universidade federal do rio de janeiroobjdig.ufrj.br/50/teses/d/ccs_d_marianagamadandrea.pdf2....
TRANSCRIPT
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO- QUÍMICA DA
ASPARAGINASE DE Escherichia coli
RIO DE JANEIRO
2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DO
RIO DE JANEIRO
MARIANA GAMA D’ ANDREA
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO- QUÍMICA DA
ASPARAGINASE DE Escherichia coli
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Química Biológica, Instituto de
Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do grau de Doutor em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Lucia Bianconi
Mariana Gama D’ Andrea
RIO DE JANEIRO
2012
D’ Andrea, Mariana Gama.
Caracterização Físico- Química da Asparaginase de Escherichia coli / Mariana Gama D’ Andrea – Rio de Janeiro, 2012 x, 148 f.:il
Tese (Doutorado em Química Biológica) – Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Biologia Estrutural, 2012
Orientador: Maria Lucia Bianconi
1. Asparaginase. 2. Calorimetria. 3. Câncer. I. Bianconi, Maria Lucia (Orient). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Bioquímica Médica. III. Título.
Mariana Gama D’ Andrea
Caracterização Físico – Química da Asparaginase de Escherichia coli
Tese de Doutorado submetida ao corpo docente Instituto de Bioquímica
Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências.
Aprovada por:
____________________________________ Profa. Dra. Maria Lucia Bianconi (orientadora) Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ
______________________________________ Prof. Dr. Salvatore Giovanni De Simone Instituto de Biologia/UFF
_______________________________________ Profª. Dra. Helena Carla Castro Instituto de Biologia/UFF
_______________________________________ Profa. Dra. Ana Paula Canedo Valente Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ
_______________________________________ Profa. Dra. Andréa Cheble de Oliveira (revisor e suplente interno) Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ
_______________________________________ Profa. Dra. Yraima Moura Lopes Cordeiro (suplente externo) Faculdade de Farmácia/UFRJ
Rio de Janeiro
2012
Dedico a tese aos meus pais,
as pessoas mais importantes
em minha vida.
AGRADECIMENTOS
À professora Maria Lucia, pela oportunidade que me foi dada. Pelos ensinamentos e
por esclarecer todas as minhas dúvidas, por menores que fossem. Por seu incentivo
e apoio em todas as situações, mas principalmente, pela amizade e confiança que
depositou em mim durante todos esses anos. Sua opinião e senso crítico foram
muito importantes para a minha formação.
Aos meus pais e meu irmão, por todo carinho, amor e compreensão em todos os
momentos. Por terem sido meu suporte nos momentos de maior dificuldade e não
me deixarem desistir.
Aos colegas do Laboratório de Biocalorimetria pela amizade.
À Karla Lima dos Santos e à Daniele Maciel, pela grande ajuda com os
experimentos.
Ao Theo Ferraz pela grande ajuda com os experimentos de espectroscopia.
Ao Professor Marcelo Santoro, pela contribuição na análise dos dados.
À Leida Gomes Abraçado, pelos experimentos de microscopia.
A Deus, por sempre me dar forças para seguir em frente.
RESUMO
D’ ANDREA, Mariana Gama. Caracterização Físico-Química da Asparaginase de Escherichia coli. Rio de Janeiro, 2012. Tese (Doutorado em Química Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2012.
A asparaginase tipo II de Escherichia coli é amplamente utilizada no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. Ela é uma enzima homotetramérica, que catalisa a hidrólise de L-asparagina em ácido aspártico e amônia. Sua atividade antineoplásica se baseia na depleção desse aminoácido no soro, pois as células leucêmicas são dependentes da L-asparagina plasmática. Por ser uma enzima de origem bacteriana, o tratamento pode causar reações alérgicas, além de efeitos colaterais que podem levar à sua suspensão. Portanto, para futuros avanços terapêuticos no tratamento, é importante o estudo das características cinéticas, termodinâmicas e estruturais da asparaginase. Neste trabalho, a caracterização proteica foi feita por fluorescência intrínseca, dicroísmo circular, aumento da pressão hidrostática, calorimetria diferencial de varredura, calorimetria de titulação isotérmica, espectroscopia de absorção em UV-Visível e microscopia. A desnaturação térmica da asparaginase foi reversível de pH 7,5 a 9,5, com maior reversibilidade entre pH 8,0 e 9,0. O pico de desnaturação, obtido por calorimetria diferencial de varredura, foi assimétrico e a desnaturação bastante cooperativa. O aumento da concentração proteica não causou aumento da temperatura de transição ou da entalpia calorimétrica, indicando a ausência de monômeros estáveis durante a desnaturação. No entanto, a temperatura de transição foi dependente da velocidade de varredura, mostrando a presença de um intermediário de desnaturação cineticamente controlado. A atividade e a estabilidade enzimática foram estudadas de pH 2,0 a 13,0. A enzima teve atividade máxima de pH 5,5, a 9,0 e apresentou pico de transição térmica de pH 2,0 a 12,0. A estrutura secundária não mudou de pH 3,0 a 12,0 e os resultados mostraram que a asparaginase desnaturou apenas em pH 13,0. Em pH 2,0, houve a formação de um intermediário do tipo “molten globule”. Em pH 8,0, a desnaturação da asparaginase por ureia ou por cloridrato de guanidina foi reversível. As curvas de desnaturação obtidas por fluorescência e por dicroísmo circular puderam ser sobrepostas e o aumento da concentração proteica não causou mudanças nos valores de CmU (concentração do agente desnaturante na qual se tem 50% de proteína desnaturada) e da variação de energia livre. Não foram detectados intermediários de desnaturação e a transição pôde ser descrita por um modelo de transição entre dois-estados. O aumento da pressão hidrostática não causou mudança significativa no espectro de fluorescência, na ausência ou na presença de concentrações subdesnaturantes de ureia, sugerindo que não houve dissociação do tetrâmero. Os resultados indicam que a asparaginase é um tetrâmero estável, bem enovelado e altamente empacotado, e que durante a desnaturação o tetrâmero enovelado é convertido diretamente em monômeros desenovelados, sem formação de intermediários estáveis.
ABSTRACT
D’ ANDREA, Mariana Gama. Caracterização Físico-Química da Asparaginase de Escherichia coli. Rio de Janeiro, 2012. Tese (Doutorado em Química Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2012.
Type II Escherichia coli asparginase is widely used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia. It is a homotetrameric enzyme which catalyzes the hydrolysis of L-asparagine into L-aspartic acid and ammonia. Its antineoplastic activity is based on the depletion of this amino acid in the serum, because leukemic cells are dependent on circulating L-asparagine. Because it is a bacterial enzyme, the treatment can cause allergic reactions, as well as side effects that may lead to the suspension of the therapy. Thus, for future therapeutic advances in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, it is important to study the kinetic, thermodynamic and structural properties of asparaginase. In this work, protein characterization was done by intrinsic fluorescence, circular dichroism, high hydrostatic pressure, differential scanning calorimetry, isothermal titration calorimetry, UV-Visible absorption spectroscopy and microscopy. The thermal denaturation of asparaginase was reversible from pH 7.5 to 9.5, with higher reversibility values from pH 8.0 to 9.0. The transition peak, obtained by differential scanning calorimetry, was asymmetric and the thermal transition was highly cooperative. Increasing protein concentration did not increase the transition temperature or the calorimetric enthalpy, showing that the thermal transition occurred without stable monomers. However, the transition temperature was dependent on scan rate, indicating the presence of a transition intermediate kinetically controlled. The enzymatic activity and stability were studied from pH 2.0 to 13.0. The enzyme had maximum stability from pH 5.5 to 9.0, and presented thermal transition from pH 2.0 to pH 12.0. The secondary structure did not change from pH 3.0 to 12.0, and our results showed that asparagine was denatured only at pH 13.0. At pH 2.0, we observed the formation of a “molten globule” intermediate. At pH 8.0, asparaginase denaturation induced by urea or guanidine hydrochloride was reversible. Transition curves obtained by fluorescence or circular dichroism could be superimposed and increasing protein concentration did not change CmU (denaturant concentration where there was 50% of denatured protein) or Gibbs free energy. Denaturation intermediates were not detected and the transition could be described by a two-state denaturation model. The increase in hydrostatic pressure did not cause significant changes in the fluorescence spectrum, in the absence or presence of sub denaturant concentrations of urea, suggesting no dissociation of the tetramer. The results suggest that asparaginase tetramer is stable, well folded and highly packaged, and that during the denaturation the folded tetramer is converted directly into unfolded monomers, without the formation of stable intermediates.
LISTA DE ABREVIATURAS
AFM microscopia de força atômica (do inglês: Atomic Force Microscopy)
ASB-14 tetradecanoil amido propil dimeitl amônio propanosulfonato
ASB-16 hexadecanoil amido propil dimeitl amônio propanosulfonato
BIS-ANS 4,4'-bis (1-anilinonaftaleno 8-sulfonato)
CD dicroísmo circular (do inglês: Circular Dicroism)
CMC concentração micelar crítica
CmU concentração na qual se tem 50% de proteína desnaturada
CTAB brometo de cetiltrimetilamônio
C-terminal região carbóxi-terminal de proteínas
DSC calorimetria diferencial de varredura (do inglês: Differential Scanning Calorimetry)
∆Hcal variação de entalpia calorimétrica, calculada pela área obtida sob os
termogramas
∆T1/2 valor correspondente à meia largura da transição térmica
∆G0w variação da energia livre de Gibbs
ITC calorimetria de titulação isotérmica (do inglês: Isothermal Titration
Calorimetry)
HPLC cromatografia líquida de alta pressão (do inglês: High pressure liquid
chromatography)
LLA leucemia linfoblástica aguda
MET microscopia de transmissão eletrônica
N-terminal região amino-terminal de proteínas
PBC tampão composto por fosfato de sódio, borato de sódio e citrato de
sódio
PDB banco de dados de proteínas (do inglês: Protein Data Bank)
PEG polietilenoglicol
PLGA ácido poli láctico co-glicólico
RMN ressonância magnética nuclear
Tm temperatura de transição térmica
Tris Tris (hidroximetil) amino-metano
UV ultra violeta
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1: Reação catalisada pelas asparaginase bacterianas..................................3
Figura 1.2: Alinhamento da sequência de aminoácidos de diferentes asparaginases
bacterianas...................................................................................................................4
Figura 1.3: Representação de um monômero da asparaginase evidenciando os
elementos de estrutura secundária e as regiões N-terminal e C-
terminal........................................................................................................................6
Figura 1.4: Estrutura do tetrâmero da asparaginase...................................................7
Figura 1.5: Reação catalisada pela asparaginase......................................................9
Figura 3.1: Representação de um calorímetro de titulação isotérmica......................17
Figura 3.2: Diagrama do calorímetro diferencial de varredura VP-DSC....................25
Figura 3.3: Espectro de dicroísmo circular em UV distante das diferentes estruturas
secundárias................................................................................................................30
Figura 3.4: Espectro de excitação dos aminoácidos aromáticos...............................33
Figura 3.5: Esquema do sistema de microscopia de força atômica...........................38
Figura 4.1.1: Determinação dos parâmetros cinéticos para a hidrólise da asparagina
catalisada pela asparaginase de Escherichia coli .....................................................44
Figura 4.1.2: Efeito de manitol sobre a estabilidade da asparaginase de Escherichia
coli..............................................................................................................................47
Figura 4.1.3: Termogramas da asparaginase na presença de osmólitos..................49
Figura 4.1.4: Titulação de uma solução micelar de ASB-14 (5 mM) na cela
calorimétrica contendo água deionizada, a 25 °C......................................................53
Figura 4.1.5: Parâmetros termodinâmicos para a micelização de ASB-14 (símbolos
fechados) e ASB-16 (símbolos abertos) em água Milli-Q em função da
temperatura................................................................................................................55
Figura 4.1.6: Titulação de uma solução micelar de ASB-14 (5 mM) na cela
calorimétrica contendo Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 (1); asparaginase 5 µM em Tris:HCl
10 mM, pH 8,0 (2) ou asparagina 10 mM em Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 (3), a
25 °C...........................................................................................................................57
Figura 4.2.1: Desenovelamento térmico da asparaginase monitorado por
fluorescência..............................................................................................................62
Figura 4.2.2: Espectros de dicroísmo circular da asparaginase em UV-distante em
pH 8,0; 8,5 e 9,0, a 25 °C...........................................................................................63
Figura 4.2.3: Desenovelamento térmico da asparaginase monitorado por dicroísmo
circular........................................................................................................................64
Figura 4.2.4: Termogramas da asparaginase em função do pH................................69
Figura 4.2.5: Variação de ∆Hcal em função de Tm para a asparaginase....................72
Figura 4.2.6: Ajuste do termograma da asparaginase ao modelo de transição entre
“não dois estados”......................................................................................................74
Figura 4.2.7: Ajuste do termograma da asparaginase ao modelo de transição entre
“não dois estados”......................................................................................................75
Figura 4.2.8: Efeito do aumento da concentração de asparaginase sobre os
termogramas..............................................................................................................77
Figura 4.2.9: Efeito da velocidade de varredura sobre os termogramas da
asparaginase..............................................................................................................80
Figura 4.2.10: Variação dos parâmetros termodinâmicos para a desnaturação da
asparaginase em função da velocidade de varredura................................................81
Figura 4.2.11: Efeito do aumento da concentração de asparaginase sobre os
termogramas..............................................................................................................82
Figura 4.2.12: Reação da asparaginase em baixa concentração, a 25 °C................84
Figura 4.2.13: Micrografias da asparaginase obtidas por microscopia de força
atômica em função da temperatura............................................................................85
Figura 4.2.14: Distribuições do diâmetro maior, do diâmetro menor e do fator de
forma para as amostras de asparaginase preparadas em diferentes
temperaturas..............................................................................................................87
Figura 4.2.15: Imagens de microscopia de força atômica e análise das amostras (10
µm vs 10 µm) de asparaginase obtidas em 25 °C.....................................................89
Figura 4.2.16: Imagens de microscopia de força atômica para a asparaginase
preparada em 63 °C...................................................................................................90
Figura 4.2.17: Imagens de microscopia de força atômica para a asparaginase
preparada em 67 °C...................................................................................................91
Figura 4.3.1: Efeito do pH sobre a atividade da asparaginase...................................93
Figura 4.3.2: Efeito do pH sobre a transição térmica da asparaginase......................98
Figura 4.3.3: Variação dos parâmetros termodinâmicos da desnaturação térmica da
asparaginase em função do pH..................................................................................90
Figura 4.3.4: Espectro de dicroísmo circular da asparaginase em UV-
distante.....................................................................................................................102
Figura 4.3.5: Espectros de dicroísmo circular da asparaginase em UV-distante em
diferentes valores de pH...........................................................................................102
Figura 4.3.6: Espectros de emissão de fluorescência intrínseca da asparaginase em
função do pH............................................................................................................105
Figura 4.3.7: Variação do centro de massa espectral em função do pH..................106
Figura 4.3.8: Variação da intensidade relativa de fluorescência em função do
pH.............................................................................................................................108
Figura 4.3.9: Ambiente do triptofano 66 em um raio de 5 Å ....................................108
Figura 4.3.10: Espectros de absorção em UV da asparaginase..............................110
Figura 4.3.11: Efeito do pH na absorbância da asparaginase em UV.....................111
Figura 4.3.12: Espectro de fluorescência de bis-ANS na presença da asparaginase
em diferentes valores de pH.....................................................................................112
Figura 4.4.1: Efeito da ureia sobre a asparaginase, avaliado por fluorescência......115
Figura 4.4.2: Efeito do cloridrato de guanidina sobre o espectro sobre a
asparaginase, avaliado por fluorescência................................................................115
Figura 4.4.3: Re-enovelamento da asparaginase após a retirada da ureia.............116
Figura 4.4.4: Efeito da ureia sobre a asparaginase, avaliado por dicroísmo circular
em UV-distante.........................................................................................................117
Figura 4.4.5: Efeito do cloridrato de guanidina sobre a asparaginase, avaliado por
dicroísmo circular em UV-distante............................................................................117
Figura 4.4.6: Sobreposição das curvas de desnaturação da asparaginase por ureia,
obtidas por dicroísmo circular e por fluorescência...................................................119
Figura 4.4.7: Sobreposição das curvas de desnaturação da asparaginase por
cloridrato de guanidina, obtidas por dicroísmo circular e por fluorescência
intrínseca..................................................................................................................121
Figura 4.4.8: Espectros de fluorescência da asparaginase em função da pressão
hidrostática na presença e na ausência de ureia.....................................................126
Figura 4.4.9: Efeito do aumento da pressão hidrostática sobre a estabilidade da
asparaginase............................................................................................................127
Figura 4.4.10: Termogramas de asparaginase em concentrações subdesnaturantes
de ureia.....................................................................................................................128
Figura 4.4.11: Variação dos valores de Tm e ΔHcal em função da concentração de
ureia..........................................................................................................................129
Figura 4.4.12: Termogramas de asparaginase em concentrações subdesnaturantes
de cloridrato de guanidina........................................................................................130
Figura 4.4.13: Variação dos valores de Tm e ΔHcal em função da concentração de
cloridrato de guanidina.............................................................................................130
Figura 4.4.14: Variação de ΔHcal em função de Tm para a asparaginase na presença
de diferentes concentrações de ureia e cloridrato de guanidina..............................131
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1: Características de absorção e emissão de fluorescência dos
aminoácidos aromáticos em água..............................................................................32
Tabela 4.1.1: Efeito do manitol sobre a estabilidade da asparaginase......................47
Tabela 4.1.2: Efeito de osmólitos sobre a atividade da asparaginase, a 25 °C.........48
Tabela 4.1.3: Efeito de osmólitos sobre a estabilidade térmica da asparaginase… 50
Tabela 4.1.4: Efeito da temperatura sobre a concentração micelar crítica e sobre os
parâmetros termodinâmicos para a micelização de ASB-14 e ASB-16.....................54
Tabela 4.1.5: Determinação dos parâmetros de micelização para os surfactantes, em
25 °C…………………………………………………………………………………………56
Tabela 4.1.6: Efeito dos surfactantes sobre a atividade da asparaginase.................58
Tabela 4.1.7: Efeito de ASB-14 sobre os parâmetros termodinâmicos para o
desenovelamento térmico da asparaginase……………………………………………..59
Tabela 4.2.1: Temperatura média de desnaturação para a transição da asparaginase
obtida por fluorescência e por dicroísmo circular.......................................................65
Tabela 4.2.2: Parâmetros termodinâmicos para o desenovelamento da asparaginase
obtidos pela aproximação de van’tHoff......................................................................66
Tabela 4.2.3: Parâmetros termodinâmicos para a transição térmica da
asparaginase..............................................................................................................69
Tabela 4.2.4: Valores de entalpia calorimétrica para proteínas oligoméricas............71
Tabela 4.2.5: Efeito da concentração de asparaginase sobre os parâmetros
termodinâmicos..........................................................................................................78
Tabela 4.2.6: Efeito da velocidade de varredura sobre os parâmetros
termodinâmicos para a desnaturação da asparaginase.............................................81
Tabela 4.2.7: Efeito da concentração de asparaginase sobre os parâmetros
termodinâmicos..........................................................................................................82
Tabela 4.2.8: Análise das micrografias da asparaginase obtidas por microscopia de
transmissão eletrônica................................................................................................86
Tabela 4.2.9: Comparação do diâmetro maior medido para a asparaginase entre as
diferentes temperaturas..............................................................................................88
Tabela 4.2.10: Comparação do diâmetro menor medido para a asparaginase entre
as diferentes temperaturas.........................................................................................88
Tabela 4.2.11: Comparação do fator de forma para a asparaginase entre as
diferentes temperaturas..............................................................................................88
Tabela 4.2.12: Diâmetro proteico estimado através de microscopia de força atômica,
para as três temperaturas..........................................................................................91
Tabela 4.3.1: Valores de pKa para os resíduos da subunidade A da
asparaginase………………………………………………………………………………..96
Tabela 4.3.2: Porcentagem de conteúdo de estrutura secundária da asparaginase
em função do pH......................................................................................................104
Tabela 4.4.1: Concentrações de ureia necessárias para causar 50% de
desnaturação da asparaginase (CmU)* ...................................................................119
Tabela 4.4.2: Energia livre de desnaturação da asparaginase calculada através de
dicroísmo circular e fluorescência............................................................................120
Tabela 4.4.3: Parâmetros para a desnaturação da asparaginase calculados através
de dicroísmo circular e fluorescência.......................................................................122
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................1
1.1 Histórico.............................................................................................................1
1.2 As asparaginases bacterianas...........................................................................2
1.3 Características estruturais da asparaginase tipo II de Escherichia coli.............5
1.4 Sítio ativo e mecanismo de catálise da asparaginase.......................................8
1.5 Mecanismo de ação da asparaginase no tratamento de câncer.....................10
1.6 Preparações de asparaginase empregadas no tratamento de leucemia
linfoblástica aguda......................................................................................................11
2 OBJETIVOS....................................................................................................14
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................15
3.1 Reagentes.......................................................................................................15
3.2 Preparação da asparaginase e determinação da concentração proteica.......15
3.3 Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)......................................................16
3.3.1 Determinação da velocidade de reação catalisada por enzimas através da
calorimetria de titulação isotérmica............................................................................18
3.4 Medidas de atividade da asparaginase em diferentes condições...................19
3.4.1 Determinação dos parâmetros cinéticos para a hidrólise da asparagina
catalisada pela asparaginase.....................................................................................20
3.5 Determinação da concentração micelar crítica (CMC)....................................21
3.6 Calorimetria Diferencial de Varredura.............................................................22
3.6.1 Características e princípios de funcionamento dos calorímetros de
varredura....................................................................................................................23
3.6.2 Medidas dos parâmetros termodinâmicos para a desnaturação térmica da
asparaginase..............................................................................................................26
3.7 Avaliação da estrutura secundária da asparaginase por dicroísmo
circular........................................................................................................................29
3.8 Fluorescência intrínseca de proteínas.............................................................31
3.8.1 Estudos com alta pressão hidrostática e fluorescência intrínseca..................35
3.9 Espectroscopia em UV-Visível da asparaginase.............................................36
3.10 Microscopia de Força Atômica (AFM).............................................................36
3.11 Medidas de Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)...........................40
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................42
4.1 Caracterização da asparaginase de Escherichia coli em sistemas
biomiméticos...............................................................................................................42
4.1.1 Determinação dos parâmetros cinéticos por calorimetria de titulação
isotérmica...................................................................................................................42
4.1.2 Efeito de osmólitos sobre a atividade e estabilidade da asparaginase..........45
4.1.3 Efeito de micelas............................................................................................50
4.2 Termoestabilidade da asparaginase de Escherichia coli.................................60
4.2.1 Análise da estabilidade térmica da asparaginase por métodos
espectroscópicos........................................................................................................61
4.2.2 Análise da termoestabilidade da asparaginase por calorimetria.....................67
4.2.3 Estudo da estabilidade da asparaginase por microscopia..............................85
4.3 Efeito do pH sobre as propriedades cinéticas e estruturais da asparaginase de
Escherichia coli...........................................................................................................92
4.3.1 Efeito do pH sobre as propriedades cinéticas da asparaginase......................92
4.3.2 Efeito do pH na estabilidade térmica da asparaginase...................................97
4.3.3 Efeito do pH sobre a estrutura secundária da asparaginase.........................101
4.3.4 Efeito do pH sobre a fluorescência intrínseca da asparaginase....................104
4.3.5 Espectros de absorção no UV da asparaginase em função do pH...............109
4.3.6 Ligação da sonda bis-ANS à asparaginase...................................................111
4.4 Efeito de agentes desnaturantes sobre a estrutura da asparaginase...........113
4.4.1 Efeito de agentes químicos sobre a estrutura secundária e terciária da
asparaginase............................................................................................................113
4.4.2 Efeito de agentes desnaturantes nos parâmetros termodinâmicos de
desnaturação térmica da asparaginase...................................................................127
5 CONCLUSÕES.............................................................................................132
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................135
ANEXO
Introdução
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
A asparaginase é uma enzima amplamente distribuída na natureza, de
bactérias a mamíferos, e desempenha uma importante função no metabolismo e
utilização de aminoácidos. Esta enzima é encontrada em mamíferos e aves e está
localizada no fígado. A L-asparaginase é encontrada frequentemente em bactérias
Gram negativas e, com menor frequência, em bactérias Gram positivas, fungos e
leveduras. A L-asparaginase foi isolada de bactérias Gram negativas como
Escherichia coli (WHELAN & WRISTON, 1969), Bacillus coagulans (LAW &
WRISTON, 1971), Serratia narcescens (WRISTON, 1971), Proteus vulgaris (TOSA
et al., 1972), Achromobacteriaceae (ROBERTS et al., 1972), Pseudomonas
(ROBERTS, 1976), Acynetobacter glutaminasificans (JONER, 1976), Vibrio
succinogenes (KAFKEWITZ & GOODMAN, 1971), Tetrahymena pyriformis
(TRIANTAFILLOU et al., 1988), Erwinia carotovora (LEE et al., 1986) e de bactérias
Gram positivas, como Staphylococcus aureus (ROZALKA, 1989) e Corynebacterium
glutamicum (MESAS et al., 1990). Ela também foi isolada de alguns fungos, como
Aspergillus sp. (WRISTON & YELLIN, 1973) e Cylindrocarpon obtusisporum MB-10
(RAHA et al., 1990) e leveduras, como Saccharomyces cerevisiae (DUNLOP et al.,
1978). A L-asparaginase é uma enzima constitutiva na maioria dos microrganismos
citados, com exceção de Proteus vulgaris (TOSA et al., 1972) e Saccharomyces
cerevisiae (DUNLOP et al., 1978). Algumas destas enzimas apresentam atividade
antineoplásica, embora poucas possam ser empregadas como quimioterápicos.
As asparaginases são enzimas de alto valor terapêutico devido ao seu
emprego no tratamento de alguns tipos de câncer, como linfoma de Hodgkin,
leucemia linfoblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, linfosarcoma e
melanosarcoma. A isoforma da asparaginase encontrada no periplasma de
Escherichia coli, ao contrário da isoforma citosólica, é particularmente efetiva no
tratamento da LLA em crianças (MULLER & BOSS, 1998).
Em 1922, Clementi sugeriu que a L-asparaginase hepática estava presente
somente em vertebrados homeotérmicos. Esse pesquisador acreditava que a L-
asparaginase era uma adaptação desenvolvida por esses animais em resposta a
uma dieta com L-asparagina (COONEY & HANDSCHUMACHER, 1970). Contudo,
Introdução
2
mais tarde foi demonstrado que a asparaginase também estava presente no fígado
de animais heterotérmicos. Foi Clementi quem observou que o sangue de
porquinhos da índia possuía uma L-asparaginase ativa. Contudo, o real interesse
pelas propriedades da L-asparaginase só cresceu na década de 1950, com Kidd
(KIDD, 1953), que demonstrou que o soro de porquinho da índia causava a
diminuição de um tipo de linfosarcoma (Linfosarcoma de Gardner) em ratos, e
sugeriu que a atividade antineoplásica era devido a uma proteína e não ao
complemento. Mais tarde, Broome (1961) relacionou definitivamente a propriedade
antitumoral do soro do porquinho da índia à atividade da L-asparaginase (BROOME,
1961). Esse pesquisador confirmou os resultados de Clementi e mostrou que havia
uma correlação entre seus resultados e os de Kidd. Logo após a descoberta de
Broome (1961), foi isolada uma asparaginase de Escherichia coli B, a qual era mais
eficiente em induzir a morte de células leucêmicas (MASHBURN & WRISTON, 1963,
1964). A partir desses achados, um grande número de trabalhos foi publicado,
estendendo a terapia com L-asparaginase ao tratamento antitumoral em humanos.
1.2 As asparaginases bacterianas
Em bactérias, a principal função fisiológica das asparaginases é manter o
crescimento celular em meio deficiente em amônia, através da regulação da
utilização da asparagina e da glutamina como fontes de nitrogênio para a nutrição
celular. Além disso, na fase de crescimento celular, a atividade da asparaginase e
da glutaminase mostra-se aumentada (SANCHES et al., 2007). A expressão dessas
enzimas é ativada por seus substratos (asparagina e glutamina) e inibida por seus
produtos de reação (ácido aspártico e ácido glutâmico). Algumas fontes de carbono,
como glicose ou ácidos mono e dicarboxílicos, causam a repressão da expressão da
asparaginase. Isso se deve ao fato de que a glutamina e a asparagina podem ser
degradadas a intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (α-cetoglutarato e
fumarato, respectivamente). Se intermediários do ciclo estão presentes ou
metabólitos estão disponíveis, não há necessidade da utilização dos aminoácidos
para esse fim. O aumento do nível de glutamina sintase, resultante da privação de
amônia, estimula a produção das asparaginases.
Introdução
3
L-asparaginase/L-glutaminase amidohidrolase é uma denominação genérica
para enzimas que catalisam a conversão de L-asparagina ou L-glutamina em
aspartato ou glutamato e amônia.
Figura 1.1: Reação catalisada pelas asparaginases bacterianas. A asparagina (n= 1) ou a glutamina (n= 2) são hidrolisadas em aspartato (n = 1) ou glutamato (n = 2) e amônia.
Essas enzimas podem ser específicas para asparagina, apresentando baixa
atividade sobre a glutamina e, dessa forma, serem denominadas asparaginases
(E.C. 3.5.1.1), ou podem catalisar a hidrólise de ambos os aminoácidos e, nesse
caso, receberem o nome de glutaminase-asparaginase (E.C. 3.5.1.38). As
asparaginases podem ser divididas em três famílias: a primeira corresponde às
asparaginases bacterianas, a segunda às asparaginases de plantas e a terceira, às
asparaginases similares àquelas de Rhizobium etli (SANCHES et al., 2007).
Em Escherichia coli, são encontradas duas isoenzimas de L-asparaginase: do
tipo I e do tipo II. Essas enzimas foram denominadas EcAI (tipo I) e EcA (tipo II), na
Escherichia coli B, e AsnI (tipo I) e AsnII (tipo II), na Escherichia coli K2. A
sequência de aminoácidos das asparaginases do tipo I e do tipo II em Escherichia
coli é diferente, exceto por algumas regiões que apresentam homologia. A região de
aminoácidos mais conservada é aquela próxima ao sítio ativo. As asparaginases
bacterianas possuem duas regiões altamente conservadas: a primeira inclui o
resíduo de treonina 12 e a segunda inclui os resíduos de treonina 89 e aspartato 90,
que fazem parte do sítio ativo. Outro resíduo que apresenta alto grau de
conservação é a lisina 162, que também participa no mecanismo de catálise das
asparaginases bacterianas. As maiores diferenças entre essas enzimas estão nas
regiões de alças e regiões localizadas na superfície da molécula (SANCHES et al.,
Introdução
4
2007). A sequência de aminoácidos de algumas asparaginases do tipo II, assim
como da asparaginase do tipo I de Escherichia coli é mostrada na Figura 1.2.
Figura 1.2: Alinhamento da sequência de aminoácidos de diferentes asparaginases bacterianas. As sequências conservadas estão marcadas em cinza. Os resíduos de aminoácidos envolvidos na formação do tetrâmero na asparaginase de E. coli tipo II estão mostradas em negrito. Resíduos de aminoácidos presentes na interface B/C ou A/D estão sublinhados. Resíduos de aminoácidos presentes na interface B/A ou D/C estão pontilhados. Resíduos de aminoácidos presentes em todas as interfaces estão sublinhados por uma linha dupla. Os resíduos importantes para a catálise estão marcados por *. As sequências mostradas são: E. coli II - asparaginase II de Escherichia coli , A. glutam II - glutaminase-asparaginase (Typ II) de Acinetobacter glutaminasificans, Er. chry. II - asparaginase (Typ II) de Erwinia chrysanthemi, S. cere II - Asparaginase (Typ II) de Saccharomyces cerevisea, B. sub. I - asparaginase (Typ I) de Bacillus subtilis e E. coli I - asparaginase (Typ I ) de Escherichia coli (VERMA, 2007).
Introdução
5
As asparaginases do tipo I são citosólicas, expressas de forma constitutiva e
utilizam asparagina como substrato, enquanto as do tipo II estão presentes no
periplasma de bactérias Gram-negativas, são induzidas por anaerobiose e catalisam
a hidrólise de asparagina. As enzimas do tipo II também hidrolisam glutamina, mas
em menor proporção em relação às do tipo I. As enzimas do tipo II possuem maior
afinidade por seus substratos. Ambos os tipos de asparaginases são encontrados
em muitas espécies bacterianas, no entanto apenas as do tipo II apresentam
atividade antitumoral. Asparaginases com atividade antitumoral foram isoladas de
diversas fontes bacterianas, como exemplo Proteus vulgaris, Acinetobacter
glutaminasificans, Pseudomonas putida, Wolinella succinogenes, mas apenas a
asparaginase tipo II isolada de Escherichia coli e a de Erwinia chrysanthemi são
utilizadas no tratamento de alguns tipos de câncer e têm sido produzidas em escala
industrial (MULLER & BOSS, 1998; AVRAMIS & PANOSYAN, 2005).
1.3 Características estruturais da asparaginase tipo II de Escherichia coli
A estrutura da asparaginase tipo II de Escherichia coli foi determinada por
cristalografia de raios-X com uma resolução de 2.3 Å (SWAIN et al., 1993).
Estruturalmente, essa asparaginase é um homotetrâmero composto de subunidades
idênticas de 34 kDa, denominadas A, B, C e D, com 326 aminoácidos cada. O
tetrâmero é descrito como um dímero de dímeros devido às interações entre as
subunidades A e C e entre B e D.
Cada subunidade é composta por dois domínios α/β conectados por uma
sequência compreendendo os aminoácidos de 191-212. O domínio N-terminal
contém uma folha- β mista composta por oito fitas- β e quatro α- hélices. Duas fitas-
β antiparalelas saem da folha- β principal e formam um grampo- β, o qual está
posicionado em direção ao interior do tetrâmero e pode ter papel na adesão entre as
subunidades. Uma ponte dissulfeto entre a cisteína 77 e a cisteína 105 localiza-se
na superfície do domímio N-terminal. O domínio C-terminal é composto pelos
resíduos de aminoácidos 213-326. Ele é composto por uma folha- β composta por
quatro fitas- β paralelas e quatro α- hélices. Cada monômero possui um triptofano,
na posição 66 e doze tirosinas. A estrutura do monômero é mostrada na Figura 1.3.
Introdução
6
Figura 1.3: Representação de um monômero da asparaginase evidenciando os elementos de estrutura secundária. As fitas-β estão representadas em amarelo e as α-hélices em vermelho. As regiões de estrutura ao acaso estão representadas em verde. A alça compreendendo os resíduos de aminoácidos de 191 a 212 está representada em azul. A ligação de enxofre entre a C77 e C105 está representada. O Trp66 está mostrado em vermelho. Figura feita utilizando-se o programa PyMOL (DeLano Scientific).
O tetrâmero da asparaginase possui quatro sítios ativos, os quais estão
localizados na interface entre as subunidades nos dímeros, como mostrado na
Figura 1.4. Cada dímero possui dois sítios ativos, embora apenas a forma
tetramérica da enzima seja ativa. Cada sítio ativo é composto por resíduos da região
N-terminal de um monômero que faz comunicação com os resíduos da região C-
terminal da subunidade intimamente ligada.
Introdução
7
A
B
Figura 1.4: Estrutura do tetrâmero da asparaginase. (A) As subunidades A (verde) e C (magenta) ou B (ciano) e D (amarelo) formam dímeros estruturalmente equivalentes. (B) O W66 (vermelho) está localizado no interior de cada subunidade. Os resíduos Y176 e Y181, na interface entre os dímeros, estão representados em verde para a subunidade A, em ciano para a B, em magenta para a C e em amarelo para a D. A figura feita utilizando-se o programa PyMOL (DeLano Scientific).
Introdução
8
No tetrâmero de asparaginase, os dímeros íntimos (A/C ou B/D) possuem
duas áreas de contato, que envolvem, principalmente, os resíduos 115 a 125 e 175
a 195. As áreas de contato entre os monômeros que compõem cada um dos
dímeros íntimos são mais extensas, enquanto as interações entre os dímeros não
íntimos são mais limitadas.
Cada monômero de asparaginase apresenta duas regiões de contato com
cada uma das subunidades que compõem o dímero íntimo oposto. Assim, a
subunidade A possui interface com as subunidades B e D, que foram um dos pares
de dímeros íntimos. Da mesma forma, a subunidade B, possui interface com A e C,
que formam o outro par de dímeros íntimos. Nessa interface podem ser destacados
alguns resíduos de aminoácidos importantes como a serina 122 e o aspartato 124,
no contato B-A e as tirosinas 176 e 181 no contato D-A.
Experimentos de mutação sítio dirigida mostraram que o mutante S122A
apresenta pequenas mudanças das propriedades cinéticas, assim como da
estabilidade em experimentos de desnaturação por ureia (DERST et al., 1992). Já a
mutação do aspartato 124 por uma alanina causou uma grande diminuição da
estabilidade da asparaginase.
A análise da estrutura local da interface entre A-D mostra a presença de
ligações de hidrogênio e pontes salinas fazendo a conexão entre as subunidades.
Ligações de hidrogênio conectam o grupamento hidroxila das tirosinas 176 e 181 da
subunidade A, ao oxigênio da carbonila dos resíduos de aspartato 188 e da
asparagina 175, da subunidade D. Pontes salinas conectam o grupamento
carboxilato do aspartato 188 e da asparagina 156, na subunidade A, aos
grupamentos guanidino das argininas 195 e 191, na subunidade oposta (VERMA,
2007).
1.4 Sítio ativo e mecanismo de catálise da asparaginase
Estudos de mutação sítio dirigida da asparaginase (WEHNER et al., 1994;
AUNG et al., 1997) em conjunto com informações de cristalografia de raios X
(SWAIN et al., 1993; PALM et al., 1996) mostraram aminoácidos que são
importantes para a catálise e para a ligação do substrato.
Entre os aminoácidos com papel catalítico, estão tirosina 25, treonina 12,
treonina 89 e a lisina 162, enquanto o aspartato 90, a serina 58, a asparagina 248 e
a glutamina 283 são importantes para a ligação do substrato (WEHNER et al., 1994).
Introdução
9
A serina 58, a alanina 114 e a glutamina 283 são responsáveis por mediar a
ligação do substrato através de ligações de hidrogênio com o substrato. Os resíduos
importantes para a catálise interagem com o substrato através do aspartato 90 e da
glutamina 283, por meio de ligações de hidrogênio (DERST et al., 2000). A treonina
12 e a tirosina 25 estão em uma alça flexível que cobre parcialmente os sítios ativos
(AUNG et al., 2000).
No sítio ativo da asparaginase existem dois grupos de tríades. Uma delas
contém a treonina 89, a lisina 162 e o aspartato 90, enquanto a outra é formada por
treonina 12, tirosina 25 e glutamina 283 (DERST et al., 2000). O mecanismo
catalítico da asparaginase é semelhante aquele das serino proteases, no qual a
tríade é composta por aspartato, histidina e serina e a reação acontece através da
formação de um intermediário beta acil enzimático (Figura 1.5).
Em serino proteases, a carga parcial negativa no oxigênio da serina é
resultado da ativação por uma histidina próxima, que aceita um próton e aumenta a
nucleofilicidade da cadeia lateral de serina. Contudo, na asparaginase não está
claro se a lisina 162 pode desempenhar o mesmo papel que a histidina possui nas
serino proteases, uma vez que o pKa teria que ser alto para permitir seu
funcionamento como base em pH menor que 5.
Figura 1.5: Reação catalisada pela asparaginase. A reação de hidrólise da asparagina procede através da formação de um intermediário beta acil enzimático, que é hidrolisado formando ácido aspártico e amônia, regenerando a enzima.
Introdução
10
1.5 Mecanismo de ação da asparaginase no tratamento de câncer
A asparaginase é um importante agente no tratamento de câncer,
principalmente linfosarcomas e leucemia linfoblástica aguda em crianças. As
preparações de asparaginase utilizadas atualmente são derivadas de Escherichia
coli e Erwinia chrysnthemi. A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o tipo de câncer
mais comum em crianças, responsável por 25% dos casos em crianças com menos
de 15 anos, afetando com mais frequência aquelas entre 3 e 5 anos (MANUAL
MERCK, 2012).
A ação terapêutica da asparaginase consiste na depleção da asparagina
circulante no soro. A asparagina é um aminoácido não essencial sintetizado pela
enzima asparagina sintase através da transaminação do ácido aspártico e é
fundamental para o crescimento celular. A asparagina sintase é uma enzima
intracelular, induzível e responsável pela síntese de novo da asparagina. Em níveis
basais de asparagina, a ação da asparagina sintase não é induzida (WRISTON &
YELLIN, 1973).
As células leucêmicas são deficientes ou possuem baixa expressão de
asparagina sintase, por isso são dependentes de fonte externa de asparagina para
síntese proteica e sobrevivência. Logo, essas células obtêm a asparagina do meio
extracelular, ou seja, dos aminoácidos circulantes no soro. Quando a asparaginase é
administrada durante o tratamento, a asparagina circulante é clivada em ácido
aspártico e amônia, o que mata seletivamente as células leucêmicas e impede sua
proliferação.
Alguns fatores são limitantes para o uso da asparaginase como
quimioterápico. Um dos fatores a ser considerado é a necessidade de doses diárias
de injeções parenterais, por um período de tempo que pode durar até 21 dias. Além
disso, a terapia com a asparaginase é acompanhada por efeitos colaterais sérios,
como hiperglicemia, queda dos níveis de albumina sérica, de lipoproteínas e de
fibrinogênio, aumento de gordura no fígado e algumas disfunções cerebrais leves.
Acredita-se que muitos deles sejam provenientes da atividade glutaminásica da
asparaginase, que corresponde a aproximadamente 2% da atividade da
asparaginase sobre a asparagina (OLLENSCHLÄGER et al., 1988). A glutamina é a
principal forma de transporte de nitrogênio no sangue e também uma doadora de
grupamento amina para muitas reações biossintéticas. Um declínio prolongado nos
Introdução
11
níveis plasmáticos de glutamina prejudica uma variedade de funções bioquímicas,
especialmente as do fígado (DERST et al., 2000).
As asparaginases de Escherichia coli e de Erwinia chrysnthemi apresentam
mecanismos de ação idênticos, contudo as propriedades farmacocinéticas são
distintas e pacientes alérgicos a uma das preparações são frequentemente imunes à
outra. Alguns fatores podem afetar a eficiência clínica da asparaginase. Um deles
corresponde aos efeitos colaterais associados à administração do medicamento,
como imunossupressão e pancreatite. Os efeitos tóxicos podem estar relacionados à
sensibilização imunológica causada por uma proteína estranha ou à inibição da
síntese proteica. O desenvolvimento de hipersensibilidade ao tratamento pode
causar desde pequenas reações alérgicas na área de injeção, broncoespasmos, até
choque anafilático, sugerindo que o paciente não deve ser submetido várias vezes a
tratamentos com o mesmo tipo de asparaginase. Outro fator importante corresponde
ao fato de que uma parte dos pacientes tratados sofre relapso, com aparecimento de
tumores resistentes à asparaginase. A base para a resistência à asparaginase ainda
não é bem compreendida, mas alguns mecanismos foram propostos, como o
aumento dos níveis de asparagina sintase ou a indução de resposta imunológica no
paciente, com a produção de anticorpos anti-asparaginase, que neutralizam a
enzima (CHAKRABATI et al., 1997).
1.6 Preparações de asparaginase empregadas no tratamento de leucemia
linfoblástica aguda
Nos Estados Unidos e Europa, as preparações de asparaginase utilizadas
são as provenientes de Escherichia coli, na forma nativa e na forma conjugada com
polietilenoglicol, PEG-asparaginase, assim como a proveniente de Erwinia
chrysantemi, a qual é adotada como substituição no caso de os pacientes
desenvolverem reações alérgicas à preparação derivada de Escherichia coli. No
Brasil, a preparação mais frequentemente empregada é a forma nativa da
asparaginase proveniente de Escherichia coli.
A enzima de Escherichia coli é a formulação inicialmente adotada no
tratamento de LLA, por ser a mais eficaz contra as células leucêmicas. No entanto,
como comentado, ela pode causar reações alérgicas, além de uma serie de efeitos
colaterais, que podem ser graves. O desenvolvimento de anticorpos anti-
Introdução
12
asparaginase também é um fator que deve ser considerado, uma vez que em
adultos a frequência chega a 78%, e em crianças a 70% (HASKELL, 1981). A
produção desses anticorpos está relacionando à inativação da asparaginase, o que
reduz sua capacidade de hidrolisar a asparagina do soro, e pode acontecer sem
sinais de hipersensibilidade. Essa inativação, chamada de inativação silenciosa,
reduz a eficácia do tratamento. Para contornar esse problema, as duas outras
formulações de asparaginase foram desenvolvidas a fim de se reduzir o risco de
produção desses anticorpos.
A asparaginase de Erwinia chrysantemi é menos imunogênica e causa menos
problemas de coagulação, uma vez que 23 a 30% das crianças tratadas
desenvolvem reação alérgica. No entanto, essa enzima possui menor meia vida no
plasma, cerca de 10 horas, e para que o tratamento seja igualmente efetivo, torna-se
necessária a administração de um maior número de doses. Além do mais, a
incidência de outros efeitos tóxicos não é significativamente diferente do que se
observa na terapia com a asparaginase de Escherichia coli. A eficiência clínica da
asparaginase de Erwinia é inferior àquela da asparaginase de Escherichia coli. O
número de pacientes que alcançaram a remissão completa foi menor e a taxa de
relapsos foi maior que a obtida com a asparaginase de Escherichia coli, o que
resultou em uma menor taxa de sobrevivência (DUVALL et al., 2002). Assim, a
asparaginase de Erwinia não é indicada para o tratamento inicial de LLA, mas sim
em casos em que há reações alérgicas às outras formulações.
A enzima de Escherichia coli conjugada com PEG, a PEG-asparaginase,
apresenta uma meia vida plasmática maior que as outras preparações, cerca de seis
dias, assim como uma menor velocidade de eliminação. Essas propriedades
permitem que ela seja administrada em menores doses e em maiores intervalos de
tempo (MASSETI & PESSION, 2009). No entanto, alguns trabalhos mostraram que a
PEG-asparaginase não é muito superior à asparaginase de Escherichia coli nativa
na indução da primeira remissão da LLA. Além disso, estudos farmacológicos
indicaram que a PEG-asparaginase é eficaz em reduzir os níveis de asparagina
plasmáticos, mas não é capaz de causar tal redução nos níveis desse aminoácido
no fluido cérebro-espinhal (AVRAMIS et al., 2005; MASSETI & PESSION, 2009). A
conjugação com polietileno glicol reduz a incidência de eventos alérgicos, contudo a
toxicidade da PEG-asparaginase é semelhante à observada com a asparaginase
Introdução
13
nativa de Escherichia coli, e foi observada uma maior incidência de pancreatite
associada à administração dessa formulação (ALVAREZ & ZIMMERMAN, 2000).
As três formulações de asparaginase disponíveis comercialmente até o
momento apresentam diferentes propriedades químicas e imunológicas. O principal
fator limitante ao uso dessas preparações é o desenvolvimento de reações de
hipersensibilidade. Novas estratégias têm sido desenvolvidas com a finalidade de
reduzir as reações imunogênicas e tóxicas e ao mesmo tempo manter a atividade
biológica e a estabilidade proteica.
Dentre as estratégias desenvolvidas, pode-se citar a encapsulação da
asparaginase de Escherichia coli em lipossomas de diferentes composições lipídicas
(CRUZ et al., 1993; JORGE et al., 1994; GASPAR et al., 1996), em nano cápsulas
de ácido poli (D,L-láctico-co-glicólico) (PLGA) que é um poliéster alifático
relativamente hidrofóbico, instável em condição úmida e biodegradável em
subprodutos atóxicos produzido a partir de recursos renováveis (SOARES et al.,
2005) e em nano cápsulas de poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV)
(BARAN et al., 2002a; 2002b). Contudo, esses bioconjugados ainda não estão
disponíveis para testes clínicos e uso terapêutico.
A importância terapêutica da asparaginase no tratamento de LLA faz com que
seja de extrema importância o entendimento de suas características estruturais e
também cinéticas, a fim de se encontrar condições apropriadas para a formulação do
medicamento. Para tanto, a caraterização cinética e estrutural da asparaginase de
Escherichia coli foi feita na presença de sistemas biomiméticos, como micelas de
surfactantes e osmólitos, que simulam condições mais próximas ao encontrado in
vivo.
Objetivos
14
2 OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi fazer a caracterização da estabilidade
conformacional e cinética da L-asparaginase tipo II de Escherichia coli. Esses
estudos são importantes para a obtenção de melhores formulações desse
medicamento. Os objetivos específicos foram:
Estudar a reação de hidrólise da asparagina catalisada pela L-asparaginase
através da técnica de calorimetria de titulação isotérmica;
Estudar o efeito da variação de pH sobre a atividade enzimática;
Determinar os parâmetros cinéticos da reação catalisada pela asparaginase;
Estudar o efeito de osmólitos sobre a reação;
Estudar a desnaturação térmica da L-asparaginase e calcular os parâmetros
termodinâmicos para a desnaturação da L-asparaginase, através da técnica
de calorimetria diferencial de varredura;
Avaliar a estabilidade térmica da asparaginase na presença de osmólitos e
em função de mudanças de pH;
Avaliar a estabilidade estrutural da asparaginase na presença de
desnaturantes químicos, através de dicroísmo circular e fluorescência;
Avaliar a estabilidade estrutural da asparaginase em função do pH, através de
dicroísmo circular e fluorescência;
Avaliar a estabilidade do tetrâmero, através do monitoramento da
fluorescência intrínseca em função do aumento da pressão hidrostática.
Material e Métodos
15
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Reagentes
A asparaginase (nome comercial Elspar®) é fabricada pela MERCK & Co, Inc
(West Point, PA, USA) e comercializada por Laboratórios Bagó (Rio de Janeiro, RJ).
A asparaginase é comercializada na forma liofilizada e cada frasco contém 10.000
unidades enzimáticas (U) e 80 mg de manitol, usado como excipiente. A atividade
específica da asparaginase é de 225 U/mg de proteína. Asparagina, ureia e
cloridrato de guanidina foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, EUA).
Os tampões foram adquiridos da Vetec Química Fina Ltda., (Duque de Caxias, RJ,
Brasil). Sorbitol e manitol são provenientes da Merck Brasil e eram de grau analítico.
Os detergentes zwitteriônicos tetradecanoil amido propil dimetil amônio
propanosulfonato (ASB-14) e hexadecanoil amido propil dimetil amônio
propanosulfonato (ASB-16) foram obtidos da Calbiochem (La Jolla, CA, EUA).
3.2 Preparação da asparaginase e determinação da concentração proteica
A asparaginase foi preparada através da diluição do conteúdo total de um
frasco em 1 mL de tampão ou de água tipo I obtida em sistema Direct-Q da Millipore,
sendo que o volume final da solução era de 1,25 mL. Com isso, a concentração final
de asparaginase (cerca de 240 µM) foi 8.000 U/mL e a de manitol igual a 0,35 M. A
solução de asparaginase foi utilizada dessa forma (experimentos para a medida de
atividade) ou após diálise para a remoção do manitol (demais experimentos). A
asparaginase foi dialisada por 4 horas em membrana de celulose seletiva para
moléculas de até 12 kDa de massa molecular, em 2 L de tampão, a 4 °C, sob
agitação constante, com uma troca de tampão. Após a diálise, a concentração do
manitol ficava aproximadamente 90 ηM.
A medida da concentração proteica foi feita através da leitura da absorbância
em 280 nm, considerando-se um coeficiente de extinção molar de 94.020 M-1·cm-1
para o tetrâmero de asparaginase, calculado com a ferramenta ProtParam no
servidor ExPASY (Expert Protein Analysis System). A pureza da asparaginase foi
determinada por Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC).
Material e Métodos
16
3.3 Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)
A calorimetria tem dado uma grande contribuição para o entendimento da
energética de reações. Os instrumentos modernos são bastante sensíveis e
detectam variações de calor na ordem de frações de microcalorias sendo, portanto,
chamados microcalorímetros.
No modelo VP-ITC da MicroCal, Llc (Northamptom, MA, USA), utilizado nesta
tese, a mudança de entalpia é medida em uma cela de reação de pequeno volume
(1,422 mL). O VP-ITC (Figura 3.1) é composto por duas celas semelhantes em
forma de moeda, uma de amostra, onde ocorre a reação, e outra de referência,
preenchida com uma solução de capacidade calorífica semelhante à do meio de
reação. Ambas as celas são fixas e encontram-se dentro de uma carapaça
adiabática, que é mantida em uma temperatura 1°C abaixo da qual será realizado o
experimento. O VP-ITC pode operar entre as temperaturas de 2 e 80 °C.
Os experimentos de ITC são realizados em modo isotérmico. Como as
reações são geralmente realizadas em tampão, a cela de referência, que é mantida
fechada durante o experimento, contém água do tipo I, desgaseificada. Caso o meio
de reação contenha outro tipo de solvente, este deverá ser utilizado como
referência.
A cela de amostra possui uma abertura através da qual a seringa de injeção é
inserida. Essa seringa tem capacidade para cerca de 260 L de solução e é
controlada por um sistema robótico que, por sua vez, é controlado por computador.
Esse sistema injeta alíquotas de volumes precisos de uma solução de titulante na
cela de amostra que contém o meio de reação. As duas celas são aquecidas à
temperatura experimental e são mantidas em equilíbrio térmico durante o
experimento. A temperatura das celas é controlada por um sistema de termopares,
sendo que a energia aplicada às mesmas corresponde ao fluxo de calor das celas
ao ambiente (no caso, a carapaça adiabática). Essa energia é traduzida em cal·s-1,
sendo pré-determinada e mantida constante para a cela de referência durante todo o
experimento. Ao atingirem um equilíbrio térmico, a energia aplicada na cela de
amostra será correspondente ao fluxo de calor proveniente da mesma; o valor inicial
dessa energia definirá a linha de base. A injeção do titulante na amostra (meio de
reação) gera uma variação de calor, que será compensada pela resistência que
mantém a temperatura da cela de amostra.
Material e Métodos
17
A variação do fluxo de calor em função do tempo é a informação registrada
durante um experimento de ITC. Quando cessa o efeito de uma interação ou
reação, o valor do fluxo de calor retorna ao nível basal e como resultado, é obtido
um termograma de fluxo de calor (cal·s-1) em função do tempo
(BIOCALORIMETRY, 2004).
Figura 3.1: Representação de um calorímetro de titulação isotérmica. (A) ITC antes de uma titulação. A cela de amostra e a cela de referência possuem forma de moeda e são mantidas na mesma temperatura, que é geralmente menor que a temperatura mantida fora da carapaça adiabática na qual as celas estão localizadas. Um dos componentes da reação é colocado na seringa enquanto o outro fica na cela de amostra. (B) ITC durante a titulação. Quando uma injeção é feita, a mudança de calor associada com a reação (exotérmica ou endotérmica) causa uma mudança na temperatura da cela de amostra. Assim é necessária uma mudança no fluxo de calor (calor/s) para que as celas retornem à mesma temperatura, ou seja, para que ∆T (diferença de temperatura entre as celas de amostra e referência) volte a ser zero. Essa mudança no fluxo de calor em função do tempo é registrada à medida que uma serie de injeções é feita. O termograma, no detalhe, é representativo de um experimento de ligação no qual a reação é exotérmica; à medida que os sítios da molécula na cela de amostra são saturados o efeito exotérmico diminui gradualmente (LADBURY, 2004).
A interação entre duas moléculas é acompanhada pela absorção ou pela
liberação de calor. Através do ITC esse calor pode ser medido diretamente,
permitindo determinar todos os parâmetros termodinâmicos. Dessa forma, a
constante de ligação (kB), a estequiometria de ligação (n), a entalpia (∆H) e a
entropia (∆S) podem ser determinadas simultaneamente, fornecendo um perfil
termodinâmico da interação em um único experimento. A entalpia calorimétrica e a
constante de ligação podem ser determinadas diretamente a partir de um
experimento apenas, pela medida direta do calor da interação à medida que um
Material e Métodos
18
componente é titulado no outro. Os outros parâmetros para a interação estão
implícitos na relação expressa na Equação 3.1:
Equação 3.1
onde R é a constante dos gases, T é a temperatura experimental absoluta, kB é
constante de ligação, ∆H é a entalpia de ligação e ∆S a entropia de ligação. Os
instrumentos mais modernos de ITC permitem determinar constantes de ligação na
faixa de 103 a 109 M-1 (WISEMAN et al., 1989) Os parâmetros termodinâmicos,
especialmente ∆H e ∆S, revelam as forças que dirigem a interação entre as
moléculas, ou seja, informações acerca de mudanças conformacionais, ligações de
hidrogênio, interações hidrofóbicas e interações eletrostáticas.
Através de experimentos de ITC em diferentes temperaturas, pode-se
determinar a variação de capacidade calorífica (∆Cp) para a interação estudada,
através da Equação 3.2:
( ) ⁄ Equação 3.2
onde T1 e T2 são as duas temperaturas nas quais as determinações experimentais
foram feitas independentemente.
3.3.1 Determinação da velocidade de reação catalisada por enzimas através
da calorimetria de titulação isotérmica
A ITC consiste em uma ferramenta valiosa para medir de forma direta e
precisa os parâmetros cinéticos e termodinâmicos de uma reação enzimática. Uma
das grandes vantagens da técnica é que os reagentes ou produtos da reação não
precisam apresentar atividade óptica. Além disso, as medidas podem ser realizadas
sem modificações do substrato e sem necessitar do uso de reações acopladas.
Outra vantagem é que a amostra não necessita ser límpida, já que a técnica não
requer absorção ou emissão de luz.
Para uma determinada reação, o calor (Q) envolvido é proporcional à entalpia
da reação (ΔH) e, portanto, à quantidade de produto formado ([P]) em um
determinado volume de reação (V), como mostrado na Equação 3.3:
Material e Métodos
19
[ ] Equação 3.3
O método da ITC se baseia no fato de que o fluxo de calor, isto é, o calor
dissipado (dQ) em função do tempo (dt), é proporcional à velocidade de formação de
produto (dQ/dt), e pode ser descrito como na Equação 3.4:
[ ] Equação 3.4
A equação anterior pode ser rearranjada em termos de velocidade de reação,
como:
[ ] ⁄ Equação 3.5
Por essa equação, pode-se notar que para calcular a velocidade de reação é
necessário que o fluxo de calor seja medido, assim como a entalpia reacional. O
volume do meio reacional corresponde ao volume da cela calorimétrica, que no
calorímetro utilizado é de 1,422 mL.
3.4 Medidas de atividade da asparaginase em diferentes condições
A atividade da asparaginase foi determinada a 25 °C por ITC, como descrito
na seção 3.3.1. Para a determinação da atividade enzimática, a asparaginase era
diluída a uma concentração correspondente a 20 U/mL em água tipo I e mantida a 4
°C, após diluição. Uma unidade enzimática (U) de asparaginase é definida como a
quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de amônia por minuto
(Sigma). Nos experimentos de ITC, a seringa de injeção foi preenchida com
asparaginase e a cela de amostra foi preenchida com o meio de reação, composto
por asparagina (5 a 10 mM) no tampão apropriado. A reação foi iniciada pela injeção
de 7 µL de asparaginase na cela de reação (V = 1,422 mL) e acompanhada pelo
tempo necessário (de 5 a 15 minutos). Nessas condições, a concentração final de
asparaginase no meio de reação foi 0,1 U/mL e a reação estava em estado
estacionário.
As medidas da velocidade de reação foram realizadas em diferentes meios,
dependendo do que seria estudado. Para o efeito do pH sobre a atividade
Material e Métodos
20
enzimática, foram empregados diferentes tampões (10 mM): citrato de sódio (pH 2,0
e 2,5), acetato de sódio (pH 3,0 a 5,0), fosfato de sódio (pH 6,0), Tris:HCl (pH 7,0 a
9,0) e tetraborato de sódio (9,0 a 12,0). Para o estudo de efeito de osmólitos na
atividade da asparaginase, o meio de reação continha tampão fosfato de sódio 50
mM, pH 8,6 e diferentes concentrações de glicose (0,055 ou 0,5 M), sorbitol (0,5, 1,0
ou 3,0 M), glicerol (0,5 ou 3 M) ou NaCl (0,150 ou 0,5 M).
As medidas da velocidade de reação na presença das amidosulfobetaínas,
ASB-14 e ASB-16, foram feitas em concentrações acima e abaixo da concentração
micelar crítica desses surfactantes. Para o ASB-14, a atividade enzimática foi
estudada nas concentrações de 0,03 mM, 0,06 mM ou 1,0 mM. Para ASB-16, as
concentrações utilizadas foram 5 µM ou 1 mM. A concentração de asparagina no
meio de reação foi 10 mM no tampão Tris:HCl (10 mM) pH 8,0 e as medidas foram
feitas na ausência e na presença de ASB-14 ou ASAB-16.
A atividade da asparaginase foi medida em concentrações muito baixas de
enzima no meio. Nesses experimentos, a concentração de asparagina foi
aumentada para 50 mM e as velocidades de reação foram medidas em Tris:HCl (10
mM) em pH 8,0, 8,5 e 9,0. A concentração inicial da asparaginase na seringa foi 5,6
ηM ou 0,85 ηM, dependendo da concentração final desejada. A concentração de
asparaginase no meio de reação variou entre 3 e 16 ρM.
A determinação da atividade enzimática da asparaginase por ITC foi feita de
forma rotineira, a fim de fazer um controle da estabilidade enzimática após sua
diluição e armazenamento.
3.4.1 Determinação dos parâmetros cinéticos para a hidrólise da asparagina
catalisada pela asparaginase
A constante de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade máxima de reação (Vm)
foram determinadas em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,6 contendo diferentes
concentrações de asparagina (0,1; 0,2; 0,3; 0,4 ou 0,5 mM), a 25 °C. As reações
foram medidas com 0,025 U/mL da enzima, a partir da injeção de 3,5 µL de uma
solução de asparaginase a 10 U/mL preparada em água do tipo I. A reação era
acompanhada por 3 minutos, em condições de estado estacionário.
Km e Vm foram estimados pelo “método dos duplos recíprocos”, com base no
gráfico do inverso da velocidade inicial em função do inverso da concentração do
Material e Métodos
21
substrato. O gráfico de 1/Vi em função do inverso da concentração de substrato
resulta em uma reta descrita pela equação de Lineweaver-Burk:
[ ] Equação 3.6
onde Km é a constante de Michaelis-Menten, Vm representa a velocidade máxima da
reação, Vi, a velocidade inicial da reação e [S] a concentração de substrato. De
acordo com a Equação 3.6, a reta obtida corta o eixo das ordenadas em 1/Vm e o
eixo das abscissas em –1/Km, permitindo a obtenção dos parâmetros cinéticos Km e
Vm. O coeficiente angular corresponde à razão Km/Vm.
3.5 Determinação da concentração micelar crítica (CMC)
A caracterização termodinâmica dos surfactantes ASB-14 e ASB-16 foi feita
por meio de experimentos ITC. Os valores de CMC e da entalpia de micelização
(∆Hmic) para ambos os surfactantes foram determinados de 15 a 75 °C, em água do
tipo I. Em um experimento de desmicelização, uma solução micelar era colocada na
seringa e injetada na cela contendo água. Para o ASB-14, a concentração na
seringa foi de 5 mM, sendo que o número de injeções e o volume variavam de
acordo com a temperatura: em 15 °C (24 3 L), em 20, 25 e 30 °C (24 3 L), em
35 e 40 °C (7 3 L; 17 4 L), em 45 °C (9 5 L; 15 7 L), em 55 °C (20 7
L), em 65 °C (20 7 L) e em 75 °C (24 7 L). Para o ASB-16, a concentração
na seringa foi de 0,210 mM para os experimentos em 15, 20, 25 e 30 °C (21 10
L), 35, 40 °C (21 10 L) e 45 °C (8 5 L; 18 10 L). Para os experimentos em
55 °C (23 3 L), em 65 °C (7 10 L; 16 6 L) e em 75 °C (22 5 L), a
concentração de ASB-16 na seringa foi de 1 mM. Nos experimentos com ambos os
surfactantes, o intervalo entre as injeções foi de 5 minutos e agitação foi de 300 rpm.
A CMC do ASB-14 e do ASB-16 foi determinada também em Tris:HCl 10 mM,
pH 8,0, a 25 °C. Para esses experimentos, a cela calorimétrica continha Tris:HCl 10
mM, pH 8,0 apenas, asparagina 10 mM ou asparaginase 5 µM, ambas diluídas no
mesmo tampão. No caso de ASB-14, a concentração na seringa foi de 5 mM e foram
feitas 23 injeções de 3 µL. Para o ASB-16, a concentração na seringa foi de 0,210
mM e foram feitas 21 injeções de 10 µL. O intervalo entre as injeções foi de 5
minutos e as injeções foram feitas sob agitação de 300 rpm.
Material e Métodos
22
A integração dos picos calorimétricos a partir da linha de base resulta em uma
curva sigmoide, da entalpia calorimétrica (∆Hcal) em função da concentração do
surfactante. A entalpia de desmicelização do surfactante (ΔHdemic) foi calculada
como a diferença entre a entalpia obtida acima da CMC e aquela abaixo da CMC. A
ΔHdemic é igual em número, mas apresenta sinal oposto ao da entalpia de formação
micelar (ΔHmic). A CMC foi calculada pelo mínimo da primeira derivada da curva de
entalpia calorimétrica em função da concentração de ASB-14. A análise dos dados
foi feita no programa Origin 7, da MicroCal, Llc (Northamptom, MA, USA).
3.6 Calorimetria Diferencial de Varredura
A Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) é a técnica experimental mais
direta para se estudar a energética de transições de sistemas macromoleculares,
cujas estruturas encontram-se estabilizadas por interações não covalentes que são
susceptíveis a transições conformacionais ou mudanças de fase ao serem
aquecidas ou resfriadas em um intervalo de temperatura. Os sistemas biológicos que
podem ser estudados por DSC compreendem os lipídios, as proteínas, os ácidos
nucleicos e os carboidratos. A capacidade calorífica relativa de um sistema em
função da temperatura é a principal informação fornecida pelo DSC.
Em um experimento de DSC, a energia necessária para manter a cela de
amostra na mesma temperatura que a cela de referência durante o aquecimento é
registrada em termos de mcals-1, gerando um termograma. A energia é proporcional
à capacidade calorífica relativa (Cp, em cal/°C) de uma solução de macromolécula, e
o termograma é caracterizado por um processo de absorção (endotérmico) ou
liberação de calor (exotérmico).
A partir do termograma (Cp em função da temperatura), é possível determinar
os parâmetros termodinâmicos associados à transição, como variações de entalpia
(H), de entropia (S), de energia livre de Gibbs (G) e de capacidade calorífica
(Cp). A temperatura registrada no valor máximo de capacidade calorífica
corresponde à temperatura de transição (Tm) e fornece uma medida da estabilidade
térmica do sistema. No caso de proteínas, o conhecimento dos valores
termodinâmicos e sua dependência das condições do meio como pH, força iônica,
natureza do solvente ou presença de ligantes, associados ao conhecimento da
estrutura tridimensional das mesmas, permite interpretar e relacionar a energética
Material e Métodos
23
dos processos de enovelamento/desenovelamento às mudanças conformacionais
associadas a tais processos (LADBURY et al., 2004).
3.6.1 Características e princípios de funcionamento dos calorímetros de
varredura
O princípio de funcionamento de um calorímetro diferencial de varredura pode
ser resumido como descrito a seguir. Ao iniciar a varredura, é administrada a mesma
intensidade de corrente às resistências elétricas em íntimo contato com a superfície
das células. A adiabacidade do sistema é obtida através de duas carapaças
metálicas concêntricas (interna e externa), que recobrem as celas e separam-nas do
meio exterior e cujas temperaturas, sempre próximas às das celas, são controladas
por sistemas de retroalimentação. Quando ocorre um efeito termicamente induzido
(endotérmico) na cela de amostra, a temperatura desta diminui em relação à
referência. Essa diferença de temperatura momentânea é detectada por um sensor
que utiliza termopares, cujo sinal elétrico comanda um sistema de compensação que
administra um excesso de potência à cela de menor temperatura, para restabelecer
o equilíbrio de térmico entre as duas celas. O sinal registrado é proporcional a essa
potência de excesso (ou de compensação) e esta, à velocidade de varredura
constante, é diretamente proporcional à diferença de capacidade calorífica entre as
duas celas.
Os experimentos de DSC descritos nesta tese foram realizados em um
calorímetro do tipo VP-DSC (MicroCal, Llc). Esse calorímetro está esquematizado na
Figura 3.2 e consiste dos seguintes componentes principais, numerados de acordo
com o esquema: duas células idênticas, uma de amostra [1] e outra de referência [2],
que contêm tubos capilares para o preenchimento e limpeza. Os elementos de
aquecimento principais [3 e 4] para varreduras de aumento de temperatura são
dirigidos pela voltagem VII de uma fonte de alimentação [5] controlada através de
uma interface analógico-digital [30] do computador [6]. Os elementos de
aquecimento auxiliares [18 e 19], também controlados através da interface com o
computador, são ativados pelas voltagens (VII e VIV) e utilizados para calibração e
retroalimentação. Há um dispositivo para a medida do efeito térmico [7] e um sensor
[8] para medir a diferença de temperatura T1 entre as duas celas. Um escudo
térmico [9] circunda as celas e possui um sistema de aquecimento/resfriamento [10]
Material e Métodos
24
operado por um controlador [11], que responde a um sinal de um sistema que
procede de um amplificador [15]. O amplificador possui uma entrada em um terminal
[20] de um sensor [12] que mede a diferença de temperatura T2 entre o escudo e
as celas e no outro terminal [16] recebe a voltagem VI de uma fonte de força [17]
controlada pelo computador através da interface. O escudo ainda possui um
dispositivo [13] para a medida de temperaturas através de um sensor [14] disposto
na carapaça térmica. Os sinais de calibração T1 e T2, assim como a temperatura
absoluta, são registrados de forma contínua durante o experimento e são
armazenados na memória do computador [40], em intervalos designados pelo
operador (PLOTNIKOV et al., 1997).
O VP-DSC possui celas em forma de uma moeda oca, com tubos capilares de
1,5 mm de diâmetro interno. As celas são feitas de uma liga metálica de tântalo,
denominada Tantaloy 61, que é inerte à maioria das substâncias, inclusive ácidos,
mas apenas parcialmente resistente a soluções fortemente alcalinas. Normalmente,
o volume efetivo das celas é de aproximadamente 0,5 mL e o volume preciso é
fornecido pelo fabricante; no caso do DSC utilizado nesta tese, o volume das celas é
de 0,5227 mL.
As soluções de referência e amostra são transferidas para as celas através de
uma seringa e o excesso removido por uma seringa que possui uma haste especial,
a qual entra na cela até uma altura fixa e retira um volume fixo de solução. Esse
método permite maior reprodutibilidade dos experimentos.
Material e Métodos
25
Figura 3.2: Diagrama do calorímetro diferencial de varredura VP-DSC. Detalhes no texto
(PLOTNIKOV et al., 1997).
O intervalo de temperatura em que se pode trabalhar no VP-DSC é de -10 a
130 °C, sendo que a velocidade de varredura pode variar de 0,1 a 2 °C/min, tanto
para o aquecimento quanto para o resfriamento da amostra. O VP-DSC possui um
sistema de pressurização que permite o uso de pressões que variam até 35 psi.
O tempo de resposta pode ser selecionado entre 1 e 30 s. Para transições
largas, comuns entre proteínas, é recomendado o uso de tempos de resposta
maiores. Já para transições mais estreitas, comuns em membranas, é mais
conveniente utilizar tempo de resposta mais curto, para evitar distorções do
termograma (MICROCAL, 2005).
O VP-DSC é controlado através do programa de computador VP-Viewer, no
qual os parâmetros experimentais, tais como o número e velocidade de varreduras,
as temperaturas de início e de fim, tempo de equilíbrio entre cada varredura e o
Material e Métodos
26
tempo de resposta podem ser definidos. Esse programa ainda permite que sejam
feitas mudanças de alguns parâmetros durante o experimento. As varreduras são
cíclicas e cada uma é automaticamente salva em um arquivo ASCII. A análise dos
dados é feita no programa Origin 7.0, fornecido pela MicroCal, Llc (Northamptom,
MA, USA).
3.6.2 Medidas dos parâmetros termodinâmicos para a desnaturação térmica
da asparaginase
Os parâmetros termodinâmicos para a desnaturação térmica da asparaginase
foram obtidos através de experimentos de DSC. Como a presença de manitol não
afetou a estabilidade térmica da asparaginase, os experimentos foram feitos com a
enzima não dialisada.
Como forma de controlar a qualidade da preparação, era feito um termograma
no tampão apropriado (Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 ou fosfato de sódio 50 mM, pH 8,6,
dependendo do experimento). Na prática, as duas celas calorimétricas não são
exatamente idênticas e, portanto, é necessário registrar uma série de termogramas
com ambas as celas contendo tampão, que representa o sinal introduzido pela
assimetria das celas e outros fatores instrumentais. Além disso, é importante fazer
vários ciclos com a mesma temperatura de início e fim, na mesma velocidade de
varredura para a obtenção de uma linha de base experimental estável. Assim, as
primeiras varreduras foram feitas com ambas as celas preenchidas com tampão e
quando a linha de base se mostrava estável, a solução contendo a proteína foi
inserida na cela de amostra.
O tampão utilizado foi desgaseificado antes de ser utilizado na diluição da
amostra e subsequente aplicação nas celas do calorímetro. As aquisições foram
feitas, preferencialmente, de 20 a 75 °C, com a velocidade de 1 °C/min e as celas
foram submetidas a uma pressão de 26 psi. Após a primeira varredura com a
proteína, a amostra foi deixada por mais um ciclo de aquecimento. Isso permite
observar o grau de reversibilidade da transição calorimétrica, que pode ser expresso
em termos da porcentagem da área da curva recuperada durante a segunda
varredura com a amostra. No caso da asparaginase, as transições obtidas foram
reversíveis dependendo da condição estudada.
Material e Métodos
27
A análise dos dados foi feita no programa Origin 7.0 (MicroCal, Llc), que
possui um menu para análise dos dados de DSC. Este pacote de análise envolve
subtração da linha de base, definição de uma conexão entre o estado nativo e
desnaturado e ajuste de curvas experimentais a modelos pré-definidos.
Os modelos de transição de “dois estados” e “não dois estados” foram
utilizados para a análise matemática das curvas experimentais. Para do modelo de
“dois estados” o ajuste da curva teórica aos dados fornece os valores da
temperatura média da curva de desnaturação (Tm) e da entalpia calorimétrica (ΔHcal).
No segundo modelo, para cada curva ajustada obtém-se os seguintes parâmetros: a
temperatura média da curva de desnaturação (Tm), entalpia calorimétrica (ΔHcal) e a
entalpia de van’t Hoff (ΔHvH). A entalpia calorimétrica é obtida por meio da
integração da curva de capacidade calorífica (Cp) em função da tempertaura. Essa
curva, depois da correção da linha de base, representa a energia total absorvida
pela amostra durante a transição. A área sob a curva calorimétrica é dependente da
concentração de amostra e, dessa forma, independe de modelo para a
determinação da entalpia absoluta envolvida no processo de transição. Já a entalpia
de van’t Hoff é uma estimativa de entalpia baseada em um modelo assumido para
aquele processo. A área sob a curva de capacidade calorífica em qualquer
temperatura dividida pela área total é uma medida da fração de moléculas
desnaturadas presentes naquela temperatura. A análise da entalpia de van’t Hoff se
baseia nas razões das áreas sob a curva experimental e, portanto, não requer
informação sobre a concentração ou pureza da amostra.
Os experimentos para a avaliação do efeito de osmólitos sobre a estabilidade
térmica da asparaginase foram feitos em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,6,
com uma concentração de asparaginase (em monômeros) de 12 µM. As varreduras
foram feitas de 20 a 75 °C, com uma velocidade de varredura de 1 °C/min. Os
osmólitos estudados foram glicose (0,055; 0,5 M), sorbitol (0,5; 1,0; 3,0 M), manitol
(0,01; 0,05; 0,5 M), glicerol (1,0; 3,0 M) e NaCl (0,15; 0,5 M). Após o término da
primeira varredura, a amostra era deixada para um segundo ciclo de aquecimento, a
fim de verificar a reversibilidade da transição.
O efeito dos surfactantes ASB-14 e ASB-16 sobre a estabilidade térmica da
asparaginase foi estudado em Tris:HCl 10 mM, pH 8,0, com uma concentração de
13,6 µM de asparaginase (monômeros). Os experimentos foram feitos na ausência e
Material e Métodos
28
na presença de concentrações monoméricas e micelares desses surfactantes. Para
ASB-14, as concentrações estudadas foram 0,03; 0,06 e 1,0 mM. Os termogramas
foram obtidos de 20 a 75 °C, com uma velocidade de varredura de 1 °C/min.
Os experimentos variando-se a concentração de asparaginase foram
realizados de 2 µM a 200 µM de proteína (concentrações de monômero) em Tris:HCl
10 mM, pH 9,0. A faixa de temperatura foi de 20 a 75 °C e a velocidade de
varredura foi 1 °C/min. O experimento com 200 µM de asparaginase foi repetido com
a velocidade de varredura de 0,1 °C/min, de 20 a 75 °C.
A estabilidade da asparaginase foi avaliada de pH 2,0 a 13,0. Nesses
experimentos, a concentração de asparaginase em termos de monômeros foi 13,6
µM, entre pH 3,0 e 11,0. Em pH 2,0, 12,0 e 13,0, a concentração de asparaginase foi
41,6 µM, devido à menor entalpia de transição. Os tampões utilizados foram citrato
de sódio (pH 2,0), acetato de sódio (pH 3,0 a 5,0), fosfato de sódio (pH 6,0), Tris:HCl
(pH 7,0 a 9,0) e tetraborato de sódio (pH 10,0 a 13,0). A concentração dos tampões
foi 10 mM. Os experimentos foram feitos de 20 a 75 °C, com a velocidade de
varredura de 1 °C/min e a reversibilidade da transição foi verificada em um segundo
ciclo de aquecimento da amostra.
Para verificar se a desnaturação da asparaginase é dependente de processos
cineticamente dirigidos, testou-se a dependência de Tm e de ΔHcal em função da
velocidade de varredura. Nesses experimentos, as velocidades de varredura
utilizadas foram 0,2 °C/min, 0,5 °C/min, 1,5 °C/min, além de 1 °C/min. A
concentração de asparaginase, expressa em concentração de monômeros, foi 13,6
µM. Os termogramas foram obtidos em Tris:HCl 10 mM, em pH 8,0, 8,5 e 9,0. Os
termogramas foram obtidos de 20 a 75 °C e a reversibilidade desses experimentos
também foi verificada em um segundo ciclo de aquecimento da amostra.
O efeito de concentrações subdesnaturantes de ureia e cloridrato de
guanidina sobre a estabilidade térmica da asparaginase foi determinado em Tris:HCl
10 mM, pH 8,0. Os termogramas foram obtidos de 20 a 75 °C e a velocidade de
varredura foi 1 °C/min. A concentração de asparaginase foi 8 µM, em termos de
monômeros. As concentrações de ureia foram 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 M. As
concentrações de cloridrato de guanidina foram 0,2; 0,4 e 0,6 M. As concentrações
subdesnaturantes de ureia e cloridrato de guanidina foram determinadas através de
Material e Métodos
29
experimentos de fluorescência, em que o centro de massa era igual àquele obtido na
ausência de ureia, indicando que a estrutura da enzima estava mantida.
3.7 Avaliação da estrutura secundária da asparaginase por dicroísmo
circular
A luz plano polarizada pode ser decomposta em dois componentes
circularmente polarizados de igual magnitude, um com rotação no sentido horário
(direita) e outro no sentido anti-horário (esquerda). O dicroísmo circular (CD) se
refere à absorção diferencial desses dois componentes. Se após passar pela
amostra esses componentes não são absorvidos ou são absorvidos na mesma
proporção, a recombinação desses feixes irá resultar em radiação polarizada no
plano original. Contudo, se esses feixes são absorvidos de forma diferencial pela
amostra, a radiação resultante terá polarização elíptica (KELLY et al., 1997, 2005).
O estudo do espectro de CD na região do UV distante, compreendida entre
180/190 e 240 nm, pode ser usado para acessar quantitativamente o conteúdo de
estrutura secundária das proteínas. Nessa região, o principal grupo de absorção é
representado pelas ligações peptídicas. Os diferentes tipos de estruturas
secundárias encontradas em proteínas apresentam diferentes espectros de CD no
UV distante (Figura 3.3). As α-hélices são caracterizadas por dois picos negativos,
em 208 e 222 nm, e um pico positivo em torno de 192 nm; já as folhas-β são
caracterizadas por um pico negativo na região de 216 nm, um positivo entre 190-195
nm e outro pico negativo em torno de 175 nm, enquanto as estruturas ao acaso são
caracterizadas por um pico negativo em 198 nm (PELTON et al., 2000).
Material e Métodos
30
Figura 3.3: Espectro de dicroísmo circular em UV distante das diferentes estruturas secundárias. α-hélice (linha contínua); folhas-β anti paralelas (tracejado longo); volta-β do tipo I (pontilhado); hélice 310 ou hélice poli-(Pro) II (traço e cruz); estrutura irregular (tracejado curto) (KELLY et al., 1997).
Os experimentos de CD com a asparaginase foram feitos em um
espectropolarímetro Jasco-710 (Jasco Instruments, Tokyo, Japão). A estabilidade
proteica foi estudada na presença de agentes desnaturantes químicos (ureia e
cloridrato de guanidina), em função do pH e em função da temperatura.
Para os experimentos de desnaturação química, a asparaginase foi incubada
por 12 h a 4 °C, em diferentes concentrações de ureia (1,0; 2,0; 3,0; 3,25; 3,5; 3,75;
4,0; 4,2; 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 5,0; 5,25; 5,5; 5,75 e 6,0 M) ou de cloridrato de
guanidina (0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,02; 1,04; 1,06; 1,08; 1,1; 1,12; 1,14; 1,16; 1,18;
1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2 M). Nesses experimentos, a concentração de asparaginase
foi 2 ou 20 µM, em tetrâmeros. O tampão utilizado foi Tris:HCl 10 mM, pH 8,0. Os
espectros foram obtidos de 260 a 190 nm, em uma cubeta de quartzo de 0,2 cm (2
µM) ou 0,02 cm (20 µM) de caminho óptico, a 25 °C. A velocidade da varredura foi
Material e Métodos
31
50 nm·min-1, com largura de banda de 2 nm. Os espectros foram obtidos com 3
acumulações.
A estrutura secundária da asparaginase (2 µM, tetrâmeros) também foi
avaliada em função do pH. Os experimentos foram feitos de pH 2,0 a 13,0. Os
tampões utilizados foram citrato de sódio (pH 2,0), acetato de sódio (pH 3,0 a 5,0),
fosfato de sódio (pH 6,0), Tris:HCl (pH 7,0 a 9,0) e tetraborato de sódio (pH 10,0 a
13,0). A concentração dos tampões foi 10 mM. Os espectros foram obtidos a 25 °C
em uma cubeta de caminho óptico de 0,05 cm, de 260 a 190 nm com 6
acumulações, velocidade de varredura de 50 nm·min-1 e largura de banda de 2 nm.
Para os experimentos de desnaturação térmica, a intensidade do sinal
negativo em 222 nm foi acompanhada em função da temperatura. Os experimentos
foram obtidos de 25 a 75 °C, e os valores da intensidade em 222 nm foram
adquiridos a cada 1 °C. O aumento da temperatura foi feito a uma velocidade de 1
°C/min. A concentração de asparaginase foi 2 µM, em tetrâmeros, e a amostra foi
preparada em tampão Tris:HCl 10mM, pH 8,0, 8,5 ou 9,0. A cubeta utilizada tinha
caminho óptico de 0,2 cm.
3.8 Fluorescência intrínseca de proteínas
A fluorescência é uma técnica espectroscópica muito utilizada para o estudo
da estrutura terciária de proteínas. Essa técnica pode fornecer informações quanto
ao meio em que a molécula se encontra apenas pela determinação da intensidade e
da posição do espectro de emissão de fluorescência. Os grupos capazes de emitir
fluorescência chamam-se fluoróforos. No estado fundamental, eles se encontram
num estado energético relativamente baixo e não fluorescem.
A emissão de fluorescência é observada quando um elétron excitado no
estado singlete (S1) retorna ao seu estado fundamental (S0). Devido às perdas de
energia que podem ocorrer durante a permanência no estado excitado, o espectro
de emissão de fluorescência apresenta-se deslocado para comprimentos de onda de
menor energia em relação ao comprimento de onda de excitação do fluoróforo (VAN
HOLDE et al., 1998).
As propriedades conformacionais de proteínas e peptídeos podem ser
estudadas pela fluorescência intrínseca de resíduos de triptofano, tirosina e
fenilalanina. Esses três resíduos absorvem e emitem fluorescência em
Material e Métodos
32
comprimentos de onda distintos e também diferem em relação ao rendimento
quântico e à meia vida (Tabela 3.1). As mudanças na fluorescência intrínseca de
uma proteína podem ser utilizadas para monitorar mudanças estruturais. Em
proteínas, o máximo de emissão do triptofano pode estar próximo de 320 nm,
quando esses resíduos estão protegidos no interior da estrutura.
Dependendo do comprimento de onda de excitação, a emissão de
fluorescência de proteínas pode ser determinada, principalmente, pela contribuição
de resíduos de triptofano, podendo ainda ter a contribuição de emissões de tirosinas
e fenilalaninas. Entre os aminoácidos aromáticos, o triptofano possui maior
rendimento quântico (Tabela 3.1). Além disso, tanto a intensidade como o
comprimento de onda de emissão máximo para esse aminoácido são dependentes
da polaridade do solvente.
Tabela 3.1: Características de absorção e emissão de fluorescência dos
aminoácidos aromáticos em água
Resíduos Tempo de
vida (s)
Absorção Fluorescência
Comprimento
de onda (nm)
ε
(M-1·cm-1)
Comprimento
de onda (nm)
Rendimento
Quântico
Triptofano 2,6 280 5.600 348 0,20
Tirosina 3,6 274 1.400 303 0,14
Fenilalanina 6,4 257 200 282 0,04
http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmocz/fluor.htm
A tirosina apresenta forte absorção em 280 nm, mas a fluorescência emitida
por esse aminoácido é de menor intensidade que a do triptofano, pois apresenta
menor rendimento quântico. Já a fenilalanina apresenta fluorescência fraca, sendo
baixa a sensibilidade experimental para esse resíduo, o que faz com que sua
fluorescência seja observada apenas quando não há resíduos de tirosina e triptofano
(Tabela 3.1).
Os espectros de absorção e de excitação de triptofano, tirosina e fenilalanina
estão mostrados na Figura 3.4. Tanto a emissão de triptofanos quanto a de tirosinas
podem ser observadas quando a proteína é excitada em 280 nm. Já a fluorescência
Material e Métodos
33
de triptofanos pode ser observada seletivamente pela excitação da molécula em 295
nm. A variação de fluorescência dos resíduos aromáticos é pouco previsível em
várias proteínas. A magnitude de intensidade de emissão pode servir como uma
prova de perturbações do estado nativo. O comprimento de onda da luz emitida é a
melhor indicação do ambiente do fluoróforo. Resíduos de triptofano expostos à água
têm fluorescência máxima em torno de 350 nm, enquanto resíduos protegidos no
interior da estrutura protéica apresentam fluorescência em comprimentos de onda
mais baixos, variando de acordo o grau de exposição ao solvente. A intensidade e o
comprimento de onda de emissão máximo para esse aminoácido são dependentes
da polaridade do solvente. O espectro muda para comprimentos de onda menores e
a intensidade de fluorescência aumenta à medida que a polaridade do solvente
diminui. Essa característica é muito importante para o estudo de proteínas
(http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmoc
z/fluor.htm).
Figura 3.4: Espectro de excitação dos aminoácidos aromáticos. A linha contínua representa o espectro de absorção óptica e os pontos são os valores da fluorescência relativa à excitação com o comprimento de onda de absorção máxima. Adaptado de TEALE et al.,
1957.
Tirosina Triptofano
Fenilalanina
Material e Métodos
34
Os experimentos de fluorescência foram conduzidos em um
espectrofluorímetro modelo ISS K2 (ISS Inc., Champaign, IL, EUA). Os espectros de
emissão de fluorescência intrínseca da asparaginase foram obtidos em tampão Tris:
HCl 10 mM, pH 8,0, na ausência e na presença de concentrações crescentes de
ureia ou cloridrato de guanidina. Os espectros foram obtidos a 25 °C. Para os
experimentos de desnaturação química, a proteína foi incubada por 12 h a 4 °C, em
concentrações crescentes de ureia (1,0; 2,0; 3,0; 3,25; 3,5; 3,75; 4,0; 4,2; 4,4; 4,5;
4,6; 4,7; 4,8; 5,0; 5,25; 5,5; 5,75 e 6,0 M) ou de cloridrato de guanidina (0,2; 0,4; 0,6;
0,8; 1,0; 1,02; 1,04; 1,06; 1,08; 1,1; 1,12; 1,14; 1,16; 1,18; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2
M). Nesses experimentos, as concentrações de asparaginase foram 2 ou 20 µM. Os
espectros foram adquiridos de 300 a 420 nm, com excitação em 280 nm e 295 nm. A
largura de banda de excitação foi 2 nm, enquanto a de emissão foi 1 nm.
O efeito do pH sobre a estrutura terciária da asparaginase foi avaliado através
da obtenção dos espectros de emissão de fluorescência de pH de 2,0 a 13,0. Os
tampões utilizados foram citrato de sódio (pH 2,0), acetato de sódio (pH 3,0 a 5,0),
fosfato de sódio (pH 6,0), Tris:HCl (pH 7,0 a 9,0) e tetraborato de sódio (pH 10,0 a
13,0). A concentração dos tampões foi 10 mM. Os espectros foram adquiridos de
310 a 420 nm, com excitação em 295 nm. A concentração de asparaginase foi 2 µM.
A largura de banda de excitação foi 2 nm, enquanto a de emissão foi 1 nm.
A desnaturação térmica da asparaginase foi avaliada pelas variações no
centro de massa da proteína em função da temperatura. Nesses experimentos, a
concentração de asparaginase foi 3,5 µM em Tris:HCl 10 mM, pH 8,0; 8,5 ou 9,0. O
comprimento de onda de excitação foi 295 nm e o comprimento de emissão foi
fixado em 310, 320, 325, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400 e 410 nm, para se
obter as intensidades de fluorescência nesses comprimentos de onda de forma a se
obter um espectro de emissão de fluorescência. Os espectros foram obtidos de 25 a
75 °C, em intervalos de 1 °C, com aquecimento da amostra à velocidade de 1
°C/min. A largura de banda de excitação e de emissão foi 5 nm.
O centro de massa dos espectros de fluorescência nas diferentes condições
estudadas foi calculado de acordo com a Equação 3.7:
Equação 3.7
Material e Métodos
35
onde λ é o comprimento de onda de emissão e Iλ é a intensidade de fluorescência
no comprimento de onda λ.
O grau de desnaturação (α) proteica devido ao calor, ureia ou cloridrato de
guanidina pode ser calculado segundo a Equação 3.8:
[ ] Equação 3.8
onde α é a fração de proteína desenovelada, λD é o centro de massa na presença do
agente desnaturante, λ0 é o centro de massa da proteína nativa na ausência do
agente desnaturante e Δλ é a mudança total no centro de massa espectral devido à
total desnaturação proteica.
3.8.1 Estudos com alta pressão hidrostática e fluorescência intrínseca
As mudanças no espectro de fluorescência intrínseca da asparaginase
também foram monitoradas em função do aumento de pressão hidrostática. Nesses
experimentos, a concentração de asparaginase era 2 µM e a amostra foi diluída em
tampão Tris:HCl 10 mM, pH 8,0. Como a enzima se mostrou muito estável frente ao
aumento de pressão, foram usadas concentrações subdesnaturantes de ureia em
associação com a alta pressão para tentar dissociá-la. Nesses experimentos, a
enzima era incubada por 12 h, a 4 °C nas concentrações de 3,5; 3,75; 3,9 ou 4,0 M
de ureia em tampão Tris:HCl 10mM, pH 8,0.
A célula de alta pressão foi descrita por Paladini e Weber, em 1981, é
fabricada por ISS Inc. (Urbana-Champaign, IL) em aço vascomax e possui três
janelas de safira ou quartzo. Ela possui uma abertura superior, através da qual a
cubeta de quartzo em formato de garrafa é inserida e um tubo flexível conecta a
bomba ao gerador de pressão. A cubeta é fechada por uma tampa flexível de
polietileno, que equaliza a pressão entre a amostra no seu interior e o meio externo,
que contém etanol. A célula de pressão é preenchida com etanol absoluto, pois este
possui índice de refração semelhante ao do quartzo, evitando assim o desvio da luz
até a amostra. A luz que incide sobre a amostra é coletada a um ângulo de 90o. O
gerador de pressão é composto por um pistão, operado manualmente, que
comprime o etanol no interior da tubulação e também a amostra. A pressão no
sistema é registrada através de um manômetro (SILVA & WEBER, 1993).
Material e Métodos
36
A partir dos experimentos de pressão, pode-se calcular a variação de volume
decorrente da dissociação proteica (ΔV) e a constante de equilíbrio (Kd) para a
dissociação por pressão, extrapolada para a pressão atmosférica. Essa relação é
expressa na Equação 3.9:
[
] (
) (
)
Equação 3.9
onde αp é a fração de proteína dissociada em cada ponto de pressão, C é a
concentração proteica, R é a constante dos gases e T a temperatura. Essa equação
permite calcular a variação de volume a partir de medidas empregando uma
concentração fixa de proteína em diferentes valores de pressão (SILVA & WEBER,
1993).
3.9 Espectroscopia em UV-Visível
Os espectros de absorção da asparaginase foram obtidos em um
espectrofotômetro GBC UV-Visível 920 (Melbourne, Austrália). Os espectros foram
obtidos em função do pH e a concentração da asparaginase foi 3,4 µM. Os tampões
utilizados foram citrato de sódio (pH 2,0), acetato de sódio (pH 3,0 a 5,0), fosfato de
sódio (pH 6,0), Tris:HCl (pH 7,0 a 9,0) e tetraborato de sódio (pH 10,0 a 13,0). A
concentração dos tampões foi 10 mM. O intervalo de comprimento de onda estudado
foi de 330 a 250 nm, com velocidade de varredura de 200 nm/s e filtro de 0,96 nm.
3.10 Microscopia de Força Atômica (AFM)
O microscópio de força atômica utiliza uma ponta fina montada sobre a
extremidade de um cantilever flexível para analisar propriedades de uma amostra,
incluindo suas características topológicas e mecânicas.
Por meio dessa técnica, é possível adquirir imagens topográficas de uma
amostra biológica sob condições experimentais variadas. A imagem da amostra já é
capaz de fornecer um grande número de informações de caráter morfológico e, além
disso, a possibilidade de se operar o equipamento em diferentes modos, permite a
obtenção de uma maior variedade de dados, como adesão, rigidez e elasticidade, o
que aumenta a riqueza de informações sobre a amostra.
Material e Métodos
37
O princípio de funcionamento do AFM consiste na medida das deflexões da
sonda enquanto uma ponta fina faz a varredura da amostra. Essas deflexões são
consequência da interação entre a ponta e a amostra. As sondas são feitas
normalmente de Si ou Si3N4 e são constituídas por uma ponta de dimensões
micrométricas e por um braço de suporte chamado cantilever, na qual ela se apoia.
As deflexões do cantilever indicam a força de interação entre a amostra e a ponta.
O cantilever pode ser visto como uma mola que sofre deflexões provocadas
por uma força (F), exercida pela amostra sobre a ponta e dada pela relação F= -k x,
sendo x o deslocamento e k a constante de força elástica.
A microscopia de força atômica baseia-se na varredura da superfície da
amostra pela ponta, de forma que a mesma é posicionada próxima ou em contato
com a amostra de acordo com o modo de operação do equipamento. Um feixe de
laser é incidido e refletido na parte superior do cantilever, passando por um espelho
e incidindo sobre o fotodetector de quatro quadrantes. Conforme a ponta passa pela
amostra, variações topográficas e de composição na sua superfície fazem com que
as interações se modifiquem levando a diferentes deflexões do cantilever. Essas
diferenças são captadas no detector por meio dos desvios do laser, que incide de
forma distinta em cada um dos quadrantes do fotodetector. A varredura é realizada
por um scanner de cerâmica piezelétrica capaz de se movimentar nas três direções
(x, y, e z). Os materiais piezelétricos sofrem deformações quando submetidos a
variações de voltagem, permitindo o controle da varredura. O esquema do AFM é
mostrado na figura abaixo:
Material e Métodos
38
Figura 3.5: Esquema do sistema de microscopia de força atômica. Detalhes no texto (FERREIRA & YAMANAKA, 2006).
A funcionalização do substrato para os experimentos de AFM é uma etapa
muito importante. A amostra deve ser depositada sobre uma superfície
perfeitamente lisa de forma forte o suficiente, para evitar que se solte durante a
varredura. Essa superfície, chamada também de substrato, deve ser
anatomicamente lisa na faixa de micrometros. A mica muscovita é o substrato mais
popular e conveniente que permite a adsorção eletrostática das moléculas. O
mineral é composto de camadas cristalinas finas, e torna-se carregado
negativamente em líquidos. A carga e a força eletrostática geradas são suficientes
para manter a maior parte dos complexos proteicos adsorvidos, uma vez que em
valores de pH próximos do neutro, a maioria das proteínas são carregadas
positivamente.
O AFM pode ser operado em três modos: modo de contato, modo de contato
intermitente (tapping mode) e modo de não contato. No modo de contato, a ponteira
e os átomos da amostra estão em contato direto levando à deflexão do cantilever.
Apesar da alta resolução das imagens obtidas, as forcas originadas podem causar
danos à amostra e à ponta da sonda ou mover moléculas que não estejam
apropriadamente adsorvidas à superfície. Sendo assim, esse modo é aplicado em
amostras secas ou fixadas, ou quando o deslocamento da amostra é desejado
(GACZYNSKA et al., 2008).
Material e Métodos
39
No modo de conato intermitente, a ponta toca a amostra apenas de forma
breve e com uma baixa força, oferecendo condições praticamente não invasivas. O
sensor vibra de forma vertical durante a varredura (tapping mode). A proximidade
dos átomos da amostra sob varredura leva a mudanças na amplitude das oscilações
do cantilever devido à forca de van der Waals e eletrostática. Mudanças na
amplitude das oscilações do cantilever são traduzidas em topografia oferecendo um
mapa tridimensional da superfície externa da amostra. Além da amplitude,
mudanças na fase de vibração do cantilever podem ser registradas. Para a aquisição
dessas informações, o equipamento deve detectar, além das variações na amplitude
de oscilação, atrasos na fase de oscilação, ou seja, retardamentos em um ciclo de
ressonância do cantilever decorrentes das interações com a amostra. O
retardamento de fases é ocasionado por superfícies mais adesivas ou moles e o
progresso rápido da fase é característico de superfícies mais duras. A imagem de
fase é importante para o monitoramento da elasticidade, viscosidade ou carga na
superfície das amostras (GACZYNSKA et al., 2008).
No modo de não-contato, o cantilever é mantido de dezenas a centenas de
ângstrons da superfície da amostra e a força interatômica entre a ponta e a amostra
é atrativa. Neste caso a ponta oscila em alta frequência, a poucos nanômetros acima
da superfície e a força total entre a ponta e a amostra é muito baixa. O modo de não-
contato não sofre os efeitos do atrito sobre a amostra, causada pela ponta, conforme
é observado no modo contato após diversas varreduras.
As amostras de asparaginase para AFM foram preparadas em água tipo I
com pH ajustado para 9,0. Após o ajuste de pH, a água foi filtrada em filtros de 0,22
µM, para retirar partículas que pudessem estar presentes e que causariam
interferências nas medidas de AFM. Para esses experimentos, a asparaginase foi
dialisada em um microdialisador contra água pH 9,0, sob agitação a 4 °C por 1 h,
com uma troca, para a retirada de todo manitol.
As amostras de asparaginase (0,05 µM, pH 9,0) foram analisadas em
temperatura ambiente, em 63 °C, que corresponde à Tm obtida por DSC em pH 9,0
e em 67 °C, que corresponde ao final do pico de transição calorimétrica. Para
preparar as placas para a observação no AFM, uma amostra de 20 µL de
asparaginase foi colocada sobre uma lamínula coberta com mica, que era clivada
apenas no momento em que a amostra era colocada. As amostras em 63 e 65 °C
Material e Métodos
40
foram incubadas na estufa, cuja temperatura já estava previamente equilibrada nos
valores de interesse. Essas amostras, depois de colocadas na mica, foram secas
dentro da própria estufa, para manter a temperatura.
As amostras foram examinadas em um microscópio NT-MDT NTEGRA,
operando no modo de semi-contato. A análise foi feita usando-se o programa Nova,
versão 1.0.26. A análise estatística dos dados foi feita com o programa Origin 6,
MicroCal, Llc (Northamptom, MA, USA) ou com o programa INSTAT
(www.graphpad.com).
3.11 Medidas de Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
A microscopia eletrônica de transmissão é uma técnica muito útil para a
observação direta de estruturas, capaz de formar imagens a nível atômico. Em
microscópio eletrônico de transmissão um feixe de elétrons é emitido em direção a
uma amostra ultra fina e interage com a mesma enquanto a atravessa. A interação
dos elétrons transmitidos através da amostra forma uma imagem que é ampliada e
focada em um dispositivo de imagem, como uma tela fluorescente em uma camada
de filme fotográfico, ou detectada por um sensor como uma câmera CCD.
Em um microscópio eletrônico de transmissão, um feixe de elétrons
monocromático é acelerado através de um potencial de 40 a 100 kV e passa por um
campo magnético forte, que funciona como uma lente. A resolução de um
microscópio eletrônico de transmissão é de 0,2 nm, a qual é, aproximadamente,
1000 vezes superior a de um microscópio ótico, por exemplo. O contraste de
imagem é obtido pela interação do feixe de elétrons com a amostra. Na imagem de
MET, áreas mais densas da imagem e áreas que contem elementos pesados
aparecem mais escuras devido ao espalhamento dos elétrons na amostra.
As medidas de MET foram feitas em um microscópio Morgagni, FEI, a 80 kV.
As amostras foram preparadas pela diluição da asparaginase à concentração final
de 0,05 μM em água tipo I, pH 9,0. As amostras foram preparadas em temperatura
ambiente, em 63 e em 65 °C. Um volume de 3 μL dessa solução era colocado sobre
uma grade de cobre forrada com formvar para MET. As amostras em 63 e 65 °C
foram incubadas na estufa, cuja temperatura já estava previamente equilibrada nos
valores de interesse. Essas amostras, depois de colocadas na grade, foram secas
dentro da própria estufa para manter a temperatura. As amostras em temperatura
Material e Métodos
41
ambiente foram deixadas para decantar por 5 minutos e o excesso de água foi
retirado com o auxílio de um papel de filtro. Depois de secas, foi feita a contrastação
negativa das grades, com acetato de uranila a 5%, por 5 minutos. A análise
estatística dos dados foi feita com o programa INSTAT (www.graphpad.com).
Resultados e Discussão
42
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização da asparaginase de Escherichia coli em sistemas
biomiméticos
A caracterização cinética da asparaginase de Escherichia coli foi realizada
pelo emprego da técnica de ITC, com o objetivo de encontrar um sistema de
encapsulação da enzima para que a mesma tenha uma maior eficiência catalítica
e/ou estabilidade. Com isso, esperamos sugerir um sistema que diminua a dose
necessária e, portanto, os efeitos tóxicos comumente encontrados no tratamento de
leucemia linfoblástica aguda. Neste trabalho, mostramos a caracterização cinética da
enzima em meio aquoso e na presença de sistemas biomiméticos (micelas
aquosas).
4.1.1 Determinação dos parâmetros cinéticos por calorimetria de titulação
isotérmica
Os parâmetros cinéticos da asparaginase de Escherichia coli descritos na
literatura foram determinados através de métodos colorimétricos de baixa
sensibilidade (WHELAN & WRISTON, 1969). A técnica de ITC tem sido utilizada
para medidas de cinéticas de reações, apresentando alta sensibilidade e
reprodutibilidade dos dados (BIANCONI, 2004). A vantagem de empregar o ITC para
determinação dos parâmetros cinéticos de uma reação é o fato de não ser
necessário o uso de um substrato modificado ou de uma reação acoplada para
medir as velocidades de reação. Além disso, o produto não precisa apresentar
atividade óptica e a amostra pode ser turva.
No caso da asparaginase, os outros métodos disponíveis até então
dependem de uma reação colorimétrica, a qual é considerada pouco sensível. Como
descrito anteriormente, a hidrólise da asparagina gera ácido aspártico e amônia. A
medida da atividade da asparaginase é feita, normalmente, através da medida da
formação de amônia com o reagente de Nessler. O reagente de Nessler reage com
a amônia no meio de reação formando um produto amarelo-acastanhado, cuja
absorbância é medida em 480 nm. O coeficiente de extinção molar do produto
formado é igual a 1.130 ± 50 M-1cm-1, ou seja, muito baixo para garantir uma medida
precisa. O método de Nessler não apresenta sensibilidade suficiente para medir
Resultados e Discussão
43
cinéticas de reações com o substrato em concentrações abaixo de 1,0 mM. Dessa
forma, não é possível utilizar esse método se o valor de Km for menor que 1,0 mM,
como é o caso da asparaginase.
Outro método para medir a velocidade da reação catalisada pela
asparaginase, mais sensível que o método de Nessler, é o emprego de um análogo
do substrato, o ácido aspártico-β-hidroxamato (AHA) (DERST et al., 2000). O ensaio
com o AHA baseia-se na reação entre a hidroxilamina liberada pelo AHA com a 8-
hidroxiquinolina (oxina) sob condições oxidativas. O produto gerado por essa reação
é esverdeado e tem um coeficiente de absorção de 1,75 x 104 M-1cm-1 em 705 nm.
Contudo, a hidroxilamina é instável em meio alcalino, o que impossibilita a utilização
desse método para medidas de atividade em valores de pH maiores que 8,0. A
atividade também pode ser medida por outras metodologias, como condutimetria
(STECHER et al., 1999) ou uso de uma reação acoplada com a glutamato
desidrogenase como enzima indicadora (DERST et al., 2000). No método
condutimétrico, o aumento de condutividade do meio devido à produção de amônia e
aspartato, é medido de forma que a atividade enzimática é medida indiretamente. No
método utilizando-se uma reação enzimática acoplada, a formação de amônia é
detectada por uma reação acoplada com a enzima glutamato desidrogenase,
monitorando-se as mudanças na absorção do NADH em 340 nm. Esse método é
aplicável apenas em pH alcalino, o que limita, também, seu uso em estudos de efeito
de pH.
Considerando que não existem trabalhos na literatura sobre a utilização de
ITC para medir a atividade enzimática da asparaginase, realizamos um estudo com
o intuito de encontrar as condições ideais de estudo. Através do emprego de ITC, a
velocidade de reação pôde ser obtida diretamente pela medida do fluxo de calor
(µcal·s-1) em função do tempo. Não houve necessidade de uso de reações
acopladas ou de substratos modificados.
Nesses experimentos, a concentração de asparagina na cela calorimétrica
variou de 0,10 a 0,50 mM e os experimentos foram realizados em tampão fosfato de
sódio 50 mM, pH 8,6. Foi feita uma única injeção de 3,5 µL asparaginase (10 U/mL),
atingindo uma concentração final de enzima na cela de 0,025 U/mL. A temperatura
foi de 25 °C. As curvas de velocidade de reação em função da concentração de Asn
e dos duplos recíprocos estão mostrados na Figura 4.1.1.
Resultados e Discussão
44
(A)
(B)
Figura 4.1.1: Determinação dos parâmetros cinéticos para a hidrólise da asparagina catalisada pela asparaginase de Escherichia coli. (A) Velocidade inicial da reação (V0) em função da concentração de asparagina. As velocidades de reação (em µcal/s) foram medidas com asparagina variando de 0,1 a 0,5 mM em fosfato de sódio 50 mM, pH 8,6. A concentração de asparaginase no meio de reação foi 0,025 U/mL. (B) Gráfico dos duplos recíprocos. Os dados foram analisados pelo programa GraphPad Prism 4.0. Os pontos representam a media de pelo menos 4 repetições e as barras representam o desvio padrão.
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,50,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
V0 (ca
l/s)
[Asparagina] (mM)
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1/V
0 (
s/
ca
l)
1/[S] (mM)-1
Resultados e Discussão
45
As curvas foram feitas com o programa GraphPad Prism 4.0, e o ajuste para
obtenção dos valores de Vmáx e Km foi feito por regressão não-linear usando a opção
de análise “Enzyme kynetics/Michaelis-Menten”, diretamente da curva obtida para o
efeito da concentração de substrato (Figura 4.1.1A). Os parâmetros cinéticos obtidos
deste experimento foram: Vm = 2,50 ± 0,12 µcal/s e Km = 0,118 ± 0,019 mM. O valor
de Km calculado foi semelhante ao obtido por Kelo (0,130 mM), através do uso de
uma reação acoplada para as medidas de velocidades de reação (KELO et al.,
2002).
4.1.2 Efeito de osmólitos sobre a atividade e estabilidade da asparaginase
Os processos biológicos ocorrem em meios contendo uma alta concentração
de osmólitos, ou seja, de moléculas de baixo peso molecular presentes no interior da
célula que controlam o volume celular. Essa condição na célula é denominada de
crowding molecular (aglomeramento molecular).
Os osmólitos podem ser classificados em três categorias: aminoácidos e seus
derivados, polióis e metilaminas. Eles ainda são classificados de acordo com seu
efeito sobre a atividade e a função de proteínas. Dessa forma, osmólitos compatíveis
são aqueles que protegem as proteínas contra a inativação e desnaturação, sem
perturbar sua função. Os osmólitos compensatórios são sintetizados pelos
organismos para contrabalançar os efeitos de agentes perturbadores, como a ureia,
por exemplo, sobre a atividade e estabilidade de suas proteínas. O acúmulo de
osmólitos acontece quando os organismos estão sob condições de estresse, seja
extremos de temperatura, estresse hídrico, alta pressão hidrostática, salinidade, ou
quando a concentração intracelular de algum agente perturbador nos organismos é
alta (ANJUM et al., 2000; YANCEY, 2001).
Em organismos multicelulares, o crowding não se limita apenas ao interior das
células, mas também à matriz tecidual. No plasma sanguíneo, a concentração total
de macromoléculas é de 80 g/L, suficiente para causar efeitos de crowding
(CHEBOTAREVA et al., 2004). A osmolalidade do sangue é mantida constante por
um equilíbrio entra a água ingerida e a excretada, de forma que as células de
mamíferos não são expostas a variações extremas nas concentrações de osmólitos.
No entanto, algumas células de mamíferos apresentam concentrações consideráveis
de osmólitos orgânicos e outras são capazes de acumular esses osmólitos quando
Resultados e Discussão
46
estão sob a influência de algum estresse. Os principais osmólitos presentes nessas
células são sorbitol, betaína, inositol, taurina e glicerolfosfocolina. Células em outros
tecidos também estão expostas à hiperosmolaridade, mas em menor grau que as
renais. Essas células também acumulam osmólitos orgânicos, o cérebro, por
exemplo, acumula aminoácidos, colina, creatina, inositol e taurina, enquanto o fígado
acumula betaína, inositol e taurina (BURG & FERRARIS, 2008).
A caracterização da asparaginase em diferentes condições é necessária para
que possamos encontrar um meio em que a enzima seja mais estável e mantenha
sua atividade. Como a asparaginase é um agente importante para o tratamento de
leucemia, a otimização da formulação se faz necessária para minimizar os efeitos
colaterais e também aumentar seu tempo de meia vida no sangue, de forma que
seja possível que o paciente receba doses com mais espaçamento entre os dias de
administração. A enzima comercial é apresentada na forma de um pó liofilizado,
contendo manitol, o qual é adicionado antes da liofilização com o objetivo de
aumentar a estabilidade da enzima durante esse processo. Neste trabalho,
estudamos a estabilidade da asparaginase em relação ao tempo de estocagem da
enzima após sua diluição. A enzima solubilizada na presença de manitol proveniente
da preparação pôde ser posteriormente dialisada para remoção desse carboidrato.
Na primeira condição de solubilização, a concentração final de manitol é de 0,35 M.
A Figura 4.1.2 mostra que o manitol aumenta a estabilidade da enzima durante a
estocagem a 4 °C. As cinéticas de reação foram medidas em função do tempo de
estocagem, para preparações da enzima na presença de manitol (Figura 4.1.2A) ou
após diálise contra tampão Tris:HCl 50 mM, pH 8,0 (Figura 4.1.2B). A Tabela 4.1.1
resume os dados obtidos.
Resultados e Discussão
47
0 2 4 6 8 10 12
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
Tempo (min)
Flu
xo d
e C
alo
r (µ
cal/sec)
A
0 2 4 6 8 10 12
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
Tempo (min)
Flu
xo d
e C
alo
r (µ
cal/s
ec)
B
Figura 4.1.2: Efeito de manitol sobre a estabilidade da asparaginase de Escherichia coli. A enzima foi estocada a 4 °C, em solução contendo manitol (A) ou apenas tampão (B). As linhas representam a atividade da enzima em (▬) 1 dia, (▬) 2 dias, (▬) 3 dias, (▬) 4 dias e (▬) 5 dias após a dissolução. A cinética da reação foi medida em tampão Tris:HCl 50 mM, pH 8,0, contendo asparagina 10 mM, a 25 °C. A concentração de asparaginase foi 0,2 U/mL.
Tabela 4.1.1: Efeito do manitol sobre a estabilidade da asparaginase
Tempo (dias)
Enzima em Manitol Enzima Dialisada
Fluxo de
calor (cal/s)
V/V0* Fluxo de
calor (cal/s)
V/V0*
1 2,38 1,00 1,38 1,00
2 2,42 1,02 0,80 0,58
3 1,81 0,76 0,54 0,39
4 1,97 0,83 0,35 0,25
5 1,30 0,55 0,21 0,15
*Atividade relativa: representa o aumento ou redução na atividade inicial da enzima (V0) em relação à atividade medida nos dias seguintes (V).
Como observado, o manitol é bastante eficiente em aumentar a estabilidade
da enzima após a dissolução do material liofilizado. Ao final de 5 dias de estocagem
das soluções, a enzima manteve cerca de 50% de sua atividade original quando na
presença de manitol. Em tampão, sua estabilidade é bastante reduzida,
apresentando apenas 15% da atividade original após cinco dias de preparo da
solução.
O efeito de outros osmólitos sobre a atividade da asparaginase foi também
estudado através de ITC (Tabela 4.1.2). Os dados estão expressos como atividade
Resultados e Discussão
48
relativa, ou seja, a fração de aumento ou redução na atividade da enzima em
relação à condição sem adição de nenhum composto.
Os solutos que tiveram maior influência sobre a atividade da asparaginase
foram sorbitol e glicerol, que levaram a uma redução na atividade enzimática de
aproximadamente 50 e 33%, respectivamente, quando na concentração de 3,0 M.
Os outros solutos tiveram pouco ou nenhum efeito. A glicose, na concentração
encontrada no plasma (55 mM) não teve efeito sobre a atividade enzimática. O NaCl,
na concentração de 150 mM, a mesma de soluções salinas usadas para a
reconstituição da enzima para a aplicação no paciente, também não teve efeito
sobre a atividade da asparaginase.
Tabela 4.1.2: Efeito de osmólitos sobre a atividade da asparaginase, a 25 °C
Composto Concentração (M) Atividade Relativa (V/V0)*
Glicose 0,055
0,5
0,99 ± 0,01
0,84 ± 0,01
Sorbitol 0,5
1,0
3,0
0,82 ± 0,09
0,76 ± 0,15
0,50 ± 0,04
Glicerol 0,5
3,0
0,89 ± 0,02
0,67 ± 0,01
NaCl 0,150
0,5
1,07 ± 0,06
1,17 ± 0,02
*A atividade relativa representa a fração de aumento ou redução na atividade enzimática na presença
dos osmólitos em relação à condição sem a adição do composto.
A estabilidade térmica da asparaginase foi estudada na presença desses
osmólitos pelo emprego da técnica de DSC (Figura 4.1.3). A Tabela 4.1.3 mostra os
parâmetros termodinâmicos para a desnaturação da asparaginase em tampão e na
presença dos osmólitos. A transição térmica da asparaginase é bastante
cooperativa, o que pode ser observado pelos picos estreitos, com ∆T1/2 variando de
2,99 a 3,45 °C, dependendo da condição. O efeito de alguns osmólitos sobre a
estabilidade térmica da asparaginase é mostrado na Figura 4.1.3. Um estudo mais
detalhado da estabilidade térmica da asparaginase será apresentado na seção 4.2.
Resultados e Discussão
49
Figura 4.1.3: Termogramas da asparaginase na presença de osmólitos. Os termogramas foram obtidos com asparaginase (12 µM, em monômeros) em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,6 na ausência (▬) e na presença de sorbitol 1,0 M (▬), sorbitol 3,0 M (▬), glicerol 3,0 M (▬) e NaCl 0,5 M (▬). A velocidade de varredura foi 1 °C/min. Os gráficos são representativos de pelo menos 3 experimentos independentes.
Nem todos os agentes utilizados para estudar o efeito de osmólitos na
termoestabilidade da asparaginase atuaram como estabilizadores da enzima.
Nossos resultados mostraram que sorbitol foi o composto que causou o maior efeito
de estabilização da asparaginase, aumentando tanto os valores de Tm quanto de
ΔHcal. Glicerol não causou um aumento significativo na Tm, mas aumentou o ΔHcal.
Glicose não causou mudanças significativas em ΔHcal e Tm. Já NaCl, que não causa
efeito na atividade enzimática, desestabilizou a proteína, reduzindo o ΔHcal em até
68% do valor em tampão e a Tm em 3,3 °C.
55 60 65 70 75
0
20
40
60
80C
p (
kcal/m
ol/
oC
)
Temperatura (oC)
Resultados e Discussão
50
Tabela 4.1.3: Efeito de osmólitos sobre a estabilidade térmica da asparaginase
Condição Concentração
(M) Tm
(°C) ΔHcal
(kcal/mol) ∆T1/2 (°C)
Tampão - 65,16 167,82 3,08
Sorbitol 1,0
3,0
66,75
70,40
242,75
240,52
3,23
3,24
Glicerol 1,0
3,0
65,53
65,23
204,38
200,07
2,61
3,14
NaCl 0,150
0,5
64,43
61,90
101,24
114,06
2,44
2,99
Glicose 0,055 65,59 166,77 3,45
Os termogramas foram obtidos em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,6, com velocidade de varredura de 1°C/min de 25 a 75 °C. O ∆H
cal é relativo à concentração de monômeros.
4.1.3 Efeito de micelas A fim de compreender como a asparaginase interage com interfaces, foi
determinada a velocidade de reação na presença de micelas aquosas de diferentes
composições. O ponto isoelétrico da asparaginase foi determinado por diferentes
autores, variando entre 4,85 (WHELAN & WRISTON, 1969) e 5,2 (HO et al., 1970).
Dessa forma, em pH 8,0 a enzima apresenta carga negativa e, portanto, não foram
utilizados surfactantes aniônicos neste estudo, apenas um catiônico (CTAB) e dois
zwiteriônicos (ASB-14 e ASB-16).
O efeito dos surfactantes, tanto na atividade quanto na estabilidade térmica
da asparaginase, foi estudado em concentrações acima e abaixo da concentração
micelar crítica (CMC). A CMC de um surfactante corresponde à concentração
saturante do monômero em solução. Acima da CMC, coexistem monômeros e
micelas em um equilíbrio dinâmico (MENGER & DOLL, 1984). A agregação de
compostos anfifílicos, ou seja, o valor de CMC dos mesmos, depende da estrutura e
da carga das moléculas (balanço hidrofílico-hidrofóbico), bem como das
propriedades do solvente, como o pH, a força iônica e a temperatura.
Resultados e Discussão
51
Existem diversas técnicas disponíveis para a determinação da CMC de um
surfactante, sendo que neste trabalho utilizamos ITC, que permite a determinação
não só da CMC como, também, da entalpia de micelização (Hmic) em um único
experimento. O experimento consiste na medida do calor produzido pela injeção de
surfactante, em concentrações acima da CMC, numa solução aquosa contida na
cela calorimétrica. Após a injeção, a solução de surfactante é diluída entre 100 e 300
vezes, atingindo concentrações abaixo da CMC. O calor observado nas primeiras
injeções corresponde à destruição das micelas e diluição dos monômeros (Figura
4.1.4A). Após algumas injeções, a concentração de surfactante aumenta na cela
calorimétrica, permitindo a formação de micelas. O calor observado nas últimas
injeções corresponde à diluição de micelas e monômeros, em equilíbrio. A
integração da curva calorimétrica (fluxo de calor em função do tempo) gera uma
curva sigmóide do efeito da concentração do surfactante na entalpia calorimétrica
(Hcal), de onde se calcula a entalpia de desmicelização (destruição das micelas),
pela diferença de entalpia entre as primeiras e as últimas injeções, a qual é igual à
entalpia de micelização (Hmic), mas com sinal oposto (Figura 4.1.4B). A CMC é
determinada pela concentração correspondente ao mínimo da primeira derivada da
curva de Hcal em função da concentração de surfactante (Figura 4.1.4C).
Os surfactantes zwiteriônicos utilizados neste trabalho foram os derivados de
amidossulfobetaína com 14 ou 16 carbonos na cadeia acila (ASB-14 e ASB-16,
respectivamente). Os ASBs não tinham sido caracterizados quando iniciamos os
estudos com a asparaginase. Sendo assim, realizamos a análise termodinâmica da
micelização do ASB-14 e do ASB-16 pelo emprego da técnica de ITC. Esse projeto
iniciou uma colaboração com o grupo da Dra. Eneida de Paula, da UNICAMP, que
estava estudando eficácia desses surfactantes na solubilização de proteínas de
membrana de eritrócitos. O estudo da termodinâmica de micelização dos ASBs foi
realizado em água do tipo I, a fim de compararmos com os dados de CMC
determinados por tensão superficial (D’ANDREA et al., 2011; em anexo) e
ressonância paramagnética eletrônica (DOMINGUES et al., 2008).
Os valores de CMC obtidos para o ASB-14 foram maiores que aqueles
obtidos para o ASB-16, como mostrado na Tabela 4.1.4. A entalpia (Hmic), a
entropia (ΔSmic) e a energia livre (ΔGmic) da formação de micelas foram
determinadas em uma ampla faixa de temperatura (15 a 75 °C). Para ambos os
Resultados e Discussão
52
surfactantes, a micelização foi endotérmica em 15 °C e exotérmica de 25 a 75 °C.
Há uma compensação entálpica/entrópica no processo de micelização de ambos os
surfactantes, ou seja, com o aumento da temperatura, a contribuição entrópica para
a micelização diminui enquanto a contribuição entálpica aumenta. Com isso, há
apenas uma pequena variação na energia livre de micelização, como mostrado na
Tabela 4.1.4.
A compensação entálpica/entrópica na micelização de ASB-14 e ASB-16
pode ser melhor observada na Figura 4.1.5. Da mesma forma que observado para
outros compostos (NUSSELDER & ENGELBERTS, 1992; MEHRIAN et al., 1993;
PAULA et al., 1995; GARIDEL et al., 2000; MAJHI & BLUME, 2001; KRESHECK,
2009), a micelização de ASB-14 e ASB-16 foi dirigida pela entalpia em temperaturas
maiores e apresentou um alto valor negativo de ∆Gmic, que não mudou de forma
significativa com a temperatura (Figura 4.1.5 e Tabela 4.1.4). O fenômeno de
compensação entálpica/entrópica foi descrito pela primeira vez por Lumry e
Rajender (LUMRY & RAJENDER, 1970), no qual uma constante de
proporcionalidade, definida como a temperatura de compensação, foi encontrada em
uma faixa de temperatura entre 250 a 315 K, para diferentes processos. A
compensação entálpica/entrópica na formação de micelas pode ser explicada pela
interação entre as moléculas de água em contato com as cadeias acila do
surfactante e as moléculas de água livres. Com o aumento da temperatura, a troca
entre as moléculas de água livres e ligadas se torna mais fácil que em temperaturas
menores. Como consequência, a contribuição entrópica diminui com a temperatura e
a inclinação da curva de ∆S em função de ∆Hmic fornece a temperatura de
compensação. Sugihara e Hisatomi (SUGIHARA & HISATOMI, 1999) calcularam a
temperatura de compensação para mais de 15 compostos não iônicos, aniônicos e
catiônicos e encontraram valores na faixa de 299 a 315 K. O valor encontrado em
nosso trabalho foi de 311 K para ASB-14 (37,85 °C) e 314 K para ASB-16 (40,85
°C).
Resultados e Discussão
53
Figura 4.1.4: Titulação de uma solução micelar de ASB-14 (5 mM) na cela calorimétrica contendo água deionizada, a 25 °C. (A) Fluxo de calor em função do tempo para 24 injeções de ASB-14 (3 µL) na cela calorimétrica contendo água Milli-Q. (B) Entalpia calorimétrica (∆H
cal) em
função da concentração final de ASB-14 na cela calorimétrica. ∆Hdemic
corresponde à entalpia de desmicelização. (C) Primeira derivada da curva B, indicando a CMC que corresponde ao mínimo da curva.
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25
-2
-1
0
CMC
Prim
eira D
erivada
(u.a
.)
0
2
4
H
ca
l
(kJ.m
ol-1
de t
itula
nte
)
Hdemic
0
1
2
30 20 40 60 80 100
C
A
ASB-14 (mM)
Flu
xo d
e C
alo
r
(cal.s
-1)
B
Resultados e Discussão
54
Tabela 4.1.4: Efeito da temperatura sobre a concentração micelar crítica e
sobre os parâmetros termodinâmicos para a micelização de ASB-14 e ASB-16
Surfactante T
(°C)
CMC
(mM)
ΔHmic
(kJ·mol-1)
ΔGmic
(kJ·mol-1)
T·ΔSmic
(kJ·mol-1)
ASB-14 15 0,128 ± 0,010 1,24 ± 0,05 -31,09 ± 0,18 32,30 ± 0,15
20 0,109 ± 0,006 -1,50 ± 0,05 -31,46 ± 0,12 29,96 ± 0,12
25 0,119 ± 0,004 -3,85 ± 0,05 -32,34 ± 0,08 28,50 ± 1,78
30 0,104 ± 0,046 -6,28 ± 0,05 -32,25 ± 0,07 25,95 ± 0,09
35 0,147 ± 0,009 -8,37 ± 0,17 -32,93 ± 0,15 24,58 ± 0,14
40 0,148 ± 0,003 -10,39 ± 0,22 -32,87 ± 0,05 22,23 ± 0,39
45 0,169 ± 0,006 -12,79 ± 0,45 -33,58 ± 0,10 20,74 ± 0,58
55 0,204 ± 0,016 -16,93 ± 1,97 -34,14 ± 0,21 17,08 ± 1,90
65 0,262 ± 0,022 -21,16 ± 1,41 -34,48 ± 0,24 13,25 ± 1,18
75 0,349 ± 0,032 -25,02 ± 2,81 -34,67 ± 0,27 9,64 ± 2,54
ASB-16 15 0,0104 ± 0,0093 1,39 ± 0,33 -37,37 ± 0,05 38,76 ± 1,10
20 0,00854 ± 0,0007 -3,89 ± 0,18 -37,58 ± 0,20 33,93 ± 0,21
25 0,0096 ± 0,0003 -5,56 ± 0,34 -38,59 ± 0,09 33,03 ± 0,38
30 0,0101 ± 0,0020 -7,00 ± 0,69 -38,78 ± 0,22 31,40 ± 0,73
35 0,0115 ± 0,0011 -9,92 ± 0,68 -39,29 ± 0,34 29,56 ± 0,99
40 0,0116 ± 0,0021 -11,39 ± 1,36 -39,41 ± 0,36 27,86 ± 1,63
45 0,0147 ± 0,0013 -15,11 ± 1,30 -40,07 ± 0,32 25,07 ± 0,91
55 0,0213 ± 0,0029 -21,71 ± 0,61 -40,31 ± 0,36 18,87 ± 1,12
65 0,0272 ± 0,0023 -25,22 ± 0,64 -40,84 ± 0,24 15,62 ± 1,38
75 0,0370 ± 0,0016 -29,90 ± 0,32 -41,12 ± 0,12 13,27 ± 1,21
Resultados e Discussão
55
Figura 4.1.5: Parâmetros termodinâmicos para a micelização do ASB-14 (símbolos fechados) e do ASB-16 (símbolos abertos) em água Milli-Q em função da temperatura. O valores de ∆H
mic
(●,o), T∆Smic
(▲,∆) e ∆Gmic
(■,□). Os símbolos representam a média de no mínimo 6 experimentos independentes. As barras representam o desvio padrão.
Além da caracterização termodinâmica, os dados de calorimetria sugeriram
que as micelas de ASB-14 e ASB-16 não eram esféricas, o que foi confirmado por
ressonância magnética nuclear (RMN) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo
(SAXS), como mostrado por D’ANDREA e colabores (D’ANDREA et al., 2011- em
anexo).
Como citado, a asparaginase apresenta carga líquida negativa em pH 8,0 e,
portanto, sua atividade foi determinada na presença de CTAB (catiônico) e dos ASBs
(zwiteriônicos). A técnica de ITC foi empregada na determinação da CMC e da Hmic
desses surfactantes em tampão (Tris:HCl), tanto na ausência como na presença da
enzima ou de seu substrato, asparagina, a 25 °C.
280 300 320 340
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
Pa
râm
etr
os T
erm
od
inâ
mic
os d
e M
ice
liza
çã
o (
kJ.
mo
l-1)
Temperatura (K)
Resultados e Discussão
56
A CMC do CTAB em água é, aproximadamente, 1,0 mM (AGUIAR et al.,
2003). Porém, como essa é uma propriedade que depende das condições do meio,
a CMC do CTAB foi determinada nas condições em que realizamos as cinéticas da
asparaginase, ou seja, em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0 (Tabela 4.1.4).
Foi possível observar que o tampão utilizado causa uma diminuição na CMC do
CTAB. Não foi observada uma mudança na CMC ou na entalpia de micelização
quando na presença de enzima ou substrato (Tabela 4.1.5).
A 25 °C, a CMC determinada por ITC, em água, foi 0,119 0,004 mM para o
ASB-14 e 0,0096 0,0003 para o ASB-16 (D’ANDREA et al., 2011- em anexo).
Valores semelhantes foram determinados em tampão Tris:HCl 50 mM, pH 8,0. Na
presença da enzima e do substrato da reação, a CMC foi praticamente a mesma que
aquela em tampão, para o ASB-14 (Figura 4.1.7). No caso do ASB-16, uma pequena
diminuição na CMC foi observada na presença de asparaginase. (Tabela 4.1.5)
Tabela 4.1.5: Determinação dos parâmetros de micelização para os
surfactantes, em 25 °C
Surfactante Condição CMC (mM)
∆Hmic (kcal/mol)
ASB-14 Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 0,125 -0,901
Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 + asparaginase 5 µM 0,127 -0,961
Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 + asparagina 10 mM 0,125 -0,885
ASB-16 Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 0,0085 -1,543
Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 + asparaginase 5 µM 0,0060 -2,178
Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 + asparagina 10 mM 0,0080 -2,473
CTAB fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0 0,419 0,192
Resultados e Discussão
57
(3)
Fig
ura
4.1
.6:
Tit
ula
ção
de
um
a s
olu
ção
mic
ela
r d
e A
SB
-14
(5 m
M)
na
cela
calo
rim
étr
ica
co
nte
nd
o T
ris:H
Cl
10 m
M,
pH
8,0
(1);
asp
ara
gin
as
e
5 µ
M e
m T
ris:H
Cl
10 m
M,
pH
8,0
(2)
ou
asp
ara
gin
a 1
0 m
M e
m T
ris:H
Cl
10 m
M,
pH
8,0
(3),
a 2
5 °
C.
(A)
Flu
xo d
e c
alo
r em
fu
nção d
o t
em
po p
ara
23 in
jeções d
e A
SB
-14 (3
µ
L)
na
cela
calo
rim
étr
ica
(1
,42
2 m
L)
em
cada
um
a das co
ndiç
ões;
(B)
Enta
lpia
ca
lori
métr
ica
(∆
Hcal )
em
fu
nção d
a
concentr
ação
fin
al de A
SB
-14 n
a c
ela
.
(2)
(1)
0,0
00,0
50,1
00,1
50,2
00,2
5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
020
40
60
80
100
120
Tem
po (
min
)
Fluxo de Calor
µcal/s
A
Razão M
ola
r
Hcal
kcal/molde injeção
B
0,0
00,0
50,1
00,1
50,2
00,2
5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
020
40
60
80
100
120
Te
mp
o (
min
)
Fluxo de Calor
µcal/s
A
Ra
zã
o M
ola
r
Hcal
kcal/mole de injeção
B
0,0
00,0
50,1
00,1
50,2
00,2
5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0,0
0,2
0,4
0,6
020
40
60
80
100
120
Te
mp
o (
min
)Fluxo de Calor
µcal/s
A
Ra
zã
o M
ola
r
Hcal
kcal/mole de injeção
B
Resultados e Discussão
58
A atividade da asparaginase foi medida na presença de CTAB 0,1 mM (abaixo
da CMC) e 1,0 mM (acima da CMC). O CTAB não alterou a atividade enzimática,
sugerindo que a mesma não interage com monômeros ou com micelas desse
surfactante (Tabela 4.1.6). Se houver uma interação, esta não leva a uma
modificação da velocidade de reação catalisada pela asparaginase. Um resultado
semelhante foi encontrado com ASB-16 que tanto na forma monomérica (5 M)
quanto micelar (1,0 mM) não provocou uma diferença significativa na atividade da
asparaginase.
Por outro lado, foi observado um aumento na atividade da asparaginase em
concentrações de ASB-14 monomérico (Tabela 4.1.6). Esse aumento foi dependente
da concentração do surfactante, sendo de cerca de 20% com ASB-14 0,03 mM e
cerca de 60% em maiores concentrações (0,06 mM e 1,0 mM). Esses dados
sugerem que o ASB-14 se associa à asparaginase na forma monomérica e que,
provavelmente, não ocorre uma interação com micelas de ASB-14. Caso ocorra, a
interação da enzima com micelas de ASB-14 causa pouco ou nenhum efeito na
atividade da asparaginase.
Esse dado é, de certa forma, interessante, pois sugere uma ligação mais
específica da enzima com o ASB-14, já que a diferença em apenas dois carbonos na
cadeia acila leva a comportamentos cinéticos distintos da asparaginase.
Tabela 4.1.6: Efeito dos surfactantes sobre a atividade da asparaginase
Surfactante Concentração (mM)
Atividade relativa (V/V0) *
ASB-14 0 1,00
0,03 1,21 ± 0,014
0,06 1,61 ± 0,064
1,0 1,64 ± 0,026
ASB-16 0,005 0,99 ± 0,002
1,0 0,99 ± 0,003
CTAB 0,1 1,00 ± 0,01
1,0 1,04 ± 0,01
*A atividade relativa corresponde à razão entre a atividade da asparaginase na presença do
surfactante e a atividade em tampão. A atividade enzimática na presença de ASB-14 e ASB-16 foi medida em Tris:HCl 10 mM, pH 8,0. O tampão utilizado para os experimentos com CTAB foi fosfato de sódio, 50 mM, pH 8,0.
Resultados e Discussão
59
A estabilidade térmica da asparaginase foi estudada na presença de
concentrações monoméricas e micelares de ASB-14. Como mostrado na Tabela
4.1.6, esse surfactante causou aumento de atividade da asparaginase. Os
resultados de atividade sugeriram que monômeros de ASB-14 podem estar
interagindo com a asparaginase e que, caso aconteça interação entre a
asparaginase e a micela de ASB-14, esta tem pouco ou nenhum efeito sobre a
atividade enzimática.
A Tabela 4.1.7 mostra os parâmetros termodinâmicos obtidos em
concentrações monoméricas (0,006 mM) e micelares (1 mM) de ASB-14. É
importante notar que os experimentos apresentados na Tabela 4.1.3, do efeito de
osmólitos na estabilidade térmica da asparaginase foram realizados em pH 8,6,
enquanto os dados da Tabela 4.1.7 foram obtidos em pH 8,0. Dessa forma, os
valores de Tm em tampão não são os mesmos nos dois casos e isso será mais
detalhado nas seção 4.2, onde estão apresentados os dados de estabilidade térmica
da asparaginase em uma pequena faixa de pH (entre pH 8,0 e 9,0), e na seção 4.3,
onde estão apresentados os dados de efeito de pH sobre as propriedades cinéticas
e estruturais da asparaginase.
Tabela 4.1.7: Efeito de ASB-14 sobre os parâmetros termodinâmicos para o
desenovelamento térmico da asparaginase
ASB-14* (mM)
Tm (°C)
∆Hcal (kcal/mol)
0 63,3 ± 0,10 170,92 ± 6,3
0,06 63,2 ± 0,06 179,90 ± 2,5
1,0 63,0 ± 0,03 181,65 ± 1,7
*O tampão utilizado foi Tris:HCl 10 mM, pH 8,0. A velocidade de varredura foi 1 °C/min. O ∆Hcal
foi
calculado em função da concentração de monômeros de asparaginase.
O ASB-14 não causou uma mudança importante na Tm, que se manteve
aproximadamente 63 °C, tanto em tampão quanto nas diferentes concentrações do
surfactante. Já a entalpia calorimétrica teve um pequeno aumento na presença do
surfactante, tanto nas concentrações monoméricas, quanto na concentração micelar.
Apesar do pequeno aumento, os dados de DSC sugerem que o ASB-14 interage
com a asparaginase, tanto em concentrações monoméricas quanto micelares. A
presença de micelas (ASB 1,0 mM) no meio não causou uma estabilização proteica
Resultados e Discussão
60
maior em relação à concentração monomérica de ASB-14. Isso sugere que a
asparaginase pode estar interagindo com os monômeros de ASB-14 e que, a
interação da enzima com as micelas causa pouco efeito adicional sobre a
estabilidade proteica.
4.2 Termoestabilidade da asparaginase de Escherichia coli
O estudo da estabilidade de uma proteína contribui para a compreensão dos
fatores relevantes para o seu enovelamento. Através desses estudos, podemos
entender, por exemplo, se há intermediários significativos no desenovelamento,
obter os parâmetros termodinâmicos (entalpia, entropia e energia livre) do processo
e estudar as condições mais adequadas para aumentar a estabilidade proteica,
como pH, força iônica, presença de ligantes e concentração proteica.
A caracterização termodinâmica do desenovelamento térmico da
asparaginase de Escherichia coli não havia sido feita até o momento. Neste capítulo,
serão apresentados os resultados do estudo da estabilidade térmica da
asparaginase, obtidos por técnicas espectroscópicas, como Dicroísmo Circular (CD)
e fluorescência intrínseca de triptofanos, além de Calorimetria Diferencial de
Varredura (DSC). Como será descrito a seguir, a desnaturação térmica da
asparaginase não ocorreu de uma forma esperada para proteínas tetraméricas,
assim, utilizamos as técnicas de calorimetria de titulação isotérmica (ITC),
microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia de força atômica (AFM)
a fim de tentar compreender o processo de desenovelamento dessa proteína. ITC foi
empregada para se medir a atividade da asparaginase em baixas concentrações, a
fim de estabelecer a estabilidade funcional da enzima. A microscopia de transmissão
eletrônica e a microscopia de força atômica foram empregadas a fim de se
determinar mudanças de tamanho da asparaginase causadas pela variação da
temperatura. A termodinâmica de desnaturação térmica da asparaginase foi
estudada em pH 8,0, 8,5 e 9,0, devido aos altos valores de reversibilidade nesses
pH (90 a 95%).
Resultados e Discussão
61
4.2.1 Análise da estabilidade térmica da asparaginase por métodos
espectroscópicos
O desenovelamento térmico da asparaginase foi analisado pela modificação
da fluorescência intrínseca dos triptofanos e por dicroísmo circular na região de UV
distante, a fim de analisar modificações da estrutura terciária e secundária,
respectivamente, da enzima. A combinação de ambos os métodos é importante para
ajudar a estabelecer um mecanismo de desnaturação para proteínas.
A estabilidade térmica da estrutura terciária da asparaginase foi estudada
pela modificação da fluorescência intrínseca de triptofanos, que reflete mudanças do
ambiente desses resíduos com a temperatura. A asparaginase é um homotetrâmero
com apenas um triptofano por subunidade, na posição 66, localizado em um
ambiente apolar na enzima nativa, mais especificamente, na região de interação das
subunidades.
O desenovelamento térmico da asparaginase foi estudado em pH 8,0, 8,5 e
9,0, acompanhando-se a variação do centro de massa espectral calculado a partir
dos espectros de emissão de fluorescência obtidos de 25 a 75 °C, a uma velocidade
de varredura de 1 °C/min. A Figura 4.2.1 mostra as curvas da fração desnaturada de
asparaginase em função da temperatura, para cada um dos três valores de pH. Com
o aumento do pH, foi observado um aumento na estabilidade térmica da
asparaginase (Figura 4.2.1). A temperatura média de transição (Tm) foi determinada
na condição em que observamos 50% de desenovelamento da proteína (Tabela
4.2.1). A primeira derivada da curva de desnaturação térmica é simétrica em todos
os pHs, sugerindo que não ocorrem intermediários estáveis na desnaturação da
asparaginase. Isso será discutido mais adiante com a análise termodinâmica das
transições.
A fim de analisarmos as mudanças na estrutura secundária da asparaginase,
a técnica de CD no UV distante foi empregada. O CD é uma ferramenta importante
para o estudo do desenovelamento proteico, pois o espectro das diferentes
estruturas secundárias e de uma estrutura ao acaso são bastante distintos. As
alterações na estrutura secundária de uma proteína, causadas pelo seu
desenovelamento, podem ser acompanhadas monitorando-se a intensidade do CD
em um determinado comprimento de onda, no qual a diferença entre o sinal da
proteína enovelada e da desenovelada seja significativa. No caso da asparaginase,
Resultados e Discussão
62
a variação de intensidade em 222 nm, onde há um pico negativo característico de -
hélice, foi monitorada. A análise das curvas obtidas permite determinar se há a
presença de intermediários significativos no processo.
Figura 4.2.1: Desenovelamento térmico da asparaginase monitorado por fluorescência. (A) Fração desenovelada de asparaginase (α) em função da temperatura. (B) Primeira derivada das curvas de desenovelamento térmico da asparaginase. As curvas de desenovelamento da asparaginase foram obtidas em tampão Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 (em preto), pH 8,5 (em vermelho) e pH 9,0 (em azul). A fração desenovelada foi calculada a partir dos valores de centro de massa, como descrito em Material e Métodos. A concentração de asparaginase foi 14 µM (monômeros) e a velocidade de varredura foi 1 °C/min. O comprimento de onda de excitação foi 295 nm.
45 50 55 60 65 70 75
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Fra
çã
o D
ese
no
ve
lad
a (
)
Temperatura (oC)
A
45 50 55 60 65 70 75
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 B
De
riva
da
(u
.a.)
Temperatura (oC)
Resultados e Discussão
63
O efeito da temperatura na estabilidade da estrutura secundária da
asparaginase foi, também, estudado em pH 8,0, 8,5 e 9,0. Como mostrado na Figura
4.2.2, o espectro de CD em UV distante da asparaginase é idêntico nesses valores
de pH e é característico de espectros de proteínas com padrão de enovelamento do
tipo α/β. O espectro de CD da asparaginase apresenta um pico positivo em 190 nm
e também picos negativos em 208 nm e 222 nm, característicos de α-hélice, assim
como um pico negativo em 216 nm, característico de folhas-β.
Figura 4.2.2: Espectros de dicroísmo circular da asparaginase em UV-distante em pH 8,0; 8,5 e 9,0, a 25 °C. O espectro da asparaginase (8 µM, em concentração de monômeros) foi obtido em Tris:HCl 10 mM, em pH 8,0 (▬), pH 8,5 (▬) e pH 9,0 (▬). Os espectros foram obtidos com 6 acumulações. Os espectros são representativos de 4 experimentos independentes.
O desenovelamento térmico da asparaginase foi estudado acompanhando-se
a variação da intensidade do sinal de CD em 222 nm. As curvas foram obtidas de 25
a 75 °C, a uma velocidade de varredura de 1 °C/min. A Figura 4.2.3 mostra as
curvas da fração desenovelada de asparaginase em função da temperatura, para
cada um dos três valores de pH. As curvas indicam que o desenovelamento da
asparaginase acontece sem a presença de intermediários significativamente
populados, aproximando-se de um processo de desenovelamento entre dois
estados, o nativo e o desenovelado. Além disso, o desenovelamento da
200 210 220 230 240 250 260
-30000
-15000
0
15000
30000
[] m
ola
r,(g
raus c
m2 d
mol-1
)
(nm)
Resultados e Discussão
64
asparaginase foi reversível nos três valores de pH estudados, o espectro de CD da
asparaginase era recuperado após o resfriamento da amostra.
Figura 4.2.3: Desenovelamento térmico da asparaginase monitorado por dicroísmo circular. (A) Fração desenovelada de asparaginase (α) em função da temperatura. (B) Primeira derivada das curvas de desenovelamento térmico da asparaginase. Os espectros foram obtidos em tampão Tris:HCl10 mM pH 8,0 (em preto), pH 8,5 (em vermelho) e pH 9,0 (em azul). O valor de α foi calculado a partir da elipiticidade em 222 nm, como descrito em Material e Métodos. A concentração de asparaginase foi 8 µM (monômeros) e a velocidade de varredura foi 1 °C/min.
45 50 55 60 65 70 75
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
AF
raçã
o D
ese
no
ve
lad
a (
)
Temperatura (oC)
45 50 55 60 65 70 75
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Derivada
(u.a
.)
Temperatura (oC)
B
Resultados e Discussão
65
As curvas de transição obtidas por fluorescência e por CD podem ser
sobrepostas, sugerindo que a asparaginase perde a estrutura terciária e a estrutura
secundária de forma paralela, indicando que o desenovelamento da asparaginase é
cooperativo. Sendo assim, as temperaturas de transição são muito semelhantes,
sugerindo que o desenovelamento térmico da asparaginase ocorre de forma
cooperativa (Tabela 4.2.1).
Tabela 4.2.1: Temperatura média de desnaturação para a transição da
asparaginase obtida por fluorescência e por dicroísmo circular
pH Tm (°C)
Fluorescência CD
8,0 61,4 62,1 ± 0,11
8,5 62,7 62,9 ± 0,13
9,0 63,8 63,9 ± 0,12
Dados obtidos a partir das curvas de desnaturação das Figuras 4.2.1 e 4.2.3
Os parâmetros termodinâmicos para o desenovelamento da asparaginase,
∆H, Tm e ∆S, foram determinados a partir das curvas de transição obtidas por CD e
por fluorescência, pelo método da aproximação de van’ t Hoff, como descrito a
seguir.
As curvas de transição foram obtidas considerando-se os dados
espectroscópicos e a fração de proteína presente no estado nativo (fN) e no estado
desenovelado (fU). A constante de equilíbrio (Keq) e a variação de energia livre de
Gibbs (∆G) foram calculadas através das equações abaixo:
Equação 4.2.1
[ ]
[ ]
Equação 4.2.2
[
] Equação 4.2.3
Resultados e Discussão
66
onde yF e yU representam a fração de y na forma enovelada e na forma
desenovelada, respectivamente. Esses dados foram ajustados segundo a Equação
4.2.4, considerando a aproximação de van’tHoff:
(
) (
) (
) Equação 4.2.4
onde Keq é a constante de equilíbrio observada experimentalmente, T é a
temperatura em Kelvin, ∆H é a inclinação obtida através da regressão dos dados
(entalpia de van’ t Hoff) e ∆S (variação de entropia) é o valor da interseção da
regressão. R é a constante dos gases.
A partir dos resultados das análises das curvas de transição mostrados na
Tabela 4.2.2, pode-se observar que os valores dos parâmetros termodinâmicos
obtidos através das duas técnicas são muito semelhantes. Apenas em pH 8,0 foi
observada uma maior diferença entre os valores Tm obtidos por CD e por
fluorescência, o que pode ser devido à preparação da amostra. Para os dados
apresentados para pH 8,5 e 9,0 (Tabela 4.2.2), a análise foi feita considerando-se os
valores obtidos através de ambas as técnicas em conjunto, pois os dados foram
muito próximos.
Tabela 4.2.2: Parâmetros termodinâmicos para o desenovelamento da
asparaginase obtidos pela aproximação de van’tHoff
pH Técnica Tm (°C) ΔH (kcal/mol) ΔS (cal/mol)
8,0 CD 62,09 224,20 668,80
Fluorescência 61,20 226,00 676,80
8,5 CD/fluorescência 62,60 228,30 680,00
9,0 CD/fluorescência 63,90 255,70 759,00
Valores calculados a partir da aproximação de van’tHoff dos gráficos de lnKeq vs 1/T.
Resultados e Discussão
67
Os dados de CD e fluorescência indicam que a desnaturação térmica da
asparaginase ocorre de forma cooperativa e que não há intermediários
significativamente populados durante esse processo, ou seja, os dados sugerem que
a desnaturação aproxima-se de um processo entre “dois estados”, o que é, de certa
forma, bastante inesperado para proteínas oligoméricas. A fim de elucidar o
mecanismo de desnaturação térmica da asparaginase, a técnica de DSC foi
empregada, como mostrado a seguir.
4.2.2 Análise da termoestabilidade da asparaginase por calorimetria
A calorimetria diferencial de varredura é a técnica mais direta para se
caracterizar a energética de diversos processos biológicos. DSC é a única técnica
que permite medidas diretas da variação da entalpia em função da temperatura e
por isso é amplamente empregada nos estudos da termodinâmica de processos
induzidos por temperatura em proteínas. Através dos experimentos de DSC, pode-se
compreender o mecanismo que rege o equilíbrio termodinâmico entre as formas
nativa e desenovelada de uma proteína, por exemplo.
A análise da estabilidade térmica de uma proteína pode ser feita através da
comparação dos valores da temperatura média de transição (Tm) e da entalpia
calorimétrica (∆Hcal), obtidos através dos termogramas de DSC. A forma e a largura
do pico estão relacionadas à presença ou não de intermediários de desnaturação,
sendo que a cooperatividade da transição é medida pela meia largura do pico
(∆T1/2). A entalpia calorimétrica corresponde à área total integrada sob o termograma
que, após a correção da linha de base, representa o calor total absorvido pela
amostra. A absorção de calor durante a desnaturação depende da quantidade de
proteína presente na amostra e é, em princípio, uma medida absoluta da entalpia
total do processo envolvido. O grau de reversibilidade é obtido pela medida de ∆Hcal
de uma segunda varredura da amostra logo após a primeira. Assim, o grau de
reversibilidade de uma desnaturação térmica é dado pela razão entre as entalpias
obtidas na primeira e na segunda varredura. No caso de ocorrer 100% de
reversibilidade, o valor de ∆Hcal será o mesmo para as duas varreduras, ou seja, o
valor de Hcal da segunda varredura serve como um parâmetro de reversibilidade e
a relação entre ambos (∆Hcal da segunda varredura/∆Hcal da primeira varredura) dá a
porção de proteína que apresenta transição térmica reversível.
Resultados e Discussão
68
A desnaturação térmica da asparaginase foi estudada por DSC com
aquecimento das amostras de 25 a 75 °C, em diferentes valores de pH. A transição
térmica foi reversível entre pH 7,5 e 9,5. Nesses casos, não foi observada mudança
na forma do termograma na segunda varredura, indicando que não há uma
mudança estrutural significativa da amostra após o aquecimento até 75 °C. Contudo,
o grau de reversibilidade foi dependente das condições de varredura, ou seja, do
valor de pH, da velocidade de varredura e da temperatura final da primeira
varredura.
Para as amostras aquecidas até 75 °C na primeira varredura, a 1 °C/min, a
reversibilidade da transição foi entre 90% e 95% em pH 8,5 e 9,0. Já para as
amostras em pH 7,5, 8,0 e 9,5, nessas mesmas condições, a reversibilidade foi de
apenas cerca de 35%. No entanto, em pH 8,0,quando a primeira varredura das
amostras terminava em 70 °C, ou seja, pouco depois do final da transição que
ocorre em 67,4 °C, a reversibilidade da transição aumentava para 90%. No entanto,
para as amostras em pH 7,5 e 9,5, apenas 50% de reversibilidade foi observada sob
as mesmas condições, em que o aquecimento terminava logo ao final das
transições. Assim, para a análise termodinâmica da desnaturação da asparaginase,
foram considerados os experimentos obtidos em pH 8,0, 8,5 e 9,0.
A Figura 4.2.4 mostra os termogramas da asparaginase, obtidos através de
DSC em pH 8,0, 8,5 e 9,0, à velocidade de varredura de 1 °C/min. Os valores da
temperatura de transição (Tm) e da entalpia calorimétrica (∆Hcal) para o
desenovelamento térmico da asparaginase foram obtidos pela integração dos
termogramas, após a subtração da linha de base e da normalização das curvas de
transição para a concentração de monômeros de asparaginase (Tabela 4.2.3).
Uma determinação precisa da linha de base é muito importante para o cálculo
tanto da entalpia calorimétrica, quanto da entalpia de van’tHoff, pois uma estimativa
errada da linha de base pode afetar tanto a área sob o termograma como sua forma.
Dessa forma, o mesmo procedimento foi adotado para a subtração da linha de base
nos experimentos.
Resultados e Discussão
69
Figura 4.2.4: Termogramas da asparaginase em função do pH. Os termogramas foram obtidos em Tris:HCl10 mM, pH 8,0 (▬), pH 8,5 (▬) e pH 9,0 (▬), com asparaginase à concentração de 13,6 µM (em monômeros). Os termogramas foram normalizados em função da concentração de monômeros de asparaginase. A velocidade de varredura foi 1°C/min.
O aumento de pH causou o aumento tanto de Tm quanto de ∆Hcal, indicando
que a estabilidade da asparaginase aumentou em função do pH (Tabela 4.2.3).
Tabela 4.2.3: Parâmetros termodinâmicos para a transição térmica da
asparaginase
pH Tm
(°C)
∆Hcal
(kcal/mol)
∆S
(cal/mol)
∆T1/2
(°C)
8,0 63,33 ± 0,1 170,91 ± 6,4 0,508 3,19 ± 0,14
8,5 64,23 ± 0,1 180,35 ± 8,4 0,534 3,20 ± 0,01
9,0 65,64 ± 0,2 195,86 ± 3,2 0,578 3,20 ± 0,01
Parâmetros calculados para experimentos feitos com velocidade de varredura de 1 °C/min. Os valores de ∆H
cal são expressos em relação à concentração de monômeros. Os dados são
representativos de pelo menos 12 experimentos independentes.
50 55 60 65 70 75
0
10
20
30
40
50
60C
p (
kcal/m
ole
/oC
)
Temperatura (oC)
Resultados e Discussão
70
Os valores de entalpia obtidos pela análise da área dos picos de transição da
asparaginase são relativamente altos, quando comparados a outras proteínas
oligoméricas. Na Tabela 4.2.4 podemos observar que os valores de entalpia
calorimétrica variam muito entre proteínas oligoméricas, pois a magnitude da
entalpia está relacionada à estrutura de cada proteína.
Algumas proteínas apresentam valores de entalpia maiores que os
observados para a asparaginase como, por exemplo, a α-cristalina bovina, um
hetero-oligômero de massa molecular média de 700 kDa, que apresenta entalpia de
235 kcal·mol-1 de monômeros e a leucoaglutinina de Phaseolusvulgaris, um
homotetrâmero de 114 kDa, que apresentou entalpia de 250 kcal·mol-1 por
monômero (BISWAS & KAYASTHA, 2004). Já a β-glicosidase da archeatermofílica
Sulfolobussolfataricus (D’AURIA et al., 1996), uma proteína tetramérica, apresenta
valores de entalpia entre 1800 a 2300 kcal·mol-1de tetrâmero (450 a 575 kcal·mol-1
de monômero), muito superior aos valores obtidos para o tetrâmero de
asparaginase. Porém, é sabido que proteínas de organismos termofílicos
apresentam uma maior estabilidade térmica.
A variação da entalpia calorimétrica em função da temperatura de transição
permite o cálculo da variação de capacidade calorífica (∆Cp). A capacidade calorífica
é a função fundamental a partir da qual as outras propriedades termodinâmicas
podem ser derivadas. A variação da capacidade calorífica pode ser calculada
através da relação:
Equação 4.2.5
Resultados e Discussão
71
Ta
be
la 4
.2.4
: V
alo
res
de e
nta
lpia
pa
ra p
rote
ínas
oli
go
mé
ric
as
Refe
rên
cia
BO
UD
KE
R
et
al.,
19
97
BA
CK
MA
N
et
al.,
19
98
SH
NY
RO
V
et
al.,
20
00
JO
HN
SO
N
et
al.,
19
92
MA
LO
LE
TK
INA
et
al.,
20
10
GR
AS
SO
e
t a
l.,
19
95
MA
NLY
e
t a
l.,
19
85
GIN
SB
UR
G,
20
05
GIA
RT
OS
IO e
t a
l.,
19
96
*Os v
alo
res d
e e
nta
lpia
são
rela
tivos à
co
ncentr
açã
o d
e m
onôm
ero
s d
as p
rote
ína
s
∆H
cal*
(kc
al/
mo
l)
63
64
,43
96
,80
12
0,8
0
16
6,3
0
17
4,5
0
18
0,2
5
18
3,2
5
18
7,8
0
Tm
(°C
)
76
,40
88
,85
10
1,7
0
53
,20
53
,70
93
,60
63
,80
51
,50
61
,80
Su
bu
nid
ad
es
Hom
oh
eptâ
me
ro
de
70
kD
a
Hom
otr
íme
ro
de
63
,5 k
Da
Hom
ote
trâm
ero
de
55
kD
a
Hom
od
ímero
d
e
24
kD
a
Hom
od
ímero
d
e
86
kD
a
Hom
od
ímero
d
e
32
kD
a
Tetr
âm
ero
d
e 1
30
kD
a
Hom
od
ecâ
me
ro
de
62
2 k
Da
Hexâ
me
ro
de
9
0
kD
a
Pro
teín
a
Co
-ch
ap
ero
nin
a
Gro
ES
de
Esch
erich
ia
co
li
Ad
en
ilato
cin
ase
da
A
rche
a S
ulfo
lobu
s
acid
oca
lda
riu
s
Tra
nstirr
etin
a h
um
ana
Rep
resso
r d
e m
etio
nin
a d
e E
sch
erich
ia
co
li
Cre
atin
a c
ina
se
do
múscu
lo d
e c
oe
lho
Su
pe
róxid
o d
ism
uta
se
Rep
resso
r la
c d
e E
sche
rich
ia c
oli
Glu
tam
ina
sin
ats
e d
e E
sch
erich
ia c
oli
Nucle
osíd
eo
difo
sfa
to c
ina
se
eu
ca
rió
tica
(Dic
tyo
ste
lium
)
Resultados e Discussão
72
A Figura 4.2.5 mostra o gráfico de ∆Hcal em função da Tm, com os resultados
obtidos entre pH 8,0 a 9,0. O valor de ∆Cp obtido para a asparaginase foi 10,81 ±
0,14 kcal/mol· °C, considerando-se a concentração monomérica de proteína.
Figura 4.2.5: Variação de ∆Hcal
em função de Tm para a asparaginase. Os valores ΔHcal
e Tm foram obtidos através dos termogramas da asparaginase obtidos em pH 8,0, 8,5 e 9,0. A concentração de asparaginase nesses experimentos foi 13,6 µM e a velocidade de varredura foi de1 °C/min. A capacidade calorífica é dada pelo coeficiente angular obtido através do ajuste dos dados experimentais a uma reta. O valor de r obtido foi de 0,999. Os dados são representativos de pelo menos 12 experimentos e as barras representam o desvio padrão.
O valor positivo de ∆Cp para a desnaturação da asparaginase sugere que o
aumento na capacidade calorífica está relacionado à hidratação hidrofóbica devido
ao contato de grupamentos não polares, antes escondidos no interior proteico, com
a água (STUTERVANT, 1977; GRAZIANO et al., 1998).
O valor de ∆Cp calculado para a desnaturação da asparaginase está entre os
valores mais altos medidos para uma proteína multimérica. Para a proteína dimérica
CsdB (proteína controladora da divisão celular ou morte celular tipo B), uma toxina
que atua como inibidor da DNA girase de Escherichia coli, o valor de ∆Cp
encontrado foi de 2,8 ± 0,2 kcal· mol-1· K-1 (BAJAJ et al., 2004). Outra proteína
63,0 63,5 64,0 64,5 65,0 65,5 66,0150
160
170
180
190
200
H
cal (
kcal/m
ol)
Tm (
oC)
Resultados e Discussão
73
dimérica, a miosina II de Acanthamoeba, apresentou um ∆Cp de aproximadamente
10 kcal·mol-1·K-1 (ZOLKIEWSKY et al., 1997). Para a glutamina sintase, uma
proteína dodecamérica, foram encontrados valores de ∆Cp entre 3,9 ± 1,7 e 11,4 ±
0,9 kcal· mol-1· K-1, dependendo da condição estudada (GINSBURG &
ZOLKIEWSKY, 1991).
A fim de determinar o modelo de transição observado para a asparaginase
nos experimentos de DSC, inicialmente observamos a forma dos picos obtidos nos
três valores de pH. Pode-se notar que os picos de transição obtidos para a
asparaginase não foram simétricos, como mostrado na Figura 4.2.4, sugerindo que a
transição térmica não ocorre entre dois estados, como sugerido por CD e
fluorescência.
Os termogramas da asparaginase foram analisados com o programa Origin
7.0, através dos ajustes das curvas de DSC a diferentes modelos de transição. Para
as análises dos termogramas, consideramos dois modelos transição: (i) de “dois
estados”, que considera o equilíbrio entre os estados nativo (N) e desnaturado (D)
sem formação de intermediários estáveis de desnaturação, e (ii) o modelo de “não
dois estados”, que considera a formação de intermediários estáveis. Para o modelo
de transição entre “dois estados” não foi possível fazer um ajuste da curva teórica à
curva experimental, como era de se esperar devido à assimetria dos picos de
transição da asparaginase.
Para o modelo de transição de “não dois estados”, se apenas uma transição é
considerada, o modelo não fornece um bom ajuste da curva, como exemplificado na
Figura 4.2.6 para o termograma da asparaginase obtido em pH 9,0. Os valores
obtidos para ∆Hcal (205 kcal/mol de monômero) e Tm (64,98 °C) são semelhantes
aos obtidos através da integração da curva (∆Hcal= 203 kcal/mol de monômero; Tm=
65,20 °C).
Resultados e Discussão
74
Figura 4.2.6: Ajuste do termograma da asparaginase ao modelo de transição entre “não dois estados”. O termograma foi obtido com a asparaginase 13,6 µM (monômeros) em Tris:HCl 10 mM, pH 9,0. A velocidade de varredura foi 1 °C/min. O dado experimental é representado pela linha sólida e o ajuste, pela linha pontilhada. O ajuste ao modelo foi feito utilizando programa Origin 7.0, MicroCal.
Com o modelo de transição do tipo “não dois estados” com dois picos de
transição na análise do termograma, obtém-se um melhor ajuste, como mostrado na
Figura 4.2.7, sendo ∆Hcal = 89 kcal/mol monômero e Tm = 63,91 °C, para o primeiro
pico de transição, e ∆Hcal = 117 kcal/mol monômero e Tm = 65,44 °C, para o segundo
pico de transição. A entalpia de van’tHoff (∆HvH) foi calculada a fim de avaliarmos a
relação entre as unidades cooperativas da proteína.
50 55 60 65 70 75
0
10
20
30
40
50
60C
p (
kca
l/m
ole
/oC
)
Temperatura (oC)
Resultados e Discussão
75
Figura 4.2.7: Ajuste do termograma da asparaginase ao modelo de transição entre “não dois estados”. O termograma foi obtido com a asparaginase a 13,6 µM em Tris:HCl 10 mM, pH 9,0. A velocidade de varredura foi 1 °C/min. O termograma foi normalizado em relação à concentração de monômeros. O dado experimental é representado pela linha sólida e o ajuste pelas linhas vermelhas pontilhadas. O ajuste ao modelo foi feito utilizando o programa Origin 7.0, Microcal.
Para uma análise geral dos termogramas de desnaturação da asparaginase,
a entalpia calorimétrica (∆Hcal) para a desnaturação proteica foi calculada através da
área do pico calorimétrico, e a entalpia de van’tHoff (∆HvH) foi calculada através da
equação:
cal
pvH
H
CpRTH
max2max4
Equação 4.2.6
onde Tmax é a temperatura na qual ocorre o valor máximo de Cp, Cpmax é o valor de
capacidade calorífica máxima e R é a constante universal dos gases perfeitos.
A razão ∆HvH/∆Hcal expressa a relação entre as unidades cooperativas por
proteína. Para transições entre dois estados, reversíveis, a razão ∆HvH/∆Hcal é igual
a 1. No entanto, transições de dois estados são raras e a termodinâmica estatística
descreve que as propriedades termodinâmicas macroscópicas de um sistema
50 55 60 65 70 75
0
10
20
30
40
50
60C
p (
kcal/m
ole
/oC
)
Temperatura (oC)
Resultados e Discussão
76
podem ser relacionadas com os estados do sistema que podem ser populados. Isso
está relacionado a uma função de partição que é soma das probabilidades
estatísticas de todos os estados. Em proteínas oligoméricas, com monômeros
idênticos, espera-se, portanto um acoplamento entre os processos de
desenovelamento e de dissociação dos monômeros. Segundo o formalismo de
Freire (1989), a razão entre ∆HvH e ∆Hcal pode ser relacionada com o grau de
autoassociação, n:
Equação 4.2.7
De acordo com essa equação, esperava-se que a razão ∆HvH/∆Hcal fosse
igual a 1,6 para a asparaginase, já que esta é uma proteína tetramérica de
subunidades idênticas. Porém, foi obtida uma razão igual a 1,44 ± 0,06, nos três
valores de pH estudados, indicando, ao mesmo tempo, que o processo de
desnaturação não obedece ao formalismo descrito como “dois estados” e, tampouco,
que a proteína se comporta como descrito para homooligômeros.
Por outro lado, para proteínas multiméricas que desenovelam de acordo com
o modelo de 2 estados com dissociação simultânea das subunidades, a Tm aumenta
com a concentração total de proteína, como descrito por Takahashi e Stutervant
(1981):
Equação 4.2.8
onde ∆HvH corresponde à entalpia de van’tHoff, R à constante dos gases, Tm à
temperatura de transição, Ct à concentração total de proteína e µ ao número de
subunidades proteicas. Em proteínas oligoméricas, é comum que a dissociação da
proteína em suas subunidades preceda o desenovelamento. Esse comportamento
seria esperado para a asparaginase, já que é uma proteína tetramérica. Quando
uma proteína oligomérica sofre dissociação durante o processo de
desenovelamento, a temperatura de transição depende da concentração proteica,
sendo o estado oligomérico favorecido com maiores concentrações de proteína.
Ou seja, para que o formalismo de Freire (eq. 4.2.7; FREIRE, 1989) fosse
válido, a temperatura e a entalpia calorimétrica de desnaturação térmica da
Resultados e Discussão
77
asparaginase seriam dependentes da concentração da amostra. A fim de verificar
essa dependência, os termogramas foram obtidos com diferentes concentrações de
amostra. Foi observado que o aumento em 10 ou 20 vezes na concentração de
asparaginase não causou mudança no perfil do pico de transição, ou seja, não
houve mudança em Tm e ∆Hcal (dados não mostrados). Dessa forma, a diferença na
concentração da amostra foi aumentada para 100 vezes, sendo os termogramas da
asparaginase obtidos com 2 µM e com 200 µM de proteína (Figura 4.2.8). Como
observado, os termogramas foram sobreponíveis, e essa variação de concentração
não causou mudanças na Tm. Esse dado, bastante inesperado para uma proteína
oligomérica, sugere que não ocorre uma dissociação da proteína acoplada à
desnaturação.
Figura 4.2.8: Efeito do aumento da concentração de asparaginase sobre os termogramas. Os termogramas foram obtidos em Tris:HCl 10 mM, pH 9,0, com asparaginase 2 µM (▬) e 200 µM (▬), em concentração de monômeros. A velocidade de varredura foi 1 °C/min. Os termogramas foram normalizados em função da concentração monomérica de proteína.
50 60 70
0
10
20
30
40
50
Cp (
kcal/m
ole
/oC
)
Temperatura (oC)
Resultados e Discussão
78
Tabela 4.2.5: Efeito da concentração de asparaginase sobre os parâmetros
termodinâmicos
Concentração
(µM)
Tm
(°C)
∆Hcal
(kcal/mol)
∆T 1/2
(°C)
2 65,78 174,21 2,94
200 65,78 181,65 3,21
Parâmetros calculados para experimentos feitos com velocidade de varredura de 1 °C/min. Os valores de ∆H
cal foram expressos em relação à concentração de monômeros. Os dados representam
a média de dois experimentos.
Outra observação interessante neste trabalho está relacionada à
cooperatividade da transição térmica. A meia largura do pico de transição (∆T1/2) é
uma medida indireta da cooperatividade da transição. Quanto mais estreito é o pico,
mais cooperativa é a transição. No caso da asparaginase, a desnaturação térmica foi
muito cooperativa, com valores de ∆T1/2 de aproximadamente 3,2 °C, nos três
valores de pH. O termograma obtido na menor concentração proteica (2 µM) foi um
pouco mais estreito (Tabela 4.2.5).
Geralmente, as transições de proteínas apresentam valores de ∆T1/2 maiores
que os observados para a asparaginase. Para a lactoferrina isolada de leite humano,
por exemplo, foram encontrados valores de ∆T1/2 igual a 4,58 °C, para a
apoproteína, e 6,21 °C, para a holoproteína saturada com ferro (MATA et al., 1998).
Para a lactoferrina recombinante produzida em arroz, esses valores foram 6,28 °C,
para a forma apo, e 5,58 °C, para a forma holo (CONESA et al., 2007). Para a
proteína isolada de Phaseolus vulgaris, o ∆T1/2 foi de 5,90 °C (YIN et al., 2011). A
enolase de levedura apresentou valores ∆T1/2 entre 4,2 e 7,0 °C, dependendo da
presença e do tipo de ligantes (BREWER & WAMPLER, 2001). Para algumas
proteínas, valores muito elevados de ∆T1/2 foram observados, como é o caso da
globulina isolada de Fagopyrum esculentum, apresentou valores de ∆T1/2 variando
entre 13 e 15 °C (CHOI & MA et al., 2005). Para a transição da albumina bovina, por
exemplo, com a proteína contendo ácidos graxos endógenos, o valor de ∆T1/2 variou
de 8,8 a 12 °C, dependendo da concentração proteica, já para a albumina na
ausência dos ácidos graxos, a cooperatividade da transição foi menor, com valores
de ∆T1/2 entre 16,5 e 17,6 °C (MICHNIK, 2003). A globulina das sementes de linhaça
Resultados e Discussão
79
(Linumusitatissimum) também apresentou um alto valor de ∆T1/2, de 10,50 °C (LI-
CHAN & MA et al., 2002).
Comparada a outras proteínas, a asparaginase apresenta um comportamento
termodinâmico, ao mesmo tempo, inesperado e interessante. A asparaginase tem o
comportamento esperado para transições de dois estados, normalmente observadas
com proteínas monoméricas, como foi observado com as técnicas espectroscópicas.
Porém, devemos considerar a falta de simetria dos picos de transição térmica
obtidos por DSC.
A transição térmica da asparaginase foi também estudada em diferentes
velocidades de varredura, de 0,2 °C/min a 1,5 °C/min, nos três valores de pH (Figura
4.2.9). Quando os parâmetros termodinâmicos de desnaturação proteica não sofrem
influência da velocidade de varredura, pode-se considerar que as espécies nativa e
desnaturada estão em equilíbrio, mesmo em velocidades de varredura elevadas. No
entanto, se a Tm e o ΔHcal apresentam dependência da velocidade de varredura,
esse é um indicativo de que as espécies nativa e desnaturada não estão em
equilíbrio ou que este equilíbrio é muito lento em relação ao tempo da varredura,
indicando que o processo é cineticamente dirigido (GRINBERG et al., 2000). Para
nossa surpresa, no caso da asparaginase, foi observado um aumento na Tm com o
aumento da velocidade de varredura (Tabela 4.2.6 e Figura 4.2.10A), o que indica
que o processo de desnaturação da asparaginase é, pelo menos em parte,
cineticamente controlado. Os valores de ∆Hcal apresentaram tendências diferentes
dependendo do pH Tabela 4.2.6 e Figura 4.2.10B). Em pH 8,0, os valores de ∆Hcal
aumentaram em função da velocidade de varredura. Nesse pH, ∆Hcal aumenta de
140 kcal/mol em 0,2 °C/min para 186 kcal/mol em 1,5 °C/min, um aumento de
aproximadamente 19%. Uma explicação para esse aumento é que em maiores
velocidades de varredura, a população de proteínas desnaturadas de forma
irreversível é menor (DE GRASSO et al., 1995). Em pH 8,5, a variação de ∆Hcal foi
cerca de 4%, entre o valor obtido em 0,2 °C/min e o obtido em 1,5 °C/min. Já em pH
9,0, não houve uma variação significativa de ∆Hcal.
Resultados e Discussão
80
50
55
60
65
70
75
0
10
20
30
40
50
60
Cp (kcal/mole/oC)
Te
mp
era
tura
(oC
)
B
50
55
60
65
70
75
0
10
20
30
40
50
60
Cp (kcal/mole/oC)
Te
mp
era
tura
(oC
)
A
50
55
60
65
70
75
0
10
20
30
40
50
60
70
Cp (kcal/mole/oC)
Te
mp
era
tura
(oC
)
CF
igu
ra
4.2
.9:
Efe
ito
d
a
velo
cid
ad
e
de
v
arr
ed
ura
so
bre
o
s
term
og
ram
as
da
asp
ara
gin
as
e.
Os
term
ogra
mas f
ora
m o
btido
s e
m T
ris:H
Cl 10 m
M
pH
8,0
(A
), p
H 8
,5 (
B)
e p
H 9
,0 (
C).
O
s e
xperim
ento
s f
ora
m
feitos e
m 0
,2 °
C/m
in (
▬),
0,5
°C
/min
, (▬
), 1
°C
/min
(▬
) e 1
,5 °
C/m
in (
▬).
Os t
erm
ogra
mas f
ora
m n
orm
aliz
ad
os
em
fu
nção
da
concentr
ação
monom
érica
de
aspara
gin
ase
(13,6
µM
).
Os g
ráficos f
ora
m a
nalis
ad
os
no p
rogra
ma O
rigin
7,0
, M
icro
cal
Resultados e Discussão
81
Tabela 4.2.6: Efeito da velocidade de varredura sobre os parâmetros
termodinâmicos para a desnaturação da asparaginase
Condição Velocidade de
Varredura (°C/min)
ΔHcal*
(kcal/mol)
Tm
(°C)
∆T1/2
(°C)
pH 8,0 0,2 140,83 60,85 2,86
0,5 160,52 ± 4,71 62,16 ± 0,05 3,11 ± 0,05
1,0 170,91 ± 6,37 63,33 ± 0,12 3,28 ± 0,01
1,5 185,99 ± 6,29 63,76 ± 0,10 3,61 ± 0,005
pH 8,5 0,2 180,31 ± 8,02 62,12 ± 0,11 2,95 ± 0,04
0,5 184,99 ± 2,16 63,60 ± 0,40 3,02 ± 0,06
1,0 180,35 ± 8,40 64,23 ± 0,07 3,21 ± 0,01
1,5 188,92 ± 5,10 65,35 ± 0,49 3,38 ± 0,21
pH 9,0 0,2 195,84 63,36 2,97
0,5 182,33 64,21 2,94
1,0 195,86 ± 3,24 65,64 ± 0,16 3,20 ± 0,005
1,5 192,85 ± 4,78 66,14 ± 0,44 3,21 ± 0,01
*Os valores de ∆Hcal
são expressos em relação à concentração de monômeros de asparaginase. Os dados sem desvio padrão representam a média de dois experimentos.
Figura 4.2.10: Variação dos parâmetros termodinâmicos para a desnaturação da asparaginase em função da velocidade de varredura. (A) Variação da temperatura de transição. (B) Variação da
entalpia calorimétrica. Os dados foram obtidos em pH 8,0 (●), 8,5 (●) e 9,0 (●).
0,0 0,5 1,0 1,5
61
62
63
64
65
66
Velocidade de Varredura (oC/min)
Tm (
oC
)
A
0,0 0,5 1,0 1,5120
140
160
180
200
H
ca
l (kca
lmo
l)
Velocidade de Varredura (oC/min)
B
Resultados e Discussão
82
Considerando essas variações, decidimos verificar como a velocidade de
varredura poderia alterar a desnaturação térmica em diferentes concentrações de
asparaginase. Os termogramas foram, então, obtidos em 0,2 °C/min, nas
concentrações de 2 µM e 200 µM e são mostrados na Figura 4.2.11. Os
termogramas apresentaram uma pequena diferença entre as temperaturas de
transição de, aproximadamente, 0,8 °C (Tabela 4.2.7).
Figura 4.2.11: Efeito do aumento da concentração de asparaginase sobre os termogramas. Os termogramas foi obtidos em Tris:HCl 10 mM pH 9,0, com asparaginase 2 µM (▬) e 200 µM (▬). A velocidade de varredura foi 0,2 °C/min. Os termogramas foram normalizados em função da concentração monomérica de proteína.
Tabela 4.2.7: Efeito da concentração de asparaginase sobre os parâmetros
termodinâmicos
Concentração
(µM)
Tm
(°C)
∆Hcal
(kcal/mol)
∆T1/2
(°C)
2 62,25 ± 0,01 182,10 ± 2,81 2,84 ± 0,08
200 63,11 198,57 3,03
Parâmetros calculados para experimentos feitos com velocidade de varredura de 0,2 °C/min. Os valores de ∆H
cal são expressos em relação à concentração de monômeros. O dado em 200 µM
representa a média de dois experimentos.
50 60 70
0
10
20
30
40
50
60
Cp
(kca
l/m
ole
/oC
)
Temperatura (oC)
Resultados e Discussão
83
Essa diferença de temperatura entre as duas condições é pequena, se
considerarmos que a concentração de asparaginase é aumentada em cem vezes.
Para a forma oxi da hemoglobina de Glossoscolex paulistus, um aumento da
concentração em 4 vezes, por exemplo, leva a um aumento da temperatura de
transição em aproximadamente 10 °C (SANTIAGO et al., 2010).
Nossos resultados de DSC, CD e fluorescência sugerem que a desnaturação
da asparaginase acontece sem a dissociação do tetrâmero em subunidades. Porém,
foi detectado um intermediário cineticamente controlado, já que a transição foi
dependente da velocidade de varredura. Dessa forma, foi empregada a técnica de
fluorescência com o aumento da pressão hidrostática, na qual a fluorescência
intrínseca da asparaginase foi monitorada. Nesses experimentos, a asparaginase foi
submetida a pressões de até 3,10 kbar e os espectros de emissão de fluorescência
foram registrados em cada uma das pressões aplicadas. Os valores de centro de
massa obtidos indicaram que o tetrâmero de asparaginase é bastante estável em
tampão (Tris:HCl 10 mM, pH 8,0), ou seja, o centro de massa não apresentou
variação significativa, com um deslocamento para o vermelho de apenas 1 nm, na
pressão de 3,10 kbar. Considerando-se que a asparaginase tem apenas um
triptofano por subunidade, o qual está localizado na interface de interação entre as
subunidades, esses dados sugerem que pressões de até 3,1 kbar não provocam a
dissociação da proteína.
Como outra tentativa de se detectar a dissociação do tetrâmero, a atividade
da asparaginase foi medida com baixas concentrações proteicas. A asparaginase é
ativa apenas na forma tetramérica, de forma que a dissociação do tetrâmero pela
diluição da amostra levaria à perda da atividade. As medidas de atividade foram
feitas através de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC), pela medida da variação
do fluxo de calor (µcal·s-1), a 25 °C, como descrito nas seções 3.4 e 3.5.
Geralmente, os experimentos para as medidas de atividade da asparaginase eram
feitos com a asparaginase à concentração final de 0,56 ηM na cela calorimétrica
contendo o meio de reação. Novos experimentos foram feitos com o objetivo de
determinar a menor concentração de asparaginase em que seria possível detectar
reação. As concentrações de asparaginase na cela calorimétrica foram diminuídas
(12, 10, 8 e 3 ρM), sendo que a menor concentração em que se obteve uma
variação de fluxo de calor detectável foi 3 ρM. A variação do fluxo de calor foi
Resultados e Discussão
84
pequena, mas foi possível medir a velocidade de reação (fluxo de calor em µcal·s-1),
como mostrado na Figura 4.2.12, sendo a reação exotérmica com a velocidade de
0,023 µcal·s-1. Abaixo dessa concentração o fluxo de calor foi muito baixo para ser
detectado de forma confiável devido ao alto grau de ruído observado, o que não
quer dizer que não houvesse reação, mas que se poderia estar no limite de
detecção da técnica. De qualquer forma, os resultados mostraram que a
asparaginase é ativa em concentrações muito baixas, o que indica que ela mantém
sua estrutura tetramérica nessas condições.
Figura 4.2.12: Reação da asparaginase em baixa concentração, a 25 °C. As velocidades de reação foram medidas através de experimentos de ITC, em condições de estado estacionário. A cela continha o meio de reação (asparagina 50 mM em Tris:HCl 10 mM, pH 9,0). A seringa de injeção continha asparaginase (0,0056 µM). A reação era iniciada pela injeção da enzima atingindo a concentração final de 3 ρM na cela calorimétrica.
Os dados de ITC são indicativos de que o tetrâmero de asparaginase é
bastante estável, e mostram que em todas as condições estudadas por DSC, CD e
fluorescência, a asparaginase estava em sua forma tetramérica em temperatura
ambiente, já que as concentrações empregadas nesses experimentos estão na faixa
de µM.
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00-0,04
-0,02
0,00
0,02
Tempo (min)
Flu
xo d
e C
alo
r (µ
cal/sec)
Resultados e Discussão
85
4.2.3 Estudo da estabilidade da asparaginase por microscopia
A estabilidade do tetrâmero foi estudada através de técnicas de microscopia.
Através da microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia de força
atômica (AFM) foi possível analisar mudanças de tamanho e forma na asparaginase,
em função da temperatura. Para esses experimentos, amostras de asparaginase
foram preparadas em pH 9,0, em três temperaturas: 25 °C, 63 °C (próxima à Tm) e
67 °C (após o término do pico de transição).
As amostras para a MET foram preparadas por contrastação negativa com
uranila a 5% e analisadas em um microscópio Morgani, FEI, a 80 kV. A análise das
imagens de MET mostrou que a asparaginase possui uma forma quase esférica,
como mostrado na Figura 4.2.13 e pela Tabela 4.2.8. A Figura 4.2.13 mostra as
micrografias obtidas para a asparaginase nas três temperaturas.
Figura 4.2.13: Micrografias da asparaginase obtidas por microscopia de transmissão eletrônica, em função da temperatura. Os experimentos foram feitos com asparaginase 0,05 µM em pH 9,0, em 25 °C (A), em 63 °C (B) e em 67 °C (C). As amostras foram contrastadas com uranila a 5%.
Resultados e Discussão
86
A Tabela 4.2.8 mostra os valores medidos para os diâmetros maior, menor e
para o fator de forma. O fator de forma representa a relação entre o diâmetro menor
e o diâmetro menor, quanto mais próximo de 1 for o esse valor, mais próximo de
uma esfera estará a forma de uma proteína.
Tabela 4.2.8: Análise das micrografias da asparaginase obtidas por
microscopia de transmissão eletrônica
Temperatura
(°C)
N DMaior
(nm)
DMenor
(nm)
Fator de
forma
25 115 344 ± 165 304 ± 155 0,88 ± 0,08
63 67 225 ± 93 193 ± 82 0,86 ± 0,09
67 128 163 ± 58 150 ± 54 0,92 ± 0,07
N corresponde ao número de observações, DMaior corresponde ao diâmetro maior medido, DMenor corresponde ao diâmetro menor medido e o fator de forma é a relação entre os diâmetros menor e maior.
Os valores dos diâmetros maior e menor diminuíram com o aumento da
temperatura. Foi observada uma maior variação de tamanho nas amostras
preparadas em 25 °C. Com o aumento da temperatura, o tamanho da asparaginase
tornou-se mais uniforme, como pode ser notado pela distribuição dos diâmetros e do
fator de forma mostrados na Figura 4.2.14.
A comparação dos diâmetros maior, menor e do fator de forma em cada
temperatura foi feita a fim de se determinar se a diferença encontrada foi
significativa. A análise estatística foi feita através do teste One Way Anova e pelo
teste deTurkey-Krame. As comparações de cada parâmetro entre cada uma das
temperaturas estão mostradas nas Tabelas 4.2.9, 4.2.10 e 4.2.11.
Resultados e Discussão
87
Figura 4.2.14: Distribuições do diâmetro maior, do diâmetro menor e do fator de forma para as amostras de asparaginase preparadas em diferentes temperaturas e analisadas por microscopia de transmissão eletrônica. Os experimentos foram feitos com asparaginase 0,05 µM em pH 9,0. As temperaturas estão indicadas nos gráficos. Os histogramas foram feitos no programa Origin 7.0, Microcal.
0 200 400 600 800 10000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
0 200 400 600 800 10000
10
20
30
40
50
60
70
Diâmetro Maior (nm)
Fre
quên
cia
TA
67°C
63°C
0 200 400 600 800 10000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
0 200 400 600 800 10000
4
8
12
16
20
24
28
0 200 400 600 800 10000
4
8
12
16
20
24
28
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10
4
8
12
16
20
24
28
0 200 400 600 800 10000
10
20
30
40
50
60
70
Diâmetro Menor (nm)
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10
10
20
30
40
50
60
70
Fator de Forma
0 200 400 600 800 10000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
0 200 400 600 800 10000
10
20
30
40
50
60
70
Diâmetro Maior (nm)
Fre
quên
cia
TA
67°C
63°C
0 200 400 600 800 10000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
0 200 400 600 800 10000
4
8
12
16
20
24
28
0 200 400 600 800 10000
4
8
12
16
20
24
28
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10
4
8
12
16
20
24
28
0 200 400 600 800 10000
10
20
30
40
50
60
70
Diâmetro Menor (nm)
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10
10
20
30
40
50
60
70
Fator de Forma
Resultados e Discussão
88
Tabela 4.2.9: Comparação do diâmetro maior medido para a asparaginase entre
as diferentes temperaturas
Comparação do DMaior Análise P
25 °C vs 63°C Estatisticamente diferentes P<0,001
63°C vs 67°C Estatisticamente diferentes P<0,001
25 °C vs 67°C Estatisticamente diferentes P<0,001
Tabela 4.2.10: Comparação do diâmetro menor medido para a asparaginase
entre as diferentes temperaturas
Comparação do DMenor Análise P
25 °C vs 63°C Estatisticamente diferentes P<0,001
63°C vs 67°C Estatisticamente diferentes P<0,05
25 °C vs 67°C Estatisticamente diferentes P<0,001
Tabela 4.2.11: Comparação do fator de forma para a asparaginase entre as
diferentes temperaturas
Comparação do Fator de forma Análise P
25 °C vs 63°C Estatisticamente iguais P<0,05
63°C vs 67°C Estatisticamente diferentes P<0,001
25 °C vs 67°C Estatisticamente diferentes P<0,001
Pelas análises estatísticas, as diferenças de valores dos diâmetros maiores
são significativas quando as temperaturas são comparadas. O mesmo acontece
para os valores de diâmetro menor. No entanto, o fator de forma em 25 °C não é
significativamente diferente daquele obtido para a amostra a 63 °C. Já quando a
amostra a 63 °C é comparada àquela em 67 °C ou quando a amostra em 25 °C é
comparada à amostra em 67 °C, a diferença é significativa. Esse resultado indica
que a asparaginase não muda de forma até 63 °C, mas entre 63 °C e 67 °C há uma
mudança de forma e as moléculas de asparaginase aproximam-se de uma esfera.
Os experimentos de AFM foram feitos com a asparaginase preparada nas
mesmas condições e temperaturas estudadas por MET. Por AFM, a forma das
moléculas em cada uma das condições pode ser estudada. Para os estudos, a
asparaginase foi preparada em cada uma das temperaturas, adsorvida na mica e
Resultados e Discussão
89
seca na temperatura a ser estudada. As imagens de AFM foram feitas em ar. A
Figura 4.2.15 mostra a análise da asparaginase preparada em 25 °C.
Figura 4.2.15: Imagens de microscopia de força atômica e análise das amostras (10 µm vs 10 µm) de asparaginase obtidas em 25 °C. (a) Imagem tridimensional; (b) Imagem em duas dimensões; (c) Imagem de fase em duas dimensões e (d) Distribuição dos diâmetros no eixo Z para essa região.
Resultados e Discussão
90
As imagens na Figura 4.2.15 possuem altura aproximada de 70 nm e
dimensões laterais na faixa de 100 a 300 nm. As imagens de AFM mostram que as
moléculas de asparaginase são relativamente alongadas. Essas imagens ainda
indicam que moléculas individuais de proteína mantêm os mesmos valores de altura
e de dimensões laterais. Nas análises de AFM, é mais confiável se considerar os
valores de altura, pois o deslocamento da ponteira na direção Z não sofre influência
de possíveis alargamentos causados pela interação da amostra com a ponteira.
A Figura 4.2.16 mostra a imagem de AFM e a análise para a asparaginase
preparada em 63 °C. Nesse caso, as moléculas proteicas apresentaram altura de
aproximadamente 14 nm e dimensões laterais na faixa de 100 a 250 nm.
Figura 4.2.16: Imagens de microscopia de força atômica para a asparaginase preparada em 63 °C. (a) Imagem tridimensional; (b) Imagem em duas dimensões e (c) Distribuição dos diâmetros no eixo Z para essa região.
O experimento de AFM para a asparaginase em 67 °C é mostrado na Figura
4.2.17. As moléculas de proteína apresentaram altura de aproximadamente 13 nm e
dimensões laterais na faixa de 80 a 200 nm. Os valores do diâmetro da proteína
Resultados e Discussão
91
obtido no eixo Z estão mostrados na Tabela 4.2.12, para as três temperaturas
estudadas.
Figura 4.2.17: Imagens de microscopia de força atômica para a asparaginase preparada em 67 °C. (a) Imagem tridimensional; (b) Imagem em duas dimensões e (c) Distribuição dos diâmetros no eixo Z para essa região.
Tabela 4.2.12: Diâmetro proteico estimado através de microscopia de força
atômica, para as três temperaturas
Temperatura
(°C) N
Diâmetro no eixo Z
(nm)
Dimensões
Laterais (nm)
25 °C, Figura 4.2.15 42 66 ± 12 100-300
63 °C, Figura 4.2.16 42 14 ± 5 100-250
67 °C, Figura 4.2.17 110 13 ± 2 80-200
Resultados e Discussão
92
O diâmetro das moléculas da asparaginase diminuiu com o aumento da
temperatura, como mostrado na Tabela 4.2.12. As dimensões laterais determinadas
por AFM (Tabela 4.2.12) e por MET (Tabela 4.2.8) foram consistentes entre os
métodos. Ambos os métodos mostraram que o tamanho da asparaginase diminui
com o aumento da temperatura, mantendo uma forma aproximadamente esférica,
como mostrado pelos dados de MET.
Os resultados obtidos por calorimetria sugerem que o desenovelamento da
asparaginase é um processo que acontece com a presença de intermediários de
desnaturação. Talvez essas formas intermediárias não sejam estáveis e por isso
não puderam ser distinguidas pelos métodos espectroscópicos.
4.3 Efeito do pH sobre as propriedades cinéticas e estruturais da
asparaginase de Escherichia coli
4.3.1 Efeito do pH sobre as propriedades cinéticas da asparaginase
A atividade da asparaginase foi medida em função do pH através de
experimentos de ITC (Figura 4.3.1). Nesses experimentos, a reação era iniciada pela
injeção da asparaginase no meio de reação contendo asparagina nos tampões
apropriados, em diferentes valores de pH (2,0 a 12,0). Na Figura 4.3.1, as
velocidades de reação estão apresentadas em termos de fluxo de calor (µcal·s-1),
que é diretamente proporcional à velocidade de reação.
Como observado na Figura 4.3.1B, a asparaginase apresentou uma faixa de
pH (entre pH 5,5 e pH 9,0) na qual sua atividade foi máxima. A partir da curva de
atividade em função do pH, foi possível determinar dois valores de pKa (4,0 e 10,1),
que poderiam corresponder às cadeias laterais dos resíduos Asp90 e Lys162,
presentes no sítio ativo.
Os resíduos importantes para a catálise enzimática e para a ligação do
substrato foram identificados através das estruturas do cristal de asparaginase com
aspartato ligado (SWAIN et al., 1993) e do mutante de asparaginase T89V (PALM et
al., 1996). A maioria desses resíduos é conservada entre as asparaginases de
diferentes organismos (DERST et al., 2000).
Resultados e Discussão
93
2 4 6 8 10 120
1
2
Vel
ocid
ade
de R
eaçã
o
(ca
l.s-1
)
pH
0 5 10 15 20-3
-2
-1
0 A
Flu
xo d
e C
alor
(ca
l.s-1
)
Tempo (min)
B
dQ/dt
Figura 4.3.1: Efeito do pH sobre a atividade da asparaginase. (A) As velocidades de reação foram medidas através de experimentos de ITC, em condições de estado estacionário. A cela continha o meio de reação (asparagina 10 mM no tampão 10 mM, no pH de interesse). A seringa de injeção continha asparaginase (20 U/mL). A reação era iniciada pela injeção da enzima (indicado por uma seta no tempo t = 2 min), atingindo a concentração final de 0,1 U/mL na cela calorimétrica. (B) A velocidade da reação (fluxo de calor, em µcal·s
-1) foi medida em diferentes tampões, no pH desejado.
Os dados representam a média () de pelo menos quatro medidas independentes e as barras, o erro padrão.
Os resíduos de Thr12, Tyr25, Thr89, Asp90 e Lys162 são importantes para a
atividade catalítica da asparaginase. Entre esses resíduos, apenas as treoninas
estão em posição que possibilita o ataque nucleofílico ao substrato, proposto como o
primeiro passo da reação enzimática. A cadeia lateral da Thr89 liga-se à Lys162 e
ao Asp90, por ligações de hidrogênio feitas através de seu grupamento hidroxila. A
disposição desses resíduos levou à suposição de que a asparaginase possui uma
tríade catalítica semelhante à das serino proteases. No entanto, o estudo do mutante
Resultados e Discussão
94
T89V (PALM et al., 1996), indicou que a Thr12, ao invés da Thr89, é o nucleófilo
envolvido na reação de acilação. O resíduo Thr89 e os resíduos Lys162 e Asp90,
que estão próximos a ela, localizam-se em uma região rígida da proteína. Além
disso, o Asp90 também faz ponte de hidrogênio com a Ser248, de outra subunidade,
o que contribui para a maior rigidez dessa região do sítio ativo. O substrato é
posicionado corretamente no sítio ativo através de uma rede de ligações de
hidrogênio e interações eletrostáticas. Os resíduos de Ser58 e Glu59, junto com
Asp90 são importantes para esse posicionamento. O resíduo de Glu283, do
monômero vizinho também é importante, pois está envolvido em interações
eletrostáticas com o grupamento amônio do substrato. Já a Thr12 e a Tyr25 estão
localizadas em uma alça que se fecha sobre o sítio ativo durante a catálise. O
fechamento dessa alça, pela ligação do substrato, põe a Tyr25 e a Thr12 na posição
favorável à catálise, por isso é um pré-requisito para catálise. Quando a alça está
fechada, o substrato ligado à enzima faz a conexão entre três monômeros (A, B e
C). Com o fechamento da alça sobre o sítio ativo, o resíduo de Tyr25 fica preso no
interior da proteína, enquanto a His183 do monômero B faz uma ligação de
hidrogênio com a Ser23 do monômero A. A mobilidade desse resíduo fica ainda
mais limitada por ligações de hidrogênio entre Asn181 (B) e Ser23 (A) e Asn281 (B).
O resíduo de Thr119 (A) também contribui no fechamento da alça pela interação
com a Gly17 (A) (PALM et al., 1996; DERST et al., 2000; AUNG et al., 2000).
Estudos de asparaginases de outros organismos, tanto eucariotos quanto
procariotos, mostraram que o pH afeta a atividade dessas enzimas de forma
diferente. A asparaginase de Aspergillus terreus é ativa de pH 4,0 a 11,0,
apresentando o máximo de atividade em pH 9,0 (SINDALISAWARA et al., 2011). A
enzima isolada de uma bactéria de solo, da família Achromobacferaceae,
apresentou pH ótimo entre 7,0 e 10,0 (ROBERTS et al., 1972). A atividade da
asparaginase de Pseudomonas aeruginosa foi estudada de pH 2,0 a 11,0, tendo
sido observado um aumento de atividade até pH 9,0, onde o máximo foi atingido e
diminuindo em valores mais alcalinos de pH (BESSOUMY et al., 2004). A
asparaginase purificada de uma nova espécie de Erwinia sp., isolada de solo, não
apresentou atividade de pH 2,0 a 4,0, sendo que a atividade aumentou a partir de
pH 5,0 e atingiu o máximo entre pH 8,0 a 9,0 mantendo cerca de 80% de atividade
na faixa alcalina (BORKOTAK et al., 2002). A asparaginase de Erwinia carotovora
Resultados e Discussão
95
NCYC 1526 apresentou baixa atividade em pH menor que 6,5 e acima desse valor,
até pH 9,0, a atividade foi independente do pH (KOTZIA et al., 2005).
A enzima da bactéria Pectobacterium carotovorum MTCC 1428 apresentou
atividade na faixa de pH 5,5 a 10,5, sendo que a atividade enzimática mais baixa foi
observada na faixa de pH ácido e a maior de pH 8,0 a 9,0 (KUMAR et al., 2011). A
atividade da asparaginase de Thermus thermophilus apresentou uma forte
dependência do pH, com um valor de pH ótimo igual a 9,2, e diminuição da atividade
enzimática tanto pela redução como pelo aumento do pH, a partir desse valor
(PRITSA et al., 2001). Para a enzima de Helicobacter pylori 26695, foi observada
uma faixa de pH ótimo próximo ao pH neutro (SHIBAYAMA et al., 2011). Já para a
enzima de uma linhagem diferente de Helicobacter pylori CCUG 17874, o perfil de
atividade da asparaginase em função do pH foi sigmoide, com uma faixa de pH
ótimo entre 7,0 e 10,0, sendo que, abaixo de pH 4,0, a atividade era reduzida para
apenas 20% (CAPPELLETTI et al., 2008). A atividade da enzima de Saccharomyces
cerevisae foi avaliada na faixa de pH de 4,0 a 9,0 e apresentou uma dependência
em forma de sino em função do pH, sendo que o pH ótimo foi obtido na faixa de pH
6,0 a 6,5 (DUNLOP et al., 1980). O maior valor de atividade para a asparaginase
proveniente da planta Withania somnifera foi observado em pH 8,5, sendo que a
curva de atividade em função do pH apresentou uma forma de sino (OZA et al.,
2009). Nos estudos citados, as mudanças de atividade foram relacionadas a
mudanças conformacionais nas proteínas.
A análise do estado de protonação dos resíduos da asparaginase permitiu
calcular os valores de pKa para cada resíduo. A análise de cargas da asparaginase
foi feita pelo TITRA (MARTEL et al., 1996), que é um programa para o cálculo do
estado de protonação de sítios tituláveis em proteínas. Através do TITRA foi possível
calcular o pKa de resíduos de aminoácidos que podem ser titulados. Dos 326
resíduos de aminoácidos em cada subunidade, cerca de 20% dos resíduos são
carregados, e desses 6% estavam fora da faixa de cálculo e não puderam ter seu
pKa determinado. A Tabela 4.3.1 mostra os valores de pka calculados através do
TITRA para os resíduos de aminoácidos da subunidade A da asparaginase.
Resultados e Discussão
96
Tabela 4.3.1: Valores de pKa para os resíduos da subunidade A da
asparaginase
Resíduo Número pKa Resíduo Número pKa
NTLEU-1 0 7,7852 LYS-172 64 Fora da faixa ASP-18 4 2,9496 TYR-176 66 Fora da faixa LYS-22 7 11,6003 TYR-181 67 Fora da faixa TYR-25 9 13,7760 HIS-183 68 5,7199 LYS-29 11 10,9247 LYS-186 69 13,7168 GLU-33 12 4,0976 ASP-188 70 1,1400 LYS-43 13 10,8716 TYR-189 71 14,0439 ASP-44 14 3,5425 LYS-196 73 12,7360 LYS-49 15 11,1916 HIS-197 74 7,9269 GLU-51 16 2,6076 ASP-200 77 3,2659 ASP-60 18 2,4900 ASP-204 79 2,9676 ASP-63 19 2,1599 LYS-207 81 10,7407 LYS-71 21 10,6455 GLU-210 82 4,2207 LYS-72 22 13,1744 LYS-213 83 12,4109 ASP-76 24 1,1128 TYR-218 84 Fora da faixa ASP-78 25 2,0690 TYR-220 85 13,4827 LYS-79 26 11,9828 ASP-225 87 2,8674 ASP-81 28 3,2712 LYS-229 88 12,0757 HIS-87 30 2,9739 ASP-233 89 3,4069 ASP-90 32 Fora da faixa TYR-236 90 11,4398 GLU-93 34 Fora da faixa ASP-237 91 3,0996 GLU-94 35 Fora da faixa TYR-250 93 10,8005 TYR-97 37 Fora da faixa LYS-251 94 12,7206 ASP-100 38 2,0150 ASP-255 96 3,9636 LYS-104 40 12,6858 LYS-262 99 10,8495 ASP-106 41 3,4744 ASP-281 107 1,5881 LYS-107 42 11,8685 GLU-283 108 3,6123 ASP-124 47 Fora da faixa ASP-285 109 2,8715 TYR-130 48 11,1843 ASP-286 110 0,3807 ASP-138 50 1,9496 LYS-288 111 11,4711 LYS-139 51 12,2689 TYR-289 112 10,9305 ASP-152 53 Fora da faixa LYS-301 115 Fora da faixa ASP-156 55 Fora da faixa LYS-314 118 11,6430 ASP-159 56 Fora da faixa ASP-315 119 3,5811 LYS-162 58 Fora da faixa TYR-326 120 9,9425 ASP-167 62 1,1886 CTTYR-326 121 Fora da faixa
Os valores de pKa para os resíduos de Asp90 e Lys162 ficaram da faixa de
cálculo, indicando que os valores de pKa que foram obtidos pela curva de atividade
não correspondem à cadeia lateral desses aminoácidos. Dessa forma, o efeito do
pH sobre a atividade da asparaginase pode atribuído à protonação do substrato da
Resultados e Discussão
97
reação, a asparagina, em função do pH e não à protonação dos aminoácidos do sítio
ativo.
Além disso, a variação da atividade catalítica em função o pH pode estar
relacionada a mudanças nas propriedades conformacionais da asparaginase. A fim
de estudarmos a estabilidade conformacional da asparaginase nos diferentes
valores de pH, foi empregada a técnica de DSC. As estruturas secundária e terciária
da asparaginase foram também estudadas, através de CD, fluorescência e
espectroscopia no UV.
4.3.2 Efeito do pH sobre a estabilidade térmica da asparaginase
A estabilidade térmica da asparaginase foi estudada através de DSC de pH
de 2,0 a 13,0. A Figura 4.3.2 mostra os termogramas da asparaginase obtidos de pH
2,0 a 12,0, já que não foi observada uma transição térmica em pH 13,0. Os
termogramas foram normalizados para a concentração de monômeros de
asparaginase (13,6 µM).
Devido à baixa entalpia calorimétrica para a desnaturação da asparaginase
em pH 2,0, o termograma foi obtido com uma concentração de asparaginase três
vezes maior do que aquela necessária nos outros pHs (41,6 M). Em pH 13,0,
mesmo aumentando-se a concentração de asparaginase para 80 µM, não foi
observada uma transição. Neste caso, observamos distorções na linha de base que
podem indicar precipitação da amostra durante o experimento.
Em pH 3,0 e 4,0 e de pH de 8,0 a 12,0, o termograma da asparaginase
apresentou uma forma mais simétrica se comparado aos picos de transição obtidos
de pH 5,0 a 7,0. Nesta faixa, o pico de transição foi bastante assimétrico, mostrando
a presença de duas populações distintas e bem definidas.
Como descrito na sec. 4.2, a desnaturação térmica da asparaginase é
reversível entre pH 8,0 e 9,0. Em pH 8,0, a reversibilidade foi de 90% quando a
primeira varredura era finalizada em 70 ºC. Já em pH 9,0, a reversibilidade foi cerca
de 95%. Nos demais valores de pH, a transição não foi reversível, já que em um
segundo ciclo de aquecimento, não foi observado um pico de transição.
Resultados e Discussão
98
Figura 4.3.2: Efeito do pH sobre a transição térmica da asparaginase. Os termogramas foram obtidos em diferentes valores de pH, os quais estão indicados ao lado de cada curva de transição. A concentração de asparaginase foi 13,6 µM para as amostras preparadas entre pH 3 e 11. Em pH 12, a concentração de asparaginase foi 41,6 µM. As concentrações são relativas à concentração monomérica da enzima. A velocidade de varredura foi 1 °C/min.
10 20 30 40 50 60 70 80
9
12
11
10
8
7
6
5
4
3
Cp
(kca
l.m
ol-1
C-1)
Temperatura (oC)
50
2
Resultados e Discussão
99
A asparaginase é mais instável em valores extremos de pH. A Figura 4.3.3
mostra a variação nos valores de Tm e ΔHcal em função do pH. Os valores de Tm
para o desenovelamento da asparaginase aumentaram aproximadamente 30 °C do
pH 2,0 ao 9,0, no qual atinge um valor máximo de 65 °C. A partir de pH 10,0 até pH
12,0, os valores de Tm diminuem cerca de 15 °C. Os valores de ∆Hcal foram
normalizados em relação à concentração de monômeros de asparaginase, e
aumentaram de 46,6 kcal·mol-1 em pH 2,0 para 170 a 220 kcal·mol-1 de pH 8,0 a
11,0, diminuindo para 150 kcal·mol-1 em pH 12,0.
Figura 4.3.3: Variação dos parâmetros termodinâmicos da desnaturação térmica da asparaginase em função do pH. Os valores de Tm e ΔH
cal foram calculados a partir dos
termogramas da proteína em diferentes condições de pH. Os valores de Tm são representados por
() e os valores de ΔH são representados por (●). Os valores foram obtidos com a velocidade de varredura de 1 °C/min. Os dados representam a média de pelo menos 6 experimentos independentes e as barras representam o desvio padrão.
O pH tem efeitos característicos nos parâmetros termodinâmicos de
desenovelamento para cada proteína, sendo algumas muito afetadas por mudanças
de pH, enquanto outras podem ser muito resistentes a tais variações. Panse e
colaboradores (PANSE et al., 2000) mostraram que o desenovelamento da proteína
SecB, uma chaperona homotetramérica de Escherichia coli, foi reversível e que o
2 4 6 8 10 1230
40
50
60
70
40
80
120
160
200
240
H
ca
l (kca
l/mo
l),
Tm (
oC
),
pH
Resultados e Discussão
100
aumento do pH diminui a estabilidade do tetrâmero, reduzindo a Tm de 341,3 K
(68,15 °C) em pH 6,5 para 332,6 K (59,45 °C) em pH 9,5. A proteína α-crystallina,
um hetero oligômero composto de 15 a 50 subunidades, não apresentou transição
térmica de pH 2,7 a 6,0 e entre pH 7,0 e 10,0, tanto Tm quanto ∆Hcal aumentaram
com a diminuição do pH, sendo a desnaturação térmica reversível (RASMUSSEN et
al., 2011). A proteína trimérica ligadora de hialurona do tipo 1 é mais estável em
meio ácido, em pH 5,0, o valor de Tm foi 60,57 ± 0,65 °C, com ∆Hcal de 59,5 ± 0,98
kcal·mol-1, já em pH 8,0, a Tm foi 40,18 ± 0,96 °C, com um valor de ∆Hcal igual a 6,38
± 0,68 kcal· mol-1 (JHA et al., 2004).
O domínio de oligomerização da proteína supressora de tumor, p53, forma um
tetrâmero cuja estabilidade foi fortemente dependente do pH, sendo que a
diminuição do pH de 7,0 para 3,0, reduziu a Tm de 84,5°C para 34,3 °C (JONHSON
et al., 1995). Estudos de DSC da aglutinina de amendoim, uma lecitina
homotetramérica, mostraram que Tm e ∆Hcal aumentam de pH 5,5 a 8,2 (REDDY et
al., 1999). As subunidades catalíticas α-1 e α-2 da isoforma Ib do fator de ativação
de plaquetas, acetil hidrolase, formam homodímeros (α-1/ α-1 ou α-2/ α-2) e estudos
de DSC mostraram que, para ambos os tipos de homodímeros, Tm e ∆Hcal
diminuíram com o aumento do pH de 6,5 para 9,5 (Mc MULLEN et al., 2000). A
lecitina das sementes de Phaseolus vulgaris, uma leucoaglutinina homotetramérica,
é extremante estável, estudos de DSC na região de pH ácido (pH 2,0 a 3,0)
mostraram que a Tm aumenta de 73 para 86,08 °C, nessa faixa (BISWAS &
KAYASTHA, 2002). A enzima ureato oxidase, proveniente Aspergillus flavus,
mostrou um padrão complexo de desenovelamento, onde os perfis dos termogramas
obtidos por DSC mostraram dois picos endotérmicos, o primeiro teve estabilidade
máxima entre pH 7,25 e 9,5, diminuindo abaixo de pH 7,25, enquanto o segundo
apresentou um platô para Tm entre pH 7,2 e 9,0, e um máximo para a ∆Hcal próximo
a pH 8,0 (BAYOL et al., 1995).
Estudos da estabilidade da proteína pirrolidina carboxipeptidase, um trímero
da archea hipertermofílica Pyrococcus furiosus, e seus mutantes, mostraram que a
Tm aumentou aproximadamente 50 °C com o aumento do pH na região ácida (pH 2,0
a 4,0) e que o aumento do pH na região alcalina (pH 8,0 a 12,0) levou à redução do
valor de Tm, de aproximadamente 110 °C para 70 °C. Por outro lado, para o
transportador de glicose GLUT-1, a mudança do pH 7,0 para 4,3 não afetou Tm e
Resultados e Discussão
101
∆Hcal de maneira significativa, Tm diminuiu apenas 2,5 °C, e o valor de ∆Hcal diminuiu
10 kcal·mol-1 (EPAND et al., 2001). Nesses trabalhos, as mudanças de Tm e ∆Hcal
estavam relacionadas a mudanças estruturais nas proteínas.
As mudanças na estabilidade proteica, encontradas através dos experimentos
de DSC, podem ser indicativas de que a variação de pH causa mudanças estruturais
na asparaginase. Dessa forma, para verificar possíveis mudanças conformacionais
na asparaginase, foram empregadas as técnicas de CD, fluorescência e
espectroscopia no UV.
4.3.3 Efeito do pH sobre a estrutura secundária da asparaginase
Estruturalmente, a asparaginase é um homotetrâmero composto por quatro
subunidades. O tetrâmero é descrito como um dímero de dímeros, pois as
subunidades interagem duas a duas, formando dois pares de dímeros. A
asparaginase é uma proteína da classe / (LEVITT & CHOTHIA, 1976) (Figura 1.3
e 1.4).
A estrutura secundária da asparaginase foi estudada através de CD na região
do UV distante. O espectro de CD em UV-distante da asparaginase apresenta dois
picos negativos, um em 222 nm e outro em 208 nm, característicos de estruturas em
α-hélice e outro em 216 nm, característico de folhas-β, como mostrado na Figura
4.3.4.
Os espectros de CD em UV-distante da asparaginase foram obtidos de pH 2,0
a 13,0 para a investigação de possíveis mudanças na estrutura secundária da
proteína (Figura 4.3.5). O espectro da asparaginase não apresentou mudanças
significativas de pH 3,0 e 12,0, indicando que sua estrutura secundária é mantida
mesmo em valores de pH extremos. Isso quer dizer que mesmo que tenha tido
algum rearranjo estrutural, não há uma mudança significativa na forma do espectro
que sugira perda ou mudança de estrutura secundária. No entanto, em pH 2,0, a
asparaginase apresentou uma modificação estrutural significativa. Há o
aparecimento de um pico negativo em 203 nm e o pico em 222 nm diminui de
intensidade, apesar de ainda continuar presente no espectro, indicando que a
enzima mantém alguma estrutura secundária, ou seja, não desenovelou
completamente
Resultados e Discussão
102
Figura 4.3.4: Espectro de dicroísmo circular da asparaginase em UV-distante. O espectro da asparaginase (8 µM, em concentração de monômeros) foi obtido em tampão (Tris:HCl 10 mM, pH 8,0) com 6 acumulações, a 25 °C.
Figura 4.3.5: Espectros de dicroísmo circular da asparaginase em UV-distante em diferentes valores de pH. O espectro da asparaginase (8 µM, em concentração de monômeros) foi obtido em tampão 10 mM de diferentes composições (ver material e métodos), em pH 2,0 (▬), pH 3,0 (▬), pH 4,0 (▬), pH 5,0 (▬), pH 6,0 (▬), pH 7,0 (▬), pH 8,0 (▬), pH 9,0 (▬), pH 10,0 (▬), pH 11,0 (▬), pH 12,0 (▬) e pH 13,0 (▬). Os espectros foram obtidos com 6 acumulações, a 25 °C.
200 210 220 230 240 250 260
-30000
-15000
0
15000
30000
[] m
ola
r,(g
raus c
m2 d
mol-1
)
(nm)
200 210 220 230 240 250 260
-30000
-15000
0
15000
30000
[] m
ola
r,(g
rau
s c
m2 d
mo
l-1)
(nm)
Resultados e Discussão
103
Efeito semelhante de uma desnaturação incompleta foi observado para a
proteína α-cristalina. Essa proteína é um heteroligômero composto de 35
subunidades de α e β na razão de 3:1, e é uma proteína composta por folhas-β
principalmente. Estudos dessa proteína na faixa de pH entre 2,5 a 10,0 mostraram
que a α-cristalina não desnatura completamente, pois o sinal de CD em 217 nm não
diminui significativamente (RASMUSSEN et al., 2011). Apenas em pH 13,0, a
asparaginase apresenta perda significativa da estrutura secundária. Esse dado
corrobora o fato de não termos observado um termograma para a asparaginase nos
experimentos de DSC, nesse valor de pH.
A análise dos espectros de CD da asparaginase em UV distante foi feita para
se obter o conteúdo de estrutura secundária da asparaginase em cada valor de pH
estudado. Em pH 13,0, não foi possível fazer a análise do espectro de CD, pois a
região do espectro abaixo de 210 nm apresentou muito ruído. As análises foram
feitas através do pacote de programas contido no CDPro, que compreende os
programas de análise SELCON3, CONTIN e CDSSTR, que permitiram fazer uma
estimativa do conteúdo de estrutura secundária da asparaginase em cada pH
estudado.
A Tabela 4.3.1, mostra os valores obtidos. O conteúdo de estrutura
secundária não sofre variação significativa na faixa de pH entre 3,0 e 12,0 (Figura
4.3.6 e Tabela 4.3.2). A variação de estrutura secundária mais marcante foi
observada no espectro de CD da asparaginase em pH 2,0, o que é refletido pelo
conteúdo de cada estrutura. Nesse pH, foi obtido o conteúdo mais baixo de α-hélice
e folhas-β, com uma diminuição de cerca de 16% dessas estruturas. O conteúdo de
voltas também foi menor que nos outros pHs, mas o conteúdo de estrutura ao acaso
foi alto. Em pH 12,0, as variações de conteúdo estrutural foram mais sutis, havendo
uma redução de cerca de 2% no conteúdo de α-hélice e folhas-β e um aumento nos
conteúdos de estrutura ao acaso e de voltas.
Resultados e Discussão
104
Tabela 4.3.2: Porcentagem de conteúdo de estrutura secundária da
asparaginase em função do pH
pH α-hélice folhas-β voltas estrutura ao
acaso
3,0 18,00 ± 1,30 29,10 ± 1,60 22,00 ± 0,60 29,90 ± 0,70
4,0 18,00 ± 1,00 29,60 ± 1,0 22,10 ± 0,70 29,70 ± 0,60
5,0 18,70 ± 1,00 29,20 ± 1,70 21,90 ± 0,50 29,00 ± 0,60
6,0 18,00 ± 1,60 29,00 ± 2,70 22,10 ± 0,70 29,20 ± 1,40
7,0 19,00 ± 1,70 28,20 ± 1,80 21,70 ± 1,10 29,80 ± 0,80
8,0 19,50 ± 1,40 28,70 ± 0,90 21,80 ± 0,80 29,00 ± 1,40
9,0 19,40 ± 1,60 27,40 ± 2,70 21,90 ± 0,60 30,10 ± 0,10
10,0 19,60 ± 1,90 28,30 ± 1,60 21,70 ± 0,90 29,50 ± 0,60
11,0 19,80 ± 1,60 29,40 ± 2,40 21,50 ± 1,10 27,90 ± 0,37
12,0 16,80 ± 1,70 27,50 ± 2,30 23,00 ± 0,70 32,00 ± 1,30
4.3.4 Efeito do pH sobre a fluorescência intrínseca da asparaginase
A asparaginase possui um resíduo de triptofano e 12 resíduos de tirosina por
subunidade. Isso faz com que essa proteína seja interessante para os estudos de
fluorescência. O resíduo Trp66 está localizado em uma fenda entre os domínios que
constituem cada monômero (resíduos 1-190 e 212 a 326, respectivamente). A
maioria das cadeias laterais na proximidade do Trp66 é extremante hidrofóbica
(Val65, Leu67, Leu69, Ala70, Phe98, Leu99, Val205, Leu211 e Val304), o que
explica o deslocamento do comprimento de onda de emissão máxima para a região
azul do espectro. Outros resíduos vizinhos ao Trp66 são polares, como Asp63,
Glu94, Thr95 e Arg303. Dessa forma, movimentos da cadeia lateral do Trp66 podem
mudar de forma importante a polaridade e modular a emissão de fluorescência.
Embora o Trp66 não seja um resíduo catalítico, ele está conectado a componentes
do sítio ativo através de interações covalentes e não covalentes. A hélice na qual o
Trp66 está localizado é ligada por alguns resíduos à Ser58 e Gln59, que são
importantes para a ligação da asparaginase ao substrato. Os resíduos catalíticos
Thr89 e Asp90, que fazem contato com o substrato, são vizinhos à His87, que está
Resultados e Discussão
105
ligada através de uma ligação de hidrogênio ao Trp66, pelo resíduo de Thr95 (AUNG
et al, 2000).
Os espectros de emissão de fluorescência da asparaginase foram adquiridos
de pH 2,0 a 13,0 e são mostrados na Figura 4.3.6. Nesses experimentos, o
comprimento de onda de excitação foi 295 nm, a fim de que fossem excitados,
seletivamente, os resíduos de triptofano.
A partir da análise do centro de massa espectral, foi observado que a
estrutura terciária da asparaginase mostrou-se bastante estável em uma ampla faixa
de pH, como pode ser notado na Figura 4.3.7. Pode-se observar que o centro de
massa não apresenta mudança significativa de pH 3,0 a 10,0, tendo variado,
respectivamente, de 332 ± 0,74 nm a 333 ± 0,22 nm, o que representa uma
modificação de apenas 1 nm nessa faixa de pH. Em pH 11,0 (334 ± 0,8 nm),
observamos um aumento discreto no centro de massa espectral em relação ao valor
em pH 8,0 (332 ± 0,2 nm), usado como referência neste trabalho.
Figura 4.3.6: Espectros de emissão de fluorescência da asparaginase em função do pH. Os valores de pH estudados foram 2,0 (▬), 3,0 (▬), 4,0 (▬), 5,0 (▬), 6,0 (▬), 7,0 (▬), 8,0 (▬), 9,0 (▬), 10,0 (▬), 11,0 (▬), 12,0 (▬) e 13,0 (▬). A concentração de asparaginase foi 8 µM (monômeros) e os tampões utilizados nas diferentes faixas estão descritos em Material e Métodos. O comprimento de onda de excitação foi 295 nm. Os espectros foram obtidos em 25 °C.
320 340 360 380 400 420
0
20000
40000
60000
80000
100000
Inte
nsid
ade
de F
luor
escê
ncia
(u.
a.)
Comprimento de Onda (nm)
Resultados e Discussão
106
As maiores variações foram observadas em pH 2,0 e a partir de pH 12,0. Em
pH 2,0, o centro de massa aumentou para 340 ± 0,58 nm, representando uma
variação de 8 nm para a região do vermelho, em relação ao valor obtido em pH 8,0.
Em pH 12,0, o centro de massa foi 336 ± 2,33 nm, representando um deslocamento
em cerca de 4 nm para a região do vermelho, ao se comparar com o espectro em pH
8,0. No entanto, apesar dessas modificações, o espectro de fluorescência intrínseca
da asparaginase indica que não há total exposição dos resíduos de triptofano, tanto
em pH 2,0 quanto em pH 12,0. A variação mais significativa foi observada em pH
13,0, no qual o centro de massa foi de 354 ± 0,45 nm, que é o valor esperado
quando os triptofanos estão expostos ao meio aquoso.
Figura 4.3.7: Variação do centro de massa espectral em função do pH. A concentração de asparaginase foi 2 µM e os tampões utilizados estão descritos em Material e Métodos. O
comprimento de onda de excitação foi 295 nm. Os dados () representam a média entre 4 experimentos e a barra representa o desvio padrão.
2 4 6 8 10 12 14
330
335
340
345
350
355
Ce
ntr
o d
e M
assa
Esp
ectr
al (n
m)
pH
Resultados e Discussão
107
Por outro lado, quando a intensidade máxima de fluorescência é analisada em
função do pH (Figura 4.3.8), observa-se um comportamento interessante, não
relacionado aos efeitos do pH na atividade enzimática (Fig. 4.3.1) ou na estabilidade
estrutural (Figuras 4.3.2, 4.3.5 e 4.3.7). Em pH 8,0 foi obtido o espectro de maior
intensidade (Figuras 4.3.6 e 4.3.7). Os dados da Figura 4.3.8 puderam ser ajustados
a três curvas sigmoidais, a partir das quais foram estimados três valores de pK. O
valor do primeiro pKa está em torno do pH 3,5, do segundo pKa, em torno do pH 6,6
e do terceiro pKa, em torno do pH 9,3. A análise do ambiente do triptofano na
estrutura cristalográfica da asparaginase (Figura 4.3.9), numa distância de 5 Å,
mostrou a presença de uma ponte salina entre os resíduos Asp63 e Arg303, que
explicaria as duas inflexões nos extremos de pH (pKa 3,5 e 9,3). Ou seja, a ponte
salina deve ser rompida em pH ácido, quando o acido aspártico é protonado, e o
resíduo de arginina protonado provavelmente ainda se localiza no microambiente do
triptofano, provocando a supressão de sua fluorescência nessa faixa de pH. De
forma semelhante, em pH alcalino, o resíduo de arginina seria desprotonado,
rompendo a ponte salina com o Asp63, o qual passaria a suprimir a fluorescência do
Trp por estar carregado negativamente. O resíduo His87 é, provavelmente, o com
pKa igual a 6,6 que suprime a fluorescência do Trp quando protonado.
Os dados apresentados até o momento indicam que a asparaginase perde
sua estrutura terciária em pH 13,0. Em uma análise da estrutura da proteína, pode-
se perceber que os triptofanos estão localizados na interface de interação entre as
subunidades e, portanto, não estão acessíveis ao solvente na enzima íntegra. Essa
informação é importante, pois indica que na faixa de pH 2,0 a 12,0, não há
dissociação das subunidades.
Resultados e Discussão
108
Figura 4.3.8: Variação da intensidade relativa de fluorescência em função do pH. A intensidade relativa é dada pela razão entre a intensidade de emissão de fluorescência em cada pH, e intensidade de emissão de fluorescência em pH 8,0, pH no qual foi obtido o espectro de maior
intensidade. O comprimento de onda de excitação foi 295 nm. Os dados () representam a média de 4 experimentos e a barra representa o desvio padrão. A análise dos dados (▬) foi feita através do ajuste a curvas sigmoidais nas três regiões de inflexões. Os espectros foram obtidos a 25 °C.
Figura 4.3.9: Ambiente do triptofano 66 em um raio de 5 Å. Os aminoácidos que estão no entorno do triptofano 66 e que podem estar fazendo pontes salinas estão indicados na figura. O triptofano 66 está representado em vermelho. Figura feita no programa PyMOL (DeLano Scientific, LLC).
2 4 6 8 10 12 140,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Inte
nsid
ad
e r
ela
tiva
de
flu
ore
scên
cia
pH
Resultados e Discussão
109
4.3.5 Espectros de absorção no UV da asparaginase em função do pH
As mudanças no espectro de absorção em UV podem ser usadas para
monitorar a desnaturação de proteínas. As variações devido à ionização de resíduos
de tirosina podem ser empregadas para estudar o desenovelamento proteico (MELO
et. al., 1997). Quando os resíduos de tirosina estão internos na proteína, não são
afetados por mudanças no pH. No entanto, com o desenovelamento proteico e
consequente exposição desses resíduos ao meio aquoso, a ionização da tirosina
pode ser detectada (MELO et al., 1997).
Para acompanhar a ionização da tirosina na proteína, dois valores de
absorbância devem ser medidos, o primeiro em 250 nm e o segundo em 278 nm.
Como a desnaturação é acompanhada pela ionização do grupamento fenólico no
resíduo de tirosina, o método é funcional na faixa de pH alcalina, onde a ionização
do hidrogênio fenólico pode ser medida.
O comportamento iônico de derivados de L- aminoácidos aromáticos (N-acetil-
amida) foi estudado por Cabral e colaboradores (MELO et al., 1997) na faixa alcalina
(pH 7,6 a 12,9). Esses compostos simulam o comportamento desses aminoácidos
na estrutura primária de proteínas. O espectro de absorção em UV da N-acetil-L-
tirosinamida sofre uma grande mudança com o aumento do pH, devido à ionização
do hidrogênio fenólico. O coeficiente de absorção molar em 250 nm aumenta e o
pico de absorção máxima muda de 275 nm para 293 nm, tendo sido calculado um
valor de pKa de 10,1 para a ionização desse derivado de tirosina. Além disso, foram
observados dois pontos isosbésticos, em 269 nm e em 278 nm. Já para os derivados
N-acetil-L-triptofanamida e N-acetil-L-fenilalanina, o espectro de absorção em UV não
é modificado nessa faixa de pH, indicando a ausência de grupos ionizáveis na
cadeia lateral dos mesmos (MELO et al., 1997).
Os espectros de absorção em UV da asparaginase foram obtidos de pH 2,0 a
13,0 como mostrado na Figura 4.3.10. Os espectros de absorção da asparaginase
não mostraram mudanças significativas até pH 8,0, apresentando um máximo de
absorbância em 280 nm. A partir de pH 9,0, a intensidade de absorção em 250 nm
aumenta e os espectros tornam-se menos simétricos, apresentando um ombro na
faixa entre 290 e 320 nm. Em pH 13,0, ocorre uma mudança drástica no espectro do
UV da asparaginase, sendo que o pico de absorção máxima muda de 280 nm para
Resultados e Discussão
110
290 nm, com um aumento considerável na absorção em 250 nm (Figura 4.3.10,
detalhe).
Figura 4.3.10: Espectros de absorção em UV da asparaginase. Os valores de pH estudados foram pH 2,0 (▬), pH 3,0 (▬), pH 4,0 (▬), pH 5,0 (▬), pH 6,0 (▬), pH 7,0 (▬), pH 8,0 (▬), pH 9,0 (▬), pH 10,0 (▬), pH 11,0 (▬), pH 12,0 (▬) e pH 13,0 (▬). A concentração de asparaginase foi 3,4 µM. No detalhe, espectro de absorção da asparaginase em pH 13,0, mostrando o aumento significativo de
absorção em 250 nm.
A variação dos valores de absorbância em 250 nm e 278 nm em função do
pH é mostrada na Figura 4.3.11. Os valores de absorbância em 278 nm não tiveram
variação significativa em função do pH, já os valores de absorbância em 250 nm
aumentam a partir de pH 9,0. Como citado, o aumento de absorção nesse
comprimento de onda pode ser atribuído à ionização das tirosinas na proteína.
A asparaginase possui 12 tirosinas por subunidade e nem todas estão
distribuídas da mesma forma na estrutura da proteína. Dessa forma, mesmo que
pequenas, as mudanças observadas em pH 9,0 e pH 10,0, próximo ao valor de pKa
observado por Melo e colaboradores (MELO et. al., 1997), já refletem mudanças na
260 280 300 320
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
260 280 300 3200,0
0,4
0,8
1,2
1,6
(nm)
Ab
so
rbâ
ncia
(nm)
Absorb
ância
Resultados e Discussão
111
superfície da asparaginase. Em pH 13,0, a absorção em 250 nm aumenta
consideravelmente. Como mostrado nos experimentos de fluorescência, CD e DSC,
nesse pH a proteína perde sua estrutura terciária, o que certamente explica esse
aumento de absorbância, pois na proteína desenovelada as tirosinas estariam
expostas ao meio.
Figura 4.3.11: Efeito do pH na absorbância da asparaginase em UV. Variação dos valores de absorbância em 250 nm e 278 nm em função do pH. Os valores são representados pela média de
quatro medidas independentes para a absorbância em 250 nm (○) e em 278 nm (). As barras representam o desvio padrão.
4.3.6 Ligação da sonda bis-ANS à asparaginase
Além de estudos da fluorescência intrínseca dos triptofanos da asparaginase,
as mudanças conformacionais induzidas pelo pH foram investigadas também
através da medida da ligação de uma sonda hidrofóbica, bis-ANS. Quando o bis-
ANS encontra-se livre em um meio aquoso, sua fluorescência é quase nula, no
entanto, quando está ligado a resíduos não polares na proximidade de cargas
positivas, sua emissão de fluorescência aumenta consideravelmente (ROSEN &
WEBER, 1969).
2 4 6 8 10 12 14
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
Absorb
ância
pH
Resultados e Discussão
112
A Figura 4.3.12 mostra os espectros de fluorescência de bis-ANS na
presença de asparaginase nos valores de pH 2,0, 8,0, 12,0 e 13,0.
Figura 4.3.12: Espectro de fluorescência de bis-ANS na presença da asparaginase em diferentes valores de pH. As concentrações de asparaginase e de bis-ANS foram 4 µM. Os espectros foram obtidos em tampão 10 mM: citrato de sódio pH 2,0 (▬), Tris:HCl pH 8,0 (▬), tetraborato de sódio pH 12,0 (▬) e pH 13,0 (▬). A amostra foi excitada em 360 nm e a emissão foi medida de 400 a 600 nm.
No meio contendo a asparaginase em pH 2,0, foi observado um aumento
considerável na fluorescência do bis-ANS, sugerindo que o bis-ANS liga-se à
asparaginase nessas condições. O bis-ANS pode se ligar melhor à proteína em pH
2,0, porque o ANS possui uma carga negativa, devido ao grupo sulfonila, na faixa de
pH de 1,5 a 12 (TURNER & BRAND, 1968). A área espectral do bis-ANS em pH 2,0
é aproximadamente 12 vezes aquela calculada em pH 8,0. Isso indica a presença de
regiões hidrofóbicas acessíveis ao solvente. Como mostrado pelos experimentos de
CD em UV distante e por fluorescência, nesse pH a asparaginase ainda mantém
estrutura.
No entanto, não foi observado aumento na fluorescência do bis-ANS quando
este está no meio com a asparaginase em pH 12,0 ou 13,0, em relação ao
observado em pH 8,0. Em pH 8,0, a asparaginase está nativa e a ligação do bis-ANS
400 450 500 550 600
0
100
200
300
400
Inte
nsid
ad
e d
e F
luo
rescê
ncia
(u
.a)
(nm)
Resultados e Discussão
113
foi muito pequena, pois o tetrâmero de asparaginase é compacto. Em pH 12,0, a
estrutura secundária da asparaginase é semelhante àquela em pH 8,0, como
mostrado pelos estudos de CD, enquanto que as modificações na estrutura terciária
não foram grandes, como mostrado pela pequena variação do centro de massa
nesse pH. É possível que as modificações estruturais que acontecem nesse pH não
sejam suficientes para levar a uma grande exposição de regiões hidrofóbicas às
quais o bis-ANS pudesse se ligar.
Já em pH 13,0, os estudos de CD, DSC e fluorescência intrínseca mostraram
que a asparaginase perde sua estrutura. Além disso, estudos da asparaginase em
UV-visível, também indicaram que a proteína pode estar dissociada nesse pH.
Portanto, o fato de não ter sido observada ligação de bis-ANS à asparaginase em
pH 13,0, deve-se ao fato de que a sonda não se liga a proteínas desnaturadas, uma
vez que essas não apresentam regiões hidrofóbicas que possam servir de sítios de
ligação.
4.4 Efeito de agentes desnaturantes sobre a estrutura da asparaginase
O uso de agentes químicos desnaturantes, como ureia e cloridrato de
guanidina, tem sido uma estratégia muito empregada para se entender o
desenovelamento de proteínas. O estudo da desnaturação de proteínas pelo
aumento da concentração desses agentes permite uma melhor compreensão da
estabilidade proteica, além de ajudar na elucidação do mecanismo de
desenovelamento, pois permite a detecção de intermediários no processo.
Nesta seção, são mostrados os resultados dos estudos do efeito de agentes
desnaturantes sobre a asparaginase. Para tal, foram empregadas técnicas
espectroscópicas, como dicroísmo circular (CD) e fluorescência intrínseca, além de
calorimetria diferencial de varredura (DSC). Foi, também, estudado o efeito do
aumento da pressão hidrostática como mais uma estratégia para se detectar a
dissociação da proteína no seu processo de desenovelamento.
4.4.1 Efeito dos agentes químicos sobre a estrutura secundária e terciária da
asparaginase
A estabilidade da estrutura terciária da asparaginase foi estudada através de
modificações de fluorescência intrínseca da proteína. Como citado, a asparaginase é
Resultados e Discussão
114
uma proteína interessante para os estudos de fluorescência intrínseca, pois
apresenta um resíduo de triptofano por subunidade, W66, o qual está localizado
próximo à região de interface entre as subunidades (AUNG et al., 2000). A maioria
das cadeias laterais localizadas próximas ao W66 é hidrofóbica, o que explica o
deslocamento para o azul observado no espectro de emissão fluorescência da
asparaginase. A asparaginase também possui 12 tirosinas por subunidade. Dessa
forma, quando excitada em 280 nm, tem-se a contribuição tanto das tirosinas quanto
do triptofano, o que dificulta a análise da exposição dos triptofanos causada pela
desnaturação da proteína. Portanto, para os estudos de fluorescência, foi
empregada a excitação em 295 nm, de maneira que fossem excitados apenas os
triptofanos.
As Figuras 4.4.1 e 4.4.2 mostram as modificações dos espectros de
fluorescência da asparaginase em função do aumento da concentração de ureia ou
de cloridrato de guanidina, respectivamente. A intensidade do pico em 320 nm (pico
de emissão máxima de fluorescência da asparaginase em tampão) diminuiu
gradualmente com o aumento da concentração de ureia ou cloridrato de guanidina.
O aumento da concentração desses agentes também tornou o espectro de
emissão de fluorescência mais alargado. Nas concentrações mais altas de ureia e
cloridrato de guanidina, houve um deslocamento dos picos para a região do
vermelho e a emissão máxima de fluorescência foi observada em 350 nm, uma
característica de triptofanos livres em solução aquosa.
Para verificar a reversibilidade da desnaturação da asparaginase, foi obtido
um espectro de fluorescência após a diluição da ureia. A desnaturação da
asparaginase foi reversível, como mostrado na Figura 4.4.3, já que após a diluição
da ureia, o perfil do espectro de fluorescência foi semelhante àquele obtido na sua
ausência.
Resultados e Discussão
115
Figura 4.4.1: Efeito da ureia sobre a asparaginase, avaliado por fluorescência. A asparaginase (2 µM, em tetrâmeros) foi incubada em meios com tampão apenas (Tris: HCl 10 mM, pH 8,0) e em meios contendo ureia (1,0; 2,0; 3,0; 3,25; 3,75; 4,0; 4,2; 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 5,0; 5,25; 5,5; 5,75 e 6,0 M), por 12 h. A seta indica o aumento da concentração de ureia. O comprimento de onda de excitação foi 295 nm. Os espectros são representativos de 5 experimentos independentes.
Figura 4.4.2: Efeito de cloridrato de guanidina sobre a asparaginase, avaliado por fluorescência. A asparaginase (2 µM, em tetrâmeros) foi incubada em tampão (Tris: HCl 10 mM, pH 8,0) e em meios contendo cloridrato de guanidina (0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,02; 1,04; 1,06; 1,08; 1,1; 1,12; 1,14; 1,16; 1,18; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2 M), por 12 h. A seta indica o aumento da concentração de cloridrato de guanidina. Os espectros foram adquiridos com excitação em 295 nm. Os espectros são representativos de 5 experimentos independentes.
320 340 360 380 400 420
0
50000
100000
150000
6 M
Inte
nsid
ade d
e F
luore
scência
(u.a
.)
Comprimento de Onda (nm)
0
320 340 360 380 400 420
0
15000
30000
45000
60000
Inte
nsid
ad
e d
e F
luo
rescê
ncia
(u
.a.)
Comprimento de Onda (nm)
0
2,2 M
Resultados e Discussão
116
Figura 4.4.3: Re-enovelamento da asparaginase após a retirada da ureia. A asparaginase (20 µM, em tetrâmeros) em 7,0 M de ureia foi diluída 10x em tampão Tris: HCl 10 mM, pH 8,0, ficando com a concentração final de 2 µM em 0,7 M de ureia. Os espectros de fluorescência foram registrados após 30 minutos. Espectro da asparaginase em Tris: HCl 10 mM, pH 8,0 (▬), espectro da proteína em 7,0 M de ureia (▬) e espectro após a diluição da ureia (▬). O comprimento de onda de excitação foi de 295 nm.
O efeito do aumento da concentração de ureia ou de cloridrato de guanidina
sobre a estrutura secundária da asparaginase foi avaliado por CD. Esses agentes
causaram a perda de estrutura secundária da asparaginase, como mostrado nos
espectros de CD nas Figuras 4.4.4 e 4.4.5. Podemos observar que concentrações
crescentes tanto de ureia (Figura 4.4.4) quanto de cloridrato de guanidina (Figura
4.4.5) causaram a perda de estrutura secundária da asparaginase.
Os agentes desnaturantes utilizados apresentam forte absorção e
espalhamento de luz na região do espectro abaixo de 210 nm, impossibilitando a
análise matemática do espectro a fim de determinar o conteúdo de estrutura
secundária. O aumento da concentração desses agentes causou uma diminuição de
intensidade no espectro de CD na região de 210 a 240 nm, devido à perda da
estrutura secundária da asparaginase. Dessa forma, a medida da elipticidade em
222 nm foi analisada como indicativo da perda de estrutura secundária da
asparaginase, em função do aumento da concentração de ureia ou cloridrato de
guanidina.
300 320 340 360 380 400 420
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Inte
nsid
ad
e d
e F
luo
rese
cê
ncia
No
rma
liza
da
Comprimento de Onda (nm)
Resultados e Discussão
117
Figura 4.4.4: Efeito da ureia sobre a asparaginase, avaliado por dicroísmo circular em UV-distante. A asparaginase (2 µM, em tetrâmeros) foi incubada em meios com tampão (Tris:HCl 10 mM, pH 8,0), na ausência e na presença de ureia (1; 2; 3; 3,25; 3,75; 4; 4,2; 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 5; 5,25; 5,5; 5,75 e 6 M), por 12 h a 4 °C. Os espectros foram obtidos com 3 acumulações, a 25 °C. A seta indica o aumento da concentração de ureia.
Figura 4.4.5: Efeito do cloridrato de guanidina sobre a asparaginase, avaliado por dicroísmo circular em UV-distante. A asparaginase (2 µM, em tetrâmeros) foi incubada em meios com tampão (Tris: HCl 10 mM, pH 8,0) e em meios contendo cloridrato de guanidina (0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,02; 1,04; 1,06; 1,08; 1,1; 1,12; 1,14; 1,16; 1,18; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2; 2,2 M), por 12 h, a 4 °C. A seta indica o aumento da concentração de cloridrato de guanidina. Os espectros foram adquiridos com 3 acumulações, a 25 °C. A seta indica o aumento da concentração de cloridrato de gianidina.
200 220 240 260
-20
-10
0
10
20
6 M
Elip
ticid
ade B
ruta
(m
gra
us)
Comprimento de Onda (nm)
0
200 220 240 260
-20
-10
0
10
20
Elip
ticid
ade B
ruta
(m
gra
us)
Comprimento de Onda (nm)
0
2,2 M
Resultados e Discussão
118
A asparaginase é um tetrâmero, portanto durante o processo de
desenovelamento a proteína poderia passar por dois processos: a dissociação do
tetrâmero em dímeros ou monômeros e a desnaturação dos monômeros. Ou seja, a
dissociação do tetrâmero da asparaginase poderia acontecer antes de seu completo
desenovelamento.
Uma maneira de se verificar se uma proteína oligomérica passa por uma
dissociação durante o desenovelamento, formando intermediários estáveis, é
verificar se as curvas de desnaturação apresentam alguma dependência da
concentração de proteína. Um aumento da concentração de proteína favoreceria a
formação de oligômeros durante a dissociação, o que seria refletido em um aumento
de estabilidade na maior concentração de proteína. Para verificar se a formação de
intermediários oligoméricos é importante no desenovelamento da asparaginase,
foram feitos experimentos variando-se a concentração de asparaginase em 10
vezes, e as curvas de desnaturação em função do aumento da concentração de
ureia foram examinadas.
Foram feitos experimentos de CD e de fluorescência em duas concentrações
de asparaginase (2 e 20 µM). A fração desnaturada de asparaginase foi calculada
em função da concentração de ureia ou cloridrato de guanidina, a partir da mudança
da elipticidade em 222 nm do espectro de CD ou da mudança do centro de massa
espectral nos espectros de fluorescência, como mostra a Figura 4.4.6. Não há uma
variação significativa no comportamento da asparaginase, sendo que a
concentração de ureia na qual metade da proteína encontra-se desnaturada (CmU) é
muito semelhante, independente da concentração de proteína e da técnica utilizada
(Tabela 4.4.1).
As curvas de desnaturação da asparaginase obtidas por CD e por
fluorescência podem ser sobrepostas, como mostrado na Figura 4.4.6, sugerindo
que o desenovelamento da asparaginase aproxima-se a um processo entre dois
estados, o nativo, no qual o tetrâmero está intacto, e o desnaturado, no qual
tetrâmero está desenovelado. As curvas indicam ainda a ausência de intermediários
estáveis durante a desnaturação da proteína, sugerindo que apenas o estado nativo
e o desnaturado são significativamente populados durante a transição.
Resultados e Discussão
119
Figura 4.4.6: Sobreposição das curvas de desnaturação da asparaginase por ureia, obtidas por dicroísmo circular e por fluorescência. A fração desnaturada obtida por CD (Δ) e por fluorescência
() foi obtida com (A) 2 µM ou (B) 20 µM de asparaginase. A fração desnaturada foi calculada, como descrito em Material e Métodos, pelas mudanças na intensidade do pico negativo do CD em 222 nm ou no centro de massa espectral, em função da concentração de ureia. Os dados em A representam a média e o desvio padrão da média de 8 amostras, os dados em B representam a média de duas medidas independentes.
Tabela 4.4.1: Concentrações de ureia necessárias para causar 50% de
desnaturação da asparaginase (CmU)*
Concentração de
Asparaginase
(µM)
CmU (M)
Dicroísmo Circular Fluorescência
2 4,40 ± 0,27 4,38 ± 0,15
20 4,2 4,3
*CmU foi calculada a partir da inflexão das curvas da Figura 4.4.6. Os experimentos realizados com asparaginase 20 µM foram repetidos apenas duas vezes.
A energia livre de desnaturação (ΔG0w) foi calculada a partir da análise das
curvas de desnaturação da asparaginase por ureia, obtidas por CD e por
fluorescência (Tabela 4.4.2). O método de análise empregado foi o método de
estrapolação linear, que é usado para analisar a mudança de energia livre envolvida
na conversão da forma nativa para a forma desenovelada de uma proteína na
ausência de um agente desnaturante (SANTORO & BOLEN, 1988). O método
0 1 2 3 4 5 6
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 1 2 3 4 5 6
BF
raçã
o D
esn
atu
rad
a (
)
[Ureia] (M)
A
Resultados e Discussão
120
consiste em converter as constantes de equilíbrio calculadas na região de transição
da curva de variação da energia livre em função da concentração de desnaturante, e
extrapolar os dados para a ausência de desnaturante. Essa relação está expressa
na Equação 4.3.1:
[ ] Equação 4.3.1
onde ΔG0w, é a variação de energia livre para a desnaturação proteica na ausência
de desnaturantes, que corresponde ao intercepto da curva, mG é a inclinação da
curva, e ∆Gobs é a variação de energia livre observada em cada concentração do
desnaturante dada por . A constante de equilíbrio foi calculada
como mostrado em Material e Métodos.
Tabela 4.4.2: Energia livre de desnaturação da asparaginase calculada através
de dicroísmo circular e fluorescência
Concentração de
Asparaginase
(M)
ΔG0w
(kJ/mol)
Dicroísmo circular Fluorescência
2 37,70 ± 3,00 41,97 ± 4,74
20 39,01 39,24
ΔG0w foi calculado a partir da Equação 4.3.1. Os valores obtidos com asparaginase 20 µM
representam a média de dois experimentos independentes.
Os valores da energia livre de desnaturação (ΔG0w) para uma mesma
concentração de asparaginase obtidos por fluorescência e por CD foram
semelhantes. Além disso, o aumento da concentração de proteína não causou
mudança significativa nos valores de ΔG0w. Estudos anteriores obtiveram valores
de ΔG0w para a asparaginase entre 45 a 55 kJ/mol e valores de CmU em torno de 4,0
M de ureia (DERST et al., 1992; WHERNER et al., 1992).
A estabilidade da asparaginase também foi avaliada em função de
concentrações crescentes de cloridrato de guanidina, através de CD e da análise da
fluorescência intrínseca de triptofanos.
Como mostrado na Figura 4.4.7, as curvas de desnaturação obtidas pelas
duas técnicas se sobrepõem. Os valores de CmU calculados a partir dos
Resultados e Discussão
121
experimentos de CD e de fluorescência foram praticamente os mesmos, como
mostrado na Tabela 4.4.3. Os valores de ΔG0w foram calculados da mesma forma
que nos experimentos com ureia, ou seja, pelo método da extrapolação linear. Os
valores de ΔG0w obtidos pela desnaturação com cloridrato de guanidina, por CD e
por fluorescência, foram muito semelhantes (Tabela 4.4.3). Os valores de ΔG0w
calculados para a desnaturação da asparaginase pelo cloridrato de guanidina estão
de acordo com os valores relatados na literatura, que variam entre 46 e 50 kJ/mol
(DERST et al., 1992, 2000; AUNG et al., 2000).
Figura 4.4.7: Sobreposição das curvas de desnaturação da asparaginase por cloridrato de guanidina, obtidas por dicroísmo circular e por fluorescência intrínseca. A fração desnaturada
foi obtida por CD (Δ) e por fluorescência () com 2 µM de asparaginase (em tetrâmeros). A fração desnaturada foi calculada, como descrito em Material e Métodos, pelas mudanças na intensidade do pico negativo do CD em 222 nm ou no centro de massa espectral, em função da concentração de cloridrato de guanidina. Os símbolos representam a media de 11 experimentos independentes, para a fluorescência e 8 experimentos independentes, para o CD.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Fra
çã
o D
esn
atu
rad
a (
)
[Gu.HCl] (M)
Resultados e Discussão
122
Tabela 4.4.3: Parâmetros para a desnaturação da asparaginase calculados
através de dicroísmo circular e fluorescência
Técnica *CmU (M) ΔG0w
(kJ/mol)
CD 1,062 ± 0,004 44,66 ± 2,60
Fluorescência 1,089 ± 0,011 47,53 ± 1,12
*CmU: concentração de cloridrato de guanidina necessária para causar 50% de desnaturação da asparaginase, calculada a partir da inflexão das curvas da Figura 4.4.7. ΔG
0w: energia livre de
desnaturação da asparaginase.
O cloridrato de guanidina foi mais efetivo na desnaturação da asparaginase,
já que os valores de CmU obtidos foram aproximadamente quatro vezes menores que
aqueles obtidos com ureia. Para algumas proteínas, os valores de ΔG0w obtidos
usando-se ureia ou cloridrato de guanidina são idênticos. Para outras, isso não
acontece e os valores de ΔG0w obtidos pela extrapolação das curvas acabam sendo
diferentes. Esse foi o caso da asparaginase, uma vez que os valores de ΔG0w
obtidos por fluorescência, por exemplo, diferiram em aproximadamente 7 kJ/mol.
Essa diferença pode ser atribuída às diferenças de interação entre esses agentes
desnaturantes e a asparaginase.
A ureia e o cloridrato de guanidina apresentam propriedades diferentes e,
portanto, interagem com proteínas de maneiras distintas. O cloridrato de guanidina é
um sal e sofre ionização em solução aquosa. Em baixas concentrações, os íons de
Gdn+ e Cl- podem neutralizar as cargas de cadeias laterais de aminoácidos
carregadas positiva e negativamente, reduzindo ou eliminando interações
eletrostáticas que possam estabilizar a proteína. As interações eletrostáticas dos
íons de Gdn+ com os resíduos de aminoácidos carregados e com o esqueleto
proteico constituem o fator dominante no mecanismo pelo qual as proteínas são
desestabilizadas pelo cloridrato de guanidina. Em altas concentrações, o cloridrato
de guanidina se torna um agente desnaturante, independente do tipo de interação
eletrostática presente na proteína. A ligação de íons de Gdn+ à proteína predomina e
favorece a reação no sentido do estado desenovelado (MONERA et al., 1994; O’
BRIEN et al., 2007). A forte interação entre os íons de Gnd+ e resíduos carregados
na proteína pode explicar a maior eficiência da desnaturação proteica causada por
cloridrato de guanidina em relação à ureia.
Resultados e Discussão
123
O mecanismo de desnaturação proteica pela ureia ainda não está bem
elucidado. Há duas hipóteses para os possíveis mecanismos responsáveis pelo seu
mecanismo caotrópico: o mecanismo de interação indireta e o de interação direta
com a proteína. O mecanismo de interação indireta sugere que a ureia age
indiretamente na desnaturação proteica pela alteração da estrutura da água, o que
enfraquece a interação hidrofóbica e facilita a exposição de resíduos de aminoácidos
hidrofóbicos do interior proteico, facilitando a solvatação dos mesmos (NOZAK &
TANFORD, 1963). Esse conceito é derivado de experimentos de transferência que
mostraram que hidrocarbonetos são mais solúveis em ureia que em água (FRANK &
FRANKS, 1968). O mecanismo direto sugere que a ureia causa a desnaturação
proteica através de interações diretas com a proteína, no entanto a natureza das
interações e a intensidade das mesmas ainda é um tema em discussão. Alguns
estudos sugerem que, no mecanismo de interação direta, as interações entre
proteína e ureia podem acontecer pela formação de ligações de hidrogênio com o
esqueleto proteico e interações eletrostáticas com resíduos carregados ou polares,
ou através da interação com ambos (TOBI et al., 2003; O’ BRIEN et al., 2007;
STRUMPE & GRUBMULLER, 2007). Outros sugerem ainda a possibilidade de
interações de van der Waals entre a ureia e resíduos proteicos (HUA et al., 2008;
DAS & ZHOU, 2010). Embora muitos estudos recentes (TOBI et al., 2003; O’ BRIEN
et al., 2007; STRUMPE & GRUBMULLER, 2007; HUA et al., 2008; DAS & ZHOU,
2010) indiquem que a interação direta da ureia com a proteína seja responsável pela
desnaturação proteica, alguns estudos sugerem que ambos os mecanismos, direto e
indireto, estão envolvidos na desnaturação proteica causada pela ureia (BENNION &
DAGGETT, 2003; CABALLERO-HERRERA et al., 2005; DAS & MUKHOPADHYAY,
2009).
Outra estratégia para se analisar a estabilidade do tetrâmero de asparaginase
foi a aplicação do aumento pressão da hidrostática associada à fluorescência de
triptofanos. Através dessa técnica, a mudança na fluorescência intrínseca da
asparaginase foi monitorada à medida que a pressão hidrostática era aumentada. A
alta pressão permite perturbar de maneira controlada a estrutura de proteínas, assim
como estudar a dissociação de oligômeros. Esse método apresenta algumas
vantagens sobre outros métodos de perturbação da estrutura proteica, por ser um
método físico, não altera a energia interna do sistema, como no caso da
Resultados e Discussão
124
temperatura, afetando apenas o volume do sistema formado por proteína e solvente.
A pressão não provoca alterações significativas na estrutura secundária e promove
de forma mais significativa mudanças nas estruturas terciária e quaternária de
proteínas. Esse método tem a vantagem de não interferir quimicamente com a
amostra. As mudanças ocorrem pelas modificações de volume do sistema (WEBER
& DRICKAMER, 1983; WEBER, 1986; SILVA & WEBER, 1993).
As interações que mantêm a estrutura tridimensional de proteínas, bem como
a associação de estruturas oligoméricas, compreendem ligações de hidrogênio,
força de van der Waals, interações eletrostáticas e hidrofóbicas. O enovelamento de
proteínas ou a associação de monômeros leva a um aumento de volume devido à
formação de cavidades internas, que excluem o solvente das proximidades das
cadeias laterais de aminoácidos. Tais cavidades são chamadas volumes mortos e o
aumento de pressão leva a um deslocamento do equilíbrio no sentido de espécies
que ocupam menor volume, como proteínas dissociadas, onde as moléculas de
água podem penetrar em tais cavidades rompendo interações e aumentando a
camada de solvatação (SILVA & WEBER, 1993).
Nesses experimentos, a asparaginase foi submetida a pressões de até 3,10
kbar e os espectros de emissão de fluorescência foram registrados em cada uma
das pressões aplicadas. A Figura 4.4.8A mostra os espectros de asparaginase em
tampão (Tris:HCl 10 mM, pH 8,0) à pressão atmosférica, em 3,10 kbar e após a
liberação da pressão. Os espectros de fluorescência obtidos nessas três condições
foram semelhantes, indicando que a pressurização da asparaginase em tampão não
causou a desnaturação do tetrâmero. Os valores de centro de massa obtidos em
tampão (Tris:HCl 10 mM, pH 8,0) em função da pressão não apresentaram variação
significativa, com um deslocamento para o vermelho de apenas 1 nm, na pressão de
3,10 kbar, o que indica que o tetrâmero de asparaginase é bastante estável em
tampão (Figura 4.4.9).
Em algumas proteínas, a pressão hidrostática não causa a desnaturação
completa, devido a uma grande estabilidade ou a uma variação de volume pequena
com a desnaturação. Portanto, é necessário combinar a pressão a outros agentes
desnaturantes físicos, como a temperatura (alta ou baixa), ou químicos, como ureia
ou cloridrato de guanidina, a fim de se provocar uma desnaturação completa da
proteína (SILVA & WEBER, 1993).
Resultados e Discussão
125
A fim de provocar uma desestabilização do tetrâmero de asparaginase foram
empregadas concentrações subdesnaturantes de ureia (3,25, 3,5 e 3,75 M), como
mostrado na Figura 4.4.8. Nas concentrações de 3,25 M e 3,5 M, a fração
desnaturada de asparaginase era correspondente a 0,029 e a 0,045,
respectivamente. Nessas condições, o deslocamento do centro de massa não foi
significativo, sendo de 1 nm em 3,25 M e de 2 nm em 3,5 M de ureia, após a
pressurização da asparaginase à 3,10 kbar. Esse comportamento foi o mesmo
observado em tampão, sugerindo que o tetrâmero não está desnaturando. Na
concentração de 3,75 M de ureia, na qual a fração desnaturada corresponde a 0,12,
o deslocamento do centro de massa do espectro de fluorescência para o vermelho
foi de 5 nm, à pressão de 3,10 kbar. Os espectros de fluorescência para essa
concentração de ureia (Figura 4.4.8B) obtidos antes da pressurização, a uma
pressão de 3,10 kbar ou após o retorno à pressão atmosférica também foram
semelhantes, sendo apenas o espectro à pressão de 3,10 kbar um pouco mais
alargado. Ou seja, mesmo em concentrações nas quais se observou uma
desestabilização estrutural da proteína (indicada pela fração desnaturada), a
variação no centro de massa espectral foi muito pequena, mostrando que não houve
modificação significativa no ambiente dos triptofanos.
Em todas as condições, após o retorno à pressão atmosférica, o centro de
massa espectral retornou aos valores iniciais, indicando que o processo foi
reversível. No entanto, como nas condições estudadas a asparaginase não foi
completamente dissociada, não foi possível calcular os parâmetros para a
dissociação do tetrâmero, como a variação de volume (ΔV) e a constante de
equilíbrio (KD) para a dissociação induzida por pressão. Considerando que os
triptofanos estão localizados nas interfaces de interação das subunidades (Figura
1.4), os dados obtidos por pressão são indicativos de que não houve dissociação
das subunidades nas condições em que a pressão hidrostática foi utilizada, mesmo
na presença de ureia.
Resultados e Discussão
126
Figura 4.4.8: Espectros de fluorescência da asparaginase em função da pressão hidrostática na presença e na ausência de ureia. Os espectros da asparaginase (2 µM, em tetrâmeros) foram obtidos em tampão Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 (A) e na presença de ureia 3,75 M (B). Em cada uma das condições, foram obtidos o espectro da amostra não pressurizada (▬), da amostra a uma pressão de 3,10 kbar (▬) e da amostra após o retorno à pressão atmosférica (▬).
300 320 340 360 380 400 420
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
300 320 340 360 380 400 420
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
B
Inte
nsid
ade d
e F
luore
scência
(u.a
.)
Comprimento de Onda (nm)
Resultados e Discussão
127
Figura 4.4.9: Efeito do aumento da pressão hidrostática sobre a estabilidade da asparaginase. Variação do centro de massa espectral em função da pressão. Os experimentos foram obtidos em
tampão Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 (), e na presença de ureia 3,25 M (▄), 3,5 M (▼) e 3,75 M (♦). O
centro de massa foi calculado após o à pressão atmosférica a fim de verificar a reversibilidade em
cada uma das condições: Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 (), ureia 3,25 M (), 3,5 M () e 3,75 M ().
4.4.2 Efeito de agentes desnaturantes nos parâmetros termodinâmicos de
desnaturação térmica da asparaginase
Os parâmetros termodinâmicos para a desnaturação térmica da asparaginase
na presença de agentes desnaturantes foram calculados através de DSC.
Concentrações subdesnaturantes de ureia (0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0 M) e de
cloridrato de guanidina (0,2; 0,4 e 0,6 M) foram empregadas e causaram uma
desestabilização da proteína. A concentração de asparaginase empregada nos
experimentos de DSC está expressa em concentração de monômeros e os valores
de ΔHcal e ΔCp foram expressos em função dessa concentração.
Ambos os agentes químicos causaram redução tanto em Tm quanto em ΔHcal.
Os termogramas obtidos em concentrações subdesnaturantes de ureia estão
mostrados na Figura 4.4.10. Ao contrário do que foi observado em tampão, as
transições não foram reversíveis na presença de ureia. A variação de Tm e ΔHcal foi
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0300
310
320
330
340
350
Ce
ntr
o d
e M
assa
Esp
ectr
al (n
m)
Pressão (kbar)
Resultados e Discussão
128
praticamente linear em relação à concentração de ureia, como mostrado na Figura
4.4.11. Há uma diminuição de cerca de 2 °C para a Tm e 17 kcal/mol para ΔHcal para
cada adição de 0,5 M de ureia.
Figura 4.4.10: Termogramas de asparaginase em concentrações subdesnaturantes de ureia. Os termogramas da asparaginase (8 µM, em preto) foram obtidos em Tris:HCl 10 mM, pH 8,0 e com 0,5 M (▬); 1,0 M (▬); 1,5 M (▬); 2,0 M (▬); 2,5 M (▬) ou 3,0 M (▬) de ureia. A velocidade de varredura foi 1 °C/min.
40 45 50 55 60 65 70
0
10
20
30
40
50
60
70
Temperatura (oC)
Cp
(kca
l/m
ol/
oC
)
Resultados e Discussão
129
Figura 4.4.11: Variação dos valores de Tm e ΔHcal
em função da concentração de ureia. Os
valores de Tm () e de ΔHcal
(○) foram calculados a partir dos termogramas obtidos por DSC.
Os termogramas da asparaginase nas concentrações subdesnaturantes de
cloridrato de guanidina estão mostrados na Figura 4.4.12. A transição térmica não foi
reversível, assim como o observado com ureia. A variação dos valores de Tm e de
ΔHcal foi praticamente linear em função da concentração do cloridrato de guanidina.
Nesse caso, Tm diminuiu 4 °C e ΔHcal aproximadamente 30 kcal/mol a cada aumento
de 0,2 M na concentração de cloridrato de guanidina. Em relação à ureia, o
cloridrato de guanidina foi mais eficaz em causar a desestabilização da
asparaginase, pois em menores concentrações foi capaz de causar uma maior
redução nos valores de Tm e de ΔHcal. A partir das variações em Tm e ΔHcal,
provocadas por diferentes concentrações de ureia ou de cloridrato de guanidina, foi
obtida a variação da capacidade calorífica do sistema (ΔCp), como mostrado na
Figura 4.4.14.
O valor de ΔCp obtido a partir dos experimentos DSC com concentrações
subdesnaturantes dos agentes desnaturantes foi de 9,15 ± 1,30 kcal·mol-1·°C-1,
semelhante ao valor obtido através dos experimentos de desnaturação térmica
(seção 4.2) que foi de 10,81 ± 0,4 kcal·mol-1·°C-1.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
100
120
140
160
180
200
50
52
54
56
58
60
62
H
cal (
kcal/m
ol)
[Ureia] (M)
Tm
( oC
)
Resultados e Discussão
130
Figura 4.4.12: Termogramas de asparaginase em concentrações subdesnaturantes de cloridrato de guanidina. Os termogramas da asparaginase (8 µM, em monômeros) foram obtidos em Tris:HCl, 10 mM pH 8,0 (▬) e com adições de 0,2 M (▬); 0,4 M (▬) e 0,6 M (▬) de cloridrato de guanidina. A velocidade de varredura foi 1 °C/min.
Figura 4.4.13: Variação dos valores de Tm e ΔH
cal em função da concentração de cloridrato de
guanidina. Os valores de Tm () e de ΔHcal
(○) foram calculados a partir dos termogramas obtidos por
DSC.
40 45 50 55 60 65 70
0
10
20
30
40
50
60
70
Cp
(kca
l/m
ol/
oC
)
Temperatura (oC)
0,2 0,3 0,4 0,5 0,680
120
160
200
45
50
55
60
H
cal (
kcal/m
ol)
[Gu.HCl] (M)
Tm
(°C)
Resultados e Discussão
131
Figura 4.4.14: Variação de ΔH
cal em função da Tm para a asparaginase na presença de
diferentes concentrações de ureia e cloridrato de guanidina. A capacidade calorífica é dada pelo coeficiente angular obtido através do ajuste dos dados experimentais a uma reta. A equação da reta y= -357,12 + 9,15·x. O valor de r obtido foi de 0,99. Os valores de ∆H
cal estão expressos em função
da concentração de monômeros de asparaginase.
Os valores de ΔCp calculados para a asparaginase estão entre os valores
mais altos medidos para uma proteína multimérica. Para a proteína dimérica CsdB
(proteína controladora da divisão celular ou morte celular tipo B), uma toxina que
atua como inibidor da DNA girase de Escherichia coli, o valor de ΔCp encontrado foi
de 2,8 ± 0,2 kcal·mol-1 ·K-1 (BAJAJ et al., 2004). Outra proteína dimérica, a miosina
II de Acanthamoeba, apresentou ΔCp de aproximadamente 10 kcal·mol-1·K-1
(ZOLKIEWSKY et al., 1997). Para a glutamina sintase, uma proteína dodecamérica,
foram encontrados valores de ΔCp entre 3,9 ± 1,7 e 11,4 ± 0,9 kcal·mol-1 ·K-1,
dependendo da condição estudada (GINSBURG & ZOLKIEWSKY, 1991).
Os dados estruturais e termodinâmicos obtidos indicam que a asparaginase é
um tetrâmero estável e bem enovelado. Além disso, os dados sugerem que a
desnaturação da asparaginase acontece sem a participação de intermediários
estáveis, ou seja, o tetrâmero enovelado é convertido em monômeros
desenovelados.
50 52 54 56 58 6080
100
120
140
160
180
200
H
cal (
kca
l/m
ol)
Tm (
oC)
Conclusões
132
5 CONCLUSÕES
Neste trabalho, estudamos as propriedades cinéticas e conformacionais da
asparaginase do tipo II de Escherichia coli. Estruturalmente, a asparaginase é um
homotetrâmero composto de subunidades idênticas de 34 kDa, denominadas A, B,
C e D. As interações entre as subunidades A e C e entre B e D, respectivamente,
formam dois pares de subunidades, sendo o tetrâmero descrito como um dímero de
dímeros (SWAIN et al., 1993).
A asparaginase é uma enzima de grande valor terapêutico, pois é um agente
importante no tratamento de leucemia linfoblástica aguda (LLA), tipo de câncer que
acomete principalmente crianças e jovens. A asparaginase catalisa a hidrólise da
asparagina em ácido aspártico e amônia. A asparagina é um aminoácido não
essencial para as células normais, que são capazes de sintetizá-las pela
transaminação do ácido aspártico, através da asparagina sintase. No entanto, as
células leucêmicas são incapazes de fazer a síntese de asparagina, por isso
dependem da asparagina circulante no plasma. O mecanismo de ação da
asparaginase consiste em diminuir a concentração de asparagina circulante no soro,
matando seletivamente as células leucêmicas, que ficam com o metabolismo
comprometido. Um dos grandes problemas da terapia com a asparaginase é que,
geralmente, ela é acompanhada de sérios efeitos colaterais e de reações alérgicas
que podem causar a inativação da enzima, prejudicando o tratamento. Outra
questão é que a asparaginase apresenta baixa estabilidade plasmática, o que faz
com que tenha que ser administrada com menores intervalos entre as doses, o que
pode contribuir para a sensibilização. Devido à importância da asparaginase para o
tratamento de LLA, tem-se desenvolvido muitos estudos com a finalidade de se
encontrar formas de melhorar a formulação. Dessa forma, é importante que se faça
uma caracterização proteica completa, abrangendo as propriedades cinéticas,
estruturais e também a estabilidade do tetrâmero em diferentes condições. Neste
trabalho, a estabilidade proteica foi estudada por fluorescência intrínseca de
triptofanos, dicroísmo circular (CD), pressão hidrostática, calorimetria diferencial de
varredura (DSC), espectroscopia de absorção em UV e microscopia. A atividade
enzimática foi estudada através de calorimetria de titulação isotérmica (ITC).
Os estudos de DSC mostraram que o pico de transição da asparaginase é
assimétrico, e a desnaturação térmica da proteína é bastante cooperativa, sendo
Conclusões
133
reversível entre pH 7,5 e pH 9,5. Os melhores valores de reversibilidade foram
obtidos entre pH 8,0 e pH 9,0, para os quais se observou até 95% de reversibilidade.
Os estudos de CD e fluorescência intrínseca de triptofanos indicaram a
ausência de intermediários estáveis durante a desnaturação térmica da
asparaginase. Além disso, a perda das estruturas secundária e terciária da
asparaginase aconteceu de forma concomitante, indicando que este é um processo
cooperativo.
Para proteínas oligoméricas, um teste para se detectar a presença de
intermediários de dissociação do oligômero é fazer os experimentos de DSC em
diferentes concentrações. No caso da asparaginase, o aumento de concentração
não causou modificação significativa em Tm e ΔHcal, indicando que a transição ocorre
sem a presença de monômeros estáveis. No entanto, Tm mostrou dependência da
velocidade de varredura, indicando que o processo é pelo menos, em parte,
cineticamente controlado. É possível que a dissociação leve à formação de espécies
muito instáveis (dímeros ou monômeros) que logo desenovelam e, portanto, não
puderam ser detectadas.
A asparaginase apresentou máxima de pH 5,5 a pH 9,0. O estudo da
estabilidade conformacional da asparaginase (DSC) mostrou que a proteína foi
estável em uma ampla faixa de pH e que, mesmo em valores em que a atividade
enzimática foi baixa, a enzima ainda apresentou o pico de transição térmica. A
estrutura secundária não mudou de pH de 3,0 a 12,0. A análise da estrutura terciária
por fluorescência e espectroscopia em UV mostrou que a asparaginase só se
apresentou completamente desnaturada em pH 13,0. A análise do efeito do pH
sobre a intensidade de fluorescência da asparaginase permitiu a identificação dos
resíduos próximos ao triptofano, Asp63, Arg303 e His87, que sofrem protonação ou
desprotonação em função do pH.
Estudos da estabilidade do tetrâmero foram feitos através de experimentos de
desnaturação por ureia ou por cloridrato de guanidina. Em pH 8,0, o equilíbrio de
desnaturação por ureia e por cloridrato de guanidina foi reversível e a transição pôde
ser descrita por um modelo de desnaturação entre dois-estados. As curvas de
transição obtidas por fluorescência e CD puderam ser sobrepostas, indicando a
ausência de intermediários estáveis na transição. O aumento da concentração de
asparaginase não causou mudança significativa nesses parâmetros. Os valores de
Conclusões
134
CmU calculados por ambas as técnicas para a desnaturação da asparaginase por
cada um dos agentes foram semelhantes, assim como os valores de ΔG°W.
O aumento de pressão hidrostática foi utilizado para se tentar dissociar o
tetrâmero. Os valores de centro de massa obtidos em tampão em função do
aumento da pressão não apresentaram variação significativa, com um deslocamento
para o vermelho de apenas 1 nm, na pressão de 3,10 kbar, o que indica que o
tetrâmero de asparaginase é bastante estável em tampão. Foram feitos, então,
experimentos em concentrações subdesnaturantes de ureia. A associação da
pressão a concentrações subdesnaturantes de ureia causou um deslocamento do
espectro de fluorescência de apenas 5 nm para o vermelho, na presença de 3,75 M
de ureia (fD = 0,12). Ou seja, mesmo em concentrações nas quais se observou uma
desestabilização estrutural da proteína (indicada pela fração de proteína
desnaturada), a variação no centro de massa espectral foi muito pequena,
mostrando que não houve modificação significativa no ambiente dos triptofanos.
Os dados termodinâmicos sugerem que a asparaginase é um tetrâmero
estável, bem enovelado e altamente empacotado, e que o tetrâmero enovelado é
convertido diretamente em monômeros desenovelados sem formação de
intermediários estáveis de desnaturação. A compreensão das características
básicas da asparaginase é importante para contribuir no desenvolvimento de novas
formulações desse medicamento, tendo em vista que a asparaginase é de grande
relevância para o tratamento da LLA.
Referências Bibliográficas
135
REFERÊNCIAS BIBILIOGRÁFICAS AGUIAR, J.; CARPENA, P.; MOLINA-BOLÍVAR, J. A.; RUIZ, R. C. On the determination of the critical micelle concentration by the pyrene 1:3 ratio method. Journal of Colloid and Interface Science 258, 116-122, 2003 ALVAREZ, O. A. & ZIMMERMAN, G. Pegaspargase-induced pancreatis. Med. Pediatr. Oncol. 34, 200-205, 2000 ANJUM, F.; RISHI, V.; AHMAD, F. Compatibility of osmolytes with Gibbs energy of stabilization of proteins. Biochim. Biophys. Acta 1476, 75-84, 2000 AUNG, H.P.; BOCOLA, M.; SCHLEPER, S.; ROHM, K.H. Dynamics of a mobile loop at the active site of Escherichia coli asparaginase. Biochim. Biophys. Acta 1481,349-59, 2000 AVRAMIS, V. I. & PANOSYAN, E. H. Pharmacokinetic/pharmacodynamics relationships of asparaginase formulations: the past, the present and recommendations for the future. Clin. Pharmacokinet. 44, 367-93, 2005 BACKMANN, J.; SCHAFER, G.; WYNS, L.; BONISCH, H. Thermodynamics and kinetics of unfolding of the thermostable trimeric adenylate kinase from the archaeon Sulfolobus acidocaldarius. J. Mol. Biol. 284, 817-83, 1998 BAJAJ, K.; CHAKSHUSMATHI, G.; BACHHAWAT-SIKDER, K.; SUROLIA, A.; VARADARAJAN, R. Thermodynamic characterization of monomeric and dimeric forms of CcdB (controller of cell division or death B protein). Biochem. J. 380, 409-417, 2004 BARAN, E.T.; OZER, N.; HASIRCI, V. In vivo half-life of nanoencapsulated L- asparaginase. J. Mater. Sci. Mater. Med. 13, 1113-1121, 2002a BARAN, E.T.; OZER, N.; HASIRCI, V. Poly (hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) nanocapsules as enzyme carriers for cancer therapy: an in vitro study. Journal of Microencapsulation 19, 363-376, 2002b BAYOL, A., DUPIN, P.; BOE, J. F.; CLAUDY, P.; LETOFF, J. M. Study of pH and temperature-induced transitions in urate oxidase (Uox-EC1.7.3.3) by microcalorimetry (DSC), size exclusion chromatography (SEC) and enzymatic activity experiments. Biophys. Chem. 54, 229-235, 1995
Referências Bibliográficas
136
BENNION, B. J. & DAGGETT, V. The molecular basis for the chemical denaturation of proteins by urea. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5142-5147, 2003 BIANCONI, M. L. Titration Calorimetry as a tool to determine thermodynamic and kinetic parameters of enzymes. In LADBURY, J. E. & DOYLE, M. L (Eds) Biocalorimetry 2: Applications of Calorimetry in the Biological Sciences. Willey, 2004. p. 175-184 BISWAS, S. & KAYASTHA, A. M. Unfolding and refolding of leucoagglutinin (PHA-L), on an oligomeric lectin from kidney beans (Phaseolus vulgaris). Biochim. Biophys. Acta (General Subjects) 1674, 40-44, 2004 BISWAS, S. &. KAYASTHA, A. M. Thermal stability of Phaseolus vulgaris leucoagglutinin: a differential scanning calorimetry study. J. Biochem. Mol. Biol. 35, 472-475, 2002 BORKOTAKY, B & BEZBARUAI, R. L. Production and properties of asparaginase from a new Erwinia sp. Folia Microbiol. 47, 473-476, 2002 BOUDKER, O.; TODD, M. J.; FREIRE, E. The structural stability of the co chaperonin GroES. J. Mol. Biol. 272, 770-779, 1997 BROOME, J.D. Evidence that L-asparaginase from pig serum is responsible for its antilymphoma effects. I. Properties of the L-asparginase of guinea pig serum in relation to those of the antilymphoma substance. J. Exp. Med. 118, 99-120, 1963a BROOME, J.D. Evidence that L-asparaginase from pig serum is responsible for its antilymphoma effects. II. Lymphoma cells cultured in a medium devoid of L-asparaginase lose their susceptibility of guinea pig serum in vivo. J. Exp. Med. 118 121- 148, 1963b BROOME, J.D. Evidence that the L-asparaginase activity of guinea pig serum is responsible for its antilymphoma effects. Nature 191, 1114-1115, 1961 BURG, M. B. & FERRARIS, J. D. Intracellular organic osmolytes: function and regulation. J. Biol. Chem. 283, 7309-7313, 2008 CABALLERO-HERRERA, A.; NORDSTRAND, K.; BERNDT, K. D.; NILSSON, L. Effect of urea on peptide conformation in water: molecular dynamics and experimental characterization. Biophys. J. 89, 842-857, 2005
Referências Bibliográficas
137
CALDERÓN DE LA BARCA, A. M.; JARA-MARINI, M. E.; VÁZQUEZ-MORENO, L. Haptenic Carbohydrates affect the thermal denaturation of soybean lectin. J. Food Biochem. 17, 295-302, 2007 CAPPELLETTI, D.; CHIARELLI, L. R.; PASQUETTO, M. V.; STIVALA, S.; VALENTINI, G.; SCOTTI, C. Helicobacter pylori L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 1222-1226, 2008 CHAKRABARTI, R. & SCHUSTER, S.M. L-asparaginase: perspectives on the mechanisms of action and resistance. Int. J. Pediatric Hematol. Oncol. 4, 597-61, 1997 CHEBOTAREVA, N. A., KURGANOV, B. I.; LIVANOVA, N. B. Biochemical effects of molecular crowding. Biochemistry (Moscow) 69, 1239-1251, 2004 CHOI, S. M. & MA, C. Y. Conformational study of globulin from common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) by fourier transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry. J. Agric. Food Chem. 53, 8046-8053, 2005 CONESA, C.; SANCHEZ, L.; PEREZ, M. D.; CALVO, M. A Calorimetric study of thermal denaturation of recombinant human lactoferrin from rice. J. Agric. Food Chem. 55, 4848-4853, 2007 COONEY, D. A.; HANDSCHUMACHER, R. E. L-asparaginase and L-asparagine metabolism. Annu. Rev. Pharmacol. 1, 421-440, 1970 COUVREUR, P.; GREF, R.; ANDRIEUX, K.; MALVY, C. Nanotechnologies for drug delivery: application to cancer and autoimmune diseases. Progress in Solid State Chemistry 34, 231-235, 2006 CRUZ, M.E.M.; GASPAR, M. M.; LOPES, F.; JORGE, J. S.; PEREZ-SOLER, R. Liposomal L-asparaginase: in vitro evaluation. International Journal of Pharmaceutics 96, 67-77, 1993 D’ANDREA, M. G.; DOMINGUES, C. C.; MALHEIROS, S. V. P.; NETO, F. G.; BARBOSA, L. R. S.; ITRI, R.; ALMEIDA, F. C. L.; DE PAULA, E.; BIANCONI, M. L. Thermodynamic and structural characterization of zwitterionic micelles of the membrane protein solubilizing amidosulfobetaine surfactants ASB-14 and ASB-16. Langmuir 27, 8248-8256, 2011
Referências Bibliográficas
138
DAS, A. & MUKHOPADHYAY, C. Urea-mediated protein denaturation: a consensus view. J. Phys. Chem. B 113, 12816-12824, 2009 DAS, P & ZHOU, R. Urea-induced drying of carbon nanotubes suggests existence of a dry globule-like transient state during chemical denaturation of proteins. J. Phys. Chem. B 114, 5427-5430, 2011 D'AURIA, S.; ROSSI, M.; BARONE, G.; CATANZANO, F.; DEL VECCHIO, P.; GRAZIANO, G.; NUCCI, R. Temperature-Induced Denaturation of ß-Glycosidase from the Archaeon Sulfolobus solfataricus. J. Biochem. 120, 292-300, 1996 DERST, C.; HENSELING, J.; ROHM, K.H. Engineering the substrate specificity of Escherichia coli asparaginase. II. Selective reduction of glutaminase activity by amino acid replacements at position 248. Protein Sci. 9, 2009-2017, 2000 DERST, C.; WEHNER, A.; SPECHT, V.; ROHM, K. H. States and functions of tyrosine residues in Escherichia coli asparaginase II. Eur. J. Biochem. 224, 533-540, 1992 DOMINGUES, C. C.; MALHEIROS, S. V. P.; DE PAULA, E. Solubilization of human erythrocyte membranes by ASB detergentes. Braz. J. Med. Biol. Res. 41, 758-764, 2008 DUNLOP, P. C.; MEYER, G. M.; BAN, D.; ROON, R. J. Characterization of two forms of asparaginase in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 253, 1297-1304, 1978 DUNLOP, P. C.; MEYER, G. M.; ROON, R. J. Reactions of asparaginase I1 of Saccharomyces cerevisiae: a mechanistic analysis of hydrolysis and hydroxylaminolysis. J. Biol. Chem. 255, 1542-1546, 1980 DUVAL, M.; OTTEN, J.; PHILIPPE, N. Comparison of Escherichia coli asparaginase with Erwinia asparaginase in the treatment of childhood lymphoid malignancies: results of a randomized European Organisation for Research and Treatment of Cancer-Children’s Leukemia Group phase 3 trial. Blood 99, 2734-2739, 2002 EL-BESSOUMY, A. A.; SARHAN, M.; MANSOUR, J. Production, isolation, and Purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation. J. Biochem. Mol. Biol. 37, 387-393, 2004
Referências Bibliográficas
139
EPAND, R. F.; EPAND, R. M.; JUNG, C. Y. Ligand-modulation of the stability of the glucose transporter GLUT 1. Protein Science 10, 1363-1369, 2001 FERREIRA, A. A. P. & YAMANAKA, H. Microscopia de Força atômica aplicada em imunoensaios. Quim. Nova 29, 137-142, 2006 FRANK , H. S. & FRANKS, F. Structural approach to the solvent power of water for hydrocarbons: urea as a structure breaker. J. Chem. Phys. 48, 4746-4758, 1968 FREIRE, E. Statistical thermodynamic analysis of the heat capacity function associated with protein folding unfolding transitions. Comments Mol. Cell. Biophys. 6, 123-140, 1989 FUKADA, H.; STURTEVANT, J.M.; QUIOCHO, F.A. Thermodynamics of the binding of L-arabinose and of D-galactose to the L-arabinose-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 258, 13193-13198, 1983 GACZYNSKA, M. & OSMULSKI, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn? Current Opinion in Colloid & Interface Sci. 13, 351-367, 2008 GARIDEL, P.; HILDEBRAND, A.; NEUBERT, R.; BLUME, A. Thermodynamic Characterization of Bile Salt Aggregation as a Function of Temperature and Ionic Strength Using Isothermal Titration Calorimetry. Langmuir 16, 5267-5275, 2000 GASPAR, M. M.; PEREZ-SOLER, R.; CRUZ, M. E. M. Biological characterization of L-asparaginase liposomal formulations. Cancer Chemother. Pharmacol. 38, 373-377, 1996 GIARTOSIO, A.; ERENT, M.; CERVONI, L.; MORERA, S.; JANIN, J.; KONRAD,M.; LASCU, I. Thermal stability of hexameric and tetrameric nucleoside diphosphate kinases: effect of subunit interaction. J. Biol. Chem. 271, 17845-17851, 1996 GINSBURG, A. & ZOLKIEWSKY, M. Differential scanning calorimetry study of reversible, partial unfolding transitions in dodecameric glutamine synthetase from Escherichia coli. Biochemistry 30, 9421-9429, 1991 GINSBURG, A. Reversible, thermally induced domain unfolding in oligomeric proteins: Spectral and DSC measurements. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry 61, 425-436, 2000
Referências Bibliográficas
140
GRASSO, D.; LA ROSA, C.; MILARDI, D.; FASONE, S. The effects of scan rate and protein concentration on DSC thermograms of bovine superoxide dismutase. Thermochimica Acta 265, 163-175, 1995 GRAZIANO, G.; CATANZANO, F.; RICCIO, A.; BARONE, G. A reassessment of the molecular origin of cold denaturation. J. Biochem. 122, 395-40, 1997 GRINBERG, V. Y.; BUROVA, T. V.; HAERTLE, T.; TOLSTOGUZOV, V. B. Interpretation of DSC data on protein denaturation complicated by kinetic and irreversible effects. Journal of Biotechnology 79, 269-280, 2000 HASKELL , C. M. L-asparaginase: human toxicology and single agent activity in nonleukemic neoplasms. Cancer Treat. Rep. 65, 57-59, 1981 HO, P. P. K.; MILIKIN, E. B.; BOBBIT, J. L.; GRINNAN, E. L.; BURCK, P. J.; FRANK, B. H.; BOERCK, D.; SQUIRES, R. W. Chrystalline L-asparginase from E. coli B. I Purification and chemical characterization. J. Biol. Chem. 245, 3708-3715, 1970 HUA, L.; ZHOUA, R.; THIRUMALAL, D.; BERNE, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 16928-16933, 2008 JHA, B. K.; MITRA,N.; RANA, R.; SUROLIA, A.; SALUNKE, D. M.; DATTA, K. pH and cation-induced thermodynamic stability of human hyaluronan binding protein 1 regulates its hyaluronan affinity. J. Biol. Chem. 279, 23061-23072, 2004 JOHNSON, C. R.; MORIN, P. E.; ARROWSMITH, C. H.; FREIRE, E. Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor. Biochemistry 34, 5309-5316, 1995 JOHNSON, M. V.; COOPER, A.; STOCKLEY, P. G. Differential scanning calorimetry of thermal unfolding of the methionine repressor protein (MetJ) from Escherichia coli. Biochemistry 31, 9717-9724, 1992 JONER, P.E. Purification and Properties of L-Asparaginase B from Acynetobacter colcoaceticus. Biochim. Biophys. Acta 438, 287-295, 1976 JORGE, J. C.; PEREZ-SOLER, R.; MORAIS, J. G.; CRUZ, M. E. Liposomal palmitoyl-L-asparaginase: characterization and biological activity. Cancer Chemother. Pharmacol. 34, 230-234, 1994
Referências Bibliográficas
141
KAFKEWITZ, D. & GOODMAN, D. L-asparaginase production by rumen anaerobe Vibrio succinogenes. Appl. Microbiol. 27, 206-209, 1971 KELLY, S. M.; JESS, T. J.; PRICE, N.C. How to study proteins by circular dichroism. Biochim. Biophys. Acta 1751, 119-139, 2005 KELLY, S. M. & PRICE, N.C. The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding. Biochim. Biophys. Acta 1338, 161-185, 1997 KELO, E.; NORONKOSKI, T.; STOINEVA, I. B.; PETKOV, D. D.; MONONEN, I. L-Aspartylpeptides as substrates of L-asparaginases from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi. FEBS Letters 528, 130-132, 2002 KIDD, J. G., J. Regression of transplanted lymphomas induced in vivo by means of normal guinea pig serum. I. Course of the of transplanted cancers of various kinds in mice and rats given guinea pig serum, horse serum, or rabbit serum. J. Exp. Med. 98, 565-582, 1953a KIDD, J. G., J. Regression of transplanted lymphomas induced in vivo by means of normal guinea pig serum. II. Studies on the nature of the active serum constituent: histologycal mechanism of the regression: test for the effects of guinea pig serum on lymphoma cells in vitro: discussion. J. Exp. Med. 98, 583-612, 1953b KOTZIA, G. A. & LABROU, N. E. Cloning, expression and characterisation of Erwinia carotovora L-asparaginase. J. Biotechnol. 119, 309–323, 2005 KRESHECK, G. C. Isothermal Titration Calorimetry Studies of Neutral Salt Effects on the Thermodynamics of Micelle Formation J. Phys. Chem. B 113, 6732-6735, 2009 KUMAR, S.; DASU ,V. V.; PAKSHIRAJAN, K. Purification and characterization of glutaminase-free L-asparaginase from Pectobacterium carotovorum MTCC 1428. Bioresource Technology 102, 2077-2082, 2011 LADBURY, J. E. & CHOWDHRY, B. Z. (Eds) Biocalorimetry 2 (Applications of calorimetry in the biological sciences) (Willey). LADBURY, J. E. Application of isothermal titration calorimetry in the biological sciences: things are heating up! BioTechniques 37, 885-887, 2004
Referências Bibliográficas
142
LAW, A.S. & WRISTON, J.C. Purification and Properties of Bacillus coagulans L-Asparaginase. Arch. Biochem. Biophys. 147, 744-752, 1971 LEE, S. M.; ROSS, J. T.; GUSTAFSON, M. E.; WROBLE, M. H.; MUSCHIK, G. M. Large scale recovery and purification of L-asparaginase from E. carotovora. Appl. Biochem. Biotechnol. 12, 229-247, 1986 LEVITT, M. & CHOTHIA, C. Structural patterns in globular proteins. Nature 261, 552-557, 1976 LI-CHAN, E. C. Y. & MA, C. Y. Thermal analysis of flaxseed (Linum usitatissimum) proteins by differential scanning calorimetry. Food Chemistry 77, 495-502, 2002 LUMRY, R. & RAJENDER, S. Enthalpy-entropy compensation phenomena in water solutions of proteins and small molecules: A ubiquitous properly of water. Biopolymers 9, 1125-1227, 1970 MAJHI, P. R. & BLUME, A. Thermodynamic Characterization of Temperature-Induced Micellization and Demicellization of Detergents Studied by Differential Scanning Calorimetry. Langmuir 17, 3844-3851, 2001 MALOLETKINA , O. I.; MARKOSSIAN, K. I.; BELOUSOVA, L. V.; KLEIMENOV, S Y.; ORLOV, V. N.; MAKEEVA, V. F.; KURGANOV, B. I. Thermal stability and aggregation of creatine kinase from rabbit skeletal muscle. Effect of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Biophys. Chem. 148, 121-130, 2010 MANLY, S. P.; MATTHEWS, K. S.; STURTEVANT, J. M. Thermal denaturation of the core protein of lac repressor. Biochemistry 24, 3842-3846, 1985 MANUAL MERCK. Distúrbios do sangue – Leucemias (http://www.msdbrazil.com/msdbrazil/patients/manual_Merck/mm_sec14_157.html). MARTEL, P.; BAPTISTA, A.; PETERSEN, S. B. Protein Electrostatics. Biotechnology Annual Review 2, 315–372, 1996 MASETTI, R. & PESSION, A. First-line treatment of acute lymphoblastic leukemia with pegasparaginase. Biologics: Targets & Therapy 3, 359–368, 2009
Referências Bibliográficas
143
MASHBURN, L. T. & WRISTON, J. C. Tumor Inhibitory effect of L-asparaginase from Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys. 105, 451-52, 1964 MASHBURN, L.T. & WRISTON, J. C. Tumor inhibitory effect of L-asparaginase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 50-55, 1963 MATA, L.; SANCHEZ, L.; HEADON, D. R.; CALVO, M. Thermal denaturation of human lactoferrin and its effect on the ability to bind iron. J. Agric. Food Chem. 46, 3964-3970, 1998 MCMULLEN, T.W.P.; LI, J.; SHEFFIELD, P. J.; AOKI, J.; MATRIN, T. W.; ARAI, H.; INOUE, K.; DEREWENDA, Z. S. The functional implications of the dimerization of the catalytic subunits of the mammalian brain platelet activating fator acetylhydroalse. Protein Engineering 13, 865-871, 2000 MEHRIAN, T.; DE KEIZER, A.; KORTEWEG, A. J.; LYKLEMA, J. Thermodynamics of micellization of n-alkylpyridinium chlorides. Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Asp. 71, 255-267, 1993 MELO, E. P.; AIRES-BARROS, M. R.; COSTA, S. M. B.; CABRAL, J. M. S. Thermal unfolding of proteins at high pH range studied by UV absorbance. J. Biochem. Biophys. Methods 34, 45–59, 1997 MENGER, F. M. & DOLL, D. W. On the structure of micelles. J. Am. Chem. Soc. 106, 1109-1113, 1984 MESAS, J. M.; GIL, J. A.; MARTIN, J. F. Characterization and partial purification of L-asparaginase from Corynebacterium glutamicum. Gen. Microbiol. 136, 515-519, 1990 MICHNIK, A. Thermal stability of bovine serum albumine: DSC study. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry 71, 509-519, 2003 MICROCAL. VP-DSC Microcalorimeter User’s Manual (MAU120030 Rev B), p.132 MONERA, O. D.; KAY, C. M.; HODGES, R. S. Protein denaturation with guanidine hydrochloride or urea provides a different estimate of stability depending on the contributions of electrostatic interactions. Protein Science 3, 1984-1991, 1994
Referências Bibliográficas
144
MULLER, H.J. & BOSS, J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 282, 97-113, 1998 NOZAKI, Y. & TANFORD, C. The solubility of amino acids and related compounds in aqueous urea solutions. J. Biol. Chem. 238, 4074-4081, 1963 NUSSELDER, J. J. H.; ENGBERTS, J. B. F. N. Toward a Better Understanding of the Driving Force for Micelle Formation and Micellar Growth. J. Colloid Interface Sci 148, 353-361, 1992
O’ BRIEN, E. P.; DIMA, R. I.; BROOKS, B.; THIRUMALAI, D. Interactions between hydrophobic and ionic solutes in aqueous guanidinium chloride and urea solutions: lessons for protein denaturation mechanism. J. Am. Chem. Soc. 129, 7346-7353, 2007 OLLENSCHLÄGER, G.; ROTH, E.; LINKESCH, W.; JANSEN, S.; SIMMEL, A.; MÖDDER, B. Asparaginase-induced derangements of glutamine metabolism: The pathogeneticbasis for some drug-related side-effects. Eur J Clin Invest 18, 512–516, 1988 OZA, V. P.; TRIVEDI, S. D.; PARMAR, P. P.; SUBRAMANIAN, R. B. Withania somnifera (Ashwagandha): a novel source of L-asparaginase. Journal of Integrative Plant Biology 51, 201–206, 2009 PALM, G. J.; LUBKOWSKI, J.; DERST, C.; SCHLEPER, S.; ROHM, K. H.; WLODAWER, A. A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: crystal structure of a Thr-89-Val mutant. FEBS Lett. 390, 211-6, 1996 PANSE, V. G.; SWAMINATHAN, C. P.; ALOOR, J. J.; SUROLIA, A.; VARADARAJAN, R. Unfolding Thermodynamics of the Tetrameric Chaperone, SecB. Biochemistry 39, 2362-2369, 2000 PAULA, S.; SUS, W.; TUCHTENHAGEN, J.; BLUME, A. Thermodynamics of Micelle Formation as a Function of Temperature: A High Sensitivity Titration Calorimetry Study J. Phys. Chem. B 99,11742-11751, 1995. PELTON, J.T & MC LEAN, L. R. Spectroscopic Methods for Analysis of Protein Secondary Structure. Anal. Biochem. 277, 167-176, 2000
Referências Bibliográficas
145
PLOTNIKOV, V. V.; BRANDTS, J. M.; LIN, L.; BRANDTS, J. F. An ultrasensitive scanning calorimeter. Anal. Biochem. 250, 237-251, 1997 PRITSA, A. A. & KYRIAKIDIS, D. A. L-asparaginase of Thermus thermophilus: Purification, properties and identification of essential amino acids for its catalytic activity. Molecular and Cellular Biochemistry 216, 93-101, 2001 RAHA, S. K.; ROY, S. K.; DEY, S. K.; CHAKRABOUTY, S. L. Purification and properties of an L- asparaginase from Cylindrocarpon MB-10. Biochem. Inter. 21, 977-1000, 1990 RASMUSSEN, T.; VAN DE WEERT, M.; JISKOOT, W.; KASIMOVA, M. R. Thermal and acid denaturation of bovine lens α-crystallin. Proteins 79, 1747-58, 2011 REDDY, G. B.; BHARADWAJ, S.; SUROLIA, A. Thermal stability and mode of oligomerization of the tetrameric peanut agglutinin: a differential scanning calorimetry Study. Biochemistry 38, 4464-4470, 1999
REMMELE, R. L. JR; ZHANG-VAN, E. J.; DHARMAVARAM, V.; BALABAN D.; DURST, M.; SHOSHITAISHVILI, A.; RAND, H. Scan-rate-dependent melting transitions of interleukin-1 receptor (type II): elucidation of meaningful thermodynamic and kinetic parameters of aggregation acquired from DSC simulations. J. Am. Chem Soc. 127, 8328-8339, 2005 ROBERTS, J. Purification and properties of a high potent ant tumor glutaminase-asparaginase from Pseudomonas 7 A. J. Biol. Chem. 251, 2119-2123, 1976 ROBERTS, J.; KOLENBERG, J. S.; DOLOWY, W. C. Isolation, purification and properties of Achromobacteriacea glutaminase-asparaginase with anti-tumor activity. J. Biol. Chem. 247, 84-90, 1972 ROSENT, C. G & WEBER, G. Dimer formation from 1 -anilino-8-naphthalenesulfonate catalyzed by bovine serum albumin: a new fluorescent molecule with exceptional binding properties. Biochemistry 8, 3915-3920, 1969 ROZALKA, M. Staphylococcal L-asparaginase: purification and properties of enzyme protein. Acta Microbiol. Pol.38, 233-245, 1989
Referências Bibliográficas
146
SANCHES, M.; KRAUCHENCO, S.; POLIKARPOV, I. Structure, Substrate Complexation and Reaction Mechanism of Bacterial Asparaginases. Current Chem. Biol. 1, 75-86, 2007 SANTIAGO, P. S.; CARVALHO, J. W. P.; DOMINGUES, M. M.; SANTOS, N. C.; TABAK, M. Thermal stability of extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus: Determination of activation parameters by optical spectroscopic and differential scanning calorimetric studies. Biophys. Chem. 152, 128-138, 2010 SANTORO, M. M. &BOLEN, D. W. Unfolding free energy changes determined by the linear extrapolation method denaturants. 1. Unfolding of phenylmethanesulfonyl α-chymotrypsin using different denaturants. Biochemistry 27, 8063-8068, 1988 SHIBAYAMA, K.; TAKEUCHI, H.; WACHINO, J. I.; MORI, S.; ARAKAWA, Y. Biochemical and pathophysiological characterization of Helicobacter pylori asparaginase. Microbiol. Immunol. 55, 408-17, 2011 SHNYROV, V. L.; VILLAR, E.; ZHADANA, G. G.; SANCHEZ-RUIZ, J. M.; QUINTAS, A.; SARAIVA, M. J. M.; BRITO, M. M. Comparative calorimetric study of non-amyloidogenic and amyloidogenic variants of the homotetrameric protein transthyretin. Biophys. Chem. 88, 61-67, 2000 SILVA, J. L. & WEBER, G. Pressure stability of proteins. Annu. Rev. Phys.Chem. 44, 89-113, 1993 SOARES, A.Q.; OLIVEIRA, L. F.; RABELO, D.; SOUZA, A. R. Polímeros biodegradáveis: novas perspectivas para as ciências farmacêuticas. Revista Eletrônica de Farmácia, 2, 202-205, 2005 STECHER, A. L.; DE DEUS, P. M.; POLIKARPOV, I.; ABRAHÃO-NETO, J. Stability of L-asparaginase: an enzyme used in leukemia treatment. Pharm. Acta Helv. 74, 1-9, 1999 STUMPE, M.C. & GRUBMULLER, H. Polar or apolar - the role of polarity for urea-induced protein denaturation. PLoS Computational Biology 4, 1-10, 2008 STURTEVANT, J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 2236-2240, 1977
Referências Bibliográficas
147
SUGIHARA, G. & HISATOMI, M. Enthalpy–entropy compensation phenomenon observed for different surfactants in aqueous solution. J. Colloid Interface Sci. 219, 31-36, 1999 SWAIN, A. M.; JASKOLSKI, M.; HOUSSET, D.; MOHANA RAO, J. K.; WLODAWER, A. Crystal Strcuture of L-asparaginase, an enzyme used in cancer chemotherapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1474-1478, 1993 TAKAHASHI, K. & STURTEVANT, J. M. Thermal denaturation of streptomyces subtilisin inhibitor, subtilisin BPN', and the inhibitor-subtilisin complex. Biochemistry 20, 6185- 6190, 1981 TEALE, F. W. J. & WEBER, G. Ultraviolet fluorescence of the aromatic amino acids. Biochem. J. 65, 476-482, 1957 THOMSON, J. A. & LADBURY, J. E. Isothermal titration Calorimetry: A tutorial. In LADBURY, J. E. & DOYLE, M. L. (Eds) Biocalorimetry 2: Applications of Calorimetry in the Biological Sciences. Willey, 2004. p. 35-57 TOBI, D.; ELBER, R.; THIRUMALAI, D. The dominant interaction between peptide and urea is electrostatic in nature: a molecular dynamics simulation study. Biopolymers 68, 359-369, 2003 TOSA, T.; SANO, R.; YAMAMOTO, K.; NAKAMURA, M.; CHIBATA, I. L-asparaginase from Proteus vulgaris: Purification, crystallization and enzyme properties. Biochemistry 11, 217-225, 1972 TRIANTAFILLOU, D.J.; GEOGATSOS, J.G.; KYRIAKIDIS, D.A. Purification and properties of L-asparaginase from Tetrahymena pyriformis. Mol. Cell. Biochem. 81, 43-51, 1988 TURNER, D. C. & BRAND, L. Quantitative estimation of protein binding site polarity: fluorescence of N-arylaminonaphthalenesulfonates. Biochemistry 7, 3381-3390, 1968 VAN HOLDE, K. E.; JOHNSON, W. C.; HO, P. S. Principles of Physical Biochemistry. Ed. Prentice Hall, 1998. p. 452-482 WEBER, G. & DRICKAMER, H. G. The effect of high pressure upon proteins and other biomolecules. Q. Rev. Biophys. 16, 89-112, 1983
Referências Bibliográficas
148
WEHNER, A.; HARMS, E.; JENNINGS, M. P. Site-specific mutagenesis of Escherichia coli asparaginase II. None of the three histidine residues is required for catalysis. Eur. J. Biochem. 208, 475-80, 1992 WHELAN, H. A. & WRISTON, J. C. Purification and properties of L- asparaginase from Serratia marcescens. Biochim. Biophys. Acta 365, 212 - 222, 1974 WHELAN, H. A. & WRISTON, J.C. Purification and properties of asparaginase from Escherichia coli. Biochemistry 8, 2386-2393, 1969 WISEMAN, T.; WILLISTON, S.; BRANDTS, J. F.; LIN, L. N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry 179,131-137, 1989 WRISTON, J. C. & YELLIN, T. O. L-asparaginase: a review. Adv. Enzymol. 39, 185-248, 1973 WRISTON, J. C. Asparaginase, In: Methods in Enzymol. 17, 732-742, 1971 YANCEY, P. H. Water stress, osmolytes and proteins. Amer. Zool. 41, 699-709, 2001 YIN, S. H.; TANG, C. H.; YANG, X. Q.; WEN, Q. B. Conformational study of red kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) protein isolate (KPI) by tryptophan fluorescence and differential scanning calorimetry. J. Agric. Food Chem. 59, 241–248, 2011 ZLATANOVA, J.; LINDSAY, S. M.; LEUBA, H. S. Single molecule force spectroscopy in biology using the atomic force microscope. Progress in Biophysics & Molecular Biology 74, 37- 61, 2000 ZOLKIEWSKI, M.; REDOWICZ, J. M.; KORN, E. D.; HAMMER, J. A.; GINSBURG, A. Two-State Thermal Unfolding of a Long Dimeric Coiled-Coil: The Acanthamoeba Myosin II Rod. Biochem. 36, 7876-7883, 1997
Anexo
Anexo
Published: June 09, 2011
r 2011 American Chemical Society 8248 dx.doi.org/10.1021/la1037525 | Langmuir 2011, 27, 8248–8256
ARTICLE
pubs.acs.org/Langmuir
Thermodynamic and Structural Characterization of ZwitterionicMicelles of the Membrane Protein Solubilizing AmidosulfobetaineSurfactants ASB-14 and ASB-16Mariana G. D’Andrea,†,‡Cleyton C. Domingues,§,‡ Sonia V. P. Malheiros,|| Francisco Gomes Neto,^ LeandroR. S. Barbosa,O Rosangela Itri,O Fabio C. L. Almeida,^ Eneida de Paula,§ and M. Lucia Bianconi†,*†Laborat�orio de Biocalorimetria, Instituto de Bioquímica M�edica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brazil§Departamento de Bioquímica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brazil
)Departamento de Biologia e Fisiologia, Faculdade de Medicina de Jundiaí, Jundiaí, SP, Brazil^CentroNacional de RessonanciaMagn�etica Nuclear Jiri Jonas, Instituto de BioquímicaM�edica, Universidade Federal do Rio de Janeiro,Rio de Janeiro, RJ, Brazil
OInstituto de Física da USP, IFUSP, S~ao Paulo, SP, Brazil
ABSTRACT: Surface tension and isothermal titration calorimetry (ITC) wereused to determine the critical micelle concentration (cmc) of the zwitterionicamidosulfobetaine surfactants ASB-14 and ASB-16 (linear-alkylamidopropyldi-methylammoniopropanosulfonates) at 25 �C. The cmc and the heat of micelliza-tion were determined from 15 to 75 �Cby ITC for both surfactants. The increasein temperature caused significant changes in the enthalpy and in the entropy ofmicellization, with small changes in the standard Gibbs energy (ΔGmic), which isconsistent to an enthalpy-entropy compensation with a compensatory tempera-ture of 311 K (ASB-14) and 314 K (ASB-16). In the studied temperature range,the heat capacity of micellization (ΔCp
mic) was essentially constant. The experi-mentalΔCp
micwas lower than that expected if only hydrophobic interactions wereconsidered, suggesting that polar interactions at the head groups are of significantimportance in the thermodynamics of micelle formation by these surfactants.Indeed, a NMR NOESY spectrum showed NOEs that are improbable to occurwithin the same monomer, resulting from interactions at the polar head groupsinvolvingmore than onemonomer. The ITC andNMR results indicate a tilt in the polar headgroup favoring the polar interactions.We havealso observedCOSYcorrelations typical of dipolar interactions that could be recoveredwith the partial alignment of themolecule in solution,which results in an anisotropic tumbling. The anisotropy suggested an ellipsoidal shape of the micelles, which results in a positive magneticsusceptibility, and ultimately in orientation induced by the magnetic field. Such an ellipsoidal shape was confirmed from results obtained bySAXS experiments that revealed aggregation numbers of 108 and 168 for ASB-14 andASB-16micelles, respectively. This study characterizesan interesting micelle system that can be used in the study of membrane proteins by solution NMR spectroscopy.
1. INTRODUCTION
Hydrophobic interactions are essential in the self-associationof amphiphilic molecules in aqueous solution, but the headgroupalso plays an important role on micelle formation. Therefore,the physicochemical properties of a surfactant depend on thehydrophilic-hydrophobic balance of the headgroups and theacyl chains. For ionic micelles, the increase in ionic strength candecrease the electrostatic repulsion between head groups, allow-ing a low curvature and the formation of larger micelles.Zwitterionic surfactants are electrically neutral, but they bearformally charged groups, presenting a higher polarity thannonionic compounds1 and properties similar to those of bothionic and noninonic micelles.1-3 These micelles can bind ionsselectively. Zwitterionic sulfobetaine micelles behave as cationicmicelles and show a charge gradient between the interior and the
interfacial surface. The anion binding increases with decreasingionic charge density, following the Hofmeister series and thePearson hard-soft classification.4-7 Although hexadecylpho-sphorylcholine (HPC) micelles present an opposite ion-head-group to that of sulfobetaines, they also incorporate anionsin the interfacial region.5,8 Cuccovia et al.5 showed that theinterfacial anion concentrations in zwitterionic micelles ofHPC and 3-(N-hexadecyl-N,N-dimethylammonio) propane-sulfonate (HPS) depends on the bulk salt concentration aswell as the dipole orientation of the detergent headgroup andthe nature of the cations.
Received: September 19, 2010Revised: December 27, 2010
8249 dx.doi.org/10.1021/la1037525 |Langmuir 2011, 27, 8248–8256
Langmuir ARTICLE
The critical micelle concentration (cmc) and the aggregationnumber (N) are important properties of surfactants that dependon experimental conditions. The cmc of a surfactant can bedetermined by surface tension,9-12 dye solubility,10-13 lightscattering,14-16 electrical conductivity,15-17 and spin label mobi-lity.18 By using isothermal titration calorimetry (ITC) it is possi-ble to measure both the cmc and the enthalpy of micelliza-tion,19-33 allowing a more accurate calculation of the entropyand the free energy involved in the process.
The zwitterionic detergents with an amidosulfobetaine head-group and alkyl tails of 14 (ASB-14) and 16 (ASB-16) carbonatoms have been described as very effective for the solubilizationof membrane proteins.34-37 Despite their recognized biologicalapplication, only a preliminary study of the micellization of thesesurfactants was done at 25 �C by electron spin resonance.18
In this work we describe the physicochemical characterizationof the ASBs micelles by different techniques. The thermody-namics of micelle formation for both ASB-14 and ASB-16 wasstudied by high sensitivity titration calorimetry (ITC) in a widetemperature range (from 15 to 75 �C). Molecular details on themicelle organization were revealed by NMR measurements,whereas the micellar shape, size and aggregation number N weredetermined by small-angle X-ray scattering.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Materials. The zwitterionic amidosulfobetaine detergents tetra-decanoylamido propyl dimethyl ammonio propanesulfonate (ASB-14) andhexadecanoylamido propyl dimethyl ammonio propanesulfonate (ASB-16)were obtained from Calbiochem, La Jolla, CA, and used without furtherpurification. The structures of these surfactants are shown in Scheme 1. Allother reagents were of analytical grade.2.2. Surface Tension. Surface tension was measured in a Sigma-
701 tensiometer from KSV Instruments Ltd. (Helsinki, Finland). ASB-14 and ASB-16 solutions with concentrations ranging from 1 to 500 μMwere used. Briefly, the surface tension (γ) of the liquid is measured priorto any addition of the surfactant and after each addition and solubiliza-tion of a determined amount of surfactant. The cmc was calculated fromthe semilogarithmic plot of surface tension as a function of the surfactantbulk concentration.2.3. Isothermal Titration Calorimetry. Heats of dilution and
demicellization of ASB-14 and ASB-16 were measured in a VP-ITC fromMicroCal, Llc (Northamptom, MA, USA) from 15 to 75 �C. At 10 �Cthe signal obtained with both surfactants was poor with fluctuations inthe heat effect, and the data were not analyzed. The principles of thetechnique were described by Wiseman et al.38 Aliquots of micellarsolution of each surfactant were injected at 5 min intervals into thesample cell (V = 1.422 mL) filled with Milli-Q water, under continuousstirring at 300 rpm. The thermograms of the heats of dilution of thedetergents were analyzed with the ORIGIN 5.0 software provided by
MicroCal. The cmc was determined by the minimum of the firstderivative of the curve obtained for the enthalpy of detergent dilutionas a function of total detergent concentration in the cell. The initialconcentration of ASB-14 in the syringe was 5 mM. For ASB-16, theconcentration in the syringe was 0.21 mM for the titrations up to 45 �C,and 1 mM from 55 to 75 �C.2.4. Nuclear Magnetic Resonance. The NMR spectra were
acquired in a Bruker DRX 400 MHz and/or a Bruker Avance III 800MHz at 25 �C.NMRsamples of ASB-16 (45mM) andASB-14 (45mMand500 mM) were prepared in Milli-Q water containing 10% 2H2O. Phasesensitive NOESY39 and TOCSY40 spectra were acquired at 9.4 T (400.13MHz) with presaturation for solvent suppression, 4,096 complex points inF2, and 512 complex points in F1; quadrature detection in the indirectdimension was obtained by States-TPPI method.41 A mixing time of 50 and100 ms was used for the NOESY spectra and 69.7 ms of spin lock40 for theTOCSY experiments. Both spectra were processed using Topspin 2.1.COSY42 spectra were acquired at 9.4 T (400.13 MHz) in magnitude modewith 4,096 complex points in F2 and 256 points in F1. The spectra wereprocessed using squared sine bell as window function with zero fillingdoubling the number of points. 13C-1H splitting due to scalar and residualdipolar coupling were measured using coupled HSQC spectra at two fields(18.8 and 9.4 T). We used gradient selected HSQC43 with 2,048 complexpoints in F2 and 512 complex points in F1. Echo/antiechoTPPI44modewasused for quadrature detection in the indirect dimension; the sweepwidthwas15 ppm for 1H centered inwater and 70 ppm for 13C centered at 40 ppm. Toobtain the coupledHSQCs, the 180o 1H pulse in themiddle of 13C evolutionwas abolished. Fully decoupled HSQCs were also acquired as a control.2.5. Small-Angle X-ray Scattering. SAXS experiments were
performed at the National Laboratory of Synchrotron Light (LNLS,Campinas, SP, Brazil) at room temperature (22( 1 �C), with radiationwavelength λ = 1.488 Å and sample-to-detector distance of ∼900 mm.Micelle aqueous solutions of 50mMASB-14 and ASB-16, were preparedin Milli-Q water. Samples were set between two mica windows, 1 mmspacer, handled in a liquid sample-holder, and placed perpendicular tothe X-ray beam. The obtained images (two-dimension position sensitivedetector) were radially averaged and normalized by taking into accountthe decrease in the intensity of the X-ray beam during the experimentand the time for the measurements (data acquisition of 15 min).
The SAXS intensity I(q) of an isotropic solution of noninteract-ing spheroidal particles of low anisometry (smaller than 3) can bedescribed as47-49
IðqÞ ¼ knpPðqÞ ð1Þ
where np and k correspond to the particle number density and thenormalization factor related to the instrumental effects, respectively. Thescattering vector q = (4π/λ) sin θ, in which 2θ is the scattering angle andλ is the wavelength of the X-rays. P(q) corresponds to the orientationalaverage of the scattering particle form factor. In the case of the ASBs, themicelle form factor P(q) is represented by a prolate ellipsoid of two shellsof different electron densities F in respect to the solvent electrondensity.48,49 In this work, Fw = 0.333 e/Å3 for water. The prolate micelle,with axial ratio ν, is represented by a hydrophobic paraffinic core withelectron density Fpar = 0.275 e/Å3, being the shortest semiaxis on theorder of the paraffinic chain length, Rpar, and the longest semiaxisdefined as νRpar. The hydrophobic core is surrounded by a polar shell ofthickness σ and electron density Fpol, which includes the polar headgroups and hydration water. The structural parameters Rpar, ν, σ, andFpol are obtained by the fitting of the experimental data to eq 1. We usedthe Global fitting procedure (GENFIT software)50-54that performs a χ2
minimization with a simulating annealing process,56 changing the freeparameters until χ2 reaches a minimum value. This allows the linkageamong different fitting parameters from distinct scattering curves. Thisprocess improves the uniqueness of the final solution. Once Rpar and νare determined, themicellar aggregation number,N, can be calculated by
Scheme 1. Chemical Structure of the ZwitterionicAmidosulfobetaine Surfactants
8250 dx.doi.org/10.1021/la1037525 |Langmuir 2011, 27, 8248–8256
Langmuir ARTICLE
taking into account the volume of the ellipsoidal micelle hydrophobiccore
4πνðRparÞ3=3 ¼ NVpar ð2Þ
with Vpar = 27.4 þ 26.9nC, the hydrophobic volume of linear surfactantwith nC carbon atoms in the alkyl chain.57 The hydration number perpolar head,W, can be further evaluated from the combined values of N,σ, and Fpol. Details can be found elsewhere.49,56
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Critical Micelle Concentration. Table 1 shows the cmcvalues for ASB-14 and ASB-16 determined by surface tensionmeasurements at 25 �C (Figure 1) and by ITC from 15 to 75 �C.The cmc values obtained by surface tension were very similar tothose previously determined by ESR18 and to the ones deter-mined by ITC (Table 1).Figure 2 illustrates a typical ITC experiment of the demicelli-
zation of ASB-14, where a solution of ASB-14 micelles wasinjected into the calorimetric cell containing water. In the first seveninjections, the endothermic peaks from these injections were due to:(i) the heat of dilution ofmicelles andmonomers in solution and (ii)the heat due to the disruption of the micelles. As the surfactantconcentration increased, the heat effect due to the demicellizationgradually decreased and thefinal injections reflect the heat of dilutionof micelles and monomers. The heat flux as a function of time wasintegrated from the baseline and the area under each peak wasnormalized for the number of moles of injectant in the cell. Theseintegrations gave rise to the sigmoid curve in Figure 2B of thecalorimetric enthalpy (ΔHcal) as a function of the surfactant concen-tration. The enthalpy of demicellization (ΔHdemic) was calculated asthe difference between the average enthalpy obtained above the cmc
and that obtained below the cmc. ΔHdemic is equal in number butopposite in sign to the enthalpy of micelle formation (ΔHmic). Cmcvalues were determined from the minimum in the first derivative ofthe sigmoid curve of ΔHcal as a function of ASB concentration(Figure 2C).The effect of the temperature on the cmc of both ASB-14 and
ASB-16 is shown in Figure 3 and the data is summarized inTable 1. As expected, cmc values of ASB-16 were lower thanthose for ASB-14 (Table 1 and Figure 3).The cmcs of both ASB-14 and ASB-16 are lower than that deter-
mined in water at 25 �C for the sulfobetaines SB-14 (0.25mM57 and
Table 1. Effect of the Temperature on the Critical Micelle Concentration (cmc) and Thermodynamic Parameters of Micellizationof ASB-14 and ASB-16
compound T (�C) cmc (mM) ΔHmic (kJ 3mol-1) ΔGmic (kJ 3mol-1) TΔSmic (kJ 3mol-1)
ASB-14 15 0.128( 0.010 1.24( 0.05 -31.09( 0.18 32.36( 0.15
20 0.109( 0.006 -1.50 ( 0.05 -31.46( 0.12 29.96( 0.12
25 0.119( 0.004 -3.85( 0.05 -32.34( 0.08 29.25( 1.78
25a 0.115a
30 0.104( 0.046 -6.28( 0.05 -32.25 ( 0.07 25.95( 0.09
35 0.147( 0.009 -8.37( 0.17 -32.93( 0.15 24.58( 0.14
40 0.148( 0.003 -10.39( 0.22 -32.87 ( 0.05 22.23( 0.39
45 0.169( 0.006 -12.79( 0.45 -33.58( 0.10 20.74( 0.58
55 0.204( 0.016 -16.93( 1.97 -34.14( 0.21 17.08( 1.90
65 0.262( 0.022 -21.16( 1.41 -34.48( 0.24 13.25( 1.18
75 0.349( 0.032 -25.02 ( 2.81 -34.67( 0.27 9.64( 2.54
ASB-16 15 0.0104( 0.0093 1.39( 0.33 -37.37( 0.05 38.76( 1.1
20 0.00854( 0.0007 -3.89( 0.18 -37.58( 0.20 33.93( 0.21
25 0.0096( 0.0003 -5.56 ( 0.34 -38.59( 0.09 33.03( 0.38
25a 0.011a
30 0.0101( 0.002 -7.00 ( 0.69 -38.78( 0.22 31.40( 0.73
35 0.0115( 0.0011 -9.92( 0.68 -39.29( 0.34 29.56( 0.99
40 0.116( 0.0021 -11.39( 1.36 -39.41( 0.36 27.86( 1.63
45 0.0147( 0.0013 -15.11( 1.30 -40.07( 0.32 25.07( 0.91
55 0.0213( 0.0029 -21.71( 0.61 -40.31( 0.36 18.87( 1.12
65 0.0272( 0.0023 -25.22 ( 0.64 -40.84( 0.24 15.6 2( 1.38
75 0.037( 0.0016 -29.9( 0.32 -41.12( 0.12 13.27( 1.21aValues determined by surface tension.
Figure 1. Surface tension as a function of bulk concentration of ASB-14(A) and ASB-16 (B) at 25 �C in Milli-Q water. The cmc corresponds tothe surfactant concentration where maximally reduced surface tension isachieved.
8251 dx.doi.org/10.1021/la1037525 |Langmuir 2011, 27, 8248–8256
Langmuir ARTICLE
0.27 mM58) and SB-16 (0.028 mM57,58), suggesting that the amidegroup favors the micellization.3.2. Thermodynamics of Micelle Formation. The effect of
temperature on the thermodynamic parameters of micellization
of ASB-14 and ASB-16 is shown in Figure 4, and it is summarizedin Table 1. For both surfactants, the micellization was endother-mic at 15 �C and exothermic from 25 to 75 �C.Assuming a pseudophase separation model, the standard
Gibbs energy of transfer of a monomer from water to a micelle(ΔGmic
0 , Figure 4 and Table 2) can be calculated from the van’tHoff equation:
ΔG0mic ¼ -RT ln cmc0 ð3Þ
where cmc0 is the critical micelle concentration in mole fractionunits. Equation 3 leads to the correlation between the cmc andthe enthalpy of micelle formation:
ΔHmic ¼ -RT2Dðln cmc0ÞDT
ð4Þ
The van’t Hoff enthalpy at 25 �C (ΔH0) and the heat capacitychange (ΔCp
0) of micellization were calculated from the tem-perature dependence of the cmc0 (Table 2):
lnðcmc0Þ ¼ aþ bTþ c� ln T ð5Þ
ΔH� ¼ Rð- bþ cTÞ ð6Þ
ΔC0p ¼ Rc ð7Þ
For both surfactants,ΔH0 obtained from eq 6 was close to theΔHmic obtained by ITC at 25 �C (Table 1). ΔH0 and ΔCp
0-(Table 2) where also calculated according to Kresheck26 from themolar enthalpy change (ΔH R) and the heat capacity change(ΔCpR) at a reference temperature (TR = 298 K), by fitting theexperimental data to:
ΔH� ¼ ΔHR þ ðΔCpR - BTRÞðT-TRÞ þ B2ðT2 -TR
2Þ ð8Þ
Figure 2. Titration of ASB-14 micellar solution (5 mM) into thecalorimetric cell (1.422 mL) containing water at 25 �C. (A) Heat flowas a function of time for 24 injections of 3 μL ASB-14 intoMilli-Q water.(B) Reaction enthalpy (ΔHcal) as a function of ASB-14 final concentra-tion in the cell where the ΔHdemic is indicated by an arrow. (C) Firstderivative of curve B where the minimum corresponds to the cmc.
Figure 3. Effect of temperature on cmc0 for ASB-14 (b) and ASB-16(O). The solid lines represent the curve fitting according to eq 3.
Figure 4. Thermodynamic parameters for micelle formation of ASB-14(solid symbols) and ASB-16 (open symbols) in Milli-Q water as afunction of the temperature. Solid lines represent the best fits of theexperimental data. ΔHmic (b, O) was fitted according to eq 9; TΔSmic
(2, Δ) was fitted by a linear correlation and ΔGmic (9, 0) by a seconddegree polynomial.
8252 dx.doi.org/10.1021/la1037525 |Langmuir 2011, 27, 8248–8256
Langmuir ARTICLE
where
ΔC0p ¼ ΔCpR þ BðT-TRÞ ð9Þ
The entropic term for micellization (TΔSmic, Figure 4 andTable 2) was, then, calculated by the Gibbs-Helmholtz equa-tion:
ΔG0mic ¼ ΔHmic -TΔSmic ð10Þ
The enthalpy-entropy compensation in the micellization ofboth ASB-14 and ASB-16 can be better visualized in Figure 4.Similar to that found for other compounds,27-32 the micelleformation of ASB-14 and ASB-16 was enthalpy-driven at highertemperatures and characterized by a large and negative ΔGmic
0 thatdid not significantly change with temperature (Figure 4 andTable 1).Entropy-enthalpy compensation was first described by Lumry
and Rajender59 in which a proportionality constant, defined asthe compensation temperature, was found in a narrow range,from about 250 to 315 K, for different processes. The entropy-enthalpy compensation in micelle formation can be explained bythe interplay between the water molecules in contact with theacyl chains (solvation or “bound” water) and the bulk watermolecules (“free” water). With the increase in temperature, theexchange between “bound” and “free” water is easier than it is atlower temperatures. As a consequence, the entropic contributiondecreases with the temperature and the slope from the curve ofΔSmic as a function of ΔHmic gives the compensation tempera-ture. Sugihara and Hisatomi60 calculated the compensationtemperature for more than 15 nonionic, anionic, and cationicsurfactants and found a compensation temperature ranging from299 to 315 K, depending on the species. In this work, we foundvery similar values with a compensation temperature of 311 K forASB-14 and 314 for ASB-16.An approximate value forΔΔGmic andΔΔHmic per methylene
group was calculated from the plots of ΔGmic and ΔHmic
obtained at 25 �C as a function of the effective methylenenumber, nCH2*(mon). According to Heerklotz and Epand,30
this number considers only methylene groups that are exposed towater in the monomeric form, the methyl group counting as 1.5.Thus, nCH2*(mon) is 13.5 for ASB-14 and 15.5 for ASB-16. Theincremental ΔΔGmic per methylene group (ΔΔGmic = -3.13kJ 3mol
-1) found for the ASBs is in a very good agreement tothose reported for other surfactants.30 The incremental enthalpyper methylene group at 25 �C was -0.86 kJ 3mol-1. From therelation ΔΔG = ΔΔH - T 3ΔΔS, the entropic term found here(-TΔΔS = -2.27 kJ 3mol-1) was similar to the -3 kJ 3mol-1
reported for liquid hydrocarbons.30
For ionic surfactants the interactions at the polar headgroupregion should also be considered. Therefore, the enthalpy andthe Gibbs free energy of micellization are not only a result ofcontributions from the acyl chains. Depending on the conforma-tion of the head groups upon formation of the electrical double
layer one can expect to have Coulombic repulsions due to thesurfactant headgroup charges. Nevertheless, favorable interac-tions can also take place. In order to evaluate the energetic of theheadgroup contribution of the ASBs upon micelle formation, weanalyzed changes in heat capacity.3.3. Heat capacity changes and methylene group con-
tributions. The heat capacity changes on micelle formation(ΔCp
mic, Table 2) is a temperature dependent variable,ÆΔCpæ ¼ δÆΔHmicæ = δT ð11Þ
and in the temperature range studied here, we found a goodlinear correlation of ΔHmic as a function of temperature. How-ever, a better fitting was achieve with the nonlinear model (eq 9)described by Kresheck26 (Figure 4 and Table 2).ΔCp
mic for the ASBs were smaller than the expected from theempirical correlation determined from the dissolution of hydrocar-bons.61 This behavior was also observed for other surfactants.22,24,30
Considering this empirical correlation, in which ΔCp = 33 nH(J 3mol
-13K
-1), where nH is the number of hydrogen atoms ex-posed to water, one could expect aΔCp
mic =-891 J 3mol-1
3K-1 for
ASB-14 andΔCpmic =-1023 J 3mol
-13K
-1 for ASB-16. Heat capa-city were obtained in two ways: ΔCp
0 from the temperature depen-dence of the cmc0 (eq 6, Table 2) and ΔCp
micfrom the temperaturedependence of ΔHmic. ΔCp
0 values are higher than ΔCpmicobtained
from ITC data (Table 2). Nevertheless, both values obtained fromthe experimental data are significantly lower than the predicted onesfrom the empirical correlation from dissolution of hydrocarbonsshown above.The discrepancy in the methylene contributions to the ther-
modynamic parameters of micellization could be an indication thatat least half of the methylene groups are exposed to water aftermicelle formation. This would lead to very unstable aggregates if oneconsiders the contribution of the amidosulfobetaine headgroup. Wesuggest that the micelles are also stabilized by intermolecularinteractions at the headgroup region between neighboring surfac-tants, i.e., by the formation of a salt bridge between the quaternaryamine group of one surfactant and the sulfonate group of anothersurfactant, as well as the formation of a hydrogen bond between theamide groups of these surfactants. This is possible if the head groupsare not tethered as it occurs with sulfobetaines, where the highlyhydrophilic sulfonate group is located at themicelle surface while theless hydrophilic quaternary amine is located near the hydrocarbonregion of the micelle.62 The conformation of the ASBs micelles aremore similar to that observed with hexadecyl phosphorylcoline(HPC)8 micelles and in bilayers of phosphatidylcholine (PC) orphosphatidylethanolamine (PE).63,64
3.4. NMR Studies of the ASB Micelles. In order to betterunderstand the interactions at the polar headgroup region inboth ASBs micelles, we used NMR spectroscopy. We have fullyassigned 1H and 13C nuclei of ASB-14 and ASB-16. A NOESYspectrum of 100 ms mixing time showed several NOEs connect-ing adjacent hydrogens (Figure 5, solid arrows) within the
Table 2. Thermodynamic Parameters of Micelle Formation for ASB-14 and ASB-16
compound nCH2*(mon)a ΔCp
mic,a J/mol 3K B coefficient, J/mol 3Kb ΔH0,c kJ/mol ΔCp
0,c J/mol 3K-1
ASB-14 13.5 -480( 7 -1.385( 0.6 4.64( 1.2 -524( 10
ASB-16 15.5 -605( 45 -1.596 ( 0.8 7.69( 1.7 -713 ( 59a nCH2
*(mon) is the effective number of methylenes driving self-association, and it was calculated as described in the text, considering 1 for eachmethylene group, and 1.5 for methyl groups. bΔCp
mic is the heat capacity change for micelle formation calculated from the fitting to eq 9 of thetemperature dependence ofΔHmic (Figure 4). cΔH0 andΔCp
0 values were calculated from the fitting of the curves obtained for lnCMC’ as a function oftemperature according to eq 6 and 7, respectively.
8253 dx.doi.org/10.1021/la1037525 |Langmuir 2011, 27, 8248–8256
Langmuir ARTICLE
surfactant monomer. We also observed NOEs that are improb-able to occur within the same monomer. We interpreted theseNOEs as a result of interactions involvingmore than onemonomer,as depicted in Figure 5 by dotted arrows. Therefore, the micellesformed by both ASB-14 and ASB-16 displayed intermolecularNOEs that evidence polar head tilts, which are represented inFigure 6. This finding is in agreement with the prediction from thediscrepancies of the experimental and predictedΔCpthat suggestedpolar interactions between adjacent monomers.We assigned both surfactants using COSY correlations
(Figure 6). We have noticed the expected COSY correlationthrough scalar coupling involving adjacent hydrogens linked bythree bonds. Remarkably, we have also observed the presence ofCOSY correlations involving hydrogens that are not linked toadjacent carbons. These correlations are typical of dipolarinteractions, rather than the interaction that results from scalarcoupling. In solution, dipolar coupling is zero for isotropicsolutions since it is averaged due to isotropic molecular tumbling.In the case of the ASBs, dipolar coupling is higher than zero,meaning that it is not completely averaged. This suggests a partialalignment of the micelle in solution resulting in anisotropictumbling. The anisotropy could be explained by an ellipsoidshape of the micelles, which results in a positive magneticsusceptibility vector, and ultimately in orientation induced bythe magnetic field.To confirm the orientation by an independent parameter, we
measured the 13C-1H splitting for each hydrogen in themolecule (Table 3). If the splitting was only due to 1JCH, itwould be independent of the magnetic field. However, weobserved that the splitting changed with the magnetic field dueto different degrees of orientation in the different fields. Weactually measured the sum of the scalar coupling and residualdipolar coupling (1JCH þ 1DCH). Residual dipolar coupling(1DCH), that is a consequence of the partial alignment, is theparameter that varies with the magnetic field, since the residualalignment tends to increase with the magnetic field.
We have also tested if the orientationwas due to crowding effects,rather than magnetically induced. The observed 13C-1H splittingwas the same for ASB-14 at 50mM and 500mM (data not shown),
Figure 5. Representation of the nuclear Overhauser cross-peaks de-tected between hydrogens of the polar headgroup region of ASBdetergents.
Figure 6. NMR correlation spectroscopy (COSY) spectra of the ASB-14. (A) COSY spectrum of 45 mM ASB-14. The red lines show thethrough bond conectivities used for the assignment of the surfactant.(B) COSY spectrum of 500 mM ASB-14. The increase in concentrationevidence the correlations via residual dipolar coupling. (C) Model ofASB-14 headgroup with the number of each heavy atom to serve as areference for the visualization of the COSY spectra and Table 3 thatcontains the full assignment. The spectra were obtained at 25 �C.
8254 dx.doi.org/10.1021/la1037525 |Langmuir 2011, 27, 8248–8256
Langmuir ARTICLE
implicating that the orientation is exclusively due to the magneticsusceptibility of the micelle. The results thus suggested that themicelles of ASB-14 and ASB-16 are not spherical, which can be anadvantage to the application of these micelles to study structuralproperties of proteins by NMR. In order to better explore thestructural features of ASB-14 and ASB-16 micelles, SAXS measure-ments were then performed, as follows.3.5. SAXS studies of the ASB micelles. Figure 7 shows the
SAXS curves of ASB-14 and ASB-16 along with the best fittingsto the experimental data (eq 1), and the fitting parameters aredescribed in Table 4. The experimental data are well representedby the scattering profile of prolate ellipsoid micelles for bothsurfactants. It corroborates the NMR results that indicated anellipsoid shape for both micelles.The micelle structural parameters are similar for both surfac-
tants concerning the polar shell features and the ellipsoid axialratio (Table 4). The main difference resides on the paraffinicradius, Rpar, which is shorter for ASB-14, as expected. The Rparvalues are in very good agreement with those obtained for C14and C16 extended chain length of 19.2 and 21.7 Å, respectively(lc = 1.5 þ 1.265nc). Therefore, the interface between the polarand apolar regions of the micelle must reside near the carboxyl
group (CdO region, see Scheme 1). Considering the extendedchain length of the polar head of about 13.2 Å and the observedthickness of the polar head of 8.1 Å for ASB-14 and 9.1 Å for ASB-16, we estimated the polar head tilt angle as 38� for ASB-14 and44� for ASB-16. The shortest hydrophobic semiaxis dimensionsare compatible to the respective extended alkyl chain lengths.The aggregation numbers (N) found for ASB-14 and ASB-16
were 108 and 168, respectively (eq 2, Table 4), which areconsiderably higher than that observed for sulfobetaines whereNwas reported as 60 by Di Profio et al.3 for SB-14, and 67 for SB-14 and 71 for SB-16 by Graciani et al.58
Considering the ASBsN values and the polar shell thickness σ,circa 12 water molecules must be hydrating each amidosulfobe-taine polar head (Table 4). For comparison, Table 4 also containsthe structural parameters determined for two other zwitterionic
Table 3. Scalar Couplings (1JCH) of ASB-14 (A) and ASB16(B) Measured at 19.2 and 9.6 Ta
A
chemical
group
1JCH, Hz
800 MHz
1JCH, Hz
400 MHz
ΔJ
(Hz) ppm
1 SO3 - - - -
2 CH2 268.87 273.84 - 4.97 2.89
3 CH2 255.20 257.78 - 2.58 2.15
4 CH2 302.54 289.20 - 13.34 3.43
5 CH3 253.99 252.16 3.63 1.18
6 CH3 0.77
7 N - - - -
8 CH2 293.11 289.03 4.08 3.30
9 CH2 261.61 258.18 3.43 1.92
10 CH2 276.11 280.88 - 4.77 3.21
11 NH - - - 7.97
12 CO - - - -
13 CH3 3.05
B
chemical
group 800MHz 400MHz Δυ (Hz) ppm
1 SO3 - - -
2 CH2 268.87 273.84 - 4.97
3 CH2 255.20 257.78 - 2.58
4 CH2 302.54 289.20 - 13.34
5 CH3 253.99 252.16 3.63
6 CH3
7 N - - -
8 CH2 293.11 289.03 4.08
9 CH2 261.61 258.18 3.43
10 CH2 276.11 280.88 - 4.77
11 NH - - -
12 CO - - -
13 CH3aThe differenceΔJ (Hz) reflects the partial orientation of both micellesinduced by the magnetic field. The assignment of each hydrogen in theASBs molecules is in the fifth column.
Figure 7. SAXS curves of 50 mM ASB-14 (A) and 50 mM ASB-16 (B).The solid lines represent the best fittings obtained with the ellipsoidalmodel. See text for details. The fitting parameters are described inTable 4.
Table 4. Fitting Parameters Obtained from the ScatteringCurves of Samples Composed of 50 mM of ASB-14 andASB-16 in Water Using the Ellipsoidal Modela
surfactant Rpar (Å) σ (Å) Fpol (e/Å3) ν N W
ASB14 18.0(5) 8.1(5) 0.391(7) 1.80(2) 108(12) 12
ASB16 21.7(5) 9.1(6) 0.392(7) 1.80(2) 168(13) 13
LPCb 22.5(3) 9.0(2) 0.39(1) 1.6(1) 166(13) 11
HPSb 22.5(3) 7.4(4) 0.39(1) 1.6(1) 166(13) 11a Rpar is the paraffinic radius, σ and Fpol are the thickness and theelectronic density of the polar headgroup, respectively, ν is the ratiobetween the largest and the shortest semiaxes of the ellipsoid, N andWare the micellar aggregation number and the number of water moleculesper surfactant molecule into the polar shell, respectively.* Valuesextracted from the literature.51,66 The uncertainties are represented inparentheses.
8255 dx.doi.org/10.1021/la1037525 |Langmuir 2011, 27, 8248–8256
Langmuir ARTICLE
surfactants, 3-(N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonium) pro-panesulfonate (HPS) and L-R-lysophosphatidylcholine (LPC),both having the same hydrophobic contribution of ASB-16. Notehowever that, in spite of the differences in the polar head groups,LPC, HPS, and ASB-16 present similar values of Rpar and ν. As aconsequence, the aggregation numbers are also quite similar(Table 4). This fact suggests that, although the micellization ofthe ASBs is driven by hydrophobic contribution and polar headinteraction, the aggregation number depends mainly on thelength of the hydrophobic paraffinic tail.
4. CONCLUSIONS
The thermodynamics of micelle formation of the amidesulfobetaine surfactants ASB-14 and ASB-16 showed enthalpy-entropy compensation as already observed with othersurfactants. The thermodynamic data indicated that headgroupinteractions play an important role to the micelle formation andstability. It is important to note that the discrepancies in the heatcapacity values obtained from the experimental data and fromthe theoretical estimation suggested the orientation of the polarheadgroup. This conformation as showed by direct NOE ob-servation (NMR) and by the structural SAXS parameters, as seenby the tilt angle of about 40� at the polar head groups of the ASBs.NMR dipolar coupling measurements provided informationon the anisotropic character of the ASBs micelle, which wascorroborated by the SAXS determination of the ellipsoid struc-ture of ASBs micelles.
This work shows that ASB-14 and ASB-16 are good candidatesfor membrane protein solubilization. In addition, the observedanisotropy can be useful for the measurement of residual dipolarcouplings in solution NMR structural determination.
’AUTHOR INFORMATION
Corresponding Author*Address: Laborat�orio de Biocalorimetria, IBQM/UFRJ, Pr�ediodo CCS - Bloco e - Sala 27b, Rio de Janeiro, RJ 21941-290, Brazil.Telephone:þ55 21 3717-5176. Fax:þ55 21 2270-8647. E-mail:[email protected] or [email protected].
Author Contributions‡Both authors contributed equally to this work and should beconsidered as first authors.
’ACKNOWLEDGMENT
This work was supported by research grants from Financia-dora de Estudos e Projetos (FINEP/CT-Infra), Conselho Na-cional de Desenvolvimento Científico e Tecnol�ogico (CNPq),Fundac-~ao Carlos Chagas Filho de Amparo �a Pesquisa do Estadodo Rio de Janeiro FAPERJ, and Fundac-~ao de Amparo �a Pesquisado Estado de S~ao Paulo (FAPESP). M.G.D and C.C.D. acknowl-edge the fellowships from CNPq and Coordenac-~ao de Aper-feic-oamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES). We thankDr. Watson Loh for facilities.
’REFERENCES
(1) Laughlin, R. G. Langmuir 1991, 7, 842.(2) Correia, V. P.; Cuccovia, I. M.; Stelmo, M.; Chaimovich, H.
J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 2144.(3) Di Profio, P.; Germani, R.; Savelli, G.; Cerichelli, G.; Chiarini,
M.; Mancini, G.; Bunton, C. A.; Gillitt, N. D. Langmuir 1998, 14, 2662.
(4) Baptista, M. S.; Cuccovia, I.; Chaimovich, H.; Politi, M. J.; Reed,W. F. J. Phys. Chem. 1992, 96, 6442.
(5) Cuccovia, I. M.; Romsted, L. S.; Chaimovich, H. J. ColloidInterface Sci. 1999, 220, 96.
(6) Tondo, W. T.; Priebe, J. M.; Souza, B. S.; Priebe, J. P.; Bunton,C. A.; Nome, F. J. Phys. Chem. B 2007, 111, 11867.
(7) Farrukh, M. A.; Beber, R. C.; Priebe, J. P.; Satnami, M. L.; Micke,G. A.; Costa, A. C. O.; Fiedler, H. D.; Bunton, C. A.; Nome, F. Langmuir2008, 24, 12995.
(8) Priebe, J. P.; Souza, B. S.; Micke, G. A.; Costa, A. C. O.; Fiedler,H. D.; Bunton, C. A.; Nome, F. Langmuir 2010, 26, 1008.
(9) Blandamer, M. J.; Briggs, B.; Cullis, P. M.; Engberts, J. B. F. N.;Kevelam, J. Phys. Chem. Chem. Phys. 2000, 2, 4369.
(10) Blandamer,M. J.; Cullis, P.M.; Soldi, L. G.; Engberts, J. B. F. N.;Kacperska, A.; van Os, N. M.; Subha, M. C. S. Adv. Colloid Interface Sci.1995, 58, 171.
(11) Zielinski, R.; Ikeda, S.; Nomura, H.; Kato, S. J. Colloid InterfaceSci. 1989, 129, 175.
(12) Matsuno, R.; Takami, K.; Ishihara, K. Langmuir 2010, 26,13028.
(13) Diaz Garcia, M. E.; Sanz-Medel, A. Talanta 1986, 33, 255.(14) Kunieda, H.; Shinoda, K. J. Phys. Chem. 1976, 80, 246.(15) Mills, C. O.;Martin, G.H.; Elias, E. Biochim. Biophys. Acta 1986,
876, 677.(16) Patist, A.; Bhagwat, B. B.; Penfield, K. W.; Aikens, P.; Shah,
D. O. J. Surfactants Deterg. 2000, 3, 53.(17) Dar, A. A.; Rather, G. M.; Das, A. R. J. Phys. Chem. B 2007, 111,
3122.(18) Domingues, C. C.; Malheiros, S. V. P.; de Paula, E. Braz. J. Med.
Biol. Res. 2008, 41, 758.(19) Bijma, K.; Engberts, J. B. F. N.; Haandrikman, G.; van Os, N. M.;
Blandamer, M. J.; Butt, M. D.; Cullis, P. M. Langmuir 1994, 10, 2578.(20) Bhattacharya, S.; Haldar, J. Langmuir 2005, 21, 5747.(21) Olofsson, G. J. Phys. Chem. 1985, 89, 1473.(22) Kresheck, G. C. J. Phys. Chem. B 1998, 102, 6596.(23) Blandamer, M. J.; Cullis, P. M.; Engberts, J. B. F. N. Pure Appl.
Chem. 1996, 68, 1577.(24) Heerklotz, H.; Epand, R. M. Biophys. J. 2001, 80, 271.(25) Hildebrand, A.; Garidel, P.; Neubert, R.; Blume, A. Langmuir
2004, 20, 320.(26) Kresheck, G. C. J. Colloid Interface Sci. 2006, 298, 432.(27) Paula, S.; Siis, W.; Tuchtenhagen, J.; Blume, A. J. Phys. Chem.
1995, 99, 11742.(28) Garidel, P.; Hildebrand, A.; Neubert, R.; Blume, A. Langmuir
2000, 16, 5267.(29) Majhi, P. R.; Blume, A. Langmuir 2001, 17, 3844.(30) Mehrian, T.; de Keizer, A.; Korteweg, A. J.; Lyklema, J. Colloids
Surf. A: Physicochem. Eng. Asp. 1993, 71, 255.(31) Nusselder, J. J. H.; Engberts, J. B. F. N. J. Colloid Interface Sci.
1992, 148, 353.(32) Kresheck, G. C. J. Phys. Chem. B 2009, 113, 6732.(33) Lah, J.; Be�ster-Roga�c, M.; Perger, T.-N.; Vesnaver, G. J. Phys.
Chem. B 2006, 110, 23279.(34) Chevallet, M.; Sabtoni, V.; Poinas, A.; Rouqui�e, D.; Fuchs, A.;
Kieffer, S.; Rossignol, M.; Lunardi, J.; Garin, J.; Rabilloud, T. Electro-phoresis 1998, 19, 1901.
(35) Henningsen, R.; Gale, B. L.; Straub, K. M.; De Nagel, D. C.Proteomics 2002, 2, 1479.
(36) Luche, L.; Santoni, V.; Rabilloud, T. Proteomics 2003, 3, 249.(37) Dias, R. S.; Svingen, R.; Gustavsson, B.; Lindman, B.; Miguel,
M. G.; Åkerman, B. Electrophoresis 2005, 26, 2908.(38) Wiseman, T.; Williston, S.; Brandts, J. F.; Lin, L.-N. Anal.
Biochem. 1989, 179, 131.(39) Piotto, M.; Saudek, V.; Sklenar, V. J. Biomol. NMR 1992, 2, 661.(40) Bax, A.; Davis, D. G. J. Magn. Reson. 1985, 65, 355.(41) Bain, A. D.; Burton, I. W. Concepts Magn. Reson. 1996, 8, 191.(42) Marion, D.;Wuthrich, K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983,
113, 967.
8256 dx.doi.org/10.1021/la1037525 |Langmuir 2011, 27, 8248–8256
Langmuir ARTICLE
(43) Sklenar, V.; Piotto, M.; Leppik, R.; Saudek, V. J. Magn. Reson.,Ser. A 1993, 102, 241.(44) Sattler, M.; Maurer, M.; Schleucher, J.; Griesinger, C. J. Biomol.
NMR 1995, 5, 97.(45) Guinier, A.; Fournet, G. Small Angle Scattering of X-Rays; Wiley:
New York, 1955.(46) Svergun, D. I.; Feigin, L. A. Structure analysis by Small-angle
X-ray and Neutron Scattering; Plenum Press: New York, 1987.(47) Glatter, O.; Kratky, O. Small Angle X-ray Scattering; Academic
Press: San Diego, CA, 1982.(48) Marignan, J.; Basserau, P.; Delord, P. J. Phys. Chem. 1986, 90,
645.(49) Barbosa, L. R. S.; Caetano, W.; Itri, R.; Homem-De-Mello, P.;
Santiago, P. S.; Tabak, M. J. Phys. Chem. B 2006, 110, 13086.(50) Sinibaldi, R.; Ortore, M. G.; Mariani, P. J. Chem. Phys. 2007,
126, 235101.(51) Sinibaldi, R.; Ortore,M. G.;Mariani, P. Eur. Biophys. J. 2008, 37,
673.(52) Barbosa, L. R. S.; Ortore, M. G.; Spinozzi, F.; Mariani, P.;
Bernstorff, S.; Itri, R. Biophys. J. 2010, 98, 147.(53) Barbosa, L. R. S.; Rigos, C. F.; Yoneda, J. S.; Itri, R.; Ciancaglini,
P. J. Phys. Chemistry B 2010, 114, 11371.(54) Press, W. H.; Teukolsky, S. A.; Flannery, B. P. Numerical
Recipes. The Art of Scientific Computing; Cambridge University Press:Cambridge, U.K., 1994.(55) Tanford, C. J. Phys. Chem. 1972, 76, 3020.(56) Teixeira, C. V.; Itri, R.; Casallanovo, F.; Schreier, S. Biochim.
Biophys. Acta 2001, 93, 1510.(57) Weers, J. G.; Rathman, J. F.; Axe, F. U.; Crichlow, C. A.; Foland,
L. D.; Scheuing, D. R.; Zielske, A. G. Langmuir 1991, 7, 854.(58) Graciani, M. M.; Rodríguez, A. M.; Mu~noz, M.; Moy�a, M. L.
Langmuir 2005, 21, 7161.(59) Lumry, R.; Rajender, S. Biopolymers 1970, 9, 1125.(60) Sugihara, G.; Hisatomi, M. J. Colloid Interface Sci. 1999, 219, 31.(61) Gill, S. J.; Wadso, I. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1976, 73, 2955.(62) Priebe, J. P.; Satnami, M. L.; Tondo, D, W.; Souza, B, S.; Priebe,
J. M.;Micke, G. A.; Costa, A. C. O.; Fiedler, H. D.; Bunton, C. A.; Nome,F. J. Phys. Chem. B 2008, 112, 14373.(63) Ken A. Dill, K. A.; Stigter, D. Biochemistry 1988, 27, 3446.(64) Scherer, P. G.; Seelig, J. EMBO J. 1987, 10, 2915.(65) Sachs, J.N.; Nanda, H.; Petrache, H. I.; Woolfz, T. B. Biophys. J.
2004, 86, 187.(66) Caetano, W.; Barbosa, L. R. S.; Itri, R.; Tabak, M. J. Colloid
Interface Sci. 2003, 260, 414.
Curriculum Vitae Nome: Mariana Gama D’ Andrea Nascimento: 26/10/1981 Naturalidade: Rio de Janeiro Formação Acadêmica
Graduação em Ciências Biológicas - Bacharelado em Genética, pela Universidade Federal do Rio de Janeiro, agosto 2000 a agosto 2004.
Mestrado em Química Biológica, pelo Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, setembro de 2004 a setembro de 2006.
Doutorado em Química Biológica pelo Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, março de 2007 a novembro de 2012.
Publicações
D’Andrea, M. G.; Domingues, C. C.; Malheiros, S. V. P.; Neto, F. G.; Barbosa, L. R. S.; Itri, R.; Almeida, F. C. L.; Paula, E.; Bianconi, M. L. Thermodynamic and structural characterization of zwitterionic micelles of the membrane protein solubilizing amidosulfobetaine surfactants ASB-14 and ASB-16. Langmuir 27, 8248-8256, 2011.
Celej, M. S.; D’ Andrea, M.G.; Campana, P. T.; Fidelio, G.; Bianconi, M. L. Superactivity and conformational changes on α-chymotrypsin upon interfacial binding to CTABr micelles. Biochemical Journal 378, 1059-1066, 2004.
Orientação de Estudante
Daniele Maciel. Caracterização parcial da L-asparaginase de Escherichia coli. (Graduada em Enfermagem/UFRJ). Iniciação Científica – 2008 a 2010.
Joaquim Lelles. Ativação da α-quimotripsina por álcoois. (Graduado em Medicina/UFRJ). Iniciação Científica – 2004 a 2006.
Comunicação em Congresso
15 comunicações em congressos nacionais
7 comunicações em congressos internacionais