universidade federal de uberl´ndia instituto de … · efeito tumor sólido (s180) implantado em...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
EFEITO CITOTÓXICO E ANTITUMORAL DA BOTHROPSTOXINA-I E DA
CROTAMINA
LUIZ CARLOS GEBRIM DE PAULA COSTA
UBERLÂNDIA-MG
JANEIRO-2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
EFEITO CITOTÓXICO E ANTITUMORAL DA BOTHROPSTOXINA-I E DA
CROTAMINA
LUIZ CARLOS GEBRIM DE PAULA COSTA
ORIENTADORA: MARIA INÊS HOMSI BRANDEBURGO
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Uberlândia como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Genética e Bioquímica (Área Bioquímica)
UBERLÂNDIA-MG
JANEIRO-2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
EFEITO CITOTÓXICO E ANTITUMORAL DA BOTHROPSTOXINA-I E DA
CROTAMINA
COMISSÃO EXAMINADORA
PRESIDENTE: MARIA INÊS HOMSI BRANDEBURGO EXAMINADORES:
Data da defesa:
As sugestões da Comissão Examinadora e as Normas PGGB para o formato da
Dissertação foram contempladas
________________________________________
Profa. Dra. Maria Inês Homsi Brandeburgo
Uberlândia,
i
AAggrraaddeecciimmeennttooss
DDrraa.. MMaarriiaa IInnêêss HHoommssii BBrraannddeebbuurrggoo,, ppeellaa oorriieennttaaççããoo dduurraannttee oo mmeessttrraaddoo ee iinniicciiaaççããoo cciieennttiiffiiccaa..
DDrraa.. VVeerriiddiiaannaa ddee MMeerrlloo RRooddrriigguueess ÁÁvviillaa,, ppeellaa ccoo--oorriieennttaaççããoo dduurraannttee oo mmeessttrraaddoo,, ssuuggeessttõõeess ppaarraa oo
ddeesseennvvoollvviimmeennttoo ddoo pprroojjeettoo,, ccoorrrreeççõõeess dduurraannttee oo ddeesseennvvoollvviimmeennttoo ddeessttee ttrraabbaallhhoo ee ppeelloo aappooiioo ffiinnaanncceeiirroo ..
DDrraa.. AAmméélliiaa HHaammaagguucchhii ppeellaass ssuuggeessttõõeess dduurraannttee aa rreeaalliizzaaççããoo ddeessttee ttrraabbaallhhoo..
DDrraa.. EElliissããnnggeellaa ddee PPaauullaa SSiillvveeiirraa LLaacceerrddaa,, ppeelloo aappooiioo dduurraannttee oo iinníícciioo ddoo ttrraabbaallhhoo ee ddeesseennvvoollvviimmeennttoo
ddaass mmeettooddoollooggiiaass eemmpprreeggaaddaass..
CCaarrllaa MMeenneezzeess,, ppeellaa ccoonnvviivvêênncciiaa ee aajjuuddaa ooffeerreecciiddaa dduurraannttee ttooddoo oo ddeesseennvvoollvviimmeennttoo ddeessttee ttrraabbaallhhoo..
DDrr.. AAnnddrreeiimmaarr MMaarrttiinnss SSooaarreess ppeelloo ffoorrnneecciimmeennttoo ddaass ttooxxiinnaass nnaattiivvaass ee mmooddiiffiiccaaddaass,, ee ppeelloo aappooiioo nnaa
rreeaalliizzaaççããoo ddeessttee ttrraabbaallhhoo..
DDrr.. AAuurroo NNoommiizzoo,, ppeelloo eessttáággiioo ooffeerreecciiddoo eemm sseeuu llaabboorraattóórriioo dduurraannttee aa ffaassee iinniicciiaall ddoo ttrraabbaallhhoo ee ppeelloo
ffoorrnneecciimmeennttoo ddaass lliinnhhaaggeennss ttuummoorraaiiss hhuummaannaass..
DDrraa.. HHeellooiissaa VViieeiirraa FFeerrrroo,, ppeellaa ddiissppoonniibbiilliizzaaççããoo ddoo LLaabboorraattóórriioo ddee HHiissttoollooggiiaa ddoo IInnssttiittuuttoo ddee
BBiioocciiêênncciiaass ddaa UUFFUU ppaarraa aa rreeaalliizzaaççããoo ddaass aannáálliisseess hhiissttoollóóggiiccaass..
DDrr.. LLuuiizz RRiiccaarrddoo GGoouullaarrtt FFiillhhoo ppoorr ddiissppoonniibbiilliizzaarr sseeuu llaabboorraattóórriioo ppaarraa aa rreeaalliizzaaççããoo ddaass aannáálliisseess ddee
eexxpprreessssããoo ggêênniiccaa....
DDrr.. MMiinneeoo ppeelloo ffoorrnneecciimmeennttoo ddaa lliinnhhaaggeemm ttuummoorraall ddee ccaammuunnddoonnggoo..
MMsscc.. CCrriissttiiaannii BBaallddoo ppeellaa ccoonnvviivvêênncciiaa,, aajjuuddaa nnaass aannáálliisseess ddee eexxpprreessssããoo ggêênniiccaa ee iimmppoorrttaanntteess ccoommeennttáárriiooss
aa rreessppeeiittoo ddeessttee ttrraabbaallhhoo..
MMaarrcciioo JJoosséé ppeellaa rreeaalliizzaaççããoo ddaa ppaarrttee mmoorrffoollóóggiiccaa ddeessttee ttrraabbaallhhoo....
ii
EElliissâânnggeellaa ddoo llaabboorraattóórriioo ddee ggeennééttiiccaa ppeellaa aajjuuddaa nnoo iinníícciioo ddaass aannáálliisseess ddee eexxpprreessssããoo ggêênniiccaa....
MMsscc.. LLuuiizz FFeerrnnaannddoo MM.. IIzziiddoorroo ppeellaa aajjuuddaa nnaass aannáálliisseess hheemmaattoollóóggiiccaass..
AAooss ccoolleeggaass ddoo LLaabboorraattóórriioo ddee QQuuíímmiiccaa ddee PPrrootteeíínnaass ee PPrroodduuttooss NNaattuurraaiiss:: RReennaattaa,, MMiirriiaamm,, RRooddrriiggoo,,
AAnnddrréé,, LLuuiizz HHeennrriiqquuee,, DDaaiiaannaa,, CCaarrooll,, FFaabbiioo,, MMaarriilliiaa,, JJoohhaarraa,, LLuuiizz AAnnttôônniioo ee DDaanniilloo..
AA CCAAPPEESS ee aaoo CCNNPPqq ppeelloo aappóóiioo ffiinnaanncceeiirroo
AA ttooddooss qquuee ddiirreettaammeennttee oouu iinnddiirreettaammeennttee ccoonnttrriibbuuíírraamm ppaarraa rreeaalliizzaaççããoo ddeessttee ttrraabbaallhhoo..
iii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS vi LISTA DE TABELAS E FIGURAS vii INTRODUÇÃO GERAL 01
1. Constituição da peçonha ofídica 02 1.1. Gênero Bothrops- Constituição da peçonha botrópica 02 1.2. Gênero Crotalus- Constituição da peçonha crotálica 08 2. Definição e características gerais das neoplasias 10
2.1. Classificação das neoplasias 11 2.2. Causas do câncer 12 2.3. Imunidade para o tumor 13 2.4. Antineoplásicos 14
OBJETIVOS 17
Objetivos gerais 18 Objetivos específicos 18 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 19
CAPÍTULO ÚNICO �Efeito Citotóxico e Antitumoral da Bothropstoxina-I e da
Crotamina�
RESUMO 29 ABSTRACT 30 1. INTRODUÇÃO 31
2. MATERIAL E MÉTODOS 33
2.1. Peçonhas 33 2.2. Toxinas 33 2.3. Animais 33
2.4. Quantificação de proteínas 34 2.5. Meios de cultura celular para células tumorais e macrófago 34 2.6. Linhagens de células tumorais humanas e de camundongos 35 2.7. Cultivo de células tumorais 35
2.8. Obtenção de macrófagos peritôneais de camundongos 35 2.9. Atividade citotóxica 36 2.10. Atividade bacteriolítica 36
iv
2.11. Inoculação e manutenção do tumor (S180) 37
2.12. Implantação do tumor sólido 38 2.13. Atividade antitumoral 38 2.14. Estudo do efeito miotóxico da miotoxinas BthTX-I e BthTx-I BPB sobre
músculo gastrocnemius de camundongos 39 2.15. Análise estatística 39
3. RESULTADOS 40 3.1. Atividade citotóxica da peçonha bruta de Bothrops jararacussu, BthTX-I nativa e
modificada (BPB) sobre linhagem leucêmica linfoblástica T humana Jurkat 40
3.2. Atividade citotóxica da BthTX-I nativa e modificada (BPB) sobre linhagem
adenocarcinoma de mama humano SK-Br-3 40
3.3. Atividade citotóxica de BthTX-I nativa e modificada (BPB) sobre linhagem
de melanoma humano B16F10 43 3.4. Atividade citotóxica de BthTX-I nativa e modificadas (BPB, NPSC e NBSF),
peçonha bruta de Crotalus durissus terrificus e crotamina sobre linhagem de
sarcoma 180 murino 43
3.5. Atividade citotóxica de BthTX-I nativa e modificada (BPB, NPSC e NBSF), peçonha
bruta de Crotalus durissus terrificus e crotamina sobre macrófagos
peritoniais murinos 44 3.6. Atividade bactericida da BthTx-I nativa e modificada (BPB, NPSC e NBSF)
sobre E. col i e S. aureus 48 3.7. Inibição do crescimento do tumor sólido (S180) implantado em camundongos 50 3.7.1. Avaliação histopatológica 52
3.7.1.1. Efeito da inoculação de BthTx-I em camundongos normais 52
3.7.1.2. Efeito da inoculação de BthTX-I BPB em camundongos normais 52
3.7.1.3. Efeito tumor sólido (S180) implantado em camundongos não tratados 52
3.7.1.4. Efeito do tratamento do tumor sólido com BthTX-I 52
3.7.1.5. Efeito do tratamento do tumor sólido com BthTX-I BPB 53 4. DISCUSSÕES 63 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 71
v
LISTA DE ABREVIATURAS
A: absorbância
Asp: aspartato
ATCC: American Type Culture Collection
B16F10: melanoma humano
BPB: brometo de p-bromofenacila
BthTX-I: Bothropstoxina-I
Cys: cisteína
DMSO: dimetil sulfato de sódio
DNA: ácido desoxirribonucléico
DP: desvio padrão
Glu: glutamato
HTLV-1: vírus linfocitotrófico T humano
i.m.: intramuscular
IL: interleucina
KGD: lisina-glicina-aspartato
Lys: lisina
MAF: macrophage activator factor
MDR: muti drug resistance
MMP: metaloprotease de matriz
MPAC: murine peritoneal adherent cells
MTT: 2,5-difenil-tetrazolium-(3-[4,5-dimetiltiazol-2]
NBSF: fluoreto de 2-nitrobenzenosulfonila
NK: natural killer
NPSC: cloreto de o-nitrofenilsulfenila
PI%: porcentagem de inibição
PLA2: fosfolipase A2
RGD: arginina-glicina-aspartato
RNA: ácido ribonicléico
RPM: rotações por minuto
RPMI: meio de cultura RPMI RT-PCR: transcripitase reversa- reação em cadeia da polimerase
vi
S180: sarcoma 180
Ser: serina
SFB: soro fetal bovino Sk-Br-3: células do adenocarcinoma humano
TIMP: inibidor tecidual de metaloprotease
TNF: fator de necrose tumoral
Trp: triptofano
VRCTC-310-ONCO: agente antineoplásico composto de crotoxina e cardiotoxina
vii
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1. Efeito do tratamento com BthTX-I ou BthTX-I BPB no tumor sólido
induzido por células do Sarcoma 180 implantados em camundongos (pág 51).
Figura 1. Efeito citotóxico da peçonha bruta de Botrhops jararacussu, BthTX-I e
BthTX-I BPB sobre a linhagem leucêmica linfoblástica T humana Jurkat (pág 41).
Figura 2. Efeito citotóxico de BthTX-I e BthTX-I BPB sobre a linhagem de
adenocarcinoma de mama humano SK-BR-3 (pág 42).
Figura 3. Efeito citotóxico de BthTX-I e BthTX-I BPB sobre a linhagem de
melanoma humano B16F10 (pág 45).
Figura 4. Efeito citotóxico: da peçonha bruta de Botrhops jararacussu , BthTX-I,
BthTX-I BPB, BthTX-I NPSC e NBSF, da peçonha bruta de Crotalus durrissus
terrificus e crotamina sobre a linhagem de sarcoma 180 murino (pág 46).
Figura 5. Efeito citotóxico: de BthTX-I, BthTX-I BPB, BthTX-I NPSC e NBSF, da
peçonha bruta de Crotalus durrissus terrificus e crotamina sobre macrófagos
peritoneais murinos (pág 47).
Figura 6. Atividade bactericida de BthTX-I nativa e modificada (BPB,
NBSF e NPSC) sobre E. col i S. aureus (pág 49).
Figura 7. Fotomicrografia de secções musculares de camundongos Balb/c
machos normais injetados com a miotoxina BthTX- I (pág 54).
Figura 8. Fotomicrografia de secções musculares de camundongos Balb/c
machos normais injetados com a miotoxina BthTX- I BPB (pág 56).
Figura 9. Fotomicrografia de secções de fragmentos de tumor sólido (S180)
implantados em camundongos não tratados (pág 57).
viii
Figura 10. Fotomicrografia de secções de fragmentos de tumor sólido (S180)
implantados em camundongos tratados com BthTX-I (pág 58-59).
Figura 11. Fotomicrografia de secções de fragmentos de tumor sólido (S180)
implantados em camundongos tratados com dose única BthTX-I BPB (pág 61-62).
1
IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO GGEERRAALL
2
11.. CCOONNSSTTIITTUUIINNTTEESS DDAA PPEEÇÇOONNHHAA OOFFÍÍDDIICCAA
As peçonhas são misturas complexas de componentes tóxicos que
possuem diversas formas de ação em presas e que podem vitimar seres
humanos. Estes componentes consistem principalmente de proteínas (90%),
compreendendo grande variedade de enzimas e toxinas não enzimáticas
(SCHIMIDT et al, 1976) que tem como funções primárias matar ou imobilizar suas
presas, e ajudar na digestão. A parte não protéica é representada por
carboidratos, lipídeos e compostos de baixo peso molecular, como nucleosídeos e
diversos íons (CHIPPAUX et al, 1991).
11..11.. GGêênneerroo BBootthhrrooppss-- CCoonnssttiittuuiiççããoo ddaa ppeeççoonnhhaa bboottrróóppiiccaa
A peçonha botrópica pode desencadear severas desordens metabólicas
devido às atividades: proteolítica, coagulante, hemorrágica, necrosante e reação
inflamatória com uma ampla liberação de mediadores celulares, entre citocinas e
produtos microbicidas (reativos de oxigênio e nitrogênio) (AMARAL et al, 1985;
LOMONTE et al, 1993). Embora raramente fatais, os casos de envenenamentos
por estas serpentes se agravam devido à intensidade dos efeitos locais. Observa-
se eritema e edema, este último tão intenso e prolongado que pode causar a
compressão dos tecidos e vasos, resultando em isquemia e aumentando a
necrose tecidual. Dependendo do tempo transcorrido até o tratamento da vítima, a
amputação da área afetada poderá ser necessária. A necrose do córtex renal é
uma freqüente e séria complicação do envenenamento botrópico (DA SILVA et al,
1979), vasoespasmos, nefrotoxicidade direta da peçonha e/ou coagulação
intravascular disseminada, levando a oclusão vascular e isquemias, são hipóteses
do mecanismo patogênico que explicam a necrose local observada (BASU et al,
1977).
Toxinas e enzimas como as hemorraginas, proteases inespecíficas,
fosfolipases A2, fosfodiesterases, L-aminoácido oxidases, entre outras, provocam
3
estas atividades por efeitos cumulativos e/ou sinérgicos (GUTIÉRREZ &
LOMONTE, 1995; MARKLAND, 1998).
O mecanismo do dano tecidual local provocado pelo envenenamento
ofídico também envolve a ativação de uma resposta imunológica em que uma
cascata de eventos é geralmente iniciada por macrófagos e monócitos do sangue.
Os monócitos ativados liberam um amplo espectro de mediadores no qual a
interleucina-1 (IL-1) e o fator de necrose tumoral (TNF) disparam vários eventos
pro-inflamatórios importantes (LOMONTE et al, 1993). Os fatores hemorrágicos (SVMP- snake venoms metalloproteases)
encontrados nas peçonhas de serpentes são metaloproteases pertencentes a
subfamília das reprolisinas (dentro da família das metzincinas); estes são
peptidases dependentes cataliticamente de íons metálicos, especialmente o zinco
(Kamigutti et al, 1998).
As SVMPs apresentam grande diversidade em relação á massa molecular
(20 a 100 KDa) e são divididos de acordo com seus domínios estruturais
(Bjarnason & Fox, 1994).
As metaloproteases da classe PI apresentam baixo peso molecular (20 a
30 KDa), elas possuem somente um domínio metaloprotease, a ação
hemorrágica é baixa ou ausente mas induzem lesão tecidual local (Gutierrez et al,
1995).
Na classe PII estão as proteases de massa molecular de 30 a 60 KDa e
com alta atividade hemorrágica; além do domínio metaloprotease possuem um
domínio adicional tipo desintegrina (Gutierrez & Rucavado, 2000), este domínio é
responsável pela inibição da agregação plaquetária por ligar ao receptor
GPαIIb/βIII da plaqueta impedindo a ligação com a molécula do fibrinogênio.
As metaloproteases encontradas na classe PIII possuem massa molecular
de 60 a 80 KDa e são altamente hemorrágica, além dos domínios citados nas
classes PI e PII, possuem um terceiro, o carboxi-terminal rico em cisteína, e
provavelmente tenha uma função de estabilização do domínio desintegrina. Na
classe PIV, estão as proteases com massa variando de 80 a 100 KDa, possuem
um quarto domínio adicional, o ligante de lectina que atua como marcador para
alvo de proteólise (Gutierrez & Rucavado, 2000).
4
A ação destas metaloproteases consiste na degradação da estrutura do
endotélio vascular, dois mecanismos são identificados, um onde a hemorragia
ocorre devido a ruptura proteolítica dos componentes da membrana basal dos
vasos capilares (colágeno tiipo IV, laminina, fibronectina etc) este mecanismo é
denominado hemorragia per rhexis, e outro onde o sangue extravasa através de
junções endoteliais (hemorragia per diapedesis) (Kamiguti et al, 1996, Gutierrez &
Rucavado, 2000).
Dentre as proteases existem as enzimas fibrinogenolíticas que atuam sobre
o fibrinogênio, podendo hidrolisar suas cadeias (Aα, Bβ e γ), levando a
incoagulabilidade sangüínea (HUANG et al, 1993).
Outro grupo de proteases são as enzimas �Thrombin-like�, que são serino-
proteases. Estas enzimas convertem o fibrinogênio em fibrina liberando os
fibrinopeptídeos A e B, formando, portanto o microcoágulo de fibrina, porém as
�Thrombin-like� não ativam o fator XIII, responsável por unir de forma cruzada os
monômeros de fibrina, tornando o coágulo mais denso. Deste modo, o coágulo
fica mais suscetível à degradação pela plasmina, induzindo assim um estado de
desfibrinogenação in vivo (FAN et al, 1999). As serinoproteases também são
capazes, de ativar o fator V da coagulação e a proteína C plasmática e clivar o
componente C3 do sistema de complemento (PETRETSKI et al, 2000).
Proteínas �Lectin-like� têm sido encontradas em peçonhas elapídicas,
viperidicas e crotalídicas. Estas proteínas ligam-se a motivos de lactose e
induzem a aglutinação de eritrócitos (OGILVIE & GARTNER, 1984) e agregação
plaquetária (OGILVIE et al, 1989).
As desintegrinas pertencem a uma família de proteínas pequenas que
contêm a seqüência de aminoácidos RGD (Arg-Gly-Asp) ou KGD (Lys-Gly-Asp)
que é o motivo estrutural reconhecido pelo receptor da plaqueta α2β3 para o
fibrinogênio, elas também agem como potentes antagonistas de várias integrinas,
inclusive αvβ3 e α5β1 que são expressas em células do endotélio vascular e em
algumas células tumorais. Além de sua atividade antiagregante potente, as
desintegrinas revelaram novas funções inibindo a angiogênese e proliferação de
tumor (KAMIGUTI et al, 1998).
Um dos principais componentes da peçonha botrópica é a enzima
termoestável fosfolipase A2 (PLA2), que tem como substrato os fosfolipídeos
5
constituintes da membrana plasmática celular. Com a ação da enzima, os
fosfolipídeos são hidrolisados, desestruturando a membrana e comprometendo
sua permeabilidade seletiva. A hidrólise ocorre especificamente na ligação acil na
posição sn-2 do fosfoglicerídeo (MOLLIER at al, 1990; ARNI & WARD, 1996; KINI
et al, 2003) liberando ácidos graxos e lisofosfatídeos. Muitas vezes um destes
ácidos é o araquidônico, que é precursor de outros eicosanóides, entre eles estão
as prostaglandinas e hormônios aromáticos que são gerados pela cicloxigenação,
e leucotrienos e acidos hidroxieicotetranóicos gerados pela lipooxigenação
(DESSEM, 2000). Os lisofosfatídeos liberados podem ser convertidos em fator de
ativação plaquetária (PAF).
Os eicosanóides são potentes mediadores celulares (DENNIS, 1997) tendo
importantes papéis nos eventos de regulação do fluxo sanguíneo, migração,
secreção e apoptose celular, estímulo de reações inflamatórias, crescimento de
tumores e metástases (KUDO et al, 1993; DENIZOT et al, 1999).
As PLA2 são encontradas tanto no interior como no exterior da célula
(BOSCH, 1980; DENNIS, 1994). As PLA2 intracelulares estão freqüentemente
associadas a membranas e envolvidas com o metabolismo de fosfolipídios,
transdução de sinais e outras funções celulares (MUKHEERJEE et al, 1994). As
extracelulares são amplamente distribuídas em secreções pancreáticas,
exudados inflamatórios e nas peçonhas de serpente e artrópodes e foram
divididas em dez classes (I a X), com base no número de resíduos de
aminoácidos e posição das ligações dissulfeto (RENETSEDER et al, 1985;
DENNIS, 1997; WARD et al, 2001).
As PLA2s de serpentes estão todas reunidas nos grupos I e II, estas são
proteínas pequenas de 119 a 143 resíduos de aminoácidos com peso molecular
variando de 13.000 a 18.000. As PLA2 do grupo I são encontradas em peçonhas
de serpentes do gênero Elapidae e Hydrophidae, enquanto que as do grupo II são
encontradas, principalmente em peçonha de serpentes crotálicas e viperideas
(WARD et al, 2001).
A distinção entre as classes I e II é baseada em dois critérios estruturais, o
primeiro critério é a localização das pontes dissulfeto formadas entre os resíduos
de meia cistina 11 e 77 no grupo I, e 51 e 133 para as PLA2 do grupo II (ARNI &
WARD, 1996). O segundo critério é a presença de duas a três inserções de
6
aminoácidos (loop elapídico), que está presente na região dos resíduos de
aminoácidos 52-65 nas PLA2s da classe I. Este �loop� é truncado nas da classe II,
porém, possui uma extensão C-terminal de 5-7 aminoácidos. Esta extensão C-
terminal é ligada ao corpo da proteína pela ponte dissulfeto 51-133 (ARNI &
WARD, 1996; OHNO et al, 2004).
Três regiões na estrutura das PLA2 das classes I e II possuem um alto grau
de homologia em suas seqüência. Estas regiões contribuem para a formação de
estruturas secundárias e terciárias altamente conservadas incluindo a hélice N-
terminal, �loop� ligante de cálcio (-W/YCGxG-) nas regiões 28-32, regiões do sítio
ativo nas regiões 44-51 junto com os aminoácidos que formam o canal hidrofóbico
que liga as cadeias de fosfolipídeos (ARNI & WARD, 1996).
A conformação catalítica da PLA2 é estabilizada pelo íon cálcio ligado no
resíduo de aspartato na posição 49 (Asp49) no loop ligante de cálcio, (VERHEIJ
et al, 1980). A substituição por outros íons divalentes como o bário ou cádmio
resulta em uma redução significante da atividade (YUAN et al, 1993). O ión cálcio
é coordenado por dois átomos de oxigênio do grupo carboxila no resíduo de
Asp49 e três átomos de oxigênio na cadeia principal, duas moléculas de água
completam a esfera de coordenação com íon cálcio formando uma bipirâmide
pentagonal. A ponte dissulfeto (Cys27-Cys44) assegura a correta orientação do
�loop� ligante de cálcio em relação aos aminoácidos que formam a rede catalítica.
Resíduos de glicina dão a esta região uma flexibilidade e a conformação
necessária, permitindo que os três átomos de oxigênio da cadeia carbonila
contribuam para a estabilização da ligação do íon cálcio (ARNI & WARD, 1996).
O resíduo de Asp49 é essencial para a ligação do íon cálcio, a substituição
conservativa Asp→Glu49 reduz a afinidade pelo cálcio em 12 vezes levando a
uma perda da atividade catalítica (ARNI & WARD, 1996). Naturalmente ocorrem
PLA2s homólogas cujo resíduo de Asp49 é substituído pelo de lisina (Lys49),
serina ou alanina e portanto estas enzimas são cataliticamente inativas; porém,
elas retêm sua atividade citolítica (HOMSI-BRANDEBURGO et al, 1988;
LOMONTE et al, 1993) por meio de um processo independente de cálcio.
Estruturas em cristal da PLA2s Lys49 revelam que o grupo ε-amino das Lys49
está localizado na posição normalmente ocupada pelo íon cálcio nas PLA2 Asp49
(ARNI & WARD, 1996; WARD et al, 2001). Esta substituição no �loop� ligante de
7
cálcio torna as PLA2-Lys49 incapazes de se ligar ao cálcio, levando a uma
inabilidade da proteína de estabilizar o intermediário tetraédico no mecanismo
catalítico (ANDRIÃO-ESCARSO et al, 2000).
As PLA2s utilizam em seu sítio catalítico o resíduo de histidina (His48)
assistido por Asp49 para polarizar uma ligação com a água, o qual ataca o grupo
carbonila do fosfolipídeo.
As PLA2 são as únicas enzimas hidrolíticas que são altamente solúveis em
água mas hidrolisam substratos fosfolipídeos Estas enzimas agem com maior
eficiência quando seu substrato (fosfoglicerídeos) é parte de uma interface como
uma micela ou membranas (OWNBY, et al, 1999; KINI, 2003).
Outras atividades tóxicas que podem ser independentes de sua atividade
catalítica primária também estão associadas às PLA2s de peçonhas de serpentes:
hemolitica (KIHARA et al, 1992), miotóxica (GUTIÉRREZ & LOMONTE, 1995),
edematogênica (LLORET & MORENO, 1993), agregante plaquetária (YUAN et al,
1993), hemolítica indireta (CONDREA et al, 1981), hipotensiva (HUANG, 1984),
cardiotóxica (FLETCHER et al, 1981) e anticoagulante (ALVARADO et al, 1988).
A necrose muscular pode ser devida a uma ação direta de PLA2s
miotóxicas sobre a membrana plasmática das células musculares, ou indireta,
como por conseqüência de degenerações vasculares e isquêmicas, causadas por
hemorraginas.
A análise da composição de aminoácidos indica que as PLA2s miotóxicas
são ricas em aminoácidos básicos e hidrofóbicos (HOMSI-BRANDEBURGO et al,
1988; LOMONTE et al, 1987).
As PLA2s miotóxicas afetam principalmente membranas plasmáticas de
músculo esquelético (LOMONTE et al, 1999). As PLA2s Asp49 e Lys49 lisam
rapidamente o sarcolema, causando necrose total, lesões em delta, inchaço
mitocondrial e hipercontração de sarcomeros (MEBS & OWNBY, 1990). Nos
casos das Asp49, cataliticamente ativas, esta desorganização da membrana é
potencializada pela degradação enzimática de fosfolipídeos.
Um modelo hipotético foi proposto para o entendimento do mecanismo de
ação das miotoxinas Lys49 (GUTIÉRREZ & LOMONTE, 1995): 1. ligação da miotoxina em um sítio não identificado localizado na
membrana sarcoplasmática;
8
2. interação eletrostática entre o sítio catiônico da toxina com grupos
carregados negativamente na membrana;
3. penetração da miotoxina na bicamada por uma interação hidrofóbica
mediada pela região citotóxica da molécula;
4. penetração da região citotóxica no centro da bicamada (o efeito seria a
desorganização e ruptura da membrana, com conseqüente prejuízo na
regulação da permeabilidade seletiva) e
5. grande influxo de íons cálcio e início de uma variedade de mecanismos
degenerativos.
As miotoxinas isoladas da peçonha Bothrops jararacussu são
Bothropstoxina I e Bothropstoxina II (HOMSI-BRANDEBURGO et al, 1988).
Bothropstoxina I (BthTX-I) é uma fosfolipase Lys49 de caráter básico com
massa molecular de 13,7kDa e 121 resíduos de aminoácidos (WARD et al, 2001)
e possui vários efeitos biológicos, incluindo mionecrose, edema de pata em
camundongos, bloqueio neuromuscular irreversível e lise de células em cultura
(SOARES et al, 2002).
11..22.. GGêênneerroo CCrroottaalluuss-- CCoonnssttiittuuiiççããoo ddaa ppeeççoonnhhaa ccrroottáálliiccaa
A peçonha crotálica atua principalmente na parte central do sistema neural
(neurotóxica), a vítima apresenta pouca dor ou nenhum sintoma no local da
picada, fácies miastêmica caracterizada por ptose palpebral, diplopia, anisocoria e
visão turva. O sangue da vítima apresenta dificuldade de coagulação. A atividade
miotóxica também existe, aparecendo mioglobulina na urina da vítima, podendo
ocorrer falência renal aguda com possíveis danos no coração e fígado
(BARRAVIEIRA et al, 1995; MONTEIRO et al, 2001).
A peçonha crotálica é composta essencialmente por quatro toxinas
principais (crotoxina, crotamina, giroxina, convulxina) e vários peptídeos
(BARRAVIEIRA et al, 1995). A convulxina é um componente que induz
convulsões (PRADO-FRANCHECHII et al, 1970) e a giroxina possui atividade
similar à trombina (BARRIO et al, 1961).
Crotoxina é uma B-neurotoxina pré-sináptica presente nas peçonhas das
cascavéis da América do Sul (LENON & KAISER, 1990). A crotoxina exerce seu
9
efeito patofisiológico bloqueando a transmissão neuromuscular. Ela age
primeiramente em nível pré-sináptico alterando a liberação do neurotransmissor
(FAURE & BON, 1987), entretanto, esta enzima também é capaz de agir pós-
sinapticamente estabilizando o receptor de acetilcolina em um estado inativo
(BON et al, 1979).
A crotoxina é um heterodímero composto de subunidades ligadas não-
covalentemente: componente B (crotactina), uma proteína básica, de ~14,5 kDa,
com atividade PLA2, e o componente A (crotapotina), uma proteína ácida de ~9,5
kDa. O componente B é uma PLA2 formada por cadeia única de 122 resíduos de
aminoácidos e apresenta sete ligações de dissulfeto intracadeia (AIRD et al,
1986). O componente A é formado por três cadeias polipeptídicas ligadas por sete
pontes dissulfeto (AIRD et al, 1986).
Os dois componentes se complexam e a associação espontaneamente
inibe a atividade PLA2 da crotactina mas aumenta a toxicidade em pelo menos
uma ordem de magnitude. A crotactina apresenta moderada toxicidade enquanto
a crotapotina é destituída de toxicidade e atividade enzimática. A adição da
crotapotina aparentemente aumenta a toxicidade da crotactina. A dissociação das
subunidades é reversível, e é proposto que a crotapotina funcione como uma
molécula chaperonina, impedindo ligações não específicas na crotactina
(CHANG, 1981) .
A crotamina é um peptídeo de caráter básico miotóxico, neurotóxico e não
enzimático composto de cerca da 42 resíduos de aminoácidos com peso
molecular de 4.880. (MANCIN et al, 1998). Esta toxina induz a despolarização de
membrana das células musculares, ativa os canais de sódio principalmente de
fibras musculares esqueléticas (CUPO et al, 1990).
A mionecrose ativada pela crotamina difere da relatada para as PLA2s
miotóxicas e outros peptídeos citotóxicos (MEBS & OWNBY, 1990). Após as 12
primeiras horas da administração in vivo da crotamina, quase não ocorre
mudança na morfologia do músculo esquelético, exceto pela dilatação do retículo
sarcoplasmático. Após 48 horas, a mitocôndria torna-se inchada e a miofibrilas
sofrem degeneração sem que o sarcolema e os túbulos-T sejam afetados.
Embora não exista alteração morfológica no sarcolema detectáveis por
microscopia eletrônica, esta toxina ainda pode causar alterações na função de
10
proteínas do sarcolema, como a ativação do canal de sódio (LOMONTE et al,
1999; FLETCHER et al, 1996).
22.. DDeeffiinniiççããoo ee ccaarraacctteerrííssttiiccaass ddaass nneeooppllaassiiaass
Neoplasia é uma proliferação celular autônoma, geralmente acompanhada
de perda da diferenciação, caracterizada por ser uma massa anormal de tecido
cujo crescimento e divisão se mostra desordenado, quando comparado ao dos
tecidos normais, e persiste da mesma maneira excessiva, mesmo depois de
cessado o estímulo que provocou todas as mudanças (AMORIM, 1964;
BRASILEIRO-FILHO, 2004). As neoplasias são formadas por células que apresentam certas
propriedades particulares que as distinguem das células normais. As principais
características de uma célula cancerosa são a possibilidade de um número,
teoricamente ilimitado de divisões e a perda da inibição de sua multiplicação
quando entram em contato com outra célula (inibição de contato); isto é, quando
as células atingem um estado de confluência (as membranas plasmáticas se
tocam). Células neoplásicas continuam se multiplicando e passam a formar pilhas
de células superpostas (ÉTIENNE, 2003; BRASILEIRO-FILHO, 2004). As células cancerígenas têm menor adesão entre si devido aos seguintes
mecanismos (ETIENNE, 2003; BRASILEIRO-FILHO, 2004): 1. modificações e irregularidades na membrana plasmática;
2. diminuição de estruturas juncionais;
3. redução de moléculas de adesão e
4. liberação de enzimas proteolíticas que alteram o glicocálice.
A destruição da matriz extracelular é indispensável para permitir o
deslocamento das células neoplásicas, além de representar o principal
mecanismo da capacidade invasiva destas células (FULOP & LARBI, 2002).
As células tumorais expressam metaloproteases de matriz extracelular, as
principais são a metaloprotease 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9). Estas enzimas
degradam o colágeno do tipo IV, o principal componente da membrana basal. A
MMP-2 (gelatinase A) é a mais amplamente distribuída das MMPs e é expressa
constitutivante pela maioria das células. A MMP-9 (gelatinase B) é produzida por
11
células inflamatórias, incluindo neutrófilos e macrófagos teciduais (POLETTEM et
al, 1998; FODA et al, 2001).
A atividade incontrolada das metaloproteases promove a progressão do
tumor de modo direto catalisando a degradação da matriz extracelular ou
indiretamente, pela liberação de fatores de crescimento ligados à matriz (FODA et
al, 2001).
A superexpressão de metaloproteases é relacionada com carcinomas
humanos, como os de estômago, pulmão , próstata e mama (HERNANDEZ-
BARRANTES et al, 2002).
Uma característica das células cancerígenas é a habilidade de sofrer uma
extensiva proliferação por meio da superprodução de fatores de crescimento e/ou
superexpressão de receptores para estes fatores de crescimento (ADAM et al,
2003).
Os tumores necessitam de oxigênio e nutrientes, que são providos por
novos vasos sanguíneos que permeiam a massa tumoral. As células tumorais
ativam a angiogênese pela secreção de fatores de crescimento e expressão de
receptores (ADAM et al, 2003; SIEMANN et al, 2004).
Além das células neoplásicas, os tumores têm células estromais as quais
fornecem um arcabouço para sustentação e nutrição das mesmas. Quanto mais
rápido o crescimento tumoral, menor é a quantidade de estroma e mais comum a
presença de necrose devido à nutrição deficiente das células em proliferação.
22..11-- CCllaassssiiffiiccaaççããoo ddaass nneeooppllaassiiaass
O termo câncer é a tradução latina da palavra grega carcinoma (de
karinos= crustáceo, caranguejo). Foi usado pela primeira vez por Galeno
(aproximadamente 138-201 d.C.) para indicar um tumor maligno da mama no qual
as veias superficiais deste órgão eram túrgidas e ramificadas, lembrando as patas
de um caranguejo. O termo generalizou-se e hoje é usado para indicar qualquer
neoplasia maligna (AMORIM, 1964; BRASILEIRO-FILHO, 2004).
Existem praticamente 800 tipos de neoplasias que são classificados de
acordo com três critérios: 1) pelo comportamento clínico (benigno ou maligno); 2)
12
pelo aspecto microscópico (histomorfológico) e 3) pela origem da neoplasia
(histogênico).
O critério mais utilizado é o histomorfológico, no qual a neoplasia é
identificada pelo tecido ou célula que está se proliferando (AMORIM, 1964;
BRASILEIRO-FILHO, 2004). A denominação é feita utilizando o sufixo �-oma�, que
designa qualquer neoplasia; a palavra carcinoma indica tumor maligno que
reproduz epitélio de revestimento; e o termo sarcoma indica tumor maligno
mesenquimal (BRASILEIRO-FILHO, 2004).
As neoplasias benignas muitas vezes não representam grande problema
para seus portadores, porém alguns efeitos lesivos podem ocorrer: obstrução de
órgãos ou estruturas ocas, compressão de órgãos podendo causar isquemias e
morte do tecido (BRASILEIRO-FILHO, 2004).
Em geral as neoplasias benignas apresentam baixa taxa de crescimento,
tipo de crescimento expansivo e limites bem definidos (BRASILEIRO-FILHO,
2004).
Em contraste, as malignas em geral, têm crescimento rápido e infiltrativo,
não se observa limite do tumor e muitas vezes provocam perturbações
homeostáticas graves que acabam levando o paciente à morte (BRASILEIRO-
FILHO, 2004).
22..22.. CCaauussaass ddoo ccâânncceerr
O câncer pode estar ligado a múltiplas causas: pode ter relação com
desequilíbrios hormonais (alguns cânceres de mama); estar ligado ao ambiente,
como nas radiações emitidas pelo sol (nos cânceres da pele), a radiações
radiativas (nos cânceres do sangue); ao tabaco (no câncer do pulmão); a certas
gorduras ou alguns produtos químicos utilizados como aditivos alimentares (nos
cânceres do cólon), etc (ÉTIENNE, 2003).
Somente alguns tipos de câncer, que representam uma pequena
percentagem de câncer humano, estão ligados a vírus. Trata-se então de vírus
com DNA, como por exemplo, o vírus da hepatite B no câncer primitivo do fígado,
o câncer de Epstein-Bairr no linfoma de Burkitt e nos tumores da rinofaringe, ou
ainda papilomavírus em alguns tipos de câncer cutâneo e genital. Entre os vírus
13
com RNA, só na família dos retrovírus que foram identificados dois vírus
humanos, o vírus HTLV-1 e II (Human T lymphocytotropic viruses), associados ao
desenvolvimento de leucemias e de linfomas (ÉTIENNE, 2003; BRASILEIRO-
FILHO, 2004).
As alterações genéticas responsáveis pelo aparecimento de uma neoplasia
podem ser devido à aquisição de oncogenes ou à perda de genes funcionais que
protegem a célula de uma divisão descontrolada (supressores de tumor)
(ÉTIENNE, 2003; BRASILEIRO-FILHO, 2004).
Oncogenes são genes mutantes que codificam proteínas importantes para
o crescimento e diferenciação celular. Podem ser introduzidos em um hospedeiro
por infecção viral, ou podem aparecer pela mutação de um gene normal que
controla a divisão celular. Os oncogenes ativam vias de sinalização levando a
uma formação inapropriada de fatores de transcrição e/ou receptores anormais
para fatores de crescimento. Os genes supressores de tumor codificam proteínas
que impedem uma divisão celular descontrolada por reprimir alguns oncogenes
(ÉTIENNE, 2003; MAREK et al, 2003).
22..33.. IImmuunniiddaaddee ppaarraa oo ttuummoorr
O sistema imunológico do hospedeiro age por meio das respostas humoral
e celular para eliminar células tumorais. Para tumores sólidos a reação mediada
por células é mais eficiente do que a humoral. No entanto, esta também coopera
com a resposta celular e parece que o efeito final depende da ação conjunta de
ambas (ABBAS et al, 2000).
Os macrófagos são as células mais eficientes na destruição de células
tumorais, eles lisam as células por meio da produção de TNFα, radicais livres do
oxigênio ou por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ABBAS et al,
2000).
As células NK (natural killer) constituem importante mecanismo de defesa
do organismo, pois são capazes de reconhecer e destruir células neoplásicas por
meio de lise direta ou dependente de anticorpos (ABBAS et al, 2000).
A resposta imune freqüentemente falha em impedir crescimento do tumor
pois as células tumorais são derivadas de células hospedeiras e, portanto,
14
assemelham-se com células normais em muitos aspectos, isto é, a maioria dos
tumores expressa somente poucos antígenos que podem ser reconhecidos como
não-próprios, e como resultado, a maioria tende a ser fracamente imunogênico.
(ADAM et al, 2003). O rápido crescimento e espalhamento do tumor podem
sobrecarregar a capacidade do sistema imune de erradicar o tumor. Muitos
tumores possuem mecanismos especializados de evasão da resposta imune.
22..44.. AAnnttiinneeoopplláássiiccooss
A maioria dos medicamentos antineoplásicos inibe as mitoses, interfere
com o metabolismo dos ácidos nucléicos ou promove distúrbios específicos de
processos bioquímicos, como inibição de certas reações enzimáticas (ZANINI &
OGA,1994).
Pelo seu modo de ação, os quimioterápicos utilizados na terapêutica
antineoplásica podem ser classificados em: (1) agentes alquilantes, (2)
antimetabólitos, (3) medicamentos obtidos por produção natural, como antibióticos
ou alcalóides e (4) hormônios (ZANINI & OGA,1994; ÉTIENNE, 2003).
A característica dos agentes alquilantes é a liberação de radicais alquila,
após metabolização. Geralmente apresentam dois ou mais grupos terminais
cíclicos ou insaturados, ou são convertidos nestas formas em meio aquoso. Em
face disto, esses grupos são capazes de se ligarem a outras moléculas
indispensáveis à economia celular, podendo fazer ligações cruzadas com o DNA
e bloqueando a divisão celular (ZANINI & OGA,1994; ÉTIENNE, 2003).
Os antimetabólitos são análogos estruturais de substâncias em ocorrência
vital para o seu metabolismo. Deste modo, eles interferem com a biossíntese das
purinas e pirimidinas, inibindo a produção de precursores normais. Privam,
portanto, a célula neoplásica de substratos ou cofatores fundamentais
necessários para a síntese do DNA ou, mesmo, são incorporados como falsos
precursores. Em geral os agentes antimetabólitos atuam na célula que se
encontra no período S do ciclo celular. As principais substâncias deste grupo são
representadas por análogos do ácido fólico, pirimidinas ou purinas (ZANINI &
OGA,1994; ÉTIENNE, 2003).
15
Infelizmente esses medicamentos não são seletivos para as células
cancerosas e agem sobre todas as células. Eles podem bloquear a replicação de
células como as da medula óssea que sintetizam os precursores dos glóbulos
brancos e vermelhos, provocando assim uma grave diminuição desses elementos
sanguíneos (ZANINI & OGA,1994).
As resistências que se desenvolvem aos medicamentos anticancerígenos
podem dever-se à amplificação de um gene chamado mdr (multi drug resistance),
esse gene codifica uma proteína membranária (gp 170), que expulsa para fora da
célula as moléculas antitumorais administradas (ÉTIENNE, 2003).
Muitas substâncias oriundas de plantas e microorganismos possuem
atividade antineoplásica. Do grande esforço dispendido em testes farmacológicos
em tumores experimentais, resultaram alguns citostáticos extraídos de plantas
(vincristina, vimblastina), alguns antibióticos e enzimas (1-asparaginase) com
ação útil no homem (ZANINI & OGA,1994; DAS, 2002; ÉTIENNE, 2003).
Os alcalóides da vinca, Catharantus roseus, a vincristina e vimblastina,
ligam-se a proteínas componentes dos microtúbulos celulares. Isto interfere com a
formação do fuso cromático, o que leva à paralisação da divisão na metáfase
mitótica (ZANINI & OGA,1994; ÉTIENNE, 2003).
Outros tipos de procedimentos terapêuticos, como a radioterapia, a cirurgia
e o homotransplante de medula têm permitido notáveis resultados. O conjunto de
tratamentos disponíveis aumentou, em muito, a sobrevida de pacientes com
neoplasias malignas, especialmente no controle de neoplasias hematológicas e
linfóides, sendo admitidos em diversos casos na cura de coriocarcinoma, tumor
de Wilms e doença de Hodgkin (ÉTIENNE, 2003).
A imunoterapia das neoplasias, embora ainda incipiente, tem apresentado
resultados animadores, dando suporte a diversos pesquisadores que acreditam
que o estado neoplásico inibe as respostas imunológicas do indivíduo, o que
facilitaria a disseminação da doença. Os vários métodos imunológicos atualmente
utilizados consistem em: (a) imunização ativa com células ou extratos celulares de
tumores, cujas células são susceptíveis à terapia por radiação ou neuroamidase;
(b) transferência da imunidade por meio de linfócitos ou extratos linfocitários de
doadores; (c) transferência de anticorpos citotóxico específico e (d) tratamento
16
com agentes que estimulam a reatividade imunológica geral, como o interferon,
ou que interferem com ela, como o levamitol (ZANINI & OGA,1994).
O interesse de testar peçonhas de serpentes como agentes antitumorais é
relatado desde o início do século passado, quando Calmette et al (1933)
demonstraram a atividade antitumoral da peçonha de Naja sp em células de
adenocarcinomas. Desde então muitos trabalhos têm sido desenvolvidos com
este propósito (COTTE et al, 1972; CARVALHO et al, 2001).
As peçonhas atuam por diferentes mecanismos capazes de afetar o
desenvolvimento do tumor, elas podem agir diretamente, por meio de uma ação
lítica ou indiretamente destruindo o microambiente produzido pelo tumor ou ainda,
pela indução da liberação de mediadores da resposta inflamatória, que
compensam a falta de uma resposta induzida pelo tumor (LOMONTE et al, 1993).
Assim, o estudo das atividades antineoplásicas de algumas toxinas
isoladas das serpentes brasileiras, poderá fornecer novas informações para
subsidiar as investigações a respeito de mecanismos envolvidos no
desenvolvimento de processoss tumorais, bem com no controle e/ou erradicação
de células neoplásicas.
17
OOBBJJEETTIIVVOOSS
18
OBJETIVOS GERAIS
Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade citotóxica in vitro da
Bothropstoxina-I (BthTX-I) e da Crotamina frente a diversas linhagens celulares,
bem como avaliar a atividade antitumoral da BthTX-I contra o desenvolvimento do
tumor sólido do Sarcoma 180 implantado em camundongos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a atividade citotóxica in vitro da BthTX-I em células tumorais (SK-
BR-3; Jurkat; B16F10 e S180), macrófagos peritoneais e linhagens de
bactérias (Escherichia coli e Staphilococus aureus);
2. Avaliação do efeito das modificações químicas dos resíduos de
aminoácidos (histidina, triptofano e tirosina) sobre a atividade citototóxica in
vitro da BthTX-I;
3. Avaliar a atividade citotóxica da crotamina in vitro em Sarcoma 180 e
macrófagos peritoneais;
4. Avaliar o efeito antitumoral da BthTX-I em camundongos implantados com
tumor sólido (S180);
5. Analisar o efeito da modificação química do resíduo de aminoácido
(histidina) sobre o efeito antitumoral da BthTX-I em camundongos
implantados com tumor sólido (S180).
19
RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS
BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAASS
20
ABBAS, A. K. LICHTMAN, A. H. AND POBER, J. S. Cellular and Molecular Immunology. 4ed. 2000, 553p.
ADAM, J. K.; ODHAV, B.; BHOOLA, K. D. Immune response in cancer.
Pharmacol. & Ther., 99:113-32, 2003.
AIRD, S. D.; KAISER, R. V.; LEWIS, W. G. et al. A complete amino acid sequence
for the basic subunit of crotoxin. Arch. of Biochem. and Biophys., 249: 296-300,
1986.
ALVARADO, J. AND GUTIÉRREZ, J. M. Anticoagulant effect of myotoxic
phospholipase A2 isolated from the venom of the snake Bothrops asper
(Viperidade). Rev. Biol. Trop., 36:563-5, 1988.
AMARAL, C. F. S.; DA SILVA, A. A.; GODOY, P. et al. Renal cortical necrosis
following Bothrops jararaca and B. jararacussu snake bite. Toxicon, 23: 877-85,
1985.
AMORIM, M. F. Patologia dos tumores (Princípios Fundamentais de Cancerologia) São Paulo-SP, Fundo Editorial Procienx,1964, 370p.
ANDRIÃO-ESCARSO, S. H.; SOARES, A. M.; RODRIGUES, V. M.et al. Myotoxic
phospholipase A2 in Bothrops snake venom: Effect of chemical modifications on
the enzymatic and pharmacological properties of bothropstoxins from Bothrops
jararacussu, Biochimie, 82: 755-63, 2000.
21
ARNI, R. K. AND WARD, R, J. Phospholipases A2- A structural review. Toxicon,
34: 827-41, 1996.
BARIO, A. Gyroxin a new neurotoxin of Crotalus durissus terrificus venom. Acta. Physiol. Latinoam. 11: 221, 1961.
BARRAVIEIRA, B. Venenos animais: Uma visão integrada. Rio de Janeiro:
Editora de Publicações Científicas LTDA, 1995. 411p.
BASU, J.; MAJUNDARR, G.; DUTTA, A. et al. Acute renal failure following snake
bite (viper). J. Ass. Phys. India, 25: 883-92, 1977.
BJNARSON, J. W. AND FOX, J. W. Hemorragic toxins from snake venoms.
Pharmacol. Ther., 62: 325-72, 1994.
BOM, C.; CHANGEAUX, J. P.; JENG, T. W. et al. Post-synaptic effects of crotoxin
and its isolated subunits. Eur. J. Biochem., 99: 471-81, 1979.
BOSCH, H. V. Intracelular phospholipases A. Biochem. Biophys. Acta, 604: 191-
246, 1980.
BRASILEIRO-FILHO, G. . Bogliolo Patologia Geral, Geraldo Brasileiro Filho, 3°
ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro-RJ, 2004, 367p.
CALMETTE, A.; SAENZ, A.; COSTIL, L. Effects du venim de cobra sur les greffes
cancereuses et le cancer spontane (adeno-carcinome) de la souris. Acad. Sci.,
197: 205-17, 1933.
CARVALHO, D. D.; SCHMITMEIER, S.; NOVELLO et al Effect of BJccL (a lectin
from the venom of snake Bothrops jararacussu) on adhesion and tumor and
endothelial cells. Toxicon, 39: 1471-6, 2001.
22
CHANG, C. AND SU, M. J. A study of the interaction of crotapotin with crotoxin
phospholipase A2, notexin and others presymnaptic neurotoxins. Br. J. Pharmacol., 73: 495-503, 1981.
CHIPPAUX, J. P.; WILLIAMS, V. AND WHITE, J. Snake venom variability:
methods of study, results and interpretation. Toxicon, 29(11): 1279- 303, 1991.
CONDREA, E.; YANG, C. C. AND ROSEMBERG, P. Lack correlation between the
anticoagulant activity and phospholipase hydrolysis snake venom phospholipase
A2. Thromb. Hemostasis, 45; 82-9, 1981.
COTTE, C. A. ESSENFELD-YAHIR, E. AND LAIRET, C. Effect of Crotalus and
Bothrops venom on normal and malignant cells cultivated in vitro. Toxicon, 10:
157-61, 1972.
CUPO, P.; AZEVEDO-MARQUES, M. M. AND HERING, S. E. Acute myocardial
infarctio-like enzyme profile in human victims of Crotalus durissus terrificus
envenoming. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 84: 447-51, 1990.
DAS, S. Garlic- A natural source of cancer preventive compounds. A. P. J. C. P.,
3:305-11, 2002.
DENIZOT, Y.; DULERY, C.; DESPLAT, V. et al Incorporation and effect of
arachidonic acid on the growth of the human K562 cell line. Cancer Letters, 139:
75-8, 1999.
DENNIS, E. A. Diversity of group types, regulation, and function of phospholipase
A2. J. Biol. Chem., 269: 13057-60, 1994.
DENNIS, E. A. The growing phospholipase A2 superfamily of signal transduction
enzymes. TiBS, 22:1-2, 1997.
23
DESSEN, A. Structure and mechanism of human cytosolic phospholipase A2.
Biochim. Biophys. Acta, 1488: 40-7, 2000.
ÉTIENNE, J. Bioquímica Genética e Biologia Molecular, 5º ed, Santos Livraria
Editora, São Paulo-SP. 2003, 504p.
FAN, C. Y.; QIAN, Y. C.; YANG, S. L.; et al. Cloning, sequence analysis and
expression in E. coli of the cDNA of Thrombim-like enzyme (Pallabin) from the
venom of Agkistrodon halys pallas. Biochem. Mol. Biol. Int., 47: 217-25, 1999.
FAURE, G. AND BON, C. Several isoforms of crotoxin are present in individual
venoms from the south American rattlesnake Crotalus durissus terrificus .
Toxicon, 25: 229-34, 1987.
FLETCHER, J. E.; HUBERT, M.; WIELAND, S. J.;et al. Similarities and differences
in mechanisms of cardiotoxins, melittin and other myotoxins. Toxicon, 34(11/12):
1301-11, 1996.
FLETCHER, J. E.; RAPUANO, B. E.; CONDREA, E.; et al. relationship between
catalysis and toxicological properties of three phospholipase A2 from elapid snake
venom. Toxic. Appl. Pharmac., 59; 375-82, 1981.
FODA, H. D. AND ZUCKER, S. Matrix metalloproteinases in cancer invasion,
metastasis and angiogenesis. Drug Discovery Today, 6: (9): 478-82, 2001.
FULOP, T. AND LARBI, A. Putative role of 67 kDa elastin-laminin receptor in
tumor invasion. Sem. Cancer Biol.. 12; 219-29, 2002.
GUTIÉRREZ, J. M. AND LOMONTE, B. Phospholipase A2 myotoxins from
Bothrops snake venoms. Toxicon, 33:1405-24, 1995.
GUTIERREZ, J. M. AND RUCAVADO, A. Snake venom metalloproteinases: Theis
role the pathogenesis of local tissue damage. Biochimie, 82: 841-50, 2000.
24
HERNARDEZ-BARRANTES, S.; BERNARDO, M.; TOTH, M. et al. Regulation of
membrane type metalloproteinases. Sem. Cancer Biol., 22: 131-8, 2002.
HOMSI-BRANDEBURGO, M.I.; QUEIROZ, L. S.; SANTOS-NETO, H.et al.
Fractionation of Bothrops jararacussu snake venom: partial chemical
characterization and biologicala ctivity of bothropstoxin. Toxicon, 26: 615-27,
1988.
HUANG, H. C. Realese of slow reacting substance from the guinea-pig lung by
phospholipase A2 of Viperidae russelli snake venom. Toxicon, 22:359-65, 1984.
HUANG, R. C.; HUNG. C. C.; AND CHIOU. S. H. Characterization of three
fibrinogenolitic proteases isolated from the venom of Taiwan habu (Trimeresurus
mucrosquamatus). Biochem. Mol. Biol. Int., 31:1041-50, 1993.
KAMIGUTI, A. S.; ZUZEL, M. AND THEAKSTON, R. G. D. Snake venoms
metalloproteases and disintegrins: interactions with cells. Braz. J. Med. Biol. Res., 31: 853-62, 1998.
KIHARA, H.; UCHIKAWA, R.; HATTORI, R. et al. Myotoxic and physiological
effects of three Trimeresurus flavoviridis phospholipase A2. Biochem. Int., 28:895-
903, 1992.
KINI, R. M. Excitement ahead: structure, function and mechanism of snake venom
phospholipase A2 enzymes. Toxicon, 42:827-40, 2003.
KUDO, I.; MURAKAMI, M.; HARA, S.; et al. Mammalian non-pancreatic
phospholipase A2. Biochem. Biophys. Acta, 117: 217-31, 1993.
LLORET, S. AND MORENO, J. J. Oedema formation and degranulation of mast
cells by phospholipase A2 purified from porcine pancreas and snake venoms.
Toxicon, 31: 949-56, 1993.
25
LOMONTE, B.; ANGULO, Y,. RUFINI, S. et al. Comparative study of the cytolytic
activity of myotoxic phospholipase A2 on mouse endothelial (tEnd) and skeletal
muscle (C2C12) cells in vitro. Toxicon, 37:145-58, 1999.
LOMONTE, B.; MORENO, E. AND GUTIÉRREZ, J. M. Detection of proteins
antigenically related to Bothrops asper myotoxin in crotaline snake venoms.
Toxicon, 25(9): 947-55, 1987.
LOMONTE, B; TARKOWSKI, A. AND HANSON, L. A. Host response to Bothrops
asper snake venom. Analysis of edema formation, inflammatory cells and
cytokines release in a mouse model. Inflammation, 17: 93-105, 1993.
MANCIN, A. C.; SOARES, A. M.; ANDRIÃO-ESCARSO, S. H.;et al. The analgesic
activity of crotamine, a neurotoxin from Crotalus durissus terrificus (South merican
rattlesnake) venom: a biochemical and pharmacological study. Toxicon, 36(12):
1927-37, 1998.
MARAGANORE, J. M.; MERUTKA, G.; CHO, W. et al. A group of phospholipases
A2 with lysine instead of aspartat 49. J. Biol. Chem., 259: 13839-43, 1984.
MAREK J.; WITOLD L.; JAKUB G.A. Natural mechanisms protecting against cancer. Immunol. Letters, 90: 103�122, 2003.
MARKLAND, F. S. Snake venoms and the hemostatic system. Toxicon, 36: 1749-
800, 1998.
MEBS, D. AND OWNBY, C. L. Myotoxic components of snake venoms: their
biochemical and biological activities. Pharm. Ther., 48: 223-36, 1990.
MOLLIER, P.; CHWETZOFF, S. AND MENEZ, A. A monoclonal antibody
recognizing a conserved epitope in a group of phospholipase A2. Mol. Immunol.,
27: 7-15, 1990.
26
MONTEIRO, H. S. A.; DA SILVA, I. M. S. C.; MARTINS, A. M. C. et al. Actions of
Crotalus durissus terrificus venom and crotoxin on the isolated rat kidney. Braz. J. Med. Biol. Res., 34(10): 1347-52, 2001.
MUKHERJEE, A. B.; MIELE, L. AND PATTABIRAMAN, N. Phospholipase A2
enzymes regulation and physiological role. Biochem. Pharmacol., 48: 1-10, 1994.
OGILVIE, M. L. AND GARTNER, T. K. Identification of lectins in snake venoms. J. Herpet., 18: 285-90, 1984.
OGILVIE, M. L.; BYL, J. A. W. AND GARTNER, T. K. Platelet-aggregation is
stimulated by lactose-inhibitable snake venom lectins. Thromb. Haemostasis, 62:
704-7, 1989.
OHNO, M.; CHIJIWA, T.; ODA-UEDA, N.; et al Molecular evolution of myotoxin
phospholipase A2 from snake venom. Toxicon, 42: 841-54, 2004.
OWNBY, C. L., SELISTRE-DE-ARAUJO, H. S.; WHITE, S. P. FLETCHER, J. E.
Lysine 49 phospholipase A2 proteins. Toxicon, 37: 411-45, 1999.
PETRESTSKI, J. H.; KANASHIRO, M.; SILVA, C. P.et al. Two related thrombin-
like enzymes present in Bothrops atrox venom. Braz. J. Med. Biol. Res, 33: 1293-
1300, 2000.
POLETTE, M. AND BIREMBAUT, P. Membrane-type metalloproteinases in tumor invasion. International J. Biochem. & Cell Biol., 30: 1195-1202, 1998
PRADO-FRANCHETI, J. Estudo sobre convulxina. Tese de Doutoramento.
UNICAMP. Campinas-SP, 1970.
RENETSEDER, R.; BRINIE, S.; DIJKSTRA, B. W.; et al. A comparison of the
crystal structural of phospholipase A2 from bovine pancreas and Crotalus atrox
venom. J. Biol. Chem., 260: 11627-34, 1985.
27
SCHIMIDT, M. E.; ABDELBAKI, Y, Z. AND TU, A. T. Nephotoxic action of
rattlesnake and sea snake venoms: an electron-microcopic study. J. Path., 118:
49-53, 1976.
SIEMANN, D. W. AND SHI, W. effecacy of combined antiangiogenic and vascular
disrupting agents in treatment of solid tumors. Int. J. Radiation Biol. Phys., 60:
1233-40, 2004.
DA SILVA, O. A.; LÓPEZ, M. AND GODOY, P. Intensive care unit treatment of
acute renal failure following snake bite. Am. J. Trop. Med. Hyg., 28:401-11, 1979.
SOARES, A. M.; OSHIMA-FRANCO, Y.; VIEIRA, C. A. et al. Mn2+ íons reduce the
enzimatic and pharmacological activities of bothropstoxin-I, a myotoxin Lys 49
phospholipase A2 homologue from Bothrops jararacussu snake venom. Intern. J. Biochem. & Cell Biol., 34:668-677.
VERHEIJ, H. M.; VOLWERK, J. J.; JANSEN, E. H. J. et al. Methylation of
histidine-48 in pancreatic phospholipase A2 role of histidine and calcium ion
catalytic mechanism. Biochemistry. 19: 743-50, 1980.
WARD, R. J.; de OLIVEIRA, A. H. C.; BORTOLETO, R. K.; et al. Refolding and
purification of Bothropstoxin-I, a Lys49-Phospholipase A2 homologue, expressed
as inclusion bodies in Escherichia coli. Prot. Expr. & Purification, 21: 134-140,
2001.
YUAN, Y.; JACKSOON, S. P.; MITCHEL, C. A. et al. Purification and
characterization of a snake venom phospholipase A2: a potent inhibitor of platelet
aggregation. Thromb. Res., 70:471-81, 1993.
ZANINI, C. A. AND OGA, S. Farmacologia Aplicada, 5° edi, Atheneu Editora São
Paulo, 1994, 739p.
28
CCAAPPIITTUULLOO ÚÚNNIICCOO
EEFFEEIITTOO CCIITTOOTTÓÓXXIICCOO EE
AANNTTIITTUUMMOORRAALL DDAA
BBOOTTHHRROOPPSSTTOOXXIINNAA--II EE DDAA
CCRROOTTAAMMIINNAA
29
RREESSUUMMOO
BthTX-I e Crotamina são miotoxinas não enzimáticas isoladas das peçonhas de
Bothrops jararacussu e Crotalus durissus terrificus respectivamente Os objetivos
deste trabalho foram avaliar a ação in vitro da BthTX-I nativa e modificada e da
crotamina sobre diversas linhagens celulares e na proliferação de bactérias gram
positiva e negativa; verificar o efeito da BthTX-I (nativa e modificada com BPB),
sobre crescimento do tumor induzido por S180 em camundongos. Os ensaios in
vitro mostraram que BthTX-I nativa ou modificada nos resíduos de Trp, Tyr ou His,
bem como crotamina incubadas separadamente em diferentes concentrações
com linhagens celulares, reduziu a viabilidade celular em um padrão dose
dependente. BthTX-I (1µg/µL) produziu 100% de morte em linhagem Jurkat, 90%
em macrófagos, S180 e B16F10, 45% em Sk-BR-3; enquanto BthTX-I BPB
(1µg/µL) mostrou 20-40% de citotoxicidade em todas as linhagens testadas; e na
mesma concentração as BthTX-I modificadas nos resíduos de Tyr e Trp,
mostraram citotoxicidade de 50-60% para S180 e 20-40% sobre macrófagos. A
crotamina (1µg/µL) apresentou citotoxicidade de 75% sobre S180 e 20% sobre
macrófagos. A atividade bactericida da BthTX-I (0,8 µg/µL) frente a E. coli e S.
aureus foi de aproximadamente 100%, enquanto que as modificações químicas
reduziram esta atividade Camundongos (n=5) inoculados com S180 (6X106
células, i.m.) na virilha desenvolveram um tumor sólido que se tornou evidente em
5 dias, apresentando alterações histopatológicas no músculo da coxa. BthTX-I e
30
BthTX-I BPB (50µg/µL, i.m.) administradas em camundongos no 5º dia após
inoculação i.m. de células S180 na virilha, reduziram o volume de tumor em 30%
no 14° dia e 80% no 60º dia, além de reduzir as alterações histopatológicas. Tais
resultados demonstram que BthTX-I e crotamina possuem atividade citótoxica
sobre linhagens celulares testadas in vitro e a atividade citotóxica de BthTX-I após
modificação por BPB foi atenuada, sugerindo que o resíduo de His tem um papel
importante na citotoxidade; a inibição do crescimento do tumor sólido em
camundongos tratados com BthTX-I ou BthTX-I BPB foram similares, sugerindo
que o mecanismo antitumoral da toxina possa ser independente da atividade
citotóxica.
Palavras chaves: BthTX-I, crotamina, citotoxicidade e células tumorais.
AABBSSTTRRAACCTT
BthTX-I and Crotamine are non enzymatic myotoxins isolated from Bothrops
jararacussu venom and Crotalus durissus terrificus respectively. The aims of this
work were to evaluate the action of BthTX-I (native or modified) and crotamine (in
vitro) on cells lines and on the bacterial proliferation; and the native and modified
BthTX-I on the growth of the tumor induced by the Sarcoma 180 (S180) in mice.
The in vitro assays showed that native and modified BthTX-I and crotamine
incubated separately in different concentrations with different cells lines, reduced
the cellular viability in a dose dependent manner. BthTX-I (1µg/µL) produces
100% cellular death on Jurkat, 90% in macrophages, S180 and B16F10, 45% in
Sk-BR-3; while BthTX-I BPB (1µg/µL) showed 20-40% of cytotoxicity on all of
cellular lines. BthTX -I modified in the Tyr and Trp residues, showed 50-60% of
cytotoxicity for S180 and 20-40% for macrophages. Crotamine (1µg/µL) showed of
75% on S180 and 20% on macrophages. The bactericidal activity of BthTX-I (0, 8
µg /µL) against E. coli and S. aureus was of approximately 100%, while the
chemical modification reduced this activity Mice (n=5) inoculated with S180 in the
groin (i.m.) developed a tumor developed a solid tumor that became evident after
5 days, presenting histological alterations. BthTX-I and BthTX-I BPB (50µg/µL,
i.m.) injection administered in mice on the 5th day after the inoculation of S180 cell
in the groin (i. m.) reduced the tumor volume in 30% in the 14th day and 80% in the
60th day, besides reducing the histological alterations. These results demonstrate
31
that BthTX-I and crotamine possess hight cytotoxic activity on the cellular lines
tested in vitro and the cytotoxicity of BthTX-I after the modification by BPB was
lower suggesting that the His residue has an important role in the cytotoxicity; the
inhibition of the growth of the solid tumor in mice treated with BthTX- I or BthTX-I
BPB were similar, suggesting that the mechanism antitumoral of the toxin can be
independent of the cytotoxicity activity.
Key word: BthTX-I, crotamine, cytotoxicity and tumor cells.
32
11.. IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO
O interesse de testar peçonhas de serpentes como agentes antitumorais é
relatado desde o início do século passado, quando Calmette et al (1933)
demonstrou a atividade antitumoral da peçonha de Naja sp em células de
adenocarcinomas. Desde então muitos trabalhos foram realizados com este
propósito (COTTE et al, 1972; CARVALHO et al, 2001).
As peçonhas possuem diferentes mecanismos que afetam o
desenvolvimento do tumor, elas podem agir diretamente, através de uma ação
lítica ou indiretamente destruindo o microambiente produzido pelo tumor ou pela
indução da liberação de mediadores da resposta inflamatória, que compensam a
falta de uma resposta induzida pelo tumor (LOMONTE et al, 1994).
Peçonhas de serpente inibem a adesão, migração e crescimento de células
tumorais e metástase (KNUDSEN et al, 1988).
Abu-Sinna et al (2003) demonstraram a inibição do tumor ascítico de
Ehrlich em camundongos, utilizando frações letais e não letais isoladas da
peçonha de Cerastes cerastes cerastes, resultando em um aumento no tempo de
sobrevivência e na diminuição da porcentagem de crescimento do tumor.
As peçonhas também induzem apoptose em tumores, Souza et al (1999)
demonstraram que a L-aminoácido oxidase isolada da peçonha de Agkistrondon
contortrix laticintus induz a apoptose de linhagens de leucemia promielocítica .
VRCTC-310-Onco é um novo produto farmacêutico desenvolvido como
agente anti-neoplásico, ele é composto de crotoxina de C. durissus terrificus e
cardiotoxima de Naja naja atra. Estudo in vitro e in vivo durante a avaliação pré-
clínica mostraram que VRCTC-310-Onco induz uma citotoxicidade em várias
linhagens tumorais humanas (STANCHI et al, 2002).
33
Carvalhho et al (2001), utilizando uma lectina isolada da peçonha de
Bothrops jararacussu inibiu a adesão e crescimento de células endoteliais e
tumorais.
Jararagina, uma metaloprotease isolada da peçonha de B. jararaca,
reduziu a migração e invasão de células tumorais in vivo e demonstrou alta
citotoxicidade in vitro (CORREA et al, 2002).
O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade citotóxica in vitro da
crotamina e da BthTX-I (nativa ou com modificações químicas) frente a células
tumorais e normais e avaliar a atividade antitumoral in vivo da BthTX-I (nativa ou
com modificação química) contra o tumor sólido implantado em camundongos.
Bothropstoxina I (BthTX-I) é uma fosfolipase Lys49 de caráter básico com
massa molecular de 13,7kDa e 121 resíduos de aminoácidos (WARD et al, 2001)
e possui vários efeitos biológicos, incluindo mionecrose, edema de pata em
camundongos, bloqueio neuromuscular irreversível (SOARES et al, 2003). Além
destes efeitos BthTX-I e capaz de lisar células quando testadas em cultura.
Soares et al (2000) demonstraram uma atividade de 100% de citotóxicidade em
células endoteliais (tEnd) e mioblastos (C2C12), devido a este fato escolhemos
BthTX-I para nosso modelo de estudo frente a linhagens de células tumorais in
vitro.
A crotamina é um peptídeo miotóxico e neurotóxico, não enzimático
composto de cerca de 42 resíduos de aminoácidos com peso molecular de 4.880,
de caráter básico (MANCIN et al, 1998). Esta toxina induz a despolarização de
membrana das células muscular e ativa os canais de sódio, principalmente de
fibras musculares esqueléticas (CUPO et al, 1990).
34
22.. MMAATTEERRIIAALL EE MMÉÉTTOODDOOSS
2.1. PEÇONHAS
As peçonhas de Bothrops jararacussu e Crotalus durissus durissus foram
obtidas na Penthapharm do Brasil mantidas a -20°C.
22.. 22.. TTOOXXIINNAASS
A Bothropstoxina-I (BthTX-I) (nativa e modificada quimicamente) e a
crotamina foram cedidas gentilmente pelo Prof. Dr. Andreimar Martins Soares da
UNAERP- Ribeirão Preto-SP.
Bothopstoxina-I foi purificada da peçonha de Bothrops jararacussu
conforme a metodologia descrita por Soares et al (1998).
A modificação química do resíduo de His-48 da BthTX-I foi feita com
brometo de p-bromofenacila (BPB) segundo método descrito por Díaz-Oreiro &
Gutiérrez (1997), com as seguintes modificações: cerca de 3 mg da BthTX-I foi
dissolvida em 1mL de bicarbonato de amônio 0,1M, pH 8,0, contendo EDTA
0,7mM, e incubados com 125µL de BPB (1,5mg/mL em etanol). Após incubação
por 24 horas, à temperatura ambiente, a solução protéica foi centrifugada a 7.000
rpm por 10 minutos para retirar o reagente precipitado, e o sobrenadante foi
lavado várias vezes, em sistema de ultrafiltração (AMICON) com membrana YM-3
e tampão bicarbonato de amônio 0,05M, pH8,0, até que a absorbância do
descarte estivesse semelhante à leitura do tampão (A280nm= 0,001). O controle da
35
toxina foi feito como descrito anteriormente, fazendo-se a incubação somente com
125 µL do etanol sem o reagente.
O reagente cloreto de o-nitrofenilsulfonila (NPSC) foi utilizado para
modificar resíduos de Trp, seguindo a metodologia descrita por Takasaki et al
(1990).
Para a realização da modificação química dos resíduos de tirosina da
BthTX-I, utilizou-se o reagente fluoreto de 2-nitrobenzenosulfenila (NBSF),
seguindo a metodologia descrita por Soons et al (1986).
Crotamina foi purificada da peçonha de Crotalus durissus terrificus
seguindo a metodologia descrita por Mancin et al (1998).
22..33.. AANNIIMMAAIISS
Os camundongos Swiss (25-30g) foram fornecidos pela Vallé; os
camundongos isogênicos da linhagem Balb/C (18-23g) foram adquiridos no
Biotério Central da USP (Ribeirão Preto, SP).
22..44.. QQUUAANNTTIIFFIICCAAÇÇÃÃOO DDEE PPRROOTTEEÍÍNNAASS
As dosagens de proteínas em soluções de 0,1 a 2,0 mg/2,0 mL de solução
foram realizadas pelo método de micro-biureto conforme descrito por Itzaki & Gill
(1964). A reta padrão foi construída utilizando a soroalbumina bovina como
proteína padrão, considerando-se o seu coeficiente de extinção molar em A280
nm (0,666).
22..55.. MMEEIIOO DDEE CCUULLTTUURRAA CCEELLUULLAARR PPAARRAA CCÉÉLLUULLAASS TTUUMMOORRAAIISS EE
MMAACCRRÓÓFFAAGGOOSS
Para a manutenção das linhagens de células tumorais e macrófagos,
seguiram-se o protocolo do ATCC (American Type Culture Collection), utilizando
meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 20mM de L-
glutamina, 7,5% de bicarbonato de sódio, 10 µg/mL de gentamicina, 100 mg/mL
de estreptomicina, 100 mM de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de
36
sódio e 50 mM de 2-mercaptoethanol (meio completo). Este meio foi preparado na
hora do uso e esterilizado por filtração em membranas de 0,22µm.
22..66.. LLIINNHHAAGGEEMM DDEE CCÉÉLLUULLAASS TTUUMMOORRAAIISS HHUUMMAANNAA EE DDEE CCAAMMUUNNDDOONNGGOO
Foram utilizadas as seguintes linhagens de células tumorais: Jurkat:
leucemia linfoblástica T humana, SK-Br-3: adenocarcinoma de mama humana,
B16F10: melanoma humano, S180: sarcoma 180 (Tumor de Crocker) murino. As
linhagens tumorais humana foram cedidas pelo Prof. Dr. Auro Nomizo, do
Laboratório de Imunologia da Faculdade de Farmácia da Universidade de São
Paulo-Ribeirão Preto (USP-RP). A linhagem de S180 foi obtida no Laboratório de
Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal de
Uberlândia.
22..77.. CCUULLTTUURRAA DDEE CCÉÉLLUULLAASS TTUUMMOORRAAIISS
As células tumorais foram cultivadas em frascos para cultivo celular
estéreis com 175 cm3, contendo meio RPMI 1640 completo, seguindo o protocolo
do ATCC. Para fins experimentais, as células foram cultivadas em microplacas de
96 poços (200µL/poço), fundo chato com tampa. As células foram incubadas em
estufa a 37°C com atmosfera 5% de CO2.
22..88.. OOBBTTEENNÇÇÃÃOO DDEE MMAACCRRÓÓFFAAGGOOSS PPEERRIITTOONNEEAAIISS DDEE CCAAMMUUNNDDOONNGGOOSS
Grupos de 5 camundongos swiss machos receberam intra-peritonealmente
1mL de PBS e após 5 minutos foi realizado uma massagem na região peritoneal,
logo depois os camundongos foram sacrificados e o exsudato peritoneal formado
foi coletado, em condições estéreis, com 5mL de meio RPMI 1640 completo. As
células peritoneais retiradas foram centrifugadas a 1.000rpm e as células
precipitadas foram lavadas 2 vezes com PBS, restando somente as células
aderentes (aqui denominadas de MPACs, Murine Peritoneal Adherent Cells)..
37
Para fins experimentais, as células foram cultivadas em microplacas de 96 poços
(200µL/poço), fundo chato com tampa. As células foram incubadas em estufa a
37°C com atmosfera 5% de CO2.
22..99.. AATTIIVVIIDDAADDEE CCIITTOOTTÓÓXXIICCAA
Para realização da atividade citotóxica as linhagens de células tumorais e
macrófagos peritoneais foram transferidos para tubos �Falcon� para
procedimentos de lavagem. As células foram lavadas três vezes por
centrifugação a 1.000 rpm por 10 minutos em meio RPMI. Ao final da última
lavagem, as células foram ressuspendidas em 5 mL de meio RPMI completo.
Uma alíquota de 10µL da suspensão celular foi colocada em 90µL de azul de
Tripan 1% (m:v) (SIGMA, EUA) e contadas em Câmara de Neubauer.
Para realização dos testes de citotóxicidade, 1x105 células tumorais ou
macrófagos foram plaqueadas em microplacas de 96 poços, na presença ou na
ausência das toxinas (diferentes concentrações) diluídas no meio de cultura. Em
seguida, as células foram incubadas por 24h a 37°C, em estufa umidificada. Após
a incubação, as células viáveis foram quantificadas colorimetricamente utilizando
a técnica padrão do MTT (MOSSMAN, 1983) com algumas modificações. Foram
adicionados 10µL (0,5mg/mL) do reagente MTT (brometo de 2,5-difenil-tetrazolio-
3-[4,5- dimetiltiazol-2-yl]) em cada poço, após 4h de incubação a 37°C, os cristais
de formazan produzidos pela redução do MTT foram solubilizados pela adição de
50µL de dodecil sulfato de sódio (SDS) em cada poço. A redução do MTT foi
quantificada pela leitura da absorbância a 540 nm do produto solubilizado,
utilizando um leitor de placa.
O cálculo da porcentagem de atividade citotóxica das toxinas foi obtido
seguindo a seguinte fórmula:
A= (leitura da absorbância residual do produto colorido formado (cristais de
formazan) após a ação da toxina na célula) x 100/ leitura da absorbância do
produto colorido formado (cristais de formazan) da célula somente na presença do
meio de cultura.
B= % atividade citotóxica = 100 �A.
38
22..1100.. AATTIIVVIIDDAADDEE BBAACCTTEERRIIOOLLÍÍTTIICCAA
Staphylococcus aureus, cepa ATCC-25923 e Escherichia coli, cepa ATCC
� 25922, foram adquiridos junto ao Laboratório Central do Hospital de Clínicas da
UFU, cedidas gentilmente pelo Dr. Luiz Ricardo Goulart, do Instituto de Genética
e Bioquímica da Universidade Federal de Uberlândia.
As bactérias individuais, S.aureus e E.coli, foram inicialmente inoculadas
em meio de cultura estéril BHI (Brain Heart Infusion-Broth � infusão desidratada
de coração e cérebro 1,75% (m/v), Triptose 0,1% (m/v), glicose 0,2% (m/v), NaCl
0,5% (m/v), Na2HPO4 0,25% (m/v), pH 7,4 ± 0,2 a 25OC da Diagnolab, Espanha) e
ativadas por 16 horas a 37OC em repouso. As culturas foram diluídas 100 vezes
em BHI estéril. Retirou-se 2mL para o plaqueamento da microplaca de 96 poços,
na presença ou na ausência das toxinas em concentrações de 0,4 e 0,8 µg.m/L
diluídas em BHI. Inicialmente e após 6 horas de incubação a 37OC sem agitação,
a densidade óptica foi monitorada em espectrofotômetro (Leitor de microplacas
Camberra-Packard) utilizando-se o filtro de interferência de 600nm.
22..1111.. IINNOOCCUULLAAÇÇÃÃOO EE MMAANNUUTTEENNÇÇÃÃOO DDOO TTUUMMOORR SS118800
As células do sarcoma 180 (ATCC-TIB66), expandidas em dois frascos de
cultivo celular, cedidas pelo Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências
biomédicas da Universidade Federal de Uberlândia foram utilizadas para a
inoculação e manutenção da linhagem nos camundongos. O meio de cultura
contendo as células tumorais foi centrifugado (2000 rpm, por 10 min., a 4°C), o
precipitado celular foi suspeso em PBS e inoculado por via intraperitoneal (0,3mL)
em camundongos albinos (Swiss), onde houve a formação do tumor ascítico.
A linhagem foi mantida por meio de passagens intra-peritoneais semanais
da seguinte maneira: após sete dias da inoculação das células tumorais no
peritôneo, os animais foram sacrificados e o líquido ascítico contendo as células
tumorais, aspirado. As células foram contadas e avaliadas quanto à viabilidade
após adição do corante vital Azul de Tripan e sua concentração ajustada para 105
células/ mL. Outros camundongos foram então, inoculados com 1 ml desta
39
suspensão celular via intraperitoneal. Desta maneira sempre havia células
disponíveis para fins experimentais.
22..1122.. IIMMPPLLAANNTTAAÇÇÃÃOO DDOO TTUUMMOORR SSÓÓLLIIDDOO SS118800
A formação do tumor sólido S180 foi obtida pela administração do líquido
ascítico do S180 (6X106 células) por via intramuscular na virilha de camundongos
da linhagem Balb/c.
2.13. ATIVIDADE ANTITUMORAL
A atividade antitumoral foi determinada comparando o volume da coxa dos
camundongos inoculados com o tumor sólido S180 tratados e não tratados após
um período de 14 dias e 60 dias Os valores de PI% foram definidos como a
porcentagem de inibição do volume do tumor dos camundongos tratados dividido
pelo volume do tumor dos camundongos não tratados e expresso como
percentagem. Neste experimento, 10 animais receberam injeção de PBS e
serviram como controle. 30 camundongos foram inoculados com o tumor sólido
do Sarcoma 180 onde foram criados os seguintes grupos de avaliação:
• 5 animais que não receberam tratamento e foram avaliados após 14 dias;
• 5 animais que não receberam tratamento e foram avaliados após 60 dias;
• 5 animais que receberam injeção intramuscular (na região do tumor sólido)
após 5 dias da inoculação do tumor sólido de 50µg de BthTX-I e foram
avaliados após 14 dias;
• 5 animais que receberam injeção intramuscular (na região do tumor sólido)
após 5 dias da inoculação do tumor sólido de 50µg de BthTX-I e foram
avaliados após 60 dias;
• 5 animais que receberam injeção intramuscular (na região do tumor sólido)
após 5 dias da inoculação do tumor sólido de 50µg de BthTX-I BPB e foram
avaliados após 14 dias;
40
• 5 animais que receberam injeção intramuscular (na região do tumor sólido)
após 5 dias da inoculação do tumor sólido de 50µg de BthTX-I e foram
avaliados após 14 dias.
A mortalidade e volume de tumor dos camundongos foram acompanhados
durante todos os dias do experimento.
A atividade antitumoral dos tratamentos foi avaliada também por análise
histológica por microscopia de luz dos tumores retirados após 14 e 60 dias e
comparadas com os tumores não tratados nos mesmos períodos de tempo.
Um fragmento da porção dos tumores tratados ou não foi retirado e
colocado em solução fixadora de água:etanol:formol:ácido acético na proporção
5:3:1:1 (v/v). Após permanecer neste fixador por uma noite, o material foi
desidratado em concentrações crescentes de etanol e então processado para
inclusão em glicol metacrilato (historesina).
Os blocos obtidos foram aparados e então cortados com auxílio de um
ultramicrótomo (Leica Instrument). Cortes com 2,5µm de espessura foram
corados com azul de toluidina a 1%, montados em lâmina e lamínula, examinados
ao microscópio óptico de luz (Nikon, modelo Optihot-2) e fotografados.
22..1144.. EESSTTUUDDOO DDOO EEFFEEIITTOO MMIIOOTTÓÓXXIICCOO DDAASS MMIIOOTTOOXXIINNAASS BBtthhTTXX--II EE BBtthhTTXX--II
BBPPBB SSOOBBRREE OO MMÚÚSSCCUULLOO GGAASSTTRROOCCNNEEMMIIOO DDEE CCAAMMUUNNDDOONNGGOOSS
Foram utilizados camundongos BALB/c machos de 18-22g divididos em
vários grupos (n=5) e um grupo controle, que recebeu injeção intramuscular, no
músculo gastrocnemius direito, de 25µL de PBS.
Os outros grupos receberam também pela mesma via, injeção de 25µL de
PBS contendo 50 µg de cada miotoxina (BthTX-I ou BthTX-I BPB). Estes animais
serviram de controle da atividade de BthTX-I e BthTX-I BPB. Após 24, 72h, 1 e 2
semanas os animais foram sacrificados e um pequeno fragmento da porção
central do músculo gastrocnemius foi retirado e processado para análise em
microscopia de luz conforme descrito no item 2.13.
22..1155.. AANNÁÁLLIISSEE EESSTTAATTÍÍSSTTIICCAA
41
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). As
análises estatísticas foram realizadas pelo teste � t de Student e o nível de
significância foi menor que 0,05 (p<0,05).
33.. RREESSUULLTTAADDOOSS
33..11.. AAttiivviiddaaddee cciittoottóóxxiiccaa ddaa ppeeççoonnhhaa bbrruuttaa ddee BBootthhrrooppss jjaarraarraaccuussssuu,, BBtthhTTXX--II nnaattiivvaa ee mmooddiiffiiccaaddaa ((BBPPBB)) ssoobbrree lliinnhhaaggeemm
lleeuuccêêmmiiccaa lliinnffoobblláássttiiccaa TT hhuummaannaa JJuurrkkaatt.. Os resultados apresentados na Figura 1A demonstram que a peçonha
bruta de B. jararacussu em concentrações variando de 0,01 a 0,02 µg/µL
apresenta atividade citotóxica significante (p<0,05) sobre as células Jurkat. A
citotoxicidade máxima foi de aproximadamente 100%. A atividade da miotoxina
BthTX-I foi significantemente menor nas mesmas concentrações, quando
comparada com a da peçonha bruta (20%). Nestas concentrações não foi
detectada atividade citotóxica para BthTX-I BPB.
A atividade citotóxica máxima de BthTX-I em concentrações variando de
0,1 a 1,0 µg/µL foi de aproximadamente 100%, enquanto que a citotoxicidade
máxima de BthTX-I BPB nas mesmas concentrações foi significamente menor
(30%) (p<0,05) (Figura 1B).
33..22.. AAttiivviiddaaddee cciittoottóóxxiiccaa ddaa BBtthhTTXX--II nnaattiivvaa ee mmooddiiffiiccaaddaa ((BBPPBB))
ssoobbrree lliinnhhaaggeemm aaddeennooccaarrcciinnoommaa ddee mmaammaa hhuummaannoo SSKK--BBrr--33..
Na Figura 2 observa-se que a BthTX-I nas concentrações variando de 0,1 a
1,0 µg/µL apresenta atividade citotóxica máxima de 50% sobre as células
tumorais SK-Br-3 (p<0,05), enquanto que a atividade de BthTX-I BPB nas
mesmas concentrações foi significativamente menor (30%).
42
0.010 0.015 0.020-20
0
20
40
60
80
100
*
*
*
* *
A
Peçonha bruta de Bothrops jararacussu BthTX- I BthTX- I BPB
% C
ITO
TOXI
CID
ADE
(ug/uL)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.10
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
**** **
****
B
BthTX-I BthTX-I BPB
% C
ITO
TOXI
CIDA
DE
(ug/uL)
Figura 1. Efeito citotóxico da peçonha bruta de Botrhops jararacussu (A), BthTX-I (A e B) e BthTX-I BPB (A e B) sobre a linhagem leucêmica linfoblastica T humana Jurkat. As células Jurkat foram incubadas por 24 h a 37°C na presença de diferentes concentrações das toxinas. Os dados são expressos como porcentagem de citotoxicidade em comparação com a porcentagem de crescimento das células não tratadas. As barras de erro mostram a médias ± desvio padrão (DP) de três experimentos realizados em triplicata. Os asteriscos representam os valores estatisticamente significantes (p < 0,05 teste t). * Significância estatística em relação à peçonha de B. jararacussu. ** Significância estatística em relação a BthTX-I.
43
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.10
10
20
30
40
50
60
* * *
*
BthTX- I BthTX- I BPB
% C
ITO
TOXI
CID
ADE
(ug/uL)
Figura 2. Efeito citotóxico de BthTX-I e BthTX-I BPB sobre a linhagem de adenocarcinoma de mama humano SK-BR-3. As células de SK-BR-3 foram incubadas por 24 h a 37°C na presença de diferentes concentrações das toxinas. Os dados são expressos como porcentagem de citotoxicidade em comparação com a porcentagem de crescimento das células não tratadas. As barras de erro mostram as médias ± desvio padrão (DP) de três experimentos realizados em triplicata. O asterisco representa os valores estatisticamente significantes (p < 0,05 teste t). * Significância estatística em relação a BthTX-I.
44
33..33.. AAttiivviiddaaddee cciittoottóóxxiiccaa ddee BBtthhTTXX--II nnaattiivvaa ee mmooddiiffiiccaaddaa ((BBPPBB))
ssoobbrree lliinnhhaaggeemm ddee mmeellaannoommaa hhuummaannoo BB1166FF1100..
Os resultados apresentados na Figura 3 demonstram que BthTX-I nas
concentrações variando de 0,25 a 1,0 µg/µL apresenta atividade citotóxica
máxima de 90% sobre as células tumorais B16F10 (p<0,05), nenhuma
citotoxicidade foi encontrada em concentrações menores que 0,25µg/µL.
Enquanto que a atividade de BthTX-I BPB nas mesmas concentrações foi
significativamente menor (20%).
33..44.. AAttiivviiddaaddee cciittoottóóxxiiccaa ddee BBtthhTTXX--II nnaattiivvaa ee mmooddiiffiiccaaddaass ((BBPPBB,,
NNPPSSCC ee NNBBSSFF)),, ppeeççoonnhhaa bbrruuttaa ddee CCrroottaalluuss dduurriissssuuss tteerrrriiffiiccuuss ee
ccrroottaammiinnaa ssoobbrree lliinnhhaaggeemm ddee ssaarrccoommaa 118800 mmuurriinnoo ((SS118800))..
Os resultados apresentados na Figura 4A demonstram que BthTX-I nas
concentrações variando de 0,05 a 1,0 µg/µL apresenta atividade citotóxica
máxima de 90% sobre as células tumorais S180 (p<0,05), enquanto que a
atividade das miotoxinas modificadas com NBSF, NPSC e BPB nas mesmas
concentrações foi menor sendo de 60, 50, 40 % respectivamente.
Os resultados apresentados na Figura 4B demonstram que a crotamina
nas concentrações variando de 0,02 a 0,1 µg/µL apresenta atividade citotóxica
máxima de 75% sobre as células tumorais S180 (p<0,05), enquanto que a
atividade da peçonha bruta de C. durissus nas mesmas concentrações foi
significativamente menor, a peçonha apresentou citotoxicidade máxima (25%) na
menor concentração utilizada.
45
33..55.. AAttiivviiddaaddee cciittoottóóxxiiccaa ddee BBtthhTTXX--II nnaattiivvaa ee mmooddiiffiiccaaddaa ((BBPPBB,,
NNPPSSCC ee NNBBSSFF)),, ppeeççoonnhhaa bbrruuttaa ddee CCrroottaalluuss dduurriissssuuss tteerrrriiffiiccuuss ee
ccrroottaammiinnaa ssoobbrree mmaaccrróóffaaggooss ppeerriittoonneeaaiiss mmuurriinnooss.. BthTX-I e BthTX-I BPB nas concentrações variando de 0,05 a 1,0 µg/µL
apresentam atividade citotóxica máxima de 90% sobre macrófagos (P<0,05),
enquanto que a atividade das miotoxinas modificadas com NPSC E NBSF, nas
mesmas concentrações, foi significativamente menor (40 e 20%, respectivamente)
(Figura 5A).
Os resultados apresentados na Figura 5B demonstram que a crotamina,
nas concentrações variando de 0,02 a 0,1 µg/µL, apresenta atividade citotóxica
máxima de 20% sobre macrófagos (p<0,05) enquanto que a peçonha nas
concentrações de 0,02 e 0,1µg/µL estimulou a proliferação de macrófagos em
aproximadamente 24 e 60%, respectivamente.
46
0.25 0.50 0.75 1.000
20
40
60
80
100
***
BthTX- I BthTX- I BPB
% C
ITO
TOXI
CIDA
DE
(ug/uL)
Figura 3. Efeito citotóxico de BthTX-I e BthTX-I BPB sobre a linhagem de melanoma humano B16F10. As células de B16F10 foram incubadas por 24 h a 37°C na presença de diferentes concentrações das toxinas. Os dados são expressos como porcentagem de citotoxicidade em comparação com a porcentagem de crescimento das células não tratadas. As barras de erro mostram a médias ± desvio padrão (DP) de três experimentos realizados em triplicata. O asterisco representa os valores estatisticamente significantes (p < 0,05 teste t). * Significância estatística em relação a BthTX-I.
47
0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.1105
101520253035404550556065707580
**
****
B
peçonha bruta de Crotalus durrisus terrificus crotamina
% C
ITO
TOXI
CID
ADE
(ug/uL)
Figura 4. Efeito citotóxico sobre a linhagem de sarcoma 180 murino. (A) BthTX-I, BthTX-I BPB, BthTX-I NPSC e BthTX-I NBSF, (B) peçonha bruta de Crotalus durrissus terrificus e crotamina. As células de S180 foram incubadas por 24 h a 37°C na presença de diferentes concentrações das toxinas ou somente na presença do meio de cultura. Os dados são expressos como porcentagem de citotoxicidade em comparação com a porcentagem de crescimento das células não tratadas. As barras de erro mostram a médias ± desvio padrão (DP) de três experimentos realizados em triplicata. Os asteriscos representam os valores estatisticamente significantes (p < 0,05 teste t). * Significância estatística em relação a BthTX-I. **Significância estatística em relação a peçonha de C. d. terrificus.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.10
10
20
30
40
50
60
70
80
90
*
*
*
**
**
*
*
*
*
A
BthTX- I BthTX- I BPB BthTX- I NPSC BthTX- I NBSF
% C
ITO
TOXI
CIDA
DE
CONCENTRAÇÃO (ug/uL)
48
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
**
**
*
*
*
* *
*
A
BthTX- I BthTX- I BPB BthTX- I NPSC BthTX-I NBSF
% C
ITO
TOXI
CIDA
DE
(ug/uL)
0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
**
**
**
B
peçonha bruta de Crotalus durissus terrificus crotamina
(% C
ITO
TOXI
CIDA
DE)
ug/uL
Figura 5. Efeito citotóxico sobre macrofagos peritoneais murinos. (A) BthTX-I, BthTX-I BPB, BthTX-I NPSC e BthTX-I NBSF, (B) peçonha bruta de Crotalus durrissus terrificus e crotamina. Os macrofagos foram incubados por 24 h a 37°C na presença de diferentes concentrações das toxinas. Os dados são expressos como porcentagem de citotoxicidade em comparação com a porcentagem de crescimento das células não tratadas. As barras de erro mostram a médias ± desvio padrão (DP) de três experimentos realizados em triplicata. Os asteriscos representam os valores estatisticamente significantes (p < 0,05 teste t). * Significância estatística em relação a BthTX-I. **Significância estatística em relação a peçonha de C. d. terrificus.
49
33..66.. AAttiivviiddaaddee bbaacctteerriicciiddaa ddaa BBtthhTTXX--II nnaattiivvaa oouu mmooddiiffiiccaaddaa ((BBPPBB,,
NNPPSSCC ee NNBBSSFF)) ssoobbrree ee EEsscchheerr iicchhiiaa ccooll ii ee SSttaapphhyyllooccooccccuuss
aauurreeuuss
Os resultados apresentados na Figura 6 demonstram a proliferação de E.
coli e S. aureus durante 4h por monitoramento da densidade óptica sem ou com
influência de BthTX-I nativa ou com modificações. BthTX-I ou BthTX-I BPB nas
concentrações de 0,4 a 0,8 µg/µL apresentam atividade bactericida significativa
sobre E. coli (p<0,05) Na concentração de 0,8 µg/µL de BthTX-I a inibição da
proliferação foi de 100% aproximadamente e de 92% para BthTX-I BPB.
Enquanto que a atividade das miotoxinas modificadas com NBSF, NPSC nas
mesmas concentrações, foi significantemente menor (Figura 6A).
Na Figura 6B, a atividade de BthTX-I nas concentrações de 0,4 a 0,8 µg/µL
mostrou-se significativa sobre S. aureus (P<0,05). Na concentração de 0,8 µg/µL
a inibição da proliferação foi de aproximadamente 90%, enquanto que a atividade
das miotoxinas modificadas com BPB, NBSF, NPSC nas mesmas concentrações,
foi significativamente menor.
50
controle
BthTX- I 0,8 ug/uL
BthTX- I 0,4 ug/ul
BthTX- I BPB 0,8 ug/uL
BthTX- I BPB 0,4 ug/uL
BthTX- I NPSC 0,8 ug/uL
BthTX- I NPSC 0,4 ug/uL
BthTX - I NBSF 0,8 ug/uL
BthTX- I NBSF 0,4 ug/uL
-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800
L
**
*
**
**
*A
% Proliferação
controle
BthTX- I 0,8 ug/uL
BthTX- I 0,4 ug/ul
BthTX- I BPB 0,8 ug/uL
BthTX- I BPB 0,4 ug/uL
BthTX- I NPSC 0,8 ug/uL
BthTX- I NPSC 0,4 ug/uL
BthTX - I NBSF 0,8 ug/uL
BthTX- I NBSF 0,4 ug/uL
0 50 100 150 200 250 300
L
*
*
*
*
*
*
B
% Proliferação
Figura 6. Ativ idade bactericida de BthTX-I nat iv a e modif icadas (BPB, NBSF e NPSC) sobre E. col i (A) S. aureus (B). Após o plaqueamento, as bactér ias indiv iduais foram incubadas por 4 h na presença de v árias concentrações de toxinas. A at iv idade das miotoxinas sobre as bactér ias foi representada pela redução da densidade ópt ica a 600nm, com 0 e 4 h a 37ºC. Os dados percentuais são relat iv os à di ferença entre 0 e 4 h, e a média ± DP é representat iv a de amostras em tripl icata. Os asteriscos representam os valores estatisticamente significantes (p < 0,05 teste t). * Significância estatística em relação ao controle.
51
3.7. Inibição do crescimento do tumor sólido (S180) implantado em camundongos A implantação de células do S180 (6 x 106) na virilha de camundongos
resultou em um tumor sólido (em todos os camundongos) que se localizava na
coxa, este apresentava consistência firme a partir do 5º dia.
A administração intramuscular de 50 µg de BthTX-I ou BthTX-I BPB (dose
única) no quinto dia após a implantação do tumor sólido (Sarcoma 180) em
camundongos avaliados até 14 e 60 dias reduziu consideravelmente o volume do
tumor (Tabela 1).
Nos animais avaliados até 14 dias, o volume do tumor tratado com BthTX-I
ou BthTX-I BPB diminui 31 e 30%, respectivamente, em relação ao grupo não
tratado.
Nos camundongos avaliados até 60 dias, a redução do volume do tumor foi
mais acentuada, resultando em uma inibição de 81 e 76%, respectivamente.
Na Tabela 1 também estão apresentados os resultados do
acompanhamento da sobrevivência dos animais. Até o 14º dia, 2 camundongos
que pertenciam ao controle (sem tratamento) foram a óbito, enquanto que nos
grupos tratados com BthTX-I ou BthTX-I BPB nenhuma morte foi verificada.
Nos animais que foram avaliados até 60 dias, 100% do grupo controle
morreu, sendo que a primeira morte ocorreu no 15º, outros 2 no 25º dia e os 2
últimos no 58º dia, quando foram feitas as últimas avaliações de volume de tumor.
Nos camundongos que receberam os tratamentos, somente 2 mortes ocorreram
nos que receberam o tratamento com BthTX-I, enquanto que os que receberam
BthTX-I BPB ocorreu apenas 1 morte (Tabela 1).
52
Tabela 1. Efeito do tratamento com injeção i. m. de 50 µg de BthTX-I ou BthTX-I BPB no tumor sólido induzido por 6 x 106 células do Sarcoma 180 implantadas na virilha de camundongos Balb/c (n=5)
Tratamento Volume do tumor (cm3)
Variação do volume do tumor (cm3)a PI (%)b Mortalidade
14 diasc Controle sem tratamento 639,23 ± 20,8 60,22 ± 5,4 - 2
BthTX-I 443,29 ± 31,4* 46,81 ± 6,9* 31 0 BthTX-I BPB 451,04 ± 19,3* 49,48 ± 6,7* 30 0
60 diasc Controle sem tratamento 4691,13 ± 97,8 4338,47 ± 10,2 - 5
BthTX-I 905,96 ± 35,4* 581,29 ± 25,3* 81 2 BthTX-I BPB 1128,6 ± 65,2* 563,08 ± 12,36* 76 1
a Variação do volume do tumor foi medida subtraindo o volume do tumor no 14° ou 60° dia pelo volume do tumor no 5º dia após a implantação do tumor. b PI (%)- porcentagem de inibição do volume de tumor tratado em relação ao controle sem tratamento. c Dois blocos foram criados: um avaliado até 14 dias e outro avaliado até 60 dias da implantação do tumor. Os asteriscos representam os valores estatisticamente significantes (p < 0,05 teste t). * Significância estatística em relação ao controle sem tratamento.
53
33..77.. 11.. AAvvaalliiaaççããoo hhiissttooppaattoollóóggiiccaa 3.7.1.1. Efeito da inoculação de BthTX-I em camundongos normais.
As fibras de músculo gastrocnêmio de camundongos normais inoculados
com 50µg de BthTX-I mostraram, após 24h (Figura 7B e C) e 72h (Figura 7D e E),
uma acentuada diminuição da estrutura muscular, áreas com necrose e infiltrado
leucocitário (principalmente neutrófilos polimorfonucleares). Nenhuma alteração
em vasos sanguíneos foi observada.
Após 1 e 2 semanas (Figuras 7F e G respectivamente) nota-se
regeneração do tecido muscular, com aparecimento de músculos com núcleo
central.
3.7.1.2. Efeito da inoculação de BthTX-I BPB em camundongos normais
As fibras de músculo gastrocnêmio de camundongos normais inoculados
com 50µg de BthTX-I BPB mostraram, após 24h (Figura 8A) e 72h (Figura 8B) um
infiltrado leucocitário evidente e uma diminuição acentuada da mionecrose em
relação à BthTX-I.
3.7.1.3. Efeito do tumor sólido (S180) implantado em camundongos não tratados
Os cortes histológicos mostram neoplasia constituída por células com
citoplasma mal delimitado, núcleos pleomórficos, de contornos irregulares (seta)
(Figuras 9C e F), necrose multifocal (N), em meio a grupos de células tumorais
(Figuras 9A, B, C e D) e infiltrado leucocitário (I) (Figuras 9C, E e F).
3.7.1.4. Efeito do tratamento do tumor sólido com BthTX-I
Os músculos implantados com sarcoma 180 e tratados com dose única de
50 µg de BthTX-I mostraram uma redução do volume do tumor, representado por
uma diminuição de células tumorais do sarcoma 180, este efeito foi mais evidente
após 60 dias de tratamento (Figuras 10H-M). As fibras musculares mostraram se
mais preservadas após 14 (Figuras 10B, C, E, F) e 60 dias de tratamento (Figuras
10H, I, K, L, M), e um amplo infiltrado leucocitário evidente foi evidenciado
(Figuras 10A, B, C, I e K).
54
3.7.1.5. Efeito do tratamento do tumor sólido com BthTX-I BPB
Os músculos implantados com sarcoma 180 e tratados com dose única de
50 µg de BthTX-I BPB também mostraram uma redução do volume do tumor,
representado por uma diminuição de células tumorais do sarcoma 180, este efeito
foi mais evidente após 60 dias de tratamento (Figuras 11E-J). As fibras
musculares mostraram-se mais preservadas após 14 (Figuras 11C e D) e 60 dias
de tratamento (Figuras 11E, H e J), e um amplo infiltrado leucocitário foi
evidenciado (Figuras 11A, B, C, I e K).
55
(legenda na página 55)
AAA
BBB
CCC
DDD
EEE FFF
GGG
N
N N
N
I
I
I
56
Figura 7. Fotomicrografia de secções musculares (cortes de 2,5 µm) do gastrocnêmio direito de camundongos Balb/c machos normais injetados com: PBS (A); BthTX- I (50µg): (B) e (C) após 24h, (D) e (E) após 72 h, (F) após 1 semana e (G) após 2 semanas. N= necrose, I= infiltrado leucocitário, coloração: azul-de-toluidina, aumento: 120X (A, E e G), 260X (B, C, D e F).
57
Figura 8. Fotomicrografia de secções musculares (cortes de 2,5 µm) do gastrocnêmio direito de camundongos Balb/c machos normais injetados com BthTX- I BPB (50µg): (A) após 24h e (B) após 72 h. I= infiltrado leucocitário, coloração: azul-de-toluidina, aumento: 120 (A), 260 (B).
AAA
BBB
III
III
58
Figura 9. Fotomicrografia de secções de fragmentos de tumor sólido (S180) (cortes de 2,5 µm) implantados em camundongos não tratados. I (infiltrado leucocitário) → (célula tumoral) N ( necrose) Coloração: azul-de-toluidina; aumento: 26X (A), 120 (B e E) e 260X (C, D e F)
BBB
NNN
AAA
NNN
CCC
NNN
III
EEE III
DDD
NNN
→→→
FFF
→→→
→→→
59
(legenda na página 60)
FFF
AAA III
BBB III
CCC III
III
EEE
DDD
→→→
60
(legenda na página 60)
HHH
III
LLL
MMM
GGG
III
JJJ
NNN
KKK III
NNN
61
Figura 10. Fotomicrografia de secções de fragmentos de tumor sólido (S180) (cortes de 2,5 µm) implantados em camundongos tratados com dose única (50µg) de BthTX-I: (A - G) após 14 dias e (H - M) após 60 dias. I (infiltrado leucocitário) → (célula tumoral) N ( necrose)
62
Coloração: azul-de-toluidina; aumento: 26 (G e I), 120 (A e M) 260X (B-F, H-K)
FFF
NNN
III
EEE
III
DDD
III
CCC →→→
III
AAA
NNN
III
BBB
NNN
III
→→→
63
Figura 11. Fotomicrografia de secções de fragmentos de tumor sólido (S180) (cortes de 2,5 µm) implantados em camundongos tratados com dose única (50µg) de BthTX-I BPB: (A - D)após 14 dias e (E - J) após 60 dias. I (infiltrado leucocitário) → (célula tumoral) N ( necrose) Coloração: azul de toluidina Aumento: 260 (A-J)
JJJ
III
GGG
III
III
NNN
HHH
NNN
64
44.. DDIISSCCUUSSSSÃÃOO
Peçonhas de serpentes possuem efeito inibitório no crescimento de vários
tumores in vitro e in vivo. Diversos trabalhos foram realizados com o objetivo de
avaliar a citotoxicidade e mecanismo de ação das toxinas frente às células
tumorais (COTTE et al, 1972; BRAGANÇA et al, 1976; de CARVALHO et al,
2001; COSTA et al, 2001; ABU-SINNA et al ,2003). O efeito citótoxico in vitro de miotoxinas botrópicas têm sido estudado em
culturas de células demonstrando que elas afetam não somente mioblastos e
miotubulos, mas também outros tipos celulares. Miotoxinas de B. asper são
citotóxicas em culturas de células musculares, neurônios, macrófagos e
fibroblastos (GUTIÉRREZ & LOMONTE, 1995).
A peçonha bruta de B. jararacussu, em baixas concentrações (0,01 e 0,02
µg/µL), apresentou alta atividade citotóxica sobre a linhagem tumoral humana
Jurkat, enquanto que nas mesmas concentrações a atividade da BthTX-I foi
significativamente menor. Isto pode ser explicado pelo fato da peçonha bruta
conter diversos tipos de proteínas que possuem mecanismos de ação diferente e
podem em conjunto aumentar a atividade citotóxica. Em concentrações maiores
de BthTX-I (0,1-1,0µg/µL) houve um acréscimo significativo da citotoxicidade
(100% na maior concentração).
A sensilbildade das linhagens tumorais à ação citotóxica da BthTX-I varia
dependendo do tipo de linhagem tumoral. A atividade citotóxica da BthTX-I para a
linhagem jurkat foi maior que o verificado para Sk-Br-3, B16F10 e S180 nas
mesmas concentrações. A citotoxicidade na maior concentração (1,0µg/µL) variou
de: 45% para SK-Br-3 e 90% para B16F10 e S180.
A atividade citotóxica da BthTX-I também foi testada em macrófagos
peritoneais murinos, a atividade na maior concentração (1,0µg/µL) foi de 90%.
A inibição da proliferação de bactérias, após 4h de avaliação do
crescimento, pela atividade da BthTX-I (0,8µg/µL) também foi evidenciada nas
linhagens E. coli (100%) e S. aureus (~92%).
65
A atividade citotóxica pode estar relacionada a diferentes tipos de interação
da toxina com as células alvos. Lomonte et al (1999) demonstraram que
miotoxinas botrópicas são mais citotóxicas para miotúbulos do que a células
endoteliais. Estudos de ligação celular realizado com PLA2 mostraram que esta
pode ligar-se a receptores ou lipídeos de membrana com diferentes graus de
afinidade, deste modo as PLA2s poderiam estar agindo através do
reconhecimento de lipídios de membrana ou sítios receptores específicos. No
caso das miotoxinas botrópicas este receptor ainda é desconhecido (KINI &
EVANS, 1989; GUTIÉRREZ & OWNBY, 2003).
Estudos com lipossomos multilamelares mostraram que, somente as
vesículas com carga negativa eram afetadas por miotoxinas botrópicas (DÍAZ et
al, 2001), sugerindo o envolvimento de aminoácidos básicos no mecanismo
perturbador de membranas biológicas. Muitas células apresentam domínios
compostos por fosfolipídeos carregados negativamente, especialmente
fosfatidilserina, do lado externo da membrana. Um baixo conteúdo destes
fosfolipídeos negativos na superfície da membrana de alguns tipos celulares
poderia dar resistência à ação citotóxica das miotoxinas (DÍAZ et al, 2001).
Eritrócitos enriquecidos com fosfatidilserina mostraram ser suceptíveis à acão
lítica das miotoxinas botrópicas quando comparados com os eritrócitos normais
que são resistentes a estas toxinas (DÍAZ et al, 2001). Isto sugere que
fosfolipídeos carregados negativamente na superfície externa da membrana
devem participar na ancoragem das PLA2 miotóxicas (GUTIÉRREZ & OWNBY,
2003).
Paramo et al (2001) mostraram que o efeito citotóxico sobre bactérias
induzido por miotoxinas Lys49 pode ser atribuido a região C-terminal (115-129) da
proteína que é o sítio ligante da heparina. Esta região também apresentou
atividade miotóxica in vivo e lisou células endoteliais (LOMONTE et al, 1994;
LOMONTE et al, 1999).
O resíduo de His48 é altamente conservado nas PLA2 e a alquilação deste
resíduo nas Lys49 induz a diminuição da toxicidade e efeitos farmacológicos,
como indução de edema e degranulação de mastócitos in vitro (ANDRIÃO-
ESCARSO et al, 2000).
66
A alquilação do resíduo de His48 com brometo de p-bromofenacila
promoveu a inibição de aproximadamente 70% da citotoxicidade sobre as
linhagens tumorais Jurkat e SK-BR-3, 80% para B16F10 e 40% para S180.
Porem, não foram evidenciados inibição significativa na citotóxicidade
quando testada frente a macrófagos.
A atividade bactericida frente a E. coli ocasionada pela BthTX-I modificada
com BPB foi similar à da BthTX-I nativa, porem frente a S. aureus a atividade foi
significantemente inibida após a alquilação da BthTX-I com BPB.
Soares et al (2003) demonstraram que as miotoxinas Lys 49 após
alquilação do resíduo de histidina com BPB reduziram em cerca de 40-50% o
efeito miotóxico, 80-85% do efeito citotóxico e 15-20% do edema, sem interferir
com rupturas de lipossomos carregados negativamente, deste modo poderia
haver regiões distintas do sítio catalítico, que podem ser responsáveis por
algumas propriedades farmacológicas.
Várias hipóteses foram propostas para explicar a perda da atividade
farmacológica das PLA2 pela alquilação da His48 pelo BPB, uma delas é a
indução de mudanças conformacionais nas regiões moleculares distintas do sítio
catalítico (RENETSEDER et al, 1988). Nas Lys49 poderiam existir domínios
farmacológicos independentes ou sobrepostos distintos do sítio ativo (OWNBY et
al, 1999).
O cloreto de o-nitrofenilsulfonila (NPSC) é um reagente utilizado para
modificar resíduos de triptofano, enquanto que o reagente fluoreto de 2-
nitrobenzenosulfonila (NBSF) é utilizado para modificar resíduos de tirosina. A
maioria das PLA2 botrópicas possue vários resíduos de tirosina e um ou mais
resíduos de triptofano. O resíduo de Trp na posição 77 é muito conservado nas
PLA2 Lys49, é sugerido que estes aminoácidos exerçam funções importantes na
manutenção estrutura molecular da proteína (VERHEIJ et al, 1994).
A modificação do resíduo de triptofano utilizando NPSC reduziu a atividade
citotóxica da BthTX-I frente ao Sarcoma 180 em 50%, 60% em macrófagos.
NPSC também interferiu sobre a atividade da BthTX-I em reduzir a
proliferação de bactérias. E. coli apresentou uma proliferação de 30% quando
incubada com BthTX-I NPSC na concentração de 0,8µg/µL em relação ao
controle e em S. aureus a proliferação foi de aproximadamente 50% (0,8µg/µL de
67
BthTX-I NPSC). Provavelmente a modificação do resíduo de Trp é importante na
atividade bactericida em bactérias gram negativas e positivas uma vez que a
BthTX-I nativa inibiu a proliferação em 100%.
BthTX-I possui somente um resíduo de Trp (ANDRIÃO-ESCARSO et al,
2000) e estudos estruturais realizados por Da Silva Giotto et al (1998)
demonstraram que este resíduo apresenta um importante papel na orientação dos
monômertos, nas duas formas de cristais dos dímeros, �aberta� e �fechada�. Este
Trp 77 contribui para a estabilização do dímero pelas pontes de hidrogênio
intermoleculares. Transições entre estas duas conformações nas estruturas
quaternárias dos homodímenros das Lys49 poderia ser fundamental no
mecanismo de ação para a atividade destruidora de membrana, uma vez que a
região C-terminal destas enzimas poderiam inserir-se dentro da membrana.
(WARD et al, 1995).
A modificação do resíduo de tirosina pelo NBSF reduziu a atividade
citotóxica da BthTX-I frente ao sarcoma 180 em 60% e 70% em macrófagos
(Figura 5A).
Houve aproximadamente 20% de proliferação em E. coli quando incubada
com BthTX-I NBSF (0,8µg/µL), entretanto esta modificação interferiu menos na
proliferação em S. aureus.
Soares et al (2003) demonstraram que a as modificações nos resíduos de
Tyr nas Lys49r pelo NBSF afetaram a letalidade, miotoxicidade e a citotoxicidade,
sugerindo um importante papel deste resíduo de aminoácido nestas atividades.
Nossos resultados indicam que BthTX-I apresenta um potente efeito
citotóxico frente às linhagens de células tumorais, macrófago e bactérias testadas,
e as modificações químicas nos resíduos de His Tyr, Trp influem na citotoxicidade
das linhagens tumorais. Portanto é necessário estudos mais aprofundados que
visam desvendar o mecanismo citotóxico desta proteína.
Apesar da peçonha de C. d. terrificus não apresentar atividade citotóxica
frente a S180 e macrófagos, a crotamina mostrou citotoxicidade in vitro frente à
linhagem do sarcoma 180, porém esta atividade foi significantemente menor
frente a macrófagos.
Fletcher et al (1996) ao testar a crotamina em cultura de músculo
esquelético não encontrraram uma concentração de toxina que matasse 50% das
68
células. Lomonte et al (1999) utilizando as concentrações de 20 e 80 µg/poço de
crotamina em cultura de células endoteliais e de miotubulos não evidenciaram
atividade citotóxica.
Nossos resultados, ao contrário dos resultados encontrados por Fletcher et
al (1996) e Lomonte et al (1999), demonstraram atividade citotóxica em células
tumorais e macrófago por meio de um mecanismo ainda desconhecido.
Nos ensaios in vivo, observou-se que BthTX-I possui efeito mionecrótico
nas células musculares de camundongo com o aparecimento de amplo infiltrado
leucocitário composto de leucócitos polimorfonucleares e macrófagos que se
torna abundante após 24h.
A regeneração muscular após a mionecrose induzida pela BthTX-I procede
normalmente, com pequenas células musculares, com núcleo central após 1 e 2
semanas. É proposto que o processo regenerativo ocorra porque as miotoxinas
não afetam vasos sanguíneos e nervos, e ocorra a ativação de células satélites
miogênicas e fusão de miotúbulos dentro dos espaços delimitados pela lâmina
basal remanescente das células necróticas (GUTIÉRREZ & LOMONTE, 1995;
QUEIROZ et al, 1998).
A alquilação do resíduo de histidina por BPB na BthTX-I reduziu a lesão
muscular, entretanto as propriedades imunológicas induzidas pela toxina não
sofreram alterações Um infiltrado leucocitário foi observado após inoculação da
toxina modicada com BPB. Andrião-Escarso et al (2000) modificando a BthTX-I
com BPB demonstraram não haver mudanças significantes na antigenicidade
uma vez que a produção de anticorpos policlonais foi mantida.
Os camundongos implantados com tumor sólido S180, que não receberam
tratamento de BthTX-I ou BthTX-I BPB, tiveram um aumento do volume do tumor
sólido quando comparado aos que receberam, as análises histológicas
demonstram um padrão de necrose multifocal devido à morte das células
musculares causada pela isquemia ocasionada pelo aumento do volume do
tumor. Observa-se também infiltrado leucocitário que poderia ter a função de
remover os debris de musculos esquelético necrosados.
A inoculação de uma única dose de 50 µg/µL de BthTX-I ou BthTX-I BPB
na região do tumor sólido reduziu o seu crescimento principalmente após 60 dias
de avaliação (81 e 76% de inibição) e diminuiu a mortalidade.
69
A fotomicrografia dos tumores tratados com BthTX-I ou BthTX-I BPB, onde
se observa uma maior preservação das fibras musculares, quando comparado ao
controle sem tratamento e um amplo infiltrado leucócitário, principalmente de
neutrófilos polimorfonucleares, linfócitos e macrófagos.
Como já mencionado, a alquilação do resíduo de histidina reduz
significativamente a atividade citotóxica e miotóxica da BthTX-I, porém a inibição
do tumor sólido pela inoculação de BthTx-I modificada com BPB foi similar à
induzida pela BthTX-I nativa.
Provavelmente a inibição do crescimento do tumor S180 implantado em
camundongos pode estar relacionada com a ativação do sistema imune, uma vez
que a modificação química da proteína não interfere nas suas propriedades
imunogênicas, onde um infiltrado leucocitário nos músculos de camundongos
normais inoculados com BthTX-I BPB é evidente.
Os macrófagos normalmente infiltram-se na massa tumoral. Entretanto,
eles precisam estar ativados para que participem como células efetoras contra as
células tumorais, macrófagos isolados de tumores imunogênicos em fase de
regressão apresentam atividade citotóxica, ao passo que os macrófagos isolados
de tumores em evolução ou não imunogênicos não apresentam atividade
citotóxica. Foi demonstrado, in vitro, que os macrófagos em repouso não são
citolíticos para as células tumorais, mas podem tornar-se citolíticos caso forem
ativados por fatores de ativação de macrófagos (MAF - macrophage-activating
factors), comumente secretados pelos linfócitos Th após estimulação antígeno
específica (BALLOW & NELSOM,1997).
Resultados preliminares, não apresentados, demonstram por meio da
expressão por RT-PCR, uma maior expressão de TNFα e INFα nos camundongos
tratados com BthTX-I ou BthTX-I BPB quando comparado com os camundongos
não tratados.
TNFα é uma proteína sintetizada e secretada por macrófagos, e induz
diversos efeitos como a ativação de neutrófilos polimorfonucleares e macrófagos
(Witkowski et al, 1997). TNFα e INFγ são citocinas chaves na ativação de estágios
inflamatórios iniciais ativando a migração de células, principalmente macrófagos e
neutrófilos (CARNEIRO et al, 2002; ADAM et al, 2003; SZLOSAREK et al, 2003).
70
Liu et al (2004) demonstraram a inibição do crescimento do S180 in vivo
tratando os camundongos com administração oral ou intraperitoneal de
polissacarídeos purificados de Artrodia camphorata. Os autores sugerem que
estes polissacarídeos induzam um efeito antitumoral promovendo a ativação da
resposta imune do tipo Th-1, este estudo demonstrou um aumento na produção
de citocinas expressas quando a resposta Th-1 está ativada (TNFα e INFγ).
Estudos in vitro mostram que macrófagos podem eliminar células tumorais
por citólise ou fagocitose (ADAM et al, 2003).
Estudos adicionais da expressão destas citocinas poderão indicar se este
mecanismo está sendo ativado pela administração de BthTX-I ou BthTX-I BPB em
camundongos implantados com tumor sólido S180.
Avaliações histológicas dos órgãos (pulmão, rins e fígado) não mostraram
nenhuma alteração em relação aos grupos de camundongos normais,
implantados com S180 tratados ou não com BthTX-I ou BthTX-I BPB (dados não
apresentados), bem como as dosagens de enzimas como bilirrubina, creatinina e
desidrogenase lática. Os parâmetros hematológicos também não revelaram
nenhuma alteração hematológica entre os grupos (dados não apresentados).
Os camundongos tratados com BthTx-I ou BthTX-I BPB após 60 dias
mostraram uma menor expressão (RT-PCR) de metaloproteases de matriz do tipo
9 (MMP-9) quando comparados com os camundongos não tratados (resultados
não apresentados).
Existe uma correlação positiva entre progressão e invasão do tumor com a
expressão de metaloproteases de matriz, principalmente MMP-2 e MMP-9 (FODA
et al, 2001). A progressão do tumor envolve a degradação das proteínas
presentes na matriz extra-celular (LÁPIS & TIMÁR, 2002).
Estudos envolvendo células de carcinoma hepático (HCC) demonstraram
que a maioria destas células secreta altos níveis de MMPs, principalmente MMP-9
e MMP-2 (YAMAMOTO et al, 1997; McKENNA et al, 2002).
Em conclusão, nossos resultados demonstram que as toxinas estudadas
apresentam atividade citotóxica in vitro nas linhagens testadas, e que as
modificações químicas na BthTX-I interferem no efeito citotóxico da proteína.
A inibição do crescimento do tumor sólido S180 em camundongos tratados
com BthTX-I ou BthTX-I BPB foram similares, sugerindo que o mecanismo
71
antitumoral da toxina deve ser independente de sua atividade citotóxica.
Provavelmente, a estimulação do sistema imune pela BthTX-I ou BthTX-I BPB
esteja envolvida na diminuição da progressão do tumor sólido (S180) em
camundongos.
72
55.. RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAASS
ABU-SINNA, G.; ESMAT, A. Y.; AL-ZAHABY, A. S.; et al. Fractionation and
characterization of Cerastes cerastes cerastes snake venom and the antitumor
action of its lethal and non-lethal fractions. Toxicon, 42; 207-15, 2003.
ADAM, J. K.; ODHAV, B.; BHOOLA, K. D. Immune response in cancer.
Pharmacol. & Ther., 99:113-32, 2003.
ANDRIÃO-ESCARSO, S. H.; SOARES, A. M.; RODRIGUES, V. M.; et al.
Myotoxic phospholipase A2 in Bothrops snake venom: Effect of chemical
modifications on the enzymatic and pharmacological properties of bothropstoxins
from Bothrops jararacussu. Biochimie, 82: 755-63, 2000.
BALLOW, M.; NELSON, R. Immunopharmacology - immunomodulation and immunotherapy. JAMA., 278: 2008-17,1997.
BRAGANÇA, B. M.; Biologically active component of cobra venom in relation to
cancer research. Indian J. Med. Res., 64: 1197-1207, 1976.
CALMETTE, A.; SAENZ, A.; COSTIL, L. Effects du venim de cobra sur les greffes
cancereuses et le cancer spontane (adeno-carcinome) de la souris. Acad. Sci.
197: 205-17, 1933.
CARNEIRO, A. S.; RIBEIRO, O. G.; FRANCO, M.;et al. Local inflammatory
reaction induced by Bothrops jararaca venom differs in mice select for acute
inflammatory response. Toxicon, 40: 1571-9, 2002.
CARVALHO, D. D.; SCHMITMEIER, S.; NOVELLO, J. C. et al. Effect of BJccL (a
lectin from the venom of snake Bothrops jararacussu) on adhesion and tumor and
endothelial cells. Toxicon, 39: 1471-6, 2001.
73
CORRÊA, M. C.; MARIA, D. A.; MOURA-DA-SILVA, A. M.; et al. Inhibition of
melanoma cells tumorigenicity by the snake venom toxin jararhagin. Toxicon, 40:
739-48, 2002.
COSTA, L. A.; FORNARI, M. C.; BERADI, V. E. et al In vivo effect of snake
phospholipase A2 (crotoxin + cardiotoxin) on serum IL-1α, TNF-α and IL-1ra level
in humans. Immunol. Letters, 75:137-41, 2001.
COTTE, C. A.; ESSENFELD-YAHIR, E.; LAIRET, C. Effect of Crotalus and
Bothrops venom on normal and malignant cells cultivated in vitro. Toxicon,
10:157-61, 1972.
CUPO, P.; AZEVEDO-MARQUES, M. M. AND HERING, S. E. Acute myocardial
infarctio-like enzyme profile in human victims of Crotalus durissus terrificus
envenoming. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 84: 447-51, 1990.
DÍAZ, C.; LEÓN, G.; RUCAVADO, A. et al. Modulation of the susceptility of human
erythrocytes to snake venom myotoxic phospholipases A2: role of negatively
charged phospholipids as potential membrane binding sites. Archives of
Biochem. and Biophys., 391: 56-64, 2001.
DÍAZ-OREIRO AND GUTIÉRREZ, J. M. Chemical modification of histidine and
lysine residues of myotoxic phospholipase A2 isolated from Bothrops asper and
Bothrops godmani snake venom: effects on enzymatic and pharmacological
properties. Toxicon, 35: 241-52, 1997.
FLETCHER, J. E.; HUBERT, M.; WIELAND, S. J. et al. Similarities and differences
in mechanisms of cardiotoxins, melittin and other myotoxins. Toxicon, 34: 1301-
11, 1996.
FODA, H. D. AND ZUCKER, S. Matrix metalloproteinases in cancer invasion,
metastasis and angiogenesis. D. D. T., 6: 478-82, 2001.
74
GUTIÉRREZ, J. M. AND LOMONTE, B. Phospholipase A2 myotoxins from
Bothrops snake venoms. Toxicon, 33:1405-24, 1995.
GUTIÉRREZ, J. M. AND OWNBY, C. L. Sketetal muscle degeneration induced by
venom phospholipase A2: insights into mechanism of local and systemic
myotoxicity. Toxicon, 12: 915-31, 2003.
ITZHAKI, R. F. AND GILL, D. M. A micro-biuret method for estimating proteins.
Anal. Biochem., 9: 401-10, 1964.
McKENNA, G. J.; CHEN, Y.; SMITH, R. M. A role for matrix metalloproteinases
and tumor host interaction in hepatocelular carcinomas. A. J. Surg., 183: 588-94,
2002.
KINI, R. M. AND EVANS, H. J. A common cytolitic region in myotoxins,
hemolysins, cardiotoxins and antibacterial peptides. Int. J. Peptide Prot. Res., 34:
277-86, 1989.
KNUDSEN, K. A.; TUSZYNKI, G.P.; HUANG, T. F. et al. Trigramin, an RGD
containing peptide from snake venom, inhibits cell-substratum adhesion of human
melanoma cells. Exp. Cell Res., 179: 42-9, 1980.
LAPIS, K. AND TÍMAR, J. Role of elastin-matrix interactions in tumor progression.
Sem. in Cancer Biol., 12:209-17, 2002.
LIU, J. J.; HUANG, T. S.; HSU, M. L. et al. Antitumor effects of the partially purified
polysaccharides from Antrodia camphorate and the mechanism of its action.
Toxicol. A. Pharmacol., 201: 186-93, 2004.
LOMONTE, B.; MORENO, E.; TARKOWSKI, A. et al. Neutralizing interaction
between heparins and myotoxin II, a lysine 49 phospholipase A2 from Bothrops
asper snake venom. Identification of a heparin-binding and cytolitic toxin region by
75
the use of synthetic peptides and molecular modeling. J. Biol. Chem. 269: 29867-
73, 1994.
LOMONTE, B.; ANGULO, Y.; RUFINI, S. et al. Comparative study of the cytolytic
activity of myotoxic phospholipase A2 on mouse endothelial (tEnd) and skeletal
muscle (C2C12) cells in vitro. Toxicon, 37:145-58, 1999.
MANCIN, A. C.; SOARES, A. M.; ANDRIÃO-ESCARSO, S. H.; et al. The
analgesic activity of crotamine, a neurotoxin from Crotalus durissus terrificus
(South merican rattlesnake) venom: a biochemical and pharmacological study.
Toxicon, 36(12): 1927-37, 1998.
MOSSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival :
application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Meth., 65: 55,
1983.
OWNBY, C. L.; SELISTRE-DE-ARAÚJO, H. S. WHITE, S. P. et al. Lysine 49
phospholipase A2 proteins. Toxicon, 37:411-45, 1999.
PARAMO, L.LOMONTE, B.; PIZARRO-CERDÁ. et al. Bactericidal activity of Lys49
and Asp49 myotoxic phospholipase A2 from Bothrops asper snake venom:
synthetic Lys49 myotoxin II-(115-129)-peptite identifies its bactericidal region. Eur.
J. Biochem., 253:452-61, 1998.
QUEIROZ, L. S. SANTO NETO, H., RODRIGUES-SIMIONI, L. et al. Muscle necrosis and regeneration after envenomation by Bothrops jararacussu snake venom. Toxicon, 22: 339-346, 1994. RENETSEDER, R.; DIJKSTRA, B.W.; HUIZINGA, K. et al. Crystal structure of bovine pancreatic phospholipase A2 covalently inhibited by p-bromo-phenacyl-bromide. J. Biol. Chem., 200:181-8, 1988.
DA SILVA-GIOTTO, M. T.; GARRAT, R. C.; OLIVA, G.; et al. Crystallographic and
spectroscopic characterization of a molecular hinge: Conformational changes in
bothropstoxinI. Proteins, 30:442-54, 1998.
76
SOARES, A. M. AND GIGLIO, J. R. Chemical modifications of phospholipases A2
from snake venoms: effects on catalytic and pharmacological properties. Toxicon,
42: 855-68, 2003.
SOARES, A. M.; RODRIGUES, V. M.; HOMSI-BRANDEBURGO, M. I.; et al A
rapid procedure for the isolation of the Lys-49 myotoxin II from Bothrops moojeni
(caissaca) venom: biochemical characterization, myotoxic and edematogenic
activity. Toxicon, 36(3): 503-14, 1998.
SOONS, R. K.; CONDREA, E.; YANG, C. C. et al. Effects of modification of
tyrosines 3 and 62(63) on enzymatic and toxicological properties of
phospholipases A2 from Naja nigricolis and Naja naja atra snake venoms.
Toxicon, 24: 679-93, 1986.
SOUZA, D. H.F.; EUGENTO, L. M.; FLETCHER, J. E. et al. Isolation and
Structural Characterization of a Cytotoxic L-Amino Acid Oxidase from Agkistrodon
contortrix laticinctus Snake Venom. Arch. Biochem. Biophys., 368: 285�90,
1999.
STANCHI, N. O.. ARIAS, D.; MARTINO, P. E. et al. 30-Day intravenous
administration of VRCT-310-ONCO in rabbits. Il Farmaco, 57: 167-70, 2002.
SZLOSAREK, P. W. AND BALKWILL, F. R. Tumour necrosis factor: A potential target for the therapy of solid tumours. L. Onco., 4:565-73, 2003.
TAKASAKI, A.; SUGAMA, A.; YANAGITA, A. et al. Effects of chemical
modification of PA-11, a phospholipase A2 from the venom of Australian king
brown snake, on its biological activities. Toxicon, 28: 107-17, 1990.
VERHEIJ, H. M.; VOLWERK, J. J.; JANSEN, E. M.; et al. Methylation of histidine-
48 in pancreatic phospholipase A2. Role of hiostidine and calcium ion in the
catalytic mechanism. Biochemistry, 39: 14714-22, 1994.
77
WARD, R. J.; MONESI, N.; ARNI, R. K. et al. Sequence of a cDNA encoding
bothropstoxin I, a myotoxic from the venom of Bothrops jararacussu. Gene, 156:
305-6, 1995.
WITKOWSKI, J.; YANG, L.; WOOD, D.; J et al. P. Migration and healing of
ligament cells under inflammatory conditions. J. Ortho. Research, 15: 269-77,
1997.
YAMAMOTO, H.; ITOH, F.; ADACHI, Y. et al. Relation of enhanced secretion of
active MMP with tumor spread in human hepatocellular .Carcinoma.
Gastroenterology, 112: 1290-6, 1997.