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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROESFERAS

DE COPOLÍMERO DE ÁCIDO LÁTICO E GLICÓLICO (PLGA)

CONTENDO SULFATO DE QUININA

LÚCIO FIGUEIRA PIMENTEL

Recife, 2004

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROESFERAS

DE COPOLÍMERO DE ÁCIDO LÁTICO E GLICÓLICO (PLGA)


Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-

-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Departamento

de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde

da Universidade Federal de Pernambuco, como pré -

requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciências

Farmacêuticas, na área de concentração em Controle e

Produção de Medicamentos.

Mestrando: Lúcio Figueira Pimentel

Orientadora: Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães - UFPE

Co-Orientadora: Profª. Drª. Vanessa Carla Furtado Mosqueira -UFOP

Recife, 2004

Dedico este trabalho

À minha mãe, Yêdda Figueira e meu

paidrastro Demóstenes Travessa, pelo exemplo

de vida, luta e vitórias conquistadas, pela

participação definitiva no meu caráter e

personalidade.

i

AGRADECIMENTOS

A Deus pela luz com a qual ilumina os caminhos que sigo em minha vida.

A minha orientadora Prof. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães, pela oportunidade, confiança,

orientações durante a realização deste trabalho, além da possibilidade de participação e

colaboração com o Grupo de Sistemas de Liberação Controlada e Vacinas (SLC).

A minha Co-orientadora Prof. Drª. Vanessa Carla Furtado Mosqueira, pelo valioso esforço na

orientação, pelo carinho e apoio na realização dos experimentos in vivo, durante o

desenvolvimento desta dissertação.

Aos professores do Programa de Pós-Graduacão em Ciências Farmacêuticas da UFPE, pela

possilidade de compartilhar seus conhecimentos e experiências durante a realização do Mestrado.

Ao Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho, Diretor do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, e ao

Prof. Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Junior, responsável pelo setor de Bioquímica, onde foi

realizada a maior parte deste trabalho, pela oportunidade de participar de uma instituição que

contribui ativamente para o desenvolviento científico e tecnológico do nosso País.

Aos funcionários do LIKA, em especial, Moises, Otaviano da Costa, Oscar, Ilma e Conceição pela

contribuição no suporte técnico, necessário na realizaçãos das pesquisas.

Ao Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto pela obtenção de amostra inicial de sulfato de quinina, para a

realização dos estudos preliminares relacionados a este trabalho.

Ao Prof. Samuel do laboratório de Hematologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas pela

contribuição na realização de microfotografias.

A minha mãe Yedda Figueira e ao meu paidrastro Desmóstenes Travessa, pelos ensinamentos

ministrados ao longo da vida, pelo suporte e apoio dispensados, necessários para a concretização

de mais uma etapa de minha carreira profissional.

ii

Aos meus irmãos Fábio e Patrícia e família, pelas horas de ausência e saudade dos momentos

sinceros de amizade e fraternidade bem vividos, imprescidíveis para a realização desta caminhada.

Aos meus amigos próximos e distantes, com os quais conto nos momentos de alegrias e tristezas,

para apoio, diversão e companheirismo, em especial a Juliana Lima Meira, pelo carinho, respeito,

compreensão e companheirismo.

Aos meus amigos do SLC, pela amizade e colaboração mútuas no desenvolvimento de nossas

atividades, o carinho e respeito individual por cada um dos componentes, em especial a Agenor

Tavares Jácome Junior, pela ajuda essencial na realização desta dissertação.

Aos meus amigos do Setor de Bioquímica e aos demais colegas dos outros laboratórios do LIKA,

em especial, Luciana Duarte, Givanildo Oliveira, Luciana da Mata, Ian Porto, Danielly Brunesca,

Diego Albuquerque, pelo incentivo, divisão de espaço, material, apoio e a possibilidade de criação

de um ambiente de trabalho propício para o desenvolvimento de nossas capacidades e realizações.

Á Roseane Maria Ribeiro Costa e Jaqueline Rodrigues da Silva, pelas orientações recebidas no

início de minhas atividades junto ao SLC, pela amizade sincera e pelo carinho recebido.

Aos colegas do Mestrado, em especial Ivana Barroso, Lívia Barreto, Daniela Lordão, Janaína

Versiani, Francisco Mendonça Junior (Chico), Severinho Granjeiro (Ceará), Valderes Almeida,

Tereza Raquel Fernandes, Líbia Bentes, Ana Amélia Lira, Risonildo Cordeiro, Pedranne Barbosa,

Lisandra Gomes pela amizade, apoio, incentivo e ajuda e no esclarecimento das dúvidas inerentes

as dúvidas surgidas durante o desenvolvimento de nossas atividades.

Á Cristina Barros, Elaine Leite e Luciano Pinto, pelo valioso apoio na realização dos testes de

atividade antimalária e minha estada na cidade de Ouro Preto.

A todos que direta e indiretamente contribuiriam para a realização desta dissertação de Mestrado,

meu sincero agradecimento.

iii

SUMÁRIO

Agradecimentos

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Lista de Abreviaturas

Lista de Siglas

Resumo

Abstract

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1

2. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 4

2.1. MALÁRIA ..................................................................................................... 5

2.1.1. Epidemiologia ........................................................................................... 6

2.1.2. Indústria Farmacêutica e Malária ............................................................. 8

2.1.3. Agentes Terapêuticos da Malária ............................................................. 9

2.2. QUININA ....................................................................................................... 11

2.2.1. Farmacocinética da Quinina ..................................................................... 11

2.2.2. Aplicações Terapêuticas ........................................................................... 12

2.2.3. Mecanismo de Ação ................................................................................. 13

2.2.4. Toxicologia da Quinina ............................................................................ 14

2.3. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS (SLC) .. 14

2.3.1. Mecanismos de Liberação do Fármaco de SLC ....................................... 17

2.3.2. Biomateria is para Sistemas de Liberação Controlada .............................. 18

iv

2.3.3. Poli(lático-co-glicólico) – PLGA ............................................................. 19

2.4. MICROPARTÍCULAS .................................................................................. 21

2.4.1. Aplicações Terapêuticas ........................................................................... 21

2.4.2. Indústria Farmacêutica e SLC .................................................................. 21

2.5. MICROENCAPSULAÇÃO ........................................................................... 23

2.5.1 Métodos de Preparação de Microesferas .................................................. 23

2.5.1.1. Métodos de Separação de Fases de Polímeros ......................................... 24

2.5.1.2. Métodos de Spray-Drying ......................................................................... 24

2.5.1.3. Métodos Utilizando Supercrítico .................................................. 25

2.5.1.4. Jateamento Sob Pressão ........................................................................... 25

2.5.1.5. Métodos de Trituração .............................................................................. 25

2.5.1.6. Sistema de Recirculação Total (TROMS) ................................................ 25

2.5.1.7. Métodos de Evaporação e Extração de Solvente ...................................... 26

2.5.1.8. Emulsão Água em Óleo em Água (Emulsão Múltipla) ............................ 27

3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 28

3.1. Geral ............................................................................................................... 29

3.2. Específicos ...................................................................................................... 29

4. ARTIGO I .......................................................................................................... 30

5. CONCLUSÕES .................................................................................................. 58

6. PERSPECTIVAS ............................................................................................... 60

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 62

v

ANEXO I

Resumos enviados para Congressos

ANEXO II

Artigos Escritos

vi

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DA LITERATURA

Figura 1. Ciclo evolutivo de Plasmodium spp. (Miller et al., 2002) 6

Figura 2. Número de casos de Malária e óbitos de todas as formas registradas no Brasil

nos anos de 1990 – 2001 (FUNASA, 2003).

7

Figura 3. a) Estrutura molecular da Quinina. b) Microfotorafia de Cristais de Sulfato de

quinina (aumento 40 ×).

11

Figura 4. Perfil farmacocinético de doses múltiplas ou em sistema de liberação controlada

de fármacos (Brannon-Peppas, 1997).

15

Figura 5. Estrutura molecular dos ácidos polilático e poliglicólico. 20

ARTIGO I

Fig. 1. Photomicrographs of quinine sulphate- loaded PLGA microspheres prepared

using multiple emulsion tequinique followed by solvent evaporation method,

with 25 mg quinine sulphate and 450 mg PLGA. a) SEM of microsphere (3500

×); b) SEM of microsphere surface (11000 ×); c) SEM of microsphere prepared

with 50 mg quinine sulphate and 450 PLGA (15500 ×), showed some crystals in

the surface of microsphere.

47

Fig. 2. In vitro relese profile of quinine sulphate from PLGA microspheres. Error bars

represent mean ± standard deviation for n=3.

48

Fig. 3. Antimalarial activity of free and microencapsulated quinine sulphate against

Plasmodium berghei-infected mice in a four-day-test. Mice were treated with 20

mg/kg/day-1 of quinine sulphate for four days with microspheres loaded with

49

vii

quinine sulphate (MS-QS) and quinine sulphate (QS) formulations. Untreated

control received saline and unloaded microspheres (MS). Each point represents

the mean ± standard deviation for ten mice.

Fig. 4. Body weight (g) of mice infected P. berghei in four-day suppresive test, treated

with quinine sulphate microspheres PLGA by subcutaneous injection of 20

mg/kg/day-1 of quinine sulphate. Each point represents the mean ± S.D. for ten

mice.

50

viii

LISTA DE TABELAS


Tabela 1. Principais fármacos antimaláricos (James, 2002) 10

Tabela 2. Principais Sistemas nanobiotecnológicos utilizados para o carreamento de

fármacos.

16

Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Microesferas. 22

ARTIGO I

Table 1 Formulation of quinine sulfate- loaded PLGA microspheres. 42

Table 2 Evaluation of the influence of the aqueous phase pH on the quinine sulphate

entrapment efficiency in PLGA microspheres.

43

Table 3 Encapsulation efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg

of polymer)

44

Table 4 Encapsulation efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg

of polymer)

45

Table 5 RBC and MST of Swiss mice infected with P. berghei treated with PLGA

microspheres loaded with quinine sulphate.

51

ix

LISTA DE ABREVIATURAS

BSA Bovine Serum Albumine (albumina sérica bovina)

CDR Controlled Drug Release System (sistema de liberação controlada de fármacos)

CEC Capillar Eletrochromatography (eletrocromatografia capilar)

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

EC Eletroforese Capilar

HPLC High Perfomance Liquid Chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência)

HSA Human Serum Albumine (albumina sérica humana)

MS Microsphere (microesfera)

MST Mean Survive Time (tempo de sobrevida médio)

Mw Mass Weight (peso molecular)

PBS Phosphate buffer saline (tampão fosfato salino)

PEG Polyethylene Glycol (polietilenoglicol)

PGA Ácido Poli-glicólico

PLA Ácido Poli- lático

PLGA Copolímero de ácido lático e glicólico

PVA Poly vinyl alcohol (álcool polivinílico)

QS Quinine sulphate (sulfato de quinina)

QS-MS Quinine sulphate Microspheres (microesferas de sulfato de quinina)

RBC Red Blood Cell (células vermelhas do sangue)

SD Stardard Deviation (desvio padrão)

SEM Scanning Electron Microscopy (microscopia eletrônica de varredura)

SFC Supercritical Fluid Chromatography (Cromatografia de flúido supercrítico)

SLC Sistema de Liberação Controlada

x

LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS

Siglas

FDA Food and Drug Administration (Agência de Controle de Alimentos e Medicamentos

dos Estados Unidos)

FUNASA Fundação Nacional de Saúde

GFATM Global Fund to Figth AIDS, Tuberculose and Malaria (Fundo Global de combate a

AIDS, Tuberculose e Malária)

LIKA Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami

MIM Multilateral Initiative on Malaria (Iniciativas Multilaterais em Malária)

MMV Medicines for Malaria Venture (Medicamentos para Malária)

RBM “Roll Back Malaria” (Regressão da malária)

xi

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de novas formulações microencapsuladas

de sulfato de quinina, para utilização na terapia antimalárica. A caracterização físico-química destas

micropartículas, a avaliação da cinética de liberação in vitro, um estudo preliminar de estabilidade e

a avaliação da atividade antimalárica in vivo foram realizados. Microesferas de copolímero de ácido

lático e glicólico associada ao antimalárico sulfato de quinina (QS-MS) foram obtidas pelo método

de emulsão múltipla, seguido de evaporação do solvente. A morfologia das microesferas foi

avaliada por microscopia óptica e eletrônica de varredura. A formulação otimizada foi utilizada para

a determinação do perfil cinético de liberação pela técnica de dissolução das microesferas em um

meio tampão fosfato 7,4. Doseamentos por CLAE foram realizados para determinar o sulfato de

quinina. O estudo preliminar de estabilidade foi realizado pela medida da perda de sulfato de

quinina das microesferas ao longo do tempo, quando estocadas a 25ºC. A atividade antimalárica in

vivo foi avaliada em fêmeas de camundongos Swiss, infectados com Plasmodium berghei no teste

de supressão em 4 dias. Os animais foram tratados com sulfato de quinina livre e sulfato de quinina

microencapsulado nas microesferas. Um grupo de animais não tratados e um grupo de animais

tratados com microesferas placebo foram utilizados como controle. As microesferas de PLGA

contendo sulfato de quinina apresentaram formato esférico, com superfície lisa, homogeneas e

tamanho de partícula com diâmetro médio de 3,53 ± 1,53 µm. A eficiências de encapsulação foi de

50,34 ± 0,62%. As microesferas liofilizadas mostraram-se estáveis por 230 dias quando

armazenadas a 25ºC. O perfil cinético da liberação in vitro de sulfato de quinina microencapsulado

exibiu um comportamento bimodal. Uma rápida liberação inicial de 40% foi observada na primeira

hora, seguido de uma liberação gradual atingindo um máximo de 73% em 144 horas. Microesferas

de sulfato de quinina administradas pela via subcutânea em camundongos não foram capazes de

reduzir a infecção por P. berghei na dose de 20 mg/kg/dia, por 4 dias. Entretanto, uma dose de 120

mg/kg/dia foi utilizada e os primeiros resultados demonstram que esta dose pode ser utilizada para

determinar a atividade antimalárica da formulação. Uma formulação parenteral de sulfato de

quinina microencapsulada pode ser utilizada como uma estratégia para a obtenção de um sistema de

liberação controlada do fármaco para o tratamento da malária.

xii

ABSTRACT

The aim of this work is the development of new microencapsulated formulations of quinine

sulphate intended for the antimalarial therapy. The physicochemical characterization of these

microparticles, their in vitro kinetic release, preliminary stability study, and their in vivo

antimalarial activity were evaluated. The polylactide-co-glycolide microspheres associated with

quinine sulphate (QS-MS) were obtained through a multiple emulsion, followed by solvent

evaporation method. The morphology of the microspheres were evaluated by optical and scanning

electron microscopy. . The optimized formulation was used to determine the release kinetic profile

of quinine from the optimized formulation was determined by the dissolution technique with

phosphate buffer 7.4 medium. A High Performance Liquid Chromatography (HPLC) assay was

used to determine the quinine sulphate content. A preliminary stability studies was performed by

following the lost of quinine sulphate content in the microspheres at 25ºC. The in vivo antimalarial

activity was evaluated in female Swiss mice infected with Plasmodium berghei by the four-day

suppressive test. The animals were treated with free and quinine-sulphate- loaded microspheres. The

untreated animal group and a group treated with unloaded microspheres were used as a control. The

quinine-sulphate-loaded microspheres showed spherical shaped particles with a smooth surface,

homogeneity, and particle size with a mean diameter of 3.53 ± 1.53 µm. The encapsulation

efficiency was 50.34 ± 0.62%. Lyophilized microspheres presented stability over 230 days, when

stored at 25ºC. The in vitro release profile of quinine-sulphate- loaded microspheres exhibited a

bimodal behavior. A burst effect of 42% was observed in the first hour, followed by a gradual drug

release, achieving a release of 72% after 144 hours. Microspheres of quinine sulphate administered

by subcutaneous route in mice were not able to reduce the infection of P. berghei at dose of 20

mg/kg/day for four days. However, a dose of 120 mg/kg/day was used in the same test and the first

achievements shown that such a dose can used to investigate the antimalarial activity of

formulation. A parenteral formulation of quinine sulphate- loaded microspheres is therefore offered

as a strategy to achieve a controlled delivering for the malaria treatment.

INTRODUÇÃO

Pimentel, L. F. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático.... 2

1. INTRODUÇÃO

A Malária é uma doença parasitária de grande impacto no mundo, sendo considerada um dos

maiores problemas de Saúde Pública, com 300 a 500 milhões de casos clínicos por ano no mundo e

com mais de um milhão de mortes. A malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium e

transmitida pela picada de mosquitos vetores em humanos, onde quatro espécies são responsáveis

pela infecção, P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale (OMS, 1999; Krettli et al., 2001;

Gomes et al., 2001).

Assim a malária é um problema de saúde constante, devendo-se incentivar a pesquisa

contínua de novos fármacos com atividade antimalárica, técnicas de melhoria da ação terapêutica

das drogas já existentes, novos esquemas de tratamento, controle do vetor e desenvolvimento de

vacina. Além da garantia de uma farmacoterapia adequada, evita-se assim o aumento da resistência

aos inseticidas e fármacos já existentes.

O sulfato de quinina é o fármaco de escolha para a grande maioria de casos de malária

falciparum resistente a cloroquina, porém a quinina possui baixa margem de segurança terapêutica e

seu emprego como antimalárico geralmente está associado à elevada incidência de efeitos tóxicos, o

que limita o seu uso na terapêutica. Quando a quinina é administrada repetidamente em doses

terapêuticas plenas, pode ocorrer um grupo de sintomas típicos relacionados à dose, denominada

Chinchonismo (James e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000).

Promissores agentes terapêuticos com características restritivas que limitam seu uso podem

ter um melhor aproveitamento, se técnicas apropriadas de microencapsulação forem desenvolvidas

para sobrepor estes inconvenientes intrínsecos. Estas técnicas são normalmente utilizadas para

aumentar a estabilidade de materiais, reduzir os efeitos tóxicos ou aumentar a liberação do agente

para diferentes aplicações em vários campos da produção (Benoit et al., 1996; Santos e Castanho,

2002; Dunne et al., 2003).


Sistemas de Liberação Controlada (SLC), podem ser definidos como aqueles nos quais o

agente ativo é liberado independentemente de fatores externos e com uma cinética bem estabelecida

(Baker, 1987). Entre as vantagens que os SLC podem oferecer, podemos citar o aumento da eficácia

terapêutica, liberação progressiva e controlada do fármaco, manutenção de níveis do fármaco com

faixas desejáveis e diminuição significativa da toxicidade (Brannon-Peppas, 1997; Durán e

Azevedo, 2002).

O desenvolvimento de formas farmacêuticas de liberação controladas por

microencapsulamento de sulfato de quinina, poderá permitir um melhor controle da cinética de

liberação do fármaco, resultando em níveis plasmáticos terapêuticos com baixas flutuações da

concentração do ativo e menor efeito tóxico, podendo consistir num passo importante para o

desenvolvimento de uma nova terapêutica antimalárica.

Esta Dissertação de Mestrado é constituída de uma revisão da literatura com tópicos sobre a

malária, sulfato de quinina, sistemas de liberação controlada e processos de obtenção de

micropartículas. Possui o artigo “IN VIVO ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE

SULPHATE-LOADED PLGA MICROSPHERES” escrito com base nos resultados obtidos no

trabalho científico realizado.

O artigo intitulado “NANOTECNOLOGIA APLICADA AO CONTROLE E COMBATE

DA MALÁRIA” foi submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. O referido artigo é

uma revisão da literatura, com abordagens sobre a malária, terapêutica atual e a aplicação da

nanotecnologia como ferramenta alternativa para o controle e combate da malária.


2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. MALÁRIA

A malária é uma doença causada por protozoários do gênero Plasmodium e transmitida pela

picada de insetos vetores em humanos. A doença ocorre principalmente nos países tropicais, onde

quatro espécies infectam o homem, P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale (Krettli et al.,

2001). É caracterizada por quadros de febre alta contínua (38,5 a 40,0ºC) ou em paroxismos febris

que apresentam quatro períodos sucessivos: o de frio, calor, de suor e apirexia (James e Leslie,

1996), acompanhada por cefaléia ocasional, náuseas, vômitos, astenia, fadiga e anorexia. (Gomes et

al., 2001).

Das espécies de Plasmodium existentes três ocorrem em humanos no Brasil: P. falciparum

causa a forma de malária mais severa, podendo ser rapidamente fatal se os indivíduos não forem

tratados. O P. vivax , registra o maior número de casos, causando cerca de 80% dos registros da

doença, de acordo com o Ministério da Saúde, com raros casos de morte. O P. malariae, o de menor

prevalência. Este protozoário causa uma malária fraca, mas pode causar nefrite fatal (Krettli et al.,

2001; James, 2002).

Os mosquitos vetores do Plasmodium spp pertencem ao gênero Anopheles (classe Insecta,

ordem Diptera, família Culicidade), onde apenas as fêmeas do mosquito têm o hábito hematofágico

tendo, portanto, capacidade de transmissão. Estas quando infectadas, ao picar o homem, durante o

repasto sanguíneo, inoculam na pele, os esporozoítos (forma infectante). O esporozoíto penetra a

pele, alcançando a corrente sanguínea, concentra-se no fígado e invade os hepatócitos. Nestas

células o esporozoíto multiplica-se em um processo conhecido como esquizogonia intra-hepática,

originando esquizontes teciduais ou hepáticos (forma evolutiva) ou diferenciam-se em merozoítos

(forma infectante de eritócidos). Os merozoítos ganham os capilares intra-hepáticos e na corrente

sanguínea invadem os eritrócitos, nos quais se transformam em trofozoítas (forma evolutiva), que


crescem e sofrem divisão nuclear, passando a esquizontes sanguíneos, que após nova divisão

(esquizogonia), originarão novos merozoítos que irão reiniciar o ciclo. Alguns merozoítos

diferenciam-se em gametócitos femininos e masculinos (forma reprodutiva), que amadurecerão e

irão contaminar a fêmea do Anopheles quando este picar o homem enfermo, onde seguirão o ciclo

evolutivo naquele inseto, até uma nova contaminação no homem (Figura 1) (Krettli e Miller, 2001;

Gomes et al., 2001).

Figura 1. Ciclo evolutivo de Plasmodium spp. (Miller et al., 2002)

2.1.1. Epidemiologia

A malária é uma protozoose com ocorrência em cerca de 103 países, estando expostas

próximo a 2,5 bilhões de pessoas no mundo, incidindo na maioria das regiões tropicais. É endêmica

no Sudoeste da Ásia, nas Américas Central e do Sul e na Oceania. Os países da África, a Índia e o

Brasil são os países com o maior números de casos no mundo (Krettli et al., 2001; Gome et al.,

2001).


De acordo com dados da Fundação Nacional de Saúde, em 2000, registaram-se 613.239

casos da doença no País, sendo 99,4% destes na Amazônia Legal. Os estados com maior número de

casos foram: Pará (278.203), Amazonas (96.026), Maranhão (78.817) e Rondônia (54.074), os quais

contabilizaram 83% dos acometimentos de malária do país (FUNASA, 2001). As condições sócio-

econômicas e ambientais da região amazônica favorecem a proliferação do mosquito e,

conseqüentemente, a exposição à contaminação de grandes contingentes populacionais (FUNASA,

2002a).

No Brasil o numero de casos de malária nos últimos 10 anos foi em média, pouco mais de

500 mil casos por ano, de acordo com dados do Ministério da Saúde, Fundação Nacional de Saúde e

Centro Nacional de Epidemiologia (Figura 2) (FUNASA, 2003).

Figura 2. Número de casos de Malária e óbitos de todas as formas registradas no Brasil nos anos de

1990 – 2001.


A África Sub-Sahara, é a região onde são registrados o maior número de casos, com cerca

de 270 milhões de casos por ano, com quase um milhão de mortes, dos quais 5% são crianças com

menos de cinco anos de idade. Entretanto, acredita-se que este números possa estar subestimado,

devido ao registro de morte de crianças por infecções respiratórias, diarréia e má nutrição, que

tiveram seus quadros clínicos agravados pela malária concomitante (OMS, 1999).

2.1.2. Indústria Farmacêutica e Malária

A maioria das Indústrias Farmacêuticas não desenvolve pesquisa de novos fármacos contra a

malária ou de uma vacina. Estima-se que apenas três delas façam pesquisa em malária, devido ao

alto custo de investimento e baixa rentabilidade no desenvolvimento de novos agentes antimaláricos

(Dias, 2002; Sachs, 2002). De acordo com Trouiller e colaboradores, 2002, no período de 1975 a

1999, dos 1.393 novos compostos químicos comercializados no mundo, apenas 13 eram destinados

a doenças tropicais, sendo quatro destes com atividade antimalárica.

Algumas iniciativas estão sendo realizadas para o combate e controle da doença. Dentre as

mais significativas estão a da Organização Mundial de Saúde, que em 1998, criou o programa

Rolling Back Malaria (Recuar a Malária), que foi lançado em consórcio com o Banco Mundial,

Programa de Desenvolvimento das Nações Unidas e Fundo de Assistência Infantil das Nações

Unidas. Outras iniciativas para o descobrimento de novos fármacos, desenvolvimento de vacinas e

aumento do financiamento de ações de controle foram lançados. A Iniciativa Multilateral em

Malária - MIM em 1997, Medicamentos para Malária - MMV em 1999 e o Fundo Global de

combate aAIDS, tuberculose e malária - GFATM, lançado em janeiro de 2002 constituem alguns

programas de cotrole e combate a malária (Sachs, 2002).

A OMS recomenda um gasto mundial de pelo menos um bilhão de dólares por ano na

prevenção e combate a malária, sendo que a maioria deste valor, deveria ser aplicado na África.


Estima-se ainda que somente na África os benefícios a curto prazo com o controle da malária

seriam entre 3 a 12 bilhões de dólares por ano (OMS, 2000).

No ano de 1999, o Governo Brasileiro destinou um investimento total da ordem de 145,7

milhões de reais em ações de combate a malária, com o objetivo geral de reduzir a magnitude da

doença em 50% até o ano de 2002 (FUNASA, 2002).

2.1.3. Agentes Terapêuticos da Málaria

Entre os agentes terapêuticos altamente eficazes com ação contra os parasitas da malária

estão a cloroquina, quinina, quinidina, mefloquina, halofantrina, pirimetamida, sulfonamidas,

sulfonas, tetraciclinas e primaquina. Os antimaláricos podem ser classificados pelo estágio do

parasita que afetam e o objetivo clínico correspondente ou mecanismo de ação (Tab. 1).

Das quatro espécies de parasitas que afetam o homem o Plamodium falciparum é o mais

perigoso. Este parasita tem mostrado a capacidade de desenvo lver resistência aos antimaláricos

atualmente utilizados. A cloroquina permanece como o antimalárico mais utilizado, porém tem

apresentado falhas contra a malária falciparum em muitas áreas tropicais do planeta (OMS, 1999).

Desde os primeiros registros de malária falciparum resistente a cloroquina no sudoeste da

África e na América do Sul a quase um século atrás, o problema da resistência dos Plasmodium à

fármacos tem sido considerado como o principal problema no controle da malária. A quinina é

atualmente reservada como um fármaco de segunda ou terceira escolha para a malária e o fármaco

de escolha nos casos de malária não grave ou complicada (Wongsrichanalai et al 2002 ; Sachs,

2002).

No Brasil, o Ministério da Saúde, através da FUNASA e seu programa de controle de

endemias, estabeleceu que para os casos de malária não grave ou complicada por P. falciparum

resistente a cloroquina, o tratamento será realizado com o uso de quinina em monoterapia ou em


associação com outros quimioterápicos como a doxiciciclina, tetraciclina, clindamicina e

primaquina (FUNASA, 2001).

Tabela 1. Principais fármacos antimaláricos (James, 2002)

Grupo de Antimaláricos

Principais Fármacos

Atividade

Alcalóides Chinchona Quinina

4-Metanolquinolinas

Quinidina

Esquizonticida sangüíneo de rápida ação. Alguma atividade gametocida.

Meloquina Esquizonticida sangüíneo. Cloroquina Hidroxicloroquina

4-Aminoquinolinas

Amodiaquina

Esquizonticida sangüíneo de rápida ação. Alguma atividade gametocida.

Primaquina 8-Aminoquinolinas Tafenoquina

Esquizonticida tecidual. Atividade gametocida e alguma atividade em outros estágios do ciclo de vida do parasita.

Biguanidas Proguanil Esquizonticida tecidual, esquizonticida sangüíneo de ação lenta. Alguma ação esporocida. Inibidor da dihidrofolato redutase.

Diaminopiridinas Pirimetamina Esquizonticida tecidual e esquizonticida sangüíneo de ação lenta. Alguma ação esporocida. Inibidor da dihidrofolato redutase. Usualmente utilizado com antimaláricos que inibem diferentes estágios da folato sintetase (sulfonamidas ou sulfonas) em combinações sinérgicas.

Diclorobenzilidinas Lumefantrina Esquizonticida sangüíneo. Hidroxinaftoquinonas Atavaquona Esquizonticida sangüíneo, usualmente dado em

combinação com o proguanil. 9-fenantrenometano Halofantrina Esquizonticida sangüíneo. Lactonas Sesquiterpênicas

Artemisinina e seus derivados

Esquizonticida sangüíneo.

Sulfodoxina Sulfonamidas Sulfametopirazina

Esquizonticida sangüíneo. Inibidor da dihidropteroato e folato sintase. Usualmente dado em combinação com a pirimetamina.

Doxiciclina Tetraciclinas Tetraciclina

Esquizonticida sangüíneo, alguma atividade esquizonticida tecidual.

Lincosamidas Clindamicina Esquizonticida sangüíneo, alguma atividade esquizonticida tecidual.

Sulfonas Dapsona Esquizonticida sangüíneo. Inibidor da folato sintetase. Usualmente dado em combinação com a pirimetamida.

2.2. QUININA

A quinina é o principal alcalóide extraído das diversas espécies de chinchona, pertencentes à

família das rubiáceas, naturais da América do Sul. Com fórmula molecular C20H24N2O2 (8α, 9R-6´-


metoxichinchonan-9-ol), (Figura 3A). Possui massa molecular de 324,42 g, ponto de fusão de 177

ºC, pKa 5,07 e 9,7 a 18ºC. Apresenta-se como cristais ortorrômbicos e luminescentes pela

cristalização com álcool. Sendo pouco solúvel em água, completamente solúvel em uma mistura de

etanol e clorofórmio (1:3), solúvel em álcool, benzeno, clorofórmio, éter e glicerol, porém é

insolúvel em éter de petróleo (Moffat et al., 1986; The Index Merck, 1996).

A quinina encontra-se sob a forma de base livre ou formando diversos sais, como sulfato,

bissulfato, bromidrato, dibromidrato, cloridrato, dicloridrato, carbonato, salicilato. O sulfato de

quinina com fórmula molecular (C20H24N2O2)2 • H2SO4 • 2 H2O e massa molecular de 782,9 g,

apresenta-se como pó cristalino branco, inodoro ou cristais ortorrômbicos ou aciculares coloridos

(Figura 3B), com pKa de 4,1 e 8,5 a 20 ºC . Sua solubilidade aproxima-se à do alcalóide base

(Moffat et al., 1986; The Index Merck, 1996).

Figura 3. a) Estrutura molecular da Quinina. b) Microfotorafia de Cristais de Sulfato de quinina

(aumento 40 ×).

2.2.1. Farmacocinética da Quinina

A quinina e seus sais são rapidamente absorvidos quando administrados por via oral ou

intramuscular. No primeiro caso, a absorção ocorre principalmente a partir do intestino delgado

superior, com mais de 80% de absorção. As concentrações plasmáticas de pico são alcançadas em

aproximadamente 3 horas, com um volume aparente de 1,5 litro por quilograma em indivíduos

saudáveis, declinando com uma meia vida de aproximadamente 11 horas após a interrupção da

terapia (James e Leslie, 1996; James, 2002).

a) b)


A ligação protéica é de 70% em indivíduos sadios, mas pode aumentar para 90% em muitos

pacientes com malária. A farmacocinética da quinina é alterada significativamente com a infecção

malárica, o maior efeito está na redução do volume aparente de distribuição e da depuração

sistêmica (James e Leslie, 1996; James, 2002). A quinina é extensivamente metabolizada no fígado

através de enzimas presentes no sistema Citocromo P450, estando sujeita a reações de hidroxilação

nos anéis quinolínicos. É excretada na urina, e estima-se que 5 a 20% da dose administrada seja

excretada de forma inalterada (Vieira e Mídio, 2000).

2.2.2. Aplicações Terapêuticas

A atividade antimalárica da quinina está largamente descrita na literatura, com os primeiros

registros de uso datandos de mais de 350 anos, por um monge agostiniano de Lima no Peru, sendo

incluída somente em 1677 na “London Pharmacopoeia” como “Cortex peruanus” (James e Leslie,

1996; Foley e Tilley, 1998).

Age principalmente como esquizonticida sangüíneo, tem pouco efeito nos esporozoítos ou

formas pré-eritrocitárias dos parasitas. É gametocida para o P. vivax e o P. malariae, mas não para

o P. falciparum, não sendo utilizada para a profilaxia devido o seu espectro de atividade, porém é

utilizada como agente supressivo e terapêutico. Apesar de sua toxicidade potencial, a quinina

permanece como o esquizontocida sangüíneo prototípico para o tratamento supressivo e cura da

malária falciparum resistente a cloroquina e a múltiplos fármacos (James e Leslie, 1996).

De acordo com a literatura além da ação antimalárica, a quinina foi utilizada como

analgésico, antipirético, anestésico local e abortivo. Contudo diante da sua baixa margem de

segurança terapêutica, tais indicações tornaram-se obsoletas. Ainda existem relatos do uso para a

ativação da circulação cerebral e periférica em associação com a papaverina. (THE INDEX

MERCK, 1996; James e Leslie, 1996;Vieira e Mídio, 2000; James, 2002;).


Segundo McCalley et al., (2002) a quinina também é utilizada na produção de bebidas

refrigerantes do tipo tônica, em concentrações variadas e com a função de conferir sabor amargo,

com esta mesma função, o alcalóide é utilizado em comprimidos de paracetamol para desencorajar

o uso inadequado e abusivo do medicamento. Sendo utilizada ainda como matéria prima para a

síntese de quinidina (antiarrítimico cardíaco e tratamento da fibrilação atrial).

Os alcalóides da chinchona, principalmente a quinina e a quinidina são utilizados como

seletores de troca iônica em diferentes técnicas de separação como a Cromatografia líquida de alta

performance (CLAE), Cromatografia em Fluído Super Crítico (SFC), Eletroforese Capilar (EC) e

Eletrocromatografia Capilar (CEC) (Franco et al., 2000).

A quinina produz o relaxamento dos músculos esqueléticos, aumentando o período de

refratividade por agir diretamente sobre a fibra muscular, diminuindo a excitabilidade da placa

terminal motora em uma ação semelhante ao curare, sendo assim relatado o uso na cãibra noturna

idiopática, provocando o alívio sintomático da miotonia congênita. No entanto, o seu uso é de

indicação restrita, pois pode causar uma alarmante angústia respiratória e disfagia em pacientes com

miastenia grave (Barajas-Lopes e Huizinga, 1989; James e Leslie, 1996).

2.2.3. Mecanismo de Ação

O mecanismo de ação da quinina, ainda não está totalmente elucidado, a teoria mais aceita é

baseada no fato da quinina por ser uma base fraca, concentrando-se nos vacúolos alimentares ácidos

do Plasmodium. Nestas organelas, a quinina inibi a atividade enzimática da heme polimerase,

responsável pela polimerização do grupo heme a hemozoína e dessa forma permite o acúmulo do

seu substrato tóxico, o heme. Ainda não foi estabelecido se o heme induz citotoxicidade por si só ou

em complexo com a quinina (Chou e Fitch, 1993; Vieira e Mídio, 2000).


2.2.4. Toxicologia da Quinina

A quinina possui baixo índice terapêutico, seu emprego como antimalárico geralmente está

associado à elevada incidência de efeitos tóxicos. Quando a quinina é dada repetidamente em doses

terapêuticas plenas, pode ocorrer um grupo de sintomas típicos relacionados à dose, denominado

Chinchonismo (James e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000). O Chinchonismo é caracterizado por

zumbidos, audição abafada, cefaléia, náuseas e distúrbios visuais. Entretanto, quando a medicação é

continuada, ou após grandes doses únicas, podem aparecer manifestações gastrintestinais,

cardiovasculares e dérmicas (FUNASA, 2001). Os distúrbios gastrintestinais são proeminentes entre

eles a náusea, vômitos, dor abdominal e diarréia resultante da ação irritativa local da quinina, efeitos

dérmicos também podem ocorrer, a pele freqüentemente apresenta-se quente e vermelha. Erupções

aparecem com freqüência. Angioedema, especialmente da face, ocasionalmente é observado (James

e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000; James, 2002).

A literatura é unânime em caracterizar a hipoglicemia pelo uso de quinina, através de seu

poderoso efeito estimulante nas células β-pancreáticas. Esta complicação pode ser potencialmente

fatal na gravidez e na infecção grave. Outros efeitos colaterais estão associados ao sistema

cardiovascular, sendo citados a hipotensão ortostática, anormalidades na repolarização atrial,

taquicardia ventricular com evolução a fibrilação ventricular e óbito por parada cardíaca (James e

Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000; FUNASA, 2001; James, 2002).

2.3. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS (SLC)

Até agora, o uso de alguns interessantes e promissores agentes terapêuticos tem sido

limitado na clínica por causa de suas restritivas características físico-químicas, como a degradação

do agente terapêutico, baixa solubilidade, necessidade de freqüentes administrações, efeitos

colaterais inerentes a sua utilização em concentrações elevadas. É possível que estas substâncias

possam ter um melhor aproveitamento, se técnicas apropriadas de microencapsulação forem


desenvolvidas para sobrepor estes inconvenientes intrínsecos (Benoit et al., 1996; Santos e

Castanho, 2002).

As formas farmacêuticas convencionais como injetáveis ou sólidos orais possuem pouco

controle sobre o modo de liberação do agente terapêutico, as quais em muitas situações, podem

resultar em condições não previsíveis e às vezes, concentrações plasmáticas sub ou supra-

terapêuticas, podendo levar a efeitos adversos (Verma e Garg, 2001; Durán e Azevedo, 2002). Cada

fármaco possui uma faixa de ação terapêutica acima da qual ela é potencialmente tóxica e abaixo da

qual ela é ineficaz, o chamado índice terapêutico, os níveis plasmáticos são dependentes das doses e

dos intervalos de tempo em que são administrados. Este fato é problemático para os fármacos de

baixo índice terapêutico.

Os SLC promovem uma concent ração uniforme do agente terapêutico no sítio de absorção e

assim, permite a manutenção das concentrações plasmáticas na faixa terapêutica, minimizando os

efeitos adversos e reduzindo a freqüência de administração (Figura 4).

Figura 4. Perfil farmacocinético de doses múltiplas ou em sistema de liberação controlada de

fármacos (Brannon-Peppas, 1997).

Sistemas de Liberação Controlada podem ser definidos como aqueles nos quais o agente

ativo é liberado independentemente de fatores externos e com uma cinética bem estabelecida


(Baker, 1987). A liberação do agente ativo pode ser constante por um longo período, cíclica em um

longo período ou ainda ser condicionada para ser iniciada por evento predeterminado. Em qualquer

um dos casos, o propósito do controle da liberação do fármaco é alcançar uma terapia mais efetiva

enquanto se elimina o potencial de baixa ou superdosagem (Brannon-Peppas, 1997). Podem ainda

serem do tipo sítio direcionados, pela conjugação com anticorpos que possuem ação contra

componentes específicos do sítio alvo. (Torchilin et al., 2001). A Tabela 2 apresenta os principais

sistemas carreadores de fármacos.

Tabela 2. Principais Sistemas nanobiotecnológicos utilizados para o carreamento de fármacos.

Sistema Definição Referência

Lipossomas São vesículas submicroscópicas, geralmente compostas

por bicamadas lipídicas (glicerofosfolipídios,

principalmente a fosfatidilcolina) ao redor de um

compartimento aquoso e podem ser estabilizadas por

colesterol.

Gabriels e Plaizier-

Vercammen., 2003

Microesferas Micropartículas monolíticas ou matriciais com tamanhos

entre 1 a 1000 µm, com o fármaco adsorvido em suas

superfícies, dissolvido ou disperso na rede polimérica.

Ahsan et al., 2002

Microcápsulas Micropartículas do tipo reservatório, com tamanhos entre

1 a 1000 µm, onde o fármaco encontra-se encapsulado

em um núcleo.

Ahsan et al., 2002

Nanoesferas Sistemas Coloidais matriciais submicrômicos, nos quais

o fármaco encontra-se disperso ou dissolvido nas

partículas, geralmente composto de polímeros.

Brigger et al., 2002

Nanocápsulas Sistemas Coloidais vesiculares submicrômicos, em que o

fármaco está confinado em uma cavidade aquosa ou

oleosa, estabilizada por uma simples membrana

polimérica.

Brigger et al., 2002


Um SLC ideal deve ser inerte, biocompatível, mecanicamente resistente, confortável para o

paciente, capaz de encapsular uma grande quantidade de fármaco, estar livre da possibilidade de

liberações acidentais, ser de simples administração, remoção, de fácil fabricação e esterilização. Em

conclusão os SLC representam um desenvolvimento relativamente novo e têm o objetivo de

prolongar e melhorar o controle da administração de fármacos (Durán e Azevedo, 2002; Brannon-

Peppas, 1997).

Entre as vantagens que os SLC podem oferecer, podemos citar o aumento da eficácia

terapêutica, liberação progressiva e controlada do fármaco, manutenção de níveis do fármaco com

faixas desejáveis, diminuição significativa da toxicidade, diminuição da instabilidade e

decomposição de fármacos sensíveis, possibilidade de direcionamento a alvos específicos,

possibilidade de incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofilicas nos dispositivos,

menor necessidade de administrações, uso otimizado do fármaco e aumento da aceitação da terapia

pelo paciente (Brannon-Peppas, 1997; Durán e Azevedo, 2002).

2.3.1. Mecanismos de Liberação do Fármaco de SLC

Dependendo do tipo de polímero e planejamento de obtenção do dispositivo, diferentes

processos físico-químicos podem estar envolvidos no controle da liberação do fármaco. Existem

três mecanismos primários pelos quais agentes ativos podem ser liberados de um sistema: a difusão,

a degradação do sistema ou ainda a combinação destes.

A difusão ocorre quando o fármaco ou outro agente ativo passa através do polímero que

forma o dispositivo de liberação. A difusão pode ocorrer na escala macroscópica, através de poros

na matriz polimérica ou a um nível molecular, pela passagem entre as cadeias poliméricas (Schaefer

e Singh, 2002). A difusão do fármaco através da matriz polimérica, esta condicionada a outras

propriedades específicas da molécula do fármaco como coeficiente de difusibilidade no polímero,


solubilidade, tamanho da molécula, distribuição do fármaco na matriz polimérica e interações

específicas com o polímero (Ghaderi et al., 1996; Faisant et al., 2002).

Na degradação do sistema, a quebra de ligações éster por hidrólise, a solubilidade do

fármaco, taxa de difusão do fármaco, são fatores que influenciam no controle de liberação.

2.3.2. Excipientes para Sistemas de Liberação Controlada

O termo polímero refere-se a grandes moléculas (macromoléculas), caracterizadas pelo seu

tamanho, estrutura química e interação intra e intermoleculares. Possuem unidades ligadas por

covalência, repetidas regularmente ao longo da cadeia, denominados “monômeros”. Sua estrutura

depende do monômero ou monômeros utilizados em sua preparação. Quando apenas uma pequena

quantidade de unidades monoméricas estão juntas resulta em um polímero de baixo peso molecular

denominado oligômero (Stevens, 1999).

Os polímeros biodegradáveis são susceptíveis de degradação por processos biológicos

naturais, eliminando a necessidade de remoção dos mesmos. Assim estes polímeros são assim

designados por degradarem em meio aquoso como nos fluídos corpóreos, por hidrólise de suas

cadeias poliméricas em compostos biologicamente aceitáveis e progressivamente menores

metabolizáveis pelo organismo. (Brennon-Peppas, 1997; Giunchedi, et al., 1998).

Uma grande variedade de polímeros naturais e sintéticos biodegradáveis ou não foram

estudados para a liberação prolongada de fármacos ou direcionamento sítio específico. Entretanto,

apenas poucos destes são biocompatíveis. Polímeros naturais como a albumina sérica bovina

(BSA), a albumina sérica humana (HSA), o colágeno, a gelatina e a hemoglobina já foram

estudados para liberação de fármacos. Estes polímeros têm uso limitado, devido os altos custos e

pela variação de pureza, consequentemente, os polímeros sintéticos biodegradáveis vêm recebendo

uma significante atenção nesta área (Jain, 2000; Hans e Lowman, 2002).


Os polímeros biodegradáveis são conhecidos por sua biocompatibilidade e reabsorção por

mecanismos naturais, além de permitirem que as taxas de degradação e a taxa de liberação do

fármaco encapsulado possam sofrer manipulação pela variação da relação entre seus monômeros

(Brannon-Peppas, 1997; Jain, 2000).

Alguns destes materiais são frequentemente utilizados ou estudados para liberação de

fármacos incluindo o álcool polivinílico, poliacrilamindas, poli-alquil-α-cianoacrilatos,

polietilenoglicol, poli-metil-metacrilatos. Além destes, poliesters termoplásticos alifáticos como

polilático (PLA) o poliglicólico (PGA) e seus copolímeros, especialmente o poli- lático-co-glicólico

(PLGA) tem gerado um grande interesse devido as suas excelentes biocompatibilidade e

biodegradabilidade e terem sido aprovados pela Agência de Vigilância Sanitária Americana, a Food

and Drug Adminitration (FDA), para uso em liberação de fármacos. Vários dispositivos poliméricos

como microesferas, microcápsulas, nanopartículas, pellets, implantes e filmes têm sido formulados

usando este polímero para a liberação de uma variedade de classes de fármacos (Jain, 2000; Hans e

Lowman, 2002; Faisant et al., 2002).

2.3.3. Poli(lático-co-glicólico) - PLGA

Copolímeros são definidos como polímeros compostos de muitas unidades de monômeros e

são classificados em quatro tipos, de acordo com a disposição de seus monômeros: copolímeros

randômicos, copolímeros alternados, copolímeros enxertados e copolímeros em bloco (Kumar et

al., 2001).

Os copolímeros de PLGA são formados por unidades monoméricas de ácido polilático e

poliglicólico (Figura 5). Possuem propriedades desejáveis como, taxa constante de biodegradação,

morfologia, resistência mecânica, cristalinidade e geometria regular de cadeias individuais (Jain,

2000; Hans e Lowman, 2002; Cai et al., 2003). Os entendimentos das propriedades físicas,

químicas e biológicas dos polímeros são úteis na formulação de dispositivos de liberação


controlada. As várias propriedades do polímero e do fármaco encapsulado influenciam diretamente

em outros fatores como a seleção do processo de microencapsulação ou taxa de liberação do

fármaco do polímero (Jain, 2000; Hans e Lowman, 2002).

Figura 5. Estrutura molecular dos ácidos polilático e poliglicólico.

O ácido lático é mais hidrofóbico que o ácido glicólico e assim copolímeros de PLGA ricos

em ácido lático são menos hidrofílicos, absorvem menos água e assim degradam mais lentamente.

Polímero de PLGA contendo relações de 50:50 de ácido lático e glicólico são hidrolisados com

maior velocidade que aqueles que contém elevadas proporções de um dos monômeros (Jain, 2000).

A degradação da matriz de PLGA ocorre em meio através da quebra de ligações a uma taxa

uniforme. A maior parte da literatura indica que a biodegradação do PLGA não envolve nenhuma

atividade enzimática, sendo puramente por meio de hidrólise. O PLGA é biodegradado em ácido

lático e glicólico. O ácido lático entra no ciclo do ácido tricarboxílico e é metabolizado e

subseqüentemente eliminado do organismo como dióxido de carbono e água. O ácido glicólico é

excretato inalterado pelos rins ou entra no ciclo do ácido tricarboxílico, sendo eventualmente

eliminado como dióxido de carbono e água (Giunchedi, et al 1998; Jain, 2000).


2.4. MICROPARTÍCULAS

Micropartículas podem ser definidas como formas de dosagem onde os dispositivos estão na

faixa de 1 a 1000 µm, e podem ser de dois tipos, as microcápsulas e as microesferas, os primeiros

são sistemas reservatórios micrométricos, onde é possível identificar um núcleo diferenciado, o qual

pode ser sólido ou líquido. Neste caso, a substância encontra-se envolvida por uma parede,

geralmente polimérica, isolando o núcleo do meio externo, por outro lado as microesferas são

sistemas matriciais micrométricos, onde o fármaco encontra-se disperso ou solubilizado no interior

da matriz polimérica. Desde que micropartículas foram desenvolvidas para o controle da liberação

de fármacos após a sua administração oral, o desenvolvimento de micropartículas contendo

fármacos mostrou-se uma alternativa promissora para a redução da freqüência de administração

(Lamprecht, 2000; Ashan et al., 2002).

2.4.1. Aplicações Terapêuticas

Micropartículas de PLGA, em particular, são importantes sistemas de liberação de fármacos,

nos quais vários perfis de liberação podem ser obtidos pelo ajuste da composição do PLGA, seu

peso molecular, fármaco encapsulado, tamanho da microesfera. Alguns fármacos formulados em

dispositivos já foram introduzidos no mercado e muitos se encontram em ensaios clínicos

(Brannon-Peppas, 1995; Jain, 2000). Algumas destas aplicações estão listadas na Tabela 3.

2.4.2. Industria Farmacêutica e SLC

Atualmente, a Indústria Farmacêutica está presa entre a guerra de preços reduzidos e o

aumento dos custos na descoberta e desenvolvimento de novos fármacos. A magnitude dos custos e

o tempo de desenvolvimento para uma nova entidade química são muitos altos (aproximadamente,

500 milhões de dólares e de 10 a 12 anos) quando comparados aos requeridos para o

desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos (20 a 50 milhões de dólares e de 3 a 4


anos). De modo que estes novos sistemas podem proporcionar a uma molécula já existente uma

nova vida e com isso aumentar o seu valor comercial e competitividade, além de estender a validade

de sua patente.

Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Microesferas.

Agente Ativo Polímero Utilizado

Via de Adm. Referência

5-fluorouracil PLGA - Faisant et al., 2002

Aciclovir PDLLA e PLGA Intravitral Conti et al., 1997

Antígeno HS de Brucella ovis PLGA, PCL Oral Murillo et al., 2002

Camptotecina PLGA Injetável Ertl et al., 1999

Cidofovir PLGA Tópica Santoyo et al., 2002

Darbeopoetin alfa PLGA - Herberger et al., 2003

Diazepam PLGA Oral Giunchedi et al., 1998

Desferrioxamina PLGA - Schlicher et al., 1997

Etoposídio PLGA Injetável Shaefer e Singh, 2002

Fentamil PLGA Injetável Choi et al., 2002

Fisostigmina PLGA Oral Chaw et al., 2003

Fosforilcolina PLGA Mucosa Nasal Fattal et al., 2002

Gentamicina PLGA Injetável Blanco-Príeto et al., 2002

Peptídio gp120 PLGA - Cleland et al., 1997

Irpriflavona PLGA Oral Perugini et al., 2003

Isoniazida PLGA Subcutânea Dutt e Khuller, 2001

Levonorgestrel e etinilestradiol PCL Intramuscular Dhanaraju et al., 2003

Merlasoprol PCL Oral Gibaud et al., 2002

Nalbufina PLGA Injetável Liu at al, 2003

Plasmídio de DNA PLGA Intramuscular Del-Barrio et al., 2003

Rodamina B PLG - Berkland et al., 2001

Antígeno SPf66 PLGA Intranasal Carcaboso et al.,2004

Antígeno SPf66 PLGA Oral Carcaboso et al., 2003

Sulfasalazina e Betametasona PLGA e PCL Oral Lamprecht et al., 2000

Sulfato de Salbutamol PLGA - Erden et al., 1996 (-) não informado.


A venda de produtos de liberação controlada de fármacos foi avaliada em torno de 22

bilhões de dólares no mundo todo e espera-se que o seu crescimento no presente século, seja de 120

bilhões em 2007 (Verma e Garg, 2001). Algumas empresas desenvolveram inúmeras pesquisas

utilizando a nanobiotecnologia para a formulação de sistemas microparticulados, com a obtenção de

SLC patenteados e que já se encontram no mercado, são exemplos o Ceform da Fuisz Technology

Ltd., USA; Phamazone da Elan Corporation, ProLease e Medisorb da Alkermes Inc., USA;

Microsponge e Retino-A-Micro da Advanced Polymer Systens Inc., USA; Oligosphere da

Macromed, Inc. (Verma e Garg, 2001).

2.5. MICROENCAPSULAÇÃO

A microencpasulação de agentes bioativos envolve processos complexos que permitem

incorporar a um sistema contendo um agente ativo propriedades funcionais e “inteligentes” , como a

liberação controlada por uma condição ou um meio específico. Uma tecnologia de ponta como a

microencapsulação, tem grande valor estratégico para o País, por oferecer produtos com maior valor

agregado, levando ao aumento da competitividade da indústria na disputa de mercados nacionais ou

internacionais (Ré, 2000).

Técnicas de microencapsulação são normalmente utilizadas para aumentar a estabilidade de

materiais, reduzir os efeitos tóxicos ou aumentar a liberação do agente para diferentes aplicações

em vários campos da produção (Dunne et al., 2003). A incorporação de medicamentos já existentes

em novos sistemas de liberação pode significar o aumento de sua performance em termos de

eficiência, segurança e aceitação pelo paciente. (Benoit et al., 1996; Verma e Garg, 2001).

2.5.1 Métodos de Preparação de Microesferas

Microesferas podem ser preparadas por diferentes métodos. Estes foram desenvolvidos e

otimizados ao longo dos anos, entre estas técnicas podemos citar: a separação de fases,


emulsificação seguida de extração do solvente, técnicas utilizando spray drying; uso de fluído

supercrítico ou ainda métodos isentos do uso de solventes orgânicos. A escolha da técnica depende

da natureza do polímero, do fármaco, do fim a que se destina e da duração do tratamento.

Os métodos de microencapsulação empregados devem garantir a estabilidade e a atividade

biológica do agente ativo, ter elevada eficiência de encapsulação, reprodução da qualidade e perfil

de liberação, sob limites especificados (Jain, 2000).

Os métodos mais empregados para a preparação de microesferas poliméricas são a

separação de fases e as técnicas de remoção de solvente. Dependendo do modo como o solvente é

evaporado, este último pode ser subdividido em evaporação do solvente, extração do solvente,

spray-drying, ou ainda utilizando a tecnologia de fluído supercrítico. A evaporação de solvente é a

técnica mais utilizada para a preparação de micropartículas de poliesteres (Benoit et al., 1996;

Giunchedi et al., 1998; Herrmann e Bodmeier, 1998; Jain, 2000).

2.5.1.1. Métodos de Separação de Fases de Polímeros

Também conhecido como coacervação, é uma excelente técnica para o encapsulamento de

fármacos solúveis em água como peptídios, proteínas ou vacinas, também pode ser utilizado para

fármacos insolúveis em água. Este processo consiste na diminuição da solubilidade do polímero

encapsulante pela adição de um terceiro componente na solução orgânica contendo o polímero

dissolvido (Benoit et al., 1996).

2.5.1.2. Métodos de Spray-Drying

Nebulização ou spray drying é um método muito utilizado na indústria farmacêutica,

envolve condições brandas, pouca dependência dos parâmetros de solubilidade e altas taxas de

encapsulamento. O princípio consiste na nebulização ou atomização de uma solução (contendo o


fármaco a ser encapsulado) por ar comprimido ou nitrogênio através de um câmara de dessecação e

secagem através de uma corrente de ar quente (Conti et al., 1997).

2.5.1.3. Métodos Utilizando Fluído Supercrítico

A técnica de uso de fluídos em temperaturas e pressões que excedam o seu ponto crítico,

utilizado-os como meio extrativo, está bem demostrada. Em microencapsulação este método pode

ser utilizando, aspergindo-se uma solução orgânica contendo um princípio ativo em uma coluna

contendo fluído supercrítico, o solvente orgânico será extraído pelo fluído em condições

supercríticas, formado as microesferas (Benoit et al., 1996).

2.5.1.4. Injeção Sob Pressão

Berckland e colaboradores (2001) desenvolveram, um sistema relativamente simples que

provoca jatos sob pressão controlada de uma solução polimérica contendo o fármaco solubilizado

através de uma agulha, sob excitação acústica controlada, produzindo micropartículas de tamanho

uniforme com desvios de apenas 1,0 a 1,5 µm da média em 95% das microesferas.

2.5.1.5. Métodos de Trituração

A preparação de micropartículas sem o uso de solventes baseia-se em triturar partículas do

polímero. O polímero em pó sofre uma prévia fusão, seguida da redução do tamanho e pode ser

completada por um processo de esferonização, que consiste em promover o degaste das partículas

de modo a obter uma forma arredondada (Herrmann e Bodmeier, 1998).

2.5.1.6. Sistema de Recirculação Total (TROMS)

Este método evita o uso de técnicas agressivas de homogenização, podendo ser utilizado

para agentes que necessitem conservar a sua integridade estrutural. Utiliza um equipamento


composto por um sistema complexo de bombas, válvulas e agulhas que permite a injeção de uma

fase orgânica em uma aquosa, sob recirculação para obtenção de emulsões, as quais são

homogeneizadas, com subseqüente evaporação do solvente orgânico e formação das microesferas

(Del-Barrio et al., 2003).

2.5.1.7. Métodos de Evaporação e Extração de Solvente

De um modo geral, o polímero é dissolvido em um adequado solvente imiscível com a água,

o princípio ativo a ser encapsulado é então disperso ou dissolvido nesta fase orgânica para formar

uma suspensão ou solução. Esta é então emulsificada em uma fase contínua aquosa constituída de

um não solvente do polímero. Devendo ainda conter um tensoativo apropriado para estabilizar a

emulsão. No processo de homogeneização por agitação, o solvente evapora após difusão através da

fase contínua na interface água/ar. Quando a evaporação do solvente ocorre, as microesferas

tornam-se rígidas e podem ser resgatadas por filtração ou centrifugação, sendo ainda lavadas e secas

de modo adequado (O’Donnell e McGinity, 1997).

A formação das microesferas pode ser afetada por muitos fatores. Entre as principais

variáveis, estão a natureza e solubilidade do fármaco a ser encapsulado, a concentração, a

composição, o peso molecular do polímero, a relação entre o polímero e o fármaco utilizada, a

solubilidade do fármaco, o solvente orgânico utilizado, concentração e a natureza do tensoativo

utilizado, a temperatura, a taxa de difusão, a velocidade de agitação usada no processo de

emulsificação, viscosidade e relação entre a fase dispersa e a contínua. Na emulsificação seguida de

evaporação do solvente, o uso de uma emulsão simples é mais apropriado para fármacos que são

insolúveis em água ou pouco solúveis em meio aquoso (Benoit et al., 1996; O’Donnell e McGinity,

1997; Jain, 2000).

Algumas estratégias permitem a redução da perda de princípio ativo e aumento da taxa de

encapsulação, como o uso de co-solventes, modificação química ou ainda ajuste de pH da fase


aquosa externa. Entretanto todas estas estratégias trazem alguns inconvenientes, sendo que para

agentes ativos solúveis em água o uso de emulsões múltiplas é a melhor alternativa para a obtenção

de microesferas (O’Donnell e McGinity, 1997, Jain, 2000).

2.5.1.8. Emulsão Água em Óleo em Água (Emulsão Múltipla)

Neste sistema, o princípio ativo pode ser incorporado em uma solução aquosa, a qual é

colocada em contato com a solução orgânica contendo o polímero para formar uma emulsão do tipo

água em óleo (W/O). Esta emulsão primária é então emulsificada em uma fase aquosa externa

levando a formação de uma emulsão múltipla do tipo água em óleo em água (W/O/W). A fase

orgânica irá atuar como uma barreira entre os dois compartimentos aquosos prevenindo a difusão do

fármaco para a fase aquosa externa. Esta emulsão é então submetida à remoção do solvente por

processos de evaporação do solvente. As microesferas solidificadas obtidas são então lavadas e

coletadas por filtração ou centrifugação. Estas são então secas sob condições apropriadas,

resultando no produto microsférico final (Ghaderi et al., 1996; Jain, 2000).

OBJETIVOS


3. OBJETIVOS

3.1. Geral

O presente trabalho visa o desenvolvimento de formulações microencapsuladas de sulfato de

quinina, para a sua utilização na terapia antimalárica.

3.2. Específicos

♦ Obter e caracterizar físico-químicamente microesferas de PLGA contendo sulfato de

quinina;

♦ Realizar um estudo preliminar de estabilidade das formulações

♦ Avaliar a cinética de liberação in vitro de sulfato de quinina microencapsulado;

♦ Determinar a atividade antimalárica in vivo de sulfato de quinina microencapsulado;

ARTIGO I

Pimentel, L. F. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático .... 31

4. ARTIGO I

ATIVIDADE ANTIMALÁRICA IN VIVO DE MICROESFERAS DE PLGA



IN VIVO ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE

SULPHATE-LOADED PLGA MICROSPHERES

Lúcio Figueira Pimentel1,2, Vanessa Carla Furtado Mosqueira3, Nereide Stela Santos-Magalhães1,4*

1Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami

(LIKA), Recife, PE, Brazil

2Departamento de Ciências Farmacêuticas (UFPE)

3Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), Departamento de Farmácia, Ouro Preto, MG, Brazil

4Departamento de Bioquímica (UFPE)

Keywords: Malaria; Plasmodium falciparum; Quinine sulphate; PLGA microspheres; Antimalarial

activity

* Corresponding author

Dr. Nereide Stela Santos Magalhães

Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

Grupo de Sistemas de Liberação Controlada de Medicamentos e Vacinas

Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA)

Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária,

50670-901, Recife, PE, Brazil

Tel: +55 81 21268484; Fax: +55 81 21268485

E-mail: [email protected]


Abstract

Quinine sulphate is the drug of choice for the treatment of the most cases of chloroquine resistant

falciparum malaria. However, the quinine has a low therapeutic index and its use at large dose is

usually associated with severe side effects, such as cinchonism. In order to circumvent this

drawback, quinine sulphate- loaded microspheres were prepared and the antimalarial activity was

investigated on mice infected with Plasmodium berghei. Quinine sulphate- loaded microspheres

prepared using the double emulsion technique presented spherical shaped particles ranging from

1.53 to 7.65 µm. The drug encapsulation efficiency attained 50.34 ± 0.62%. The in vitro release

profile of quinine sulphate from microspheres showed a bimodal behavior. A burst effect of 42%

was initial observed, followed by a gradual drug release achieving 72% within 144 h. Microspheres

administered in mice by subcutaneous route were at least as efficient as the free quinine sulphate

administered by s.c. injection at 20 mg/kg for four days. Nevertheless, no efficacy improvement

was achieved with microencapsulation of quinine sulphate. A parenteral microsphere-based

formulation of quinine sulphate is however feasible, which can ensue a potential strategy to achieve

a controlled therapeutic effect in the treatment of malaria.


1. Introduction

The malaria is a worldwide spread disease, which afflict and kill million people in the world.

Drug resistance is probably the major drawback to achieve a successful malaria control. Since the

emergence of multidrug-resistant falciparum malaria, the search for new antimalarial drugs and

more efficient treatments involving drugs combinations are urgently needed [1]. About 40% of the

world’s population lives in malaria-endemic areas [2]. Population of high contamination risk is that

living under poverty, isolation, and inadequate health services with delay in receiving appropriate

treatment [3]. The WHO estimates the prevalence of this disease in order of 300 million new

clinical cases per year and it is predicted that two million people will pass away each year due to

malaria [4]. Malaria is even believed as a major obstacle to the development and the economic

advancement of countries within the tropical Africa [3].

Plasmodium falciparum malaria causes annually hundred of thousand of death, and a large

proportion of morbidity [5,6]. P. falciparum is the most pathogenic among the four species that

infect humans, and is the principal cause of severe disease, since the other species of malaria rarely

cause death or persistent sequela [2]. It is encountered throughout the tropics, and has developed

resistance to almost all presently available drugs. Resistance has severely limited the use of

chloroquine for P. falciparum [7]. Chloroquine-resistance is widespread, however quinine has been

used to treat malaria for more than 350 years, and moderate resistance has only recently developed

in limited geographic areas [8,9]. Quinine is consequently an effective replacement for chloroquine

and remains a first- line drug for the treatment of falciparum malaria, including severe cases [7, 10].

Suggested regimens by WHO are based on quinine administered intravenously or intramuscularly

for the treatment of severe malaria in both children and adults [2, 11].

There are several pharmacological factors that may have contributed to the upholding

efficacy of the quinine. First, it quite often causes annoying side effects, so people are unlikely to


take the drug unless absolutely necessary. Second, quinine has a relatively short elimination half-

life (11 hours) [12]. That requirement for repeated administrations, less probability of

subtherapeutic concentrations in the blood stream and little evolutionary selective resistance [8].

Quinine has a small therapeutic index, and its use is often associated with side effects such

as fever, confusion, respiratory arrest, and arrhythmias. Even standard doses produce symptoms of

“cinchonism,” i.e., tinnitus, giddiness, blurred vision. Hypoglycaemia and hypotension are further

more serious side effects of a rapid administration of quinine [13].

These constraints reduce the patient compliance and the usefulness of quinine in P.

falciparum treatment. In this way, a controlled release dosage forms may be valuable to improve the

efficacy of this drug by reducing the frequency of administrations and by decreasing plasma level

fluctuations [14]. Controlled delivery systems provide more uniform concentration of drug at the

absorption site and are able to maintain plasma concentration within the therapeutic range.

Simultaneously, they minimize side effects, and improve patient compliance to treatment. The

drugs associated to these formulations could present more suitable administration regimens and

habitually are less toxic when compared with the free drug administration [15].

A variety of synthetic biodegradable polymers have long been used to develop controlled

drug delivery systems. Biodegradable microspheres prepared from a copolymer of poly(lactic-co-

glycolic acid) (PLGA) have been used as oral or injectable drug delivery systems [15]. The

adjustable degradation rate of these biodegradable devices provides an efficient means to control

and prolong the release of encapsulation of a variety of compounds [16].

Ogawa et al., 1988 [17], developed a water- in-oil- in-water (w/o/w) emulsion technique to

encapsulate water soluble active agents with higher efficiency. Since then, several studies report on

the encapsulation of hidrophylic drugs into microspheres using this technique [13,18-22].

The water solubility property of quinine sulphate turn it into a actual candidate to be loaded

in microspheres prepared by the water-oil-water double emulsion method, which is suitable for


parenteral administration. It is expected that this kind of formulation could able to modify the

pharmacokinetics of the entrapped drug, producing sustained drug blood concentration.

An attempt was thus made in this study to develop and characterize a formulation of poly

(D,L-lactide)-co-glycolide microspheres containing quinine sulphate as a controlled release system

for the treatment of malaria. Their in vitro kinetic profile and their in vivo efficacy were evaluated

on mice infected with P. berghei using a four-day standard test.

2. Materials and Methods

2.1. Materials

Poly (D,L- lactide-co-glycolide) acid (PLGA) 50:50 (0.17 dl.g-1), was purchased from

Birmingham Polymers Inc. (Alabama, USA); Poly vinyl alcohol (PVA, MW. 30 000-70 000);

Polyethylene Glycol (PEG, mw. 4000), D (+) Trehalose dihydrate and standard quinine sulphate

were obtained from Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, USA). Quinine sulphate was obtained from

Henrifarma (São Paulo, Brazil). HPLC grade acetonitrile, analytical grade solvents and reagents

were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). Ultrapure water was obtained by a Milli-Q

purification System from Millipore (Molshein, France). Plamodium berghei strains were kindly

supplied by Dr. Érika Martins Braga, from the Department of Parasitology of the Federal University

of Minas Gerais, Brazil.

2.2. Methods

2.2.1. Preparation of empty and quinine sulphate–loaded PLGA microspheres

The microspheres were formulated according to the modified method previously described

[23], using the double emulsion solvent evaporation technique. Several batches were developed by


modifying the continuous phase pH, the polymer/drug ratio, and the solvent organic phase volume,

as an attempt to derive more stable formulations (Table1).

Briefly, PLGA (450 mg) was dissolved in methylene chloride (8, 10 or 12 ml) and

homogenized with several amounts of quinine sulphate (QS) (10, 25 or 50 mg) dissolved in

deionized water (five milliliters) with PEG 4000 (400 mg), using a mechanical homogenizer (Ultra-

Turrax T25, Ika, Germany) at 8,000 rpm for 60 seconds in an ice bath, resulting in a simple

emulsion (w/o). The result ing emulsion was added to a continuous phase constituted of 50 ml PVA

solution (0.5% w/v) at pH (6, 8, 9 or 10) adjusted with diethylamine solution (10% w/v) and

emulsified at 8,000 rpm for 30 seconds, resulting in a double emulsion (w/o/w). This emulsion was

then stirred with a four-blade propeller (Mechanic stirrer RE 162/P, IKA, Germany) at room’s

temperature at 400 rpm for four hours to allow the solvent evaporation followed by the

microspheres formation. The microspheres were collected by centrifugation (Kubota KN-70

centrifuge, Japan) at 3,000 rpm for five minutes and washed three times with 20 ml of deionized

water. Microspheres were finally dispersed with 1.0 % threalose aqueous solution (w/v), which was

frozen overnight at –80ºC before lyphilisation (EZ-DRY, FTS System, New York, USA) operated

at 200 bars for 16 hours. Unloaded microspheres were prepared under the identical conditions. The

PLGA-microspheres were stored at 25ºC ± 2 ºC in vacuum desiccators.

2.2.2. Characterization of quinine sulphate-loaded microspheres

Morphological Analysis

The morphology of microspheres was analyzed by light microscopy (Olympus CH-2, USA)

to evaluate the microsphere homogeneity and the particle size. The average particle size was

visually determined by counting 200 microspheres. The shape and surface morphology of dried

microspheres were examined by scanning electron microscopy (SEM), using an electron


microscope (JSM-T200, JEOL, Japan). A sample of lyophilized microspheres was ressuspended in

distilled water to obtain a homogeneous suspension, dry in vacuum desiccators, and placed in a

surface of a metallic support, which was coated with colloidal gold using a sputter module in a

high-vacuum evaporator (JFC-1100, JOEL, Japan). Microspheres were then examined and

photographed under the microscope at 10 kV.

Quinine sulphate assay by HPLC Method

The Pharmacopoeia method [24] was adapted to quantify the quinine sulphate content using

a computer-assisted HPLC System (Shimadzu SCL-6B, Japan) composed of a UV/VIS detector and

manual injector with a 20 µl loop. The chromatographic run was performed using a µBondapack

C18 column (10 µm particle size, 125 Å porous size, 300 mm × 3.9 mm I.D. Waters, USA) and a

mobile phase of HPLC grade acetonitrile/ultrapure water (Milipore ultra pure water system) / 10%

diethylamine solution (w/v)/ 10% orthophosphoric acid solution (w/v) (80:16:2:2), pH adjusted to

2.6 with 10% orthophosphoric acid solution (w/v). Sample aliquots (20 µl) were injected and eluted

with the mobile phase at a flow rate of 1.5 ml.min–1. The quinine sulphate peak was verified at a

wavelength of 250 nm (0.005 a.u.f.s.) with a retention time of about 4.5 min. The amount of quinine

sultafe into microspheres was determined through the standard calibration curve, which was

prepared for concentrations varying from 2.5 µg.ml–1 to 50 µg.ml–1. A stocked standard solution (1

mg.ml–1) was prepared with ten milligrams of standard quinine sulphate in 50 ml of mobile phase.

Each experiment was performed in triplicate.

Content of quinine sulphate and encapsulation efficiency

Accurately weighed samples of loaded microspheres (5 mg) were dissolved in methylene

chloride (10 ml) under ultrasound agitation for 15 minutes with the aim of determining the drug

content after the dissolution of microspheres. One milliliter of resulting solution was diluted with


five milliliters of HPLC mobile phase, filtered through a 0.45 µm membrane filter (Millipore) and

injected into an HPLC system to obtain the drug concentration.

The entrapment efficiency was evaluated from the ratio of the quinine sulphate content into

the microspheres and the theoretical amount of this drug into microspheres, calculated by the

quinine sulphate amount used for preparation of microspheres.

Percentage entrapment efficiency (%) = esmicrospher into QS ofcontent lTheoreticaesmicrospher intocontent sulphate Quinine

× 100

Preliminary stability studies of quinine sulphate loaded-microspheres

A preliminary stability studies of quinine sulphate encapsulated into lyophilized PLGA

microspheres was performed by measuring the lost of quinine sulphate content in the microspheres

along the time, when the microspheres were stored at 25ºC. At pre-determined time intervals,

samples of microspheres were collected and morphological characteristics were observed. Assay by

HPLC method was used to determine the quinine sulphate content in the microspheres as above

described.

In vitro kinetic release of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres

The in vitro release profile of quinine sulphate from microspheres was determined along

with the procedure by Herrmann and Bodmeier, 1998 [14]. Drug- loaded PLGA microspheres (5

mg) were resuspended in five milliliters of 20 mM phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4). The

tubes were incubated in a horizontal shaker with a water bath (Polytest 20, Bioblock Scientific

86507) at 37ºC ± 1ºC and shaken at 180 rev.min–1 with samples intervals (1, 24, 48, 72, 96, 120 and

144 hours). Samples of two milliliters of the dissolution medium were withdrawn and centrifuged at

2,800 rpm for five minutes in order to separate any microsphere present in the sample. The

supernatant was removed and the amount of quinine sulphate was measured by the above described


HPLC method. Assays were performed in triplicates and results were expressed in percentage of the

mean values and their corresponding standard deviations.

2.2.3. Antimalarial activity of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres

The in vivo antimalarial activity of quinine sulphate- loaded PLGA microspheres was

determined by means of the "four-day suppressive test" described by Peters et al., 1975 [25]. Tests

were performed against Plasmodium berghei NK-65, which is sensitive to all current antimalarial

drugs and is characterized by a high mortality in mice, providing thus a suitable model to estimate

efficacy in reducing parasitemia. This strain was frozen stored in liquid nitrogen with glycerolyte. It

was also maintained through weekly blood passages in mice infected by intraperitoneal route (i.p.)

using the heparin as an anticoagulant in saline solution.

Female, seven week aged, adult Swiss albino mice weighing 27 ± 3 g from “Ouro Preto

Federal University animal facility” were inoculated by retro orbital route with 1×106 Plasmodium

berghei infected-red blood cells in 0.2 ml inoculum’s obtained from the donor mouse with rising

parasitaemia. Animals were firstly infected on the day namely zero (D+0), and were randomly

divided in four groups of ten animals per cage.

Two hours later, the treatment started with four consecutive daily doses of quinine sulphate

microspheres (20 mg/kg per day); or unloaded microspheres; quinine sulphate solution (20 mg/kg

per day) as a free drug. Untreated controls received 0.5 ml of saline (0.9%) by s.c. route. All

microspheres preparations were subcutaneously (s.c.) administered in 0.5 ml of suspens ion with

saline 0.9% and 0.1% Tween 80.

Thin blood smears were made from tail blood from untreated controls and from treated

animals on the days (D+4, D+6, D+8 and D+10), fixed with methanol, and stained with Giemsa.

Levels of parasitemia (the percentage of infected erythrocytes, ring stages and schizonts) were


microscopically determined (magnification 1,000×) by examining 3,000 cells. The percentage of

parasitemia suppression was calculated for each group in comparison with infected non treated

control group.

At days 5, 7 and 9, the red blood cell content (RBC) of treated animals was indirectly

estimated by hematocrit percentage and compared with the untreated groups. The parasitemia

levels, the variation in body weight from D0 to the D10, and the mean survival time were used to

evaluate the in vivo antimalarial activity.

2.2.4. Statistics

All erythrocyte counts and parasitemia levels are expressed as mean value ± S.D (n= number

of surviving mice at a determined time of treatment). The parasitemia data were analyzed by the

one-way ANOVA test. Mean survival times were compared using Student's t-test considering a

significance level of 5%.

3. Results and discussion

3.1. Preparation of quinine sulphate-loaded microspheres

Pre-formulation studies were performed to guide the choice of the concentrations of

constituents for obtaining stable formulation of quinine sulphate- loaded microspheres. The

preparations conditions of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres are listed in Tables 2 to 4.

The solvent evaporation method is a basic technique to prepare microspheres and involves

two major steps, namely the formation of stable droplets of the drug-containing polymer solution

and the subsequent removal of solvent from these droplets. Some factors can make hard this

manufacturing, such as the polymer concentration, the solvent nature, the phase volume ratio of

organic and aqueous phases, the continuous phase pH, the used stabilizer, the time and stirring

speed, etc. [15, 26, 27]. Some of these effects were investigated, but further information is required

to elucidate the complete processes of microspheres formation.


Table 1

Formulation of quinine sulfate- loaded PLGA microspheres.

Formulations

Constituents

1 2 3 4 5 6 7 8

PLGA 50:50 (g) 450 450 450 450 450 450 450 450

Quinine sulphate (g) 25 25 25 25 50 10 25 25

PEG 4000 (mg) 400 400 400 400 400 400 400 400

PVA solution 0.5% (w/v) (ml) 50 50 50 50 50 50 50 50

pH of PVA solution 0.5% 6 9 10 11 10 10 10 10

Methylene choride (ml) 10 10 10 10 10 10 8 12


The effect of the pH of the aqueous phase on the second emulsification process was

examined (Table 2). It was observed that the pH of the external aqueous phase plays an important

role on the entrapment efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres. The alkaline pH of

the external phase raises the retention of drug in the internal aqueous phase during the

manufacturing of microspheres by the double emulsion method. This strategy was used in

accordance with Bodmeier and McGinity [27], to reduce drug loss in external aqueous phase. The

effect of the continuous phase pH in the encapsulation efficiency of the quinine sulphate in PLGA

microspheres was similar at pH 9 and 11, but increased at pH 10, achieving the highest

encapsulation rate (50.34 ± 0.62).

Table 2

Evaluation of the influence of the aqueous phase pH on the quinine sulphate entrapment efficiency

in PLGA microspheres.

pH of the aqueous

continuous phase

Quinine sulphate encapsulation rate (%)

6 30.57± 0.60

9 47.01 ± 0.33

10 50.34 ± 0.62

11 44.73 ± 2.86

Data: mean ± S.D. (standard deviation), n=3.

The low encapsulation efficiency could be explained by the hidrophilicity of quinine

sulphate, its affinity to the aqueous phase and a much higher tendency to diffuse into water phases.

Quinine has two basic nitrogen atoms of pKa approximately 4.3 and 8.5 (the quinoline nitrogen


having the lower basicity). The molecule is thus likely to be at least partially protonated over the

whole pH range between two and eight [28]. This effect allows decreasing the solubility of drug in

alkaline solutions, and subsequently limiting potential drug loss into the external PVA solution.

Previous investigations described that the loss of the encapsulated hydrophilic active agent

during the microspheres formation process essentially resulted from its diffusion in the inner water

phase to the outer water phase [29]. Furthermore, the entrapment efficiency can be affected by the

stability of o/w and w/o/w emulsions, the solvent removal rate, the interactions among drug,

polymer and solvent, and particle size [30].

Despite the fact of the quinine sulphate physicochemical properties include photo sensibility

and chemical instability, an encapsulation of (10, 25 or 50 mg) quinine sulphate was achieved into

microspheres prepared with 450 mg of PLGA and pH 10 of external aqueous phase. At the 1:18

drug-polymer ratio, the best quinine sulphate encapsulation efficiency (50.34 ± 0.62) and more

stable microspheres were attained for an initial payload of 25 mg of QS. The encapsulation

efficiency of the quinine sulphate into PLGA microspheres for different drug-polymer ratio is

presented in Table 4. The encapsulation efficiency decreases at higher quinine sulphate

concentrations achieving 41.2 for a 1:9 drug-polymer ratio.

Table 3

Encapsulation efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg of polymer)

Quinine sulphate amount (mg) Encapsulation Efficiency (%)

10 43.41 ± 0.70

25 50.34 ± 0.62

50 41.21 ± 0.87



The influence of the solvent volume at a constant aqueous phase volume on the QS-MS

encapsulation efficiency was evaluated as shown in Table 3. Methylene chloride was used in the

organic phase because of its ease removal, and excellent ability to dissolve polymer and allow the

microspheres formation. The drug encapsulation efficiency decreased when eight or twelve

milliliters was used. This can probably be accounted for the primary emulsion instability and the

diffusion of quinine sulphate amount not emulsified to the external aqueous phase during the

solvent evaporation step, explaining the low encapsulation efficiency obtained. Some publications

have evaluated the relevance of the primary emulsification stage for increasing entrapment

efficiency and for controlling the internal structure of microparticles prepared using the (w/o/w)

emulsification solvent evaporation technique [30, 31].

Table 4

Encapsulation efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg of polymer)

Solvent volume (ml) Encapsulation Efficiency (%)

8 36.95 ± 0.13

10 50.34 ± 0.62

12 41.40 ± 0.13


When eight milliliters of methylene chloride was used, the higher polymer concentration

leaded to a less effective emulsifying process. This result is in accordance with those of Schlicher et

al., 1997 [32], who observed a decreasing in the encapsulation efficiency of a water soluble

antimalarial agent, after increasing the volume of the internal phase at a fixed polymer

concentration and volume (i.e. increasing the ratio of inner aqueous phase/organic phase in primary

emulsion). This effect takes place because the organic polymer phase acts as a diffusion barrier for


the drug between the internal and external aqueous phase. The thickness of this layer decreases with

increasing the volume of internal aqueous phase and leads to less stable w/o emulsions with larger

droplets of the internal aqueous phase [31]. The highest encapsulation rate (50.34 ± 0.62) was

achieved for microspheres prepared with 25 mg of quinine sulphate and ten milliliters of methylene

chloride.

Optimization studies resulted in a typical microsphere formulation prepared with 450 mg of

PLGA, 400 mg of PEG, 25 mg of quinine sulphate, 50 ml of 0.5% PVA solution with pH 10, and

10 ml of methylene crloride. The relative fairly small encapsulation efficiency achieved can be

attributed to the solubility of the quinine sulphate in the aqueous phase and the loss of quinine to the

external aqueous phase, where most of the drug was found.

3.2. Characterization of quinine sulphate-loaded microspheres

The characteristics of ressuspended lyophilized MS-QS were suitable for further

subcutaneous injection and the particles shown no aggregation. Lyophilized PLGA microspheres

containing quinine sulphate were evaluated vis-à-vis their morphological characteristics,

encapsulation efficiency and stability at long-term.

Lyophilized quinine sulphate- loaded PLGA microspheres presented initial macroscopic

aspect as a pastille, which release the powder with soft touch. Microscopic analysis showed

spherical shaped microspheres and the particle size analysis showed a homogeny population

distribution. A mean diameter of 3.53 ± 1.53 µm was estimated by particle counting.

Scanning electron microscopy (SEM) is an excellent tool for morphological observation of

microspheres. It is helpful not only to examine microspheres shape, but also to observe surface

characteristics. The microspheres obtained in this work were spherical, smooth and homogeneously

distributed. The microphotographs do not display any pores on microsphere surface. However,

some crystals were observed in microspheres surface prepared with more than 50 mg of quinine


sulphate, but this effect was not observed when microspheres were prepared with 25 mg of quinine

sulphate (Fig. 1).

The content of quinine sulphate was 26.6 µg/mg after microsphere preparation and this

content was roughly maintained (23.9 µg/mg, 90.2%) after 230 days of storage at 25ºC.

Fig. 1. Photomicrograph of quinine sulphate- loaded PLGA microspheres prepared using multiple

emulsion technique followed by solvent evaporation method, with 25 mg quinine sulphate and 450

mg PLGA. a) SEM of microsphere 3,500 ×; b) SEM of microsphere surface 11,000 ×; c) SEM of

microsphere prepared with 50 mg quinine sulphate and 450 PLGA 15,500 ×, shown some crystals

in the microsphere surface.

c)

b) a)


In vitro kinetic release of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres

The in vitro release profile of quinine sulphate from PLGA particles (formulation 2)

presented a typical bimodal behavior, comprising an initial burst effect followed by a sustained

continuous phase. A large burst effect (42.6 ± 0.48%) occurs in the first hour (Fig. 2). This effect

could be attributed to the immediate dissolution and release of portion of the drug adsorbed at the

surface of microspheres. This burst step was followed by a slow and gradual release rate of quinine

sulphate reaching 72.2 ± 0.84 within 3 days.

Fig. 2. In vitro release profile of quinine sulphate from PLGA microspheres. Error bars represent

the standard deviation for n=3 experiments.

3.3. Antimalarial activity of quinine sulphate-loaded PLGA microspheres

The standard 4-day suppressive test was chosen in order to evaluate the activity of PLGA

microspheres loaded with quinine sulphate for the treatment of Plasmodium berghei- infected mice.

Four consecutive days subcutaneous treatment of 20 mg/kg/day was not able to reduce parasitemia

to low levels under our experimental conditions.

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120 144Time (hours)

Rel

ease

d q

uin

ine

sulp

hat

e (%

)


A dramatic increase in the parasitemia was observed after six days of animal’s infection

(Fig. 3). Untreated control mice was highly parasitized (about 20%) by day 10 and died on days 10

to 19. The treatment with QS-MS was able to reduce parasitemia to low levels on day 10 (16.3 ±

8.2%) compared to the untreated control group (19.2 ± 7.1%). However, no significant difference

was found. The group treated with free quinine sulphate has lower parasitemia by day 10 (about

10%) and died on days 19 to 20. One-way ANOVA test for parasitemia data and shown a

significant difference between one of treatments (p<0.05). The Student’s t-test demonstrated there

is a statistically significant difference between the group treated with free quinine soleplate and the

other treatment groups.

0

5

10

15

20

25

2 4 6 8 10

Day

% P

aras

item

ia

Control

MS

MSQS

QS

Fig. 3. Antimalarial activity of free and microencapsulated quinine sulphate against Plasmodium

berghei-infected mice in a four-day-test. Mice were treated with 20 mg/kg/day of quinine sulphate

for four consecutive days for both microsphe res loaded with quinine sulphate (MS-QS) and quinine

sulphate (QS) formulations. Untreated control received saline and unloaded microspheres (MS).

Each point represents the mean ± standard deviation. (n=10).


The RCB (106/µl) values were 8.65 ± 0.7 and 5.6 ± 2.04 on days 5 and 9, respectively for

MS-QS group and 8.63 ± 0.6 and 5.69 ± 1.3 for control group showing that treatment was not able

to reverse anemia. These results were analyzed by one-way ANOVA test and shown the ρ-value

was more than 0.05, thus, there is no statistically significant difference between treatment groups at

95% confidence level.

Animal body weight was roughly maintained in all groups during the treatment (Fig. 4). No

significant difference (p<0.05) was found when one-way analysis of variance was performed and

the effect of the treatments were evaluated. The decrease of animal body weight seems to be only

related to the infection development not to a potential toxicity of the microspheres.

Fig. 4. Body weight (g) of mice infected P. berghei in four-day suppressive test, treated with

quinine sulphate microspheres PLGA by subcutaneous injection of 20 mg/kg/day of quinine

sulphate. Each point represents the mean ± S.D. for ten mice.

MST obtained with the different groups ranged from 10 to 27 days. Mice treated with MS-

QS had a slightly extend mean survival time, with 60% of the mice living for more than 16 days

22

24

25

27

28

30

0 2 4 6 8 10

Day

Wei

ght

(g)

ControlMS

MSQSQS


post-infection. The statistical analysis demonstrated no difference between MS-QS treatment and

the other evaluated treatments. Table 5 summarizes the results of RBC and MST test. Indeed, minor

variations were obtained with MS-QS.

Table 5

RBC and MST of Swiss mice infected with P. berghei treated with PLGA microspheres loaded

with quinine sulphate.

RBC (106/µL) MST

Treatment

Day 5 Day 7 Day 9 (days)

CONTROL 8.63±0.56 5.97±0.93 5.69±1.32 15.6±2.91

MS 9.02±0.97 6.87±0.89 4.68±0.68 18.20±3.68

MS-QS 8.65±0.7 7.72±2.92 5.61±2.04 16.5±2.55

QS 8.61±0.81 7.45±0.84 6.23±1.21 19.4±0.52

Mice were treated by s.c. route with 20 mg/kg/day in a four-day suppressive test;

RBC = red blood cells; MST = mean survival time.

Quinine sulphate-loaded PLGA microspheres at 20 mg/kg/day did not provide any

protection against P. berghei. The free quinine sulphate at the same dose was also unable to treat

animals or reduce parasitemia. However, it is interesting to note that on the day D+10, the QS

formulation was better in reducing parasitemia. Microspheres were conceived in this work so as to

prolong release of quinine in the body, and it should be expected that their effect in reducing

parasitemia would be retarded when compared with that of free quinine. In our experiments,

however, even free quinine was not able to diminish sanguine forms of P. berghei in the first hours


post-infection, which resulted in progress of the infection in contrast with our expectations of

arresting the growth of the murine infection. MS-QS in vitro release only 40% of drug in the first

hour and reduce even more the amount of quinine available to produce antimalarial effect. This fact

suggests that higher doses of quinine should be tested in further experiments to produce a decrease

of parasitemia in the first days after infection. Some evidence the effect of drug slow release from

microspheres during the infection could be remarked.

4. Conclusions

Quinine sulphate remains as a foremost active antimalarial agent against P. falciparum chloroquine-

resistant strains, but it presents a few side effects and short elimination half- life that obligate

repeated administrations. Biodegradable microspheres for controlled release of quinine sulphate

were successively prepared by w/o/w emulsion solvent evaporation process with stable and

spherical shaped particles with a mean diameter 3.53 µm ± 1.53. It was observed that the pH of the

external aqueous phase plays an important role on the entrapment efficiency of quinine sulphate

into PLGA microspheres. The alkaline pH of the external phase enhances the retention of drug in

the internal aqueous phase of microspheres preparation, so improving the encapsulation efficiency.

The drug release profile was investigated and a typical bimodal behavior was obtained, which

comprises an initial first burst effect followed by a sustained continuous phase characterizing a

controlled release system. The lyophilized PLGA-MS were very stable during 230 days concerning

their quinine sulphate content. No difference between the activity of MS-QS and free QS were

evidenced in a “four day standard test”, maybe due to the fact of such a low dose was enable to

arrest the development of infection. A better protocol will be adopted in further experiments in

order to address the formulations differences and the usefulness of the quinine microsphere system.

The results suggest that parenteral MS-based formulation of quinine sulphate is feasible and would


be offered as an alternative to obtain sustained release of quinine in the body, for the treatment of

malaria.

Acknowledgements

This work received partial support from the Brazilian National Council for Scientific and

Technological Development (CNPq). NSSM is grateful to CNPq for research grant 479979/01-4.

NSSM and VCFM thanks CNPq and the Brazilian Research and Development Ministry

(Nanobiotechnology Network). Authors are also grateful to Dr. Érika Martins Braga for supplying

P. berghei NK65 strains.

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CONCLUSÕES


5. CONCLUSÕES

♦ Foram obtidas microesferas de PLGA contendo sulfato de quinina, com taxa de encapsulação de

50,34 ± 0,62, correspondente a concentração de 26,53 µg/mg e diâmetro médio de 3,53 ± 1,53

µm;

♦ As microesferas obtidas mostraram forma esférica e superfície lisa, com uma boa

homogeneidade e distribuição do tamanho das partículas;

♦ As microesferas de PLGA liofilizadas, contendo sulfato de quinina, mostraram-se estáveis, por

230 dias quando armazenadas a 25ºC, no estudo pré-liminar de estabilidade.

♦ O perfil cinético da liberação in vitro de sulfato de quinina a partir das microesferas de PLGA

apresentou comportamento bimodal, com uma rápida liberação inicial de 42% em uma hora,

seguido de liberação gradual, atingindo 72% de liberação em 48 horas.

♦ O sulfato de quinina microencapsulado adminsitrado na dose de 20 mg/Kg de peso do animal de

sulfato de quinina, não demonstrou proteção significativa contra a infecção de Plamodium

berghei em camundongos. Entretanto, um novo protocolo já esta sendo aplicado com dose de

120 mg/kg de peso do animal, com resultados preliminares que indicam a eficácia do sistema

em controlar a infecção induzida nos camundongos.

PERSPECTIVAS


6. PERSPECTIVAS

§ A realização de ensaios de atividade antimalárica das micropartículas com um protocolo

experimental que permita a utilização de diferentes doses para comparação dos resultados, com

a prioridade para a dose de 120 mg/kg de sulfato de quinina;

§ Realização de estudos de transposição industrial do sistema desenvolvido, com o

desenvolvimento de lotes de bancada, escala piloto e escala industrial.

§ O desenvolvimento de uma forma farmacêutica sólida oral (cápsula), utilizando as microesferas

desenvolvidas; validação da metodologia de análise e elaboração dos parâmetros de fabricação e

controle de qualidade do produto.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

Pimentel, L. F. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático....

Anexo I - Resumos enviados para Congressos

1. PIMENTEL, L.F., JÁCOME-JUNIOR A.T., SANTOS-MAGALHÃES N.S. Preparation and

Characterisation of Quinine Sulphate- loaded Microspheres. Durante o VII PHAMATEC – IV

ENEQ, João Pessoa, Paraíba, Brasil, Agosto/2003.

PIMENTEL, L.F., JÁCOME-JUNIOR A.T., SANTOS-MAGALHÃES N.S. Biodegradble Quinine

Sulphate- loaded Microspheres. Durante a 2ª Reunião da Rede de Nanobiotecnologia, Campinas,

São Paulo, Brasil, Outubro/2003.

3. PIMENTEL, L.F., MOSQUEIRA, V.C.F.,SANTOS-MAGALHÃES, N.S. Antimalarial Activity

of Quinine Sulphate-Loaded PLGA Microspheres. Durante a XXXIII Reunião Anual da Sociedade

Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular –SBBq, Caxambu, Minas Gerais, Brasil, Maio/2004.


Category Code: DD

Preparation and Characterisation of Quinine Sulphate-loaded Microspheres

PIMENTEL, L.F.1, JÁCOME-JUNIOR A.T.2, SANTOS-MAGALHÃES N.S.1,2

1Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)-Departamento de Ciências Farmacêuticas – UFPE, Av. Prof. Artur de Sá, S/N, Cidade Universitária CEP 50670-901 Recife, Brasil.

2Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) - UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária CEP 50670-901 Recife-PE, Brasil, e-mail:[email protected]

Introduction: The malaria is a world-wide spread tropical disease which, require update and more efficient treatments. The WHO estimates the prevalence of this disease in order of 300 million new clinical cases per year and it is predicted that 2 million people will die due to malaria each year [1]. Quinine sulphate is widely adopted as an anti-malarial agent to treat multi-drug-resistant Falciparum malaria. However some side effects have been reported. A variety of synthetic biodegradable polymers have long been used to develop controlled drug delivery systems. The thermoplastic polymers such as polylactic (PLA), polyglycolic (PGA), and especially poly lactic-co-glycolic (PLGA) have been the focus of interest due to their biocompatibility and biodegradability [2]. Controlled delivery systems provide more uniform concentration of drug at the absorption site. Therefore, they allow the maintenance of plasma concentrations within the therapeutical range. Simultaneously, they minimise side effects, reduce the frequency of administration, and improve patient compliance to treatment [3]. The goal of this work was to develop and characterise PLGA-microspheres containing quinine sulphate, as a controlled release system for the treatment of malaria. Methods : The following chemicals were used: Poly (lactic -co-glycolic acid)– (PLGA 50/50) (Birmingham Polymers, USA), polyethylene glycol– (PEG 4000) (Labsynth, Brazil), polyvinyl alcohol–(PVA 30/70) (Sigma, USA), triethanolamine (Merck, Germany). All others reagents were analytical grade. Quinine sulphate-loaded microspheres were prepared by a double emulsion (W/O/W) solvent evaporation method. The influence of several preparation parameters, such as drug and polymer concentration, solvent volume, and pH of aqueous phase were inves tigated. PEG and PVA were used as stabilisers in the first emulsion and in the external aqueous phase, respectively. The influence of the external phase pH on the encapsulation rate of quinine sulphate was evaluated. The pH was varied from 8.7 to 11.1 by pH adjusting with triethanolamine. The morphology and the mean diameter of particles were evaluated by optical microscopy. The content of quinine sulphate entrapped into microspheres was assessed by UV-spectroscopy at 250 nm. Results: Morphological observation of PLGA - microspheres containing revealed spherical shaped particles ranging from 1.53 to 7.65 µm. The calculated mean diameter was 3.53 µm ± 1.53. The highest encapsulation rate of quinine sulphate into PLGA -microspheres (56.28%±0.33%) was obtained by using

an external aqueous phase at pH 10.3. The elevated pH of the external aqueous phase reduced the solubility of quinine sulphate (pKa=8.5) in this phase, and, limiting drug loss. Table 1. The effect of pH of the external aqueous phase on the entrapment of quinine sulphate into PLGA -microspheres.

Polymer Aqueous phase pH

Particle mean

diameter (µm ±SD)

Encapsulation rate

(% ± SD%)

PLGA 50/50 8.7 3.73 ± 1.69 47.0 ± 0.23 PLGA 50/50 10.3 3.67 ± 1.59 56.3 ± 0.33 PLGA 50/50 11.1 3.20 ± 1.32 44.7 ± 2.02 SD = standard deviation

Figure 1. Microphotograph of the quinine sulphate-loaded PLGA-microspheres (100 ×). Conclusions: Stable and spherical shaped quinine sulphate-loaded PLGA -microspheres were obtained with a mean diameter about 3.53 µm ± 1.53. It was verified that the pH of the external aqueous phase play an important role on the entrapment efficiency of quinine sulphate into PLGA -microspheres. The alkaline pH of the external phase promoted an improvement on the retention of quinine sulphate in the internal aqueous phase during the manufacturing of microspheres by the double emulsion method. Further studies are being carried out to evaluate the in vitro anti malaria activity of quinine sulphate-loaded microspheres. Acknowledgements . This work was supported by CNPq, MCT/CNPq Rede Nanobiotec and FACEPE. [1] Word Health Organization, The World Health Report 1999. Malaria. [WWW] URL:http://www.who.int [Accessed 14 may 2003]. [2] Jain RA (2000). Biomaterials 21, 2475-2490.

[3] Verma RK, Garg Sanjay (2001). Pharmaceutical Technology On-Line 25 (2), 1-14.


PREPARATION OF BIODEGRADABLE MICROSPHERES LOADED WITH QUININE SULPHATE

Pimentel, L.F.1, Jácome -Junior A.T.2, Santos-Magalhães N.S.1,2

1Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)-Departamento de Ciências Farmacêuticas – UFPE, Av. Prof. Artur de Sá, S/N, Cidade Universitária CEP 50670-901 Recife, Brazil.

2Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) - UFPE, Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária CEP 50670-901 Recife-PE, Brazil

email:[email protected]

ABSTRACT Microspheres of Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA 50/50) containing quinine sulphate were prepared by a double emulsion (W/O/W) solvent evaporation method. The morphology and particle size of microspheres were analyzed. The influence of several preparation parameters on microspheres stability, such as drug and polymer concentration, solvent volume, and pH of aqueous phase were investigated. Stable and spherical shaped quinine-loaded PLGA -microspheres were obtained. With a highest entrapment effiency of 56.3 % ± 0.33. INTRODUCTION The malaria is a world-wide spread disease which, require update and more efficient treatments. The WHO estimates the prevalence of this disease in order of 300 million new clinical cases per year and it is predicted that 2 million people will die due to malaria each year1. In Brazil more than 600,000 cases were registered in 2000, 99% being transmitted in the Amazon region2. Quinine sulphate (Fig.1), is widely adopted as an anti-malarial agent to treat multi-drug-resistant Falciparum malaria. However some side effects have been reported. A variety of synthetic biodegradable polymers have long been used to develop controlled drug delivery systems. The thermoplastic polymers such as polylactic (PLA), polyglycolic (PGA), and copolymers as poly lactic-co-glycolic (PLGA) have been the focus of interest due to their biocompatibility and biodegradability3. Controlled delivery systems provide more uniform concentration of drug at the absorption site. Therefore, they allow the maintenance of plasma concentrations within the therapeutical range. Simultaneously, they minimize side effects, reduce the frequency of administration, and improve patient compliance to treatment4. The goal of this work was to develop and characterize PLGA -microspheres containing quinine sulphate, as a controlled release system for the treatment of malaria. EXPERIMENTAL METHODS The following chemicals were used: Poly (lactic -co-glycolic acid)– (PLGA 50/50 inherent viscosity 0.44 dL g-1) (Birmingham Polymers, USA), polyethylene glycol– (PEG 4000) (Labsynth, Brazil), polyvinyl alcohol–(PVA 30/70) (Sigma, USA), triethanolamine (Merck, Germany). All others reagents were analytical grade. Quinine sulphate-loaded microspheres were prepared by a double emulsion (W/O/W) solvent evaporation method. Initially 5 ml of purified water containing 400 mg polyethylene glycol and 25 mg quinine sulphate was emulsified under vigorous mechanical stirring (8000 rpm, 1 min) into 10 ml dichlorometane (DCM) containing 450 mg of PLGA. This O/W emulsion was them dispersed into 50 ml aqueous PVA solution (0.5% w/w) under vigorous stirring (8000 rpm, 30 sec). DCM was removed at room temperature and mechanical stirring (400 rpm, 4 hours). After the solvent was removed, the microspheres were formed. The influence of several preparation parameters, such as drug and polymer concentration, solvent volume, and pH of aqueous phase on microsphere stability was investigated. PEG and PVA were used as stabilisers in the first emulsion and in the external aqueous phase, respectively. The influence of the external phase pH on the encapsulation rate of quinine sulphate was evaluated. The pH was varied from 8.7 to 11.1 by pH adjusting with triethanolamine. The morphology and the mean diameter of particles were evaluated by optical microscopy. The content of quinine sulphate entrapped into microspheres was assessed by UV-spectroscopy at 250 nm. RESULTS AND DISCUSSION Morphological observation of PLGA-microspheres containing quinine sulphate revealed spherical shaped particles ranging from 1.53 to 7.65 µm. The mean diameter was 3.53 µm ± 1.53. The highest encapsulation rate of quinine sulphate into PLGA-microspheres (56.28%±0.33%) was obtained by using an external aqueous phase at pH 10.3. The elevated pH of the external aqueous phase reduced the solubility of quinine sulphate (pKa=8.5) in this phase, improving drud entrapment and, limiting drug loss during microsphere preparation. Images of Chemical structure of quinine sulphate (Fig.1). Optical microscopy were obtained and showed Quinine sulphate incorporated into the particles (Fig.2). Images of optical microscopy were obtained and showed Quinine crystals (Fig.3).


Table 1. The effect of pH of the external aqueous phase on the entrapment of quinine sulphate into PLGA -microspheres.

Polymer Aqueous phase pH

Particle mean diameter (µm ±SD)

Encapsulation rate (% ± SD%)

PLGA 50/50 8.7 3.73 ± 1.69 47.0 ± 0.23

PLGA 50/50 10.3 3.67 ± 1.59 56.3 ± 0.33

PLGA 50/50 11.1 3.20 ± 1.32 44.7 ± 2.02

SD = standard deviation CONCLUSION Stable and spherical shaped quinine-loaded PLGA -microspheres were obtained with a mean diameter about 3.53 µm ± 1.53. It was verified that the pH of the external aqueous phase play an important role on the entrapment efficiency of quinine sulphate into PLGA -microspheres. The alkaline pH of the external phase promoted an improvement on the retention of drug in the internal aqueous phase during the manufacturing of microspheres by the double emulsion method. Further studies are being carried out to evaluate the in vitro anti malaria activity of quinine-loaded microspheres. REFERENCES 1. Word Health Organization, The World Health Report 1999. Malaria. [WWW] URL:http://www.who.int [Accessed

14 may 2003]. 2. Brazil – National Foundation of Health. [WWW] URL:http://www.funasa.gov.br [Accessed 04 may 2002 3. Jain RA. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)

devices. Biomaterials 21, 2475-2490, 2000. 4. Verma RK, Garg S. Drug delivery technologies and future directions. Pharmaceutical Technology On-Line 25 (2),

1-14, 2001. ACKNOWLEDGEMENTS: We acknowledged the financial support by CNPq, MCT/CNPq Rede Nanobiotec and FACEPE.

Fig. 1. Chemical structure of quinine sulphate [Cinchonan-9-ol, 6´-methoxy -, (8α,9R)-, sulphate (2:1)]

Fig. 2: Microphotograph of the quinine Fig. 3. Microphotograph of sulphate-loaded PLGA-microspheres (100 x). quinine sulphate (40 x)


ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE SULPHATE-LOADED PLGA

MICROSPHERES

Pimentel, L.F.1,2; Mosqueira, V.C.F. 3; and Santos-Magalhães, N.S.1,2

1 Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami – UFPE [email protected]; 2 PG em Ciênc. Farmacêuticas – UFPE; 3 Depto. de Farmácia - UFOP

The aim of the present study was to evaluate the antimalarial activity of PLGA-microspheres

containing quinine sulphate in mice, which were infected with Plasmodium berghei. Quinine

sulphate- loaded PLGA microspheres (QS-MS) were prepared by the double emulsion (W/O/W)

solvent evaporation method. The morphology and the mean diameter of particles were evaluated by

optical microscopy. The content of quinine sulphate entrapped into microspheres was assayed by

HPLC. The in vitro kinetic profile study was investigated under sink conditions using a dyalisis

technique. The antimalarial activity of QS-MS was determined by the four-day test against P.

berghei ANKA NK65 strain. Two hours later, animals were randomly divided in 4 groups (n=10

animals) and treated with a sc single dose (0.5 ml) of 20 mg/kg per day of sulphate quinine during

four consecutive days. Control groups received saline (0.9%) or unloaded microspheres; treated

groups received QS-MS or a suspension of quinine sulphate in 0.1% Twen 80. The efficacy of the

treatment on the level of parasitemia, animals’ weight, and red blood counting (RBC) were

monitored. The QS-MS presented spherical shaped particles ranging from 1.53 to 7.65 µm. The in

vitro kinetic profile exhibited a maximum release of 44% within 96 h. A significant increase in the

parasitemia was observed only after 6 days of animal infection. The treatment with QS-MS was

able to reduce parasitemia to low levels on day 10 (11.5 ± 2.6%) in relation to the untreated control

group (18.1 ± 4.8%). However no significant difference was found between treatment with free and

encapsulated quinine sultafe. Animal weight body was maintained during the treatment (28 ± 4.2).

Nevertheless, a slightly reduction was observed on 10 days after infection whatever the treatment

(23.9 ± 2.9). The RCB (106 /µl) values were 8.62 ± 0.70 and 5.61 ± 2.04 on days 5 and 9,

respectively. Results suggest that QS-MS can be offered as an alternative to the treatment of

Falciparum malaria.

Supported by: CNPq, MCT/CNPq-Rede Nanobiotec and BNB.


Anexo II – Artigos Escritos

1. NANOTECNOLOGIA APLICADA AO CONTROLE E COMBATE DA MALÁRIA Lúcio Figueira Pimentel, Vanessa Carla Furtado Mosqueira, Nereide Stela Santos-Magalhães Trabalho submetido a “Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas” 2. IN VIVO ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE SULPHATE-LOADED PLGA MICROSPHERES Lúcio Figueira Pimentel, Vanessa Carla Furtado Mosqueira, Nereide Stela Santos-Magalhães Trabalho a ser submetido ao “European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics”


Artigo 1. NANOTECNOLOGIA APLICADA AO CONTROLE E COMBATE DA

MALÁRIA - RESUMO

Apesar de vivermos atualmente uma era de pleno desenvolvimento tecnológico e científico

a malária permanece como um dos maiores problemas de saúde a serem combatidos. As estratégias

modernas para o controle e combate a malária prevêem ações conjuntas, como o controle do inseto

vetor, diagnóstico rápido e preciso, garantia de uma terapêutica adequada, redução dos casos de

resistência, otimização dos agentes terapêuticos utilizados na atualidade, além do desenvolvimento

de novos agentes terapêuticos e vacinas. A nanobiotecnologia pode ser vista como a criação de

materiais funcionais, dispositivos e sistemas, através do controle da matéria na escala de

nanômetros. Estes novos materiais apresentam novos fenômenos e propriedades particulares que

permitem a aplicação nas áreas de biomedicina, genômica e o desenvolvimento de novos sistemas

terapêuticos. Os sistemas de liberação controlada de fármacos vêm recebendo atenção especial

nesta nova área de pesquisa com o desenvolvimento de estratégias para a veiculação de agentes

bioativos na forma de nanodispositivos, como lipossomas, micro e nanopartículas biodegradáveis,

microemulsões e dispositivos transdérmicos. Muitos nanossistemas já demonstraram a sua

utilidade na otimização de vacinas, inseticidas e quimioterápicos utilizados contra a malária. A

nanobiotecnlogia constitui-se, portanto, em uma alternativa promissora no controle e combate a

malária.


REVISTA BRASILEIRA DE CIÊNCIA FARMACÊUTICAS Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences

RECIBO

N° de Registro: 099/04 Acusamos o recebimento do trabalho para publicação na Revista

Brasileira de Ciências Farmacêuticas/ Brazilian Journal of Pharmaceutical

Sciences.

Autoria: PIMENTEL, L.F.; MOSQUEIRA, V.C.F.; SANTOS-MAGALHÃES, N. S..

Título do artigo: "Nanobiotecnologia aplicada ao controle e combate da malária "

São Paulo, 14 de dezembro de 2004

Editora Científica


Artigo 2. IN VIVO ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE SULPHATE-LOADED

PLGA MICROSPHERES - ABSTRACT

Quinine sulphate is the drug of choice for the treatment of the most cases of chloroquine

resistant falciparum malaria However, the quinine has low therapeutic index and its use as an

antimalarial agent at large doses is usually associated with several side effects, such as cinchonism.

In order to circumvent this drawback, quinine sulphate loaded microspheres were prepared and the

antimalarial activity was investigated on mice infected with Plasmodium berghei. Quinine sulphate-

loaded microspheres prepared using the double emulsion technique presented spherical shaped

particles ranging from 1.53 to 7.65 µm. The drug encapsulation eficiency attained 50.34 ± 0.62%.

The in vitro release profile of quinine sulphate- loaded microspheres showed a bimodal behaviour. A

burst effect of 40% was initial observed, followed by a gradual drug release achieving 72% at 48 h.

Microspheres administered by subcutaneous route were at least as efficient as the free quinine

sulphate administered by sc injection at 20 mg/kg for four days. Nevertheless no efficacy

improvement achieved with microencapsulation of quinine sulphate. A parenteral microsphere-

based formulation of quinine sulphate is however feasible, which can ensue a potential strategy to

achieve a controlled therapeutic effect in the treatment of malaria.

universidade federal de pernambuco centro de … · em especial, luciana duarte, givanildo...

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