Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Bioquímica

Centro de Ciências BiológicasPrograma de Bolsas REUNI

Florianópolis, 23 de novembro de 2010

Proteômica

Proteômica

A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA. Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo, podendo caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares.

Proteômica é a técnica utilizada para identificar todas as proteínas expressas por um genoma em um determinado tempo/espaço com o principal objetivo de elucidar os produtos gênicos a nível protéico.

Tempo

Espaço

Núcleo

Citoplasma

Membrana

Proteômica

Proteômica

Proteômica sistemática: mapa protéico

Tecidos

Células

Compartimentos celulares

Proteômica diferencial: faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência

Desenvolvimento

Interações entre microorganismos e hospedeiros

Tratamentos

Proteômica

Áreas de pesquisa : Caracterização do câncer

1999 Proteoma do cérebro de camundongo

2006 Proteoma do hipocampo de camundongo

2005 Proteoma do complexo NMDA de camundongo em resposta à fármacos

2005 Proteoma do cérebro de rato

2008 Proteoma de hipocampo de rato sob exercício

2004 Proteoma de hipocampo humano

2001 Foi proposto pela HUPO a caracterização do Proteoma humano sob condições normais e patológicas

Área de pesquisa : Neuroproteômica – Caracterização do cérebro humano

2005 Proteoma de M.P de hipocampo de camundongo

Revistas

Etapas metodológicas

Tratamento do animal

Extração das proteínas

Espectrometria de massa

Digestão in gel

Focalização isoelétrica

Principais etapas metodológicas

Eletroforese em gel 2-DE

Isolamento de proteinas

Extração da amostra

Tampão de lise:

25 mM Tris HCl pH 7,2 10 mM CHAPS 0,5 M NaCl 5% glicerol (v/v) 1 mM PMSF

Lise mecânica da célula

Centrifugação 30 min a 12000 x g a 4º C

Proteínas nucleares

Proteínas citoplasmáticas

Proteínas membranares

Precipitado é re-extraído

SN1+ SN2

Homogenato de ptns em gelo por 20 min

Lise da célula, proteção contra proteólise e fracionamento.

Estratégias a serem tomadas: manter a amostra na menor temperatura possível e utilizar o protocolo mais simples para evitar perda protéica.

Quantificação das proteínas com 2D Quant Kit

Solução com Íon cúprico (Cu+1)

Cu+1

Cu+1

Cu+1

Cu+1

Agente colorimétrico

Cu+1

Cu+1 480 nm

Proteínas totais

MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS : Bradford, Biureto, Lowry e Smith ou BCA.

Limpeza da amostra com Clean up Kit

100 ug /ul de proteína

Solução precipitante

Centrifugação

Baseada na precipitação por TCA

Diversas moléculas são eliminadas:

-DNA, lipídeos

- Sais, detergentes

Pellet de Proteína pura

Ressuspensão das ptns em 250uL tampão de reihidratação:

7 M Uréia

2 M Tiuréia

2%(p/v) CHAPS

0.5% de IPG buffer pH 3-10

18 mM DTT

0,001% azul de bromofeno

MÉTODOS BCA:

Agentes redutores: DTT

Solubilização da amostra

Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia

Agentes Surfactantes: CHAPS

Hidratação do strip

Tiras de strip de 13 cm imobilizado com pH 3-10

Strips foram removidos

Cerâmica IEF Strips foram posicionados

Paper Pads umedecidos

Total: 15500 V/h e 25 uA/strip

Ettan IPGphor 3 Ajuste dos eletrodos

Focalicalização isoelétrica (IEF)

Separação das proteínas por pI

Gel poliacrilamida 12,5%

Cuba vertical Hoefer SE Ruby

Separação das ptns por massa

Proteínas separadas por pI e massa

1º DTT

2º Iodoacetamida

Coloração: Coomassie Blue G-250 por 24h

Fixação: 8% de ácido fosfórico, 50% de etanol por 1 hora

Eletroforese em gel bidimensional (2D)

Análise simultânea de diversas proteínas. Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes.

Separação de proteínas com eletroforese em gel 2D

Análise das imagens no gel

Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais)

Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa

Presença ou Ausência de spots

Digestão in gel

Descoloração:

25 mM bicarbonato de amônio e 50% acetonitrila

Tripsinização

(entre os resíduos de lisina e arginina)

Extração de petídeos: 50% de acetonitrila e 5% trifluoroacético

Peptídeos são secos à vácuo

Estocagem a -20ºC

Excisão dos spots

Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos.

Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas.

Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós-traducionais das proteínas.

Identificação das proteínas por Espectrometria de Massa

Amostras 2-DE

Fonte de ionização

Analisador de massa

Detector

Sistema à vácuo

Peptídios são ionizados

Os íons são dessorvidos

Peptídeos são homogenizados com pequenos compostos orgânicos

Estes compostos reagem com a matriz orgânica ácido -ciano-4-hidroxicinâmico

Espectômetro de Massa

Os íons são acelerados alcançando alta energia cinética

Colisão dos íons ao detector

Espectômetro de Massa

As massas dos fragmentos são separadas e detectadas

As massas digeridas dos peptídeos são comparadas com uma lista de massas teóricas de peptídeos oriundas das ORFs do banco de dados do genoma de um organismo

Espectômetro de Massa

Identificação de cada proteína do mapa proteômico

Proteômica

Array-based protein interaction detection

Array-based protein interaction detection

Protein microarrays

Proteomicworld.com