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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA.

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA

LABORATÓRIO DE AMBIENTES RECIFAIS E

BIOTECNOLOGIA COM MICROALGAS

PATRICIA GIULIANNA PETRAGLIA SASSI

CIANOBACTÉRIAS MARINHAS DA PARAÍBA E RIO GRANDE

DO NORTE: CULTIVO, TAXONOMIA E POTENCIALIDADES

BIOTECNOLÓGICAS

JOÃO PESSOA

2013


CIANOBACTÉRIAS MARINHAS DA PARAIBA E RIO GRANDE

DO NORTE: CULTIVO, TAXONOMIA E POTENCIALIDADES

BIOTECNOLÓGICAS

Monografia apresentada

em cumprimento das

exigências para a obtenção

do título de Bacharelado

em Ciências Biológicas da

Universidade Federal da

Paraíba.

Orientador: Prof. Dr. Roberto Sassi

Co-Orientador: Profa. Cristiane Francisca da Costa

JOÃO PESSOA

2013


CIANOBACTERIAS MARINHAS DA PARAIBA E RIO GRANDE DO NORTE:

ISOLAMENTO, CULTIVO, TAXONOMIA E POTENCIALIDADES

BIOTECNOLÓGICAS

Aprovada em:________________________

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________

Dr. Roberto Sassi

(Orientador: Departamento de Sistemática e Ecologia/CCCEN/UFPB – Campus I)

_________________________________________

Dra. Beatriz Suzana Ovruski de Ceballos

Departamento de Biologia, Centro de Ciencias Biológicas e da Saúde, UEPB.

_________________________________________

Msc. Katharina Kardinele Barros Sassi

Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologia de Alimentos: UFPB

_________________________________________

MsC. Clediana Dantas Calixto

Programa de Pós Graduação em Química; UFPB

JOÃO PESSOA

2013

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço a Deus por tudo que Ele providenciou em minha vida

durante todo o caminho na graduação, principalmente por nunca ter me deixado desistir

e por nunca me abandonar sempre me mostrando uma solução;

Agradeço à minha mãe, Rosa Cristina Petraglia Sassi, por quem tenho imenso

orgulho e amor. Obrigada pela educação ensinada, por me tornar uma pessoa cada vez

melhor, por me ensinar a sempre ter dignidade e amor ao próximo, por nunca ter

medido esforços na minha criação e na minha vida profissional, pelos conselhos, por ser

essa GUERREIRA que mesmo “chorona e mole” é uma mulher de extremo pulso forte.

Obrigada por ser uma mãe exemplar, pela força, coragem e, pelo IMENSO e

INCONDICIONAL amor oferecido aos seus filhos.

Ao meu pai, Roberto Sassi que além de PAI, foi meu professor e orientador.

Obrigada pelos ensinamentos da vida como pai e como professor, pelo incentivo, pelos

carões e que também, assim como minha mãe, ensinou-me a ser uma pessoa digna, e ter

respeito e amor ao próximo. Agradeço também pela extrema preocupação com minha

vida profissional. Obrigada por ser um pai exemplar, pela força, coragem e, pelo

IMENSO e INCONDICIONAL amor oferecido aos seus filhos.

Aos meus irmãos André e Renato, que além dos meus pais, eles são as pessoas

que eu mais amo nesse mundo (não sei viver sem eles). Obrigada meus irmãos por

serem seres humanos exemplares e com uma inteligência inigualável, os quais eu quero

me espelhar para o resto da minha vida. Muito obrigada por sempre estarem dispostos a

me ajudar no que eu precisar, pelo incentivo, preocupação, pelo AMOR e CARINHO

imenso que vocês me ofereceram (quando morávamos juntos) e me oferecem, e por fim

obrigada por eu ser a “Nega” mais amada e “paparicada” desse mundo. A vocês ofereço

o meu amor eterno;

Às minhas queridas e amadas cunhadas, Elisa e Katharina por cuidarem de uns

dos meus bens mais preciosos da minha vida, por oferecerem suas casas como refúgio

de estresse (principalmente nesse período da monografia) por serem além de cunhadas,

amigas-irmãs, que sempre me dão amor, carinho, conselhos e cuidado. Obrigada por

tudo, amo vocês;

À Lena, que durante todo este percurso agiu como uma MÃE, sempre me dando

amor, carinho e cuidado;

Aos meus familiares que moram em São Paulo e mesmo longe mostraram

preocupação e deram/dão muito amor e carinho quando os visito;

Aos meus amigos (irmãos), Cyntya, Derek, Rachel, Elói e Vinícius que ganhei

durante a graduação, por terem me proporcionado momentos alegres, de aprendizagem,

por terem aguentado meus aperreios durante as aulas e minhas “loucuras” que os

tiravam do sério, pelas noites e madrugadas de estudo, por dividirem momentos de

estresse e por fim, obrigada por serem meus amigos. Amo vocês;

À turma de Ciências Biológicas 2008.2, por terem dividido momentos de

felicidade (como a viagem à Cabaceiras) e estresse absoluto com provas, trabalhos e

seminários;

A todos os professores do curso de ciências biológicas, por terem contribuído

imensamente na minha formação acadêmica;

Aos companheiros do laboratório LARBIM (Aline, Jordana, Giuseppe, Evandro,

Viviane, Gabriel, Thamara, Clediana, Renata (Loba do mar)), por dividirem o estresse

do nosso orientador e por tornarem o ambiente de trabalho harmonioso.

À amigas (irmãs), Aline e Jordana que ganhei do LARBIM, pelos momentos

alegres (de compras e almoços deliciosos, principalmente), por me aguentarem

diariamente com meus ataques de histeria, pelos momentos tristes e de estresse

(desculpa Jordana!), e por todo auxílio que ofereceram para que esta monografia se

concretizasse;

À minhas amigas e irmãs de infância, Andréa, Jéssica, Camila e Jéssica Lisboa,

pelos momentos de imensa alegria que vocês me proporcionaram e me proporcionam,

pelos conselhos, confidência, pela compreensão de alguns períodos afastada de vocês

devido à minha vida acadêmica, pelo amor e carinho que vocês têm por mim. Levarei

vocês comigo sempre em meu coração;

Aos meus amigos do período escolar, Jéssica Lisboa, Camila Montenegro,

Kelson, Cecília, Rossana, Lívia e Agnes.

Aos meus amigos, Maria Gabriela, Pedro e Tito, pela amizade, momentos de

“biririris”, pelos sermões sempre na hora certa (dados por Gabi) e pelo apoio que vocês

ofereceram para o andamento desse trabalho. Obrigada por tudo, amo vocês.

Ao meu orientador Prof. Dr. Roberto Sassi por ter aberto as portas do seu

laboratório, pelo incentivo à pesquisa, por todo conhecimento científico oferecido

durante a graduação e por ter proporcionado, assim, uma melhor qualificação na minha

vida acadêmica. Obrigada também pelas aulas filosóficas, com pensamentos holísticos e

integradores sobre o mundo, que abrem nossa percepção mental e ambiental, e que nos

auxilia a compreender a humanidade;

À Prof. Dra. Cristiane Costa por ter sido minha orientadora durante um período

da graduação e pelos ensinamentos sobre os recifes de corais.

À Doutoranda Katharina Kardinele, por ter aceitado ser membro da banca

avaliadora, por todo conhecimento oferecido no laboratório e na minha formação

acadêmica.

Ao Prof. Dr. Roberto Antoniosi Filho do Laboratório de Métodos de Extração e

Separação da Universidade Federal de Goiás, pelas análises cromatográficas das

amostras de cianobactérias estudadas.

Ao CNPq pela concessão de bolsa ITI-A, através do projeto “Pesquisa,

Desenvolvimento e Inovação na produção de biodiesel de óleos derivados de

microalgas”, financiado pelo MCTI/FINEP.

RESUMO

Neste trabalho foram estudadas espécies de cianobactérias marinhas isoladas (e

mantidas em cultivo) de ambientes costeiros da Paraíba e Rio Grande do Norte (zonas

recifais, estuários e regiões infra-litorais rasas). Também foram obtidas amostras de

cianobactérias que vivem em associação simbiótica com invertebrados marinhos

(cnidários e esponjas). O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar espécies de

cianobactérias marinhas e estuarinas dos Estados da Paraíba e Rio Grande do Norte e

avaliar sua potencialidade para usos biotecnológicos. O material coletado foi levado em

condições herméticas ao Laboratório de Ambientes Recifais e Biotecnologia com

Microalgas (LARBIM). As amostras de água foram inoculadas em meio Conway,

constituído em água do mar filtrada e autoclavada. Todas as amostras inoculadas foram

mantidas numa câmara de cultura climatizada, a 25ºC ± 1ºC dotada de iluminação

mantida por lâmpadas fluorescentes tipo luz-do-dia, com fotoperíodo de 12 horas. As

cianobactérias que crescerem nos inóculos foram isoladas com microcapilares em

microcoscópio, transferidas para novo meio, sendo este procedimento repetido tantas

vezes quantas necessárias até se obter cultivos monoespececíficos. Cada cepa cultivada

foi codificada e incluída no banco de microalgas da Coleção de Microalgas da UFPB

(CMUFPB). Todas as cepas cultivadas foram identificadas ao menor nível taxonômico,

usando critérios diacríticos, seguindo procedimentos de taxonomia botânica. Os cultivos

foram interrompidos no início da fase exponencial. A biomassa obtida foi concentrada,

liofilizada e o rendimento de cada cultivo foi determinado em balança analítica. Foram

determinados, na biomassa obtida, os teores de ésteres metílicos de ácidos graxos, por

cromatografia gasosa. No total foram identificadas 17 espécies de cianobactérias nas

amostras isoladas, incluídas em 10 clones. Como conclusão deste trabalho nós temos

que diversas cepas de uma mesma espécie foram isoladas de diferentes habitats (água

do mar, zonas estuarinas, tecidos de invertebrados benticos), refletindo a variabilidade

de habitat que uma mesma espécie pode ocupar, sugerindo a existência de diferenças

químicas nos bioprodutos por elas metabolizados, em função das pressões do. As

cianobactérias estudadas quanto à sua capacidade de produção de FAME são pobres

nesses produtos, a exceção da cepa M3C (Synechocystis aquatilis), isolada nos recifes

costeiros do Cabo Branco, que apresentou cerca da metade dos teores de óleo

produzidos pela soja, em torno que 15% do ácido graxo EPA, um ômega 3 de grande

importância à indústria de alimentos e de alto valor de mercado.

Palavras chaves: Cianobacterias. Cultivo monoespecífico. Ômega 3. Cromatografia

gasosa.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Vista geral do banco de cultura de microalgas da UFPB mostrando a

manutenção das cepas...................................................................................

36

Figura 2 – Experimento de produção de biomassa em andamento, em balões de 6L com

aeração...........................................................................

36

Figura 3(A-F) – Cepas da cianobacteiras Synechocystis aquatilis cultivadas no

LARBIM/UFPB (M3C, isolada do Cabo Branco; M20C, isolada da praia do Jacaré,

estuário do rio Paraiba; M60C, isolada do Cabo Branco e M91C, isolada do estuário do

rio Mamanguape..........................................................................

40

Figura 4 – Romeria gracilis (cepa M6C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada dos

recifes costeiros do Cabo Branco...........................................................................

41

Figura 5 – Planktotrix isothrix (cepa M11C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada dos

recifes costeiros do Cabo Branco.............................................................

42

Figura 6 – Cepas da cianobacteiras Planktolyngbya limnetica cultivadas no

LARBIM/UFPB (M12C e M48C isoladas do Cabo Branco e M104C da praia de Jacaré,

estuário do rio Paraíba)...........................................................................................

44

Figura 7 – Cepas da cianobacteiras Synechococcus nidulans cultivadas no

LARBIM/UFPB (M38C, isolada de Cynachrella sp. dos recifes do Cabo Branco; M41C,

isolada de Protopalythoa variabilis dos recifes do Cabo Branco, M94C isolada da água

do mar da Praia de Pirangí, RN, M95C isolada da água do mar da Praia de Jacarapé e

M99C e M100C isoladas de Cynachrella sp. dos recifes do Cabo Branco.....................

46

Figura 8 – Planktotrix isothrix (cepa M11C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada dos

recifes costeiros do Cabo Branco.............................................................................

47

Figura 9 – Croococcus sp (cepa M62C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de

amostra de água do mar coletada Praia Jacaré (estuário do rio Paraíba)...................

48

Figura 10 – Perfil cromatográfico dos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido

para a espécie Synechococcus aquatilis (M3C).......................................................

50


para a espécie Romeria gracilis (M6C).................................................................

51


para a espécie Synechococcus nidulans (M41C)...................................................

51


para a espécie Synechococcus aquatilis (M60C)....................................................

52


para a espécie Synechococcus nidulans (M95C)....................................................

53

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Composição do meio Conway (Walne, 1970) conforme utilizado nesta

pesquisa............................................................................................ 34

Tabela 2 – Relação das cepas de cianobactérias marinhas isoladas de diferentes

habitats dos estados da Paraíba e Rio Grande do Norte, mantidas em meio

Conway na Coleção de Microalgas da UFPB (CMUFP) no Laboratório de

Ambientes Recifais e Biotecnologia com Microalgas

(LARBIM/UFPB)..........................................................................................

39

Tabela 3 – Constante de crescimento (divisões celulares/dia), duração da fase

exponencial de cultivo (dias), rendimento em biomassa (mg/g) e totais de ésteres

metílicos de ácidos graxos (mg/g) das cianobactérias marinhas cultivados nesta

pesquisa em meio Conway.......................................................

49

Tabela 4 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos

obtidos para a espécie Synechococcus aquatilis (M3C)..................................

50


obtidos para a espécie Romeria gracilis (M6C)...............................................

51


obtidos para a espécie Synechococcus nidulans (M41C).................................

52


obtidos para a espécie Synechococcus aquatilis (M60C).................................

52


obtidos para a espécie Synechococcus nidulans (M95C)....................................

53

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 12

2 OBJETIVO GERAL .......................................................................................................... 17

2.1 Objetivos específicos ................................................................................................ 17

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ....................................................................................... 18

3.1 Cultivo de cianobactérias e microalgas em geral ..................................................... 18

3.2 O potencial biotecnológico das cianobactérias ........................................................ 21

3.3 Cianobactérias tóxicas .............................................................................................. 27

3.4 Diazotrofia ................................................................................................................ 29

3.5 Taxonomia das cianobactérias ................................................................................. 30

4 METODOLOGIA ............................................................................................................ 34

4.1 Preparação dos meios de cultura ............................................................................. 34

4.2 Coleta, isolamento e manutenção dos cultivos ....................................................... 35

4.3 Crescimento das espécies em condições laboratoriais ............................................ 35

4.4 Análise do perfil dos ácidos graxos........................................................................... 37

4.5 Taxonomia das cianobactérias ................................................................................. 38

5 RESULTADOS ................................................................................................................ 39

5.1 Espécies isoladas e mantidas em culturas monoespecíficas .................................... 39

5.1.1 Synechocystis aquatilis Sauvageau 1892 (Ordem: Synechococcales; Família:

Merismopediaceae) (Fig. 3 A-F)...................................................................................... 40

5.1.2 Romeria gracilis (KOCZW.) KOCZW. ex GEITL. Rabenh.’s Krypt.-Fl. 14: 916, 1932.

(Ordem: Oscillatoriales; Familia; Pseudanabaenaceae ) (Fig. 4 A-B ) ............................ 41

5.1.3 Planktothrix isothrix (Skuja) Komárek et Komárková, Czech Phycol. 4: 14, 2004.

(Ordem: Oscillatoriales Familia: Phormidiaceae) (Figs. 5A-C) ........................................ 42

5.1.4 Planktolyngbya limnetica (Lemmermann) Komárková-Legnerová & Cronberg,

Algolog. Stud. 67:21, 22, 1992. (Ordem: Oscillatoriales Familia: Pseudanabaenaceae )

(Fig. 6-F) .......................................................................................................................... 43

5.1.5 Synechococcus nidulans (E. G. Pringsheim) Komárek, in P. C. Bourrelly, Les Algues

d’Eau Douce, III: 690.1970. (Ordem: Synechococcales; Familia: Synechococcaceae )

(Fig.7 A-F) ........................................................................................................................ 45

5.1.6 Spirulina labyrinthiformis (Linnaeus) Gomont, 1892 (Ordem: Oscillatoriales,

Familia: Pseudoanabaenacea; Subfamilia: Spirulinoideae) (Fig. 8) ................................ 46

5.1.7 Croococcus sp (Ordem: Chroococcales, Familia: Chroococcaceae) (Fig. 9) .......... 48

5.2 Dados dos cultivos .................................................................................................... 48

5.3 Análise cromatográfica dos ácidos graxos das espécies selecionadas ..................... 49

6 DISCUSSÃO .................................................................................................................. 54

7 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 59

REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 61

1 INTRODUÇÃO

Cianobactérias, também conhecidas como cianofíceas ou algas azuis, são

organismos procariontes, aeróbios e fotossintetizantes, que possuem uma ampla

distribuição geográfica ocorrendo em diversas condições ambientais. O grupo abriga

cerca de 150 gêneros, dos quais 40 são potencialmente tóxicos. Surgiram no planeta

Terra há cerca de 3,5 bilhões de anos e foram indispensáveis para a conversão da

atmosfera primitiva à atual (SAHA et al., 2007).

As células vegetativas das cianobactérias caracterizam-se por possuírem

grânulos fosfatos, grânulos de glicogênio, grânulos de cianoficina e os carboxissomos

(STAINER; COHEN-BAZIRE, 1977). Além destas, algumas cianobactérias apresentam

células modificadas denominadas heterocistos que são permeáveis a todos os gases (N2,

O2, CO2, CO, H2, Ar, CH4) e às moléculas de água, contribuindo na regulação da célula

na coluna d’água (WALSBY, 1972). Nos heterocistos ocorre fixação do nitrogênio

atmosférico em condições anaeróbicas, o qual é transferido para as células vegetativas

(TONIETTO, 2009).

Alguns gêneros também podem apresentar outras células modificadas

denominadas acinetos que constituem uma estrutura capaz de promover resistência à

célula (STAINER; COHEN-BAZIRE, 1977). Os acinetos ocorrem em cianobactérias

filamentosas e se apresentam como células diferenciadas e aumentadas, são formadas

em condições desfavoráveis, como em situações de baixa intensidade luminosa,

mudanças do pH e da temperatura, e em baixas concentrações de nutrientes. Eles

guardam, em seu interior, grânulos com substâncias de reserva e atuam como esporos de

resistência. Uma vez liberados ao meio em situaões de estresse entram em divisão

quando as condições são novamente favoráveis, originando um novo filamento.

As cianobactérias também apresentam células que contêm clorofila-a e outros

pigmentos acessórios característicos, como ficocianina, ficoeritrina e aloficocianina,

contidos em tilacóides e responsáveis pela coloração verde-azulada característica do

grupo (LORENZI, 2008)

Filogeneticamente, as cianobactérias estão incluídas no grupo das bactérias

gram-negativas, com distribuição cosmopolita. Podem ser encontradas nos ambientes:

marinho, estuarino e de água doce, vivendo livremente no plâncton ou associadas a

algum tipo de substrato como rochas, sedimento arenosos e lodosos, ou como epífitas,

epizóicas e até mesmo como endossimbiontes.

13

Muitas cianobactérias são psamófilas, vivendo entre os grãos de sedimento. O

hábito psâmico indica a relação desse grupo com as condições de umidade, ao

ressecamento, à natureza do substrato, à temperatura e à reação do movimento da água,

mostrando as exigências ecológicas multiformes das cianobactérias. Seu crescimento

torna-se intenso, a ponto de alterar a coloração da areia (GARCIA-BAPTISTA;

BAPTISTA, 1992). Elas podem viver livres, agregadas aos grãos de sedimento ou em

tubos de mucilagem secretados em suas atividades metabólicas (ROUND, 1983).

Muitas espécies também colonizam pântanos salinos, solos úmidos, raízes de

leguminosas e ambientes extremos como fontes termais, hidrotermais e lagos

hipersalinos, até regiões árticas e antárticas, e diversas espécies vivem endoliticamente

em esteiras microbianas (DAMÁZIO et al., 2005; SINHA; HADER, 2008).

A razão deste sucesso adaptativo tem raízes históricas e é largamente dependente

da versatilidade morfológica e funcional desses organismos. As cianobactérias são os

mais primitivos procariontes fotoautotróficos que supostamente apareceram no planeta

durante o período Précambriano, considerado também a “Era dos estromatólitos”

(SRIVASTAVA, 1997), e “Idade das cianobactérias” (HOEK et al., 1998), devido à

biota estar dominada por estes organismos (SILVA et al., 2004), e por persistiram como

os únicos seres fotossintetizantes oxigênicos por um período de 2 a 3 bilhões de anos.

Os estromatólitos são estruturas organo-sedimentares litificadas cuja formação ocorre

devido ao trapeamento dos sedimentos com minerais precipitados a partir de

comunidades microbianas bentônicas. As construções estromatolíticas apresentam três

estágios de desenvolvimento: esteiras microbianas, estromatólitos estratiformes e

estromatólitos individuais (SILVA; SILVA, 2002), onde são verificadas espécies de

cianobactérias cocóides e filamentosas (HORODYSKY et al., 1977; SILVA et al.,

2004).

Alterações nas condições do ambiente, particularmente no pH, dióxido de

carbono, matéria orgânica, alcalinidade, nitratos e fosfatos são fatores importantes na

determinação da distribuição das cianobactérias (PODDA et al., 2000). A alta

diversidade de hábitats e a consequente divergência ecológica podem explicar a ampla

diversificação de morfótipos e especiação dos tipos cianobacterianos. Esta

diversificação é baseada, muito provavelmente, em uma adaptabilidade rápida e a

estabilização genética de novos ecótipos e morfótipos em novos ambientes

(REJMANKOVA et al., 2004).

14

Sua ampla variação morfológica mostra cianobactérias unicelulares, coloniais e

filamentosas. Os filamentos são formados a partir dos tricomas (uma cadeia de células

que podem ou não estar envoltas por uma bainha de polissacarídeos). Já os grupos

coloniais estão imersos em uma bainha que confere à célula um contorno irregular ou

esférico (CHORUS; BARTRAM, 1999).

A maioria das cianobactérias se reproduz por divisão celular ou pela formação

de esporos, mas no caso das filamentosas, além dessas formas já citadas, a reprodução

pode ocorrer por formação de hormogônios que são pequenas partes de tricomas que se

destacam para formar novos filamentos (CHORUS; BARTRAM, 1999).

Segundo Hoffmann (1996), a consideração de diversos fatores relacionados à

ecofisiologia e capacidades de dispersão, como por exemplo, temperatura, distribuição

de habitats, dispersão e especiação podem resultar em explicações possíveis para os

diferentes padrões de distribuição geográfica das cianobactérias e colonização dos

distintos habitats.

No plâncton de água doce e marinho, algumas espécies podem formar densas

florações em determinadas situações, que se estendem por várias dezenas ou até mesmo

centenas de metros, formando manchas na superfície do mar visíveis à distância.

Associadas ao ambiente bêntico marinho, algumas espécies crescem profusamente em

certos habitats (DE PHILLIPPIS et al., 2005) formando tufos e mucilagens que podem

se aderir a corais, algas e invertebrados marinhos (CHARPY et al., 2012), podendo se

desenvolver, em alguns casos, como culturas praticamente monoespecíficas.

Contribuições das cianobactérias na formação de tapetes microbianos e seu

papel nas cadeias alimentares da zona intertidal foram investigados em vários estudos

(JAVOR; CASTENHOLZ, 1984; FARMER, 1992; WHITTON; POTTS, 2000; AL-

THUKAIR; ABED; MOHAMED, 2007). Muitas espécies são predadas por peixes,

moluscos e diversos herbívoros do macro e do mesozooplâncton e como método de

defesa aos predadores muitas delas produzem potentes toxinas (CHARPY et al., 2012).

Alguns gêneros e espécies de cianobactérias halotolerantes possuem

mecanismos específicos que ajustam intracelularmente o seu status osmótico (APSE;

BLUMWALD, 2002) devido à produção de moléculas osmoprotetoras como glicina,

betaina, trealose e glicerol (LALOKNAM et al. 2006). Pela sua habilidade

fotossintetizante as cianobactérias ocupam um papel de destaque no ciclo global do

carbono, e desde que muitas espécies também são diazotróficas (CAPONE et al., 2005)

15

também desempenham importante papel no ciclo do nitrogênio, particularmente em

áreas oceânicas.

Cianobactérias marinhas produzem metabólitos secundários com potentes

atividades anti-cancer, anti-tumorais e antimicrobianas, além de apresentarem

propriedades biotóxicas (GERWICK et al., 2008). Inúmeras espécies também são fontes

potenciais de diversos produtos naturais biologicamente ativos de interesse químico,

como bio-fertilizantes e combustível renovável (LEM; GLCK, 1985), além de outros

compostos de interesses para a indústria farmacêutica e de alimentos. Recentemente

também tem aumentado o interesse no uso das cianobactérias para propósitos de

bioremediação e controle de poluição, inclusive em processos que envolvem a

degradação de óleos combustíveis e biocombustíveis.

No grupo ocorrem inúmeras espécies que são reconhecidamente tóxicas a

animais aquáticos e ao homem sendo que tais organismos podem provocar desde

alergias leves até a morte por ações neurotóxicas, hepatóxicas ou citotóxicas. De acordo

com Carmichael (2001), as cianotoxinas formam um grupo diverso de substâncias

químicas e o alvo de seu efeito em vertebrados é utilizado para separá-las em

hepatotoxinas (microcistinas e nodularinas), neurotoxinas alcalóides ou

organofosforados (anatoxina-a, anatoxina-a(s) e saxitoxinas), citotoxinas

(cilindrospermopsinas), dermatotoxinas (lyngbyatoxinas) e toxinas irritantes

(lipopolissacarídeos). Alguns autores acreditam que a função ecológica das cianotoxinas

se deve à proteção contra a herbivoria ou por alguma outra condição que proporciona o

stress.

No Brasil, as cianobactérias têm sido particularmente estudadas em ambientes

dulcícolas, especialmente nos aspectos taxonômico, com base na morfologia,

usualmente empregando-se a avaliação taxonômica botânica. Mas apesar da sua grande

importância do ponto de vista ecológico da engenharia sanitária, ainda é pequeno o

conhecimento da diversidade das cianobactérias de ambientes aquáticos brasileiros

(SANT’ANNA et al., 2007), bem como há carência de informações ecológicas sobre

muitas espécies.

Os estudos da biodiversidade das cianobactérias marinhas bentônicas, realizados

por Halperin (1967, 1970, 1974) no litoral da Argentina contribuíram muito para o

conhecimento da diversidade do grupo no Atlântico sul, mas nos ecossistemas costeiros

ao longo da costa brasileira o grupo tem sido bastante menosprezado e a escassez de

informações a respeito é imensa, fazendo-se necessário um estudo amplo e detalhado da

16

biodiversidade das cianobactérias do litoral brasileiro. A despeito de o Brasil possuir

mais de 8000 km de costa e ambientes recifais que se estendem por mais de 2000 km ao

longo da costa brasileira, nenhum trabalho enfocando o grupo foi conduzido até o

momento em recifes.

Em ambientes costeiros, o grupo tem sido estudado particularmente em estuários

e manguezais (BRANCO, 1994; NEVES, 1991; 1992; BRANCO et al., 1996;

BRANCO et al. 1997; BRANCO et al., 2003; JOLY, 1957; OLIVEIRA, 1984;

CARMO,1987; SANTÁNNA, 1988; MOURA, 1991; FROIS-ABREU, 1939;

DAMÁZIO, 1979/1980a; 1979/1980b; DAMÁZIO; SANTOS, 1985, 1990; CUTRIM,

1998) sendo a referencia pioneira o trabalho de Möebius (1889), que reportou a

ocorrência de Microcoleus chtonoplastes. Em manguezais de Joinville, Santa Catarina.

Outros estudos incluem os trabalhos desenvolvidos por Baeta-Neves (1992): Baeta-

Neves; Tribuzi (1992), SantÁnna; Simnonetti (1992), Nogueira; Ferreira-Correia

(2001); Branco et al. (2003).

Os estudos disponíveis sobre o tema também incluem os trabalhos realizados nos

estados do Maranhão (NOGUEIRA; FERREIRA-CORREIA 2001), Pernambuco

(MOURA 1991; MOURA et al. 2000), Rio de Janeiro (BAETA-NEVES; TRIBUZI,

1992) e São Paulo (BRANCO et al. 1994, 1996, 1997; SANTÁNNA, 1988). Melo

Magalhães et al. (2009) citam 31 espécies de cianobactérias encontradas em associação

com outras espécies fitoplanctônicas na Lagoa de Mundaú, Alagoas. Na Paraíba, apenas

5 espécies são referidas para o ambiente marinho (SASSI, 1991).

Neste trabalho nós isolamos diversas espécies de cianobactérias marinhas dos

estados da Paraíba e Rio Grande do Norte identificando-as taxonomicamente e

realizamos ensaios laboratoriais de cultivo avaliando as respostas dessas espécies às

condições de cultivo e discutimos o seu potencial para a produção de alguns bio-

produtos que possam ter interesse econômico.

17

2 OBJETIVO GERAL

Isolar e identificar taxonomicamente espécies de cianobactérias marinhas dos

estados da Paraíba e Rio Grande do Norte e avaliar sua potencialidade para usos

biotecnológicos, a partir de cepas isoladas de habitats marinhos e estuarinos, incluindo

espécimes associadas a invertebrados bênticos recifais.

2.1 Objetivos específicos

a) Obter culturas monoespecíficas de cianobactérias marinhas e estuarinas do Estado da

Paraíba e Rio Grande do Norte isoladas de amostras do plâncton e de tecidos

extraídos de cnidários e esponjas.

b) identificar ao menor nível taxonômico possível as cepas isoladas em cultivos

monoespecíficos, a partir de critérios morfológicos;

c) caracterizar as respostas de crescimento das cianobactéria mantidas em culturas

monoespecíficas em condições laboratoriais de cultivo;

d) comparar as diferentes espécies de cianobactérias mantidas em culturas

monoespecíficas quanto à produção de biomassa e velocidade de crescimento;

e) avaliar o potencial de utilização biotecnológica das espécies levando em conta a sua

capacidade de produção de ésteres metílicos de ácidos graxos.

18

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 Cultivo de cianobactérias e microalgas em geral

Tradicionalmente as cianobactérias têm sido cultivadas usando as mesmas

técnicas e métodos empregados para os cultivos das microalgas em geral. Isso porque,

as cianobactérias são microorganismos fotoautotróficos que ainda hoje são incluídas no

vasto grupo das microalgas pelo simples fato de que tradicionalmente suas bases

taxonômicas e nomenclaturais seguiram os procedimentos adotados pelo código de

nomenclatura botânica, como é feito para as algas em geral.

O uso do termo microalgas não tem nenhuma conotação taxonômica visto que

inclui distintos grupos de prototistas e é de natureza polifilética. Nele também estão

incluídas clorofíceas, bacilariofíceas, dinofíceas, euglenofíceas, eustigmatofíceas,

xantofíceas, glaucofíceas, entre outros.

Os cultivos intensivos de microalgas representam hoje um dos mais modernos

processos da biotecnologia e a partir desses cultivos é possível obter-se alimento e

alguns produtos de interesse nutricional, farmacológico e industrial a custos muito

inferiores do que aqueles empregados pela agricultura tradicional e numa velocidade de

produção muito mais rápida (http://www.spirulinasource.com/earthfoodintro.html).

Historicamente, o primeiro cultivo unialgal foi obtido por Beijerinck em 1890

com Chlorella vulgaris (clorofícea) e os primeiros estudos fisiológicos empregando

essas culturas foram realizados por Warburg por volta de 1900. Mas foi somente por

volta de 1950 que os cultivos em massa desses organismos começaram a receber mais

atenção. O livro clássico de Burlew (1953) procurou sumarizar o conhecimento a

respeito na época e a partir de então o interesse nos cultivos de microalgas tem crescido

continuadamente.

Desde que várias espécies podem conter mais de 50% de proteína (BECKER,

1995) o aproveitamento mais promissor das microalgas é a produção de alimento. Mas

elas também têm importância ambiental muito grande, porque podem ser utilizadas no

controle da qualidade da água, particularmente na remoção de compostos tóxicos,

incluindo amônia (NH3) e nitrito (NO2) em efluentes de carcinicultura (VÍLCHEZ et al.,

1997; CHUNTAPA; POWTONGSOOK; MENASVETA, 2003) e na remoção de

compostos nutricionais em estações de tratamento de água. Nesses casos a biomassa

http://www.spirulinasource.com/earthfoodintro.html

19

algácea aumenta consideravelmente levando à depleção de oxigênio, sendo necessária

sua remoção frequente (VÍLCHEZ;VEGA, 1994; KAYA et al., 1995).

Muitos estudos básicos com microalgas mantidas em culturas já foram

desenvolvidos. Esses estudos têm enfocado diversos aspectos como efeitos das

condições fóticas sobre os cultivos (QURAISHI; SPENCER, 1971; GRIFFTHS, 1973;

FAWLEY, 1984; SAVIDGE, 1986); temperatura (MORRIS; CLOVER, 1974;

GOLDMAN, 1977a; GOLDMAN; MANN, 1980; RAIMBAULT, 1984; 1986),

salinidade (SHIMURA; SHIBUYA; ICHIMURA, 1979; SCHOBERT, 1980; BLINN,

1984; BRAND, 1984), absorção de compostos nitrogenados (CRESSWELL; SYRETT,

1979; RAIMBAULT, 1984), guanina (SHAH; SYRETT, 1982), aminoácidos (FLYNN;

SYRETT, 1985, 1986a,b), amônia (GOLDMAN; GLIBERT, 1982), excreção

(RAIMBAULT, 1986), aqüicultura (WALNE, 1970; GUILLARD, 1975; SIMNON,

1978; OKAUCHI; HIRANO, 1986; SCOTT; BAYNES, 1978; BEM-AMOTZ et al.,

1987; WALSH et al., 1987), composição química, neste caso objetivando-se a

alimentação de animais em cativeiro (WHYTE, 1987; BROWN, 1991; BROWN et al.,

1997, 1998; LOPES-MUÑOZ et al., 1992; O’CONNOR, NELL; DIEMAR 1992;

SOUTHGATE et al., 1998; CAERS, COUTTEAU, 1999), constituição química das

microalgas em diferentes condições de cultivos (ANTIA et al., 1977; GOLDMAN,

1980; FABREGAS et al., 1984, 1985, 1987; OJEDA; AFONSO, 1986; WIKFORS,

1986; NELSON et al., 1992; SUKENIK; YAMAGUCHI; LIVNE., 1993; LOURENÇO

et al., 1997; FIDALGO et al., 1998; SAUODIS-HELIS et al., 1999; VALENZUELA-

ESPINOZA; MÍLAN; NÚNEZ, 2002) e outros estudos ecológicos diversos envolvendo

relações interespecíficas como competição (GOLDMAN; DENNET; RILEY, 1982;

RIJSTENBIL, 1988) e alelopatia (SHARP, UNDERHILL e HUGHERS, 1979).

A literatura que trata dos estudos sobre cultivos de microalgas é muito vasta,

demonstrando que o tema vem de longo tempo recebendo a atenção de pesquisadores no

mundo todo. Outras abordagens que foram conduzidas com esses organismos incluem

estudos sobre fotossíntese, bioensaios de toxicidade, bioensaios de enriquecimento

visando determinar compostos nutricionais limitantes, tolerância de espécies à

dessecação e escuridão de células vegetativas e esporos de resistência, excreção e

absorção de compostos, entre outros assuntos (NAKANISHI; MONSI, 1965;

RAIMBAULT, 1984; 1986; LOMBARDI, 1990; BERLAND et al., 1973;

HARGRAVES e FRENCH, 1975; QUARMBY et al., 1982; POULET e MARTIN-

JÉZÉQULl, 1983; MYKLESTAD et al., 1972).

20

No Brasil, a maior parte das pesquisas sobre este tema tem-se restringido a

estudos laboratoriais em condições controladas, principalmente sobre aspectos

metodológicos (VIEIRA, 1975, 1977), ecológicos e eco-fisiológicos (VIEIRA;

TUNDISI, 1978), meios alternativos (CASTRO, 1979; GONZALEZ-RODRIGUEZ;

MAESTRINI, 1983, OLIVEIRA; KOENING, 1984, TRIANI et al., 1984, 1986;

OLIVEIRA, 1988; MELO et al., 1993) e análises bioquímicas (TALAMONI et al.,

1988; KOENING; MAIA,; CAMPOS-TAKAKI, 1990, LOURENÇO et al., 1997),

principalmente. Estudos envolvendo cultivos em massa visando obtenção de biomassa e

possibilidades de usos tecnológicos foram iniciadas mais tarde, particularmente a partir

dos trabalhos de Derner (2006).

O cultivo de microalgas pode ser considerado um sistema biológico muito

eficiente no armazenamento de energia solar, através da produção de compostos

orgânicos via processo fotossintético, sendo que a maioria das espécies apresenta

crescimento mais rápido que as plantas terrestres, possibilitando maior rendimento de

biomassa (VONSHAK, 1990). Além disso, culturas puras desses organismos também

são essenciais para o estudo de vários aspectos de sua biologia e fisiologia.

No caso particular das cianobactérias, que é o objeto desse trabalho, os cultivos

são muito susceptíveis às variações físicas e químicas, da luz, salinidade, temperatura e

nutrientes (BOOMIATHAN, 2005; SEMYALO, 2009). Sendo o seu crescimento

influenciado por diversos fatores torna-se necessário avaliar as condições ótimas para o

seu cultivo em massa visando aplicações tecnológicas.

Os requerimentos para o sucesso dos cultivos das cianobactérias variam de

espécie para espécie e normalmente pode ser necessário fazer algumas modificações no

meio e nas condições de cultivo (RIPPKA et al., 1979; ALLEN; ARNON, 1955). As

espécies marinhas, por exemplo, tem um requerimento adicional dos íons Na+, Cl

-, Mg

+

e Ca+ para o seu crescimento ótimo (RIPPKA et al., 1979). Diversos meios líquidos

foram modificados para o cultivo de espécies marinhas e de água doce, como por

exemplo: ASN-III, MN, e BG11 (RIPPKA et al., 1979), ASP-2 e SAG1 (PROVASOLI

et al., 1957; RIPPKA, 1988). Para algumas espécies o meio Conway (WALNE, 1970),

também utilizado para o cultivo de diatomáceas, tem demonstrado resultados muito

eficientes.

No processo de isolamento e manutenção do cultivo monoespecífico de

cianobactérias facilmente ocorre contaminação do material por outros organismos

microscópicos, sejam fotossintéticos ou não. Para isso muitos trabalhos foram

21

desenvolvidos com o intuito de descobrir novas alternativas para a obtenção de cepas

monoespecíficas. Mas a obtenção de culturas axênicas não é fácil de ser atingida, pois

usualmente todos os cultivos de organismos fotoautotróficos são fácilmente

contaminados por bactérias heterotróficas. A utilização da azida sódica e fluoreto de

sódio na inibição da cadeia transportadora de elétrons e da glicólise pode ser um bom

procedimento de modo que apenas organismos fotossintetizantes sobrevivam tendo este

método sido aplicado no cultivo das espécies Aphanothece halophytica e Chroococus

minutus, ambas cianobactérias marinhas (MELO; BAETA NEVES; BAPTISTA, 2011).

Outros procedimentos descritos na literatura incluem o uso de antibióticos seletivos que

inibem o crescimento de bactérias, mas que são ineficazes às cianobactérias produtoras

de mucilagem, pois tal composto abriga e protege esses organismos dos antibióticos

(CHO et al., 2002).

3.2 O potencial biotecnológico das cianobactérias

O interesse pelas cianobactérias tem crescido profusamente nas últimas décadas,

a notar pelo volume de publicações sobre o grupo e pela quantidade de informações

divulgadas pela internet, quer seja em termos de documentação científica e educacional,

divulgações de eventos científicos, usos econômicos, perigos à saúde publica e

ambiental, e aplicações industriais.

No Google, são listadas 70 páginas (Janeiro de 2013) que cobrem uma grande

diversidade de assuntos sobre cianobactérias, colocando à disposição dos usuários da

rede mundial de computadores o que existe de mais atual a respeito. Inúmeras outras

páginas relacionadas são também referidas, evidenciando que este assunto penetra em

outras áreas de interesse, a exemplo da importância paleontológica dos estromatólitos e

trombólitos, cujo interesse no assunto tem crescido profusamente, inclusive no Brasil, e

até mesmo sobre ciências espaciais e planetárias visando à colonização do espaço. O

youtube fornece diversos filmes que mostram em detalhes magníficas imagens de

espécies, de florações de espécies, da formação da atmosfera, tratamento de águas e

esgotos, cultivo, produção de biocombustíveis, e outros usos.

Os artigos científicos publicados sobre o grupo tem aumentado a cada década.

Uma busca sobre as principais pesquisas monitoradas pelos scirus.com mostra que de

1920 a 1980 (60 anos) foram divulgados 1849 artigos em Html, 315 em pdf, 1 em ppt e

22

1 documento word, enquanto que somente nas últimas duas décadas (1990 a 2010)

foram divulgados 94746 artigos em html, 46345 em pdf, 1018 em ppt, 35 em OS e 1

TeX. E somente nos últimos meses de 2012 até o mês de fevereiro de 2013 já foram

monitorados pelo scirus.com 2.524 artigos em html e 1.095 artigos em pdf. Só o

interesse aplicado desse microorganismos relacionam assuntos dos mais variados

possíveis, que incluem desde a produção de hidrogênio (DUTTA et al., 2005),

engenharia ambiental, fotobiologia, bioenergética molecular, bioinformática, pesquisas

pós genômicas, engenharia genética, dentre tantas outras frentes de ponta.

Indubitavelmente, o assunto está em alta, e deverá crescer ainda mais. Por trás

desse interesse estão as múltiplas possibilidades do uso biotecnológico das

cianobactérias. Em função das inúmeras aplicações dos produtos derivados desses

organismos. Só a indústria de alimentos e a produção de fármacos e medicamentos

mostram um potencial de crescimento inesgotável. Alimentos, cosméticos e corantes

extraídos das cianobactérias deverão contribuir com grande parcela das necessidades

nas sociedades futuras. E as pesquisas sobre produção de energia a partir de

cianobactérias apontam para possibilidades ainda mais relevantes.

Nesta conjuntura de expansão da biologia das cianobactérias torna-se essencial a

busca e estudos de novas espécies (isolar e purificar) e estabelecer um conjunto que

pode ser uma porta para a exploração biotecnológica (SHAH et al, 2000). As

cianobactérias marinhas, por exemplo, são reconhecidamente consideradas como

prolificas produtoras de metabolitos secundários bioativos (GERWICK et. al., 2001;

TAN, 2007; CARMICHAEL, 2001; CODD, 1997) e muitos desses compostos têm

elevada importância biotecnológica visto que podem ser importantes fontes de agentes

farmacêuticos como vitaminas (TAN; GOH, 2009) e substancias antimitóticas e

antimicrobianas. Os compostos Apratoxina A (LUESCH et al., 2001), largazole

(TAORI et al.,2008) e hantupeptina A (TRIPATHI et al.,2009), por exemplo, tem sido

estudadas como drogas anticancerígenas; combustíveis e compostos químicos finos

além de muitos outros produtos (DEVRIES et al., 1993; MIURA et al., 1993; MUNDT

et al., 2001), são outros exemplos.

A importância das cianobactérias para a biotecnologia destaca-se entre os

modernos processos microbiológicos com inúmeros trabalhos e frentes de pesquisa

desenvolvidos nas ultimas décadas (NAGARAJAN; MARUTHANAYAGAM;

SUNDARARAMAN, 2012; http://www.algenolbiofuels.com/). Esses organismos

fotoautotróficos oxigênicos produzem mais de 600 metabólitos secundários, muitos com

http://www.algenolbiofuels.com/

23

inibição sobre várias proteínas, constituindo uma fonte de produtos com potencial

farmacológico ainda desconhecido (SAMPAIO; CARNEIRO; PINTO, 2011). Além da

produção de toxinas por inúmeras espécies, também foram isolados de cianobactérias

um grande número de substâncias ativas com potencial biológico antibacteriano,

antiviral, fungicida, de inibição de enzimas, com atividade imunossupressora, efeitos

citotóxicos e algicida (MUNDT et al., 2001).

Algumas das espécies podem fixar nitrogênio e assim desempenharem um

importante papel no balanço global de nitrogênio nos oceanos (CARPENTER;

ROMANS, 1991) e pelo mesmo motivo diversas espécies são relevantes para a

agricultura VAISHAMPAYAN et al., 2001) e muitas tem sido uma grande promessa

para propósitos de biorremediação (PATTERSON,1996).

De acordo com Nagaragan; Maruthanayagam; Sundararaman (2012) alguns

gêneros de cianobactérias marinhas como Lyngbya, Oscillatoria, Symploca, Calothrix,

Leptolyngbya, Dichothrix, Geitlerinema, Schizothrix, Aphanothece, Blennothrix e

Synechocystis produzem diversas classes de metabólitos peptídeos acíclicos,

decadepsipeptídeos lineares, lipopeptídeos lineares, lipopeptídeos alcinóicos lineares,

depsipeptídeos cíclicos, undecapeptídeos cíclicos, hexapeptídeos cíclicos, peptídeos

cíclicos lipofílicos, paraciclofanos, alcalóides sesterterpenos, “swinholides”, ácidos

graxos aminados, ácidos graxos brominados, glicolipídeos, éteres polifenólicos,

macrolactonas, macrólidos glicosódicos e iminotetrasacarídeos (ANDRIANASOLO et

al., 2005; BUI et al., 2007; CLARK et al., 2008; GUNASEKERA et al., 2010; KHAN;

LU ; HECHT, 2009; LININGTON et al., 2007, 2009; MO et al., 2009; MULLER et al.,

2006; SALVADOR et al., 2011).

A utilização das cianobactérias na produção de energia também tem sido cada

vez mais investigada, podendo-se admitir que a energia do futuro que poderá atender

grande parte das atividades humana deverá ser dependente do cultivo e processamento

das cianobactérias. Neste contexto, a empresa americana algaenol já registrou patente

para a produção de etanol biogênico, produzido por cianobactérias

(http://www.algenolbiofuels.com/). Tem-se descoberto que algumas espécies excretam

diretamente para o meio de cultura etanol puro, que evapora da água e é colhido usando

fotobioreatores com condensação. A produção total de etanol das cianobactérias

ultrapassa os 8000 kg/há, sendo até 4 vezes maior do que o que é obtido com a cana de

açúcar, numa mesma área.


24

Esses achados também deverão estimular pesquisas sobre o potencial de

produção de biodiesel a partir de cianobactérias e outras microalgas, sendo este um

campo de investigação bastante promissor. A quantidade de óleo que algumas espécies

de microalgas podem conter chega até 75-80% da biomassa seca, dependendo da

espécie e do estado fisiológico em que ela se encontra. Chisti (2007) aponta que a

espécie Botryococcus braunii, por exemplo, pode conter de 25 a 75% de lipídeos,

Chlorella sp de 28 a 32%, Phaeodactylum tricornutum, de 20 a 30%, Schizochytrium sp

de 50 a 77% e Neochloris oleoabundans de 35 a 54%.

A importância nutricional das cianobactérias é outro fato que as qualifica como

um dos mais promissores grupos de microorganismos que deverão ocupar papel de

destaque em nossa sociedade num futuro próximo. Neste contexto, a inserção de

microrganismos ou enzimas na produção de alimentos e de novos produtos é de grande

interesse nutricional e econômico (MULITERNO et al., 2005).

Alternativas alimentares que possam diminuir o déficit nutricional das pessoas

através de novos processos e matérias-primas tem sido alvo de inúmeras pesquisas

recentes e a utilização das cianobactérias para a produção de alimentos representa

atualmente um mercado em franco crescimento, com inúmeras indústrias que cultivam,

beneficiam, embalam e vendem biomassa de algumas espécies (especialmente

Spirulina), para fins nutracêuticos e outros.

A cianobactéria Arthrospira platensis (Spirulina platensis) apresenta um papel

de destaque, devido ao seu alto teor protéico 55-70 % em peso seco (PHANG et al.,

2000), sendo produzida e comercializada em varias partes do mundo. O produto seco é

um valioso suplemento alimentar (CIFELLI, 1983; BELAY et al., 1993), visto que

apresenta baixas concentrações de ácidos nucléicos e aminoácidos, similares ao

recomendado pela FAO (CIFERI; TIBONI, 1985; RICHMOND, 1988). Ela é rica em

proteínas (60–70% em peso), vitaminas (especialmente B12 e B-caroteno), e sais

minerais; contém muitos aminoácidos essenciais e ácidos graxos, sendo, ainda, uma das

fontes de ácido γ-linolenic (GLA) e pigmentos antioxidantes como os carotenóides

(BELAY; KATO; OTA, 1996; BELAY, 2002). Também é grande a possibilidade de

obter-se outros produtos como ficocianinas, ficoeritrina, clorofilas, vitaminas

(especialmente vitamina B12 pró-vitamina A = β-caroteno) e ácidos graxos poli-

insaturados, incluindo os ácidos graxos omega-3 (AARONSON et al., 1980;

SASSANO, 1999) e minerais como o Ferro (BELAY, 2002; HABIB et al., 2008).

25

Pertencente à ordem Oscillatoriales, Arthrospira (Spirulina) é uma cianobactéria

microscópica, fotossintética, unicelular, filamentosa, composta por tricomas de 5-6 μm

de largura e 20-200 μm de comprimento, em forma de um espiral, que tem seu habitat

preferencial em águas alcalinas (HOFF; SNELL, 1999), e que surgiu em nosso planeta

há cerca de 3,0 bilhões de anos (YANG; LEE; KIM, 1997).

Ela tem sido muito usada na alimentação humana e também é conhecida por

produzir vários compostos bioativos. Em particular, S. platensis tem sido usada para

melhorar a imunidade das pessoas e ela também tem sido muito usada na medicina

tradicional chinesa. Estudos pré-clínicos e estudos clínicos sugerem que a Spirulina tem

um efeito terapêutico certo (FOX, 1996), atuando na redução do colesterol do sangue,

proteção contra alguns tipos de câncer, equilíbrio do sistema imunológico, aumento dos

lactobacilos intestinais, redução de nefrotoxicidade por metais pesados e drogas,

proteção à radiação ultravioleta, redução de hiperlidemia (excesso de substâncias como

o colesterol, triacilgliceróis e lipoproteínas no plasma sanguíneo) e obesidade (BELAY

et al., 1993), conforme demonstrado em estudos in vitro em ratos e em humanos (DEVI;

VENKATARAMAN, 1983; KATO et al., 1984; TORRES-DURAN et al., 1999;

MANI; IYER; SUBRAMANIAN, 1998). Tem-se verificado também que em estrato

aquoso S. platensis inibia parcialmente a replicação do vírus HIV1 em células T, em

células mononucleares periféricas e em células de Langerhans, em humanos infectados

com HIV1 (AYEHUNIE et al., 1998) e que ela podia inibir reações anafiláticas em ratos

(YANG et. al., 1997).

Seus efeitos na desnutrição têm sido reportados especialmente em crianças

(SESHADRI, 1993; SIMPORE et al. 2006). Tem-se constatado também que Spirulina

atua também como imunomoduladores em seres humanos e animais, indicando que

Spirulina e seus extratos poderiam impedir ou inibir câncer (QURESHI; ALI, 1996;

HAYAKAWA et al., 1997; KIM et al., 1998; MIRANDA et al., 1998; MISHIMA et al.,

1998; QURESHI; GARLICH; KIDD, 1996; SAEKI et al., 2000a ; SAEKI et al.,

2000b). Também foi relatado que Spirulina apresenta atividade antimicrobiana

(DEMULE; DECAIRE; DECANO, 1996; OZDEMIR et al, 2004), visto que ela

estimula a secreção de Interleucina (IL)-1β, IL-4, e interferon (IFN)-γ em 2.0, 3.3, e até

13.6 vezes os níveis basais, respectivamente, indicando que ela pode fornecer uma forte

proteção contra patógenos e parasitas intracelulares e pode ser eficaz no combate a

parasitas extracelulares (MAO; VAN DE WATER; GERSHWIN, 2003). Neste

contexto, verificou-se que Spirulina tem efeito anti-viral (HAYASHI; HAYASHI;

26

MORITA, 1993), especialmente Herpes simplex (HSV-1) e HIV-1.68. (AYEHUNIE et

al. 1998; HERNANDEZ-CORONA et al. , 2002) e contra diferentes espécies de

bactérias patogênicas humanas (MALA et al., 2009).

Além disso, ela é reconhecidamente um microorganismo toxicologicamente

seguro, não se registrando inclusive efeito colateral devido à overdose de Spirulina, mas

somente um aumento benigno de carotenoides na pele, em alguns casos extremos

(“suntan pill” effect), que pode inclusive auxiliar na prevenção do câncer de pele

(HABIB et al, 2008).

Com todas essas aplicações não é a toa que Spirulina tem sido denominada de

“Super Alimento Natural” (MOORHEAD; CAPELLI; CYSEWSKI, 2006), “uma fonte

maravilhosa de alimento do futuro (HABIB et al., 2008) e “Powerful New Food That

Can Help Rebuild Our Health and Restore Our Environment.” (HENRIKSON, 2009).

Spirulina produzida pela Earthrise tem um status GRAS (Generally Recognized as

Safe). Ela é hoje produzida em diversos países por empresas que utilizam sistemas cada

vez mais complexos de produção e que a comercializam de diversas formas,

disponibilizando-a para lojas de alimentos e muitos outros pontos de venda no mundo

todo(http://www.fda.gov/Food/FoodIngredientsPackaging/GenerallyRecognizedasSafe

GRAS/GRASListings/ucm153944.htm).

Atualmente, microfazendas de cultivo de Spirulina estão se espalhando ao redor

do mundo. E muitas pessoas estão aprendendo a produzir Spirulina em pequena escala

para sua autossuficiência ou para obter algum ganho extra. Em países subdesenvolvidos,

vilas de Spirulina estão crescendo para melhorar a saúde de crianças subnutridas e para

aumentar um ganho extra na economia local

(http://www.spirulinasource.com/microfarms.html).

Spirulina é produzida em pelo menos 22 países incluindo o Brasil e a produção

anual estimada chega a 3000 toneladas por ano (BELAY, 2002; SHIMMAMATSU,

2004), mas esses dados podem estar subestimados. A produção chinesa, por exemplo,

não está dentro das estatísticas oficiais da FAO, e na China já existia em 1997 mais de

80 fábricas produzindo Spirulina (Li; Qi, 1997). A produção chinesa em 2003

ultrapassou 19000 toneladas e passou de 41000 toneladas em 2004 (FAO, 2006).

Apesar disso, a distância entre o desenvolvimento tecnológico dos cultivos dessa

espécie, cada vez mais sofisticados, e sua produção artesanal é muito grande. Também,

são escassos os dados sobre o grau de aceitação da espécie como alimento popular, o

que poderia melhorar a qualidade nutricional de comunidades carentes, no mundo todo.

http://www.fda.gov/Food/FoodIngredientsPackaging/GenerallyRecognizedasSafeGRAS/GRASListings/ucm153944.htm


http://www.spirulinasource.com/microfarms.html

27

Embora a maior aplicação desses microrganismos na indústria de alimentos

esteja associada às Spirulinas, espera-se que outros gêneros e outras espécies dentro da

biodiversidade total desses organismos também sejam promissores para esse fim, à

medida que avancem as pesquisas biotecnológicas sobre as cianobacterias.

3.3 Cianobactérias tóxicas

Uma importância ambiental particular das microalgas são as florações que

ocorrem em circunstâncias excepcionais. Muitas dessas florações podem ser de espécies

tóxicas, e nesses casos os impactos ambientais decorrentes trazem tanto consequências

sociais como econômicas negativas muito significativas, inclusive com danos à saúde

pública.

No Brasil, muitos episódios de florações nocivas recentes têm sido registrados

(http://www.cttmar.univali.br/algas/publicacoes/V_FANSA.pdf). O caso mais

dramático ocorreu em 1960 em Caruaru-Pernambuco, onde 52 pessoas morreram

intoxicadas com cianotoxinas e 116 pacientes apresentaram distúrbios visuais, náusea,

vômitos e fraqueza muscular após uma seção de hemodiálise (AZEVEDO et al, 2002).

No Brasil, a ocorrência de blooms cianobacterianos são frequentes em

ecossistemas de água doce como demonstra os trabalhos de Ferrão-filho et al. (2002);

Sotero-Santos et al. (2006); Becker; Cardoso; Marques, (2004); Bittencourt-Oliveira et

al.(2010) dentre tantos outros. Mas a formação de blooms da cianobactéria

Tichodesmium tem sido registrada e observada com frequência no ambiente marinho,

em diversas regiões ao longo da costa brasileira (SILVA; MATTHIENSEN; YUNES,

2008).

O fenômeno foi registrado pela primeira vez na Baia de Tamandaré, Estado de

Pernambuco (SATO et al., 1963), sendo que os autores atribuiram uma doença

conhecida na região do litoral de Pernambuco como “febre de Tamandaré” às florações

dessas cianobactérias, alegando que a causa da doença seria o “spray” marinho

contendo tricomas de Trichodesmium, inalados pelos habitantes da região, ou

simplesmente a ingestão de água contendo as colônias, que apareceram quase que

anualmente, geralmente entre os meses de fevereiro e março. O fenômeno provoca entre

os habitantes locais um tipo de febre popularmente conhecida pelo nome “tingui”.

Chellappa e Passavante (2004) descrevem uma floração da espécie de

cianobacteria Trichodesmium ertythraeum em águas costeiras do Estado do Rio Grande

http://www.cttmar.univali.br/algas/publicacoes/V_FANSA.pdf

28

do Norte. Em 1995 florações de Trichodesmium também foram relatadas na região de

Ubatuba – São Paulo (GIANESELLA-GALVÃO et al., 1995) e posteriormente o

fenômeno também foi relatado para o litoral norte de Santa Catarina (RORIG et al.,

1998a). Em 1994, uma floração de Trichodesmium atingiu a praia do Cassino (SILVA

et al., 2008), impactando o ambiente costeiro por mais de sete dias. Relatos de florações

de Trichodesmium erythraeum também são conhecidos para o litoral do Paraná,

ocorridos entre os anos de 1998 e 1999 (SIQUEIRA et al., 2006) e na plataforma

continental na região de SANTOS – São Paulo, em 2006 (CARVALHO et al., 2008),

bem como na região da Baía de Camamu – Bahia (PROENÇA et al., 2009). A

ocorrência de florações de Trichodesmium no litoral da Paraíba é fato bastante comum,

conforme relato de pescadores artesanais e observações pessoais pesquisados (SASSI,

comunicação pessoal).

No meio marinho os blooms de cianobactérias ocorrem em algumas áreas

restritas dos oceanos tropicais e subtropicais, e quase sempre estão formados por

representantes dos gêneros Trichodesmium, uma oscillatoriaceae fixadora de N2

(CARPENTER; PRICE, 1976; 1977; CAPONE et al., 1997); Nodularia, e

Aphanizomenon (SELLNER, 1997) e Lyngbya majuscula (DENNISON et al., 1999),

uma oscillatoriacea filamentosa.

A principal preocupação com as florações de cianobactérias é a capacidade

dessas células de produzir toxinas que são metabólitos secundários e podem ser letais

para muitos organismos, incluindo o homem e também causam efeitos que podem

influenciar no equilíbrio dos ecossistemas.

As cianotoxinas são classificadas de acordo com sua ação tóxica nos animais

pela composição química. De modo geral essas substâncias são agrupadas como:

neurotóxicas, hepatóxicas, dermatotóxicas, e aquelas caracterizadas como inibidores

potentes de síntese proteica (YUNES et al., 2003). As neurotoxinas ainda podem ser

classificadas em subgrupos que são eles: anatoxina-a, anatoxina-a(s), saxitoxina, L-

BMMA (Beta-n metilamino-L-alanina).

As neurotoxinas apresentam ação rápida em vertebrados através de diferentes

mecanismos fisiológicos causando a morte por parada respiratória. A anatoxina-a possui

o menor número de ocorrência no Brasil. As saxitoxinas fazem parte de um grupo de

neurotoxinas comumente observadas em dinoflagelados marinhos, responsáveis pelo

fênomeno das marés vermelhas.

29

Diferente das neurotoxinas, as hepatoxinas apresenta um mecanismo de ação

mais lenta, podendo causar a morte em horas, dias ou meses (CARMICHAEL, 1994).

As hepatoxinas são conhecidas como microcistinas, estas possuem maior occorência no

mundo e no Brasil. As microcistinas apresentam maior número de registros,

principalmente em reservatórios utilizados para o abastecimento público.

O aumento dos registros sobre a produção de cianotoxinas por diversas espécies

de cianobactéria sugere ocorrência cosmopolita desses compostos. Entretanto, muitos

trabalhos referem-se a ambientes salobros ou de água doce, com poucos exemplos de

cianobactérias tóxicas em habitats marinhos e terrestres. Com a exceção de estudos

sobre cianobactérias costeiras e planctônicas de regiões tropicais e temperadas-quentes

(HAWSER et al., 1991; 1992), relativamente poucas pesquisas tem sido desenvolvidas

sobre a produção de toxinas por cianobactérias marinhas. Apesar de se reconhecer que

linhagens marinhas também produzem compostos tóxicos ainda existem poucos casos

de intoxicação resultante de cianobactérias marinhas quando comparadas com

ambientes de água doce ou salobra (PEARL, 1996).

3.4 Diazotrofia

As comunidades microbiológicas são componentes essenciais dos ecossistemas,

onde desempenham papéis fundamentais no metabolismo da matéria orgânica e na

transformação bioquímica detodos os elementos, incluindo a fixação biológica do

nitrogênio. Para a realização da fixação do nitrogênio alguns grupos de cianobactérias

sofrem modificações morfológicas e fisiológicas, a exemplo do desenvolvimento dos

heterocistos e o aparecimento da atividade do complexo enzimático da nitrogenase.

Atualmente, o elemento mais importante para aumentar a produção agrícola

tropical é o nitrogênio, que forma 80% da atmosfera na forma gasosa de N2, mas que as

plantas não conseguem utilizar. Somente certas bactérias e cianobactérias, chamadas

diazotróficas ou fixadoras de N2, são capazes de transformar o N2 da atmosfera em NH3,

NH4+ ou aminoácidos, que as plantas podem usar em sua nutrição.

(http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio01/1hp_15.pdf). No meio terrestre fixação

de nitrogênio é um processo natural que ocorre devido à interação entre plantas e

bactérias, razão pela qual na agricultura sustentável a técnica é utilizada como

alternativa para aumentar a produtividade e minimizar a emissão dos Gases de Efeito

Estufa (GEE), contribuindo para atenuar os efeitos das mudanças climáticas.

http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio01/1hp_15.pdf

30

No meio aquático, os microrganismos responsáveis pela fixação biológica do

nitrogênio são as cianobactérias, sejam filamentosas ou unicelulares. A fixação do

nitrogênio é um processo induzido e regulado pelos níveis de amônia e é uma fonte de

entrada de formas assimiláveis de nitrogênio na biosfera, por meio da redução do N2

atmosférico a amônia (NH3), sendo que globalmente, esse é o mais importante processo

depois da fixação do CO2 pela fotossíntese (GENUÁRIO, 2010). As cianobactérias são

os únicos seres-vivos capazes de realizar esses dois processos, que são importantes para

a manutenção da vida na Terra.

As principais ordens das cianobactérias responsáveis pela realização da fixação

biológica do nitrogênio incluem Stigonematales e Nostocales que consiste na sua

morfologia células verdadeiramente diferenciadas, chamadas heterocistos e as ordens

Oscillatoriales e Chroococales, que apresentam células não diferenciadas denominadas,

diazócitos (BERMAN-FRANK et al, 2001). No meio marinho Trichodesmium é o único

gênero de cianobactéria não heterocistada conhecido até hoje que realiza a fixação

biológica de nitrogênio. Algumas espécies isoladas de uma variedade de habitats como

epífitas, planctónicas (CARPENTER; ROMANS, 1991) e edáficas (ZUBERER;

SILVER, 1978) também são fixadoras de nitrogênio e cianobactérias diazotrófricas

foram reportadas para habitats similares em varias partes do mundo. Todas essas

cianobactérias fixadoras de nitrogênio tem um papel significativo na produção de novo

nitrogênio bem como na produção primária no ambiente marinho (HERBERT, 1999) o

que torna esse grupo de microorganismos ecológicamente relevante particularmente em

áreas oligotróficas dos diversos oceanos e mares do mundo.

3.5 Taxonomia das cianobactérias

A taxonomia das cianobactérias atualmente adota dois seguimentos sistemáticos,

o tradicional da botânica e o bacteriológico, respectivamente, pelos Sistemas de

classificação sugeridos por Anagnostidis e Komarék (ANAGNOSTIDIS; KOMÁREK,

1985). A cultura pura da espécie descrita é referência no código de bacteriologia ao

passo que espécimes conservados em herbários, fotografias e/ou desenhos são usados

no código botânico (OREN, 2004; OREN; TINDALL, 2005).

Na taxonomia botânica cada espécie é descrita seguindo normas do Código

Internacional de Nomenclatura Botânica, incluindo a descrição do material em latim e

sua inclusão em coleções de herbários (GEITLER, 1932). Além disso, informações

31

genéticas somadas às características morfológicas, citológicas, ecológicas e bioquímicas

das cianobactérias são usadas na classificação botânica (KOMÁREK;

ANAGNOSTIDIS, 2005). Como as cianobactérias apresentam um aparato

fotossintético semelhante aos das plantas estes microrganismos foram inicialmente

classificadas junto às algas, e assim receberam a denominação de algas-azuis ou

cianofíceas (STAINER et al., 1971).

A taxonomia bacteriana baseia-se na organização da estrutura celular a partir de

microscopia eletrônica, juntamente com análises bioquímicas da composição da parede

celular e estrutura dos ribossomos que revelam a natureza procariótica das células e

justificam o posicionamento do grupo junto às bactérias Gram-negativas (BONEN;

DOOLITTLE, 1978; RIPPKA, 1988; STANIER et al., 1971; STANIER; COHEN-

BAZIRE, 1977) e a inserção das cianobactérias no Código Internacional de

Nomenclatura Bacteriana.

Tanto a abordagem botânica como a molecular é empregada no estudo das

cianobactérias e como referências se utilizam os sistemas de classificação proposto por

Anagnostidis e Komárek (1985; 1990), Komárek e Anagnostidis (1989; 1999; 2005) e o

Manual de Bergey de Bacteriologia Sistemática (BOONE; CASTENHOLZ; GARRITY,

2001), respectivamente conforme as normas botânicas e microbiológicas.

Apesar das diferenças e restrições de cada sistema, os dois códigos estão

convergindo cada vez mais (HOFFMANN; KOMÁREK; KAŠTOVCKÝ, 2005; OREN;

TINDALL, 2005) de modo que nomes botânicos são usados na classificação

bacteriológica e a divisão das cianobactérias em subseções reflete as ordens usadas na

classificação botânica (GENUÁRIO, 2011).

O emprego tradicional de caracteres morfológicos e ecológicos (GEITLER,

1932; DESIKACHARY, 1959; LANE et al., 1985) tem sido aplicado a diferentes

biótopos o que tem contribuído para o conhecimento da variabilidade morfológica das

espécies e permitido, por consequência, obter-se informações da sua distribuição

geográfica. Komarék (2006) ressalta que os estudos florísticos são pouco populares na

pesquisa moderna ficológica, pois as relações filogenéticas entre as cianobactérias ainda

é escassamente entendida, apesar de que estudos comparativos de populações

provenientes de diferentes hábitats (ou de hábitats similares e diferentes regiões) são

importantes para o entendimento do diverso mundo cianobacteriano.

Por outro lado, Stainier et al. (1978) e Rippka et al. (1979) argumentaram que a

sistemática das cianobactérias não deve basear-se somente nos métodos tradicionais da

32

Botânica pois conforme ressaltam Zerhr; Mello; Hiorns (1997); Henson; Watson;

Barnum (2002); Fiore et al. (2007), é extremamente árduo definir as relações

taxonômicas e filogenéticas das cianobactérias por causa das poucas distinções de

características consistentes que suportam um esquema taxonômico seja este pelo

sistema nomenclatural botânico ou o bacteriano.

Branco et al., 2003 admitem que abordagens moleculares podem também

esclarecer mais sobre a biogeografia das cianobactérias, cujos membros desempenham

papel ecológico fundamental nos diversos ecossistemas onde ocorrem, enquanto Garcia-

Pichel et al, (1998) e Palinska et al, (1996) consideram que a reorganização da

sistemática cianobacteriana baseada somente na morfologia pode não ser o método mais

adequado.

Como se vê, o uso de dois sistemas de classificação torna a sistemática das

cianobactérias bastante confusa e esse dilema ainda será tema recorrente nas discussões

entre botânicos e microbiologistas (GENUÁRIO, 2011).

O sistema da taxonomia botânica nas cianobactérias tem sido baseado nas

descrições fenotípicas, morfologia da célula e forma da bainha, reprodução, formação

de colônia, pigmentação, fisiologia e bioquímica. Esses procedimentos têm sido usados

em estudos de levantamento da biodiversidade do grupo iniciados no século XIX e

continuados até hoje.

Adicionalmente, os estudos ultraestruturais e ecológicos usualmente adotados na

taxonomia botânica convencional, não necessitam de grandes exigências visto que

podem ser efetuados com espécimes coletados de amostras naturais. O emprego das

ferramentas da biologia molecular parece ser um complemento dos procedimentos

tradicionais, sendo recomendável a manutenção das populações em bancos de cultura

com condições adequadas para o crescimento das cianobactérias. Este é um aspecto

crítico, visto que muitas cianobactérias não se estabelecem em condições artificiais e,

portanto, não são cultiváveis (FERREIRA, 2008). Um problema adicional das culturas

disponíveis em bancos é a imprecisão nas identificações taxonômicas, levando a um

potencial equívoco na análise dos dados obtidos. Estima-se que mais de 50% das

linhagens de cianobactérias existentes em coleções de cultura estejam identificadas

incorretamente ou foram colocadas erroneamente em alguns grupos taxonômicos

(ANAGANOSTIDIS; KOMÁREK,1990).

Sendo esses alguns dos vários problemas existentes nos estudos da taxonomia

das cianobactérias presume-se que a utilização de diferentes procedimentos de análise

33

que combinem caracteres fenotípicos com o genótipo poderá melhorar o conhecimento

das espécies (SWILMOTTE; HERDMAN, 2001; MARQUARDT; PALINSKA, 2007;

ZEHR et al., 2003; RAJANIEMI et al., 2005). Com relação ao último aspecto, biólogos

têm empregado variedade de técnicas moleculares para responder questões de filogenia,

evolução e diversidade de populações cianobacterianas, particularmente na última

década, (BOYER; FLETCHTER; JOHANSEN, 2001; TOMITANI, 2004) sendo que a

maioria desses estudos baseiam-se na seqüência do rRNA 16S (GIOVANNI et al.,

1988; TURNER et al., 1999; WILMOTTE; HERDMAN, 2001; GUGGER;

HOFFMANN, 2004).

Segundo WEISBURG et al., (1991), a comparação de seqüências de rRNA é

uma poderosa ferramenta para deduzir as relações filogenéticas e evolutivas entre

Bacteria, Archaea e Eukarya e Casamatta, Vis e Shesth (2003) relatam que muitas

vezes a variação morfológica pode não corresponder a diferenças genéticas em

cianobactérias, e que métodos moleculares são essenciais na detecção do curso

biogeográfico de espécies potencialmente críticas.

Segundo Genuário (2011), o advento da sistemática molecular permite comparar

seqüências de DNA de cianobactérias com outros procariotos e eucariotos inferindo

uma filogenia. Análises baseadas em uma ordem de extensão de seqüências gênicas

revelam claramente que as cianobactérias constituem um dos onze maiores clados do

domínio Bacteria. Esta filogenia explica a disposição de muitas similaridades em

estruturas celulares e fisiológicas que cianobactérias compartilham com outros

procariotos (GRAHAM; WILCOX, 2000).

34

4 METODOLOGIA

4.1 Preparação dos meios de cultura

Como meio básico para o cultivo das cianobactérias marinhas estudadas neste

trabalho foi utilizado o meio Conway (WALNE, 1970), preparado com água do mar

filtrada em filtro de fibra de vidro Whatman GF/C de 47mm de diâmetro, autoclavada e

deixada em repouso por 24 horas em temperatura constante, para a re-oxigenação. Após

este tempo, foram adicionados à água filtrada, todos os macronutrientes,

micronutrientes e vitaminas presentes na formulação do referido meio de cultura (Tab.

1).

Tabela 1- Composição do meio Conway (Walne, 1970) conforme utilizado nesta pesquisa.

Solução principal Quantidades FeCl3.6H2O 2,60g MnCl2.4H2O 0,72g H3BO3 67,20g EDTA 90g NaH2PO4.2H2O 40g NaNO3 200g Solução de metais traços 2ml Água destilada 2000mL Adicionar 1ml para cada litro de água do mar Solução de metais Quantidades ZnCl2 2,1g CoCl2.6H2O 2,0g (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,9g CuSO4.5H2O 2,0g Água destilada 100ml Adicionar a Solução Principal Solução de vitaminas Quantidades B12 10mg B1 200mg Água destilada 200ml Adicionar 0,1ml para cada litro de água do mar Solução de silicato Quantidades Na2SiO3.5H2O 4,0g Água destilada 100ml Adicionar 2ml para cada litro de água do mar em caso de cultivo de

diatómaceas e de sílicoflagelados

35

4.2 Coleta, isolamento e manutenção dos cultivos

As coletas foram realizadas em meses aleatórios ao longo dos anos de 2010 a

2012, principalmente na zona de entremarés dos recifes costeiros do Cabo Branco, João

Pessoa, PB, na praia de Pirangi, RN, nos estuários dos rios Mamanguape e Paraíba e na

laguna costeira de Jacarapé. Também foram coletados diversos exemplares dos

invertebrados bênticos recifais: Protopalythoa variabilis (zoantídeo) e Cynachrella sp

(esponja), para o estudo das populações de cianobactérias simbioticamente a eles

associadas. O material coletado foi transportado ao Laboratório de Ambientes Recifais e

Biotecnologia com Microalgas (LARBIM/LEA/UFPB) em condições herméticas onde

foi processado.

As amostras de água foram inoculadas em meio Conway em tubos de ensaio. Os

exemplares de esponjas foram lavados em água do mar filtrada usando jatos de água

projetados com um Water Pik® e também espremidas em placa de Petri.

O zoantídeo Protopalythoa variabilis teve seus tecidos macerados em placa de

Petri com água do mar filtrada, usando estilete e bisturi. Os materiais oriundos desses

invertebrados foram inoculados também em meio Conway, em tubos de ensaio. Todas

as amostras inoculadas foram mantidas em câmara de cultura climatizada, a 25º C ± 1º

C dotada de iluminação mantida por lâmpadas fluorescentes tipo luz-do-dia, com

fotoperíodo de 12 horas.

As cianobactérias que cresceram nos inóculos foram isoladas em microcoscópio

utilizando micropipetas capilares (confeccionada em bico de Bunsen) transferidas para

novo meio, sendo este procedimento repetido tantas vezes quantas necessárias até se

obter cultivos monoespecíficos. Cada cepa cultivada foi codificada e incluída no banco

de microalgas da Coleção de Microalgas da UFPB (CMUFPB) (Fig. 1).

4.3 Crescimento das espécies em condições laboratoriais

O crescimento das espécies selecionadas para estudo foi efetuado em meio

Conway na câmara de cultura climatizada em balões de 6 litros contendo 4 litros de

meio de cultura, sendo que a agitação dos cultivos foi realizada por injeção contínua de

ar (2,0 mL.min-1

) por minicompressor de membrana Resun AOC2. (Fig. 2)

O desenvolvimento dos cultivos foi efetuado por meio de contagens celulares em

câmaras de Fuchs Rozenthal e em câmaras de Sedgewick-Rafter (para as espécies

36

filamentosas), em microscópio binocular Leica, ou através de medidas da fluorescência

in vivo usando um fluorômetro Turner Design 10005 R e/ou medidas da densidade ótica

num espectrofotômetro Micronal B382. Durante as contagens em microscópio também

se efetuou observações do estado fisiológico das células, avaliando-se aspectos da sua

morfologia e tamanho. Todas as espécies estudadas foram fotografadas em vários

aumentos e medidas, utilizando-se um sistema “image-vision” acoplado ao microscópio

Leica.

Figura 1 – Vista geral do banco de cultura de

microalgas da UFPB evidenciando a maneira

como as cepas são mantidas.

As curvas de crescimento de cada espécie cultivada foram traçadas utilizando os

parâmetros de crescimento supra referidos, a partir das quais foi possível determinar-se

o tempo de cultivo, a duração da fase exponencial, a velocidade de crescimento (µ), e o

rendimento final em biomassa. Todas as curvas obtidas foram ajustadas com o

programa estatístico CurveExpert versão 1.3 pela aproximação à curva logística,

conforme Pindich e Rubenfeld (1981) e segundo Derner (2006).

A velocidade de crescimento (k), a qual representa o número de divisões

celulares da população em estudo por unidade de tempo (dia), foi determinada através

da seguinte fórmula (STEIN,1973):

Figura 2 – Fotografia mostrando um

experimento de produção de biomassa em

andamento, em balões de 6L com aeração.

37

k = 3,322 x Log N2

T2 - T1 N1

onde:

k = velocidade de crescimento.

3,322 = fator de conversão do logaritmo base 2 a base 10.

(T2 - T1) = intervalo de tempo em dias.

N1 = densidade celular inicial.

N2 = densidade celular final.

Log = logaritmo em base 10.

No final da fase exponencial do crescimento os experimentos foram

interrompidos e o material foi centrifugado em centrifuga refrigerada a 18oC, os

concentrados foram congelados (-40°C), e posteriormente liofilizados em um

liofilizador da marca Terroni. A biomassa seca foi pesada e guardada em recipiente

hermético para as análises dos ésteres metílicos de ácidos graxos.

4.4 Análise do perfil dos ácidos graxos

As analises da composição dos ésteres metílicos de ácidos graxos (Fatty Acids

Methil Ester – FAME) e os cálculos do teor de ésteres foram efetuados no Laboratório

de Métodos de Extração e Separação (LAMES), da Universidade Federal de Goiás, pela

equipe do Prof. Dr. Nelson Antoniosi Filho através de cromatografia gasosa, usando um

Cromatógrafo a Gas Agilent 7890, equipado com detector FID e injetor split/splitless.

Segundo os procedimentos adotados no LAMES e conforme publicado no artigo

de Menezes et al., (2013), a coluna capilar utilizada foi a DB-WAX (30 m x 0.25 mm x

0.25 um); o forno operou sob temperatura inicial de 70˚C, sendo aquecido a 10˚C.min-1

ate 240˚C, e mantido nesta temperatura por 13 minutos, sendo novamente aquecido a

5˚C.min-1 ate 250˚C; o injetor foi mantido a temperatura de 310˚C com volume de

injecão de 2 µL, no modo split, com razão de split de 10:1; a temperatura do detector foi

mantida a 310˚C; o Hidrogênio 5.0 foi utilizado como gás de arraste a velocidade linear

de 42 cm.s-1

, e o nitrogênio usado como gás make-up auxiliar a 20 mL.min-1

Os FAME foram identificados pela comparação direta com amostras de

composição conhecida, tais como o óleo de soja, amendoim e crambre, por injeção de

padrões de referencia de FAME (NuCheck Prep®) e por análises via Cromatografia

38

Gasosa de Alta Resolução acoplada a Espectrometria de Massas (GC-MS), usando um

Cromatógrafo a Gás modelo Shimadzu 17A acoplado a Espectrômetro de Massas QP-

5050 Shimadzu, com interface a 280oC. O gás de arraste utilizado nos ensaios foi o

hélio a velocidade linear de 42 cm.s-1

. As condições operacionais para forno, injetor e

coluna capilar foram às mesmas utilizadas para HRGC-FID (MENEZES et al., 2013).

4.5 Taxonomia das cianobactérias

A identificação das espécies foi feita através de literatura especializada

utilizando critérios diacríticos (HINDAK, 1990). Foram realizadas observações

morfológicas dos principais caracteres usados na taxonomia do grupo, utilizando um

microscópio Leica com vários aumentos. A identificação morfológica seguiu os

manuais tradicionais de ficologia (GEITLER; 1932; KOMARÉK; ANAGNOSTIDIS

1999, 2005).

As espécies foram identificadas utilizando artigos de referencia, seguindo-se os

procedimentos usuais de taxonomia das cianobactérias (BRANCO et al., 1996; 1997) e

adotando-se como sistema de classificação Komárek; Anagnostidis (1989, 1999, 2005).

Fotografias de cada uma das cepas cultivadas foram realizadas em vários

aumentos, inclusive em objetivas de contraste de fase.

39

5 RESULTADOS

5.1 Espécies isoladas e mantidas em culturas monoespecíficas

Foram identificadas 7 espécies de cianobactérias. Cada cepa identificada foi

codificada e inserida no banco de culturas de microalgas da UFPB (CMUFPB).

Informações referentes à sua procedência e data de isolamento são apresentados na

tabela 2.

Tabela 2 Relação das cepas de cianobactérias marinhas isoladas de diferentes habitats dos

estados da Paraíba e Rio Grande do Norte, mantidas em meio Conway na Coleção de

Microalgas da UFPB (CMUFP) no Laboratório de Ambientes Recifais e Biotecnologia com

Microalgas (LARBIM/UFPB).

Código da cepa Taxon Procedência Data de

isolamento

CMUFPB M3C Synechocystis aquatilis Cabo Branco (água do mar) 12/02/2011

CMUFPB M6C Romeria gracilis Cabo Branco (água do mar) 12/02/2011

CMUFPB M11C Planktotrix isothrix Cabo Branco (água do mar) 14/03/2010

CMUFPB M12C Planktolyngbya limnetica Cabo Branco (água do mar) 14/03/2010

CMUFPB M20C Synechocystis aquatilis. Maceió de Intermares (água salobra) 09/07/2010

CMUFPB M38C Synechococcus nidulans Cynachrella sp. (Cabo Branco) 17/02/2012

CMUFPB M41C Synechococcus nidulans Protopalythoa variabilis (Cabo Branco) 17/02/2011

CMUFPB M48C Planktolyngbya limnetica Cabo Branco (água do mar) 06/07/2011

CMUFPB M60C Synechocystis aquatilis Cabo Branco (água do mar) 09/08/2011

CMUFPB M62C Chroococcus sp Praia Jacaré (estuário do rio Paraíba) 17/08/2011

CMUFPB M85C Spirulina labirintiformis Cabo Branco (água do mar) 02/12/2011

CMUFPB M91C Synechocystis aquatilis Estuário Mamanguape 09/01/2012

CMUFPB M94C Synechocystis aquatilis Praia de Pirangí, RN (água do mar) 26/01/2012

CMUFPB M95C Synechococcus nidulans Praia de Jacarapé (água do mar) 17/01/2012



CMUFPB M104C Planktolyngbya limnetica Praia do Jacaré (estuário do rio Paraíba) 28/12/2011

Os dados da tabela 2, mostram isolados vários clones de uma mesma espécie, de

distintas procedências, a exemplo de Synechococcus aquatilis cujas cepas foram

isoladas de amostras de água do Cabo Branco, do Maceió de Intermares, do estuário do

rio Mamanguape e da Praia de Pirangi no rio Grande do Norte, e Synechococcus

nidulans isolada de amostras de água coletada na Praia de Jacarapé e dos invertebrados

40

bënticos recifais Cynachrella sp e Protopalythoa variabilis coletados nos recifes do

Cabo Branco. Detalhes taxonômicos das cepas identificada são apresentados a seguir.

5.1.1 Synechocystis aquatilis Sauvageau 1892 (Ordem: Synechococcales;

Família: Merismopediaceae) (Fig. 3 A-F)

Descrição: A espécie Synechocystis aquatilis é esférica e usualmente é encontrada em

células solitárias ou aos pares, com diâmetros variando de 2-4 µm. Apresenta coloração

esverdeada-pálida com granulações mais densas em um dos polos.

Figura 3(A-F) – Diferentes cepas da cianobacteiras Synechocystis aquatilis cultivadas no

LARBIM/UFPB (M3C do Cabo Branco; M20C da praia do Jacaré, estuário do rio Paraiba;

M60C do Cabo Branco e M91C do estuário do rio Mamanguape.

A (Cepa M3C, aumento 400x) B (Cepa M3C, aumento 1000x)

D (Cepa M60C, aumento 400x)

F (Cepa M91C, aumento 1000x) E (Cepa M60C, aumento 1000x)

C (Cepa M20C, aumento 1000x)

http://www.algaebase.org/browse/taxonomy/?id=87019


41

Comentários: Os exemplares cultivados tem grande semelhança com os espécimens

estudados por Ferragut et al., (2005) em amostras coletadas no Lago IAG, São Paulo,

com os quais concorda muito bem em forma e tamanho. São ligeiramente menores do

que os exemplares estudados por Tucci et al. (2002) em amostras oriundas do Lago das

Garças, São Paulo. Outra referencia para o Brasil é o trabalho de Sant’anna et al., 2007,

que cita esta espécie para reservatórios do alto Tietê, São Paulo, bem como para o alto

rio Paraná.

5.1.2 Romeria gracilis (KOCZW.) KOCZW. ex GEITL. Rabenh.’s Krypt.-Fl. 14:

916, 1932. (Ordem: Oscillatoriales; Familia; Pseudanabaenaceae ) (Fig. 4 A-B )

Descrição: Esta espécie apresenta tricomas solitários, irregularmente ondulados e até

enrolados com quantidades de células que variam de 2 a 16 células. As células possuem

formas cilíndricas, levemente dilatadas no centro larguras em torno de 1,5 µm.

Apresentam coloração azul esverdeada pálida homogênea.

Figura 4 – Romeria gracilis (cepa M6C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de amostra de

água do mar coletada nos recifes costeiros do Cabo Branco.

Comentários: Os exemplares cultivados são muito semelhantes em forma e tamanho

dos exemplares estudados por Brito et al, 2012. Romeria gracilis é uma espécie

planctônica cosmopolita, encontrada em lagoas e lagos (Komarek, 2001). Este autor

considera as espécies Raciborskia gracilis KOCZW. Kosmos 53: 104, 1929; Amalia

gracilis (KOCZW.) DE TONI Noter. Nomencl. Algol. 1: 5, 1934 e Synechococcus

gracilis (KOCZW.) KOM. Arch. Protistenk. 112: 363, 1970 como sinônimos de R.

gracilis. Previamente esta espécie foi referida para o Lago das Garças, São Paulo (Tucci

B (Cepa M6C, aumento 1000x)

A (Cepa M6C, aumento 400x)



42

et al., 2006). Esta parece ser a primeira referencia para o nordeste e a segunda para o

Brasil.

5.1.3 Planktothrix isothrix (Skuja) Komárek et Komárková, Czech Phycol. 4: 14,

2004. (Ordem: Oscillatoriales Familia: Phormidiaceae) (Figs. 5A-C)

Descrição: P. isothrix apresenta tricomas solitários retos ou levemente sinuosos, com

extremidade sub-hemisférica e parede celular reta e sem constricção. Usualmente possui

granulação adensada no sentido transversal da parede. Largura dos tricomas: 4.0-10.0

μm. As células são usualmente de 0.3 a 1.0 vezes mais compridas do que largas, com

comprimento variando de 2.0 a 5.0 μm. Pigmentos marrom-esverdeados, numerosos

aerótopos.

Figura 5 – Planktotrix isothrix (cepa M11C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de amostra

de água do mar coletada nos recifes costeiros do Cabo Branco.

Comentários: A espécie estudada apresenta muita semelhança em forma e dimensões

com P. isothrix estudada por Martins; Branco; Werner (2012) em lagoas costeiras


C (Cepa M11C, aumento 1000x,

Fotograia em contraste de fase)



43

associadas à Lagoa dos Patos no Rio Grande do Sul. As características da espécie

mostram semelhanças com a descrição fornecida por Komárek; Komárková (2004). De

acordo com Martins; Branco; Werner (2012) esta espécie é bentônica

preferencialmente, mas também forma blooms e está presente em corpos de água

estagnadas eutróficos e hipereutróficos e em lagos tropicais e temperados (DAVIS et al.

2003, STEFANIAK; KOKOCINSKI; MESSYASZ, 2005; PÉREZ et al. 2009). Santos:

Sant’anna (2010) referem-se à Oscillatoria agardhii var. isothrix Skuja, Symb. Bot.

Upsal. 9(3): 49. 1948. Figura 31 como sinônimo. Esses dois autores fazem referencia

dessa espécie para lagoas do pantanal da Nhecolândia, Mato Grosso do Sul. De acordo

com Komárek; Anagnostidis (2005) P. isothrix ocorre em água doce, com hábito

primariamente bentônico, epipélico, secundariamente planctônico, solitário,

frequentemente formando florações, distribuída mundialmente em águas estagnadas e

lagos eutróficos a hipereutróficos.

5.1.4 Planktolyngbya limnetica (Lemmermann) Komárková-Legnerová &

Cronberg, Algolog. Stud. 67:21, 22, 1992. (Ordem: Oscillatoriales Familia:

Pseudanabaenaceae ) (Fig. 6-F)

Descrição: Os exemplares cultivados apresentam filamentos solitários retos ou

ligeiramente tortos, que flutuam na água e que possuem larguras variando de 1 a 2 µm.

Normalmente são pálidos, de coloração verde-azulada homogênea, mas com uma

granulação mais forte sobre cada lado da parede no sentido longitudinal. As células

apicais são cilíndricas com ápice arredondado. Os tricomas são cilíndricos e são de

largura uniforme de aproximadamente 0,8 a 1,7 µm. As células são aproximadamente 3

a 5 vezes mais longas do que largas.



44

Figura 6 – Diferentes cepas da cianobacteiras Planktolyngbya limnetica cultivadas no

LARBIM/UFPB (M12C e M48C isolada do Cabo Branco e M104C da praia de Jacaré, estuário

do rio Paraíba).

Comentários:

Os nossos exemplares assemelham-se bastante com as espécimes estudados por

Martins et al. (2012) em amostras coletadas na região da Lagoa dos Patos, Rio Grande

do Sul. A espécie P. limnetica havia sido referida previamente para o Brasil por

Sant’anna et al. (2007) em amostras coletadas em reservatórios do alto Tiete, São Paulo.

Esses autores referem-se à Lyngbya limnetica Lemmermann, Bot.Centralbl. (76):154.

1898 como basiônimo de Planktolyngbia limnetica.

E (Cepa M48C, aumento 1000x) F (Cepa M104C, aumento 1000x)

C (Cepa M12C, aumento 1000x,

fotografia em contraste de fase)

D (Cepa M12C, aumento 1000x,

fragmento de treicoma em contraste

de fase)


45

Este táxon apresenta semelhanças a Pseudoanabaena sp1 estudada por Cordeiro-

Araujo et al. (2010) no estado de São Paulo. Cordeiro-Araújo et al. (2010) comentam

que com a mudança de gênero proposto por Anagnostidis & Komárek (1985), Lyngbya

limnetica Lemmermann 1898 foi considerada sinônimo de L. subtilis W. West 1892, o

que significa utilizar o epíteto específico “subtilis” para o novo gênero Planktolyngbya,

devido à prioridade de publicação, resultando então em Planktolyngbya subtilis. No

entanto, como Lyngbya subtilis é sinônimo de Lyngbya distincta (Norstedt) Schmidle

1897 a qual pertence ao gênero Heteroleibleinia (GEITLER, 1905) então o epíteto

“subtilis” não seria mais adequado e sim, o epíteto “limnetica” Komárková-Legnerová;

Cronberg 1992. Portanto, P. limnetica é o nome válido para esta espécie, segundo estes

autores. Esta é a primeira referencia dessa espécie para o Estado da Paraíba.

5.1.5 Synechococcus nidulans (E. G. Pringsheim) Komárek, in P. C. Bourrelly, Les

Algues d’Eau Douce, III: 690.1970. (Ordem: Synechococcales; Familia:

Synechococcaceae ) (Fig.7 A-F)

Descrição: Synechococcus nidulans apresenta células isoladas, podendo formar curtos

filamentos de 2 células, raramente mais, que podem ser retos, curvos ou sigmoides. As

células tem formato subcilindrico até levemente ovalado e não possuem mucilagem e

usualmente variam de 1,5 a 6.0 μm de comprimento e de 0,5 a 2,0 μm de largura.

Apresenta coloração homogenea verde-azulada pálida, sem aerótopos.

Comentários: Os exemplares cultivados assemelham-se em forma e dimensões ao

material estudado por Ferragut et al. (2005) em amostras oriundas do Lago do IAG, São

Paulo. Segundo Sant’anna et al. (2007) a espécie Lauterbornia nidulans Pringsheim,

Arch. Mikrobiol. 63. 1968 é o basiônimo de Synechococcus nidulans. A espécie é

referida previamente para o Estado de São Paulo em reservatórios do alto Tietê

(SANT´ANNA et al., 2007), para a lagoa das Garças (GENTIL, 2000; TUCCI, 2002;

CROSSETTI, 2002) e para o Lago do IAG (LOPES, 1999; FERRAGUT et al., 2005).

Esta é a primeira citação da espécie para o Estado da Paraíba.



46

Figura 7 – Diferentes cepas da cianobacteiras Synechococcus nidulans cultivadas no

LARBIM/UFPB (M38C, isolada de Cynachrella sp. dos recifes do Cabo Branco; M41C, isolada

de Protopalythoa variabilis dos recifes do Cabo Branco, M94C isolada da água do mar da Praia

de Pirangí, RN, M95C isolada da água do mar da Praia de Jacarapé e M99C e M100C isolada

de Cynachrella sp. dos recifes do Cabo Branco.

5.1.6 Spirulina labyrinthiformis (Linnaeus) Gomont, 1892 (Ordem: Oscillatoriales,

Familia: Pseudoanabaenacea; Subfamilia: Spirulinoideae) (Fig. 8)

Descrição: Esta espécie apresenta tricomas isolados com conteúdo celular de coloração

tipicamente verde-azulada pálida e com espiras justapostas de 2 a 2,5 µm de diâmetro.

B (Cepa M41C, aumento 1000x) B (Cepa M41C, aumento 1000x)

C (Cepa M94C, aumento 1000x) D (Cepa M95C, aumento 630x)

F (Cepa M100C, aumento 1000x) E (Cepa M95C, aumento 1000x)


47

O eixo longitudinal dos tricomas tem aproximadamente µm de diâmetro e é mais ou

menos retilíneo e as células são até duas vezes mais longas do que largas.

Figura 8 – Spirulina labyrinthiformis (cepa M85C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de

amostra de água do mar coletada nos recifes costeiros do Cabo Branco.

Comentários: A espécie foi previamente referida para a Praia Mansa, Município de Ilha

Bela, São Paulo, Praia das Anchovas e Praia do Saco do Eustáquio, bem como em

Itanhaém (SANT’ANNA et al., 1985), Ubatuba (SANT’ANNA, 1997).

Spirulina labyrinthiformis tem sido encontrada vivendo sobre a mucilagem de

outras cianobactérias filamentosas como Blennothrix glutinosa e B. lyngbyacea bem

como em meio a massa de Oscillatoria nigro-viridis, mas pode ocorrer isoladamente

não formando talo ou massa de tricomas como descrito por Komarék; Anagnostidis

(2005) como foi observados nos nossos cultivos em laboratório. Também tem sido

encontrada vivendo como epífita da macroalga Bostrychia radicans.

O holótipo do gênero Spirulina é Spirulina major (Kützing ex Gomont. Spirulina

labyrinthiformis (Linnaeus) Gomont 1892 é nome correntemente aceito mas nenhum

sinônimo é incluído no AlgaeBase

(http://www.algaebase.org/search/species/detail/?species_id=143130). A localidade tipo

da espécie é “Thermis Patavinis” (Àbano Terme, próximo à Padova, Itália) (SILVA;

BASSON; MOE,1996:).

F (Cepa M85C, aumento 1000x)

http://www.algaebase.org/search/genus/detail/?genus_id=43080

48

5.1.7 Croococcus sp (Ordem: Chroococcales, Familia: Chroococcaceae) (Fig. 9)

Descrição

Os exemplares cultivados apresentam células arredondadas, isoladas em grupos

de 2 a 4 células, com diâmetros variando de 2 a 4 µm. Aparentemente as células se

agrupam numa massa mucilaginosa pouco densa, hialina. As células são esféricas, têm

paredes espessas, de coloração verde-azulada e com granulações densas em seu interior,

visíveis em grande aumento.

Figura 9 – Croococcus sp (cepa M62C) cultivada no LARBIM/UFPB isolada de amostra de

água do mar Praia Jacaré (estuário do rio Paraíba).

Comentários:

As características observadas para os exemplares cultivados não permitiram

enquadrá-la em nenhuma espécie conhecida do gênero, segundo a literatura consultada.

Pelas suas dimensões diminutas é possível que seja uma espécie ainda não descrita,

visto que em muitos casos a identificação é baseada principalmente no tamanho da

célula, associado ainda ao fato de que a taxonomia de populações tropicais ainda não é

perfeitamente clara conforme ressaltam Sant´Anna et al, (2004).

5.2 Dados dos cultivos

A tabela 3 apresenta os resultados finais dos cultivos em condição de

laboratório. Os valores apresentados de velocidade específica de crescimento (k) são a

média dos respectivos valores obtidos em cada experimento. Houve grande diferença

Cepa M62C, aumento 1000x,

fotografia em contraste de fase

49

nos resultados para as diferentes espécies estudadas, com valor máximo de 1,07

divisões/dia para a cepa M94C (Synechococcus nidulans), e mínimo de 0,26

divisões/dia para a cepa M3C (Synechocystis aquatilis).

Tabela 3 – Constante de crescimento (divisões celulares/dia), duração da fase exponencial de

cultivo (dias), rendimento em biomassa (mg/g) e totais de ésteres metílicos de ácidos graxos

(mg/g) das cianobactérias marinhas cultivados nesta pesquisa em meio Conway.

Espécie Cepa k

(média)

Desvio

Padrão

Duração

da fase

Log

(dias)

Biomassa

total

Total de

ésteres de

ácidos graxos

Synechocystis aquatilis M3C 0,26 ±0,16 6 25,35 101,1

Romeria gracilis M6C 0,36 ±0,17 11 25,82 72

Planktotrix isothrix M11C 0,48 ±0,15 8 15,13

Planktolyngbya limnetica M12C 0,31 ±0,21 9 7,85

Synechocystis aquatilis M20C 0,33 ±0,28 7 5,65

Synechococcus nidulans M38C 0,87 ±0,6 8

Synechococcus nidulans M41C 0,77 ±0,3 4 2,64 45,4

Planktolyngbya limnetica M48C 0,45 ±0,3 4 7,86

Synechocystis aquatilis M60C 0,65 ±0,45 8 16,46 4,8

Croococcus sp M62C 0,45 ±0,32 8 9,64

Synechocystis aquatilis M91C 0,39 ±0,009 7


Synechococcus nidulans M95C 0,66 ±0,46 5 5,21 4,0


O rendimento final em biomassa foi maior nas cepas M3C, M6C, M60C e

M11C, em ordem decrescente. A cepa M6C foi a que apresentou uma fase exponencial

mais longa, chegando há 11 dias, enquanto as cepas M41C e M48C foram as que

tiveram as menores durações da fase log (4 dias). Dentre as espécies selecionadas para

análises dos ésteres metílicos de ácidos graxos, os maiores valores foram encontrados

nas cepas M3C (101,1 mg/g) e M6C (72 mg/g).

5.3 Análise cromatográfica dos ácidos graxos das espécies selecionadas

Os cromatogramas relativos aos ésteres metílicos de ácidos graxos (Fig. 10-

14) evidenciaram maiores picos e maior diversidade de ácidos graxos (Tabelas 4 a 8)

nas cepas M3C (Synechocystis aquatilis) e M6C (Romeria gracilis). As cepas M60C e

M95C foram extremamente pobres em ácidos graxos. Na cepa M3C foram detectados

18 tipos de ácidos graxos, com maior representatividade quantitativa dos ácidos

palmítico (C16:0), com 35,8 mg/g e palmitoleico (C16:1c9), com 22,8 mg/g,

representando a soma desse dois tipos mais que 50% dos ácidos graxos totais dessa

50

espécie. Esses ácidos graxos são respectivamente saturados e monoinsaturados e,

portanto, uteis para propósitos de produção de biodiesel. Entretranto, constatou-se,

também, que esta espécie produz expressiva quantidade do ácido graxo

Eicosapentanóico (C20:5 c5,8,11,14,17), com 14,4 mg/g (quase 15% do total de ácidos

graxos produzido por esta espécie), que é um ômega 3 de extrema importância

econômica e alto valor de mercado, frente suas possibilidades de utilização na indústria

de alimentos.

Figura 10 – Perfil cromatográfico relativo aos ésteres metílicos dos ácidos graxos obtido para a

espécie Synechococcus aquatilis (M3C).

Tabela 4 – Composição percentual dos ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos para a espécie

Synechococcus aquatilis (M3C).

Tempo de eluição

(min) Símbolo Éster Metílico do Ácido

Notação

Taquigráfica Teor (%)

5,18 Cy Caprílico C8:0 0,4 7,65 C Cáprico C10:0 0,2 10,12 La Láurico C12:0 1,8 12,43 M Mirístico C14:0 8 13,51 Pt Pentadecílico C15:0 0,4 14,57 P Palmítico C16:0 35,8 14,85 Po Palmitoléico C16:1 c9 22,8 15,07 11-Hexadecenóico C16:1 c11 0,3 15,55 Mg Margárico C17:0 0,3 15,8 9-Heptadecenóico C17:1 c9 0,4 16,55 S Esteárico C18:0 0,9 16,7 7-Octadeceóico C18:1 c7 0,1 16,8 O Oléico C18:1 c9 6,7 16,86 V Vacênico C18;1 c11 0,2 17,34 L Linoleico C18:2 c9,12 3,9 17,72 γ Ln Gama linolênico C18:3 c6,9,12 0,2 21,17 AA Araquidônico C20:4 c5,8,11,14 2,9 22,6 EPA Eicosapentanóico C20:5 c5,8,11,14,17 14,4

51


espécie Romeria gracilis (M6C).


Romeria gracilis (M6C).

Tempo de

eluição (min) Símbolo Éster Metílico do Ácido

Notação

Taquigráfica Teor (%)

5,16 Cy Caprílico C8:0 0,1 10,1 La Láurico C12:0 0,2 12,4 M Mirístico C14:0 0,2 13,49 Pt Pentadecílico C15:0 0,3 14,55 P Palmítico C16:0 47,3 14,75 Po Palmitoléico C16:1 c9 0,1 14,82 11-Hexadecenóico C16:1 c11 15 15,53 Mg Margárico C17:0 1,6 15,77 9-Heptadecenóico C17:1 c9 3,9 16,3 Diinsaturado 0,2 16,52 S Esteárico C18:0 0,6 16,77 O Oléico C18:1 c9 14,6 16,84 V Vacênico C18;1 c11 0,5 17,3 L Linoléico C18:2 c9,12 9,9 18,11 Ln Linolênico C18:3 c9,12,15 5,3


espécie Synechococcus nidulans (M41C).

52


Synechococcus nidulans (M41C).

Tempo de

Retenção (min) Símbolo

Éster Metílico do Ácido

Graxo Notação Taquigráfica

Teor

(%) 5,7 L Láurico C12:0 1,1 7,8 M Mirístico C14:0 25,9 8,3 Mo Miristoléico C14:1 c9 1,9 8,9 Pt Pentadecílico C15:0 1,0 9,8 P Palmítico C16:0 19,5 10,0 Po Palmitoléico C16:1 c9 26,5 10,5 7,10-Hexadecadienóico C16:2 c7,10 3,5 11,0 7,10,13-Hexadecatrienóico C16:3 c7,10,13 4,1 11,8 S Esteárico C18:0 1,7 11,9 O Oléico C18:1 c9 1,1 12,0 V Vacênico C18:1 c11 3,1 12,2 L Linoléico C18:2 c9,12 1,0 12,8 Ln Linolênico C18:3 c9,12,15 0,5 14,9 Poliinsaturado 9,1


espécie Synechococcus aquatilis (M60C)


Synechococcus aquatilis (M60C)

Tempo de

Retenção (min) Símbolo Éster Metílico do Ácido Graxo Notação Taquigráfica Teor (%)

9,8 P Palmítico C16:0 25,6 10,5 7,10-Hexadecadienóico C16:2 c7,10 13,4 11,0 7,10,13-Hexadecatrienóico C16:3 c7,10,13 13,2 11,9 O Oléico C18:1 c9 7,4 12,2 L Linoléico C18:2 c9,12 26,1 12,8 Ln Linolênico C18:3 c9,12,15 14,3

53


espécie Synechococcus nidulans (M95C)


Synechococcus nidulans (M95C).

Tempo de

Retenção (min) Símbolo

Éster Metílico do Ácido

Graxo Notação Taquigráfica

Teor

(%)

9,8 P Palmítico C16:0 39,1

10,0 Po Palmitoléico C16:1 c9 11,6

11,7 S Esteárico C18:0 6,3

11,9 O Oléico C18:1 c9 24,0

12,2 L Linoléico C18:2 c9,12 10,1

12,8 Ln Linolênico C18:3 c9,12,15 8,9

54

6 DISCUSSÃO

Culturas unialgais de cianobactérias são essenciais para se estudar vários

aspectos da sua biologia, mas até o momento deste trabalho nenhum estudo prévio tinha

sido realizado no estado da Paraíba. Os resultados aqui apresentados obtidos em escalas

laboratoriais (cultura batch), trazem importantes resultados sobre as respostas de

crescimento das espécies isoladas e de produção de biomassa, bem como sobre a

diversidade e quantidade de ésteres metílicos de ácidos graxos que elas produzem o que

é necessário para futuros propósito de desenvolvimento de cultivos em maiores escalas.

A grande diversidade de hábitats dos quais as espécies estudadas foram isoladas

reflete a ampla variabilidade de adaptação ecológica das cianobactérias, corroborando

informações pretéritas de outros autores acerca da enorme capacidade de dispersão e

colonização de diferentes ambientes do grupo (DAMÁZIO et al., 2005; SINHA;

HADER, 2008), refletindo o caráter cosmopolita dessas. Algumas espécies podem

ocorrer em distintos habitats, como foi evidenciado com Synechococcus nidulans,

isolada tanto de amostras de água do mar como de estuários e de tecidos de

invertebrados marinhos como no zoantídeo Protopalyhota variabilis, na esponja

Cynachrella sp, em água do mar e em água salobra de ambientes estuarinos.

A presença de cianobactérias associadas a invertebrados certamente não se

constitui um exemplo de mutualismo perfeito, mas de oportunismo, visto que a

associação é mais importante para os hóspedes do que para os hospedeiros (COSTA;

SASSI; AMARAL, 2005), os autores citados ressaltam que cianobactérias, diversas

outras microalgas e outros tipos de prototistas tiram proveito das condições oferecidas

pelos hospedeiros que os abrigam. No caso específico dos corais e zoantídeos toda essa

microbiota se acha associada à camada de mucopolissacarídeos produzidos por esses

organismos. Essa camada pode abrigar uma comunidade microbiana diversificada,

incluindo zooxantelas, bacterias, fungos, algas e diversos protistas (ROHWER et al.

2002).

Pesquisas recentes demonstraram que existem evidencias acerca da existência de

cianobactérias endossimbiontes em Montastraea cavernosa do Caribe, capazes de fixar

nitrogênio atmosférico (LESSER et al., 2004). Evidências a partir de microscopia

eletrônica demonstraram que formas similares a cianobactérias também ocorrem no

interior de duas espécies tabulares de Acroporídeos (Acropora hyacinthus e Acropora

cytherea) dos recifes de Heron e Wistari, parte sul da Grande Barreira de Recifes da

55

Austrália (KVENNEFORS; ROFF, 2009). Nestes casos, as células dessas

cianobactérias apresentam diâmetros de 1 a 4 µm e ocorrem adjacentes às zooxantelas

encerradas numa membrana do hospedeiro e frequentemente apresentam altas

densidades nos tecidos da gastroderme. As implicações da presença de altas densidades

desses microrganismos nos corais são consideráveis especialmente no tocante à

absorção pelas zooxantelas do nitrogênio fixado pelas cianobactéria (LESSER et al.,

2007).

Cianobacterias endossimbiontes também foram isoladas de dois taxa diferentes

de Soritideos coletados no Mar Vermelho e na Grande Barreira (LEE, 2006), e é comum

encontrarmos a cianobactéria Richelia intracelulares vivendo no interior de diatomáceas

do gênero Rhizosolenia. Esses dados sugerem que o fato pode ser mais comum do que

se imagina e que esses microorganismos podem ocorrer endossimbioticamente numa

grande diversidade de organismos marinhos de diferentes grupos taxonômicos.

O pequeno número de espécies isoladas e cultivadas neste trabalho frente à

enorme diversidade de espécies das cianobactérias que deve existir no meio marinho

muito provavelmente reflete a seletividade do meio de cultura utilizado, associado ao

simples fato de que muitas espécies de cianobactérias não são cultivadas. Presume-se,

entretanto, que com o avanço da pesquisa usando outros tipos de meios como o BG11

(RIPPKA et al; 1979) ou Zarrouk (ZARROUK, 1966) constituídos em água do mar será

possível aumentar a diversidade das cianobactérias marinhas no banco de microalgas do

LARBIM.

Todas as cepas cultivadas nesta pesquisa são referidas para diversos

ecossistemas lacustres de diferentes regiões do globo, indicando, este fato, a enorme

capacidade adaptativa das cianobactérias visto que foram cultivadas em meio salino

oriundas de diferentes tipos de habitat, incluindo água do mar, água estuarina e até

mesmo como episimbiontes de invertebrados marinhos. Esses achados refletem a

variabilidade de habitat que uma mesma espécie pode ocupar e também indica que é

possível ocorrer mudanças na síntese de bioprodutos por essas espécies, como resultado

das pressões do ambiente onde elas vivem. Tal aspecto poderá abrir novas fontes

investigativas dos pontos de vista da taxonomia e biotecnologia, desde que tais produtos

poderão ser detectado por técnicas cromatográficas.

A água do mar utilizada em todos os cultivos deste trabalho tem pH em torno de

8,1 e salinidade por volta de 34, sugerindo que todas as espécies cultivadas tem

preferencia por meio salino e alcalino, o que parece óbvio visto que a água do mar é

56

naturalmente tamponada. No entanto, Buck; Smith, (1995); Burja et al., (2002); Bano e

Siddiqui, (2003), demonstraram que muitas espécies de cianobactérias são hábeis em

crescer em meio ácido (pH 6.5), refletindo capacidade adaptativa à variações do pH.

Buck e Smith (1995) consideram que as cianobactérias possuem diferentes mecanismos

para manutenção da homeostasia com o pH, dependendo de seus habitats naturais.

Provavelmente esta capacidade de homeostasia às condições do pH indica porque

muitas das espécies estudadas usualmente também tem sido referidas para diferentes

tipos de ambientes lacustres de distintas regiões geográficas.

Também é sabido que mudanças na salinidade afetam o crescimento das

cianobactérias. Mas muitas espécies de água doce têm sido registradas em altas

salinidades (CARR; WYMAN, 1986). E similarmente, muitas formas marinhas podem

sobreviver muito bem em salinidades menores (BANO; SIDDIQUE, 2003), muito

embora nesses casos, o seu ótimo de crescimento expresse requisitos específicos para a

adição de sais (RIPPKA et al.,1979), refletindo características halotolerante e halofilica.

Ripkka et al (1979) citam por exemplo, P. lonchoides, L. contorta e S. major que

parecem ser halofílicas e duas espécies S. aquatilis e K. accurata que demonstraram

seus comportamentos halotolerantes, uma vez que elas cresceram bem a baixas

salinidades mas podem suportar salinidades maiores.

Ressalta-se, no entanto, que nem todas as cianobactérias são halotolerantes

(YOPP et al., 1978; BLUMEWALD; TEL-OR, 1982) apesar do fato de que muitas

espécies possam se adaptar a variações de salinidade. Conforme demonstrado por

Thajuddin e Subramanian (1992), algumas linhagens podem crescer muito bem em

salinidades que variam de 0 a 99, e Moisander et al., (2002) evidenciaram que uma

espécie de Nodularia mostrava crescimento em salinidades variando de 0 a 20. Esses

achados e a reflexões aqui apresentadas sugerem que não são todas as cianobactérias

que podem ser classificadas distintamente como formas marinhas ou de água doce, fato

este de extrema importância para propósitos tecnológicos, em cultivos em escala

industrial.

As espécies testadas mostraram diferentes respostas de crescimento na mesma

condição de cultivo, conforme ficou evidente nos valores dos ks e no rendimento

máximo da biomassa de cada espécie. Mas nem sempre as espécies que apresentaram as

maiores taxas de divisão celular mostraram os maiores valores de biomassa, como

também nem sempre se observou que as maiores taxas de divisão celular ocorriam nas

espécies que apresentavam uma menor duração da fase exponencial, demonstrando,

57

esses achados, que cada espécie responde diferentemente a uma mesma condição

experimental.

Os dados das análises cromatográficas efetuadas nessa pesquisa evidenciaram

uma grande variação na capacidade de produção de ésteres metílicos de ácidos graxos

entre as espécies estudadas, presumindo-se que o mesmo deve acontecer com muitos

outros metabólitos secundários sintetizados pelas cianobactérias que são de importância

farmacêutica ou nutricional. Entretanto, conforme ressaltam Burja et al., (2002) as

condições de crescimento dos cultivos influenciam a produção de metabolitos

secundários, razão esta que demandará muita investigação ainda em casos de interesses

específicos.

Com relação ao teor de ésteres, experimentalmente observa-se que a soja - que

possui cerca de 20% de seu peso em óleo - por transesterificação direta fornece cerca de

200 mg de ésteres por grama de biomassa seca. As cianobactérias testadas até o

momento apresentaram teores de ésteres inferiores ao da soja, muito embora a cepa

M3C apresentou 101,6 mg/g, ou pouco mais que 50% do que é produzido pela soja.

Entretanto, a presença de mais que 10% do ácido eicosapentanóico merece destaque

pelo alto valor de mercado desse produto. Há que se ressaltar que manipulações

experimentais que alterem as rotas metabólicas relacionadas com a síntese de ácidos

graxos e outros produtos de interesse são perfeitamente possíveis de serem efetuadas

como, por exemplo, o cultivo em condições de estresses fóticos, térmicos e nutricionais,

permitindo incrementar com certa facilidade a produção desses compostos.

Finalmente, ressaltamos que de todas cianobactérias cultivadas cuja biomassa foi

enviada para as análises cromatográficas no Laboratório de Métodos de Extração e

Separação da Universidade Federal de Goiás, até o momento recebemos os resultados

de apenas 5 cepas, de modo que, considerando a grande variabilidade entres cepas nas

quantidades de ácidos graxos obtido, pode-se presumir que valores mais elevados do

que o que foi observado para a cepa M3C poderão ser encontrados.

No Brasil, este é um campo de investigação pioneiro, bastante promissor, e que

necessita de atenção urgente. Considerando-se a existência de regiões com condições

climáticas potencialmente adequadas, com temperaturas amenas e sol em abundância,

sua prática parece ser uma possibilidade sócio-econômica muito promissora,

particularmente na região Nordeste. Assim, a pesquisa de espécies de cianobactérias ou

outras microalgas que tenham potencialidades biotecnológicas é um aspecto importante

a considerar, pois pode levar à redução dos custos no processo produtivo.

58

No caso do biodiesel, por exemplo, os resíduos gerados no processo produtivo

usando microalgas podem se constituir numa importante fonte de material proteico e de

outras substancias nutricionais que poderão ser utilizados como suplemento alimentar

de baixo custo para alimentação humana ou ração animal. Citam-se como exemplos, a

produção de etanol, metano, alimento para gado, fertilizante orgânico (devido à sua alta

relação N:P), ou, como ressaltam Wang et al., (2008), a biomassa remanescente pode

ser queimada para a co-geração de energia.

Este é o primeiro trabalho efetuado com cultivo de cianobactérias direcionado à

potencialidade de aplicação tecnológica desses organismos na Paraíba. Acreditamos que

os dados aqui apresentados apesar de modestos, poderão abrir novas frentes de

investigação não somente sobre a importância ecológica e taxonômica das

cianobactérias em áreas marinhas costeiras, mas também intensificar cultivos

direcionados para múltiplas aplicações tecnológicas, incluindo pesquisas sobre química

fina e compostos bioativos de importância econômica, em particular os antioxidantes

como a astaxantina, e corantes naturais como a ficoeretrina, ficocianina e clorofila.

59

7 CONCLUSÕES

a) As espécies de cianobactérias cultivadas e estudadas nesta pesquisa ocorrem

comumente em ambientes lacustres, mas o seu isolamento de habitats marinhos e

estuarinos reflete a grande capacidade adaptativa do grupo.

b) Todas as cepas identificadas segundo os critérios diacríticos utilizados em ficologia,

resultaram em 6 espécies e 5 gêneros, com predominância para as formas cocóides.

c) A pequena quantidade de espécies que foram isoladas com sucesso se deve à

seletividade do meio, indicando que outros tipos de meios poderão ampliar as cepas

de cianobactérias marinhas da Coleção de Microalgas da UFPB.

d) Diversas cepas de uma mesma espécie foram isoladas de diferentes habitats (água do

mar, zonas estuarinas e até mesmo em tecidos de invertebrados benticos), refletindo

a variabilidade de habitat que uma mesma espécie pode ocupar, sugerindo a

existência de diferenças químicas nos bioprodutos por elas metabolizados, em função

das pressões do meio.

e) As espécies testadas mostraram diferentes respostas de crescimento na mesma

condição de cultivo, conforme ficou evidente nos valores dos ks e no rendimento

máximo da biomassa de cada espécie. Mas nem sempre as espécies que apresentaram

as maiores taxas de divisão celular mostraram os maiores valores de biomassa, como

também nem sempre se observou que as maiores taxas de divisão celular ocorriam

nas espécies que apresentavam uma menor duração da fase exponencial,

demonstrando, esses achados, que cada espécie responde diferentemente a uma

mesma condição experimental.

f) Os dados das análises cromatográficas efetuadas nessa pesquisa evidenciaram uma

grande variação na capacidade de produção de ésteres metílicos de ácidos graxos

entre as espécies estudadas, presumindo-se que o mesmo deve acontecer com muitos

outros metabólitos secundários sintetizados pelas cianobactérias que são de

importância farmacêutica ou nutricional.

60

g) As cianobactérias estudadas quanto à sua capacidade de produção de ésteres

metílicos de ácidos graxos são pobres nesses produtos, a exceção da cepa M3C

(Synechocystis aquatilis), isolada da água do mar coletada nos recifes costeiros do

Cabo Branco, que apresentou cerca da metade dos teores de óleo produzidos pela

soja, em torno que 15% do ácido graxo eicosapentanoico, um ômega 3 de grande

importância à indústria de alimentos e de alto valor de mercado.

61

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universidade federal da paraiba. centro de … · também foram obtidas amostras de cianobactérias...

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