataway, NJ) e posteriormente, as

membranas foram fotografadas usando ImageQuant LAS 4000 mini (GE Healthcare).

Todas os testes ocorreram em triplicata e a normalização foi realizada utilizando a

proteína endógena β-actina

52

3.18 VIABILIDADE DE CÉLULAS DE CÂNCER DE MAMA HUMANO

A ação da fração ID7 também foi avaliada sobre a linhagem de câncer de mama

humano MCF-7 (uma linhagem não invasiva, hormônio positiva e Her2 negativa)

(LEVENSON e JORDAN, 1997), MDA-MB-231 (linhagem celular invasiva e triplo

negativa) (CAILLEAU et al., 1978) e BT20, considerada Her2 positiva (FRAPPAR et

al., 1989). As células foram plaqueadas (5x103 células/poço) e incubadas por 24 horas

para adquirirem confluência. Em seguida as mesmas foram tratadas, por 24 horas

com 0, 5, 10, 25, 75, 100, 200 e 300 µg/mL de ID7, diluídos em meio de cultura e 0,5%

de SFB. Após este período, o meio de cultura foi retirado e a viabilidade celular foi

quantificada usando o kit CellTiter 96 Aqueous Cell Proliferation Assay (MTS)

(Promega, Madison, WI). Para isso as células foram novamente incubadas por 4

horas. Em seguida foi realizada a leitura em espectrofotometria à 490 nm. Este ensaio

foi realizado em triplicata.

3.19 ENSAIO IN VIVO

Os camundongos utilizados neste trabalho foram alojados, separadamente em

caixas gaiolas autoclaváveis de polipropileno (40 x 45 x 25cm). Receberam água e

ração comercial ad libitum, sob regime de luminosidade (12 horas de luz e 12 horas

sem luz), e foram higienizadas a cada três dias. Todos os animais foram submetidos

a um período de adaptação antes do início do experimento.

Para a indução dos tumores, as células de carcinoma mamário murino (4T1),

estabelecidas em cultura (meio RPMI-1640, 10% SFB) foram inoculadas (4x106

diluídas em 100 µL de meio RPMI-1640) no flanco esquerdo (figura 9) de 16

camundongos BALB/c, pesando aproximadamente 25 gramas.

53

Figura 9: Camundongo com tumor de células 4T1 induzido no flanco esquerdo.

Fonte Santos, 2016.

Foi utilizada a fração que diminuiu a viabilidade das células tumorais, com baixa

toxicidade em células normais. Os animais foram distribuídos em 2 grupos de 8

animais cada: o grupo controle recebeu 100 µL do veículo de diluição do extrato (NaCl

0,9%) e o grupo tratado, recebeu 100 µL da fração ID7 diluída em soro fisiológico na

concentração de 30 mg/kg de peso do animal. Todos os animais receberam os

tratamentos por via intraperitoneal do nono ao vigésimo primeiro dia após a inoculação

do tumor

Após o início do tratamento, a cada dois dias os animais foram pesados e os

tumores mensurados com auxílio de um paquímetro, sendo tomadas as medidas

látero-lateral, crânio caudal e diagonal do tumor. Também foram analisadas as

características físicas de cada animal como pelos levantados, regiões com ausência

de pelos e mobilidade da perna. Após 11 dias de tratamento, os animais foram

eutanasiados por deslocamento cervical e os tumores, pulmões e fígados de todos os

animais foram coletados, pesados e fotografados. Os nódulos nos pulmões e fígados

foram contados macroscopicamente. Após extraídos, os tumores foram mensurados

com paquímetro e o volume avaliado, a partir da quantificação do deslocamento

líquido após imersão em água. Em seguida, os órgãos e tumores foram fixados em

formol e após 24h transferidos e mantidos em etanol 70%.

Todos os testes usando animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em

Pesquisa com Animais da Universidade Federal de São João del Rei sob número de

parecer 027/2016 – A (anexo 2).

54

3.20 ANÁLISES HISTOLÓGICAS

Os órgãos e tumores foram processados, incluídos em parafina histológica e

seccionados a 5 micrômetros para a produção de lâminas histológicas. Os tecidos

foram então corados com Hematoxilina de Harris e Eosina alcoólica (H/E) e analisados

à microscopia de luz.

Para a análise dos tumores, foram obtidas 20 imagens aleatórias (mas

seguindo um padrão) por lâmina, no aumento de 400X e analisadas as áreas contendo

necrose usando o software Image J. Para a análise das imagens dos pulmões,

também foram obtidas 20 imagens aleatórias por lâmina no aumento de 400X e

analisadas as áreas de metástase (massa de células tumorais) (REIGSTAD et al.,

2016; YE et al., 2015). Já para a análise das lâminas dos fígados foram obtidas sete

imagens aleatórias por lâmina e mensuradas as áreas de infiltrado inflamatório e/ou

tumoral, sob aumento de 200X e analisadas a presença de células mieloides

supressoras (CMS) (GODDARD et al., 2016; ILKOVITCH e LOPEZ, 2009).

3.21 ESPECTROMETRIA ATÔMICA DE MASSAS – ESI-

Para identificar os compostos presentes na fração ID7, que foi utilizada para o

ensaio in vivo, dissolveu-se 10 µL deste extrato em 1000 µL de solução de acetonitrila.

O extrato foi diretamente infundido com taxa de fluxo de 4.0 L/min-1 em um injetor ESI

(-). Foi utilizado espectrômetro de massas (modelo 9.4 T Solarix, BrukerDaltonics,

Bremen, Alemanha) do Laboratório de Petróleo da Universidade Federal do Espírito

Santo. O equipamento foi ajustado para o modo ión negativo, ESI (-) sobre um

intervalo de massa (M/z) de 150-1500. As condições da fonte foram pressão de gás

nebulizador de 1,5 bar, voltagem capilar de 3,9kV e temperatura capilar de

transferência de 200ºC. A acumulação de íons foi em 0,010s. Os espectros de massas

foram obtidos acumulando 64 varreduras de sinais transientes em quatro conjuntos

de dados de mega-pontos no domínio do tempo. Todos os espectros de massa foram

calibrados externamente utilizando NaTFA (m/z de 200 a 1200). A precisão de massa

utilizada foi de <5 ppm. Os espectros de massa foram adquiridos e processados

55

utilizando o software DataAnalysis (BrukerDaltonics, Bremen, Alemanha). As

composições elementares dos compostos foram determinadas medindo os valores

m/z. As estruturas propostas para cada fórmula foram atribuídas utilizando o banco

de dados Chemspider (www.chemspider.com). O grau de insaturação para cada

molécula foi deduzido diretamente de seu valor de DBE de acordo com equação: DBE

= c - h / 2 + n / 2 + 1, onde c, h e n são os números de átomos de carbono, hidrogênio

e nitrogênio, respectivamente, na formulação molecular (BALIANO et al., 2016).

3.22 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises estatísticas para comparações únicas foram realizadas pelo teste t

de Student e as diferenças entre os grupos foram testadas usando o teste de

comparação múltipla ANOVA One Way usando o programa GraphPad Prims versão

7 p <0,05. Todos os resultados foram submetidos ao teste de normalidade Shapiro-

Wilk com p> 0,05.

56

4. RESULTADOS

Nesse trabalho, foram avaliadas as ações de ID7, IA10, IID10 e IIIA32 sobre a

viabilidade de células tumorais de câncer de mama murino (4T1), adenocarcinoma

cervical humano (HeLa) e sobre as células não tumorais esplenócitos murinos e

leucócitos mononucleares humanos, pelo método usando MTT. Com os valores de

IC50 obtidos nesses testes também foram determinados os Índices de Seletividades

das frações ID7, IA10, IID10 e IIIA32 às células tumorais. A fim de elucidar as

possíveis vias da perda da viabilidade celular, os ensaios usando vermelho neutro e

azul de tripano também foram realizadas com as células 4T1. Para confirmar esses

resultados, as atividades das frações de Bauhinia sobre a morfologia e perda de

viabilidade também foram mensuradas usando os corantes fluorescentes Iodeto de

Propídeo e Laranja de Acridina. Em seguida, foram avaliadas as atividades das

frações de Bauhinia sobre os mecanismos presentes na metástase, através dos

ensaios in vitro, como o teste de migração celular por fechamento de ferida e por

quimiotaxia (Boyden Chamber), ensaio de invasão celular usando Matrigel e ensaio

de adesão celular à componentes da matriz extracelular. Tendo em vista que as

frações usadas neste trabalho são capazes de inibir totalmente a atividade de

metaloproteinase-2 e metaloproteinase-9 in vitro (resultados realizados em estudo

prévio), e que estas enzimas são fundamentais para os processos de migração e

invasão, foi verificada a ação destas frações sobre as gelatinases (MMP-2 e MMP-9)

presentes no sobrenadante celular. O óxido nítrico presente no sobrenadante celular

também foi quantificado. Em seguida a fração mais seletiva foi selecionada para os

demais ensaios. Foram quantificadas as proteínas envolvidas com a via de morte

celular caspase-7, caspase-8 e PARP em células 4T1 tratadas com a fração mais

seletiva assim como a ação desta fração sobre a viabilidade de linhagens de câncer

de mama humanos MDA-MB-231, MCF-7 e BT-20. Para avaliar a ação da fração

selecionada sobre a progressão tumoral em modelo in vivo, as células 4T1 foram

inoculadas nos flancos de camundongos BALB-c e estes foram tratados com a fração

por 11 dias. Foram avaliados o crescimento tumoral, e o peso dos animais. Após o

tratamento os animais foram eutanasiados e os tumores, pulmões e fígados foram

coletados. Foi avaliada a ação da fração sobre a metástase para o pulmão e para o

57

fígado. Por fim, a fração selecionada foi caracterizada por espectrometria atômica de

massas.

4.1 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 DIMINUEM A VIABILIDADE DAS

CÉLULAS 4T1 E HELA PELO MÉTODO USANDO MTT

O ensaio de viabilidade celular pelo método usando o MTT avalia a viabilidade

das células a partir da diminuição da atividade de enzimas mitocondriais. A fração ID7

foi pouco citotóxica para as linhagens 4T1 e HeLa em 24 horas de tratamento, não

monstrando diferença significativa de porcentagem de células viáveis em comparação

com as células do controle para 4T1 (figura 10A). Para HeLa, ID7 alcançou diferença

significativa apenas nas concentrações 50 e 75 µg/mL (figura 10B). Em 48 e 72 horas

de tratamento, a fração ID7 apresentou atividade citotóxica sobre as células 4T1 de

forma dose dependente, com IC50 de 29,93 µg/mL em 48 horas e 23,47 µg/mL em 72

horas de tratamento (figura 10A). Já para a linhagem HeLa, apresentou toxicidade em

72 horas de tratamento, com IC50 de 23,02 µg/mL (figura 10B).

58

Figura 10: Viabilidade de células tumorais tratadas com ID7, através do teste usando

MTT. As células 4T1 e HeLa foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de 96

poços e após 24 horas, foram tratadas com ID7 nas concentrações 5, 10, 25, 50, 75

e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. A viabilidade das células foi mensurada pela

metabolização do MTT, através de espectrofotometria (570 nm). Controle: 1% de

DMSO. A: Células 4T1; diferença significativa em 48 e 72h com p=0,0001. B: Células

HeLa; diferença significativa em 24h com p=0,0017 e 72h com p=0,0001. Cada coluna

representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One Way).

A

B

A fração IA19 também foi citotóxica sobre as células 4T1 de forma dose

dependente em 48 e 72 horas de tratamento, apresentando IC50 de 39,20 µg/mL, em

48 horas e IC50 de 33,70 µg/mL em 72 horas (figura 11A). Quanto à linhagem HeLa,

He

La

4

T1

59

a fração IA19 apresentou atividade citotóxica significativa em 72 horas de tratamento,

com IC50 de 55,59 µg/mL (figura 11B).

Figura 11: Viabilidade de células tumorais tratadas com IA19, através do teste usando

MTT. As células 4T1 e HeLa foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de 96

poços e após 24 horas foram tratadas com IA19 nas concentrações 5, 10, 25, 50, 75

e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. A viabilidade das células foi mensurada pela

metabolização do MTT, através de espectrofotometria (570 nm). Controle: 1% de

DMSO. A: Células 4T1; diferença significativa em 48 e 72h com p=0,0001. B: Células

HeLa; diferença significativa em 72h, p=0,001. Cada coluna representa a media ± d.p.

de 3 experimentos independentes (ANOVA One Way).

A

B

4T

1

He

La

60

A fração IID10, em 24 horas de tratamento, apresentou ação citotóxica sobre a

linhagem 4T1 nas concentrações de 5, 10 e 25 µg/mL e para a linhagem HeLa nas

concentrações de 75 e 100 µg/mL com diferenças significativas com p=0,02 e

p=0,0013, respectivamente (figuras 12A e 12B). Já em 48 e 72 horas de tratamento,

foi citotóxica de forma dose dependente sobre as células 4T1 com IC50 de 16,33 µg/mL

e IC50 de 11,10 µg/mL, respectivamente com p=0,0001 (figura 12A). Para a linhagem

HeLa, IID10 atingiu IC50 de 31,85 µg/mL em 72 horas de tratamento (figura 12B).

Figura 12: Viabilidade de células tumorais tratadas com IID10, através do teste

usando MTT. As células 4T1 e HeLa foram plaqueadas (2x104 células/poço) em

placas de 96 poços e após 24 horas foram tratadas com IID10 nas concentrações 5,

10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. A viabilidade das células foi

mensurada pela metabolização do MTT, através de espectrofotometria (570 nm).

Controle: 1% de DMSO. A: Células 4T1; diferença significativa em 24h com p=0,02 e

em 48 e 72h com p=0,0001. B: Células HeLa; diferença significativa em 24h e 72 h,

p=0,0013. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes

(ANOVA One Way).

A

B

4T

1

He

La

61

Já a fração IIIA32, em 72 horas de tratamento, foi capaz de diminuir em 50% a

viabilidade das células 4T1, com IC50 de 82,31 µg/mL (figura 13A). Contudo, essa

fração não foi citotóxica em nenhuma das concentrações utilizadas para a linhagem

HeLa (figura 13B).

Figura 13: Viabilidade de células tumorais tratadas com IIIA32, através do teste

usando MTT. As células 4T1 e HeLa foram plaqueadas (2x104 células/poço) em

placas de 96 poços e após 24 horas foram tratadas com IIIA32 nas concentrações 5,

10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas; A viabilidade das células foi

mensurada pela metabolização do MTT, através de espectrofotometria (570 nm).

Controle: 1% de DMSO. A: Células 4T1; diferença significativa em 24h com p=0,1732,

em 48 p=0,0003 e 72h com p=0,0014. B: Células HeLa; diferença significativa em 72h

p=0,0001. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes

(ANOVA One Way).

A

B

He

La

62

4.2 O MÉTODO USANDO AZUL DE TRIPANO DETECTOU DIMINUIÇÃO DA

VIABILIDADE DAS CÉLULAS 4T1 QUANDO TRATADAS COM AS FRAÇÕES ID7,

IA19 E IID10

O ensaio usando azul de tripano avalia a viabilidade das células a partir da

integridade da membrana citoplasmática. Após o tratamento das células 4T1 com a

fração IID10, na dose de 5 µg/mL, em 24 h as células não tiveram sua viabilidade

alterada em relação as células do controle (figura 16). Com exceção desta, todas as

frações em todos os tempos e doses utilizadas foram eficazes em diminuir a

viabilidade das células em relação ao controle (figura 14, figura 15 e figura 16).

Figura 14: Viabilidade de células 4T1 tratadas com ID7, através do teste usando azul

de tripano. As células 4T1 foram plaqueadas em placas de 96 poços (2x104

células/poço) e após 24 horas foram tratadas com ID7 nas concentrações 5, 10, 25,

50, 75 e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. Após esses períodos as células foram

tripsinizadas, coradas com azul de tripano e adicionadas à Câmara de Neubauer onde

foram contadas as células não coradas em azul (viáveis) usando o aumento de 400X.

Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 24h com p=0,0030, em 48h com

p=0,0002 e em 72h com p=0,0001. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3

experimentos independentes (ANOVA One Way).

63

Figura 15: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IA19, através do teste usando azul

de tripano. As células 4T1 foram plaqueadas em placas de 96 poços (2x104

células/poço) e após 24 horas foram tratadas com IA19 nas concentrações 5, 10, 25,

50, 75 e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. Após esses períodos as células foram

tripsinizadas, coradas com azul de tripano e adicionadas à Câmara de Neubauer onde

foram contadas as células não coradas em azul (viáveis), usando o aumento de 400X.

Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 24h com p=0,0061, em 48h com

p=0,0001 e em 72h com p=0,0001. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3

experimentos independentes (ANOVA One Way).

64

Figura 16: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IID10, através do teste usando

azul de tripano. As células 4T1 foram plaqueadas em placas de 96 poços (2x104

células/poço) e após 24 horas foram tratadas com IID10 nas concentrações 5, 10, 25,

50, 75 e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. Após esses períodos as células foram

tripsinizadas, coradas com azul de tripano e adicionadas à Câmara de Neubauer onde

foram contadas as células não coradas em azul (viáveis), usando o aumento de 400X.

Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 24h com p=0,0006, em 48h com

p=0,0001 e em 72h com p=0,0001. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3

experimentos independentes (ANOVA One Way).

4.3 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 NÃO ATINGEM IC50 NO TRATAMENTO

DAS CÉLULAS 4T1 ATRAVÉS DO ENSAIO USANDO VERMELHO NEUTRO

O teste usando o vermelho neutro, que avalia a viabilidade das células a partir

da incorporação do corante nos lisossomos celulares, mostrou que nenhuma das

frações testadas diminuíram, de forma significativa (p<0,05), a viabilidade das células

4T1 em 24 horas de tratamento (figuras 17, 18, 19, e 20). Já em 48 horas de

tratamento, apenas a fração ID7 diminuiu a viabilidade das células nas concentrações

de 75 e 100 µg/mL (figura 17), porém sem atingir IC50. As demais frações, IA19, IID10

e IIIA32 não apresentaram diferença significativa de viabilidade celular em 48h de

tratamento (p<0,05) (figuras 18, 19 e 20). Em 72 horas de tratamento, as frações IA19

e IID10 diminuíram a viabilidade das células nas doses 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL

65

(figuras 18 e 19, respectivamente), e a fração IIIA32 nas concentrações de 25, 50, 75

e 100 µg/mL (figura 20) e ID7 nas concentrações 25, 75 e 100 µg/mL (figura 17),

porém nenhuma das frações testadas alcançou a IC50.

Figura 17: Viabilidade de células 4T1 tratadas com ID7, através do teste usando

vermelho neutro. As células 4T1 foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de

96 poços e após 24 horas foram tratadas com ID7 nas concentrações 5, 10, 25, 50,

75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas. Em seguida a viabilidade das células foi

avaliada pela captação de vermelho neutro, mensurada por espectrofotometria (540

nm). Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 48h p=0,0049 e em 72h com

p=0,0167. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes

(ANOVA One Way).

66

Figura 18: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IA19, através do teste usando

vermelho neutro. As células 4T1 foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de

96 poços e após 24 horas foram tratadas com IA19 nas concentrações 5, 10, 25, 50,

75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas. Em seguida a viabilidade das células foi

avaliada pela captação de vermelho neutro, mensurada por espectrofotometria (540

nm). Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 72h com p=0,0002. Cada

coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One

Way).

67

Figura 19: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IID10, através do teste usando

vermelho neutro. As células 4T1 foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de

96 poços e após 24 horas foram tratadas com IID10 nas concentrações 5, 10, 25, 50,

75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas. Em seguida a viabilidade das células foi

avaliada pela captação de vermelho neutro, mensurada por espectrofotometria (540

nm). Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 72h com p=0,0001. Cada

coluna representa a média ± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One

Way).

68

Figura 20: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IIIA32, através do teste usando

vermelho neutro. As células 4T1 foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de

96 poços e após 24 horas foram tratadas com IIIA32 nas concentrações 5, 10, 25, 50,

75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas. Em seguida a viabilidade das células foi

avaliada pela captação de vermelho neutro, mensurada por espectrofotometria (540

nm). Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 72h com p=0,0137. Cada

coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One

Way).

4.4 AS FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10 DIMINUEM A VIABILIDADE DAS CÉLULAS

4T1 COM IC50 MAIS BAIXOS PELO MÉTODO USANDO AZUL DE TRIPANO

A análise dos valores de IC50 obtidos nos testes de viabilidade celular

mostraram que a fração IIIA32 não atingiu IC50 em nenhum dos ensaios realizados.

Pelo ensaio usando MTT foi verificado que todas as frações testadas somente

apresentaram IC50 após 48 ou 72 horas de tratamento da linhagem 4T1, e com

exceção de IID10, apenas em 72 horas quando testados sobre a linhagem HeLa. O

ensaio de viabilidade celular usando o azul de tripano mostrou valores de IC50 mais

baixos em relação ao ensaio usando MTT. As frações não atingiram IC50 pelo ensaio

usando vermelho neutro (tabela 2).

69

TABELA 2 - valores de IC50 obtidos pelos testes de toxicidade

MTT Azul de tripano

4T1 HeLa 4T1

24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h

ID7 nd 29,93 23,47 nd nd 23,02 nd nd <5

IA19 nd 39,20 33,70 nd nd 55,59 7,44 0,45 1,77

IID10 nd 16,33 11,19 96,14 nd 31,85 14,48 5,36 4,65

IIIA32 nd nd nd 82,31 nd nd

nd: valor não determinado

4.5 A FRAÇÃO ID7 É A MAIS SELETIVA SOBRE A VIABILIDADE DAS CÉLULAS

TUMORAIS.

As frações que apresentaram IS maior que 1 foram consideradas seletivas para

a linhagem tumoral. Assim, a fração ID7 foi considerada seletiva para a linhagem HeLa

e para a linhagem 4T1. Já as frações IID10 e IIIA32 foram seletivas para a linhagem

4T1. A fração IA19 não foi considerada seletiva às células tumorais (tabela 3). Assim,

a fração ID7 foi selecionada para os demais testes pois, além de apresentar

seletividade foi a fração que apresentou maior rendimento em massa, possibilitando

a execução dos demais ensaios.

70

TABELA 3 – Índice de seletividade de frações de Bauhinia às células tumorais em

72 horas de tratamento.

4T1 HeLa

Fração IS

Esplenócitos

IS

Mononucleares

ID7 2,26735905 1,284100782

IA19 0,262726383 0,639863285

IID10 1,670217299 0,255855573

IIIA32 3,503127793 0,000340582

4.6 AS FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10 INDUZEM APOPTOSE TARDIA E MODIFICAM

A MORFOLOGIA CELULAR

As frações ID7, IA19 e IID10 diminuíram a quantidade de células viáveis

quando comparada ao controle (p=0,0002). Essa atividade foi semelhante aos

resultados obtidos pelo tratamento com a Cisplatina, quimioterápico usado no

tratamento de diversos tipos de neoplasias. Também foi maior a quantidade de

células, tratadas com todas as frações usadas, em apoptose tardia (p=0,0324), de

forma semelhante ao observado nas células tratadas com a Cisplatina. Não foi

observada modificação na quantidade de células, tratadas com as frações de

Bauhinia, em apoptose inicial (figura 21 F). As frações ID7, IA19 e IID10 promoveram

85%, 81% e 84% de células em apoptose.

71

Figura 21: Viabilidade das células 4T1 tratadas com as frações de Bauhinia, a partir

do teste de fluorescência. As células 4T1 foram plaqueadas em placas de 96 poços

(2x104 células/poço) e após 24 horas foram tratadas com DMSO 1%, Cisplatina (30

µg/mL), ID7 (25 µg/mL), IID10 (25 µg/mL) e IA19 (50 µg/mL), durante 72 horas. Após

esse período as células foram tripsinizadas e coradas com 10 µL de Iodeto de

Propídeo (IP 10 µg/mL) e 10 µL de Laranja de Acridina (LA 10 µg/mL). Em seguida as

células foram aplicadas em lâminas de vidro e a morfologia das células foi avaliada

utilizando microscópio de fluorescência (400X). A: imagens fotográficas de células

tratadas com DMSO; B: imagens fotográficas de células tratadas com Cisplatina; C:

imagens fotográficas de células tratadas com ID7; D: imagens fotográficas de células

tratadas com IA19; E: imagens fotográficas de células tratadas com IID10. “cv”: células

viáveis. “ai”: apoptose inicial. “at”: apoptose tardia. F: Porcentagem de células viáveis,

em apoptose inicial e tardia. Diferença significativa em células viáveis com p=0,0002

em células em apoptose tardia com p=0,0324. Cada coluna representa a media ± d.p.

de 3 experimentos independentes (ANOVA One Way).

F

72

4.7 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A MIGRAÇÃO DE

CÉLULAS 4T1 IN VITRO.

O teste de migração por fechamento de feridas avalia a capacidade das células

tumorais aderentes em migrar, buscando a confluência no ambiente in vitro. A partir

das fotomicrografias foi possível observar o total fechamento da ferida das células 4T1

do controle em 72 horas tratamento (figura 22A). Os tratamentos com todas as frações

diminuíram a migração das células 4T1 acima de 60%, em 24, 48 e 72 horas de

tratamento quando comparadas ao controle. Em 12 e 24 horas de tratamento a fração

IIIA32 aumentou o tamanho da ferida (figura 22 B).

73

Figura 22: Ensaio de migração por fechamento de ferida de células 4T1. As células

4T1 foram plaqueadas em placas de 24 poços (5x105 células por poço) e após 24

horas foram realizadas feridas nas monocamadas de células. Em seguida foram

adicionadas as frações ID7 (25 µg/mL), IA19 (50 µg/mL), IID10 (25 µg/mL) e IIIA32

(100 µg/mL). Após 12, 24, 48 e 72 horas de tratamento foram capturadas imagens das

feridas e a distância entre as bordas foi mensurada para a realização do cálculo de

fechamento de ferida. Controle: 1% de DMSO. A: fotomicrografias em aumento de

400X. B: Porcentagem de fechamento de ferida comparado ao controle de cada tempo

de tratamento. Diferença significativa com p=0,0001. Cada coluna representa a média

± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One Way).

A

B

Po

rce

nta

ge

m d

e f

ech

am

en

to d

e f

eri

da

74

O ensaio de migração Boyden chamber permite que as células migrem por

quimiotaxia (SZATMARY et al., 2015), sendo que, neste trabalho foi utilizado como

quimioatático o SFB. O tempo de tratamento, utilizado para este ensaio, foi

determinado a partir do menor tempo em que os resultados apresentaram diferença

significativa em todas as frações. Assim este ensaio ocorreu por 24 horas. A partir

desta metodologia apenas as frações IID10 e IA19 inibiram a migração das células

4T1 em 65% e 76% respectivamente, em 24 horas de tratamento (figura 23).

75

Figura 23: Ensaio de migração Boyden Chamber de células 4T1. As células 4T1 foram

adicionadas (4x104 células/inserto) à insertos com poros de 5 µm, em placas de 24

poços e tratadas por 24 horas com as frações ID7 (25 µg/mL), IA19 (50 µg/mL), IID10

(25 µg/mL) e IIIA32 (100 µg/mL). Foi usado meio de cultura RPMI-1640, contendo 2%

de SFB como quimioatrativo. Após esse período as células que não migraram foram

retiradas e as membranas dos insertos foram coradas com azul de toluidina.

Posteriormente foram capturadas imagens usando microscópio invertido (200X)

Controle: 1% de DMSO. A: fotomicrografias em aumento de 200X. B: Porcentagem

de células que migraram comparado ao controle de cada tempo de tratamento.

Diferença significativa com p=0,0027 (ANOVA One Way).

A

B

4.8 AS FRAÇÕES ID7, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A INVASÃO DE CÉLULAS 4T1 IN

VITRO

O teste de invasão Boyden chamber, usando a Matrigel, mostrou que as

frações ID7, IID10, IIIA32 inibiram a invasão das células 4T1 (55%, 50%, 52%,

76

respectivamente) quando tratadas por 24 horas. A fração IA19 não inibiu a migração

das células de forma significativa quando comparada ao controle (figura 24).

Figura 24: Ensaio de invasão Boyden Chamber de células 4T1. As células 4T1 foram

adicionadas (4x104 células/inserto) à insertos com poros de 5 µm, contendo Matrigel,

em placas de 24 poços e tratadas por 24 horas com as frações ID7 (25 µg/mL), IA19

(50 µg/mL), IID10 (25 µg/mL) e IIIA32 (100 µg/mL). Foi usado meio de cultura RPMI-

1640, contendo 2% de SFB como quimioatrativo. Após esse período as células que

não invadiram foram retiradas e as membranas dos insertos foram coradas com azul

de toluidina. Posteriormente foram capturadas imagens usando microscópio invertido

(200X) Controle: 1% de DMSO. A: fotomicrografias em aumento de 200X. B:

Porcentagem de células que migraram comparado ao controle de cada tempo de

tratamento. Diferença significativa com p=0,0001 (ANOVA One Way).

A

B

77

4.9 AS FRAÇÕES ID7, ID19, IID10 E IIIA32 AUMENTAM A ADESÃO DE CÉLULAS

4T1 ÀS MOLÉCULAS DA MATRIZ EXTRACELULAR, IN VITRO

Todas as frações testadas foram capazes de aumentar a adesão das células

4T1 aos componentes colágeno I, colágeno IV, fibronectina e laminina com diferença

significativa quando comparada a adesão das células do controle (p=0,0001). A

Fração IID10 dobrou a porcentagem de células aderidas em todos componentes

(figura 25).

Figura 25: Porcentagem de células 4T1 viáveis aderidas aos componentes colágeno

I, colágeno IV, fibronectina e laminina. Em cada poço de uma placa de 96 poços foram

adicionados os componentes colágeno I (0,08 µg/mL), colágeno IV (0,04 µg/mL),

fibronectina (0,04 µg/mL) e laminina (0,04 µg/mL). Após a incubação foram

adicionadas as células 4T1 tratadas com ID7 (25 µg/mL), IA19 (50 µg/mL) IID10 (25

µg/mL), e IIIA32 (100 µg/mL) por 24 horas. Após esse período os poços foram lavados

e as células que permaneceram aderidas foram coradas com azul de toluidina. Esse

corante foi quantificado por espectrofotometria (620 nm) Controle: 1% de DMSO.

Diferença significativa com p=0,0001 (ANOVA One Way).

78

4.10 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A PRESENÇA DE

GELATINASES ATIVAS NO SOBRENADANTE CELULAR

Devido à complexidade do meio de cultivo de células eucarióticas que contém

diversos nutrientes e metabólitos, as enzimas capazes de degradar a gelatina

presentes no gel de eletroforese não foram totalmente separadas e apareceram como

uma única banda, classificada como banda de gelatinases (figura 26A).

O zimograma do sobrenadante das células 4T1, tratadas com as frações de

Bauhinia, revelou que as frações ID7 e IID10 inibiram a presença de gelatinases ativas

em mais de 86%. O tratamento com as frações IA19 e IIIA32 também inibiram (63% e

70%, respectivamente) a atividade das gelatinases (figura 26B).

Figura 26: Gelatinases ativas presentes no sobrenadante de células 4T1 tratadas com

as frações de Bauhinia. As células 4T1 foram plaqueadas (5x105 células/poço) em

placas de 24 poços e tratadas com as frações ID7 (25 µg/mL), IA19 (50µg/mL) IID10

(25 µg/mL) e IIIA32 (100 µg/mL) por 24 horas. Em seguida o sobrenadante foi coletado

e a atividade gelatinolítica foi mensurada por gel de zimograma em que o contraste

das bandas claras no fundo escuro do gel demostraram a atividade gelatinolítica das

gelatinases. As imagens dos géis foram capturadas e as bandas foram quantificadas

usando o software Image J. Controle: 1% de DMSO. A: zimograma do sobrenadante.

B: Porcentagem de atividade de gelatinases presentes no sobrenadante celular.

Diferença significativa com p=0,0001 (ANOVA One Way).

79

4.11 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 NÃO ALTERAM A LIBERAÇÃO DE

ÓXIDO NÍTRICO DE CÉLULAS 4T1 IN VITRO

A partir da análise de óxido nítrico foi possível observar que os tratamentos com

as frações de Bauhinia não modificaram sua expressão (figura 27).

Figura 27: Teor de óxido nítrico presente no sobrenadante de células 4T1 tratadas

com as frações de Bauhinia. As células 4T1 foram aplicadas (1x105 células/poço) a

poços de placas de 24 poços e tratadas com ID7 (25 µg/mL), IA19 (50 µg/mL), IID10

(25 µg/mL) e IIIA32 (100 µg/mL) por 24 horas. Após esse período o sobrenadante foi

coletado e o óxido nítrico foi dosado por quimioluminescência. Controle: 1%DMSO.

4.12 ID7 ATUA SOBRE A MORTE CELULAR PELA VIA EXTRÍNSICA

A quantificação das proteínas caspase-7 e caspase-8 determinantes da via de

morte celular juntamente com a quantificação de PARP, que demonstra dano celular,

foi realizado por western blot a partir do lisado das células 4T1. As leituras

densitométricas foram normalizadas pela expressão de β-actina e apresentadas como

razão relativa às culturas controle.

Os resultados mostram que a exposição à ID7 proporcionou um aumento

(100%) na proporção de cPARP/PARP, quando usado na concentração de 40 µg/mL

e de cCaspase 7/Caspase (300%) quando na concentração de 25 µg/mL (Figura 34

A, B e C). Além disso, na concentração de 40 μg/mL ID7 aumentou a expressão de

cCaspase8/Caspase 8 (100%), de forma semelhante ao tratamento com Cisplatina

(Figura 34 D).

80

Figura 28: Expressão das proteínas de vias de morte celular em células 4T1 tratadas

com ID7 e Cisplatina. As células 4T1 foram cultivadas em placas de 24 poços com

ID7 nas concentrações de 15, 25 e 40 μg/mL e com Cisplatina nas concentrações de

15 e 20 μg/mL. Após 24 h, na ausência de CMS2, foi realizada a lise celular com

tampão apropriado para isolamento de proteínas totais. Após a eletroforese e

transferência a membrana foi revelada por quimiluminescência. Os resultados foram

normalizados pela expressão de β-actina. Foram avaliadas as expressões de A:

PARPc/PARPp; B: cCaspase7/Caspase7; C: cCaspase8/Caspase8. Diferença

significativa com p=0,001 (ANOVA One Way).

81

4.13 ID7 É SELETIVO PARA LINHAGEM DE CANCER DE MAMA MDA-MB-231

O ensaio de viabilidade célular com as linhagens de câncer de mama MDA-

MB-231, MCF-7 e BT-20 revelou que ID7 é seletivo (IC50 10,2 µg/mL) para a linhagem

MDA-MB-231, uma linhagem caracterizada como triplo negativo (figura 29).

Figura 29: Viabilidade de linhagens de câncer de mama humano tratadas com ID7,

através do teste usando MTS. As células 4T1 foram plaqueadas (5x103 células/poço)

em placas de 96 poços e após 24 horas foram tratadas com ID7 nas concentrações

0, 5, 10, 25, 75, 100, 200 e 300 µg/mL. Após 24 horas de tratamento a viabilidade das

células foi mensurada pela metabolização do MTS, através de espectrofotometria (490

nm). Controle: 1% de DMSO. BT-20: linhagem Her2 positiva. MDA-MB-231: linhagem

triplo negativo. MCF-7: linhagem hormônio positiva, Her2 negativa. Diferença

significativa com p=0,001. Cada coluna representa a média ± d.p. de 3 experimentos

independentes (ANOVA One Way).

4.14 A FRAÇÃO ID7 INIBIU O CRESCIMENTO TUMORAL E A PERDA DE PESO

DOS ANIMAIS INOCULADOS COM 4T1.

As aferições do volume tumoral, realizadas a cada dois dias, mostraram que

ID7 inibiu o crescimento do tumor 4T1 quando comparado ao crescimento do tumor

IC50: 10,2 µg/mL

82

do grupo controle (figura 30 A). A exposição à ID7 também reduziu a perda de peso

destes animais, uma vez que os camundongos do grupo controle, mesmo

apresentaram tumores de volume maior, apresentaram menor peso corpóreo, quando

comparados ao grupo tratado com ID7 (figura 30 B).

Figura 30: Crescimento tumoral e peso, do tumor 4T1 em camundongos. As células

de 4T1 foram inoculadas (4x106 diluídas em 100 µL de meio RPMI-1640) no flanco

esquerdo de camundongos BALB-c. A partir do nono dia após a inoculação os animais

receberam a 100 µL de ID7 por gavagem, 30 mg/kg de peso do animal, diariamente.

Os animais do grupo controle receberam 100 µL do veículo de diluição do extrato

(NaCl 0,9%). Após o início do tratamento, a cada dois dias os animais foram pesados

e os tumores mensurados com auxílio de um paquímetro, sendo tomadas as medidas

látero-lateral, crânio caudal e diagonal do tumor. Os animais também foram pesados

a cada dois dias. Diferença significativa com p=0,001 (ANOVA One Way).

A B

4.15 ID7 DIMINUIU O VOLUME E O PESO DO TUMOR 4T1 RETIRADO DO ANIMAL

Após a eutanásia dos animais os tumores foram extraídos, pesados e o volume

mensurado. Foi possível observar que os tumores dos animais tratados com a fração

ID7 apresentaram menor volume e peso, de forma significativa (com p=0,0204 e

p=0,0354, respectivamente), quando comparados com os tumores do grupo controle

(figura 31)

83

Figura 31: Volume e peso dos tumores extraídos dos camundongos inoculados com

células 4T1. Após 11 dias de exposição à ID7 ou NaCl 0,95% (grupo controle) os

animais foram eutanasiados e os tumores foram retirados e pesados. Os volumes dos

tumores foram mensurados por deslocamento de líquido por imersão em água. A:

imagem dos tumores. B: volume (p=0,0204) e peso dos tumores (p=0,0354). Cada

coluna representa a média dos valores de peso e volume dos tumores dos animais de

cada grupo (ANOVA One Way).

A

B

4.16 ID7 DIMINUIU A ÁREA DE NECROSE DOS TUMORES

As análises histológicas dos tumores mostraram que o grupo controle

apresentou maior área de necrose, do que os tumores do grupo tratado com ID7

84

(figura 32). Acredita-se que a necrose evidenciada nos tumores pode ser

caracterizada como uma necrose coagulativa por hipóxia.

Figura 32: Análise de necrose em tumores 4T1 extraídos de camundongos tratados

com ID7 e grupo controle. Após a extração, os tumores foram processados, incluídos

em parafina histológica e seccionados a 5 micrômetros para a produção de lâminas

histológicas. Os tecidos foram então corados com Hematoxilina de Harris e Eosina

alcoólica (H/E) e analisados à microscopia de luz (400X). Foram mensuradas as áreas

contendo necrose usando o software Image J. A: Cortes histológicos (H/E). B: Área

(µm) de necrose dos tumores *: área de necrose. T: área de massa tumoral. Cada

coluna representa a média das áreas de necrose. Diferença significativa com

p=0,0031 (ANOVA One Way).

A

Controle ID7 (30 mg/kg de peso do animal)

B

85

4.17 ID7 DIMINUIU A METÁSTASE PARA OS PULMÕES

Após a coleta dos pulmões, esses foram fotografados e foi realizada a

contagem de nódulos indicativos de possíveis focos de metástase. A partir dessa

análise foi observado que os pulmões do grupo exposto à ID7 apresentaram um

menor número de focos de metástase, contados macroscopicamente, do que os

pulmões extraídos do grupo controle (figura 33).

Figura 33: Pulmões extraídos de animais inoculados com 4T1. Após 11 dias de

tratamento com ID7 (30 mg/kg de peso do animal) ou NaCl 0,95% (grupo controle) os

animais foram eutanasiados e os pulmões foram retirados. Foram contados os

números de nódulos visíveis macroscopicamente. A: Pulmões extraídos do grupo

controle e do grupo tratado com ID7 apresentando focos de metástase (seta preta).

B: Média do número de metástase presentes nos pulmões do grupo controle e do

grupo tratado com ID7. Diferença significativa com p=0,0239. Cada coluna representa

a média do número de nódulos visualizados macroscopicamente (ANOVA One Way).

86

A análise microscópica, das lâminas coradas por H/E dos pulmões revelou

menor número de focos de metástase com massa tumoral bem definida nos pulmões

tratados com ID7 (figura 34).

Figura 34: Análise de metástases pulmonares dos camundongos com 4T1 do grupo

controle e tratados com ID7. Após a extração, os pulmões foram processados,

incluídos em parafina histológica e seccionados a 5 micrômetros para a produção de

lâminas histológicas. Os tecidos foram então corados com Hematoxilina de Harris e

Eosina alcoólica (H/E) e analisados à microscopia de luz (200X). A: cortes histológicos

dos pulmões (H/E) do grupo controle e tratado com ID7. Focos contendo massa

tumoral estão circulados em preto. B: análise de área contendo massa tumoral

definida. Cada coluna representa a média das áreas de células tumorais nos pulmões.

Diferença significativa com p=0,001. (ANOVA One Way).

A

Controle ID7 (30 mg/kg de peso do animal)

B

87

4.18 ID7 DIMINUI OS FOCOS DE INFILTRADO INFLAMATÓRIO NOS FÍGADOS

As análises histológicas dos fígados não mostraram áreas com massa tumoral

bem definida. Porém, foi evidenciado que a exposição à ID7 diminuiu a área de

infiltrado inflamatório (figura 35A), assim como diminuiu o número de possíveis células

mieloides supressoras no órgão (figura 35B).

88

Figura 35: Análise de infiltrado inflamatório nos fígados de camundongos com tumor

4T1 tratados com ID7 e grupo controle. Após a extração, os fígados foram

processados, incluídos em parafina histológica e seccionados a 5 micrômetros para a

produção de lâminas histológicas. Os tecidos foram então corados com Hematoxilina

de Harris e Eosina alcoólica (H/E) e analisados à microscopia de luz (400X). A: cortes

histológicos contendo possivelmente CMS em destaque (seta preta). B: análise da

área (µm) de focos com infiltrado inflamatório em fígados. C: Análise do número de

possivelmente CMS em fígados. Diferença significativa com p=0,001.

A

B C

89

4.19 CARACTERIZAÇÃO DE CONSTITUINTES DA FRAÇÃO ID7.

O espectro obtido da fração ID7 usando MS-ESI- revelou a presença de sinais

com alta intensidade m/z (figura 36). A análise química destes espectros sugere a

presença de compostos orgânicos como ácidos graxos, diterpenos, flavonoides,

aminoácidos (tabela 4). A região de m/z entre 300 e 350 é referente à componentes

que não fazem parte da fração ID7, possivelmente contaminação por detergente ou

derivados de petróleo. Também foram detectados sinais m/z (225.58247) que não

foram encontradas sugestões de fórmulas moleculares.

Figura 36: Perfil de ID7 por espectrometria de massas MS-ESI- com os sinais de maior

intensidade.

90

TABELA 4 - Moléculas identificadas por MS-ESI- na fração ID7 de Bauhinia

M/z Fórmula Molecular [M-H]-

DBE Erro (ppm)

Possível molécula

225,58247 -

255,23299 [C16H32 O2 -H+]- 1 0,15 Ácido palmítico

281,24866 [C18H34O2 - H+]- 2 0,19 Ácido oleico

283,26433 [C18H36O2 - H+]- 1 0,26 Ácido esteárico

413,19720 [C24H30O6] 10 0,57 Diterpeno

593,12051 [C30H26O13]

18 0,73 Kaempferol

91

5 DISCUSSÃO

As frações ID7, IID10, IA19 e IIIA32, produzidas a partir de caules de três

espécies de Bauhinia, inibem completamente a atividade gelatinolítica das MMP-2 e

MMP-9, in vitro (SANTOS et al., 2015). Assim, neste trabalho foram avaliadas as suas

atividades antitumoral e anti-metastática, tanto in vitro, quanto in vivo. Todas as

frações estudadas diminuíram a viabilidade das linhagens tumorais HeLa e 4T1

utilizando o ensaio MTT, que estima a atividade das desidrogenases mitocondriais.

Esse resultado também foi encontrado, de forma significativa, quando foi utilizado o

ensaio azul de tripano, que avalia a integridade da membrana citoplasmática destas

células. Porém, não foram observadas alterações no metabolismo lisossomal,

verificado pela técnica usando o vermelho neutro. Além disso, estas frações

aumentaram o número de células em apoptose tardia e diminuíram o número de

células viáveis. As frações de Bauhinia usadas nesse trabalho também aumentaram

a adesão das células 4T1 aos componentes de membrana basal (colágeno I, colágeno

IV, fibronectina e laminina), inibiram a migração das células 4T1 pelo ensaio de

fechamento de ferida, além de diminuírem a presença de gelatinases ativas no

sobrenadante destas células. Ademais, as frações IID10 e IA19 diminuíram a

migração celular estimulada por quimiotaxia e as frações IID10 e IIIA32 diminuíram a

invasão celular. Além disso, a fração ID7 aumentou a expressão de proteínas

indutoras de apoptose por via extrínseca e foi seletiva para o câncer de mama humano

do tipo triplo negativo MDA-MB-231. ID7 ainda diminuiu o volume, o peso e área de

necrose dos tumores extraídos dos camundongos inoculados com 4T1. Esta fração

diminuiu o número de metástases pulmonares e de focos inflamatórios no fígado

desses animais (figura 37). Entre as substâncias encontradas nessa fração foram

caracterizados o ácido palmítico, o ácido oleico, o ácido esteárico, um diterpeno e o

Kaempferol.

92

Figura 37: Atividade antitumoral e anti-metastática de ID7.

Como os resultados encontrados neste trabalho, estudos tem mostrado

espécies de Bauhinia com potencial ação antitumoral (CHEW et al., 2014 e

KAEWPIBOON et al., 2012). Mishra et al. (2013) demonstraram que extratos de B.

variegata apresentaram atividade citotóxica em linhagens tumorais DU-145 (próstata),

HOP-62 (pulmão), IGR-OV-1 (ovário), MCF-7 (mama) e THP-1 (leucemia) e que eram

compostos dentre outros, por flavonoides e terpenoides, classe de substâncias

também encontradas em nosso trabalho. Já o estudo de Fang et al. (2010) mostrou

que as lectinas da mesma espécie diminuíram a proliferação da linhagem de câncer

de nasofaringe CNE-1. Com isto, acredita-se que o gênero Bauhinia, que apresenta

mais de 300 espécies em todo o mundo (SILVA e CECHINEL FILHO, 2002), possua

promissores componentes com ação antitumoral.

Atualmente, considera-se como potente atividade antineoplásica as

substâncias que apresentam IC50 ≤ 30 µg/mL (ITHARAT et al., 2004). A fração ID7

apresentou IC50 menor do que este valor, em ambas linhagens tumorais testadas. As

frações IA19 e IID10 também apresentaram IC50 abaixo de 30 µg/mL, mas somente

93

quando testadas sobre as células 4T1. Assim, as frações ID7, IA19 e IID10 foram

selecionadas para os testes de viabilidade celular com azul de tripano e vermelho

neutro.

Estes valores de IC50 ≤30 µg/mL foram alcançados sempre após 72 horas de

tratamento, o que também tem sido observado em outros estudos. TOR et al. (2013)

mostraram que o extrato de acetato de etila de Dillenia suffruticosa apresentou

menores IC50 em células de câncer de mama (MCF-7), nesse tempo de tratamento.

Assim como o extrato de Enicosanthellum pulchrum, que inibiu a proliferação de

células CAOV-3 (câncer humano de ovário) com maior atividade citotóxica (NORDIN

et al., 2015) e o extrato metanólico de Phaleria macrocarpa que apresentou atividade

anti-proliferativa sobre a linhagem de adenocarcinoma ovariano (SKOV-3) (LAY et al.,

2014) quando incubadas neste mesmo tempo. Assim, acredita-se que o tempo de

tratamento de maior eficácia encontrado neste trabalho é compatível com outros

estudos relatados na literatura e com quimioterápicos usados atualmente, o que

viabiliza a sua prospecção. Um bom exemplo é a doxorrubicina, que é um dos

quimioterápicos mais comumente utilizados contra tumores malignos, incluindo o

câncer de mama, e que tem sido empregada através de perfusão por 72 horas, a fim

de diminuir a toxicidade cardíaca sem prejudicar a atividade antitumoral (OGURA,

2001).

O uso de medicamentos à base de plantas com menores efeitos colaterais, mas

com potencial antitumoral, tem se tornado cada vez mais popular (KANNAN et al.,

2015). O índice de seletividade (IS) é um dado que auxilia estes estudos, pois pode

indicar a ação de um potencial agente antitumoral de forma seletiva sobre linhagens

neoplásicas em relação às células não tumorais, determinando a sua toxicidade e

indicando o uso deste extrato para futuros testes clínicos (SUFFNESS e PEZZUTO,

1991). Neste trabalho, dentre as frações testadas, ID7 foi a mais seletiva frente às

células tumorais, uma vez que apresentou IS acima de 1 para as células HeLa, quando

comparada os leucócitos mononucleares humanos, e acima de 2 para a linhagem 4T1

quando comparada com os esplenócitos murinos. Assim como os resultados relatados

neste trabalho, encontram-se na literatura estudos que também apresentam produtos

de origem natural com atividade citotóxica às células tumorais de forma seletiva. Uma

combinação de substâncias naturais apresentou atividade citotóxica altamente

seletiva à linhagem MCF-7, quando comparada à fibroblastos, e esta atividade ocorreu

devido a ação sinérgica dos seus constituintes (NGUYEN e HUYNH 2016). Outro

94

estudo mostrou que o extrato hexânico de Cystoseira tamariscifolia foi citotóxico às

células de hepatocarcinoma HepG2 de forma seletiva a partir de indução de apoptose

(VIZETTO-DUARTE et al., 2016). Assim, por atuar de forma seletiva, a fração ID7

pode ser considerada um potente agente antitumoral com menor potencial de causar

efeitos colaterais.

Atualmente, existe uma variedade de testes que estimam a viabilidade de

células, a partir de diferentes técnicas. A viabilidade celular a partir do método usando

o MTT, detecta células metabolicamente ativas, pois avalia a eficácia das

desidrogenases mitocondriais presentes nestas células em reduzir o sal MTT, que é

amarelo e solúvel, em formazan, que é um sal azul púrpura e insolúvel (RISS et al.,

2013). Por outro lado, danos aos lisossomos diminuem o acúmulo lisossomal do

corante vermelho neutro, pois este é captado e incorporado, por transporte ativo,

apenas nos lisossomos de células viáveis (FOTAKIS e TIMBRELL, 2006), estimando

assim a viabilidade celular por esta via. Já o método por azul de tripano avalia a

integridade da membrana citoplasmática que, quando comprometida, permite a

entrada do corante, marcando as células de azul. Consequentemente, estas técnicas

podem emitir dados distintos sobre o mecanismo de ação de um determinado

tratamento. Por essa razão, autores têm sugerido utilizar mais de um tipo de ensaio

para determinar a viabilidade celular, a fim de melhorar a confiança e evitar a

superestimação ou subestimação da toxicidade de um tratamento (FOTAKIS e

TIMBRELL, 2006), além de direcionar possíveis vias de atividade sobre a viabilidade

celular.

Neste contexto, os índices com maior toxicidade verificados nos resultados

usando MTT e azul de tripano sugerem que as frações de Bauhinia atuem sobre as

células tumorais na diminuição da viabilidade da membrana plasmática e do

metabolismo das mitocôndrias, mas que seu mecanismo de ação pode não influenciar

a via lisossomal (figuras 10 a 20). Assim como nosso trabalho, Masson-Meyers et al.

(2016) também encontraram níveis diferentes de sensibilidade quando comparou

estas três técnicas, apresentando maior sensibilidade quando realizado o ensaio

usando azul de tripano e menor sensibilidade quando usado o ensaio de vermelho

neutro.

Dentre os tipos de mecanismos de morte celular, destacam-se a apoptose e a

autofagia. Em células não tumorais, a autofagia atua na renovação celular,

degradando moléculas e organelas velhas ou defeituosas (TAIT et al., 2014), contudo,

95

acredita-se que no câncer a autofagia atue sustentando a sobrevivência das células

tumorais (WHITE et al., 2015). Entre os mecanismos celulares que evidenciam a

ocorrência de autofagia há a formação de vesículas ácidas e acúmulo de

componentes intracelulares nos lisossomos, formando os chamados autofagossomos

(WHITE et al., 2015). Como neste trabalho não foi verificado o acúmulo nos

lisossomos das células tratadas com frações de Bauhinia (figuras 17 e 20), acredita-

se que estas frações possam estar provocando a morte celular de 4T1, por outras vias

que não pela inibição da via autofágica.

Outro evento extremamente regulado de morte celular é a apoptose. Existem

dois mecanismos que podem desencadeá-la: a via intrínseca, conhecida como via

mitocondrial e a via extrínseca, que é dependente de receptores de superfície celular

(MCILWAIN et al., 2013). Como os resultados deste trabalho mostraram a perda da

viabilidade de membrana plasmática e a diminuição do metabolismo mitocondrial,

acredita-se que as frações de Bauhinia possam atuar sobre a viabilidade das células

4T1 a partir de algum evento de morte celular por apoptose. Atualmente sabe-se que

diversas linhagens tumorais são capazes de desenvolver rotas para evitar a apoptose

a fim de sobreviver (HANAHAN e WEINBERG, 2011). Assim, a indução da apoptose

em células tumorais pode ser um método de tratamento promissor na terapia do

câncer. Neste contexto, os produtos de origem natural têm sido cada vez mais

utilizados devido à sua capacidade de modulação desta via de morte celular (FULDA

et al., 2010).

A apoptose é uma forma de morte celular fisiológica ou patológica e pode ser

caracterizada por várias formas, incluindo o encolhimento celular, a condensação da

cromatina, a ativação das caspases entre outras proteínas, o rearranjo dos lipídios da

membrana e a fragmentação celular e do DNA. (SHIN et al., 2017). Deste modo, a fim

de investigar por qual via ocorreu a morte das células 4T1, induzidas pela fração ID7,

foram avaliadas as expressões de proteínas envolvidas na regulação da morte celular.

Na maioria das células as caspases são amplamente expressas em uma forma

inativa e uma vez ativadas podem acionar outras pro-caspases, permitindo o início de

uma cascata de proteases, amplificando a via de sinalização apoptótica (ELMORE,

2007). Diversas caspases já foram identificados e amplamente categorizados como

iniciadoras (caspase-2, -8, -9, -10), efetores ou executores (caspase-3, -6, -7) e

inflamatórias (caspase-1, -4, -5) (RAI et al., 2005).

96

Tendo em vista que o caminho de ativação de apoptose por via extrínseca é

desencadeado pelo receptor do ligante Fas e prossegue através da ativação da

caspase-8 e consequente ativação das caspases executoras 3 ou 7 (KRAMMER et

al., 2007) e que as caspases 7 e 8 tiveram sua expressão aumentada pelo tratamento

com ID7, acredita-se que essa fração induza a morte das células 4T1 por via

extrínseca. Além disso a clivagem de PARP, que foi aumentada no tratamento com

ID7, é um marcador bioquímico da apoptose (MISHRA et al., 2016). Outros estudos

também já revelaram a ação de extratos vegetais sobre células tumorais por via

extrínseca com a ativação dessas mesmas proteínas. Mishra et al, (2016)

demonstraram que os extratos de Betula utilis diminuíram a viabilidade de células de

câncer de mama MCF-7 e atribuíram essa atividade principalmente à ação de ácido

ursólico juntamente com ácido betulínico e ácido oleanólico sobre a via extrínseca de

apoptose. Wong et al, (2013) também revelaram a ação citotóxica de Vernonia

amygdalina sobre as linhagens de câncer de mama MDA-MB-231 e MCF-7 e

correlacionou essa ação, dentre outras vias, por ativação de via extrínseca de

apoptose dependente de caspases. Além desses Dhaheri et al, (2013) mostraram que

o extrato de Origanum majorana induziu a via apoptótica de células MDA-MB-231 por

extrínseca mediada por TNF-α, que induziu a sinalização a jusante, com ativação de

caspase 8, caspase 3 e clivagem de PARP.

A detecção de apoptose também pode ser realizada a partir de observações de

alterações morfológicas. A utilização do microscópio de fluorescência em abordagens

de detecção de apoptose tem uma série de vantagens expressivas, visto que a

fluorescência geralmente garante uma relação sinal-ruído mais elevada do que outras

técnicas, o que melhora a sensibilidade da análise (GALLUZZI et al., 2009). Além

disto, o método de detecção por fluorescência não envolve uma reação enzimática,

cuja eficácia pode ser afetada por variáveis incluindo a composição do tampão, o pH

e a temperatura. Os métodos de marcação dupla para a detecção da apoptose (LA e

IP) por fluorescência proporcionam resultados confiáveis e reprodutíveis, distinguindo

claramente as subpopulações de células apoptóticas (células apoptóticas precoces

ou tardias) e de células viáveis (BEHZAD et al., 2016).

As alterações morfológicas nas células 4T1 tratadas com as frações de

Bauhinia e utilizando o ensaio com LA e IP foram analisadas de forma semelhante às

descritas por pesquisadores anteriores (BELLATI et al., 2010). A observação da

formação de citoplasma denso com núcleo fragmentado e a presença de vacúolos na

97

membrana celular indicou que estas células estavam em apoptose inicial. Já os

núcleos fragmentados, marcados de vermelho pelo iodeto de protídeo representaram

a apoptose tardia (DELPHI et al., 2015). Nosso trabalho corrobora com um estudo que

mostrou a diminuição das células de câncer de ovário (CAOV-3) viáveis e o aumento

de células em apoptose tardia, também quando tratadas por 72 horas, com extratos

de Enicosanthellum pulchrum também tiveram o número de células viáveis diminuídas

e o de células em apoptose tardia aumentado (NORDIN et al., 2015). Assim, esses

resultados, juntamente com os encontrados pelo ensaio de western blot, demonstram

que as frações de Bauhinia atuem provavelmente induzindo a morte celular por

apoptose das células 4T1.

O desenvolvimento do câncer inclui a lesão pré-tumoral, a formação e

crescimento do tumor e a metástase. Este processo ocorre a partir de uma cascata

de fatores incluindo a adesão celular, a migração e a proteólise da matriz extracelular

(STEEG, 2003). Sabe-se que a taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de

mama não passa de cinco anos e que este prognóstico é determinado

predominantemente se o câncer estiver com ocorrência de metástase (NIEVES et al.,

2009). Como a inibição do potencial metastático é essencial para melhorar o

prognóstico dos doentes, este trabalho buscou avaliar alguns dos mecanismos

envolvidos com a metástase deste tipo tumoral. Deste modo, constatou-se que todas

as frações de Bauhinia inibiram a migração das células 4T1 pelo ensaio de

fechamento de ferida. Assim como em nossos resultados, autores têm encontrado

componentes de origem vegetal como o ácido betulínico, que é um triterpenoide

(JIANG et al., 2010) e compostos polifenólicos (LEE et al.,2016) com ação sobre a

migração de células e correlacionado este ensaio com uma potencial ação anti-

metastática. Zheng et al. (2012) detectaram que o extrato de Actinidia valvata inibiu

tanto a migração quanto a invasão de células de carcinoma hepatocelular e SHIN et

al. (2016) também verificaram que a migração de células de câncer de mama MDA-

MB-231 foi inibida pelo extrato de acetato de etila de Euphorbia humifusa. Uma vez

que esta espécie apresenta em sua constituição o Kaempferol (DENG et al., (2008)

substância também encontrada em ID7 acredita-se que esta molécula possa estar

correlacionada com as atividades descritas.

A fim de complementar estes resultados, também foi realizado o teste de

migração usando a Boyden chamber. Vários estudos têm preferido este ensaio para

avaliar a migração de linhagens tumorais, pois seu princípio se baseia na orientação

98

por quimiotaxia das células pelo estímulo do SFB, rico em fatores de crescimento

(MAWA et al., 2016; LIM et al., 2015). Assim, embora as células tumorais possam se

mover de forma aleatória e/ou direcional, a invasão, a migração e a disseminação são

mais eficientes quando a célula está envolvida na migração dirigida, sendo o

mecanismo de direcionamento por quimiotaxia um dos mais importantes para as

células tumorais metastatizarem (ROUSSOS et al., 2011). Assim, acredita-se que

apenas as frações IID10 e IA19 inibiam a quimiotaxia ao SFB de células 4T1 in vitro.

Outro mecanismo essencial à metástase dos carcinomas é a invasão da

membrana basal. Esta membrana é uma fina camada de matriz extracelular,

subjacente ao epitélio e ao endotélio que separa estes tecidos do estroma

(DERYUGINA e QUIGLEY, 2015). As células tumorais devem atravessar esta

membrana para estabelecer a invasão e a metástase. Para isto, produzem proteases

que degradam a matriz extracelular, como as MMP-2 e MMP-9 (FOLGUERAS et al.,

2004). Entre os vários modelos de ensaios in vitro para invasão, os que utilizam

Matrigel são os mais confiáveis, reprodutíveis e representativos da invasão in vivo

(KLEINMAN e JACOB, 2001). Os resultados deste ensaio mostram que as frações

ID7, IID10 e IIIA32 inibiram a invasão das células 4T1. Niedzwiecki et al. (2016)

relataram que uma mistura contendo diversos compostos fenólicos inibiu, de forma

dose dependente, a invasão de células escamosas de carcinoma de cabeça e

pescoço utilizando Matrigel, assim como inibiu a migração e diminuição de MMP-2 e

MMP-9. Zheng et al. (2014) demonstraram que o extrato das sementes de Momordica

cochinchinensis suprime a migração e invasão de células ZR-75-30 de câncer de

mama humano via inibição de atividade de MMP-2 e MMP-9.

Nossos resultados corroboram os estudos encontrados na literatura pois, além

da inibição da migração e invasão, as frações de Bauhinia diminuíram a quantidade

de gelatinases ativas no sobrenadante. Recentemente foi demonstrado que o

composto Cyanidin-3-O-sambubioside, do fruto de Acanthopanax sessiliflorus, inibiu

a invasão de células de câncer de mama MDA-MB-231 através da diminuição de

MMP-9, também detectada por zimograma (LEE et al., 2013). Além disso, foi relatado

que uma isoflavona de soja reduziu a invasão destas mesmas células por inibição de

MMP-2 (MAGEE et al., 2014). Ademais, estudos anteriores têm afirmado que a

inibição das MMPs desempenha um papel importante no processo de metástase (JIA

et al., 2013, SHUMAN MOSS et al., 2012), fazendo com que com nossos achados

99

possamos sugerir que as frações de Bauhinia atuem como um potencial agente contra

o câncer e metástase, possivelmente por inibição da atividade de MMP-2 e MMP-9.

Além do exposto, no ambiente tumoral as MMPs apresentam o papel de

degradar componentes da matriz extracelular (MEC) como fibronectina, laminina,

colágeno I e colágeno IV, responsáveis pela adesão das células à matriz extracelular

facilitando assim a saída da célula do ambiente tumoral (GUAN, 2015). Neste trabalho

foi mostrado que as frações de Bauhinia aumentaram a adesão das células 4T1 a

estes componentes da MEC. Acredita-se que este resultado possa estar relacionado

com a menor quantidade de MMPs ativas no sobrenadante das células tratadas com

as frações de Bauhinia, ou que haja componentes nas frações que atuem aumentando

a adesão celular. As MMPs, quando inativas, não degradaram os componentes de

membrana basal e por isso possibilitam a adesão celular. Uma vez que os

mecanismos de adesão regulam o desprendimento das células proporcionando a

motilidade celular, e que esta é essencial para a ocorrência da metástase, pode-se

afirmar que a adesão é um evento crítico no desenvolvimento metastático (ALIZADEH

et al., 2014). Assim, torna-se evidente que as frações de Bauhinia são promissores

agentes que impedem o desprendimento celular, provavelmente devido à inibição de

MMPs, podendo suprimir a progressão do evento metastático.

Neste trabalho foi demonstrado que a fração ID7 apresentou atividade

citotóxica de forma seletiva, provavelmente atuando sobre a via de apoptose, além de

diminuir a migração e invasão celular, aumentando a adesão celular aos componentes

da MEC. Assim, esta fração foi selecionada para os testes in vivo (PULASKI e

OSTRAND-ROSENBERG, 2001). Porém, diversos fatores podem influenciar a

toxicidade de um composto ativo, como, fatores individuais do organismo que

receberá o tratamento, concentração da amostra testada, estado de dispersão (forma

e tamanho das partículas), solubilidade nos fluídos orgânicos, afinidade e

sensibilidade aos tecidos (CAZARIN et al., 2004), fazendo com que os testes in vivo

sejam ainda muito necessários.

Os resultados mostraram que a fração ID7 inibiu de forma significativa o

crescimento do tumor mensurado até o nono dia de tratamento e diminuiu o tamanho

final do tumor. Assim como observado neste trabalho, estudos têm comprovado a

atividade antitumoral in vivo de extratos das folhas de Bauhinia. O extrato de B.

variegata candida inibiu a o crescimento de tumores hepáticos induzidos em ratos

(RAJKAPOOR et al., 2006). Outro estudo, também usando extratos de das cascas de

100

B. variegata, apresentou atividade anticarcinogênica em ratos induzidos com câncer

de pele (PANDEY e AGRAWAL, 2009). Kannan et al. (2015) encontraram ação

antitumoral do extrato metanólico de B. tomentosa contra ascite induzida por linfoma

de Dalton.

Também foi observado que ID7 inibiu a metástase das células 4T1 para o

pulmão e para o fígado. Estes achados reforçam os resultados dos ensaios in vitro da

ação de ID7 sobre os mecanismos de metástase. Atualmente são encontrados na

literatura muitos exemplos de drogas que exibem um comportamento citotóxico e anti-

metastático em células tumorais em ensaios in vitro, mas que perdem a eficácia

quando são testados em ensaios in vivo. Em muitos casos isso ocorre devido à efeitos

quimiorresistentes conferidos às células tumorais, pelo microambiente do câncer nas

condições do organismo como um todo (HOLLE et al., 2016). Corroborando com

nossos resultados o extrato de Glycyrrhiza uralensis, inibiu a migração e produção de

MMP-9 de células 4T1 in vitro e inibiram a metástase pulmonar dessas células em

experimentos in vivo sugerindo que essas ações sejam provocadas principalmente

por um flavonoide (PARK et al., 2016), classe de compostos também encontrada em

ID7. Assim, nossos resultados mostram que ID7 pode ser desenvolvido como um

agente para prevenir ou atrasar o crescimento e metástase do tumor uma vez que foi

ativo contra o crescimento e desenvolvimento metastático em ambas condições

experimentais.

As células tumorais são comumente cercadas por várias células do estroma

incluindo fibroblastos, células vasculares angiogênicas e células imunes infiltrantes

(HANAHAN et al., 2012) Dentre estas, as células mieloides infiltradas acumulam-se

em grandes quantidades em áreas onde os níveis locais de oxigênio são baixos e

podem apoiar a proliferação e progressão tumoral através da promoção da

angiogênese e invasão (MURDOCH et al., 2004). As análises histológicas dos fígados

dos animais não tratados mostraram um número elevado de células de defesa, com

acentuada presença de células possivelmente derivadas mieloides, classificadas

como supressoras (CMS). Esta classe de células contribui e ajuda a orquestrar a

imunossupressão tumoral pois podem interagir com células T, macrófagos e células

NK, para criar um ambiente favorável à progressão tumoral. Estudos já revelaram que

esse tipo de célula apresenta uma tendência de acúmulo no fígado interagindo com

as células de Kupffer (ILKOVITCH e LLOPEZ, 2009). Em contrapartida, a análise

101

histológica dos fígados dos animais tratados com ID7 mostraram uma redução do

número de células possivelmente caracterizadas como CMS.

À medida que as terapias que controlam o sítio do câncer do tumor primário

melhoram, a incidência de metástase tem aumentado e o manejo dos pacientes com

metástase continua sendo um desafio (HANAHAN et al., 2012). Além disso, a

imunossupressão induzida por tumor desempenha um papel fundamental na evasão

tumoral do sistema imunológico (ILKOVITCH e LLOPEZ, 2009), assim acredita-se que

ID7 possa ter um papel na prevenção da metástase de 4T1. A função de CMS também

já foi reduzida pela Withaferina A, um componente abundante no extrato de raíz de

Withania somnifera. Acredita-se que essa atividade ocorra principalmente pela

diminuição da IL-10 e de espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidos pelas CMS

(SINHA e OSTRAND-ROSENBERG, 2013). Tendo em vista que extratos de outras

espécies de Bauhinia, como a Bauhinia championii já inibiram a produção de EROs,

pela inibição das mitocôndrias produtoras de EROs (LIAO et al., 2016) e que já foi

evidenciado que terapias com peptídeos conjugados à ácido palmítico, composto

presente em ID7, induzem a imunidade antitumoral pela diminuição da função de

macrófagos associados ao tumor por bloqueio de IL-10 (SHEN et al., 2014), acredita-

se que essa fração, em especial o ácido palmítico presente em sua constituição possa

atuar sobre essas moléculas auxiliando na imunidade antitumoral.

A linhagem de células 4T1, utilizadas nesse trabalho, é considerada uma

linhagem de câncer de mama do tipo triplo negativo (CMTN) (SILVA et al., 2016) que

é um tipo de câncer de mama altamente agressivo (KAUR et al., 2012). Os ensaios

de viabilidade com células de câncer de mama humano mostraram que ID7 foi seletivo

às células MDA-MB-231 que também são caracterizadas como triplo negativo pois

não possuem receptores para estrogênio, progesterona ou Her2 (KAUR et al., 2012).

Atualmente já é de conhecimento que esse tipo de câncer de mama (CMTN) é

altamente agressivo e corresponde entre 10 a 20% dos cânceres de mama

diagnosticados (SILVA et al., 2016). Tendo em vista que os pacientes com CMTN não

se beneficiam das terapias moleculares ou endócrinas existentes atualmente,

principalmente devido à ausência de alvos desses fármacos, a quimioterapia

citotóxica continua sendo a única modalidade de abrangência sistêmica disponível

(JEONG et al., 2012). Assim, considerando que o fenótipo triplo negativo possui mal

prognóstico com características altamente agressivas, e ainda que os medicamentos

citotóxicos ou genotóxicos disponíveis produzem eficácia limitada e efeitos adversos

102

significativos (KIM et al., 2017), a ação seletiva evidenciada neste trabalho, de ID7

sobre esse tipo tumoral é muito relevante.

Recentemente alguns compostos de origem natural também têm mostrado

ação sobre o CMTN. Já foram encontrados alguns peptídeos ativos (SILVA et al.,

2016) e o extrato de Paeonia suffruticosa, que também diminui a viabilidade das

células MDA-MB-231 porém por indução de apoptose pela via intrínseca (KIM et al.,

2017). Entre os compostos encontrados em ID7, os diterpenos pertencem à uma

classe de compostos secundários que pode estar relacionada com esta atividade uma

vez que já foi relatado que alguns tipos de diterpenos, isolados de algas marinhas da

espécie Laurencia alfredensis, apresentaram atividade antiproliferativa sobre células

MDA-MB-231 e sobre HeLa, assim como nosso estudo (DZIWORNU et al., 2017).

Além disso, acredita-se que os compostos encontrados na caracterização de

ID7 possam estar relacionados às atividades antitumorais encontradas, uma vez que

foi identificado que o ácido palmítico, extraído de algas marinhas, apresentou

atividade citotóxica seletiva para células leucêmicas humanas sem alterar a

viabilidade de células HDF normais. Além disso, esse ácido graxo induziu a apoptose

das células tumorais e também apresentou atividade antitumoral in vivo (HARADA et

al., 2002). Outro estudo mostrou que o extrato de Ganoderma tsugae var. Jannieae

apresentou atividade citotóxica sobre a linhagem de câncer de mama MCF7 e que

este extrato apresenta, principalmente, ácido palmítico, ácido oleico e ácido linoléico

em sua composição (CHAN et al., 2015). Ainda de acordo com nossos resultados, o

extrato lipofílico de Viscum album L., contendo diversos tipos de ácidos graxos,

apresentou atividade antiproliferativa e induziu a morte celular por apoptose de

linhagens tumorais Molt4, K562 e U937 (URECH et al., 2005). Saab et al. (2015)

revelaram que o extrato das sementes de Laurus nobilis L apresentou atividade

citotóxica frente a linhagens tumorais resistentes à quimioterápicos, atividade devida

ao ácido oleico e ácido palmítico, dentre outros componentes.

A caracterização fitoquímica da fração ID7 também sugeriu a presença do

flavonoide do tipo tilirosídeo chamado de Kaempferol e de diterpenos. Estes

resultados também corroboram com resultados anteriores do nosso grupo de trabalho

a partir da análise por CCD-UV. Acredita-se que estes flavonoide e diterpeno também

possam atuar nas atividades antitumorais e antimetastáticas encontradas neste

trabalho, uma vez que já é de conhecimento que o Kaemperol é um fitoestróegeno

conhecido por desempenhar um papel quimiopreventivo. Lee et al. (2016)

103

identificaram este flavonoide como um agente eficaz na inibição do comportamento

metastático do câncer de mama (MCF-7). Assim como diterpenos, que são uma classe

de substâncias com já comprovada ação antitumoral. Extratos de Salvia revelaram

ação antitumoral e tem essa atividade atribuída ao seu conteúdo de diterpenos e

fenóis (HAO et al., 2016).

Neste contexto um estudo revelou que a presença de lipídeos em extratos

contendo compostos fenólicos auxilia na solubilização destas substâncias, o que pode

potencializar a sua atividade. Neste estudo foi verificado que os extratos fenólicos

ligados a lipídeos exerciam atividades antiproliferativas contra as linhagens celulares

de câncer de colorretal CRC1 e CRC5 e que este extrato continha ácido esteárico,

ácido linoleico e ácido palmítico em sua composição, além de flavonoides como o

Kaempferol (ALU'DATT et al., 2014).

A análise química também sugeriu outras moléculas não mencionadas como

tendo atividade antitumoral. Assim sugere-se que a fração ID7 seja futuramente

purificada e que a atividade dos seus componentes seja avaliada separadamente a

fim de verificar se tais moléculas apresentam ações terapêuticas isoladamente ou de

forma sinérgica.

104

6 CONCLUSÃO

A partir dos resultados encontrados, foi possível concluir que as frações ID7, IID10,

IA19 e IIIA32 apresentam atividades, in vitro, sobre mecanismos do desenvolvimento

tumoral e metastático da linhagem de câncer de mama 4T1; E que a fração ID7 se

mostrou um potencial agente antitumoral visto que, além de atuar de forma seletiva

sobre o desenvolvimento tumoral e mecanismos metastáticos in vitro, diminuiu o

crescimento do tumor 4T1, a metástase pulmonar e a inflamação nos fígados de

camundongos. Por fim, concluímos que os Ácidos graxos, Kaempferol e diterpenos

estejam relacionados com estas atividades.

105

ANEXO 1 – Parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres

Humanos.

106

107

108

109

110

ANEXO 2 – Parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais

111

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