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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ODONTOLOGIA PREVENTIVA E INFANTIL
LEOPOLDINA DE FÁTIMA DANTAS DE ALMEIDA
Atividade antifúngica de óleos essenciais frente à Candida albicans isoladas de pacientes
HIV positivos
João Pessoa 2011
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LEOPOLDINA DE FÁTIMA DANTAS DE ALMEIDA
Atividade antifúngica de óleos essenciais frente à Candida albicans isoladas de pacientes
HIV positivos
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Odontologia, Área de Concentração em Odontologia Preventiva e Infantil, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de mestre.
Orientadora: Profª Drª Edeltrudes de Oliveira Lima
João Pessoa 2011
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A447a Almeida, Leopoldina de Fátima Dantas de.
Atividade antifúngica de óleos essenciais frente à Candida albicans
isoladas de pacientes HIV positivos / Leopoldina de Fátima Dantas de
Almeida. – João Pessoa: [s.n.], 2011.
93 f.: il. -
Orientadora: Edeltrudes de Oliveira Lima.
Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCS.
1. Candida albicans. 2. Candidíase. 3. Produtos Naturais.
BS/CCS/UFPB CDU: 616.934(043.3)
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LEOPOLDINA DE FÁTIMA DANTAS DE ALMEIDA
Atividade antifúngica de óleos essenciais frente à Candida albicans isoladas de pacientes
HIV positivos
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Odontologia, Área de Concentração em Odontologia Preventiva e Infantil, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de mestre.
Dissertação aprovada em ____ / ____ / ____
_____________________________________
Edeltrudes de Oliveira Lima, Doutora- UFPB Orientadora – UFPB
_____________________________________
Cláudia Roberta Leite Vieira de Figueiredo, Doutora - UFPB Examinadora – UFPB
_____________________________________
Alessandro Leite Cavalcanti, Doutor, UEPB Examinador Externo – UEPB
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DEDICATÓRIA
Aos meus pais, José Geraldo e Maria do Céu,
pelo apoio e empenho durante toda a minha vida.
Ao meu namorado, colega de profissão,
amigo e co-autor Yuri Cavalcanti.
Dedico.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus, por ter me guiado em minhas escolhas, me
iluminando a cada dia.
Agradeço a todos que de alguma forma fizeram parte desta conquista,
me estimulando ou me ajudando a não desistir ou fracassar. Cada um tem sua
contribuição nesta etapa que acaba e de outra, tal qual importante que se
inicia. Sem a ajuda de todos vocês não teria conseguido. Muito Obrigada!
Agradeço à minha família pelo estímulo e paciência durante todo este
período, em especial aos meus pais, os quais souberam entender minha
ausência e entenderam que este é um grande passo em minha vida.
Agradeço ao meu namorado Yuri, por todos os dias de “aperreio” e
desânimo, bem como por todos os momentos de diversão e produção científica
durante todo este tempo, sem você isso não seria possível. Sua família,
especialmente Sandra e Yves, pelos conselhos e ajudas durante esta
caminhada.
À minha orientadora Profª Edeltrudes, pelos ensinamentos e pela
confiança depositada em mim, fostes grande incentivadora em minhas
decisões, muito obrigada pelo apoio.
Aos colegas de laboratório e luta durante este período, Fillipe, Janiere e
Waléria.
Aos meus queridos professores Ana Maria Gondim Valença, Wilton
Padilha e Bianca Santiago, por todos os ensinamentos profissionais e de
caráter que obtive durante todos esses anos. A minha vida acadêmica e
profissional está pautada nestes ensinamentos.
Ao Prof. Ricardo Castro, pela sua presteza durante este trabalho e em
muitas outras parcerias.
Aos meu colegas do Grupo de Pesquisa em Odontopediatria e Clínica
Integrada, com os quais dividi experiências e dúvidas.
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Aos meu colegas da turma de Pós Graduação, em especial Rosa
Virgínea, Wilson Júnior, Kaline Castro e Rubênia Cristina, pelos momentos de
dúvidas e medos que compartilhamos, mas também pelas comemorações e
experiência trocadas ao longo desse tempo de convivência.
Aos membros da minha banca examinadora, Profª. Cláudia Roberta e
Prof. Alessandro Cavalcanti, pelas contribuições e presença neste momento
importante em minha vida profissional.
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Odontologia, em
especial à Profª Andressa Feitosa e Prof. Fabio Sampaio, pelo estímulo e força
que me deram para tomar a grande decisão de me tornar docente.
Aos meus queridos amigos e colegas, professores da Faculdade de
Imperatriz, pelo acolhimento e parcerias em minha chegada à aquela casa, em
especial Rossana Almeida, André Campos, Maira Massuia, Leonilson Gaião,
Kaline Queiroz e Henrique Caballero.
Aos meus alunos, do curso de Graduação da Faculdade de Imperatriz. A
experiência da docência tem me realizado a cada dia, isto é apenas o começo.
À Universidade Federal da Paraíba e ao CNPq pelo apoio financeiro e
oportunidade de fazer parte deste programa de pós graduação.
À todos que aqui não foram citados, mas que de alguma forma
contribuíram nesta conquista durante este tempo.
Meu muito obrigada!
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“Pra Não Dizer Que Não Falei Das Flores”
Caminhando e cantando
E seguindo a canção
Somos todos iguais
Braços dados ou não
Nas escolas, nas ruas
Campos, construções
Caminhando e cantando
E seguindo a canção
Vem, vamos embora
Que esperar não é saber
Quem sabe faz a hora
Não espera acontecer...
Geraldo Vandré
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ALMEIDA, L. F. D. Atividade antifúngica de óleos essenciais frente à Candida albicans isoladas de pacientes HIV positivos. 2011. 93f. Dissertação (Mestrado em Odontologia- Área de Concentração: Odontologia Preventiva e Infantil) - UFPB/ CCS. João Pessoa.
RESUMO
A utilização de produtos de origem natural como agentes antimicrobianos tem sido estudada na área odontológica, sobretudo no combate à doenças orais causadas por biofilmes como a cárie dentária e a candidose oral. Asssim, objetivou-se avaliar a atividade antifúngica dos óleos essenciais de Ocimum basilicum L (manjericão), Cymbopogon martinii Motia (palmarosa), Cyperus articulatus L. (piprioca), Thymus vulgaris (tomilho) e Cinnamomum cassia L (canela) sobre cepas de Candida albicans
isoladas de pacientes HIV positivos e cepa padrão- CP (ATCC 76485). Foram cedidas, pelo laboratório de Micologia Clínica da Universidade Federal da Paraiba, 15 amostras clínicas de C. albicans (C1-C15), as quais foram mantidas em ágar Sabouraud
Dextrose. Os testes de atividade antifúngica realizados foram: triagem para selecionar os óleos com atividade antifúngica, além da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), pela técnica da microdiluição, dos óleos essenciais de O. basilicum, C. martinii, T. vulgaris e C. cassia, com concentrações variando entre 1024 µg/mL à 4 µg/mL. Após, determinou-se o efeito do óleo essencial de C. cassia sobre a curva de
morte microbiana, por meio do ensaio de cinética, sobre as amostras C-02 e CP, nas seguintes concentrações: CIM, 2xCIM e 4xCIM, nos tempos de 0, 0,5, 1, 2 e 24 horas. Além disto, determinou-se por meio do teste das alterações da micromorfologia fúngica a atividade do óleo essencial de C. cassia, nas concentrações: CIM, 2xCIM e 4xCIM, quanto a presença de blastoconídeos, clamidoconídeos e pseudohifas. Foram realizados controles para o crescimento das leveduras como também para antifúngicos padrão nistatina e miconazol (50 µg/mL).Para os resultados do screening, observou-se que os valores dos halos de inibição dos óleos essenciais de O. basilicum, C. martinii, T. vulgaris e C. cassia frente as amostras clínicas e padrão de C. albicans variaram entre 27 e 30mm. O óleo essencial de C. articulatus não apresentou atividade frente às cepas. Já em relação à CIM constatou-se que frente a CP, a CIM do óleo essencial de C. cassia foi de 64 µg/mL, entretanto para óleo de e C. martinii foi de 1024 µg/mL. Para as cepas clínicas, verificou-se que a CIM do óleo essencial de C. cassia variou entre 64 µg/mL a 128 Observou-se que para 66,6% das amostras clínicas, a CIM de C. martinii foi de 612 µg/mL. Os demais óleos não
apresentaram efeitos sobre o crescimento das leveduras. Quanto ao ensaio de cinética, verificou-se em todos os tempos ação antifúngica de C. cassia nas
concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM. Em relação às alterações morfológicas observadas nas cepas de C. albicans, constatou-se a ausência de pseudohifas e presença de clamidoconídeos raros, à partir do uso do óleo essencial de C. cassia na CIM. Constatou-se atividade antifúngica dos óleos essenciais de C. cassia e C. martinii sobre cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos e cepa padrão (ATCC 76485), em diferentes concentrações. O óleo essencial de C. cassia apresentou efeito sobre a curva de morte das leveduras, bem como alterou a micromorfologia das amostras de C. albicans padrão e clínica.
Palavras-chave: Candida albicans, Candidíase oral, óleos essenciais, Infecções por
HIV.
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ALMEIDA, L. F. D. Antifungal activity of essential oils against Candida albicans isolated from HIV-positive patients. 2011. 93f. Dissertation (Master of Sciences in Dentistry)- UFPB/ CCS. João Pessoa.
ABSTRACT The use of natural products as potent antimicrobial compound has been studied by Dentistry, especially in combating diseases caused by oral biofilms such as dental caries and oral candidiasis. The aim of this study was to evaluate the antifungal activity of essential oils from Ocimum basilicum L (basil), Cymbopogon martinii Motia (palmarosa), Cyperus articulatus L. (piprioca), Thymus vulgaris (thyme) and Cinnamomum cassia L (cinnamom) against strains of Candida albicans isolated from
HIV-positive patients, and pattern strain – PC (ATCC 76485). The Clinical Mycology Laboratory from Federal University of Paraiba provided fifteen clinical samples of C. albicans (C1-C15), which were kept in Sabouraud Dextrose agar. The assays to
determine the antifungal actions were: screening to select oils with antifungal activity, and the determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC), by microdilution technique, of essential oils from O. basilicum, C. martinii, T. vulgaris and C. cassia, with concentrations ranging between 1024 µg/mL to 4µg/mL. After, the effect of essential oil from C. cassia on the microbial death curve was determined by kinetics
assay, against samples C-02 and PC, at concentrations CIM, 2xCIM and 4xCIM, and times 0, 0.5, 1, 2, 3, and 24 hours. Furthermore, the micro-morphological changes caused by essential oil from C. cassia, at concentrations CIM, 2xCIM and 4xCIM, was
accessed by determination of presence of blastoconides, clamidoconides and pseudohyphae. Controls were performed for yeast growth but also to standard antifungal nystatin and miconazole (50µg/mL). After screening, it was observed that the values of inhibition zones caused by essential oils from O. basilicum, C. martinii, T. vulgaris and C. cassia ranged between 27 and 30mm. The essential oil from C. articulatus showed no activity against the strains. Regarding the MIC, against PC, the essential oil from C. cassia inhibited at concentration 64µg/mL, and C. martini at concentration 1024µg/mL. For the clinical strains, the MIC of essential oil from C. cassia varied between 64 and 128µg/mL. For 66.6% of clinical samples, the MIC of C. martinii was 612µg/mL. The other oils showed no effect against the yeasts’ growth. Regarding the kinetics assay, the essential oil from C. cassia presented antifungal
activity at all times and concentrations analyzed (MIC, 2xMIC and 4xMIC). Considering the morphological changes observed to C. albicans, the absence of pseudohyphae and presence of rare clamidoconides was found after application of essential oil from C. cassia at MIC concentration. The essential oils from C. cassia and C. martini showed antifungal activity, at different concentrations, against yeasts of Candida albicans
isolated from HIV-positive patients, and pattern strain – PC (ATCC 76485). The essential oil from C. cassia presented effect on the microbial death curve, as well as
changed the morphology of clinical and pattern samples.
Key words: Candida albicans, oral candidiasis, essential oils, HIV Infections
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Lista de Abreviaturas e Siglas
IgA ..................... Imonoglobulina A
IgG ..................... Imunoglobulina G
IgM ..................... Imunoglobulina M
SIDA .................. Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
HIV ..................... Vírus da Imunodeficiência Humana
OMS .................. Organização Mundial de Saúde
ATCC ................. American Type Culture Collection
CIM .................... Concentração Inibitória Mínima
ASD ................... Ágar Saburaud Dextrose
CSD ................... Caldo Saburaud Dextrose
µg ....................... Micrograma
mg ...................... Miligrama
g ......................... Grama
mL....................... Mililitro
mm ..................... Milímetros
h ......................... Horas
min ..................... Minutos
UFC ................... Unidades Formadoras de Colônia
UFPB ................. Universidade Federal da Paraíba
OE ..................... Óleo essencial
CP ...................... Cepa padrão
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Lista de Figuras
Figura 1 – Espécie Cymbopogon martinii ......................................................
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Figura 2 – Espécie Ocimum basilicum ...........................................................
25
Figura 3 – Espécie Cyperus articulatus ..........................................................
25
Figura 4 – Espécie Thymus vulgaris ..............................................................
26
Figura 5 – Espécie Cinnamomum cassia .......................................................
26
Artigo 3: Atividade antifúngica e alterações morfológicas induzidas pelo óleo essencial de Cinnamomum cassia frente cepas de Candida albicans isoladas de pacientes HIV positivos Figura 1 – Curva de morte microbiana obtida para a atividade antifúngica do Miconazol (A) óleo essencial de C. cassia – OE (B) nas concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM sobre a cepa clínica de C. albicans (C-02), nos tempos 0, 30, 60, 120 minutos e 24 horas. Observou-se diferença estatisticamente significante (p<0,01) entre o total de UFC/mL obtidos para o controle e para os grupos teste.....................................................................
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Figura 2 – Curva de morte microbiana obtida para a atividade antifúngica
do Miconazol (C) óleo essencial de C. cassia – OE (D) nas concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM sobre a cepa padrão de C. albicans (CP), nos tempos 0, 30, 60, 120 minutos e 24 horas. Observou-se diferença estatisticamente significante (p<0,01) entre o total de UFC/mL obtidos para o controle e para os grupos teste ................................................................................................
62
Figura 3 – Micromorfologia da cepa clínica C-02 de C. albicans frente ao uso do óleo essencial na CIM. Observa-se presença de raros clamidoconídeos e ausência de pseudohifas..................................................
63
Figura 4 - Micromorfologia da cepa clínica C-02 de C. albicans, sob ação do Miconazol, observando-se a presença de pseudohifas e clamidoconídeos .............................................................................................
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Lista de Quadros
Artigo 3: Atividade antifúngica e alterações morfológicas induzidas pelo óleo essencial de Cinnamomum cassia frente cepas de Candida albicans isoladas de pacientes HIV positivos Quadro 1 – Composição química informada do óleo essencial de C. cassia,
segundo especificação do fornecedor (João Pessoa, 2011)...........................
58
Quadro 2 – Concentração Inibitória Mínima (µg/mL) do óleo essencial de C. cassia frente às amostras de C. albicans .......................................................
61
13
Lista de Tabelas
Artigo 1: Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre Candida albicans Tabela 1 – Valores dos halos de inibição em mm dos óleos essenciais e
controles positivos frente às cepas de C. albicans........................................
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Artigo 2: Atividade antifúngica de óleos essenciais frente amostras clínicas de Candida albicans isoladas de pacientes HIV positivos Tabela 1 – Concentração Inibitória Mínima (µg mL-1) dos óleos essenciais
frente cepas de C. albicans clínicas e padrão...............................................
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Artigo 3: Atividade antifúngica e alterações morfológicas induzidas pelo óleo essencial de Cinnamomum cassia frente cepas de Candida albicans isoladas de pacientes HIV positivos Tabela 1 – Média do total de Unidades Formadoras de Colônia por mililitro (UFC/mL x 104) de cada cepa testada, após exposição aos produtos analisados nas concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM....................................
61
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SUMÁRIO
1. Introdução ...................................................................................
15
2. Capítulos .....................................................................................
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2.1. Capítulo 01 ...........................................................................
29
2.2. Capítulo 02 ...........................................................................
40
2.3. Capítulo 03 ...........................................................................
55
3. Considerações Gerais ...............................................................
68
4. Conclusões .................................................................................
74
5. Referências .................................................................................
76
6. Anexos ........................................................................................
86
6.1. Anexo 01- Normas para Defesa .........................................
87
6.2. Anexo 02- Certidão do Comitê de Ética em Pesquisa .....
88
6.3. Anexo 03 – Laudos técnicos dos óleos essenciais.......... 89
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1. Introdução
A microbiota bucal é composta por diferentes espécies de
microrganismos, os quais sobrevivem em uma condição de simbiose,
representada pela saúde bucal de cada indivíduo. Alguns dos quais compõem
o biofilme dentário, uma das causas de doenças orais mais prevalente como a
cárie dentária e as doenças periodontais.
Coexistindo com a comunidade bacteriana da microbiota oral, há
espécies fúngicas, leveduriformes, do gênero Candida. Assim, o isolamento de
Candida spp. da cavidade bucal não implica, necessariamente, na ocorrência
de infecções, já que tal fato é observado em indivíduos saudáveis
(SAMARANAYAKE; SAMARANAYAKE, 2001). Entretanto, por serem leveduras
oportunistas, podem causar infecções agudas e crônicas (KURIYAMA et al.,
2005), superficiais e sistêmicas, em indivíduos saudáveis ou
imunocomprometidos, diagnosticadas como candidoses (CROCCO et al.,
2004).
A transição da forma comensal para a patogênica é acompanhada por
modificações no fungo, passando a apresentar forma filamentosa. Assim como
muitos fungos patogênicos, a C. albicans se manifesta de duas formas: a
leveduriforme, sendo geralmente inócua, e na forma de hifas, sendo
patogênica. Desta forma esta característica do fungo determina seu caráter
dimórfico (EZZAT, 2001). Além disso, fatores de virulência como a habilidade
em resistir à fagocitose, aderência a células epiteliais e ser cultivável à
temperatura de 37 °C auxiliam na instalação e progressão da candidose oral
(SCHERER; MAGEE, 1990).
A aderência celular é um dos mais importantes fatores de virulência da
C. albicans, sendo este mecanismo mediado pela presença de hifas e tubos
germinativos (ODDS, 1987). Algumas espécies de Candida, incluindo C.
albicans, são produtoras de enzimas hidrolíticas, como as proteinases ácidas e
as fosfolipases, que facilitam sua penetração no tecido subjacente (ODDS,
1987). Sugere-se que a produção enzimática poderia ser usada como um
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critério para a biotipagem de C. albicans (CANDIDO; AZEVEDO; KOMESU,
2000; MENEZES et al., 2005).
Segundo Barros et al. (2008), a atividade enzimática tem um papel
essencial na capacidade do fungo em colonizar e infectar os tecidos
hospedeiros. As exoenzimas, proteinases e fosfolipases, degradam
imunoglobulinas e proteínas da matriz celular, inibem a fagocitose por
neutrófilos polimorfonucleares e induzem reações inflamatórias. Além disto, a
fosfolipase atua catalisando a hidrólise dos fosfolipídeos da membrana das
células do hospedeiro (LANE; GARCIA, 1991), prejudicando a estabilidade da
membrana e ocasionando lise celular (NIEWERTH; KORTING, 2001).
A colonização da mucosa oral por C. albicans ocorre devido à produção
de proteinase, pois as proteínas responsáveis pela defesa da mucosa,
incluindo lactoferrina, lactoperoxidade e mucina, são susceptíveis a
degradação pela proteinase in vitro. Além disso, imunoglobulinas presentes na
saliva, como IgA, IgG e IgM, são substratos naturais da enzima
(SAMARANAYAKE; SAMARANAYAKE, 2001).
Fatores como o uso de próteses dentárias mal higienizadas, associada à
xerostomia e terapia antibiótica de amplo espectro podem ser observados
como fatores que predispõem ao aparecimento da candidose oral (KURIYAMA
et al., 2005; TORRES et al., 2007). Esta infecção é caracterizada usualmente
pela descamação do epitélio oral, tendo um aspecto eritematoso com presença
de placas brancas destacáveis sobre a mucosa; sensação de ardência e
prurido (NEVILLE et al., 2009).
São identificadas 81 espécies no gênero Candida, sendo a Candida
albicans a mais prevalente (SAMARANAYAKE, 1992). Entretanto, outras
espécies não albicans, como C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis e C.
guilliermondii estão relacionadas com a candidose, no curso da infecção
(CROCCO et al., 2004). Estas espécies estão classificadas taxonomicamente
no reino Fungi, filo Ascomycota, classe Ascomycetes, ordem
Saccharomycetales, família Saccharomycetaceae (DIEZMANN et al., 2004).
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Além dos fatores inerentes à cavidade bucal, a imunossupressão é um
fator condicionante para o aparecimento de candidose oral. Esta é uma
infecção oportunista, comum, em indivíduos com Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS), sendo a C. albicans reconhecida
como um marcador biológico da evolução da doença (CORRÊA; ANDRADE,
2006). Relata-se que em isolados clínicos de pacientes portadores de AIDS a
C. albicans é a espécie mais freqüente, todavia C. glabrata, C. krusei, C.
tropicalis (POZZATTI et al., 2008), C. parapsilosis, C. guillermondii e C.
dublinienisis são frequentemente observadas (GABLER et al., 2008).
A AIDS foi reconhecida oficialmente no ano de 1981, devido à um
aumento de casos de sarcoma de Kaposi e pneumonia, em homossexuais
masculinos, tendo estes casos ocorridos em diversas cidades dos Estados
Unidos. Já em 1986, a Comunidade Econômica Européia discutiu os
manifestações orais relacionados com a infecção pelo Vírus da
Imunodeficiência Humana (HIV) (SOUZA et al., 2000).
As infecções fúngicas, como a candidose oral, se instalam em muitos
dos pacientes portadores do HIV, pois nestes há alterações nas funções
imunológicas mediadas por linfócitos T, consequentemente ocorre redução da
imunidade do paciente (LIMA; SILVEIRA; BIRMAN, 1994; CAVASSANI et al.;
2001). As manifestações bucais associadas com a infecção pelo HIV são
listadas em três grupos, sendo o grupo I caracterizado pelas lesões de
candidose, leucoplasia pilosa, gengivite ulcerativa necrosante aguda e sarcoma
de Kaposi. No grupo II estão enquadradas as ulcerações atípicas, doenças de
glândulas salivares, infecções virais por citomegalovírus, herpes, papiloma
vírus e varicela. Lesões mais graves como a osteomielite estão incluídas no
grupo III (AXELL et al., 1990).
A prevalência de candidose oral tem sido observada como marcador
biológico da doença (SOUZA et al., 2000; GASPARIN et al., 2009). Assim,
Cavassani et al. (2001) analisaram as manifestações estomatológicas em 431
pacientes HIV positivos no Hospital Heliópolis – São Paulo, Brasil, no período
de 1995 a 2001. Dentre os achados, 128 casos de candidose oral foram
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diagnosticados, sendo a pseudomembranosa a de maior incidência. A queilite
angular foi a terceira afecção estomatológica mais encontrada.
De forma equivalente, a prevalência de candidose oral em pacientes
portadores do vírus do HIV com suas infecções oportunistas, situação qual
caracteriza o indivíduo como portador de AIDS, foi estudada por Souza et al.
(2000) . Foram examinados 100 pacientes portadores de HIV, atendidos pelo
Hospital Giselda Trigueiro - Natal/RN, Brasil no período de 1996-1997. Do
estudo, observou-se que a candidose oral foi à manifestação mais freqüente,
com 99 ocorrências.
A prevalência da candidose oral também foi estudada por Amorim et al.
(2009), por meio da análise de 212 prontuários fornecidos pelo Serviço de
Assistência Especializada, da cidade de Campina Grande-PB. Os autores
concluíram que a infecção teve a maior prevalência, isoladamente,
representada por 27,8% da amostra. Ressaltam também que indivíduos de
todas as faixas etárias foram acometidos pela patologia, inclusive pacientes
infantis, com até um ano de vida.
Desta forma, pacientes portadores de imunodeficiências como a AIDS,
apresentam a candidose oral como uma das infecções oportunistas. Esta
ocorre devido às alterações nas funções imunológicas mediadas por linfócitos
T, conseqüentemente queda da imunidade (LIMA; SILVEIRA; BIRMAN, 1994).
Relata-se que em isolados clínicos, da cavidade bucal, de pacientes portadores
da AIDS a C. albicans é a espécie mais frequente, todavia C. glabrata, C.
krusei, C. tropicalis (POZZATTI et al., 2008), C. parapsilosis, C. guillermondii e
C. dublinienisis são frequentemente observadas (GABLER et al., 2008).
Segundo Teichert et al. (2002), aproximadamente 81% dos pacientes
com AIDS tem a cavidade bucal colonizada por cepas de Candida. Já
Magliorati et al.(2004), em seu estudo, isolaram diferentes amostras de C.
albicans da cavidade bucal de pacientes HIV-positivos, além disto verificaram
que parte das amostras eram resistentes aos antifúngicos sintéticos, utilizados
no tratamento de candidose oral.
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Assim, Gutiérrez et al. (2007) identificaram as espécies de leveduras
prevalentes em pacientes com AIDS e as submeteram a testes de atividade
antifúngica in vitro, utilizando o fluconazol e voriconazol. Observaram que a C.
albicans,C. krusei, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. glabrata foram as cepas
encontradas nos sítios de infecção. Para a susceptibilidade aos antifúngicos
relataram que a maioria das espécies de Candida (72,9%) foram susceptíveis
ao fluconazol, sendo 20,8% resistentes e 6,3% susceptível dependendo da
dose. Já para o voriconazol 89,6% da amostra das cepas foi sensível, sendo
2,1% resistente e 8,3% sensível considerando a dose.
Com objetivo semelhante, Kuriyama et al. (2005) submeteram 618
isolados de Candida à testes de suscetibilidade in vitro ao fluconazol,
itraconazol, voriconazol, cetoconazol, miconazol, anfotericina B, nistatina.
Observaram que a maioria das espécies estudadas apresentaram sensibilidade
aos medicamentos testados.
Para o tratamento da candidose oral existem vários antifúngicos
sintéticos dentre eles a anfotericina B. Outras alternativas os triazólicos
(fluconazol, itraconazol e voriconazol). Porém, o uso indiscriminado destes
agentes tem chamado atenção para o aparecimento de espécies resistentes
(PFALLER et al., 2004). O aparecimento destas espécies de Candida
resistentes ao uso de antifúngicos (LIMA et al., 2006; POZZATI et al., 2008),
além do relato de resistência medicamentosa em pacientes portadores de HIV
frente à medicamentos como derivados azólico (REX et al., 2000) suscita a
busca de terapias alternativas que introduzam novos agentes antimicrobianos
no arsenal terapêutico (KHAN, 2009).
Nesta tentativa inclui-se o estudo de substâncias de origem natural, na
perspectiva de obter-se melhor desempenho sobre diferentes microrganismos
(LIMA et al., 2006; POZZATI et al., 2008). A utilização destes produtos, devido
às suas propriedades anti-sépticas, é verificada desde a antiguidade. A
Organização Mundial de Saúde (OMS), desde a década de 1970, tem apoiado
o desenvolvimento de estudos que possam esclarecer as características
desses produtos naturais. Entretanto, evidências clínicas e laboratoriais sobre a
efetividade desses elementos ainda são escassas na literatura mundial
(LOGUÉRCIO et al., 2005). Os estudos que vem se desenvolvendo na referida
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área se baseiam, em sua maioria, nas práticas populares cotidianas (BUFFON
et al. 2001).
Produtos fabricados nas formas de extratos ou óleos essenciais são
utilizados em pesquisas laboratoriais visando conhecer o potencial antifúngico
das substâncias (ARAÚJO et al., 2004; BARBARO; STELATO, 2009; POZZATI
et al., 2008). A investigação científica das propriedades antimicrobianas de
óleos essenciais tem sido realizada, utilizando o embasamento popular,
destacando-se as aplicações destes produtos como anti-sépticos tópicos.
(CLAFFEY, 2003; REHDER et al., 2004; ALMEIDA et al., 2006).
Os óleos essenciais são obtidos a partir do metabolismo secundário das
plantas e apresentam composição química complexa (GONAÇALVES et al.,
2003). Constituem os elementos voláteis contidos em muitos órgãos vegetais,
e, estão relacionados com funções necessárias à sobrevivência vegetal,
exercendo papel fundamental na defesa contra microrganismos (SIQUI et al.,
2000).
O mecanismo de ação dos óleos essenciais ainda não foi totalmente
descrito, porém Hammer et al. (2004) sugeriram que essas substâncias são
capazes de interagir com estruturas lipídicas e causar alterações nas
membranas celulares das células dos patógenos. Phongpaichit et al. (2004)
identificaram alterações na parece celular de fungos, como a C. albicans, após
a exposição a produtos naturais. Adicionalmente, tem sido estabelecido
cientificamente que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem propriedades
antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (BHAVANANI;
BALLOW, 1992).
Assim, frente à resistência das espécies de Candida aos antifúngicos
sintéticos observa-se o uso de produtos naturais, na tentativa de obter-se
melhor desempenho sobre tais microrganismos. (JANTAN, 2008; VIUDAS-
MARTOS, 2008; LIMA, 2006; POZZATI et al., 2008). O uso de óleos essenciais
de origem vegetal frente à Candida spp. é relatado em algumas pesquisas
laboratoriais visando conhecer o potencial antifúngico das substâncias
(ARAÚJO et al., 2004; BARBARO; STELATO, 2009; POZZATI et al., 2008).
A ação antifúngica de óleos essenciais de Zingiber officinalis (gengibre),
Cominum cyminum (cominho), Coriandrum sativum (coentro), Thymus vulgaris
22
(tomilho), Ocimum basilicum (manjericão) e Myristica fragrans (noz moscada)
foi observada por Barbaro, Stelato (2009), de forma a concluírem que os
produtos apresentam atividade antifúngica considerável frente cepas de
Candida. A ação antibacteriana e antifúngica de outras espécies como a da
Cynnamomum zeylanicum (canela), Eucaliptus citriodora (eucalipto) e Eugenia
uniflora (pitanga) foi relatada por Araújo et al. (2004).
Navas et al. (2007) verificaram a ação inibitória da aderência, do chá de
Thymus vulgaris (tomilho), na concentração de 10%, em corpos de prova de
resina acrílica, contaminados por C. albicans, sendo efetivo na inibição da
aderência à superfície. Pode-se sugerir que o produto inibe a aderência por
meio da diminuição de tubos germinativos (MOLINA et al., 2008).
A atividade antifúngica dos óleos essenciais de C. martinii (palmarosa),
O. basilicum (manjericão) e T. vulgaris (tomilho) foi avaliada frente a cepas de
C. albicans (ATCC 10231) por Sartorato et al. (2004) e Duarte et al. (2005).
Dos estudos, observou-se que a CIM dos óleos de C. martinii e O. basilicum foi
superior a 2000µg/mL, considerando-os de baixa atividade, já para o T. vulgaris
foi inferior ao valor citado, sendo apresentado como produto de moderada
atividade antifúngica. Entretanto, observando os valores da CIM do óleo
essencial de T. vulgaris (tomilho) frente à mesma cepa, Rahimifard et al.(2008)
encontraram CIM de 0,3 µg/mL determinado-se ao óleo essencial um caráter
antifúngico.
O extrato bruto etanólico do T. vulgaris foi avaliado frente à cepas de C.
albicans, C. glabrata, C. parapsilosis nas concentrações de 50, 100 e 200
mg/mL por Rangel; Silva (2010), por meio de difusão em ágar. Os autores
constataram que a concentração de 50mg/ mL foi a mais efetiva sobre C.
albicans, considerando-se a metodologia empregada.
A atividade antimicrobiana do óleo essencial da C. martinii foi constatada
frente a microrganismos como S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, S.
thyphimurium e C. perfringens, observando valores de CIM entre 0,4 e 0,8
mg/mL (SCHERER et al., 2009). O mesmo óleo essencial teve atividade
comprovada frente ao S. cerevisiae na concentração de 0,1% (PRASHAR et
al., 2003). Esta atividade se deve à presença de geraniol e acetato de geraniol,
23
compostos com alta atividade antimicrobiana presentes no óleo essencial de C.
martinii (PRASHAR et al., 2003; DUARTE et al., 2005).
Já Giordani et al. (2006), avaliaram a atividade do óleo essencial de C.
cássia frente a C. albicans (ATCC 90029), de forma isolada e associado à
Anfotericina B. Assim, o óleo essencial foi caracterizado como um eficiente
antifúngico,sendo a CIM sobre 80% das cepas igual 0.169 μL/mL. No mesmo
estudo analisou-se a composição química do óleo observando-se que o trans-
cinanomaldeído (92,0%) foi o composto mais encontrado.
O óleo essencial de C. cassia (caule) foi avaliado frente ao crescimento
de hifas e esporos de Aspergillus niger. Observou-se que o óleo essencial,
comparado à outras 74 amostras de óleos teve o segundo melhor
desempenho, comparando-se os halos de inibição das amostras, sendo inferior
apenas ao óleo essencial de C. cassia (folhas). No referido estudo a
composição química do óleo foi analisada, destacando-se a presença do
cinanomaldeído (66.36%) e eugenol (7.74%), conhecidos por sua atividade
antifúngica (PAWAR; THAKER, 2006).
Além disto, o emprego de produtos naturais é apoiado pelos
profissionais da saúde e por programas oficiais na área, já que o Brasil possui
um vasto número de espécies vegetais que são consideradas medicinais (LIMA
et al., 2006), entretanto muitas destas amostras não obtiveram adequada
avaliação laboratorial ou clínica.
Na área odontológica as pesquisas com produtos naturais têm
aumentado nos últimos anos, objetivando a descoberta de produtos com
atividade farmacológica melhorada, menor poder toxicológico e custo
acessível. Considerando que as principais patologias que acometem a
cavidade bucal têm, como fator etiológico, os microrganismos, é recomendável
o uso de substâncias que tenham efeito antimicrobiano sobre patógenos
causadores da cárie, doenças periodontais e candidose oral (MOLINA et al.,
2008).
Dentro desta abordagem podemos destacar que o estudo dos produtos
naturais pode trazer ao profissional de saúde uma alternativa terapêutica de
menor custo e viável, no tratamento de doenças, sobretudo as bucais. Assim,
objetivou-se avaliar o potencial antifúngico de óleos essenciais sobre cepas de
24
C. albicans isoladas de pacientes HIV, baseando-se na resistência que
algumas destas cepas apresentam frente a determinados antifúngicos
sintéticos.
Foram selecionados, mediante pesquisa bibliográfica, os seguintes óleos
essenciais:
a. Óleo essencial de Cymbopogon martinii (Figura 1), espécie pertencente
à família Poaceae, sendo caracterizada como nativa brasileira, da região
amazônica, popularmente conhecida com palmarosa. Tem sido citada
pelo uso do seu óleo essencial e tintura, apresentando efeito
antisséptico e repelente (DUARTE et al., 2005);
Figura 1 – Espécie Cymbopogon martinii
Fonte: http://www.viessence.com.br/
b. Óleo essencial de Ocimum basilicum (Figura 2), espécie pertencente à
família Lamiaceae, identificada como exótica e aromática, conhecida
popularmente como manjericão (DUARTE et al., 2005). É encontrado
em regiões tropicais e subtropicais, tendo sua origem no Norte da África
e Ásia (VIEIRA; SIMON, 2000). É utilizada como condimento na culinária
e planta ornamental, tendo seu uso popular associado à distúrbios
gastro intestinais, tosse e disfunção renal (JAVANMARDI et al., 2002);
25
Figura 2 – Espécie Ocimum basilicum
Fonte: http://www.viessence.com.br/
c. Óleo essencial de Cyperus articulatus (Figura 3), pertencente à família
Cyperaceae, espécie nativa amazônica, conhecida como piprioca, tendo
sua atividade anti inflamatória relatada popularmente (DUARTE et al.,
2005). Não foram encontrados estudos que relatassem à cerca da
atividade antimicrobiana desta espécie;
Figura 3 – Espécie Cyperus articulatus
Fonte: http://www.viessence.com.br/
d. Óleo essencial de Thymus vulgaris (figura 04), pertencente à família
Lamiaceae, sendo uma espécie exótica, conhecida como tomilho
26
(DUARTE et al., 2005). É uma planta originária da Europa, mas cultivada
no Sul e Sudeste do Brasil (SILVA; RANGEL, 2010). A esta espécie são
atribuídas ações antisséptica, expectorante e antiespasmódica
(LOUGUÉRCIO et al., 2005);
Figura 4 – Espécie Thymus vulgaris
Fonte: http://www.viessence.com.br/
e. Óleo essencial de Cinnamomum cassia (Figura 5), pertencente à família
Lauraceae é uma espécie exótica, conhecida popularmente como
canela. Seu óleo é utilizado como corretivo de odor e sabor (LIMA et al.,
2005). É encontrada em florestas tropicais (JANTAN et al., 2008), sendo
empregada popularmente como anti-inflamatório e antimicrobiano
(DUARTE et al., 2005);
Figura 5 – Espécie Cinnamomum cassia
Fonte: http://www.viessence.com.br/
27
Além de determinar-se a atividade antifúngica dos óleos citados, observou-
se a comparação da atividade dos produtos entre cepa de C. albicans padrão
(ATCC 76485) e as amostras clínicas isoladas de pacientes HIV positivos.
28
29
Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre Candida
albicans
Screening of antifungal activity of essential oils on Candida albicans Leopoldina de Fátima Dantas de Almeida
Aluna do Programa de Pós-Graduação em Odontologia (Odontologia Preventiva Infantil). Mestrado em Odontologia. Universidade Federal da Paraíba. E-mail: [email protected] Yuri Wanderley Cavalcanti
Aluno de Graduação em Odontologia. Bolsista de Iniciação Científica (PIBIC/CNPq/UFPB). Curso de Graduação em Odontologia. Universidade Federal da Paraíba. E-mail: [email protected] Waléria Pereira Viana
Aluna do Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais Sintéticos e Bioativos (Mestrado). Universidade Federal da Paraíba. E-mail: [email protected] Edeltrudes de Oliveira Lima Professora Doutora do Departamento de Ciências Farmacêuticas. Universidade Federal da Paraíba. E-mail: [email protected] O presente estudo corresponde à parte de dissertação de mestrado do programa de Pós Graduação em Odontologia da UFPB. Endereço para correspondência: Leopoldina de Fátima Dantas de Almeida
Rua Luiz Germóglio, 439, apt. 304 Bancários. João Pessoa, Paraíba -Brasil [email protected]
Capítulo 01: Artigo publicado. “Revista Brasileira de Ciências da Saúde”. v. 14, n. 4, p.:
51-56, 2010.
30
Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre Candida albicans
Screening of antifungal activity of essential oils on Candida albicans
Resumo Objetivo: Avaliar a atividade antifúngica de óleos essenciais de Ocimum basilicum (manjericão), Cymbopogon martinii (palmarosa), Cyperus articulatus (piprioca), Thymus vulgaris (tomilho) e Cinnamomum cassia (canela da china) frente cepas de Candida albicans. Material e Métodos: Foram selecionadas oito cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos (cedidas pelo laboratório de Micologia da Universidade Federal da Paraíba), e uma cepa padrão de C. albicans (ATCC7648). A atividade antifúngica foi avaliada pela técnica de difusão em ágar Saburaud Dextrose, utilizando-se suspensões das leveduras, preparadas em solução salina a 0,9% (106UFC/mL). Discos de papel de filtro (6mm) foram embebidos com 20µL de cada óleo essencial e posicionados sobre o meio de cultura. Realizou-se incubação em estufa bacteriológica a 37ºC, por 48h. A atividade antifúngica foi avaliada pela medição dos valores dos halos de inibição. Utilizou-se como controle positivo o miconazol (50µg/mL). Resultados: Os valores dos halos de inibição dos óleos essenciais de O. basilicum, C. martinii, T. vulgaris e C. cássia frente as amostras clínicas e padrão de C. albicans variaram entre 27 e 30mm; enquanto o miconazol variou entre 8 e 10mm. O óleo essencial de C. articulatus (piprioca) não apresentou atividade frente às cepas. Conclusão: A exceção do óleo essencial de C. articulatus, todos os produtos testados apresentaram atividade antifúngica frente amostras de C. albicans avaliadas. Descritores: Candida albicans, Candidíase, produtos naturais.
Summary
Objective: To evaluate the antifungal activity of essential oils from Ocimum basilicum (basil), Cymbopogon martinii (palmarosa), Cyperus articulatus (piprioca), Thymus vulgaris (thyme) and Cinnamomum cassia (cinnamon china) on strains of Candida albicans. Material and Methods: Eight strains of C. albicans isolated from HIV-positive patients (provided by the Mycology Laboratory of Federal University of Paraíba) and one pattern strain (ATCC7648) were selected for this study. The antifungal activity was evaluated by the Diffusion Technique on agar Saburaud-Dextrose, using fungal suspensions prepared in saline solution 0.9% (106CFU/mL). Paper discs (6mm) were soaked with 20µL of essential oils and fixed on the agar media. The incubation was in bacteriological incubator at 37ºC for 48h. The antifungal activity was evaluated by the measurement of inhibition zones. The miconazole (50µg/mL) was used as positive control. Results: The values of inhibitions zones produced by the essential oils from O. basilicum, C. martinii, T. vulgaris and C. cássia against the clinical and pattern strains of C. albicans renged between 27 and 30mm, while the miconazole ranged between 8 and 10mm. Conclusions: In exception of the essential oil from C. articulates, all products tested showed antifungal activity against the assessed strains of C. albicans. Descriptors: Candida albicans, candidiasis, natural products
31
Introdução
A candidose oral geralmente é diagnosticada por meio da descamação
do epitélio oral, além de seu aspecto eritematoso com presença de placas
brancas destacáveis sobre a mucosa; sensação de ardência e prurido
(NEVILLE, ALLEN, DAMM, 2009). Candida albicans é citada como a espécie
de maior patogenicidade do gênero, sendo predominantemente encontrada nas
lesões (CANNON et al., 1995). Sugere-se que o aparecimento da infecção
esteja relacionado ao grau de imunodeficiência do indivíduo (COOGAN,
GREENSPAN, CHALLACOMBE, 2005), pois 80 a 90% dos indivíduos
acometidos pela AIDS apresentam lesões de candidose oral (COOGAN,
GREENSPAN, CHALLACOMBE, 2005; GUTIÉRREZ, DE BEDOUT, TOBON,
2007).
Algumas lesões da cavidade bucal são consideradas preditivas para o
diagnóstico de indivíduos infectados pelo HIV, dentre estas a candidose oral
(PATTON, HILL, 2000). Estudos têm buscado confirmar a infecção por Candida
como um indicador de imunossupressão e progressão da AIDS, embora
tenham realizado estas observações em curto espaço de tempo (PATTON,
HILL, 2000; MATTEE, SCHEUTZ, MOSHY, 2000; SCHUMAN et al., 1998).
A terapia medicamentosa de eleição para o tratamento da candidose
oral utiliza antifúngicos poliênicos, como a anfotericina B e a nistatina, e os
derivados azóis incluindo o miconazol, sendo usualmente os fármacos de
aplicação tópica mais utilizados. Já os sistêmicos são representados pelo
fluconazol e itraconazol (KURIYAMA et al., 2005). Entretanto, mesmo com o
emprego de diversos medicamentos existe a possibilidade de cepas
resistentes, já que há relatos de casos referentes à resistência medicamentosa
da C. albicans frente a derivados azólicos, em pacientes HIV positivos com
diagnóstico de candidose oral (REX et al., 2000). Estudos têm indicado o
aparecimento de Candida spp. resistentes aos derivados azólicos como
fluconazol, cetoconazol e itraconazol (PEREA et al., 2001; PFALLER et al.,
2004).
Assim, frente à resistência das espécies de Candida aos antifúngicos
sintéticos observa-se o uso de produtos naturais, na tentativa de obter-se
melhor desempenho sobre tais microrganismos (JANTAM et al., 2008; LIMA et
32
al., 2007; POZZATTI, 2008). O uso de óleos essenciais de origem vegetal
frente à Candida spp. é relatado em algumas pesquisas laboratoriais visando
conhecer o potencial antifúngico das substâncias (POZZATTI, 2008; ARAÚJO
et al., 2004; BARBARO, STELATO, 2009).
A utilização de óleos essenciais na medicina popular tem servido de
base em variadas aplicações, dentre estas a produção de produtos anti-
sépticos tópicos. Assim, a investigação científica das propriedades dos óleos
essenciais tem sido realizada (ALMEIDA et al., 2006; CLAFFEY, 2003;
REHDER et al., 2004).
A ação antifúngica de óleos essenciais de Zingiber officinalis (gengibre),
Cominum cyminum (cominho), Coriandrum sativum (coentro), Thymus vulgaris
(tomilho), Ocimum basilicum (manjericão) e Myristica fragrans (noz moscada)
foi observada por BARBARO, STELATO (2009), de forma a concluírem que os
produtos apresentam atividade antifúngica considerável frente cepas de
Candida. A ação antibacteriana e antifúngica de outras espécies como a de
Cynnamomum zeylanicum (canela), Eucaliptus citriodora (eucalipto) e Eugenia
uniflora (pitanga) foi relatada por ARAÚJO et al. (2004).
Outros óleos essenciais de espécies vegetais como Syzygium
aromaticum (cravo), Ocimum basillicum (manjericão), Rosmarinus officinalis
(alecrim), Anethum graveolens (endro), Zingiber officinalis (gengibre) e
Cinnamon zeylanicum (canela) tiveram suas atividades antimicrobianas
avaliadas frente ao Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Enterococcus
faecalis, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica,
Salmonella choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans,
Penicillium islandicum e Aspergillus flavus. Averiguou-se que as espécies
fúngicas foram as mais sensíveis à ação das substâncias (LÓPEZ et al., 2005).
Assim, objetivou-se avaliar a atividade antifúngica dos óleos essenciais
de Ocimum basilicum (manjericão), Cymbopogon martinii (palmarosa), Cyperus
articulatus (piprioca), Thymus vulgaris (tomilho branco) e Cinnamomum cassia
(canela da china) frente cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV
positivos e cepa padrão (ATCC 76485).
33
Materiais e Métodos
Os óleos essenciais de Ocimum basilicum (manjericão), Cymbopogon
martinii (palmarosa), Cyperus articulatus (piprioca), Thymus vulgaris (tomilho) e
Cinnamomum cassia (canela da china) foram obtidos através da empresa
Viessence® (Florianópolis -SC) e ensaiados em suas formulações puras.
Foram utilizadas oito cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV
positivos, cedidas pelo Laboratório de Micologia da Universidade Federal da
Paraíba. As amostras foram selecionadas aleatoriamente e nomeadas (C01-
C08), após foram repicadas em Ágar Saburaud Dextrose e incubadas em
estufa a 35ºC por 48 horas. As suspensões fúngicas foram efetuadas em
solução salina estéril a 0,9%, sendo posteriormente comparadas à escala de
MacFarland (106 UFC/mL). O mesmo processo foi efetuado para a cepa padrão
de C. albicans -CP (ATCC 76485).
A avaliação antifúngica dos óleos essenciais foi determinada por meio
da técnica da disco-difusão em Agar Saburaud Dextrose (BAUER et al., 1966).
Assim, placas de petri contendo Ágar Saburaud Dextrose foram semeadas por
meio da técnica do esgotamento e discos de papel com 6,0mm de diâmetro,
foram embebidos nos óleos essenciais e inseridos sob o meio de cultura. As
placas foram incubadas em estufa a 37ºC por 48 horas. A atividade antifúngica
dos óleos essenciais foi avaliada por meio da medição dos halos de inibição,
em mm, os quais foram analisados descritivamente. Utilizou-se o na
concentração de 50µg/mL como controle positivo.
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do
Hospital Universitário Lauro Wanderley de acordo com a resolução 196/96.
Resultados
Os valores dos halos de inibição dos óleos essenciais frente às cepas de
C. albicans estão descritos na tabela 01.
34
Tabela 01: Valores dos halos de inibição em mm dos óleos essenciais e
controles positivos frente às cepas de C. albicans
Óleos essenciais e
controles
Cepas de C. albicans.
C01 C02 C03 C04 C05 C06 C07 C08 CP
O.basilicum
(manjericão) 30,0 28,0 30,0 30,0 30,0 30,0 28,0 27,0 28,0
C.martinii
(palmarosa) 30,0 28,0 30,0 30,0 27,0 30,0 28,0 27,0 30,0
C.articulatus
(piprioca) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
T. vulgaris
(tomilho) 30,0 28,0 30,0 30,0 30,0 30,0 28,0 27,0 30,0
C. cassia
(canela da china) 30,0 28,0 30,0 30,0 30,0 30,0 28,0 27,0 27,0
Miconazol
(Controle positivo) 10,0 9,0 9,5 8,5 9,0 10,0 9,0 8,0 9,0
Discussão
A infecção causada por C. albicans tem sido relatada como um indicador
de imunossupressão e progressão da AIDS (PATTON, HILL, 2000; MATTEE,
SCHEUTZ, MOSHY, 2000; SCHUMAN et al., 1998). Assim, a terapêutica
adotada no tratamento da candidose oral em pacientes portadores da síndrome
é de grande valia, sendo atualmente realizada pelo uso de fármacos como a
anfotericina B, nistatina (KURIYAMA et al., 2005). Entretanto, alguns estudos
relatam a resistência de espécies de Candida aos antifúngicos sintéticos.
Assim, destacam o uso de produtos naturais na tentativa de obter-se melhor
desempenho sobre tais microrganismos (JANTAM et al., 2008; LIMA et al.,
2007; POZZATTI, 2008).
A utilização de produtos naturais como agentes antimicrobianos tem sido
investigada (POZZATTI, 2008; ARAÚJO et al., 2004; BARBARO, STELATO,
35
2009). Assim, como resultados do presente estudo observou-se que os óleos
essenciais de O. basilicum (manjericão), C. martinii (palmarosa), T. vulgaris
(tomilho) e C. cassia (canela da china) apresentaram atividade antifúngica
frente as cepas testadas. Apenas o óleo essencial de C. articulatus (piprioca)
não apresentou qualquer indício de atividade antifúngica.
Desta forma, nossos resultados corroboram com os achados de
BARBARO, STELATO (2009), que avaliaram a atividade antifúngica do O.
basilicum (manjericão) e T. vulgaris (tomilho), em meio sólido, frente à espécies
de C. albicans de referência (ATCC 10231, 42272, 421888). Os autores
apresentaram valores de halos de inibição de 30, 50 e 33 mm do óleo essencial
do manjericão e para o óleo essencial do tomilho os valores de halos foram de
40, 34 e 50 mm frente a C. albicans (BARBARO, STELATO, 2009). Em nossos
resultados observou-se que para o óleo essencial de manjericão e tomilho os
valores dos halos de inibição variaram entre 27 e 30 mm.
Da comparação entre os resultados citados observa-se uma potente
atividade antifúngica dos óleos essenciais de manjericão e tomilho, frente a C.
albicans. Entretanto, ressalta-se que as diferenças nos valores dos halos de
inibição, observadas no presente estudo e naquele realizado por BARBARO,
STELATO (2009), podem ser devido à utilização de cepas fenotipicamente
diferentes, pois as amostras do estudo citado e deste apresentam números de
ATCC distintos, além da utilização de cepas clínicas no presente estudo.
A ação antimicrobiana dos óleos essenciais de palmarosa, manjericão e
tomilho frente a espécies bacterianas e fúngicas, incluindo a C. albicans (ATCC
10231) foi mensurada por DUARTE et al. (2005), por meio do método da
microdiluição. Assim, observou-se que a Concentração Inibitória Mínima dos
óleos da palmarosa e manjericão foi superior a 2mg/mL e do óleo de tomilho foi
inferior ao valor mencionado. Com objetivo semelhante GIORDANI et al.
(2006) avaliaram a atividade antifúngica do óleo essencial de C. cassia
(canela), sobre C. albicans (ATCC 90029), isolado e associado a Anfotericina
B, obtendo valores de CIM de 0,5mg/mL.
Diante do fato, observa-se atividade antifúngica dos óleos essenciais
frente a C. albicans, entretanto a comparação entre os estudos deve ser feita
somente no tocante a presença ou ausência de atividade, já que foram
36
utilizadas metodologias distintas, a difusão em ágar e a microdiluição, pois o
presente estudo apenas avalia a presença de atividade e não o valor da CIM,
como realizado por DUARTE et al. (2005) e GIORDANI et al. (2006).
O óleo essencial de C. cássia (canela), juntamente com 74 amostras de
outros produtos naturais, foi avaliado frente ao Aspergillus niger, utilizando-se a
técnica da difusão em ágar. Observou-se um valor de 40 mm para o halo de
inibição do óleo essencial frente ao fungo (PAWAR, THAKER, 2006).
Resultado semelhante foi encontrado, já que se observa uma variação entre 27
e 30 mm nos valores dos halos de inibição do óleo essencial de canela da
china, frente às cepas de C. albicans. Assim, observa-se atividade antifúngica
do óleo de canela, mesmo em fungos de gêneros distintos e potencialmente
patogênicos.
O óleo essencial de C. articulatus (piprioca) não apresentou atividade
antifúngica, quando comparada ao controle positivo (miconazol) e aos outros
óleos. Esta espécie vegetal é popularmente utilizada por sua ação antibiótica e
antiinflamatória (DUARTE et al., 2005; DUARTE et al., 2006). No entanto,
mesmo sendo uma espécie nativa brasileira, nenhum estudo a cerca da
atividade antimicrobiana da piprioca foi encontrado.
A C. albicans por ser a espécie mais prevalente no diagnóstico da
candidose oral, foi inserida no estudo para avaliar a atividade antifúngica dos
óleos essenciais. O fato da escolha de amostras clínicas se baseia na
necessidade de dados referentes a estas amostras, visto que a literatura utiliza
apenas cepas padrão para ensaios microbiológicos.
Em relação à metodologia utilizada caracteriza-se por ser um método
difundido em ensaios laboratoriais, sendo de rápida e fácil execução,
possibilitando a seleção de produtos com potencial atividade antimicrobiana,
entretanto, a lipofobia do meio de cultura e a viscosidade dos óleos essenciais
podem impedir a difusão dos fitoconstituintes no ágar, sendo, assim,
caracterizado como um teste de baixa sensibilidade (ALLEN, MOLAN, REID,
1991). Assim, o presente estudo realiza apenas uma triagem da atividade
antifúngica dos óleos essenciais, em suas concentrações puras, apenas
avaliando a ausência e existência de atividade antifúngica, não tendo sido
realizado nenhum teste em meio de cultura líquido ou com concentrações
37
menores dos óleos essências. Desta forma, sugere-se a realização de estudos
com metodologias com maior acurácea, a fim de denotar a real atividade dos
óleos essenciais frente às amostras fúngicas.
Conclusão
Observou-se atividade antifúngica dos óleos essenciais de O. basilicum
(manjericão), C. martinii (palmarosa), T. vulgaris (tomilho) e C. cassia frente
amostras de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos e C. albicans
padrão (ATCC 7648). A atividade antifúngica do óleo essencial de C. articulatus
(piprioca) não foi comprovada frente às cepas ensaiadas.
Referências
1. ALLEN KL, MOLAN PC, REID GM. A survey of the antibacterial activity of some New Zealand honeys. J. Pharm. Pharmacol., 43(6): 817-22, 1991.
2. ALMEIDA JRGA, SILVA-FILHO RN, NUNES XP, DIAS CS, PEREIRA
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40
Atividade antifúngica de óleos essenciais frente amostras clínicas de
Candida albicans isoladas de pacientes HIV positivos
ALMEIDA, L.F.D.¹*; CAVALCANTI Y.W.1; CASTRO R.D.2; LIMA E.O.3
¹Universidade Federal da Paraíba, 2Departamento de Clínica e Odontologia
Social, 3Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal da
Paraíba, CEP: 58051-900, João Pessoa-Brasil.
Atividade antifúngica de óleos essenciais frente amostras clínicas de
Candida albicans isoladas de pacientes HIV positivos
RESUMO: Objetivou-se avaliar a atividade antifúngica dos óleos essenciais de
Ocimum basilicum L. (manjericão), Cymbopogon martinii L. (palmarosa),
Thymus vulgaris L. (tomilho) e Cinnamomum cassia Blume (canela da china)
sobre cepas de Candida albicans isoladas de pacientes HIV positivos e cepa
padrão (ATCC 76845). Quinze amostras clínicas de C. albicans (C1-C15) foram
repicadas em ágar Sabouraud Dextrose, para confecção de suspensões em
solução salina estéril (0,9%) contendo 1,5 x 106 UFC mL-1. As emulsões dos
óleos essenciais foram preparadas em água destilada estéril e tween 80, com
concentrações variando entre 1024 µg mL-1 e 4 µg mL-1. A ação antifúngica foi
determinada por meio da Concentração Inibitória Mínima (CIM) utilizando-se a
Capítulo 02: Artigo formatado segundo as normas do periódico “Revista Brasileira de
Plantas Medicinais”. Enviado para publicação em 20 de abril de 2011. Aguardando
parecer dos revisores.
41
técnica da microdiluição. Foram utilizados como controles positivos nistatina e
miconazol (50 µg mL-1). Os testes foram realizados em triplicata, sendo a CIM a
menor concentração capaz de inibir o crescimento das leveduras, observada
por método visual, de acordo com a turvação do meio de cultura. Para C.
albicans (ATCC 76845), a CIM do óleo essencial de C. cassia foi 64 µg mL-1,
enquanto para óleo de C. martinii foi 1024 µg mL-1. Para as cepas clínicas,
verificou-se que a CIM de C. cassia para 80% das cepas foi 64 µg mL-1, sendo
a variação dos valores da CIM entre 128 µg mL-1 e 64 µg mL-1. Observou-se
que para 66,6% das amostras clínicas, a CIM de C. martinii foi 612 µg mL-1.
Constatou-se que a nistatina não apresentou atividade frente às cepas clínicas
(C1-C15), enquanto a atividade antifúngica do miconazol foi verificada em
100% das amostras. Não se constatou CIM dos óleos essenciais de O.
basilicum e T. vulgaris, nas concentrações avaliadas. Concluiu-se que os óleos
essenciais de C. cassia e C. martinii, em diferentes concentrações, apresentam
atividade antifúngica sobre cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV
positivos e cepa padrão (ATCC 76845). Entretanto não foi observada CIM para
os óleos de O. basilicum e T. vulgaris.
Palavras- chave: Candida albicans, Candidose, produtos naturais
ABSTRACT: Antifungal activity of essential oils against clinical samples
of Candida albicans isolated from HIV-positive patients. The aim of this
study was to evaluate the antifungal activity of essential oils from Ocimum
basilicum L. (basil), Cymbopogon martinii L. (palmarosa), Thymus vulgaris L.
(thyme) e Cinnamomum cassia Blume (cinnamon china) against Candida
albicans strains, isolated from HIV-positive patients and pattern strain (ATCC
42
76845). Fifteen clinical samples of C. albicans (C1-C15) were seeded to
Sabouraud Dextrose agar, then fungal suspensions were prepared on sterile
saline (0.9%), with 1.5 x 106UFC mL-1. The emulsions of essential oils were
prepared on sterile distilled water and tween 80, with concentrations ranging
between 1024 µg mL-1 and 4 µg mL-1. The antifungal activity was determined by
the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), using the microdilution technique.
Nystatin (50 µg mL-1) and miconazole (50 µg mL-1) were applied as positive
controls. The tests were performed in triplicate and the MIC was the lowest
concentrations enable to inhibit the yeasts. The MIC was evaluated by the
visual method, according to the turbidity of culture medium. For C. albicans
(ATCC 76845), the MIC of the essential oil from C. cassia was 64 µg mL-1, while
the MIC for C. martini was 1024 µg/mL. To the clinical strains, was verified that
the MIC of C. cassia was 64 µg mL-1 for 80% of the yeasts, being the MIC
variation between 128 µg mL-1 and 64 µg mL-1. For 66.6% of the clinical
samples, the MIC of C. matinii was 612 µg mL-1. Nystatin did not presented
antifungal activity against clinical samples (C1-C15), while the antifungal action
of miconazole was observed to 100% of the yeasts. The MIC of essential oils
from O. basilicum and T. vulgaris was not identified at the evaluated
concentrations. It was concluded that the essential oils from C. cassia and C.
martinii, at different concentrations, presented antifungal activity against pattern
strain (ATCC 76845) of C. albicans and clinical samples isolated from HIV-
positive patients. To the essential oils from O. basilicum and T. vulgaris was not
observed antifungal activity.
Key words: Candida albicans,Candidoses, natural products
43
INTRODUÇÃO
A microbiota oral normal apresenta, regularmente, espécies de Candida,
sem haver comprometimento da saúde do indivíduo (Kuriyama et al., 2005).
Entretanto, por ser uma levedura oportunista, pode causar candidose oral,
devido ao rompimento das relações comensais existentes (Crocco et al., 2004).
Fatores como baixo fluxo salivar (Torres et al, 2007) e a utilização inadequada
de próteses dentárias podem acentuar a infecção fúngica em pacientes
portadores de doenças como a Síndrome da Imudeficiência Adquirida (AIDS)
(Noborikawa et al., 2009). Assim, entre indivíduos portadores do vírus da
imunodeficiência (HIV), a candidose oral é uma infecção comum e a levedura
Candida albicans consiste na espécie mais prevalente (Gabler et al., 2008;
Pozzatti et al., 2008).
Dentre os fármacos mais utilizados para o tratamento da candidose oral,
destacam-se os derivados azólicos (fluconazol, miconazol e itraconazol) e os
poliênicos (anfotericina B e nistatina), atuando de forma tópica ou sistêmica
(Kuriyama et al., 2005). Entretanto, observa-se certa resistência das espécies
de Candida, principalmente aquelas que infectam pacientes HIV positivos, a
alguns destes medicamentos (Rex et al., 2000). Assim, frente à resistência das
espécies de Candida aos antifúngicos sintéticos observa-se o uso de produtos
naturais, na tentativa de obter-se melhor desempenho sobre tais
microrganismos (Lima et al., 2006 ; Pozzati et al., 2008).
Os óleos essenciais como os de Cymbopogon martinii (palmarosa),
Ocimum basilicum (manjericão) e Thymus vulgaris (tomilho) apresentam
atividade frente a espécies bacterianas e fúngicas, incluindo a C. albicans
(Duarte et al. 2005; Almeida et al. 2010; Almeida & Cavalcanti, 2012). A ação
44
antibacteriana e antifúngica de espécies como Cynnamomum zeylanicum
(canela), Eucaliptus citriodora (eucalipto) e Eugenia uniflora (pitanga) também
foi relatada por Araújo et al. (2004).
O tratamento da candidose oral em pacientes infectados pelo HIV é
instituído empiricamente e por um longo tempo, na maioria dos casos. Este fato
contribui para o aparecimento de espécies resistentes à terapia
medicamentosa comum (Wingeter et al., 2007). Tal evento, tem motivado
estudos sobre a susceptibilidade in vitro de fungos, isolados principalmente de
pacientes imunocomprometidos, a novos produtos devido ao aparecimento de
espécies resistentes (Bachmann, 2002; Almeida et al., 2010).
Diante disto, objetivou-se determinar a Concentração Inibitória Mínima
dos óleos essenciais de Ocimum basilicum L. (manjericão), Cymbopogon
martinii L. (palmarosa), Thymus vulgaris L. (tomilho) e Cinnamomum cassia
Blume (canela da china) frente à cepas de C. albicans isoladas de pacientes
HIV positivos e cepa padrão (ATCC 76845).
MATERIAL E MÉTODO
1. Seleção das leveduras
O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Universitário Lauro Wanderley de acordo com a
resolução 196/96.
Foram incluídas no estudo 15 amostras clínicas de C. albicans (CA 01-
CA 15) isoladas de pacientes portadores de HIV e, devidamente identificadas,
escolhidas aleatoriamente da micoteca do Laboratório de Micologia da
45
Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba. Utilizou-se uma cepa
padrão de C. albicans - CAP (ATCC 76845).
As amostras das leveduras foram repicadas em ágar Sabouraud
Dextrose (DIFICO®, Detroit, Michigan, EUA) e incubadas em estufa a 35ºC por
48 horas. As suspensões fúngicas foram preparadas utilizando-se solução
salina estéril a 0,9%, sendo comparadas ao tudo 0,5 da escala de MacFarland
(1,5 x 106 UFC mL-1).
2. Soluções dos óleos essenciais
Os óleos essenciais de Ocimum basilicum (manjericão), Cymbopogon
martinii (palmarosa), Thymus vulgaris (tomilho) e Cinnamomum cassia (canela
da china) foram obtidos, mediante compra, através da Empresa Viessence®
(Florianópolis, Santa Catarina, Brasil). As propriedades físico-químicas foram
descritas pelo fornecedor por meio de laudo técnico (Quadro 01).
QUADRO 1. Especificações técnicas dos óleos essenciais utilizados no estudo,
segundo laudo técnico expedido por fornecedor.
Óleos essenciais Densidade (g mL-1
, 20 ºC) Origem Fitoconstituintes
Ocimum basilicum
(manjericão) 0,898 Brasil
Linalol
1,8-cineol
Cymbopogon martinii
(palmarosa) 0,878 Brasil
Geraniol
Acetato de geranila
Thymus vulgaris
(tomilho) 0,908 França
Timol
p-cimeno
Cinnamomum cassia
(canela da china) 0,912 China Aldeído cinâmico
Para cada óleo essencial, foi preparada uma solução padrão, levando-
se em consideração valor médio de densidade de 0,9g mL-1, amostras dos
46
óleos previamente pesadas. A solução fina apresentava 0,04mL TWEEN 80
(Farmafórmula Farmácia de Manipulação, João Pessoa-PB, Brasil) e q.s.p.
5mL de água destilada estéril. Assim, foi estabelecida uma concentração inicial
padrão de 1024 µg mL-1, para todos os produtos.
3. Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A atividade antifúngica, determinada pela Concentração Inibitória
Mínima, foi avaliada por meio da técnica da microdiluição em caldo, utilizando-
se microplacas com 96 orifícios, com fundo em forma de “U”, com tampa
(ALAMAR®, Diadema, São Paulo, Brasil).
Inicialmente, foram distribuídos 100 µL de caldo Sabouraud Dextrose
(DIFICO®, Detroit, Michigan, EUA) duplamente concentrado nos orifícios das
placas de microdiluição. Em seguida, 100 µL das soluções padronizadas dos
óleos essenciais foram adicionadas na linha A, sendo o conteúdo dos orifícios
homogeneizados com o meio e transferidos para o orifício da linha seguinte
(B), repetindo-se este procedimento até a linha H, de modo a obter uma
concentração decrescente, que variou entre 1024 µg mL-1 e 4 µg mL-1. Os 100
µL finais foram desprezados. Nos orifícios de cada coluna foram dispensadas
alíquotas de 10 µL do inóculo correspondente a cada cepa a ser avaliada
(NCCLS, 2003). Paralelamente, foram realizados controle da viabilidade das
cepas de leveduras. Realizou-se controle de sensibilidade das cepas frente à
ação antifúngica do miconazol e nistatina, em uma concentração fixa de 50 µg
mL-1.
Os ensaios foram realizados em triplicata e incubados a 35ºC durante 48
horas. A leitura para determinação da CIM dos óleos sobre as cepas de
leveduras foi realizada a partir do método visual. Assim, considerou-se a
47
formação ou não de aglomerados de células (“botão”) no fundo da cavidade da
placa. A CIM foi determinada como a menor concentração das amostras em
teste capaz de produzir inibição visível sobre o crescimento das cepas de
leveduras utilizadas nos ensaios microbiológicos (NCCLS, 2003). Diante disto,
os dados foram analisados descritivamente.
RESULTADO
Os resultados referentes à CIM dos óleos essenciais estão dispostos na
Tabela 01. Observou-se que todas as cepas avaliadas foram sensíveis aos
óleos de C. cassia (canela) e C. martinii (palmarosa). Em relação aos controles
com os antifúngicos, observou-se que 100% das amostras foram sensíveis ao
miconazol, entretanto, observou-se crescimento fúngico de todas as cepas
para a nistatina.
TABELA 1. Concentração Inibitória Mínima (µg mL-1) dos óleos essenciais
frente cepas de C. albicans clínicas e padrão.
Cepas de
C. albicans
Óleos essenciais Miconazol Nistatina
O. basilicum C. martinii T.vulgaris C. cassia
CA- 01 + 256 + 64 50 +
CA- 02 + 256 + 64 50 +
CA- 03 + 256 + 64 50 +
CA- 04 + 256 + 64 50 +
CA- 05 + 612 + 64 50 +
CA- 06 + 256 + 64 50 +
CA- 07 + 612 + 64 50 +
CA- 08 + 612 + 64 50 +
CA- 09 + 612 + 64 50 +
CA- 10 + 612 + 64 50 +
CA- 11 + 612 + 64 50 +
CA- 12 + 612 + 128 50 +
CA- 13 + 612 + 64 50 +
48
CA- 14 + 612 + 64 50 +
CA- 15 + 612 + 64 50 +
ATCC 76845 + 1024 + 64 50 +
*+ Crescimento microbiano. Ausência de atividade antifúngica a partir de 1024 µg mL-1
DISCUSSÃO
A atividade antifúngica dos óleos essenciais de C. martinii (palmarosa),
O. basilicum (manjericão) e T. vulgaris (tomilho) foi avaliada frente a cepas de
C. albicans (ATCC 10231) por Sartorato et al. (2004) e Duarte et al. (2005).
Dos estudos, observou-se que a CIM dos óleos de C. martinii e O. basilicum foi
superior a 2000 µg mL-1, considerando-os de baixa atividade; já para o T.
vulgaris foi de 2000 µg mL-1, sendo apresentado como produto de moderada
atividade antifúngica. Entretanto observando os valores da CIM do óleo
essencial de T. vulgaris (tomilho) frente à mesma cepa, Rahimifard et al. (2008)
encontraram CIM de 0,3 µg mL-1.
Comparando-se os resultados obtidos neste estudo observa-se que os
valores médios de CIM (612-256 µg mL-1) alcançados pelo óleo essencial da C.
martinii frente às cepas, foi consideravelmente menor que o valor encontrado
por Sartorato et al. (2004) e Duarte et al. (2005). Os óleos essenciais de T.
vulgaris e O. basilicum não produziram inibição sobre o crescimento das
leveduras mesmo diante da concentração inicial empregada (1024 µg mL-1),
não apresentando similaridade com os resultados apresentados por Sartorato
et al. (2004), Duarte et al. (2005) e Rahimifard et al. (2008).
As diferenças entre os valores de CIM do óleo essencial de T. vulgaris,
mesmo nos achados que utilizaram a mesma cepa de C. albicans, podem ser
atribuídas às condições climáticas e disponibilidade de água no solo, que
49
afetam o metabolismo secundário da espécie vegetal, podendo alterar a
composição dos óleos essenciais, de uma mesma espécie, nas diferentes
estações do ano (Freire et al., 2006). Atrelado à este fato pode-se observar que
os estágios fenológicos e clico de reprodução podem interferir na concentração
dos fitoconstituintes (Carvalho et al., 2008).
Mesmo observando-se a ausência de atividade antifúngica do óleo
essencial de O. basilicum, no presente estudo, deve-se ressaltar suas
características antioxidante (Armani et al., 2006), moduladora da síntese de
colesterol (Bravo et al., 2008) e antimicrobianas frente à Staphylococcus
aureus, Escherichia coli e Aspergillus niger (Hussain et al., 2008).
O extrato bruto etanólico do T. vulgaris foi avaliado frente a cepas de C.
albicans, C. glabrata e C. parapsilosis nas concentrações de 50, 100 e 200 mg
mL-1 por Rangel & Silva (2010), por meio de difusão em ágar. Os autores
constataram que a concentração de 50 mg mL-1 foi a mais efetiva sobre C.
albicans, considerando-se a metodologia empregada. Nas condições do
presente estudo, não foi observada atividade antifúngica o óleo de T. vulgaris.
Assim, a comparação entre os resultados deve se feita com ressalvas,
pois os requisitos metodológicos dos estudos foram distintos. Além disto, os
veículos utilizados e as formas de extração do princípio ativo dos produtos,
extrato bruto etanólico e o óleo essencial, poderia interferir na ação antifúngica,
havendo diferença na concentração do princípio ativo responsável pela
atividade anti-Candida.
Outro componente encontrado no óleo essencial de T. vulgaris, o
carvacol, tem sido citado como indutor de células apoptóticas no carcinoma
hapatocelular (Yin et al., 2012). Além disto, alguns óleos essenciais e extratos,
50
pertencentes à espécies da família Lamiaceae são relatados como
antioxidantes, assim intensifica-se a pesquisa a cerca de tais substâncias
potencialmente empregadas na indústria alimentícia (Mauritti; Bragagnolo,
2007).
A atividade antifúngica do carvacol e timol, isolados de T. viciosoi, foi
avaliada frente a cepas de C. albicans. Observou-se que a concentração
inibitória mínima e fungicida mínima variaram entre 0,04 a 0,64 µL mL−1,
demonstrando seu poder antifúngico (Vale- Silva et al. 2010). Em nosso
estudo, o óleo essencial de T. vulgaris não apresentou atividade inibitória,
dentro das concentrações avaliadas. Tais diferenças podem ser consideradas
devido a comparações entre espécies vegetais diferentes e isolamento do
princípio ativo para os testes realizados pelo ensaio citado.
Gioradani et al. (2004) avaliaram a atividade antifúngica de alguns óleos
essenciais, dentre estes do óleo essencial de T. vulgaris, com percentual de
63,2% de timol, isolado e em associação a anfotericina b, frente à C. albicans
(ATCC 90029). Os autores concluíram que a adição do óleo essencial ao
antifúngico poderá ser utilizada em futuros tratamentos de micoses, além disto
a CIM do referido óleo foi de 0,016% para 80¢ das amostras fúngicas. Assim,
observa-se a necessidade de ensaios posteriores que objetivem o isolamento
dos fitoconstituintes dos óleos essenciais e possíveis associações aos
antifúngicos sintéticos, bem como o emprego de outras cepas fúngicas, que
apresentem fenótipos distintos.
A atividade antimicrobiana do óleo essencial da C. martinii foi constatada
frente a microrganismos como S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, S.
thyphimurium e C. perfringens, observando valores de CIM entre 0,4 e 0,8 mg
51
mL-1 (Scherer et al., 2009). O mesmo óleo essencial teve atividade comprovada
frente ao S. cerevisiae na concentração de 0,1% (Prashar et al., 2003). Assim,
constata-se a eficácia antimicrobiana de C. martinii frente à espécies
bacterianas e fúngicas, como observa-se no presente estudo, com CIM
variando entre 1024 e 256 µg mL-1. Esta atividade se deve à presença de
geraniol e acetato de geralniol, compostos com alta atividade antimicrobiana
(Prashar et al., 2003; Duarte et al., 2005).
A atividade antifúngica dos óleos de O. basilicum e T. vulgaris não
foram observadas nas concentrações testadas, entretanto a ação
antimicrobiana destes produtos, em concentrações diferentes, foi constatada
em alguns estudos (Sartorato et al., 2004; Duarte et al., 2005; Rahimifard et al.,
2008), sendo esta atividade atribuída ao eugenol, presente em plantas do
gênero Ocimum (Pereira & Maia; 2007) e à presença de timol, em maior
quantidade no óleo essencial de T. vulgaris, mas também encontrado no óleo
de O. basilicum (Sartorato et al., 2004).
Dentre os produtos avaliados, o óleo essencial de C. cassia apresentou
os menores valores de CIM, variando entre 128 e 64 µg mL-1, sendo o mais
eficaz entre as amostras. Assim, estes achados corroboram com os resultados
encontrados por Giordani et al. (2006), que avaliaram a atividade do óleo
essencial de C. cassia frente a C. albicans (ATCC 90029), de forma isolada e
associado à Anfotericina B. O produto foi caracterizado como um eficiente
antifúngico, sendo verificado, para 80% das amostras, CIM igual a 0,169 μL
mL-1.
O óleo essencial de C. cassia foi avaliado frente ao crescimento de hifas
e esporos de Aspergillus niger. Observou-se que o óleo essencial, comparado
52
a outras 74 amostras de óleos teve o melhor desempenho, relacionando-se os
valores dos halos de inibição das amostras, sendo inferior apenas ao óleo
essencial de C. zeylanicum (Pawar & Thaker, 2006).
No referido estudo a composição química do óleo foi analisada,
destacando-se a presença do cinanomaldeído (66.36%) e eugenol (7.74%),
conhecidos por sua atividade antifúngica. (Pawar & Thaker, 2006). É válido
ressaltar que o estudo citado utilizou metodologia e cepa fúngica distintas
daquelas utilizadas por este, entretanto a ação do óleo essencial da canela foi
constatada.
A atividade antimicrobiana de fitoconstituintes extraídos do óleo
essencial de C. cassia, foi descrita por Ooi et al. (2006). Foram avaliados o
ácido cinâmico, o cinanomaldeído e óleo essencial sobre bactérias Gram
positivas, Gram negativas, fungos dermatófitos e leveduras, dentre estas a C.
albicans.Os autores observaram que CIM do cinanomaldeído foi 125 mg mL-1
e para o óleo essencial um valor de 138 mg mL-1, já para o ácido cinâmico não
foi encontrado valor de CIM. Desta forma, ao compararmos os resultados aqui
apresentados observam-se aproximação entre os valores de CIM (128-64 mg
mL-1), reforçando o poder antifúngico do óleo essencial estudado. É válido
ressaltar que as diferenças metodológicas encontradas nos estudos podem
interferir nos valores de CIM, pois naquele realizado por Ooi et al. (2006)
utilizou-se a técnica da difusão em ágar, entretanto no presente estudo
realizou-se a técnica da microdiluição.
A atividade antimicrobiana do óleo essencial da C. cassia foi testada
frente a Escherichia coli, Enterococcus sp., Klebsiella sp. e Proteus mirabilis,
sendo a CIM do óleo, frente a E. coli e P. mirabilis, 0,1 mg mL-1 e 0,001 mg mL-
53
1, respectivamente (Carvalho et al., 2010). Assim, mesmo comparando espécie
fúngicas e bacterianas, nossos resultados se assemelham aos observados por
Carvalho et al. (2010), pois a CIM frente às bactérias foi de 0,1 e 0,001 mg mL-1
e a CIM sobre as cepas de C. albicans variou entre 128 e 64 µg mL-1.
É importante ressaltar que poucos estudos a cerca da atividade
antifúngica do óleo essencial de C. cassia foram encontrados na literatura,
caracterizando o presente ensaio como pioneiro a abordar a atividade
antifúngica do óleo essencial frente a C. albicans padrão e potencialmente
virulentas.
Os óleos essenciais são conhecidos pelo caráter hidrofóbico, o que
permite interação com estruturas lipídicas, aumentando a permeabilidade
celular, provocando danos irreversíveis à célula (Nascimento et al., 2007). Tal
constatação poderia indicar um possível mecanismo de ação dos óleos
essenciais de C. cassia (canela) e C. martinii (palmarosa), os quais
apresentaram resultados satisfatórios frente às amostras de C. albicans.
Entretanto, observa-se que a realização de testes microbiológicos e
farmacológicos complementares torna-se relevante diante da necessidade de
se estabelecer o real mecanismo de ação dos produtos frente às cepas de C.
albicans e outras espécies de microrganismos potencialmente patogênicos.
CONCLUSÃO
Concluiu-se que os óleos essenciais de C. cassia e C. martinii, em
diferentes concentrações, apresentam atividade antifúngica sobre cepas de C.
albicans isoladas de pacientes HIV positivos e cepa padrão (ATCC 76845).
Entretanto não foi observada CIM para os óleos de O. basilicum e T. vulgaris.
54
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Atividade antifúngica e alterações morfológicas induzidas pelo óleo essencial de Cinnamomum cassia frente cepas de Candida albicans
isoladas de pacientes HIV positivos
Antifungal activity and morphological alterations caused by essential oil from Cinnamomum cassia against Candida albicans yeasts isolated from
HIV-positive patients
Leopoldina de Fátima Dantas de Almeida
Aluna do Programa de Pós-Graduação em Odontologia (Odontologia Preventiva Infantil - Mestrado) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa/PB, Brasil. [email protected] Yuri Wanderley Cavalcanti
Aluno do curso de graduação em Odontologia da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa/PB, Brasil. [email protected] Ricardo Dias de Castro Professor do Departamento de Clínica e Odontologia Social. Universidade Federal da Paraíba (UFPB), João Pessoa/PB, Brasil. [email protected] Edeltrudes de Oliveira Lima
Professora Doutora do Departamento de Ciências Farmacêuticas. Universidade Federal da Paraíba. [email protected]
O presente estudo corresponde parte de dissertação de mestrado do programa de Pós Graduação em Odontologia da UFPB. Endereço para correspondência: Leopoldina de Fátima Dantas de Almeida Rua Luiz Germóglio, 439, apt. 304 Bancários. João Pessoa, Paraíba -Brasil [email protected]
Capítulo 03: Artigo formatado segundo as normas do periódico “Pesquisa Brasileira em
Odontopediatria e Clínica Integrada”. Enviado para publicação em 20 de outubro de
2011. Aguardando parecer dos revisores.
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Atividade antifúngica e alterações morfológicas induzidas pelo óleo essencial de Cinnamomum cassia frente cepas de Candida albicans
isoladas de pacientes HIV positivos
Antifungal activity and morphological alterations caused by essential oil from Cinnamomum cassia against Candida albicans yeasts isolated from
HIV-positive patients
Resumo Objetivo: Avaliar a atividade antifúngica, o efeito sobre a cinética de morte microbiana e as alterações morfológicas do óleo essencial de Cinnamomum cassia (canela) sobre cepas de Candida albicans isoladas de pacientes HIV positivos e cepa padrão (ATCC 76485). Método: Suspensões fúngicas
(106UFC/mL) foram preparadas a partir de amostras clínicas (n=15) e padrão (n=1) de C. albicans. Emulsões do óleo essencial foram avaliadas em concentrações que variaram entre 1024µg/mL e 4µg/mL. A ação antifúngica foi determinada pela Concentração Inibitória Mínima (CIM), por meio da técnica da microdiluição. Realizou-se o ensaio de cinética sobre a morte das leveduras (tempos 0, 30, 60, 180 minutos e 24h), bem como a avaliação da interferência do óleo essencial sobre a micromorfologia das cepas. O miconazol (50 µg/mL) foi utilizado como controle e a análise estatística se deu pelos testes Kruska-Wallis e Dunn (p<0,05). Resultados: A CIM variou entre 64 e 128 µg/mL, frente às cepas testadas. Para o teste de cinética, verificou-se ação antifúngica de C. cassia nas concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM, em todos os tempos analisados. O controle de crescimento foi estatisticamente diferente do miconazol e do óleo essencial (p<0,01), não sendo observada diferença estatística entre o efeito do miconazol e do produto natural (p>0,05). Alterações na micromorforlogia das cepas (ausência de pseudohifas e clamidoconídeos) foram verificadas na CIM. Conclusão: O óleo essencial de C. cassia,
semelhante ao miconazol, apresentou atividade antifúngica e efeito sobre a cinética de morte microbiana. Os produtos avaliados provocaram alterações sobre a micromorfologia das cepas testadas. Descritores: Candida albicans, Candidíase Bucal, Produtos Biológicos. Abstract Purpose: The aim was to evaluate the antifungal activity, the effect on the
kinetics of microbial death and the morphological changes caused by essential oil from Cinnamomum cassia (cinnamon) on Candida alicans yeasts isolated from HIV-positive patients, and pattern strain (ATCC 76485). Method: Fungal suspensions (106CFU/mL) were prepared from clinical (n=15) and standard (n=1) samples of C. albicans. Essential oil emulsions were evaluated at concentrations ranging from 1024μg/mL and 4μg/mL. The antifungal activity was determined by Minimum Inhibitory Concentration (MIC), by microdilution technique. Tests were also conducted to evaluate the kinetics of the death of
60
yeast (at times 0, 30, 60, 180 minutes and 24 hours) and the interference of the essential oil on the morphology of the strains. The miconazole (50 µg/mL) was used as control and statistical analysis was given by Kruska-Wallis and Dunn tests (p <0.05). Results: The MIC ranged between 64 and 128 µg/mL against tested strains. For the kinetics assay, it was found antifungal activity of C. cassia, at concentrations MIC, 2xMIC and 4xMIC, at all times analized. The growth control was statistically different from miconazole and essential oil (p <0.01), and no statistical difference was observed between the effect of miconazole and the natural product (p> 0.05). Changes in the micromorphology of the strains (absence of pseudohyphae and clamidoconides) were observed at MIC. Conclusion: The essential oil from C. cassia, similar to miconazole,
presented antifungal activity and effect on the kinetics of microbial death. The evaluated products caused changes on the morphology of tested strains. Descriptors: Candida albicans, Oral Candidiasis, Biological Products.
Introdução
As espécies fúngicas do gênero Candida coexistem com a comunidade
bacteriana da microbiota oral normal, sendo verificado que o isolamento de Candida spp. da cavidade bucal não implica, necessariamente, na ocorrência de infecções, já que tal fato é observado em indivíduos saudáveis (1). Entretanto, por representarem um grupo de microrganismos oportunistas, podem causar infecções diagnosticadas como candidoses (2,3).
Além dos fatores inerentes à cavidade bucal, a imunossupressão é um fator condicionante para o aparecimento de candidose oral. Essa infecção é comum em indivíduos com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS), sendo a C. albicans reconhecida como um marcador biológico da evolução da doença (4).
Aproximadamente 81% dos pacientes com AIDS são colonizados por cepas de Candida (5). O isolamento de C. albicans da cavidade bucal de pacientes portadores de AIDS tem sido comum (6-8), permitindo observar que algumas amostras são resistentes aos antifúngicos utilizados no tratamento da doença (6).
Para o tratamento da candidose oral, a conduta clínica tem levado ao uso de antifúngicos sintéticos, representados pela Anfotericina B e Nistatina, bem como os derivados azólicos (miconazol, fluconazol, itraconazol e voriconazol) (3). Porém, o amplo uso destes agentes tem chamado atenção para o desenvolvimento de espécies resistentes (9). A literatura relata casos de resistência medicamentosa de C. albicans frente a derivados azólicos, em pacientes HIV positivos com diagnóstico de candidose oral (10). Assim, diante do evidente crescimento do número de patógenos resistentes aos antimicrobianos atualmente utilizados na clínica, existe uma clara e emergente necessidade de introduzir novos compostos antimicrobianos no arsenal terapêutico (11).
A utilização de produtos de origem natural tem sido uma opção estudada, visando obter substâncias de capacidade antifúngica comprovada, aliada a menor resistência esperada das espécies fúngicas. Diante disto,
61
alguns estudos avaliaram a atividade antifúngica e antibacteriana de produtos naturais à base de Cinnamomum cassia (canela da china) (12-14).
Assim, o propósito deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial de C. cassia e seu efeito sobre a cinética de morte microbiana e micromorfologia de cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos e cepa padrão. Metodologia
Óleo essencial
O óleo essencial de C. cassia foi adquirido mediante compra na Empresa Laszlo Aromaterapia LTDA® (Santa Catarina). De acordo com o laudo técnico fornecido pelo fabricante, o nome popular do espécime é canela da china. Segundo o mesmo laudo, utilizou-se a casca para extração do óleo essencial, obtido pelo método da destilação e arraste a vapor. O Quadro 1 apresenta a composição química informada do produto.
Quadro 1 – Composição química informada do óleo essencial de C. cassia, segundo especificação do fornecedor (Santa Catarina, 2011).
Constituinte %
Aldeído Cinâmico 83,9
α-pineno 1,2
Canfeno 0,4
p-cimeno 0,5
Eugenol 0,4
β-cariofileno 0,2
Benzoato de benzila 6,8
Amostras Fúngicas
No presente estudo, foram utilizadas 15 amostras de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos, cedidas pelo Laboratório de Micologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal da Paraíba. Para tal finalidade, foi assinado um termo de anuência, para concessão das referidas amostras e utilização do espaço físico do laboratório. As amostras foram nomeadas aleatoriamente por códigos C-01 a C-15. Utilizou-se uma cepa padrão de C. albicans (ATCC 76485), identificada pelo código CP.
Devido à utilização de amostras clínicas de C. albicans, o presente estudo foi submetido à apreciação do Comitê de Ética de Pesquisa em Seres Humanos do Hospital Universitário Lauro Wanderley, de acordo com a resolução 196/96. A aprovação pelo respectivo órgão foi registrada segundo parecer n°.462/10, folha de rosto n°363362.
As amostras foram devidamente isoladas e estocadas em agar Saburaud Dextrose (ASD), em ambiente refrigerado. Para o ensaio laboratorial foram confeccionadas suspensões fúngicas em solução salina estéril a 0,9%, contendo aproximadamente 106 UFC/mL, padronizado de acordo com a turbidez do tubo 0,5 da escala de McFarland.
62
Diluição do Óleo Essencial de C. cassia Para a realização dos ensaios microbiológicos, proferiu-se diluição do
óleo essencial de C. cassia (15). A emulsão foi mantida sob agitação em Vortex, sendo a concentração inicial obtida de 2048 µg/mL. Determinação da Concentração Inibitória Mínima Para determinação da CIM, utilizou-se a técnica da microdiluição em caldo Sabaraud Dextrose (16). Inicialmente, distribuiu-se 100 µL de caldo Sabouraud Dextrose (DIFICO®, Detroit, Michigan, EUA) (CSD) duplamente concentrado nos orifícios das placas de microdiluição de 96 orifícios. Em seguida, 100 µL da emulsão do óleo essencial de C. cassia foi distribuída realizando-se diluições a partir da transferência de alíquotas de 100 µL da cavidade mais concentrada para a cavidade sucessora. Desta forma as concentrações variaram entre 1024 µg/mL e 4µg/mL, totalizando nove diluições seriadas. Nos orifícios de cada coluna foram dispensadas alíquotas de 10 µL das suspensões fúngicas de C. albicans. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica por 48 horas a 35-37ºC. Para validação do teste foram realizados o controle de viabilidade das cepas ensaiadas, teste de esterilidade do meio de cultura e controle das cepas com antifúngico miconazol (considerado fármaco padrão), na concentração 50 µg/mL. A determinação da CIM foi observada mediante teste visual, observando-se a presença ou não de aglomerados de células (crescimento visual) no fundo das cavidades da placa. Assim, a foi considerada CIM a menor concentração do óleo essencial capaz de produzir inibição visível (ausência de aglomerados celulares) do crescimento das cepas de C. albicans (16). A análise dos dados para determinação da CIM se deu de forma descritiva.
Efeito sobre a cinética de morte das leveduras O estudo da interferência do óleo essencial de C. cassia sobre a cinética de morte microbiana foi realizado por meio da técnica de contagem de células viáveis para os fungos leveduriformes. Neste ensaio, observou-se o comportamento das cepas frente à CIM determinada pelo método de microdiluição, além das concentrações 2xCIM e 4xCIM. Para a execução do ensaio de cinética foi selecionada uma amostra clínica (C-02) e a amostra padrão (CP) de C. albicans.
Emulsões (500 µL) do óleo essencial de C. cassia, preparadas nas concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM, foram adicionados em tubos de ensaio contendo 4 mL de CSD estéril e 500 µL das suspensões das leveduras (106 UFC/mL). Os respectivos tubos foram incubados a 35-37ºC por 24 horas, no decorrer do ensaio. Nos tempos determinados (0, 30, 60, 120min e 24 horas), uma alíquota de 10 µL das soluções testes foi inoculada sobre em placas de ASD para determinação da contagem de colônias. As placas inoculadas foram incubadas a 35-37ºC durante 24 horas, sendo os testes realizados em triplicata.
De forma equivalente, realizou-se o ensaio de cinética para o miconazol, fármaco padrão escolhido para o referido teste. Assim, o comportamento das cepas foi avaliado utilizando-se as concentrações de 50µg/mL, 100µg/mL e 200µg/mL, pois nos ensaios anteriores o antifúngico padrão foi utilizado em uma concentração fixa, não tendo sido realizada a determinação da CIM, já
63
que o mesmo apresenta-se para uso clínico. No mesmo experimento, foi realizado o grupo para controle de crescimento, utilizando-se água destilada estéril em substituição do agente antifúngico.
Após o período de incubação, determinou-se o total de Unidades Formadoras de Colônias por mililitro (UFC/mL) para cada tempo, concentração e cepa testadas. Verificou-se a relação entre a concentração testada, o tempo de exposição às soluções antifúngicas e a média de crescimento de cada cepa avaliada. Assim, comparou-se a dimensão da atividade antifúngica em várias concentrações, diante dos tempos avaliados, comparando-se o grupo teste com o fármaco sintético e o controle de crescimento.
Os dados coletados (total de UFC/mL em função do tempo e concentração analisados) foram considerados não paramétricos, visto que são variáveis discretas e não podem apresentar distribuição normal. Assim, a análise estatística se deu pelos testes Kruskal-Wallis e Dunn, com nível de significância de 5%.
Efeito sobre a morfologia das leveduras A técnica do microcultivo para leveduras foi empregada na determinação do efeito sobre a morfologia das amostras de C. albicans, utilizando-se o meio sólido ágar-arroz em câmera úmida (17). Para tal teste, selecionou-se uma amostra clínica (C-02) e a padrão (CP). Ao meio de cultura ágar-arroz, foram dispensadas as emulsões do óleo essencial nas concentrações correspondentes a CIM, 2xCIM e 4xCIM. O controle de crescimento foi realizado com água destilada estéril e o miconazol (padrão farmacológico) foi avaliado nas concentrações: 50, 100 e 200 µg/mL. Assim, foram formados sete sistemas-testes, em tubos de ensaio estéreis.
Em seguida, transferiu-se 1 mL do ágar-arroz associado aos produtos testes para uma lâmina de vidro, formando uma camada delgada. Após a solidificação do ágar-arroz, semeou-se a levedura com o auxílio de alça bacteriológica em forma de agulha, fazendo uma estria paralela. Adicionou-se uma lamínula de vidro, para cobrir o microcultivo e inseriu-se o sistema em placa de petri estéril. Posteriormente, 1 mL de água destilada e esterilizada foi inserida na placa de petri, para manter a umidade. Cada placa foi fechada e incubada a temperatura de 35-37ºC durante 48 horas.
Decorrido o tempo de incubação, cada preparação foi examinada em microscopia de campo claro para a observação da formação ou não das estruturas características das leveduras, incluindo blastoconídeos, pseudohifas, e clamidoconídeos. Os microcultivos foram fotografados e caracterizados de acordo com a presença das estruturas leveduriformes, as quais se encontravam presentes, ausentes ou raros.
Resultados
A CIM do óleo essencial de C. cassia, frente às cepas clínicas e padrão
variou entre 128 e 64 µg/mL (Quadro 2). O miconazol, avaliado na concentração 50 µg/mL, inibiu a atividade de todas as cepas testadas.
64
Quadro 2 – Concentração Inibitória Mínima – CIM (µg/mL) do óleo essencial de C. cassia frente às amostras de C. albicans.
Amostra CIM
C-01 64
C-02 64
C-03 64
C-04 64
C-05 64
C-06 64
C-07 64
C-08 64
C-09 64
C-10 64
C-11 64
C-12 128
C-13 64
C-14 64
C-15 64
CP 64
Em relação ao efeito do óleo essencial de C. cassia sobre a cinética de
morte de C. albicans (C-02 e CP), verificou-se que os produtos testados produziram redução significativa do total de UFC/mL, quando comparados ao controle de crescimento. A Tabela 1 apresenta as médias do total de Unidades Formadoras de Colônia por mililitro (UFC/mL x 104) de cada cepa testada, após exposição aos produtos analisados nas concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes (p>0,05) entre a atividade do óleo essencial e do miconazol, nas concentrações testadas, sendo ambos estatisticamente diferentes (p<0,01) do controle de crescimento.
Tabela 1 – Média do total de Unidades Formadoras de Colônia por mililitro
(UFC/mL x 104) de cada cepa testada, após exposição aos produtos analisados nas concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM.
Produtos testados Amostras de C. albicans
C-02 CP
Controle (água destilada) 26,7 a 49,5 ª
C. cassia CIM 9,2 b 19,4 b
C. cassia 2xCIM 8,6 b 17,3 b
C. cassia 4xCIM 9,2 b 18,3 b
Miconazol CIM 12,7 b 18,8 b
Miconazol 2xCIM 11,4 b 15,1 b
Miconazol 4xCIM 6,7 b 12,9 b
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatisticamente significante (p<0,01) – Testes Kruskal-Wallis e Dunn.
A Figura 1 ilustra o efeito das concentrações do Miconazol e do óleo
essencial (OE) frente à cepa C-02, em todos os tempos de avaliação.
65
Observou-se diferença estatisticamente significante (p< 0,01) entre os grupos teste e o controle de crescimento.
0 1 2 3 4 50
20
40
60
80
Controle de Crescimento C-02
Miconazol CIM
Miconazol 2CIM
Miconazol 4CIM
Tempo
UF
C/m
L x
10
4
0 1 2 3 4 50
20
40
60
80
Controle de Crescimento C-02
OE CIM
OE 2CIM
OE 4CIM
Tempo
UF
C/m
L x
10
4
Figura 1 – Curva de morte microbiana obtida para a atividade antifúngica do Miconazol (A) óleo essencial de C. cassia – OE (B) nas concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM sobre a cepa clínica de C. albicans (C-02), nos tempos 0, 30, 60, 120 minutos e 24 horas. Observou-se diferença estatisticamente significante (p<0,01) entre o total de UFC/mL obtidos para o controle e para os grupos teste.
A Figura 2 ilustra o efeito das concentrações do Miconazol e do óleo essencial (OE) frente à cepa padrão CP, em todos os tempos de avaliação. Observou-se diferença estatisticamente significante (p< 0,01) entre os grupos teste e o controle de crescimento.
0 1 2 3 4 50
20
40
60
Controle de Crescimento CP
Miconazol CIM
Miconazol 2CIM
Micoazol 4CIM
Tempo
UF
C/m
L x
10
4
0 1 2 3 4 50
20
40
60
Controle de Crescimento CP
OE CIM
OE 2CIM
OE 4CIM
Tempo
UF
C/m
L x
10
4
Figura 2 – Curva de morte microbiana obtida para a atividade antifúngica do
Miconazol (C) óleo essencial de C. cassia – OE (D) nas concentrações CIM, 2xCIM e 4xCIM sobre a cepa padrão de C. albicans (CP), nos tempos 0, 30, 60, 120 minutos e 24 horas. Observou-se diferença estatisticamente
A B
C D
66
significante (p<0,01) entre o total de UFC/mL obtidos para o controle e para os grupos teste.
Em relação à interferência do óleo essencial sobre a micromorfologia
fúngica, por meio da análise em microscopia de campo claro, foi verificada e presença de balstoconídeos em todas as lâminas analisadas. Entretanto, a presença de pseudohifas foi considerada ausente, em todas as concentrações do grupo teste bem como comparadas ao miconazol. A presença de clamidoconídeos foi considerada rara nos grupos analisados (Figuras 3 e 4).
Figura 3 – Micromorfologia da cepa clínica C-02
de C. albicans frente ao uso do óleo essencial na CIM. Observa-se presença de raros clamidoconídeos e ausência de pseudohifas.
Figura 4 - Micromorfologia da cepa clínica C-02 de C. albicans, sob ação do Miconazol, observando-se a presença de pseudohifas e clamidoconídeos.
67
Discussão A atividade antifúngica do óleo essencial de C. cassia foi avaliada por
métodos distintos, inicialmente pelo da microdiluição em caldo, no qual foram verificados os valores de CIM entre 128 e 64 µg/mL, sendo para 93,75% (n=15) a CIM igual a 64 µg/mL, inclusive a CP. O produto foi caracterizado como eficiente agente antifúngico, já que apresentou atividade antifúngica superior a 0,5mg/mL (18). Outras investigações avaliaram a CIM do óleo essencial de C. cassia frente a C. albicans (ATCC 90029), obtendo-se como valor para CIM 0,169 μL/mL (12). Ressalta-se que as diferenças encontradas nos valores de CIM podem ser caracterizadas devido à utilização de espécies fenotipicamente diferentes de C. albicans.
A ação antimicrobiana do óleo essencial de C. cassia foi testada frente espécies bacterianas como Escherichia coli e Proteus mirabilis, sendo a CIM do óleo determinada nas concentrações 0,1 mg/mL e 0,001mg/mL, respectivamente (14). Desta forma, mesmo sendo estabelecida comparação entre espécies fúngicas e bacterianas, considerando suas diferenças estruturais como parede celular e metabolismo, constata-se atividade antimicrobiana do óleo essencial de C. cassia.
A composição química do óleo essencial de C. cassia pode explicar sua atividade antimicrobiana, devido à presença do cinanomaldeído (83,9%) e eugenol (0,4%), conhecidos por sua atividade antifúngica. A atividade antifúngica do referido óleo foi constatada pela literatura, frente a inibição do crescimento de hifas e esporos de A. niger (13). Observou-se que o óleo essencial, comparado a outras 74 amostras de óleos essenciais teve o melhor desempenho, relacionando-se os valores de halos de inibição das amostras, sendo inferior apenas ao óleo essencial de C. zeylanicum (13).
A atividade antifúngica do óleo essencial foi comprovada diante da determinação da CIM, bem como por meio da atividade sobre a cinética de inibição das leveduras. Observou-se que a CIM foi capaz de diminuir o crescimento das leveduras, sendo este efeito diretamente proporcional à concentração do óleo essencial. Dessa forma, demonstra-se que, para o ensaio de cinética, quanto maior a concentração do óleo essencial maior a atividade antifúngica. Sugere-se que estudos futuros possam comparar os possíveis mecanismos de ação do óleo essencial, sabendo-se que, devido ao seu caráter hidrofóbico, permitem interação com estruturas lipídicas, aumentando a permeabilidade celular, provocando danos irreversíveis à célula (19,20).
O gênero Candida é caracterizado por apresentar fungos leveduriformes, tendo em sua reprodução assexuada a formação de blastoconídeos, clamidoconídeos e pseudo-hifas (21). Estas estruturas são determinadas como estruturas de virulência deste gênero.
Estudos sobre as alterações morfológicas provocadas por óleos essenciais na micromorfologia fúngica ainda são escassos. Entretanto, observou-se que o óleo essencial de C. cassia foi eficiente na diminuição dos fatores de virulência da C. albicans de origem clínica e padrão. Da mesma forma que o ensaio de cinética, a atividade do óleo inibiu o crescimento de pseudohifas e clamidoconídeos, considerando-se a o efeito de inibição diretamente proporcional à concentração.
68
Sabe-se que a resistência aos produtos antifúngicos se deve a fatores do próprio paciente e sua interação com o patógeno e o medicamento; entretanto pode-se considerar a resistência in vitro e in vivo. A resistência in vitro pode ser observada a partir da interação entre o microrganismo e o fármaco, sendo verificadas transformações na morfologia microbiana, as quais levarão à resistência. A resistência in vivo pode estar relacionada ao teor do fármaco presente na corrente sanguínea e a ineficácia do medicamento (22). O presente estudo confronta a utilização do óleo essencial de C. cassia frente a cepas de origem padrão e clínica, de C. albicans, constatando que não há diferenças na resistência destes microrganismos ao uso do produto.
A realização de estudos mais específicos, como a atividade antifúngica sobre biofilme multiespécie de Candida, o qual engloba espécies com genótipos e fenótipos diferentes devem ser realizados a fim de determinar o comportamento do óleo essencial frente a outros microrganismos. Aliado a este estudo, outros devem ser realizados buscando o isolamento do princípio ativo do óleo essencial e assim formar suposições a cerca do mecanismo de ação do óleo essencial.
Conclusão Concluiu-se que o óleo essenial de C. cassia, semelhante ao miconazol,
apresentou atividade antifúngica e efeito sobre a cinética de morte microbiana, sendo observadas alterações na micromorfologia das cepas testadas.
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71
72
3. Considerações Gerais
Os fungos são microrganismos que constituem um grupo diversificado e
abundante na natureza. São caracterizados por estruturas unicelulares ou
multicelulares e classificados de acordo com sua morfologia em filamentosos,
leveduras e dimórficos. São seres eucarióticos, isto é, apresentam uma
membrana nuclear que envolve os cromossomos e o nucléolo. São
classificados como seres heterotróficos por não possuírem pigmentos
fotossintéticos (SIDRIM; ROCHA, 2004).
Dentre estes fungos destaca-se a Candida albicans, que é caracterizada
como uma levedura oportunista que invade áreas do corpo humano,
provocando infecções cutâneas e mucocutâneas (EZZAT, 2001). Na cavidade
bucal esta infecção, denominada de candidose oral, geralmente acomete
pacientes imuncomprometidos ou aqueles usuários de prótese dentária, que
não realizam higienização.
O diagnóstico de candidose oral apresenta-se como um preditor para
infecções pelo vírus do HIV, sendo considerado um marcador biológico desta
doença, em alguns casos. Desta forma, o isolamento de C. albicans de
pacientes portadores do vírus do HIV tem sido frequente (CORRÊA;
ANDRADE, 2006; GABLER et al., 2008; POZZATTI et al., 2008). Estudos
acerca da virulência das espécies de Candida são necessários, já que estão
inseridas na etiologia da candidose oral, pois Samaranayake (1992) afirmou
que 81 espécies do gênero Candida são identificadas, sendo a C. albicans a
mais prevalente.
O isolamento de Candida spp. da cavidade bucal não implica,
necessariamente, na ocorrência de infecções, sendo tal fato observado em
indivíduos saudáveis (SAMARANAYAKE; SAMARANAYAKE, 2001). A invasão
tecidual por C. albicans ocorre por meio da ativação da via de transdução de
sinal MAP (mitogen-activated protein) Kinase, ocorrendo interferências na
formação da parede celular, adaptação ao estresse osmótico e reprodução do
fungo (MONGE et al., 2006). Outras características conferem à levedura um
caráterpatogênico, como a formação de pseudohifas, concedendo às leveduras
um caráter de virulência, o qual é expresso pela C. albicans, sendo estas
73
estruturas que dificultam a fagocitose e assim permitem o estabelecimento da
espécie no tecido invadido (ROMANI; BISTONI; PUCETTI, 2003).
O tratamento medicamentoso da candidose oral inclui a utilização de
antifúngicos sintéticos sistêmicos dentre eles a Anfotericina B, outras
alternativas são os triazólicos (fluconazol, itraconazol e voriconazol). Como
tratamento tópico prescreve-se o uso do miconazol ou nistatina (PFALLER et
al., 2004). O tratamento medicamentoso da candidose oral, principalmente para
pacientes infectados pelo HIV, é feito por tempo prolongado, tal fato em
conjunto com a pouca disponibilidade de novas drogas aliado à pouca
disponibilidade de novos produtos desenvolvidos pela indústria farmacêutica
tem gerado a busca por conhecimento sobre a susceptibilidade dos fungos a
novas substâncias (WINGETER et al., 2007).
Além disto, o uso indiscriminado de agentes antifúngicos gera o
aparecimento de espécies resistentes à terapia convencional (BANSOD; RAI,
2008). Assim, tem-se estimulado a busca por novos fármacos que atuem de
forma eficiente, gerando os mesmos efeitos farmacológicos, entretanto sem a
adição da resistência microbiana ou efeitos tóxicos.
Outro fato a ser destacado é a necessidade de confirmação laboratorial
das espécies inseridas nos casos de candidose oral, entretanto tal manobra
não é realizada por muitos profissionais, desta forma não se conhece a
susceptibilidade das leveduras aos agentes antifúngicos, gerando assim
espécies resistentes. Desta forma, o presente estudo teve o objetivo de avaliar
a atividade antifúngica de óleos essenciais, extraídos de espécies vegetais
bem como determinar o comportamento de amostras de C. albicans isoladas
de pacientes HIV positivos frente aos produtos avaliados.
Na odontologia, os produtos naturais tem sido usados como agentes
antiinflamatórios, antibióticos, analgésicos, sedativos e em tratamentos como o
endodôntico, atuando como soluções irrigadoras (GROPPO et al., 2008).
Muitas espécies vegetais apresentam potencial para novas terapias
odontológicas, entretanto a maioria dos estudos são iniciais, in vitro, notando-
se a necessidade de estudos in vivo que demonstrem o baixo potencial tóxico e
efeito farmacológicos destes produtos (GROPPO et al., 2008).
74
Os óleos essenciais são misturas complexas, extraídos de espécies
vegetais, sendo sintetizados e armazenados em algumas estruturas das
plantas como os idioblastos ou tricomas glandulares. As condições ambientais
podem alterar a concentração dos princípios nos óleos essenciais
(GONÇALVES et al., 2003). Os constituintes químicos desses óleos aromáticos
variam desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples, fenóis, aldeídos,
éteres, ácidos orgânicos, ésteres, cetonas, lactonas, cumarinas, até compostos
contendo nitrogênio e enxofre (SIMÕES et al., 2004; GAYOSO et al., 2005 ).
Estudos avaliaram a atividade antifúngica de óleos essenciais frente a C.
albicans, utilizando como técnica a difusão em ágar, assim determinaram a
presença ou ausência da atividade antifúngica de alguns óleos essenciais
(BARBARO, STELATO, 2009; PAWAR, THAKER, 2006; CAVALCANTI;
ALMEIDA; PADILHA, 2011). É válido destacar que esta metodologia serve
como uma triagem (screening) da ação do produto, assim não determina em
qual concentração obtêm-se uma melhor atividade antimicrobiana, já que na
maioria dos estudos, realiza-se tal teste com o produto natural em sua
formulação pura.
O objetivo inicial do presente estudo foi avaliar a atividade antifúngica
dos óleos essenciais de Ocimum basilicum (manjericão), Cymbopogon martinii
(palmarosa), Cyperus articulatus (piprioca), Thymus vulgaris (tomilho branco) e
Cinnamomum cassia (canela da china) frente cepas de C. albicans isoladas de
pacientes HIV positivos e cepa padrão (ATCC 76485). Utilizou-se a técnica da
difusão em ágar, sendo a atividade antifúngica avaliada por meio da medição
dos halos de inibição dos óleos frente às cepas. Do estudo conclui-se que O.
basilicum, C. martinii, T. vulgaris e C. cassia apresentaram ação antifúngica
frente às cepas testadas, corroborando com estudos realizados por Barbaro;
Stelato (2009), Duarte et al. (2005) e Giordani et al.(2006).
Assim, observou-se que quatro dos cinco óleos essenciais triados
apresentaram atividade antifúngica, entretanto este resultado não foi
conclusivo, pois a metodologia utilizada requer o emprego do meio de cultura
sólido, o qual pode impedir a difusão do óleo essencial que é hidrófobo, sendo
caracterizado como um teste de baixa sensibilidade (ALLEN; MOLAN; REID,
1991), entretanto de fácil execução e baixo custo.
75
Assim, após a triagem da atividade antifúngica determinou-se a
Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos óleos essenciais de O. basilicum, C.
martinii, T. vulgaris e C. cassia frente às cepas clínicas e padrão de C.
albicans. Para tal ensaio foram testadas concentrações que variaram entre
1024 µg/mL e 4µg/mL, de acordo com proposto por Ellof (1998). Empregou-se
a metodologia da microdiluição em caldo, sendo a CIM designada a menor
concentração capaz de inibir o crescimento fúngico, no meio de cultura líquido
(CASTRO; LIMA, 2010).
Os resultados do teste de microdiluição demonstraram que os óleos
essenciais de T. vulgaris e O. basilicum não apresentaram atividade inibitória
nas concentrações avaliadas. Alguns estudos apresentaram atividade
antimicrobiana dos óleos essenciais de T. vulgaris e O. basilicum
(SARTORATO et al., 2004; DUARTE et al., 2005), entretanto deve-se destacar
que a composição dos óleos essenciais podem variar de um ambiente para
outro de acordo com a disponibilidade de água no solo e condições climáticas
(FREIRE et al., 2006).
Já os óleos essenciais de C. martinii e C. cassia apresentaram valores
de CIM variando entre 1024 e 256µg/mL e 128 e 64µg/mL, respectivamente.
Estes dados confirmam alguns estudos encontrados na literatura (PRASHAR et
al., 2003; DUARTE et al., 2005; GIORDANI et al., 2006). Assim, constatou-se
que a composição do óleo essencial pode interferir em sua atividade
antifúngica, bem como a forma de coleta do material vegetal e critérios
climáticos.
Dentre os óleos essenciais avaliados o de C. cassia foi o mais efetivo
frente às cepas de C. albicans isoladas de pacientes HIV positivos e padrão
(ATCC 76485). Assim, este óleo foi selecionado para a realização dos testes
de cinética sobre a curva de morte das leveduras e alterações sobre a
micromorfologia fúngica.
Devido à escassez de estudos que tratem sobre o comportamento de
produtos com ação antifúngica sobre a curva de morte microbiana, avaliamos
que o presente estudo apresenta-se pioneiro, já que a atividade antifúngica do
óleo essencial de C. cassia, até então, havia sido avaliada apenas por meio da
determinação da CIM, sem ser verificado o impacto do tempo de ação e
76
concentração do produto frente às leveduras. Diante disto, constatou-se que na
CIM, o óleo essencial de C. cassia foi capaz de diminuir o crescimento das
leveduras, sendo este efeito diretamente proporcional à concentração do óleo
essencial.
No presente estudo foi investigada a atividade antifúngica do óleo
essencial de C. cassia e as alterações na micromorfologia das cepas de C.
albicans, observando-se que a presença de clamidoconídeos e pseudohifas foi
alterada pelo uso do óleo essencial já na CIM. Estas estruturas conferem
virulência às cepas sendo relatado por Sidrim; Rocha (2004) que os fungos
leveduriformes, tendo em sua reprodução assexuada a formação de
blastoconídeos, clamidoconídeos e pseudo-hifas
Diante do exposto verifica-se que os óleos essências de C. martinii e C.
cassia obtiveram atividade antifúngica desejável tendo o segundo um efeito
superior. Assim verifica-se que novos estudos, in vitro ou ensaios clínicos,
incorporando a utilização de metodologias que busquem o isolamento dos
fitoconstituintes, atividade antifúngica sobre espécies não albicans sejam
realizados a fim de obter-se maiores conhecimentos acerca do uso do óleo
essencial de C. cassia como eficiente agente antifúngico.
77
78
4. Conclusões
Os óleos essenciais de Cyperus articulatus (piprioca), Thymus vulgaris
(tomilho) e Ocimum basilicum (manjericão) não apresentaram atividade
inibitória sobre o crescimento das cepas de C. albicans isoladas de
pacientes HIV positivos;
Os óleos essenciais de Cymbopogon martinii (palmarosa) e
Cinnamomum cassia (canela) apresentaram CIM dentro das
concentrações analisadas;
O óleo essencial de C. cassia apresentou atividade antifúngica sobre a
curva de morte microbiana das amostras clínica e padrão de C. albicans;
O óleo essencial de C. cassia promoveu alterações na micromorfologia
fúngica das cepas de C. albicans clínica e padrão.
79
80
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90
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
NORMAS PARA DEFESA DA DISSERTAÇÃO
1. Formato Alternativo
Capa
Folha de rosto (primeira folha interna)
Ficha catalográfica (verso da folha de rosto)
Folha de aprovação
Dedicatória (Opcional)
Agradecimentos (Opcional)
Epígrafe (Opcional)
Resumo
Abstract
Lista de Abreviaturas e Siglas (Opcional)
Sumário
Introdução (trata-se da parte inicial do texto, de formulação clara e simples do tema investigado, constando a delimitação do assunto tratado, sua justificativa e objetivos da pesquisa)
Capítulos (devem ser inseridos as cópias de artigos de autoria ou co-autoria do candidato, já publicados ou submetidos para publicação em revistas científicas ou anais de congresso sujeitos a arbitragem. Cada capítulo deve conter sua indicação, seguido do número (em arábico) Ex. Capítulo 1, Capítulo 2 e assim sucessivamente)
Discussão ou Considerações Gerais (esta parte deve conter argumentos para estabelecer relações entre os artigos apresentados nos capítulos)
Conclusão
Referências (não devem ser inseridas as referências já relacionadas nos trabalhos apresentados nos capítulos)
Apêndice (Opcional)/ Anexos (Opcional)
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