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Maria Raquel Cavalcanti Inácio
TEOR DE ANTOCIANINAS TOTAIS EM FRUTOS INTACTOS DE AÇAÍ (Euterpe
oleracea MART.) E PALMITEIRO-JUÇARA (Euterpe edulis MART.) USANDO
ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E CALIBRAÇÃO
MULTIVARIADA.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como parte dos requisitos necessários para
obtenção do título de Doutor em Química.
Orientador: Prof. Dr. Kássio Michell Gomes
de Lima
Natal / RN
2014
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN Biblioteca Setorial do Instituto de Química
Inácio, Maria Raquel Cavalcanti. Teor de antocianinas totais em frutos intactos de açaí (euterpe oleracea MART.) e palmiteiro-juçara (euterpe edulis MART.) usando espectroscopia na região do infravermelho próximo e calibração multivariada / Maria Raquel Cavalcanti Inácio. – Natal, RN, 2014.
89 f. : il.
Orientador: Kássio Michell Gomes de Lima. Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química.
1. Açaí – Tese. 2. Juçara – Tese. 3. NIR – Tese. 4. PLS – Tese. 5. Método não destrutivo – Tese. 6. Calibração multivariada – Tese. I. Lima, Kássio Michell Gomes de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UFRN/BSE- Instituto de Química CDU 543.424.4 (043.2)
“... Mãe lê pensamento, tem premonição, sonhos estranhos. Conhece cara de choro, de gripe,
de medo, entra sem bater, liga de madrugada, pede favor chato, palpita e implica com amigos,
namorados, escolhas. Mãe dá a roupa do corpo, tempo, dinheiro, conselho, cuidado, proteção.
Mãe dá um jeito, dá nó, dá bronca. Mãe cura cólica, porre, tristeza, pânico noturno, medos.
Espanta monstros, pesadelos, mosquitos, perigos. Mãe tem intuição e é messiânica: mãe
salva. Mãe exagera, exaure, extrapola. Mãe transborda, inunda, transcende...”
(Hilda Lucas)
À minha mãe, Maria Lêda, o coração mais forte, bondoso e compassivo que conheci até hoje.
Exemplo de força e garra diante das dificuldades. Que me proporcionou o bem mais precioso
da vida, o estudo. Responsável por quem sou hoje.
Com admiração, gratidão e amor.
Dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida, sua constante proteção e presença ao meu lado. Por sua
força e sabedoria para chegar até aqui. Por não me permitir desistir nos momentos de maiores
dificuldades.
À minha família, meu porto seguro. Minha mãe Lêda por seu amor e exemplos. Meu
irmão Demetrius por seu carinho e proteção. Sem vocês eu nada faria, nada seria.
Ao meu companheiro de todas as horas Gustavo. Por sua paciência, compreensão e
amor. Por sempre tentar me acalmar nas horas do estresse e pela força nos momentos mais
difíceis. E por sempre me esperar. Esperar minha hora, meu tempo.
Ao meu orientador, Doutor Kássio Michell Gomes de Lima. Por sua orientação,
ensinamentos, conhecimentos transmitidos ao longo dos anos, amizade e compreensão. Por
me fazer enxergar além do óbvio e mostrar através do exemplo que com esforço e dedicação
tudo se alcança.
Aos amigos e amigas da “família GPQA”, hoje GPQBQ. Vocês foram vitais nesse
período. Agradeço pela amizade, carinho, compreensão. Pelo apoio, conhecimento
transmitido e força nos “momentos em que nada fazia sentido”. Minha segunda família, meus
grandes amigos. E o que dizer das meninas? Minhas Helenas!!!! Estarão sempre comigo, em
qualquer lugar, em qualquer situação. Afinal, é impossível “me livrar” de vocês.
Ao meu amigo Ricardo Pedroza, “meu irmão pequeno”, por sua paciência constante
em me fazer entender as vontades do MATLAB e por ser sempre tão gentil e atencioso. A
inteligência em forma de humildade. Muito obrigada irmão.
A minha amiga Fernanda Saadna. Por sua amizade sincera, por seu apoio,
compreensão e estimulo nos momentos difíceis. Por se fazer sempre presente nos principais
momentos da minha vida. Sou muito grata e feliz por sua amizade “Lady”.
Ao professor Gustavo Henrique de Almeida Teixeira, da Universidade de São Paulo,
pelo apoio para a realização deste trabalho.
Aos professores e funcionários do Instituto de Química da UFRN.
A CAPES pelo auxílio nas missões de estudo.
A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho: MUITO
OBRIGADA!
Resplandecente é a sabedoria e sua beleza é inalterável: os que a amam,
descobrem-na facilmente, os que a procuram encontram-na. Ela antecipa-
se aos que a desejam.
(Livro da Sabedoria, Capítulo 6, versículos 12 e 13 – Bíblia Sagrada)
RESUMO
Neste trabalho, foram avaliados a espectroscopia de reflectância do infravermelho
próximo (NIR) e o potencial da calibração multivariada, como um método rápido para
determinar o teor total de antocianinas em frutos intactos de açaí e palmiteiro juçara. É
importante o desenvolvimento de novas metodologias para determinação de parâmetros de
qualidade em alimentos, principalmente com a utilização de técnicas rápidas, não invasivas e
que apresentem resultados confiáveis. A espectroscopia NIR preenche estes requisitos e vem
se mostrando como uma alternativa às análises convencionais de controle de qualidade nos
mais diversos alimentos, entre eles, frutos. Atualmente, metodologias analíticas vêm sendo
relatadas para a determinação de antocianinas em frutos. Porém a espectroscopia NIR é
raramente citada para determinação do teor total de antocianina em frutos de açaí e palmiteiro
juçara. Portanto, tal estudo poderá contribuir cientificamente com pesquisas já realizadas.
.Diversos métodos quimiométricos, incluindo regressão por mínimos quadrados parciais
(PLS), Mínimos Quadrados Parciais por Intervalo (iPLS), algoritmo genético (AG) e
algoritmo das projeções sucessivas (APS), foram utilizados e validados pelo cálculo das
figuras de mérito. Foram utilizados 139 frutos, 69 frutos de açaí e 70 frutos de palmiteiro
juçara. Utilizou-se o método de referência do pH diferencial para a determinação do teor total
de antocianinas nos frutos. Em seguida foram realizadas as medidas espectrais na região do
infravermelho próximo (NIR) com reflectância difusa e construídos modelos quimiométricos.
Resultados adequados foram obtidos com o modelo PLS (4 variáveis latentes e suavização em
janela com 5 pontos) com limite de detecção de 0,62 mg g-1
, limite de quantificação de 2,07
mg g-1
, raiz quadrada da média do erro da previsão (RMSEP) de 4.8 mg g-1
, seletividade de
0,79 mg g-1
, sensibilidade de 5,04 x 10-3
mg g-1
, precisão de 27,8 mg g-1
e a razão sinal-ruído
foi de 1,04 x 10-3
mg g-1
. Estes resultados sugerem que a espectroscopia NIR e a calibração
multivariada podem ser efetivamente usadas para determinar o teor de antocianinas em frutos
intactos de açaí e palmiteiro juçara.
Palavras-chave: Açaí. Juçara. NIR. PLS. Método não destrutivo. Calibração multivariada.
ABSTRACT
In this study was evaluated near-infrared reflectance spectroscopy (NIR), and
multivariate calibration potential as a rapid method to determinate anthocyanin content in
intact fruit (açaí and palmitero-juçara). It’s important to develop new methods to determinate
quality parameters in foods, mostly the use of quick techniques, non-invasive and which
have reliable methods. The NIR spectroscopy fills these requirements and these have shown
as an alternative to conventional quality control analysis in several foods, including, fruit.
Currently, analytical methods have been reported to determinate anthocyanin in fruits.
However, the NIR spectroscopy is cited rarely to determinate anthocyanin content in açaí and
palmitero-juçara. This study could contribute to research that already have performed. Several
multivariate calibration techniques, including partial least squares (PLS), interval partial least
squares (iPLS), genetic algorithm (AG), successive projections algorithm (SPA), were
compared and validated by establishing figures of merit. In this job, 139 fruits were used, 69
were acai and 70 were palmiteiro juçara. The potential anthocyanin sources has been
quantified using differential pH method, as a reference method. Soon after, the near-infrared
diffuse reflectance spectra have been measured, and finally the chemometrics models have
been built. Suitable results were obtained with the PLS model (four latent variables and 5-
point smoothing) with a detection limit of 6.2 g kg-1
, limit of quantification of 20.7 g kg-1
,
accuracy estimated as root mean square error of prediction of 4.8 g kg-1
, mean selectivity of
0.79 g kg-1
, sensitivity of 5.04 x10-3
g kg-1
, precision of 27,8 g kg-1
, and signal-to-noise ratio
of 1.04 x10-3
g kg-1
. These results suggest NIR spectroscopy and multivariate calibration can
effectively be used to determine anthocyanin content in intact açaí and palmitero-juçara fruit.
Keywords: NIRS. PLS. Non-destructive method. Multivariate calibration.
LISTA DE FIGURAS
FIGURAS PÁGINA
FIGURA 1- Fruto do açaizeiro. 12
FIGURA 2- Fruto do palmiteiro juçara. 13
FIGURA 3- Estrutura química geral das antocianinas. 15
FIGURA 4- Fases de (A) Colheita, (B) Debulha e (C) Frutos para análise de
qualidade. 18
FIGURA 5- Modo de medida na região NIR: Reflectância difusa. 24
FIGURA 6- Componentes de um espectrofotômetro NIR. 26
FIGURA 7- Representação esquemática dos três tipos de dados em calibração:
ordem zero, primeira e segunda ordem. 29
FIGURA 8- (a) Espectros originais de reflectância difusa e (b) espectros após os
pré-processamentos de suavização e MSC. 37
FIGURA 9- (a) Espectros originais de reflectância difusa e (b) espectros com o pré-
processamento de primeira derivada em janela de 15 pontos. 39
FIGURA 10- (a) Espectros originais de reflectância difusa e (b) com aplicação do
pré-processamento de segunda derivada em janela de 31 pontos. 39
FIGURA 11- Seleção de variáveis, via iPLS, dentro de uma ampla faixa espectral 43
FIGURA 12- Etapas do procedimento de coleta dos frutos. 57
FIGURA 13- Etapas do método de referencia para o teor de antocianinas totais. 59
FIGURA 14- Medidas instrumentais com espectroscopia NIR 60
FIGURA 15- Total de 139 espectros originais de reflectância difusa na região do
NIR dos frutos de açaizeiro e juçara. 65
FIGURA 16- Teor previsto versus teor medido de antocianinas, a partir de amostras
de referência de calibração e previsão para o teor de antocianinas,
usando o modelo PLS (4) suavização (5pts.).
70
FIGURA 17- Região elíptica de confidencia conjunta para o declive e intercepto dos
valores previstos versus medidos a partir da validação externa do teor
de antocianinas, usando o modelo PLS(4) suavização (5pts.).
70
LISTA DE TABELAS
TABELAS PÁGINA
TABELA 1- Composição química, com base na matéria seca, e valor nutricional de
frutos de açaizeiro e juçara. 14
TABELA 2- Regiões espectrais no infravermelho 22
TABELA 3- Teores de TAC (cianidina-3-glicosídeo) (% m/m) dos frutos das diferentes
palmeiras de açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) e palmiteiro-juçara
(Euterpe edulis Mart.) obtidos pelo método de referência.
62
TABELA 4- Resultados dos modelos de calibração e previsão para TAC (kg.g-1
). 68
TABELA 5- Figuras de mérito para o melhor modelo encontrado. PLS(4) 5pts 73
LISTA DE ABREVIATURAS
ANN Artificial neural networks – Redes neurais artificiais
AOAC Official Methods of Analysis – Método Oficial de Análise
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
EJCR Elliptical Joint Confidence Region--Região Elíptica de Confidencia Conjunta
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FCAV Viveiro Experimental de Plantas Ornamentais e Florestais da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias
FOM Figures Of Merit - Figuras de Mérito
GA Genetic Algorithm - Algoritmo Genético
GPQA Grupo de Pesquisa em Quimiometria Aplicada
GPQBQ Grupo de pesquisa em química biológica e quimiometria
HPLC-DAD High Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detection - Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência - Detecção por Arranjo de Diodos
HPLS-MS Liquid Cromatography-mass spectrometry- cromatografia líquida- espectrometria de massa
IAC Instituto Agronômico de Campinas
iPLS Interval Partial Least Square - Mínimos Quadrados Parciais por Intervalo
LDL Low Density Lipoproteins - lipoproteínas de baixa densidade
LOD Limit of Detection - Limite de Detecção
LOQ Limit of Quantitation – Limite de Quantificação
MATLAB Software para cálculos numéricos (Matrix Laboratory)
MCR Multivariate Curve Resolution - Resolução de Curvas Multivariadas
MSC Multiplicative Scatter Correction – correção do espalhamento multiplicativo de luz
NIR Near Infrared – Infravermelho próximo
PARAFAC Parallel Factor Analysis – Análises de fatores paralelos
PCR Principal Component Regression – Regressão por Componentes Principais
PLS Partial Least Squares - regressão por mínimos quadrados parciais
RMSEC Root Mean Square Error of calibration – Raiz Quadrada do Erro Médiode calibração
RMSECV Root Mean Square Error of Cross Validation - Raiz Quadrada do Erro Médio de Validação
Cruzada.
RMSEP Root Mean Square Error of Prediction – Raiz Quadrada do Erro Médio de Previsão
SEC Square Error of Calibration – Erro de calibração
SEL Seletividade.
SEN Sensibilidade.
SEP Square Error of Prediction – Erro de previsão
SG Savitzky- Golay
SPA Successive Projections Algorithm - Algoritmo das Projeções Sucessivas
TAC Total Anthocyanin Content – Teor Total de Antocianinas
UNESP Universidade Estadual Paulista
UV-VIS Ultravioleta Visível
SUMÁRIO
PÁGINA
1 INTRODUÇÃO 12
1.1 AÇAÍ, JUÇARA E AS ANTOCIANINAS. 12
1.2 PÓS-COLHEITA 16
1.3 ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR) 20
1.3.1. Origem da espectroscopia NIR 20
1.3.2 A espectroscopia na região do infravermelho próximo 21
1.3.3 Instrumentação NIR 25
1.4 QUIMIOMETRIA E CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA 27
1.4.1 Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS) 29
1.4.2 Pré-Processamentos de dados 33
1.4.2.1 Centragem na Média 34
1.4.2.2 Suavização ou Filtro Digital Savitzky-Golay (SG) 34
1.4.2.3 Correção de Espalhamento Multiplicativo de Luz (MSC) 36
1.4.2.4 Cálculo das Derivadas 38
1.4.3 Seleção de Amostras 41
1.4.4 Seleção de Variáveis 42
1.4.4.1 Mínimos Quadrados Parciais por intervalos (iPLS) 42
1.4.4.2 Algoritmo das Projeções Sucessivas (APS) 43
1.4.4.3 Algoritmo Genético (AG) 43
1.4.5 Detecção de amostras anômalas - Outliers 45
1.4.6 Testes Estatísticos 46
1.4.7 Figuras de Mérito 49
1.5 ESPECTROSCOPIA NIR E CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA APLICADAS EM
ANÁLISES DE FRUTOS 51
2 JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS 54
3 PARTE EXPERIMENTAL 57
3.1 AMOSTRAS 57
3,2 MÉTODO DE REFERENCIA: ANTOCIANINAS TOTAIS (AT) 58
3.3 INSTRUMENTAÇÃO NIR 60
3.4 MODELOS QUIMIOMÉTRICOS 61
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 61
4.1 ANTOCIANINAS TOTAIS PELO MÉTODO DE REFERENCIA (pH diferencial) 61
4.2 ATRIBUIÇÃO DE BANDAS NO NIR E PRÉ-PROCESSAMENTOS 66
4.2.1 Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLS) 68
5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 74
REFERENCIAS 75
12
1. INTRODUÇÃO
1.1. AÇAÍ, JUÇARA E AS ANTOCIANINAS.
As palmeiras do Açaí (Euterpe oleracea Mart.) e de Juçara (Euterpe edulis
Mart.) são espécies nativas da Amazônia e da Floresta Atlântica, respectivamente. Seus
frutos são economicamente importantes para o estado brasileiro do Pará. Os frutos de
açaizeiro e palmiteiro-juçara são globosos, do tipo baga com diâmetro que varia de 1 a 2
cm, possuindo uma superfície lisa, de cor azul noite quando atinge seu período de
maturação. O açaí tem o mesocarpo de aproximadamente 1 mm de espessura e no
restante da parte interna predomina um caroço endurecido, pesando de 2,6 a 3,0 g. A
polpa representa de 5 a 15% do volume do fruto e esta porcentagem flutua segundo a
variedade e grau de maturidade do fruto (PAULA, 1975; FGV, 2003). Na Figura 1 é
representado o fruto do açaizeiro.
Figura 1- Fruto do açaizeiro.
Fonte: http://www.arara.fr/BBACAI.html
13
O fruto da juçara pesa em média 1g e as infrutescências, conjunto de frutos
pequenos originados de muitas flores separadamente, podem atingir 5 kg (REITZ, 1974;
FGV, 2003), conforme a Figura 2. Os frutos exóticos são considerados ricas fontes de
energia e tem sido reconhecidos por certas propriedades funcionais apresentando
capacidade antioxidante.
Figura 2- Fruto do palmiteiro juçara
Fonte: http://www.projetojucara.org.br
Através da cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de
massa foi possível observar a capacidade antioxidante de amostras de açaí contra os
radicais peroxil, contra os radicais peroxinitros e baixa capacidade antioxidante em
relação ao radical hidroxila. Foi observada uma correlação não linear entre as
concentrações das amostras e as capacidades antioxidantes (LICHTENTHÄLER et al,
2005; ROSSO et al, 2007; RUFINO et al, 2010). As polpas de tais frutos apresentam
um alto valor nutricional, sendo a matéria seca composta por cerca de 10% de proteínas
e 50% de lipídios, sendo ricos também em minerais e o seu sabor se assemelha ao sabor
da beterraba (BAUER, 2000). Silva e colaboradores, em um estudo sobre a
caracterização química da polpa dos frutos de juçara e de açaí, observaram a
composição química com base na matéria seca e o valor nutricional destes frutos,
conforme indicado na Tabela 1 que segue (SILVA et al, 2004).
14
Tabela 1- Composição química, com base na matéria seca, e valor nutricional de frutos de
açaizeiro e juçara.
Composição Juçara Açaí
pH 4,7 4,8
Zinco 12,2 g/kg 10,1 mg/kg
Cobre 14 mg/kg 20,4 mg/kg
Ferro 559,6 mg/kg 328,5 mg/kg
Magnésio 1,5 g/kg 1,4 g/kg
Cálcio 4,3 g/kg 4,8 g/kg
Potássio 12,1 g/kg 7,4 g/kg
Fósforo 0,8 g/kg 1,4 g/kg
Energia 155,74 kcal/100g 152,9 kcal/100g
Açúcares Totais 12,1 g/kg 10,2 g/kg
Lipídios Totais 137,8 g/kg 130,9 g/kg
Proteínas 67,2 g/kg 77,6 g/kg
Fonte: SILVA et al, 2004
A juçara possui maiores valores de zinco, ferro, magnésio, potássio, energia,
açúcares totais e lipídeos totais se comparada ao fruto açaí. Os dois frutos apresentam
pH semelhante, de 4,7 para a juçara e 4,8 para o açaí. O açaí por sua vez, apresenta
maior teor de cobre, cálcio, fósforo e proteínas em sua composição, em comparação
com a juçara. Dessa forma é possível observar que tanto a juçara quanto o açaí podem
ser considerados alimentos calóricos, pois são ricos em lipídeos. E ainda apresentam um
elevado valor nutricional devido à presença de proteínas e minerais em sua composição.
Ricos em antocianinas, que são substâncias com elevada capacidade
antioxidante e de comprovados efeitos benéficos à saúde, os frutos de açaí e juçara vem
ganhando espaço no mercado internacional (ROGEZ, 2000; DEL POZO-INSFRAN et
al, 2004; KUSKOSKI, et al, 2006).
As antocianinas, das palavras gregas anthos, flor e kianos, azul, são pigmentos
vegetais responsáveis pela maioria das cores azul, roxa e algumas das tonalidades de
15
vermelho encontradas em flores, frutos, algumas folhas, caules e raízes de plantas
(MARKAKIS, 1982). As antocianinas são de importância vital, por colorir frutos e
flores, como atrativo para animais polinizadores e dispersores de frutos (TAIZ e
ZEIGER, 2004). Fazem parte do grupo dos flavonoides, que são compostos fenólicos
caracterizados pelo núcleo básico flavílio (cátion 2-fenilbenzopirílio), consistindo de
dois anéis aromáticos unidos por uma unidade de três carbonos e condensados por um
oxigênio. A molécula de antocianina é constituída por duas ou três porções, sendo uma
aglicona (antocianidina), um grupo de açúcares e um grupo de ácidos orgânicos
(FRANCIS, 1989), conforme a Figura 3. São conhecidas cerca de 22 agliconas, dentre
elas 18 ocorrem de forma natural, sendo apenas 6 importantes nos alimentos:
pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, petunidina e malvidina. As
antocianinas sem os seus açúcares são chamadas de antocianidinas ou aglicona
(FRANCIS, 2000; TAIZ e ZEIGER, 2004).
Figura 3- Estrutura química geral das antocianinas.
Fonte: Autor baseado em MARÇO et al, 2008.
Já foram identificadas e descritas na literatura mais de 100 antocianinas, sendo
que vários legumes, frutas e seus derivados são fontes destes compostos na dieta
humana. As antocianinas encontradas com frequência nos alimentos são: cianidina-3-
glucosídeo, encontrada em cerejas, jambolão, uvas, vinho, morangos e amoras
vermelhas; peonidina-3-glucosídeo, encontrada em cerejas, jabuticabas, uvas e vinho;
malvidina-3-glucosídeo, encontrada em uvas e vinho; e pelargonidina-3-glucosídeo
encontrada em morangos. Algumas antocianinas como, cianidina-3-arabinosídeo e
cianidina-3-arabinosil-arabinosideo, foram identificadas através de métodos químicos,
16
espectroscópicos e CLAE. O teor de antocianinas totais no caso do fruto do açaizeiro foi
determinado como sendo 263mg/100g da casca (BOBBIO, 2000).
As antocianinas são substancias pouco estáveis e durante o processamento dos
alimentos, bem como tratamentos para conservação dos mesmos e armazenamento pode
ocorrer à degradação de tal substancia. O pH, luz, temperatura, degradação enzimática,
estrutura química e presença de oxigênio, são alguns dos fatores que podem influenciar
na estabilidade das antocianinas (FRANCIS, 1989; MARÇO et al, 2008). O
aquecimento durante o processo de preparação dos alimentos pode também levar a
degradação das antocianinas (MALACRIDA e DA MOTTA, 2006; MARÇO et al,
2008).
Alguns estudos in vitro demonstraram seu efeito antioxidante sobre o LDL humano
(lipoproteínas de baixa densidade, do inglês, Low Density Lipoproteins) indicando um
potencial protetor sobre doenças como a arteriosclerose (SATUE-GRACIA, 1997;
GHISELLI et al, 1998). O conteúdo de antocianinas dos frutos do palmiteiro juçara
(Euterpe edulis) é quatro vezes superior ao dos frutos do açaizero (Euterpe oleracea)
(IADEROZA et al, 1992). Poucos são os estudos que quantificam o teor de antocianinas
em Euterpe edulis.
1.2. PÓS-COLHEITA
Nos últimos anos, tem crescido a conscientização em relação ao conceito de
qualidade, principalmente nos setores de alimentação e saúde. O que impulsiona
fortemente as atividades de pesquisa focalizando a geração de definições de qualidade, a
preservação da mesma durante a comercialização e, também, à possibilidade de
integração de parâmetros de avaliação de qualidade aos processos de produção (BUTZ
et al, 2005).
Alguns fatores na pré-colheita afetam a qualidade final do produto após a
colheita, tais como, semeadura, pH do solo, plantio, espaçamento, irrigação, controle de
plantas daninhas, adubação, fertirrigação, poda, controle fitossanitário, raleamento; w
fatores de clima, como: temperatura, umidade, radiação, precipitação e vento.
Na fase pós-colheita, algumas características precisam ser levadas em
consideração para garantir a qualidade dos alimentos, especialmente os frutos. A
qualidade dos frutos é um conjunto de muitas propriedades ou características peculiares
17
de cada produto, como: propriedades sensoriais, valor nutritivo e multifuncional,
propriedades mecânicas, assim como a presença ou ausência de defeitos nos frutos
(CHITARRA e CHITARRA, 1990).
Assim, a qualidade dos frutos é definida como o conjunto de características que
diferenciam componentes individuais de um mesmo produto e que têm significância na
determinação do grau de aceitação desse produto pelo consumidor. Alguns atributos de
qualidade devem ser observados para atender as necessidades do consumidor, a
legislação e proteção à saúde. Entre eles, atributos sensoriais, como aparência (tamanho,
forma, brilho, cor, defeitos), textura (firmeza, dureza, fragilidade, resistência), sabor e
aroma, valor nutritivo (carboidratos, proteínas, lipídeos, vitaminas, etc), segurança e
rendimento (relação entre a casca, polpa e caroço, volume do suco, número de
sementes, entre outros) (CHITARRA e CHITARRA, 1990).
O ponto de colheita dos frutos de juçara é determinado da mesma forma que os
frutos do açaí. Sendo o ponto final de maturação identificado pela coloração de violácea
a negro vinosa, fato este que ocorre devido à síntese de compostos antociânicos
(MANTOVANI E MORELLATO, 2000; ROGEZ, 2000). Os frutos devem ser frescos,
sãos, maduros, limpos, sem terra, micro-organismos e parasitas (Instrução normativa,
2000). Durante o processo de debulha os frutos são selecionados, com o objetivo de
excluir os frutos prejudicados por doenças, ataques de animais ou insetos e
contaminados por fezes de aves (VASCONCELOS et al, 2005). Justamente na fase da
debulha, que consiste da liberação dos frutos dos cachos, acontecem os principais danos
aos frutos de açaizeiro e juçara, como ferimentos, amassamentos e abrasões provocados
pelo incorreto manuseio dos frutos, o que pode provocar o rompimento da epiderme e
levar a contaminações por microrganismos causando a deterioração do produto. A
Figura 4 mostra as fases de colheita, debulha e os frutos para análise de qualidade.
18
Figura 4- Fases de (A) Colheita, (B) Debulha e (C) Frutos para análise de qualidade.
Fonte: http://www.projetojucara.org.br
Na etapa de pós-colheita dos frutos de açaizeiro e palmiteiro-juçara, os métodos
de referência, para análise de parâmetros físico-químicos, tais como: acidez titulável,
potencial hidrogeniônico, teor de açúcares totais, teor de sólidos solúveis e pigmentos
(antocianinas e clorofila), são geralmente de natureza destrutiva, necessitam de longos
períodos de análise e produzem resíduos químicos. Porém, tais métodos de referência
são aceitos pelos principais órgãos reguladores devido a exatidão e precisão de suas
determinações (MORGANO et al, 2005). No entanto, são necessárias novas alternativas
analíticas para análise de frutos, para o diagnóstico de atributos físico-químicos que
garantam estatisticamente as mesmas figuras de mérito calculadas pelos métodos de
referência, como a exatidão e precisão de resultados.
Algumas metodologias analíticas têm sido relatadas para a determinação do teor
de antocianinas em frutos, incluindo espectroscopia UV-VIS, ressonância magnética
nuclear (MISSANG, et al, 2003), espectroscopia de massa (WILLIAMS et al, 2002) e a
espectroscopia na região do infravermelho próximo, do inglês “Near Infrared
Spectroscopy” (NIR), entre outras.
Alguns trabalhos já foram publicados com estudos sobre os frutos de açaí e
Juçara. Dentre eles, Bobbio e colaboradores, utilizaram a técnica espectrofotométrica,
19
onde a partir do extrato aquoso, congelado e liofilizado dos frutos do açaizeiro, foram
extraídas as antocianinas e após purificação e separação das duas principais frações as
mesmas foram identificadas usando métodos químicos, espectroscópicos e CLAE
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência). (FRANCIS, 1982).
Outro trabalho foi realizado por Gallori e colaboradores. Se trata da
caracterização de antocianinas em frutos de açaí onde foram utilizadas técnicas
cromatográficas. A composição de polifenóis de Euterpe oleracea Mart. foi estudada
por HPLC-DAD-UV-VIS (do inglês, High Performance Liquid Chromatography -
Diode Array Detection - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - Detecção por
Arranjo de Diodos) e HPLC-MS (Liquid Cromatography-mass spectrometry-
cromatografia líquida- espectrometria de massa. O estudo confirmou a presença de
cianidina 3-O-glicosídeo e cianidina 3-O-rutinosideo como principais compostos
antociânicos. Além disso, quatro compostos principais também foram identificados pela
primeira vez: homoorientina, orientina, taxifolina de oxyhexose e isovitexina.
(GALLORI et al, 2004).
Iaderoza em seu estudo extraiu antocianinas de frutos de açaí e juçara, e em
cromatografia de papel conseguiu identificar cianidina-3-glucosídeo e cianidina-3-
rutinosídeo em ambas as espécies. No fruto da juçara o teor de antocianinas encontrado
foi de 1.347mg/100g do fruto. Já para o açaí o teor encontrado foi de 336mg/100g do
fruto, ou seja, foi observado que os frutos de juçara apresentam um teor de antocianinas
4 vezes maior do que em açaí (IADEROZA et al, 1992).
Rogez em seu estudo quantificou as antocianinas de 60 amostras de frutos de
açaí, sendo o mesmo recém-preparado. As amostras foram coletadas durante o período
de alta produção no estado do Pará e foi encontrado um valor médio de 44mg/100g do
fruto. Quando foi considerado o rendimento médio de despolpamento de 474,5g de açaí
por kg de frutos e o teor médio de matéria seca de 15,26%, o teor de antocianinas
encontrado foi de 92,7mg/100g de açaí. E quando o valor foi expresso em gramas de
matéria seca, o teor encontrado de antocianinas foi de 6,1mg/g (ROGEZ, 2000).
Em outro estudo, as capacidades antioxidantes da polpa de fruta do açaí seca e
congelada e a pele do açaí em pó, foram avaliadas por diferentes ensaios com várias
fontes de radicais livres (SCHAUSS et al, 2006). Também foi estudada a influência da
temperatura do ar de secagem e da concentração de agente carreador sobre as
20
propriedades físico-químicas do suco de açaí em pó produzido por spray drying
(TONON et al, 2009). Todas essas técnicas apresentam a necessidade de destruição da
amostra e são relativamente demoradas, dificultando assim, a determinação da
qualidade inicial da matéria-prima em função do teor destes compostos no momento da
recepção.
A espectroscopia na região do infravermelho próximo (NIR) juntamente com as
ferramentas quimiométricas de análise, tem sido utilizadas em várias áreas de análise
nas últimas décadas, principalmente nas áreas da alimentação e saúde (INÁCIO et al,
2011; NEVES et al, 2012; SAKUDO et al, 2009). Nazarov e seus colaboradores
realizaram um estudo de alguns parâmetros para frutos de uvas, entre eles, a
antocianina, onde foi observado que é possível se utilizar métodos não invasivos e não
destrutivos para a avaliação da qualidade de frutos íntegros (NAZAROV et al, 2005).
1.3. ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO (NIR)
1.3.1. Origem da Espectroscopia NIR
Data de 1800 os primeiros documentos sobre a descoberta da radiação do
Infravermelho Próximo (NIR), antes mesmo da descoberta da radiação do
Infravermelho Médio (MID). Porém, apenas em 1950 estudos começaram a ser
realizados e divulgados por espectroscopistas que se interessaram em verificar essa
região do espectro (BURNS et al, 2001).
Na década de 60, Norris et al, apresentaram um método para determinar
umidade em sementes baseada na análise espectroscópica no infravermelho próximo
(WILLIAMS et al, 1985). Em 1963, Hoffman apontou as vantagens da espectroscopia
na região do Infravermelho Próximo com Reflectância Difusa para a determinação do
teor de umidade em sólidos. Ele apresentou a relação da reflectância para o teor de
umidade em várias amostras sólidas incluindo farinha e amido. Ben-Gera e Norris
apresentaram o efeito da concentração de gordura no leite sobre o espectro de absorção
na região do NIR (WATSON, 1977).
Entre os anos de 1950 e 1980, relatou-se os primeiros estudos sobre a descoberta
e tecnologia NIR, onde sua teoria vibracional, técnicas e instrumentos espectroscópicos
(características e vantagens) e suas aplicações foram enfocadas. Nesta época também,
21
surgiram as primeiras análises qualitativas e quantitativas em produtos agrícolas e
farmacêuticos utilizando reflectância difusa (BURNS, 2001).
A década de 1980 foi um marco na espectroscopia NIR, pois em 1983 Wetzel,
publicou o trabalho “Near Infrared Reflectance Analysis - sleeper among spectroscopic
techniques”, que destacava as vantagens e o potencial da técnica, que até então tinha
sido pouco utilizada. Também na década de 80 o computador foi integrado no
desenvolvimento de instrumentos eletrônicos, o que possibilitou a aquisição de dados
tão complexos, sua manipulação e interpretação, mais sofisticada, devido a diversos
programas computacionais. Dessa forma, na década de 90 houve um grande aumento de
publicações utilizando a espectroscopia NIR (PASQUINI et al, 2003).
A espectroscopia NIR já foi aplicada em determinações de moléculas orgânicas
como proteína e gordura, sendo um método analítico que apresentou resultados
satisfatórios para essas determinações. Aplicações têm sido realizadas nas indústrias de
petróleo, têxtil, carvão, cosméticos, polímeros, química, tintas, farmacêuticas, sendo
aplicada até em restauração de imagens decorativas de pinturas históricas (ILARI, 1998;
RUFINO, 2004).
1.3.2. A espectroscopia na região do infravermelho próximo
A espectroscopia na região do infravermelho próximo é uma técnica poderosa
bastante utilizada na determinação de compostos químicos, aplicada em determinação
qualitativa e quantitativa de espécies moleculares que apresentam em sua composição
C-H, N-H, O-H. Tais espécies são representadas através de espectros de absorção,
reflexão ou emissão, onde os métodos espectroscópicos utilizados são baseados na
interação da energia radiante com a matéria e fornecem diferentes tipos de informações,
dependendo da região espectral em que ocorrem (MCCLURE, 2003). Conforme a
Tabela 2 abaixo, a faixa espectral do infravermelho está dividida em: radiação do
Infravermelho Próximo (780 a 2500 nm), Médio (2500 a 5000 nm) e Distante (5000 a
100000 nm) (BURNS et al 2001; SKOOG, 2006).
22
Tabela 2- Regiões espectrais no infravermelho.
Região do Infravermelho
Intervalo de
número de onda
(cm-1
)
Região de
comprimento de
onda (nm)
Região de frequência
(Hz)
Próximo 12800 – 4000 780 – 2500 3,8 x 1014– 1,2 x 1014
Médio 4000 – 200 2500 – 5000 1,2 x 1014– 6,0 x 1012
Distante 200 – 10 5000 - 100000 6,0 x 1012– 3,0 x 1011
Fonte: SKOOG, 2006.
Nessa região acontecem transições vibracionais e rotacionais das moléculas e
dessa forma as moléculas podem passar diretamente de um determinado nível
energético para dois ou mais níveis de maior energia. Na região do infravermelho
próximo as bandas de absorção mais proeminentes estão relacionadas a sobretons e
combinações de vibrações fundamentais de grupos funcionais –CH, –NH, –OH e –SH
(PASQUINI, 2003).
Na mecânica quântica é assumido o oscilador harmônico. Tal modelo prevê
separações iguais entre os níveis vibracionais e impõe a regra de seleção Δυ=±1. Nas
oscilações anarmônicas, a separação entre os níveis não é igualmente espaçada e
diminui para energias mais altas. Assim sendo, a regra da seleção Δυ=±1é relaxada e as
transições com Δυ=±2 ou Δυ=±3 originam os sobretons. Os sobretons são as transições
que se observam no NIR. As bandas de combinações aparecem entre 1900 e 2500 nm,
sendo resultantes de interferências construtivas de frequências, ou seja, suas frequências
são a soma dos múltiplos da cada frequência de interação (SKOOG, 2002).
As bandas de absorção na região NIR são largas, sobrepostas, e de 10 a 100
vezes mais fracas que suas bandas fundamentais na região do infravermelho médio.
Possui baixa absortividade, o que permite uma alta profundidade de penetração, que é
uma vantagem analítica. Dessa forma é possível a realização de análises diretas de
fortes absorventes e também o nivelamento de amostras com espalhamento, tais como
os líquidos turvos ou sólidos nos modos de reflectância ou transmitância sem
necessidade de pré-tratamento (MILLER et al, 1995)
A espectroscopia NIR é uma técnica que apresenta algumas vantagens e também
desvantagens. Algumas das vantagens de tal técnica são; rapidez na obtenção de seus
23
espectros, técnica de natureza não destrutiva, não invasiva, requer uma mínima ou
nenhuma preparação das amostras, entre outras Algumas das desvantagens são; técnica
não muito sensível e seletividade baixa. Porém, a principal desvantagem ou dificuldade
da espectroscopia NIR é a complexidade de seus espectros, que são de difícil
interpretação, devido à natureza dos seus sinais (sobretons e bandas de combinações)
(SKOOG et al, 2006). Os espectros NIR apresentam muitas informações químicas
relevantes, e, além disso, se correlacionam com as propriedades físicas da amostra,
dificultando mais ainda a interpretação dos dados obtidos. Por isso se torna necessário a
utilização da quimiometria para extrair as informações importantes dos espectros de
amostras obtidos na espectroscopia NIR (PASQUINI, 2003; LUYPAERT et al, 2007).
Baseados em propriedades ópticas, existem três maneiras para medir o produto
da interação da radiação NIR com a amostra: transmitância, reflectância difusa e
transflectância, sendo a transmitância empregada para materiais transparentes, a
transflectância utilizada para líquidos, sólidos ou semi-sólidos, dependendo das
características de absorção e espalhamento das amostras e a reflectância difusa,
empregada a amostras sólidas e pó (PASQUINI, 2003).
A reflectância difusa é usada como uma das várias maneiras para realização de
medidas analíticas na região NIR. Este modo de medida é apropriado quando a
superfície do material reflectante é pouco absorvente no comprimento de onda
incidente.
Na reflectância difusa um feixe de luz penetra na camada superficial das
partículas, os modos vibracionais das moléculas são excitados e há o espalhamento da
radiação em todas as direções. Parte dessa radiação é absorvida pela amostra, e a outra
parte é refletida difusamente, conforme ilustra a Figura 5 abaixo.
24
Figura 5- Modo de medida na região NIR: Reflectância difusa
Fonte: autor baseado em SKOOG, 2006.
Um espectro de reflectância é obtido como resultado, e neste espectro estão as
informações qualitativas e quantitativas sobre a natureza química do analito de interesse
(PASQUINI, 2003; WETZEL et al, 1983). Na reflectância difusa, uma série de teorias
foram propostas, e a mais popular entre elas é a de Kubelka-Munk (KUBELKA et al,
1931). Esta equação matemática relaciona a concentração (C) e a reflectância (R) como
mostra a equação abaixo (MOHAMMADI et al, 2004)
Equação 1
Em que:
R = reflectância da amostra;
C = concentração;
Rr = reflectância medida com um padrão de referência;
Ra= reflectância da amostra (medida nas mesmas condições);
k = coeficiente de absorção da amostra (proporcional a concentração) e
s = coeficiente de espalhamento da amostra.
A reflectância é dependente dos coeficientes k e s. O k indica o quanto a luz foi
absorvida pela amostra e s determina a extensão do espalhamento de luz pela amostra,
antes dela retornar a superfície. Quanto menor for o espalhamento (s), maior será a
reflectância (R) do material. A equação de Kubelka-Munk é conhecida também como a
lei de Beer da espectroscopia de reflectância, pois é capaz de transformar espectros de
25
reflectância em espectros semelhantes a um espectro de absorbância, relacionando
reflectância com concentração da amostra. Assim sendo, esta equação é raramente
empregada, podendo ser substituída por uma mais prática que relaciona o logaritmo
com o inverso da reflectância, como mostra a equação 2
Equação 2
Tal equação não é muito diferente da equação de Kubelka-Munk, pois para
mudanças pequenas na reflectância, é possível que assuma um comportamento linear
(intensidade da banda de absorção) com a concentração do analito (MOHAMMADI et
al, 2004).
Costa et al, utilizaram a espectroscopia no infravermelho próximo com
reflectância difusa para determinação de sólidos solúveis e pH em frutos intactos de
ameixas. Os resultados obtidos se apresentaram satisfatórios quando comparados aos
obtidos na literatura para frutas usando o PLS (COSTA et al, 2013).
1.3.3. Instrumentação NIR
Os espectrofotômetros utilizam uma variedade de métodos para produzir
espectros de radiação NIR, entre eles: detectores de dispositivos de diodo, redes de
difração, fontes de radiação de interferências com diodos de emissão de infravermelho e
filtros ópticos de comprimento de onda variável (BENITO et al, 2008). É importante
observar que as características necessárias para uma boa instrumentação NIR se
relacionam com a precisão do comprimento de onda e à medida espectral realizada
(SKOOG et al, 2006).
Os principais componentes de um espectrofotômetro NIR são: fonte de luz,
seletor de comprimento de onda, suporte onde será colocada a amostra e o detector
óptico. Cada um dos componentes de um espectrofotômetro pode apresentar diferentes
origens e propriedades, assim é possível a classificação de espectrofotômetros NIR de
acordo com as características de seus constituintes (BERZAGHI, 2009). A Figura 6
ilustra os componentes de um espectrofotômetro NIR.
26
Figura 6- Componentes de um espectrofotômetro NIR.
Fonte: autor baseado em SKOOG, 2002.
Em relação aos componentes básicos, os equipamentos de infravermelho não são
tão diferentes dos equipamentos utilizados nas regiões do ultravioleta e do visível.
Porém existem diferenças importantes na fase de seleção de comprimento de onda,
originando assim, espectrofotômetros dispersivos ou interferométricos ou fotômetros
equipados com filtros (SKOOG, 2002).
Os espectrofotômetros NIR, de espectro continuo com transformada de Fourier e
interferômetro, apresentam a combinação das melhores características em relação a
precisão e exatidão na recuperação dos comprimentos de onda. Apresentam também alta
relação sinal/ruído, rapidez em suas varreduras, o que possibilita a obtenção de
espectros em um curto intervalo de tempo (PASQUINI, 2003). Instrumentos com
transformada de Fourier são apropriados tanto para medidas qualitativas como
quantitativas (SKOOG, 2006). A transformada de Fourier vem sendo utilizada em
processamento de dados e também substituindo amplamente os instrumentos
dispersivos, visto que atualmente os instrumentos reduziram de tamanho para topo de
bancada e tornaram-se mais confiáveis, de custo mais viável e competitivo e de fácil
manutenção (DURIG, 1990). O espectrofotômetro com transformada de Fourier utiliza
um interferômetro ao invés de redes de difração e apresenta vantagens como: grande
eficiência no transporte da radiação até o detector, melhorando a relação sinal/ruído,
apresenta um alto poder de resolução e reprodutibilidade do comprimento de onda.
Além disso, todos os elementos de resolução para um espectro são medidos
simultaneamente possibilitando assim, a aquisição de dados de um espectro inteiro em
cerca de um segundo ou menos (SKOOG et al, 2002).
27
1.4. QUIMIOMETRIA E CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA
Pode se definir quimiometria como a pesquisa e utilização de métodos
matemáticos e estatísticos para tratar dados químicos, com o objetivo de extrair uma
maior e melhor quantidade de informações dos resultados analíticos (OTTO, 2007). A
quimiometria começou a ser utilizada na década de 1970, tendo se firmado
definitivamente quando o computador começou a ser utilizado no laboratório de
química. Com o uso de computadores no laboratório, os métodos instrumentais de
análise começaram a gerar grandes quantidades de dados, que eram obtidos de maneira
rápida e exigiam um menor esforço por parte dos analistas (NETO et al, 2006). Nos
anos de 1980, iniciou-se uma nova era de aquisição, processamento e interpretação de
dados químicos com a disponibilidade do uso de computadores. Os programas
computacionais existentes na época, aliados aos métodos matemáticos e estatísticos
possibilitaram aos pesquisadores trabalharem com informações de natureza complexa e
também a buscar o desenvolvimento de novos métodos (OTTO, 2007).
A quimiometria está dividida em algumas áreas, entre elas a calibração
multivariada, que é uma das combinações de métodos estatísticos com dados químicos
mais bem sucedidas (NETO et al, 2006). A calibração pode ser definida como uma série
de operações que estabelecem uma relação entre medidas instrumentais e valores para
uma propriedade de interesse correspondente (MARTENS e NAES, 2002). O método
de calibração mais difundido é a calibração univariada, onde se tem uma medida
instrumental apenas para cada amostra de calibração. Na calibração univariada ocorre
uma relação entre duas variáveis X e Y, onde X pode ser utilizada para predizer Y.
Trata-se de uma função matemática que relaciona as variáveis independentes Y e
dependente X da seguinte forma:
Equação 3
Sendo que b representa os coeficientes da equação e X se refere às medidas
instrumentais realizadas em um determinado comprimento de onda λ, por exemplo,
Absorbância, A.
Entretanto, a calibração univariada é aplicada a situações onde a grandeza que é
medida diretamente no sistema, seja livre de interferentes, para não haver desvios entre
a relação linear e a propriedade de interesse (NAES et al, 2002; MARTENS e NAES,
28
2002). Quando são relacionadas duas ou mais respostas instrumentais com a
propriedade de interesse, tem-se um tipo de calibração denominada de calibração
multivariada, podendo ser representada por uma função matemática que representa a
relação entre X e Y da seguinte forma:
Equação 4
Em que k indica o número de variáveis presentes na equação e f representa os resíduos
(MARTENS e NAES, 2002).
A calibração multivariada é utilizada para a análise sem a presença de
seletividade e confiabilidade das análises realizadas em laboratório e vem sendo
utilizada largamente nos últimos anos. Com a calibração multivariada é reduzida a
necessidade de preparação de amostras, pois, não são mais necessárias às medidas
iniciais e os resultados são mais seletivos (MARTENS e NAES, 2002).
É importante ressaltar que de acordo com a dimensão dos seus dados, os
métodos de calibração existentes podem ser divididos atualmente em dados de ordem
zero, primeira ordem, segunda ordem, até quarta ordem (ESCANDAR et al, 2014).
Quando para cada medida experimental realizada em uma amostra é dado como
resposta um único valor (escalar), temos calibração de ordem zero, ou seja, univariada.
Lembrando que neste tipo de calibração, a grandeza medida precisa ser livre de
interferentes. Já para tratar dados multivariados, utilizam-se os dados de primeira
ordem. Neste caso, é gerado um vetor de dados como resposta para cada amostra
analisada. Em dados de primeira ordem é possível a calibração na presença de
interferentes, contanto que os interferentes estejam presentes nas amostras de
calibração, “vantagem de primeira ordem”. Quando uma matriz de dados é gerada como
resposta para cada amostra analisada, observa-se uma calibração de segunda ordem.
Este método permite a calibração na presença de interferentes que não estão presentes
no conjunto de calibração, a chamada “vantagem de segunda ordem”. Métodos de
ordem igual ou superior a três são possíveis, porém são escassos os trabalhos na
literatura (VALDERRAMA et al, 2009; SENA et al, 2005; MILLER e MILLER, 2005).
A Figura 7 mostra o esquema dos tipos de dados que são utilizados em calibração de
ordem zero, primeira e segunda ordem.
29
Figura 7- Representação esquemática dos três tipos de dados em calibração: ordem zero, primeira e
segunda ordem.
Fonte: autor
Diversos modelos de calibração multivariada para dados de primeira ordem
podem ser construídos. Entre os modelos de regressão, os mais aplicados são: modelos
de regressão por componentes principais (PCR, do inglês, Principal Component
Regression) e a regressão por mínimos quadrados parciais (PLS, do inglês, partial least
squares). Para dados de segunda ordem podem também ser construídos vários modelos,
entre eles, análise de fatores paralelos (PARAFAC, do inglês, Parallel Factor Analysis),
Regressão por Mínimos Quadrados Parciais N-dimensional (N-PLS), Resolução de
Curvas Multivariadas (MCR, do inglês, Multivariate Curve Resolution), PLS
desdobrado (do inglês, Unfolded PLS) e PCR desdobrado (do inglês, Unfolded PCR)
(VALDERRAMA et al, 2009).
1.4.1. Regressão por mínimos quadrados parciais (PLS)
De todas as técnicas multivariadas o método PLS é o mais amplamente aplicado
no processo de calibração multivariada. O método PLS desenvolve uma relação linear
entre os dados espectrais (matriz X) e as propriedades químicas de interesse (matriz Y).
O método PLS foi desenvolvido por Hermam Wold, na década de 60, onde as
informações espectrais e as informações das concentrações são usadas ao mesmo tempo
30
na fase de calibração. O método PLS prevê uma informação y, a partir de valores de
medidas, por exemplo, absorbância x (LIU et al, 2009).
A matriz espectral, no modelo PLS, é decomposta em matrizes de variações dos
espectros, denominados loadings ou pesos e em posição das amostras, os chamados
escores. Os espectros originais são considerados combinações lineares das variações dos
espectros e os escores representam as suas contribuições. Dessa forma, as informações
espectrais e as informações das concentrações são usadas ao mesmo tempo na fase de
calibração (GELADI et al, 1985; BLANCO et al, 2006). Este modelo estende o conceito
do modelo inverso, a propriedade sendo função da resposta instrumental, onde as
variáveis originais são trocadas por um subconjunto truncado das variáveis latentes dos
dados originais (WOLD, 2001; BEEBE et al, 1987).
Para a determinação de mais de uma espécie de interesse, as matrizes X e Y são
decompostas em suas matrizes de pesos e escores respectivamente, como mostra as
equações a seguir.
Equação 5
Equação 6
Em que
T e U são as matrizes dos escores;
P e Q são as matrizes dos pesos das matrizes X e Y;
E é a matriz dos resíduos espectrais;
F é a matriz dos resíduos de concentração.
No método PLS, o modelo final relaciona linearmente os escores da matriz X
com os escores da matriz Y, de acordo com as equações abaixo (GELADI et al, 1985;
BLANCO et al, 2006)
Equação 7
31
Equação 8
Sendo
B a matriz dos coeficientes de regressão;
G a medida realizada – a medida do modelo;
H a matriz de resíduos de concentração.
Para avaliar uma eficiente calibração é preciso observar parâmetros de medidas
de tendência central, dispersão e qualidade dos modelos que serão descritos para se
poderem avaliar os modelos desenvolvidos. É importante observar a identificação das
amostras anômalas, através das medidas que descrevem o quanto à amostra está distante
do centro do modelo ou dos vizinhos mais próximos. Para isto, existem alguns recursos
para melhorar a compreensão dos dados obtidos (LIU, et al, 2009). Entre eles está o erro
padrão de previsão (SEP, do inglês, standard error of prediction) que é definido como
um desvio padrão dos resíduos de previsão, de acordo com a equação (MARTENS e
NAES, 2002)
Equação 9
Em que ŷi é o valor estimado calculado pelo modelo para uma dada amostra i;
yi é o valor medido pelo método padrão;
Np é o número de amostras de previsão.
Pode se definir o BIAS como o somatório do erro sistemático presente no
modelo, sendo calculado como mostrado abaixo (MILLER e MILLER, 2005)
Equação 10
32
Outro medidor de erro usado em calibração multivariada é o RMSEP, que é a
raiz quadrada do erro quadrático médio de previsão (do inglês, root mean square error
of prediction), calculado como (MARTENS e NAES, 2002).
Equação 11
E a relação entre o SEP e o RMSEP é a seguinte:
Equação 12
O denominador do SEP é (Np-1) e o do RMSEP é somente (Np), assim a
igualdade não é usada. Se comparado ao SEP, o RMSEP é mais utilizado, pois o SEP é
uma medida da precisão do modelo, e o RMSEP se refere a exatidão do método
multivariado, pois mede a diferença entre o valor real e o valor estimado pelo modelo
multivariado.
Esses erros são utilizados também na calibração do modelo, onde é acrescentada
a letra C ao final das suas siglas, se tornando RMSEC e SEC, sendo calculado para a
previsão da seguinte forma (MARTENS e NAES, 2002)
Equação 13
Sendo
A o número de variáveis latentes ou componentes do modelo multivariado.
Muitas publicações vêm sendo realizadas com a utilização da quimiometria e a
frente de pesquisa da calibração multivariada em análises de alimentos com
espectroscopia NIR, entre elas, análises de frutas. No estudo do nível do fungicida
tiabendazol em laranjas intactas, Pena et al, estudaram a viabilidade da aplicação da
espectroscopia NIR, para obter predições do fungicida em níveis inferiores ao Limite de
33
Resíduo Máximo (0,2-3,9 ppm). Foram obtidos erros de calibração entre 0,3 e 0,36 ppm
e R2 variando de 0,85 e 0,73 respectivamente para espectros da região equatorial e da
soma da região equatorial e de base. Foi também observado que os espectros da região
de base não foram adequados para a predição de níveis de tiabendazol (PENA et al,
2007).
Já em outro estudo publicado por Lammertyn e colaboradores, foram realizadas
medições de acidez, teor de sólidos solúveis e firmeza para frutos de maçãs. Neste
trabalho foi observado o potencial da espectroscopia do visível e NIR como técnicas de
medição não destrutiva para medição de características de qualidade de maçãs. Foi
estabelecida uma relação entre o espectro de reflectância com fibra ótica bifurcada e
parâmetros dos frutos tais como, pH, sólidos solúveis, rigidez e elasticidade da pele dos
frutos. Em relação ao pH, o melhor modelo apresentou um erro de previsão de 0,068 e
uma correlação entre os valores medidos e previstos de 0,93. Para a rigidez, apresentou
um erro de previsão de 2,49 e r de 0,90. Para medidas de sólidos solúveis o erro de
previsão foi de 0,61 e r igual a 0,82. Para a elasticidade da pele dos frutos os modelos de
previsão apresentaram o erro de previsão em torno de 0,26 e r de 0,75. Assim foi
observado que os modelos foram satisfatórios para os parâmetros de pH, sólidos
solúveis e rigidez, porém não tão satisfatórios para o parâmetro elasticidade
(LAMMERTYN et al, 1998).
Uma importante etapa em calibração multivariada é a etapa do pré-
processamento de dados, que pode ser realizada antes da construção de modelos
multivariados, o que pode tornar ou não, os cálculos computacionais mais precisos e
exatos.
1.4.2. Pré-processamento de dados
Esse é um procedimento comum que pode ser aplicado aos espectros antes de
qualquer método multivariado. Como os dados originais podem não apresentar uma
distribuição adequada para análise, isso poderá dificultar a extração de informações
úteis e sua interpretação (FERREIRA et al. 1999). O pré-processamento de dados é
usado principalmente para tentar solucionar os problemas de espalhamento de luz ou
radiação (PASQUINI, 2003). Alguns exemplos de pré-processamento de dados são:
suavização ou filtro digital Savitzky-Golay (SG), Centragem na média, correção de
34
espalhamento multiplicativo de luz, MSC (do inglês “multiplicative scatter correction”),
cálculo das derivadas, entre outros.
1.4.2.1. Centragem na média
É um dos pré-tratamentos mais simples.
Primeiramente, calcula-se a média de cada variável, conforme a equação abaixo:
Equação 14
Em que Xcj é a média dos dados Xij contidos em uma coluna (variáveis).
Em seguida, subtraem-se os dados originais pela média calculada:
Equação 15
O objetivo desse pré-tratamento é diminuir a flutuação do sinal analítico (offset)
que pode ocorrer devido a efeitos físicos ou erros sistemáticos (OTTO, 2007; MATOS
et al, 2003). Alguns trabalhos citam a centragem da média em seus pré-processamentos,
entre eles: A análise exploratória em química analítica com emprego de quimiometria:
PCA e PCA de imagens (MATOS et al, 2003) e Determinação não destrutiva do
Nitrogênio total em plantas por espectroscopia de reflectância difusa no infravermelho
próximo (LIMA et al, 2008). Em análises de frutos, Janik e seus colaboradores,
estudaram a predição para a concentração total de antocianinas em uvas vermelhas. Este
estudo comparou o desempenho da regressão por mínimos quadrados parciais (PLS) e
redes neurais artificiais (do inglês, artificial neural networks, ANN). (JANIK et al,
2007).
1.4.2.2. Suavização ou filtro digital Savitzky-Golay (SG)
Esse pré-processamento é um método matemático de suavização, que tem por
objetivo aumentar a relação sinal/ruído o máximo possível, pois quanto maior for esse
valor, maior será também a intensidade do sinal em comparação ao branco
35
(background) ou padrão (BRERETON, 2003). O filtro digital Savitzky-Golay consiste
em definir uma janela de comprimento “n” e movê-la um ponto por vez ao longo de
todo o sinal analítico, sendo um dos mais aplicados a dados espectrais. Para o cálculo do
valor do filtro, Yk*, a partir dos valores do sinal original Yk, é mantida a relação que
segue (SAVITZKY et al,1964):
Equação 16
Em que k é o índice para o ponto real;
2m+1 representa o tamanho da janela (largura do filtro);
m é a variável para ajustar a largura do filtro.
Na suavização Savitzky-Golay todos os dados são ponderados pelo mesmo fator:
Equação 17
O valor do ponto central da janela é calculado pelos coeficientes da função, que
será o valor suavizado, k, conforme a equação abaixo (OTTO, 2007):
Equação 18
Sendo NORM o fator de normalização obtido a partir do somatório dos coeficientes cj.
É importante determinar a melhor largura da janela de pontos para cada conjunto
de dados em estudo, ao se utilizar o pré-processamento de suavização ou filtro digital.
Se a suavização for realizada em excesso pode se perder informação espectral a medida
que se aumenta o número de pontos a serem suavizados, sendo os picos dos sinais
prejudicados tanto em intensidade quanto em resolução. Por outro lado, o ruído ainda
permanecerá se a suavização aplicada não for suficiente (BRERETON, 2003). Artigos
diversos trazem a aplicação deste pré-tratamento, como em: Princípios e aplicações na
ciência da produção animal (BERZAGHI et al, 2009) e Na determinação do teor de
sólidos solúveis em Jaboticaba usando espectroscopia no infravermelho próximo e
quimiometria (MARIANI et al, 2014). Em análises de frutos, Costa et al, em seu estudo
36
sobre os teores de sólidos solúveis e pH em frutos intactos de ameixa, utilizou vários
pré-processamentos, entre eles, a suavização Savitzky-Golay (SG), com janelas
variando de 3 a 91 pontos. Foi realizada uma comparação de algumas técnicas de
calibração multivariada com relação ao pré-processamento dos dados. Os resultados
obtidos foram considerados satisfatórios e foi possível concluir que a espectroscopia
NIR pode ser usada como uma técnica não destrutiva para determinações de sólidos
solúveis e pH (COSTA et al, 2013).
1.4.2.3. Correção de Espalhamento Multiplicativo de luz (MSC)
Este metodologia de pré-processamento é empregada para corrigir o
espalhamento de luz de espectros obtidos por reflectância difusa para reduzir a diferença
de espalhamento de luz das amostras antes da etapa de calibração (NAES et al, 1990;
GELADI et al, 1985).
O espalhamento de luz ocorre na aquisição dos espectros por técnicas de
reflectância, pois as partículas das amostras possuem diferentes granulometrias e
geometrias que são responsáveis pela dispersão da luz em todas as direções, provocando
uma das principais fontes de erros em determinações analíticas, pois ocorre alteração da
relação entre a intensidade das medidas de reflectância e a concentração das espécies
presentes na amostra. A Correção de Espalhamento Multiplicativo de luz é utilizada
para amenizar este efeito de dispersão no conjunto de dados para obter espectros ideais
(ou médias dos espectros) para construção de modelos mais confiáveis e robustos que
possam oferecer uma boa habilidade de previsão. A Figura 8 ilustra exemplos de
suavização SG e correção de espalhamento de luz (MSC) aplicado em espectros. A
aplicação desse pré-processamento apresenta grande utilidade na interpretação e
modelagem dos espectros que são tratados por reflectância difusa. A correção de
espalhamento de luz é feita de acordo com algumas etapas (OSBORNE, 1988; NAES et
al, 1990).
Inicialmente, um espectro médio Xm é calculado a partir do conjunto total de
espectros. Em seguida, para cada espectro individual, os coeficientes linear e angular
são estimados por regressão, como mostra a equação a seguir
37
Equação 19
Sendo Xi cada espectro individual;
ai é o coeficiente linear;
bi é o coeficiente angular
E por fim ocorre a correção dos espectros, indicada pela equação:
Equação 20
Em que Xicorr é o espectro corrigido.
Figura 8- (a) Espectros originais de reflectância difusa e (b) espectros após os pré-processamentos de
suavização e MSC.
Fonte: autor
Recentes pesquisas citam a utilização de MSC em: Monitoramento em qualidade de
alimentos e bebidas (HUANG et al, 2008), Projeto experimental, espectroscopia no
infravermelho próximo e calibração multivariada: um projeto avançado em um curso de
quimiometria (OLIVEIRA et al, 2012), entre outros trabalhos. Já para análises de frutos,
Paz et al, em seu estudo sobre avaliação quantitativa e qualitativa da qualidade de pêras,
utilizou alguns pré-processamentos de dados, entre eles, MSC. Em tal estudo, foi
realizada uma comparação de desempenho de diferentes espectrofotômetros como parte
de uma pesquisa da espectroscopia NIR como um método de análise não destrutivo para
a previsão do teor de sólidos, firmeza e tempo de armazenamento pós-colheita para
frutos intactos de pêras Os modelos de previsão para o teor de sólidos solúveis
apresentaram um coeficiente (R2) variando de 0,32 a 0,76 e o erro padrão da validação
38
cruzada (SECV) entre 0,59 e 1,49. Para a firmeza o R2 variou de 0,45 a 0,79, e o SECV
variou de 5,33 a 7,36. Os valores observados variaram de acordo com os instrumentos
utilizados. A capacidade destes instrumentos foi testada usando o modelo dos mínimos
quadrados parciais (PLS), que mostrou que as amostras foram classificadas
corretamente. Foi possível concluir então que, instrumentos que trabalham na região
NIR apresentam um bom potencial para avaliação da qualidade pós-colheita de frutos
(PAZ et al, 2009).
1.4.2.4. Cálculo das derivadas
Um método de fácil execução e muitas vezes utilizado em dados
espectroscópicos, é o cálculo das derivadas, para remover deslocamentos de linha de
base e espalhamentos ou flutuações do sinal analítico, e também para melhorar a
resolução espectral (MARTENS e NAES, 2002). O método Savitzky-Golay (SG) é um
dos mais utilizados e de abordagem sofisticada para o cálculo das derivadas
(SAVITZKY et al, 1964). Assim como no pré-processamento da suavização ou filtro, o
cálculo das derivadas aplica regressões polinomiais para o cálculo de derivadas de
primeira ou segunda ordem. A derivada de primeira ordem iguala a zero o ponto central
de um pico, e assim é possível localizar precisamente a posição de picos largos. A
Figura 9 exemplifica a primeira derivada aplicada em um espectro.
39
Figura 9- (a) Espectros originais de reflectância difusa e (b) espectros com o pré-processamento de
primeira derivada em janela de 15 pontos.
Fonte: autor
Já a segunda derivada é o declive da primeira derivada. A Figura 10 mostra este
pré-processamento aplicado em espectros de reflectância difusa.
Figura 10- (a) Espectros originais de reflectância difusa e (b) com aplicação do pré-processamento de
segunda derivada em janela de 31 pontos.
Fonte: autor
O cálculo das derivadas pode trazer algumas desvantagens como a diminuição
da razão sinal/ruído, pois o cálculo amplifica o ruído, especialmente em dados que já se
apresentam muito ruidosos. Por isso é indicado que antes do cálculo das derivadas, seja
realizada uma suavização nos dados.
O cálculo das derivadas pode ser representado da seguinte maneira.
Equação 21
Em que
40
X é o comprimento de onda;
Y é a absorbância espectral;
são parâmetros estimados por mínimos quadrados.
A inclinação é apresentada como
Equação 22
Podendo ser avaliada por qualquer X, e a segunda derivada
Equação 23
Que é constante para todos os X.
Alguns estudos mostram a utilização do pré-tratamento com derivadas tais
como: Determinação do teor de proteínas em aurícula Auricularia (LIU et al, 2009) e
em Teste de dissolução de comprimidos de isoniazida, rifampicina, pirazinamida e
etambutol usando espectroscopia NIR e calibração multivariada (NEVES et al, 2012).
Um estudo realizado por Flores e colaboradores, observou a viabilidade da
espectroscopia NIR para a predição da qualidade interna de frutos de tomate intactos.
Alguns pré-processamentos de dados foram utilizados neste estudo, entre eles, a
derivada. O controle de qualidade é de extrema importância na produção de tomates
frescos, principalmente para o tomate do tipo “Raf”, uma variedade de tomates muito
apreciada na Espanha, apresentando um requintado sabor e preços de mercado bastante
elevados. O teor de sólidos solúveis e a acidez titulável, são os dois índices de qualidade
interna que contribuem para o sabor dos frutos de tomate. Neste trabalho foi analisada a
viabilidade do uso da espectroscopia NIR para predizer os parâmetros de qualidade
interna em tomates individuais.. Com os resultados obtidos foi possível concluir que a
técnica NIR pode prever com precisão parâmetros de qualidade interna de frutos, como
tomate, mesmo se estudando uma grande variedade de frutos (FLORES et al, 2009).
41
1.4.3. Seleção de amostras
Outro ponto importante antes da construção de modelos multivariados é a seleção
de amostras. É provável que quanto maior o número de amostras disponíveis para a
construção dos modelos, melhor será sua eficiência. É fundamental uma escolha correta
das amostras de calibração e previsão, pois isso garante a habilidade de previsão e um
modelo multivariado eficiente evitando a ocorrência de extrapolações. A escolha das
amostras de calibração deve ser realizada de modo que as amostras de validação
(previsão) sejam bem representadas pelas amostras de calibração (MARTENS e NAES,
2002). Quanto mais representativo for o modelo de calibração, menor será a chance de
erro em relação as amostras desconhecidas. O algoritmo Kennard-Stone é utilizado para
realizar a seleção das amostras. Este algoritmo calcula a distancia Euclidiana entre os
valores X para cada par de amostras (p,q), como mostra a equação a seguir:
Equação 24
Em que
Xp(j) e Xq(j) são respostas instrumentais nos j-ésimos comprimentos de onda para as
amostras p e q;
J representa o número de comprimentos de onda de um espectro (SOUSA, 2008).
A seleção de amostras é realizada com a escolha de um par de amostras (p1, p2)
para as quais a distancia dx (p1, p2) seja maior. O algoritmo seleciona, em cada
interação subsequente, a amostra que apresentar a maior distancia em relação a última
amostra já selecionada (SOUSA, 2008; FILHO, 2007). Este procedimento é então
repetido até que o número de amostras desejado para cada conjunto seja alcançado.
Assim, é garantido que as amostras de calibração sejam as que apresentem uma maior
variabilidade, ou seja, aquelas que carregam o máximo de informações químicas e
físicas que se relacionam com as propriedades das amostras, e que se contemplem as
amostras desconhecidas devidamente (MARTENS e NAES, 2002). No estudo da
predição do teor de sólidos solúveis em frutos intactos de jabuticaba, usando
42
espectroscopia NIR e quimiometria, Mariani e colaboradores, utilizaram o algoritmo de
seleção Kernard-Stone, para a seleção de amostras, antes da construção dos modelos
PLS. Os modelos usando o espectro original apresentaram um melhor desempenho em
relação aos tratamentos utilizados, significando que todas as informações contidas no
espectro foram importantes. O melhor modelo PLS não apresentou diferenças
significativas com o método de referência, indicando que o NIR é uma técnica muito
promissora para a quantificação não destrutiva deste importante parâmetro em
jabuticabas (MARIANI et al, 2014).
1.4.4. Seleção de variáveis
Na calibração multivariada, há uma fase importante que é a escolha das variáveis
que serão usadas na construção de modelos. Selecionar as variáveis significa escolher
uma ou mais partes das respostas instrumentais para utilização na construção de
modelos. Esta é uma alternativa a utilização de toda a faixa espectral, o que pode tornar
os modelos mais simples, além de robustos e de fácil interpretação e ainda contribui
para facilitar a aquisição dos dados espectrais (MARTENS e NAES, 2002). A
realização da seleção de variáveis pode melhorar consideravelmente os resultados de
um dado modelo multivariado, seja ele linear ou não linear tornando-o mais exato em
suas determinações, pois serão consideradas somente as regiões que contenham
informações úteis à análise, e serão eliminadas aquelas regiões que contribuem apenas
como fontes de incertezas e adição de ruídos (KULIGOWSKI, 2010). Alguns
algoritmos que são bastante utilizados para seleção de variáveis são: iPLS (do inglês,
interval partial least squares), APS (do inglês, successive projections algorithm) e o AG
(do inglês, genetic algorithm).
1.4.4.1. Mínimos quadrados parciais por intervalos – iPLS
É um dos mais simples métodos para seleção de variáveis, onde são selecionadas
faixas espectrais e não variáveis isoladas. No iPLS são construídos diversos modelos
independentes por mínimos quadrados parciais que utilizam subdivisões equidistantes,
43
dentro de toda a faixa espectral. O iPLS é uma extensão do PLS. No iPLS são ignoradas
as faixas espectrais que apresentam ruídos e informações prejudiciais à análise, e com
isso um novo modelo PLS é construído. Nesse novo modelo é utilizada somente a faixa
espectral que apresentar os melhores resultados. A Figura 11 abaixo ilustra um modelo
com seleção de variáveis, via iPLS, dentro de uma área espectral.
Figura 11- Seleção de variáveis, via iPLS, dentro de uma ampla faixa espectral
Fonte: autor
As melhores sub-regiões são identificadas através da comparação dos valores de
RMSECV para cada modelo iPLS comparados ao modelo global (com toda a faixa
espectral). O subintervalo que apresenta o menor erro representa a faixa correspondente
às variáveis selecionadas pelo método (KULIGOWSKI, 2010).
1.4.4.2. Algoritmo das projeções sucessivas – APS
Este algoritmo é usado para seleção de variáveis e realiza diversas projeções
vetoriais para selecionar as variáveis espectrais mais relevantes, com o mínimo de
redundância e colinearidade, para construir modelos multivariados (LIU et al, 2009).
Inicialmente é selecionada uma única variável (comprimento de onda) e são
incorporadas novas variáveis à medida que são realizadas as interações até que um
número de comprimentos de ondas (N) seja alcançado. O APS tem um número máximo
de variáveis que podem ser selecionadas, devido ao modo como as projeções vetoriais
são realizadas, e este número é sempre menor ou igual à quantidade total de amostras de
calibração (ARAÚJO et al, 2001).
44
1.4.4.3. Algoritmo Genético - AG
Este método de seleção de variáveis tenta “copiar” condições evolucionárias.
Neste método variações aleatórias na composição genética combinadas com a seleção
dos indivíduos mais adaptados leva a progressivas melhorias em seus descendentes. O
algoritmo genético é baseado em inteligência artificial, sendo suas variáveis
representadas por genes em um cromossomo. As variáveis são selecionadas através dos
cromossomos que apresentam maior aptidão ou capacidade de adaptação, isto é, as
variáveis que apresentam os menores somatórios dos erros quadráticos de previsão ou
de validação cruzada (MARTENS e NAES, 2002). Códigos binários representam as
variáveis, onde aquelas que forem selecionadas recebem o código 1, enquanto as
excluídas, recebem o código 0. São três os operadores genéticos básicos que envolvem
o procedimento para seleção de variáveis: seleção, o cruzamento e a mutação. A seleção
copia cromossomos “parentes” com o objetivo de gerar uma nova população, enquanto
o cruzamento compartilha informação útil entre dois indivíduos bem adaptados. No
cruzamento, as variáveis são escolhidas aleatoriamente para serem cruzadas, e assim
dão origem a novos descendentes que carregam genes de ambos os parentes. E na
mutação, há a inversão aleatória dos genes escolhidos em um cromossomo, a uma dada
probabilidade de mutação (LEE, 2013; FEL et al, 2009). Todo esse processo é repetido
e os cromossomos já modificados terão chances maiores de serem escolhidos nas
próximas seleções (SAVITZKY, 1964).
Costa e Lima, em seu estudo sobre a predição de sólidos solúveis e pH em
ameixas intactas utilizando espectroscopia NIR, fizeram uso dos algoritmos de seleção
de variáveis (iPLS, APS, AG) para construção de modelos multivariados. Após a
obtenção dos melhores modelos PLS foram utilizados os algoritmos de seleção de
variáveis para os melhores resultados encontrados do PLS para cada parâmetro. Para o
teor de sólidos solúveis, o coeficiente de correlação na previsão variou entre 0,78 e 0,95
para todos os modelos usando iPLS, APS e AG. Foram utilizadas de 6 a 8 variáveis
latentes. O algoritmo genético diminui a matriz de variáveis para 299 para a construção
de novos modelos. Quando utilizado o APS com 7 variáveis latentes e uma matriz de 32
variáveis, o coeficiente de correlação na calibração ficou em torno de 0,93 e o de
45
previsão foi 0,80. Já para o uso do iPLS com 6 variáveis, os resultados foram: 0,89 para
o coeficiente de correlação na calibração e 0,90 para a previsão, com uma matriz de 243
variáveis. E quando foi usado o algoritmo genético com 7 variáveis latentes e uma
matriz com 299 variáveis, foi obtido um coeficiente de correlação na calibração de 0,97
e na previsão de 0,85. Estes resultados se apresentaram satisfatórios quando foram
comparados aos obtidos na literatura (COSTA e LIMA, 2013).
Já para os resultados do pH em ameixas, pode-se observar que a correlação da
calibração apresentou bons resultados variando de 0,97 a 0,99 e a correlação da previsão
ficou entre 0,33 e 0,85. Os melhores modelos foram obtidos utilizando o algoritmo
genético GA com 6 VL, para o qual a correlação foi de 0,85, numa matriz com 295
variáveis. O modelo AG com 6 VL apresentou um melhor desempenho em relação ao
de 7 VL, a redução do número de variáveis latentes torna o modelo mais simples de ser
explicado. Uma grande vantagem do uso dos algoritmos de seleção de variáveis é a
redução da dimensionalidade da matriz, neste caso do AG o modelo foi desenvolvido
com 295 variáveis. Assim como para o teor de sólidos solúveis, os resultados para o pH
foram satisfatórios quando comparados com resultados observados na literatura
(COSTA et al, 2013).
1.4.5 – Detecção de amostras anômalas – Outliers
Além dos métodos utilizados para a seleção de variáveis que permitem a
construção de melhores modelos multivariados usando um espectro de variáveis com
informações mais relevantes, outra ferramenta importante é o teste para a detecção da
presença de Outliers. O termo Outlier é utilizado para designar amostras anômalas que
podem estar presentes nos conjuntos de calibração e de validação que serão empregados
na construção e validação de um modelo de calibração multivariada. Se a amostra
pertencer a uma população diferente das demais (normais) ela é considerada anômala, e
com isso a relação entre as variáveis X dessa amostra será significativamente diferente
da outras.
Uma amostra anômala pode surgir quando um equipamento ou instrumento
utilizado para obtenção de medidas não funcione corretamente, podendo gerar um sinal
errado de uma ou mais amostras. Além disso, existem erros causados nas metodologias
46
de referência (metodologia que fornece valores de um parâmetro, Y). Não
necessariamente amostras anômalas são amostras errôneas, mas amostras que
apresentam comportamento diferente das demais e influenciam os resultados
(MARTENS e NAES, 2002; VALDERRAMA et al, 2007).
Nas fases de calibração e previsão de um modelo multivariado é importante a
detecção de amostras anômalas, pois as amostras de calibração são usadas para a
construção do modelo e se existirem amostras anômalas incorporadas ao modelo, pode
haver prejuízo na equação final, podendo trazer consequências para amostras futuras
(MARTENS e NAES, 2002).
Voltando ao estudo de Costa e Lima, é possível observar que além da seleção de
variáveis, foi utilizado também a detecção de amostras anômalas ou teste de outliers.
Logo após a construção de modelos com seleção de variáveis, foi realizado o teste de
outliers, onde algumas amostras que não se ajustavam ao modelo foram removidas e
novos modelos construídos. O teste de outliers foi aplicado para otimização dos
modelos com exclusão de 5 amostras do conjunto de calibração e 4 do conjunto de
previsão para o melhor modelo. Após a remoção das amostras anômalas os novos
resultados para o teor de sólidos solúveis foram: o coeficiente de correlação para
calibração para o modelo PLS com seleção de variáveis APS com 7 variáveis latentes
foi de 0,98 e o de previsão foi de 0,78. Já para o iPLS com 6 variáveis latentes foi de
0,96 para a calibração e 0,87 para a previsão. E para o modelo com algoritmo genético
(AG) com 7 variáveis latentes o coeficiente para a calibração foi de 0,98 e para a
previsão foi de 0,92. Todos os resultados foram considerados satisfatórios quando
comparados aos já publicados em outros estudos (COSTA et al, 2013).
1.4.6. Testes estatísticos
Outro fator importante na construção de modelos multivariados é a realização de
testes estatísticos para garantir que os métodos analíticos estejam livres de erros
sistemáticos, pois tais erros influenciam na exatidão dos resultados. Os testes
estatísticos são usados para observar se a diferença entre um valor obtido e um valor
esperado (real) é causada apenas pela ocorrência dos erros aleatórios (e não
47
sistemáticos). Se houver diferença significativa entre os valores das medidas a uma
determinada probabilidade é atribuída a presença de erros sistemáticos ao método em
questão (MILLER e MILLER, 2005).
O teste t ou teste t pareado é um dos mais utilizados para comparar dois métodos
analíticos. Quando se avalia diferença entre as medidas fornecidas por dois métodos
analíticos distintos é importante considerar a presença de erros aleatórios nas análises, a
variação entre as amostras e a variação entre os métodos analíticos em questão. O
objetivo do teste t é avaliar se os métodos produzem resultados significativamente
diferentes. O teste t é capaz de separar a diferença entre os métodos da diferença entre
as amostras, por meio do cálculo do d, que é a diferença entre cada par de medidas, para
uma única amostra. Tal cálculo é explicado na equação abaixo
Equação 25
Em que
dm é a média de d entre os valores pareados;
Sd é desvio padrão de d entre os valores pareados;
n é o número de amostras.
A hipótese nula avaliada é se dm difere significativamente de zero. O valor de t
calculado é então comparado com o valor de t crítico, tcrit. que é tabelado e selecionado
de acordo com os graus de liberdade de t (n-1). Se o t > tcrit., existe diferença
significativa entre os dois métodos analíticos, ao nível de confiança escolhido.
A probabilidade de que a hipótese nula seja aceita é conhecida por nível de
confiança e normalmente utiliza-se 95%. Existem outros níveis de confiança que podem
também ser utilizados, porém quanto maior for o nível de confiança, maiores são as
chances de que a hipótese nula seja aceita (MILLER e MILLER, 2005).
Outro teste de significância utilizado para comparar a precisão entre dois
métodos é o teste F. Neste teste é realizada a análise dos erros aleatórios das medidas,
utilizando as suas variâncias. O teste F é expresso de tal modo
Equação 26
Onde e são a hipótese nula, isto é, não há diferença significativa entre as variâncias
dos dois métodos, a um determinado nível de confiança (MILLER e MILLER, 2005).
48
Um outro teste de significância utilizado em calibração multivariada é o teste
EJCR (do inglês, elliptical joint confidence region) que detecta a presença de erros
sistemáticos em um método analítico, avaliando a exatidão deste método, comparado ao
método de referência. Os cálculos comparam a inclinação e o intercepto das regressões
lineares entre os métodos de referência e o alternativo. A equação a seguir é utilizada
para o cálculo da elipse de confiança
Equação 27
Em que
â e são a inclinação e o intercepto estimados;
a e b são a inclinação e o intercepto do método padrão;
N dat é o número de amostras;
c act são os valores de referência do parâmetro analisado;
s2 é variância do método analisado;
F a,2,Ndat-2 é o valor de F crítico com 2 e (Ndat - 2) graus de liberdade, normalmente a um
nível de confiança de 95%.
Se o ponto crítico (1) que é correspondente a inclinação e ao intercepto, estiver
contido na elipse de confiança calculada, a hipótese nula é aceita e afirma que as
diferenças observadas entre os dois métodos são provenientes de erros aleatórios e não
sistemáticos (GOIGOECHEA et al, 2001).
Na publicação de Costa e Lima, sobre o estudo do teor de sólidos solúveis e pH
em ameixas usando espectroscopia NIR, após o teste de outliers foram também
realizados testes estatísticos, entre eles, o teste EJCR, que é o teste da região elíptica de
confidencia conjunta para o declive e intercepto para os valores previsto versus medido,
usando modelos PLS. Para um intervalo de confiança de 95%, o valor teórico esperado,
igual a 1, foi obtido dentro da elipse para os dois parâmetros estudados, sólidos solúveis
e pH (COSTA et al, 2013).
No estudo de Mariani e colaboradores usando a espectroscopia NIR e
quimiometria para predição do teor de sólidos solúveis em frutos intactos de jaboticaba,
foi realizado o teste estatístico t ou t pareado. Neste estudo o melhor modelo PLS não
49
apresentou uma boa calibração (Rcal= 0,58) em relação aos demais modelos, mas
demonstrou uma boa capacidade preditiva (Rprev= 0,71). Após a realização do teste t,
foi observado que tal modelo não apresentou diferença significativa em relação ao
método de referencia utilizado. O valor de t calculado foi de 1,22,enquanto que o valor
de t(0,05; 30) é de 2,04 (t = 1,22 < t(0,05; 30) = 2,04), significando que não houve
diferenças entre os valores do modelo e da referência no intervalo de 95% de confiança
(MARIANI et al, 2014).
1.4.7.- Figuras de mérito
Um requisito importante para a validação dos métodos quimiométricos é a
determinação das figuras de mérito (do inglês “figures of merit”, FOM). Para observar o
bom desempenho de qualquer técnica analítica, é preciso garantir a qualidade das
medidas instrumentais e a confiabilidade estatística dos cálculos envolvidos. E a forma
para assegurar este bom resultado é a estimativa das figuras de mérito. Muitos trabalhos
na literatura apresentam o cálculo das figuras de mérito, entre eles, na determinação de
compostos de interesse em misturas de biodiesel usando espectroscopia NIR e UV
visível (OLIVEIRA et al, 2014). As figuras de mérito indicam o bom desempenho das
técnicas utilizadas e neste trabalho são descritas como: sensibilidade analítica,
seletividade, precisão, limite de detecção, limite de quantificação e razão sinal-ruído.
Sensibilidade analítica
A sensibilidade analítica indica a menor diferença de concentração que pode ser
distinguida na faixa linear dinâmica do modelo univariado. Define-se sensibilidade
analítica como a razão entre a sensibilidade e o ruído instrumental, o qual é definido
como o desvio padrão do branco. A sensibilidade analítica expressa o melhor valor que
poderá ser obtido caso exista um modelo perfeito de calibração, que seja limitado
somente pelo ruído instrumental (MILLER e MILLER, 2005; VALDERRAMA et al,
2009).
Seletividade
A seletividade expressa o grau de sobreposição entre o sinal da espécie de interesse
e os interferentes presentes na amostra, o que indica a parte do sinal que é perdida por
50
essa sobreposição. A mais baixa seletividade está associada a um alto grau de
sobreposição espectral entre o analito e os demais constituintes da amostra (OLIVIERI
et al, 2006; VALDERRAMA et al, 2009).
Precisão
A precisão faz a medida do erro aleatório que está associado ao método analítico. A
precisão expressa a proximidade de uma série de resultados obtidos a partir de
diferentes amostras de um produto homogêneo. É possível expressar os resultados da
precisão em termos de desvio padrão relativo ou absoluto (OLIVIERI et al, 2006,
VALDERRAMA et al, 2009).
Limite de detecção
É a menor quantidade de um analito que pode ser detectada quantitativamente. O
limite de detecção é necessário para a análise de traços e pode ser necessário em testes
de uniformidade de conteúdo e dissolução (OLIVIERI et al, 2006, VALDERRAMA et
al, 2009).
Limite de quantificação
Equivale a menor concentração da substancia de interesse que pode ser medida com
uma incerteza máxima de 10% (VALDERRAMA et al, 2009).
Razão sinal/ruído
É um método adequado para procedimentos analíticos que apresentam ruído da
linha de base. É considerada aceitável uma razão sinal/ruído de 10:1. Indica o quanto da
intensidade do sinal analítico da espécie de interesse está acima do desvio padrão do
sinal de referência (VALDERRAMA et al, 2009; RIBEIRO et al, 2008).
No estudo da validação de modelos de calibração multivariada na determinação dos
parâmetros de qualidade da cana de açúcar por espectroscopia NIR, Valderrama e seus
colaboradores determinaram os teores de sólidos solúveis (BRIX), açúcares polarizáveis
(POL) e açúcares redutores (RS) em caldo de cana, utilizando a espectroscopia na
região do infravermelho próximo e calibração multivariada, os quais foram validados
pelos cálculos das figuras de mérito. As figuras de mérito como sensibilidade,
51
sensibilidade analítica, seletividade, limites de confiança, precisão, exatidão e razão
sinal-ruído foram calculadas. Resultados satisfatórios foram obtidos para BRIX e POL
apresentando resultados de RMSEP de 0,28 e 0,42% de caldo, respectivamente. Os
coeficientes de correlação para ambos os parâmetros foram de 0,99. Estes resultados
indicaram que os modelos desenvolvidos para BRIX e POL poderiam ser seguramente
utilizados como uma alternativa em relação ao método padrão utilizada na indústria
alcooleira (VALDERRAMA et al, 2007).
1.5. ESPECTROSCOPIA NIR E CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA APLICADAS
EM ANÁLISES DE FRUTOS
Alguns trabalhos científicos têm sido realizados nos últimos anos utilizando a
espectroscopia NIR em análises de alimentos, entre eles, análises de frutos na fase pós
colheita, para garantir os parâmetros de qualidade dos mesmos. Com o uso da técnica
NIR e ferramentas quimiométricas, foi revisada a utilização da união de técnicas para
predições rápidas de alguns parâmetros nutricionalmente relevantes em diversos frutos
(NICOLAI et al, 2007). A técnica NIR também foi aplicada na determinação da
composição química de forragens (ALOMAR et al, 1999; FONTANELI et al, 2002), de
café, de cana-de-açúcar e no controle de qualidade de medicamentos (SOUZA et al,
2006). Em muitos países, principalmente na Itália a técnica NIR é bastante utilizada
para a seleção de frutos íntegros, principalmente com base no conteúdo de sólidos
solúveis (AGATI et al, 2005; WALSH, 2005). A espectroscopia NIR tem sido utilizada
com sucesso para prever a qualidade interna em muitos tipos de frutas intactas
(WEDDING et al, 2011). Tal técnica apresenta muitas vantagens atraentes, tais como:
método sem a necessidade de preparação prévia da amostra, método rápido, barato,
preciso, não contaminante e com a possibilidade da determinação simultânea de vários
parâmetros utilizando uma mesma medida (TEERACHAICHAYUT et al, 2011).
As técnicas multivariadas são desenvolvidas pela quimiometria, sendo a
quimiometria definida como a pesquisa e utilização de métodos matemáticos e
estatísticos para o tratamento de dados químicos de forma a extrair uma maior
quantidade de informações e melhores resultados analíticos.
A espectroscopia NIR oferece a vantagem do uso de amostras intactas
apresentadas diretamente ao instrumento sem a necessidade da preparação de tal
52
amostra. Esta propriedade constitui uma vantagem em relação aos métodos tradicionais
destrutivos, e algumas aplicações da espectroscopia NIR incluem detecção de
antocianina em frutos intactos, como a determinação dos parâmetros de qualidade de
uvas vermelhas (DAMBERGS, et al, 2006).
Costa e Lima, determinaram os parâmetros (sólidos solúveis e pH) em frutos
intactos de ameixa usando espectroscopia NIR e a calibração multivariada. Para o teor
de sólidos solúveis, o coeficiente de correlação para a previsão variou na faixa de 0,78 a
0,95 para todos os modelos. Em relação ao resultado do pH em ameixas, a correlação da
calibração apresentou bons resultados variando de 0,97 a 0,99 e o erro de calibração
variou entre 0,02 e 0,05. Na previsão houve uma variação na correlação de 0,68 a 0,85,
exceto OPS não apresentando bom desempenho com coeficiente de correlação de 0,33.
E no erro de previsão houve uma variação entre 0,17 e 0,21 (COSTA et al, 2013).
Em outro trabalho, Mariani e colaboradores, empregaram a espectroscopia NIR
e a calibração multivariada para a determinação do Teor de sólidos solúveis em
Jabuticabas intactas (Myrciaria Jaboticaba). Os coeficientes de correlação para a
calibração variaram na faixa de 0,55 a 0,99. E o erro de calibração variou de 0,12 a
1,93. Já os coeficientes de correlação para a previsão variaram na faixa de 0,48 a 0,71
com erros de 1,26 a 1,85 (MARIANI et al, 2014).
Jha e colaboradores utilizaram espectroscopia NIR para prever a doçura de
frutos intactos de manga. Neste estudo foi usado a faixa de comprimento de onda de
1200 a 2200 nm na determinação de sólidos solúveis e pH para sete tipos de mangas em
sete estados da Índia. Os coeficientes de correlação encontrados para a calibração e
validação foram 0,782 e 0,762 para o teor de sólidos solúveis e 0,715 e 0,703 para o pH,
respectivamente pata frutos de manga (JHA et al, 2012).
Sanchez e colaboradores realizaram um estudo sobre o controle de qualidade de
frutos de morango com espectroscopia NIR. Foram estudados os parâmetros de
qualidade externa e interna de morangos nas fases de colheita e pós-colheita. A análise
por mínimos quadrados parciais confirmou a viabilidade da técnica NIR para prever
parâmetros de qualidade relacionados com a cor, firmeza, teor de sólidos solúveis e
acidez titulável (SÁNCHEZ et al, 2012).
Theanjumpol utilizou a espectroscopia NIR para avaliar a qualidade de frutos de
manga. O objetivo da pesquisa foi selecionar as bandas de absorção química adequadas
53
para avaliar duas variedades de manga. As principais substancias químicas encontradas
no fruto da manga, tais como glicose, sacarose, ácido cítrico, ácido málico, amido e
celulose foram avaliadas e sua bandas de absorção identificadas. O tipo de cultivo da
manga não teve efeito sobre a seleção do comprimento de onda para os modelos PLS. O
coeficiente de correlação para todos os modelos foi de 0,99. O erro de calibração e o
erro de previsão foram inferiores a 0,5% (THEANJUMPOL et al, 2013).
Em outro estudo Caballero et al, desenvolveram um estudo com espectroscopia
NIR para o controle de qualidade de uvas utilizadas para a produção de vinhos. A
espectroscopia NIR foi usada como uma técnica não destrutiva para a avaliação das
mudanças nas propriedades internas de uvas utilizadas para produção de vinhos desde a
plantação até a adega. Os modelos de predição foram construídos para o teor de sólidos
solúveis, teor de açúcar ácido tartárico e ácido málico, sendo esses os parâmetros mais
importantes para o amadurecimento dos frutos. A espectroscopia NIR provou ter uma
boa precisão para as amostras analisadas. Para o teor de sólidos solúveis o R2 foi de
0,89 e o SECV foi de 1,41. Para o teor de açúcar apresentou um R2 de 0,87 e SECV de
17,13 e para o pH o R2 foi igual a 0,69 e o SECV igual a 0,19 (CABALLERO et al,
2010).
Em mais um estudo usando a espectroscopia NIR em análises de frutos, Jaiswal
e colaboradores observaram a predição da qualidade de frutos intactos de banana. Os
modelos PLS apresentaram resultados satisfatórios. Coeficientes de calibração e
validação apresentaram valores de 0,88 e 0,81 para sólidos solúveis; 0,85 e 0,78 para
BRIX; 0,88 e 0,83 para pH; 0,90 e 0,87 para matéria seca, respectivamente. Os erros de
calibração e previsão foram muito baixos, o que indicou que a técnica NIR apresenta
potencial para prever os parâmetros de maturidade e de amadurecimento de tais frutos
(JAISWAL et al, 2012).
Marín em um estudo realizado com seus colaboradores sobre a determinação dos
parâmetros de qualidade em nectarinas, observou as alterações nas propriedades físico-
químicas dos frutos, durante o amadurecimento ainda na árvore e após a colheita usando
espectroscopia NIR. Foram utilizados dois espectrofotômetros neste estudo: um sistema
micro-eletro mecânico portátil de 1600-2400 nm e um espectrofotômetro de diodo vis-
NIR de 400-1700 nm. Os dois instrumentos usados apresentaram boa precisão nos
resultados. Para o teor de sólidos solúveis o R2 foi igual a 0,89 e o SEP variou de 0,75 a
54
0,81 e para a firmeza os valores foram de R2 variando entre 0,84 e 0,86 e o SEP entre
11.6 e 12,7. Com o instrumento com arranjo de diodo foram previstos de forma
satisfatória, outros dois parâmetros testados. Para o peso dos frutos o R2 foi de 0,98 e o
SEP de 5,40 g. E para o diâmetro os valores encontrados foram R2 igual a 0,75 e SEP de
0,46. Os resultados indicaram que as alterações nos parâmetros de qualidade de
nectarinas podem ser medidas de forma não destrutiva, com uma medição de espectro
único e em questão de segundos, tanto durante o amadurecimento na árvore, como no
armazenamento pós-colheita, abrindo o caminho para a utilização dos instrumentos
portáteis para auxiliar os produtores na colheita no campo (MARÍN et al, 2009).
2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
Diante do crescimento da conscientização em relação a qualidade no setor de
alimentação, novas atividades de pesquisas em alimentos buscam definição e
preservação da qualidade durante sua comercialização e a possibilidade de integrar os
parâmetros de avaliação de qualidade aos seus processos de produção. Desenvolver
novas metodologias para determinar parâmetros de qualidade em alimentos, entre eles,
frutos, é de grande importância social, tecnológica e econômica, principalmente, com o
uso de técnicas que sejam rápidas, não invasivas e que apresentem boa precisão,
sensibilidade, robustez e seletividade. Dentre os métodos que preenchem tais requisitos
pode ser citada a espectroscopia na região do infravermelho próximo (NIR), que vem
sendo largamente utilizada nos últimos anos nas mais diversas análises, incluindo
aquelas em frutos. Os métodos analíticos principais para avaliar a qualidade dos
alimentos, utilizam as técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia
gasosa, espectrometria de massa, espectroscopia na região do ultravioleta e do visível,
absorção atômica, assim como os métodos clássicos que são muito utilizados em
análises de controle de qualidade em alimentos. Porém, as análises convencionais para
avaliação da qualidade de alimentos consomem muitos reagentes químicos, despendem
muitas horas de análises, produzem uma grande quantidade de resíduos, além de muitas
vezes necessitar de uma mão de obra especializada. Dessa forma, na tentativa de
minimizar tal situação, os métodos multivariados de análises associados à
espectroscopia NIR tem se mostrado como uma alternativa para a diminuição das
análises convencionais de controle de qualidade nos mais diversos alimentos, inclusive
55
frutos. A quimiometria associada à espectroscopia NIR se torna uma poderosa
ferramenta para processar a imensa quantidade de dados gerados por tal técnica. E,
dessa forma, tempo, reagentes e mão de obra especializada podem ser descartados. Os
métodos multivariados possibilitaram análises com espectroscopia NIR de diferentes
propriedades de frutos, como teor de sólidos solúveis, pH, BRIX, açúcares, matéria
seca, entre outros. O modelo de regressão por mínimos quadrados parciais (PLS) é o
mais utilizado em calibração multivariada em análises de frutos.
Neste trabalho, foi realizada a determinação do teor total de antocianinas em frutos
intactos de açaí e juçara, sendo usadas várias técnicas multivariadas, como regressão por
mínimos quadrados parciais (PLS) e algoritmos de seleção de variáveis (iPLS, APS,
AG), além de testes de amostras anômalas (outliers) e testes estatísticos.
Quando um procedimento analítico é realizado, há a necessidade de averiguar se o
método utilizado apresenta bom desempenho. É preciso garantir a qualidade das
medidas instrumentais e a confiabilidade estatística dos cálculos envolvidos. E a forma
para assegurar este bom resultado é a estimativa das figuras de mérito que foram
calculadas, neste trabalho, como sensibilidade analítica, seletividade, precisão, limite de
detecção, limite de quantificação e razão sinal-ruído.
Diversas metodologias analíticas têm sido relatadas para a determinação de
antocianinas em frutos. Entretanto, a espectroscopia na região do infravermelho
próximo em conjunto com a calibração multivariada, é raramente citada para a
determinação do teor total de antocianina com frutos de açaí e juçara. A pesquisa
realizada nesta tese poderá contribuir no meio científico com as pesquisas já conhecidas
pelos trabalhos publicados na literatura, podendo ser também aplicada em indústrias
para o controle de qualidade de frutos.
Baseado nas justificativas acima, o objetivo geral deste trabalho é desenvolver
uma metodologia e/ou modelo, empregando calibração multivariada para determinação
de antocianina total em frutos íntegros de açaizeiro e palmiteiro-juçara empregando a
técnica NIR. Os objetivos específicos são citados a seguir:
Realizar uma análise quantitativa para o teor de antocianinas totais em frutos de
açaí e juçara, a partir dos espectros NIR obtidos dessas amostras, sem fazer uso
de pré-processamentos.
Aperfeiçoar os modelos de regressão multivariada, fazendo o uso de pré-
processamentos dos dados.
56
Comparar diferentes técnicas de calibração multivariada utilizadas para seleção
de variáveis, tais como iPLS, APS e AG, em modelos lineares do tipo PLS.
Avaliar o desempenho dos modelos multivariados, antes e depois da detecção de
outliers.
Validar a metodologia utilizada através dos cálculos das figuras de mérito.
57
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. AMOSTRAS
Um grupo de 10 frutos de açaí-roxo ou comum (Euterpe oleracea Mart.) e um
grupo de 10 frutos de palmiteiro-juçara (Euterpe edulis Mart.) foram colhidos, no
estágio de maturação comercial (frutos completamente roxos), de cada um dos sete
clones de açaizeiro e dos sete de palmiteiro-juçara, o que totalizou 139 frutos. Os frutos
de palmiteiro-juçara foram colhidos no dia 10 de junho de 2010 no Viveiro
Experimental de Plantas Ornamentais e Florestais da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de
Jaboticabal, localizado no município de Jaboticabal, São Paulo (21 15’ de latitude Sul,
48 15’ de longitude e 560 metros de altitude), pois como era o fim da safra, não havia
mais frutos de palmiteiro-juçara no município de Ubatuba - SP. Os frutos de açaizeiro
foram colhidos no dia 15 de junho de 2010, sendo que das sete plantas de açaí, cinco
foram colhidas no Banco de Germoplasma do Instituto Agronômico de Campinas
(IAC), localizado no município de Ubatuba, São Paulo (23 27’ de latitude Sul, 45 04’
de longitude Oeste e oito metros de altitude), e duas na FCAV-UNESP, uma vez que
não havia disponibilidade de frutos no IAC. .A Figura 12 ilustra o procedimento de
coleta das frutas.
Figura 12- Etapas do procedimento de coleta dos frutos.
Fonte: autor
58
Depois de colhidos, os frutos foram acondicionados em sacos plásticos,
devidamente identificados e rapidamente transportados para a EMBRAPA
Instrumentação Agropecuária no município de São Carlos – SP. Em seguida, os frutos
foram selecionados visando à retirada dos doentes, com danos mecânicos e/ou causados
por insetos e também os fora de padrão (de coloração verde). Os mesmos permaneceram
à temperatura ambiente (~25C) visando à uniformização da temperatura entre as
diferentes amostras. Retirou-se aleatoriamente uma amostra de 10 frutos de cada
genótipo que foram individualmente analisados na região do infravermelho próximo
(NIR).
3.2. MÉTODO DE REFERÊNCIA: ANTOCIANINAS TOTAIS (AT)
Utilizou-se o método do pH diferencial para a determinação do teor de AT,
segundo o preconizado pela AOAC (2006, 2005-02). A extração da AT foi realizada na
polpa dos frutos, sendo obtidos separando o epicarpo e mesocarpo do endocarpo
(caroço) com uma faca de aço inoxidável e o material separado da amostra (1 fruto) foi
macerado e homogeneizado utilizando gral e pistilo de porcelana. O macerado foi
pesado em tubo tipo Falcon de 15 mL, em duas porções de 0,1 g, sendo uma porção
misturada a 10 mL de tampão de cloreto de potássio a 0,025 mol.L-1
, pH 1,0, e outra
misturada em 10 mL de tampão acetato de sódio a 0,4 mol.L-1
, pH 4,5, em seguida
foram processados em homogenizador de tecido marca IKA, modelo T-10 basic,
realizando a homogeneização por 30 segundos O homogenizado foi transferido para
balão volumétrico âmbar de 100 mL e completado o volume com o pH correspondente.
As amostras foram analisadas em duplicatas. A Figura 13 ilustra o procedimento
experimental descrito.
59
Figura 13- Etapas do método de referencia para o teor de antocianinas totais.
Fonte: autor
Após uma hora de extração, as amostras foram filtradas em papel de filtro
Watman no 1 e a absorbância determinada utilizando um espectrofotômetro Biochrom
Libra S12 (Biochrom Ltda., Cambridge, Reino Unido), nos comprimentos de onda 520
nm e 700 nm, para as soluções com pH 1,0 e pH 4,5, respectivamente. O teor de AT foi
expresso em grama de cianidina-3-glicosídeo por quilograma de polpa, segundo a
fórmula abaixo:
Equação 28
Em que
· A = absorção (Abs 520nm – Abs 700nm) pH 1.0 – (Abs 520nm – Abs 700nm) pH
4.5;
· MM (massa molecular) = o valor 449,2 g mol-1
para cianidina-3-glicosídeo;
· FD = o fator de diluição (quando necessário);
· l = o caminho óptico em cm (1 cm);
ε representa o valor 26.900, que é o coeficiente de extinção molar em L mol–1
cm–1
para
cianidina-3-glicosídeo;
60
· P = o peso da amostra (mg).
O teor de AT foi expresso em grama de cianidina-3-glicosídeo, por ser tal
antocianina a mais abundante em frutos de açaí e juçara.
3.3. INSTRUMENTAÇÃO NIR
Os espectros na região do infravermelho próximo (NIR) com reflectância difusa
e transformada de Fourier (FT) foram obtidos usado um espectrofotômetro FT-IR
Spectrum 100N (Perkin Elmer, Shelton, Estados Unidos). Os frutos foram colocados em
um suporte de politetrafluoretileno (Teflon®) branco possuindo um orifício de 0,5 cm
de diâmetro. A Figura 14 abaixo ilustra a etapa das medidas instrumentais com
espectroscopia NIR.
Figura 14- Medidas instrumentais com espectroscopia NIR
Fonte: autor.
Foto dos frutos: http://www.arara.fr/BBACAI.html
Tal suporte foi construído para permitir que os frutos permanecessem parados na região
equatorial dos mesmos, pois estes são irregulares, visando à obtenção dos espectros NIR em três
posições diferentes por fruto. O suporte com os frutos foi colocado diretamente na saída do
feixe de luz no acessório de reflectância, sendo o mesmo coberto para evitar a entrada de luz
externa, como é mostrado na Figura 14 acima.
Os dados foram obtidos na faixa espectral entre 700 – 2500 nm, com média de
50 varreduras, resolução espectral de 8 cm-1
, sem tratamento químico prévio, de 139
61
frutos de açaizeiro e palmiteiro-juçara intactos, em triplicata, o que totalizou 420
espectros NIR, cada um possuindo 3001 pontos.
3.4. MODELOS QUIMIOMÉTRICOS
Para a construção de modelos multivariados PLS foram utilizados os seguintes
pré-tratamentos: suavização Savitzky-Golay (janelas variando de 3 a 21 pontos),
correção por espalhamento multiplicativo de luz (MSC) e 1ª e 2ª derivadas Savitzky –
Golay (janelas variando de 3 a 21 pontos). Os modelos multivariados PLS, etapa de
pré-processamento de dados, algoritmos para seleção de variáveis (iPLS, AG, APS),
teste para a detecção da presença de Outliers, testes estatísticos e o cálculo das figuras
de mérito, para a determinação do teor total de antocianinas em frutos intactos de açaí e
palmiteiro juçara, foram utilizados empregando-se o programa MATLAB 7.1 usando o
pacote PLS-Toolbox. O algoritmo Kennard-Stone foi utilizado para seleção de amostras
para a construção de duas importantes etapas na calibração multivariada que é a
construção do modelo de calibração e a verificação de sua validade, ou seja, se o
modelo construído é ou não realístico (previsão), sendo selecionadas 100 amostras para
o conjunto de calibração e 39 para o conjunto de previsão.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. ANTOCIANINAS TOTAIS PELO MÉTODO DE REFERÊNCIA (pH diferencial)
O teor de antocianina total, expresso como cianidina-3-glicosídeo (% m/m), nos
139 frutos apresentou uma faixa bem ampla de valores, variando de 0,15 a 8,20%.
conforme a Tabela 3 a seguir:
62
Tabela 3.-Teores de TAC (cianidina-3-glicosídeo) (% m/m) dos frutos das diferentes palmeiras de
açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) e palmiteiro-juçara (Euterpe edulis Mart.) obtidos pelo método de
referência.
Genótipos Amostras de calibração
Número de
amostras
Teor de AT
(%)
Média +dp* (%)
Açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) 69 2,59 – 0,15 1,05 + 0,63
Planta 1: Ubatuba 10 1,70 – 0,22 0,75 + 0,45
Planta 2: Ubatuba 10 0,82 – 0,15 0,50 + 0,24
Planta 3: Ubatuba 9 2,59 – 0,46 1,46 + 0,73
Planta 4: Ubatuba 10 2,31 – 0,51 1,67 + 0,60
Planta 5: Ubatuba 10 1,96 – 0,70 1,41 + 0,42
Planta 6: Jaboticabal 10 0,79 – 0,19 0,50 + 0,18
Planta 7: Jaboticabal 10 1,87 – 0,63 1,08 + 0,46
Palmiteiro-juçara (Euterpe edulis
Mart.)
70 8,20 – 0,59 3,94 + 1,87
Planta 1: Jaboticabal 10 4,62 – 0,59 2,05 + 1,21
Planta 2: Jaboticabal 10 5,36 – 2,97 4,20 + 0,78
Planta 3: Jaboticabal 10 6,85 – 4,69 5,57 + 0,89
Planta 4: Jaboticabal 10 7,90 – 2,95 4,44 + 1,44
Planta 5: Jaboticabal 10 1,76 – 0,70 1,33 + 0,33
Planta 6: Jaboticabal 10 6,36 – 2,18 4,54 + 1,18
Planta 7: Jaboticabal 10 8,20 – 3,34 5,11 + 1,51
dp*=desvio padrão.
Fonte: autor
O teor de antocianina total encontrado nos frutos de açaí variou de 0,15 a 2,59
(% m/m). Dentre os frutos provenientes das plantas de Ubatuba, os frutos da planta 2
apresentaram menores teor de antocianinas, em torno de 0,15 %. Os frutos das plantas 3
e 4 apresentaram semelhança no teor de antocianina: 2,59 e 2,31, respectivamente,
sendo os maiores teores encontrados. Já os frutos provenientes das plantas 1 e 5,
apresentaram semelhantes valores de antocianinas em % m/m, 1,70 e 1,96,
respectivamente. Para os frutos colhidos em Jaboticabal, os provenientes da planta 7,
apresentaram um teor mais elevado de cianidina-3-glicosídeo; 1,87 %. Valor inferior foi
observado para os frutos da planta 6, em torno de 0,79 %.
63
Para os frutos do palmiteiro juçara o teor de antocianinas variou entre 0,59 e
8,20 %. Todas as amostras de frutos foram coletadas em Jaboticabal e os frutos colhidos
da planta 5, apresentaram um valor inferior de antocianinas quando comparado aos
demais. As plantas 4 e 7 forneceram frutos com maiores teores de cianidina-3-
glicosídeo: 7,90 e 8,20, respectivamente. Os frutos vindos das plantas 3 e 6,
apresentaram semelhantes valores de antocianinas, superiores a 6%.
As amostras em estudo apresentaram teores de cianidina-3-glicosídeo inferiores
aos encontrados na literatura. Iaderoza et. al. realizaram a extração de antocianinas a
partir dos frutos de E. oleracea e E. edulis., e identificaram através da cromatografia de
papel a cianidina-3-glucosídeo e cianidina-3-rutinosídeo como as principais
antocianinas em ambas as espécies. A quantidade de antocianinas encontradas em E.
oleracea foi de 336mg/100g de frutos e em E. edulis foi de 1.347mg/100g de frutos.
Portanto, segundo tal estudo, o palmiteiro (E. edulis) tem quatro vezes mais
antocianinas do que o açaizeiro (E. oleracea). O trabalho de Harborne também
identificou as antocianinas de frutos de E. edulis como cianidina-3-glucosídeo e
cianidina-3-rutinosídeo, embora não tenha quantificado estes compostos (IADEROZA
et al, 1992; HARBORNE et al, 1994). Del Pozo-Insfran e colaboradores, em seu estudo
quantificaram e identificaram as antocianinas e outros compostos fenólicos do açaí. As
antocianinas identificadas em cromatografia líquida foram cianidina-3-glucosídeo e
pelargonidina-3-glucosídeo, com concentrações de 1,040mg/L e 74,4mg/L de açaí
respectivamente (DEL POZO-INSFRAN et al, 2004). Kuskoski e colaboradores
quantificaram o teor de antocianinas e os compostos fenólicos de polpas de frutas
congeladas e também de açaí de E. oleracea (congelado). As antocianinas do açaí
totalizaram 22,8mg/100g de açaí e os polifenóis totalizaram 136,8mg/100g
(KUSKOSKI et al, 2006). Gallori et al. identificaram e quantificaram as antocianinas. O
estudo confirmou que as principais antocianinas presentes no açaí são cianidina-3-
glucosídeo e cianidina-3-rutinosídeo. A quantidade total de antocianinas foi de 0,5mg/g
(GALLORI et al, 2004). Rogez também quantificou as antocianinas de 60 amostras de
açaí (E. oleracea) recém-preparado e encontrou um valor médio de 44mg/100g de frutos
(ROGEZ, 2000). No trabalho de Bobbio et al, utilizando CLAE, o teor de antocianina
encontrado foi em torno de 263mg/100g da casca dos frutos de açaí (BOBBIO et al,
2000). Teixeira e colaboradores, usando o método do pH diferencial para quantificação
64
de antocianinas, encontraram um teor de 19,62mg/100g de antocianinas em frutos de
açaí (TEIXEIRA et al, 2008).
Nesta tese, os valores médios observados foram de 1,05 e 3,94% nos frutos de
açaizeiro e palmiteiro-juçara, respectivamente. Os frutos de palmiteiro-juçara
apresentaram, em média, cerca de três vezes mais antocianina que os de açaizeiro,
comportamento observado em outros estudos sobre a determinação do teor de
antocianinas em frutos de açaí e juçara, onde os frutos de juçara apresentam teor de
antocianinas superior aos frutos de açaí, como no estudo de Iaderoza (IADEROZA et al,
1992)
4.2. ATRIBUIÇÃO DE BANDAS NO NIR E PRÉ-PROCESSAMENTOS
Na Figura 15, é possível observar o espectro original da média dos espectros de
reflectância difusa na região do infravermelho próximo (NIR) de 70 frutos de açaizeiro
e 69 de juçara, totalizando 139 espectros, em triplicata. Percebe-se a sobreposição entre
os espectros das amostras, um comportamento que é característico dos espectros na
região NIR e dessa forma não há a possibilidade de qualquer tipo de identificação prévia
dos principais constituintes das amostras, sejam químicos ou físicos, ou de
características semelhantes entre os mesmos.
O NIR apresenta bandas largas, o que é típico dessa região. Além disso, os
espectros obtidos contem alguns ruídos instrumentais e erros no espalhamento de luz,
que provocam o deslocamento da linha base e, ainda, espalhamentos multiplicativos.
Apesar de não serem bem definidos, é possível realizar uma atribuição das bandas
observadas nos espectros em função das estruturas químicas dos parâmetros em análise.
65
Figura 15- Total de 139 espectros originais de reflectância difusa na região do NIR dos frutos de
açaizeiro e juçara.
Fonte: autor.
É possível a atribuição de algumas bandas de combinação e sobretons
evidenciadas nos espectros originais, dentre elas podem-se citar: bandas de molécula de
água em 1470 e 1950 nm; C-H em torno de 1100 nm que recebe influencia exercida
pelo terceiro sobretom relacionado a presença de açúcar; C=O, em torno de 1950 nm
referente ao segundo sobretom; N-H em torno de 1500 referente ao primeiro sobretom.
As bandas em 2110, 2205 e 2250 nm podem ser associadas aos grupos N-H (proteínas)
e O-H (água) relacionados às combinações das vibrações. Analisando estes espectros foi
possível observar que as amostras dos frutos de açaí e juçara se comportaram de modo
semelhante em relação a sua composição.
Foi necessária a aplicação de pré-processamentos matemáticos nos espectros
originais de modo a facilitar a interpretação das propriedades relacionadas aos sinais
analíticos, antes da construção do modelo multivariado. A correção de espalhamento
multiplicativo de luz, MSC (do inglês, “Multiplicative Scattering Correction”), foi
realizada sobre os espectros, devido às dispersões de luz em todas as direções
ocasionadas por granulação e geometria das partículas na amostra, provocando
alterações na relação entre a intensidade das medidas de reflectância e a concentração
das espécies em análise. Além disso, foi realizado sobre os espectros corrigidos pelo
MSC o cálculo da primeira e segunda derivada utilizando o algoritmo Savitzky-Golay,
variando o número de pontos da janela de 3 a 21, visando-se principalmente, a correção
da linha de base. A suavização Savitzky-Golay, também foi utilizada, variando o
número da janela de 3 a 21 pontos, com o objetivo de aumentar a razão sinal/ruído na
66
matriz de dados. E o MSC aplicado para corrigir o espalhamento de luz. Para a
suavização SG, foram utilizadas diversos pontos na janela de 3 a 21 pontos. O cálculo
das derivadas foi realizado para aumentar a resolução espectral e também corrigir
flutuações na linha de base. Neste tipo de pré-processamento, é importante considerar
que pode haver uma diminuição na relação sinal/ruído. Por isso, no presente trabalho o
cálculo das derivadas foi sempre realizado em conjunto com a aplicação dos pré-
processamentos MSC e suavização SG.
4.2.1. Regressão por mínimos quadrados parciais (PLS)
Após a realização dos pré-processamentos dos dados originais foram construídos
então os modelos de regressão por mínimos quadrados parciais. O conjunto de dados foi
organizado em forma de uma matriz (matriz X) e as amostras divididas em dois
conjuntos: 100 amostras para o conjunto de calibração e 39 amostras para o conjunto de
previsão. Uma segunda matriz (matriz y) foi formada pelos valores médios de
antocianinas totais expressos como cianidina-3-glicosídeo (% m/m), obtidos pelo
método de referência (pH diferencial). Para seleção de variáveis também foram
utilizados os algoritmos iPLS, APS e AG. Após a construção de diversos modelos
utilizando os mais variados pré-processamentos e seleção de variáveis foram
encontrados os resultados esperados.
O modelo PLS(4) 2ªDer. 3pts (com 4 variáveis latentes e pré-processamento de
2ª derivada com 3 pontos) apresentou um maior coeficiente de correlação na calibração,
RC igual a 0,9999, e apresentou um erro médio quadrático de validação cruzada
(RMSECV) superior aos demais modelos de calibração. O modelo PLS (4) Suavização
5pts, resultou no menor coeficiente de correlação na calibração, em torno de 0,75 e o
RMSECV ficou em torno de 1,46. Os modelos iPLS (5), PLS-APS(4) e PLS-AG(4),
apresentaram valores de coeficiente de correlação semelhantes na calibração, superiores
a 0,76, e os valores do RMSECV ficaram em torno de 1,68; 1,48 e 1,38,
respectivamente. E os demais modelos, tiveram seus coeficientes de correlação na
calibração variando entre 0,83 e 0,98, e o erro médio quadrático da validação cruzada,
variando de 0,93 a 1,68. Na Tabela 4 estão apresentados os valores obtidos para os
modelos construídos
67
Em relação aos resultados de previsão, o modelo iPLS(5) apresentou o menor
valor do coeficiente de correlação Rp de 0,2678 e o erro médio quadrático de previsão
(RMSEP) em torno de 1,53. Já o modelo PLS(4) 1ª Der. 5pts. foi o que obteve o maior
valor de Rp em torno de 0,85 e um RMSEP de 0,81. Os modelos PLS(4) Suavização
5pts., PLS-APS(4) (com 98 e 99 variáveis) e PLS-AG(4) (com 899 variáveis)
apresentaram valores de coeficiente de correlação semelhantes, superiores a 0,75, tendo
valores de RMSECV variando em torno de 0,91 a 0,99.
Observando todos os valores de coeficientes de correlação obtidos para os
conjuntos de calibração e previsão, assim como seus erros médios quadráticos, o
modelo que se apresentou mais satisfatório foi o modelo PLS(4)* com suavização em
janela de 5 pontos. O coeficiente de correlação para a calibração foi de 0,9731 e de
previsão 0,9056. Seu erro médio quadrático de validação cruzada (RMSECV) ficou em
torno de 1,3847 e o erro médio quadrático de previsão (RMSEP) igual a 0,4827.
68
Tabela 4- Resultados dos modelos de calibração e previsão para TAC (kg.g-1
).
Modelos Calibração Previsão
MSC Rc RMSECV Rp RMSEP Número de
variáveis
espectrais
(g kg-1
) (g kg-1
)
PLS(4)
Suavização
5pts.
0,7569 1,4698 0,7544 0,9395 2997
PLS(4)
1ª Der.. 5pts.
0,9714 1,4228 0,8524 0,8160 2993
PLS(4)
1ª.Der 7pts
0,9203 1,3942 0,8033 0,9383 2995
PLS(4)
2ªDer. 3pts
0,9999 2,1318 0,3282 1,9478 2999
iPLS(5) 0,7717 1,6816 0,2678 1,5384 298
iPLS(4) 0,9410 1,3594 0,8091 0,9258 1497
PLS-APS(4) 0,7631 1,4816 0,7660 0,9344 98
PLS-APS(4) 0,8302 1,3617 0,7567 0,9970 99
PLS-AG(4) 0,7749 1,3863 0,7589 0,9152 899
PLS-AG(4) 0,9869 0,9306 0,8412 0,8559 774
PLS(4)*
Suavização 5pts.
0,9731 1,3847 0,9056 0,4827 2997
PLS(4)*= melhor modelo
Fonte: autor
O erro médio quadrático de validação cruzada (RMSECV) e previsão (RMSEP),
coeficiente de correlação para calibração (Rc) e previsão (Rp) e número de variáveis
espectrais (tamanho). O número de variáveis latentes nos modelos PLS, iPLS, PLS-APS
e PLS-AG são indicados em parênteses, na Tabela 4 acima.
Os resultados encontrados não apresentaram diferenças significativas, a um nível
de confiança de 95%, de acordo com os testes estatísticos realizados, entre o melhor
modelo PLS, que foi o PLS (4)* e outros modelos, com a exceção do PLS (4) primeira
derivada (7 pts.), PLS (4) derivada segunda (3 pts.), iPLS (5), utilizando 298 variáveis
espectrais, e o iPLS (4) usando 1497 variáveis espectrais. O coeficiente de correlação
69
(Rp) para o conjunto de previsão variou de 0,75 a 0,90 para todos os modelos, com a
exceção do PLS (4) com segunda derivada (3 pts.) e iPLS (5). E para o conjunto de
calibração, o coeficiente variou de 0,75 a 0,98.
As regiões espectrais do NIR para modelos com dados derivados geralmente
mostraram maiores valores de RMSEP do que modelos com dados brutos ou com
suavização, por realçar a informação espectral quando se utilizou a derivada de
espectros. Quatro ou cinco variáveis latentes foram usadas para construção de modelos
através dos espectros NIR com PLS, e com seleção de variáveis IPLS, APS e AG. A
estratégia para a utilização de modelos de AG foi a vantagem de empregar menos
variáveis (774) para construir modelos PLS.
O teste de outliers foi aplicado para otimização dos modelos e duas amostras
com valores discrepantes foram excluídas do conjunto de calibração, do melhor modelo
PLS para teor de antocianinas com suavização com cinco pontos. Para este modelo, o
menor erro quadrático de validação cruzada (RMSECV) e RMSEP foram de 1,38 kg g-1
e 0,48 kg g-1
respectivamente. O coeficiente de correlação R2 para o conjunto de
previsão foi de 0,90, e foi obtido com quatro variáveis latentes. A Figura 16 mostra a
correlação entre os valores medidos e os previstos para os teores de antocianinas em
açaí e juçara. Quanto mais próximo os pontos plotados estiverem da diagonal, melhor o
ajuste do modelo. Os círculos abertos azuis representam amostras do conjunto de
calibração, e os triângulos fechados representam amostras do conjunto de validação.
70
Figura 16. Teor previsto versus teor medido de antocianinas, a partir de amostras de referência de
calibração e previsão para o teor de antocianinas, usando o modelo PLS (4) suavização (5pts.).
Fonte: autor.
É possível observar que os valores do teor previsto e do teor medido se
aproximam não havendo diferença significativa entre os modelos (ao nível de 95% de
confiança). O gráfico da correlação entre o valor medido e previsto para o melhor
modelo apresentou uma boa correlação sendo isso observado através de testes F. E,
além disso, foi realizado também o cálculo da região elíptica de confidencia conjunta,
EJCR, que é um teste estatístico para verificar se há diferença entre dois métodos,
levando em consideração o intercepto e a inclinação da elipse, como é apresentado na
Figura 17 abaixo.
71
Figura 17. Região elíptica de confidência conjunta para o declive e intercepto dos valores previstos
versus medidos, a partir da validação externa do teor de antocianinas, usando o modelo PLS(4)
suavização (5pts.).
Fonte: autor.
A região elíptica de confidencia conjunta (EJCR) foi construída para a
inclinação e intercepto quando foram plotados os valores previstos versus os valores dos
parâmetros reais, em um intervalo de confiança de 95%. O cálculo EJCR foi um meio
conveniente para verificar se existiu erro na determinação dos parâmetros ao usar o
modelo PLS (4) com suavização (5pts.), o que indica que a exatidão do modelo está
adequada A elipse contém o valor teórico esperado de 1,0, quando construída para AT.
Diversas publicações na literatura tratam do uso da espectroscopia NIR para
análises em frutos, como já citado anteriormente. Comparando os resultados obtidos
neste trabalho com os encontrados na literatura, é possível observar que os valores
encontrados para o coeficiente de correlação na previsão, se assemelham aos valores
encontrados por Costa et al em seu estudo sobre sólidos solúveis com frutos de ameixa,
com Rp variando em torno de 0,75 e 0,95 (COSTA et al, 2013). No trabalho de Mariani
e colaboradores, que determinou sólidos solúveis em frutos de jabuticabas, utilizando
pré-processamentos e seleção de variáveis semelhantes ao que foi usado na
determinação de antocianinas, foram encontrados coeficientes de correlação para a
calibração variando entre 0,55 a 0,99, valores semelhantes aos encontrados para
antocianinas. Já os erros na calibração foram superiores aos encontrados por Mariani.
Os valores para a previsão, entre 0,48 e 0,71 são inferiores a maioria dos valores para as
72
antocianinas, entre 0,26 e 0,90 (MARIANI et al, 2014). Já no trabalho de Jha e
colaboradores que estudaram a doçura de frutos intactos de manga, os valores de Rc se
aproximaram de um grande número de modelos construídos para antocianinas, com
valores superiores a 0,75. O melhor modelo PLS para antocianinas apresentou um valor
de Rp igual a 0,90, maior que os encontrados por Jha, em torno de 0,70 (JHA et al,
2012). Em outro estudo com frutos de manga, realizado por Theanjumpol e
companheiros, o coeficiente de correlação para todos os modelos foi de 0,99, valor que
se aproxima de muitos modelos construídos nesta pesquisa. Os erros de previsão
encontrados por Theanjumpol em torno de 0,5 % foi inferior aos erros para a maioria
dos modelos para antocianinas, porém semelhante ao erro do melhor modelo PLS(4)*
com suavização em janela de 5 pontos, em torno de 0,48. (THEANJUMPOL et al,
2013). Já no estudo sobre a qualidade de uvas, realizado por Caballero et al, os valores
dos coeficientes de calibração encontrados para sólidos solúveis ficaram em torno de
0,89 e o erro RMSECV em torno de 1,41, valores não distantes dos encontrados para
antocianinas, que ficou em torno de 0,90 para coeficiente de calibração e 1,3 para o
RMSECV, na maioria dos modelos formados (CABALLERO et al, 2010). Jaiswal e
companheiros em pesquisa sobre a qualidade de frutos de banana construíram modelos
PLS e observaram os seguintes resultados, coeficientes de calibração e previsão
apresentaram valores de 0,88 e 0,81 para sólidos solúveis; 0,85 e 0,78 para BRIX; 0,88
e 0,83 para pH; 0,90 e 0,87 para matéria seca, respectivamente. Valores que se
assemelham aos encontrados para antocianinas em frutos de açaí e juçara, em torno de
0,70 e 0,90 para calibração e valores em torno de 0,80 para muitos modelos PLS
construídos (JAISWAL et al, 2012). Os resultados obtidos para determinação de
antocianinas em frutos de açaí e juçara apresentaram valores semelhantes aos
encontrados na literatura em análises de frutos utilizando espectroscopia NIR, embora
os parâmetros estudados por outros autores sejam diferentes do parâmetro estudado
nesta pesquisa. Os valores obtidos para antocianinas se mostraram próximos a valores
para outros parâmetros, tais como: sólidos solúveis, pH, matéria seca, açúcar, entre
outros, indicando que a técnica NIR pode ser usada satisfatoriamente para determinar o
teor total de antocianinas em frutos intactas de açaí e juçara.
Para observar o bom desempenho das técnicas analíticas utilizadas, e garantir a
qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatística dos cálculos
73
envolvidos, foram realizados os cálculos das figuras de mérito, cujos resultados são
apresentados na Tabela 5.
Tabela 5- Figuras de mérito para o melhor modelo encontrado. PLS(4) 5pts
Figuras de mérito Concentração total de antocianinas (g.kg-1
)
RMSEC 13,8
RMSEP 4,8
Rc2 0,97
Rp2 0,90
Precisão 2,78
SEN 5,04x10-3
SEL 0,079
LOD 0,62
LOQ 2,07
S/N 1,04x10-3
Fonte: autor
Valores de precisão representados por RMSEC (raiz quadrada média do erro de
calibração) e RMSEP indicaram que os dados estimados pelo modelo multivariado
estão em concordância com o método de referência. A precisão foi avaliada por análise
de cinco amostras / dez repetições por amostra, sendo as medições registradas no
mesmo dia. Observaram-se resultados aceitáveis para a sensibilidade do parâmetro
avaliado considerando a faixa de análise de cada um dos modelos. A relação direta com
os erros de previsão não foi detectada para o valor da relação sinal-ruído, o que era
aparentemente pequena. Estes resultados sugeriram que os valores estimados do Limite
de Detecção e Limite de Quantificação podem ser otimistas. Embora na literatura seja
rara a citação de cálculo de figuras de mérito em análises de frutos utilizando
espectroscopia NIR, é encontrada a publicação de Valderrama et al, na qual foram
construídos modelos de validação e calibração para o teor de açúcar em frutos de cana
(VALDERRAMA et al, 2007),. Os valores de RMSEC encontrados por Valderrama
(VALDERRAMA et al, 2007), 0,30; 0,44 e 0,28, foram inferiores ao encontrado para
antocianinas em torno de 13,8 g.kg-1
. O mesmo acontece para os valores de RMSEP,
para os quais os resultados encontrados por Valderrama são menores que o valor para
antocianinas. E desta forma os valores determinados para as antocianinas foram
superiores aos encontrados por Valderrama.
74
5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos foram promissores em relação à determinação do teor de
antocianinas em frutos intactos de açaí e juçara, através da espectroscopia NIR aliada à
calibração multivariada. O melhor valor encontrado foi para o modelo PLS(4)* com
pré-processamento de suavização em janela de 5 pontos, com resultado de RMSEP
igual a 4,827 g kg-1
. As regiões selecionadas por algoritmos de seleções de variáveis,
iPLS, APS e AG, melhoraram os valores do coeficiente de previsão para a maioria dos
modelos PLS construídos. Os valores encontrados para RMSEP, RMSECV, bem como
os coeficientes de correlação para calibração e previsão, apresentaram-se próximos aos
encontrados na literatura em estudos com frutos, embora sendo parâmetros diferentes do
estudado. A espectroscopia NIR mostrou-se como um método rápido e não destrutivo
para determinação do teor de antocianinas totais em frutos intactos de açaí e juçara. Os
valores para a exatidão, precisão e outras figuras de mérito, exibiram resultados
promissores, indicando que o modelo desenvolvido por espectroscopia NIR para teor
total de antocianinas pode ser utilizado como uma alternativa a medidas de UV-VIS,
entre outras técnicas empregadas em análises de frutos, pois de modo geral a técnica
NIR, utilizada como método alternativo, não fez uso de reagentes ou soluções, o que
resultou na diminuição de tempo de análise e na não geração de resíduos. Além disso,
mostrou-se equivalente ao método de referência (pH diferencial), de acordo com os
testes estatísticos realizados.
Após a realização deste estudo fica a perspectiva da implementação da proposta
de utilização da espectroscopia na região do infravermelho próximo, como uma técnica
a ser usada na indústria de pós colheita, para promover e garantir um melhor controle de
qualidade em frutos.
75
REFERENCIAS
AGATI, G., CEROVIC, Z.G. Non-destructive monitoring of fruit anthocyanins of
chlorophyll fluorescence spectroscopy. In: Information and technology for
sustainable fruit and vegetable productions. FRUTIC, n.512 - 16 September,
Montpellier 2005. Disponível em: http://www.symposcience.org/exl-
doc/colloque/ART-00001677.pdf Acesso em: 05 Dez. 2012.
ALOMAR, D., MONTERO, R., FUCHSLOCHER, R. Effect of freezing and grinding
method on near-infrared reflectance (NIR) spectra variation and chemical composition
of fresh silage. Animal Feed Science and Technology, v.78, p.1-2, 1999. Disponível
em: http://openagricola.nal.usda.gov/Record/IND22004218 Acesso em 03 Maio 2012.
ARAÚJO, M.C.U., SALDANHA, T.C.B., GALVÃO, R.K.H., YONEYAMA, T.,
CHAME, H.C., VISANI, V. The successive projections algorithm for variable selection
in spectroscopic multicomponent analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory
Systems, João Pessoa, v. 57, n. 2, p. 65-73, 2001. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169743901001198 Acesso em: 5
jan. 2013.
BAUER K. Tropical fruit flavors: A flavorist’s perspective. CEREAL FOODS
WORLD. v.45, p.204-207,2000. Disponível em: https://getinfo.de/app/Tropical-Fruit-
Flavors-A-Flavorist-s-Perspective/id/BLSE%3ARN079528651 Acesso em 15 Abril
2012.
BEEBE, K.R., KOWASLSKI, B.R., An introduction to multivariate calibration
analysis, Analytical Chemistry, v. 59, p. 1007A-1017A, 1987. Disponível em:
http://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/ac00144a001 Acesso em 15 Abril 2013.
BENITO, M. T. J., OJEDA, C. B., ROJAS,F. S. Process Analytical Chemistry:
Applications of Near Infrared Spectrometry in Environmental and Food Analysis: An
Overview. Applied Spectroscopy Reviews, v.43, n.5, p.452–484, 2008. Disponível em:
http://www.informaworld.com/smpp/content~db=all~content=a795169845 Acesso em
14 Set. 2011.
BERZAGHI, P., RIOVANTO, R. Near infrared spectroscopy in animal science
production: principles and applications. Italian Journal of Animal Science, v.8, n.3,
p.39-62, 2009. Disponível em:
http://www.aspajournal.it/index.php/ijas/article/view/ijas.2009.s3.39/691 Acesso em: 14
Jan.. 2012.
76
BLANCO, M., ALCALA, M.; Content uniformity and tablet hardness testing of intact
pharmaceutical tablets by near infrared spectroscopy - A contribution to process
analytical technologies, Analytica Chimica Acta, v. 557, p.353-359, 2006. Disponível
em: www.elsevier.com/locate/aca Acessoem 23 Jan.2013.
BOBBIO, F.O., DRUZIAN, J.I., ABRÃO, P.A., BOBBIO, P.A., FADELLI, S.
identificação e quantificação das antocianinas do fruto do açaizeiro (Euterpe oleracea)
Mart), Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.20, n.3, p.388-390, 2000. Disponível em:
http://www.scientificcircle.com/pt/93149/identificacao-quantificacao-antocianinas-
fruto-acaizeiro Acesso em: 15 Jul.2011.
BOBBIO, F.O.; BOBBIO, P.A. Introdução à química de alimentos. 3. ed. São Paulo:
Varela, 2003. 238p.
Brasil. Instrução normativa nº 1, de 7 de janeiro de 2000. Estabelece o regulamento
técnico para a fixação dos padrões de identidade e qualidade para a polpa de fruta.
Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 10 jan. Seção 1, n.6, p.54-58,
2000.
BRERETON, R.G. Chemometrics: data analysis for the laboratory and chemical
plant, 1. ed. Chichester: John Wiley and Sons, 2003, 489p.
BURNS, D.A., CIURCZAK, E.W. Handbook of Near-Infrared Analysis.2. ed. Rev.
exp. New York: Marcel Dekker, 2001. v. 27, 814 p. (Série: espectroscopia prática).
Disponível em: http://www.amazon.com/Handbook-Near-infrared-Analysis-Donald-
Burns/ Acesso em 18 Jul. 2011.
BUTZ, P, HOFMANN, C AND TAUSCHER, B. Recent developments in non-invasive
techniques for fresh fruit and vegetable internal quality analysis. Journal of Food
Science. v.70, n. 9, p.131–141, 2005.Disponívelem:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2621.2005.tb08328.x/abstract Acesso
em 02 Jan. 2012.
CABALLERO, V. G., SÁNCHEZ, M. A., LÓPEZ, M. I., MARÍN, D. P. First steps
towards the development of a non-destructive technique for the quality control of wine
grapes during on-vine ripening and on arrival at the winery. Journal of Food
Engineering, v.101, p.158-165, 2010.Disponívelem:
www.elsevier.com/locate/jfoodeng Acesso em 17 Ago. 2012.
CHITARRA , M.I.F., CHITARRA, A.B. Pós-colheita de frutos e hortaliças: fisiologia e
manejo. 2 ed. Lavras: ESAL/FAEPE, 1990. 320p.
COSTA, R., LIMA, K. M. G. Prediction of Parameters (Soluble Solid and pH) in Intact
Plum using NIR Spectroscopy and Wavelength Selection, Journal of the Brazilian
chemical society, v.24, n.8, p.1351-1356, 2013. Disponível
77
em:http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-
50532013000800017 Acesso em: 15 Jan. 2014.
DAMBERGS, R. G., COZZOLINO, D., CYNKAR, W. U., JANIK, L., GISHEN, M.
The determination of red grape quality parameters using the LOCAL algorithm.
Journal of Near Infrared Spectroscopy, n.14, p.71-79, 2007. Disponível
em:http://books.google.com.br/books Acesso em 13 Ago. 2011.
DEL POZO-INSFRAN, D., BRENES, C.H., TALCOTT, S.T. Phytochemical
composition and pigment stability of açai (Euterpe oleracea Mart.). Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v. 52, n.6, p. 1539-1545, 2004. Disponível em:
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf035189n Acesso em 13 Mar.2012.
DURIG, J.R., SULLIVAN, J.F. Vibrational spectroscopy, Fourier transforms and
analytical chemistry. Trends Analytical Chemistry, v.9, n.4, p.104-106, 1990.
Disponível em: http://www.scielo.br/scieloOrg/php/reflinks.php?refpid=S0101-
2061200600040001100007&pid=S0101-20612006000400011&lng=en. Acesso em 18
Jul. 2011.
ESCANDAR, G. M., GOICOECHEA, H. C., LA PENA, A. M., OLIVIERI, A.C.,
Second- and higher-order data generation and calibration: A tutorial, Analytica
Chimica Acta, v.806, p.8-26, 2014. Disponível em:
http://www.researchgate.net/publication/259316361_Second-_and_higher-
order_data_generation_and_calibration_A_tutorial Acesso em 16 Out.2014.
FEI, Q.; LI, M., WANG, B., HUANG, Y., FENG, G.; REN, Y. , Analysis of cefalexin
with NIR spectrometry coupled to artificial neural networks with modified genetic
algorithm for wavelength selection. Chemometrics and Intelligent Laboratory
Systems, China, v. 97, n. 2, p. 127-131, 2009. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169743909000392 Acesso em 26
Out. 2011.
FGV, Fundação Getúlio Vargas, PROJETO POTENCIALIDADES REGIONAIS
ESTUDO DE VIABILIDADE ECONÔMICA – AÇAÍ, 2003. Disponível em:
http://www.suframa.gov.br/publicacoes/proj_pot_regionais/acai.pdf Aceeso em 18
Jul.2014.
FERREIRA, M. M. C., ANTUNES, A. M., MELGO, M. S., VOLPE, P. L. O.,
Quimiometria I: Calibração Multivariada, um tutorial, Química Nova, São Paulo, 1999,
Divulgação, p.724-731. Disponível em:
http://quimicanova.sbq.org.br/qn/qnol/1999/vol22n5/v22_n5_%20(15).pdf Acesso em
14 Jul. 2010.
78
FILHO, H.A.D. Desenvolvimento de técnicas quimiométricas de compressão de
dados e de redução de ruído instrumental aplicadas a óleo diesel e madeira de
eucalipto usando espectroscopia NIR. 2007. 158 f. Tese (Doutorado em Química).
2007. 158 f. Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Estadual de
Campinas, Campinas, SP, Brasil, 2007. Disponível
em:http://biq.iqm.unicamp.br/arquivos/teses/vtls000422359.pdf Acesso em 23 Maio
2011.
FONTANELI, R.S., SCHEFFER-BASSO, S.M., DURR, J.W., APPELT, J.V.,
BORTOLINI, F., HAUBERT, F.A. Validação do Método da Reflectância no
Infravermelho Proximal para Análise de Silagem de Milho. Revista Brasileira de
Zootecnia, v.31, n.2, p.594-598, 2002. Disponível em:
http://www.scielo.br/pdf/rbz/v31n2/10344.pdf Acesso em: 12 Jun.2012
FLORES, K., SANCHES, M. T., MARIN, D. P., GUERRERO., VARO, A.G.
Feasibility in NIRS instruments for predicting internal quality in intact tomato. Journal
of Food Engineering, v.91, p.311-318, 2009. Disponível em:
www.elsevier.com/locate/jfoodeng Acesso em 28 Abr. 2012.
FRANCIS, F.G. Analysis of Anthocyanins. In: Anthocyanins as Food colors. Food
science and technology. A series of monographs. Ed. Academic Press, New York, 1982,
261p.
FRANCIS, F. J. Food colorants: anthocyanins. Critical Review of Food Science and
Nutrition, v. 28, p. 273-314, 1989. Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20612012000100006
Acesso em 27 Set. 2012.
FRANCIS, F. J. Anthocyanins and betalains: composition and applications. Cereal
Foods World, v. 45, p. 208-213, 2000. Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20612005000400006
Acesso em 24 Jan. 2012.
GALLORI, S., BILIA, A.R., BERGONZI, M.C., BARBOSA, W.L.R., VINCIERI, F.F.
Polyphenolic Constituents of Fruit Pulpof Euterpe oleracea Mart. (Acaipalm)
Chromatographia, v.59, p.739-743, 2004. Disponível em:
https://www.google.com.br/?gws_rd=ssl#q=Polyphenolic+Constituents+of+Fruit+Pulp
+of+Euterpe+oleracea+Mart.+(Acai+palm) Acesso em 30 Set. 2011.
GELADI, P., MACDOUGALL, D., MARTENS, H. Linearization and sacatter
correction for near-infrared reflectance spectra of meat. Applied Spectroscopy, v.39,
n.3, p.491-500, 1985. Disponível em:
http://www.opticsinfobase.org/abstract.cfm?URI=as-39-3-491 Acesso em 15 Set. 2011.
79
GHISELLI, A., NARDINI, M.; BALDI, A., SCACCINI, C. Antioxidant activity of
different phenolic fractions separated from an Italian red wine. Journal of Agriculture
and Food Chemistry, v.46, n.2, p. 361-367, 1998. Disponível em:
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf970486b Acesso em 15 Ago. 2011.
GOIGOECHEA, H.C., OLIVIERI, A.C. Sustained prediction ability of net analyte
preprocessing methods using reduced calibration sets. Theoretical an experimental study
involving the spectrophotometric analysis of multicomponent mixtures. Analyst,
Argentina, v. 126, p. 1105-1112, 2001. Disponível em:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11478644 Acesso em 03 Mar. 2011.
HARBORNE, J.B., SAITO, N., DETONI, C.H. Anthocyanins of Cephaelis,
Cynomorium, Euterpe, Lavatera and Pinanga. Biochemical Systematics and Ecology,
vol. 22, n. 8, p. 835-836, 1994. Disponível
em:http://www.researchgate.net/publication/229419685_Anthocyanins_of_Cephaelis_C
ynomorium_Euterpe_Lavatera_and_Pinanga Acesso em 13 Mar. 2012.
http://www.ctaa.embrapa.br/projetos/ Acesso em 14 Mar. 2012.
HUANG, H., YU,H., XU, H., YING, Y. Near infrared spectroscopy for on/in-line
monitoring of quality in foods and beverages: A review. Journal of Food Engineering,
v.87, n.3, p.303–313, 2008. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T8J-4RJ3W9D-
6&_user=10&_coverDate=08%2F31%2F2008&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_
sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1443823992&_rerunOrigin=google&_ac
ct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=a3de2dee62c1a71d15
08eb3944d16599 Acesso em 30 Out. 2012.
HUANG, L., WU, D., JIN, H., ZHANG, J., HE, Y.; LOU, C. Internal quality
determination of fruit with bumpy surface using visible and near infrared spectroscopy
and chemometrics: A case study with mulberry fruit, Biosystems Engineering, v.109,
n.4, p.377–384, 2011. Disponível em:
:http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S153751101100081X Acesso em 14
Jul. 2012.
IADEROZA, M., BALDINI, V.L.S., DRAETTA, S. E., BOVI, M. L. A. Anthocyanins
from fruits of açaí (Euterpe oleracea, Mart) and juçara (Euterpe edulis, Mart).Tropical
Science, v.32, p.41-46, 1992. Disponível em: http://www.bdpa.cnptia.embrapa.br/busca
Acesso em 19 Abr. 2011.
ILARI, L., MARTENS, H., ISAKSSON, T. Determination of Particle Size in Powders
by Scatter Correction in Diffuse Near-Infrared Reflectance. Applied Spectroscopy,
v.42, n.5, p.722–728, 1988. Disponível em: http://www.opticsinfobase.org/abstract.cfm?uri=as-42-5-722 Acesso 06 Mar.2011.
80
INÁCIO, M. R. C., MOURA, M. F., & LIMA, K. M. G. Classification and
determination of total protein in milk powder using near infrared reflectance
spectrometry and the successive projections algorithm for variable selection.
Vibrational Spectroscopy, v.57, p.342-345, 2011. Disponível
em::www.elsevier.com/locate/vibspec Acesso em 05 Out. 2011.
JAISWAL, P., JHA, S. N., BHARADWAJ, R. Non-destructive prediction of quality of
intact banana using spectroscopy. Scientia Horticulturae, v.135, p,14-22, 2012.
Disponível em: www.elsevier.com/locate/scihorti Acesso em: 16 Dez. 2012.
JANIK, L. J., COZZOLINO, D., DAMBERGS, R., CYNKAR, W., GISHEN, M. The
prediction of total anthocyanin concentration in red-grape homogenates using visible-
near-infrared spectroscopy and artificial neural networks. Analytica chimica acta,
v.594, n.1, p.107-118, 2007. Disponível em:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17560392 Acesso em 18 Jul. 2012.
JHA, S. N., JAISWAL, P., NARSAIAH, K., GUPTA, M., BHARDWAJ, R., SINGH,
A.K. Non-destructive prediction of sweetness of intact mango using near infrared
spectroscopy. Science Horticulture, v.138, p.171-175, 2012. Disponível
em:http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423812001069 Acesso em
15 Jan. 2013.
KUBELKA. P., MUNK F., EinBeitrag ZurOptik der Farbanstriche. Zeitschrift
furtechnische Physikn.12, p.593-601, 1931. Disponível em: http://art-
si.org/PDFs/Processing/KMreport_10_01.pdf Acesso em 30 Nov. 2012.
KULIGOWSKI, J., QUINTÁS, G., GARRIGUES, S., de La GUARDIA, M. Direct
determination of polymerized triglycerides in deep-frying olive oil by attenuated total
reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy using partial least squares
regression. Analytical and Bioanalytical Chemistry. v. 397, n. 2, p. 861-869, 2010.
Disponível em: http://connection.ebscohost.com/c/articles/49444142 Acesso em 14 Jul.
2011.
KUSKOSKI, E. M., ASUERO, A. G., MORALES, M. T., FETT, R. Frutos tropicais
silvestres e polpas de frutas congeladas: atividade antioxidante, polifenóis e
antocianinas. Ciência Rural, v.36, n.4, p.1283-1287, 2006. Disponível em:
http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=33136437 Acesso em 24 Jun.2012.
LAMMERTYN, J., NICOLAÏ, B., OOMS, K., SMEDT, V. AND DE
BAERDEMAEKER, J. Non-destructive measurement of acidity, soluble solids, and
firmness of Jonagold apples using NIR-spectroscopy. American Society of
Agricultural and Biological Engineers, v.41, n.4, p.1089-1094, 1998. Disponível
em:https://elibrary.asabe.org/abstract.asp?aid=17238&t=2&redir=&redirType Acesso
em 18 Dez. 2012.
81
LEE, Z.J. An integrated algorithm for gene selection and classification applied
tomicroarray data of ovarian cancer. Artificial Intelligence in Medicine, v. 42, n. 1, p.
81-93, 2008. Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18006289 Acesso
em 6 jan. 2013.
LIMA, K.G., TREVISAN, M.G., POPPI, R.J., ANDRADE. Determinação não
destrutiva do nitrogênio total em plantas por espectroscopia de reflectância difusa no
infravermelho próximo. Química Nova, São Paulo, v.31, n. 3, p. 700-703, 2008.
Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-
40422008000300039 Acesso em 13 Jan. 2012.
LICHTENTHÄLER, R., RODRIGUES, RB., MAIA, JG., S.,
PAPAGIANNOPOULOS, M., FABRICIUS, H., MARX, F. Total oxidant scavenging
capacities of Euterpe oleraceae Mart. (acai) fruit. International Journal of Food
Science and Nutrition, v.56, n.1, p. 56-64, 2005. Disponível em:
http://gotxhealth.com/pdf/acai_berry/OxidantScavengingCapacities.pdf Acesso em 11
Mar.2011.
LIU, Y, YING,Y, YU, H, FU, XIAPING. Comparison of the HPLC method and FT-
NIR analysis for quantification of glucose, fructose, and sucrose in intact
apple fruits.Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.54, n.8, p.2810-2815,
2006. Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16608193 Acesso em: 16
Out. 2012.
LIU, F., HE, Y., HE, Y., WANG, L. Application of visible/near infrared spectroscopy
and chemometric calibrations for variety discrimination of instant milk teas, Journal of
Food Engineering, v.93, p.127–133, 2009. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science Acesso em: 15 Mar.2012.
LIU, F., HE, Y., SUN, G. Determination of protein content of Auricalia auricalia using
near infrared spectroscopy combined with linear and nonlinear calibrations. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v. 57, n. 11, p. 4520-4527, 2009. Disponível em:
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf900474a Acesso em 30 Nov. 2011.
LUYPAERT, J., MASSART, D.L., HEYDEN, V. Near-infrared spectroscopy
applications in pharmaceutical analysis. Talanta, v. 73. n. 3, p. 865-883, Maio 2007.
Disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003991400600823X.
Acesso em 15 Jul.2011.
MALACRIDA, C.R., MOTTA, S. Antocianinas em suco de uva: composição e
estabilidade. Boletim CEPPA, v. 24, n. 1, p. 59-82 jan./jun. 2006. Disponível em:
http://ojs.c3sl.ufpr.br/ojs/index.php/alimentos/article/viewFile/5294/3924 Acesso em 15
Mar. 2012.
82
MANTOVANI, A., MORELLATO, P. Fenologia da floração, frutificação, mudança
foliar e aspectos da biologia floral. Sellowia, v.49, n.52, p.23-38, 2000. Disponível em:
https://periodicos.ufsc.br/index.php/biotemas/article/viewFile/21757925.2013v26n4p53
/25698 Acesso em 15 Jul..2012.
MARÇO, P.H., POPPI,R.J., SCARMÍNIO, I.S. Procedimentos analíticos para
identificação de antocianinas presentes em extratos naturais. Química Nova, v.31,
p.1218-1223, 2008. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/qn/v31n5/a51v31n5.pdf
Acesso em 13 Jul.2014.
MARIANI, N.C.T., COSTA, R. C., LIMA, K.M., NARDINI, V., JÚNIOR, L.C.C.,
TEIXEIRA, G.H.A. Predicting soluble solid content in intact jaboticaba [Myrciaria
jaboticaba(Vell.) O. Berg] fruit using near-infrared spectroscopy and chemometrics.
Food Chemistry, v. 159, p.458-462, 2014. Disponível
em::www.elsevier.com/locate/foodchem Acesso em: 9 Abril 2014.
MARKAKIS, P. Anthocyanins as food colors. Food science and technology. A series
of monographs. Ed. Academic Press,. New York, 1982, 261p.
MARTENS, H., NAES, T. Multivariate Calibration, 2.ed. JONH WILEY & SONS,
2002, 419p.
MARÍN, D. P., SÁNCHEZ, M. T., PAZ, P., SORIANO, M.A, GUERRERO, J. E.,
VARO, A.G. Non-destructive determination of quality parameters in nectarines during
on-tree ripening and postharvest storage. Postharvest Biology and Technology, v.52,
p.180-188, 2009 .Disponível em: www.elsevier.com/locate/postharvbio Acesso em 29
Set. 2012.
MATOS, G.D., PEREIRA-FILHO, E.R., POPPI, R.J., ARRUDA, M.A.Z. Análise
exploratória em química analítica com emprego de quimiometria: PCA e PCA de
imagens. Revista Analytica, Campinas, v. 6, n.3, p.38-48, 2003. Disponível em:
http://www.google.com.br/revistaanalytica.com.br Acesso em 15 Set. 2010.
MCCLURE, W.F. 204 years of Near Infrared: 1800-2003. Journal Near Infrared
Spectroscoscopy, v.11, p.487-518, 2003. Disponível em:
http://www.google.com.br/search?hl=ptBR&q=MCCLURE%2C+W.F.+204+years+of+
Near+Infrared%3A+18002003.+J.+Near+Infrared+Spectrosc.&btnG=Pesquisar&aq=f&
aqi=&aql=&oq=&gs_rfai= Acesso em 15 Nov. 2011.
MILLER, J.N., MILLER, J.C. Statistics and chemometrics for analytical
chemistry.5.ed. Londres: Pearson Prentice Hall, 2005, 268p.
MILLER, S.S., FULCHER, R.G. Oat endosperm cell walls: II, Hot-water solubilization
and enzymatic digestion of the wall. Cereal Chemistry, v.72, n.5, p.428-432, 1995.
Disponível em: http://www.scielo.br/scieloOrg/php/reflinks.php?refpid=S0101-
83
2061200700020002500025&pid=S0101-20612007000200025&lng=en Acesso em 14
Jul. 2011.
MISSANG, C. E., GUYOT, S., & RENARD, C. M. G. C. Flavonols and anthocyanins
of bush butter, Dacryodesedulis (G. Don) H.J. Lam, fruit. Changes in their composition
during ripening. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.51, n.25, p.7475-
7480, 2003. Disponível em: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf0346399 Acesso em 7
Jul. 2011.
MOHAMMADI, M., BERNS, R.S. Verification of the Kubelka-Munk Turbid Media
Theory for Artist Acrylic Paint. Revista eletrônica:Technical Report, p.1- 15, 2004.
Disponível em: http://www.art-si.org/Acesso em: 21 Mar. 2012.
MORGANO, M.A., FARIA, C.G., FERRÃO, M.F., BRAGAGNOLO, N., FERREIRA,
M.M.C.Determinação de proteína em café cru por espectroscopia NIR e regressão PLS.
ciência e tecnologia de alimentos, v.25, n.1, p.25-31, 2005. Disponível
em:http://scholar.google.com.br/citations?user=iVpWxtAAAAAJ&hl=pt-BR Acesso
em 28 Set. 2011.
NAES, T.; ISAKSSON.T., FEARN, T., DAVIES, T.A user-friendly guide to
Multivariate Calibration and Classification, 1.ed.Chichester-UK: NIR Publications,
2002., 354p.
NAZAROV, I., WAMPLE, R.L., KAYE, O., SANTOS, A.O., GOULART, K. “Near
Infrared Laboratory on shoulder” Portable NIR Solutions. Information and technology
for sustainable fuit and vegetable productions. FRUTIC 5, p. 355-362, 2005.
Disponível em: file:///C:/Users/Raquel/Documents/Tese/artigo%20NIR%20s.pdf
Acesso em 14 Ago. 2012.
NETO, B.B., SCARMÍNIO, I.S., BRUNS, R.E. 25 Anos de quimiometria no Brasil.
Química Nova, São Paulo, v. 29, n.6, p. 1401-1406, 2006. Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-40422006000600042.
Acesso em : 18 Jun.2010.
NEVES, A. C. O., SOARES, G. M., MORAIS, S. C., COSTA, F. S. L., PORTO, D. L.,
LIMA, K. M. G. Dissolution testing of isoniazid, rifampicin, pyrazinamide and
ethambutol tablets using near-infrared spectroscopy (NIRS) and multivariate
calibration. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.57, p.115-119,
2012. Disponível em::www.elsevier.com/locate/jpba Acesso em: 23 Set. 2012.
NICOLAÏ, B.M., BEULLENS, K., BOBELYN, E., PEIRS, A., SAEYS, W., THERON,
K.I., LAMMERTYN, J. Nondestructive measurement of fruit and vegetable quality by
means of NIR spectroscopy: A review. Postharvest Biology and Technology, v.46,
p.99-118, 2007.Disponível em: http://books.google.com.br/books?i Acesso em 25 Jul.
2012.
84
OLIVEIRA, R.R., NEVES, L.S., LIMA, K.M.G. Experimental Design, Near-Infrared
Spectroscopy, and Multivariate Calibration: An Advanced Project in a Chemometrics
Course. Journal of chemical education. v.89, p.1566-1571, 2012. Disponível em:
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed200765j Acesso em: 13 Dez. 2012.
OLIVEIRA, R.R., LIMA, K.M.G., TAULER, R., JUAN, A. Application of correlation
constrained multivariate curve resolution alternating least-squares methods for
determination of compounds of interest in biodiesel blends using NIR and UV–visible
spectroscopic data. Talanta. v.125, p.233-241, 2014. Disponível em:
www.elsevier.com/locate/talanta Acesso em 14 Mar. 2014.
OLIVIERI, A. C., FABER, N. M., FERRÉ, J., BOQUÉ, R., KALIVAS, J. H., MARK.
H.; Uncertainty estimation and figures of merit for multivariate calibration; Pure and
Applied Chemistry,v. 78, n. 3, p. 663-661,2006. Disponível em:
http://old.iupac.org/publications/pac/2006/7803/7803x0633.html Acesso em 03 Fev.
2012.
OSBORNE, B.G. Comparative study of methods of linearisation and scatter correction
in near infrared reflectance spectroscopy. Analyst, v.113, p.263-267, 1988. Disponível
em: http://www.rsc.org/publishing/journals/AN/article.asp?doi=AN9881300263
Acesso em: 15 Jan. 2012.
OTTO, M.,. Chemometrics, Statistics and Computer Application in Analytical
Chemistry,2.ed. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2007, 328p.
PASQUINI, C. Near Infrared Spectroscopy: Fundamentals, Practical Aspects and
Analytical Applications. Jornal of Brazilian Chemical Society.,São Paulo, v. 14, n.2,
p. 198-219, 2003. Disponível em: http://scholar.google.com.br/scholar Acesso em 18
Ago.2010.
PAULA, J.E. Anatomia de Euterpe oleracia Mart. Acta Amazônica, v.5,p.265-278,
1975, Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000158&pid=S2317-
1537201300020000500041&lng=pt Acesso em 23 Set. 2014.
PAZ, P., SANCHEZ, M. T., MARIN, D. P., GUERRERO., VARO, A.G. Instantaneous
quantitative and qualitative assessment of pear quality using near infrared spectroscopy.
Computers and Electronics in Agriculture, v.69, p.24-32, 2009. Disponível
em:www.elsevier.com/locate/compag Acesso em: 26 Abr. 2012.
PENA, F., PEREZ, J., GAITÁN, J., ORTIZ, V. Study of the near infrared spectroscopy
response to thiabendazole levels lower than the maximum residue limit on intact orange.
V CONGRESO IBEROAMERICANO DE TECNOLOGÍA POSTCOSECHA Y
AGROEXPORTACIONES. p.248-258, 2007. Disponível em:
http://www.horticom.com/pd/imagenes/68/211/68211.pdf Acesso em 02 Mar. 2012.
85
REITZ, R.Palmeiras. Itajaí: Herbário Barbosa Rodrigues, 1974. 189p.
RIBEIRO, F.A.L.; FERREIRA, M.M.C. Planilha de validação: uma nova ferramenta
para estimar figuras de mérito na validação de métodos analíticos univariados. Química
Nova. São Paulo. v.31, n.1, p.164-171, 2008. Disponível em:
http://www.scientificcircle.com/pt/51566 Acesso em 21 Set. 2011.
ROGEZ, H.. Açaí: Preparo, Composição e Melhoramento da Conservação. Belém:
EDUFPA, 2000, 313p.
ROSSO, V. V., MERCADANTE, A. Z. Evaluation of colour and stability
ofanthocyanins from tropical fruits in an isotonic soft drink system. Innovative Food
Science eEmerging Technologies, v.8, p. 347-352, 2007. Disponível em:
https://www.escience.unicamp.br/quimifea/admin/publicacoes/documentos/publicacao_
609_De%20Rosso%202007%20-%20isotonico.pdf Acesso em 14 Dez. 2011.
RUFINO, J.L. Desenvolvimento de Metodologias Analíticas Para Controle de
Qualidade de Fármacos, Utilizando-se Técnicas Espectroscópicas (NIR e MID) e
Processos de Calibração Multivariada (PLS). 2004. 116 f. Dissertação (Mestrado em
Química). Programa de Pós Graduação em Química. Universidade Federal do Paraná.
Curitiba, 2004. Disponível em: http://www.google.com.br/search?hl=pt-
BR&&sa=X&ei=6QN0TKapDYH8AbU7Jz0CA&ved=0CBUQvwUoAQ&q=disserta%
C3%A7%C3%A3o+de+mestrado+-+Jos%C3%A9+Luiz+Rufino&spell=1Acesso em 23
Dez. 2010.
RUFINO, M. S. M., ALVES, R. E., BRITO, E. S., PÉREZ-JIMÉNEZ, J., SAURA-
CALIXTO, F., MANCINI FILHO, J.. Bioactive compounds and antioxidant capacities
of 18 non-traditional tropical fruits from Brazil. Food Chemistry, v. 121, p. 996-1002,
2010. Disponível em: http://www.producao.usp.br/handle/BDPI/19471 Acesso em07
Set. 2011.
SÁNCHEZ, M. T., HABA, M. J., LÓPEZ M. B., NOVALES, J. F., VARO, A. N.,
MARIN, D. P. Non-destructive characterization and quality control of intact
strawberries based on NIR spectral data.Journal of Food Engineering, v.110, n.1,
p.102-108, 2012. Disponível em:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0260877411006455 Acesso em 18
Abr. 2013.
SAKUDO, A., KATO, Y. H., KURATSUNE, H., & IKUTA, K. Non-invasive
prediction of hematocrit levels by portable visible and near-infrared spectrophotometer.
Clinica Chimica Acta, v.408, p.123-127, 2009. Disponível em:
http://www.deepdyve.com/lp/elsevier/non-invasive-prediction-of-hematocrit-levels-by-
portable-visible-and-EFo3A0QRbn Acesso 08 Maio 2011. Acesso em 15 Abr. 2012.
SATUE-GRACIA, M.T.; HEINONEN, M.; FRANKEL, E.N. Anthocyanins as
Antioxidants on Human Low-Density Lipoprotein and Lecithin-Liposome Systems.
86
Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.45, n.9, p.3362-3367,
1997.Disponívelem:http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf970234aAcesso em 27
Jun.2012.
SAVITZKY, A., GOLAY, M.J.E. Smoothing and Differentiation of data by simplified
least squares procedures. Analytical Chemistry, Norwalk, v. 36, n. 8, p. 1627-1638,
1964. Disponível em: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60214a047 Acesso em 14
Jan. 2011.
SCHAUSS, A.G., WU, X., PRIOR, R.L., OU, B., HUANG, D., OWENS, J.,
AGARWAL, A., JENSEN, G.S., HART, A.N., SHANBROM, E. Antioxidant Capacity
and Other Bioactivities of the Freeze-Dried Amazonian Palm Berry, Euterpe oleraceae
Mart. (Acai).Journal of Agriculture and Food Chemistry, v.54, p.8604-8610, 2006.
Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17061840 Acesso em: 22 Nov.
2011.
SENA. M.M., TREVISAN, M.G., POPPI, R. J. PARAFAC: Uma ferramenta
quimiométrica para tratamento de dados multidimensionais. Aplicações na
determinação direta de fármacos em plasma humano por espectrofluorimetria. Química
Nova, São Paulo, v. 28, n.5, p. 910-920, 2005. Disponível em:
http://biblioteca.universia.net/html_bura/ficha/params/title/parafac-uma-ferramenta-
quimiometrica-tratamento-dados-multidimensionais-aplica%C3%A7%C3%B5es-na-
determina%C3%A7%C3%A3o/id/Acesso em 15 Jul. 2010.
SILVA, M. G. C. P. C., BARRETTO, W. S., SERÔDIO, M. H. Caracterização Química
da Polpa dos Frutos de Juçara e de Açaí. XVIII CONGRESSO BRASILEIRO DE
FRUTICULTURA. Florianópolis, Santa Catarina, 22 a 26 de novembro de 2004..
Anais... CD ROOM, Florianópolis, SC, 2004. Disponível em:
http://www.ceplac.gov.br/radar/semfaz/producaodefrutos.htm Acesso em 08 Jul. 2012.
SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A; Fundamentos de Química
Analítica.Trad. 8. ed. Norte Americana:Bookman, Porto Alegre, 2006. 1026 p.
SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A; Princípios de análise Instrumental. 5a
ed., Bookman,Porto Alegre, 2002, 836p.
SOUZA, J. S., FERRÃO, M.F. Aplicações da espectroscopia no infravermelho no
controle de qualidade de medicamentos contendo diclofenaco de potássio. Parte 1:
Dosagem por regressão multivariada. Revista Brasileira de Ciências
Farmacêuticas,v.42,n.3, p.437-445, 2006. Disponível
em:http://www.readcube.com/articles/10.1590/S1516-93322006000300013 Acesso em:
27 fev.2012.
SOUSA, L.C. Espectroscopia na região do infravermelho próximo para predição
de características da madeira para produção de celulose. 2008. 109 f. Tese
(Doutorado em Ciência Florestal). 2005. 109 f. Programa de Pós-Graduação em Ciência
87
Florestal,Universidade Federal de Viçosa, MG, Brasil, 2008. Disponível
em:http://www.bibliotecaflorestal.ufv.br/handle/123456789/146 Acesso em 16 Abr.
2012.
TAIZ, L., ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 3 ed. Porto Alegre: ARTMED, 2004. 719 p.
TEERACHAICHAYUT,S. TERDWONGWORAKUL, A., THANAPASE, W.,KIJI, K.,
Non-destructive prediction of hardening pericarp disorder in intact mangosteen by near
infrared transmittance spectroscopy, Journal of Food Engineering., v.106, n.3, p.206-
211,2011. Disponível em: http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=24314731
Acesso em 14 Fev.2012.
TEIXEIRA, L. C., STRINGHETA, P. C., OLIVEIRA, F, B. Comparação de métodos
para quantificação de antocianinas. Ceres, v.55, n.4, p.297-304, 2008. Disponível
em:http://www.redalyc.org/pdf/3052/305226703009.pdf Acesso em 24 Out. 2012.
THEANJUMPOL, P.. SELF, G., RITTIRON, R., PANKASEMSUK, T., SARDSUD,
V. Selecting Variables for Near Infrared Spectroscopy (NIRS) Evaluation of Mango
Fruit Quality. Journal of Agricultural Science, v.5, n.7, p.146-159, 2013. Disponível
em: http://dx.doi.org/10.5539/jas.v5n7p146 Acesso em 14 Dez. 2013.
TONON, R,V., BRABET, C., HUBINGER, M.D. Influência da temperatura do ar de
secagem e da concentração de agente carreador sobre as propriedades físico-químicas
do suco de açaí em pó. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.29, n.2, p.444-450, 2009.
Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000110&pid=S0103-
8478201300010003000022&lng=pt Acesso em 24 Set. 2011.
VALDERRAMA, P., BRAGA, J.W.B., POPPI, R.J. Variable Selection, Outlier
Detection, and Figures of Merit Estimation in a Partial Least-Squares Regression
Multivariate Calibration Model. A Case Study for the Determination of Quality
Parameters in the Alcohol Industry by Near-Infrared Spectroscopy. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, Campinas, v. 55, n. 21, p. 8331-8338,
2007.Disponível em: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf071538s Acesso em 19 Ago.
2011.
VALDERRAMA, P., BRAGA, J. W.B., POPPI, R. J. Estado da arte em figuras de
mérito em calibração multivariada. Química Nova, São Paulo, v. 32, n.5, p.1278-1287,
2009. Disponível em: http://www.bv.fapesp.br/en/publicacao/50773/estado-arte-figuras-
merito-calibracao/ Acesso em 15 Jul. 2010.
VALDERRAMA. P., BRAGA, J. W. B., POPPI, R. J. Validation of Multivariate
Calibration Models in the Determination of Sugar Cane Quality Parameters by Near
Infrared Spectroscopy. Journal of the Brazilian chemical society, v.18, n.2, p.259-266,
88
2007.Disponívelem: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0103-
50532007000200003&script=sci_arttext Acesso em 26 Out. 2012.
WALSH, K.B. Commercial adoption of technologies for fruit grading, with emphasis
on NIRS. In: Information and technology for sustainable fruit and vegetable
productions fruit, 12 - 16 September, Montpellier 2005. Disponível em:
http://www.symposcience.org/exl-doc/colloque/ART-00001677.pdf Acesso em 12
Dez. 2012.
WATSON, C.A. Near infrared reflectance spectrophotometric analysis of agricultural
products, Analytical Chemistry, v.49, n.9, p.835A-840A, 1977. Disponível em:
http://www.scielo.br/scieloOrg/php/reflinks.php?refpid=S010120612008000100003000
18&pid=S0101-20612008000100003&lng=en Acesso em 03 Maio 2011.
WEDDING, B. B., WHITE, R. D., GRAUF, S., WRIGHT, C., TILSE, B., HOFMAN,
P.; GADEK, P. A., Non-destructive prediction of “Hass” avocado dry matter via FT-
NIR spectroscopy, Journal Science Food Agricultural,v.91, n.2, p.233-238
2011.Disponível em:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20839265 Acesso em: 30
Nov.2012.
WETZEL, D.L. Near-infrared reflectance analysis sleeper among spectroscopic
techniques. Analytical Chemistry, v.55, n.12, p.1165A-1176A, 1983. Disponível em:
http://www.scielo.br/scieloOrg/php/reflinks.php?refpid=S151693322004000300015000
46&pid=S1516-93322004000300015&lng=en Acesso em 24 Maio 2011.
WILLIAMS, C. A., GREENHAM, J., HARBORNE, J. B., KONG, J. M., CHIA, L.,
GOH, N. K., SAITO, N., TOKI, K., TATSUZAWA, F. Acylated anthocyanins and
flavonols from purple flowers of Dendrobium cv. ‘Pompadour’. Biochemical
Systematics Ecology, v.30, n.7, p.667-675, 2002. Disponível em:
http://www.ingentaconnect.com/content/els/03051978/2002/00000030/00000007/art001
47 Acesso 14 Fev. 2012
WILLIAMS, P. C., NORRIS, K. H., SOBERING, D. C. Determination of protein and
moisture in wheat and barley (cevada) by near-infrared transmission. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, n.33, p.239-244, 1985. Disponível em:
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf00062a021 Acesso em: 13 Maio 2011.
WOLD, S. Personal memories of the early PLS development; Chemometrics and
Intelligent Laboratory Systems, v. 58, p.83-84,2001. Disponível em:
www.elsevier.com/locate/chemometrics Acesso em 25 Fev.2012
WORKMAN, Jr. J. J. Interpretive spectroscopy for near infrared. Applied
Spectroscopy Review, v.31, n.3, p. 251–320, 1996. Disponível em:
89
http://www.informaworld.com/smpp/content~db=all~content=a747188189 Acesso em:
02 Out. 2012.