UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

INSTITUTO DE QUÍMICA

Anne Natalia Almeida de Oliveira

Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera Floribunda

NATAL,RN

2015

Anne Natalia Almeida de Oliveira

Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera floribunda

NATAL,RN

2015

Monografia apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Química.

Orientadora: Profª. Drª. Renata Mendonça Araújo

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN Biblioteca Setorial do Instituto de Química

Oliveira, Anne Natália Almeida de.

Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera floribunda/ Anne Natália Almeida de

Oliveira. – Natal, RN, 2015.

62 f. : il.

Orientadora: Renata Mendonça Araújo.

Monografia (Graduação em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra.

1. Bredemeyera floribunda – Monografia. 2. Polygalaceae – Monografia. 3. Raiz-

de-cobra – Monografia. I. Araújo, Renata Mendonça. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UFRN/BSE- Instituto de Química CDU 54:615 (02)

Anne Natalia Almeida de Oliveira

Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera floribunda

Monografia apresentada ao Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Bacharel em Química, na área de concentração em Química Orgânica.

Aprovada em : ___/___/___

_________________________________________________________

Profa. Dra. Renata Mendonça de Araujo (Orientadora)

_________________________________________________________

Prof. Dr. Fabricio Gava Menezes

_________________________________________________________

Ms. Daniele Silva dos Santos

Tu, Senhor, guardarás em perfeita paz

aquele cujo propósito está firme, porque em ti confia.

Isaías 26:3

AGRADECIMENTOS

Quero primeiramente agradecer a Deus por toda a força e capacitação para

realização deste trabalho, sem Ele, nada disso estaria acontecendo.

Quero também agradecer ao meu pai Paulo Roberto, que mesmo não

estando presente fisicamente, me deu as forças necessárias para que eu pudesse

seguir em frente.

Agradeço a minha mãe Kilza, que sempre enfrentou as dificuldades que a

vida lhe impôs, em busca do melhor para todos os seus filhos. Obrigada por não me

deixar desistir, obrigada por cada injeção de ânimo. Eu amo a senhora.

Á meu padrasto Maciel que me deu todo o suporte necessário para realização

deste sonho. Obrigada por me escolher e me acolher como sua filha, a você o meu

eterno agradecimento. Te amo.

À os meus irmãos, que direta ou indiretamente contribuíram para a realização

deste sonho. Eu amo vocês.

À os meus padrinhos Manoel Fontes e Nudia Fontes, por toda a ajuda, os

senhores contribuíram muito para a realização deste sonho. Amo vocês.

À Deusiely Avelar, por sempre estar pronta para me ajudar, por ouvir as

minhas reclamações, não me deixar desistir e acreditar no meu potencial. Muito

obrigada

À Sheeza Duarte, que está comigo desde o primeiro semestre, me ajudando

em tudo, me aconselhando e o mais importante, acreditando no meu potencial

quando eu não acreditava mais. Muito obrigada.

Aos grandes e inesquecíveis amigos: Jéssica Santana, Ângela Luciana e

Taiannie Soriano que nas horas de sufoco, estiveram ali dizendo que no final tudo

daria certo.

À minha orientadora Renata Mendonça, pela a força, pela a amizade e pela

orientação nesses 4 anos, que certamente contribuíram para o meu crescimento

como profissional. Obrigada por sempre acreditar no meu potencial.

Aos companheiros de laboratório desde os antigos até os mais recentes, em

especial aos meus colegas de área: Gizely, Marcela, Rusceli, Vanessa, Kleiton,

Nara, Daniele e Fatima. Também aos meus vizinhos de pesquisa, os alunos da

síntese: Erivaldo Paulino, Edson Lima, Jannielly, Lilian e Djalan.

À CNPq e UFRN.

RESUMO

Certas espécies de plantas são utilizadas popularmente para tratar

acidentes com animais peçonhentos, e seus estudos se mostram interessantes do

ponto de vista fitoquímico, muitas vezes contribuindo para o isolamento e

identificação de compostos biologicamente ativos. A espécie Bredemeyera

floribunda Willd, pertencente à família Polygalaceae, é uma destas espécies

conhecida popularmente como “raiz de cobra” devido ao seu uso como antiofídico.

Além de suas propriedades antiofídicas, também é conhecida por suas propriedades

expectorante, diurética e hipotensiva. O estudo cromatográfico desta planta resultou

no isolamento de dois metabolitos secundário, a primeira um flavonoide rutina e a

segunda uma xantona, denominada 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona. Indicou

também a presença de açúcares, além de uma fração contendo uma mistura de

duas saponinas. Essas com um estimado valor biológico, devido às várias atividades

desenvolvidas por elas e por isso incentivam a continuação desse trabalho. A

determinação estrutural dos metabólitos secundários isolados foi realizada através

das técnicas: Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C, uni e bidimensionais e

comparação com dados de RMN da literatura. O estudo anti-hemorrágico mostrou

atividade para o extrato da planta, mas não para o constituinte majoritário, o

flavonóide rutina.

Palavras-chave: Bredemeyera floribunda. Polygalaceae. “raiz-de-cobra”.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Bredemeyera floribunda Willd........................................................... 17

Figura 2 - Fotografia de Bothrops jararacussu.................................................. 18

Figura 3 - Esqueleto base da xantona............................................................... 19

Figura 4 - Estrutura básica da saponina característica da família

Polygalaceae.....................................................................................

25

Figura 5 - Bredemeyerosídeo C da espécie B.

Floribunda..........................................................................................

26

Figura 6 - Bredemeyerosídeo D da espécie B. Floribunda................................ 26

Figura 7 - Esqueleto básico do núcleo xantona................................................. 27

Figura 8 - Espectro de RMN 1H (MeOD, 400 MHz) de B1.................................. 42

Figura 9 - Expansão do espectro RMN 1H (MeOD, 400 MHz) entre δ 6,19 e

7,67 da B1.........................................................................................

43

Figura 10- Espectro de RMN 13C (MeOD, 100 MHz) de B1................................ 44

Figura 11- Espectro de HSQC (C5D5N, 500 MHz) de B1.................................... 45

Figura 12- Estrutura do flavonóide Rutina (B1) .................................................. 46

Figura 13- Espectro de RMN 13C (D2O, 125 MHz) de B2................................... 48

Figura 14- Espectro RMN 1H (D2O, 500 MHz) de B2.......................................... 49

Figura 15- Espectro de RMN 1H (DMSO, 300 MHz) de B3................................. 51

Figura 16- Espectro de RMN 13C (DMSO, 75 MHz) de B3............................................ 52

Figura 17- Espectro de HSQC (DMSO, 500 MHz) de B3.................................... 53

Figura 18- Estrutura da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona.............................. 54

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Dados da obtenção dos extratos de B. floribunda............................. 32

Tabela 2 - Dados da obtenção dos extratos após a partição de B. floribunda... 33

Tabela 3 - Dados finais da B1............................................................................. 34

Tabela 4 - Dados finais de B2............................................................................. 36

Tabela 5 - Dados finais de B3............................................................................. 38

Tabela 6 - Dados de RMN 1H (MeOD, 400 MHz) e 13C (MeOD, 100 MHz) de

B1 e dados da literatura de MOURA et al., 2011..............................

48

Tabela 7 - Dados de RMN 1H e 13C da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona (SILVEIRA et al., 1995)......................................................................

54

LISTA DE ABREVIATURAS

BFRE - Extrato etanólico da raiz de Bredemeyera floribunda

BFRMA - Extrato da raíz de Bredemeyera floribunda em metanol/água

(70:30)

BFTE - Extrato etanolico do talo de Bredemeyera floribunda

CCD - Cromatografia de Camada Delgada

CENAUREMN-

UFC -

Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância

Magnética Nuclear da Universidade Federal do Ceará

CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

DMSO - Dimetilssulfóxido

HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC - Heteronuclear Single Quantum Correlation

MS Ministério da Saúde

PBS - Veneno de B. jararacussu em solução salina

RMN - Ressonância Magnética Nuclear

SAB - Soro antibotrópico

SINAN- Sistema de Informação de Agravos de Notificação

SUS- Sistema Único de Saúde

VBju - Veneno de Bothrops jararacussu

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...................................................................................... 13

1.1 PLANTAS MEDICINAIS ....................................................................... 13

1.2 ACIDENTES OFÍDICOS ...................................................................... 14

2 OBJETIVOS......................................................................................... 16

2.1 Objetivo geral........................................................................................ 16

2.2 Objetivos específicos............................................................................ 16

3 CONSIDERAÇÕES.............................................................................. 17

3.1 SOBRE FAMÍLIA POLYGALACEAE.................................................... 17

3.2 SOBRE BREDEMEYERA FLORIBUNDA WILLD................................. 17

4 BOTHROPS JARARACUSSU............................................................. 18

5 PRINCIPAIS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ISOLADOS DO

GÊNERO BREDEMEYERA.................................................................

20

5.1 XANTONAS........................................................................................... 20

5.2 SAPONINAS.......................................................................................... 25

5.3 FLAVONOIDE........................................................................................ 28

6 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.................................................... 30

6.1 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS...................................................... 30

6.2 METODOS ESPECTROSCOPICOS..................................................... 31

6.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de

Hidrogênio (RMN 1H) e de carbono-13 (RMN 13C)............................

31

6.3 MATERIAL VEGETAL...........................................................................

32

6.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS............................................................. 32

6.5 PARTIÇÃO LIQUIDO/LIQUIDO............................................................. 33

7 ESTUDO FITOQUIMICO DE BREDEMEYERA FLORIBUNDA........... 34

7.1 FRACIONAMENTO CROMOTOGRÁFICO DO EXTRATO BFRE........ 34

7.2 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO BFRMA/C.. 36

7.3 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO BFTE......... 38

8 TESTES BIOLÓGICOS......................................................................... 40

8.1 ENSAIOS IN VIVO PARA ATIVIDADE HEMORRÁGICA...................... 40

9 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ 41

9.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B1.................................................. 45

9.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B2.................................................. 48

9.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B3.................................................. 51

10 ATIVIDADES BIOLOGICAS................................................................. 55

10.1 ATIVIDADE HEMORRÁGICA................................................................ 55

11 CONCLUSÃO........................................................................................ 56

REFERÊNCIAS..................................................................................... 57

13

1 INTRODUÇÃO

1.1 PLANTAS MEDICINAIS

A utilização de plantas como medicamento é tão antiga quanto a própria

existência do homem. Há relatos da utilização de plantas medicinais na terapêutica

por várias civilizações antigas, como chinesas, assírias e egípcias. Os egípcios, em

seus papiros de 2.300 a.C. já mencionavam vários nomes de substâncias, ou nomes

de preparações como: mirra, ópio, aloe, cássia, dentre outras, que eram utilizadas

em atividades, como o embalsamamento de múmias (VOEKS, 2004).

No Brasil, o uso de plantas medicinais e a automedicação, práticas

comuns que se inserem nas circunstâncias analisadas anteriormente, podem

incluir fatores como crenças, carência econômica, dificuldade de acesso à

assistência médica ou ainda por influência da mídia, que promove os produtos

que contém em suas formulações diversos componentes naturais (ARRAIS et

al.,1997; LOYOLA-FILHO et al., 2002; SCHENKEL et al., 2004).

O governo brasileiro aprovou em 2006 duas políticas públicas que

inserem no Sistema Único de Saúde (SUS) a utilização das plantas medicinais

e dos fitoterápicos. A Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos

têm como objetivo geral a garantia de acesso seguro e racional de plantas

medicinais e fitoterápicos, promoção do uso sustentável da biodiversidade e

desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional (BRASIL, 2006a)

Até metade do século XX, antes do crescimento da síntese química, as

plantas medicinais representavam a base da terapia medicamentosa. Ainda hoje,

medicamentos obtidos a base de plantas são amplamente utilizados na terapêutica.

Podemos citar como um exemplo clássico a Papaver somniferum L.

(Papaveraceae), popularmente conhecida como papoula, usada para produção do

ópio, que tem como principal componente a morfina, substância há muito tempo

empregada para combater a dor (FOGLIO et al., 2006).

Algumas plantas medicinais representam uma importante fonte de

compostos bioativos com capacidade de auxiliar diretamente no tratamento de

envenenamentos ofídicos, ou complementar a utilização da soroterapia tradicional.

Sendo assim, pessoas do mundo todo se utilizam de plantas para tratar

acidentes ofídicos, principalmente indígenas e residentes de zonas rurais. (MORS et

al., 2000; SOARES et al., 2009).

14

O emprego de plantas no tratamento de acidentes peçonhentos é uma prática

comum em vários povos do mundo, principalmente em regiões de difícil acesso ao

soro anti-ofídico. Extratos de plantas têm recebido considerável atenção como

antídotos alternativos, tendo algumas plantas sua atividade antiofídica relatada,

como Curcuma longa (FERREIRA et al, 1992), Casearia sylvestris (BORGES et al,

2001) e Bauhinia forficata (OLIVEIRA et al, 2005).

1.2 ACIDENTES OFÍDICOS

O emprego de plantas medicinais para o tratamento em casos de acidentes

ofídicos se dá há vários séculos. Curandeiros em todo o mundo relatam que extratos

aquosos ou etanólicos de plantas medicinais, tem capacidade de aliviar o edema e a

hemorragia (OTERO et al., 2000). A aplicação tópica da planta na área da picada,

mastigar as folhas ou cascas, ou ainda ingerir os extratos ou decocções são alguns

procedimentos realizados com o intuito de neutralizar a atividade do veneno (MEBS,

2000).

Acidentes com serpentes peçonhentas podem ser considerados preocupantes

para a saúde pública, principalmente em regiões tropicais e subtropicais tais como,

África, Ásia, Oceania e América Latina, por ocorrerem com maior frequência,

causando considerável morbi-mortalidade (PINHO et al., 2004; CRUZ et al., 2009).

Segundo dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação

(SINAN) do Ministério da Saúde (MS), foram registrados entre os anos de 2000 a

2013, um total de 360.506 casos de acidentes envolvendo serpentes peçonhentas,

com uma média de 14,0 casos a cada 100.000 habitantes, resultando em 1.487

óbitos (BRASIL, 2015). Em torno de 90% desses acidentes são causados por

serpentes do gênero Bothrops, com nomes populares tais como: jararaca,

jararacussu, urutu, caiçaca e comboia (SANTORO et al., 2008).

Oficialmente, os acidentes ofídicos são tratados exclusivamente por

soroterapia, que consiste na administração de anticorpos que auxiliam a neutralizar

as toxinas da peçonha. Um dos fatores limitantes desse tratamento é que em alguns

casos, as pessoas que são mordidas residem em local afastado do lugar onde

ocorre a administração do soro antiofídico. E consequentemente, a ação do soro se

torna limitada, pois devido ao extenso tempo transcorrido até o atendimento, a

peçonha já destruiu grande parte dos tecidos (CARDOSO et al., 2003).

15

A soroterapia, mesmo administrada em tempo hábil, é eficaz na neutralização

de efeitos sistêmicos, mas tem limitações quanto a neutralização de danos teciduais

locais (MELO et al., 2007). Pesquisas têm sido realizadas com o intuito de encontrar

tratamentos alternativos para casos de pacientes que sofreram acidentes ofídicos,

tais como: o uso de plantas medicinais, terapia com irradiação a laser e, ainda, de

terapias baseadas no emprego de anticorpos recombinantes humanos, visando o

tratamento de danos locais e promovendo efeitos anti-inflamatórios, alívio da dor e

aumento da regeneração do tecido danificado (BARBOSA et al., 2008).

São produzidos os seguintes soros antibotrópicos: antibotrópico

pentavalente, produzido a partir dos venenos de Bothrops jararaca (50%), Bothrops

jararacussu, Bothrops alternatus, Bothrops moojeni e Bothrops neuwedii (12,5%

cada); antibotrópico-crotálico, acrescentando-se soro anticrotálico (Crotalus durissus

terrificus) ao soro antibotrópico pentavalente; antibotrópico-laquético (Lachesis muta)

e antibotrópico-laquético-crotálico (ARAÚJO et al., 2008).

As raízes de B. floribunda são utilizadas amplamente no Brasil,

especialmente no Nordeste, sob a forma de infusões, chás e outras preparações

para o tratamento de diversas enfermidades, principalmente em acidentes ofídicos,

cálculo renal e hipertensão, infecções da pele, disenteria amebiana, reumatismo e

manifestações sifílicas (BEVEVINO et al., 1994).

Os estudos fitoquímicos realizados com esta espécie constataram que seus

principais constituintes são saponinas, xantonas e flavonóides. Desses, as

saponinas constituem a classe de substâncias mais interessantes, (exemplificadas

pelos Bredemeyerosídeos B, C e D, substâncias que apresentaram forte atividade

antiofídica (SILVEIRA et al., 1995; PEREIRA et al., 1996; DAROS et al., 1996).

16

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Contribuir para o conhecimento químico e farmacológico da espécie

Bredemeyera floribunda Willd e testar a atividade hemorrágica do extrato e

substâncias isoladas.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Preparar extratos orgânicos e aquosos das raízes de Bredemeyera floribunda;

Particionar os extratos orgânicos obtidos por meio de partição líquido/líquido

e/ou cromatografia em gel de sílica;

Isolar os metabólitos secundários através de métodos apropriados, como

técnicas de cromatografia em coluna (adsorção e/ou exclusão molecular)

Identificar os metabólitos secundários presentes nas frações;

Elucidar estruturalmente os compostos isolados por meio de técnicas

espectroscópicas como RMN 1H e 13C uni e bidimensionais e comparação

com a literatura.

Testar a atividade hemorrágica do extrato, frações e substâncias isoladas

17

3 CONSIDERAÇÕES

3.1. SOBRE A FAMÍLIA POLYGALACEAE.

A família Polygalaceae engloba alguns gêneros, dentre eles o Bredemeyera,

com espécies encontradas nas Américas Central e do Sul e nas Índias Ocidentais.

No Brasil, este gênero é representado por 14 espécies que estão espalhadas desde

a região Nordeste até o estado do Paraná, com a maioria ocorrendo entre os

estados do Amazonas e Minas Gerais. Entretanto, consta na literatura estudos

incluindo a planta em listagens também da região Sul (LUDTKE et al., 2008).

Espécies desta família são conhecidas por conter compostos químicos que

exibem atividades analgésica, expectorante, sedativa, antifúngica, entre outras. A

família também tem sido alvo de estudos fitoquímicos, nos quais já foram descritos

saponinas, xantonas, derivados de pironas, cumarinas, ácidos graxos, fenóis e

alcaloides.

Duas espécies deste gênero são encontradas no Ceará, sendo as duas

denominadas pelo mesmo nome popular, Bredemeyera floribunda Willd., encontrada

na serra de Ibiapaba, e Bredemeyera brevifolia Klotzsch., encontrada na chapada do

Araripe (MATOS, 2007).

3.2 SOBRE A ESPÉCIE BREDEMEYERA FLORIBUNDA WILLD.

Conhecida popularmente por pacari, botica-inteira, marfim-de-rama, pau-

rendoso, pau-caixão, pau-gemada, laça-vaqueiro, raiz-de-cobra e raiz-de-joão-da-

costa. Duas espécies deste gênero são encontradas no Ceará, sendo as duas

denominadas pelo mesmo nome popular, Bredemeyera floribunda Willd., encontrada

na serra de Ibiapaba, e Bredemeyera brevifolia Klotzsch., encontrada na chapada do

Araripe (MATOS, 2007).

Bredemeyera floribunda Willd Figura 1 é uma trepadeira lenhosa e pertence à

família Polygalaceae. Possui folhas simples e glabras de 7-10 centímetros de

comprimento. Suas flores, reunidas em vistosas inflorescências, são alvacentas com

as asas amarelas ou vermelhas e perfumadas. As raízes têm casca espessa quase

esponjosa, amarga e espumígea quando agitadas com água (MATOS, 2007).

18

O estudo da espécie é bastante extenso, portanto várias classes de

substâncias já foram identificadas e isoladas das suas raízes, como xantonas,

saponinas e flavonoides.

Figura 1 - Bredemeyera Floribunda Willd.

Fonte: Profº Francisco José de Abreu Matos, Horto de Plantas Medicinais, Campus do Pici, UFC.

4 BOTHROPS JARARACUSSU

A Bothrops Jararacussu é responsável por mais de 80% dos acidentes

peçonhentos no Brasil (BRASIL, 2015).

No território brasileiro, o gênero Bothrops (família Viperidae, subfamília

Crotalinae) possui 20 espécies já classificadas. São consideradas solenóglifas, pois

os dentes inoculadores de veneno situam-se na parte anterior do maxilar. Dentro

desse gênero, as serpentes da espécie B. jararacussu podem alcançar maior

comprimento (até 1,8 m) e produzem maior quantidade de veneno, predominando

nas regiões Sul e Sudeste do país (ZENI et al., 2007; BRASIL, 2015). Esta espécie

representada na Figura 2 é conhecida popularmente como urutu dourado ou

surucucu tapete e pode atingir até 22 centímetros de diâmetro.

É encontrada em florestas tropicais, pântanos e margens de rios do Brasil,

em várias ilhas na região sul do Rio Grande do Sul, nordeste da Argentina e sul da

Bolívia e do Paraguai (MILANI et al., 1997).

19

Figura 2 - Fotografia de Bothrops jararacussu.

Fonte: http://www.panoramio.com/photo/9179345.

A produção de veneno dessa espécie é a maior do gênero, podendo atingir 1

g de peso seco (MILANI et al., 1997).

20

5 PRINCIPAIS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ISOLADOS DO GÊNERO

BREDEMEYERA

5.1 XANTONAS

A palavra xantona é derivada do grego e significa amarelo, cor apresentada

pela grande maioria desses constituintes químicos (ROBERTS, 1961). A xantona,

ou quimicamente 9H-xanten-9-ona, é estruturalmente formada por dois anéis

benzênicos (A e B) e uma γ-pirona central (C), conferindo um arranjo simétrico a

esse tipo de esqueleto. A classe das xantonas abrange uma importante série de

heterociclos oxigenados bastante estudados quimicamente (SULTANBAWA, 1980).

Neste desenho esquemático Figura 3, as posições numeradas de 1-4 e de

5-8 correspondem aos carbonos com h idrogên ios substituíveis, resultando em

uma variedade de derivados xantônicos, que podem ser obtidos por meios naturais

(ROBERTS 1961; VIEIRA et al., 2005) ou por rotas sintéticas (SOUSA et al.,

2005). As demais posições não estão susceptíveis a introdução de nenhum

grupamento químico, pois já são completamente substituídas.

Figura 3 - Esqueleto básico do núcleo xantona

O

O

B A

8

7

6

5

8a 8b

4b 4a

1

2

3

4

Fonte: Autor, 2015

21

As xantonas possuem várias atividades biológicas e medicinais, como por

exemplo bactericida, antiviral, antioxidativa, anti-inflamatória, anti-hipertensiva,

antitrombótica, anticâncer, citotóxica, coagulante, antifúngica, entre outras (PERES

et al., 1997).

As plantas produzem esses metabólitos aparentemente para o controle do

estresse oxidativo, causado pela incidência da luz solar e oxigênio. Assim, esses

metabólitos representam uma interessante fonte de novos compostos com

atividade antioxidante, e muitos estudos estão sendo realizados com o objetivo

de identificar novas substâncias antioxidantes com baixa toxicidade

(SCARTEZZINI et al., 2000).

Geralmente, a alta atividade antioxidante de derivados fenólicos, como

hidroxixantonas, é atribuída aos substituintes OH que atuam como poderosos

doadores de próton. Isso ocorre devido à deslocalização de elétrons ao longo da

molécula estabilizando os radicais fenoxi R–O.

A presença de hidroxilas no núcleo xantona, além de contribuir para o

aumento da atividade antioxidante, promove também a captura de radicais

livres, e atuação como quelante de metais, bem como no impedimento da

oxidação lipídica. (SATO et al., 1992). Essa propriedade tem implicado na

melhora de sua ação hepatoprogressiva (FERNANDES et al., 1995; MARTINEZ et

al., 2001) e quimiopreventiva ao câncer (MACKEEN et al., 2000; PAULETTI et

al., 2003), além de antiinflamatória (MADAN et al., 2002; JIANG et al., 2004).

Para ilustrar alguns integrantes deste grupo, no Quadro 1 estão

representados seis substâncias conhecidas e bastante estudadas

biologicamente. As xantonas e seus respectivos grupos são: fusarindina

(simples), mangiferina (glicosilada), mangostina (prenilada), kielcorina

(xantonolignóide), Globulixantona E (bis-xantona) e xantofulvina (miscelânea).

22

Quadro 1: Alguns representantes de cada classe das xantonas.

O

OCH3 OH

OHOH

87

6

5

1

2

3

4

O

O

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH

OH

O

O

H3CO

OH

OH

CH3

CH3

OH

CH3 CH3

O

O

O

OCH3

O

O

OH OH

OCH3

Fusarindina (simples)

Mangiferina (glicosilada)

Mangostina (prenilada)

Kielcorina (xantonolignóide)

23

O

OH OH

OH

OCH3

O

O

O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

O

O COOH

OH

OH

CH3 OO

OH

OH

COOHMeOCO

Fonte: Autor, 2015

Do gênero Bredemeyera, foram isoladas 5 xantonas, duas das quais foram

isoladas de Bredemeyera brevifolia e três isoladas de Bredemeyera floribunda. No

Quadro 2 abaixo estão apresentadas as xantonas isoladas para este gênero.

(OLIVEIRA, 2000; SILVEIRA et al, 1995).

Globulixantona E (bis-xantona)

Xantofulvina (miscelânea)

24

Quadro 2 : Xantonas isoladas do gênero Bredemeyera

O

OO

O O

O

OCH3

O

OCH3

OH

OH

OCH3

OCH3

O

O

H3CO

OH

OH

O

OH

OCH3

O

OCH3

OH

OH

OH

OCH3

O

O

O

O

CH3 OCH3OCH3

H3CO

B. brevifolia B. brevifolia

B. floribunda B. floribunda

B. floribunda

Fonte: Autor, 2015

1-metoxi-2,3,7,8-dimetilenodioxixantona

1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona

1,3,6-trihidroxi-2,7-dimetoxixantona 1,3,7-trihidroxi-4,8-dimetoxixantona

1,7,8-trimetoxi-2,3-metilenodioxixantona

25

5.2 SAPONINAS

As saponinas constituem uma classe química bastante heterogênea, cujo

nome deriva de sua propriedade de formação de espuma em solução aquosa

(MILGATE et al., 1995). Estão amplamente distribuídas em diversas espécies

vegetais abrangendo aproximadamente 100 famílias (OLESZEK, 2002) e alguns

gêneros de esponjas marinhas. Quimicamente são constituídas por uma porção

hidrofóbica triterpênica ou esteróide ligada a uma ou mais cadeias de açúcares, em

geral, glicose, galactose, ácido glicurônico, xilose ou metilpentose (FRANCIS et al.,

2002) cuja massa molecular pode variar entre 600 e 2000 Da, aproximadamente

(OLESZEK, 2002; SCHENKEL et al, 2003).

Saponinas são subdivididas em duas classes, triterpênicas e esteroidais,

ambas derivadas do óxido de esqualeno, com 30 átomos de carbono (C30). A

diferença entre estas duas classes é que as saponinas esteroidais têm 3 grupos

metila a menos (C27), enquanto as saponinas triterpênicas se mantêm com 30

átomos de carbono. (RIBEIRO, 2012)

As saponinas mais comumente encontradas na natureza são as triterpênicas

com agliconas de 30 átomos de carbono. Nesta classe, 50% apresentam o

núcleo hidrofóbico do tipo oleano (HILLER, 1987).

As saponinas podem ser subdivididas também em função do número de

cadeias de açúcares ligados. As que apresentam uma única cadeia de açúcar

ligado à aglicona, via ligação éter na posição C3, são as monodesmosídicas.

Quando apresentam duas ou três cadeias de açúcares são classificadas como

bidesmosídicas ou tridesmosídicas, respectivamente (HILLER, 1987; SCHENKEL

et al., 2003).

Embora as saponinas tenham sido utilizadas por séculos como detergente

doméstico (SPARG et al., 2004), devido a sua característica lipofílica com a

presença de uma aglicona sóluvel em lipídeo e das unidades solúveis em água nas

cadeias laterais (GÜÇLÜ-ÜNTÜNDAĞ et al., 2007), as novas descobertas acerca

das propriedades anticâncer das saponinas de origem vegetal tem itensificado as

produções científicas na área. Além disso, as saponinas também são bastante

conhecidas por possuírem complexos metálicos de ferro, zinco e cálcio (MILGATE et

al., 1995).

26

Do mesmo modo que as indústrias farmacêutica, alimentícia e cosmética

vêm utilizando as saponinas, outros tipos de indústrias também exploram o potencial

desse metabólito. Elas o fazem através de subprodutos ricos em saponinas

(derivados da produção do petróleo), utilizando-os como vermífogo botânico e

gerindo seletivamente minhocas lançadas em campos de golfe e outros esportes

(AUGUSTIN et al., 2011).

A maior parte das saponinas da família Polygalaceae foi isolada do extrato

bruto das raízes das plantas obtido a partir de etanol/água 70%. As saponinas desta

família possuem uma estrutura bem característica e intimamente relacionada,

constituindo triterpenóides pentacíclicos oxigenados, como mostra a Figura 4. Além

disso, a maior parte é composta por glicosídeos bidesmosídicos baseadas em

agliconas com uma ou duas glicoses em C3 e de um a seis açúcares em C28, sendo

acilados pelos ácidos para, di ou trimetoxicinâmico e/ou ácido acético (LACAILLE-

DUBOIS et al., 2005).

Figura 4 - Estrutura básica da saponina característica da família Polygalaceae

OH

O

H

CH3CH3

R1

OHR2 CH3

CH3 CH3

R3

1

2

3 4

5

10

6

7

8

9

11

12

13

14

15

1817

16

19 20 21

22

2825

2324

27

26

29 30

Fonte: Autor, 2015

Três saponinas já foram isoladas da espécie Bredemeyera floribunda, sendo

conhecidos como Bredemeyerosídeos B, C Figura 5 e D Figura 6. Destes, não foi

encontrada a estrutura do Bredemeyerosídeo B. (PEREIRA et al., 1996).

27

Figura 5 - Bredemeyerosídeo C da espécie B. Floribunda

Fonte: Autor, 2015

Figura 6 - Bredemeyerosídeo D da espécie B. Floribunda

Fonte: CAVALCANTE, 2015.

28

5.3 FLAVONOIDES

Os flavonoides fazem parte de uma subclasse de polifenóis, caracterizados

por possuir quinze átomos carbonos no seu esqueleto básico. A sua estrutura geral

é formada por dois anéis aromáticos (anel A e anel B), com mais três átomos de

carbono que unem os dois anéis e formam um terceiro oxigenado entre eles (anel

C). Compostos que possuem como esqueleto básico a estrutura apresentada na

Figura 7 são denominados flavonoides. Quando apresentam uma unidade

glicosídica ou O-glicosídica ligadas a algum átomo de carbono da cadeia, são

classificados como flavonoides glicosilados. Esses compostos agem como

antioxidantes, não apenas pelo seu poder doador de hidrogênio ou elétrons, mas

também devido a seus radicais intermediários estáveis, que impedem a oxidação de

vários ingredientes de alimentos, por exemplo. (BRAND-WILLIAMS, 1995)

Figura 7 - Esqueleto base de um flavonoide

O

2

3

45

6

7

8

1' 5'

4'2'

A

B

C

Fonte: Autor, 2015

Os flavonoides podem ainda ser divididos entre diferentes classes, o quadro

3 exemplifica as principais subclasses reportadas na literatura e suas respectivas

estruturas moleculares.

29

Quadro 3 : Subclasses dos flavonoides

O

O

O

O

OH

O

OH

O

O

O+

OH

O

O

Fonte: Autor, 2015

Flavanona

Flavonol

Flavanol

Antocianina

Isoflavona

Flavona

30

6 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

6.1 MÉTODOS CROMATOGRAFICOS

Nas cromatografias de adsorção foram utilizadas gel de sílica 60 Ø 63-200 μm

e de sílica 60 para coluna cromatográfica flash (Ø 400 - 200 μm) da marca Ultra

Chem. O comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com as

alíquotas das amostras e as quantidades de gel de sílica utilizadas. As colunas

utilizadas na cromatografia de adsorção sob pressão média (cromatografia flash)

foram de vidro resistente à pressão e continham bulbos no ápice, para

armazenamento do solvente.

Na Cromatografia de Exclusão Molecular, os fracionamentos foram

efetuados em gel de dextrana Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals,

utilizando-se como eluente metanol.

Para cromatografia de camada delgada (CCD) utilizou-se cromatoplacas de

gel de sílica 60 (Ø 2-25 μm) sobre poliéster e/ou alumínio T-6145 da marca Sigma

Chemical CO.

Os eluentes utilizados foram: hexano, clorofórmio, diclorometano, acetato de

etila, e metanol, puros ou combinados em proporções crescentes de polaridade.

A revelação das substâncias nas cromatoplacas analíticas foi realizada por

imersão em solução de vanilina (C8H8O3) e ácido perclórico (HClO4) em etanol

(C2H6O), seguido de aquecimento em chapa a 100 0C por aproximadamente 5

minutos, ou ainda por exposição a vapores de iodo e observação sob luz UV.

31

6.2 MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS

6.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e de carbono-13 (RMN 13C)

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e

Carbono-13 (RMN 13C), uni e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetros

Bruker, modelo Avance DRX-500 e processados no programa Bruker TopSpin

versão 3.0, em computador com windows 7.0, pertencentes ao Centro Nordestino de

Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal do

Ceará (CENAUREMN-UFC).

Os experimentos foram realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500 e

DPX-300. O tipo de sonda variou conforme o tipo de técnica: sonda dual de 5 mm

com detecção direta (experimentos unidimensionais) e sonda multinuclear de 5 mm

com detecção inversa (experimentos bidimensionais). As amostras foram dissolvidas

em alíquotas de 0,6 mL de solvente deuterado: clorofórmio (CDCl3), água (D2O) e

metanol (CD3OD), Tedia Brazil. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em

partes por milhão (ppm) e referenciados, no caso dos espectros de Hidrogênio,

pelos picos dos hidrogênios pertencentes às moléculas residuais não-deuteradas

dos solventes deuterados utilizados: clorofórmio (δ 7,27), metanol (δ 3,31), água (δ

4,80), piridina (δ 8,73, 7,59 e 7,22) e DMSO (δ 2,71). Nos espectros de 13C, os

deslocamentos químicos foram referenciados pelos picos centrais dos carbonos-13

dos solventes: clorofórmio (δ 77,23), metanol (δ 49,15), piridina (δ 150,2 ) e DMSO (δ

40,1).

As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H foram

indicadas segundo a convenção: s (singleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t

(tripleto), q (quarteto), m (multipleto).

Os microprogramas utilizados para a aquisição dos dados foram: 1H (zg),

13C-CPD (zgpg), 13C-DEPT 135 o (dept135), gs-COSY (cosygp), gs-HSQC

(hsqcgpph), gs-HMBC (hmbclpndqf).

A técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com

ângulos de nutação de 135 o, CH e CH2 com amplitudes em oposição aos CH2, e 90

o, somente CH, foi utilizada na determinação do padrão de hidrogenação dos

carbonos em RMN 13C, descrito segundo a convenção: C (carbono não-

32

hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2 (carbono metilênico ou metilidênico) e

CH3 (carbono metílico). Os carbonos não-hidrogenados foram caracterizados pela

subtração do espectro DEPT 135 do espectro BB.

Os experimentos bidimensionais de correlação heteronuclear (HSQC e

HMBC), realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500, foram efetuados em sonda

multinuclear de 5 mm, com detecção inversa, empregando-se gradiente de campo,

posicionado no eixo z e magnitude de 10 A. Os valores de J utilizados para os

experimentos pertinentes foram 1JH,C = 145, nJH,C = 7, onde n ≥ 2.

6.3 MATERIAL VEGETAL

As raízes e talos de Bredemeyera floribunda Willd utilizadas no estudo foram

coletadas na chapada Araripe, Ceará, em março de 2013. A planta foi identificada

por comparação com um espécime de B. floribunda, coletado em Julho de 2001 em

Macaíbas, região do Crato, no Ceará, e depositado no Herbário Prisco Bezerra, da

Universidade Federal do Ceará, com Nº de exsicata 30844.

6.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS

Após a coleta das raízes de Bredemeyera floribunda e do talo, estas foram

trituradas e colocadas em mariote contendo etanol e um outro contendo

metanol/água. Posteriormente o resíduo da planta foi filtrado com algodão, para

remoção de partículas maiores, e o solvente evaporado à pressão reduzida, dando

origem ao extrato etanólico das raízes de B. Floribunda, denominado BFRE, ao

extrato etanólico do talo chamado de BFTE e ao extrato hidroalcoólico denominado

BFRMA. Os extratos estão descriminados na Tabela 01.

Tabela 01 - Dados da obtenção dos extratos de B. floribunda

Fonte: Autor, 2015

Extratos Massa(g)

BFRE 20

BFTE 26,4

BFRMA 3,58

33

6.5 PARTIÇÃO LÍQUIDO/LÍQUIDO

O extrato bruto BFRMA (3,5817g) foi submetido à extração líquido-líquido,

utilizando como solventes hexano (C6H14), clorofórmio (CHCl3) e acetato de etila

(C4H8O2). Foram adicionados 80,0 mL de água e 30,0 mL de MeOH, e então esta foi

colocada em funil de separação, juntamente com 100,0 mL de hexano (4 x 25,0 mL)

então separou-se a solução hexânica (BFRMA/H). Em seguida, adicionou-se à fase

hidro-alcoólica 100,0 mL de clorofórmio (4 x 25,0 mL), e separou-se a solução

clorofórmica (BFRMA/C) para cada extrato bruto. Removida esta fração, adicionou-

se ao funil 40,0 mL de acetato de etila, separando então a solução (BFRMA/AC).

Logo após estes procedimentos, os resíduos hidro-alcoólicos foram reunidos. As

extrações com solventes foram concentradas em evaporador rotativo de baixa

pressão, originando seus respectivos extratos, como descriminados na Tabela 02.

Tabela 02 - Dados da obtenção dos extratos após a partição de B. floribunda

Fonte: Autor, 2015

Extratos Massa (g)

BFRMA/H 0,28

BFRMA/C 1,53

BFRMA/AC 0,58

34

7 ESTUDO FITOQUIMICO DE BREDEMEYERA FLORIBUNDA

7.1 FRACIONAMENTO DO EXTRATO BFRE

O extrato BFRE foi submetido a um processo de liofilização, resultando em

14g de pó amarelo, o qual foi submetido à cromatografia do tipo em gel de dextrana

Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals, utilizando-se metanol puro. Este

procedimento foi realizado quatro vezes, todas utilizando apenas metanol como fase

móvel. Para a primeira coluna utilizou-se uma massa de amostra de 3,3031g,

obtendo 17 frações; a segunda com massa 3,7477g, resultando em 14 frações; a

terceira com massa 3,4170g, obtendo 16 frações; por fim, a quarta com 3,5333g,

rendendo 13 frações. As frações obtidas foram analisadas por CCD e reunidas de

acordo com a sua semelhança, resultando em 5 frações denominadas A, B, C, D e

E, como apresentadas na Tabela 03 e no Fluxograma 1, abaixo. Estas frações

foram analisadas por RMN 1H para caracterização química inicial do extrato, depois

também por RMN 13C, quando constatou-se que a fração BFRE-D se tratava de um

flavonoide rutina, denominada B1.

Tabela 03 - Dados finais da B1

Fonte: Autor, 2015

Frações Finais Massa(g)

A 6,1 g

B 0,5g

C 0,9g

D 2,6g

E 3,2g

35

FLUXOGRAMA 1 : Procedimento experimental da B1

Fonte: Autor, 2015

RAIZ

1) Maceração

2) Liofilização

Extrato

Liofilizado

3) Sephadex LH-20

5) RMN

A B C D E

4) CCD

5) RMN 5) RMN 5) RMN 5) RMN

Saponina e

Sacarose

E

Sacarose

E

Sacarose e

Rutina

E

B1

E

Flavonoide e

Rutina

E

36

7.2 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO BFRMA/C

O extrato BFRMA/C (1,5361g) foi submetido à cromatografia de exclusão

molecular em gel de dextrana Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals,

utilizando-se metanol puro. Este procedimento foi realizado cinco vezes, todas

utilizando apenas metanol como fase móvel. Para a primeira coluna utilizou-se uma

massa de 0,3031g, obtendo 11 frações; a segunda com massa 0,2477g, resultando

em 09 frações; a terceira com massa 0,3170g, obtendo 10 frações, a quarta com

0,331g, rendendo 10 frações, por fim a quinta com 0,313g. As frações obtidas foram

analisadas por CCD e reunidas de acordo com a sua semelhança, resultando em 3

frações denominadas A, B, C e D, como apresentadas na Tabela 04 e no

Fluxograma 3, abaixo. Após análise dos espectros de RMN 1H e 13C, constatou-se

que a fração B é uma saponina, ainda não totalmente identificada, denominada B2.

Tabela 04 - Dados finais da B2

Fonte: Autor, 2015

Frações Finais Massa(g)

A 0,2453g

B 0,3057g

C

D

0,2958g

0,3145g

37

FLUXOGRAMA 02: Procedimento experimental da B2

Fonte: Autor, 2015

TALO

Extrato

hidroalcolico

1) Maceração

2) Partição liquido/liquido

BFRMA/H BFRMA/C BFRMA/Ac

3) Sephadex LH-20

4) CCD

A B C

5) RMN

B2

38

7.3 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO BFTE

O extrato BFTE (26,4g) foi submetido a cromatografia de adsorção (coluna do

tipo filtrante), utilizando eluição gradiente com misturas binárias dos solventes

hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. Foram obtidas 20 frações, que foram

analisadas por CCD e reunidas de acordo com a sua semelhança. A fração 7

(0,8857g) apresentou-se promissora, sendo então submetida à cromatografia de

adsorção sob pressão média (coluna “flash”). Após este procedimento, a fração 08

foi analisada por CCD, como apresentadas no Fluxograma 3 e na Tabela 05

abaixo, posteriormente encaminhada para o RMN. Após análise dos espectros de

RMN 1H e 13C, constatou-se que a fração 08 tratava-se da 1,7-dihidroxi-3,4,8-

trimetoxixantona, denominada B3.

TABELA 05 - Dados finais da B3

Fonte: Autor, 2015

Frações Finais Massa(g)

01-02 0,2811g

03-04 0,0457g

05-07 0,0797g

08 0,0992g

09-10 0,0867g

11-14 0,0371g

15-16

17-18

19-20

0,129g

0,0237g

0,0025g

39

FLUXOGRAMA 03: Procedimento experimental da B3

Fonte: Autor, 2015

TALO Extrato

etanólico 1) Maceração

2) Coluna filtrante

20 frações

3) CCD

01-02 03-04 05-07 08 09-10 11-14 15-16 17-18 19-20

5) RMN

07

4) Coluna “flash”

B3

40

8 TESTES BIOLÓGICOS

Os testes biológicos do extrato das raízes de Bredemeyera floribunda,

frações e substâncias isoladas foram realizados no Laboratório de Farmacologia de

Venenos e Toxinas (LAFAVET) da UFC, pela mestranda Natacha Queiroz e por

Rafael Ximenez, sob a orientação da professora Helena Serra Azul Monteiro.

8.1 ENSAIOS IN VIVO PARA ATIVIDADE HEMORRAGICA

a) Grupos experimentais

I. Grupo veneno: animais tratados com 50 μg/animal de veneno de Bothrops

jararacussu (vBju) dissolvidos em 50μL de solução de NaCl 0,9%.

II - Grupo pré-tratado i.p.: animais tratados com o extrato de B. floribunda (BFRE;

150mg/kg, i.p.) 30 minutos antes da administração do veneno (50 μg/animal).

III – Grupo pré-tratado v.o.: animais tratados com o extrato de B. floribunda (BFRE;

150mg/kg, v.o.) 30 minutos antes da administração do veneno (50 μg/animal).

IV- Grupo pós-tratado i.p.: animais tratados com BFRE (150mg/kg, i.p.) 30 minutos

após a administração do vBju (50 μg/animal).

V - Grupo pós-tratado v.o.: animais tratados com BFRE (150mg/kg, v.o.) 30 minutos

após a administração do vBju (50 μg/animal).

VI - Grupo pré-incubado: animais tratados com BFRE (150mg/kg) e vBju (50

μg/animal), (1:3, p/p) pré-incubados por 15 minutos a temperatura de 37º C.

VII - Grupo controle com soro antibotrópico (SAB): animais tratados com SAB i.p.

(quantidade suficiente para neutralizar 500 μg de veneno) 30 minutos antes da

administração do vBju (50 μg/animal).

41

b) Procedimento Experimental

Camundongos machos Swiss, foram anestesiados com pentobarbital sódico

(50mg/kg i.p.) para posteriormente ter o dorso tricotomizado onde foi injetado por via

intradérmica 50 μL de uma solução contendo 50 μg de vBju. Os tratamentos foram

realizados conforme os grupos experimentais discriminados anteriormente.

Decorridas 2 horas para cada grupo, os animais foram sacrificados e a pele do dorso

foi removida. A superfície interna da pele foi examinada e fotografada. O tamanho da

área hemorrágica foi medido com o programa Image®, um software desenvolvido

por Wayne Rasband do Research Services Branch, National Institute of Mental

Health, Bethesda, Maryland. A área dos halos é contornada por meio de ferramentas

do programa e o resultado é transformado de pixels para mm². O tecido do dorso foi

coletado para análise histológica (ESMERALDINO et al., 2005).

42

9 RESULTADOS E DISCUSSÃO

9.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B1

Após os procedimentos cromatográficos realizados com o extrato etanólico

das raízes de B. floribunda, obteve-se 5,3 g de uma substância denominada B1, que

apresentou-se como um sólido alaranjado e solúvel em metanol.

O espectro de RMN 1H (MeOD, 500 MHz, Figura 8) apresentou absorções

características de hidrogênios de ligações glicosídicas entre δ 3,26 e 3,81 ppm. E

ainda, absorções características de hidrogênios aromáticos com deslocamento entre

δ 6,19 e 7,67 ppm.

Figura 8 - Espectro de RMN 1H (MeOD, 400 MHz) de B1

Fonte: Autoria própria, 2015

2

3456

7

89

10

1'

2'3'

4'

5'

6'

OO

O

HOH

HO

O

OH

OH

OH

O

O

HO

OH

OH

OH

O

1"

2"

3"4"

5"6"

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''6'''

43

Figura 9 - Expansão do espectro RMN 1H (MeOD, 400 MHz) entre δ 6,19 e 7,67 da B1

Analisando a região compreendida entre δ 6,19 e 7,67 (Figura 9), foi

possível identificar δ 6,19 (H6, d, J = 1,8 Hz) e δ 6,38 (H8) o qual não foi possível

calcular a constante de acoplamento, devido o sinal não apresentar multiplicidade.

Contudo a constante de acoplamento para o H6, além de outros sinais espectrais

como 13C, apontam para um acoplamento meta entre si. Foi possível também

visualizar os acoplamentos dos hidrogênios 5´ e 6´ localizados no anel B, com

deslocamentos δ 6,87 (H5’, d, J =6,7 Hz) e δ 7,62 (H6’, dd, J = 1,4 Hz e 6,7 Hz) ppm,

com acoplamento orto e meta. E neste mesmo anel temos o hidrogênio em δ 7,67

(H2’, d, J = 1,36 Hz), em um acoplamento meta com o hidrogênio 6’.

44

O espectro de RMN 13C (100MHz, MEOD, Figura 10) apresentou um sinal

em δ 18,0 ppm, característico de carbono metílico. Na região compreendida entre δ

68,6 e 104,8 ppm, há presença de carbonos com hibridização sp3 oxigenados,

característicos de carbonos de unidades glicosídicas, além de duas absorções

características de carbonos anoméricos em δ 102,5 (C-1’’’) e 104,8 (C-1’’). No

intervalo entre δ 105,7 até 166,0 ppm, foi observado absorções características de

carbonos sp2 pertencentes à anéis aromáticos. Além destes o espectro também

mostrou uma absorção característica de carbonila de cetona alfa-beta-insaturada em

δ 179,4 ppm.

Figura 10 - Espectro de RMN 13C (MeOD, 100 MHz) de B1

Fonte: Autoria própria, 2015

2

3456

7

89

10

1'

2'3'

4'

5'

6'

OO

O

HOH

HO

O

OH

OH

OH

O

O

HO

OH

OH

OH

O

1"

2"

3"4"

5"6"

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''6'''

45

A análise do espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear a

uma ligação (1H, 13C – HSQC) (Figura 11) corroborou com o padrão de

hidrogenação proposto para cada carbono (Tabela 5).

Figura 11 - Espectro de HSQC (C5D5N, 500 MHz) de B1

46

Todos esses dados indicados nos espectros de Ressonância Magnética

Nuclear, além da comparação com dados disponíveis na literatura (Tabela 5),

comprovam que o metabólito secundário denominado B1 se trata do flavonoide

rutina, (Figura 13) já descrito anteriormente (MOURA et al., 2011).

Figura 12 - Estrutura do flavonóide Rutina (B1)

Fonte: Autor, 2015

2

3456

7

89

10

1'

2'3'

4'

5'

6'

OO

O

HOH

HO

O

OH

OH

OH

O

O

HO

OH

OH

OH

O

1"

2"

3"4"

5"6"

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''6'''

47

Tabela 06 - Dados de RMN 1H (MeOD, 400 MHz) e 13C (MeOD, 100 MHz) de B1 e dados da literatura

de MOURA et al., 2011.

Fonte: Autor, 2015

C RMN 13C RMN 13C

MOURA et al.,

2011

RMN 1H

(int.,mult., JH,H)

RMN 1H

(int.,mult., JH,H)

MOURA et al., 2011

2 159,4 156,5

3 145,9 133,2

4 179,4 177,3

5 163,0 161,2

6 100,0 98,7 6,19 (1 H, d, J=1,4 Hz)

6,20 (1 H, d, J=2,1 Hz)

7 166,0 164,5

8 95,0 93,6 6,38 (1 H, d, J=1,4 Hz)

6,40 (1 H, d, J=2,1 Hz)

9 158,5 156,4

10 105,7 103,7

1’ 135,7 121,5

2’ 123,4 116,2 7,67 (1 H, d, 1,4 Hz) 7,53 (1 H, d, J=2,0 Hz)

3’ 117,8 115,2

4’ 149,8 148,5

5’ 116,1 115,2 6,87 (1 H, d, J=6,7 Hz)

6,83 (1 H, d, J=9,0 Hz)

6’ 123,2 121,0 7,62 (1 H, dd, J=1,4 Hz e J=6,7 Hz)

7,75 (1 H, dd, J=2,4 Hz e J=7,8 Hz)

1’’ 104,8 101,2

2’’ 77,2 75,8

3’’ 75,8 74,0

4’’ 71,4 69,9

5’’ 78,2 76,4

6’’ 68,6 66,9

1’’’ 102,5 100,7

2’’’ 72,3 70,5

3’’’ 72,1 70,3

4’’’ 74,0 71,8

5’’’ 68,9 68,2

6’’’ 18,0 17,6

48

9.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B2

Após os procedimentos cromatográficos realizados com o extrato aquoso

das raízes de B. floribunda, obteve-se também 0,300g de uma amostra denominada

B2, que apresentou-se como um cristal esbranquiçado e solúvel em metanol.

Esta fração foi submetida à análise por RMN 13C e o espectro (D2O, 500

MHz, Figura 13) obtido revelou tratar-se de uma mistura de saponinas.

Figura 13 - Espectro de RMN 13C (D2O, 100 MHz) de B2.

Fonte: Autoria própria, 2015

49

Embora o espectro seja claro em relação à presença de saponina

triterpênica glicosilada através de absorções características de carbonos sp3 entre δ

13,1 e 51,1. Além disso, os sinais dos carbonos sp2 em δ 125,5 (C-12) e 138,7 (C-

13) são característicos de aglicona do tipo presenegenina, já descritas na literatura

para esta espécie (VASCONCELOS, 2015). Os carboidratos foram observados na

região do espectro entre δ 60,7 e 83,7 e os carbonos anoméricos foram observados

entre δ 92,9 e 109,6. Do mesmo modo, o espectro ainda revelou a presença de 4

carbonilas em δ 175,6, 170,4, 170,3 e 169,57 que demonstraram mais uma vez que

esta fração se tratava de uma mistura de duas saponinas, já que as saponinas

relatadas na literatura possuem apenas duas carbonilas em seu esqueleto.

Figura 14 - Espectro RMN 1H (D2O, 500 MHz) de B2.

Fonte: Autoria própria, 2015

50

A análise desta fração permitiu a identificação de uma classe de substâncias

anteriormente isolada dessa espécie, as saponinas. Elas têm estimado valor

biológico, devido às várias atividades desenvolvidas por elas e por isso incentivam a

continuação desse trabalho.

9.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B3

A amostra B3 apresentou-se como um sólido amarelo, solúvel em clorofórmio,

que foi analisado por ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono

(RMN1H e RMN13C).

Figura 15 - Espectro de RMN 1H (DMSO, 300 MHz) de B3

Fonte: Autoria própria, 2015

O

O OH

OCH3

OCH3

OH

OCH3

8

7

6

5

8a 8b

4b 4a

1

2

3

4

51

O espectro de RMN1H (300 MHz, DMSO, Figura 15) revelou um sinal de

hidrogênio em região de campo baixo (δ 13,14 ppm), indicando presença de uma

hidroxila quelada, devido ao alto deslocamento observado no valor do sinal do

próton. Além destes sinais, havia também dois pares de dubletos centrados em δ

7,38 (1 H, J = 9,0 Hz) e δ 7,28 ppm (1 H, J = 9,0 Hz), indicando a presença de

hidrogênios aromáticos vizinhos, com acoplamento orto.

Também foi identificado um sinal singleto em δ 6,51, referente a hidrogênio

ligado a anel aromático protegido por efeitos ressonantes provenientes da hidroxila

ligada ao C-1 e C-2, o espectro evidenciou picos para absorções grupos metoxi, com

deslocamentos em δ 3,91, 3,80, 3,76 ppm. Após a verificação de todos os sinais dos

espectros, foi possível concluir que a substância em questão era uma xantona

trimetoxilada.

Figura 16 - Espectro de RMN 13C (DMSO 75 MHz) de B3

O

O OH

OCH3

OCH3

OH

OCH3

8

7

6

5

8a 8b

4b 4a

1

2

3

4

52

O espectro de 13C (75 MHz, DMSO, Figura 16) nos possibilitou identificar

treze carbonos com hidribização sp2, sendo três deles hidrogenados em δ 94,6,

113,3 e 124,4 e nove não hidrogenados em δ159,2, 114,6, 146,9, 114,7, 102,6,

145,5, 127,5, 146,9 e 149,3 como também uma absorção característica de carbonila

em δ 180,9. Indicou também a presença de três grupos metoxi, mostrando duas

absorções em δ 60,8 e δ 60,9, referente ao impedimento estérico que ambos os

grupos estão sofrendo. Por último, temos um sinal para um grupo metoxila

desimpedido em δ 56,4.

Através da análise do Espectro de RMN bidimensional de correlação

heteronuclear (HSQC) Figura 17, foi possível correlacionar os hidrogênios

pertencentes a cada anel aromático aos seus respectivos carbonos.

Figura 17 - Espectro de HSQC (DMSO 125 MHz) de B3

53

Todas essas absorções mostradas nos espectros de Ressonância

Magnética Nuclear, comprovam que o metabólito secundário denominado B3 se

trata da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona (Figura 18), já descrito na literatura

(SILVEIRA et al., 1995). Os dados de RMN 1H e 13C foram comparados aos dados

da literatura e organizados na Tabela 07.

Figura 18 - Estrutura da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona

O

O OH

OCH3

OCH3

OH

OCH3

8

7

6

5

8a 8b

4b 4a

1

2

3

4

Fonte: Autor, 2015

Tabela 07 - Dados de RMN 1H e 13C da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona (SILVEIRA et al., 1995)

C δ C δ C* (SILVEIRA

et al., 1995)

δ H (mult., int., J/Hz) δ H (mult., int., J/Hz)*

(SILVEIRA et al., 1995)

1 159,2 159,3

2 94,6 94,6 6,51 (s, 1 H) 6,39 (s, 1 H)

3 158,3 158,4

4 127,5 127,5

4a 146,9 148,3

4b 149,3 149,4

5 113,3 113,4 7,28 (d, 1 H, J = 9,0) 7,25 (d, 1 H, J = 9,0)

6 124,4 124,6 7,38 (1 H, J = 9,0 Hz) 7,36 (d, 1 H, J = 9,0)

7 146,9 147,0

8 145,5 145,4

8a 114,7 114,6

8b 102,6 102,2

C=O 180,9 180,8

OMe 60,9 61,0 3,91 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H)

OMe 60,8 60,9 3,80 (s, 3 H) 3,88 (s, 3 H)

OMe 56,4 56,4 3,76 (s, 3 H) 3,94 (s, 3 H)

Fonte: Autor, 2015

54

10 ATIVIDADES BIOLÓGICAS

10.1. ATIVIDADE HEMORRÁGICA

O extrato etanólico de B. floribunda (BFRE) e o flavonóide Rutina foram

submetidos ao teste hemorrágico in vivo utilizando camundongos machos Swiss. O

teste gerou resultado promissor para o extrato e está indicado no Quadro 04.

Quadro 04 - Inibição da peçonha de B. jararacussu por BFRE

Fonte: Autor, 2015

* Os grupos representados são: Veneno de Bothrops jararacussu em solução salina (PBS), Soro

antibotrópico (SAB), Extrato de etanólico B. floribunda (BFRE): Pré-incubado (PI), Administração do

extrato 30 min antes (30’A) e Administração do extrato 30 min depois (30’D). A área hemorrágica foi

calculada em mm². Para análise estatística, foi utilizado ANOVA, seguido de Bonferroni com *P <

0,05 vs vBJu, **P < 0,01 vs vBJu ***P < 0,001 vs vBJu; # P < 0,05 vs SAB.

A hemorragia causada pela peçonha de B. jararacussu foi inibida pelo

extrato etanólico de B. floribunda nas diferentes proporções testadas. Observou-se

que a hemorragia causada pela peçonha utilizada foi mais fortemente inibida quando

administrado o extrato (BFRE) 30 min após administrar o veneno. O flavonóide

Rutina não apresentou atividade antihemorrágica.

Muitas substâncias antihemorrágicas têm sido isoladas de plantas. E

estudos sugerem que a atividade enzimática das peçonhas é alterada pelos extratos

naturais através da captação do zinco ou cálcio dos sítios catalíticos, tornando-os

inativos, ou pela interação de grupamentos dessas substâncias naturais que podem

estar interferindo na conformação estrutural das proteínas (COSTA, 2010).

55

11 CONCLUSÕES

O estudo fitoquímico do extrato etanólico das raizes e dos talos de B.

floribunda permitiu o isolamento de grande quantidade do flavonóide rutina, de uma

xantona denominada 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona. Além do isolamento de

uma mistura de saponinas, presente no extrato aquoso daB. floribunda.

O extrato etanólico das raízes de B. floribunda, assim como as frações

obtidas deste e substâncias isoladas foram submetidas a ensaio hemorrágico in

vivo, utilizando o veneno de Bothrops jararacussu, demonstrando resultados

promissores, que contribuem para o conhecimento químico e biológico desta

espécie e estimulam a continuidade deste estudo

Vale considerar que a soroterapia tradicional tem eficácia limitada contra os

efeitos locais dos acidentes peçonhentos e compostos isolados de plantas mostram-

se uma boa alternativa para complementar este tratamento, o que torna a

continuidade deste estudo bastante promissor, a fim de identificar o princípio ativo

desta planta.

56

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