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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
Instituto de Ciências Biológicas
Produção de Filmes Poliméricos a Base de Polissacarídeos de Anacardium
occidentale L.
Fábio Eduardo Fernandes Silva
2014
Fábio Eduardo Fernandes Silva
Produção de Filmes Poliméricos a Base de Polissacarídeos de Anacardium
occidentale L.
Orientadora: Kátia Flávia Fernandes
Trabalho de Dissertação apresentado ao
Programa de Mestrado em Biologia da
Universidade Federal de Goiás, como
requisito para a obtenção do título de
Mestre em Biologia.
Goiânia
2014
DEDICATÓRIA
A vida é uma jornada de aprendizado constante. Aprendemos a falar,
andar, comer. Depois nos ensinam números, cores, formas, letras.
Aprendemos então a ler! E deste ponto em diante, nosso universo se expande
sem parar, exponencialmente. Fomos para a escola primária, secundária,
faculdade, e alguns vão um pouco mais adiante, em mestrados e doutorados.
Contudo, a grande escola é a vida, que diariamente nos mostra nossa
pequeneza e nossa carência de aprendizado. Nunca, jamais saberemos tudo,
não importa nossa formação acadêmica.
Nessa grandiosa escola, a vida, tem um mestre que crê em mim acima
de tudo. Que vê em mim alguém capaz de ser melhor, todos os dias. Esse
mestre perdoa minhas falhas e cobra, sem precisar falar uma só palavra, que
eu me empenhe em ser um homem melhor.
Dedico este trabalho ao meu filho, Eduardo Barreto Fernandes Silva, por
ensinar-me diariamente que a vida merece ser vivida com intensidade, com
integridade, com humildade e dedicação.
AGRADECIMENTOS
À minha mãe, Nair Fernandes: Seu exemplo de vida é a mais pura
inspiração. Sua crença em nós e coragem em enfrentar tudo para que nos
tornássemos gente de bem merece ser reverenciada sempre. Cada sacola de
roupa vendida para que eu pudesse ir à faculdade, cada vale-refeição dividido,
cada esforço e sacrifício seu só podem ser retribuídos com o amor, pois nunca
haverá fortuna no mundo que possa lhe pagar. Obrigado, minha mãe, por ser a
MINHA mãe.
À minha irmã Karla Grace: Ser minha mãe substituta tomou parte de sua
juventude, e fez com que você ainda sonhe comigo ainda menino. Seu amor
incondicional, sua dedicação e carinho são sempre motivos de conforto e de
inspiração para que eu sempre faça o melhor possível. Obrigado, minha irmã,
por estar sempre por perto.
À minha irmã Kátia Flávia: Ser a irmã mais velha teve seus custos, e sua
segurança, inteligência, dedicação e empenho sempre foram inspiradores.
Você cuidou e me protegeu quando éramos menores, ensinou-me muito
sempre, e até hoje tiro lições de nossa convivência. Nesta curta jornada
pudemos nos aproximar, viver e conviver. Você me abrigou, protegeu e
conduziu como uma irmã mais velha deve fazer. Sempre te serei grato e jamais
serei capaz de expressar completamente como seu apoio foi fundamental para
que esse projeto se concluísse. Obrigado, minha irmã, por cuidar de mim e me
ensinar tanto.
Ao meu pai, Eduardo Almeida: Lembro com carinho das nossas
conversas e mesmo quando criança, do quanto você me ensinou a usar
ferramentas, fazer meus brinquedos e tantas outras coisas que me deram uma
habilidade manual invejável. Acho que este tenha sido um dos grandes motivos
para que eu tenha escolhido ser Cirurgião-Dentista. Aprendi muito com os seus
erros e acertos também, saber que você tem uma certa “inveja da minha
dedicação ao Edu”, é motivo de orgulho, pois sei que você aprova o meu
esforço de ser pai. Obrigado por tudo, pai.
À minha esposa Cleudenir Paiva Ximenes: A vida quis que nos
encontrássemos, e nos jogou um de encontro o outro. É difícil definir um
sentimento tão amplo, tão intangível e tão magnífico quanto o que tenho por
você. Sinto que sou uma pessoa melhor porque você está comigo, e sei que
posso estender a mão em busca de ajuda sempre, pois você estará lá para
segurá-la. Essa segurança, cumplicidade, amizade e parceria me fazem ter
coragem de enfrentar o mundo. Você me completa, me complementa, me
inspira e sinto verdadeiramente que te devo a minha paz. Eu te amo, obrigado
por estar em minha vida, cada minuto de cada dia.
Aos colegas do laboratório, aos que já se foram, outros que estão
chegando: obrigado por suas competências individuais, sua colaboração e
ajudas. Suas gentilezas e favores nunca serão esquecidos, e este projeto só foi
possível graças à colaboração de muitos. Entretanto, lembrem-se que há vida
lá fora, e que este aspecto, o acadêmico, é só uma pequena parte do que
vocês são, e isto não os define. Sejam felizes, tenham sucesso e tenham uma
boa vida.
Aos demais mestres e doutores do ICB e da UFG, em especial às
doutoras Elizabeth Mendes e Elisandra Gava por sua presteza, dedicação e
boa vontade.
À minha Orientadora, Dra. Kátia Flávia Fernandes: Esse período de
aprendizado não poderia ter sido tão enriquecedor a não ser sob sua
orientação. Todos se referem à “Porta Azul” do laboratório como o caminho
para o saber e para a vitória. Sua grande destreza na gestão de pessoas foi
capaz de extrair o melhor de cada um, no seu tempo e à sua maneira. Sua
vasta experiência e extenso conhecimento científico e técnico são os pilares da
segurança. Obrigado pela oportunidade de conhecer este universo.
RESUMO
Neste trabalho polissacarídeos extraídos de goma de Anacardium
occidentale (PEJU) foram utilizados para produzir filmes em blendas com álcool
polivinílico (PVA) por processo de casting. Os testes das formulações dos
filmes revelaram que a melhor concentração dos componentes poliméricos era
6% (p/v) de PVA e 6% (p/v) de PEJU, numa razão ente volume da mistura e
área dos moldes de 0,5 mL cm-2. Nestas condições, os filmes obtidos
apresentaram 7,58 Kgf cm-2 de força tênsil, 186 % de elongação e módulo
elástico no valor de 49908,6. Estes filmes, na forma hidratada, apresentaram
níveis de transparência entre 50 e 70% analisadas pela transmitância de luz na
região visível do espectro. A hidratação atingiu um platô após 20 minutos de
imersão em diferentes soluções, e resultou em alterações estruturais
significativas dos filmes, permitindo classificá-los como Materiais Sensíveis a
Estímulos (Stimule Responsive Materials). Ao serem hidratados os filmes
dobram a sua área e apresentam índices de intumescimento na ordem de 1,6,
quando a hidratação é feita com água, até 2,2 quando feita com solução salina.
As alterações dimensionais observadas no processo de
hidratação/desidratação foram estáveis, sem comprometimento da rede
polimérica. Testes de biocompatibilidade a nível celular mostraram ausência
de citotoxicidade e ausência de adesão celular quando culturas de fibroblastos
humanos (PDL) foram colocadas a crescer na presença dos filmes. De modo
similar, os testes in vivo com ratos Wistar mostraram boa resposta tecidual e
cicatrização similar ao controle na ausência dos filmes. A imobilização de
papaína nos filmes de PVA/PEJU se deu com máximo rendimento quando
conduzida em pH 4,0, a 5 ºC, com tempo de reação de 60 minutos. A
imobilização reduziu a faixa ótima de pH de reação para 8,0, sem no entanto
comprometer totalmente a atividade da enzima em pH fisiológico (7,0). A
enzima imobilizada apresentou alta estabilidade no armazenamento, inclusive a
sem. A bioatividade conferida aos filmes de PVA/PEJU pela imobilização de
papaína confere a estes materiais possibilidades de aplicação em várias áreas,
com especial importância para aplicações na área farmacêutica.
ABSTRACT
In this study polysaccharides from gummous exudates of Anacardium
occidentale (PEJU) were extracted and blended with polyvinyl alcohol (PVA) in
order to produce films by casting procedure. The best film formulation was
achieved using 6% (w/v) PVA and 6% (w/v) PEJU and 0.5 mL cm-2 ratio of
solution to molds area. Under optimized conditions, the films presented 7,58 Kgf
cm-2 tensile strength , 186% elongation and 49908,6 in the elastic module. After
hydration the films presented good transparency, with values from 50 to 70% of
light transmittance at visible spectrum. Maximum hydration occurred after
immersion of the films for 20 minutes in different solutions. Hydration resulted in
stable structural changes that allow classify these films as Stimule Responsive
Materials (SRM). After hydration the films presented 2-fold higher area and
swelling index from 1.6 to 2.2 when water and saline solution were respectively
used in the process. Absence of cellular toxicity and absence of cell adhesion
were observed when human fibroblasts (PDL) were grown in the presence of
the PVA/PEJU films. Additionally, tissue response and wound healing were
similar both in the presence or absence of the PVA/PEJU films. Immobilization
of papain was maximized when reaction occurred at 5 ºC, pH 4.0 and for 60
minutes. After immobilization optimum pH was restricted to pH 8.0, but
preserving activity at physiological range (pH 7.0). Immobilized papain showed
high stability during storage, including when stored dried. The bioactivity
achieved by immobilization of papain on PVA/PEJU films open
possibilifiguraties of application of this biomaterial in several areas, mainly in the
pharmaceutical.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Exsudato gomoso de A.occidentale. ................................................ 18
Figura 2. Representação da estrutura do polissacarídeo extraído exsudado gomoso do cajueiro. (R = ramnose, arabnose)[15]. ........................................... 19 Figura 3. Estrutura tridimensional da papaína de Carica papaya. ................... 26
Figura 4. Esquema representando a ativação de suportes poliméricos a base de polissacarídeos utilizando metaperiodato de sódio (Modificado de Batista et al.[53]). ............................................................................................................... 30
Figura 5. Aspectos macroscópicos dos filmes PVA/PEJU: (a) filme 3% antes da lavagem; (b) filme 6% (p/v) antes da lavagem; (c) filme 6% após lavagem. 38
Figura 6. Curva típica apresentadas pelos filmes durante teste de resistência a tração: (a) PVA/PEJU 3% e (b) PVA/PEJU 6%. ............................................. 451
Figura 7. Medida de transparência dos filmes de PVA/PEJU no espectro de luz visível. ............................................................................................................ 462 Figura 8. Potencial de emprego como embalagem. Da esquerda para a direita: lâmina de vidro seguida por amostra de filme de PVA/PEJU 3 e 6 % hidratados. ....................................................................................................................... 473 Figura 9. Comparação dos filmes secos com seus respectivos moldes: (a) Molde 18 x 18 cm com filme ao final da secagem e (b) o filme na sua forma hidratada medindo 14 x 14 cm. ........................................................................ 49 Figura 10. Capacidade de intumescimento dos filmes PVA/PEJU: (a) alterações de área; e (b) alterações de massa. ............................................... 50
Figura 11. Morfologia das células do ligamento periodontal em contato direto com o biofilme (a-c) e análise da viabilidade celular na presença do biofilme (d). As células vivas e células mortas são observadas pela coloração diferencial dos núcleos. As células viáveis estão com as membranas marcadas em verde e as não-viáveis, no mesmo campo de verificação, encontram-se com os núcleos corados em vermelho. ......................................................................... 49
Figura 12. Gráfico de Pareto evidenciando o efeito absoluto das variáveis na imobilização da papaína. .................................................................................. 57 Figura 13. Atividade de papaína em função do pH e temperatura de imobilização. ..................................................................................................... 58
Figura 14. Predição matemática das condições de imobilização para o máximo de atividade de papaína. .................................................................................. 59
Figura 15. Atividade da papaína livre e imobilizada em diferentes pHs. ....... 606
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades mecânicas dos filmes de PVA/PEJU. ........................ 44 Tabela 2. Alterações dimensionais observadas nos filmes durante processo de hidratação e secagem. ..................................................................................... 47 Tabela 3. Atividade de papaína nas diferentes condições de imobilização. .... 55 Tabela 4. Análise de variância para a atividade da enzima nas diferentes condições de imobilização................................................................................ 56
Tabela 5. Atividade da papaína imobilizada após 24h de armazenamento em diferentes condições. ....................................................................................... 61
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 16
1.1 GOMAS ............................................................................................... 16
1.2 CAPACIDADE FILMOGÊNICA DA GOMA DE CAJUEIRO ................ 20
1.3 BIOCOMPATIBILIDADE ..................................................................... 22
1.4 BIOMATERIAIS PARA CURATIVOS .................................................. 24
1.5 PAPAÍNA ............................................................................................. 26
1.6 IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS ............................................................ 28
2 OBJETIVOS .............................................................................................. 32
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................. 32
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................... 32
3 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................ 33
3.1 EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DA GOMA DE CAJUEIRO (PEJU) .......................................................................................................... 33
3.2 PREPARO DOS FILMES DE PVA/PEJU ............................................ 33
3.3 AUTOCLAVAGEM DOS FILMES ........................................................ 34
3.4 PROPRIEDADES FÍSICAS E ESTRUTURAIS DOS FILMES ............. 35
3.4.1 Propriedades Mecânicas ............................................................ 35
3.4.2 Transparência ............................................................................. 36
3.4.3 Perfil de Hidratação e Intumescimento dos Filmes ................. 36
3.5 TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE ................................................. 37
3.5.1 Ensaio de citotoxicidade ............................................................ 37
3.6 IMOBILIZAÇÃO DE PAPAÍNA ............................................................ 38
3.6.1 Otimização das condições de imobilização ............................. 38
3.6.2 Teste de atividade de papaína livre e imobilizada ................... 39
3.6.3 Efeito do pH na atividade da papaína imobilizada em filme de PVA/PEJU ................................................................................................ 40
3.6.4 Estabilidade durante o armazenamento ................................... 40
3.6.5 Análise estatística ...................................................................... 41
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 41
4.1 PREPARO E SECAGEM DOS FILMES .............................................. 41
4.2 PROPRIEDADES FÍSICAS E ESTRUTURAIS DOS FILMES ............. 43
4.2.1 Propriedades Mecânicas ............................................................ 43
4.2.2 Transparência ............................................................................. 45
4.2.3 Perfil de hidratação dos filmes .................................................. 47
4.2.4 Intumescimento dos Filmes....................................................... 49
4.3 TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE ................................................. 52
4.4 IMOBILIZAÇÃO DE PAPAÍNA EM FILMES DE PVA/PEJU ................ 54
4.4.1 Efeito do pH na atividade enzimática da enzima imobilizada . 59
4.4.2 Estabilidade ao armazenamento ............................................... 61
5 CONCLUSÕES ......................................................................................... 62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 64
ANEXO 1 – ARTIGO PUBLICADO .................................................................. 73
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 GOMAS
Os polissacarídeos gomosos são matérias primas abundantes para os
mais diversos processos industriais, e tem sido alvo de intensos estudos em
função da sua sustentabilidade, biodegradabilidade e biossegurança[1]. As
gomas naturais são classificadas com base em suas origens, características
físico-químicas e suas estruturas químicas. As principais fontes destes
polissacarídeos complexos são o endosperma de sementes (goma guar),
exsudado de plantas (goma arábica), algas marinhas (goma agar), bactérias
(goma xantana), e fontes de origem animal (quitina)[1].
Exsudados gomosos de plantas são heterogêneos em sua composição,
sendo heteropolissacarídeos cuja hidrólise resulta em unidades de açúcares
simples tais como, arabinose, galactose, glicose, manose, xilose, ácidos
hexurônicos em forma de sal, derivados o-metilados ou ainda derivados
aminados de monossacarídeos. De modo geral os polissacarídeos gomosos
possuem cadeias extensas e muito ramificadas[2].
As árvores em geral, especialmente o cajueiro (Anacardium ocidentale L.)
quando injuriadas, seja mecanicamente ou por invasão microbiológica, reagem
à essas agressões produzindo uma goma que é exsudada afim de corrigir e
minimizar os efeitos dessas injúrias[3].
O cajueiro, espécie vegetal pertencente à família Anacardiceae, é uma
planta muito abundante nas regiões norte e nordeste do Brasil. A planta é
produtora do pseudofruto caju e de suas castanhas (fruto verdadeiro), que são
17
bastante utilizadas na indústria de alimentos. A cultura dessa espécie possui
grande importância econômica para essas regiões brasileiras. Além das
frutificações os exsudados gomosos do cajueiro vêm sendo explorados com o
intuito de ampliar sua utilização em processos industrias, além de constituir
fonte adicional de renda para o produtor, especialmente no que se refere ao
aproveitamento dos cajueiros improdutivos, em fase de declínio e
senescência[4].
O cajueiro é encontrado no mundo tropical e sua exploração
econômica restringe-se, principalmente, à Índia, Brasil, Moçambique, Quênia e
Tanzânia. No Brasil, a cultura do cajueiro ocupa uma vasta área de plantação,
praticamente toda no Nordeste, com destaque para os Estados do Ceará, Piauí
e Rio Grande do Norte[5]. O cajueiro também é encontrado em todos os estados
em que ocorre o Bioma Cerrado, sendo que destacam-se a presença da
espécie Anacardium humile St. Hill., conhecido como cajuzinho-do-campo ou
cajuí, Anacardium othonianum, conhecido como cajueiro arbóreo-do-cerrado, e
Anacardium nanum e Anacardium corymbosum, apresentando porte rasteiro[6,
7].
O tronco do cajueiro produz um exsudato, a goma do cajueiro, que tem
potencial para substituição de outras gomas em escala industrial (Figura 1). A
formação da goma de cajueiro pode ser induzida por vários métodos, dentre
eles pode se destacar a incisão deliberada nas plantas e a introdução no caule
de agentes químicos como o óxido de etileno e derivados do ácido benzóico.
Após a retirada destas resinas do caule da planta, faz-se o isolamento da
goma, ou seja, a separação do polissacarídeo das impurezas presentes no
material bruto. As etapas de isolamento e purificação das gomas influenciam
18
fortemente as suas características gerais, cujo controle é essencial para
aplicação industrial[5].
Figura 1. Exsudato gomoso de A.occidentale.
A goma do cajueiro contém um polissacarídeo de coloração branca,
solúvel em água, com estrutura química semelhante à goma arábica, podendo
ser usada como cola líquida para papel[8]; na indústria farmacêutica, como
aglutinante de cápsulas e comprimidos; na indústria de alimentos, como
estabilizante de sucos, cerveja e sorvetes, bem como clarificante de sucos,
como na fabricação da cajuína[9]. Além de se mostrar como poderosa cola[10],
apresenta ação antimicrobiana e antifúngica[11], característica fundamental
quando do emprego em bioengenharia e reconstrução de tecidos.
A goma do cajueiro interage com a água, sendo bom emulsificante,
adesivo e estabilizador de soluções, podendo ser usada para substituir a goma
arábica[12]. Tem excelente capacidade como espessante quando comparada ou
combinada com a goma arábica, e pode ser formulada como solução, gel, filme
e mesmo em nano partículas para liberação de medicamentos[13].
19
Dados da literatura relatam que o polissacarídeo presente na goma de
cajueiro (PEJU) tem em sua composição 61% de galactose, 14% de arabinose,
7% de ramnose, 8% de glicose e 5% de ácido glicurônico[14]. Também é sabido
que o PEJU é uma goma de baixa viscosidade, comparável em muitos
aspectos com a goma arábica e que possui alto grau de ramificação[5].
Figura 2. Representação da estrutura do polissacarídeo extraído exsudado gomoso
do cajueiro. (R = ramnose, arabnose)[15].
Explorando os potencias tecnológicos deste polissacarídeo, muitos
trabalhos vêm propondo formulações de materiais que possuem PEJU em sua
constituição. Magalhães-Júnior et al.[16] sintetizaram microesferas de quitosana
complexadas com PEJU carboximetilado, com finalidade de liberação
controlada de drogas. Os resultados do trabalho demonstraram que com uma
20
mistura adequada dos dois polissacarídeos, as microesferas proporcionam a
liberação de drogas em um tempo desejável para essa aplicação.
Guilherme et al.[17] em seu trabalho, sintetizaram um hidrogel
superabsorvente a partir de PEJU e acrilamida. O material obtido apresentou
alta capacidade de retenção de água, alto módulo elástico, com indicações
para ser utilizado como aparato para cultura de células.
Em outro trabalho Guilherme et al.[18], prepararam e caracterizaram
hidrogéis superabsorventes, associando monômeros de acrilamida com PEJU
modificado. As aplicações dos hidrogéis obtidos podem ser exploradas na
agricultura, como condicionador de solo e na área biomédica, como biomaterial
para cultura celular. Além dessas aplicações, estes hidrogéis apresentaram
características para serem utilizados como absorvente para cuidados pessoais.
1.2 CAPACIDADE FILMOGÊNICA DA GOMA DE CAJUEIRO
De modo geral, as características químicas e reatividade das gomas
podem ser utilizadas para obtenção de materiais menos solúveis e com
propriedades mecânicas adequadas para cada aplicação desejada[19].
Dentre as propriedades químicas e físicas interessantes das gomas, a
capacidade filmogênica tem sido alvo de muitos estudos, principalmente
quando a busca é por materiais de revestimento que sejam biodegradáveis.
Além dessa vertente, filmes poliméricos têm sido sintetizados para serem
utilizados como biomateriais com propriedades biocompatíveis, encontrando
aplicações na área biomédica, médica e odontológica.
21
Outra propriedade interessante dos filmes à base de polissacarídeos é
a sua permeabilidade ao oxigênio, o que permite a sua aplicação em
revestimentos de frutos. Além disto, o caráter hidrofílico destes filmes faz com
que eles sejam permeáveis ao vapor de água e, portanto, podem ser utilizados
como coberturas comestíveis[20, 21].
Se por um lado, estas características são interessantes para as
aplicações citadas, por outro lado, para aumentar a estabilidade dos filmes à
base de polissacarídeos é necessário a presença de um agente
impermeabilizante. Rodrigues et al.[21], propuseram em seu trabalho a
formulação de um filme de PEJU fundido com amido de mandioca e cera de
carnaúba, com finalidade de aplicação como embalagem na indústria de
alimentos. A inserção de um componente hidrofóbico na formulação foi uma
estratégia utilizada pelos autores do trabalho para melhorar as propriedades do
material.
O desenvolvimento de sensores voltamétricos e filmes de múltiplas
camadas (Layer by Layer - LbL) para detecção de neurotransmissores no
líquido extracelular do sistema nervoso central tem sido bastante explorado nas
últimas décadas. Araújo et al.[22], estudaram o potencial do PEJU na síntese de
filmes de múltiplas camadas com aplicação na área de nanobiomedicina. Estes
filmes ultrafinos LbL foram construídos com o PEJU atuando como um
poliânion, sobre o qual foi depositada uma camada do policátion hidrocloreto de
polialilamina. O trabalho demonstrou que o PEJU contribuiu favoravelmente
para obtenção de filmes estáveis, com processo redox bem definido, que
puderam detectar dopamina com limite de detecção adequado aos níveis
necessários para aplicações na área farmacêutica.
22
Recentemente em um trabalho realizado no Laboratório de Química de
Polímeros (LQP) por Silva et al.[11] blendas de PEJU e álcool polivinílico (PVA)
resultaram em um filme com características bastante interessantes. O filme
PEJU/PVA se mostrou um excelente suporte para imobilização de enzimas
quitinolíticas, permitindo propor sua aplicação como material bioativo para ser
utilizado em embalagens de alimentos. O filme de PEJU/PVA também
apresentou propriedade de biodegradabilidade muito interessante, permitindo
que este material seja utilizado com a proposta ecologicamente correta.
Embora o filme de PEJU/PVA produzido no LQP tenha se mostrado um
material promissor para aplicações biotecnológicas, este não apresentou boas
propriedades mecânicas, bem como não demonstrou características de
transparência adequadas. Neste sentido, novas formulações foram testadas
pelo grupo de pesquisadores do LQP, resultando em uma nova formulação de
filme com características melhores no que diz respeito à propriedades
mecânicas e transparência[23]. A nova formulação conferiu ao filme de
PEJU/PVA uma boa resistência mecânica agregada a uma alta capacidade de
elongação, e alto grau de transparência, o que torna este material bastante
promissor, principalmente para aplicações médicas e biomédicas[23], sendo
uma das aplicações em potencial a sua utilização como material para curativos.
1.3 BIOCOMPATIBILIDADE
Para biomateriais serem considerados biocompatíveis, devem
incorporar características físicas, químicas e sinais biológicos que orientem as
células no tecido funcional, através de migração celular, adesão e
23
diferenciação, e que estes materiais provoquem pouca ou nenhuma resposta
imunológica no hospedeiro[24]. Além disso, é importante que os biomateriais
apresentem certa morfologia desejada, não toxicidade, propriedades
mecânicas apropriadas e ambiente propício para o crescimento de células
específicas[25].
Uma das aplicações para os filmes e membranas que têm chamado
bastante atenção dos pesquisadores é a sua utilização como material para
curativo. Das etapas do estudo desse tipo de material para aplicação como
aparato para curativo, a investigação da biocompatibilidade é extremamente
importante.
Frequentemente a estratégia para avaliar a biocompatibilidade dos
filmes para aplicação como curativo utilizam a análise toxicológica in vitro,
tendo como modelo celular fibroblastos ou queratinócitos, os quais são os
principais constituintes celulares das camadas dérmicas e epidérmicas,
respectivamente[26].
Além disso, é importante a avaliação do poder de intumescimento do
material para garantir que os exsudados produzidos por ferimentos infectados
sejam absorvidos. As propriedades mecânicas do material devem ser
satisfatórias no que tange à uma combinação de boa força tensil, com boa
flexibilidade, para garantir manipulação adequada do material e uma boa
adesão do curativo ao ferimento[27]. Entretanto, diferindo dos materiais de modo
geral, os materiais utilizados para curativo não devem apresentar adesão
celular, uma vez que devem ser substituídos periodicamente durante o
processo de cicatrização[28].
24
1.4 BIOMATERIAIS PARA CURATIVOS
A ferida é o resultado de uma lesão, podendo ser reversível ou
irreversível, com base na profundidade da perda de tecido. A maior limitação
para o processo de cura de uma ferida são as infecções, pois causam
formação de exsudados promovendo um atraso no processo de cura e também
facilitam uma deposição imprópria de colágeno[29].
Curativos são ferramentas terapêuticas que auxiliam no processo de
cura para o local ferido de maneira mais rápida. Um curativo ideal para feridas
deve ser capaz de absorver o exsudado e componentes tóxicos da superfície,
manter uma alta umidade na interface ferida / curativo, permitir trocas gasosas,
proporcionar isolamento térmico, proteger a ferida de traumas mecânicos e
contra invazão bacteriana e não apresentar toxicidade. Curativos com
componentes antimicrobianos vêm sendo uma alternativa para tratar ferimentos
infectados[29].
Materiais curativos para tratamento de ferimentos provocados por
queimadura devem apresentar, além de todas essas características descritas,
uma certa conveniência de manipulação do material, tanto por parte do médico
quanto do paciente, facilidade para ser removido da superfície do ferimento,
elasticidade suficiente para promover conformidade à superfície da pele e ser
resisternte a procedimentos de esterelização[28].
Diferentes polímeros sintéticos e naturais vêm sendo utilizados para
preparar materiais para curativos de feridas. Polímeros naturais tais como
colágeno, alginato, quitosana, pectina, dextranas, celulose, goma carragena
25
entre outros, estão tendo seus potenciais biotecnológicos bastante explorados
para essa finalidade[27].
Mishra et al.[30] realizaram em seu trabalho a síntese de uma
membrana de pectina-gelatina, cito-compatível com células de melanoma B16.
O material obtido foi indicado para atuar como curativo no tratamento de feridas
úmidas. O aumento na proporção de gelatina na formulação da membrana
representou significativa melhora na microporosidade do material, conferindo à
membrana uma arquitetura altamente interligada, tipo favo de mel, e maior
estabilidade térmica.
Thu et al.[31] sintetizaram um filme de dupla camada a base de alginato
e seu potencial como veículo de liberação lenta de droga foi investigado. A
camada superior do filme foi carregada com a droga modelo ibuprofeno,
enquanto a camada inferior, livre de drogas agiu como membrana de controle
da velocidade de liberação da droga. O ibuprofeno foi escolhido em função de
sua grande utilização como um complemento eficaz no tratamento de ferida
para reduzir a dor provocada pelo ferimento e a dor durante as trocas de
curativos. O filme sintetizado apresentou boas propriedades mecânicas, tendo
razoável força tensil e alta porcentagem de elongação, e os testes de liberação
lenta da droga demonstraram a eficácia do filme para essa proposta.
Sabe-se que na fase de limpeza de tecidos necróticos em ferimentos, a
utilização de curativos contendo enzimas proteolíticas é bastante interessante.
Curativos dessa natureza favorecem uma melhor limpeza de feridas
purulentas, suprime o crescimento da microflora e fornece melhores condições
para a posterior reparação[31]. Várias preparações de curativos contendo
enzimas proteolíticas têm sido investigados e utilizados clinicamente[32]. Dentre
26
as enzimas proteolíticas utilizadas, a papaína tem destaque como um agente
debridante, principalmente no tratamento de feridas de queimadura[33].
1.5 PAPAÍNA
A papaína é uma enzima proteolítica isolada do látex das folhas e dos
frutos do mamão verde adulto (Carica papaya Linné)[34] muito empregada na
indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica (Figura 3).
Figura 3. Estrutura tridimensional da papaína de Carica papaya.
A papaína hidrolisa qualquer proteína que contém resíduos de cisteína.
Esta propriedade torna a papaína uma enzima não seletiva, uma vez que
muitas proteínas, incluindo fatores de crescimento, contêm resíduos de
cisteína. O colágeno não contém resíduos de cisteína, e portanto, não sofre
ação da papaína[35].
Assim a papaína possui ação bactericida, bacteriostática e anti-
inflamatória, auxiliando na remoção de exsudatos inflamatórios e restos
necróticos ou purulentos, reduzindo o período de reparação do tecido, além de
não prejudicar o tecido são ao redor da lesão. Também facilita a contração e a
27
aproximação dos bordos da ferida, tornando-a mais próxima da estrutura
original com um melhor resultado estético. Isso se dá porque a papaína age
digerindo restos teciduais e constituintes insolúveis do exsudato inflamatório
tais como a fibrina e as desoxirribonucleoproteínas derivadas dos núcleos das
células mortas ou degeneradas, que resultam em peptídeos que são
quimiotáticos para os fibroblastos, estimulando precocemente a fibroplastia [36-
40]. Por estas razões a papaína tem sido utilizada no tratamento de diversos
tipos de feridas, com ação positiva na estimulação do processo de cicatrização
e ausência de efeitos colaterais [36-40].
Por ser uma enzima proteolítica, a papaína poderia agir destruindo o
tecido sadio. No entanto, isso não ocorre devido à presença de um inibidor de
protease plasmático que impede sua ação proteolítica em tecidos considerados
normais, fato que não ocorre no tecido desvitalizado que não possuem este
inibidor[41].
Na terapêutica de feridas, a papaína é utilizada sob várias formas
farmacêuticas, como pó, gel, creme e solução na concentração de 2 a 5%
(p/v)[42]. Outras concentrações podem ser utilizadas como 10% (p/v) para
tecidos com necrose e de 1 a 4% (p/v) para tecido fibrinoso ou de
granulação[43]. Ao contrário do que muitos pensam, a papaína pode ser
utilizada durante todas as fases da cicatrização, variando apenas sua
concentração[41].
No entanto, a papaína apresenta baixa estabilidade, o que dificulta sua
comercialização em uma forma farmacêutica definida. Velasco[44] padronizou
um gel de papaína 0,4% (p/v), com estabilidade durante o armazenamento por
28
60 dias. No entanto, a forma farmacêutica gel não ofereceu proteção contra
agentes externos e a estabilidade da papaína permaneceu relativamente baixa.
Assim, uma estratégia para utilizar a papaína como agente cicatrizante
deve passar necessariamente por uma formulação que estabilize sua atividade
e permita sua liberação contínua e controlada. Neste aspecto a imobilização de
enzimas fornece ferramentas diversificadas e promissoras a fim de solucionar
este problema.
1.6 IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
De acordo com Chibata et al.[45], enzimas imobilizadas podem ser
definidas como enzimas que estão fisicamente confinadas, ou localizadas em
uma certa região do espaço, com retenção de suas atividades catalíticas, e que
podem ser usadas repetidamente e continuamente.
O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um
biocatalizador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante a
reação[46]. As enzimas imobilizadas deverão exibir uma atividade catalítica
superior. Além disso, não deverão ocorrer alterações estruturais, bem como
modificações no sítio ativo[47].
As vantagens da imobilização de enzimas podem ser sumarizadas como
segue[47]:
a) Possibilidade de usos repetidos de uma única batelada de enzima
ocasionado redução nos custos operacionais;
b) Possibilidade de parar a reação por remoção da enzima do meio
reacional;
29
c) Estabilização da estrutura terciária da enzima resultante da ligação ao
suporte;
d) O produto não é contaminado com a enzima. Este fato é particularmente
importante em aplicações relativas a alimentos e preparações
farmacêuticas;
e) A extensão do curso da reação pode ser controlada pela velocidade de
fluxo do substrato através da solução ou pela simples remoção da
enzima.
Na literatura estão descritos inúmeros métodos de imobilização. Em
comum, estes métodos visam contornar os possíveis problemas de
instabilidade enzimática e otimizar as várias aplicações para as enzimas
imobilizadas[46, 47]. A escolha do método de imobilização a ser empregado é
muito importante para o sucesso do processo, portanto deve ser criteriosa. É
necessário o conhecimento sobre as características do método, suas
vantagens e limitações em relação às outras opções existentes. Além disto, a
escolha do método deve envolver uma análise criteriosa sobre o rendimento e
pureza do produto pretendido, o tempo e os custos necessários para viabilizar
o método de imobilização escolhido.
Dentre os métodos de imobilização descritos na literatura, o que usa
ligação covalente da enzima ao suporte tem sido o mais utilizado e
investigado[11, 14, 48-53]. Apesar deste método de imobilização envolver um maior
número de etapas de reação, as preparações enzimáticas obtidas apresentam
alta estabilidade. Isto se deve ao fato da ligação entre a enzima e o suporte ser
forte, de tal forma que somente alterações muito drásticas no meio reacional
30
seriam capazes de romper a ligação, de modo que a estabilidade obtida
permite vários ciclos de uso da enzima[54].
Vários meios distintos são disponíveis para preparar o suporte para a
imobilização da enzima. Diversos grupos funcionais podem ser inseridos na
superfície do suporte, de acordo com o reagente escolhido[55]. Uma
metodologia frequentemente empregada para preparar suportes a base de
polissacarídeos envolve a oxidação de hidroxilas vicinais pelo metaperiodato
de sódio (Figura 4).
Figura 4. Esquema representando a ativação de suportes poliméricos a base de
polissacarídeos utilizando metaperiodato de sódio (Modificado de Batista et al.[53]).
Este método de ativação de suportes resulta em imobilizações estáveis,
tendo a enzima ligada com grande proximidade ao suporte. Esta proximidade
pode ter por consequência alterações no microambiente de catálise
31
decorrentes de propriedades química e físicas do suporte, tais como alteração
da hidrofilicidade / hidrofobicidade da vizinhança da enzima, efeitos de partição
de prótons com a consequente alteração de pH ótimo de reação, atração ou
repulsão do substrato em função da presença de cargas superficiais do
suporte, entre outras. Portanto, quando se utiliza esta metodologia de ativação
para imobilização, deve-se averiguar se os parâmetros de reação da enzima
imobilizada foram alterados.
32
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho é a produção de filmes à base de
polissacarídeos de caju (PEJU) em blenda com álcool polivinílico (PVA) que
apresentem propriedades físicas, mecânicas e biológicas que permitam sua
aplicação na área biomédica.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Otimizar as formulações de filmes de PVA/PEJU para obter o máximo de
transparência, maleabilidade e manipulação;
Avaliar a biocompatibilidade dos filmes de PVA/PEJU em testes de resposta
celular;
Conferir bioatividade aos filmes de PVA/PEJU através da imobilização de
papaína em sua superfície;
Testar o efeito da imobilização sobre a atividade e estabilidade da papaína.
33
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DA GOMA DE CAJUEIRO (PEJU)
Amostras da goma do cajueiro foram coletadas de árvores da fazenda
CIALNE (Companhia de Alimentos do Nordeste), no município de Pacajús, no
Ceará, Brasil. Os nódulos passaram por um processo de catação, para
remoção de impurezas maiores, como cascas de árvore e insetos. A goma
resultante foi moída e imersa em água destilada numa proporção de 20% (p / v)
e mantida à temperatura ambiente (25° C), durante 24 horas, sob agitação. A
solução foi filtrada para remover os fragmentos de impurezas remanescentes e
em seguida foi precipitada com etanol absoluto, na proporção de 1:3 (v / v),
durante 24 h. O precipitado polissacarídeo goma do cajueiro (PEJU) foi
separado por filtração, lavado com etanol e secado à temperatura ambiente.
Todo o material obtido foi moído e armazenado em pote hermético em
temperatura ambiente.
3.2 PREPARO DOS FILMES DE PVA/PEJU
Os filmes foram preparados tendo como base a metodologia descrita por
Silva et al.[23] (Anexo 1). Após alguns testes em que a formulação sofreu
ajustes na concentração dos componentes, o filme foi produzido na seguinte
proporção: a 7,5 mL de uma solução de PVA com concentração de 3 ou 6%
34
(p/v), foram adicionados 7,5 mL de uma solução de PEJU de igual
concentração. Após completa homogeneização, a mistura recebeu 0,6 mL de
metaperiodato de sódio 1.0 mol L−1, 1,5 mL de ácido fosfórico 1mol L−1
contendo 10% (p/v) de cloreto de cálcio e 15 mg de manitol.
As soluções utilizadas no preparo do filme foram pré-aquecidas e
mantidas a 55ºC até serem vertidas em moldes onde se dava a polimerização
para formação do filme pelo método de casting (secagem natural por
evaporação do solvente) em temperatura ambiente, ou em estufa de circulação
forçada com temperatura de 45 ºC.
A fim de padronizar a espessura dos filmes foram feitos testes em que a
relação entre o volume de solução e a área dos moldes foi variada entre 0,3 e
0,5 mL cm-2.
Depois de secos, os filmes foram removidos de seus moldes, lavados à
exaustão com água destilada até a neutralização do pH da água residual de
lavagem e a completa remoção do excesso de iodo. Testes de presença de
iodo com solução padrão de lugol foram aplicados como prova. Os filmes foram
então secos por desidratação natural, em temperatura ambiente e em seguida
guardados em vasilhames hermeticamente fechados.
3.3 AUTOCLAVAGEM DOS FILMES
Com o objetivo de testar a aplicação clínica do material, os filmes foram
submetidos a processo de esterilização por vapor úmido em autoclave, em
procedimento padrão do Ministério da Saúde do Brasil, isto é, 121ºC por 30
minutos. A fim de verificar a estabilidade do material, a autoclavagem foi feita
35
em amostras de filme desidratado e hidratado. As amostras foram
autoclavadas individualmente em potes de vidro e após resfriamento foram
analisadas as alterações morfológicas.
3.4 PROPRIEDADES FÍSICAS E ESTRUTURAIS DOS FILMES
3.4.1 Propriedades Mecânicas
Os ensaios mecânicos de microtracionamento foram realizados em
texturômetro LLOYD (Modelo TA1), de coluna simples, utilizando célula de
carga de 50 N e garras de apreensão. As amostras de filme tiveram sua
dimensão padronizada em 10 X 20 mm, de acordo com a norma ASTM D-
638M[56]. O espaço de montagem da amostra foi de 10 mm e os testes de
tração feitos com uma velocidade de separação 5 mm min-1. Foram utilizadas
nestes testes amostras de filme de PVA/PEJU 3 e 6% que estavam
desidratadas, tinham espessura variando entre 140 a 200 μm e um tempo de
armazenamento superior a 30 dias. Amostras com imperfeições e variações de
espessura maiores que 5% foram descartadas.
A resistência à tração (T), porcentagem de elongação na ruptura (%E) e
módulo de elástico (ME) foram avaliados usando o Nexygen 3 Plus (LLOYD
Instruments CO). A porcentagem de elongação na ruptura (%E) e o módulo de
elasticidade foram calculados como descrito por Silva et al.[11].
36
3.4.2 Transparência
As medidas da transparência dos filmes foram feitas de acordo com a
metodologia descrita por Wang e Xiong[57], usando um espectrofotômetro
(Biospectro SP-330). Para medida da transparência, amostras de filme
hidratado foram presas com presilhas à célula de leitura do espectrofotômetro e
a leitura em porcentagem de transmitância medida em varredura nos
comprimentos de onda entre 350 a 750 nm, com incrementos de 5 nm. A cada
mudança de comprimento de onda o equipamento foi zerado utilizando uma
cubeta de poliestireno contendo água destilada.
3.4.3 Perfil de Hidratação e Intumescimento dos Filmes
A fim de testar as alterações dimensionais, os filmes foram submetidos a
teste de hidratação utilizando água destilada, solução salina 0,9%, tampão
fosfato de sódio 0,1 mol L-1 pH 8,0 e tampão Tris-HCl 0,1 mol L-1 pH 8,0. Os
testes foram conduzidos como segue: amostras de filmes selecionadas entre
aquelas que não apresentaram bolhas ou deformações, cortadas
aleatoriamente de todas as áreas dos filmes, de massa, comprimento, largura e
espessura conhecidas, foram hidratadas por imersão em uma das soluções. A
cada 10 min, uma amostra era retirada da respectiva solução, seca em papel
absorvente para remoção do excesso de solução, e suas medidas e peso
aferidos. O índice de intumescimento para cada amostra no tempo t foi
calculado utilizando-se a seguinte equação:
0
0t
M
)M(M entointumescim de Índice
37
Onde Mt refere-se à massa do filme intumescido no tempo t e Mo refere-se à
massa inicial da amostra seca.
A fim de se verificar se a alteração estrutural era estável, amostras de
filme foram submetidos a hidratação e secagem sequenciais. A hidratação foi
feita com água destilada aquecida a 55 ºC, por intervalos de no mínimo 3 h.
Decorrido esse tempo, os filmes foram colocados em superfície seca e o
aumento dimensional aferido com paquímetro. Em seguida os filmes foram
deixados à temperatura ambiente até a secagem completa e o procedimento
de hidratação e medida de alteração dimensional foi repetido como descrito.
3.5 TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE
3.5.1 Ensaio de citotoxicidade
Para a verificação da citotoxicidade amostras autoclavadas do filme de
PVA/PEJU medindo 10 x 2 cm foram depositadas sobre placas contendo meio
de cultura Dulbecco’s/Eagles, suplementado com penicilina/estreptomicina e
soro fetal bovino a 10% (v/v). As placas foram semeadas com fibroblastos (PDL
human fibroblast) e em seguida incubadas em estufa umidificada, a 37°C, em
atmosfera saturada em 5% de CO2 por até 96 horas. Após 48h de incubação,
os filmes foram removidos e analisados quanto à presença de células aderidas
à sua superfície.
A viabilidade celular foi analisada qualitativamente utilizando o kit
Live/Dead, que permite a distinção visual entre células vivas e mortas. Para
isso, as amostras foram lavadas com tampão fosfato de sódio por 5 min, e em
38
seguida, incubadas por 30 min com uma solução preparada em tampão fosfato
contendo calceína AM para marcação das células vivas e homodímero de
etídio para marcação das células mortas. Por fim as células foram fixadas por
30 min com solução de formaldeído 4% (v/v), lavadas com tampão fosfato de
sódio por 15 min e analisadas em microscópio de luz invertida (Leica
DMI4000). A visualização da calceína AM se deu a 488 nm com um espectro
de emissão entre 491 a 545 nm e o homodímero de etídio foi visualizado a 568
nm com um espectro de emissão entre 590 a 685 nm.
3.6 IMOBILIZAÇÃO DE PAPAÍNA
3.6.1 Otimização das condições de imobilização
Análise multivariada foi utilizada com o objetivo de otimizar as condições
de imobilização da papaína sobre filmes de PVA/PEJU. Para tanto, foi utilizado
um planejamento do tipo Composto com Rotação no Ponto Central, cujos
fatores e níveis testados foram pH (4,0; 6,0; 8;0), tempo (15, 30 e 60 min) e
temperatura (5 ºC, 15 ºC e 25 ºC) de reação.
Os resultados deste planejamento foram analisados usando metodologia
de superfície de resposta com auxílio do software Statistica 6.0 (Statsoft Inc.,
Tulsa, USA, 1997). O ajuste dos dados experimentais para as variáveis
independentes foi representado pela seguinte equação polinomial de segunda-
ordem:
j ji j
jjjjiijjj exxxxy
2
0
39
onde y representa a variável dependente a ser analisada; ijj ,,0 e jj são os
coeficientes de regressão; ix e jx são as variáveis independentes e e
corresponde ao erro. O modelo foi simplificado descartando-se os termos que
não foram estatisticamente significativos (p > 0.05) por ANOVA.
Para a imobilização os filmes de PVA/PEJU foram previamente ativados,
mergulhando-se por 30 min tiras de 1 cm2 de filme em uma solução de
metaperiodato de sódio 0,1 mol L-1 sodium conforme descrito por Silva et al.[11].
As tiras foram então lavadas com tampão Tris-HCl 0,1 mol L-1, pH 8,0, para
remover o excesso de solução de metaperiodato e em seguida incubadas em
uma solução de papaína de concentração 5 mg mL-1 (Calbiochem, La Jolla,
CA, USA). Após imobilização, as tiras de filme (PVA/PEJU-papaína) foram
lavadas com tampão Tris-HCl 0,1 mol L-1, pH 8,0 para remover a enzima não
imobilizada.
3.6.2 Teste de atividade de papaína livre e imobilizada
A atividade da enzima foi determinada pela metodologia descrita por
Kunitz, modificada por Arnon[58], como segue: a 0,1 mL de uma solução 5 mg
mL-1 de papaína foram adicionados 0,9 mL de uma solução ativadora contendo
EDTA 20 M e cisteína 50 M preparados em tampão Tris-HCl 0,1 mol L-1, pH
8,0. Após 10 min de incubação a 37 ºC, 1 mL de uma solução de caseína a 1%
(p/v) foi adicionada à mistura. A reação prosseguiu por mais 10 min e foi
paralisada pela adição de 1 mL de solução de ácido tricloroacético 10% (p/v). A
suspensão foi deixada resfriar até atingir a temperatura ambiente para em
40
seguida ser centrifugada e a extensão da hidrólise medida em
espectrofotômetro a 280 nm.
A atividade da papaína imobilizada nos filmes de PVA/PEJU foi medida
de modo similar, substituindo-se a solução de papaína livre por uma tira de
filme medindo 1 cm2 suspensa em 0,1 mL de tampão Tris-HCl pH 8,0. Uma
unidade de enzima foi definida como a quantidade de enzima capaz de elevar a
absorbância em 0,1 unidade. Provas em branco foram feitas com a adição de
ácido tricloroacético antes da adição da enzima.
3.6.3 Efeito do pH na atividade da papaína imobilizada em filme de
PVA/PEJU
Para verificar se a imobilização alterou o pH ótimo de reação da papaína
após imobilização, foram feitos testes em que a hidrólise da caseína foi testada
na presença de tiras de PVA/PEJU-papaína em meio tamponado com tampão
fosfato de sódio 0,1 mol L-1, pH 6,0; tampão Tris-HCl 0,1 mol L-1, pH 8,0; e
tampão glicina 0,1 mol L-1, pH 10,0.
3.6.4 Estabilidade durante o armazenamento
A fim de se estabelecer a melhor forma de armazenar o filme bioativo de
PVA/PEJU-papaína, foram feitos testes em que tiras de 1 cm2 foram
armazenadas durante 24h a 4º C nas seguintes soluções: tampão glicina 0,1
mol L-1 , pH 3,6 contendo CaCl2 0,6 mmol L-1; tampão glicina 0,1 mol L-1, pH 9,6
contendo CaCl2 0,6 mmol L-1; tampão Tris-HCl 0,1 mol L-1, pH 8,0; tampão
41
Tris-HCl 0,1 mol L-1, pH 8,0 contendo CaCl2 0,6 mmol L-1. Adicionalmente tiras
de PVA/PEJU-papaína foram armazenadas a seco, a temperatura ambiente.
A estabilidade dos filmes foi determinada pela comparação da atividade
observada antes e após o armazenamento nas diferentes condições.
3.6.5 Análise estatística
Todos os testes foram realizados em triplicata com repetição. Os dados
foram tabulados usando o programa Statistica 6.0 (Statsoft Inc., Tulsa, USA,
1997) e os resultados foram expressos como média ± desvio padrão.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 PREPARO E SECAGEM DOS FILMES
Independente da concentração das soluções de PVA e de PEJU
utilizadas na formulação dos filmes houve necessidade de ajuste da relação do
volume de solução por área dos moldes, uma vez que o método de obtenção
do filme por casting resultava em material de espessura variável e com
propriedades mecânicas diferentes, ora com características de espessura
muito reduzida, polimerização irregular, friáveis, o que impedia uma análise
mecânica adequada.
Os filmes com razão volume/área inferiores a 0,3 mL cm-2 mostraram-se
friáveis à manipulação e muito finos, dificultando sua remoção intacta dos
moldes, resultando em rasgos e furos, e inviabilizando seu emprego em testes
42
padronizados. Assim, os filmes com melhores características foram obtidos
com a proporção de 0,5 mL cm-2 dos moldes.
O processo de secagem se deu de maneira uniforme independente de
ser conduzido à temperatura ambiente ou em estufa a 45 ºC, sendo que o
tempo médio de polimerização e secagem não sofreu variação. No entanto,
quando o processo foi feito em estufa, o aquecimento dos moldes resultou em
uma aceleração da perda de água de forma irregular, levando ao aparecimento
de falhas na estrutura do filme.
O fator que interferiu no tempo de secagem foi a concentração dos
componentes. Os filmes produzidos com 3% (p/v) de PVA/PEJU levaram em
média 18 horas para completa secagem, enquanto que os filmes produzidos
com 6% de PVA/PEJU levaram em média 14 horas.
Ao final da otimização, os filmes obtidos apresentaram aspecto opaco,
esbranquiçado e semirrígido, com imperfeições superficiais decorrentes do
descolamento do molde (Figura 5). Após as lavagens para remoção do
excesso de ácido e iodo, os filmes adquiriram aspecto transparente, tornando-
se maleáveis e resistentes à manipulação (Figuras 5b e 5c).
Figura 5. Aspectos macroscópicos dos filmes PVA/PEJU: (a) filme 3% antes da
lavagem; (b) filme 6% (p/v) antes da lavagem; (c) filme 6% após lavagem.
43
Além disso, as formulações de filmes de PVA/PEJU 6% na razão 0,5
mL cm-2 apresentaram características físicas, mecânicas e macroscópicas
viáveis à manipulação e realização de ensaios, mesmo após o processo de
autoclavagem, apresentando tempo de polimerização e secagem reduzido.
Para efeito de comparação, a primeira formulação de filme PVA/PEJU testada
por Silva et al.[23] necessitou de 5 dias para completa polimerização e secagem,
enquanto a formulação otimizada secou completamente em 14 horas.
4.2 PROPRIEDADES FÍSICAS E ESTRUTURAIS DOS FILMES
4.2.1 Propriedades Mecânicas
As propriedades mecânicas dos filmes são medidas importantes, uma
vez que de acordo com estas propriedades pode-se sugerir diferentes
aplicações para estes materiais.
A medida da resistência à tração na ruptura ou força tensil (T), é
definida pela capacidade de um material resisitir a romper-se quando
submentido a uma força de pressão. Já a porcentagem de elongação (%E)
relaciona-se com a elasticidade de uma material, ou seja, sua capacidade de
elongar-se quando submetido a uma forção de estiramento ou tração. O
módulo elástico (ME) ou módulo Young mede a elasticidade de um material em
termos de flexibilidade molecular, isto é, o módulo elástico nos informa quanta
energia o material pode absorver e dispersar por sua rede polimérica sem
sofrer deformação.
44
Os resultados referentes às propriedades mecânicas dos filmes estão
dispostos na Tabela 1.
Tabela 1. Propriedades mecânicas dos filmes de PVA/PEJU.
PVA/PEJU
(%)
Razão
(ml cm-2)
Força tensil
Kgf cm-2
Elongação
(%E) Modulo Elástico
3% 0,5 3,71 263,2 12135,8
6% 0,5 7,58 186,6 49908,6
Como pode ser visto, à medida que a concentração do PVA e do PEJU
aumenta de 3 para 6% a resistência à tração dos filmes dobrou em valor, o que
provavelmente se deu por consequência da formação de uma rede polimérica
mais densa. Por outro lado, ao tornar-se mais resistente o filme perdeu
elasticidade, como mostram os valores de %E, que caíram de 263,2
(PVA/PEJU 3%) para 186,6 Kgf/cm2 (PVA/PEJU 6%). Isto por que ao aumentar
a concentração dos componentes na formulação dos filmes, aumentam-se os
pontos de interação de hidrogêncio e de ligação covalente entre as cadeias,
tornando a rede polimérica mais rígida. No entanto, ainda que a rede formada
no filme PVA/PEJU 6% tenha menor elongação, o módulo elástico deste
material é maior e revela que este filme tem maior capacidade de manter sua
estrutura sem sofrer deformação, quando submetido a forças de tração e
elongação.
Para visualização e comparação, os perfis típicos dos filmes quando
submetidos a testes de tração e elongação são mostrados na Figura 6.
45
Figura 6. Curva típica apresentadas pelos filmes durante teste de resistência a tração:
(a) PVA/PEJU 3% e (b) PVA/PEJU 6%.
Os resultados observados na caracterização mecânica dos filmes
evidenciaram que os filmes contendo 6% de PVA/PEJU são mais promissores
no que se refere à maleabilidade e resistência. Desse modo, os testes de
caracterização e aplicabilidade foram realizados utilizando as formulações
contendo 6% PVA/PEJU.
4.2.2 Transparência
A análise macroscópica dos filmes PVA/PEJU 6% revelou que estes se
apresentaram homogêneos e transparentes quando hidratados (Figura 6c).
Sob o ponto de vista da aplicabilidade, a propriedade de transparência é
altamente desejável, seja por ampliar o leque de possíveis aplicações, seja por
favorecer a apresentação do produto final[59].
As medidas de transparência na região visível do espectro revelaram
que os filmes hidratados de PVA/PEJU apresentaram porcentagem de
46
transmitância variando entre 50 a 70%, dependo do comprimento de onda,
como pode ser observado na Figura 7. Contrariamente, os filmes secos
apresentaram-se esbranquiçados, bloqueando completamente a passagem de
luz na região visível do espectro.
A transparência pode ser afetada pela composição química dos
componentes do filme ou ainda pelo arranjo assumido pelas cadeias
poliméricas na matriz. De acordo com Levkin et al.[60], a transparência é
prejudicada pela rugosidade da superfície, uma vez que a presença de
rugosidade promove a dispersão da luz. Assim, pode-se inferir que nos filmes
secos os arranjos das cadeias dos polímeros componentes são mais
compactos deixando a superfície mais rugosa. Ao sofrer hidratação as cadeias
relaxam ao mesmo tempo em que permitem a entrada de moléculas de água, o
que torna a superfície mais plana e menos densa, tendo então por
consequência uma menor restrição à passagem da luz[57, 60].
Figura7. Medida de transparência dos filmes de PVA/PEJU no espectro de luz visível.
47
Figura 8. Potencial de emprego como embalagem. Da esquerda para a direita: lâmina
de vidro seguida por amostra de filme de PVA/PEJU 3 e 6 % hidratados.
4.2.3 Perfil de hidratação dos filmes
Os filmes apresentaram alterações estruturais relevantes nos processos
de hidratação e secagem. Os resultados de hidratação com subsequente
secagem dos filmes PVA/PEJU 6% em diferentes razões volume/área são
mostrados na Tabela 2.
Tabela 2. Alterações dimensionais observadas nos filmes durante processo de
hidratação e secagem.
I – área inicial; H1 - primeira hidratação; D1 - primeira desidratação; H2 - segunda
hidratação; D2 - segunda desidratação; H3 - terceira hidratação.
PVA/PEJU
(%)
Razão
(área/volume)
I
(cm2)
H1
(cm2)
D1
(cm2)
H2
(cm2)
D2
(cm2)
H3
(cm2)
6 0,5 360 513 126 416 112 416
6 0,3 520 782 188,5 598 182 598
48
Os resultados indicam que no processo de casting, a velocidade com
que a polimerização e ligação entre as cadeias de PVA e PEJU ocorre é alta e,
portanto, ao final da secagem a rede guarda ainda certo grau de desordem. Ao
ser colocado em contato com o solvente, as interações de hidrogênio entre as
cadeias dos polímeros são substituídas por interações entre os polímeros e as
moléculas de água, levando ao afrouxamento da rede polimérica com
consequente alteração dimensional.
Como evidenciado na Tabela 2, na primeira etapa de hidratação foi
observado um aumento de 50,4% na área dos filmes com razão 0,3 mL cm-2 e
42,5% nos filmes com razão 0,5 mL cm-2. Isso provavelmente ocorre em função
da lixiviação para o meio de fragmentos curtos de PVA e PEJU que ficaram
aprisionados na rede durante o processo de polimerização e secagem.
Com a saída destes fragmentos para a solução, o processo de secagem
subsequente leva a uma retração mais pronunciada da rede polimérica,
provavelmente porque a interação entre as cadeias dos polímeros se dá agora
de modo mais efetivo e ordenado, resultando em um material com dimensão
menor devido à organização estrutural mais compacta. Por consequência, a
redução observada na área dos filmes preparados na razão 0,3 mL cm-2 na
segunda secagem foi de 63% e nos filmes com razão 0,5 mL cm-2 foi de 75%.
Para ilustrar melhor esta alteração, filmes fotografados logo após o
processo de polimerização/secagem e após a primeira hidratação com água
destilada são apresentados na Figura 9.
49
Figura 9. Comparação dos filmes secos com seus respectivos moldes: (a) Molde 18 x
18 cm com filme ao final da secagem e (b) o filme na sua forma hidratada medindo 14
x 14 cm.
Após a redução da área na primeira etapa de hidratação/secagem, novo
processo de hidratação leva a alterações estruturais menores e estáveis, uma
vez que a rede final está formada e estabilizada (Tabela 2).
4.2.4 Intumescimento dos Filmes
A capacidade de intumescimento é uma importante propriedade a ser
determinada para a proposição de possíveis aplicações de filmes a base de
polissacarídeos nas diferentes áreas biotecnológicas[61]. Os resultados
referentes à capacidade de intumescimento dos filmes de PVA/PEJU em
diferentes solventes são apresentados na Figura 10.
50
Figura 5. Capacidade de intumescimento dos filmes PVA/PEJU: (a) alterações de
área; e (b) alterações de massa.
O intumescimento dos filmes resultou em alteração da área, conforme
pode ser observado na Figura 10(a). Os filmes passaram por alterações
conformacionais, com aumento de área de 2 vezes, atingindo a estabilidade
dimensional após a 20 min de imersão no solvente. Estas alterações de área
foram acompanhadas por alterações na massa (Figura 10(b)), sendo obtidos
índices de intumescimento após equilíbrio variando entre 1,6 (água) e 2,2
(solução salina 0,9%).
Os filmes apresentaram estabilização de intumescimento após 20 min de
imersão, indicando que a capacidade de difusão dos solventes no filme é
rápida, especialmente quando comparado com outros filmes a base de
polissacarídeos[61-63]. O rápido intumescimento pode estar relacionado com as
características de hidrofilicidade das moléculas de PVA e PEJU. A presença de
grupos amino e hidroxilas na estrutura do PEJU, assim como o conteúdo de
hidroxilas presentes no PVA permitiram a formação de interações entre estes
grupos hidrofílicos e a água de forma efetiva, contribuindo para o rápido
aumento de água e massa após imersão nos diferentes solventes.
51
Outra característica importante está relacionada com a manutenção do
intumescimento após o equilíbrio. A maioria dos filmes a base de
polissacarídeos acabam por se degradar à medida que aumenta o tempo de
contato com a água, em função do rompimento das ligações intermoleculares e
lixiviação dos polissacarídeos que não estão ligados à rede polimérica para a
solução solvente[61, 64]. A natureza dos polímeros e a estabilidade das ligações
entre PVA e PEJU nos filmes permite que estes mantenham sua característica
estrutural, mesmo em contato prolongado com os solventes. Além disto, ao
serem hidratados os filmes perdem o aspecto esbranquiçado e adquirem
transparência.
As alterações observadas nos filmes permitem classificá-los como
Materiais Sensíveis a Estímulo – (Stimuli Responsive Materials - SRM), uma
classe de materiais que respondem a estímulos do meio com alterações que
variam entre: i) ligação ou desligamento de camadas ou moléculas; ii)
alterações conformacionais; e iii) mudanças em grupos funcionais[65]. Materiais
do tipo SRM tem sido objeto de muitas publicações recentes, especialmente
devido às possibilidades de aplicações deste tipo de materiais na área médica,
ambiental e clínica, como sensores, elementos ativos de dispositivos
microfluídicos, elementos ópticos inteligentes e biomateriais[65].
No caso dos filmes de PVA/PEJU, a alteração estrutural observada é
provavelmente resultado de alteração na rede polimérica na presença de
solvente. É provável que durante o processo de secagem, a saída das
moléculas de água permita a aproximação das cadeias de PVA e PEJU que
então, reagem entre si em pontos específicos que foram oxidados pela ação do
metaperiodato de sódio, em mecanismo similar ao proposto por Papas et al.[66].
52
Com isto forma-se uma rede intercruzada destes polímeros, unida por pontos
de ligação covalente e reforçada por interações de hidrogênio entre as cadeias
de PVA e PEJU.
O curto tempo requerido para se obter o máximo de inchamento e a
manutenção desta capacidade após desidratações sequenciais são resultados
promissores, uma vez que demonstraram que a rede polimérica formada é
estável e não sofre desintegração por ação dos diferentes solventes testados.
Além disso, a alta capacidade de inchamento apresentado pelos filmes é uma
importante característica quando se pensa em utilização para recobrimento de
feridas, especialmente no que se refere a remoção de exsudados[27, 29].
4.3 TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE
A biocompatibilidade de um determinado material pode ser
determinada levando-se em consideração a capacidade que tal material tem de
permitir crescimento e proliferação celular em sua superfície, bem como
garantir a viabilidade das células ali depositadas. Essa característica é
fundamental quando se pensa em materiais passíveis de serem utilizados na
área biomédica.
Os resultados dos testes in vitro evidenciaram a proliferação celular na
presença do filme de PVA/PEJU 6%, como pode ser observado na Figura 11.
Esse resultado sugere que o filme não apresenta citotoxicidade para as células
testadas. Entretanto, quando o filme foi retirado do meio de cultura observou-se
que as células crescem na presença do filme mas não ficaram aderidas a ele.
53
Figura 6. Morfologia das células do ligamento periodontal em contato direto com o
biofilme (a-c) e análise da viabilidade celular na presença do biofilme (d). As células
vivas e células mortas são observadas pela coloração diferencial dos núcleos. As
células viáveis estão com as membranas marcadas em verde e as não-viáveis, no
mesmo campo de verificação, encontram-se com os núcleos corados em vermelho.
A confirmação da viabilidade celular foi realizada através de análise
qualitativa feita com o kit Live/Dead. Como pode ser observado na Figura 11
(d), há uma grande quantidade de células viáveis, o que confirma que os filmes
não apresentam toxicidade e são biocompatíveis nos testes conduzidos em
meio de cultura celular. A ausência de citotoxicidade é uma característica que
permite usar o filme de PVA/PEJU em aplicações biomédicas.
Além dos testes com células, foram realizados testes utilizando
animais, no intuito de se verificar se o filme causaria algum efeito no processo
de inflamação e cicatrização de feridas.
54
A biocompatibilidade do filme, associada à ausência de aderência
celular e alta capacidade de intumescimento deste material torna-o promissor
para utilização em revestimento de lesões. Além disso, trabalhos anteriores
evidenciaram que este filme é um excelente suporte para imobilização de
biomoléculas, o que o aumenta seu potencial para utilização como material
bioativo contendo enzimas imobilizadas para utilização na área biomédica[11].
4.4 IMOBILIZAÇÃO DE PAPAÍNA EM FILMES DE PVA/PEJU
Com o objetivo de transformar o filme de PVA/PEJU em um material
bioativo, papaína foi imobilizada por ligação covalente. A escolha da papaína
deveu-se ao fato de que essa enzima é largamente utilizada no tratamento de
feridas, tendo como objetivo a remoção de tecido lesionado e a consequente
melhora do processo cicatricial[36-40].
A otimização do processo de imobilização foi realizada utilizando-se
planejamento fatorial por superfície de resposta. Os resultados referentes à
atividade enzimática em cada uma das condições de imobilização são
mostrados na Tabela 3.
55
Tabela 3. Atividade de papaína nas diferentes condições de imobilização.
Teste
pH
X1
Tempo (min)
X2
Temperatura (ºC)
X3
Atividade papaína
(U cm-2)
1 4,0 15 5 7,31 ± 0,01
2 4,0 15 25 1,43 ± 0,49
9 4,0 30 15 1,19 ± 0,54
3 4,0 60 5 11,11 ± 0,54
4 4,0 60 25 0,97 ± 0,28
11 6,0 15 15 2,45 ± 0,66
13 6,0 30 5 8,60 ± 0,47
15 (C) 6,0 30 15 2,29 ± 0,91
16 (C) 6,0 30 15 2,30 ± 0,72
14 6,0 30 25 1,98 ± 0,08
12 6,0 60 15 3,86 ± 0,63
5 8,0 15 5 3,40 ± 0,19
6 8,0 15 25 1,29 ± 0,50
10 8,0 30 15 1,46 ± 0,62
7 8,0 60 5 1,78 ± 0,42
8 8,0 60 25 1,43 ± 0,59
Como pode ser observado, a atividade da enzima imobilizada variou de
0,97 U cm-2 (teste 4) a 11,11 U cm-2 (teste 3), dependendo das condições
utilizadas na imobilização.
A análise dos valores apresentados na tabela de ANOVA (Tabela 4)
indicou que o modelo foi estatisticamente significativo e adequado para
representar o relacionamento entre as variáveis independentes tempo, pH e
temperatura e a variável dependente, neste caso a atividade da papaína, o que
pode ser confirmado pelo valor de F apresentado (razão entre F calculado pelo
tabelado). O ajuste do modelo também pode ser avaliado pelo valor de r2, que
foi 0,89; indicando que 89% da variabilidade na resposta pode ser explicada
pelo modelo. Isso sugere que o modelo pode representar acuradamente os
dados na região coberta pelo delineamento experimental. Outro dado bastante
expressivo é o valor reduzido de p, demonstrando o bom domínio da técnica.
56
Tabela 4. Análise de variância para a atividade da enzima nas diferentes condições de
imobilização.
Causa da variação SQ1 GL2 QM3 F p4
pH (linear) 34,24 1 34,24 27,29 2 10-5
pH (quadrático) 14,34 1 14,34 11,42 2 10-3
Temperatura (linear) 126,00 1 126,00 100,44 3 10-10
Temperatura (quadrática) 33,84 1 33,84 26,98 2 10-5
Efeito de interação (pH/tempo) 8,10 1 8,10 6,46 1,7 10-2
Efeito de interação (pH/temperatura) 45,94 1 45,93 36,62 3 10-6
Erro 31,36 25 1,25
1SQ: soma dos quadrados; 2GL: grau de liberdade; 3QM: média quadrática; 4p: nível de
significância.
Além disso, como pode ser observado no gráfico de pareto (Figura 12),
os termos lineares e quadráticos para a variável tempo (X2) e a interação entre
os fatores tempo e temperatura (X2/X3) não afetaram a atividade enzimática da
papaína (p>0,05). Por outro lado, o termo quadrático da temperatura (X3) e a
interação entre os fatores pH e temperatura (X1/X3) afetaram positivamente a
imobilização, enquanto que o termo linear da temperatura, termo quadrático do
pH (X1) e a interação entre o pH e o tempo (X1/X2) afetaram negativamente a
resposta (p>0,05).
57
0,19
-0.86
1,28
-2,52
-3,30
4,75
-5,18
5,99
-9,97
p=0,05
Ef eitos estimados (v alor absoluto)
tempo quadrático
interação tempo/temperatura
tempo linear
interação pH/tempo
pH quadrático
temperatura quadrática
pH linear
interação pH/temperatura
temperatura linear
Figura 7. Gráfico de Pareto evidenciando o efeito absoluto das variáveis na
imobilização da papaína.
A análise de regressão mostrou um ajuste adequado dos valores
experimentais a um modelo polinomial de segunda-ordem (r2=0,89), em função
dos fatores significativos. Desse modo, a correlação entre a atividade da
papaína e as variáveis de imobilização pode ser descrita de acordo com a
seguinte equação:
31
2
33
2
1
-2 08,002,048,139,016,9)cm (UE Papaína de Atividade XXXXX
Onde X1 corresponde à variável pH e X3 corresponde à variável temperatura. A
equação acima foi utilizada para construção do gráfico de superfície de
resposta para a atividade de papaína nos limites operacionais do delineamento
experimental, mostrado na Figura 13.
58
Figura 8. Atividade de papaína em função do pH e temperatura de imobilização.
Como pode ser observado, o aumento da temperatura e pH de
imobilização tem um efeito geral negativo na atividade da enzima. Além disso,
a análise de correlação demonstrou que a temperatura teve o efeito mais
pronunciado na atividade da enzima, apresentando uma correlação negativa na
ordem de -0,67.
Buscando estabelecer a condição ótima de imobilização, foi realizada
um teste de predição matemática utilizando a função de desejabilidade. A
determinação da desejabilidade baseia-se no estabelecimento de uma relação
matemática que permita predizer as interações entre as variáveis de modo a se
obter a máxima resposta, no caso, a máxima atividade de papaína. Como pode
ser observado na Figura 14, as condições ótimas de imobilização para se obter
a máxima atividade de papaína seria a imobilização a 5ºC, em pH 4,0, por 60
min, sendo que esta predição garante 78% de fidelidade dos resultados.
59
Figura 9. Predição matemática das condições de imobilização para o máximo de
atividade de papaína.
A validação da condição de imobilização estabelecida pela predição
matemática foi realizada em triplicata, sendo encontrada uma atividade de
papaína de 11,1 U cm-2. Esse valor confirma a eficiência da predição
matemática, 11,49 U cm-2 estabelecido pela desejabilidade.
4.4.1 Efeito do pH na atividade enzimática da enzima imobilizada
O perfil de atividade enzimática da papaína livre e imobilizada em função
do pH da reação está apresentado na Figura 15. Como pode ser observado,
enquanto para a papaína livre há um platô de atividade ótima entre pH 7 e 8,
para a enzima imobilizada no filme de PVA/PJU o ótimo restrito ao pH 8.0, o
que indica a presença de um efeito do suporte no microambiente de catálise da
enzima, uma vez que o filme apresenta caráter ácido.
60
Alterações no perfil de pH de enzimas imobilizadas são comuns e
geralmente estão relacionadas a um efeito de partição de prótons promovido
pelo suporte na vizinhança da enzima [14, 51, 67, 68].
Figura 10. Atividade da papaína livre e imobilizada em diferentes pHs.
No caso observado na Figura 15, o estreitamento do pH ótimo da
enzima imobilizada provavelmente se deu em função do suporte sofrer
desprotonação crescente até o pH 7,0, quando todos os grupos perderam os
prótons ionizáveis. Deste modo, o pH na vizinhança da enzima provavelmente
permanece mais ácido que o pH do meio de reação, e portanto com força
iônica insuficiente para promover ionização apropriada dos aminoácidos que
compõem o sítio ativo da papaína. Ultrapassada a capacidade tamponante do
suporte, o pH do microambiente se eleva constituindo força iônica capaz de
forçar a ionização dos aminoácidos do sítio ativo da enzima, que é
caracterizado por um pico de atividade da papaína imobilizada em pH 8,0.
61
Embora apresente diferença no perfil de pH ótimo, a enzima imobilizada
apresentou boa retenção de atividade no pH próximo ao fisiológico (pH 6,0 -
7,0), o que permite sua indicação para aplicações na área médica.
4.4.2 Estabilidade ao armazenamento
A estabilidade dos filmes de PVA/PEJU-papaína foi testada
armazenando este material em diferentes condições. Como pode ser
observado na Tabela 5, os filmes mantiveram de 78% a 97% da atividade
proteolítica quando armazenados em solução. Entretanto, o armazenamento a
seco foi mais eficiente, garantindo a retenção de 100% da atividade.
Tabela 5. Atividade da papaína imobilizada após 24h de armazenamento em
diferentes condições.
Condição de armazenamento
Atividade de
papaína
(UE cm-2)
Retenção da
atividade
(%)
Tampão glicina pH 3,6 + CaCl2 5,09 ± 0,57 80,9
Tampão glicina pH 9,6 + CaCl2 4,95 ± 0,93 78,6
Tampão Tris-HCl pH 8,0 5,04 ± 0,95 80,1
Tampão Tris-HCl pH 8,0 + CaCl2 6,09 ± 0,30 96,8
Seco 8,46 ± 1,49 134,4
Atividade Inicial 6,30 ± 0,19 100
O fato do filme PVA/PEJU-papaína reter valores superiores a 70% da
atividade inicial após 24h de armazenamento nas diferentes soluções é
bastante relevante quando se pensa em aplicações deste material como
62
curativo, já que a manutenção da bioatividade é essencial para a eficiência
terapêutica.
Sobretudo importante é a manutenção de 80% da atividade da papaína
armazenada em pH ácico (Tampão glicina pH 3,6 + CaCl2), uma vez que este
dado mostra a alta estabilidade adquirida pela enzima no processo de
imobilização, além de ampliar o leque de aplicações deste material.
Além disso, a manutenção da atividade da enzima submetida ao
processo de secagem é um excelente resultado. Muitas enzimas perdem
completamente a atividade quando submetidas à secagem na forma
imobilizada[51]. Isto ocorre porque a mobilidade natural da molécula é
restringida pela imobilização ao suporte e assim as alterações conformacionais
necessárias para acomodar as cadeias polipeptídicas com a saída da água são
comprometidas, levando à perda de atividade. No caso do filme PVA/PEJU-
papaína esta restrição à mobilidade não ocorre, o que abre boas perspectivas
de aplicação desse material.
5 CONCLUSÕES
As modificações promovidas na formulação dos filmes de PVA/PEJU
resultaram em um material com propriedades mecânicas superiores no
63
que se refere à força tênsil porcentagem de elongação, tendo como
consequência a produção de um material com boa maleabilidade e de
fácil manuseio.
O filme PVA/PEJU apresentou boa transparência caracterizada por
valores de transmitância na região visível do espectro próximas a 70%.
A completa hidratação dos filmes de PVA/PEJU ocorre em 20 minutos e
resulta em alterações conformacionais que permitem classificar estes
filmes como Materiais Sensíveis a Estímulos (Stimule Responsive
Materials).
O filme de PVA/PEJU apresenta boa capacidade de absorção de água o
que é uma característica desejável para materiais destinados a
aplicações biomédicas.
A imobilização de papaína nos filmes de PVA/PEJU resultou em um
material bioativo com potencial aplicação como curativo oclusivo.
64
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ANEXO 1 – ARTIGO PUBLICADO ARTIGO – FILMES DE BLENDAS DE PVA/POLISSACARÍDEOS: PROPRIEDADES MECÂNICAS
JOURNAL OF MATERIALS, v. 2013, Article ID 413578, 6 pages
PVA/POLYSACCHARIDES BLENDED FILMS:
MECHANICAL PROPERTIES
FÁBIO E. F. SILVA; MARIA CAROLINA B. DI-MEDEIROS; KARLA A. BATISTA; KÁTIA F. FERNANDES