Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Pós-Graduação Engenharia Ambiental

Mestrado em Engenharia Ambiental

Davi Silva Moreira

“DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALITICA POR

CROMATOGRAFIA/ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA

AVALIAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE PERTURBADORES

ENDÓCRINOS EM MANANCIAIS DE ABASTECIMENTO DA

REGIÃO METROPOLITANA DE BELO HORIZONTE.”

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Engenharia Ambiental,

Universidade Federal de Ouro Preto, como parte

dos requisitos necessários para a obtenção do

título: “Mestre em Engenharia Ambiental –

Área de Concentração: Saneamento Ambiental”

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino

Ouro Preto, MG

2008

 

  ii

                                                                              Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br

M838D MOREIRA, DAVI SILVA. Desenvolvimento da metodologia analítica por cromatografia/ espectrometria de massas para avaliação da ocorrência de pertubadores endócrinos em mananciais de abastecimento da Região Metropolitana de Belo Horizonte [manuscrito] / Davi Silva Moreira. – 2008. 123f. : il. color., graf., tabs. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisa em Recursos Hídricos Pró-Água.

1. Belo Horizonte - Abastecimento de água - Teses. 2. Mananciais hídricos - Teses. 3. Análise cromatográfica - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

mailto:Sisbin@sisbin.ufop.br

  iii

 

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“Por falta de reflexão os projetos

fracassam, mas se realizam quando

há muitos conselheiros.”

Provérbios 15,22

  v

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por sempre estar comigo em todos os momentos. Sem Ele não

seria possível completar esta importante etapa na vida.

Ao professor Sérgio por ter acreditado na minha capacidade e ter sido um grande

professor nos ensinamentos de vida acadêmica e profissional. Ao professor Robson por

ter apoiado o projeto e ajudado valiosamente com seus conhecimentos.

Aos professores do DEQUI pela dedicação em repassar seus conhecimentos a

todos nós alunos durante a graduação e mestrado.

Aos colegas da UFMG: Jacson, Lucinda e, principalmente, ao Fábio e a Eliane

que ajudaram no projeto sempre que necessário.

Ao professor Valter por ter confiado no DEQUI-UFOP como parceiro no projeto

PROSAB 5.

Aos amigos do laboratório Aniel, Danusa, Fernanda e Gustavo pela grande

amizade e o intercâmbio de conhecimentos que foram de grande valia para a evolução

de nossos projetos. A Miriany pela grande ajuda no final do projeto com as análises

complementares.

Aos amigos Flaviane e Leandro que sempre estiveram comigo nos melhores e

piores momentos de UFOP, que já são seis anos. Obrigado!

A UFOP pela bolsa concedida.

A COPASA pela colaboração na coleta das amostras.

E finalmente, aos meus pais Luiz Henrique e Iolanda e aos meus irmãos Saulo e

Ariel que sempre apoiaram e incentivaram mostrando que todo esforço vale a pena.

Muito obrigado!

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SUMÁRIO

Página

1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 1 2. OBJETIVOS................................................................................................. 4 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................... 5 3.1. O sistema endócrino.................................................................................. 5 3.2. Perturbadores endócrinos......................................................................... 7 3.2.1. Mecanismos de Ação dos Perturbadores Endócrinos............................. 9 3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endócrinos relatados em animais silvestres e de laboratório................................................................................................. 11 3.2.3. Efeitos dos perturbadores endócrinos relatados em humanos............... 13 3.3. Análise e monitoramento de Perturbadores Endócrinos em Águas Superficiais........................................................................................................ 14 3.3.1. Metodologias para análise de perturbadores endócrinos....................... 15 3.3.2. Monitoramento de perturbadores endócrinos em águas superficiais..... 24 3.3.3. Técnicas de remoção de perturbadores endócrinos................................ 30 3.3.4. Considerações finais................................................................................ 32 4. MATERIAIS E MÈTODOS....................................................................... 34 4.1. Desenvolvimento e Otimização do Método Analítico............................... 34 4.1.1. Amostragem, filtração e ajuste do pH .................................................... 36 4.1.2. Extração e concentração dos analitos..................................................... 36 4.1.3. Secagem e suspensão dos analitos........................................................... 38 4.1.4. Análise Cromatográfica........................................................................... 38 4.2. Validação do método analítico.................................................................. 42 4.2.1. Estabilidade............................................................................................. 43 4.2.2. Seletividade.............................................................................................. 44 4.2.3. Curva analítica........................................................................................ 44 4.2.4. Linearidade e Sensibilidade.................................................................... 47 4.2.5. Precisão................................................................................................... 47 4.2.6. Ensaio de supressão................................................................................ 48 4.2.7. Ensaio de recuperação............................................................................ 48 4.2.8. Ensaio de calibração interlaboratorial................................................... 49 4.3. Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos nos Mananciais da Região Metropolitana de Belo Horizonte........................................................ 50 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES............................................................... 58 5.1.Cromatografia Gasosa com Detecção por Ionização em Chama............. 58 5.2. Cromatografia Líquida com Detecção por Espectrometria de massas - Desenvolvimento do Método Analítico............................................................. 61 5.3. Validação do Método Analítico para LCMS............................................. 65 5.3.1. Estabilidade............................................................................................. 65 5.3.2. Seletividade.............................................................................................. 66 5.3.3. Curva Analítica....................................................................................... 67 5.2.4. Linearidade e Sensibilidade..................................................................... 69 5.2.5. Precisão................................................................................................... 70

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SUMÁRIO (continuação)

Página

5.3.6 Ensaio de Supressão................................................................................. 71 5.3.7 Ensaio de Recuperação............................................................................ 73 5.3.8. Ensaio de calibração interlaboratorial................................................... 74 5.4. Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos em Mananciais da Região Metropolitana de Belo Horizonte......................................................... 76 5.5 Estimativa de valores críticos de toxicidade dos PE estudados................. 94 6. CONCLUSÕES............................................................................................ 97 7. PERSPECTIVAS......................................................................................... 99 8. REFERÊNCIAS........................................................................................... 100

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LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 3.1: Órgãos do sistema endócrino....................................................... 5 Figura 3.2: Funcionamento do hipotálamo..................................................... 6 Figura 3.3: Estruturas químicas de alguns perturbadores endócrinos

comumente encontrados em águas superficiais........................... 8 Figura 3.4: Disfunções endócrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista;

(c) efeito antagonista.................................................................... 11 Figura 3.5: Diagrama esquemático para preparação e análise dos

perturbadores endócrinos............................................................. 16 Figura 3.6: Etapas da extração por fase sólida para isolamento de

compostos de interesse................................................................. 19 Figura 3.7: Exemplo dos dois passos genericamente associados aos

imunoensaios: A) Imobilização do receptor específico ao suporte, seguido de incubação após a adição da amostra contendo estrogénios e de anticorpos; B) Adição da solução adequada ao tipo de detecção pretendida..................................... 22

Figura 4.1: Diagrama geral para preparação e análises dos PE. .................... 35 Figura 4.2: Cartucho SPE C18 500mg Unitech............................................. 37 Figura 4.3: Sistema de extração em fase sólida utilizado para extração dos

analitos de interesse das amostras ambientais.............................. 38 Figura 4.4: Reação de Silanização a partir dos analitos a serem

derivatizados (nonilfenol, estradiol e etinilestradiol) e o reagente de derivatização utilizado (BSTFA).............................. 39

Figura 4.5: Diagrama esquemático de funcionamento do espectrômetro de massas íon-trap – time-of-flight.................................................. 41

Figura 4.6: Fórmula Estrutural da Fenolftaleína............................................ 45 Figura 4.7: Localização dos 3 mananciais estudados na Região

Metropolitana de Belo Horizonte................................................ 51 Figura 4.8: Contribuição das ETAs no abastecimento da Região

Metropolitana de Belo Horizonte................................................. 51 Figura 4.9: Vista aérea ETA Rio das Velhas.................................................. 53

Figura 4.10: Local de amostragem para água bruta do manancial Rio das Velhas.......................................................................................... 53

Figura 4.11: ETA Vargem das Flores............................................................... 54 Figura 4.12: Vista aérea ETA Vargem das Flores............................................ 55 Figura 4.13: Vista aérea da ETA Sistema Morro Redondo.............................. 56 Figura 4.14: ETA Morro Redondo................................................................... 56 Figura 5.1: Cromatogramas obtidos (5) no GC-FID com a injeção de

mistura de padrões em diferentes concentrações. ........................ 60 Figura 5.2 Curva de calibração obtida com a mistura dos padrões

analisados...................................................................................... 60

  ix

LISTA DE FIGURAS (continuação)

Página

Figura 5.3: Cromatograma típico da análise dos PE em questão: 1 – Fenolftaleína, 2 – Estradiol, 3 – Etinilestradiol, 4 – ms² Etinilestradiol, 5 – ms² Estradiol, 6 – Nonilfenol , 7 – ms² nonilfenol ) .................................................................................. 63

Figura 5.4: Cromatogramas relativos aos íons precursores ms1 e ms² (modos negativo) característicos de cada composto.................... 64

Figura 5.5: Cromatograma do metanol puro (branco). Ausência de picos para E2, EE2 (Segmento 1 - 5minutos - esquerdo) e a presença de interfente no tempo de retenção do NP (Segmento 2 - 6,8minutos - direito).................................................................... 66

Figura 5.6: Amostra Morro Redondo (água bruta) com adição de estradiol e etinilestradiol (100 μg.L-1, quadro da esquerda) e n-nonilfenol (200 μg.L-1, quadro da direita). ................................................... 67

Figura 5.7: Curvas analíticas obtidas com soluções-padrão para os quatro padrões de PE............................................................................... 70

Figura 5.8: Chuva acumulada mensal na RMBH durante o período de monitoramento (fev/07 a jan/08)................................................. 76

Figura 5.9: Box-plot da concentração dos três compostos determinados nos mananciais estudados em todas as campanhas amostrais. Água Bruta............................................................................................ 78

Figura 5.10: Variação da concentração de nonilfenol em água bruta nos mananciais durante o período de fev/07 a jan/08......................... 80

Figura 5.11: Cromatograma para Nonilfenol da Amostra Rio das Velhas – Nov. 2007 e as diferentes fragmentações (ms²) de seus isômeros (esquerda). Exemplos de estruturas químicas de 5 dos 550 Isômeros de nonilfenol existentes (direita)........................... 81

Figura 5.12: Boxplot da concentração de nonilfenol na água bruta nos 3 mananciais................................................................................... 82

Figura 5.13: Índice de remoção de NP (água bruta – água filtrada) durante as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008................................ 83

Figura 5.14: Variação da concentração de estradiol em água bruta nos mananciais durante o período de fev/07 a jan/08......................... 84

Figura 5.15: Variação da concentração de etinilestradiol em água bruta nos mananciais durante o período de fev/07 a jan/08......................... 86

Figura 5.16: Índice de remoção (água bruta – água filtrada) de EE2 durante as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008............................... 87

Figura 5.17: Confirmação da presença de Bisfenol A na água a partir do LCMS. Amostra: Rio das Velhas janeiro de 2008....................... 88

Figura 5.18: Análise quimiométrica das amostras referentes aos meses de jun/07 a set/07 com base no PCA................................................ 89

  x

LISTA DE FIGURAS (continuação)

Página

Figura 5.19: Variação do pH nas amostras de água bruta dos três

mananciais durante o período de monitoramento........................ 91 Figura 5.20: Variação da turbidez nas amostras de água bruta dos três

mananciais durante o período de monitoramento........................ 91 Figura 5.21: Variação da cor aparente nas amostras de água bruta durante o

período de monitoramento nos 3 mananciais............................... 92 Figura 5.22: Variação da cor verdadeira nas amostras de água bruta durante

o período de set/07 a Jan/08 nos 3 mananciais............................ 92 Figura 5.23: Análise da Componente principal (PCA) dos seis parâmetros

utilizados para o monitoramento dos mananciais escolhidos...... 93

  xi

LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 3.1: Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os Perturbadores Endócrinos............................................................. 9

Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribuídos aos perturbadores endócrinos em animais.......................................................................................... 12

Tabela 3.3: Classificação de alguns perturbadores endócrinos (adaptado de Mol et al. 2000)............................................................................ 15

Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes.. 19 Tabela 3.5: Compilação de trabalhos publicados sobre o monitoramento de

nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em águas superficiais......... 26-28 Tabela 3.6: Principais fontes de perturbadores endócrinos em águas

superficiais.................................................................................... 30 Tabela 3.7: Metodologias estudadas para remoção de perturbadores

endócrinos..................................................................................... 32 Tabela 4.1: Nome IUPAC, massa, fórmula molecular, pureza, marca e

número CAS dos compostos determinados.................................. 35 Tabela 4.2: Descrição do procedimento de extração com cartucho Unitech

C18 (500 mg) utilizado nesse trabalho para a extração simultânea dos três compostos de interesse.................................. 37

Tabela 4.3: Condições de análise dos Perturbadores endócrinos por cromatrografia gasosa................................................................... 40

Tabela 4.4: Condições de análise dos PE por cromatrografia líquida acoplada à espectrometria de massas............................................ 42

Tabela 4.5: Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol na ETA Rio das Velhas........................ 54

Tabela 4.6: Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol na ETA-Vargem das Flores.................. 55

Tabela 4.7: Campanhas realizadas para determinação dos Perturbadores Endócrinos na Região Metropolitana de Belo Horizonte – ETA Morro Redondo............................................................................. 57

Tabela 5.1: Tempo de retenção, área obtida em relação à concentração e limite de detecção dos compostos analisados por cromatografia gasosa........................................................................................... 59

Tabela 5.2: Fórmulas moleculares, tempos de retenção, íons primários (ms1) e secundários (ms2) característicos para cada padrão utilizado........................................................................................ 64

Tabela 5.3: Variação da concentração dos compostos em relação ao tempo de preparo das amostras................................................................ 66

  xii

LISTA DE TABELAS (continuação)

Página

Tabela 5.4: Faixa de trabalho, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) dos quatro compostos determinados por LCMS-IT-TOF............................................................................. 68

Tabela 5.5: Coeficiente de correlação (r) obtido para os 4 padrões determinados por LCMS-IT-TOF ao longo do monitoramento... 69

Tabela 5.6: Repetibilidade dos resultados obtidos para soluções-padrão dos três PE expressa por meio do coeficiente de variação (CV)......... 71

Tabela 5.7: Resultados dos testes de supressão realizados com amostras coletadas na entrada da ETA Morro Redondo (fev. 2008)........... 72

Tabela 5.8: Variação da supressão nas amostras de água bruta no mês de janeiro 2008.................................................................................. 73

Tabela 5.9: Valores obtidos pelos ensaios de recuperação de E2, EE2 e NP em função da fortificação das amostras coletadas na entrada da ETA Morro Redondo.................................................................... 74

Tabela 5.10: Resultados obtidos pela calibração interlaboratorial UFOP-CIRRA.......................................................................................... 70

Tabela 5.11: Concentração de nonilfenol (ng.L-1) encontrada durante as campanhas de amostragem........................................................... 79

Tabela 5.12: Concentração de 17β-estradiol (ng .L-1) encontrada durante as campanhas de amostragem........................................................... 84

Tabela 5.13: Concentração de 17α-etinilestradiol (ng.L-1) encontrada durante as campanhas de amostragem...................................................... 86

Tabela 5.14: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Rio das Velhas (água bruta)............................................................................................. 89

Tabela 5.15: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Vargem das Flores (água bruta)................................................................................... 90

Tabela 5.16: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Morro Redondo (água bruta)............................................................................................. 90

Tabela 5.17: Exemplos de pertubação endócrina observada em animais do sexo masculino expostos aos estradióis e nonilfenol durante o período pré-natal. (adaptado Damstra et al., 2002)............................................................................................. 94

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LISTA DE NOTAÇÕES

APEO Alquilfenóis Polietoxilados BPA Bisfenol A

BSTFA N-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida CAS Chemical Abstract Service

CETESB Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental CG Cromatografia Gasosa

CG-FID Cromatrografia Gasosa com detecção por Ionização em Chama CGMS Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas CSTEE Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment

DAD Detector de Arranjo de Diodo (para cromatografia líquida) DDE Diclorodifeniltricloroetileno DDT Dicloro-difenil-tricloro-etano DES Dietilestilbestrol DIC Detector de Ionização em Chama (para cromatografia Gasosa) E1 Estrona E2 Estradiol E3 Estriol

EDC Endocrine Disrupting Chemicals EE2 Etinilestradiol EM Espectrometria de Massas ESI Eletronspray ionization ETA Estação de tratamento de água ETE Estação de tratamento de esgoto FE Fase estacionária FM Fase móvel

H2SO4 Ácido Sulfúrico HCl Ácido Clorídrico

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência IEH Institute for Ecological Health IPCS Programa Internacional de Segurança Química

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LC Cromatografia Líquida

LCMS Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas LCMS-IT-

TOF Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas. Detecção por Ion Trap e Time of Flight

MSTFA N-metil-n-trifluoroacetamida MTBSTFA N-metil-n-(tert-butildimetilsilil)trifluoroacetamida

4NP 4-nonilfenol

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LISTA DE NOTAÇÕES (continuação)

NP Nonilfenol ou n-nonilfenol

NPEO Nonilfenol Polietoxilado OCDE Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico OMS Organização Mundial da Saúde PCA Análise de componente principal PE Perturbadores Endócrinos

POP Poluentes Orgânicos Persistentes RMBH Região Metropolitana de Belo Horizonte

SPE Extração por fase sólida SPME Microextração em fase sólida STP Substâncias Tóxicas Persistentes UE União Européia

UKEA Agência de Proteção Ambiental do Reino Unido USEPA Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos UV/VIS Detector ultravioleta na região do visível

VTG Vitelogenina

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RESUMO

Alguns compostos orgânicos classificados como Perturbadores Endócrinos (PE) são

encontrados em águas superficiais e têm atraído a atenção da comunidade científica

devido à alteração que eles causam no sistema endócrino da fauna aquática e ao

potencial risco à saúde humana. Nessa classe de compostos, destacam-se os hormônios

(17β-estradiol, 17α-etinilestradiol) e subprodutos da degradação de surfactantes não-

iônicos (n-nonilfenol). Devido a atualidade do tema, há poucos trabalhos nacionais

publicados abordando o monitoramento e a remoção de PE de águas naturais, não

havendo ainda uma legislação que regulamente a emissão de hormônios e nonilfenóis

no ambiente ou que estabeleça padrões de potabilidade para tais compostos. Sendo

assim, essa dissertação teve como objetivo desenvolver metodologia analítica para

quantificação de 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e n-nonilfenol (NP) em

amostras de água superficial, de forma a permitir o monitoramento de tais PE em três

mananciais de abastecimento da Região Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH). A

quantificação dos PE nas amostras ambientais foi feita em equipamento de

cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LCMS) após extração e

concentração em cartuchos tipo C18. A recuperação dos PE pelo processo de extração

em fase sólida variou de 90 a 96¨% ao passo que os limites de detecção do método

foram de 1,4; 0,9 e 4,9 ng.L-1 para o E2, EE2 e NP, respectivamente. Após validação do

método analítico, foi feito o monitoramento do afluente e da água filtrada (em filtro de

areia) de três estações de tratamento de água (Morro Redondo, Vargem das Flores e Rio

das Velhas) da região Metropolitana de Belo Horizonte. Todos os três compostos

monitorados foram encontrados em pelo menos uma amostra, sendo que o n-nonilfenol

esteve presente em todas amostras de água bruta, na faixa de concentração de 44 a 1.918

ng.L-1. Os compostos 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol foram determinados em apenas

15% das amostras, na faixa de concentração de 2 a 54 ng.L-1. As análises das amostras

coletadas nas ETAs após o filtro de areia mostraram que as etapas de pré-cloração,

coagulação, sedimentação e filtração não foram capazes de remover, em sua totalidade,

os PE monitorados.

Palavras-chave: Perturbadores endócrinos; microcontaminantes orgânicos; qualidade

da água; tratamento de água; espectrometria de massas.

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ABSTRACT

Some organic molecules classified as endocrine disrupters compounds (EDC) have been

found in surface waters and attracted attention from the scientific community due to

their hability to tamper with the endocrine system of aquatic fauna, hence due to the

potential risk they pose to human health. Among the compunds with endocrine

properties, the hormones (17β-estradiol 17α- ethinylestradiol) and a by-product of the

degradation of non-ionic surfactants (n-nonylphenol) are of particular importance. There

are a handful of papers on the monitoring of EDC in Brazilian waters and there is no

Brazilian legislation regulating estradiol and nonylphenol in surface or drinking water.

Therefore, this work aimed at developing analytical techniques to quantify 17 β-

estradiol (E2), 17 α-ethynilestradiol (EE2) and n-nonylphenol (NP) in samples of

surface water from three manancials located in the Belo Horizonte Metropolitan Area,

Minas Gerais, Brazil. The quantification of such EDC was performed by liquid

chromatography coupled to mass spectrometry (LCMS) after the samples being

extracted and concentrated with C18 cartridges. The recovery of EDC by solid phase

extraction varied from 90 to 96% and the limit of detection of the whole analytical

procedure was determined as 1.4; 0.9 and 4.9 ng.L-1 for E2, EE2 and NP, respectively.

After the method validation it was carried out a one year monitoring of raw and filtered

water (sand filtration) of three water treatment plants (Morro Redondo, Vargem das

Flores and Rio das Velhas) that supply Belo Horizonte Metropolitan Area. The results

showed that the three compounds were found in at least one sample, and that the n-

nonylphenol was present in all water samples analysed, in a concentration range of 44 to

1,918 ng.L-1. The estrogens 17β-estradiol and 17 α-ethinylestradiol were detected in

only 15% of the samples, in a concentration range of 2 to 54 ng/L. The analyses of

samples collected in the WTPs after the sand filter indicates that the pre-chlorination,

coagulation, sedimentation and sand filtration steps were not capable of completely

removing the EDC present in the raw water.

Keywords: Endocrine Disruptors Compounds; organic microcontaminants; Water

Quality; Water Treatment; mass spectrometry

  1

1. INTRODUÇÃO

A água é hoje reconhecida como um dos bens naturais mais importantes do

planeta. Seus múltiplos usos são indispensáveis a um amplo espectro das atividades

humanas. Devido a crescente degradação dos corpos d’água, as preocupações com o uso

e destino têm mobilizado pessoas de diversas áreas acadêmicas a pesquisas científicas

com o intuito de preservar e recuperar esse recurso natural.

A partir da década de 70, o interesse da comunidade acadêmica e a criação de

órgãos de proteção ambiental, como a Agência de Proteção Ambiental dos Estados

Unidos (USEPA), promoveram um crescimento de pesquisas envolvendo

monitoramento de microcontaminantes orgânicos em diversos setores ambientais. Com

isso, o interesse dos setores público e privado por assuntos ambientais resultou em

várias organizações governamentais e não-governamentais que hoje debatem,

estabelecem normas e discutem práticas de minimização e remediação de substâncias

químicas potencialmente poluentes.

Dentre as substâncias químicas potencialmente poluentes, nos últimos anos,

destacaram-se alguns compostos denominados perturbadores endócrinos (PE), que são

substâncias que podem provocar alterações no sistema endócrino de animais e de

humanos. Os PE constituem uma classe de substâncias não definidas pela sua natureza

química, mas pelo seu efeito biológico, que pode causar distúrbios no sistema endócrino

mesmo em baixas concentrações. Muitos dos perturbadores endócrinos listados por

algumas organizações como a USEPA e a Agência Ambiental do Reino Unido (UKEA),

também estão classificados numa série de grupos de compostos orgânicos

potencialmente tóxicos, tais como as substâncias tóxicas persistentes (STP), poluentes

orgânicos persistentes (POP), poluentes emergentes, dentre outros. A União Européia

também elaborou um relatório contendo uma vasta lista de 118 compostos suspeitos de

interferir no sistema endócrino, tanto de seres humanos como de diferentes espécies

animais (Ghiselli e Jardim 2007; Damstra et al. 2002).

O interesse no estudo de compostos classificados como PE foi motivado a partir

de observações sobre a ocorrência de anormalidades no sistema endócrino e reprodutivo

de animais. Os sintomas observados têm sido atribuídos à presença de uma grande

variedade de substâncias químicas, mesmo em concentrações-traço, principalmente em

sistemas aquáticos naturais (Auger et al. 1995; Routledge et al. 1998). Uma evidência

dos possíveis efeitos dos PE em seres humanos foi obtida a partir da experiência

  2

envolvendo mulheres grávidas que tomaram o estrogênio sintético dietilestilbestrol

(DES), prescrito para evitar o aborto espontâneo e promover o crescimento do feto, no

período entre 1948 a 1971. Muitas das filhas dessas mulheres são hoje estéreis e, uma

minoria, tem desenvolvido um tipo raro de câncer vaginal (Damstra et al., 2002).

Homens adultos que foram expostos a estradiol mostram maior incidência de

anormalidades em seus órgãos sexuais, apresentam contagem média de espermatozóides

diminuída e podem sofrer um risco maior de desenvolver câncer de testículos (Colucci

et al. 2001; Guillette et al. 1996; Legler et al. 2002).

Dentre a vasta quantidade de PE que já foram avaliados pela comunidade

científica, destacam-se três compostos que são comumente avaliados em diversos

trabalhos, que pode ser justificado pelos seguintes fatores:

i) n-nonilfenol ou nonilfenol: é um subproduto da degradação dos

alquillfenóis polietoxilados (APEO), que são agentes surfactantes de

amplo uso tanto em processos industriais como em produtos de uso

doméstico, por exemplo, detergentes (USEPA 2001);

ii) 17β-estradiol ou estradiol: é um hormônio natural que nas mulheres é

responsável pela síntese de estrogênio circulante, sendo por isso

naturalmente e diariamente excretado na urina humana e, assim,

descartado no esgoto doméstico (Bila e Dezotti 2003);

iii) 17α-etinilestradiol ou etinilestradiol: é um dos estrogênios sintéticos

mais usados como contraceptivos orais, na reposição terapêutica na

menopausa ou na prevenção do aborto (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli e

Jardim 2007).

De acordo com trabalhos nacionais e internacionais, compostos classificados

como PE têm sido detectados em amostras de águas superficiais, principalmente em

função da atividade antrópica (Alda e Barceló 2001). Pesquisas também têm mostrado

que substâncias estrogênicas são encontradas em rios receptores de esgotos domésticos,

tratados ou in natura. Potencialmente danosos à saúde, os PE têm se mostrado

resistentes aos processos de tratamento convencionais utilizados nas estações de

tratamento de esgotos (ETE) e de águas (ETA), sendo a intensidade de remoção dos PE

dependente das condições operacionais impostas no sistema de tratamento. Os poucos

trabalhos existentes sobre o tema indicam que os tratamentos convencionais não

  3

conseguem remover completamente tais micropoluentes, havendo relato da presença de

diversos fármacos e de estrogênios naturais e sintéticos no esgoto doméstico e efluentes

de ETEs (Jeannot et al. 2002; Körner et al. 2000).

Em relação aos corpos d’água, outro fator importante é que pouco se sabe sobre

o real impacto desses compostos sobre o ambiente aquático e, principalmente, sobre a

saúde humana. No caso do Brasil, a ausência de ETEs em grande parte dos municípios

brasileiros agrava ainda mais o quadro de possível contaminação das águas superficiais

por PE.

Tendo em vista a crescente preocupação ambiental dedicada aos “perturbadores

endócrinos”, principalmente no Brasil, o objetivo deste trabalho é desenvolver uma

metodologia analítica que permita a detecção e quantificação de três PE (NP, E2 e EE2)

em amostras de água superficiais a partir da técnica de LCMS. Serão também

discutidos, brevemente, resultados sobre análises dos três compostos a partir da

cromatografia gasosa com detector por ionização em chama (CG-FID). Após o

desenvolvimento da técnica de análise, será feito o monitoramento de três mananciais

de abastecimento da RMBH: Rio das Velhas e Morro Redondo e Vargem das Flores.

Dessa forma, o primeiro capítulo de resultados apresentará o procedimento para

validação da metodologia analítica empregada e discutirá os parâmetros mais relevantes

para análise. O segundo capítulo de resultados apresentará os dados do monitoramento

de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em três pontos de captação de água da região

metropolitana de Belo Horizonte (RMBH) e discutirá os resultados obtidos. Finalmente,

o capítulo de conclusões consubstanciará as informações mais relevantes e destacará a

contribuição da dissertação para o tema pesquisado.

  4

2. OBJETIVOS

O objetivo geral do trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a

detecção e quantificação dos perturbadores endócrinos nonilfenol (NP), estradiol (E2) e

etinilestradiol (EE2) em amostras de água usando cromatografia acoplada a

espectrometria de massas (LCMS).

Objetivos específicos:

• Monitorar, pelo período de um ano, a água de três mananciais da região

metropolitana de Belo Horizonte para avaliar a presença de NP, E2 e EE2;

• Avaliar, de forma geral, a eficiência das etapas de pré-cloração, coagulação,

sedimentação e filtração, empregadas nas estações de tratamento de água (ETA)

monitoradas, na remoção de NP, E2 e EE2.

  5

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. O sistema endócrino

Dá-se o nome de sistema endócrino ao conjunto de órgãos que apresentam como

atividade característica a produção de secreções denominadas hormônios, que são

lançados na corrente sangüínea e irão atuar em outra parte do organismo, controlando

ou auxiliando o controle de sua função. Os órgãos que têm sua função controlada e/ou

regulada pelos hormônios são denominados órgãos-alvo (Guyton 1988).

Os hormônios influenciam praticamente todas as funções dos demais sistemas

corporais. Freqüentemente o sistema endócrino interage com o sistema nervoso,

formando mecanismos reguladores bastante precisos. O sistema nervoso pode fornecer

ao endócrino a informação sobre o meio externo, ao passo que o sistema endócrino

regula a resposta interna do organismo a esta informação. Dessa forma, o sistema

endócrino, juntamente com o sistema nervoso, atua na coordenação e regulação das

funções corporais (Guyton 1988). A Figura 3.1 apresenta os órgãos do sistema

endócrino. As propriedas dos órgãos do sistema endócrino serão discutidas a seguir.

Figura 3.1 - Órgãos do sistema endócrino (Fonte: AFH, 2007).

Hipófise ou pituitária: os hormônios produzidos pela hipófise são denominados tróficos

por atuarem sobre outras glândulas endócrinas. São responsáveis por ativar a secreção

de outros hormônios como os da glândula tireóide, glândula adrenal, gônadas e do

crescimento.

http://www.afh.bio.br/nervoso/nervoso1.asp

  6

Hipotálamo: responsável pelo controle da hipófise através de conexões neurais e

substâncias semelhantes a hormônios chamados fatores desencadeadores (ou de

liberação), o meio pelo qual o sistema nervoso controla o comportamento sexual via

sistema endócrino. Em mulheres, a glândula-alvo do hormônio gonadotrófico é o

ovário; no homem, são os testículos. O hipotálamo é responsável pelo controle de

inibição ou liberação destes hormônios. Como a hipófise secreta hormônios que

controlam outras glândulas e está subordinada, por sua vez, ao sistema nervoso, pode-se

dizer que o sistema endócrino é subordinado ao nervoso e que o hipotálamo é o

mediador entre esses dois sistemas A Figura 3.2 apresenta um diagrama de

funcionamento do hipotálamo.

Figura 3.2 - Funcionamento do hipotálamo (Fonte: AFH, 2007).

Tireóide: responsável pela produção de hormônios como triiodotironina (T3) e tiroxina

(T4), que aumentam a velocidade dos processos de oxidação e de liberação de energia

nas células do corpo, elevando a taxa metabólica e a geração de calor. A calcitonina,

outro hormônio secretado pela tireóide, participa do controle da concentração sangüínea

de cálcio, inibindo a remoção do cálcio dos ossos e a saída dele para o plasma

sangüíneo, estimulando sua incorporação pelos ossos.

Paratireóides: glândulas responsáveis pela secreção do paratormônio, hormônio que

estimula a remoção de cálcio da matriz óssea (o qual passa para o plasma sangüíneo), a

absorção de cálcio dos alimentos pelo intestino e a reabsorção de cálcio pelos túbulos

renais, aumentando a concentração de cálcio no sangue.

Adrenais ou supra-renais: são duas glândulas localizadas sobre os rins, divididas em

duas partes independentes, medula e córtex.

  7

Pâncreas: é uma glândula mista, ou seja, apresenta determinadas regiões endócrinas e

exócrinas ao mesmo tempo. As funções endócrinas do pâncreas são responsáveis por

células que secretam dois hormônios: insulina e glucagon.

3.2. Perturbadores endócrinos

O termo “Pertubador Endócrino” é utilizado nesse texto como sinônimo de

disruptores endócrinos, interferentes endócrinos e agentes hormonalmente ativos, que

na literatura internacional corresponde aos “endocrine disrupting compounds or

chemicals” (EDC). Os termos mais usados são perturbadores endócrinos e disruptores

endócrinos. Muitas definições têm sido propostas para tal classe de compostos,

entretanto, para todas elas existe um ponto em comum: trata-se de uma substância

química que pode interferir no funcionamento natural do sistema endócrino de espécies

animais, incluindo os seres humanos.

Alguns pesquisadores definem um interferente endócrino com base nos seus

efeitos, ou seja, trata-se de uma substância química que, mesmo presente em

concentração extremamente baixa, é capaz de interferir no funcionamento natural do

sistema endócrino, podendo causar câncer, prejudicar os sistemas reprodutivos e causar

outros efeitos adversos (Mozaz et al. 2007; Yang et al. 2006). Em maio de 1997, a

agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (Environmental Protection Agency -

USEPA), definiu um interferente endócrino como “agente exógeno que interfere com

síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônio natural no corpo,

que são responsáveis pela manutenção, reprodução, desenvolvimento e/ou

comportamento dos organismos”.

O Programa Internacional de Segurança Química (IPCS), em conjunto com o

Japão, os EUA, o Canadá, a Organização para a Cooperação e Desenvolvimento

Econômico (OCDE) e a União Européia, adotou a seguinte definição para os

perturbadores endócrinos: “Um perturbador endócrino é uma substância ou um

composto exógeno que altera uma ou várias funções do sistema endócrino e tem,

conseqüentemente, efeitos adversos sobre a saúde num organismo intacto, sua

descendência, ou (sub) populações” (CEC 1999).

Os PE podem ser produtos naturais, como os fitoestrógenos produzidos por

plantas, e por isso bastante comuns em alimentos de origem vegetal; ou produtos

sintéticos, como no caso de solventes clorados, aditivos alimentares, constituintes de

  8

produtos de limpeza, agrotóxicos, e cosméticos; pílulas anticoncepcionais e outros

fármacos. Desta forma, a exposição aos perturbadores endócrinos pode ocorrer a partir

de uma variedade de fontes, de forma voluntária ou não, inclusive por meio da dieta

diária e do consumo de água potável (Damstra et al. 2002; Solé et al. 2003; Veras

2006). A Figura 3.3 mostra exemplos de perturbadores endócrinos comumente

presentes no ambiente (Laganà et al. 2004).

 

Figura 3.3 – Estruturas químicas de alguns perturbadores endócrinos comumente encontrados em águas superficiais (Laganà et al. 2004).

Embora desde o início do século XX já existissem hipóteses prevendo alterações

no funcionamento do sistema endócrino de algumas espécies animais expostas a

determinadas substâncias químicas tóxicas, apenas recentemente esta importante

questão tem recebido a devida atenção por parte da comunidade científica. Isso pode ser

constatado pelo número crescente de publicações que relatam o aumento da incidência

de disfunções no sistema endócrino de seres humanos (incluindo a infertilidade

masculina), e mais significativamente, efeitos fisiológicos adversos observados em

espécies animais para as quais a relação causa/efeito é mais evidente (Damstra et al.

2002).

De fato, as evidências observadas em estudos envolvendo moluscos, crustáceos,

peixes, répteis, pássaros e alguns mamíferos têm sugerido que possíveis alterações de

saúde humana envolvendo o sistema reprodutivo, tais como o câncer de mama e de

testículo, podem estar relacionadas à exposição aos Perturbadores Endócrinos

(Lintelmann et al. 2003). Para esclarecer, desenvolver estratégias e solucionar o

problema dos perturbadores endócrinos, várias organizações governamentais e não

governamentais, como, União Européia (UE), US-EPA, Damstra et al. 2002, IPCS e a

  9

Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE), investigaram

o tema “perturbadores endócrinos”, conforme mostra a Tabela 3.1.

Tabela 3.1: Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os Perturbadores Endócrinos (Bila e Dezotti 2007). Ano Organização Objetivos do Estudo 1995 Agência Ambiental Federal

Alemã Discussão sobre evidência e impactos dos PE e riscos potenciais que podem causar em humanos e animais

1995 Agência Proteção Ambiental Americana (USEPA)

Seminários para avaliar os riscos à saúde e efeitos ambientais dos PE

1995 Ministério do Meio Ambiente e Energia da Dinamarca

Avaliação dos efeitos de substâncias estrogênicas no desenvolvimento e nas funções do sistema reprodutivo masculino

1996 USEPA  Seminário para desenvolvimento de estratégia para avaliar o risco dos PE no ambiente

1996 USEPA  Desenvolvimento de programa de testes e análises (screening) para avaliar a ação dos PE

1997 USEPA  Relatório sobre os PE presentes no meio ambiente 1998 USEPA  Revisão e discussão das informações científicas

disponíveis sobre PE 1998 Organização para a Cooperação

e Desenvolvimento Econômico (OCDE)

Desenvolvimento de métodos de ensaio para os PE

1999 Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment

(CSTEE)

Revisão da literatura existente e opinião científica nas evidências dos PE, em particular, avaliação dos riscos ecológicos e diretrizes de ensaios toxicológicos

1999 Comissão das Comunidades Européias

Identificação do problema dos PE, suas causas, conseqüências e definição das medidas adequadas para dar uma resposta ao problema

2001 Comissão das Comunidades Européias

Primeiro relatório sobre o progresso dos trabalhos da comunidade européia sobre os PE

2002 Comissão das Comunidades Européias

Programa COMPREHEND: Avaliação das evidências dos PE no ambiente aquático na Europa

2002 OCDE Avaliação dos métodos de ensaios para as substâncias estrogênicas

2002 Organização Mundial da Saúde (OMS)

Avaliação global do estado da arte da ciência dos PE

2003 Instituto de Saúde Ecológica (IHE)

Relatório de avaliação do progresso internacional da pesquisa dos PE

2004 Comissão das Comunidades Européias

Segundo relatório sobre o progresso dos trabalhos sobre os PE.

3.2.1. Mecanismos de Ação dos Perturbadores Endócrinos

A ação de um determinado hormônio inicia-se através da sua ligação a um

receptor específico, no interior de uma célula. O complexo resultante liga-se a regiões

  10

específicas do DNA presente no núcleo da célula, o que determina a ação dos genes.

Certos compostos químicos podem também se ligar ao receptor hormonal e,

conseqüentemente, mimetizar ou bloquear a ação do próprio hormônio (Ghiselli e

Jardim 2007; Damstra et al. 2002; Soto et al. 1991).

Esta mudança de atividade é transmitida por várias vias metabólicas, através da

membrana plasmática, dependendo do tipo de hormônio. Os diferentes processos

fisiológicos (em cascata e independentes) obtidos são controlados por mecanismos

complexos, que são ativados ou desativados de acordo com os níveis dos hormônios

encontrados no organismo. Embora muitas destas vias metabólicas possam ser

influenciadas por estimulações externas ao organismo, a grande maioria das disfunções

endócrinas observadas é atribuída ao funcionamento das gônadas, responsáveis pelas

características sexuais secundárias e pelo desenvolvimento e funcionamento dos órgãos

sexuais (Ghiselli e Jardim 2007; OMS 2002).

Um receptor hormonal possui elevada sensibilidade e afinidade por um

hormônio específico produzido no organismo. Por isso, concentrações extremamente

baixas de um determinado hormônio geram um efeito, produzindo uma resposta natural

(Figura 3.4a). Entretanto, estes receptores hormonais também podem se ligar a outros

compostos químicos, e isso explica o porquê de determinados perturbadores endócrinos

presentes no organismo, mesmo em baixíssimas concentrações, serem capazes de gerar

um efeito, provocando conseqüentemente uma resposta (Damstra et al., 2002).

A alteração no sistema endócrino ocorre quando o PE interage com os receptores

hormonais modificando a sua resposta natural, e para isso dois processos distintos

podem ser desencadeados. O PE pode se ligar ao receptor hormonal e produzir uma

resposta, atuando então como um mimetizador, ou seja, imitando a ação de um

determinado hormônio, processo este denominado de efeito agonista (Figura 3.4b). Se o

PE se ligar ao receptor, mas nenhuma resposta for produzida, ele estará agindo como

um bloqueador, ou seja, estará impedindo a interação entre um hormônio natural e o seu

respectivo receptor. Este processo é denominado de efeito antagonista (Figura 3.4c)

(Ghiselli 2006).

Um exemplo de perturbação endócrina é o caso do estradiol. Muitos PE

competem com o estradiol, pelos receptores de estrogênio. Outros competem com a

dihidrotestosterona (hormônio sexual masculino produzido naturalmente pelo

organismo), pelos receptores de androgênio. Portanto, estes compostos exercem efeitos

de feminização ou masculinização sobre o sistema endócrino. Compostos que produzem

  11

efeitos de feminização são conhecidos como estrogênicos, enquanto que os que

produzem efeitos de masculinização são conhecidos como androgênicos. Assim, se um

determinado composto é considerado anti-androgênico como a flutamida (fármaco

utilizado no tratamento de câncer de próstata) ele certamente inibirá a ação biológica

dos androgênios, ligando-se e, conseqüentemente, inativando os receptores de

androgênios presentes nos tecidos-alvo. Já um composto anti-estrogênico como o

tamoxifeno (fármaco utilizado no tratamento de câncer de mama) inibe a ação biológica

dos estrogênios ligando-se e, conseqüentemente, inativando os receptores de estrogênios

presentes nos tecidos-alvo (Joon Kang et al. 2002; Panter et al. 2000).

Figura 3.4 - Disfunções endócrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista; (c) efeito antagonista (Ghiselli, 2006).

3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endócrinos em animais silvestres e de laboratório

Vários estudos relacionam a poluição ambiental das águas naturais com

anomalias no sistema reprodutivo e no desenvolvimento de diferentes espécies de

animais. A exposição aos perturbadores endócrinos pode ser responsável por alterações

fisiológicas e histológicas em animais silvestres e de laboratório, incluindo alterações

nos níveis de vitelogenina (VTG) no plasma sangüíneo, feminização de peixes machos,

indução ao hermafroditismo, inibição no desenvolvimento das gônadas e declínio na

reprodução. Essas e outras anomalias relatadas em várias espécies de animais são

apresentadas na Tabela 3.2.

  12

Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribuídos aos perturbadores endócrinos em animais (Bila e Dezotti 2007)

Espécie Contaminante Efeitos Referência Feminização de Peixes (Allen et al. 1999)

Declínio da Reprodução (Robinson et al. 2003)

Efluente de ETE

Indução da síntese de VTG (Allen et al. 1999; Solé et al.

2000; Solé et al. 2003) Feminização de Peixes (Körner et al. 2000) Alteração nas gônadas (Panter et al. 2000)

Hermafroditismo (Hartley et al. 1998) Incidência de Testículo-Ovulos nas

gônadas (Joon Kang et al. 2002) Declínio da Reprodução (Shioda e Wakabayashi 2000)Mortalidade elevada dos

descendentes (Knorr e Braunbeck 2002)

17β-Estradiol Indução da síntese de VTG (Routledge et al. 1998)

Indução da síntese de VTG (Folmar et al. 2000) Mortalidade da espécie (Schmid et al. 2002)

17α-etinilestradiol

Declínio da Reprodução (Robinson et al. 2003) Estrona Indução da síntese de VTG (Routledge et al. 1998)

Declínio da Reprodução Indução da síntese de VTG

(Jobling e Sumpter 1993; Routledge et al. 1998) Octilfenol

Nonilfenol Butilfenol

Mortalidade elevada dos descendentes

Feminização de Peixes (Knorr e Braunbeck 2002)

Peixe Bisfenol A Declínio da Reprodução (Shioda e Wakabayashi 2000)

Bisfenol A Anomalia no sistema reprodutivo de

ratos (Markey et al. 2002) Mamífero PCB Alta mortalidade de golfinhos (Aguilar e Borrell 1994)

DDE e DDT

Concentrações anormais de hormônios sexuais no plasma e

anomalias morfológicas nas gônadas

(Guillette et al. 1996; Guillette et al. 1999; Milnes

et al. 2002)

Réptil 17β-Estradiol

Indução da síntese de VTG no sangue e alterações na produção de

ovos de tartaruga (Irwin et al. 2001) Feminização de Gaivotas machos (Fry e Toone 1981) DDT

Anomalia no sistema reprodutivo (Bitman et al. 1968) Aves DDE Nascimento prematuro de aves (Damstra et al. 2002)

Anfíbio Efluente de

ETE Indução à síntese de VTG no sangue

e hermafroditismo (Bogi et al. 2003)

Vários estudos mostram que organismos aquáticos respondem com indução da

síntese de VTG à exposição a determinadas concentrações de estrogênios (Panter et al.

2000; Robinson et al. 2003). No estudo de Routledge et al. 1998, duas espécies de

  13

peixes, Oncorhynchus mykiss e Rutilus rutilus, foram expostas por 21 dias a

concentrações de E2 e estrona (E1) ambientalmente relevantes (1, 10, 100 ng.L-1). Os

resultados mostraram que as espécies do sexo masculino são sensíveis para E2 e E1 nas

concentrações utilizadas, pois ocorreu aumento na concentração de VTG no plasma

sanguíneo durante o período de exposição. Entre as fêmeas da espécie Rutilus rutilus

ocorreu diminuição do tamanho do ovo.

De acordo com esses e outros pesquisadores, os resultados confirmaram que os

estrogênios identificados em efluentes domésticos estão presentes em quantidades

suficientes para induzir o surgimento de órgãos masculinos em peixes fêmeas,

conhecido como “imposex”, ou imposição sexual (Ghiselli 2006). Este fenômeno é

irreversível e provoca a esterilização das espécies, podendo causar declínio considerável

nas populações de espécies mais sensíveis. Segundo o estudo de Fernandez et al (2002),

os PE encontrados nas águas estudadas (organoestânicos) interferiram na síntese da

testosterona (hormônio masculino), ocorrendo aumento na produção deste pelas fêmeas.

Consequentemente, a alteração hormonal faz surgir estruturas sexuais masculinas não

funcionais, mantendo-se, porém, a anatomia interna do organismo (Fernandez et al.

2002; Damstra et al. 2002).

Foram observadas anomalias em embriões machos e fêmeas de trutas, como por

exemplo, a feminização dos machos (Körner et al. 2000; Damstra et al. 2002). Várias

espécies de peixes são usadas como modelo para detectar os efeitos de perturbadores

endócrinos no desenvolvimento de anomalias no sistema reprodutivo. O estudo de

Legler et al (2002) mostrou que as substâncias com atividade estrogênica não só são

importantes na fase aquosa, mas também podem acumular-se em sedimentos marinhos e

expor os organismos em ambientes aquáticos a substâncias com atividade estrogênica.

3.2.3. Efeitos dos perturbadores endócrinos em humanos

Uma variedade de substâncias químicas é suspeita de causar efeitos adversos na

saúde humana, resultando em alterações no sistema endócrino, incluindo efeitos no

sistema reprodutivo feminino e masculino. Os efeitos dos PE em humanos foram

revisados em alguns estudos como o relatório “Global Assessment of the State-of-the-

Science of Endocrine Disrupters” do estudo feito pela International Pannel on

Chemical Safety (IPCS) encomendado pela Organização Mundial da Saúde (Damstra et

al. 2002). Uma das conclusões do estudo foi a possível relação entre alguns PE e

  14

alterações na saúde humana, como o câncer de testículo, mama e próstata. A

conseqüência da exposição aos PE foi relacionada ao declínio das taxas de

espermatozóides, deformidades dos órgãos reprodutivos e disfunção da tireóide.

Vários grupos de pesquisas acreditam que grande parte da população masculina

sofre com o decréscimo na qualidade do sêmen nas últimas décadas, e que isso parece

estar relacionado à presença de estradióis nas águas (Damstra et al., 2002). De 1973 a

1994, analisaram a qualidade do sêmen de um grupo de homens férteis saudáveis,

levando em conta o volume do fluido seminal, a concentração de esperma e a

mobilidade e morfologia dos espermatozóides. Os autores observaram um declínio na

concentração e mobilidade dos espermas nos homens por um período de 20 anos, e esse

decréscimo da qualidade do sêmen coincide com o aumento na incidência de anomalias

no sistema reprodutivo masculino, incluindo câncer testicular (Auger et al. 1995).

O desenvolvimento e as funções do sistema reprodutivo feminino dependem do

balanço e das concentrações dos hormônios (estrogênios, andrógenos e tireoidianos).

Portanto, uma disfunção no sistema endócrino pode resultar em algumas anomalias, tais

como, irregularidades no ciclo menstrual, prejuízos na fertilidade e ovários policísticos.

No entanto, devido à capacidade dos PE em modular ou alterar a intensidade dos

hormônios, resta saber se essas substâncias podem realmente afetar as funções do

sistema reprodutivo feminino. Alguns fatos demonstram que isso pode realmente

ocorrer, como o uso de dietilestilbestrol (DES) em mulheres grávidas na década de 70.

Uma das conseqüências foram anomalias do sistema reprodutivo feminino (câncer

vaginal, gravidez anormal e redução na fertilidade) de crianças nascidas a partir de mães

que fizeram uso desse medicamento. Este fato é, sem dúvida, uma evidência dos efeitos

à exposição aos perturbadores endócrinos (Damstra et al. 2002).

Apesar de alguns pesquisadores não sugerirem uma correlação entre a exposição

aos perturbadores endócrinos e efeitos danosos em humanos, revisões como a da OMS

(Damstra et al. 2002) indicam que há claras evidências experimentais e epidemiológicas

dessas substâncias na disfunção no sistema reprodutivo humano (Ghiselli 2006).

3.3. Análise e Monitoramento de Perturbadores Endócrinos em Águas Superficiais

Uma importante fonte de contaminação de águas superficiais com perturbadores

endócrinos (PE) é o lançamento de esgotos domésticos tratados ou in natura. Vários

estudos mostram que as águas receptoras de efluentes de estações de tratamento de

  15

esgoto doméstico (ETEs) foram estrogênicas para peixes, e que a proporção da

intersexualidade nos peixes estava correlacionada com a quantidade dos efluentes

lançados nas águas dos rios estudados (Folmar et al. 2000; Solé et al. 2003; Van den

Belt et al. 2004). Além das emissões pontuais de efluentes doméstico e industrial,

emissões difusas, associadas à chuva e ao escoamento que dela resulta, chegam aos

corpos de água e podem contribuir para o aporte de PE. A poluição difusa pode ocorrer

devido às deposições atmosféricas (poluição industrial e veicular), à lixiviação de solo

contaminado (Ex. drenagem de lixões) e ao escoamento de águas pluviais em ambientes

rurais (Ex. pesticidas) e urbanos (Ex. óleos, lixo). A Tabela 3.3 mostra as classes de

alguns perturbadores endócrinos e a Figura 3.3 mostra a estrutura química de alguns

perturbadores endócrinos comumente encontrados em águas superficiais.

Tabela 3.3: Classificação de alguns perturbadores endócrinos (adaptado de Mol et al. 2000)

Tipo de composto Uso Pesticidas Agricultura (ex: DDT)

Hormônios naturais e sintéticos

Contraceptivos, agentes de crescimento (ex: estradiol e etinilestradiol)

Alquilfenóis polietoxilados

(APEOs)

Detergentes, cosméticos, agroquímicos

Alquilfenóis Produtos de degradação dos APEOs (ex: nonilfenol, octilfenol), anti-oxidantes

PCBs / dioxinas Fluidos para refrigeração / subprodutos da combustão

Ésteres ftalatos Plastificantes Fitoestrogênios Ocorrência natural em plantas

Bisfenol A Produção de polímeros, degradação de plásticos (policarbonatos)

 

3.3.1. Metodologias para análise de perturbadores endócrinos

Diferentes métodos analíticos têm sido desenvolvidos para a determinação de

perturbadores endócrinos em amostras ambientais (Mol et al. 2000). A metodologia de

análise ideal deve ser rápida, exata, precisa, de fácil adaptação e consumir a menor

quantidade de insumos possíveis (Mozaz et al. 2007). As metodologias utilizadas para a

análise de perturbadores endócrinos são, em sua maioria, técnicas cromatográficas que

podem utilizar equipamentos de cromatografia líquida (Hu et al. 2005; Komori et al.

  16

2004) ou de cromatografia gasosa (Wang et al. 2005; Yang et al. 2006). Em ambos os

casos, a quantificação dos perturbadores endócrinos nas concentrações ambientais é

normalmente feita com espectrômetros de massa, dada à sua elevada especificidade.

Outro método de análise baseado em técnicas enzimáticas ou bioensaios também têm

sido estudados, todavia, seu maior custo operacional e a pouca especificidade do

método tem favorecido o uso das técnicas cromatográficas na análise de perturbadores

endócrinos (Farré et al. 2007)

Basicamente, a determinação dos PE em amostras aquosas envolve três etapas:

amostragem, pré-concentração e análise. Para a determinação de perturbadores

endócrinos é necessário usar critérios analíticos rigorosos para que as várias etapas,

como amostragem, transporte, estocagem e análise, tenham o menor erro possível, tendo

em vista a baixa quantidade dos PE (µg.L-1 a ng.L-1) nas amostras ambientais (Liu et al.

2004b). A Figura 3.5 mostra um diagrama simplificado do protocolo de análise dos PE.

Figura 3.5 - Diagrama esquemático para preparação e análise dos perturbadores endócrinos

Amostragem, filtração e ajuste de pH

A primeira etapa da análise é a amostragem, e a qualidade do processo de

amostragem e preparação das análises é um fator determinante para um resultado

correto (Mozaz et al. 2007). Como os PE em amostras de água podem sofrer degradação

biológica durante o transporte e estocagem, é comum adicionar alguns biocidas, como o

formaldeído ou metanol, bem como manter as amostras em baixa temperatura (4 ºC) até

  17

o procedimento de extração e concentração. O tempo máximo recomendado entre a

coleta e a extração é de 48 horas (Fountoulakis et al. 2005; Wang et al. 2005), sendo a

coleta feita em frascos de cor escura uma vez que alguns estrogênios, como estradiol,

podem ser foto-degradados (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005).

A quantidade de água coletada pode variar de acordo com as propriedades

intrínsecas da água analisada, tipo de composto, método de extração e aparelho utilizado

para quantificação. Aparelhos com grande sensibilidade, águas com nível alto de

poluição e alguns métodos de extração como a microextração por fase sólida (SPME)

geralmente necessitam de pouca quantidade de amostra (Yang et al 2006). Contudo,

para a maioria dos casos é necessária uma quantidade maior de água, que normalmente

varia de 250 a 1000 mL (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005). Como exemplo,

Lagana et al (2004) fizeram análise de perturbadores endócrinos em diferentes matrizes,

e o volume de amostra variou de 110 mL para esgoto bruto a 1000 mL para água de rio.

Após coletada a amostra, a primeira etapa de preparação consiste na sua

filtração. A filtração tem a finalidade de retirar os sólidos presentes na água, evitando

assim o comprometimento (entupimento e queda na taxa de filtração) da etapa posterior

de concentração em cartuchos de extração em fase sólida. Embora a maioria das

membranas utilizadas e citadas na literatura seja de acetato de celulose, recomenda-se a

utilização de membranas de materiais mais inertes (teflon, fibra de vidro, nylon) para

evitar a adsorção de perturbadores durante a etapa de filtração. As membranas mais

utilizadas na filtração são de 0,45µm feitas de acetato de celulose. Etapas preliminares

de filtração, como a utilização de filtros de 8µm, podem ser necessárias dependendo da

quantidade de sólidos presentes na água. Isso é particularmente importante durante a

amostragem de água de mananciais superficiais durante períodos chuvosos.

Em seguida é feito o ajuste do pH da amostra, que tem como finalidade

aumentar a afinidade dos perturbadores endócrinos, principalmente aqueles de caráter

ácido como nonilfenol, bisfenol e estrona, pela fase estacionária do cartucho de

extração, aumentando assim sua extração da fase aquosa (Raimundo 2007). De fato, Liu

et al (2004b) fizeram um trabalho para avaliar a influência do pH inicial da amostra na

eficiência de extração, e os resultados obtidos mostraram que a melhor recuperação

obtida foi àquela feita em meio mais ácido. À medida que o pH era diminuído, o índice

de recuperação aumentava, chegando a 100% para alguns compostos no pH igual a 3. O

pH escolhido para as amostras pode variar de acordo com a capacidade máxima que o

cartucho de extração suporta, mas a maioria dos trabalhos de fato utilizam o pH

  18

variando entre 2 e 3, sendo 3 o valor de pH mais utilizado (Gibson et al. 2007; Wang et

al. 2005). Os ácidos mais utilizados para a correção do pH são o clorídrico (HCl) ou o

sulfúrico (H2SO4).

Concentração e eluição dos compostos de interesse

Os PE são, em sua maioria, compostos orgânicos hidrofóbicos encontrados em

baixas quantidades no ambiente, e como a maioria dos equipamentos não consegue

detectá-los nas concentrações usualmente encontradas, uma etapa de concentração é

usualmente necessária (Ghiselli e Jardim 2007). Atualmente existe um considerável

interesse no desenvolvimento de novos métodos seletivos para extração e isolamento

dos componentes de matrizes ambientais complexas (Kasprzyk-Hordern et al. 2007). A

seletividade da fase estacionária é um importante parâmetro, uma vez que um dos

principais objetivos seria remover os interferentes e facilitar as análises posteriores

feitas nos equipamentos de LC-MS e CG-MS (Mozaz et al. 2007). A alternativa mais

utilizada para contornar esses problemas tem sido a extração em fase sólida (Solid

Phase Extration - SPE). A SPE é uma técnica de separação líquido-sólido que, do ponto

de vista prático, pode ser descrita como uma cromatografia líquida, onde se usa uma

pequena coluna aberta, denominada cartucho de extração, que contém a fase sólida (o

correspondente à fase estacionária em cromatografia).

No procedimento de extração a amostra contendo o analito de interesse é

colocada no topo do cartucho e aspirada através dele pela aplicação de um pequeno

vácuo. Ao passar a amostra pelo cartucho o analito fica retido (adsorvido) na fase

sólida, de forma a ser posteriormente eluído com um pequeno volume de solvente, e

essa etapa de eluição permite a determinação do grau de concentração necessário para a

análise uma vez escolhido o volume inicial de amostragem e o volume final de solvente

eluído. Se houver contaminantes que possam interferir na análise, uma lavagem e/ou

clean-up precede a eluição, com a utilização de um solvente que tenha afinidade pelo

contaminante e não pelos compostos de interesse. Em muitos casos, onde a amostra não

precisa ser filtrada, a própria etapa de extração em fase sólida funciona como clean-up

(Lanças 2004a). A Figura 3.6 exemplifica as etapas envolvidas na extração em fase

sólida.

  19

Figura 3.6 - Etapas da extração por fase sólida para isolamento de compostos de interesse (Lanças 2004a)

Atualmente um grande número de cartuchos de SPE está disponível de modo

que possa ser utilizado por uma grande faixa de aplicações. Um adsorvente genérico é

capaz de adsorver uma grande variedade de PE, mas alguns compostos específicos

exigem cartuchos mais seletivos. O mecanismo mais utilizado é a interação hidrofóbica

e as fases sólidas mais reportadas nos trabalhos são as compostas de octadecil (C18) e

sílica. A Tabela 3.4 mostra os cartuchos mais utilizados na extração por fase sólida para

os perturbadores endócrinos nonilfenol e estradióis.

Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes

Cartuchos Descrição Fabricante Oasis HLB Poli(divinilbenzeno-co-N-vinilpirrolidona) Waters

C18 Polimericamente ligado, octadecil (18% C) Vários C18/ENV+ C18 hidroxilado poliestireno-divinilbenzeno IST

Liu et al (2004b) fizeram um estudo a respeito da eficiência de recuperação dos

PE em relação ao tipo de cartucho SPE. A conclusão obtida foi que o melhor cartucho

para adsorção de alquilfenóis e estrogênios é o conhecido como Oasis HLB 500mg. O

maior inconveniente na utilização deste tipo de cartucho é o preço, cerca de cinco vezes

superior aos cartuchos de eficiência de recuperação semelhante, como o DSC-18. Dessa

forma, fases estacionárias compostas de octadecil (C18) possuem melhor relação custo-

benefício.

Uma das grandes desvantagens obtidas na extração em fase sólida é a quantidade

de amostra a ser coletada para análise. Para uma concentração de 1000 vezes, por

exemplo, necessita-se, em média, de 1 litro da amostra, e o tempo de extração pode ser

bastante demorado, podendo chegar a até 3 horas (Wang et al. 2005). Kuch e

Ballschmiter (2001) e Snyder et al (1999) alcançaram baixos limites de detecção de

  20

estradiol natural, etinilestradiol e nonilfenol devido ao grande volume de amostra

utilizado, que chegou a 5 litros com uma pré concentração de 5000 vezes.

Uma das soluções apresentadas seria a microextração por fase sólida (SPME), a

qual possui as mesmas funcionalidades da SPE e reduz consideravelmente a quantidade

de amostra e tempo de extração para análise. Yang et al (2006) compararam as

metodologias SPME e SPE e os resultados obtidos mostraram que a SPME é bastante

promissora para a análise de estrogênios, anabolizantes e alquilfenóis, sendo possível

utilizar apenas 3mL de amostra para obter fatores de concentração de 100 vezes.

Recentemente, Wang et al (2008) criaram um método alternativo de extração utilizando

filtros de cigarro como cartuchos de SPE. Uma vez que os filtros de cigarro são

utilizados para a retenção de parte dos poluentes orgânicos gerados pela fumaça,

avaliou-se a capacidade destes em reter alguns PE como o estradiol. Uma das grandes

vantagens seriam o baixo custo e a facilidade de aplicação. Os resultados obtidos

chegaram a 100% de recuperação do estradiol para amostras do rio monitorado.

A eluição do cartucho, ou seja, a dessorção dos compostos de interesse vai

depender do tipo de composto a ser analisado. Trabalhos publicados utilizam

geralmente metanol, acetato de etila e acetona, puros ou misturados, como agentes de

eluição (Alda e Barceló 2001; Gibson et al. 2007; Laganà et al. 2004; Wang et al.

2005). É importante destacar que a eluição é normalmente feita com um volume maior

de solvente (5 a 15 ml) para assegurar a completa dessorção dos analitos de interesse.

Desta forma, para se obter um elevado grau de concentração é preciso secar o extrato

orgânico e re-solubilizar o analito em volume adequado de solvente.

Além de obter o grau de concentração adequado, a secagem permite ainda

adequar o solvente ao método de análise tendo em vista que o solvente utilizado na

eluição pode ser incompatível com o equipamento cromatográfico. Um exemplo é o

diclorometano, que não é recomendado para análises em cromatografia líquida devido a

sua alta volatilidade, mas que foi utilizado (junto com o metanol em solução 1:1) por

Laganà et al (2004) para a eluição de fitoestrogênios, micoestrogênios, estrogênios e

alquilfenóis.

A secagem dos extratos orgânicos é normalmente feita em banho-maria à

temperatura pouco maior que a ambiente. Além disso, é comum utilizar fluxo de

nitrogênio sobre os extratos orgânicos para acelerar o processo de secagem. Conforme

dito anteriormente, a reconstituição do extrato seco é feita com o solvente mais

apropriado para análise cromatográfica. Para a cromatografia líquida geralmente utiliza-

  21

se acetonitrila e metanol como solventes de reconstituição, ao passo que para

cromatografia gasosa é comum o uso de solventes mais voláteis como acetona e acetato

de etila (Jeannot et al. 2002). Outros métodos analíticos, como a utilização de kits

enzimáticos, exigem a reconstituição em soluções tampão de fosfato (Farré et al. 2007).

Análise Instrumental

Do ponto de vista analítico, os métodos mais adequados para monitoramento dos

PE em amostras ambientais incluem, genericamente, métodos biológicos e métodos de

separação (Farré et al. 2007). Dentre os métodos biológicos destacam-se,

principalmente, os imunoensaios, cujos princípios são a produção de anticorpos e/ou

receptores que se ligam especificamente a substâncias que apresentam atividade

estrogênica. A Figura 3.7 exemplifica os dois passos genericamente associados aos

imunoensaios. Inicialmente ocorre a imobilização do receptor específico a um suporte,

seguido de adição da amostra contendo estrogênios e anticorpos, ocorrendo então um

período de incubação, que varia de 1 a 4 horas. Em seguida, por adição de uma solução

adequada ao tipo de detecção pretendida, procede-se à quantificação por medidas de

fluorescência ou isotópicas (Ex. ELRA: "Enzyme Linked Receptor Assay"; ELISA:

"Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay"; RIA: "Radio Immuno Assay") (Mozaz et al.

2007; Nogueira 2003).

Com o intuito de análise vestigial em amostras ambientais, têm-se desenvolvido

inúmeros anticorpos e receptores específicos para os mais diversos tipos de poluentes

químicos, permitindo a tais métodos elevada rapidez de screening (Nogueira 2003). As

vantagens dos métodos biológicos são: rapidez, seletividade, especificidade e

sensibilidade. Por apresentarem limites de detecção na ordem de ng/L não necessitam,

em alguns casos, de pré-concentração da amostra. Algumas desvantagens incluem a

necessidade de se fazer análises individualizadas dos PEs e problemas causados por

alguns interferentes da matriz, podendo levar a resultados superestimados. Farré et al

(2007) observaram que seria necessário um clean-up da amostra para que não ocorresse

este efeito e concluíram também que, para análise de estrogênios como o estradiol,

poderia haver interferência de outros contaminantes como estrona e nonilfenol. Para

contornar esta limitação recorre-se, usualmente, a métodos cromatográficos de

separação, que têm se mostrado bastante eficazes e versáteis no monitoramento de um

grande grupo de PE.

  22

Figura 3.7 - Exemplo dos dois passos genericamente associados aos imunoensaios: A)

Imobilização do receptor específico ao suporte, seguido de incubação após a adição da

amostra contendo estrogênios e de anticorpos; B) Adição da solução adequada ao tipo

de detecção pretendida (Mozaz et al. 2007; Nogueira 2003).

Os métodos cromatográficos implicam em interações fisico-químicas entre os

compostos presentes na amostra e a coluna cromatográfica, e sua aplicação permite a

análise qualitativa ou quantitativa de vários microcontaminantes de interesse ambiental.

A cromatografia permite separar constituintes de uma mistura através de sua

distribuição em duas fases: uma estacionária (fixa na coluna cromatográfica) e outra

móvel. A cromatografia acoplada à espectrometria de massas, seja líquida ou gasosa,

apresenta-se como a técnica analítica mais robusta, abrangente, reprodutível e sensível,

para o monitoramento de amostras ambientais. A instrumentação disponível combina

baixos limites de detecção e reprodutibilidade analítica através do monitoramento de

íons pré-selecionados.

A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CGMS) tem sido

uma técnica comumente empregada, apesar de a cromatografia líquida acoplada à

espectrometria de massas (LCMS) ter ganhado popularidade. O pré-requisito necessário

para análise em cromatografia gasosa é que o analito de interesse seja volatilizável e

termicamente estável, muito embora a derivatização possa ser usada em alguns casos

para superar esta limitação. Tradicionalmente, a cromatografia gasosa necessita do

emprego de derivatização para determinar compostos estrogênicos, e os compostos mais

utilizados com tal finalidade são o MSTFA (n-metil-n-trifluoroacetamida), BSTFA (n-

bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida) e MTBSTFA (n-metil-n-(tert-

butildimetilsilil)trifluoroacetamida). A diferença entre eles se baseia no tipo de reação

que ocorre com o grupo hidroxila dos compostos. Quintana et al (2004) fizeram um

  23

estudo comparando os três compostos e mostrando que o MTBSTFA é mais seletivo e o

MSTFA o mais reativo. Apesar da derivatização ser mais comum quando se usa

cromatografia gasosa, Matsumoto et al (2002) utilizaram o anidrido de

pentafluorpropionil (CDPP) em cromatografia líquida, reduzindo assim os limites de

detecção para os estradióis analisados. As desvantagens do procedimento de

derivatização estão relacionadas ao maior trabalho laboratorial para preparo das

amostras, ao maior tempo de análise, e à possibilidade de perdas de analito, uma vez

que a baixa eficiência da hidrólise dos conjugados a estrogênios livres, via

derivatização, pode compor erros nos estágios de recuperação, extração e quantificação.

Tais desvantagens têm dado mais popularidade à cromatografia líquida para a

determinação de estrogênios (Reis Filho et al. 2006) e outros contaminantes ambientais

pouco voláteis.

A cromatografia líquida tem várias vantagens para análise de compostos

orgânicos em água, e uma delas refere-se ao fato de os compostos voláteis serem apenas

uma pequena fração de poluentes usualmente presentes em água e esgotos. De fato, a

maior parte dos perturbadores endócrinos não é volátil, tornando a cromatografia líquida

a técnica mais adequada para sua análise. Isto é especialmente verdade para esgotos, os

quais contêm muito material húmico e compostos orgânicos polares, tais como os

carboidratos. Vários detectores podem ser acoplados à cromatografia líquida, tais como

ultravioleta-visível, arranjo de diodos, fluorescência e espectrômetro de massas (Alda e

Barceló 2001; Mao et al. 2004; Matsumoto et al. 2002; Raimundo 2007; Solé et al.

2000; Wang et al. 2008).

Os detectores de arranjo de diodos e fluorescência são menos utilizados como

alternativas devido a sua especificidade, mas são poderosas ferramentas adicionais para

análise ou confirmação de alguns grupos específicos de PE (Mozaz et al. 2007).

Conforme mencionado anteriormente, a detecção de perturbadores endócrinos por

espectrometria de massas (MS) tem sido a técnica preferida pela comunidade científica

devido à sua elevada sensibilidade, reprodutibilidade, abrangência e robustez. A

instrumentação atualmente disponível combina a diminuição dos limites de detecção e

excelente reprodutibilidade analítica e elevada seletividade seja no modo de varredura

(modo Full-SCAN), seja através do monitoramento de íons selecionado (modo SIM)

(Hu et al. 2005; Liu et al. 2004b).

Segundo Nogueira (2003), a tendência para um eficiente monitoramento dos PE

em amostras ambientais parece ser a combinação entre métodos biológicos, através de

  24

ensaios de imunoextração que consistem no isolamento seletivo de classes restritas de

PE de amostras ambientais com a utilização de "immunosorbents", que seria uma SPE

contendo anticorpos muito específicos na constituição da fase estacionária. Os

compostos de interesses que ficariam retidos na fase estacionária seriam analisados por

cromatografia. Atualmente pouco se desenvolveu neste tipo de técnica, mas a

expectativa para a criação ainda existe, pois o desenvolvimento de uma metodologia de

alta especifidade onde baseia-se em reações enzimáticas é possível. A principal

vantagem deste método estaria na minimização de interferentes durante a análise

cromatográfica.

3.3.2. Monitoramento de perturbadores endócrinos em águas superficiais

 

A Tabela 3.5 resume resultados disponíveis na literatura do monitoramento de

três perturbadores endócrinos encontrados em águas superficiais: um estrogênio natural

(17β-estradiol ou E2), um estrogênio artificial (17α-etinilestradiol ou EE2) e um

produto da degradação dos surfactantes alquilfenóis etoxilados (nonilfenol ou NP), que

foram escolhidos pelo potencial de risco aos seres vivos e pela freqüência com que

foram reportados em trabalhos nacionais e internacionais.

O 17β-estradiol (conhecido também como estradiol ou pela sigla E2) é um

hormônio natural que nas mulheres é responsável pela síntese de estrogênio circulante.

Esses estrogênios são naturalmente e diariamente excretados na urina humana e, assim,

descartados no esgoto doméstico (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). O 17α-

etinilestradiol ou etinilestradiol é um dos estrogênios sintéticos mais usados como

contraceptivos orais (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). Os alquilfenóis, por sua vez,

apresentam uma variedade de aplicações, incluindo detergentes industriais e

domésticos, lubrificantes, emulsificantes, formulações de pesticidas, de tintas, bem

como produtos de higiene pessoal (maquiagem, cremes de pele, produtos para cabelo e

banho). Nas ETEs e mananciais, os alquilfenóis polietoxilatos (APEOs) são

inicialmente biodegradados, derivando em metabólitos persistentes e altamente

lipofílicos que incluem os alquilfenóis etoxilatos e, finalmente, os alquilfenóis, tais

como nonilfenol (NP) e octilfenol (OP).

Os trabalhos apresentados na Tabela 3.5 mostram que a técnica de preparo de

amostra usada predominantemente na análise dos estradióis e do nonilfenol utiliza a

extração em fase sólida, sendo o cartucho Oasis HLB e o octadecilsilano (C18) os mais

  25

comuns para tal finalidade. Os resultados compilados mostram ainda que as técnicas de

cromatografia (tanto gasosa como líquida) acopladas à espectrometria de massas são as

mais utilizadas, sendo usada ainda, em menor freqüência, cromatografia acoplada a

detector de arranjo de diodos ou a detector de fluorescência. Quando a cromatografia

gasosa é utilizada percebe-se que a derivatização por reações de silanização é preferida

e que os reagentes mais utilizados para tanto são o MTBSTFA, o MSTFA e o BSTFA.

As técnicas preferidas pelos pesquisadores resultam em limites de detecção na ordem de

0,15 a 2,0 ng.L-1 para os PE investigados. Valores baixos de limite de detecção

dependerão do tipo de equipamento utilizado e volume de amostragem, e todas as

técnicas de análise listadas na Tabela 3.5 resultam em limites de detecção semelhantes.

A Tabela 3.5 mostra que para amostras de rios e mananciais