UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

CURSO DE GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BACHARELADO

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

Germinação e Estabelecimento in vitro de Crambe abyssinica Hochst

(Brassicaceae)

Renan Gabriel Gomes Júnior

ALEGRE-ES

Novembro/2011

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

CURSO DE GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BACHARELADO

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

Germinação e Estabelecimento in vitro de Crambe abyssinica Hochst (Brassicaceae)

Renan Gabriel Gomes Júnior

“Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao Centro de Ciências

Agrárias, Universidade Federal do Espírito

Santo, como exigência para obtenção do

título de Bacharel em Ciências Biológicas e

avaliação obrigatória da disciplina

Seminários de Graduação em Ciências

Biológicas.”

Orientadora: Profa. Dr

a. Andreia Barcelos Passos Lima

ALEGRE-ES

Novembro/2011

iii

iv

"(...) As palavras têm a capacidade de ferir um ser tão ferozmente quanto uma faca feriria. As

palavras têm a força de acalentar, tanto quanto um abraço faria; as palavras quando usadas

gentilmente podem tudo, e quando ferozmente ditas, também podem."

Nátaly Neri Napoli

“ A fé é a força da vida. Se o homem vive, é porque acredita em alguma coisa.”

Leon Tolstoi

Dedico aos meus pais, Renan e Rosangela

pelo apoio incondicional e

lições de vida.

v

AGRADECIMENTOS

À professora Doutora Andreia Barcelos Passos Lima, pela orientação, confiança e

ensinamentos durante esse período. Meu agradecimento especial;

Ao amigo Elias Terra Werner, peça fundamental na realização deste trabalho, que muito me

auxiliou e instruiu.

Aos meus pais por sempre apoiarem e, por muitas vezes, abrirem mão de seus sonhos para

que os meus fossem realizados;

A todos os amigos que fiz durante a graduação, todos contribuíram de alguma forma em

diferentes momentos, em especial à minha amiga e namorada Ingrid, pelo carinho,

compreensão e incentivos a mim dedicados;

Aos educadores desta instituição, os quais tive o prazer de conhecer, e que também

contribuíram com minha formação, especialmente ao Fábio Demolinari de Miranda, Nina

Cláudia Barbosa da Silva e Taís Cristina Bastos pelos diálogos que muito acrescentaram na

minha vida acadêmica e pessoal;

Agradeço

vi

RESUMO

Com os atuais incentivos para a busca de fontes de energias renováveis, o Crambe (Crambe

abyssinica Hochst) se destaca como mais uma das culturas potenciais para produção de

biodiesel pelo seu alto teor de óleo, pela mecanização durante a condução da cultura e pela

produção dos grãos não concorrer com a indústria alimentícia. Ferramentas da Cultura de

Tecidos podem auxiliar na produção homogênea e em larga escala desta cultura, oferecendo

subsídios à indústria e agricultura. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de diferentes

meios de cultivo, condições físicas dos frutos e condições de luminosidade na germinação e

estabelecimento in vitro de Crambe. O experimento foi conduzido em esquema de parcelas

sub-subdivididas, tendo nas parcelas as condições luminosas (presença ou ausência de luz),

nas subparcelas os meios de cultivo (MS, WPM e B5) e nas sub-subparcelas as condições

físicas do fruto (presença ou ausência de pericarpo), totalizando 12 tratamentos. Após a

desinfestação, os frutos, com e sem pericarpo, foram inoculadas nos meios MS, B5 e WPM,

na presença e ausência de luz, para avaliação dos seguintes parâmetros: Índice de velocidade

de germinação, porcentagem de germinação, porcentagem de plântulas normais, comprimento

de parte aérea e comprimento de raiz. A porcentagem de germinação foi maior nos meios

WPM e B5, com médias de 97,5% e 99,37% respectivamente. Os maiores valores de IVG

foram observados também nos meios WPM e B5, com média de 3,87, na ausência de luz em

frutos sem pericarpo. Nenhum dos fatores avaliados influenciou significativamente na

porcentagem de plântulas normais. O comprimento de parte aérea não foi influenciado pela

presença ou ausência de pericarpo e sim pela composição do meio de cultivo e condição

luminosa. Os meios WPM e B5 na ausência de luz apresentaram os maiores valores, 11,71 e

13,250 cm, respectivamente. O comprimento de raiz foi maior no meio MS e B5, com média

de 6,89 e 5,01, respectivamente, mas sem diferenças estatísticas entre si. Assim, para todos os

parâmetros avaliados o meio B5 se mostrou vantajoso em relação aos demais, utilizando-se

frutos sem pericarpo e na ausência de luz.

Palavras-chave: oleaginosa, biodiesel, meios de cultivo, condição de luminosidade.

vii

ABSTRACT

With the newest incentive to search for sources of renewable energy, Crambe (Crambe

abyssinica Hochst) stands out as more of as potential crop for biodiesel production because of

its high oil content, for mechanization of the culture and for the grains production not

compete with the food industry. Tools of Tissue Culture can assistant in homogeneous

production and in large scale culture, offering subsidies to industry and agriculture. The

objective of this study was to evaluate the effects of different culture media, physical

conditions of the fruits and light conditions on germination and in vitro establishment of

Crambe. The experiment was conducted in plots sub-subdivided scheme, in the plots the light

condition (presence or absence of light), in the subplots the media culture (MS, WPM an B5)

and the sub-subplots the physical condition of the fruit (presence or absence of pericarp),

totaling 12 treatments. After disinfection, the fruits, with and pericarp, were inoculated in MS,

B5 and WPM media, in presence and absence of light, to evaluate the following parameters:

speed of germinations index, germination percentage, normal seedlings percentage, length of

shoot and root length. The germination percentage was higher in WPM and b% media, with

averages of 97,5% and 99,37% respectively. The highest values of GSI was observed in the

WPM and B5 media, with average of 3,87 in absence of light in fruits without pericarp. None

of the factors evaluated significantly influenced in normal seedling percentage. The length of

shoot was not influenced by the presence or absence of pericarp, but the composition of the

culture media and light condition. The WPM and B5 media in absence of light showed the

highest values, 11,71 and 12,25cm, respectively. The root length was higher in MS e B5

media, with average of 6,89 and 5,01 respectively, but no statistical differences between them.

Thus, for all evaluated parameters, the B5 media proved advantageous over the others without

using fruit pericarp and in absence of light.

Keywords: oil plant, biodiesel, culture media, light condition

viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANA - Ácido-1-Naftaleno Acético

B5 – Meio de cultivo formulado por Gamborg et al., (1968)

Ca+2

– Cátion cálcio

cm – Centímetros

DIC – Delineamento inteiramente casualizado

g/L-1

– Gramas por litro

H+

- Cátion hidrogênio

ha – Hectares

IVG – Índice de velocidade de germinação

ml - mililitros

MS – Meio de cultivo formulado por Murashige & Skoog (1961)

NH4+ - Cátion amônio

NO3- - Ânion nitrato

pH – Potencial de hidrogênio

t – Toneladas

WPM – “Woody Plant Medium” Meio de cultivo formulado por Lloyd e McCown (1981)

°C – Graus Celsius

ix

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Características das principais oleaginosas do Brasil......................................4

TABELA 2 – Resumo da análise da variância demonstrando a significância do teste F para

porcentagem de plântulas normais (PN), porcentagem de germinação (%G),

índice de velocidade de germinação (IVG), comprimento de parte aérea (PA)

e comprimento de raiz (CR) de Crambe (C. abyssinica)................................10

TABELA 3 – Porcentagem de germinação de frutos de Crambe (C. abyssinica) em

diferentes meios de cultivo, dez dias após inoculação....................................11

TABELA 4 – Índice de velocidade de germinação (IVG) de plântulas de C. abyssinica em

diferentes condições luminosas, após oito dias de

avaliação..........................................................................................................12

TABELA 5 – Índice de velocidade de germinação (IVG) de plântulas de C. abyssinica em

diferentes meios de cultivo e condições físicas, após oito dias de

avaliação..........................................................................................................13

TABELA 6 – Comprimento de parte aérea (cm) de C. abyssinica em diferentes meios de

cultivo e condições luminosas.........................................................................14

TABELA 7 – Comprimento de parte aérea (cm) de plântulas de C. abyssinica em diferentes

meios de cultivo e condições físicas...............................................................15

TABELA 8 - Comprimento de raiz (cm) de plântulas de C. abyssinica em diferentes meios

de cultivo e condições físicas..........................................................................16

x

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – A espécie C. abyssinica. A- Plântula adulta; B- Frutos imaturos e flores;

C- Frutos maduros.............................................................................................3

FIGURA 2 – Estiolamento de plântulas de Crambe (C. abyssinica). As sementes com

pericarpo foram germinadas em meio MS e na ausência de luz.....................15

xi

LISTA DE ANEXOS

ANEXO A – Composição do meio de cultivo MS (MURASHIGE e SKOOG, 1961)............24

ANEXO B – Composição do meio de cultivo “Woddy Plant Medium” – WPM (LLOYD e

MC COWN, 1981)............................................................................................25

ANEXO C – Composição do meio de cultivo B5 (GAMBORG et al., 1968)..........................26

xii

SÚMÁRIO

1. - INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1

2. - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 2

2.1 – Descrição da espécie ............................................................................................ 2

2.2 – Aspectos importantes da cultura ........................................................................ 3

2.3 – Cultura de tecidos vegetais ................................................................................. 5

2.3.1 – Meios nutritivos, condições luminosas e de temperatura ........................... 6

3. - OBJETIVOS.................................................................................................................. 8

3.1 - Objetivo geral: ..................................................................................................... 8

3.2 - Objetivos específicos: ........................................................................................... 8

4. - MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 8

5. - RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 9

6. – CONCLUSÃO: ........................................................................................................... 17

7. – REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 18

8. - ANEXOS...................................................................................................................... 24

1

1. - INTRODUÇÃO

O Crambe (Crambe abyssinica Hochst) é uma espécie pertencente à família Brassicaceae,

originária da região mediterrânea, sudoeste e central da Ásia e América do Norte ocidental

(JUDD et al., 2009). É uma planta herbácea anual de crescimento e produção em ciclo curto,

variando entre 90 a 100 dias, produz um grande número de sementes as quais possuem um

grande potencial para produzir cerca de 26% a 38% de teor de óleo em relação ao seu peso

(DESAI et al., 1997), além de conter cerca de 56% de ácido erúcico, um ácido graxo de cadeia

longa que tem alto valor industrial e farmacêutico (VARGAS-LOPES et al., 1999).

Por ser um vegetal robusto, consegue se desenvolver em condições climáticas antagônicas,

suportando desde geadas típicas do sul do país até climas quentes e secos como do centro-oeste

do país, se destacando como mais uma das culturas potenciais para produção de biodiesel

(MACHADO et al., 2007), não só pelo seu alto teor de óleo, mas por possibilitar a mecanização

durante a condução da cultura e produção em larga escala (MARTINS et al., 2010).

A cultura vem ganhando importância no Brasil devido a sua aptidão principalmente para a

produção de biodiesel e potencial para plantio entre os meses de abril e maio, caracterizando

safrinha na região centro-oeste (TEIXEIRA et al., 2011), consequentemente, surgem tecnologias

a fim de aumentar a produtividade da espécie, sendo o melhoramento genético uma das

principais ferramentas aplicadas para esse fim.

Desta forma, a qualidade da semente e a emergência uniforme são de fundamental importância

para atingir uma elevada produtividade e a sustentabilidade econômica da cultura. Neste sentido,

o cultivo de tecidos vegetais se destaca por oferecer subsídios à indústria e agricultura, entre as

quais está à propagação de plantas em larga escala (micropropagação), técnica que permite a

obtenção de grande número de plantas em curto espaço de tempo, em reduzida área de

laboratório, e com qualidade fitossanitária (PAIVA; GOMES, 1995). Portanto, torna-se

necessário o desenvolvimento de pesquisas que possam auxiliar na germinação e

estabelecimento in vitro desta oleaginosa.

Os vários tipos de respostas morfogênicas in vitro apresentadas por diferentes espécies fazem

com que seja necessário o estabelecimento de condições padronizadas de cultivo para cada uma

2

delas e para seus genótipos e tipos de explantes. Portanto, a escolha adequada do meio nutritivo e

a padronização das condições de cultivo constituem etapas relevantes no processo de

estabelecimento in vitro da cultura (RADMAN et al., 2009).

2. - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 – Descrição da espécie

O Crambe (Crambe abyssinica Hochst) é uma espécie pertencente à família Brassicaceae,

composta por cerca de 350 gêneros e 3200 espécies (WATSON e DALLWITZ, 1992). A família

abrange plantas de grande importância para a alimentação humana e produção de óleos e

gorduras vegetais. As brassicáceas são cultivadas praticamente no mundo todo, sendo destaque o

gênero Brassica, que compreende o repolho, a couve, o nabo e a mostarda (SILVA, 2005).

O crambe é originário da região mediterrânea, região sudoeste e central da Ásia, além da

América do Norte ocidental (JUDD et al., 2009), se desenvolvendo em condições climáticas

antagônicas, suportando desde geadas típicas do sul do país até climas quentes e secos como do

centro-oeste do país (MACHADO et al., 2007.) Possui grande potencial para produzir cerca de

26% a 38% de teor de óleo, tem crescimento e produção em ciclo curto, variando entre 90 a 100

dias (VEDANA, 2007).

É uma planta herbácea anual, com aproximadamente um metro de altura (FIGURA 1A), cuja

haste ramifica-se próxima ao solo para formar trinta ou mais galhos, que novamente se

ramificam, formando galhos terciários (DESAI et al., 1997). As flores amarelas ou brancas,

localizadas nos longos cachos, produzem um grande número de sementes pequenas (FIGURA

1B). O fruto é uma síliqua, inicialmente verde, mas que se torna amarelo com a maturidade

(FIGURA 1C). Cada fruto contém uma única semente esférica, envolvida por uma estrutura

denominada pericarpo, de cor verde ou marrom esverdeado (DESAI et al., 1997).

3

A B

C

Figura 1 – A espécie C. abyssinica. A- Plântula adulta; B- Frutos imaturos e flores; C-

Frutos de Crambe. Fonte: BiodieselBR

As sementes de C. Abyssinica são ortodoxas, albuminosas, têm o eixo embrionário curvo, e

apresentam a plúmula protegida por uma fina cobertura mucilaginosa (ELLIS et al., 1985). O

tamanho da semente varia consideravelmente no diâmetro (0,8 a 2,6 mm), sendo influenciada

pelo número de sementes por planta, fertilidade do solo e chuva (DESAI et al., 1997).

2.2 – Aspectos importantes da cultura

A busca por fontes alternativas e renováveis de energia tornou-se uma constante no mundo,

devido à escassez e aos impactos ambientais gerados por fontes não renováveis, como o petróleo.

O biodiesel surge como uma alternativa em relação ao petróleo e seus derivados, já que sua

produção é obtida de fontes renováveis como plantas oleaginosas e gordura animal, reduzindo a

emissão de poluentes para a atmosfera (MAIA, 2009).

O Biodiesel é um biocombustível renovável, biodegradável e ambientalmente correto, sucessor

ao óleo diesel mineral, constituído de uma mistura de ésteres metílicos ou etílicos de ácidos

graxos, obtidos da reação de transesterificação de qualquer triglicerídeo com um álcool de cadeia

curta, metanol ou etanol (PARENTE 2005). Ele vem sendo utilizado em motores à combustão

interna com ignição por compressão ou, conforme regulamento para outro tipo de geração de

energia, que possa substituir parcial ou totalmente combustível de origem fóssil (BRASIL,

2005). Assim, existem amplas possibilidades de uso do biodiesel em transportes urbanos,

rodoviários, ferroviários e aquaviários de passageiros e cargas, geradores de energia, motores

estacionários, entre outros.

4

Na produção de biodiesel muitas empresas e órgãos estaduais e federais vêm priorizando a busca

por matérias-primas alternativas, contudo sempre avaliando seus atributos sob aspectos

agronômicos e tecnológicos, como o teor de óleo, a produtividade, o sistema produtivo e o ciclo

da cultura (JASPER et al., 2010). Existem no Brasil inúmeras espécies vegetais oleaginosas que

podem ser utilizadas para a produção do biodiesel, tais como mamona, soja, algodão, girassol,

dendê, amendoim, pinhão-manso, nabo forrageiro, crambe, entre outras.

A produção de biodiesel no Brasil encontra-se embasada em culturas anuais, do ciclo

primavera/verão, faltando alternativas para o outono/inverno que permita dar continuidade à

produção, além de realizar rotação de culturas. Para a obtenção de máxima eficiência da

capacidade produtiva do solo, o planejamento de rotação de culturas deve considerar, além das

espécies comerciais, aquelas destinadas à cobertura do solo, que produzam grandes quantidades

de biomassa, cultivadas quer em condição solteira, quer em consórcio com culturas comerciais

(EMBRAPA SOJA, 2004).

Assim, com os atuais incentivos para a busca de fontes renováveis, a cultura de C. Abyssinica,

antes, basicamente, destinada à produção de forragem, alternativa na rotação de culturas e

cobertura de solos para o plantio direto, surge com um grande potencial para a produção de

matéria-prima visando a extração de óleo vegetal (RUAS et al. 2010), em virtude da sua

superioridade sob vários aspectos em relação à soja (NEVES et al., 2007), e as demais

oleaginosas com potencial para a produção de biodiesel (TABELA 1).

Tabela 1 – Características das principais oleaginosas cultivadas no Brasil.

Espécie Nome científico Origem

do óleo

Teor de

óleo (%)

Meses de

colheita por ano

Rendimento

(t óleo.ha-1

)

Dendê Elaeis guineenses L. Amêndoa 22 12 3 – 6

Côco Cocos nucifera L. Fruto 55 – 60 12 1,3 – 1,9

Babaçu Orbignya phalerata Mart. Amêndoa 66 12 0,1 – 0,3

Girassol Helianthus annuus L. Grão 38 – 48 3 0,5 – 1,9

Canola Brassica napus L. Grão 40 – 48 3 0,5 – 1,9

Mamona Ricinus communis L. Grão 45 – 50 3 0,5 – 1,9

Amendoim Arachis hypogaea L. Grão 40 – 43 3 0,6 – 0,8

Soja Glicine Max (L.) Merril Grão 18 3 0,2 – 0,4

Algodão Gossypium hirsutum L. Grão 15 3 0,1 – 0,2

Crambe Crambe abyssinica Hochst Grão 26 - 38 3 0,5 – 0,8

Fonte: Brasil, 2005 modificado.

5

Jasper et al., (2010) apontaram uma produtividade de 1.507,05 quilos por hectare, acima do

potencial produtivo de 1.000 a 1.500 quilos por hectare, informado no catálogo da Fundação MS

em 2007, detentora da cultivar FMS brilhante.

Esta oleaginosa tem despertado interesse dos produtores de soja, porque todo seu cultivo é

mecanizado, utilizando os mesmos equipamentos já existentes para grãos miúdos, e

principalmente, por ser uma cultura de inverno (mais uma alternativa para a safrinha), plantada

após a colheita da soja em março/abril e ter baixo custo de produção. A extração do óleo pode

ser feita de forma mecânica, com extrusora e prensa e, por ser uma cultura mecanizada poderá

ser produzida em grande escala e rapidamente, sem grandes investimentos por parte dos

produtores rurais (VEDANA, 2007).

A espécie C. abyssinica produz um óleo semelhante ao diesel extraído do petróleo, o que a torna

um forte candidato a integrar o grupo de plantas oleaginosas que irá fazer parte de programas

mundiais de energias renováveis. Outro aspecto importante da cultura é o fato do fruto conter

cerca de 56% de ácido erúcico, um ácido graxo de cadeia longa que tem alto valor industrial e

farmacêutico (VARGAS-LOPES et al., 1999). Por este motivo, o crambe é utilizado para

fabricação de produtos químicos intermediários que, posteriormente, serão utilizados como

insumos na fabricação de sacos de plástico, cosméticos, produtos de higiene pessoal, entre

outros. O óleo de Crambe também é um lubrificante eficiente e mais biodegradável do que óleos

minerais (LEONARD, 1993; LAZZERI et al. 1997; WANG et al. 2000).

Devido à presença do ácido erúcico, que causa problemas à saúde humana (IICA, 2009), o óleo

de Crambe não é adequado para alimentação, o que é uma vantagem em relação às demais

oleaginosas cultivadas no Brasil, pois esta cultura fica destinada apenas para fins industriais. Em

contrapartida, a torta de Crambe contém aproximadamente 47% de proteína, podendo ser

aplicada na fabricação de ração animal (MASSOURA et al., 1998).

2.3 – Cultura de tecidos vegetais

As técnicas que envolvem a Cultura de tecidos vegetais consistem no cultivo in vitro de qualquer

parte de uma planta, denominada explante, sob condições assépticas, objetivando obter uma nova

planta idêntica à original (TORRES et al., 1998).

6

A Cultura de tecidos vegetais traz significativas contribuições para a agricultura e para a

indústria, oferecendo muitas aplicações importantes, entre as quais estão: produção de plantas

haplóides, micropropagação, obtenção de plantas livres de vírus (limpeza clonal), produção de

metabólitos secundários, conservação de germoplasma in vitro para a manutenção de bancos

genéticos, dentre outras (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1988). Entretanto, uma das mais

importantes aplicações comerciais do cultivo in vitro, tem sido a micropropagação (PAIVA;

GOMES, 1995).

A germinação de sementes in vitro é uma das técnicas que podem ser utilizadas para a produção

de mudas ou como ponto de partida para a obtenção de explantes sadios para posterior

repicagem, ou seja, a partir da germinação in vitro é possível alcançar altas taxas de

multiplicação, independente de condições climáticas, variações estacionais e de fatores bióticos,

tais como agentes polinizadores, dispersores ou patogênicos (ANDRADE et al., 2000). Além

disso, a germinação de sementes in vitro permite freqüentemente, uma maior germinabilidade

das sementes do que em viveiros, provavelmente porque as condições in vitro são mais

adequadas aos processos de germinação e desenvolvimento inicial da plântula (NOLETO e

SILVEIRA, 2004).

Desta forma, a qualidade da semente e a emergência uniforme são de fundamental importância

para atingir uma elevada produtividade e a sustentabilidade econômica da cultura. Neste sentido,

a cultura de tecidos vegetais se destaca por oferecer subsídios à indústria e agricultura, entre as

quais está a propagação de plantas em larga escala (micropropagação), técnica que permite a

obtenção de grande número de plantas em curto espaço de tempo, em reduzida área de

laboratório, e com qualidade fitossanitária (PAIVA; GOMES, 1995). Portanto, torna-se

necessário o desenvolvimento de pesquisas que possam auxiliar na germinação e

estabelecimento in vitro desta oleaginosa.

2.3.1 – Meios nutritivos, condições luminosas e de temperatura

O crescimento de plantas, órgãos, tecidos e células in vitro depende do desenvolvimento de

meios nutritivos padronizados, que contenham componentes essenciais como fontes de carbono e

nutrientes minerais; sendo que os fatores que limitam esse crescimento in vitro são similares

àqueles que o limitam in vivo (AMARAL, 2003). A função do meio nutritivo é fornecer as

substâncias essenciais para o crescimento e controlar, em parte, o padrão de desenvolvimento in

7

vitro. As mesmas vias bioquímicas e metabólicas básicas que funcionam nas plantas in situ são

conservadas em material vegetal in vitro. Por isso, os meios nutritivos se baseiam nas exigências

das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para atender as

necessidades específicas in vitro (CALDAS et al., 1998).

A lista dos minerais incluídos na maioria dos meios utilizados hoje foi definida por White (1951;

apud TORRES et al., 1998), que foi utilizado durante anos como o meio básico para a cultura de

uma grande variedade de tecidos de diferentes espécies. A partir de então, houve o aparecimento

de outros meios nutritivos, foi onde surgiram os meios MS (Murashige; Skoog, 1961; Anexo A),

cuja formulação foi desenvolvida, inicialmente, para tecido medular de Nicotiana tabacum, o

meio B5 (GAMBORG et al., 1968; Anexo C) e o meio WPM (“Woody Plant Medium”)

elaborado por Lloyd e McCown (1981; Anexo B), para a propagação de plantas lenhosas, dentre

vários outros utilizados atualmente.

Além dos fatores químicos, outros fatores também influenciam o desenvolvimento in vitro,

dentre eles incluem a luz e a temperatura. Em relação à temperatura, no que diz respeito às

culturas in vitro, essas diferenças são minimizadas, pois as condições experimentais são

padronizadas no laboratório. A uniformidade da temperatura dentro da sala de cultivo constitui

um dos princípios básicos da experimentação – o controle local -, que garante um tratamento

térmico semelhante ao do material dentro das unidades experimentais ou das parcelas durante a

experimentação, visando maior precisão (CID et al., 2010).

É preciso destacar também a influência da luminosidade, tanto para o processo germinativo,

quanto para desenvolvimento das plântulas. Há sementes que germinam somente após rápida

exposição à luz ou de um período amplo de exposição; outras em que a germinação é

desencadeada somente no escuro e ainda as sementes indiferentes à luz (VÁZQUEZ-YANES e

OROZCO-SEGÓVIA, 1991). Com relação ao desenvolvimento da plântula, a luz é um fator

fundamental, pois desencadeia alteração de concentrações endógenas de reguladores de

crescimento, atua na síntese de pigmentos, espessura de tecidos, bem como na diferenciação e

divisão celular (DIGNART, 2006).

Os vários tipos de respostas morfogênicas in vitro apresentadas por diferentes espécies fazem

com que seja necessário o estabelecimento de condições padronizadas de cultivo para cada uma

delas e para seus genótipos e tipos de explantes. Portanto, a escolha adequada do meio nutritivo e

8

a padronização das condições de cultivo constituem etapas relevantes no processo de

estabelecimento in vitro da cultura (RADMAN et al., 2009).

3. - OBJETIVOS

3.1 - Objetivo geral:

Desenvolver um protocolo para a germinação in vitro de sementes de C. abyssinica visando o

estabelecimento da cultura e posterior micropropagação.

3.2 - Objetivos específicos:

Avaliar o efeito da presença ou ausência de pericarpo do fruto sobre a germinação in vitro

e desenvolvimento das plântulas;

Testar o efeito de diferentes meios de cultivo (MS, B5 e WPM) sobre a germinação in

vitro e desenvolvimento das plântulas;

Analisar o efeito da luz e escuro sobre a germinação in vitro e desenvolvimento das

plântulas.

4. - MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Centro de Ciências

Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo. Foram utilizadas sementes de C. abyssinica

da cultivar FMS brilhante, safra de 2010, obtidas junto à Fundação MS, localizada em Maracajú-

MS.

O experimento foi conduzido em esquema de parcelas sub-subdivididas, tendo nas parcelas as

condições de luminosidade na sala de crescimento, nas subparcelas os meios de cultivo e nas

sub-subparcelas as condições físicas do fruto, em DIC com 4 repetições, sendo a repetição

constituída por um frasco por parcela com 10 sementes e 40 mL de meio, totalizando 40

sementes por tratamento.

Para os ensaios de germinação in vitro os frutos foram divididos em dois lotes com 210 frutos

cada, o primeiro representado por frutos com pericarpo intacto, sem danos mecânicos, enquanto

o segundo os frutos foram submetidos à retirada do pericarpo. A seguir, ambos foram

9

submetidos ao seguinte processo de desinfestação: inicialmente os frutos foram lavadas em água

corrente e detergente neutro comercial por 5 minutos, e em condições assépticas na capela de

fluxo laminar, foram imersas em álcool 70% (v/v) por 1 minuto seguido pela imersão em

hipoclorito comercial (2-2,5% de cloro ativo) por 7 minutos e posteriormente lavadas três vezes

com água destilada autoclavada.

Três meios de cultivo foram testados: MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), WPM (LLOYD;

MCCOWN 1980) e B5 (GAMBORG et al., 1968), todos suplementados com ágar (7 g.L⁻¹), pH

ajustado para 5,8±1 e autoclavados a 121°C por 20 minutos. As condições de cultivo da sala de

crescimento foram ajustadas para temperatura de 25 2 ºC, sendo as sementes submetidas a duas

condições de cultivo: claro e escuro, segundo o tratamento proposto.

Os parâmetros avaliados após 10 dias de inoculação das sementes foram: Porcentagem de

germinação (%G), porcentagem de plântulas normais, comprimento de parte aérea e

comprimento de raiz. O Índice de velocidade de germinação (IVG) foi avaliado diariamente,

através da fórmula de Maguire (1962): IVG= G1/N1 + G2/N2 + ... + Gn/Nn, onde: G1, G2, Gn =

número de plântulas germinadas na primeira, segunda, até a última contagem e N1, N2, Nn =

número de dias desde a primeira, segunda, até a última contagem.

Os dados de porcentagens foram transformados em arco-seno e os dados do IVG em

para fins de análise estatística, porém, os resultados foram apresentados através das

médias dos dados originais. Os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias

comparadas pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05), utilizando-se software Assistat versão 7.6 beta

(2011). (SILVA; AZEVEDO, 2009).

5. - RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na tabela 2 encontra-se o resumo da análise de variância e as estimativas dos coeficientes de

variação das variáveis analisadas. Não houve interação significativa para nenhum dos fatores

testados em relação à porcentagem de plântulas normais. Para a porcentagem de germinação

houve significância a 1% de probabilidade para os meios de cultivo testados. Para o IVG houve

interação significativa entre os meios de cultivo e condição física do fruto, além de significância

a 5% de probabilidade para as condições luminosas. Para o comprimento de parte aérea houve

interação significativa entre o meio de cultivo e condição física da semente e entre a condição

10

luminosa e o meio de cultivo. Para o comprimento de raiz, houve interação apenas entre a

condição luminosa e o meio de cultivo.

Tabela 2. Resumo da analise da variância demonstrando a significância do teste F para porcentagem de

plântulas normais (PN), porcentagem de germinação (%G), índice de velocidade de germinação (IVG),

comprimento de parte aérea (PA) e comprimento de raiz (CR) de crambe.

Fonte de variação Grau de

liberdade PN %G IVG PA CR

Condição luminosa (A) 1 0,8299ns

0,1621ns

6,0473* 28,7506** 1,3801ns

Meio de cultivo (B) 2 3,4210ns

28,6901** 33,8801** 51,5460** 8,8194*

Condição física (C) 1 0,0741ns

3,3744ns

18,0013** 1,6182ns

3,1931ns

A:B 2 0,6315ns

0,8888ns

2,1889ns

7,9229** 0,0511**

A:C 1 0,5168ns

1,1372ns

1,3363ns

1,2014ns

0,5429ns

B:C 2 2,5541ns

3,2702ns

4,4086* 0,0144* 1,1639ns

A:B:C 2 0,0741ns

0,2202ns

0,0773ns

0,7601ns

1,6447ns

Resíduo 18 - - - - -

CV (%) - 1,38375 1,39771 3,59479 9,18542 5,16458

**, * significativos a 0,01 e 0,05 de probabilidade, respectivamente; CV(%): coeficiente de variação.

Na Tabela 3 encontram-se os resultados relativos à porcentagem de germinação em função dos

diferentes meios de cultivo testados. O processo de germinação in vitro das sementes de C.

abyssinica teve início logo no primeiro dia após a inoculação, com a protrusão da radícula. Foi

observado que os três meios de cultivo (MS, B5 e WPM) promoveram a germinação de sementes

de Crambe de forma satisfatória, sendo os melhores resultados observados no meio WPM e B5,

sem diferença estatística entre si.

11

Tabela 3. Porcentagem de germinação de frutos de C.

abyssinica em diferentes meios de cultivo, dez dias após

inoculação.

Meio de cultivo Médias (%)

MS 76.87 b

WPM 97.50 a

B5 99.37 a Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si

pelo teste de Tukey a 5%.

Barros et al., (2009) avaliando a porcentagem de germinação em casa de vegetação observaram

que a remoção do pericarpo do fruto de Crambe não influenciou a germinação, sendo os

resultados similares aos obtidos com sementes intactas (80% e 82% respectivamente).

Entretanto, Ruas et al., (2010) avaliando a embebição e germinação de Crambe acondicionadas

em papel toalha, verificaram que o pericarpo afetou significativamente a germinação das

sementes, atingindo a porcentagem de 89,71% em sementes sem pericarpo contra 43,71% na

ausência deste.

Apesar do meio MS ser amplamente utilizado para a germinação de sementes de várias famílias

de espécies de oleaginosas (COSTA et al., 2010; ROCHA et al., 2003; FURTADO, 2007), sabe-

se que este meio possui alta concentração de sais em sua composição, e a maior concentração de

sacarose em relação aos demais meios de cultivo testados, tais como o WPM e B5, o que leva ao

aumento de íons na solução e, consequentemente, o aumento do potencial osmótico

(KERBAUY, 2008). A elevada concentração de sais no meio MS pode ter impedido a absorção

de água pelas sementes, refletindo nas menores médias obtidas em relação ao percentual

germinativo. Assim, os meios B5 e WPM proporcionaram condições mais adequadas à

germinação das sementes possivelmente devido ao seu baixo potencial osmótico. Os meios de

cultivo utilizados também possuem em suas formulações diferentes macro e micro nutrientes que

também podem ter favorecido a germinação das sementes de Crambe.

Na tabela 4 encontram-se os valores para o IVG em função das condições luminosas. Na

ausência de luz nota-se maior valor de IVG (13,65) em relação á condição de claro (12,07).

12

Tabela 4. Índice de velocidade de germinação (IVG) de plântulas de C. Abyssinica Hochst em

diferentes condições luminosas, após oito dias de

avaliação.

Condição luminosa Médias

Presença de Luz 12,07 b

Ausência de luz 13,65 a

Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Contrário aos resultados obtidos nesse trabalho, Martins, Costa e Lopes (2010) estudando a

influencia da luz na germinação de sementes de C. abyssinica em BOD sob temperatura

constante de 25°C, constataram que o IVG das sementes germinadas na presença de luz foi

maior (5,14) que na ausência desta (1,57), e ressaltam ainda que mesmo na ausência de luz, há a

mobilização das reservas energéticas e a ocorrência do processo germinativo, no entanto, este

processo é fracionado em função do tempo.

Guimarães et al., 2010 testando a influência da luz na germinação em papel toalha de sementes

de Thlaspi caerulescens, uma Brassicácea, concluíram que houve diferença significativa entre as

condições luminosas, sendo que houve aumento do IVG na presença de luz, no entanto, assim

como no presente estudo, não se restringiu a essa condição. Ferreira e Ranal (1999) e Ellis et al.,

1989, estudando espécies dessa mesma família, sob as mesmas condições, também

demonstraram que durante a germinação, as sementes de brássicas foram indiferentes à luz.

Na tabela 5 encontram-se os valores de IVG em função do meio de cultivo testado e as condições

físicas da semente. Podemos notar que para os meios WPM e B5 não houve interação entre os

meios e as condições físicas do fruto, sendo os valores estatisticamente iguais entre si. Para o

meio MS, houve diferença significativa entre as condições físicas do fruto, sendo observado nas

sementes em meio MS com pericarpo um menor valor em relação aos demais (6,08).

13

Tabela 5. Índice de velocidade de germinação (IVG) de plântulas de C. Abyssinica em diferentes meios de cultivo e condições físicas, após oito dias

de avaliação

Meio de cultivo Condição física

Com pericarpo Sem pericarpo

MS 6,08 bB 12,87 aA

WPM 13,23 aA 16,09 aA

B5 13,61 aA 15,29 aA

Médias seguidas pela mesma letra, minúsculas na coluna ou maiúsculas na

linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Neves et al., (2007) estudando a qualidade fisiológica de sementes de Crambe semeadas em

papel toalha, evidenciaram a inferioridade do IVG em frutos com pericarpo em relação aos em

pericarpo, mostrando valores próximos de 6,3 e 2,2, respectivamente.

Ruas et al., (2010) afirmam que os frutos de Crambe possuem capacidade de absorção de água

mesmo quando envolvidas pelo seu pericarpo, apesar disso o referido trabalho concluiu que o

pericarpo que envolve fruto de Crambe oferece algum tipo de resistência à emissão da radícula

durante o processo de germinação, consequentemente, a relação entre o número de sementes

germinadas por dia foi menor, tal como observado nos resultados para os frutos nessa condição

física independente do meio de cultivo.

Assim como a porcentagem de germinação foi menor no meio de cultivo MS, em função da

maior concentração dos íons (TABELA 3), conseqüentemente, esperava-se que o número de

sementes germinadas em função do tempo também fosse, tal como apresentado. Somando-se

ainda o fato do pericarpo oferecer algum tipo de resistência à emissão da radícula e a germinação

(RUAS et al., 2010), possivelmente estes fatores possam ter justificado a diferença estatística

observada para esse meio de cultivo em função da condição física.

Em relação à variável comprimento de parte aérea, podemos observar na tabela 6 que,

independente do meio de cultivo testado, os maiores valores foram obtidos na condição de

escuro. As maiores médias foram observadas nos meios B5 e WPM na ausência de luz (13,250 e

11,712 cm, respectivamente). Para o meio MS a condição luminosa não influenciou esta

variável.

14

Tabela 6. Comprimento de parte aérea (cm) de C. abyssinica em diferentes meios de

cultivo e condições luminosas.

Meio de cultivo Condição luminosa

Presença de luz Ausência de luz

MS 6.0000 bA 6.9125 bA

WPM 8.6370 aB 11.712 aA

B5 8.6000 aB 13.250 aA

Médias seguidas pela mesma letra, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Martins, Costa e Lopes (2005), germinando sementes de Crambe em recipientes do tipo gerbox,

em ausência ou presença de luz e sob temperatura constante de 25°C, encontraram resultados

contrários aos obtidos no presente trabalho, onde as plântulas germinadas na luz apresentaram

maiores tamanhos de parte aérea (8,61 cm) em relação àquelas do escuro (7,10 cm).

Em todos os tratamentos realizados no escuro foram obtidas plântulas que apresentavam fenótipo

de plantas estioladas, com hipocótilos esbranquiçados e com aspecto translúcido (FIGURA 2). A

ocorrência destas características é comum em plantas mantidas no escuro por determinado tempo

como sendo produto da inibição do desenvolvimento de cloroplastos e redução nos conteúdos de

pigmentos fotossintéticos. Quando colocadas em presença de luz, as plantas retomam a expansão

e o seu desenvolvimento normal (TAIZ; ZEIGER 2004; RAVEN; EVERT e EICHHORN,

2007).

A alta concentração de NH4+ e NO3

- presentes na formulação do meio MS, provavelmente pode

ter inibido o desenvolvimento das plântulas de Crambe (KRIKORIAN, 1991). Esse retardo no

desenvolvimento reflete no tamanho reduzido da parte aérea comparada aos demais meios de

cultivo. Segundo Sakuta et al., (1987), altas concentrações de NH4+ e NO3

- podem ser críticas no

processo de morfogênese e crescimento dos explantes. Essa tendência, provavelmente, indicaria

que, para a variável comprimento de parte aérea, uma menor relação NH4+/NO3

- seria necessária

para obter melhores resultados.

15

Figura 2 – Estiolamento de plântulas de Crambe. As sementes com pericarpo foram germinadas em meio MS e na ausência de luz.

A presença ou ausência do pericarpo dos frutos não influenciou o comprimento da parte aérea

das plântulas nos três meios de cultivo (Tabela 7). As maiores médias foram encontradas nos

meios B5 e WPM (10,562 cm e 9,812 cm, respectivamente), sendo os tratamentos

estatisticamente iguais entre si e superiores em relação ao meio MS.

Tabela 7. Comprimento de parte aérea (cm) de plântulas de C. abyssinica

em diferentes meios de cultivo e condições físicas da semente.

Meio de cultivo Condição física

Com pericarpo Sem pericarpo

MS 6.7250 bA 6.1870 bA

WPM 10.537 aA 9.8120 aA

B5 11.287 aA 10.562 aA

Médias seguidas pela mesma letra, minúsculas na coluna e maiúsculas na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Resultados semelhantes foram encontrados por Barros et al., (2009) avaliando tratamentos para a

superação de dormência de sementes de Crambe em casa de vegetação. Os autores verificaram

que as plântulas germinadas em campo, independente da condição física dos frutos apresentaram

valores de comprimento de parte aérea numericamente iguais (4,55 cm).

16

A Tabela 8 apresenta os valores médios para o comprimento de raiz. Pode ser observado que o

meio MS proporcionou os maiores valores para esta variável, não deferindo estatisticamente do

meio B5 (6,893 cm e 5,018 cm, respectivamente). Os menores comprimentos foram observados

no meio WPM (3,581cm) que também não diferiu estatisticamente do B5.

Tabela 8. Comprimento de raiz (cm) de plântulas

de C. abyssinica em diferentes meios de cultivo e

condições físicas da sementes.

Meio de cultivo Médias

MS 6.893 a

WPM 3.581 b

B5 5.018 ab Médias seguidas pela mesma letra não diferem

entre si pelo teste de Tukey a 5%.

As diferenças encontradas nos meios MS e WPM podem estar relacionadas com a concentração

de sais entre eles. O meio MS apresenta quatro vezes mais íons nitrato e amônio que o meio

WMP (PASQUAL, 2001), sendo que esses íons, segundo Poddar et al., (1997) e Mercier e

Kerbauy (1998) influenciam no aumento dos níveis endógenos hormonais, tais como o ANA;

provavelmente isso poderia ter favorecido o desenvolvimento de raiz.

Outro fator que poderia ter influenciado os resultados seria o cálcio. Segundo Takane (2002) e

Tais (2004), este elemento é essencial no desenvolvimento radicular. A liberação de H+ induzida

pela auxina durante o desenvolvimento da plântula ocorre pela troca de Ca+2

por H+. Com isso,

ocorre uma diminuição do pH da parede celular, que se torna menos rígida, aumentando sua

plasticidade, possibilitando o processo de alongamento da célula (RAYLE e CLELAND, 1992).

Outro constituinte dos meios de cultivo que pode ter influenciado nos resultados, mas não

isoladamente, é a sacarose, uma vez que o meio MS contém maior concentração de sacarose

(30g/L-1

), consequentemente, o crescimento da raiz foi maior quando comparado aos demais

meios de cultivo, onde a concentração de sacarose foi de 20g/L-1

.Vários trabalhos relatam que a

presença deste carboidrato é essencial para o enraizamento in vitro de muitas espécies

(GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1990; GEORGE e SHERRINGTON, 1984;

SRISKANDARAJAH e MULLINS, 1981).

17

6. – CONCLUSÃO:

A porcentagem de germinação foi maior nos meios WPM e B5, com médias de 97,5% e 99,37%

respectivamente. Os maiores valores de IVG foram observados também nos meios WPM e B5,

com média de 3,87, na ausência de luz em frutos sem pericarpo. Nenhum dos fatores avaliados

influenciou significativamente na porcentagem de plântulas normais. O comprimento de parte

aérea não foi influenciado pela presença ou ausência de pericarpo e sim pela composição do

meio de cultivo e condição luminosa, onde os meios WPM e B5 na ausência de luz apresentaram

os maiores valores, 11,71 e 13,250 cm, respectivamente. O comprimento de raiz foi maior no

meio MS e B5, com média de 6,89 e 5,01 cm, respectivamente, mas sem diferenças estatísticas

entre si. Logo, conclui-se que, para todos os parâmetros avaliados o meio B5 se mostrou

vantajoso em relação aos demais, utilizando-se frutos sem pericarpo e na ausência de luz.

18

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24

8. - ANEXOS

Anexo A. Composição do meio de cultivo MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962).

Componentes Concentração (mg/L⁻¹)

Macronutrientes

NH4NO3 1650,0

KNO3 1900,0

CaCl2.2 H2O 440,0

MgSO4.7 H2O 370,0

KH2PO4 170,0

Micronutrientes

MnSO4.4H2O 22,3

ZnSO4.7H2O

KI

8,6

0,83

H3BO3

Na2MoO4.2H2O

CoCl2.6H2O

CuSO4.5H2O

6,2

0,25

0,025

0,025

FeEDTA

Na2EDTA.2 H2O

FeSO4.7H2O

37,3

27,8

Vitaminas

Ácido Nicotínico

Piridoxina.HCl

Tiamina.HCl

Glicina

0,5

0,5

0,5

2,0

Mio-inositol 100,0

Sacarose 30,0

25

Anexo B. Composição do meio de cultivo WPM (Lloyd & McCown 1980).

Componentes Concentração (mg/L⁻¹)

Macronutrientes

NH4NO3 400,0

CaCl2.2H2O 96,0

MgSO4.7H2O 370,0

KH2PO4

Ca(NO3)2. 4H2O

K2SO4

170,0

556,0

990,0

Micronutrientes

MnSO4.4H2O 22,4

ZnSO4.7H2O 8,6

H3BO3

Na2MoO4.2H2O

CuSO4.5H2O

6,2

0,25

0,25

FeEDTA

Na2EDTA.2 H2O

FeSO4.7H2O

37,3

27,8

Vitaminas

Ácido Nicotínico 0,5

Piridoxina.HCl 0,5

Tiamina.HCl 1,0

Glicina 2,0

Sacarose 20

Mio-inositou 100,0

26

Anexo C. Composição do meio de cultivo B5 (GAMBORG et al., 1968).

Componentes Concentração (mg/L⁻¹)

Macronutrientes

(NH4) SO4

NaH2PO4.H2O

KNO3

134,0

150,0

2,5

CaCl2.2H2O 150,0

MgSO4.7H2O 250,0

Micronutrientes

MnSO4.H2O 10,0

ZnSO4.7H2O 2,0

H3BO3

Na2MoO4.2H2O

KI

CuSO4.5H2O

CoCl2.6H2O

3,0

0,25

0,75

0,025

0,025

Vitaminas

FeSO4.7H2O

Na2EDTA.2H2O

27,8

37,3

Vitaminas

Ácido Nicotínico

Piridoxina.HCl

Tiamina.HCl

1,0

1,0

1,0

Sacarose 20,0

Mio-inositou 100,0