universidade federal do cearÁ centro de ciÊncias programa de pÓs-graduaÇÃo em quÍmica edla...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
EDLA FREIRE DE MELO
BIOCOMPÓSITOS DE GELATINA DE PELE E HIDROXIAPATITA DE ESCAMAS
DE RESÍDUOS DO BENEFICIAMENTO DE TILÁPIA DO NILO
(Oreochromis niloticus)
FORTALEZA
2017
EDLA FREIRE DE MELO
BIOCOMPÓSITOS DE GELATINA DE PELE E HIDROXIAPATITA DE ESCAMAS
DE RESÍDUOS DO BENEFICIAMENTO DE TILÁPIA DO NILO
(Oreochromis niloticus)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Química, da Universidade Federal
do Ceará, como requisito parcial para obtenção
do título de Mestre em Química.
Orientação: Dra. Judith Pessoa de Andrade
Feitosa.
Co-Orientador: Dr. Men de Sá Moreira de Souza
Filho.
FORTALEZA
2017
Esta dissertação foi aprovada como parte dos requisitos necessários à obtenção
do Grau de Mestre em Química, área de concentração Química, outorgada pela
Universidade Federal do Ceará, em cuja Biblioteca de Ciências e Tecnologia/UFC
encontra-se à disposição dos interessados.
_________________________________
Edla Freire de Melo DISSERTAÇÃO APROVADA EM: 16/05/2017
EXAMINADORES:
Profa. Dra. Judith Pessoa de Andrade Feitosa Universidade Federal do Ceará – UFC ____________________________________________________ Profa. Dra. Cristiane Pinto Oliveira Universidade Federal do Ceará - UFC
Prof. Dr. Ricardo Emilio Ferreira Quevedo Nogueira Universidade Federal do Ceará – UFC
Ao meu amado e saudoso pai, Raimundo
Bezerril de Melo (in memorian).
O senhor sempre me incentivou a realizar
meus sonhos.
AGRADECIMENTOS
Quero agradecer, em primeiro lugar, a Deus, pela força e perseverança
durante esta caminhada. Eu sei que Ele sempre está ao meu lado.
Aos meus pais, Raimundo Bezerril (in memorian) e Estela Freire, por esta
conquista tão desejada e por me ensinarem a ser uma pessoa honesta e
comprometida com tudo a que me proponho. A minha irmã Érika e aos meus
sobrinhos Lavoisier Felipe e Erick Lucan, vocês são preciosos e meus maiores
presentes!
A minha querida tia Graciete pelo seu carinho e atenção. A senhora é uma
mãe para mim.
O apoio e incentivo do meu tio Alencar e o exemplo de coragem e força do
meu tio Assis.
Ao meu namorado Domingos Sávio pelo apoio, compreensão e paciência.
Ao Sr. Felipe, Dna. Rogéria, Luciana, Tiago e Camila por sempre me
acolherem tão bem nessa família generosa. Em especial, ao Sr. Felipe pela correção
desta dissertação. Muito obrigada!
A professora Dra. Judith Pessoa de Andrade Feitosa pela orientação e
contribuição para o meu desenvolvimento e formação acadêmica.
Ao professor. Dr. Men de sá Moreira de Souza pela confiança e por me
oportunizar o mundo da pesquisa sempre de maneira generosa. Seu
companheirismo ao ir na bancada procurando saber realmente o que se passava na
pesquisa foi essencial. Sua sensibilidade e percepção vão muito além da pesquisa.
Muito obrigada!
A Dra. Morsyleide de Freitas Rosa também pela oportunidade de fazer parte
do grupo de pesquisa e por sempre ser tão solícita todas as vezes que eu precisei.
A professora Dra. Cristiane Oliveira e professor Dr. Ricardo Emílio Nogueira
pelas significativas contribuições a este trabalho.
Aos meus colegas do Laboratório de Tecnologia da Biomassa – Hálisson,
Vitória, Hélder, Elígenes, Edna, Celso, Avelino, Aurélio, Priscila, Niédja, Lídia,
Matheus, Amanda, Túlio, Joan, Aldo, Fábio e Talita. A Menta, Gabriela, Yana,
Vanessa, Rayane, Andressa e Juliana do grupo específico do pescado e por tudo
que ainda poderemos descobrir com a pesquisa. Ao Eden pela ajuda com as
análises. A Lílian, Ana Cassales, Natália e Ídila, pela ajuda em análises e por se
disporem sempre da melhor maneira possível para o desenvolvimento dos trabalhos.
Em especial a amiga Nágila pela ajuda em decisões importantes em alguns
momentos e sempre me ouvir! Os vários aprendizados do convívio diário neste
grupo certamente leverei eternamente comigo.
Aos amigos Elenilda, Lindovânia, Raquel, Cyntia, Alessandro. Amigos que
ingressaram comigo na graduação e me acompanham, apoiam e torcem pelo meu
crescimento profissional.
A professora Selma Mazzetto do Laboratório de Tecnologia de Processos e a
professora Nágila Ricardo do Laboratório de Polímeros e Inovação de Materiais,
pelas realização de análises, ambas do Departamento de Química Orgânica e
Inorgânica, da Universidade Federal do Ceará.
Ao Agnaldo, Joel e Leal do Laboratório de Microscopia Eletrônica do
Departamento de Geologia e ao Laboratório de raios – x, do Departamento de
Física, da Universidade Federal do Ceará, pelas análises realizadas.
A Capes pelo apoio financeiro.
Agradeço a Embrapa, instituição que apoiou a presente proposta de projeto
de dissertação quanto ao seu desenvolvimento com base nas ações de cooperação
técnica entre Embrapa Agroindústria Tropical por meio do seu Laboratório de
Tecnologia da Biomassa – LTB -, com o Programa de Pós Graduação em Química
da Universidade Federal do Ceará – UFC -, sendo as atividades de dissertação
desenvolvidas como parte integrante das ações do projeto “Embrapa–BNDES -
Ações estruturantes e inovação para o fortalecimento das cadeias produtivas da
Aquicultura no Brasil”, comtemplando o apoio institucional e financeiro necessários
para o desenvolvimento da pesquisa.
“...Mas é preciso ter manha
É preciso ter graça
É preciso ter sonho sempre
Quem traz na pele essa marca
Possui a estranha mania
De ter fé na vida...”
(Milton Nascimento)
RESUMO
Compostos à base de fosfato de cálcio, dentre esses a hidroxiapatita,
registram diversas aplicações tecnológicas, a exemplo de biocompósitos. A
hidroxiapatita é muito utilizada como biomaterial devido à sua excelente
biocompatibilidade. Escamas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) são
compostas de uma fração orgânica (colágeno) e outra inorgânica (principalmente
fosfatos). Assim como as peles, são ótimas fontes para extração de
colágeno/gelatina. O objetivo deste trabalho consistiu na extração e caracterização
de hidroxiapatita de escamas e gelatina da pele de pescado para produção de
biocompósito como alternativa de aproveitamento desse resíduo. Empregou-se um
tratamento térmico alcalino para a obtenção da hidroxiapatita e álcali/ácido para a
gelatina. A escama foi caracterizada em termos de cinzas, umidade, lipídeos,
proteínas e minerais. Os materiais obtidos foram caracterizados por técnicas de
calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TG), espectroscopia de
infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), difração de raio-x (DRX),
microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de energia dispersiva
(EDS), cromatografia por permeação em gel (GPC) e ponto isoelétrico da gelatina. A
presença de hidroxiapatita na escama foi demostrada não só pela análise de
minerais (Ca e P) e EDS com picos intensos, mas também pelo teor de cinzas de
28,39%, confirmando a fase mineral. No MEV, as partículas minerais aparecem
interligadas entre as fibras colagenosas das escamas e as bandas típicas do FTIR
em 567 e em 603 cm-1, característicos de vibrações P-O, 1045 cm-1, podem estar
associadas à ligação P-O em grupos PO43-
, e as bandas de 3440 cm-1 e 1645 cm-1
são típicas das ligações O-H. Além disso, o DRX confirma a fase cristalina de
hidroxiapatita, reforçando que a escama é uma fonte do material. A caracterização
da gelatina também mostra que possui peso molecular considerado bom, de acordo
com a fonte de obtenção, assim como as bandas de FTIR confirmam presença de
contituintes típicos de amida I, II e III. O ponto isoelétrico encontrado foi PI = pH =
8,6. Os tratamentos apresentam potencial para obtenção de hidroxiapatita e
gelatina, assim como desenvolvimento de biocompósito.
Palavras-chave: hidroxiapatita, escamas de tilápia e biocompósitos.
ABSTRACT
Compounds based on calcium phosphate, among them hydroxyapatite,
record several technological applications, such as biocomposites. Hydroxyapatite is
widely used as biomaterial because of its excellent biocompatibility. Scales of Nile
tilapia (Oreochromis niloticus) are composed of an organic fraction (collagen) and
another inorganic (mainly phosphates). The skins, they are great sources for
extracting collagen/gelatine. The objective of this work was the extraction and
characterization of hydroxyapatite of fish skin and scales, gelatine for the production
of biocomposite as an alternative for the recovery of this residue. An alkaline heat
treatment was used to obtain hydroxyapatite and alkali/acid for gelatin. The scale
was characterized in terms of ash, moisture, lipids, proteins and minerals. The
obtained materials were characterized by differential scanning calorimetry (DSC),
thermogravimetry (TG), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), X-ray
diffraction (XRD), scanning electron microscopy (SEM), spectroscopy of Dispersive
energy (EDS), gel permeation chromatography (GPC) and isoelectric point of gelatin.
The presence of hydroxyapatite in the scale was demonstrated not only by the
analysis of minerals (Ca and P) and EDS with intense peaks, but also by the ash
content of 28.39%, confirming the mineral phase. In the SEM, the mineral particles
appear interconnected between the collagenous fibers of the scales and the typical
FTIR bands at 567 and 603 cm-1, characteristic of P-O vibrations, 1045 cm-1, may be
associated with P-O bonding in PO43- groups, and The bands of 3440 cm-1 and 1645
cm-1 are typical of the O-H linkages. In addition, the XRD confirms the crystalline
phase of hydroxyapatite, reinforcing that the scale is a source of the material. The
characterization of gelatine also shows that it has a good molecular weight according
to the source of the production, just as the FTIR bands confirm the presence of
typical amide I, II and III constituents. The isoelectric point found was PI = pH = 8,6.
The treatments present potential for obtaining hydroxyapatite and gelatine, as well as
development of biocomposite.
Key words: hydroxyapatite, tilapia scales and biocomposites.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Quantidade produzida de peixes segundo as Unidades da Federação -
2015 .......................................................................................................................... 22
Figura 2 – Quantidade produzida e valor da produção de peixes segundo a espécie
ou grupos de peixes – Brasil - 2015. ......................................................................... 23
Figura 3 – Utilização da produção das pescas mundiais - 2014 ............................... 24
Figura 4 – Imagem da escama de tilápia do Nilo em microscópio estereoscópio
trinocular.................................... ................................................................................ 25
Figura 5 – Pele de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) ......................................... 25
Figura 6 – Imagem da estrutura hierárquica do osso normal em várias escalas de
comprimento .............................................................................................................. 27
Figura 7 – Célula unitária e rede cristalina da hidroxiapatita ..................................... 28
Figura 8 – Estrutura básica da gelatina e principais aminoácidos ............................. 33
Figura 9 – Estrutura da Riboflavina ........................................................................... 35
Figura 10 – Hipótese para reação de reticulação da gelatina com riboflavina .......... 36
Figura 11 - Fluxograma de limpeza e pré-tratamento das escamas de tilápia do Nilo38
Figura 12 - Fluxograma de extração da nano-hidroxiapatita a partir das escamas de
tilápia do Nilo ............................................................................................................. 40
Figura 13 – Fluxograma de extração da gelatina a partir das peles de tilápia do Nilo42
Figura 14 – Fluxograma de obtenção dos biocompósitos de gelatina e nano-
hidroxiapatita ............................................................................................................. 44
Figura 15 - Gráfico de TGA/DTG da escama ........................................................... 56
Figura 16 – Gráfico de DSC da escama .................................................................... 57
Figura 17 – Micrografias da escama de tilápia (a) escama inteira (b), (c) e (d) da
escama moída ........................................................................................................... 58
Figura 18 - Espectro de FT-IR da nano-hidroxiapatita obtida da escama ................. 59
Figura 19 – Difratograma da nano-hidroxiapatita obtida da escama ......................... 61
Figura 20 – Micrografia da nano-hidroxiapatita ......................................................... 62
Figura 21 – Gráfico de EDS da nano-hidroxiapatita .......................................................................... 63
Figura 22 – Gráfico de TGA/DTG da gelatina de pele ............................................... 64
Figura 23 – Gráfico de DSC da gelatina obtida da pele ............................................ 65
Figura 24 – Espectro de FT-IR da gelatina obtida da pele ........................................ 66
Figura 25 – Micrografias da gelatina de pele de tilápia ............................................. 68
Figura 26– Curva de distribuição de massa molar da gelatina .................................. 68
Figura 27 – Gráfico de ponto isoelétrico da gelatina ................................................. 69
Figura 28 – Imagens dos biocompósitos antes da liofilização ................................... 70
Figura 29 – Imagens dos biocompósitos antes e após a exposição a radiação ultra
violeta: (a) Gel 5%+HAp 1%+Rib 0,05%, (b) Gel 5% + HAp 1% + Rib 0,1% ............ 71
Figura 30 – Imagens dos biocompósitos antes e após a exposição a radiação ultra
violeta: (a) Gel 5%+HAp 2,5%+Rib 0,05%, (b) Gel 5% + HAp 2,5% + Rib 0,1% ...... 72
Figura 31 – Imagens dos biocompósitos liofilizados ................................................. 73
Figura 32 – Gráfico de TGA dos biocompósitos de gelatina com nano-hidroxiapatita74
Figura 33 – Gráfico de DTG dos biocompósitos de gelatina com nano-hidroxiapatita75
Figura 34 – Espectro de FT-IR dos biocompósitos de gelatina com nano-
hidroxiapatitas ........................................................................................................... 77
Figura 35 – Micrografias dos biocompósitos ............................................................. 80
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Propriedades de fosfatos de cálcio biologicamente relevantes ............... 29
Tabela 2 – Métodos para obtenção de hidroxiapatita ................................................ 30
Tabela 3 – Classificação do colágeno ....................................................................... 31
Tabela 4 – Formulações dos compósitos de gelatina e nano-hidroxiapatita ............. 43
Tabela 5 – Determinação de minerais de escama de tilápia do Nilo (Oreochromis
niloticus) .................................................................................................................... 54
Tabela 6 – Resumo das análises de caracterizações da escama de tilápia do Nilo
(Oreochromis niloticus) ............................................................................................. 55
Tabela 7 – Perdas de massa das curvas de TGA/DTG da escama .......................... 55
Tabela 8 – Bandas do espectro de infravermelho e tipos de vibrações da nano-
hidroxiapatita ............................................................................................................. 60
Tabela 9 – Identificação de elementos em massa da hidroxiapatita ......................... 63
Tabela 10 – Perdas de massa das curvas de TGA/DTG da gelatina ........................ 64
Tabela 11 – Bandas do espectro de infravermelho e tipos de vibrações da gelatina 67
Tabela 12 – Perdas de massa das curvas de TGA/DTG dos biocompósitos ............ 75
Tabela 13 – Bandas do espectro de infravermelho e tipos de vibrações dos
biocompósitos ........................................................................................................... 78
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ca Cálcio Co Cobalto Cu Cobre DRX Difração de raio-x DSC Calorimetria Diferencial de Varredura DTG Termogravimetria Derivada EDS Espectroscopia de Energia Dispersiva FAO Organização para Alimentação e Agricultura Fe Ferro FTIR Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier GPC Cromatografia por Permeação em Gel HA Hidroxiapatita K Potássio MAPA Ministério da Pesca e Agricultura MEV Microscopia Eletrônica de Varredura Mg Magnésio Mn Manganês Na Sódio nHA Nano-hidroxiapatita OCDE Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico P Fósforo pH Potencial Hidrogeniônico PI Ponto Isoelétrico S Enxofre TGA Análise Térmica Gravimétrica Zn Zinco
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 17
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 20
2.1 Geral.................................................................................................................... 20
2.2 Específico ............................................................................................................ 20
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 21
3.1 Produção de pescado ......................................................................................... 21
3.2 Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) ................................................................ 24
3.3 Hidroxiapatita ...................................................................................................... 26
3.3.1 Estrutura e composição .................................................................................... 26
3.3.2 Aplicações e formas de obtenção .................................................................... 28
3.4 Gelatina ............................................................................................................... 31
3.5 Compósito de hidroxiapatita e gelatina ............................................................... 33
3.6 Reticulação com riboflavina ................................................................................. 34
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 37
4.1 Materia-prima e reagentes .................................................................................. 37
4.2 Metodologia ......................................................................................................... 37
4.2.1 Hidroxiapatita ................................................................................................... 37
4.2.1.1 Limpeza e pré-tratamento das escamas ....................................................... 37
4.2.1.2 Extração da hidroxiapatita/nano-hidroxiapatita .............................................. 39
4.2.2 Extração da gelatina ......................................................................................... 40
4.2.2.1 Preparação das peles de tilápia .................................................................... 41
4.2.2.2 Etapa básica .................................................................................................. 41
4.2.2.3 Etapa ácida ................................................................................................... 41
4.2.2.4 Extração de gelatina ...................................................................................... 41
4.2.3 Obtenção dos biocompósitos ........................................................................... 42
5 CARACTERIZAÇÕES ........................................................................................... 45
5.1 Caracterização dos macronutrientes da escama ................................................ 45
5.1.1 Cinzas e umidade. ............................................................................................ 45
5.1.2 Lipídeos ............................................................................................................ 45
5.1.3 Proteínas .......................................................................................................... 46
5.1.4 Minerais ............................................................................................................ 48
5.2 Análise Termogravimétrica (TGA) ....................................................................... 49
5.3 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) ........................................................ 49
5.4 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR). .......... 50
5.5 Análise de Difração de Raio-X (DRX) ................................................................. 50
5.6 Microscopia Eletrônica por Varredura (MEV) com Espectroscopia de Energia
Dispersiva (EDS) ....................................................................................................... 50
5.7 Microscopia Eletrônica por Varredura (MEV) ...................................................... 51
5.8 Cromatografia por Permeação em Gel (GPC) ..................................................... 51
5.9 Ponto Isoelétrico da Gelatina .............................................................................. 52
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................... 53
6.1 Caracterização da escama .................................................................................. 53
6.1.1 Caracterização de Macronutrientes da escama ............................................... 53
6.1.2 Análise Termogravimétrica ............................................................................... 55
6.1.3 Calorimetria Exploratória Diferencial ................................................................ 57
6.1.4 Microscopia Eletrônica por Varredura .............................................................. 58
6.2 Caracterização da nano-hidroxiapatita ................................................................ 59
6.2.1 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier ..................... 59
6.2.2 Difração de Raio-x ............................................................................................ 60
6.2.3 Microscopia Eletrônica por Varredura (MEV) com Espectroscopia de Energia
Dispersiva.................................................................................................................. 61
6.3 Caracterização da gelatina .................................................................................. 64
6.3.1 Análise Termogravimétrica ............................................................................... 64
6.3.2 Calorimetria Exploratória Diferencial ................................................................ 65
6.3.3 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier ..................... 66
6.3.4 Microscopia Eletrônica por Varredura .............................................................. 67
6.3.5 Cromatografia por Permeação em Gel ............................................................. 68
6.3.6 Ponto Isoelétrico da gelatina ............................................................................ 69
6.4 Caracterização dos biocompósitos ...................................................................... 70
6.4.1 Análise Termogravimétrica ............................................................................... 74
6.4.2 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier ..................... 77
6.4.3 Microscopia Eletrônica por Varredura .............................................................. 79
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 81
8 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 82
17
1 INTRODUÇÃO
Dados de 2015 da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento
Econômico – OCDE – , apontam que o Brasil é o segundo maior fornecedor mundial
de alimentos. Assim como, dados de 2010 da Organização para a Alimentação e
Agricultura – FAO -, das Nações Unidas, já mostravam que os setores da pesca e
aquicultura desempenhariam um papel importante na segurança alimentar do Brasil,
devido não apenas ao fornecimento de uma fonte importante de proteínas de alto
valor nutricional, mas também devido à atividade pesqueira ser uma fonte de
subsistência para milhões de famílias.
O volume de pescado continua aumentando gradativamente de acordo
com dados estatísticos da FAO (2016), onde a produção global de peixes poderia
crescer 1,8 % para 174,1 milhões de toneladas em 2016, impulsionada por uma
expansão de 5 % da aquicultura para 81,4 milhões de toneladas, confirmando assim,
o setor como principal impulso para o crescimento da pesca. Observa-se que a
demanda de peixe pelos consumidores continua forte, com mais pessoas no mundo
apreciando os benefícios para a saúde do consumo regular de peixe.
Ainda sobre alguns dados da FAO (2016), as perspectivas para a
indústria especificamente de tilápia cultivada no mundo permanecem promissoras.
A demanda é crescente em uma série de mercados na Ásia, África, América Latina e
Caribe. Alguns países estão seguindo para expandir significativamente suas
indústrias de cultivo de tilápia, em particular, os setores indiano e brasileiro que
deverão receber grandes investimentos de fontes governamentais e privadas, o que
pode impulsionar a oferta global no longo prazo.
Apesar do crescimento e das animadoras perspectivas do setor, são
grandes os desafios diante de alguns obstáculos dentro da produção de pescado.
Esse aumento também se refletirá na geração de resíduos oriundos do
processamento do pescado que visa à obtenção principal do filé para
comercialização.
A propósito, Seibel & Soares (2003) afirmam que, no Brasil, o
aproveitamento dos resíduos da industrialização de pescado é pequeno e que, na
indústria, aproveitam-se as sobras para preparo de farinha de pescados. Também a
utilização de parte do que é considerado como resíduo ajuda a reduzir os custos,
gerando produtos como fertilizantes, óleos e silagens para a produção própria de
18
ração animal, e biodiesel como fonte alternativa de combustíveis (FELTES et al,
2010).
Muitos resíduos não são, porém, ainda aproveitados de forma produtiva.
Segundo Costa (2012), a geração de resíduo em alguns casos pode chegar a mais
de 50% do peso inicial da matéria-prima, no caso, o pescado. Esses resíduos são
principalmente vísceras, cauda, coluna vertebral, barbatana, escamas e restos de
carne (FELTES et al., 2010). As escamas são importantes resíduos sólidos da
indústria de pescado, representando aproximadamente 1% do peso total do peixe,
podendo provocar um problema de logística na distribuição deste resíduo, caso não
se imponha um destino adequado (WEISS et al., 2015). De acordo com Vidotti et al.
(2011), a escama pode ser uma eficiente alternativa para tratamento de efluentes,
porque é um biomaterial que apresenta propriedades adsortivas.
Nesse contexto, um dos desafios postos é agregar valor a esse resíduo
que ainda não se reveste de valor comercial e, adicionalmente, minimizar danos
ambientais, a exemplo do descarte inadequado deles em aterros sanitários, podendo
ser fonte de contaminação de solos e corpos d’água.
Uma das possíveis alternativas para agregação de valor a esses resíduos
é o isolamento de hidroxiapatita – HAp - a partir das escamas de peixe. Segundo
Ikoma et al (2013), a escama é composta por duas regiões distintas: uma camada
externa óssea e uma placa fibrilar interna, onde as fibras de colágeno estão
organizadas em lamelas. Devido a essas características, muito tem sido pesquisado
com relação a sua utilização como fonte de obtenção de materiais de grande
interesse comercial.
Neste sentido, a região externa da escama pode ser utilizada para
extração de HAp, um composto à base de fosfato de cálcio, de fórmula
estequiométrica Ca10(PO4)6(OH)2, sendo um dos materiais mais semelhante à fração
inorgânica dos ossos e dentes (BOUTINGUIZA et al., 2012; KONGSRI el al., 2013).
Além disso, a HAp, pode ser utilizada para formulação de biocompósitos devido a
características como ausência de toxicidade e ausência à resposta a corpo estranho
e inflamações (KAWACHI et al., 2000).
Dentre os resíduos de pescado, existem também algumas fontes para a
obtenção de colágeno e gelatina, visto que a gelatina é obtida da hidrólise do
colágeno. As principais matérias-primas utilizadas na produção de gelatina são
ossos bovinos, peles de bovinos e suínos (GMIA, 2012). Todavia, várias fontes
19
alternativas incluem aves e peixes. As peles de peixes e até mesmo as escamas são
fontes ricas em colágeno e podem ser utilizadas para extração de gelatina.
Considere-se também que a gelatina é amplamente utilizada pela
indústria alimentar, além do que é, ainda, útil nas áreas de medicina, farmacêutica e
fotografia (IRWANDI et al., 2009).
Existe, por isso, uma busca crescente para o aproveitamento dos
resíduos de pescado para aplicação como fonte alternativa e tecnológica, devido à
alta quantidade gerada pela intensa produção do beneficiamento para obtenção de
filé de pescado.
Em alguns casos, obtêm-se biomateriais que podem ser utilizados em
várias áreas, como odontologia, medicina e farmacêutica. De acordo com Hossan et
al. (2014), os avanços mais importantes no campo dos biomateriais ao longo dos
últimos anos têm sido em biomateriais bioativos. Os compósitos produzidos com
hidroxiapatita e polímeros naturais apresentam benefícios de composição por
possuírem semelhante ao sistema natural (RUNGSIYANONT et al., 2014).
Dessa forma, com base no contexto apresentado, percebe-se como
oportunidade para estudos e elaboração, caracterização e avaliação de compósitos
a partir de hidroxiapatita e gelatina, ambas obtidas a partir dos resíduos do
processamento da tilápia, escamas e peles, respectivamente.
20
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Obter e caracterizar bionanocompósitos com base em nanohidroxiapatita
e gelatina obtidos a partir de resíduos de beneficiamento de tilápia (Oreochromis
niloticus).
2.2 Específicos
i. Extrair e caracterizar por métodos químicos, termogravimétricos e
microscópicos a hidroxiapatita das escamas e a gelatina da pele de tilápia do Nilo
(Oreochromis niloticus);
ii. Empregar a riboflavina como agente de reticulaçao da gelatina;
iii. Avaliar os bionanocompósitos obtidos em relação às suas propriedades
químicas, térmicas e morfológicas.
21
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Produção de pescado
De acordo com a publicação, O estado das pescas e da aquicultura no
mundo (2016), que se baseia em dados da FAO, a produção de pescado chegou a
atingir mais de 101 mil toneladas em 2014. Entre os vinte e cinco produtores de
principais espécies (peixes, moluscos, crustáceos, plantas aquáticas entre outros),
neste cenário os três maiores produtores foram a China, atingindo o percentual de
58,16% (58.795,3 mil toneladas), a Indonésia, com 14,17% (14.330,9 mil toneladas)
e a Índia, com 4,83% (4.884,0 mil toneladas). O Brasil ocupou o 14º lugar,
contribuindo com 0,55% (562,5 mil toneladas) dessa produção.
Segundo dados do IBGE (2015), a produção total de peixes da
piscicultura brasileira foi de 483,24 mil toneladas em 2015, representando um
aumento de 1,8% em relação ao ano anterior que foi de 474,3 mil toneladas.
Apresentou aumentos nas Regiões Norte (6,2%), Sudeste (12,7%) e Sul (13,1%). No
Nordeste e Centro-Oeste, registrou quedas de 4,7% e 19,7%, respectivamente.
Ainda nesse contexto, a produção regional teve o município de Rio Preto
da Eva (AM) como o principal produtor nacional de peixes, registrando a despesca
de 14,10 mil toneladas. O município de Jaguaribara (CE), mesmo com a queda de
18,4% de sua produção, continuou na segunda posição, com 13,80 mil toneladas,
sendo a tilápia a única espécie produzida.
A esta queda observada foi atribuída à grande mortandade de peixes no
Açude Castanhão em 2015, em virtude da baixa no reservatório de água e da falta
de oxigenação, fatores que levaram à perda de cerca de 3,00 mil toneladas da
espécie. A Figura 1 apresenta dados da produção de peixes por região no Brasil no
ano de 2015.
Dentro deste panorama, observa-se que a aquicultura tem-se expandido
muito nos últimos anos, e que o Ceará foi o maior produtor da região Nordeste no
ano de 2015, com 5,8% da produção total, que corresponde a 27.896,1 toneladas
(PPM, 2015).
22
Figura 1 - Quantidade produzida de peixes segundo as Unidades da Federação - 2015.
Fonte: Adaptado de IBGE, Diretoria de Pesquisas, Pesquisa da Pecuária Municipal 2015.
Quando avaliado por espécie (Figura 2), especificamente, a tilápia segue
como a espécie mais criada, representando 45,4% (219,33 mil toneladas) da
produção total nacional de pescado.
A perspectiva de aumento e os próprios dados apresentados mostram
que o pescado vem sendo uma das proteínas mais consumidas no mundo. Segundo
dados do Anuário de Pescados (2015), esse aumento do consumo deve-se,
principalmente, a uma maior divulgação dos benefícios proporcionados à saúde, já
que os pescados são ótimas fontes de vitaminas, minerais e Ômega 3 de alta
qualidade.
Geralmente, desse pescado, são obtidos filés do peixe, por meio de
filetagem, que propicia cerca de 17 a 30% de aproveitamento (MORAIS et al., 2013),
sendo o restante considerado resíduo.
Segundo a FAO (2016), dentro deste cenário apresentam-se dados sobre
as formas de utilização da produção de pesca mundial conforme a Figura 3. Houve
evolução nas últimas décadas dos processos de refrigeração, transporte e
distribuição, ou seja, a infra-estrutura cresceu. Porém, pode-se observar que apesar
disso, cerca de 20 milhões de toneladas do pescado é direcionado a usos não
23
alimentares e neles se incluem os resíduos.
Figura 2 - Quantidade produzida e valor da produção de peixes, segundo a espécie ou grupo de peixes - Brasil - 2015.
Fonte: IBGE, Diretoria de Pesquisas, Pesquisa da Pecuária Municipal 2015.
24
Figura 3 - Utilização da produção das pescas mundiais, 2014.
Fonte: Adaptado da publicação - O estado das pescas e da aquicultura no mundo, 2016.
3.2 Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)
A tilápia, incluindo todas as espécies, é o segundo grupo mais importante
de peixes cultivados em viveiro depois das carpas (ZENG et al., 2009). De acordo
com dados do Panorama da Aquicultura, dentre mais de 70 espécies de tilápias, a
maioria delas oriundas da África, quatro espécies destacam-se na aquicultura
mundial, sendo uma delas a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus).
Esta espécie apresenta características que favorecem que ela seja a
principal espécie cultivada para fins de comercialização, principalmente pelo seu
baixo custo. Segundo Sousa (2001), a tilápaia atinge peso em curto intervalo de
tempo, mostra resistência a doenças, oferece carne branca e de textura firme, de
sabor pouco acentuado e de extraordinária aceitação.
As escamas das tilápias (Figura 4), que representam um dos resíduos
gerados na filetagem, são ciclóides, normalmente finas, subcirculares e com a
margem lisa (MARTINS, 2015). Elas são formadas por duas fases, uma orgânica,
basicamente fonte de colágeno e gelatina, e outra inorgânica fonte de fosfato de
cálcio, a hidroxiapatita.
25
Figura 4 – Imagem da escama de tilápia do Nilo em microscópio estereoscópio trinocular. Aumento
225x.
Fonte: Vasconcelos, 2016.
A pele (Figura 5), que também é um resíduo da filetagem da tilápia, é uma
fonte rica em colágeno e consequentemente em gelatina, visto que ela é produto da
hidrólise parcial do colágeno.
Figura 5 – Pele de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus).
Fonte: Autora, 2015.
26
A busca por novas fontes para produção de gelatina para fins comerciais
justifica o crescente estudo dos animais aquáticos, além das conhecidas fontes que
são as peles de bovinos e suínos. De acordo com Martins (2015), as peles de peixe
são especialmente adequadas como fonte de gelatina por serem facilmente
extraídas a temperatura moderada, resultando em alta produção.
Dessa forma, escamas e peles de tilápia são ótimas fontes de
hidroxiapatita e gelatina, pois são resíduos de baixo custo e de grande importância
para a produção de biomateriais de alto valor agregado.
3.3 Hidroxiapatita
3.3.1 Estrutura e composição
A hidroxiapatita – HAp -, é um material cerâmico à base de fosfato de
cálcio hidratado e basicamente formado por três elementos principais: cálcio, fósforo
e oxigênio (MAVROPOULOS, 1999). Conhecido pela fórmula molecular
Ca10(PO4)6(OH)2, apresenta uma razão molar Ca/P = 1,67. Devido a sua composição
semelhante ao osso natural (Figura 6), tem sido amplamente usada como material
de implantes. É também semelhante à parte inorgânica dos dentes. Segundo
Boutinguiza et al. (2012), devido a hidroxiapatita apresentar aspectos de densidade
e porosidade, ela tem sido intensamente investigada como material de implante para
aplicações ortopédicas e dentárias, apresentando excelente bioatividade,
osteocondutividade e osteoindutividade, de modo que essas suas características
justificam o crescente interesse e estudo para sua obtenção.
27
Figura 6 – Imagem da estrutura hierárquica do osso normal em várias escalas de comprimento.
Fonte: Adaptada de Sadat-Shojai et al., 2013.
Estruturalmente, a hidroxiapatita é um composto formado por uma célula
unitária hexagonal, da qual dez íons de cálcio estão localizados em sítios não
equivalentes, sendo quatro no sítio I, tetraédricos – Ca I e seis no sítio II, octaédricos
– Ca II. Os íons de cálcio no sítio I estão alinhados em colunas, enquanto os íons de
cálcio do sítio II estão em triângulos equiláteros perpendiculares à direção do plano
C da estrutura. Os cátions do sítio I estão coordenados a seis átomos de oxigênio
pertencentes a diferentes tetraedros de PO43-, assim como também a três outros
átomos de oxigênio com uma relativa distância (COSTA el al., 2009). Dessa forma,
a célula unitária apresenta seis grupos fosfato - PO4 em unidades compactas e dois
grupos hidroxila – OH; nele, os quatro sítios cristalinos de oxigênio são distintos O1,
O2, O3 e O4. O O4 é o oxigênio da hidroxila e os demais estão ligados ao fósforo -
P. A Figura 7 representa essa estrutura.
28
Figura 7 – Célula unitária e rede cristalina da hidroxiapatita.
Fonte: (http://www.chemtube3d.com/solidstate/SShydroxyapatite.htm, acessado em 04/09/2016.)
Um arranjo hexagonal no plano perpendicular ao eixo cristalino de mais
alta simetria, o eixo C, é formado por átomos de cálcio e fósforo. Além disso, ligam-
se entre si por meio de íons fosfato, os íons óxidos (O2-) e os íons de cálcio (Ca2+),
formando colunas pelo empilhamento de triângulos equiláteros.
3.3.2 Aplicações e formas de obtenção
Conforme a sua semelhança com os fosfatos de cálcio naturais, a HAp
sintética vem sendo utilizada para a confecção de produtos biomédicos e
biomateriais, como implantes ósseos na área de ortopedia e implantes dentários
(KONGSRI et al., 2013), e na área de farmacologia e cosméticos, por sistemas de
distribuição de fármacos para um efeito prolongado e produtos de higiene, como
cremes dentais com função de polidor (SOUZA, 2011) .
Ainda devido às suas características superficiais como porosidade e
capacidade adsortiva, despertou grande interesse para a remoção de íons poluentes
de metais pesados da água e solos contaminados (MAVROPOULOS, 1999;
BANDEIRA, 2007).
29
De acordo com a aplicação da HAp, têm-se utilizado várias formas para
obtenção desse material, principalmente quando é necessário um controle da sua
estrutura (SADAT-SHOJAI et al., 2013). Dependendo do processo utilizado para
obtenção da hidroxiapatita, suas características físico-químicas são diferentes
(COSTA et al., 2009). Algumas propriedades de fosfatos de cálcio biologicamente
relevantes estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1 - Propriedades de fosfatos de cálcio biologicamente relevantes.
Composto Fórmula química Sigla Razão Ca/P
Solubilida- de a 25 °C,
pKps
pH de
estabilidade em solução
aquosa a 25 °C
Fosfato de monocálcio
monohidra-tado Ca(H2PO4)2.H2O MCPM 0,5 1,14 0,0-2,0
Fosfato de dicálcio
dihidratado CaHPO4 .2H2O DCPD 1,0 6,59 2,0-6,0
Fosfato de octacálcio
Ca8(HPO4)2(PO4)4
.5H2O OCP 1,33 96,6 5,5-7,0
α-Fosfato tricálcico
α-Ca3(PO4)2 α-TCP 1,5 25,5 [a]
β-Fosfato tricálcico
β-Ca3(PO4)2 β-TCP 1,5 28,9 [a]
Fosfato de cálcio amorfo
Cax(PO4)y .nH2O ACP 1,2-2,2 [b] [c]
Hidroxiapatita cácio deficiente
Ca10-x(HPO4)x
(PO4)6-x(OH)2-x, (0<x<1)
CDHA 1,5-1,66
≈85,1 6,5-9,5
Hidroxiapatita Ca10(PO4)6(OH)2 HA 1,67 116,8 9,5-12 Fosfato de tetracalcio
Ca4(PO4)2O TTCP 2,0 38-44 [a]
[a] Esses compostos não podem ser precipitados a partir de uma solução aquosa.
[b] Não pode ser mensurado com precisão.
[c] Sempre metaestável. A composição de um precipitado depende do valor de pH da solução.
Fonte: Adaptado de Dorozhkin, 2002.
Quanto à obtenção, os métodos usados são conhecidos como vias de
síntese. De acordo com a literatura, eles apresentam em muitos casos
particularidades do processo, assim como vantagens, e podem ser classificados de
acordo com a forma de obtenção. A Tabela 2 apresenta diferentes métodos para
obtenção de hidroxiapatita.
30
Tabela 2 – Métodos para obtenção de hidroxiapatita.
Métodos Materiais de Partida Referências
Secos
Ca(OH)2-P2O5 e
CaO-Ca(OH)2-P2O5 KIM et al., 2000
CaO, P2O5, SiO2 e
outros aditivos PRAMANIK et al., 2007
(Ca(H2PO4)2.H2O, Ca(OH)2 e
polietilenoglicol (PEG) TSENG et al., 2009
Por via úmida
Ca(OH)2 e H3PO4 LAZIC´ et al., 2001
Ca(NO3)2 e H3PO4 KONG et al., 2002
α-Ca3(PO4)2 e α-TCP PARK et al., 2004
(CH3O)3P e fontes de Ca e P CHEN et al., 2011
Processos de alta
temperatura
CaO e P2O5 AYERS et al., 2007
FeSO4, FeCl3, Ca(N)3)2 e
H3(PO)4 WAKIYA et al., 2010
Ca(NO3)2, (NH4)2HPO4,
CH4N2O e C2H5NO2 GHOSH et al. 2011.
Síntese com base
em fontes
biogênicas
Osso bovino RUKSUDJARIT et al., 2008
Osso bovino HERLIANSYAH et al., 2009
Casca de ovo MESKI et al., 2010
Escama de peixe,
Labeo rohita MONDAL et al., 2010
Escama de peixe,
tilápia, Oreochromis sp. HUANG et al., 2011
Escama de peixe,
tilápia do Nilo KONGSRI et al. , 2013
Escama de peixe, tilápia FARA et al. , 2014
Procedimentos
combinados
Ca3(PO4)2, CaHPO4 e
osso bovino JINAWATH et al., 2002
CaCO3 e H3PO4/
(CH3COO)2Ca e K2HPO4/
Ca(OH)2 e (NH4)2HPO4
MOSTAFA et al., 2005
Ca(NO3)2.4H2O, CTAB e
Na2HPO4 ARAMI et al., 2009
Ca(NO3)2, NH4OH e
(C2H5)3HPO4 WANG et al., 2009
Fonte: Adaptada de Sadat-Shojai, 2013.
31
3.4 Gelatina
A gelatina é uma proteína derivada a partir de subprodutos animais,
obtida na hidrólise parcial do colágeno originado de cartilagens, ossos, tendões e
peles de animais (Tabela 3). Segundo Schrieber & Gareis (2007), a gelatina é
produzida pela hidrólise parcial do colágeno nativo e durante a fabricação de
gelatina, matérias-primas animais podem ser pré-tratadas com ácido diluído ou
álcali, resultando na clivagem parcial das ligações cruzadas. O colágeno é solúvel
em água quente e, assim, a gelatina é formada.
Tabela 3 – Classificação do colágeno.
Tipo Descrição
Tipo I Ocorre largamente, principalmente em tecidos conjuntivos, tais como a
pele, os ossos e os tendões.
Tipo II Ocorre praticamente de modo exclusivo em tecido de cartilagem.
Tipo III Depende fortemente da idade: pele muito jovem pode conter até 50%,
mas, no decorrer do tempo, ele é reduzido a 5-10%.
Outros
tipos
Os outros tipos de colágeno estão presentes em quantidades muito
baixas na maior parte específica do órgão.
Fonte: Adapatada de Schrieber & Gareis, 2007.
A fonte de obtenção está, muitas vezes, ligada às crenças religiosas e
culturais. A gelatina obtida de fontes marinhas detém a vantagem de não estar
associada aos riscos das doenças, como a Encelopatia Espongiforme Bovina,
conhecida por doença da vaca louca, por isso a gelatina de peixe é aceitável. Além
disso, pode ser usada com o mínimo de restrições no judaísmo e hinduísmo (KARIM
& BHAT, 2009).
O processo de extração pode influenciar o comprimento das cadeias
polipeptídicas e as propriedades funcionais da gelatina, o que depende dos
parâmetros de processo (temperatura, tempo e pH), do pré-tratamento, das
propriedades e do método de conservação da materia-prima de partida (KARIM &
BHAT, 2009) .
Martins (2015) afirma que as propriedades funcionais das gelatinas são
dependentes das suas propriedades físico-químicas e estruturais, e são
32
determinantes para definir sua aplicabilidade.
Alguns trabalhos já vêm sendo desenvolvidos para a produção de gelatina
e de outros derivados, a partir do peixe tilápia do Nilo, além de estudos visando a,
por exemplo, possíveis aplicações:
Extração de gelatina a partir de pele de tilápia do Nilo (Oreochromis
niloticus) e obtenção de filmes com propriedades antimicrobianas, de gelatina com
nanopartículas de prata (RODRIGUES, 2015);
Extração de gelatina a partir das escamas de tilápia do Nilo
(Oreochromis niloticus) para aplicá-la como revestimento em filé de peixe resfriado
para avaliar seu desempenho quanto ao processo de deterioração (MARTINS,
2015);
Obtenção e exploração das potencialidades do colágeno, obtido dos
resíduos do beneficiamento da tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), como matriz
polimérica para a elaboração de compósitos com nano-hidroxiapatita, visando à
produção de um material com potencial para utilização como enxerto ósseo
(IBIAPINA, 2015);
Obtenção de gelatina a partir de resíduos do processamento de carne
mecanicamente separada (CMS) de tilápia, comparando suas propriedades com
uma gelatina bovina comercial e, a partir dessas gelatinas, produção de bioblendas
de gelatina e amido de milho (NUNES, 2014);
Produção de um bionanocompósito, de gelatina de resíduos de tilápia e
galactomanana extraída da semente da algaroba, reforçado com nanocelulose de
vagem de algaroba, avaliando o efeito da adição dos nanocristais sobre as
características e desempenho do filme (CRUZ, 2013);
Desenvolvimento de filmes biodegradáveis a partir de gelatina de
resíduos de tilápia avaliando o efeito da adição de nanocristais de celulose sobre as
características e desempenho de filmes biodegradáveis de gelatina de resíduos de
tilápia (SANTOS, 2012).
A Figura 8 apresenta a estrutura básica da gelatina e seus principais
aminoácidos constituintes.
33
Figura 8 - (a) estrutura básica da gelatina, (b) principais aminoácidos presentes na gelatina.
Fonte: Elzoghby, 2013.
3.5 Compósito de hidroxiapatita e gelatina
A seleção de um material de partida que, de alguma forma pode imitar um
outro que naturalmente existe, é um dos pontos mais importantes e decisivos no
desenvolvimento de biomateriais.
Nesse aspecto, os avanços mais importantes no campo dos biomateriais
ao longo dos últimos anos têm sido em biomateriais bioativos (HOSSAN et al.,
2014). Alguns polímeros revelam, porém, uma resistência mecânica relativamente
baixa para algumas aplicações, e uma forma de melhorar essas propriedades
mecânicas dos polímeros é o uso de partículas para reforço. Dessa forma, existem
novas perspectivas para o estudo e desenvolvimento de biomateriais que
proporcionem segura interação e também atuem de forma semelhante às funções
biológicas.
Como exemplo, para Gorgieva & Kokolé (2011), a HAp, que expõe
semelhança ao mineral ósseo, assim como suas propriedades físico-químicas, é
34
bem conhecida pela sua bioatividade e osteocondutividade in vitro e in vivo .
Segundo Demirbay et al., 2017, a gelatina além de várias aplicações
industriais também comprova alguns usos na área da medicina. Na verdade, já
apresentam uma significativa importância, pois propiciam grandes benefícios para a
humanidade, visto que a gelatina é um tipo de proteína e age como um agente de
reticulação químico natural, pois as ligações reticuladas de moléculas de gelatina
podem reter os fármacos e ser usadas em sistemas de administração de fármacos.
Assim, a gelatina com HAp formando um composto é um potencial
biomaterial temporário para a regeneração de tecido duro, pois combina a
bioatividade e a osteocondutividade de HAp com a flexibilidade e característica de
hidrogel da gelatina (KIM et al., 2004; NARBAT et al., 2006; WAHL &
CZERNUSZKA, 2006; CHANG & DOUGLAS, 2007).
3.6 Reticulação com Riboflavina
Apesar de a gelatina ser um biomaterial funcional para a obtenção dos
biocompósitos, algumas vezes é necessário o uso de agentes reticulantes para
melhorar a funcionalização do material com as ligações cruzadas. A adição de
grupos funcionais ao esqueleto da gelatina é uma estratégia de reticulação com grau
de controle sobre o design e propriedades do hidrogel (KLOTZ et al., 2016). Géis
são materiais cujas cadeias poliméricas formam redes poliméricas, e as cadeias
poliméricas são encadeadas com ligações cruzadas, em nível microscópico, por
ligações químicas (SENNA et al., 2012).
Alguns reagentes conhecidos já são utilizados como agentes reticulantes,
como o glutaraldeído, que é o mais comum (MCDADE et al., 2013), ácido metacrílico
(KLOTZ et al., 2016), isocianatos (BRYAN et al., 2012), alguns extratos de plantas,
como a genipina (HUANG et al., 1999; SUNG et al., 1999) e também os conhecidos
como agentes fotorreativos, por exemplo, a riboflavina (HEO et al., 2016; AHEARNE
et al., 2016). Com tantas opções, a escolha por qual utilizar para reticulação do
material dependerá de fatores como citotoxicidade, imunogenicidade, efeitos
inflamatórios de seus produtos de degradação e aplicação final do material (KLOTZ
et al., 2016). A principal limitação para o uso de glutaraldeído é que ele é citotóxico
e, portanto, é inadequado para reticulação de hidrogéis (AHEARNE et al., 2016). Já
a genipina é uma alternativa menos citotóxica que glutaraldeído e tem sido mostrado
35
na reticulação de vários tipos diferentes de hidrogel (GAO et al., 2014; SCHEK et al.,
2011).
Conhecida como vitamina B2, a riboflavina foi escolhida para a produção
do compósito por ser estável ao calor, à oxidação e aos ácidos. Apresenta-se na
forma de pó alaranjado, não é tóxica, mas é sensível à luz. A Figura 9 mostra a
estrutura da molécula da riboflavina.
Figura 9 – Estrutura da riboflavina.
Fonte: Sousa et al., 2005.
Sendo assim, de acordo com Tirella et al. (2012), seu uso para preparo de
compósitos deve-se à possibilidade de controlar a rigidez dos géis. Os géis
produzidos com riboflavina e tratados com radiação ultravioleta originam compósitos
microestruturados típicos das ligações cruzadas. Demirbay et al. (2017) afirmam que
o uso de riboflavina, mesmo com baixas concentrações, como 0,5% é suficiente
para iniciar interações entre as moléculas usando luz ultravioleta, e pode ser usado
como um agente de reforço, fortalecendo as propriedades mecânicas dos materiais.
A Figura 10 apresenta uma hipotética reação de reticulação da riboflavina
com a gelatina. Ocorre pela reação de radical livre iniciada por fotoindução da
riboflavina. Uma vez que ela é irradiada com radiação ultravioleta, libera um íon H+,
produzindo um oxigênio – O-, ativo como radical. Os grupos amina da gelatina
podem, então, reagir gerando ligações covalentes.
36
Figura 10 – Hipótese para a reação de reticulação da gelatina com a riboflavina.
Fonte: Adaptada de Sridhar et al., 2014; Tirella et al., 2012.
Segundo Combs et al. (2017), a função primária da riboflavina é servir
como componente essencial das coenzimas, mononucleótido de flavina (FMN) e
dinucleótido de adenina de flavina (FAD), que atuam como intermediários nas
transferências de elétrons em reações de oxidação-redução biológicas. Nos estudos
para obtenção de biomateriais procuram-se uma fusão de hidrogéis biologicamente
ativos e fisico-quimicamente adaptáveis (BENTON et al., 2009).
37
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Matéria-prima e reagentes
Os resíduos de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), peles e escamas
foram doados pela empresa de beneficiamento de pescado, situada em Fortaleza,
Ceará.
Os reagentes utilizados nas análises e experimentos não foram
submetidos à purificação adicional.
Foi utilizada água destilada como solvente nas soluções aquosas e
tampão fosfato salino PBS (pH= 7,4) como solvente nas soluções de gelatina para
obtenção dos biocompósitos.
4.2 Metodologia
Neste trabalho, foi realizada a extração de hidroxiapatita das escamas e
gelatina das peles de tilápia. Segue toda metodologia desde a limpeza até a
obtenção dos produtos finais, assim como as análises realizadas para
caracterização das escamas, hidroxiapatita e gelatina.
4.2.1 Extração de nano-hidroxiapatita
4.2.1.1 Limpeza e pré-tratamento das escamas
As escamas doadas por um frigorífico de filetagem de peixe situado em
Fortaleza, Ceará, foram armazenadas em câmara frigorífica a -18°C. O processo de
limpeza das escamas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) foi realizado no
laboratório de Tecnologia da Biomassa, situado na Embrapa Agroindústria Tropical,
em Fortaleza. O pré-tratamento foi processado com uma massa inicial de 4 kg de
escamas. As escamas foram inicialmente descongeladas para separação
manualmente dos restos grosseiros de gordura, pele, nadadeiras e outros resíduos
indesejados. Foi realizada uma primeira lavagem vigorosa com água corrente,
aproximadamente 20 litros, para retirar os resíduos da limpeza do peixe. A segunda
lavagem, após esse processo, foi com água aquecida a 60 °C, aproximadamente 10
38
litros, para retirar a gordura superficial das escamas. Uma terceira lavagem com
água deionizada, aproximadamente 10 litros, para retirar os minerais superficiais.
Após essa lavagem com água deionizada, foi acrescentada uma solução de ácido
cítrico - C6H8O7 0,02% (m/m), com a finalidade de conservar e prevenir surgimento
de micro-organismos durante o período de armazenamento que pudessem causar
alterações nas características (odor, cor e textura) das escamas. O ácido cítrico foi
utilizado na proporção de 1 litro de solução 0,02% de ácido cítrico para 1 kg de
escamas. As escamas foram deixadas com a solução por 30 minutos e depois a
solução foi escorrida. Foi retirado o excesso de água/solução, e as escamas foram
colocadas em bandejas metálicas para, posteriormente, serem levadas à estufa com
circulação de ar a 60 ºC até secar, por 24 h. Depois, as escamas tratadas foram
pesadas em balança marca Digimed, modelo DG-20 WT, em porções de 100 g e
guardadas em embalagens plásticas seladas.
A Figura 11 apresenta o fluxograma de limpeza e pré-tratamento das
escamas.
Figura 11 – Fluxoframa de limpeza e pré-tratamento das escamas de tilápia do Nilo
Fonte: Autora, 2016.
39
4.2.1.2 Extração da hidroxiapatita/nanohidroxiapatita
A hidroxiapatita foi obtida a partir das escamas da tilápia. Empregou-se
um tratamento térmico alcalino para a obtenção do material conforme o utilizado por
Kongsri et al. (2013), com algumas modificações.
Às escamas tratadas, adicionou-se uma solução de ácido clorídrico - HCl
0,1 mol/L, na proporção de escamas/solução de 1:8, para que todas as escamas
ficassem submersas no ácido, durante uma hora, em temperatura ambiente, sob
agitação de 600 rpm para o intumescimento das escamas e retirada de proteínas
superficiais. Após esse tempo, as escamas foram lavadas até a neutralização, pH
igual a 7 e tratadas sob agitação com solução de hidróxido de sódio - NaOH 5%
(m/v), na proporção de escamas/solução de 1:8 para que todas as escamas
ficassem submersas na base, durante cinco horas, a uma temperatura de 70 ºC,
ainda sob agitação de 600 rpm retirada de proteínas não colagenosas. O material foi
deixado em repouso até esfriar e separadas as escamas do líquido remanescente.
Por último, às escamas foi adicionada uma solução de hidróxido de sódio - NaOH
50% (m/v), na proporção de escamas/solução de 1:8, para que todas as escamas
ficassem submersas na base, sob constante agitação de 600 rpm durante uma hora,
a uma temperatura de 100 ºC, para dissolução completa da escama, obtendo a HAp.
O material obtido foi filtrado, dialisado até pH igual a 7, e secado em estufa a 60 ºC
por 24 horas.
Foram efetuadas algumas modificações para a obtenção da nano-
hidroxiapatita. Para isso, o material obtido foi passado em peneiras vibratórias marca
Fritsch, modelo Analysette, durante 5 minutos, com amplitude igual a 2 mm, a fim de
obter a mesma granulometria em toda a extensão do material.
Em seguida, o material foi levado ao ultrassom marca Unique, modelo
ultra-sônico, dissolvido em etanol na proporção de 0,2 g/100 mL e submetido por 30
min a uma potência igual a 55%. O material foi filtrado e secado em estufa com
circulação de ar a 50 °C por 24 horas. Em seguida, foi macerado em almofariz com
pistilo e novamente passado em peneiras vibratórias para uniformizar a
granulometria do material. Em seguida, o material foi analisado em um equipamento
Zeta Sizer da marca Malvern, modelo ZEN3600 para confirmação do tamanho da
partícula em escala nanométrica, quando se obteve o valor de partícula entre 50,8 e
105,7 nm. O material foi armazenado em um recipiente limpo e seco.
40
A Figura 12 apresenta o fluxograma de obtenção de nano-hidroxiapatita.
Figura 12 – Fluxoframa de extração da nano-hidroxiapatita a partir das escamas de tilápia do Nilo.
Fonte: Autora, 2016.
4.2.2 Extração da gelatina
A extração da gelatina foi realizada considerando o ensaio que combinou
as melhores características do delienamento experimental conforme a metodologia
de Catunda (2015).
41
4.2.2.1 Preparação das peles de tilápia
Foram removidas as escamas das peles, com o auxílio de um
liquidificador industrial e, em seguida, as peles foram lavadas e armazenadas em
câmara frigorífica com temperatura -18 °C.
4.2.2.2 Etapa básica
Para a remoção das proteínas não colagenosas, em um reator de aço
inox com capacidade para 30 litros foram adicionadas 4 Kg de peles. Em seguida,
foram adicinados 16 litros de solução de hidróxido de sódio - NaOH 0,1 mol/L, ou
seja, na proporção de 1:4 massa de pele úmida/solução, durante 30 minutos, com
agitação constante de 60 rpm e temperatura ambiente para a remoção de proteínas
não colagenosas. O material foi neutralizado lavando-se com água corrente, sendo
a última lavagem com água destilada.
4.2.2.3 Etapa ácida
Para intumescimento, as peles da etapa anterior foram tratadas com
uma solução de ácido acético - CH3COOH 0,1 mol/L, na proporção de 1:4 massa
de pele úmida/solução, ou seja, o mesmo volume utilizado na etapa básica, durante
30 minutos, com agitação constante de 60 rpm e temperatura ambiente. O material
foi neutralizado lavando-se com água corrente, tendo a última lavagem ocorrido com
água destilada para remoção completa de sal. Foi utilizado um reator de aço inox
com capacidade de 30 litros.
4.2.2.4 Extração da gelatina
As peles pré-tratadas foram misturadas com água destilada na
proporção de 1:4, a uma temperatura de 45°C, durante 60 minutos, com agitação
constante de 60 rpm. Foi utilizado um reator de aço inox com capacidade de 30
litros. O material foi filtrado e concentrado a vácuo até redução de 50% do volume
inicial. Momento seguinte, o filtrado foi congelado em ultrafreezer e levado para ser
liofilizado, utilizando um liofilizador - LP510, marca LIOTOP, com capacidade de
10 litros. Finalizou-se o processo com trituração da gelatina após liofilização e
armazenamento em recipiente limpo e seco.
42
A Figura 13 mostra o fluxograma da extração da gelatina.
Figura 13 – Fluxoframa de extração da gelatina a partir das peles de tilápia do Nilo.
Fonte: Autora, 2016.
4.2.3 Obtenção dos biocompósitos
Foi produzida 300 mL de solução de gelatina com concentação 5% (m/v).
A gelatina foi dissolvida em solução tampão de fosfato salino – PBS de pH igual a
7,4, pois simula os fluidos corporais. A solução foi processada sob agitação
constante com barra magnética em chapa aquecedora da marca Ika e modelo C-
MAG HS10, por 45 minutos, a uma temperatura de 50 °C, após o que foi adicionada
a massa de nano-hidroxiapatita 1%, calculada em relação à massa de gelatina.
Manteve-se a agitação constante com barra magnética em chapa aquecedora por 4
horas, a uma temperatura de 45 °C. As soluções foram levadas ao ultrassom marca
Unique, modelo ultra-sônico, para dispersarem as partículas de nano-hidroxiapatita
43
nas condições de 55% de potência durante 5 minutos. Depois, as formulações foram
colocadas em placa de Petri com 90 x 15 mm (diâmetro x altura). O mesmo
procedimento até esse ponto foi realizado para obter a solução de gelatina 5% com
nano-hidroxiapatita 2,5%.
Retiraram-se alíquotas de 50 mL da solução de gelatina 5%, 50 mL de
solução de gelatina 5% com nano-hidroxiapatita a 1% e solução de gelatina a 5%
com nano-hidroxiapatita a 2,5%, respectivamente, para fins de comparação com as
formulações contendo concentrações de riboflavina.
Em seguida, essa solução foi dividida em alíquotas de 50 mL, e
adicionou-se riboflavina como agente reticulante para o biocompósito. Foram
preparados compósitos conforme Tabela 4, com concentrações de 0,1% e 0,05% de
riboflavina, respectivamente, calculando-se a massa necessária em relação à massa
de gelatina. As soluções foram deixadas sob agitação constante com barra
magnética em chapa aquecedora por 2 horas, a uma temperatura de 40 °C. Nesta
etapa, os béqueres foram cobertos totalmente com papel alumínio para preservar a
ação da riboflavina em relação à luz. Essas formulações com riboflavina foram
colocadas em placa de Petri e levadas para a câmara de UV da marca Bioforce
Nanoscience e modelo UV.PC.220, sendo submetidas a radiação ultravioleta
durante 60 minutos sob potência máxima do equipamento de 14,76 mW/cm².
Os compósitos foram levados para ultrafreezer por 24 horas para total
congelamento e depois liolizados em equipamento da marca Liotop e modelo LP
510. Após esses procedimentos, os biocompósitos foram triturados em moinho
analítico da marca Ika e modelo A11 basic, guardados em recipientes secos e
limpos para posteriores caracterizações. A Figura 14 mostra o fluxograma para a
obtenção dos biocompósitos de gelatina com nano-hidroxiapatita.
Tabela 4 – Formulações dos biocompósitos de gelatina com nano-hidroxiapatita.
Componentes (Legenda)
Biocompósitos
Quantidade dos componentes (%)
Gelatina (G) 5 5 5 5 5 5 Nanohidroxiapatita
(HAp) 1 1 1 2,5 2,5 2,5
Riboflavina (R) - 0,05 0,1 - 0,05 0,1 Fonte: Autora, 2016.
44
Figura 14 – Fluxoframa de obtenção dos biocompósitos de gelatina com nano hidroxiapatita.
Fonte: Autora, 2016.
45
5 CARACTERIZAÇÕES
5.1 Caracterização dos macronutrientes da escama
5.1.1 Cinzas e umidade
Essas análises foram realizadas no Laboratório de Tecnologia da
Biomassa, situado na Embrapa Agroindústria Tropical. Utilizou-se uma balança de
infravermelho (ID 50, da Marte) para determinar a umidade das escamas moídas. A
balança foi ajustada para aquecer as escamas a 100 ºC, com variação de 0,01.
Pesou-se, aproximadamente, 1,0 g da escama moída e aguardou-se a balança
indicar a massa final da escama moída (perda de água) e a porcentagem de perda
mássica. Efetuou-se esse procedimento em triplicata.
O teor de cinzas foi medido por análise gravimétrica. As cinzas foram
obtidas utilizando o forno Mufla, da Quimis. Pesou-se o cadinho vazio anteriormente
calcinado a 600 ºC em forno mufla e, em seguida, resfriado em dessecador.
Pesaram-se, aproximadamente 2 g de escamas moídas. Após pesados, os cadinhos
contendo as escamas moídas foram para o forno mufla e lá foram submetidos à
temperatura de 600 ºC por três horas. Após esse tempo, os cadinhos foram
colocados para esfriar em dessecador por 30 minutos, e pesou-se a massa do
cadinho com as cinzas das escamas moídas. A partir da Equação 1, calculou-se o
teor de cinzas na amostra. Realizou-se tal procedimento em triplicata.
onde:
m1: massa do cadinho vazio.
m2: massa do cadinho com a amostra.
m3: massa do cadinho com as cinzas.
5.1.2 Lipídeos
A análise de lipídeos foi realizada no Laboratório de Análise de Alimentos,
situado na Embrapa Agroindústria Tropical, em Fortaleza, CE, pelo método de
1
46
extração Soxhlet, em triplicata; utilizando como solvente hexano. Foi analisado o
teor de lipídeos, utilizando-se a Equação 2 para os cálculos.
onde:
mb: massa do balão.
L: lipídeos.
ma: massa da amostra.
Inicialmente as amostras de escamas moídas foram secadas em balança
de infravermelho, pesadas em balança analítica e colocadas em filtros de café
comerciais, formando os cartuchos. Os balões de fundo chato da extração Soxhlet
foram levados para a mufla aquecida a 105 ºC, por 1 hora, para remover a umidade,
resfriados em dessecador para, então, serem mensurados em balança analítica e
devolvidos ao dessecador. Em extratores Soxhlets, foram colocados os cartuchos,
aos balões foram adicionados 200 mL de hexano cada, e foram postos sobre chapas
aquecedoras, com os extratores Soxhlets colocados entre os balões e os
condensadores, que estavam conectados a um trocador de calor, da destilação,
formando o sistema. A extração ocorreu por aproximadamente 6 horas. O balão foi
retirado e posto em banho-maria quente para evaporação do solvente residual. O
balão com os lipídeos (gordura) foi posto em estufa a 105 ºC por 1 hora, resfriado
em dessecador e pesado em balança analítica.
5.1.3 Proteínas
A análise de proteínas foi realizada no Laboratório de Análise de
Alimentos da Embrapa Agroindústria Tropical, em Fortaleza, CE.
Essa análise foi efetivada para a quantificação de proteína bruta das
escamas e gelatina a partir da determinação de nitrogênio total pelo método Micro-
Kjeldahl (AOAC, 1997). Utilizou-se o fator de conversão de proteínas para nitrogênio
(P:N) ao valor de 4,94, específico para peixe, sugerido por Salo-Väänänen;
Koivistonen (1996).
A determinação de proteínas baseia-se na determinação do conteúdo de
2
47
nitrogênio em substâncias orgânicas e inorgânicas digeridas pelo processo de
Digestão Kjeldahl. Ocorre em três etapas: digestão, destilação e titulação (GALVANI
& GAERTNER, 2006).
Inicialmente, é processada a digestão das amostras a 400 °C, para a
decomposição da matéria orgânica com ácido sulfúrico puro e de concentração igual
a 18 M junto a uma mistura catalítica formada por sulfato de cobre, sulfato de
potássio e selênio, que acelerarão a oxidação da matéria orgânica. Assim, o carbono
contido na matéria orgânica é oxidado e o dióxido de carbono, desprende-se junto
com a água e o dióxido de enxofre. Segue a reação:
Matéria Orgânica + H2SO4 (NH4)2SO4 + H2O + CO2 + SO2
Ocorrerá uma mudança de coloração da amostra de preto para verde-
claro. Existe o nitrogênio sob a forma de amina, amida, nitrila, além de grupamentos
proteicos, que serão transformadas em amônia, que reagirá com o ácido sulfúrico,
formando o sulfato de amônia, apresentando-se na forma de cristais quando a
solução digerida esfria.
A seguir, a destilação é realizada pelo arraste de vapor. O sulfato de
amônio (cristais) é tratado com hidróxido de sódio, em excesso, para haver liberação
de amônia . Segue-se a reação:
(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH4OH + Na2SO4 2 NH3 + 2 H2O
A amônia desprendida conforme a reação anterior é recebida em uma
solução ácida de ácido bórico com indicadores vermelho de metila, e azul de
bromocresol, de coloração cor de rosa. Ela ficará com coloração azulada à medida
que vai formando o borato de amônio, conforme a reação abaixo.
NH3 + H3BO4 + indicadores NH4H2BO3
Por último, é realizada a titulação para a determinação da quantidade de
nitrogênio contido na amostra. Faz-se, então, a titulação do excesso de borato de
amônio com uma solução de ácido clorídrico padronizado, com concentração
conhecida, até a mudança de cor do indicado de violeta para levemente cor de rosa,
catalisadores
48
indicando, por tal modo, o final da titulação. Expõe-se a reação.
NH4H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO4 cor de rosa
No final da análise, foi realizado o cálculo baseado nos valores conforme
descrito a seguir na Equação 3:
onde:
Va: volume titulado da amostra;
Vb: volume titulado do branco;
M: molaridade do ácido clorídrico utilizado para titulação;
fa: fator de correção;
Pa: peso da amostra.
5.1.4 Minerais
As análises de minerais foram realizadas no Laboratório de Solos da
Embrapa Agroindústria Tropical, em Fortaleza, CE.
A análise química para determinação dos teores totais de P, K, Ca, Mg,
S, Na, Cu, Fe, Zn e Mn foram realizados para a escama, após digestão
nitroperclórica de 0,5 g do resíduo em bloco digestor da marca Tecnal e modelo TE-
040/25, conforme procedimentos descritos em Miyazawa et al. (2009). Para a
quantificação de P, foi adicionada solução de molibdato de amônio e ácido
ascórbico, seguida de leitura em espectrofotômetro a 660 nm, marca Femto e
modelo 600 Plus. A concentração de K e de Na foi determinada por meio de leitura
direta do extrato em fotômetro de chama da marca Digimed e modelo DM-62. As
concentrações de Ca e de Mg nas amostras foram determinadas após adição de
solução de lantânio e leitura em espectrômetro de absorção atômica da marca
Perkin Elmer e modelo Analyst 400. O S foi quantificado por meio do método da
turbidimetria e leitura em espectrofotômetro a 420 nm, marca Femto e modelo 600
Plus. As concentrações de Cu, Fe, Zn e Mn foram determinadas por meio de leitura
3
49
direta da amostra em espectrômetro de absorção atômica.
5.2 Análise Termogravimétrica – TGA
A análise em questão foi realizada no Laboratório de Tecnologia da
Biomassa, em Fortaleza, CE.
A análise de TGA é um método utilizado para determinar a estabilidade
térmica do composto pela alteração no peso do composto em relação à temperatura.
A análise termogravimétrica das escamas e gelatina foi desenvolvida
utilizando-se, respectivamente, 10,763 mg e 10,119 mg da amostra. O equipamento
utilizado para a análise foi o STA 6000, da PerkinElmer, com cadinho de alumina. As
condições da análise da escama foram: faixa de temperatura de 20 a 900 °C e a
razão de aquecimento 10 ºC/min, em atmosfera de ar sintético, com vazão de 40
mL/min; já as condições da análise da gelatina foram: faixa de temperatura de 20 a
900 °C e a razão de aquecimento 10 ºC/min, em atmosfera de ar sintético, com
vazão de 20 mL/min. Para todos os biocompósitos, a análise foi realizada utilizando-
se massas iguais a 9,90 mg, 10,582 mg, 10,367 mg, 10,753 mg, 10,132 mg e 10,180
mg das amostras conforme a ordem que se apresentam na Tabela 4. As condições
da análise para os compósitos foram: faixa de temperatura de 20 a 900 °C e razão
de aquecimento 10 ºC/min, em atmosfera de ar sintético, com vazão de 40 mL/min.
Os dados obtidos foram plotados pelo software OriginPro 8.
5.3 Calorimetria Exploratória Diferencial – DSC
A análise de DSC foi realizada no Laboratório de Tecnologia da
Biomassa, situado na Embrapa Agroindústria Tropical, em Fortaleza, CE.
Na análise realizada para as escamas e gelatina utilizou-se um
equipamento DSC Q20 V24.9 Build 12. As condições de análise para a escama
foram: gás nitrogênio com vazão de 50 mL/min; o experimento foi realizado a uma
taxa de 1 °C/min, com uma temperatura de equilíbrio de 25 °C e uma temperatura
final de 400 °C, com massa de amostra inicial de 6,3 mg e utilizando-se cadinho de
alumínio selado. Quanto à condição de análise para a gelatina, foi gás nitrogênio,
com vazão de 50 mL/min. O experimento foi realizado a uma taxa de 1 °C/min, com
uma temperatura de equilíbrio de 10 °C e uma temperatura final de 250 °C, com
50
massa de amostra inicial de 2,4 mg e utilizando-se cadinho de alumínio selado. Os
dados obtidos foram plotados pelo software OriginPro 8.
5.4 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier – FT-IR
A análise de FT-IR foi realizada no Laboratório de Tecnologia de
Processos, situado na Universidade Federal do Ceará, em Fortaleza, CE.
Este método de análise é utilizado para analisar os vários grupos
funcionais presentes em qualquer composto. Os espectros na região do
infravermelho foram obtidos para hidroxiapatita e gelatina na região de 400 a 4000
cm-1, no modo de pastilha de brometo de potássio. Os biocompósitos foram
analisados na região de 550 a 4000 cm-1. Os dados obtidos foram plotados por meio
do software OriginPro 8.
5.5 Difração de Raios-x - DRX
A análise de DRX foi realizada no Laboratório de Raios – x do
Departamento de Física, situado na Universidade Federal do Ceará, em Fortaleza,
CE.
A análise foi realizada em um difratômetro para amostras policristalinas
modelo Xpert Pro MPD da marca Panalytical, operando a 40 kV e 50 mA. Nesta
análise utilizou-se radiação de cobalto (Co), comprimento de onda 1.78 Å. As
amostras foram examinadas com ângulo 2θ variando de 10° a 70°. Utilizou-se a
amostra de hidroxiapatita em pó. Coloca-se um pouco de amostra na região circular
central do porta-amostra de silício, de modo que toda essa cavidade seja
preenchida, alinhando-se com a superfície deste, tendo-se o cuidado para deixar a
amostra mais plana possível. Os dados obtidos foram plotados através do software
OriginPro 8.
5.6 Microscopia eletrônica por varredura – MEV e Espectroscopia de Energia
Dispersiva – EDS
A análise de MEV/EDS foi realizada no Laboratório de Microscopia
Eletrônica do Departamento de Geologia, situado na Universidade Federal do Ceará,
51
em Fortaleza, CE.
O método de análise EDS é usado para determinar a constituição
elementar do composto, baseado na imagem MEV.
Essa análise foi realizada para a amostra de hidroxiapatita, em pó,
destaque-se. O equipamento utilizado é da marca HITACHI, modelo TM 3000, com
periférico acoplado do tipo EDS SWIFT ED 3000, sob uma voltagem de aceleração
de 15 kV. As amostras foram montadas em stubs com o auxílio de fita adesiva de
carbono, ficando a 1mm de distância do topo da câmara de vácuo. Após a
finalização do vácuo, iniciam-se os procedimentos para visualização e obtenção das
imagens no MEV. Para o EDS, utiliza-se a imagem gerada no MEV e procede-se a
uma varredura espectral por área para, assim, obter uma composição química média
da amostra.
5.7 Microscopia Eletrônica por Varredura – MEV
A análise de MEV foi realizada no Laboratório de Microscopia, situado na
Embrapa Agroindústria Tropical, em Fortaleza, CE.
A análise MEV é usada para analisar a morfologia superficial de qualquer
composto, seja poroso ou cristalino. As amostras de escama, gelatina e
biocompósitos foram montadas em stubs com o auxílio de fita adesiva condutora e
recobertas com ouro em metalizadora Emitech. Por fim, foram levadas ao MEV
TESCAN, modelo LUM – VEGA 3 sob uma voltagem de aceleração de 15 KV, para
visualização e obtenção das imagens.
5.8 Cromatografia por Permeação em Gel – GPC
A análise de GPC foi realizada no Laboratório de Polímeros e Inovação
de Materiais, do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, situado na
Universidade Federal do Ceará, em Fortaleza, CE.
Foi analisada amostra de gelatina. Preparou-se uma solução na
proporção de 2 mg/mL. A amostra foi deixada por 30 minutos para hidratar. Em
seguida, foi colocada em banho-maria por 15 minutos a 60 °C. Após esse período,
ficou sob agitação por 24 horas. Filtrou-se em membrana de celulose com poro 0,45
µm e 47 mm de diâmetro. Logo, o perfil cromatográfico da gelatina foi determinado
52
em um cromatógrafo SHIMADZU LC-10AD como detector de índice de refração RID-
10A a 40 °C. A análise foi realizada utilizando coluna Phenomenex Ultrahydrogel
linear (7,8 x 300 mm), fase móvel de NaNO3 0,1 mol/L, fluxo de 1 mL/min e o volume
da amostra injetada foi de 20 μL. O padrão foi de pululana (Shodex Denko) (MM de
5.9 x 103 a 7.88 x 105 g/mol).
5.9 Ponto Isoelétrico da Gelatina
A análise foi realizada no laboratório de Tecnologia da Biomassa, situado
na Embrapa Agroindústria Tropical, em Fortaleza, CE.
A determinação do ponto isoelétrico foi efetuada para a gelatina pelo
método de NAGARAJAN et al. (2013), com adaptações. As amostras de gelatina
foram dissolvidas em água deionizada a uma concentração de 0,5 mg/mL. A
amostra foi deixada por 30 minutos para hidratar, sendo, após, colocada em banho-
maria por 15 minutos a 60 °C. Após esse período, ficou sob agitação por 24 horas. A
determinação do ponto isoelétrico foi estabelecida em um equipamento Zeta Sizer
da marca Malvern, modelo ZEN3600, quando 1,16 mL da solução foi utilizado para
medir o potencial zeta com diferentes valores de pH, com NaOH e HCl, ambos 0,1
mol/L, utilizando-se um autotitulador. Os dados obtidos foram plotados por meio do
software OriginPro 8.
53
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Caracterização da escama
6.1.1 Caracterização de macronutrientes da escama
As escamas analisadas por métodos gravimétricos e químicos
apresentaram 12,67% de umidade e de 28,39% de cinzas, 0,62% de lipídeos e
53,0% de proteínas.
A propósito, conhecer a umidade de um material permite um controle de
alterações químicas e biológicas, sendo que um dos principais fatores é a ausência
ou redução do desenvolvimento de micro-organismos como fungos e bactérias, que
afetariam a conservação e o armazenamento do material de interesse. O valor para
umidade foi próximo ao de 14% de Martins (2015) também para escamas de tilápia e
menor, quando comparado a Matmaroh et al. (2011), que obtiveram o valor de
23,7% para escamas de Parupeneus heptacanthus.
O elevado teor de cinzas de 28,39% está relacionado às frações minerais
da fase inorgânica da escama, que é a presença de hidroxiapatita e que se encontra
estruturalmente unida ao colágeno. O valor encontrado está dentro de uma faixa
relatada na literatura. Martins (2015) obteve um valor inferior a 30,5%, porém outros
autores referem valores superiores para o teor de cinzas, como para as escamas de
tilápia de Huang et al. (2015), 45,18%, nas escamas de Parupeneus heptacanthu
42,31% (MATMAROH et al., 2011) e das escamas de Sebastes mentella, 39,4%
(WANG et al., 2008).
O teor de lipídeos obtido de 0,62% pode ser considerado elevado quando
comparado com o de Martins (2015) e Huang et al. (2015), com 0,33% e 0,02%,
respectivamente. Essas diferenças podem estar relacionadas ao pré-tratamento não
efetivo das escamas ou, ainda, à alimentação da tilápia.
As escamas apresentaram valor de proteína igual a 53,0%, abaixo do
valor encontrado por Martins (2015), 58%, e das escamas de Sebastes mentella
(WANG et al., 2008), 56,9%, e superiores aos encontrados nas escamas de tilápia
de Huang (2015), 49,42% e no Parupeneus heptacanthus com 45,2% (MATMAROH
et al., 2011). Pode-se considerar que as escamas compõem unidades estruturais da
anatomia da tilápia. A principal proteína estrutural dos pescados, a exemplo do ser
54
humano, é o colágeno.
Com base no alto teor de proteína total, que a escama de tilápia contém,
pode chegar a ser uma fonte de colágeno e, consequentemente, de gelatina,
exigindo, para sua extração, um processo de desmineralização eficiente, já que o
colágeno está firmemente ligado a frações minerais dessa estrutura.
A análise de minerais das escamas de tilápia está descrita na Tabela 5. É
importante para o conhecimento de macronutrientes (N, Ca, P, K) e micronutrientes
(Cu, S, Fe, Mg, Mn, Zn), constituintes da escama.
Tabela 5 – Determinação de minerais de escama de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus).
Identificação de Elementos (g/kg) Ca P Mg Na S K Zn Mn Fe Cu
168,2 58,3 3,2 1,0 0,3 0,02 0,098 0,016 0,010 ALD *ALD: abaixo do limite de detecção.
Fonte: Autora, 2016.
Segundo Weiss et al. (2015), os valores máximos dos macronutrientes
foram de 34,34, 73,70, 2,54 g/kg para P, Ca e K, respectivamente. Em relação aos
micronutrientes, os valores máximos encontrados foram de 69,51 mg/kg para o ferro,
23,67 mg/kg para o cobre, e 89,00 mg/kg para o zinco. Levando em consideração
que a análise foi realizada sob as mesmas condições, as variações de valores para
esses micronutrientes e macronutrientes podem estar relacionadas a diferenças
regionais. De fato, o trabalho de Weiss et al. (2015) foi desenvolvido com escamas
de tilápias de indústrias de filetagem do município de Nova Aurora, estado do
Paraná, região sul do país. As condições climáticas, assim como a alimentação dos
peixes são diferentes. O período de estiagem prolongada no estado do Ceará,
região nordeste, pode estar ocasionando a concentração de sais na água e pode
elevar esses valores de macronutrientes e micronutrientes.
Conforme Kubitza (1999), as exigências da maioria dos minerais é
satisfeita com os minerais presentes nos alimentos naturais e nas rações. As rações
para tilápia, geralmente, mantêm uma concentração máxima de cálcio de 3%,
provenientes dos próprios ingredientes ou do calcário calcítico e fosfato bicálcico, no
entanto, os peixes também absorvem esse mineral da água.
Observa-se, entretanto, o alto teor de Ca e P, que são os principais
componentes da hidroxiapatita e estão relacionados à razão Ca/P do material. Por
55
isso, a escama é rica na fase mineral e ótima fonte para extração de hidroxiapatita.
Além disso, conhecer a composição mineral da escama permite a escolha do
método para a extração tanto da hdroxiapatita como também do colágeno/gelatina.
Um resumo generalizador dessas análises de caracterização da escama
estão na Tabela 6, a seguir:
Tabela 6 – Resumo das análises de caracterizações da escama de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus).
Macronutrientes da
Escama
Teor
(%) Referências
Umidade 12,67 14,0 % Martins (2015);
23,7 % Matmaroh (2011).
Cinzas 28,39
30,45 % Martins (2015);
45,18 % Huang (2015);
42,31 % Matmaroh (2011).
Lipídeos 0,62 0,33 % Martins (2015);
0,02 % Huang (2015).
Proteínas 53,0
58,0 % Martins (2015);
49,42 % Huang (2015);
45,20 % Matmaroh (2011).
Fonte: Autora, 2016.
6.1.2 Análise Termogravimétrica
As curvas de TGA/DTG da escama está apresentada na Figura 15 e na
Tabela 7, exibem-se os dados das perdas de massa.
Tabela 7 – Perdas de massa das curvas de TGA/DTG.
Amostra
1ª. Perda de Massa - (1) 2ª. Perda de Massa - (2)
Massa (%) Faixa de
Temperatura (°C) Massa (%)
Faixa de Temperatura (°C)
Escama 11,5 25 - 200 51,0 200 – 470 Fonte: Autora, 2016.
56
Figura 15 – Gráfico de TGA/DTG da escama.
Fonte: Autora, 2016.
Para a escama houve regiões de perda de massa conforme as curvas.
Essas regiões de perda de massa estão em 25 a 200 °C e de 200 a 470 °C. Na
primeira região (1) para a escama a temperatura de 80 °C, essa temperatura está
relacionadas à perda de água. Verifica-se que para a escama, correspode a 11,5%
de perda de massa, muito próxima ao valor da umidade calculada igual a 12,67%.
Em Oliveira (2011), corresponde à perda de água fisicamente presa à superfície da
escama. A segunda perda de massa (2) da escama, quando houve um pico máximo
de temperatura de 327°C, está muito próxima ao valor de degradação de proteínas,
que foi de 53% de perda de massa, referente à desnaturação do colágeno presente
na estrutura. Para a escama, registra-se ainda uma região (3) no final da curva de
TGA. Essa região com massa residual em torno de 29,45% de perda de massa, está
condizente ao valor de cinzas calculado e reforça a presença de fase mineral na
escama.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Ma
ss
a (
%)
De
riv
ad
a d
a m
as
sa
(%
/min
)
TG
DTG
1
2
3
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0 200 400 600 800
Temperatura (°C)
57
6.1.3 Calorimetria Exploratória Diferencial
A Figura 16 apresenta a curva resultante das medidas de calorimetria
exploratória diferencial para a escama.
Figura 16 – Gráfico de DSC da escama.
Fonte: Autora, 2016.
Pode-se observar na Figura 16, que o início da curva descrescente indica
presença de água na amostra e pode estar associado a perda de água até em torno
de 100°C que, de acordo com a análise de umidade representa 12,67%. O gráfico
apresenta em seguida mais dois picos endotérmicos. Eles estão associados a fusão
do material inciando com o primeiro pico em 115,6 °C e com o segundo pico de
maior intensidade em 139,5°C. Segundo Mothé et al. (2009) nesta temperatura a
amostra passa de um estado mais rígido para uma estrutura mais flexível. Logo,
esses eventos podem estar associado a fase orgânica da escama, ou seja, a
degradação de colágeno. Sendo assim, percebe-se que, provavelmente, a variação
de temperatura indica que o colágeno não mostre uma faixa de transição térmica
50 100 150 200 250 300 350 400
-15
-10
-5
0
5
Flu
xo
de
Ca
lor
(W.g
-1)
Temperatura (°C)
115,6 °C
139,5 °C
280,6 ° C
EX
OE
ND
O
58
bem definida (OLIVEIRA, 2011). Em 280,6 °C ocorre outro evento que pode pode
estar relacionado com variações de massa da amostra. Além disso, pode confirmar a
presença da fase mineral da escama, rica em hidroxiapatita, que suporta
temperaturas mais elevadas.
6.1.4 Microscopia Eletrônica por Varredura
As micrografias da Figura 17 apresentam as estruturas da escama. Na
Figura 16a, tem-se a estrutura de uma escama inteira; já na Figura 16b, referente à
escama moída, é visível a presença das lamínulas, características de fibras
proteicas. Nas Figuras 16c e 16d, igualmente da escama moída, há também a
presença de outras estruturas depositadas entre essas lamínulas com
características cristalinas típicas de minerais.
Figura 17 – Micrografias da escama de tilápia (a) escama inteira; (b), (c) e (d) escama moída.
Fonte: MUNIZ, C. R., 2015.
59
6.2 Caracterização da nano-hidroxiapatita
6.2.1 Espectroscopia de Infravermelho com Transformadas de Fourier
A Figura 18 mostra o espectro de FT-IR, onde se verifica a identificação
de grupos funcionais principais da hidroxiapatita em um intervalo de 4000 cm-1 a 400
cm-1.
Figura 18 – Espectro de FT-IR da hidroxiapatita obtida da escama.
Fonte: Autora, 2016.
A Tabela 8, contém as principais bandas e seus respectivos tipos de
vibrações.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Tra
nsm
itân
cia
(%
)
Número de onda (cm-¹)
34
40
16
35
14
20
10
45
56
7
87
4
60
3
96
0
14
28
60
Tabela 8 – Bandas do espectro de infravermelho e tipos de vibrações da nano-hidroxiapatita.
Número de onda (cm-¹) Tipo de vibrações
3440 O-H
1635 O-H
1468 as CO2
1420 as CO2
1045 as P-O
960 s P-O
874 as CO2
603 as O-H
567 as O-H
Fonte: Autora, 2016.
Observam-se bandas em 567 e em 603 cm-1, características de vibrações
assimétricas de ligações P-O e em 960 cm-1, típico de vibração de estiramento
simétrico de grupos P-O de íons PO43- (MONDAL et al., 2014). A banda em
1045 cm-1 pode estar associada ao modo de vibração assimétrico de ligações P-O
em grupos PO4. Bandas nessa região são comuns para a identificação do grupo
fosfato devido a sua maior intensidade. As bandas de 3440 cm-1 e em 1635 cm-1 são
típicas das ligações O-H.
As bandas em 874 cm-1 e a faixa entre 1420-1468 cm-1 sugerem íons
carbonatos (MONDAL et al., 2012; KONGSRI et al., 2013), embora a amostra não
tenha sido calcinada. Liu et al. (2013) identificaram os valores de intensidade de
876, 1412 e 1451 cm-1 sugerindo a presença de íon carbonato para HAp extraída de
escama de peixe e calcinada a 700 °C.
6.2.2 Difração de raios-x
A Figura 19 mostra o difratograma, onde se verifica a fase rica em
fosfatos da escama.
Confirmou-se a fase cristalina de nano-hidroxiapatita conforme mostra a
Figura 19, na qual está identificada a fase hidroxiapatita de acordo com o padrão
(JCPDS*086-0740). Observa-se o pico de maior intensidade com 2θ igual a 35,59°,
61
relacionado ao plano 221. Mondal et al. (2010) encontraram o mesmo pico em
31,77° para hidroxiapatita, também obtida de escamas de peixe. A diferença está
relacionada ao tipo de radiação, pois, neste caso, o autor citado utilizou cobre (Cu) e
a análise apresentada foi realizada com radiação de cobalto (Co). Dessa forma, a
análise realizada com cobalto ocasiona um deslocamento dos picos do eixo para a
direita, levando algumas vezes a diferenças de até 6° para 2θ.
Figura 19 – Difratograma da nano-hidroxiapatita obtida da escama.
Fonte: Autora, 2016.
6.2.3 Microscopia Eletrônica por Varredura e Espectroscopia de Energia
Dispersiva
Como mostra a Figura 20, foi possível determinar os elementos presentes
na amostra.
10 20 30 40 50 60 70
0
10
20
30
40
50
60
Inte
ns
ida
de
(u
.a.)
2
35,59
62
Figura 20 – Micrografia da hidroxiapatita.
Fonte: Autora, 2016.
Observa-se diferença morfológica nos cristais de HAp em pó, e isso pode
estar relacionado à fonte de obtenção. Dependendo da fonte e forma de extração,
pode-se obter cristais não muito bem definidos e com diversas formas e aparência.
Para Sadat-Shojai (2013), dependendo das espécies marinhas para extração, pode-
se obter blocos de HAp exibindo diferente morfologia interna e tamanhos de poro.
O método de secagem também pode influenciar na determinação da
morfologia, pelo que a aparência obtida pode ser devido à secagem e à
homogenização em almofariz com pistilo.
Conforme mostra a Figura 21 e a Tabela 9, os respectivos elementos
detectados e suas massas.
63
Figura 21 – Gráfico de EDS da hidroxiapatita.
Fonte: Autora, 2016.
Tabela 9 – Identificação de elementos em massa da nano-hidroxiapatita.
Elemento Massa (%)
Oxigênio 46,51
Cálcio 32,20
Fósforo 14,93
Carbono 6,86
Magnésio 0,69
Sódio 0,60
Fonte: Autora, 2016.
Apresentam-se em maiores quantidades o cálcio e o fósforo, que são os
principais elementos de indicação de hidroxiapatita e sua razão estequiométrica.
Para Ginebra (2015), HAp com uma fórmula química de Ca10(PO4)6(OH)2 constitui
uma composição teórica de 39,68 % de Ca, 18,45 % de P, uma razão de peso Ca/P
de 2,151 e uma relação molar Ca/P de 1,667. Sendo assim, o valor calculado para a
razão cálcio e fósforo – Ca/P, foi igual a 1,66, podendo ser considerada como uma
HAp cálcio deficiente (DOROZHKIN, 2002). O resultado está de acordo com o
esperado, pois HAp provenientes de resíduos são não estequiométrica, vale dizer,
cálcio deficiente.
A presença do sinal de carbono é devido à fita adesiva de carbono para
fixação da amostra no stub. Os demais elementos em menor quantidade condizem
com os valores encontrados na análise mineral de composição da escama.
64
6.3 Caracterização da gelatina
6.3.1 Análise Termogravimétrica
As curvas de TGA/DTG da gelatina está apresentada na Figura 22, assim
como a Tabela 10 com as respectivas perdas de massa.
Figura 22 – Gráfico de TGA/DTG da gelatina de pele.
Fonte: Autora, 2016.
Tabela 10 – Perdas de massa das curvas de TGA/DTG da gelatina.
Amostra
1ª. Perda de Massa - (1) 2ª. Perda de Massa - (2)
Massa (%) Faixa de
Temperatura (°C) Massa (%)
Faixa de Temperatura (°C)
Gelatina 9,6 0 - 175 60,5 175 - 460 Fonte: Autora, 2016.
Para a gelatina houve regiões de perda de massa conforme a curva.
Essas regiões de perda de massa estão em 0 a 175 °C e de 175 a 460 °C. Na
100 200 300 400 500 600 700 800 900
0
20
40
60
80
100
Ma
ss
a (
%)
Temperatura (°C)
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
De
riv
ad
a d
a M
as
sa
(%
/min
)
1
2
DTG
TG
65
primeira região (1), na temperatura de 77 °C para a gelatina está relacionada à
perda de água.
A degradação térmica da gelatina apresenta-se, na segunda perda de
massa, região (2) em 332 °C, que está relacionada à perda de constituintes
proteicos. Correia et al. (2013) consideraram que a perda de massa até 175 °C pode
ser referente à evaporação de, diferentes tipos de água associados à gelatina, como
a água associada ao interior ou da superfície da tripla hélice, pelas ligações de
hidrogênio, ou até mesmo água situada entre as camadas de proteínas.
Todos esses comportamentos térmicos apresentados são importantes
para uma previsão das características térmicas do biopolímero.
6.3.2 Calorimetria Exploratória Diferencial
A Figura 23 mostra o gráfico de DSC com os principais eventos para a
gelatina de pele de tilápia.
Figura 23 – Gráfico de DSC da gelatina obtida da pele.
Fonte: Autora, 2016.
50 100 150 200 250
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
Flu
xo
de C
alo
r (W
.g-1)
Temperatura(°C)
179,5 °C
86,1 °C
100,5 °C
EX
OE
ND
O
66
O gráfico da gelatina apresenta os dois primeiros eventos endotérmicos
com picos em 86,1 °C e 100,5 °C. O priemiro evento está relacionado com a
transição vítrea (Tg) da gelatina. O segundo é um evento de fusão da gelatina. A
fusão implica na transição hélice-espiral, devido à quebra de pontes de hidrogênio
da estrutura tripla-hélice ocasionada pelo aquecimento (SANTOS et al., 2015). Já o terceiro evento com pico endotérmico em 179,5 °C, pode está
relacionado a degradação da gelatina. Nunes (2014) observou eventos de
degradação da gelatina em 135,7 °C. Essa diferença pode ser referente ao processo
de obtenção como pré-tratamento e etapas de extração. Além disso, essa ocorrência
confirma que a gelatina apresenta uma boa estabilidade térmica em temperaturas
menores que 175 °C.
6.3.3 Espectroscopia de Infravermelho com Transformadas de Fourier
A Figura 24 contém o espectro de FT-IR, onde se verifica a identificação
de grupos funcionais principais da hidroxiapatita em um intervalo de 4000 cm-¹ a 400
cm-1.
Figura 24 – Espectro de FT-IR da gelatina obtida da pele.
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
88
90
92
94
96
98
100
102
Tra
nsm
itân
cia
(%
)
Número de onda (cm-¹)
32
97
2935
16
30 1
54
0
12
30
Fonte: Autora, 2016.
67
Já a Tabela 11, apresenta as principais bandas e seus respectivos tipos
de vibrações.
Tabela 11 – Bandas do espectro de infravermelho e tipos de vibrações da gelatina.
Número de onda (cm-¹) Tipo de vibrações
3297 O-H
2935 C-H
1630 C=O
1540 N-H
1230 C-N
Fonte: Autora, 2016.
A Figura 24 mostra as principais bandas características para a gelatina.
Em 3297 cm-1, ocorre estiramento de O-H da amida A e em 2935 cm-1, estiramento
da ligação C-H. Segundo Rodrigues (2015), a amida A de gelatinas extraídas em
altas temperaturas aparece com uma banda em 2930 cm-1, referente ao estiramento
CH2, denominado, por convenção, amida B.
As bandas em 1630, 1540 e 1230 cm-1 são típicas de amidas I, II e III,
respectivamente. Elas indicam estiramentos da ligação dupla de C=O de formações
peptídicas e também em ligações de C=N da amida I (MARTINS, 2015). Ocorrem,
em 1540 cm-1, deformações da ligação N-H da amida II, e a banda de menor
intensidade, em 1230 cm-1 de amida III, pode indicar desordem das moléculas de
gelatina, sendo mais provavelmente associada à perda de estado hélice tripla
(FRIESS; LEE, 1996).
6.3.4 Microscopia Eletrônica por Varredura
As micrografias para a gelatinas na Figura 25 revelam uma morfologia
com a superfície rugosa, fina e com bastante ondulações. Pode-se observar ainda
que houve formação de alguns vazios e que houve homogeneização da gelatina no
solvente. Alguns particulados que estão visíveis na superfície da gelatina deve-se ao
processo de trituração em moinho para análise.
68
Figura 25 – Micrografias da gelatina de pele de tilápia
Fonte: MUNIZ, C. R., 2016.
6.3.5 Cromatografia por Permeação em Gel
A Figura 26 apresenta a curva de distribuição de massa molar da gelatina.
Figura 26 – Curva de distribuição de massa molar da gelatina.
Fonte: Autora, 2016.
3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5
0
20
40
60
80
100
Mass
a M
ola
r (%
)
log MM
69
Nesta análise, obteve-se um perfil macromolecular para a gelatina
extraída da pele da tilápia, com massa molar média igual a 45.000 g/mol. Esse valor
pode ser considerado elevado, levando-se em conta a temperatura de extração de
45 °C. Segundo Bordigon et al. (2012), para gelatina obtida de pele de tilápia do
Nilo, em temperaturas mais elevadas, ocorre a clivagem de cadeias de proteína
durante o processo de extração, e a massa molar das frações de peptídeos mantém-
se elevada.
A importância de conhecer a massa molecular do material deve-se às
várias propriedades mecânicas e químicas do biopolímero em termos de sua
obtenção e aplicações futuras.
6.3.6 Ponto Isoelétrico
A Figura 27 mostra o gráfico do ponto isoelétrico para a gelatina de pele
de tilápia.
Figura 27 – Gráfico de ponto isoelétrico da gelatina.
Fonte: Autora, 2016.
Nesta análise foi determinado o valor igual a PI = pH = 8,6. De acordo
com dados da literatura, esse valor caracteriza-se pela etapa de pré-tratamento
2 4 6 8 10 12
-10
-5
0
5
10
15
20
Po
ten
cia
l Z
eta
(m
V)
pH
Ponto Isoelétrico
PI = pH = 8,6
70
ácido. O ponto isoelétrico pode variar em função da sua forma de obtenção, ficando
em torno de 4,5 a 5,3 para gelatinas tipo B (pré-tratamento de hidrólise com pH
alcalino) e permanecendo entre 7,0 a 9,4 na gelatina tipo A (pré-tratamento ácido)
(SILVA, 2010).
A fonte de obtenção da gelatina, no caso da pele de tilápia, do mesmo
modo influencia o valor do ponto isoelétrico. Segtnan (2002) comenta que peles e
ossos de origens diferentes produzem gelatina tipo A. Gelatinas tipo B são obtidas a
partir de peles de bovinos ou ossos. Os tipos de gelatina revelam composição
similar, de modo que a diferença nas propriedades do produto ocorre devido ao tipo
de material utilizado, ao processo de pré-tratamento empregado e à agressividade
da hidrólise (SCHOTT, 2001). Pode-se confirmar, então, que a gelatina obtida é do
tipo A.
Nesta análise, o valor do pH encontrado caracteriza o ponto isoelétrico
representando a neutralidade e tem efeito direto nas propriedades e caracterização
da uma proteína. Conhecer o ponto isoelétrico é, pois, importante para definir a
menor solubilidade de um composto em água.
6.4 Caracterização dos biocompósitos
A Figura 28a-b, apresenta imagens dos biocompósitos antes da
liofilização apenas com variação da concentração da nano-hidroxiapatita e sem o
agente reticulante riboflavina.
Figura 28 – Imagens dos biocompósitos antes da liofilização: (a) Gel 5%+HAp 1%, (b) Gel 5%+HAp
2,5%.
Fonte: Autora, 2017.
71
As Figuras 29a-b, mostra os biocompósitos com concentração de 1% de
nano-hidroxiapatita e variações da concentração de riboflaviana, antes e após a
exposição a radiação ultra violeta.
Figura 29 – Imagens dos biocompósitos antes e após a exposição a radiação ultra violetada: (a) Gel
5%+HAp 1% + Rib 0,05%, (b) Gel 5%+HAp 1% + Rib 0,1%.
Fonte: Autora, 2017.
Já a figura 30a-b apresenta os biocompósitos com 2,5% de nano-
hidroxiapatita e com variações da concentração de riboflaviana também antes e
após a exposição a radiação ultra violeta.
72
Figura 30 – Imagens dos biocompósitos antes e após a exposição a radição ultra violetada: (a) Gel
5%+HAp 2,5% + Rib 0,05%, (b) Gel 5%+HAp 2,5% + Rib 0,1%.
Fonte: Autora, 2017.
A Figura 31 apresenta imagens de todas as formulações dos
biocompósitos, após etapa de exposição a radiação ultra violeta. Eles foram
liofilizados e que, posteriormente, foram moídos para as caracterizações.
73
Figura 31– Imagens dos biocompósitos liofilizados. (a) Gel 5%+HA 1%, (b) Gel 5%+ HA 1%+ Rib
0,05%, (c) Gel 5%+ HA 1% + Rib 0,1%, (d) Gel 5%+HA 2,5%, (e) Gel 5%+ HA 2,5%+ Rib 0,05%, (f)
Gel 5%+ HA 2,5% + Rib 0,1%.
Fonte: Autora, 2017.
74
6.4.1 Análise Termogravimétrica
A análise de TGA/DTG foi realizada para todas as formulações dos
biocompósitos à base gelatina com nano-hidroxiapatita, conforme Figuras 32 e 33.
Essa análise caracteriza as propriedades físicas do polímero utilizado na preparação
do biocompósito, com a perda ou alteração em massa com o decorrer do aumento
da temperatura.
Figura 32 – Gráfico de TGA dos biocompósitos de gelatina com nano-hidroxiapatita.
Fonte: Autora, 2017.
100 200 300 400 500 600 700 800 900
0
20
40
60
80
100
Massa (
%)
Temperatura (°C)
G5%+HAp1%
G5%+HAp1%+R0,05%
G5%+HAp1%+R0,1%
G5%+HAp2,5%
G5%+HAp2,5%+R0,05%
G5%+HAp2,5%+R0,1%
100 200
86
88
90
92
94
96
98
100
Região 1
300 400 500
40
60
80
Região 2
600 700 800 900
20
40
Região 3
75
Figura 33 – Gráfico de DTG dos biocompósitos de gelatina com nano-hidroxiapatita.
Fonte: Autora, 2017.
Houve regiões típicas de perdas de massa para todos os biocompósitos
conforme as curvas. Em todas as formulações, com suas variedades de
concentrações, apresentaram três regiões de perdas de massa bem definidas. Na
Tabela 10, expõem-se os dados das perdas de massa.
Tabela 12 – Perdas de massa das curvas de TGA/DTG dos biocompósitos.
Compósitos
1ª. Perda de Massa (1)
2ª. Perda de Massa (2)
3ª. Perda de Massa (3)
Massa (%)
Faixa de Temperatura
(°C)
Massa (%)
Faixa de Temperatura
(°C)
Massa (%)
Faixa de Temperatura
(°C) G5%+HAp1% 10,4 20 – 190 46,9 190 – 457 88,2 457 – 672
G5%+HAp1%+
R0,05%
10,1 20 – 180 45,5 180 – 459 87,1 459 – 673
G5%+HAp1%+
R0,1%
10,7 20 – 185 46,0 185 – 466 86,5 466 – 700
G5%+HAp2,5% 10,3 20 – 184 46,0 184 – 460 88,4 460 – 689
G5%+HAp2,5%
+R0,05%
10,3 20 – 185 48,0 185 – 479 88,3 479 – 712
G5%+HAp2,5%
+R0,1%
11,0 20 – 185 46,2 185 – 470 88,0 470 – 706
100 200 300 400 500 600 700 800 900
-4
-2
0
2
4
Der
ivad
a d
a m
assa
(%
/min
)
Temperatura (°C)
12
3
Fonte: Autora, 2017.
76
Todos os biocompósitos sofreram perdas de massas e registraram faixas
de temperaturas de degradação muito próximas em todas as formulações, o que
podemos observar pelos destaques das três regiões na curva de TGA. Já a derivada
de primeira ordem de curvas TGA revela a temperatura em que a diminuição
máxima de massa ocorre (HOSSAN et al., 2014). Logo, na região (1), em todas as
formulações, estão relacionadas as perdas de massa de água absorvidas
físicamente, e podem estar associadas à umidade nos biocompósitos, cujas faixas
variam entre 20 °C e 190 °C. Em relação à região (2), que é considerada a principal,
por representar as perdas de massas das cadeias da gelatina, registrou em média
uma faixa de decomposição entre 180 °C e 480 °C. A região (3) representa a massa
residual da fase inorgânica, quando a hidroxiapatita, resistente a temperaturas mais
elevadas, suportou faixas de temperatura em média de 457 °C a 712 °C. De acordo
com essa região, esperava-se uma maior resistência gradual à medida que
aumentou a concentração de hidroxiapatita nas formulções. Segundo Hossan et al.
(2014), a partir dos dados de TGA/DTG, observa-se que compósitos de gelatina com
hidroxiapatita são extremamente estáveis. A estabilidade do composto intensifica-se
com o aumento da concentração de hidroxiapatita. As temperaturas para a região
(2) encontradas pelo autor citado foram em média em torno de 328,5 °C para as
perdas de massa da gelatina nos compósitos. Comparando com as faixas, as
temperaturas encontradas foram superiores e podem estar associadas ao uso da
riboflavina como agente reticulante, pois aumentou a estabilidade das cadeias da
gelatina devido às ligações cruzadas.
Além disso, a adesão entre as fibras naturais e a matriz polimérica, o
volume de fração de fibra, a orientação da fibra e a matriz polimérica usada
representam um papel determinante nas propriedades dos compósitos (MOTHÉ et
al., 2007).
77
6.4.2 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
A Figura 34 apresenta os espectros de FT-IR, neles, é possível identificar
os grupos funcionais principais da gelatina e nano-hidroxiapatita utilizados nas
formulações dos biocompósito em um intervalo de 4000 a 550 cm-1. A Tabela 13
resume as bandas do espectro de infravermelho e tipos de vibrações dos
biocompósitos.
Figura 34 – Espectros de FT-IR dos biocompósitos de gelatina com nano-hidroxiapatita.
Fonte: Autora, 2017.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
G5%+HAp2,5%+R0,05%
G5%+HAp1%+R0,1%
Número de onda (cm-1
)
G5%+HAp1%
Amida IIIAmida II
G5%+HAp1%+R0,05%
O-HAmida I
P-O
G5%+HAp2,5%
Tran
smit
ânci
a (%
)
G5%+HAp2,5%+R0,1%
78
Tabela 13 – Bandas dos espectros de infravermelho e tipos de vibrações dos biocompósitos.
Biocompósito
Tipo de vibrações
O-H C=O
Amida I
N-H
Amida II
C-N
Amida III asP-O
Número de onda (cm-1)
G5%+HAp1% 3285 1633 1539 1236 1063
G5%+HAp1%+R0,05% 3286 1638 1546 1241 1060
G5%+HAp1%+R0,1% 3281 1644 1548 1240 1026
G5%+HAp2,5% 3287 1640 1532 1233 1048
G5%+HAp2,5%+R0,05% 3285 1630 1535 1236 1032
G5%+HAp2,5%+R0,1% 3290 1634 1532 1234 1030
Fonte: Autora, 2017.
É, de fato, possível verificar a presença de uma banda que varia entre
3281 e 3290 cm-1, referente ao estiramento da ligação de O-H de grupos hidroxila,
típicas da gelatina e hidroxiapatita, estando mais evidente nos compósitos 2 a 7
nessa região, com intensidade variável. Narbat et al. (2006) encontraram bandas
relacionadas ao alongamento de grupos hidroxila em 4000 a 3200 cm-1. Para Sridhar
et al. (2014), bandas em 3400 cm-1 seriam referentes a hidroxilas O-H da riboflavina.
Outras bandas típicas da gelatina foram observadas em todas as
formulações para estiramento da ligação C=O de amida I, variando entre 1630 e
1644 cm-1, assim como deformação de ligações N-H referentes à amida II que
variaram de 1532 a 1548 cm-1,além de bandas relativas à amida III devido ao
estiramento da ligação C-N, que variou entre 1233 e 1241 cm-1. De acordo com
Sridhar et al. (2014), as bandas amidas I, II e III de gelatinas ocorrem a 1643, 1541 e
a 1240 cm-1 nas microfibras de riboflavina com gelatina. Segundo Huang el al.
(2013), as bandas de absorção da gelatina a 1645 cm-1 e 1554 cm-1 foram
associadas com o estiramento de C=O na amida I e o do N-H na amida II,
respectivamente. Além do mais, o pico em torno de 1454 cm-1 foi atribuído ao
estiramento de C-O na amida III. Narbat et al. (2006) associaram ao estiramento de
ligação C=O a 1670 a 1650 cm-1 para a amida I e deformação de ligação de N-H em
1500 a 1550 cm-1para a amida II.
Outros fatores importante são bandas entre 1333 e 1339 cm-1, que estão
presentes em todas as formulações, porém mais evidentes em algumas e estão
79
relacionadas às cadeias laterais de prolina da gelatina. Para Narbat et al. (2006), a
banda em 1337 cm-1 na gelatina não representa simplesmente o grupo carboxila,
como é uma de um número de bandas na gama de 1400-1260 cm-1 que são
atribuídas à presença de gelatina de tipo I, confirmando que gelatinas do tipo I são
aquelas obtidas de fontes como peles e tendões, conforme descrito na Tabela 3.
Bandas que variaram entre 1030 e 1063 cm-1 são referentes a
estiramentos de ligações P-O de grupamentos PO43- da hidroxiapatita. Para Huang
el al. (2013), uma banda a 1028 cm-1 correspondeu ao estiramento de um grupo
fosfato PO43- para compósito com hidroxiapatita obtida de escamas de peixe.
Durante o processo de formação do compósito hidroxiapatita e gelatina,
os íons Ca2+ formarão uma ligação iônica com R-COO- de moléculas da gelatina
(NARBAT et al., 2006). A ligação cruzada induz o encurtamento da distância entre
as fibrilas hidroxiapatita e gelatina, e mais quantidade de íons Ca2+ da hidroxiapatita
terá a possibilidade de ligar-se com os íons R-COO- das moléculas da gelatina
(HOSSAN et al., 2014).
6.4.3 Microscopia Eletrônica por Varredura
As micrografias da Figura 35 apresentam a morfologia e as estruturas dos
biocompósitos após liofilização. A Figura 35a e 35d , apresenta o material não
reticulado e com apenas ondulações típicas da gelatina. Algumas características
mais diferenciadas poderão ser observadas nas Figuras 35b-c que mostram
visivelmente as estruturas de nano-hidroxiapatita polimerizadas na gelatina usada
como polímero orgânico, porém poucos poros no material. Apesar de apresentar
nano-hidroxiapatita 1% e agente reticulante riboflavina em concentrações variadas,
não ficaram muito evidentes os poros. Já nas Figuras 35e-f, percebem-se divisões
das amostras apresentando estruturas homogênea entre as partículas de nano-
hidroxiapatita. As imagem comparadas das amostras exibiram uma estrutura
macroporosa fortemente análoga e profundamente interligada, denotando a
homogeneidade entre as nanopartículas de HAp (SARTUQUI et al., 2016). Isso pode
estar relacionado à maior concentração de nano-hidroxiapatita igual a 2,5%. Para
Tirella et al. (2012), uma estrutura com poros aleatórios torna evidente a formação
de ligações cruzadas covalentes dentro de fibras adjacentes. A formação dos poros
é importante devido à aplicação que pode ser dada ao material. Segundo Sartuqui et
80
al. (2016), a presença de poros, interconexão, geometria, orientação e tamanhos
são necessários para manter as interações célula-célula de forma adequada para
garantir a correta transferência de massa de nutrientes, resíduos e oxigênio.
Em geral, nesta análise, verificou-se que o tamanho e a disposição da
nano-hidroxiapatita eram semelhantes para as formulações examinadas, não
estando agregados em porções nos biocompósitos.
Figura 35 – Micrografias dos biocompósitos.(a) Gel 5%+HA 1%, (b) Gel 5%+ HA 1%+ Rib 0,05%, (c)
Gel 5%+ HA 1% + Rib 0,1%, (d) Gel 5%+HA 2,5%, (e) Gel 5%+ HA 2,5%+ Rib 0,05%, (f) Gel 5%+ HA
2,5% + Rib 0,1%.
Fonte: MUNIZ, C. R., 2016.
81
7 CONCLUSÃO
Os tratamentos utilizados foram eficientes para isolar a nano-
hidroxiapatita das escamas e obter gelatina da pele de tilápia do Nilo, possibilitando
a formação de biocompósitos.
As análises térmicas foram condizentes com a fase inorgânica da
escama, e gelatina com temperaturas máximas de 470°C e 460 °C,
respectivamente.
A análise de cromatografia por permeação em gel apresentou valor de
45.000 g/mol, o que mostra que a gelatina obtida contém uma massa molecular
média elevada por conta do tratamento ácido realizado.
A análise de ponto isoelétrico confirmou que a gelatina é do tipo A
podendo ser atribuído também por conta do tratamento ácido realizado.
A microscopia da escama confirmou as fase orgânica (proteína) e
inorgânica (rica em fosfatos). A análise de miscroscopia para a gelatina confirmou
ser uma eficiente matriz polimérica devido a sua morfologia, com ondulações e
aplicações para biocompósitos.
Foi possível a incorporação de riboflavina (vitamina B2), como agente
reticulante nos bionanocompósitos apresentando na análise de Espectroscopia de
Infravermelho com Transformada de Fourier, bandas características como P-O de
nano-hidroxiapatita, O-H tanto de nano-hidroxiapatita como gelatina e grupamentos
de amidas I, II e III típicos da gelatina.
Os biocompósitos obtidos apresentaram boa estabilidade térmica com
temperaturas máximas variando entre 672 °C e 712 °C.
Através da microscopia observou-se que foi possível obter biocompósitos
com dispersão de nano-hidroxiapatita mesmo com aumento da concentração.
82
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