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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
ALINE GONZAGA CUNHA
ATIVIDADE DE ENZIMAS DA VIA DE SÍNTESE DOS FENÓLICOS DURANTE O
DESENVOLVIMENTO DE PEDÚNCULOS DE CLONES DE CAJUEIRO
(Anacardium occidentale L.)
FORTALEZA
2015
ALINE GONZAGA CUNHA
ATIVIDADE DE ENZIMAS DA VIA DE SÍNTESE DOS FENÓLICOS DURANTE O
DESENVOLVIMENTO DE PEDÚNCULOS DE CLONES DE CAJUEIRO
(Anacardium occidentale L.)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientadora: Prof.ª Dra. Maria Raquel
Alcântara de Miranda.
Coorientador: Prof. Dr. Edy Sousa de Brito.
FORTALEZA
2015
A Deus;
A meu marido, Edson Correia;
A meus pais, Dilza e Aguinézio.
AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal do Ceará (UFC) pela minha formação, em particular ao
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudo.
A Secretária de Educação do Estado do Ceará (Seduc) pela licença de afastamento
concedida para a conclusão deste trabalho.
Aos meus familiares representados pelos meus pais Aguinézio Raimundo da Cunha e
Maria Gonzaga Cunha e meu marido Edson Correia Lima Neto.
A minha orientadora Dra. Maria Raquel de Alcântara Miranda, pela valiosa
orientação, pelos conhecimentos e ensinamentos.
A meu coorientador Dr. Edy Sousa de Brito pelo exemplo de competência e por sua
serenidade durante minhas pesquisas realizadas no Laboratório Multiusuário de Química de
Produtos Naturais na Embrapa.
Ao pesquisador da Embrapa Dr. Carlos Farley Herbster de Moura por me fornecer os
cajus utilizados no experimento e por seu exemplo de extrema dedicação ao trabalho de
campo em Pacajus.
Ao Dr. Jesús Fernando Ayala Zavala pela valiosa colaboração em participar dessa
banca examinadora.
Aos meus colegas do Laboratório de Fisiologia Vegetal e Bioquímica de Frutos da
UFC.
Aos analistas da Embrapa; Lorena Mara Alexandre e Silva e Paulo Riceli Vasconcelos
Ribeiro e a técnica Tigressa Helena Soares Rodrigues.
RESUMO
O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma planta tropical, originária do Brasil, que se
destaca como espécie frutífera com elevada potencialidade para o consumo in natura e para o
processamento industrial. Com a descoberta de compostos bioativos presentes nos
pedúnculos, se fazem necessários estudos da atividade de enzimas da síntese dos compostos
fenólicos, tais como a fenilalanina amônia liase (PAL), UDP-glicose: trans-cinamato β-D-
glicosiltransferase (UGT), flavonol sintase (FLS) e leucoantocianidina redutase (LAR). Logo,
esse estudo objetivou determinar a atividade dessas enzimas, em pseudofrutos de cajueiro-
anão-precoce dos clones CCP 76 e BRS 189 em três diferentes estádios de maturação, além
de estabelecer o perfil de fenólicos nestes referidos estádios. Os produtos resultantes das
reações enzimáticas foram identificados e quantificados por LC-DAD. A atividade da PAL
decresce com o amadurecimento dos pseudofrutos. A enzima UGT no estádio 4 do clone CCP
76 apresentou a maior atividade enzimática específica que nos outros estádios de
desenvolvimento para o referido clone. Enquanto no clone BRS 189, a maior atividade
deteve-se no caju maduro. A maior síntese de quercetina no caju foi evidenciada no estádio 4
para os dois clones estudados. As enzimas envolvidas no metabolismo de fenólicos se
comportam diferentemente, demonstrando a complexidade dessa rota biossintética que varia
entre os clones e durante o desenvolvimento dos pedúnculos de cajueiro. Estudos posteriores,
com CLAE acoplada a espectrômetro de massa, irão elucidar melhor o perfil dos compostos
presentes em cajus liofilizados para caraterização química destes em diferentes estádios de
maturação. Portanto, o entendimento do metabolismo enzimático entre os clones e durante o
desenvolvimento do pedúnculo representam um potencial real para o desenvolvimento de
novos produtos com propriedades funcionais e promoção da saúde humana.
Palavras-chave: compostos fenólicos, PAL, UGT, FLS, LAR, estádios de maturação e
cromatografia líquida.
ABSTRACT
The dwarf cashew apple (Anacardium occidentale L.) is a tropical plant, originated in Brazil,
which is fruit species with high potential for fresh consumption and for industrial processing.
With the discovery of bioactive compounds in the cashew apple are necessary studies of the
activity of enzymes of the synthesis of phenolic compounds, such as phenylalanine ammonia
lyase (PAL), UDP-glucose: trans-cinnamate β-D-glycosyltransferase (UGT), flavonol
synthase (FLS) and leucoanthocyanidin reductase (LAR). Soon, this study aimed to determine
the activity of these enzymes in CCP 76 and BRS 189 dwarf cashew clones in three different
stages of maturation, and to establish the phenolic profile in these stages. Reaction products
were identified and quantified by LC-DAD. PAL activity decreases with maturation for dwarf
cashew clones. UGT enzyme in the CCP 76 clone stage 4 showed the highest enzyme specific
activity than in other stages of development for that clone. Whereas BRS 189 clone, the
highest activity was in the mature cashew apple. Quercetin synthesis was evidenced in stage 4
for the two clones analyzed. The enzymes involved in the metabolism phenolic behave
differently, showing the complexity of this biosynthetic pathway that varies between clones
and during the development of cashew apple. Further studies, with mass spectrometer linked
HPLC, will elucidate the profile of the compounds present in cashews apple lyophilized for
chemical characterization of these in different stages of maturation. Therefore, the
understanding of the enzymatic metabolism between the clones and during cashew apple
development represent a real potential for the development of new products with functional
properties and promotion of human health.
Keywords: phenolic compounds, PAL, UGT, FLS, LAR, ripening stages and liquid
chromatography.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01- Visualização de caju (clone BRS 189) .................................................... 13
Figura 02 - Síntese de fenólicos simples por vias metabólicas catalisadas pelas
enzimas PAL, fenilalanina amônia liase; C4H, cinamato 4-hidroxilase e
CoAL, hidroxicinamato CoA ligase......................................................
16
Figura 03 - Via biossintética dos flavonóides e as enzimas responsáveis pela
catálise: fenilalanina amônia liase (PAL), UDP-glicose: trans-cinamato
β-D-glicosiltransferase (UGT), chalcona sintase (CHS), chalcona
isomerase (CHI), flavanona 3-hidroxilase (F3H), diidroflavonol-4-
redutase (DFR), flavonol sintase (FLS), antocianidina sintase (ANS),
antocianidina redutase (ANR) e leucoantocianidina redutase (LAR)........
17
Figura 04 - Estrutura geral dos flavonóides................................................................ 18
Figura 05 - Estrutura das principais classes de flavonóides, em que R1 e R2 indicam
os locais de possíveis substituições. OGly indica uma ligação
glicosídica...................................................................................................
19
Figura 06 - Reação catalisada pela PAL ...................................................................... 21
Figura 07 - Reação catalisada pela UDP-glicosiltransferase de morango FaGT2........ 23
Figura 08 - Reações da enzima flavonol sintase........................................................... 24
Figura 09 - Reação da leucoantocianidina redutase (LAR)......................................... 25
Figura 10 - Cajus dos clones BRS 189 (1, 2 e 3) e CCP76 (4, 5, 6) nos respectivos
estádios de desenvolvimento 2, 4 e 7; provenientes da Embrapa
Agroindústria Tropical...............................................................................
27
Figura 11 - Cromatogramas (254 nm) do produto da atividade enzimática da PAL
de cajus nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C) do clone do clone CCP76.........
33
Figura 12 - Cromatogramas (254 nm) do produto da atividade enzimática da PAL
de cajus nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C) do clone BRS 189....................
34
Figura 13 - Cromatogramas (254 nm) do produto da atividade enzimática da UGT
de cajus nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C) do clone do clone CCP 76........
36
Figura 14 - Cromatogramas (254 nm) do produto da atividade enzimática da UGT
de caju nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C) do clone do clone BRS 189.......
37
Figura 15 - Cromatogramas (370 nm) do produto da atividade enzimática da FLS de
cajus nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C) do clone do clone CCP 76............
39
Figura 16 - Cromatogramas (370 nm) do produto da atividade enzimática da FLS de
cajus nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C) do clone do clone BRS 189..........
40
Figura 17 - Perfil cromatográfico (356nm) dos flavonóides glicosilados de cajus do
clone CCP 76 nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C).........................................
42
Figura 18 - Perfil cromatográfico (356nm) dos flavonóides glicosilados de cajus do
clone BRS 189 nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C).......................................
43
LISTA DE TABELAS
Tabela 01- Atividades específicas de enzimas do metabolismo de compostos
fenólicos em pedúnculos de cajus dos clones CCP76 e BRS 189 em
diferentes estádios de maturação.
32
Tabela 02 - Dados sobre o perfil de flavonóides glicosilados durante o
desenvolvimento de pseudofrutos de dois clones de cajueiro, em
relação aos cromatogramas das Figuras 17 e 18.
.
45
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 11
2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 13
2.1 O cajueiro (Anacardium occidentale L.)......................................................................... 13
2.2 Compostos fenólicos......................................................................................................... 15
2.2.1 Estrutura e função dos fenólicos simples...................................................................... 15
2.2.2 Estrutura e função dos flavonóides .............................................................................. 16
2.3 Principais enzimas do metabolismo de fenólicos .......................................................... 20
3 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 27
3.1 Material ............................................................................................................................ 27
3.2 Métodos ............................................................................................................................ 27
3.2.1 Conteúdo de proteínas solúveis totais ........................................................................... 28
3.2.2 Atividade da fenilalanina amônia liase (PAL).............................................................. 28
3.2.3 Atividade da UDP-glicose: trans-cinamato β-D-glicosiltransferase (UGT)................ 29
3.2.4 Atividade da flavonol sintase ........................................................................................ 29
3.2.5 Atividade da leucoantocianidina redutase .................................................................... 30
3.2.6 Avaliação do perfil de fenólicos .................................................................................... 31
3.3 Delineamento experimental e análise estatística ........................................................... 31
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 32
4.1 Atividades das enzimas do metabolismo de fenólicos .................................................. 32
4.2 Perfil cromatográficos de fenólicos ............................................................................... 41
5 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 47
11
1 INTRODUÇÃO
O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma espécie pertencente à família
Anacardiaceae, nativa do Nordeste brasileiro onde seu cultivo apresenta grande importância
socioeconômica, principalmente devido à comercialização da castanha e em menor escala, do
pedúnculo ou caju (CARDOSO, 1999). As plantas, por serem organismos sésseis produzem
uma ampla classe de metabólitos de defesa chamados de secundários, que não participam
diretamente do metabolismo fotossintético ou respiratório, mas que são essenciais para
sobrevivência no meio ambiente (HARBORNE, 1980). Dentre esses metabólitos secundários,
estão os compostos fenólicos que vêm sendo progressivamente estudados em pedúnculos de
cajueiro, devido a sua abundância, variedade e relevância para a qualidade pós-colheita
(BRITO et al. 2007; MICHODJEHOUN-MESTRES, AMRAOUI, BRILLOUET, 2009).
O caju se apresenta como uma excelente fonte de fenólicos, todavia sua composição
físico-química pode ser modificada em função da variedade e do estádio de maturação
(SIMÕES et al. 2001). De modo que, Agostini-Costa et al. (2014) afirmaram que os
resultados observados em pesquisas até o momento, tornam-no um forte candidato para
acrescentar saúde, além de sabor na mesa tropical. Pois, fontes ricas em compostos fenólicos
são necessárias à manutenção da saúde humana como comprovado por estudos
epidemiológicos que demonstraram que a alta ingestão de frutos reduz a mortalidade por
doenças vasculares e cânceres, justificado principalmente pela atividade antioxidante presente
nesses produtos (MOURA et al. 2013).
Os fenólicos são produzidos por uma via metabólica originada inicialmente de
produtos do metabolismo primário como o aminoácido L-fenilalanina, e continuada,
subsequentemente por reações que vão dar origem a diversas classes de fenólicos, quer por
adição de novos grupos funcionais, quer por reações de polimerização.
Apesar de constar na literatura dados sobre a rota biossintética dos fenólicos, ainda
não há relatos sobre a atividade das enzimas responsáveis por essa rota em pedúnculos de
cajueiro e muito menos, ao longo dos diferentes estádios de maturação. Logo, esse estudo tem
a finalidade de revelar possíveis mudanças nas atividades das enzimas envolvidas com a
síntese de fenólicos ao longo da maturação dos pedúnculos, a fim de uma melhor
compreensão do metabolismo para a melhoria da qualidade pós-colheita e promoção da saúde
humana.
Portanto, serão quantificadas as atividades das enzimas fenilalanina amônia liase,
UDP-glicose: trans-cinamato β-D- glicosiltransferase, flavonol sintase e leucoantocianidina
12
redutase, além da avaliação do perfil de compostos fenólicos em diferentes estádios de
maturação de pedúnculos dos clones CCP76 e BRS189 de cajueiro anão-precoce.
13
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O cajueiro (Anacardium occidentale L.)
O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma planta tropical frutífera originária do
Brasil, que se destaca por sua potencialidade tanto para o consumo in natura como para o
processamento industrial (ABREU, 2007). O Brasil é o principal produtor mundial com
1.805.000 toneladas de pedúnculo (FAO, 2012) e a região Nordeste é responsável por mais de
95% dessa produção, sendo os estados de Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte e Bahia os
principais produtores (MONTENEGRO et al. 2003). O cultivo dessa espécie se difundiu
também para outros países da Ásia, América Central e África (LEITE; PAULA-PESSOA,
2002).
Botanicamente o cajueiro apresenta um pseudofruto, o caju, que suporta o fruto
verdadeiro do tipo aquênio; a castanha é seca e indeiscente (RAVEN, 2011) (Figura 1).
Apesar de a castanha representar 10% do peso total do caju, ela é o principal produto
explorado por esse cultivo, enquanto que grandes quantidades do pedúnculo ainda são
desperdiçadas no campo ou em pós-colheita, após a retirada da castanha (ALBUQUERQUE,
2011). Entre 2001 e 2009, a produção e a produtividade do cajueiro em termos de castanha
cresceram 78% e 50%, respectivamente, quando comparadas a outras culturas frutíferas
(MAPA, 2011).
Figura 1- Visualização de caju (clone BRS 189).
Fonte: Aline Gonzaga Cunha (2014).
Mesmo com grandes perdas no aproveitamento do pedúnculo do cajueiro, a sua
relevante exploração comercial deve-se aos inúmeros produtos obtidos; como sucos,
refrigerantes, cajuínas, doces, xaropes, néctares e bebidas alcoólicas. Todavia, o uso do
pedúnculo não se restringe à indústria alimentícia, mas também tem sido utilizado como
Aquênio
Pedúnculo
14
substrato para a fermentação e outros bioprocessos industriais. Rocha et al. (2014) utilizaram
bagaço de caju pré-tratado com ácido sulfúrico para a produção de etanol e xilitol por
leveduras. Fontes et al. (2013) produziram o açúcar manitol a partir do suco de caju,
utilizando bactérias e uma fonte exógena de sulfato de amônio.
O caju cresceu ainda mais em importância com o avanço nas descobertas sobre as
propriedades farmacológicas e o conteúdo de fitonutrientes, como suas atividades
antimicrobiana (KUBO; NIHEI; TSUJIMOTO, 2003), anti-mutagênica (CAVALCANTE et
al. 2005), inibitória da urease (KUBO et al. 1999) e inibitória da lipoxigenase (HA; KUBO,
2005). Vergara et al. (2010) avaliaram e concluíram que o suco de caju fermentado
apresentava um melhor efeito prebiótico, quando comparado com um meio de cultura
contendo somente glicose e frutose como fontes de carbono, destacando assim mais um
produto promissor para os consumidores.
Dentre os compostos bioativos do caju estão carotenóides, vitamina C e metais
segundo Melo-Cavalcante et al. (2003) e fenólicos como os flavonóides segundo Lopes et al.
(2012). Vários estudos vêm comprovando que dietas ricas em fitoquímicos como carotenóides
e fenólicos previnem certos tipos de câncer, doenças inflamatórias, cardiovasculares e neuro-
degenerativas como cataratas e degeneração macular (BUENO et al. 2012; SERGENT et al.
2010; SNYDER et al. 2011; TANAKA; SHNIMIZU; MORIWAKI, 2012).
Outros compostos fenólicos foram identificados no caju, como (MACHEIX;
FLEURIET; BILLOT, 1990; BRITO et al. 2007):
Ácidos fenólicos como p-hidroxibenzóico, protocatecuico e gálico;
Flavonóides agliconas como quercetina, miricetina, kaempferol, cloreto de
delfinidina, ramnetina e naringenina;
Flavonóides glicosilados como naringenina 7-(6”-p-coumaroilglucosídeo),
miricetina 3-(O-galactosídeo, O-glucosídeo, O-xilopiranosídeo, O-
arabinopiranosídeo, O-arabinofuranosídeo, O-ramnosídeo), quercetina 3-(O-
galactosídeo, O-glucosídeo, O-xilopiranosídeo, O-arabinopiranosídeo, O-
arabinofuranosídeo) e kaempferol 3-O-glucosídeo;
Taninos condensados.
Nesse pseudofruto, o conteúdo total de fenólicos diminuem ao longo do
desenvolvimento com valores de 95,54 para 64,01 no clone CCP 76 e de 116, 96 para 54,85
mg de equivalentes de ácido gálico (EAG)/100 g de massa fresca (MF) no clone BRS 189,
15
nos estádios 2 e 7, respectivamente. Quanto ao conteúdo de flavonóides amarelos, estes
aumentam com a maturação do pedúnculo com valores de 18,57 para 56,32 no clone CCP 76
e de 27, 65 para 50,75 mg de flavonóides/100 g de MF no clone BRS 189, nos estádios 2 e 7,
respectivamente (LOPES et al. 2012).
Brito et al. (2007) também destacam que o conteúdo total de flavonóides glicosilados
encontrados em caju maduro foram de 0,28 mg de flavonóides glicosilados/g de massa seca
(MS), sendo 0,15 mg/g MS de miricetina glicosilada, 0,11 mg/g MS de quercetina glicosilada
e 0,02 mg/g MS de antocianina.
2.2 Compostos fenólicos
As plantas produzem diversos metabólitos secundários que possuem um grupo fenol,
classificados como compostos fenólicos, sendo que os fenólicos vegetais constituem um
grupo bastante heterogêneo com aproximadamente 10.000 compostos. Estes são produzidos
por duas rotas metabólicas básicas, a rota do ácido malônico e a rota do ácido chiquímico.
Esta última rota resulta na biossíntese da maioria dos fenólicos vegetais, formando
aminoácidos aromáticos como a fenilalanina para originar os ácidos fenólicos simples e seus
derivados complexos (TAIZ; ZEIGER, 2013).
2.2.1 Estrutura e função dos fenólicos simples
Os compostos fenólicos simples ou fenilpropanóides contém um anel benzênico e uma
cadeia lateral de três átomos de carbono e resultam, inicialmente, da ação da enzima
fenilalanina amônia liase (do inglês fenilalanina amônia liase-PAL) com a formação do ácido
trans-cinâmico (TAIZ; ZEIGER, 2013). Reações subsequentes àquelas catalisadas pela PAL
formam outros fenólicos simples, são eles os derivados do ácido hidroxicinâmico p-cumárico,
tais como os ácidos caféico, ferúlico e sináptico, estes formados pela ação da cinamato 4-
hidroxilase (C4H), posteriormente à ação da hidroxicinamato CoA ligase (do inglês
hidroxicinamato CoA ligase-CoAL) gera o hidroxicinamoil-CoA 4-coumaril-CoA
(MACHEIX; FLEURIET; BILLOT, 1990). Essas três etapas enzimáticas são necessárias à
biossíntese de praticamente todos os compostos fenólicos (Figura 2).
16
Figura 2- Síntese de fenólicos simples por vias metabólicas catalisadas pelas enzimas PAL, fenilalanina
amônia liase; C4H, cinamato 4-hidroxilase e CoAL, hidroxicinamato CoA ligase.
Fonte: Imagem adaptada de Macheix, Fleuriet, Billot (1990).
Hyogo et al. (2010) têm mostrado a importância desses fenólicos simples, por meio
dos efeitos antioxidantes dos ácidos caféico e ferúlico em eliminar espécies reativas de
oxigênio em neutrófilos humanos. Além disso, o ácido caféico, em extrato de própolis,
também tem sido descrito como responsável pela ação antimicrobiana frente a micro-
organismos presentes na saliva humana (SIMÕES; BARRAL de ARAÚJO; CORREIA de
ARAÚJO, 2008).
2.2.2 Estrutura e função dos flavonóides
Os flavonóides constituem uma família relativamente diversa de moléculas aromáticas
que são derivadas dos fenilpropanóides e do malonil-coenzima A, proveniente da rota do
ácido malônico (WINKEL-SHIRLEI, 2001) (Figura 3). Estes podem se apresentar como
agliconas, porém frequentemente estão glicosilados, quando tem a capacidade de doar
elétrons ou átomos de hidrogênio, realizando uma atividade redutora (BEHLING et al. 2004;
HERNÁNDEZ et al. 2009).
FENILALANINA ÁCIDO
CINÂMICO
ÁCIDO HIDROXICINÂMICO
(p-cumárico) (ácido caféico) (ácido ferúlico)
(ácido sináptico)
HIDROXICINAMOIL CoA (4-coumaroil CoA)
PAL C4H CoAL
Derivados
17
Figura 3- Via biossintética dos flavonóides e as enzimas responsáveis pela catálise: fenilalanina amônia
liase (PAL), UDP-glicose: trans-cinamato β-D-glicosiltransferase (UGT), chalcona sintase (CHS), chalcona
isomerase (CHI), flavanona 3-hidroxilase (F3H), diidroflavonol-4-redutase (DFR), flavonol sintase (FLS),
antocianidina sintase (ANS), antocianidina redutase (ANR) e leucoantocianidina redutase (LAR).
Fonte: Imagem adaptada de Macheix, Fleuriet, Billot (1990) e Dixon, Liu e Jun (2013).
Fenilalanina
Ácido trans-cinâmico
PAL
Via dos fenilpropanóides
4-coumaroilCoA + 3 malonilCoA
Chalconas
CHS
Flavanonas
CHI
FLS Flavonóis
UGT 1-O- trans-cinamoil- β- D-glicopiranose
Diidroflavonóis
F3H
Leucoantocianidinas
DFR
LAR Flavan-3-óis
Antocianidinas ANR
epi-flavan-3-óis
ANS
Via de biossíntese
dos flavonóides
18
Nas plantas, os flavonóides são abundantes em flores, frutos e folhas e são
caracterizados pela presença de dois anéis benzeno (anéis A e B, Figura 4), podendo estes
anéis serem ligados por três átomos de carbono, formando as chalconas, ou ligados por um
anel heterocíclico C, formando os demais flavonóides (TAYLOR; GROTEWOLD, 2005).
Com base na posição e nas modificações dos anéis A, B e C, existem mais de 10.000
estruturas de flavonóides (POLLASTRI; TATTINI, 2011).
Figura 4- Estrutura geral dos flavonóides.
Fonte: Imagem adaptada de Taiz e Zeiger (2013)
Distribuídos em seis principais subgrupos (Figura 5), chalconas, flavonas, flavonóis,
flavandióis, antocianinas e taninos condensados (ou proantocianidinas); o sétimo subgrupo
trata-se das auronas que não são ubíquas ao Reino Plantae. Algumas espécies de plantas
sintetizam flavonóides especializados, tais como os isoflavonóides que são encontrados em
leguminosas (WINKEL-SHIRLEI, 2001).
19
Figura 5- Estrutura das principais classes de flavonóides, em que R1 e R2 indicam os locais de possíveis
substituições. OGly indica uma ligação glicosídica.
Fonte: Imagem adaptada de Taylor e Grotewold (2005).
Os flavonóides apresentam importantes funções fisiológicas nas plantas como; atração
de pássaros, germinação do pólen, proteção contra radiação, quelação de metais, impedimento
ao herbivorismo e na defesa contra patógenos (HARBORNE, 1993; GOULD et al. 2006).
Jeong et al. (2014) afirmaram que flavonóides de Citrus sp. funcionavam como barreira na
defesa química constitutiva contra fungos. Kobayashi et al. (2004) demonstraram ainda que
os flavonóides funcionam como sinais químicos liberados pelas raízes de leguminosas durante
a formação de nódulos por bactérias fixadoras de nitrogênio.
Estudos mostraram, quanto à distribuição intracelular, que os flavonóides estão
presentes nos vacúolos, cloroplastos e até no núcleo (POLSTER et al. 2006; HERNÁNDEZ
et al. 2009; POLLASTRI; TATTINI, 2011; AGATI et al. 2012). Os diversos papéis exercidos
por esses fenólicos em interações planta-ambiente corroboram com sua presença em uma
grande variedade de células e compartimentos sub-celulares. Além disso, a massiva
localização dos flavonóides em apêndices externos como tricomas está associada às funções
de proteção à radiação UV (ROZEMA et al. 1997). Li et al. (1993), Bieza e Lois (2001)
observaram os papéis-chave dos flavonóides na proteção contra radiação UV-B, examinando
mutantes de Arabidopsis que não sintetizavam tais compostos.
Brown et al. (2001) e Murphy, Peer e Taiz (2000) mostraram que os flavonóides
podem regular negativamente o transporte polar de auxina in vivo, interferindo, dessa forma,
na formação do gradiente do fitohormônio (BUER; MUDAY, 2004). Mo, Nagel e Taylor
20
(1992) descreveram a importância dos flavonóides na germinação do pólen, uma vez que
mutantes deficientes em flavonóides não produziram tubos polínicos funcionais, porém com a
adição in vitro de flavonóis, a fertilidade era restaurada.
Raghunathan et al. (2012) e Pahari et al. (2012) demonstraram a habilidade dos
flavonóides em interagir com regiões polares e apolares da bicamada lipídica, beneficiando o
ordenamento dos lipídios e prevenido danos oxidativos (ERLEJMAN et al. 2004).
Além dos flavonóides apresentarem propriedades antioxidantes baseadas em sua
capacidade de neutralizar radicais livres, eles possuem a capacidade de quelar metais
transientemente; estes complexos de flavonóides com cátions revelam atividade superóxido
dismutase (SOUZA; GIOVANI, 2004; MALESEV; KUNTIC, 2007).
Os flavonóides não são produzidos pelos animais, os quais dependem da ingestão de
plantas para obtê-los (KYLE; DUTHIE, 2006). Unnikrishnan et al. (2014) apontam estes
compostos como uma alternativa para tratamento de diabetes, hiperlipidemia e estresse
oxidativo. Já, Winkel-Shirley (2001) afirma que as isoflavonas extraídas de alimentos à base
de soja, têm sido associadas a efeitos antineoplásicos, enquanto os estilbenos presentes no
vinho tinto contribuem para redução de doenças cardíacas. Ray e Bagchi (2005) afirmam
ainda que os flavonóides desencadeiam a morte celular programada (apoptose) em vários
modelos animais.
2.3 Principais enzimas do metabolismo de fenólicos
A fenilalanina amônia liase (PAL, EC 4.3.1.24) catalisa a desaminação não oxidativa
da L-fenilalanina (L-Phe) em ácido trans-cinâmico que é a primeira reação da via de síntese
dos fenólicos (Figura 6) e, portanto, uma importante etapa reguladora por representar uma
ligação entre o metabolismo primário e o secundário (TAIZ; ZEIGER, 2013).
Essa enzima está amplamente distribuída em plantas superiores, sendo hidrossolúvel e
intracelularmente distribuída no citoplasma (MACDONALD; D CUNHA, 2007), plastídios,
mitocôndrias e microcorpos (HANSON; HAVIR, 1981).
A massa molecular da PAL varia entre 270 a 330 kDa com uma estrutura tetramétrica,
constituída por quatro cadeias polipeptídicas idênticas (CAMM; TOWERS, 1973). O pH
ótimo para a reação varia entre 8 e 8,7, sem requerer qualquer cofator (MACHEIX;
FLEURIET; BILLOT, 1990).
21
Figura 6- Reação catalisada pela PAL.
Fonte: Imagem adaptada de Taiz e Zeiger (2013).
A PAL tem como principal substrato a L-Phe, porém em menor grau utiliza o
aminoácido L-tirosina (L-Tyr), enquanto D-Phe e D-Tyr atuam como inibidores competitivos
(OGATA et al. 1967; HODGINS, 1968). Os mecanismos regulatórios de sua atividade
incluem efeitos alostéricos, inativação por proteases específicas e inibição pelo produto final
da reação (TENA et al. 1984). Em muitas espécies vegetais, a regulação da atividade da PAL
torna-se mais complexa pela existência de múltiplos genes que codificam essa enzima, pois
alguns são expressos apenas em tecidos específicos ou sob certas condições ambientais
(LONGEMANN et al. 1995).
Essa primordial enzima do metabolismo de fenólicos tem sido estudada em diversos
frutos como amora, framboesa, morango, groselha preta e groselha vermelha, por Flores et al.
(2014), cereja, kiwi, ameixa, framboesa por Halbwirth et al. (2009), Citrus, tomate, uva,
maça, pêra, manga, pêssego e morango por Macheix, Fleuriet e Billot (1990). Lopez-Galvez
et al. (1996) correlacionaram aumentos da atividade da PAL com o decréscimo na aparência e
qualidade visual de alface minimamente processado, assim, concluíram que condições que
promovessem a redução da atividade enzimática melhoraria a aparência de produtos vegetais.
Outras aplicações foram desenvolvidas para a PAL, Watanabe et al. (1992) afirmam
ser possível quantificar L-Phe e L-Tyr em plasma, urina e outros fluidos corpóreos de
humanos. Já, Evans et al. (1987) demonstraram o uso industrial da PAL catalisando a reação
no sentindo inverso para a produção de fenilalanina que é precursor do edulcorante aspartame.
As glicosiltransferases (GT) (EC 2.4.x.y) catalisam a transferência de um açúcar
móvel para uma ampla gama de moléculas aceptoras, tais como açúcares, lipídios, proteínas,
ácidos nucléicos, antibióticos e outras pequenas moléculas, incluindo metabólitos secundários
de plantas, como os fenólicos (YONEKURA-SAKAKIBARA; HANADA, 2011). Essas
enzimas podem ser classificadas em 97 famílias, das quais a família GT1, também referida
PAL
Ácido trans-cinâmico Fenilalanina
NH3
22
como UDP-glicosiltransferases (UGTs), compreende isoformas divergentes em plantas,
animais, fungos, bactérias e vírus (CHEYNIER et al. 2013; CAZY, 2015). Em plantas, as
UGTs utilizam açúcares como glicose, galactose e arabinose, ativados por uridina difosfato
(UDP), como moléculas doadoras (CHEYNIER et al. 2013).
A glicosilação normalmente ocorre no citosol, mas conjugados são encontrados no
vacúolo (VOGT; JONES, 2000). Nesse processo ocorrem mudanças nas propriedades
químicas das moléculas aceptoras em vários aspectos, são elas: aumento da solubilidade de
glicosídeos e ésteres de açúcar, aumento considerável da estabilidade, e, por conseguinte,
diminuição da reatividade, em virtude da ligação do grupo funcional da molécula com o
açúcar (JONES; VOGT, 2001).
No metabolismo dos fenólicos, essas enzimas se sobressaem por glicosilar ácidos
hidroxicinâmico (LUNKENBEIN et al. 2006), assim como flavonóides (CHENG et al. 1994),
alcalóides (MOEHS et al. 1997) e precursores das coumarinas e da lignina (MACHEIX;
FLEURIET; BILLOT, 1990).
Tais conjugados formados, glicosídeos e ésteres de glicose, têm sido identificados em
numerosas plantas (HERRMANN, 1989), os primeiros são destacados por Dixon (2001)
como moléculas de grande importância biológica para as plantas, agindo como compostos de
defesa ou como fontes de armazenamento de energia.
Em morango (Fragaria x ananassa Duch.), a UDP-glicose: trans-cinamato
glicosiltransferase (FaGT2, E.C 2.4.1.177) foi avaliada no amadurecimento do fruto com
massa molecular de 61.4 kD, 555 aminoácidos, pH reacional entre 8 e 8,5, temperatura ótima
de 21 ºC para atuação da enzima e especificidade por substratos como ácido benzoico, ácido
cinâmico e seus respectivos derivados. A reação formou ésteres de ácido cinâmico e de ácido
p-cumárico que são os prováveis precursores dos compostos responsáveis pelo aroma em
frutos (Figura 7). Estudos da expressão gênica revelaram que os genes da FaGT2 eram
ativados tanto pelo amadurecimento como em resposta ao estresse oxidativo (LUNKENBEIN
et al. 2006).
A expressão desses genes da FaGT2 é regulada negativamente pela síntese de auxina
nos aquênios (GIVEN et al. 1988). Durante os estádios iniciais do desenvolvimento do fruto
esse fitohormônio promove o seu crescimento, porém com o amadurecimento há o declínio de
auxina no receptáculo, provavelmente devido ao fim da síntese e transporte de auxina para os
aquênios. Logo, Benítez et al. (2003) tem mostrado que a expressão dos genes de FaGT2 é
regulada negativamente por auxina.
23
Figura 7- Reação catalisada pela UDP-glicosiltransferase de morango FaGT2.
Fonte: Imagem adaptada de Lunkenbein et al. (2006).
Latza, Gansser e Berger (1996) afirmam que o morango foi o primeiro alimento a ser
descoberto fonte de 1-O- trans-cinnamoil β-D glicopiranose, no entanto Michodjehoun-
Mestres, Amraoui e Brillouet (2009) já purificaram e caracterizaram 1-O- trans-cinamoil- β-
D-glicopiranose em pedúnculo de caju.
A avaliação dos níveis desse composto, em cajus dos clones CCP76 e EMBRAPA 50
e variedades Parakou Rouge e Parakou Jaune, mostraram que 1-O- trans-cinamoil- β- D-
glicopiranose é mais abundante na epiderme do pedúnculo do que na polpa do caju, sendo de
quatro a cinco vezes mais abundante na epiderme. Desses clones citados anteriormente o
clone CCP76 possui o menor conteúdo, em cajus maduros, sendo de 6,2 mg/100g MF,
enquanto o clone EMBRAPA 50, o maior; 20,1 mg/100g MF (MICHODJEHOUN-
MESTRES; AMRAOUI; BRILLOUET, 2009).
Em morangos maduros de diferentes cultivares, o composto 1-O-trans-cinamoil- β- D-
glicopiranose tem uma concentração média de 5 mg/100g MF, porém nas cultivares Marlate e
Carisma esses valores foram de 23 a 25 mg/100g MF (AABY et al. 2012).
Essa UDP-glicose: trans-cinamato β-D-glicosiltransferase (E.C 2.4.1.177) também
tem sido encontrada em Eucalyptus perriniana (NAGASHIMA et al. 2004), Ipomoea batatas
(SHIMIZU; KOJIMA, 1984), Phaseolus vulgaris (EDWARDS; MAVANDAD; DIXON,
1990), Vanilla planifolia (FUNK; BRODELIUS, 1992) e Verbesiana caracasana (VITALI et
al. 1999).
A enzima flavonol sintase (FLS, E.C 1.14.11.23) catalisa a formação dos flavonóis na
rota biossintética dos flavonóides, através da conversão dos diidroflavonóis (diidroquercetina,
diidrokaempferol e diidromiricetina) em (quercetina, kaempferol e miricetina) (FLORES et
al. 2014) (Figura 8). Essa enzima pertence ao grupo das dioxigenases dependente de 2-
oxoglutarato (2-ODD), que utilizam oxigênio molecular como co-substrato e são
R2=R3=R4=H: ácido cinâmico R2=R3=R4=H: cinamoil-D-glicose
24
caracterizadas por requerer cofatores como ferro (Fe2+), 2-oxoglutarato e ascorbato
(BRITSCH; HELLER; GRISEBACH, 1981).
A massa molecular da FLS encontrada em Citrus unshiu foi de 38 kDa com atividade
enzimática máxima observada em pH entre 5 e 6 e temperatura ótima de 37oC, com
diidroquercetina como substrato (WELLMANN et al. 2002). Essa classe de enzimas
funcionalmente heterogêneas tem diferentes especificidades por substratos como flavonóides,
giberelinas e alcalóides (PRESCOTT; LLOYD, 2000; LUKACIN et al. 2003).
Figura 8- Reações da enzima flavonol sintase.
Fonte: Imagem adaptada de Li et al. (2013).
Quanto aos mecanismos regulatórios dessa enzima, incluem mudanças no potencial
redox celular que ativam a biossíntese de flavonóis (TAYLOR; GROTEWOLD, 2005) pela
ativação do fator de transcrição MYB, este envolvido com o desenvolvimento, metabolismo
celular e mediação de respostas a estresses bióticos e abióticos (DUBOS et al. 2010).
A FLS já foi extraída de Dianthus caryophyllus (FORKMANN, 1991), Citrus unshiu
(MORIGUCHI et al. 2002), Matthiola incana (SPRIBILLE; FORKMANN, 1984), Petunia
hybrida (FORKMANN et al. 1986) e Vitis vinifera (MATTIVI et al. 2006).
Não consta na literatura as possíveis aplicações da FLS na indústria ou medicina,
apesar de seus produtos reacionais apresentarem relevantes funções, como a utilização da
25
quercetina complexada com íons metálicos, como agente antitumoral (DURGO et al. 2011)
ou sua interação com lipoproteínas de baixa densidade (LDL), presentes no sangue de
humanos, evitando as influências tóxicas e apoptóticas da LDL oxidada (YAO et al. 2012).
Já, Psahoulia et al. (2007) mostraram que quercetina pode induzir o acúmulo de receptores de
morte e induzir a apoptose em células tumorais de câncer do cólon, enquanto Baliga et al.
(2014) relataram que kaempferol e quercetina são efetivos na redução dos sintomas
associados à colite ulcerosa. Miricetina e seus derivados têm sido reportado ter efeito
anticâncer (LEE et al. 2007), anti-inflamatório (WANG et al. 2010) e atividades citotóxicas
(DIMAS et al. 2000).
Em plantas, Havaux e Kloppstech (2001) destacam que os flavonóis desempenham um
papel mais importante do que as xantofilas na proteção de folhas de Arabidopsis induzidas a
dano oxidativo pela exposição à luz visível por um longo período. Essa proteção ao dano
oxidativo, de acordo com Agati et al.(2009), não pode ser atribuída a blindagem fornecida por
quercetina-3-O-glucosídeo 7-O-raminosídeo e Kaempferol 3-O-glucosídeo 7-O-raminosídeo à
luz visível (400-700 nm), mas na capacidade deles reduzirem as espécies reativas de oxigênio
(ROS) e não em evitar sua geração (AGATI et al. 2012). Todavia, Brown et al. (1998)
mostraram que a quercetina possuía a capacidade de se complexar com íons Cu e Fe, inibindo
a geração de ROS pela reação de Fenton, bem como reduzindo ROS já formadas.
A enzima leucoantocianidina redutase (LAR; E.C. 1.17.1.3) catalisa a reação que
reduz leucoantocianidinas (flavan-3,4-dióis), de forma dependente de NADPH, em (+)
catequinas (flavan-3-óis) (PFEIFFER et al. 2006; GAGNÉ et al. 2009) (Figura 9). O produto
dessa reação é monômero para a biossíntese das proantocianidinas também conhecidas como
taninos condensados, formados a partir da condensação de flavan-3-óis (catequinas) e epi-
flavan-3-óis (epicatequinas) (DIXON; XIE; SHARMA, 2005).
Figura 9- Reação da enzima leucoantocianidina redutase. (LAR).
Fonte: Imagem de Pfeiffer et al. (2006).
26
Quanto à especificidade da LAR, há uma exigência por substratos com o anel B dos
flavonóides hidroxilados, como observado nas leucoantocianidinas: leucopelargonidina,
leucocianidina e leucodelfinidina (TANNER et al. 2003). De tal forma, que a LAR apresenta
a mesma similaridade química da enzima antocianidina redutase (ANR), quanto à
especificidade por tais substratos hidroxilados, como observado em folhas de uva e maçã
(PFEIFFER et al. 2006).
LAR foi descrita por atuar enzimaticamente, em espécies cultivadas como, Camellia
sinensis (PUNYASIRI et al. 2004), Vitis vinífera (PFEIFFER et al. 2006; GAGNÉ et al.
2009) e Malus x domestica (PFEIFFER et al. 2006). Em Camelia sinenses, o pH reacional
ótimo foi de 7,6 com a reação ocorrendo a 25 ºC.
Os produtos da ação da LAR que vão originar os taninos condensados apresentam
importantes funções ecológicas e sensoriais/nutricionais. Em plantas, os taninos agem como
fatores de proteção contra radiação (SOLOVCHENKO; EIBERGER, 2003), doenças (DAI et
al. 1995) e predadores (FORKNER; MARQUIS; LILL, 2004), além de serem componentes
cruciais que conferem propriedades sensoriais, como amargura e adstringência aos frutos
(BROSSAUD; CHEYNIER, 2001).
Com base em todas as informações discutidas anteriormente, esse trabalho quantifica a
atividade de enzimas relevantes ao metabolismo de fenólicos em diferentes etapas do
desenvolvimento do pedúnculo do cajueiro, com o objetivo de esclarecer os mecanismos de
acúmulo/redução desses fitonutrientes tão abundantes.
27
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Material
Foram avaliados pseudofrutos dos clones BRS 189 (vermelho) e CCP 76 (alaranjado)
de cajueiro-anão-precoce nos estádios: pedúnculo verde e castanha madura e seca (estádio 2),
pedúnculo mudando de cor e castanha madura e seca (estádio 4) e pedúnculo colorido e
castanha madura e seca (estádio 7), de acordo com Alves et al. (1999).
Um total de 15 cajus, para cada tratamento, foram colhidos manualmente em
setembro de 2014, na estação experimental de Pacajus-CE da Embrapa Agroindústria
Tropical, e acondicionados em caixas plásticas forradas com espuma e em apenas uma
camada de frutos. Em seguida, foram transportados para o Laboratório de Bioquímica e
Fisiologia de Frutos no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade
Federal do Ceará, em Fortaleza.
Figura 10: Cajus dos clones BRS 189 (1, 2 e 3) e CCP76 (4, 5, 6) nos respectivos estádios de
desenvolvimento 2, 4 e 7; provenientes da Embrapa Agroindústria Tropical.
Fonte: Aline Gonzaga Cunha
3.2 Métodos
Os pseudofrutos foram separados da castanha, que foi descartada, e depois
processados em centrífuga doméstica para obtenção das polpas (exceto para o ensaio da UGT
1 2 3
4 5 6
28
e para o perfil de fenólicos), sendo que o filtrado resultante (amostra) foi utilizado para as
análises a seguir, sendo armazenado em freezer doméstico a -20 ºC. Todas as etapas da
extração enzimática foram realizadas a 4 ºC.
3.2.1 Conteúdo de proteínas solúveis totais
Todas as atividades enzimáticas determinadas foram especificas baseadas no conteúdo
total de proteínas que foi quantificado segundo o método de Bradford (1976). A quantificação
de proteínas solúveis totais foi realizada com adição de 100 µL de amostra mais 1000 µL do
reagente de Bradford e absorbância monitorada a 595 nanômetros (nm) em espectrofotômetro
de multi-detecção de microplaca Synergy Mx (BioTek, EUA). O controle consistiu em 100
µL de água deionizada mais 1000 µL do reagente de Bradford. De posse das leituras, os
resultados foram expressos em mg de proteína solúvel/g de massa fresca.
3.2.2 Atividade da fenilalanina amônia liase (PAL)
O extrato enzimático e a atividade da PAL foram determinados pelos métodos
descritos originalmente por Mori, Sakurai e Sakuta (2001) e El-Shora (2002). As enzimas
foram extraídas a partir 1 g de amostra homogeneizado em 4 mL de tampão Tris-HCl 100
mM pH 8,4, seguido de centrifugação a 10.000 xg por 10 min à 4 ºC, sendo o sobrenadante
considerado o extrato enzimático.
A mistura reacional foi composta por 20 µL de β-mercaptoetanol 50 mM, 100 µL do
extrato, 580 µL do tampão Tris-HCl 100 mM pH 8,4 e 200 µL de L-fenilalanina 40 mM. A
reação foi incubada a 30 ºC por 60 min, e após esse período, sendo interrompida com 100 µL
de HCl 6 M. Na amostra controle, a solução de L-fenilalanina 40 mM foi adicionada, somente
após a adição de HCl 6 M. A mistura reacional foi centrifugada a 10.000 xg por 10 min e o
sobrenadante foi aplicado em LC-DAD para a quantificação de ácido trans-cinâmico,
formado a partir da fenilalanina. Os resultados foram expressos em nano unidades catalíticas
(nKat)/kg de proteína (P).
A cromatografia líquida (LC) acoplada com detector por arranjo de diodos (DAD) foi
realizada em um sistema cromatográfico modelo Agilent LC-20A (Shimadzu, Japão)
acoplado ao detector SPD-M20A e amostrador automático SIL-20AC. As amostras foram
percoladas através de uma coluna C18 de fase reversa com dimensões de 4,6 x 150 mm à
temperatura constante em 30 ºC. O gradiente de eluição iniciou com 95% de solvente A (água
29
com 0,1% de ácido fórmico) e 5% de solvente B (acetonitríla com 0,1% de ácido fórmico) e
aumentou para 100% de B, em 30 min (LANDMANN, FINK E SCHWAB, 2007).
O fluxo do solvente foi de 0,4 mL/min, o volume de injeção de 20 µL e a absorbância
mensurada em 254 nm. O pico foi identificado baseado no tempo de retenção do padrão ácido
trans-cinâmico (Sigma, EUA) que foi quantificado, segundo uma curva de calibração com
uma solução padrão.
3.2.3 Atividade da UDP-glicose: trans-cinamato β-D-glicosiltransferase (UGT)
Inicialmente, uma solução de 50 µL de ácido trans-cinâmico 50 mM foi injetada, com
uma seringa, em dez locais diferentes do pseudofruto, segundo método de Landman, Fink e
Schwab (2007), com modificações. O controle consistia na injeção de água destilada nos
pedúnculos. Após 24 h em temperatura ambiente (24 ºC), os cajus foram processados em
Ultra Turrax T25 Digital (IKA, Alemanha), a amostra foi filtrada em uma peneira doméstica e
o filtrado resultante centrifugado a 5.000 xg por 15 min a 4 ºC. O sobrenadante recolhido foi
aplicado em LC-DAD para a quantificação de 1-O-trans-cinamoil-β-D-glicopiranose,
formado a partir de ácido trans-cinâmico e os resultados foram expressos em nKat/kg P. A
LC-DAD foi realizada nas mesmas condições descritas acima para a PAL.
3.2.4 Atividade da flavonol sintase (FLS)
O extrato enzimático foi preparado segundo método de Flores et al. (2014), com
modificações, a partir de 5 g de amostra, 0,25 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) e 4 mL de
0,1 M de Tris/HCl com 0,4% de ascorbato de sódio pH 7,25, homogeneizados por 5 min, à
4ºC. A mistura foi centrifugada a 5.000 xg por 10 min a 4 ºC e o sobrenadante foi considerado
o extrato enzimático.
A determinação da atividade enzimática foi realizada como descrito por Halbwirth et
al. (2009) e Flores et al. (2014), com modificações. A reação enzimática continha 50 µL do
susbtrato dihidroquercetina, 50 µL de extrato, 5 µL de 3,48 mM de 2-oxoglutarato, 5 µL de
2,01 mM de FeSO4.7 H2O e 60 µL do tampão Tris/HCl 0,1M com 0,4% de ascorbato de sódio
pH 7,25. O controle consistia na substituição do substrato por água destilada. A mistura foi
incubada por 45 min a 30 ºC, seguido de adições de 140 µL de acetato de etíla, 10 µL de
ácido acético e 10 µL de 0,1 mM de EDTA. Essa mistura foi aplicada em LC-DAD para a
30
quantificação de quercetina, formada a partir da diidroquercetina e os resultados foram
expressos em nKat/kg P.
Quanto à análise cromatográfica, esta foi realizada em um sistema cromatográfico
HPLC-920 acoplado com detector por arranjo de diodos PDA e amostrador automático
(Varian, EUA). As amostras foram percoladas através de uma coluna MICROSORB 100,
mantida à temperatura de 35 °C. A eluição foi realizada inicialmente na proporção 50:50 dos
solventes A (água com 0,1% de ácido fosfórico) e B (metanol grau HPLC), aumentando para
100% de B dos 20 a 25 min, voltando para a proporção 50:50 (solventes A e B) dos 27 aos 35
min finais. O fluxo do solvente foi de 1 mL/min, o volume de injeção de 20 µL e a
absorbância mensurada em 370 nm. O pico foi identificado baseado no tempo de retenção do
padrão quercetina (Sigma, EUA) que foi quantificado segundo uma curva de calibração com
uma solução padrão.
3.2.5 Atividade da leucoantocianidina redutase (LAR)
O extrato e a determinação da atividade da LAR foram realizados por adaptação do
método de Gagné et al. (2009). A amostra (2 g) foi homogeneizada com 3 mL do tampão de
lise (0,1 M HEPES pH 7,3, 1 % de sacarose (p/v), 1% polietileno glicol (PEG, p/v), 25 mM
de CaCl2), juntamente com 200 mg de PVPP. O homogenato foi centrifugado a 20.000 xg por
10 min a 4 ºC e o sobrenadante foi incubado com a resina Dowex 1 x 2 com malha 200,
equilibrada com o tampão de lise. Após a incubação, repetiu-se a centrifugação e o
sobrenadante consistia no extrato enzimático.
A mistura reacional continha 10 µL de diidroquercetina (1 g/L em metanol), 10 µL de
NADPH 20 mM e 110 µL de tampão Tris-HCl 0,1 M pH 7,5. A reação iniciou com adição de
70 µL do extrato, seguido de incubação a 25 ºC por 30 min, quando foi parada com a adição
de 200 µL de acetato de etíla e uma vigorosa agitação. Os resíduos resultantes da atividade
enzimática foram dissolvidos em 100 µL de metanol grau HPLC para análise por LC-DAD,
que quantificou (+) catequina, formada a partir da diidroquercetina. Os resultados foram
expressos em nKat/kg P.
O sistema cromatográfico foi o mesmo das enzimas UGT e PAL, porém as condições
cromatográficas diferiram. O gradiente de eluição iniciou-se com 90% de solvente A (água
com 0,1% de ácido fosfórico) e 10% de solvente B (metanol P.A), aumentando para 26% de
B, dos 40 aos 55 min, 100% de B dos 55 aos 65 min, finalizando com 10% de B até os 75
min. O fluxo do solvente foi de 0,4 mL/min, o volume de injeção de 20 µL e a absorbância
mensurada em 270 nm. O pico foi identificado baseado no tempo de retenção do padrão
31
catequina (Sigma, EUA) que foi quantificado segundo uma curva de calibração com uma
solução padrão.
3.2.6 Avaliação do perfil de fenólicos
Conforme Brito et al. (2007), cajus íntegros foram cortados em suas partes centrais,
sendo estas liofilizadas. Do material liofilizado, 300 mg foram extraídos com 10 mL metanol-
água (60:40, v/v) em sonicador UltraCleaner USC1400 (China) por 60 min em temperatura
ambiente. Procedeu- se, em seguida, com centrifugação a 1680 xg por 15 min a 4 ºC e o
sobrenadante coletado (8mL) foi evaporado em rotaevaporador R-215 (Buchi, Suíça), sendo o
resíduo ressuspendido em 1 mL metanol-água (60:40, v/v). Essa solução foi posteriormente
levada ao sonicador por 10 min, filtrada em filtro Syringe PTFE com diâmetro de 13 mm e
poro 0,22 µm, seguido de análise por LC-DAD.
O sistema cromatográfico utilizado foi o mesmo das amostras da enzima flavonol
sintase, com alterações apenas no gradiente de eluição. Os solventes foram A (água com 0,1%
de ácido fosfórico) e B (Metanol grau HPLC) e o gradiente iniciou com 80% de solvente A e
20% de solvente B, aumentando para 27% de B entre 5 e 18 min, 47% de B de 18 a 24 min,
61% de B de 24 a 25 min, finalizando a corrida com a proporção de A:B de 0:100 (v/v). O
fluxo foi constante de 1 mL/min, o volume de injeção de 20µL e a absorbância mensurada em
370 nm (flavonóides) e 254nm (ácidos orgânicos). Os resultados preliminares mostram picos
que representam flavonóides glicosilados com diferentes tempos de retenção e que podem ser
quantificados como mg de equivalente molar de quercetina/g MS.
3.3 Delineamento experimental e análise estatística
O experimento foi conduzido em Delineamente Inteiramente Casualizado (DIC) com
os seis materiais genéticos como tratamentos. Para avaliar diferenças significativas (p < 0,05)
entre as amostras foi realizada análise de variância (ANOVA) com médias avaliadas pelo
teste de comparação múltipla de Tukey. O software Assistat 7.7 beta (Paraíba, Brasil) foi
utilizado para a análise estatística e os valores representam a média de três replicatas.
32
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Atividades das enzimas do metabolismo de fenólicos
As atividades de quatro enzimas, sendo duas da via dos fenilpropanóides (PAL, UGT)
e duas da via dos flavonóides (FLS e LAR) foram avaliadas em três diferentes estádios de
maturação do pseudofruto de dois clones de cajueiro. As figuras 11 e 12 mostram os
cromatogramas obtidos após o ensaio da PAL em diferentes estádios de caju dos clones
CCP76 e BRS 189, respectivamente.
O ácido trans-cinâmico, produzido nessa reação, apresentou um tempo de retenção de
26,4 min e a sua produção, devido à atividade da PAL foi diminuindo conforme avançava o
desenvolvimento do caju, em ambos os clones (Tabela 1). Os cajus do clone CCP 76
apresentaram uma atividade enzimática mais alta no estádio 2, 126,30 nkat/Kg P, diminuindo
quase 50% com o amadurecimento, no estádio 7 apresentava 69,14 nkat/Kg P, porém não foi
observado diferença estatística nesses valores. Já, os cajus do clone BRS 189 obtiveram um
menor conteúdo inicial, 80,93 nkat/Kg P no estádio 2 e depois uma queda ainda maior de 70%
da atividade inicial com o amadurecimento; 23,58 nkat/Kg P no estádio 7.
Tabela 1. Atividades específicas de enzimas do metabolismo de compostos fenólicos em pedúnculos de cajus
dos clones CCP76 e BRS 189 em diferentes estádios de maturação.
Clones Estádio Atividade enzimática*
PAL (nkat/Kg P)
UGT (nkat/Kg P)
FLS (nkat/Kg P)
LAR (nkat/Kg P)
CCP76 2 126,30 a 14,36 b 113,08 b - 4 87,11 a 222,77 a 7.676,24 a - 7 69,14 a 2,78 c 1.655,96 b -
BRS189 2 80,93 a 0, 60 c 116,30 b - 4 -a 3, 67 b 29.733, 51 a - 7 23, 58 b 78,12 a 3.575,96 b -
*Valores médios com letras diferentes são significativamente diferentes entre si ao nível de 5%, pelo teste de Tukey. a(-) representa ausência de atividade enzimática.
33
Figura 11- Cromatogramas (254 nm) do produto da atividade enzimática da PAL de cajus nos estádios 2 (A), 4
(B) e 7 (C) do clone do clone CCP76. * Pico1: ácido trans-cinâmico.
Ácido trans cinâmico 1
1
1
A
B
C
34
Figura 12- Cromatogramas (254 nm) do produto da atividade enzimática da PAL de cajus nos estádios 2 (A), 4
(B) e 7 (C) do clone BRS 189. * Pico1: ácido trans-cinâmico.
Ácido trans cinâmico 1
1
1
1
A
B
C
35
O decréscimo observado na atividade da PAL corrobora com os resultados
apresentados por Lopes et al. (2012) que mostram que o conteúdo de fenólicos totais reduz
entre os estádios 2 e 7 de 95,54 para 64,01 mg de equivalentes de ácido gálico (EAG)/100 g
massa fresca (MF) no clone CCP 76 e de 116.9 para 54.8 mg (EAG)/100g (MF) em cajus do
clone BRS 189.
A ausência de atividade da PAL nos frutos BRS 189 no estádio 4, apesar de
improvável nesse tipo de tecido, foi também observada em estádios imaturos e maduros de
ameixa (Prunus domestica), cereja (Prunus avium) e amora (Rubus fruticosa) por Halbwirth
et al. (2009). Todavia, os mesmos autores encontraram valores de atividade da PAL
crescentes com o amadurecimento de kiwi (280 nkat/Kg P), de Sambucus nigra (de 3 para
101 nkat/Kg P) e framboesa (50 nkat/Kg P). O aumento da atividade da PAL durante o
amadurecimento de frutos está associado ao acúmulo de antocianinas e outros compostos
fenólicos (GIVEN; VENIS; GRIERSON, 1988).
Em morangos, a atividade da referida enzima revelou dois picos de atividade de
90.000 nkat/Kg P, um em frutos verdes e outro em frutos quase maduros (CHENG; BREEN,
1991) isso pode ser explicado pelos múltiplos genes que codificam essa proteína e que são
expressos em tecidos específicos ou sob certas condições ambientais (LONGEMANN et al.
1995).
As figuras 13 e 14 mostram os cromatogramas obtidos após o ensaio da UGT em
diferentes estádios de caju dos clones CCP 76 e BRS 189, respectivamente. O produto dessa
reação, 1-O trans-cinamoil B-D-glicopiranose apresentou um tempo de retenção de 21,8 min
e sua concentração denotava uma variação significativa na atividade da UGT durante o
desenvolvimento dos pedúnculos de ambos os clones (Tabela 1). Os cajus CCP 76
apresentaram um forte aumento na atividade da UGT no estádio 4 de 222,77 nkat/Kg P,
seguido de queda, enquanto os pseudofrutos BRS 189 aumentaram continuamente de 0,60
para 78,12 nkat/Kg P, entre os estádios 2 e 7, respectivamente.
Michodjehoun-Mestres et al. (2009) avaliaram o conteúdo de 1-O trans-cinamoil B-D-
glicopiranose em diferentes clones e variedades de caju e observaram um aumento de 1,6 para
6,2 mg/100g MF desse composto, a medida que os pseudofrutos CCP 76 amadureciam. O
aumento da atividade da UGT no estádio 4 pode explicar esse maior conteúdo do produto
reacional nos frutos maduros.
36
Figura 13- Cromatogramas (254 nm) do produto da atividade enzimática da UGT de cajus nos estádios 2 (A), 4
(B) e 7 (C) do clone do clone CCP 76. *Pico 1: 1-O trans-cinamoil B-D-glicopiranose.
1
1
1
1-O trans cinamoil B- D glicopiranose A
B
C
37
Figura 14- Cromatogramas (254 nm) do produto da atividade enzimática da UGT de caju nos estádios 2 (A), 4
(B) e 7 (C) do clone do clone BRS 189. *Pico 1; 1-O trans-cinamoil B-D-glicopiranose.
1
1
1
1-O trans cinamoil B- D glicopiranose A
B
C
38
Enquanto isso, o aumento da atividade até o estádio 7 no BRS 189 pode resultar em
níveis ainda mais altos desse produto, pois cajus maduros de outros clones e variedades
avaliados, pelos autores acima, apresentavam valores mais altos de trans-cinamoil, como
EMBRAPA 50, 20,1 mg/100 g MF; Parakou Rouge, 15,2 mg/100 g MF e Parakou Jaune; 13,9
mg/100 g MF.
Nesse estudo com os pedúnculos de cajueiro, os resultados mostram que o aumento da
atividade da UGT estava associado com a mudança ou estabelecimento da cor. Segundo Latza
et al. (1996) a formação do cinamoil glicose, produto da UGT, antecede a formação dos
pigmentos antociânicos em frutos e pode diferir entre as diferentes cultivares (LUNKENBEIN
et al. 2006).
Além disso, não pode ser descartada a hipótese que a diferença de atividade da UGT
entre os clones de cajueiro pode ser justificada em virtude da avaliação apenas do ácido
cinâmico como substrato, pois, se levarmos em consideração que se trata de uma enzima
inespecífica que glicolisa outros substratos, a atividade poderia ter um comportamento
diferente.
Lunkenbein et al. (2006) explicaram que a UGT está envolvida em vias metabólicas
ativadas pelo amadurecimento nos tecidos do morango, uma vez que é fraca a expressão dos
seus genes em tecidos vegetativos. Além disso, a expressão de alguns genes relacionados ao
amadurecimento do morango tem sua expressão regulada negativamente pela síntese de
auxina nos aquênios (GIVEN et al. 1988; BENÍTEZ et al. 2003). De modo, que nos estádios
iniciais do desenvolvimento do fruto, o fitohormônio auxina promove o crescimento do fruto,
sendo o amadurecimento desencadeado pelo declínio de auxina no receptáculo, estimulando a
expressão de vários genes como o da UGT.
As figuras 15 e 16 mostram os cromatogramas obtidos após o ensaio da FLS em
diferentes estádios de caju dos clones CCP 76 e BRS 189, respectivamente. O produto dessa
reação é o flavonóide amarelo, quercetina, que apresentou um tempo de retenção de 8,8 min
em ambos os clones.
O pico de atividade da FLS ocorreu no estádio 4, correspondendo com a mudança de
cor dos pseudofrutos (Tabela 1). Então, os cajus CCP 76 e BRS 189 apresentaram valores
respectivos de 7.676,24 e 29.733, 51 nkat/Kg P neste referido estádio.
39
Figura 15- Cromatogramas (370 nm) do produto da atividade enzimática da FLS de cajus nos estádios 2
(A), 4 (B) e 7 (C) do clone do clone CCP 76. *Pico 1; quercetina.
1
1
A
B
C
40
Figura 16- Cromatogramas (370 nm) do produto da atividade enzimática da FLS de cajus nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C) do clone do clone BRS 189. *Pico 1; quercetina
1 1
1
A
B
C
41
Ao longo do desenvolvimento, o clone vermelho BRS 189 (3.575,96 nkat/Kg P; no
estádio 7) apresentou uma maior atividade da FLS, sugerindo que outros pigmentos como os
carotenóides e os flavonóides amarelos miricetina contribuam para a coloração alaranjada do
clone CCP 76, conforme observado por Lopes et al. (2012) que obtiveram valores de
carotenóides totais e flavonóides amarelos aumentando com o desenvolvimento do caju para
os dois clones aqui estudados e Brito et al. (2007) que evidenciaram glicosídeos de miricetina
como os flavonóis mais abundantes em caju. Esse aumento dos conteúdos de flavonóides
amarelos encontrados em cajus CCP 76 e BRS 189, sendo no estádio 7 até 56,3 para o
primeiro clone referido e até 50,7 mg/100 g para o segundo clone podem ser explicados em
virtude do aumento da atividade da FLS no estádio 4 (LOPES et al. 2012).
Nenhuma atividade enzimática foi encontrada para a LAR (Tabela 1) ao longo do
desenvolvimento do pseudofruto nos dois clones. Em uvas, Gagné et al. (2009) mostrou que
LAR é ativada cedo e sintetizada durante o florescimento e estabelecimento do fruto,
facilitando a biossíntese precoce de taninos.
4.2 Perfil cromatográfico de fenólicos
O perfil cromatográfico de fenólicos permitiu uma caracterização preliminar quanto às
diferenças nas concentrações dos principais flavonóides glicosilados nos pedúnculos de
cajueiro dos clones CCP 76 e BRS 189 (Figuras 17 e 18). Todavia, a identificação da massa
molecular desses compostos depende da utilização de um HPLC acoplado a um espectrômetro
de massas, porém o curto tempo para a execução desse trabalho, devido à sazonalidade da
produção do cajueiro, não permitiu que esses dados fossem considerados, sendo uma meta
futura a ser considerada.
Os cromatogramas revelam compostos representados por cinco picos com tempos de
retenção de 19,7; 21,3; 22,4; 24,2 e 24,6 em minutos que se repetem durante o
desenvolvimento do caju, mas com diferença entre os clones.
42
Figura 17- Perfil cromatográfico (356nm) dos flavonóides glicosilados de cajus do clone CCP 76 nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C). Picos: 1- tR 19,7 min; 2- tR 21,3 min; 3- tR 22,4 min; 4-tR 24, 2 min e 5- tR 24,6 min.
A
B
C
43
Figura 18- Perfil cromatográfico (356nm) dos flavonóides glicosilados de cajus do clone BRS 189 nos estádios 2 (A), 4 (B) e 7 (C). Picos: 1- tR 19,7 min; 2- tR 21,3 min; 3- tR 22,4 min; 4-tR 24, 2 min e 5- tR 24,6 min.
A
B
C
44
No clone BRS 189, esses compostos decaem em concentração do estádio 2 para o 4,
de 11,22 para 0,12 mg/g MS, respectivamente, e o caju maduro no estádio 7 ainda apresenta
alguns desses compostos totalizando 0,48 mg/g MS (Tabela 2). O clone CCP 76, também
apresentou uma queda entre os estádios 2 e 4 de 5,69 para 3,26 mg/g MS, porém nos
pseudofrutos maduros, estes não foram detectados (Tabela 2).
Os cromatogramas (254 nm) também mostram picos iniciais provavelmente referentes
a compostos hidrofílicos como ácidos orgânicos e açúcares solúveis que são eluídos mais
rapidamente que os fenólicos.
Dentre as enzimas avaliadas (Tabela 1), a FLS é a responsável pela síntese de
quercetina e em ambos os clones, esta apresenta um aumento no estádio 4, provavelmente
associado a mudança de cor do caju. Entre os clones, o BRS 189 apresentou uma atividade
muito mais alta da FLS do que o CCP 76 e isso pode ter refletido no conteúdo de flavonóides
glicosilados persistirem até o estádio 7, diferentemente do observado para o clone CCP 76
que culminou com o desaparecimento desses flavonóides glicosilados (Tabela 2).
Além disso, durante a maturação, ocorre um decréscimo no teor de ácidos orgânicos
no caju, como já observado por Lopes (2011), porém não só esses compostos contribuem para
a acidez, mas também os fenólicos que também podem apresentar caráter acídico,
contribuindo para a adstringência (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Logo, os flavonoides
existentes no caju maduro do clone BRS 189 podem ser responsáveis pela maior
adstringência do mesmo, e sua ausência no clone CCP 76 permita uma maior doçura do caju
deste clone, aliado ao maior conteúdo de sólidos solúveis, já verificado por Moura et al.
(2013).
45
Tabela 2. Dados sobre o perfil de flavonóides glicosilados durante o desenvolvimento de pseudofrutos
de dois clones de cajueiro, em relação aos cromatogramas das Figuras 17 e 18.
Clone Estádio Pico Tempo de retenção
(min) Conteúdo* (mg/g MS)
BRS 189
2
Total 11,2294 1 19,77 4,0853 2 21,33 2,4556 3 22,41 2,9447 4 24,28 0,6117 5 24,62 1,1321
4
Total 0,1210 1 19,79 0,0185 2 21,35 0,0138 3 22,44 0,0532 4 24,30 0,0133 5 24,64 0,0222
7
Total 0,4895 1 19,77 - a 2 21,33 - a 3 22,43 0,3074 4 24,28 - a 5 24,61 0,1821
CCP 76
2
Total 5,6914 1 19,79 1,7133 2 21,35 1,1201 3 22,43 1,7731 4 24,29 0,3843 5 24,62 0,7006
4
Total 3,2662
1 19,77 0,6638 2 21,33 0,4696 3 22,41 1,1470 4 24,29 0,3912 5 24,61 0,5946
7
Total - 1 - - b 2 - - b 3 - - b 4 - - b 5 - - b
*Quantificados como mg de equivalente molar de quercetina (370 nm). a Quantidade traço; b Não detectado.
46
5. CONCLUSÃO
As enzimas envolvidas no metabolismo de fenólicos se comportam diferentemente,
demonstrando a complexidade dessa rota biossintética que varia entre os clones e durante o
desenvolvimento dos pedúnculos de cajueiro. Foi observado que a atividade da PAL decresce
com o amadurecimento dos pseudofrutos, influenciando o conteúdo total de fenólicos, todavia
as enzimas intermediárias da rota apresentam aumentos da atividade nos estádios relacionados
à mudança de cor, indicando que grupos enzimáticos específicos (UGT e FLS) são ativados às
custas do decréscimo de outras atividades enzimáticas.
47
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