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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

MELQUISEDEC ABIARÉ DANTAS DE SANTANA

CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E PROJEÇÕES RETINIANAS NO

NÚCLEO GENICULADO LATERAL DORSAL, COMPLEXO PRÉ-TECTAL E

COLÍCULO SUPERIOR DO MORCEGO Artibeus planirostris.

Natal / RN

2016

MELQUISEDEC ABIARÉ DANTAS DE SANTANA

CARACTERIZAÇÃO CITOARQUITETÔNICA E PROJEÇÕES RETINIANAS NO

NÚCLEO GENICULADO LATERAL DORSAL, COMPLEXO PRÉ-TECTAL E

COLÍCULO SUPERIOR DO MORCEGO Artibeus planirostris.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Psicobiologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, sob a orientação do

Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior, para

a obtenção do título de Doutor em Psicobiologia.

Área de concentração: Psicologia Fisiológica.

Natal/RN

2016

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB

Santana, Melquisedec Abiare Dantas de.

Caracterização citoarquitetônica e projeções retinianas no

núcleo geniculado lateral dorsal, complexo pré-tectal e colículo superior do morcego Artibeus planirostris. / Melquisedec Abiare

Dantas de Santana. - Natal, 2016.

90 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Nor-

te. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobio-logia.

1. Sistema visual - Tese. 2. Quirópteros - Tese. 3. Estereo-

logia - Tese. 4. CTb - Tese. 5. Densidade óptica relativa - Te-

se. I. Nascimento Júnior, Expedito Silva do. II. Universidade

Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 612.843

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

Candidato: Melquisedec Abiaré Dantas de Santana

Título da tese: Caracterização citoarquitetônica e projeções retinianas no núcleo geniculado

lateral dorsal, complexo pré-tectal e colículo superior do morcego Artibeus planirostris.

Orientador: Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior

Data da defesa: 09/09/2016

Banca examinadora:

____________________________________________________

Prof. Dr. Francisco Gilberto de Oliveira

Universidade Regional do Cariri (URCA)

____________________________________________________

Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN)

____________________________________________________

Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

____________________________________________________

Prof. Dr. Daniel Marques de Almeida Pessoa


____________________________________________________

Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior


Dedico este trabalho aos meus pais Antônio e Dilma, meus irmãos Jéssica e

Mezaabe e minha noiva Jeniffer que com muito carinho e apoio, não mediram esforços

para que eu chegasse até aqui.

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a Marília, Rayane, Lara, Luísa, Nayana, Geórgia, Hélder e Ma-

riana, que participaram das capturas dos morcegos montando e desmontando as redes, manu-

seando os animais e ainda depois disso permanecendo mais algumas horas no laboratório rea-

lizando os procedimentos pós captura.

À Marília, pela identificação, captura e todos os ensinamentos sobre os morcegos.

À Joacil, pelas divertidas noites de injeção intraocular e por acertar de primeira a dose

anestésica dos animais.

À Rayane, Lara, Luísa, Nayana e Geórgia, pela ajuda durante todos os procedimentos

no laboratório.

Ao professor Fernando que me ajudou em todas as etapas da análise estereológica.

Ao Instituto do Cérebro por ceder os equipamentos necessários para a análise estereo-

lógica.

À Felipe e Alane por toda a ajuda na análise da densidade óptica relativa.

À todos os professores do programa de Pós-graduação em Psicobiologia que participa-

ram da minha formação profissional.

À Universidad Autónoma de Madrid e a todos que me acolheram durante o doutorado

sanduíche, em especial aos Professores Francisco Clascá, Pablo Rubio, Carlos Avendaño e

Maria Garcia às técnicas de laboratório Begoña, Marta e Rosa e aos alunos de pós-graduação

Angélica, Mariam, Diana, Javier, Jesus e Cézar.

À professora Miriam e aos professores Judney e Ruthnaldo pelos esclarecimentos e

ensinamentos dados durante estes anos que passei no laboratório.

Ao professor/amigo/orientador Expedito por todos os momentos de ensinamentos no

Labneuro e no Departamento de Morfologia, e pelos momentos de descontração dentro do

laboratório e fora dele (nas nossas reuniões do clube do vinho).

À todos que participaram e participam do Labneuro e que de alguma forma ajudaram

com este trabalho.

À Regina pelo preparo de todo o material de laboratório.

As agências de fomento CNPq, CAPES e FAPERN.

Por fim, não poderia deixar de agradecer a minha noiva Jeniffer por todo carinho, de-

dicação, apoio, compreensão, ajuda e paciência, sem você tudo seria mais difícil. Te Amo!

A resposta certa, não importa nada: o essencial é que as perguntas estejam certas.

Mario Quintana

RESUMO

Em muitos vertebrados, a maior parte do cérebro está envolvida no processamento

da visão, mais do que qualquer outra modalidade sensorial. Isto se deve, provavelmente, à

extrema complexidade da tarefa que é exigida da visão: classificar e interpretar a ampla gama

de estímulos visuais que os animais confrontam no ambiente físico. A retina modifica e

processa sinais evocados pela luz nos fotorreceptores, que depois são enviados a centros

superiores pelas células ganglionares. Os axônios destas células formam os nervos ópticos

que distribuem a informação da retina à estruturas encefálicas com diversas funções, como o

núcleo geniculado lateral dorsal (GLD), do qual a informação visual ascende ao córtex

cerebral; o colículo superior (CS), responsável por integrar sinais visuo-motores; e o

complexo pré-tectal (CPT), envolvido no controle do reflexo pupilar à luz e no nistagmo

optocinético. Com o objetivo de descrever a citoarquitetura e o padrão de projeção retiniana

nestas estruturas no morcego Artibeus planirostris, foram realizadas injeções intra-oculares de

CTb e analisadas secções coronais do encéfalo coradas pelo método de Nissl e secções

submetidas à imunoistoquímica para CTb. Quanto ao padrão citoarquitetônico, o GLD

apresentou-se como um núcleo homogêneo e sem laminação aparente. Entretanto, quanto a

projeção retiniana o núcleo apresentou duas camadas com intensidade de marcação

significativamente diferentes, sendo a projeção predominantemente contralateral. O CS foi

identificado como uma estrutura laminar composta por sete camadas, onde a marcação de

fibras e varicosidades imunorreativos a CTb foi observada exclusivamente no lado

contralateral, tendo como alvo as camadas zonal e cinzenta superficial. Foram identificados

compondo o CPT os núcleos pré-tectal medial, pré-tectal olivar, pré-tectal anterior, pré-tectal

posterior e o núcleo do tracto óptico, onde apenas o núcleo pré-tectal anterior não apresentou

inervação da retina, sendo esta predominantemente contralateral para todos os demais núcleos

que compõem o CPT. Em conjunto, os dados apontam a presença de especializações

morfológicas nos núcleos estudados, não observadas previamente em outras espécies de

quirópteros e, finalmente, o presente trabalho é o primeiro a abordar, estereologicamente e

morfometricamente, essas áreas em Yangochiroptera.

Palavras chave: Sistema visual, Nissl, CTb, densidade óptica relativa, estereologia,

quirópteros

ABSTRACT

In many vertebrates, most of the brain is devoted to the processing of vision, more

than any other sensory modality. This is probably due to the extremely complex task required

from vision: classifying and translating the wide range of visual stimuli that animals face in

the physical environment. The retina modifies and processes light trigged signals in

photoreceptors, which are sent to higher centers by ganglion cells. These cells axons form the

optic nerves, which deliver visual information to brain structures with diverse functions such

as the dorsal lateral geniculate nucleus (DGL), from which the visual information rises to the

cerebral cortex; the superior colliculus (SC), responsible for mediating visuomotor funtions;

and the pretectal complex (PTC), involved in the pupillary light reflex and optokinetic

nystagmus. In order to describe the citoarchitecture and the pattern of retinal projection in

these structures in Artibeus planirostris bat, CTb intraocular injections were performed and

coronal sections of the brain stained with Nissl method and sections subjected to

immunohistochemistry for CTb were analyzed. Regarding to the cytoarchiteture, DGL was

homogeneous and without evident lamination. However, the retinal projection revealed two

layers with significantly different marking intensity, and massive contralateral input. The SC

was identified as a laminar structure composed by seven layers, where retinal input was

observed only on the contralateral side, targeting the superficial layers I and II. Medial

pretectal nucleus, pretectal olivary nucleus, anterior pretectal nucleus, posterior pretectal

nucleus and nucleus of optic tract were identified composing the PTC. Only the anterior

pretectal nucleus lack retinal input, which is predominantly contralateral in all other nuclei. In

sumary, the results show morphometrical and stereological features in a bat species for the

first time.

Keywords: Visual system, Nissl, CTb, relative optical density, stereology, bats

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Distribuição geográfica do Artibeus planirostris.

Figura 2: Artibeus planirostris.

Figura 3: Árvore molecular das famílias de morcegos existentes.

Figura 4: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de Artibeus

planirostris mostrando a citoarquitetura do GLD.


planirostris mostrando a morfologia das células do GLD.

Figura 6: Média (± desvio padrão) da área das células do GLD para cada animal analisado.

Figura 7: Média (± desvio padrão) da área das células para cada região analisada.


planirostris mostrando a citoarquitetura do CPT.


planirostris mostrando a morfologia das células do CPT.

Figura 10: Média (± desvio padrão) da área das células do PTM para cada animal analisado.

Figura 11: Média (± desvio padrão) da área das células do PTO para cada animal analisado.

Figura 12: Média (± desvio padrão) da área das células do PTO ao longo do eixo rostrocaudal.

Figura 13: Média (± desvio padrão) da área das células do NTO para cada animal analisado.

Figura 14: Média (± desvio padrão) da área das células do PTP para cada animal analisado.

Figura 15: Média (± desvio padrão) da área das células do PTP ao longo do eixo rostrocaudal.

Figura 16: Média (± desvio padrão) da área das células para cada núcleo do CPT.

Figura 17: Fotomicrografia em campo claro de secção coronal do encéfalo de Artibeus

planirostris mostrando a citoarquitetura do CS.

Figura 18: Média (± desvio padrão) da área das células do CS para cada animal analisado.


planirostris mostrando a morfologia das células do CS.

Figura 20: Volume total das regiões do sistema visual primário de Artibeus planirostris.


planirostris mostrando a marcação das projeções retinianas no GLD.

Figura 22: Média (± erro padrão) da DOR do GLD para cada animal analisado.

Figura 23: Média (± erro padrão) da DOR para cada região analisada.


planirostris mostrando o detalhe das projeções retinianas no GLD.


planirostris mostrando a marcação das projeções retinianas no CPT.

Figura 26: Média (± erro padrão) da DOR do CPT para cada animal analisado.


planirostris mostrando o detalhe das projeções retinianas no CPT.

Figura 28: Fotomicrografia em campo claro de secção coronal do encéfalo de Artibeus

planirostris mostrando a marcação das projeções retinianas no CS.

Figura 29: Média (± erro padrão) da DOR do CS para cada animal analisado.


planirostris mostrando o detalhe das projeções retinianas no CS.

LISTA DE ABREVIAÇÕES

3v Terceiro ventrículo

Aq Aqueduto cerebral

CE Coeficiente de erro

CS Colículo superior

CBI Camada branca intermédia

CBP Camada branca profunda

CCI Camada cinzenta intermédia

CCP Camada cinzenta profunda

CCS Camada cinzenta superficial

CL Núcleo central lateral

CM Núcleo centromediano

cp Comissura posterior

CPT Complexo pré-tectal

CTO Camada do tracto óptico

CZ Camada zonal

CTb Subunidade b da toxina colérica

DAB Diaminobenzidina

DOR Densidade óptica relativa

FIG Folheto intergeniculado

GLD Núcleo geniculado lateral dorsal

GLV Núcleo geniculado lateral ventral

HbM Núcleo habenular porção medial

HbL Núcleo habenular porção lateral

IMD Núcleo intermédio dorsal

LD Núcleo lateral dorsal

LP Núcleo lateral posterior

MD Núcleo médiodorsal

NTO Núcleo do tracto óptico

PB Núcleo parabigeminal

Pcom Núcleo pré-comissural

PF Núcleo parafascicular

Po Núcleo posterior

PTA Núcleo pré-tectal anterior

PTO Núcleo pré-tectal olivar

PTM Núcleo pré-tectal medial

PTP Núcleo pré-tectal posterior

PVT Núcleo paraventricular do tálamo

SCP Substância cinzenta periaquedutal

UTM Sistema universal transverso de mercator

VP Núcleo ventral posterior

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO....................................................................................................................14

1.1 – Núcleo geniculado lateral dorsal..........................................................................15

1.2 – Complexo pré-tectal.............................................................................................16

1.3 – Colículo superior..................................................................................................17

1.4 – Considerações sobre o modelo animal.................................................................19

1.4.1 – Taxonomia e filogenia...........................................................................21

2. JUSTIFICATIVA................................................................................................................23

3. OBJETIVOS........................................................................................................................24

3.1 – Geral.....................................................................................................................24

3.2 – Específicos...........................................................................................................24

4. METODOLOGIA...............................................................................................................25

4.1 – Sujeitos.................................................................................................................25

4.1.2 – Métodos de identificação taxonômica...................................................26

4.2 – Procedimentos......................................................................................................26

4.2.1 – Anestesia................................................................................................26

4.2.2 – Injeção intraocular.................................................................................27

4.2.3 – Perfusão.................................................................................................27

4.2.4 – Remoção dos encéfalos e microtomia...................................................28

4.2.5 – Imunoistoquímica..................................................................................28

4.3 – Obtenção das imagens..........................................................................................30

4.4 – Análise estereológica............................................................................................30

4.5 – Morfometria.........................................................................................................31

4.6 – Densidade óptica relativa.....................................................................................32

4.7 – Análise estatística.................................................................................................33

5. RESULTADOS....................................................................................................................34

5.1 – Citoarquitetura.....................................................................................................34

5.1.1 – Núcleo geniculado lateral dorsal...........................................................34

5.1.2 – Complexo pré-tectal..............................................................................37

5.1.3 – Colículo superior...................................................................................45

5.1.4 – Análise estereológica.............................................................................47

5.2 – Projeção retiniana.................................................................................................48

5.2.1 – Núcleo geniculado lateral dorsal...........................................................48

5.2.2 – Complexo pré-tectal..............................................................................52

5.2.3 – Colículo superior...................................................................................57

6. DISCUSSÃO........................................................................................................................61

6.1 – Núcleo geniculado lateral dorsal..........................................................................62

6.2 – Complexo pré-tectal.............................................................................................67

6.3 – Colículo superior..................................................................................................69

7. CONCLUSÕES...................................................................................................................73

8. REFERÊNCIAS..................................................................................................................74

14

1. INTRODUÇÃO

Em muitos vertebrados, particularmente primatas, a maior parte do cérebro é

devotada ao processamento da visão, sensibilidade fundamental para a adaptação ao meio

ambiente. Isto se deve provavelmente à extrema complexidade da tarefa que é exigida pela

visão: classificar e interpretar a ampla gama de estímulos visuais que confrontamos no

ambiente físico, como a detecção de presas, predadores e reconhecimento de parceiros sexuais.

Nos níveis mais altos do processamento, o córtex cerebral extrai deste ambiente diversas

qualidades, como: movimento, cor, textura e profundidade; e a partir dessas qualidades

direciona e otimiza os comportamentos. Sendo assim, as informações que guiam o

comportamento animal são adquiridas por meio dos sentidos, e a visão é, de longe, a fonte de

informação mais importante para os primatas (Kandel e Wurtz, 2000).

A retina modifica e processa sinais evocados pela luz nos fotorreceptores que depois

são enviados a centros superiores pelas células ganglionares. Diferente dos cones e bastonetes,

que respondem a luz com mudanças graduais no potencial de membrana, as células

ganglionares transmitem a informação como potenciais de ação. Os axônios destas células

formam os nervos ópticos que distribuem a informação visual a estruturas encefálicas com

diversas funções. Entre os fotorreceptores e as células ganglionares existem três classes de

interneurônios: bipolares, horizontais e as células amácrinas. Estes interneurônios não

simplesmente transmitem sinais dos fotorreceptores para as células ganglionares, eles também

combinam sinais de vários fotorreceptores de tal modo que as respostas elétricas evocadas nas

células ganglionares dependem de padrões espaciais e temporais precisos (Tessier-Lavigne,

2000).

As projeções centrais das células ganglionares da retina foram estudadas

extensivamente em muitas espécies de mamíferos (Moore e Card, 1994; Moore et al., 1995;

Qu et al., 1996; Ling et al., 1998; Costa et al., 1999; Cavalcante et al., 2005; Morin e Allen,

2006; Engelberth et al., 2008; Nascimento et al., 2008; Nascimento et al., 2010; Sousa et al.,

2013; Morais et al., 2014; Scalia et al., 2015). A principal estação de processamento e

retransmissão do sinal visual ocorre em um grupo de células do tálamo, chamado núcleo

geniculado lateral dorsal (GLD), do qual a informação ascende ao córtex cerebral, onde será

interpretada e evocada. As projeções retinianas para o colículo superior, responsável por

integrar sinais visuo-motores, e para a área pré-tectal, envolvida no controle do reflexo pupilar

à luz, somadas àquelas para o GLD, constituem o sistema visual primário (Kaas e Huerta,

1988).

15

1.1 NÚCLEO GENICULADO LATERAL DORSAL

No complexo geniculado lateral de mamíferos pode-se reconhecer três componentes.

O primeiro, o GLD, derivado do tálamo dorsal, é composto em sua maior parte por células de

projeção tálamo-cortical, ou seja, que enviam a informação visual originária da retina ao

córtex cerebral. O GLD pode variar entre espécies, sendo um núcleo com várias camadas ou

uma massa homogênea de células (Kaas e Huerta, 1988; Groenewegen e Witter, 2004). O

segundo componente do complexo, o núcleo geniculado lateral ventral (GLV) é derivado do

tálamo ventral e não se projeta para o córtex cerebral (Jones, 2007). Por fim, o terceiro

componente do complexo é o folheto intergeniculado (FIG), descrito por Hickey e Spear

(1976) em ratos como uma lâmina celular intercalada entre os núcleos GLD e GLV que recebe

projeções da retina bilateralmente. Em primatas, o núcleo pré-geniculado, uma camada

delgada de pequenas células, pode ser o homólogo do GLV e do FIG em roedores (Moore,

1993; Lima et al., 2012).

Em ratos, o GLD pode ser identificado facilmente pelo método de Nissl,

apresentando citoarquitetura bastante homogênea, diferente do que ocorre em outras espécies

de mamíferos, que apresentam camadas bem definidas (Groenewegen e Witter, 2004).

Entretanto, a projeção retiniana dos olhos ipsi e contralateral revelam uma forma de

laminação não visualizada por métodos citoarquitetônicos no GLD do rato (Reese, 1988). A

camada externa, diretamente associada ao tracto óptico, chamada de outer shell, recebe

aferência do olho contralateral, e a camada interna, chamada de inner core, consiste em duas

regiões, uma medial, que recebe aferência do olho contralateral, e uma região lateral, inervada

pelo olho ipsilateral (Reese, 1988; Jones, 2007).

Em primatas, humanos e não humanos, o GLD fica situado rostral e lateralmente ao

corpo geniculado medial, lateralmente ao pedúnculo cerebral e ventralmente ao pulvinar

(Parent, 1996). Apresenta uma estrutura laminar, variando de acordo com a espécie, em até

seis camadas concêntricas, numeradas de 1 a 6 no sentido ventro-dorsal onde os neurônios

apresentam distinção morfológica e fisiológica. Estas camadas recebem intensa projeção da

retina e podem ser dispostas da seguinte maneira: duas camadas mais ventrais do núcleo que

contêm células relativamente grandes, sendo assim chamadas camadas magnocelulares e

quatro camadas dorsais contendo células relativamente pequenas, conhecidas como camadas

parvocelulares (Kaas e Huerta, 1988).

A projeção da retina para o GLD de primatas segue um padrão de inervação

específico, onde cada camada recebe a projeção de um único olho. As fibras do olho

16

contralateral, fibras cruzadas no quiasma óptico, pertencentes à retina nasal fazem sinapse nas

camadas 1, 4 e 6 do GLD, enquanto que as fibras do olho ipsilateral, fibras não cruzadas no

quiasma óptico, pertencentes à retina temporal o fazem nas camadas 2, 3 e 5 (Kaas e Huerta,

1988).

Em quirópteros da subordem Yinpterochiroptera, o GLD ocupa a porção lateral do

tálamo dorsal por quase toda sua extensão anteroposterior, apresentando formato arqueado ou

biconvexo (Cotter e Pentney, 1979). Através da coloração de Nissl e da citocromo oxidase é

possível reconhecer três principais camadas: uma camada externa ou camada 1, com corpos

neuronais maiores quando comparada às demais camadas; uma camada média ou camada 2 e

uma camada interna ou camada 3 (Manger e Rosa, 2005). A laminação do GLD tem sido

descrita em detalhes na subordem Yinpterochiroptera em estudos anteriores, existindo entre

eles alguma variação de nomenclatura (Cotter e Pentney, 1979; Pentney e Cotter, 1981;

Pettigrew et al., 1989; Ichida et al., 2000). Na subordem Yangochiroptera, o GLD não

apresenta estratificação celular clara, tanto em Myotis lucifugus (Cotter e Pentney, 1979)

quanto em Carollia perspicillata (Scalia et al., 2015), Eptesicus fuscus e Artibeus jamaicensis

(Cotter, 1985).

1.2 COMPLEXO PRÉ-TECTAL

O complexo pré-tectal (CPT) é uma estrutura situada na transição mesodiencefálica,

entre o tálamo e o colículo superior (Büttner-Ennerver et al., 1996). Em mamíferos, é uma

região altamente especializada no controle de várias funções como o reflexo pupilar a luz

(Kaas e Huerta, 1988) e o nistagmo optocinético (Telkes et al., 2001), formando extensas

ligações com numerosos centros visuais subcorticais (Büttner-Ennever e Horn, 1997). Os

núcleos do tracto óptico (NTO), pré-tectal posterior (PTP), pré-tectal olivar (PTO), pré-tectal

medial (PTM), e o pré-tectal anterior (PTA) compõem o CPT em: mico-de-cheiro (Huthchins

e Weber, 1985), gato (Kaneseki e Sprague, 1974; Avendaño e Juretschke, 1980), coelho

(Giolli e Guthrie, 1967), gambá (Vargas et al., 1996), e roedores (Scalia, 1979; Eichler e

Moore, 1974), sendo assim agrupados de acordo com suas características morfológicas e

funcionais entre as espécies.

Com relação aos humanos, Kuhlenbeck e Miller (1949) dividiram o CPT de acordo

com estudos de citoarquitetura e mieloarquitetura em: nucleus lentiformis, nucleus

sublentiformis, nucleus pretectalis principalis, area pretectalis propria e nucleus pretectalis

olivaris. Entretanto, Borostyánkoi-Baldauf e Herczeg (2002), baseados em imunoistoquímica

para o neuropeptídio Y (NPY) e para o polipeptídio intestinal vasoativo (VIP), propõem uma

17

nova nomenclatura para o CPT em humanos, onde o nucleus lentiformis, nucleus

sublentiformis, nucleus pretectalis principalis, area pretectalis propria e nucleus pretectalis

olivaris correspondem respectivamente ao NTO, PTP, PTA, PTM e PTO.

As projeções retinianas para o complexo pré-tectal foram descritas previamente em

detalhes no rato (Scalia e Arango, 1979), mico-de-cheiro (Huthchins e Weber, 1985), hamster

(Ling et al., 1998; Morin e Blanchard, 1997), rato-toupeira-africano (Nemec et al., 2004) e no

rato do Nilo (Gaillard et al., 2013). Estas projeções atingem o CPT bilateralmente. Entretanto,

observa-se uma dominância contralateral como visto em roedores da família Bathyergidae

(Crish et al., 2006; Nemec et al., 2008), no rato-do-Nilo (Gaillard et al., 2013), no hamster

(Ling et al., 1998; Morin e Blanchard, 1997), em morcegos como o Pteropus giganteus,

Myotis lucifugus, Eptesicus fuscus e Artibeus jamaicensis (Cotter e Pentney, 1979; Cotter,

1985), em roedores da família Cricetidae (Herbin et al., 1994), e, em ratos Sprague-Dawley

(Scalia e Arango, 1979).

1.3 COLÍCULO SUPERIOR

O colículo superior (CS) é uma estrutura laminar que ocupa a porção rostral do tecto

mesencefálico de vertebrados e desempenha dois papéis na visão: participa na transmissão de

informação visual para estruturas talâmicas associadas com a percepção e participa da

integração da informação visual e outros tipos de informação em sinais que controlam os

movimentos dos olhos e cabeça (Kaas e Huerta, 1988).

A característica mais marcante do CS de mamíferos é a sua disposição em camadas,

com base tanto na distribuição de fibras quanto nas variações do tamanho e densidade dos

neurônios (May, 2006). Sete camadas são tradicionalmente reconhecidas dentro do CS de

mamíferos. Essas camadas estão dispostas concentricamente em torno da porção dorsolateral

da substância cinzenta periaquedutal e numeradas da superfície (camada 1) à profundidade

(camada 7) do tecto mesencefálico (Kaas e Huerta, 1988).

Com base em dados anatômicos e comportamentais, estas camadas podem ser

agrupadas em duas unidades funcionais: compartimento superficial e profundo. O

compartimento superficial é formado pelas seguintes camadas superficiais: camada zonal

(CZ), camada cinzenta superficial (CCS) e a camada do tracto óptico (CTO), que recebem

projeções quase exclusivamente da retina. O compartimento profundo é formado por camadas

intermediárias: camada cinzenta intermédia (CCI) e camada branca intermédia (CBI); e por

camadas profundas: camada cinzenta profunda (CCP) e camada branca profunda (CBP), que

recebem informações de várias modalidades sensoriais como visão, audição e somestesia, e

18

possuem neurônios com propriedades motoras (Gandhi e Sparks, 2003).

Inúmeros trabalhos em diferentes animais, como gato (Norita, 1980), humano

(Laemle, 1983), Macaca mulatta (Ma et al., 1990) e musaranho (Tupaia glis) (Graham e

Casagrande, 1980), baseados na técnica de Golgi, propõem diferentes nomenclaturas e

categorias celulares para o CS. Nas camadas superficiais, a maioria dos estudos observou

células horizontais; células de campo estreito, orientadas verticalmente; células de campo

largo, onde seus dendritos se estendem obliquamente em direção a superfície do CS; células

estreladas, cujos dendritos não mostram orientação; e pequenas células localizadas na borda

da CZ. Nas camadas profundas do CS, todos os estudos descrevem vários tipos de células

multipolares, que variam em tamanho e em alguns casos têm seus dendritos orientados mais

verticalmente ou horizontalmente (May, 2006).

O CS desenvolveu-se em uma área onde as informações sensoriais visuais podem ser

utilizadas para controlar o comportamento, orientando o animal em direção aos objetos de

interesse e o afastando de objetos que possam representar uma ameaça (May, 2006). A

projeção da retina ao CS atinge primariamente a CCS, com menor inervação da CZ, em gato

(Graybiel, 1976), furão (Zhang e Hoffmann, 1993), Macaca mulatta (Pollack e Hickey, 1979),

rato (Lund et al.,1980) e esquilo (Citellus tridecemlineatus) (Petry et al., 1989).

Existem diferenças entre espécies na projeção retinotectal relacionada com o grau a

que os olhos se encontram no plano frontal para produzir sobreposição binocular. Por

exemplo, em roedores que possuem uma pequena região de sobreposição binocular, a maioria

dos axônios da retina inervam a porção contralateral do CS (Lund et al., 1980; Cusick e Kaas,

1982; Major et al., 2003). Em animais que possuem um maior grau de sobreposição binocular,

como o gato (Graybiel, 1976) e macaco do gênero Saimiri (Tigges e Tigges, 1981), um padrão

mais complexo de inervação é observado. Estudos com gato (Harting et al., 1992), primatas

do gênero Macaca e Saimiri (Lui et al., 1995; Tigges e Tigges, 1981) e musaranho (Tupaia

glis) (Huerta et al., 1985) mostram que além dos aferentes retinianos, as camadas superficiais

do CS também recebem aferências das áreas 17, 18 e 19 de Brodmann, bem como do núcleo

parabigeminal (PB) e do CPT (May, 2006). O PB projeta bilateralmente para as camadas

superficiais do CS em gato (Sherk, 1979), furão (Jiang et al.,1996) e macaco (Baizer et

al.,1991), sendo ambas as projeções colinérgicas (Baizer et al.,1991; Hall et al., 1989; Wang et

al., 1988). Essas projeções exercem efeito inibitório via interneurônios gabaérgicos que

modulam a resposta das células tectogeniculadas (Binns e Salt, 2000; Lee et al., 2001).

Quanto ao CPT, as projeções ao CS são principalmente ipsilaterais (May, 2006),

19

emergindo primariamente do NTO e do PTP (Edwards et al., 1979; Weber e Harting, 1980).

Em gato e coelho, o NTO projeta-se à CCS (Holstege e Collewijn, 1982; Borostyánkoi-

Baldauf et al., 2003), enquanto que, em Macaca mulatta (Büttner-Ennever et al., 1996) e

musaranho (Weber e Harting, 1980), o NTO e o PTP projetam-se para a CCS, mas também

podem inervar a CZ e a CCI na sua porção mais superficial. Essas projeções do CPT ao CS

são, em sua grande maioria, gabaérgicas (Borostyánkoi-Baldauf et al., 2003).

1.4 CONSIDERAÇÕES SOBRE O MODELO ANIMAL

Primatas não-humanos, e carnívoros em geral, têm sido utilizados historicamente

como modelos para estudos envolvendo a análise dos mecanismos anatômicos e fisiológicos

subjacentes ao processamento visual em mamíferos. Em relação à filogenia, primatas não-

humanos compartilham com os humanos uma alta capacidade de distinção de cores e uma

extensiva sobreposição binocular. Outro grupo de mamíferos, os quirópteros, apresenta

estruturas diferenciadas de orientação sensório-motora, um sistema de sonar capaz de detectar

a presença de barreiras físicas ou até mesmo a presença de uma presa no ambiente (Schnitzler

e Kalko, 2001). Assim, este grupo de mamíferos apresenta um sistema auditivo muito mais

integrado ao sistema motor quando comparado ao sistema visual e, talvez por isso, pouco tem

sido explorado quanto aos aspectos morfológicos e fisiológicos envolvidos no seu

processamento visual.

Artibeus planirostris (Chiroptera, Phyllostomidae) apresenta ampla distribuição

geográfica (Figura 1), ocorrendo em zonas tropicais de diversos países ao longo da metade

norte da América do Sul (Hollis, 2005). É um morcego comum em muitas regiões do Brasil

(Zortéa, 2007), inclusive no Rio Grande do Norte (Barros, dados não publicados). Apresenta

pelagem de coloração castanha-acinzentada e listras faciais pouco evidentes. É uma espécie

de tamanho médio, com comprimento do corpo variando de 7,5 a 11 cm, e peso entre 40 e 69

gramas (Reis et al., 2013).

A. planirostris (Figura 2) é um morcego primariamente frugívoro, alimentando-se de

uma grande variedade de frutas silvestres e cultivadas e, em menor frequência, de néctar,

pólen e insetos (Zortéa, 2007). Habita fragmentos de mata, em áreas de floresta úmida ou

xeromórfica. Durante o dia, a espécie utiliza folhagem e ocos de árvores como abrigo (Reis et

al., 2013). Embora atividade tenha sido registrada em diferentes horários ao longo do período

noturno, A. planirostris é uma espécie mais ativa no início da noite, principalmente na

segunda e terceira hora após o pôr do sol (Bernard, 2002

20

Figura 1: Área de distribuição geográfica do Artibeus planirostris, destacada em amarelo. (Em:

<http://maps.iucnredlist.org/map.html?id=2139> Acesso em: 31 de maio de 2016).

Figura 2: Espécime macho de Artibeus planirostris (Foto: Marília Barros).

http://maps.iucnredlist.org/map.html?id=2139

21

A. planirostris é uma espécie oportunista e utiliza, principalmente, hábitats fechados

onde forrageia junto à vegetação (Bernard, 2002). Apresenta estratégia de forrageio do tipo

“coletor” (gleaning), que consiste na captura de alimentos relativamente estacionários junto a

uma superfície – em contraste com morcegos “aéreos” (aerial) que capturam presas em vôo

(Kalko et al., 1996). Ao localizar uma fonte de frutos, os morcegos voam em círculos ao redor

da mesma e então se aproximam de um fruto individual (Kalko, 1994). Ainda em vôo ou com

um breve pouso na planta, os morcegos mordem, puxam e arrancam a fruta, voando para um

poleiro temporário, geralmente sob as folhas de uma árvore, onde a ingerem (Kalko et al.,

1996). As sementes grandes são descartadas e as pequenas são ingeridas (Handley et al.,

1991).

Morcegos frugívoros da família Phyllostomidae podem utilizar o olfato e a

ecolocalização na busca e discriminação de frutos (Kalko, 1994; Kalko e Condon, 1998; Thies

et al., 1998; Korine e Kalko, 2005). O papel da visão na ecologia sensorial de morcegos no

geral ainda é pouco conhecido, mas morcegos frugívoros, incluindo espécies do gênero

Artibeus, apresentam maior acuidade visual e capacidade de discriminar formas em

comparação a morcegos com outros tipos de hábito alimentar (Suthers, 1966; Neuweiler,

2000). Estudos morfológicos, moleculares e eletrofisiológicos sugerem que morcegos

filostomídeos são capazes de perceber cores (Hope e Bhatnagar, 1979; Wang et al., 2004;

Müller et al., 2009), o que foi apoiado por evidências comportamentais em um estudo

realizado com Artibeus lituratus (Gutierrez et al., 2014).

1.4.1 TAXONOMIA E FILOGENIA

A ordem Chiroptera tem sido tradicionalmente dividida, com base em caracteres

morfológicos de espécies fósseis e atuais, em duas subordens monofiléticas: Megachiroptera e

Microchiroptera (Simmons, 1994; Simmons e Geisler, 1998). Os megaquirópteros

correspondem a uma única família (Pteropodidae), à qual pertencem as espécies de raposas-

voadoras que ocorrem exclusivamente nas zonas tropicais do Velho Mundo (Neuweiler, 2000).

Já os microquirópteros são cosmopolitas e englobam as 17 demais famílias (Simmons, 1998),

incluindo a família Phyllostomidae, à qual pertence A. planirostris. Os microquirópteros

desenvolveram um complexo sistema de ecolocalização laringeal ausente nas raposas-

voadoras, que apresentam apenas algumas espécies cavernícolas (gênero Rousettus) capazes

de utilizar um sistema rudimentar de ecolocalização a partir de estalidos da língua

(Altringham, 1996).

22

Porém, esta classificação tem sido contrariada por estudos filogenéticos baseados em

dados moleculares, que indicam que alguns grupos de morcegos com ecolocalização

sofisticada compartilham um ancestral comum com as raposas-voadoras (Teeling et al. 2005;

Van den Bussche e Hoofer, 2004; Teeling, 2009). Dessa forma, a família Pteropodidae e mais

cinco famílias de microquirópteros foram agrupados na subordem Yinpterochiroptera, e as

famílias restantes, incluindo a Phyllostomidae, na subordem Yangochiroptera (Figura 3)

(Jones e Teeling, 2006; Teeling et al., 2012).

Dentre os diferentes táxons de morcegos, a família Mormoopidae é a mais próxima

filogeneticamente da família Phyllostomidae (Jones e Teeling, 2006; Datzmann et al., 2010).

Muito provavelmente, o ancestral comum de ambas as famílias foi um insetívoro, uma vez

que a insetivoria estrita é a estratégia de forrageio adotada pelos mormoopídeos e pela maciça

maioria das espécies de morcegos (Baker et al., 2012). Morcegos filostomídeos especializados

no consumo de frutos, como os do gênero Artibeus, representam condições mais derivadas e

recentes em relação às espécies insetívoras/onívoras, hematófagas, carnívoras e nectarívoras

desta família (Baker et al., 2012). As relações filogenéticas entre as diferentes espécies de

Artibeus têm sido amplamente debatidas nos últimos anos (e.g. Marques-Aguiar, 1994; Van

Den Bussche et al., 1998; Lim et al., 2004). Estudos indicam que A. planirostris é espécie

irmã de A. amplus e estreitamente relacionada à A. obscurus (Redondo et al., 2008), porém a

filogenia do gênero ainda não está resolvida.

Figura 3: Árvore molecular das famílias de morcegos existentes. Família do modelo

experimental em destaque. (Adaptado de Jones e Teeling, 2006).

23

2. JUSTIFICATIVA

Embora a ecolocalização seja a principal ferramenta de navegação utilizada pelos

morcegos durante o voo, a visão desempenha um importante papel na resolução de diferentes

tarefas cotidianas, como, por exemplo, o forrageio. Levando-se em consideração a

importância fisiológica e comportamental do sistema visual, sobretudo em morcegos

frugívoros, como é o caso do gênero Artibeus, que possuem a visão mais desenvolvida em

relação a espécies de outros hábitos alimentares, é fundamental aprofundar o conhecimento

acerca da organização desse sistema.

Poucos estudos abordam a organização citoarquitetônica e o padrão de distribuição das

projeções retinianas no sistema visual de quirópteros. Nosso trabalho é o primeiro estudo

realizado em morcegos que descreve essas características a partir de análises morfométricas,

estereológicas e de densidade óptica relativa.

Assim, o presente estudo visa compreender o padrão de distribuição das projeções

retinianas e caracterizar a citoarquitetura do sistema visual primário do morcego A.

planirostris, pois, no que se refere à análise do mapeamento anatômico cerebral, esta espécie

é pouco estudada, apresentando amplo campo de pesquisa em um modelo animal de mamífero

voador.

O trabalho propõe-se a contribuir com as correlações filogenéticas ao longo do

desenvolvimento das vias visuais, oferecendo o substrato necessário para futuros estudos

comparativos dessas vias, bem como, estabelecer a caracterização das áreas encefálicas

envolvidas no estudo.

24

3. OBJETIVOS

3.1 GERAL

Este trabalho tem como objetivo estabelecer a configuração do sistema visual

primário de A. planirostris, tendo como referência o padrão de distribuição das projeções

retinianas, associado às características citoarquitetônicas do encéfalo destes animais.

3.2 ESPECÍFICOS

• Identificar e caracterizar os núcleos que compõem o sistema visual primário através da

correlação das projeções retinianas com a citoarquitetura;

• Descrever morfologicamente as projeções retinianas nos núcleos que compõem o

sistema visual primário;

• Estimar o volume total dos núcleos que formam o sistema visual primário;

• Verificar, através da análise de densidade óptica relativa, as diferenças nos padrões de

densidade de fibras imunorreativas a CTb distribuídas no sistema visual primário.

25

4. METODOLOGIA

4.1 SUJEITOS

Foram utilizados 10 espécimes de A. planirostris capturados no campus da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal (RN), nordeste do Brasil (Licença

SISBIO Nº 25233-2).

As coletas foram realizadas em quatro diferentes ocasiões: nos dias 18/10/2012,

21/11/2012 e 26/02/2013 na borda de um fragmento de vegetação, no Centro de Biociências

(Coordenadas em UTM: 25M 256251 / 9353764), e no dia 13/06/2013 no interior de um

agrupamento arbóreo, nas proximidades da Reitoria da UFRN (Coordenadas em UTM: 25M

256226 / 9354214).

Para as capturas, foram utilizadas de uma a três redes de neblina Ecotone® de nylon,

dimensões 12 x 3 m e tamanho de malha 19 x 19 mm. As redes foram armadas no nível do

solo e, em cada noite de captura, foram abertas logo após o pôr do sol e permaneceram

expostas por duas horas consecutivas.

Cada indivíduo capturado foi analisado quanto ao sexo e à faixa etária. Para o presente

estudo, foram coletados apenas morcegos machos adultos, mantidos em sacos de algodão até

o término da amostragem e transporte até o laboratório. Os demais indivíduos foram soltos no

mesmo local de captura.

Os animais foram acomodados no Centro de Biociências, UFRN, em gaiolas

medindo 0,50 x 0,70 x 0,35 m, onde havia caixas ninho medindo 0,15 x 0,13 x 0,29 m. A sala

onde foram alocadas as gaiolas pertence a um anexo dos laboratórios de Anatomia Animal. Os

animais foram expostos a luminosidade, temperatura e umidade controladas, com comida e a

água ad libitum. Os animais permaneceram neste recinto durante a sobrevida após a injeção

intraocular. Todos os animais utilizados estavam em boas condições de saúde.

Todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e sofrimento aos animais

durante os procedimentos experimentais, seguindo estritamente as normas estabelecidas pelo

Comitê de Ética para Uso de Animais da UFRN (CEUA-UFRN), tendo sido o projeto

referente a este trabalho considerado adequado às normas e princípios da Lei Arouca, a qual

versa sobre o tratamento de animais em pesquisas e atividades científicas (protocolo de

número 009/2012). Todos os procedimentos foram realizados no Laboratório de

Neuranatomia, Departamento de Morfologia, UFRN, vinculado ao Programa de Pós-

graduação em Psicobiologia.

26

4.1.2MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA

Todos os indivíduos capturados foram identificados por uma especialista em

quirópteros (Msc. Marília Abero Sá de Barros). Em campo, a identificação até o nível de

espécie foi baseada em um conjunto de características morfológicas externas de acordo com

os trabalhos de Aguirre e colaboradores (2009), Haynes e Lee Jr. (2004), Hollis (2005),

Miranda e colaboradores (2011), Reis e colaboradores (2013) e Simmons e Voss (1998).

Para diferenciar espécies do gênero Artibeus, estes estudos levam em consideração,

principalmente, padrões da pelagem, das listras faciais e da morfologia da folha nasal, e a

espécie em questão foi identificada como A. planirostris por apresentar: 1. pelagem castanho-

clara ou cinza-clara, curta, pouco densa e áspera; 2. listras faciais pouco evidentes; 3. borda

inferior da folha nasal completamente livre; 4. antebraço com poucos pêlos; 5. pontas das asas

esbranquiçadas; 6. bordas das orelhas e trago de coloração não diferenciada; 7. ausência de

máscara escura ao redor dos olhos.

Todos os indivíduos capturados corresponderam a exemplares típicos de A.

planirostris, exceto pelo comprimento do antebraço (< 62 mm), menor em relação ao descrito

para outras regiões da América do Sul (Aguirre et al., 2009; Barquez et al., 1999; Miranda et

al., 2011; Simmons e Voss, 1998). Porém, esta medida pode ser bastante variável (de 56 a 73

mm) (Reis et al., 2013) e, assim como foi observado para o Cerrado (Zortéa, 2007),

indivíduos da espécie aparentemente apresentam menor tamanho corporal no Rio Grande do

Norte (Barros, dados não publicados).

Para confirmação da identificação taxonômica em laboratório, um indivíduo da

espécie foi sacrificado para retirada e exame detalhado do crânio. A confirmação da espécie

com base na morfometria craniana foi realizada segundo os trabalhos de Barquez e

colaboradores (1999), Haynes e Lee Jr. (2004), Hollis (2005) e Simmons e Voss (1998). Esta

análise confirmou a identificação do indivíduo como A. planirostris, devido à ocorrência das

seguintes características morfológicas: 1. constrição pós-orbitária ampla (> 7,3 mm); 2. arco

supraorbital pouco acentuado; 3. processo pós-orbital pouco desenvolvido; 4. presença de

terceiro molar superior; 5. largura do canino > 8,4 mm; 6. maior comprimento do crânio (>

29.5 mm). Este indivíduo foi fixado em formol 10%, encontra-se mantido em álcool 70% e

será posteriormente tombado em uma coleção científica pública como material testemunho.

4.2 PROCEDIMENTOS

4.2.1 ANESTESIA

Os animais foram anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina (5

27

mg/kg), xilazina (0,5 mg/kg), diazepam (0,5 mg/kg) e cloridrato de tramadol (5 mg/kg).

Acrescido a isso, foi instilado 1 gota de tetracaína oftálmica no olho submetido a infusão de

CTb.

4.2.2 INJEÇÃO INTRAOCULAR

Os animais foram submetidos a uma injeção intraocular unilateral de 15µl de uma

solução aquosa da subunidade B da toxina colérica (CTb, List Biological Laboratories, Inc.,

Campbell, CA) a 5%, contendo dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% para aumentar a

permeabilidade e consequentemente melhorar a captação de CTb pelas células ganglionares

da retina. A injeção foi realizada no olho esquerdo utilizando-se uma agulha calibre 30G (0,3

mm x 25 mm), lentamente, sob pressão, com o auxílio de uma bomba de infusão de dois

canais (InSight), que impulsionou a solução num fluxo de 0,8 µl/minuto. A agulha foi

introduzida na junção esclero-corneal, atingindo o corpo vítreo, em um ângulo de

aproximadamente 45º. A agulha foi retirada 15 minutos após ter cessado o fluxo. Este

procedimento visa diminuir um possível refluxo da solução (Sousa et al., 2013). Durante o

período de recuperação (sobrevida), os animais retornaram para as gaiolas de origem, onde

receberam antibioticoterapia (cefalotina) e anti-inflamatório (meloxican) por via

intramuscular, e como suplementação o complexo vitamínico Bionew pela via subcutânea.

Após um período de sobrevida de cinco dias, os animais foram novamente anestesiados

(conforme protocolo anterior) e perfundidos.

4.2.3 PERFUSÃO

Após anestesia, cada animal foi submetido à perfusão transcardíaca, procedimento

que durou cerca de 30 minutos, compreendendo os seguintes passos:

1. Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame sob ponto de água.

2. Toracotomia, com incisão de pele, músculos e arco costal, sendo estes removidos em

bloco, para exposição do coração.

3. Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha de 16G (1,5 x 10 mm), a

qual foi direcionada para a aorta, seguindo-se de uma incisão no átrio direito. A agulha foi

conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer), passando-se 150 ml de solução salina

a 0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 com heparina (Parinex, Hipolabor, 2 ml/1000 ml

de solução salina) a um fluxo de 60 ml por minuto, seguida de 300 ml de solução de

paraformaldeido 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, sendo os primeiros 150 ml

injetados a um fluxo inicial de 60 ml por minuto e os 150 ml restantes a um fluxo final de

30 ml por minuto.

28

4.2.4 REMOÇÃO DOS ENCÉFALOS E MICROTOMIA

Concluída a etapa da perfusão, os encéfalos foram retirados da cavidade craniana por

fratura dos ossos da calota craniana, com o uso de um alicate. Em seguida foram pós-fixados

na mesma solução fixadora utilizada na perfusão por duas horas e então colocados em solução

sacarose 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, a 4 ºC, até serem submetidos à microtomia.

Os encéfalos foram congelados por gelo seco e seccionados em um micrótomo de

deslizamento. Foram obtidas secções frontais de 30 µm de espessura, as quais foram

distribuidas sequencialmente em 6 compartimentos, em um meio líquido contendo tampão

fosfato 0,1M, pH 7,4, de maneira cíclica e sequenciada. Desse modo, a distância entre uma

secção e a outra imediatamente seguinte de um mesmo compartimento é de aproximadamente

180 µm.

Os cortes de um compartimento foram imediatamente montados em lâminas de vidro

e submetidos à coloração de Nissl para permitir a demarcação das estruturas. Os cortes dos

demais compartimentos foram armazenados em solução anticongelante e conservados a -20

ºC para utilização posterior em procedimentos de imunoistoquímica.

Através da coloração de Nissl, o retículo endoplasmático rugoso, o núcleo e o nucléolo

das células foram seletivamente corados, sendo elas, neurônios ou células da glia,

proporcionando a possibilidade de identificá-las através de seu tamanho, forma e localização.

A cor resultante da marcação é azul-arroxeada. Esse procedimento foi realizado com cada um

dos animais utilizados, uma vez que podem ocorrer diferenças individuais nas estruturas

encefálicas.

4.2.5 IMUNOISTOQUÍMICA

A imunoistoquímica tem como princípio a utilização de um anticorpo específico ao

antígeno estudado, cuja interação pode ser identificada pela ligação a um marcador que pode

ser uma molécula fluorescente ou uma enzima (peroxidase ou fosfatase), cuja atividade será

utilizada para produzir um complexo colorido na presença de um cromógeno.

Sendo assim, os cortes de um compartimento de cada morcego foram submetidos à

imunoistoquímica para revelação de CTb transportada anterogradamente, com a finalidade de

detectar-se os alvos das projeções retinianas. As secções foram submetidas inicialmente a

cinco lavagens de cinco minutos cada, em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 em agitador orbital.

Em seguida, foram submetidas ao pré-tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2) a 0,3%

diluído em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 por vinte minutos para a neutralização da peroxidase

endógena, evitando aumento do background durante a reação de peroxidase à qual o tecido foi

29

submetido. Posteriormente, as secções foram submetidas a mais cinco lavagens de cinco

minutos cada em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4.

Após as lavagens, os cortes foram incubados em uma solução de bloqueio contendo

albumina de soro bovino (BSA) a 5% diluído em Triton X-100 durante sessenta minutos com

o propósito de bloquear sítios inespecíficos ao anticorpo primário. Em seguida, as secções

foram incubadas em solução contendo anticorpo primário anti-CTb obtido em cabra (List

Labs) em diluição de 1:1000, Triton X-100 0,4% e albumina de soro bovino a 2%, por 16

horas em rotor em baixa velocidade (60 a 80 rpm) a 24 ºC. Ao fim deste período, os cortes

foram lavados novamente por cinco vezes de cinco minutos cada em tampão fosfato 0,1M, pH

7,4.

Posteriormente a esta etapa, as secções foram colocadas em contato com o anticorpo

secundário biotinilado anti-cabra obtido em asno (Jackson Laboratories, Inc., Burlingame, CA)

diluído a 1:1000 em Triton X-100 0,4%, por noventa minutos à 24 ºC, sob agitação lenta (60 a

80 rpm), em rotor. Em seguida, os cortes passaram por mais uma sessão de lavagens

novamente em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 e foram colocados em solução de avidina e

biotina marcados com HRP (Elite ABC Kit Standard - Vector), numa diluição de 1:100 em

Triton X-100 a 0,4%, contendo NaCl, por noventa minutos. Essa solução foi preparada trinta

minutos antes para que ocorresse a formação de complexos avidina-biotina-peroxidase.

Ao fim da incubação neste complexo, os cortes foram lavados novamente por cinco

vezes de cinco minutos cada em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4. Para evidenciar a reação, as

secções foram expostas a meio contendo peróxido de hidrogênio (H2O2) como substrato e 25

mg de 3,3’,4,4’ tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DAB), utilizada como cromógeno. A

DAB foi diluída em 99 ml de tampão fosfato 0,1M, pH 7,4. A solução de DAB e tampão foi

preparada cinco minutos antes dos cortes entrarem em contato, e estes permaneceram em

contato com a solução durante aproximadamente cinco minutos. Após este período, foi

acrescentado H2O2 a 0,3%, que na solução final se torna 0,03%. Ao adicionar o H2O2, a reação

inicia e o substrato começa a ser utilizado, deixando reagir até que fique com coloração

marrom, cerca de 1 a 10 minutos. O tempo ideal de reação varia de acordo com o anticorpo.

Ao final desta etapa, os cortes foram lavados por cinco vezes de cinco minutos cada em

tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 em agitador orbital.

Os cortes foram montados em lâminas carregadas eletrostaticamente, que após secas

em temperatura ambiente, foram imersas em solução de tetróxido de ósmio a 0,05% com o

intuito de intensificar a reação. Após as etapas de desidratação, em baterias de álcool de

30

graduação crescente até o álcool absoluto, e diafanização em xilol, as lâminas foram cobertas

com lamínulas utilizando como meio de montagem ERV-Mount (Erviegas Ltda).

4.3 OBTENÇÃO DAS IMAGENS

As secções do encéfalo, coradas pelo método de Nissl ou submetidas à

imunoistoquímica para CTb, foram examinadas ao microscópio óptico (Nikon Ni-U) em

campo claro e então selecionadas. Imagens digitais foram obtidas de secções representativas

usando uma videocâmara digital (Nikon DS-Ri1) acoplada ao microscópio, ajustado com as

objetivas de 4X, 10X, 20X, e 100X, e conectada a um computador com o software NIS

instalado. As imagens foram analisadas, e, com auxílio do software Canvas XII,

transformadas em escala de cinza e ajustadas para brilho, contraste e resolução. O software

Canvas XII também foi utilizado para a construção dos esquemas, tomando como base o atlas

estereotáxico do cérebro de rato (Paxinos e Watson, 2007) e o atlas do morcego Carollia

perspicillata (Scalia et al., 2013).

4.4 ANÁLISE ESTEREOLÓGICA

Para estimar o volume dos núcleos do sistema visual primário de A. planirostris, foi

utilizado o Princípio de Cavalieri (Howard e Reed, 2005). Para isto, foram selecionadas entre

7 a 9 secções do GLD, 3 a 4 secções do CPT e 7 secções do CS, na coloração de Nissl de

cinco animais, contendo os núcleos em um aumento de 50 vezes. A amostragem de cada área

foi sistemática e uniformemente aleatória (SURS) (Gundersen et al., 1999). Estas secções

foram analisadas com o auxílio do Software StereoInvestigator da MBFmicrosystem,

acoplado ao Microscópio Zeiss Imager M.2 com ApoTome.2 para fluorescência e campo claro.

A partir da imagem gerada pelo microscópio em campo claro, o programa posicionou

grids de contagem, contendo pontos equidistantes e com área conhecida. Para o GLD, CPT e

CS foram utilizados grids de 100 µm, 150 µm e 300 µm com área por ponto de 10.000 µm2,

22.500 µm2 e 90.000 µm2, respectivamente. Em cada imagem, foram delimitados através do

software os contornos dos núcleos de interesse e os pontos contidos na área dos núcleos foram

contados.

A seguinte fórmula foi usada para estimar o volume dos núcleos:

V= Σp . a/p . t . F-1

onde,

V: volume do núcleo;

31

Σp: somatória dos pontos contidos no núcleo;

a/p: área por ponto;

t: espessura das secções dos núcleos;

F-1: inverso da distância entre os cortes.

O coeficiente de erro (CE) para a estimativa de volume pelo Princípio de Cavalieri foi

calculado de acordo com a fórmula proposta por Gundersen e colaboradores (1999). O CE é

expresso geralmente em porcentagem. A fórmula utilizada foi:

• Variação (noise) da contagem de pontos:

Noise = 0,0724 . (b/√a . √n . ∑p)

• Variação devido a amostragem sistemática e uniformemente aleatória (SURS):

Var [surs] = (3. (A – Noise) – (4 . B + C))/240

• Variação total:

Var [total] = Noise + Var [surs]

• Coeficiente de erro (CE):

CE = √Var [total]/∑p

A média do CE do volume do GLD, CPT e CS foram respectivamente: 4,5%, 5,7% e

4,9%.

4.5 MORFOMETRIA

Para a mensuração das células, foram utilizadas secções frontais do encéfalo de cinco

exemplares de A. planirostris submetidos a coloração de Nissl. Todos os cortes que

apresentavam a região de interesse foram amostrados para cada núcleo, a fim de obter o perfil

celular em toda a extensão rostrocaudal dos núcleos estudados. Foi utilizado o software NIS

ELEMENTS AR para medir a área das células, bem como para selecionar as células que

foram mensuradas. As medições foram realizadas na objetiva de 20X.

Para a seleção das células, o software gerou uma grade com linhas horizontais e

verticais distantes em 30 µm, onde as células que tocavam as linhas horizontais e que estavam

na região de interesse eram selecionadas. Para o GLD, foram selecionadas 10 células por

corte, sendo cinco da camada externa e cinco da camada interna totalizando 360 células

32

mensuradas. Para o CS, foram selecionadas 10 células por corte para cada camada analisada,

totalizando 500 células mensuradas. Por fim, para o CPT, foram selecionadas também 10

células por corte para cada núcleo estudado no complexo, contabilizando um total de 120

células para o NTO, 120 para o PTO, 110 para o PTM e 80 para o PTP.

Ao final de cada sessão de contagem, uma tabela de áreas celulares foi disponibilizada

pelo software NIS. Estes dados foram exportados para o Excel e utilizados para posterior

análise no software estatístico.

4.6 DENSIDADE ÓPTICA RELATIVA (DOR)

Para realizar a DOR, foram utilizados cortes coronais do encéfalo de cinco exemplares

de A. planirostris submetidos a imunoistoquímica contra CTb. As imagens utilizadas para a

análise foram obtidas em um mesmo momento, estando submetidas a mesma intensidade de

luz e sem modificação de brilho e contraste, já que os valores de pixels encontrados em cada

imagem correspondem a uma intensidade maior ou menor de marcação da substância

analisada no tecido correspondente. Para cada animal foram obtidas todas as imagens

necessárias para que as áreas de interesse fossem amostradas desde o nível rostral ao caudal.

Utilizando o programa Image J (versão 1.49), campos com área de 18225 pixel² foram

traçados nos núcleos de interesse e medida a intensidade de imunomarcação para CTb. Para o

GLD, foram traçados oito campos de medição por corte em todos os níveis, de forma que toda

a extensão do núcleo fosse amostrada, sendo quatro campos na camada interna e quatro na

externa. Já para o CS, foram traçados quatro campos, também obedecendo os mesmos

critérios de amostragem do GLD. Por fim, para os núcleos do CPT, foi traçado apenas um

campo de medição por núcleo em todos os níveis. Os campos foram traçados em ambos os

antímeros. Para cada corte, foi traçado um campo de medição de igual tamanho em uma área

controle sem nenhuma marcação de CTb no tecido, que serviu para a normalização dos

valores em todos os núcleos daquele corte, uma vez que as imunoistoquímicas foram

realizadas em momentos diferentes e assim poderiam apresentar backgrounds diferenciados

entre os animais e entre cortes.

Cada campo de medida gerado no Image J, forneceu uma área, uma média de pixels e

seu desvio padrão. A partir da média de pixels por campo, foi realizada uma média geral de

pixels por corte para cada antímero de cada núcleo. Então, esse valor médio de pixels obtido e

o valor de pixels da área controle do mesmo tecido foram utilizados na seguinte fórmula:

DOR = (XAI - XAC) / ( XAI + XAC)

onde,

33

XAI: média da área de interesse

XAC: média da área controle

A partir deste método, foi possível estimar a intensidade de marcação de fibras

imunorreativas a CTb nas áreas alvo.

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para todos os testes, foi realizada previamente a análise de normalidade dos dados,

através do teste de Kolmogorov-Smirnov. Foi utilizado o Modelo Linear Misto Geral para

analisar a influência do animal, corte e camada (fatores fixos) sobre a variação da área das

células (variável resposta); e do animal, corte, camada e antímero (fatores fixos) sobre a

variação dos valores de DOR das projeções retinianas (variável resposta). Estas análises de

modelo misto foram realizadas separadamente para cada núcleo. Também foi utilizado o

Modelo Linear Misto Geral para verificar se houve diferença entre os núcleos (fator fixo) com

relação ao volume (variável resposta). Em todos os modelos mistos foi incorporado o animal

analisado como fator randômico. Diferenças par a par foram analisadas utilizando teste post

hoc de Bonferroni. Foi considerado o nível de significância igual ou inferior a 5% bicaudal

para todos os testes. O software estatístico utilizado foi o SPSS Statistics 21.

34

5. RESULTADOS

5.1 CITOARQUITETURA

5.1.1 Núcleo geniculado lateral dorsal

Através das secções coradas pelo método de Nissl, observou-se que o GLD ocupa a

porção dorsolateral do tálamo dorsal por quase toda a sua extensão rostrocaudal em A.

planirostris. Nos níveis mais rostrais, o GLD apresentou-se mais dorsal no tálamo e ao longo

do seu trajeto no sentido rostrocaudal passou a assumir posição mais lateral (Figura 4).

Nenhum padrão de laminação em camadas foi encontrado a partir da técnica de Nissl, que foi

corroborado através da ausência de diferença significativa quando comparada a área das

células nas porções interna e externa do núcleo (F1,353=0,74; p=0,389). O GLD também não

apresentou diferença significativa quando analisado nos diferentes níveis ao longo do sentido

rostrocaudal (F1,353=3,6; p=0,059), mostrando que o núcleo pode ser caracterizado como

homogêneo em relação a área de suas células, quando avaliado entre camadas e no seu eixo

anteroposterior.

Com a análise morfométrica, foi possível caracterizar os perfis celulares do GLD,

onde predominam células arredondadas distribuídas esparsamente por toda a extensão do

núcleo (Figura 5), com média de área de 149,1 µm2 (± 65,0 DP). Foram observadas diferenças

individuais significativas (F4,353=20,85; p<0,001) (Figura 6). A partir desta análise também foi

possível observar que o GLD possui área celular significativamente maior que o CPT

(p<0,001) e o CS (p<0,001) (Figura 7).

35

Figura 4: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais, coradas pelo método de

Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do GLD nos níveis

rostral (A), médio (B) e caudal (C). As linhas pontilhadas demarcam a estrutura de interesse.

Para abreviaturas ver lista de abreviaturas. Barra: 500µm.

36


Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do GLD em A. (B)

Ampliação de caixa em A, mostrando em detalhe a morfologia arredondada das células do

GLD. Barra: 500µm em A, 10µm em B.

Figura 6: Média (± desvio padrão) da área das células do GLD para cada animal analisado.

Linha tracejada representa a média geral. Letras diferentes representam diferenças

significativas entre os animais (Comparação par a par – Média marginal estimada p<0,01).

37

Figura 7: Média (± desvio padrão) da área das células para cada região analisada. Diferença

entre as regiões (F2,1287=775,8; p<0,001). Letras diferentes representam diferenças

significativas entre as regiões (Comparação par a par – Média marginal estimada p<0,01).

5.1.2 Complexo pré-tectal

Foram identificados compondo o complexo pré-tectal em A. planirostris, através da

técnica de Nissl, os seguintes núcleos: pré-tectal medial (PTM), pré-tectal olivar (PTO), do

tracto óptico (NTO), pré-tectal anterior (PTA) e pré-tectal posterior (PTP) (Figura 8). Os

núcleos PTM e PTA são os primeiros do complexo a aparecerem no sentido rostrocaudal,

situando-se ao nível mais caudal do GLD. O PTA ocupa quase toda a extensão do complexo

no sentido rostrocaudal, enquanto que o PTM se estende apenas até o nível mais rostral da

substância cinzenta periaquedutal. Os núcleos PTO e NTO emergem dentro do complexo,

logo ao final dos núcleos habenulares, e se estendem até o nível mais rostral do CS. Por fim, o

PTP surge nos níveis mais rostrais da comissura posterior e se estende até o nível mais rostral

do CS.

Com a análise morfométrica, observou-se que no PTM predominam células ovais e

arredondadas (Figura 9 C), com média de área de 46,8 µm2 (± 30,2 DP). Não foram

observadas diferenças significativas tanto em relação ao animal analisado (F4,104=2,39; p=0,55)

(Figura 10), quanto no sentido rostrocaudal (F1,104=0,56; p=0,457), quanto a área das células.

Já no PTO, o perfil morfológico celular predominantemente encontrado foi o arredondado

(Figura 9 D), com média de área de 64,7 µm2 (± 25,7 DP). Assim como no PTM, não foram

observadas variações individuais significativas quanto a área das células (F4,114=1,89; p=0,117)

38

(Figura 11). Entretanto, na análise rostrocaudal, foi possível observar que a área das células

aumentaram ao longo do eixo, sendo maiores à medida que o núcleo se aproxima dos níveis

mais caudais (F1,114=7,40; p=0,008) (Figura 12). No NTO predominam células ovais e

arredondadas (Figura 9 E) com média de área de 29,5 µm2 (± 16,6 DP). Os animais analisados

apresentaram diferenças individuais significativas (F4,114=7,89; p<0,001) (Figura 13). Quanto

à análise rostrocaudal, o núcleo não apresentou variação significativa em relação a área das

células (F1,114=0,02; p=0,875). Por fim, no PTP predominam células de perfil morfológico

arredondado na porção mais lateral do núcleo e células ovais na porção mais medial (Figura 9

F e G), com média de área de 84,4 µm2 (± 36,5 DP), apresentando diferenças individuais

significativas (F4,75=9,49; p<0,001) (Figura 14). Quando analisado no eixo rostrocaudal, as

células do PTP apresentaram aumento da área no sentido caudal (F1,78=20,27; p<0,001)

(Figura 15). Fazendo-se um comparativo entre os núcleos que compõem o CPT foi observada

diferença significativa entre eles (F3,426=73,87; p<0,001), quando analisada a área das células

(Figura 16), sendo o PTP o núcleo de maior área celular, seguido pelo PTO, PTM e, por fim,

pelo NTO, o núcleo de menor área celular do complexo.

A partir da análise morfométrica, também foi possível observar que os núcleos

retinorrecipientes do CPT em conjunto possuem área celular significativamente menor que o

GLD (p<0,001) e maior que o CS (p<0,01) (Figura 7).

39


Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CPT nos níveis

rostral (A), médio (B) e caudal (C). As linhas pontilhadas demarcam as estruturas de interesse.

Para abreviaturas ver lista de abreviaturas. Barra: 500µm.

41


Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CPT em A e B.

Ampliações das caixas em A, mostrando em detalhe a morfologia arredondada e oval das

células do PTM (C), a morfologia arredondada das células do PTO (D) e a morfologia

arredondada e oval das células do NTO (E). Ampliações das caixas em B, mostrando em

detalhe a morfologia oval das células na porção medial do PTP (F) e arredondada das células

da porção lateral do PTP (G). Barra: 500µm em A e B, 10µm em C, D, E, F e G.

Figura 10: Média (± desvio padrão) da área das células do PTM para cada animal analisado.

Linha tracejada representa a média geral. (Comparação par a par – Média marginal estimada

p>0,05).

42

Figura 11: Média (± desvio padrão) da área das células do PTO para cada animal analisado.

Linha tracejada representa a média geral. (Comparação par a par – Média marginal estimada

p>0,05).

Figura 12: Média (± desvio padrão) da área das células do PTO em µm² ao longo do eixo

rostrocaudal.

43

Figura 13: Média (± desvio padrão) da área das células do NTO para cada animal analisado.



44

Figura 14: Média (± desvio padrão) da área das células do PTP para cada animal analisado.



Figura 15: Média (± desvio padrão) da área das células do PTP em µm2 ao longo do eixo

rostrocaudal.

45

Figura 16: Média (± desvio padrão) da área das células de cada núcleo do complexo pré-tectal

em µm2. Letras diferentes representam diferenças significativas entre os núcleos (Comparação

par a par - Média marginal estimada p<0,001)

5.1.3 Colículo superior

O CS foi identificado como uma estrutura laminar composto por sete camadas em A.

planirostris, como mostrado pela técnica de Nissl (Figura 17). Inicia-se ao nível mais caudal

dos núcleos PTO e NTO e estende-se até os níveis mais rostrais do colículo inferior. As

camadas identificadas na direção dorsoventral são as seguintes: camada zonal (CZ), camada

cinzenta superficial (CCS) e camada do tracto óptico (CTO), compondo o compartimento

superficial; camada cinzenta intermédia (CCI), camada branca intermédia (CBI), camada

cinzenta profunda (CCP) e camada branca profunda (CBP), compondo o compartimento

profundo.

A partir da análise morfométrica, foi possível observar diferenças significativas de

área celular entre as camadas retinorrecipientes CZ e CCS do CS (F1,493=326,7; p<0,001),

bem como variações individuais significativas (F4,493=17,5; p<0,001) (Figura 18). A CZ é

composta predominantemente por células ovais (Figura 19 B), com média de área de 32,2

µm2 (± 12,2 DP) (Figura 18), enquanto que a CCS possui em sua maioria células de perfil

morfológico arredondado (Figura 19 C), com média de área de 55,8 µm2 (± 18,2 DP) (Figura

18), não havendo variação rostrocaudal da área das células destas camadas (F1,493=1,6;

p=0,198).

46

Com a análise morfométrica também foi possível observar que as camadas retino

recipientes do CS possuem em conjunto área celular significativamente menor que o GLD

(p<0,001) e o CPT (p<0,01) (Figura 7).

Figura 17: Fotomicrografia em campo claro de secção coronal, corada pelo método de Nissl,

do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CS e seu padrão de

laminação em camadas. As linhas pontilhadas demarcam as camadas que compõem a

estrutura de interesse. Para abreviaturas ver lista de abreviaturas. Barra: 500µm.

Figura 18: Média (± desvio padrão) da área das células do CS para cada animal analisado por

camada. Linha tracejada representa a média geral para a CZ e a linha contínua representa a

média geral para a CCS. Letras diferentes representam diferenças significativas entre os

animais (Comparação par a par – Média marginal estimada p<0,05).

47


Nissl, do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CS em A.

Ampliações de caixas em A, mostrando em detalhe a morfologia oval das células da CZ (B), e

morfologia arredondada das células da CCS (C). Barra: 500µm em A, 10µm em B e C.

5.1.4 Análise estereológica

A partir da análise estereológica, foi possível calcular a estimativa de volume total

para o GLD, CPT e CS, onde a média do volume para cada área analisada foi de 1,08 mm3,

0,95 mm3 e 6,19 mm3, respectivamente. O volume do CS foi significativamente maior quando

comparado ao GLD (p<0,001) e ao CPT (p<0,001). Já o GLD e o CPT apresentaram volumes

semelhantes não havendo diferença significativa entre eles (p=1,0) (Figura 20).

48

Figura 20: Volume total das regiões do sistema visual primário de Artibeus planirostris. Os

círculos representam o volume estimado para cada animal. As barras horizontais representam

a média geral do volume estimado de cada região. Diferença entre as regiões (F2,12=929,1;

p<0,001). Letras diferentes representam diferenças significativas entre as regiões

(Comparação par a par – Média marginal estimada p<0,001).

5.2 PROJEÇÃO RETINIANA

5.2.1. Núcleo geniculado lateral dorsal

O GLD, em secções coronais do encéfalo de A. planirostris, apresentou-se marcado

por fibras e varicosidades CTb imunorreativas (Figura 21). A partir da análise da densidade

óptica relativa, foram identificadas diferenças individuais significativas quanto à intensidade

de marcação (F4,109=5,1; p<0,01) (Figura 22). A projeção retiniana distribuiu-se de forma

homogênea em toda extensão rostrocaudal do núcleo (F8,109=0,4; p=0,918), com

predominância contralateral (F1,109=141,7; p<0,001) (Figura 21). Com base nas fibras e

varicosidades imunorreativas a CTb, foi possível estabelecer um padrão de laminação no

GLD quanto à projeção retiniana, em uma camada externa com média de densidade óptica

relativa de 0,14 (± 0,11 DP) e uma interna com média de densidade óptica relativa de 0,04 (±

0,07 DP) (F1,109=60,6; p<0,001) (Figura 22). A partir da DOR também foi possível observar

que o GLD como um todo possui intensidade de marcação de fibras e varicosidades

imunorreativas a CTb significativamente menor que o CPT (p=0,002) e o CS (p<0,001)

(Figura 23).

49

Ambas as camadas apresentaram uma densa inervação por fibras e varicosidades,

entretanto algumas diferenças podem ser apontadas. A camada externa apresentou um grande

número de fibras com varicosidades grandes e enoveladas em forma de cacho, poucas fibras

com varicosidades distribuídas ao longo do seu eixo, bem como poucas fibras com

varicosidade única na ponta. Já a camada interna apresentou um grande número de fibras com

varicosidades espalhadas ao longo do seu eixo, bem como um grande número de fibras com

varicosidade única na ponta. Entretanto, poucas fibras com varicosidades enoveladas foram

encontradas quando comparada com a camada externa (Figura 24).

50

Figura 21: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do GLD nos

níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), secções coradas pelo método de Nissl. As linhas pontilhadas demarcam a estrutura de interesse. Nos

níveis rostral (A'), médio (B') e caudal (C'), imunoistoquímica contra CTb evidenciando a marcação das projeções retinianas com predominância

contralateral no GLD. Para abreviaturas ver lista de abreviaturas. Barra: 500µm

51

Figura 22: Média (± erro padrão) da DOR do GLD para cada animal analisado por camada.

Linha tracejada representa a média geral para a camada interna e a linha contínua representa a

média geral para a camada externa. Letras diferentes representam diferenças significativas

entre os animais (Comparação par a par – Média marginal estimada p<0,05).

Figura 23: Média (± erro padrão) da DOR das regiões analisadas. Diferenças entre as regiões

(F2,281=28,94; p<0,001). Letras diferentes representam diferenças significativas entre as

regiões (Comparação par a par – Média marginal estimada p<0,01).

52


planirostris mostrando as projeções retinianas no GLD. Fotos de imunoistoquímica contra

CTb do antímero contralateral. Ampliação de caixas em A, mostrando em detalhe a

morfologia das fibras e varicosidades na camada interna do GLD (B) e na camada externa do

GLD (C). Setas em B e C indicam fibras com varicosidades ao longo do seu eixo e fibras com

varicosidades grandes e enoveladas, respectivamente. Barra: 100µm em A, 10µm em B e C.

5.2.2 Complexo pré-tectal

Em secções frontais do encéfalo de A. planirostris, foi possível identificar fibras e

varicosidades imunorreativas a CTb nos núcleos PTM, PTO, NTO e PTP (Figura 25), não

apresentando diferença significativa entre eles (F3,78=1,61; p=0,193). A partir da análise da

densidade óptica relativa foi possível observar diferenças individuais significativas quanto à

intensidade de marcação (F4,78=25,1; p<0,001) (Figura 26). A projeção retiniana distribuiu-se

de forma homogênea em toda extensão rostrocaudal do complexo (F3,78=2,0; p=0,121),

apresentando média de densidade óptica relativa de 0,11 (±0,13 DP) para o PTM, 0,15 (±0,12

DP) para o PTO, 0,14 (±0,10 DP) para o NTO e 0,16 (±0,08 DP) para o PTP, todos com

53

predominância contralateral (F1,78=89,9; p<0,001) (Figura 25). A partir da DOR também foi

possível observar que os núcleos retinorrecipientes do CPT possuem em conjunto intensidade

de marcação de fibras e varicosidades imunorreativas a CTb significativamente menor que o

CS (p<0,001) e maior que o GLD (p=0,002) (Figura 23).

As fibras e varicosidades preencheram quase que a totalidade da área dos núcleos

PTM, PTO e NTO, entretanto no PTP as fibras e varicosidades concentraram-se na porção

dorsolateral do núcleo (Figura 25). Com relação a projeção ipsilateral, esta concentrou-se na

porção mais ventral dos núcleos PTO e NTO (Figura 25). Quanto a avaliação morfológica das

fibras e varicosidades, encontrou-se nos núcleos PTM, PTO e PTP fibras com varicosidades

distribuídas ao longo do seu eixo, bem como fibras com varicosidade única na ponta. Além

destas fibras e varicosidades o PTO também apresentou grandes varicosidades. Já no NTO,

predominam as fibras que apresentam varicosidades grandes e enoveladas (Figura 27).

54

Figura 25: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CPT nos

níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), secções coradas pelo método de Nissl. As linhas pontilhadas demarcam os núcleos retinorrecipientes

do complexo. Nos níveis rostral (A'), médio (B') e caudal (C'), imunoistoquímica contra CTb evidenciando a marcação das projeções retinianas

com predominância contralateral no CPT. Para abreviaturas ver lista de abreviaturas. Barra: 500µm.

55

Figura 26: Média (± erro padrão) da DOR do CPT para cada animal analisado por núcleo.

Letras diferentes representam diferenças significativas entre os animais (Comparação par a

par – Média marginal estimada p<0,05).

56


planirostris mostrando as projeções retinianas no CPT. Fotos de imunoistoquímica contra

CTb do antímero contralateral. Ampliação de caixas em A e B, mostrando em detalhe a

morfologia das fibras e varicosidades em (C) PTM, em (D) PTO, em (E) NTO e em (F) PTP.

Setas em C e E indicam fibras com varicosidade única na ponta e varicosidades grande e

enoveladas, respectivamente; setas em D e F indicam fibras com varicosidades ao longo do

seu eixo. Barra: 100µm em A e B, 10µm em C, D, E e F.

57

5.2.3 Colículo superior

A partir das secções coronais do encéfalo de A. planirostris, observou-se forte

marcação de fibras e varicosidades imunorreativos a CTb no CS, tendo como alvo as camadas

CZ e CCS (Figura 28). A partir da análise da densidade óptica relativa foi possível observar

diferenças individuais significativas quanto à intensidade de marcação (F4,54=8,3; p<0,001)

(Figura 29). A projeção retiniana distribuiu-se de forma homogênea por toda extensão

rostrocaudal das camadas retinorrecipientes do CS (F10,54=1,9; p=0,064), com média de

densidade óptica relativa de 0,22 (± 0,13 DP) (Figura 29), e exclusivamente contralateral

(F1,54=111,1; p<0,001) (Figura 28). A partir da DOR também foi possível observar que as

camadas retinorrecipientes do CS possuem em conjunto intensidade de marcação de fibras e

varicosidades imunorreativas a CTb significativamente maior que o CPT (p<0,001) e o GLD

(p<0,001) (Figura 23).

Na CZ foram identificados apenas fibras com grandes varicosidades enoveladas

formando um cacho, enquanto que na CCS predominam fibras com varicosidades simples e

distribuías ao longo de sua extensão (Figura 30).

58

Figura 28: Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo de Artibeus planirostris mostrando a citoarquitetura do CS nos

níveis rostral (A), médio (B) e caudal (C), secções coradas pelo método de Nissl. As linhas pontilhadas demarcam as camadas do CS. Nos níveis

rostral (A'), médio (B') e caudal (C'), imunoistoquímica contra CTb evidenciando a marcação das projeções retinianas exclusivamente

contralateral no CS, atingindo as camadas CZ e CCS. Para abreviaturas ver lista de abreviaturas. Barra: 500µm.

59

Figura 29: Média (± erro padrão) da DOR do CS para cada animal analisado. Linha tracejada

representa a média geral. Letras diferentes representam diferenças significativas entre os

animais (Comparação par a par – Média marginal estimada p<0,05).

60


planirostris mostrando as projeções retinianas no CS. Fotos de imunoistoquímica contra CTb

do antímero contralateral. Ampliação de caixas em A, mostrando em detalhe a morfologia das

fibras e varicosidades em (B) CCS e (C) CZ. Setas em B e C indicam fibras com

varicosidades ao longo do seu eixo e fibras com varicosidades grandes e enoveladas,

respectivamente. Barra: 100µm em A, 10µm em B e C.

61

6. DISCUSSÃO

Yangochiropteros utilizam a ecolocalização para a orientação e para detecção de

presas, podendo, assim, operar tanto na escuridão quanto sob qualquer condição luminosa

(Griffin, 1958). Entretanto, devido à atenuação rápida dos sons de alta frequência no ar e o

limite de alcance da ecolocalização (Kick, 1982; Kalko e Schnitzler, 1993; Fenton et al.,

1995), o sonar pode não ser efetivo para a detecção de pequenos alvos a longas distâncias.

Além disso, a distinção entre presa e ruído de fundo (ecos de outros objetos além do alvo de

interesse) pode ser problemática em morcegos que utilizam ecolocalização para o forrageio

próximo da vegetação (Schnitzler e Kalko, 1998; Arlettaz et al, 2001; Jensen et al, 2001).

Apesar de ser um tema ainda pouco explorado, os estudos que abordam a possibilidade

de uso de pistas visuais por quirópteros indicam que elas sejam importantes para a detecção

de presas nesses animais. Morcegos da espécie Eptesicus nilssonii (Vespertilionidae), que

realizam captura de presas em pleno voo, são guiados por pistas visuais quando procuram

mariposas da espécie Hepialus humuli (Lepidoptera) sobre a grama durante o crepúsculo

(Eklöf et al, 2002). Outro morcego da mesma família, Plecotus auritus (Vespertilionidae), é

capaz de detectar presas visualmente a uma intensidade luminosa de 4 lux, preferindo utilizar

pistas visuais a pistas sonoras, se dado a chance de escolha (Eklöf e Jones, 2003). Antes disso,

Pettigrew (1980) já havia observado que morcegos da espécie Craseonycteris thonglongyai

(Emballonuridae), que também capturam presas durante o voo, potencialmente utilizam pistas

visuais, fazendo uso do brilho do céu, contra o qual os insetos são vistos como silhuetas

(Pettigrew, 1980). Logo em seguida, Bell (1985) observou que morcegos da espécie Macrotus

californicus (Phyllostomidea) utilizam a visão para captura de presas no solo. Mais

recentemente, foi observado que Artibeus lituratus (Phyllostomidea) discrimina mais

facilmente alvos em condição luminosa próxima à da lua cheia, indicando que pistas visuais

podem ser utilizadas para detectar alimentos a curta distância (Gutierrez et al., 2014).

Como demonstrado pelos trabalhos citados, a visão parece desempenhar papel

importante na ecologia dos morcegos da subordem Yangochiroptera. Neste trabalho,

avaliamos a citoarquitetura dos núcleos do sistema visual primário em A. planirostris,

caracterizando suas células morfológica e morfometricamente, a fim de conhecer melhor o

perfil citoarquitetônico do GLD, CS e CPT, como também avaliamos a distribuição das

projeções retinianas sobre esses núcleos e suas características morfológicas. A seguir, serão

discutidos esses resultados acerca da organização do sistema visual de A. planirostris.

62

6.1 Núcleo Geniculado Lateral Dorsal

Embora os sistemas sensoriais primários em todos os mamíferos sejam organizados de

maneira similar, variações significativas em sua estrutura têm sido relatadas em determinadas

ordens filéticas entre ou dentro de famílias que enfrentam pressões ecológicas diferentes

(Barton et al., 1995).

Tomando como referência o sistema visual, objeto de estudo deste trabalho, o GLD em

A. planirostris ocupou a porção dorsolateral do tálamo dorsal por quase toda a sua extensão

anteroposterior, não sendo encontrado nenhum padrão de laminação em camadas, quando

analisado pela técnica de Nissl, o que está de acordo ao encontrado em alguns roedores como

o mocó Kerodon rupestris (Silva, 2009), o rato (Sefton et al., 2004), o rato-toupeira-africano

Cryptomys anselli (Nemec et al., 2004), o rato-do-Nilo Arvicanthis niloticus (Gaillard et al.,

2013) e o Arvicola terrestris (Compoint-Monmignaut, 1983). Em alguns gêneros de morcegos

da subordem Yangochiroptera, como Myotis lucifugus (Cotter e Pentney, 1979), Carollia

perspicillata (Scalia et al., 2015), Eptesicus fuscus e Artibeus jamaicensis (Cotter, 1985),

também não foi encontrado padrão de estratificação do GLD.

Entretanto, nossos resultados diferem do encontrado na ratazana-do-campo-japonesa

Microtus montebelli (Uchiumi et al., 1995), no esquilo Tamias sibiricus asiaticus (Morigiwa

et al., 1988), no esquilo-terrestre-da-Califórnia Spermophilus beecheyi (Major et al., 2003), e

no furão (Chiu e Weliky, 2004), onde o GLD apresenta laminação evidente. Em morcegos da

subordem Yinpterochiroptera, Ichida e colaboradores (2000) encontraram em Pteropus

poliocephalus (raposa-voadora), um padrão de laminação do GLD em três camadas celulares

distintas e duas zonas interlaminares com células esparsas. Resultado similar foi encontrado

por Manger e Rosa (2005), também em Pteropus poliocephalus, entretanto foram

identificadas apenas três camadas celulares distintas compondo o GLD. Em primatas, assim

como no raposa-voadora, o GLD também apresenta uma típica estratificação em camadas,

podendo se distinguir até seis camadas em primatas humanos e não-humanos (Callaway, 2005;

Fitzpatrick et al., 1983).

Assim, o GLD de mamíferos pode apresentar ou não camadas morfologicamente

distintas, e a presença ou ausência delas pode representar diferenças funcionais entre as

espécies. Em carnívoros e primatas, que apresentam camadas distintas no GLD, a informação

visual é levada da retina ao córtex visual em vias paralelas (Wässle, 2004; Nassi e Callaway,

2009). Diferentes tipos de informação visual permanecem segregadas nestas vias, e são depois

combinadas no córtex para diferentes tarefas de processamento visual (Denman e Contreras,

2016). Estas vias, compostas por grupos de células específicas, podem ser diferenciadas por

63

suas propriedades de resposta visual.

Nos mamíferos examinados até hoje, três classes básicas de neurônios podem ser

encontradas no GLD (Sherman et al., 1976; Shapley e Perry, 1986; Casagrande e Norton,

1991; Holdefer e Norton, 1995; Hendry e Reid, 2000; Van Hooser et al., 2003). Em primatas,

temos as seguintes classes de células: parvocelulares (P), magnocelulares (M) e

koniocelulares (K); enquanto que em gatos podemos identificar as células: X, Y, e W. As

relações de homologia entre estas classes de células permanecem incertas, embora haja

paralelismos funcionais entre as células P e X, as células M e Y, e células K e W,

respectivamente (Van Hooser, 2007).

Em gatos, as células X e Y do GLD respondem de maneira diferente quanto aos seus

campos receptivos. As células X possuem propriedade de somação espacial linear, enquanto

que as células Y exibem propriedade de somação espacial não linear (Shapley et al., 1981).

Além disso, as células X mostram respostas sustentadas com seletividade espacial alta,

seletividade temporal baixa e sensibilidade de baixo contraste, enquanto que as células Y

possuem respostas contrárias (Cleland et al., 1973). Células X e Y também podem ser

diferenciadas pela precisão e confiabilidade das suas respostas (Kumbhani et al., 2007) e o

tamanho de seus campos receptivos (Weng et al., 2005).

Existem ainda outras vias paralelas nas camadas magnocelular e parvocelular do GLD

de primatas (Nassi e Callaway, 2009). Estas células apresentam propriedades de respostas

visuais muito semelhantes as células X e Y de gato (Levitt et al., 2001). Apesar da aplicação

de testes de somação espacial sugerir a existência de duas populações de células (lineares e

não-lineares) nas camadas magnocelulares de primatas (Kaplan e Shapley, 1982), outros

estudos demonstraram que a distribuição de linearidade é unimodal dentro dos neurônios

magnocelulares ou parvocelulares (Levitt et al., 2001). Nos primatas, o processamento é

separado em, pelo menos, uma via para a profundidade e movimento e uma para a cor e a

forma: as vias magnocelulares e parvocelulares, respectivamente (Livingstone e Hubel, 1988;

Nassi e Callaway, 2009).

A terceira classe de células, W e K, são uma mistura heterogênea de vários subtipos,

incluindo células de longa latência, células não-confiáveis e algumas células que não mostram

antagonismo centro/periferia (Van Hooser, 2007). As células K e W fazem conexões em uma

região específica do córtex visual de carnívoros e primatas, os blobs, localizados nas camadas

mais superficiais (Fitzpatrick et al., 1983; Boyd e Matsubara, 1996). No gênero Macaca, estas

células possuem projeções monoculares, onde cada blob recebe informação de um único olho

(Hendry e Yoshioka, 1994). Em outros primatas como o mico-de-cheiro, as projeções das

64

células K e W para cada blob são binoculares (Adams e Horton 2006). Em animais que não

possuem os blobs, como o musaranho, estas projeções para as camadas superficias do córtex

são difusas (Usrey et al., 1992).

Até agora foram descritas as vias paralelas do processamento visual para mamíferos

que possuem o GLD subdividido em camadas. Entretanto, existem evidências de

processamento da informação visual em vias paralelas, em mamíferos onde o GLD não se

apresenta de forma laminada. Krahe e colaboradores (2011) encontraram células

morfologicamente distintas no GLD de camundongos que apresentam características

semelhantes àquelas de gatos, com células de perfil morfológico do tipo X, W e Y. A maioria

das células tipo X foram localizadas na porção ventroposterior do GLD, adjacente ao FIG e ao

GLV. As células do tipo W foram localizadas ao longo da porção mais externa do GLD, em

regiões que se encontram perto do tracto óptico. E as células do tipo Y distribuiam-se

amplamente por todo GLD, entretanto prevaleciam dentro de uma banda central ao longo do

seu comprimento (Krahe et al., 2011). Em um estudo mais recente, Denman e Contreras

(2016), através de estímulos fisiológicos, demonstraram em camundongos três grupos de

células que podem ser distinguidos pelas velocidades de condução dos seus aferentes

retinianos, mas não quanto ao tamanhos dos seus campos receptivos.

Quanto à citoarquitetura do GLD de A. planirostri, fica clara a diferença para a

organização laminar, de primatas e carnívoros, onde as células do GLD se agrupam em

camadas, com um grupo menor de células distribuídas em zonas interlaminares, e a

semelhança encontrada com roedores como o rato e o camundongo, onde não há camadas.

Levando em consideração esta semelhança, e os estudos que apontam para o processamento

em paralelo nestes animais (Krahe et al., 2011; Denman e Contreras, 2016), podemos inferir

que o GLD de A. planirostris pode possuir algum tipo de organização do processamento da

informação visual em paralelo, onde as células com morfologia do tipo W estariam

organizadas na porção dorsal (shell) e as células com morfologia do tipo X organizadas na

porção central (core) do GLD e as células do tipo Y distribuidas as longo da banda central do

GLD, assim como acontece em camundongo (Krahe et al., 2011; Denman e Contreras, 2016).

Quanto à análise morfométrica, observou-se que predominam no GLD de A.

planirostirs células com média de área de 149,1 µm2. No morcego Pteropus poliocephalus,

Ichida e colaboradores (2000) observaram células com média de área de 106 µm2. Dado

semelhante ao nosso foi encontrado por Fitzpatrick e colaboradores (1983) no GLD do mico-

de-cheiro (Saimiri sciureus), onde as células apresentam média de área de 154 µm2 e 119 µm2

nas camadas magnocelulares e parvocelulares, respectivamente. Já as camadas intralaminares

65

interna e externa apresentam média de área celular de 76 µm2 e 71 µm2, respectivamente.

Macacos cinomolgos (Macaca fascicularis), por sua vez, apresentam no GLD células com

média de área de 300 µm2 nas camadas magnocelulares, enquanto que nas camadas

parvocelulares a média de área celular é de 210 µm2 (Shimazawa et al., 2012), ambas as

camadas apresentando áreas célulares maiores à encontrada no nosso animal experimental.

No rato-toupeira-africano (Cryptomys anselli), foi observado que o GLD é constituído de

neurônios com média de 15,5 µm de diâmetro (Nemec et al., 2004), enquanto que no rato-do-

Nilo (Arvicanthis niloticus), um roedor da família Muridae, o GLD apresenta células com

média de 13,9 µm de diâmetro (Gaillard et al., 2013). You e colaboradores (2012) observaram

que ratos (Sprague-Dawley) apresentam células do GLD com média de área de 60,3 µm2.

Todos os resultados encontrados em roedores apresentam média muito inferior ao encontrado

no A. planirostris. Por fim, estudo morfofisiológico realizado em camundongos encontrou que

células tipo X, W e Y apresentam média de área de 1,53 µm2 x 10³, 2,04 µm2 x 10³ e 1,71

µm2 x 10³, repectivamente (Krahe et al., 2011).

Poucos estudos têm abordado dados estereológicos com relação ao volume do GLD.

Alguns trabalhos trazem dados morfométricos de comprimento e largura dos núcleos, o que

dificulta a comparação entre as espécies. No presente estudo, foi possível observar através da

estereologia que o GLD de A. planirostris possui uma média de volume igual a 1,08 mm³. No

rato-toupeira-africano (Cryptomys anselli), o GLD apresenta uma extensão rostrocaudal de

aproximadamente 1000 µm e 150 µm de largura (Nemec et al., 2004). Crish e colaboradores

(2006) encontraram no rato-toupeira-pelado (Heterocephalus glaber) um volume de 0,05 mm³

para o GLD. Estudo comparativo entre o rato-do-Nilo (Arvicanthis niloticus), o camundongo

(C57BL6) e o rato (Wistar), demonstrou que estes animais possuem o GLD com média de

volume de 0.55 mm³, 0,32 mm³ e 0,95 mm³, respectivamente (Gaillard et al., 2013).

Com base na análise das fibras e varicosidades imunorreativas a CTb, foi possível

estabelecer um padrão de laminação no GLD de A. planirostris quanto à projeção retiniana,

em uma camada externa, com média de densidade óptica relativa de 0,14, e uma interna, com

média de densidade óptica relativa de 0,04, exibindo predominância contralateral. Este

resultado é semelhante ao encontrado por Scalia e colaboradores (2015), no Carollia

perspicillata, morcego da família Phyllostomidae, quanto à predominância de inervação da

projeção retiniana. Entretanto, o Carollia perspicillata não possui padrão de laminação da

projeção, como encontrado no A. planirsotris. Em Myotis lucifugus, morcego da família

Vespertilionidae, Cotter e Pentney (1979) observaram também uma projeção

predominantemente contralateral e com padrão de laminação em duas camadas, uma externa

66

com maior concentração de projeção e uma interna com menor concentração. Resultado

semelhante em relação à predominância da projeção, pode ser encontrado também no rato-do-

Nilo (Gaillard et al., 2013), no rato-toupeira-pelado (Crish et al., 2006), no rato-toupeira-

africano (Nemec et al., 2008).

Em gatos, a projeção retiniana ao GLD é bilateral e apresenta um padrão laminar,

assim como o do nosso animal experimental, atingindo as camadas A, C e C2 no antímero

contralateral e as camadas A1 e C1 no antímero ipsilateral (Matteau et al., 2003). Em primatas,

a projeção da retina também é bilateral, onde as camadas magnocelular e parvocelular

internas recebem projeções do olho ipsilateral, enquanto que as camadas magnocelular e

parvocelular externas recebem projeções do olho contralateral (Kaas e Huerta, 1988). Major e

colaboradores (2003) encontraram padrão de projeção semelhante ao de primatas e gatos no

esquilo-terrestre-da-Califórnia (Spermophilus beecheyi), onde a projeção é bilateral e a retina

contralateral atinge as camadas 1, 3a e 3c, enquanto que a retina ipsilateral inerva a camada 2.

Em Pteropus giganteus, morcego da família Pteropodidae, cada uma das lâminas

identificáveis citoarquitetônicamente recebe projeção bilateral da retina diferencialmente

distribuída, onde as fibras contralaterais estão localizadas na convexidade das lâminas 1, 2 e 3,

enquanto que as fibras ipsilaterais dominam a porção côncava de cada camada (Pentney e

Cotter, 1981).

Com relação a morfologia das fibras e varicosidades, foi observado no GLD de A.

planirostris que ambas as camadas identificadas pela projeção retiniana apresentaram fibras e

varicosidades semelhantes àquelas descritas por Ling e colaboradores (1997) em hamster:

fibras com varicosidades de vários tamanhos, geralmente entre 1 µm e 2 µm de diâmetro,

espalhadas ao longo do seu eixo, caracterizadas como string-like complex; fibras com

varicosidade pequena ou média na ponta, também apresentando entre 1 µm e 2 µm de

diâmetro, caracterizadas como simple endings; e fibras com grandes varicosidades,

geralmente maiores que 2 µm de diâmetro, enoveladas formando um cacho, caracterizadas

como R1 e R2. Estes tipos de fibras e varicosidades apresentam propriedades sinápticas

distintas, como proposto por Petrof e Sherman (2013), que as classificam em dois tipos:

aferentes de classe 1, que são os principais veículos da informação e são caracterizados por

uma série de características sinápticas e anatômicas, como grandes varicosidades medindo

mais que 2 µm², contato com os dendritos proximais, axônios mais espessos, grandes

potenciais pós-sinápticos excitatórios e ativação de receptores ionotrópicos; e os aferentes de

classe 2, que desempenham papel modulador e estão associados com pequenas varicosidades

medindo entre 1 µm² e 2 µm², apresentando como características contatos com as porções

67

mais distais dos dendritos, axônios finos, pequenos potenciais pós-sinápticos excitatórios e a

ativação de receptores ionotrópicos e metabotrópicos.

6.2 Complexo Pré-tectal

O CPT compreende um conjunto de pequenos núcleos de difícil delimitação, sendo

melhor definidos a partir de critérios citoarquitetônicos e de redes de conexão. Estas

estruturas medeiam o reflexo pupilar a luz e funções oculomotoras como o nistagmo

optocinético (Kaas e Huerta, 1988). O reflexo pupilar à luz garante percepção visual ideal,

ajustando com precisão o diâmetro da pupila em resposta à iluminação ambiente variável.

Este reflexo ativa o músculo constritor da pupila, a fim de reduzir o seu diâmetro e proteger

os pigmentos visuais dos fotorreceptores da retina de branqueamento (Sun e May, 2014).

Além de impedir o branqueamento, a contração da pupila aumenta a profundidade de foco e

reduz aberrações esféricas e cromáticas, aumentando a acuidade visual (McDougal e Gamlin,

2008). Este mecanismo de adaptação é mediado pelo núcleo PTO. O nistagmo optocinético é

a perseguição ocular realizada para manter a imagem de alvos móveis focada na retina de

mamíferos. O NTO é provavelmente um dos núcleos envolvidos na iniciação e manutenção

do nistagmo horizontal (Yakushin et al., 2000).

Foram identificados compondo o CPT em A. planirostris, através da projeção retiniana

e da técnica de Nissl, os seguintes núcleos: PTM, PTO, NTO, PTA e o PTP, estando

localizados desde o nível mais caudal do GLD até o nível mais rostral do CS. Resultado

semelhante ao nosso foi encontrado em Carollia perspicillata (Scalia et al., 2015), no gato

(Matteau et al., 2003) e em primatas (Kaas e Huerta, 1988). Outro morcego da ordem

Yangoquiróptera, Myotis lucifugus, apresenta o CPT formado pelos núcleos PTO, NTO e pelo

núcleo da comissura posterior (Cotter e Pentney, 1979). Em Pteropus giganteus é possível

identificar citoarquitetonicamente seis núcleos, todos aqueles presentes no A. planirsotris, e o

núcleo da comissura posterior (Cotter e Pentney, 1979). No rato-do-Nilo (Arvicanthis

niloticus) (Gaillard et al., 2013) e em camundongo (Morin e Studholme, 2014) o CPT é

composto pelos núcleos PTM, PTO, NTO, PTA, PTP e pelo núcleo posterior limitante. Em

hamster é possível identificar sete núcleos compondo o CPT. Além de todos os núcleos

encontrados no rato-do-Nilo, pode-se identificar o núcleo pré-tectal comissural (Morin e

Blanchard, 1998). Major e colaboradores (2003) identificaram os núcleos PTA, PTP, PTO e

NTO no CPT do esquilo-terrestre-da-Califórnia (Spermophilus beecheyi).

Com a análise morfométrica, observou-se que os núcleos que compõem o CPT

apresentam diferença significativa entre eles com relação à área das células, onde o PTP

apresentou média de área de 84,4 µm2, o PTO média de área de 64,7µm2, o PTM média de

68

área de 46,8 µm2 e por fim o NTO com média de área de 29,5 µm2. No rato-do-Nilo, Gaillard

e colaboradores (2013) observaram que as células que compõem o núcleo PTP têm média de

12,3 µm de diâmetro, já as do PTO possuem média de 13,9 µm de diâmetro e por fim as

células do NTO apresentam média de 15,8 µm de diâmetro. Dados similares foram

observados no rato-toupeira-africano, onde as células do PTP apresentam média de 9,3 µm de

diâmetro, as do PTO possuem média de 11,5 µm de diâmetro e as células que compõem o

NTO possuem média de 9,9 µm de diâmetro (Nemec et al., 2004).

A partir da análise estereológica, foi possível observar que o CPT de A. planirostris

possui média de volume igual a 0,95 mm³. Dados relativos ao volume dos núcleos do CPT

como um todo são escassos na literatura. Entretanto, Crish e colaboradores (2006) observaram

que o PTO do rato-toupeira-pelado apresenta volume de 0,01 mm³, enquanto que o PTO de

camundongos tem volume igual a 0,03 mm³. Em um estudo mais recente realizado no rato-do-

Nilo, Gaillard e colaboradores (2013) relatam que o CPT deste animal possui extensão

rostrocaudal de aproximadamente 1450 µm, entretanto nenhum dado volumétrico é

apresentado.

Quanto à marcação de fibras e varicosidades imunoreativas a CTb, foi possível

observar em A. planirostris que os núcleos PTM, PTO, NTO e PTP exibiram um padrão de

inervação da projeção retiniana com predominância contralateral e com média de densidade

óptica relativa de 0,11, 0,15, 0,14 e 0,16, respectivamente. Scalia e colaboradores (2015)

observaram no Carollia perspicillata, morcego da mesma família do A. planirostris, que os

núcleos do CPT apresentam o mesmo padrão de inervação encontrado no nosso estudo. Em

um trabalho comparativo entre Pteropus giganteus e Myotis lucifugus, Cotter e Pentney (1979)

observaram que P. giganteus apresenta o mesmo padrão de projeção com predominância

contralateral encontrado no nosso animal experimental, entretanto além da marcação para o

NTO, PTP e PTO, foi encontrada projeção para o PTA e não foi detectada marcação no PTM.

Já no M. lucifugus, apenas duas áreas apresentam marcação de inervação retiniana, o NTO e o

PTO. No esquilo-terrestre-da-Califórnia, também é possível verificar forte predominância

contralateral no NTO, PTP, PTO e PTA, entretanto não foi observada marcação para o núcleo

PTM (Major et al., 2003). No rato-toupeira-africano, Nemec e colaboradores (2004)

identificaram apenas três núcleos com marcação contralateral da retina, o NTO, PTP e PTO.

Já no rato-toupeira-pelado, apenas o núcleo PTO pode ser facilmente identificado como uma

área de inervação retiniana (Crish et al., 2006). No rato-do-Nilo, todos os núcleos do CPT

recebem aferências visuais com forte predominância contralateral (Gaillard et al., 2013).

Recentemente um estudo realizado em camundongos mostrou que todos os núcleos que

69

compõem o CPT apresentam densa inervação da retina (Morin e Studholme, 2014). Em gatos

é possível observar inervação retiniana bilateral em todos os núcleos que compõem o CPT,

entretanto estes divergem quanto à intensidade de marcação, sendo possível observar intensa

marcação nos núcleos NTO, PTO e PTP, enquanto que os núcleos PTA e PTM apresentam

esparsa marcação de fibras e varicosidades (Matteau et al., 2003). Em primatas, inervação

bilateral com forte predominância contralateral também pode ser encontrada nos núcleos do

CPT (Kaas e Huerta, 1988).

Com relação à morfologia das fibras e varicosidades, foi observado no CPT de A.

planirostris que os núcleos PTM, PTO e PTP apresentaram fibras com varicosidades

espalhadas ao longo do seu eixo, bem como fibras com terminais simples na ponta, com a

ressalva que o PTO também apresentou fibras com grandes varicosidades. Já no NTO

parecem predominar as fibras com grandes varicosidades. Estes resultados com relação à

morfologia das fibras são semelhantes àqueles descritos por Ling e colaboradores (1997) em

hamster e por Morais e colaboradores (2014) na zona incerta do mocó. Logo, é possível que

estas fibras e varicosidades encontradas nos núcleos do CPT tenham características

semelhantes às descritas por Petrof e Sherman (2013), apresentando características de

aferentes controladores e moduladores.

6.3 Colículo Superior

O CS é uma estrutura laminar localizada no mesencéfalo de vertebrados, onde está

estrategicamente posicionado para receber informações sensoriais e modular a atividade do

tronco encefálico. Sua função principal é a de direcionar as estruturas sensoriais da cabeça

para um estímulo de interesse (May, 2006). Embora o principal canal de transporte da maior

parte dos sinais a partir da retina até o córtex visual seja via GLD, que por intermédio das

radiações ópticas atinge o córtex estriado para posterior processamento (via retino-geniculo-

estriado) (Bertini et al., 2016), a informação visual também pode ser processada através de

uma via visual alternativa, que transmite sinais visuais da retina para o CS e, em seguida, se

projeta para os córtices visuais extra-estriado (Milner e Goodale, 1995). Esta via alternativa

colículo-extra-estriado tem sido sugerida como uma via responsável por funções visuais

residuais como movimento, cor e orientação (Cowey, 2010; Tamietto et al., 2010). Chang e

colaboradores (2016), em um estudo realizado com ressonância magnética funcional,

mostram que o CS de humano responde a contraste de cor vermelho-verde. Tal efeito

possivelmente é realizado por neurônios encontrados nas camadas intermediárias ou

superficiais do CS com acesso transcortical a regiões de cores tradicionais.

70

Tradicionalmente o CS é dividido em duas porções estruturais e funcionais distintas,

as camadas superficiais e as camadas intermédias/profundas. Esta distinção clássica é baseada

em observações, onde as camadas superficiais CZ, CCS e CTO são exclusivamente visuais,

enquanto que as camadas intermédias CCI e CBI e profundas CCP e CBP respondem a

estímulos visuais, auditivos e somatosensoriais (Grantyn e Berthoz, 1985; Meredith e Stein

1986; Kaas e Huerta 1988; May, 2006).

O CS de A. planitostris foi identificado como uma estrutura laminar composta por sete

camadas, como demonstrado pela técnica de Nissl. Esse padrão citoarquitetônico é similar ao

encontrado no furão (Zhang e Hoffman, 1993), no gato (Kaneseki e Sprague, 1974), no

esquilo-terrestre-da-Califórnia (Major et al., 2003), no esquilo arborícola (Major et al., 2000),

no rato-do-Nilo (Gaillard et al., 2013), no rato-toupeira-pelado (Crish et al., 2006), no rato-

toupeira-africano (Nemec et al., 2008), no camundongo (Morin e Studholme, 2014) e em

primatas (Kaas e Huerta, 1988). A estrutura anatômica do CS em mamíferos parece ser bem

conservada entre as espécies, o que provavelmente reflete a estrutura organizacional comum

necessária para transformar sinais sensoriais em comandos de orientação adequados.

As células presentes nas camadas superficiais do CS codificam a localização de

objetos em um mapa retinotópico, enquanto que as células das camadas intermediárias estão

organizadas em um mapa espacial que codifica os vetores de mudanças rápidas da direção do

olhar, as chamadas sacadas. O mapa motor nas camadas intermediárias corresponde ao mapa

visual da camada imediatamente acima (May, 2006). Evidências anatômicas revelam

conexões recíprocas entre as camadas superficiais e as camadas intermédias/profundas do CS,

sugerindo a presença de interações funcionais entre estas camadas (Hall e Lee, 1997; Doubell

et al., 2003; May, 2006), além das conexões tecto-tectais via comissura intercolicular (May,

2006). Os neurônios das camadas profundas do CS possuem axônios e dendritos apicais que

estendem-se para as camadas superficiais, proporcionando assim um possível substrato

estrutural para interações funcionais entre estes compartimentos (Isa e Hall, 2009). Em

particular, os neurônios multissensoriais das camadas profundas do CS apresentam uma

melhora na resposta quando estímulos visuais e auditivos são registrados juntos (Bertini et al.,

2016). Recentemente, um estudo realizado em gatos examinou o impacto de um estímulo

auditivo na resposta visual das camadas superficiais do CS, onde foi possível observar que

estes estímulos alteram a natureza da informação visual processada nas camadas superficiais

do CS, resultando em um aprimoramento ou depressão da resposta visual (Ghose et al.,2014).

A partir deste experimento, podemos inferir a importância destas conexões das camadas

multimodais com as camadas visuais do CS em A. planirostris, levando em conta que este

71

morcego se utiliza de ecolocalização para orientação espacial e captura de alimento. Este tipo

de estímulo pode ajudar a orientação da cabeça e os movimentos sacádicos realizados pelo

morcego.

Quanto à análise morfométrica, foi possível observar em A. planirotris que a CZ é

composta por células com média de área de 32,2 µm2, enquanto que a CCS possui células

com média de área de 55,8 µm2. No rato-toupeira-africano, onde as camadas superficiais são

de difícil distinção morfológica, a média das células que compõem estas camadas é de 9,4 µm

de diâmetro (Nemec et al., 2004). Em um estudo mais recente, Gaillard e colaboradores (2013)

observaram no rato-do-Nilo que a CZ é constituída de neurônios com média de 11,6 µm de

diâmetro e os nerônios da CCS possuem média de 11,1 µm de diâmetro. Kaas e Huerta (1988)

descrevem que a CZ de primatas é composta por células de pequeno tamanho com média de

10 µm de diâmetro.

A partir da análise estereológica, foi possível observar que o CS de A. planirostris

possui média de volume igual a 6,19 mm³. Um estudo comparativo entre o rato-do-Nilo

(Arvicanthis niloticus), o camundongo (C57BL6) e o rato (Wistar) demonstrou que estes

animais possuem o CS com média de volume de 6.07 mm³, 3,00 mm³ e 11,45 mm³,

respectivamente (Gaillard et al., 2013). Crish e colaboradores (2006) observaram que o CS do

rato-toupeira-pelado (Heterocephalus glaber) possui média de volume de 1,41 mm³. Alguns

trabalhos trazem apenas a espessura das camadas superficiais do CS sem dados quantitativos

quanto ao volume do núcleo. No rato-toupeira-africano, as camadas retino recipientes

apresentam espessura de 50 µm (Nemec et al., 2008). Em primatas, a CZ apresenta espessura

entre 20 µm e 50 µm, enquanto que a CCS varia entre 250 µm e 400 µm de espessura (Kaas e

Huerta, 1988).

Quanto à marcação de fibras e varicosidades imunoreativas a Ctb, observou-se em A.

planirostris que a projeção retiniana foi exclusivamente contralateral no CS, tendo como alvo

principal a camada zonal e a camada cinzenta superficial, com média de densidade óptica

relativa de 0,22. Poucos estudos abordam os valores de DOR. Em um trabalho realizado com

ratos, Fleming e colaboradores (2006) descrevem que a projeção retiniana contralateral para o

CS apresenta DOR de 0,39 e 0,36, para ratos albinos e pigmentados, respectivamente. Com

relação ao padrão de projeção ser exclusivamente contralateral, o mesmo resultado pode ser

encontrado em morcegos da subordem Yangochiroptera, como o Myotis lucifugus (Cotter e

Pentney, 1979) e o Carollia perspicillata (Scalia et al., 2015), sendo o mesmo padrão também

encontrado no rato-toupeira-africano Cryptomys anselli (Nemec et al., 2004).

Nossos resultados diferem do encontrado em outros mamíferos onde é possível

72

observar um claro padrão bilateral de distribuição da projeção retiniana para o CS. Em

primatas, apesar das diferenças no padrão de distribuição das inervações encontradas no CS

dentro desta ordem, de forma geral, o olho contralateral inerva as porções mais superficiais

das camadas 1, 2 e 3 do CS, enquanto que o olho ipsilateral inerva a porção mais profunda

destas camadas (Kaas e Huerta, 1988). Matteau e colaboradores (2003) também observaram

em gatos uma densa inervação bilateral da retina atingindo toda a extensão das camadas

superficiais do CS. Entretanto, também foi observada a marcação de fibras e varicosidades

nas camadas intermediárias do CS. Major e colaboradores (2003) também observaram o

mesmo padrão de inervação do CS encontrado em gatos (Matteau et al., 2003) no esquilo-

terrestre-da-Califórnia. Em Fukomys anselli e Heterocephalus glaber, a projeção da retina ao

CS é predominantemente contralateral atingindo as camadas superficiais e com esparsa

projeção ipsilateral (Crish et al., 2006; Nemec et al., 2008). Em um estudo comparativo entre

ratos albinos (F344c/c) e pigmentados (F344c/+), foi observada a presença de fibras e terminais

densamente marcados nas camadas superficiais do CS contralateral, enquanto que a marcação

ipsilateral se concentrou na porção mais superficial das camadas intermediárias (Fleming et

al., 2006). Outro roedor, o rato-do-Nilo, também apresenta projeção bilateral da retina para o

CS, tendo marcação muito intensa nas camadas CZ, CCS e CTO do lado contralateral, e

apresentando do lado ipsilateral pequenos pontos densamente marcados na metade lateral do

CS (Gaillard et al., 2013). Em um trabalho mais recente realizado em camundongos, as

camadas CZ, CCS e CTO contralaterais apresentam-se intensamente inervadas, enquanto que

a CCI apresenta uma inervação moderada, já a inervação ipsilateral que atinge estas camadas

é esparsa (Morin e Studholme, 2014).

Com relação à morfologia das fibras e varicosidades, foi observado no CS de A.

planirostris que ambas as camadas identificadas pela projeção retiniana apresentaram fibras e

varicosidades semelhantes àquelas descritas por Ling e colaboradores (1997) em hamster,

como foi descrito acima para o GLD e o CPT. Logo, é possível que estas fibras e

varicosidades encontradas no CS tenham características semelhantes às descritas por Petrof e

Sherman (2013), permitindo assim inferirmos que o CS recebe aferentes controladores de

classe 1 e moduladores de classe 2.

73

7. CONCLUSÕES

Poucos estudos abordam a organização citoarquitetônica e o padrão de distribuição das

projeções retinianas no sistema visual de quirópteros. Nosso trabalho é o primeiro estudo

realizado em morcegos que descreve características morfométricas, estereológicas e de

densidade óptica relativa. Estes parâmetros nos permitiram as seguintes conclusões:

1. O GLD de A. planirostris apresenta duas lâminas (externa e interna) evidenciadas

pela análise da projeção retiniana utilizando o método de DOR.

2. As médias de área celular observadas entre o GLD, CPT e CS são

significativamente diferentes entre si. Os neurônios do GLD apresentam média de

área significativamente maior que os neurônios dos demais núcleos investigados.

3. O CS apresenta estimativa de volume superior àquela observada no GLD e no CPT.

4. O CS de A. planirostris apresenta sete camadas bem definidas pela citoarquitetura.

A média de área dos neurônios da camada CCS é maior que os valores observados

na camada CZ.

5. O CPT de A. planirostris é formado pelos núcleos PTA, PTM, PTO, NTO e PTP a

partir da análise da citoarquitetura dos núcleos. A análise da DOR revela

distribuição uniforme entre os núcleos avaliados. O PTA não apresenta inervação

retiniana.

6. O PTP apresenta maior média de área celular entre os núcleos do CPT de A.

planirostris.

7. As fibras e varicosidades encontradas nos núcleos do sistema visual primário de A.

planirostris podem ser classificadas como R1, R2, simple endings e string-like

complex.

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ANEXO

universidade federal do rio grande do norte centro … · universidade federal do rio grande do...

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