rosimeire nunes de oliveirarepositorio.unicamp.br/bitstream/reposip/321644/1/...amor, pelo afeto,...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

Rosimeire Nunes de Oliveira

Atividade do Óleo essencial, Frações e Sesquiterpenos de

Baccharis trimera (Less) sobre Schistosoma mansoni

Activity of Baccharis trimera (Less) Essential oil, Fractions

and Sesquiterpenes on Schistosoma mansoni.

Campinas

2016

Rosimeire Nunes de Oliveira

Atividade do Óleo essencial, Frações e Sesquiterpenos de Baccharis trimera (Less) sobre Schistosoma mansoni

Activity of Baccharis trimera (Less) Essential oil, Fractions and

Sesquiterpenes on Schistosoma mansoni.

Campinas

2016

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Animal, área de concentração: Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia.

Thesis presented to the State University of Campinas-Unicamp, Biology Institute of University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Animal Biology, area of concentration:

Anthropic Relations, Environment and Parasitology.

Este arquivo digital corresponde à versão final da Tese de Doutorado defendida por Rosimeire Nunes de Oliveira, e orientada pela Profa. Dra. Silmara Marques Allegretti.

Campinas, 11 de Fevereiro de 2016

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof.(a) Dr.(a) Silmara Marques Allegretti

Prof.(a) Dr.(a) Danilo Ciccone Miguel

Prof.(a) Dr.(a) Marcos José Salvador

Prof.(a) Dr.(a) Tarsila Ferraz Frezza

Prof.(a) Dr.(a) Fernanda Janku Cabral Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

Dedicatória

Dedico esta Tese a minha mãe, Josefa. Meu maior exemplo de Amor, Dedicação e Fé!

Obrigada por todas orações dedicadas a mim, pelas palavras, pelos conselhos, pelo Amor, pelo Afeto, por me ensinar a ser cada dia mais forte e não me deixar

desistir nos momentos em que me senti fraca. Se não fosse por você, Mãe, eu não estaria aqui realizando este sonho!

Te amo, minha vida!

Agradecimentos

À Capes pelo suporte financeiro por intermédio da Bolsa de estudos no Brasil e no

Exterior.

Ao CNPq pelo suporte financeiro para realização deste projeto por meio da Chamada MCTI/Cnpq/MS-SCTIE-DECIT. Pesquisa em Doenças Negligenciadas. Processo: 40.4134/2012-2.

Ao Instituto de Biologia e a Coordenação e Comissão da Pós-Graduação em

Biologia Animal, em nome da Profa. Dra. Silmara Marques Allegretti, Profa. Dra.

Regina Maura Bueno Franco, Profa. Dra. Fosca Pedini, pela assistência prestada.

Agradeço a Deus pelo dom da vida, pela proteção, sabedoria e Fé nos momentos

em que mais precisei de coragem!

À minha orientadora, Profa. Dra. Silmara Marques Allegretti, por me acolher de

braços abertos, pela primorosa orientação e oportunidade de conhecer o mundo

científico. Obrigada pela confiança, respeito, carinho, apoio e acima de tudo, sua

amizade. Obrigada por me oferecer inúmeras oportunidades que tanto contribuíram

para a minha formação profissional e pessoal, sobretudo no sentido de refletir sobre os

próximos passos e tomada de decisões. Agradeço ainda por saber conduzir todas as

situações e imprevistos ocorridos durante esta caminhada de forma tão humana.

Obrigada por ser essa pessoa tão especial, pela qual tenho imensa admiração e respeito.

Expresso minha eternamente gratidão por tudo! Você é INCRÍVEL!

Aos membros da banca examinadora, pelas importantes considerações e sugestões,

as quais me auxiliaram a aprimorar este estudo.

À Profa. Dra. Vera Garcia, pela amizade e ensinamentos sobre Química orgânica.

À Profa. Dra. Veronica Sierpe Jeraldo, pelos primeiros conhecimentos em

Parasitologia na Graduação, e por ter sido o elo para a realização deste sonho. Serei

eternamente grata por acreditar em mim desde o primeiro momento, por sempre estar

ao meu lado torcendo por cada vitória alcançada!

À Profa. Dra. Marlene Tiduko Ueta, (minha “vovozinha” científica) que sempre

esteve disponível para me ajudar e esclarecer dúvidas com seus valiosos conhecimentos

em todos os momentos que precisei, além de adocicar meus dias de experimentos com

deliciosos chocolates!!!

Meu singelo agradecimento ao Prof. Dr. Danilo Ciccone Miguel que, desde sua

chegada ao Departamento de Biologia Animal, sempre se mostrou prestativo

contribuíndo com sugestões e conhecimentos importantes para melhoria desta Tese.

Obrigada por sempre me escutar e me aconselhar, principalmente nesta etapa final.

Você tornou-se um grande amigo! Conte comigo para sempre!!

À Profa. Dra. Mara Cristina Pinto, pelas sugestões no exame prévio e pela ajuda,

em todos os momentos que sempre precisei, muito obrigada!

À Profa. Dra. Ana Afonso, pela ajuda e colaboração para realização do meu

Doutorado Sanduíche no Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT) em Lisboa,

Portugal.

Às Profas. Dra. Manuela Calado e Silvana Belo, pela supervisão e ajuda durante o

Doutorado Sanduíche no IHMT.

Ao Dr. Pedro Ferreira, um grande amigo que o Doutorado sanduíche me deu de

presente. Obrigada por compartilhar sua sala comigo, pela ajuda, pelos conselhos, pelos

cafés e almoços em sua companhia. Ah! Obrigada por me apresentar os Fados!

Aos meus pais, Josefa Nunes e Antônio Nunes pelo exemplo de amor, dedicação e

formação dos meus princípios. Obrigada pela educação e pela alegria de estar aqui hoje.

Aos meus irmãos (as), sobrinhos (as), cunhados (as). Incontáveis foram as vezes que

meu cansaço, preocupação e saudade foram compartilhados com vocês. Obrigada por

sempre estarem ao meu lado, procurando amenizar minha ansiedade, mantendo-me

firme diante dos obstáculos diários, em uma união familiar que me incentivava a

prosseguir... O momento que vivo agora é único, e só existe porque vocês se doaram e

aceitaram viver comigo a busca deste sonho. Meu eterno obrigado! Amo vocês!

Agradeço aos amigos (as) da Unicamp que cativei nesta incrível experiência e

vivência. Em especial, todos (as) que fazem e fizeram parte do Laboratório de

Helmintologia, Sheila Correia (Sheiloca), Júlia Molina (Moli), Maria Francisca (Kika),

Eliana Camargo (Eli), Vanessa Perdigão, César Prado, Tiago Mendes, Maria Isabel

(Bella), Paula Berna (Paulete), Michelle Viviane (Mi), Tarsila Frezza (Ervilha) e

Claudineide Oliveira (Zefa), por todos os momentos compartilhados durante esta

caminhada, pelos momentos de descontração, risadas e até os de estresse (rs) todos

ficarão guardados!

Agradeço de modo especial a Karina Rodrigues (Magrela) aluna SAE, que teve

participação fundamental para conclusão deste trabalho com esforço e dedicação em

todos os experimentos realizados. Sem você, tudo ficaraia mais difícil, “Magrela”!

Obrigada por tudo!

Aos ex-técnicos do Laboratório de Helmintologia, João Batista (Jones) e Letícia

Duart (Lê), que me acolheram desde minha chegada à Unicamp em 2010, me

ensinando as principais técnicas parasitológicas e histológicas. Obrigada pela amizade,

apoio e carinho.

Ao amigo Nilson Branco por sempre se fazer prestativo nos momentos em que

precisei, principalmente nesta etapa final, tentanto recuperar os arquivos perdidos...

Obrigada pelo carinho e amizade, Nilson!

A todos que fazem parte da Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica do

CPQBA, em especial, Adriana S. Santos Oliveira (Dri) e Sinésio Ventura (Si), pelo

auxílio na obtenção das amostras e análises cromatográficas, além da amizade.

As meninas do Laboratório de Micrsocopia Eletrônica de Varreduda, Adriane

Sprogis (Dri), Stella Ferraz e Ana Floriana pelo suporte, prontidão e pelos chazinhos no

final das análises no MEV.

As amigas (o) que a vida me deu de presente, Daniela Felix (Dani), Denise Aquino

(Dê), Cintya Wink, Natália Oliveira, Grasiele Jorge, Mariana Ricken e Julio Miné

(“Curicença”), que sempre estiveram disponíveis para me ouvir, me aconselhar e

compartilhar momentos juntos. Quero vocês sempre perto, meus queridos!

Enfim, a todos que contribuíram direta e indiretamente para a conclusão deste trabalho, expresso minha gratidão, muito obrigada!

“Não há nada como regressar a um lugar que está igual, para descobrir o quanto você mudou”

(Nelson Mandela).

Resumo

A esquistossomose é uma infecção parasitária negligenciada que afeta, principalmente, populações de países tropicais em desenvolvimento. As diretrizes dos programas de controle das helmintíases preconizam o tratamento em massa utilizando o praziquantel (PZQ). Contudo, o emprego deste fármaco em larga escala pode desencadear o aparecimento de resistência sobre Schistosoma sp. Nesse sentido, o estudo de espécies vegetais conduz uma alternativa promissora com expectativa de obtenção de um fitofármaco para tratamento e controle da doença. Neste trabalho, realizou-se um estudo fitoquímico por meio do fracionamento e identificação de substâncias do óleo essencial (OE) de Baccharis trimera e avaliou-se o efeito das amostras contra vermes adultos de Schistosoma mansoni por meio de ensaios in vitro, utilizando sondas fluorescentes específicas a fim de identificar possíveis sítios de ação sobre o sistema excretor e integridade de membrana de S. mansoni. Além disso, avaliou-se, in vivo, o efeito do OE e substâncias identificadas, em diferentes estágios de desenvolvimento do parasita. Os resultados fitoquímicos evidenciaram que o OE de B. trimera apresenta substâncias da classe monoterpenos e sesquiterpenos, porém, maiores percentagens de sesquiterpenos. Em relação aos estudos in vitro, observou-se que as amostras avaliadas influenciaram na motilidade dos vermes, suprimiram a oviposição em todas concentrações avaliadas e ocasionaram a mortalidade dos vermes machos e fêmeas entre 06 e 24 horas de incubação. Em relação as análises morfológicas dos parasitas, realizadas por meio da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), observou-se que os tratamentos ocasionaram alterações no tegumento dos vermes machos e fêmeas, após 24 horas de incubação na concentração de 100 µg/mL, caracterizadas pela descamação, perda dos tubérculos e espinhos, contração muscular, enrugamento corporal, além de alterações nas ventosas oral e acetabular em ambos os sexos do parasita. Adicionalmente, observou-se que os sesquiterpenos, alfa-humuleno e trans-cariofileno, influenciaram na expressão da P-glicoproteina (PgP) dos vermes machos, marcados com Resorufin. Observou-se também que estes tratamentos ocasionaram alterações na integridade da membrana dos vermes machos e fêmeas, após marcação com Hoechst 33258. Em relação aos estudos in vivo, observou-se que a associação entre OE+PZQ, potencializou a atividade do PZQ sobre as formas imaturas de S. mansoni. Entretanto, para os tratamentos realizados em dose única (100 mg/kg), observou-se maiores reduções da carga parasitária dos animais tratados com OE, alfa-humuleno e espatulenol, contra as fases - esquistossômulos e vermes jovens- de S. mansoni. Além disso, observou-se uma redução significativa de ovos eliminados nas fezes, alterações no oograma, evidenciando parada de oviposição após a administração dos tratamentos na fase pré-postural da esquistossomose. Finalmente, se observou redução do número e tamanho dos granulomas hepáticos, bem como redução do infiltrado inflamatório, evidenciando, desta forma, o efeito hepatoprotetor de B. trimera e os efeitos antiiflamatório e imunomodulador dos sesquiterpenos alfa-humuleno, trans-cariofileno e espatulenol. Os resultados obtidos neste estudo, evidenciam o efeito terapêutico de B. trimera contra diferentes estágios de desenvolvimento do S. mansoni.

Palavras-Chaves: Baccharis trimera, Óleo essencial, Sesquiterpenos, Schistosoma mansoni, Tratamento.

Abstract

Schistosomiasis is a neglected disease parasitic that primarily affects populations in tropical developing countries. Helminth control programs recommend mass treatment using praziquantel (PZQ). However, the use of this drug on a large scale may result in the development of PZQ resitance in Schistosoma sp. Thus, the usage of natural products may lead to promising drug alternatives for treatment and control of schistosomiasis. In this work, we performed a phytochemical study through fractionation and identification of substances of essential oil (OE) of Baccharis trimera and evaluated the samples effect against adult worms through in vitro assays, using specific fluorescent probes to identify possible sites of action on the excretory system and integrity membrane of S. mansoni. In addition, we assessed the in vivo effect of OE and identified substances against different parasite development stages. The phytochemicals results showed that the EO of B. trimera presents monoterpene substances and higher percentages of sesquiterpenes substances. Regarding the in vitro studies, all samples affected the worms motility, oviposition was suppressed in all tested concentrations and caused the death of male and female worms, between 06 and 24 hours of incubation respectively. In the Scanning Electron Microscopy (SEM) studies, alterations on S. mansoni adult males and females were observed after 24h in vitro incubation at 100 µg/mL concentration. The treatments caused tegument changes, contraction, peeling of spines and tubercles, blebs between tubercles and changes in oral and ventral suckers. Additionally, it was observed that the, alpha- humulene and trans-caryophyllene, sesquiterpenes influenced male worms P-glycoprotein expression, marked with Resorufin probe. It was also observed that such treatments cause changes in membrane integrity of both male and female worms after marked with Hoechst 33258 probe. The in vivo studies, showed an association between OE + PZQ, increasing PZQ activity on the immature stages of S. mansoni. However, the in vivo oral treatments performed in a single dose of 100 mg/kg, reduced the worm burden of the treated mice, showing the effect of treatments with pure essential oil, alpha-humulene and spathulenol against schistosomula and juveniles worms of S. mansoni. Furthermore, there was a significant reduction in eggs eliminated in the feces, changes in oogram, showing no oviposition when administrated in the pre-postural phase of schistosomiasis. Finally, there was a reduction in the number and size of hepatic granulomas, and a reduction of inflammatory infiltrate, showing, thus, the hepatoprotective effect of B. trimera and anti-inflammatory and immunomodulatory effect of sesquiterpenes alpha-humulene, trans-caryophyllene and spathulenol. The results obtained in this study show the therapeutic effect of B. trimera against different developmental stages of S. mansoni. Key Words: Baccharis trimera, Essential oils, Sesquiterpenes, Schistosoma mansoni, Treatment.

Lista de Figuras

Figura 1: Distribuição mundial da esquistossomose. WHO, 2015........................................................ 18

Figura 2: (A) Prevalência da esquistossomose no Brasil no período de 2005 a 2009; (B) Distribuição da prevalência média de risco de infecção por esquistossomose no Brasil em 2014. Scholte et al., 2014................................................................................................................................

19

Figura 3: Estágios de desenvolvimento do S. mansoni........................................................................ 26

Figura 4: Ciclo Biológico do Schistosoma mansoni.............................................................................. 27

Figura 5: Fórmula molecuar do praziquantel........................................................................................ 30

Figura 6: Baccharis trimera ( Less) DC. Cultivar do CPQBA................................................................ 35

Figura 7: Obtenção do óleo essencial a partir das folhas frescas da B. trimera através do sistema de hidrodestilação..................................................................................................................................

42

Figura 8: Obtenção das frações de OE por coluna clássica. (A) - Obtenção das frações em tubos de ensaios (B) – eluição final em erlenmeyer de 250 mL (DQOF). Fonte: arquivo pessoal.

43

Figura 9 Fórmulas moleculares dos sesquiterpenos e sondas flurescentes........................................ 45

Figura 10: (A) alteração do órgão interno na região anterior da fêmea;(B) -alterações na ventosa oral e descamação do tegumento do verme macho e fêmea ...............................................................

48

Figura 11: Esquema dos grupos experimentais nos diferentes períodos dos tratamentos. (n=10 animais para cada período de tratamento.............................................................................................

51

Figura12: Esquema de infecção, períodos dos tratamentos, perfusão e análise dos camundongos........................................................................................................................................

51

Figura 13: Fluxograma dos rendimentos das frações (FCS1, FCS2 e FCS3) obtidas a partir de 1g do óleo essencial de B. trimera por coluna cromatográfica do tipo seca (CS)......................................................................................................................................................

56

Figura 14: Fluxograma dos rendimentos das frações (FCC1 a FCC11), obtidas a partir de 1g do óleo essencial de B. trimera por coluna cromatográfica do tipo clássica (CC)......................................................................................................................................................

56

Figura 15: Perfil cromatográfico do OE e frações obtidas por coluna cromatográfica do tipo seca (CS), revelando substâncias de diferentes polaridades. Eluente: CH2Cl2 (97:3 v/v) e revelador anisaldeído............................................................................................................................................

57

Figura 16: Perfil cromatográfico das frações obtidas por coluna cromatográfica do tipo clássica (CC), revelando substâncias de diferentes polaridades. Eluente: CH2Cl2 (97:3 v/v) (97:3 v/v) e revelador anisaldeído............................................................................................................................

58

Figura 17: Cromatograma do Óleo essencial de B. trimera obtido por CG- EM. Onde foram identificadas substâncias pertencentes a classe dos terponóides, monoterpenos e sesquiterpenos.....................................................................................................................................

61

Figura 18: Cromatograma da fração FCS1 obtida por Coluna Cromatográfica Seca (CS) e analisada por CG- EM. Foram identificadas semelhanças com o perfil químico do OE entre os índices de retenção de monoterpenos e de sesquiterpenos.................................................................

61

Figura 19: Cromatograma da fração FCS2 obtida por Coluna Cromatográfica Seca (CS) e analisada por CG- EM. Onde foram identificados menores índice de retenção de monoterpenos e maiores índicies de sesquiterpenos.....................................................................................................

62

Figura 20: Cromatograma da fração FCS3 obtida por Coluna Cromatográfica Seca (CS) e analisada por CG- EM. Onde foram identificados menores índices de retenção de monoterpenos e maiores índicies de sesquiterpenos......................................................................................................

62

Lista de Figuras

Figura 21: Cromatograma da fração FCC1 obtida por Coluna Cromatográfica Clássica (CC) e analisada por CG- EM. Onde foram identificados maior índice de retenção de sesquiterpenos com maior % relativa de trans- cariofileno....................................................................................................

63

Figura 22: Cromatograma da fração FCC5 obtida por Coluna Cromatográfica Clássica (CC) e analisada por CG- EM. Onde foram identificados maior índice de retenção sesquiterpenos com maior % relativa de alfa-humuleno.......................................................................................................

63

Figura 23: Cromatograma da fração FCC6 obtida por Coluna Cromatográfica Clássica (CC) e analisada por CG- EM onde foram identificados maior índice de retenção de Sesquiterpenos....................................................................................................................................

64

Figura 24: Cromatograma da fração FCC7 obtida por Coluna Cromatográfica Clássica (CC) e analisada por CG- EM onde foram identificados maior índice de retenção de sesquiterpenos......................................................................................................................................

64


65

Figura 26: Cromatograma da fração FCC9 obtida por Coluna Cromatográfica Clássica (CC) e analisada por CG- EM. Onde foram identificados maior índice de retenção de sesquiterpenos com maior % relativa de espatulenol............................................................................................................

65


66

Figura 28: Efeito do Óleo essencial de B. trimera (A) alfa-humuleno (B) trans-cariofileno (C) sobre a taxa de mortalidade dos vermes adultos de S. mansoni em relação à concentração avaliada e período de incubação de 72 horas. Controle farmacológico exposto a 10 µg/mL de PZQ......................................................................................................................................................

82

Figura 29: Efeito das frações (A) FCS1; (B) FCS2 e (C) FCS3, obtidas por Coluna Seca (CS) sobre a taxa de mortalidade dos vermes adultos de S. mansoni em relação à concentração avaliada e período de incubação de 72 horas. Controle farmacológico exposto a 10 µg/mL de PZQ......................................................................................................................................................

82

Figura 30: Efeito das frações (A) FCC1; (B) FCC5; (C) FCC6 e (D) FCC7, obtidas por Coluna Clássica (CC) sobre a taxa de mortalidade dos vermes adultos de S. mansoni em relação à concentração avaliada e o período de incubação de 72 horas. Controle farmacológico exposto a 10 µg/mL de PZQ......................................................................................................................................

83

Figura 31: Efeito das frações (A) FCC 8; (B) FCC 9; (C) FCC 10, obtidas por Coluna Clássica (CC) sobre a taxa de mortalidade dos vermes adultos de S. mansoni em relação à concentração avaliada e o período de incubação de 72 horas. Controle farmacológico exposto a 10 µg/mL de PZQ.......................................................................................................................................................

83

Figura 32: S. mansoni adultos após incubação com alfa-humuleno, transcariofileno e PZQ, marcados com Resorufin. (A) Verme fêmea exposta a 200 µg/mL de alfa-humuleno durante 4 horas, mostrando a atividade excretora normal através dos ductos excretores na região posterior do verme; (B) Verme macho exposto a 200 µg/mL de alfa-humuleno durante 4 horas, mostrando a atividade excretora bloqueada ; (C) Verme fêmea exposta a 200 µg/mL de trans-cariofileno mostrando intensa atividade do sistema excretor no ducto principal e ramificações; (D) Verme macho exposto a 200 µg/mL de trans-cariofileno durante 4 horas, mostrando a difusão de resorufin e atividade excretora bloqueada na região posterior do verme; (E) Verme fêmea exposta a 2 µg/mL de PZQ durante 15 min, apresentando uma contração muscular, porém com atividade do sistema excretor (F) Verme macho exposto a 2µg/mL de PZQ durante 15 min , mostrando a difusão de Resorufin e ausência da atividade excretora em toda extrenção corporal; (H e F) Verme fêmea e macho do grupo controle, marcados apenas com Resorufin apresentando atividade normal do sistema excretor nos ductos laterais na porção mediana e posterior, respectivamente. (tp)- tubo principal..............................................................................................................................

85

Lista de Figuras

Figura 33: S. mansoni adultos marcados com Hoechst, após incubação com alfa-humuleno, trans-cariofileno e PZQ. (A) Verme fêmea exposta a 200 µg/mL de alfa-humuleno durante 4 horas; (B) Verme macho exposto a 200 µg/mL de alfa-humuleno durante 4 horas; (C) Verme fêmea exposta a 200 µg/mL de trans-cariofileno (D) Verme macho exposto a 200 µg/mL de trans-cariofileno durante 4 horas (E) Verme fêmea exposta a 2 µg/mL de PZQ durante 15 min, (F) Verme macho exposto a 2 µg/mL de PZQ durante 15 min (H e F) Verme fêmea e macho do grupo controle, marcados apenas com Hoechst. .......................................................................................................................................

87

Figura 34: Vermes adultos de S. mansoni (grupo controle) mantidos em meio RPMI- 1640 sem adição de fármacos por 24 horas. (A e B) - Vermes fêmeas; (C e D) - vermes machos, apresentando morfologia íntegra. (TG) - tegumento, (VO) - ventosa oral; (VA) - ventosa acetabular; (ES) - espinhos; (CG) - canal ginecóforo.............................................................................................

90

Figura 35: Vermes adultos de S. mansoni (grupo controle farmacológico) expostos a 10 µg/mL de PZQ por 24 horas. (A) Casal de vermes contraídos com alterações no tegumento; (B) - verme fêmea apresentando contração muscular (C) - verme macho, apresentando contração muscular e peeling do tegumento; (D) -Tegumento do verme macho apresentando perda de tubérculos e espinhos...............................................................................................................................................

91

Figura 36: Vermes expostos a 100 µg/mL da fração FCS3 - obtidas por coluna cromatográfica seca (CS). (A e B) – vermes fêmeas. As setas indicam alterações na ventosa oral (VO); descamação do tegumento e enrugamento em algumas regiões do corpo; (C e D) - Casal de vermes adultos e verme macho. As setas indicam a perda de tubérculos e espinhos, resultando em áreas lisas no corpo do verme, além do enrugamento no corpo do verme fêmea.....................................................................................................................................................

91

Figura 37: Vermes expostos a 100 µg/mL da fração (FCC6) - obtidas por cromatografia de coluna clássica (CC), enriquecida de alfa- humuleno. (A e B) - vermes fêmeas. As setas indicam alterações no corpo do verme, caracterizada pelo enrugamento em toda extenção do corpo. Além disso, observa-se alterações na ventosa; (C e D) - vermes machos. As setas indicam a desprendimento do tegumento, resultando na perda dos espinhos desta superfície...............................................................................................................................................

92

Figura 38: Vermes expostos a 100 µg/mL da fração (FCC7) - obtidas por (CC) enriquecida de trans-cariofileno. (A e B) vermes fêmeas. As setas indicam o desprendimento do tegumento, além da presença de “ sulcos” na região dorsal do verme (C e D) vermes machos. As setas indicam alterações no tegumento, caracterizada pela perda de tubérculos e espinhos da região anterior e dorsal do verme....................................................................................................................................

92

Figura 39: Vermes expostos a 100 µg/mL da fração (FCC9) - obtidas por cromatografia de coluna clássica (CC) enriquecida de espatulenol. (A e B) - vermes fêmeas. As setas indicam errugamento e leve contração do corpo do verme, além de alterações (retração) da ventosa acetabular. (C e D) vermes machos. As setas indicam descamação do tegumento, resultando em áreas lisas da superfície do corpo do verme...............................................................................................................

Figura 40: Vermes rescuperados após 48 horas do tratamento in vivo em dose única (100 mg/kg) de trans-cariofileno (A e B) - vermes fêmeas. As setas indicam regiões do corpo do verme com “ondulações e “sulcos”, além da retração da ventosa acetabular e contração do corpo do verme. (C e D) - verme macho. As setas indicam alterações no tegumento, caracterizada pela perda de tubérculos e espinhos de protuberâncias na região ventral do corpo.................................................................................................................................................... Figura 41: Vermes rescuperados após 48 horas do tratamento in vivo em associação OE+PZQ (100 + 40 mg/kg). (A e B) vermes fêmeas. As setas indicam contração da musculatura, retração da ventosa acetabular e descamação do tegumento. (C e D) vermes machos. As setas indicam a perda de tubérculos e espinhos, evidenciando uma redução de tamanho dos tubérculos e protuberâncias na superfície dorsal do corpo, além de alterações caracterizada pela retração da ventosa oral e acetabular (E e F) - vermes do grupo controle, mostrando a morfologia normal do verme macho e fêmea.........................................................................................................................

93

Figura 42: Total de vermes recuperados no sistema porta-hepático e Taxas de redução de vermes após análises dos tratamentos adimistrados em dose única (100 mg/kg) e associação entre OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 7 dpi – contra esquistossômulos. Diferenças estatísticas em relação

94

93

Lista de Figuras

ao grupo controle: OE+PZQ (p< 0,0001***); OE (p˂0,001***); alfa-humuleno (p˂ 0,0001***); trans-cariofileno (p˂ 0,01*); PZQ+PZQ (p< 0,01*); PZQ (p< 0,05*).............................................................

100

Figura 43: Total de vermes recuperados no sistema porta-hepático e Taxas de redução de vermes após análises dos tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação entre OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 21 dpi – contra vermes jovens. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE+PZQ (p< 0,0001***); trans-cariofileno (p˂ 0,0001***); espatulenol (p< 0,0001***); OE (p˂0,001***); alfa-humuleno (p˂0,001**); PZQ (p<0,01*); PZQ+PZQ (p< 0,05*)....................................................................................................................................................

101

Figura 44: Total de vermes recuperados no sistema porta-hepático E Taxa de redução de vermes após análises dos tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação entre OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 56 dpi – contra vermes jovens. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE+PZQ (p< 0,0001***); espatulenol (p<0,0001***); alfa-humuleno (p˂ 0,0001***); OE (p˂0,0001***); trans-cariofileno (p˂0,001**); PZQ (p<0,05*); PZQ+PZQ (p< 0,001**)...............................................................................................................................................

102

Figura 45: Total de casais, machos e fêmeas recuperados no sistema porta-hepático, após análises dos tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 7 dpi – contra esquistossômulos. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE (p˂0,0001***); OE+PZQ (p<0,0001***); trans-cariofileno (p˂0,0001*); alfa-humuleno (p˂ 0,001**); PZQ+PZQ (p< 0,01*); PZQ (p< 0,01*)..........................................................................

104

Figura 46: Total de casais, machos e fêmeas recuperados no sistema porta-hepático, após análises dos tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 21 dpi – contra vermes jovens. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE (p˂0,0001***); OE+PZQ (p< 0,0001***); espatulenol (p< 0,0001***); alfa-humuleno (p˂ 0,001**); trans-cariofileno (p˂0,0001***); PZQ (p<0,01*) PZQ+PZQ (p< 0,05*)....................................................................................................................................................

105

Figura 47: Total de casais, machos e fêmeas recuperados no sistema porta-hepático, após análises dos tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 56 dpi – contra vermes jovens. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE+PZQ (p< 0,0001***); OE (p˂0,0001***); alfa-humuleno (p˂ 0,0001***); trans-cariofileno (p˂0,001**); PZQ+PZQ (p< 0,001**); espatulenol (p< 0,0001***); PZQ (p< 0,05*).....................................................................................................................................................

105

Figura 48: Oograma- Porcentagem do número de ovos encontrados nas análises dos animais tratados (7, 21 e 56 dpi). Ovos Imaturos (1º ao 4º estágio de desenvolvimento); Ovos Maduros (5º estágio de desenvolvimento) e Ovos mortos, referente aos tratamentos em dose única (100 mg/kg) com OE e compostos sesquiterpenos e associação OE+PZQ (100+ 40 mg/kg) e PZQ+PZQ. Grupo controle farmacológico PZQ (100 mg/kg). Grupo controle negativo, foi administrado 0.3mL de PBS.................................................................................................................................................

108

Figura 49: Redução do número de OPG após tratamentos em dose única com OE, sesquiterpenos e associação OE+PZQ e PZQ+PQZ, realizados nos diferentes períodos de infecção da esquistossomose mansônica. (A) - Tratamentos realizados 07 dpi; (B) - Tratamentos realizados (21 dpi) ;(C) -Tratamentos realizados 56 dpi. Grupo controle farmacológico PZQ (100 mg/kg). Grupo controle negativo, foi administrado 0.3mL de PBS...............................................................................

110

Figura 50: Cortes histológicos do tecido hepático de animais do grupo controle negativo (infectado e não tratado). (A e B) – Animais receberam 0.3 mL de PBS 07 dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) - Animais receberam 0.3 mL de PBS 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Animais receberam 0.3 mL de PBS 56 dpi (fase pós- postural- crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença dos ovos com miracídio degenerado, presença de conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), presença de granulomas conjugados periovulares, além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória. Coloração Tricrômico de Masson. Escalas 50 e 100 μm........................................................................................................

114

Figura 51: Granulomas hepáticos de animais tratados em dose única (100 mg/kg) com alfa- humuleno em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica (A e B) -Tratamento realizado 07dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural-

Lista de Figuras

crônica) e analisado 70 dpi As setas indicam a presença dos ovos degenerados no centro dos granulomas e a presença de conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória. Coloração Tricrômico de Masson. Escalas 50 e 100 μm........................................................................................................................................

115

Figura 52: Granulomas hepáticos de animais tratados em dose única (100 mg/kg) com trans-cariofileno em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica (A e B) -Tratamento realizado 07dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural-crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença do verme macho no fígado, presença dos ovos com miracídios degenerados no centro dos granulomas, presença de conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), presença do Verme macho no corte histológico dos tratamentos realizados 56 dpi, além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória. Coloração com Tricômico de Masson. Escala 100 μm.......................................................................

116

Figura 53: Granulomas hepáticos de animais tratados em dose única (100 mg/kg) com espatulenol em duas fases de infecção da esquistossomose mansônica (A e B) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (C e D) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural-crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença dos ovos com miracídios degenerados no centro dos granulomas e a presença de conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória. Coloração com Tricômico de Masson Escalas 50 e 100 μm................................................................

117

Figura 54: Granulomas hepáticos em cortes histológicos de animais tratados com OE (100 mg/kg) em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica. (A e B) - Tratamento realizado 07 dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural- crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença dos ovos com miracídios retraídos e degenerados no centro dos granulomas e a presença do infiltrado inflamatório com deposição de colágeno ao redor da reação granulomatosa. Coloração com Tricômico de Masson. Escala 50 e 100 μm........................................................................................................................................................

118

Figura 55: Granulomas hepáticos em cortes histológicos de animais tratados com OE+ PZQ (100 + 40 mg/kg) em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica. (A e B) - Tratamento realizado 07 dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural- crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença dos ovos com miracídios retraídos e degenerados no centro dos granulomas e a presença do infiltrado inflamatório de fibras de colágeno ao redor da reação granulomatosa. Coloração com Tricômico de Masson. Escala 50 e 100 μm.................................................................................................................................................

119

Figura 56: Granulomas hepáticos de animais do grupo controle farmacológico tratados com dose única de PZQ 100 mg/kg em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica. (A e B) -Tratamento realizado 07 dpi (fase pulmomar) e analisado 45 dpi; (C e D) - Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase prós- postural- crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença dos ovos com miracídios degenerados no interior dos granulomas, presença de granulomas conjugares com intenso conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória. Coloração com Tricômico de Masson. Escala 50 e 100 μm.......................................................................................................................................................

120

Lista de Tabelas

Tabela 1: Terpenóides com atividade esquistossomicida comprovada..................................

37

Tabela 2: Relação das substâncias do OE de B. trimera identificados por CG-EM. Foram identificados maior índice de retenção de compostos Sesquiterpenos. tR: tempo de retenção, IRcal: índice de retenção calculado; IRlit: índice de retenção obtido com dados na literatura..............................................................................................................................

60

Tabela 3: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes concentrações do OE e Alfa-humuleno, até 72h de incubação................................................................................................................................

70

Tabela 4: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes concentrações de Trans-cariofileno e FCS1, até 72h de incubação................................................................................................................................

71

Tabela 5: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes concentrações da FCS2 e FCS3, até 72h de incubação................................................................................................................................

72

Tabela 6: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes concentrações da FCC1 e FCC5, até 72h de incubação...............................................................................................................................

73

Tabela 7: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes concentrações da FCC6 e FCC7, até 72h de incubação..............................................................................................................................

74

Tabela 8: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes concentraçõesda FCC8 e FCC9, até 72h de incubação................................................................................................................................

75

Tabela 9: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes concentrações da FCC10, até 72h de incubação.................................................................................................................................

76

Tabela 10: Efeito dos tratamentos sobre a separação de casais de S. mansoni e

eliminação de ovo até 72horas de incubação.........................................................................

79

Tabela 11. Efeito dos tratamentos em dose única (100mg/kg) e associação OE+PZQ sobre

granulomas hepáticos em diferentes períodos de infecção por S.

mansoni................................................................................................................................

113

Lista de Abreviaturas e Siglas

ARTs - Derivados da artemisinina

BSA- Soro Albumina Bovina

CC- Coluna Cromatográfica do tipo Clássica

CCD- Cromatografia por Camada Delgada

CG-EM-Cromatografia de Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas

CS- Coluna Cromatográfica do tipo Seca

DQOF -Divisão de Química Orgânica e Farmacêutica

DTNs - Doenças Tropicais Negligenciadas

FCC1 a FCC11- Frações obtidas por Coluna Cromatográfica do Tipo Clássica

FCS1 a FCS3- Frações obtidas por Coluna Cromatográfica do Tipo Seca

FDA-Food and Drug Administration

MEV- Microscopia Eletrônica de Varredura

MO- Microscopia Óptica

OE- Óleo essencial

OXA- oxamniquina

P&D - Pesquisa & Desenvolvimento

PBS- Phosphate Buffered Saline

PZQ- praziquantel

RO- Redução de número de ovos

RV- Redução de número de vermes

SBF- Soro Fetal Bovino

WHO- World Health Organization

Sumário

1. Introdução............................................................................................................................17

2. Revisão de Literatura......................................................................................................... 24

2.1. Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs) ................................................................ 24

2.2. Biologia do Schistosoma mansoni................................................................................25

2.3. Patogenia e Formas Clínicas da Esquistossomose......................................................28

2.4. Tratamento da Esquistossomose e desenvolvimento de tolerância e resistência ao praziquantel...................................................................................................................30

2.5. Associação de fármacos para terapêutica da Esquistossomose ................................32

2.6. Planejamento e descoberta de novos fármacos esquistossomicidas a partir de espéciesvegetais ...........................................................................................................33

3. Objetivos................................................................................................................................39

3.1. Objetivo geral...............................................................................................................40

3.2. Objetivos específicos...................................................................................................40

4. Material e Métodos................................................................................................................41

4.1. Material Vegetal...........................................................................................................42

4.1.1. Obtenção do óleo essencial (OE) da B. trimera............................................................42

4.1.2. Fracionamento do óleo essencial (OE) em Coluna Cromatográfica do tipo Seca- (CS) .....................................................................................................................................42

4.1.3. Fracionamento do óleo essencial (OE) em Coluna Cromatográfica do tipo Clássica- (CC) .............................................................................................................................43

4.1.4. Análises Cromatográficas ..............................................................................................43 4.1.5 Cromatografia por Camada Delgada (CCD) .................................................................43

4.1.6 Cromatografia Gasosa Acoplada à Aspectrometria de Massas (CG-EM) ....................44 4.2. Compostos e Sondas fluorescentes.............................................................................44

4.3. Modelo Biológico...........................................................................................................46 4.3.1. Parasita e infecção dos animais....................................................................................46 4.3.2. Ensaios de atividade esquistossomicida in vitro..........................................................46 4.3.3. Obtenção dos vermes e cultura in vitro dos parasitas.....................................................47 4.3.4. Avaliação da atividade do sistema excretor de S. mansoni após incubação in vitro com alfa-humuleno e trans-cariofileno utilizando a sonda Resorufin.................................................48

4.3.5. Avaliação da integridade de membrana de S. mansoni após incubação in vitro com alfa-humuleno e trans-cariofileno utilizando a sonda Hoechst 33258 ....................................................................................................................................................49 4.3.6. Análises Morfológicas e Tegumentares dos parasitas por Microscopia Eletrônica de

Varredura (MEV) ........................................................................................................................50

4.3.7. Ensaios de atividade esquistossomicida in vivo..............................................................50

4.3.8. Acompanhamento e análises dos Tratamentos...............................................................51

Sumário

4.3.9. Parâmetros parasitológicos avaliados ..........................................................................52

5. Ensaios Toxicológicos.............................................................................................................53

5.1. Análises Estatísticas.........................................................................................................53

5.2. Comitê de Ética.................................................................................................................54

6. Resultados e Discussão .........................................................................................................55

6.1. Análise Fitoquímica.....................................................................................................56

6.1.1. Obtenção e rendimento das frações obtidas a partir do Óleo essencial de

B. trimera.................................................................................................................................56

6.1.2. Análises Cromatográficas por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ................57

6.1.3. Análises por Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrômetro de Massas

(CG-EM) ..................................................................................................................................58

6.2. Resultados e Discussão: Ensaios in vitro..............................................................67 6.2.1. Efeito do Óleo essencial, Frações e Compostos sobre a atividade motora de

S. mansoni..............................................................................................................................68

6.2.2. Efeito in vitro do Óleo essencial, Frações e Compostos sobre o acasalamento

e produção de ovos de S. mansoni......................................................................................... 77

6.2.3. Efeito do Óleo essencial, Frações e Compostos sobre a Mortalidade de S. mansoni..80

6.2.4. Avaliação da atividade do sistema excretor e integridade de membrana de S. mansoni após incubação in vitro com alfa-humuleno e trans-cariofileno utilizando as sondas

Resorufin e Hoechst 33258............................................................................................... 84

6.2.5. Efeito dos tratamentos sobre a morfologia e Tegumento de S. mansoni.......................88

6.3 Resultados e Discussão: Ensaios in vivo......................................................................95

6.3.1. Importância dos Ensaios in vivo....................................................................................96

6.3.2 Efeito do Óleo essencial e Compostos sobre a carga parasitária de

(Esquistossômulos, Vermes jovens e Adultos) de S. mansoni ................................................97

6.3.3 Efeito dos tratamentos sobre Casais, Machos e Fêmeas nas diferentes fases

de desenvolvimento de S. mansoni...... ................................................................................103

6.3.4 Efeito dos tratamentos sobre a oviposição de S. mansoni nos diferentes períodos

de infecção da esquistossomose mansônica......................................................................106

6.3.5 Efeito dos tratamentos sobre as reações granulomatosas em diferentes fases

de infecção da esquistossomose mansônica........................................................................111

7. Conclusões e Perspectivas..........................................................................................................121

8. Referências Bibliográficas............................................................................................................122

9. Anexo..............................................................................................................................................135

16

Introdução

1. Introdução

17

Introdução

A esquistossomose é uma infecção parasitária negligenciada que afeta,

principalmente, populações de países tropicais e subtropicais em desenvolvimento

(Chitsulo et al., 2000). Dentre as doenças parasitárias, a esquistossomose é

considerada a segunda principal causa de mortalidade e morbidade no mundo,

depois da malária, necessitando, portanto, de maior atenção dos órgãos

governamentais e indústrias farmacêuticas (Engels et al., 2002, Steinnman et al.,

2006).

A morbidade da esquistossomose, representada principalmente pela forma

crônica, está associada a fatores como intensidade parasitária, duração da infecção

e o desenvolvimento de reações granulomatosas (Gryseels, 2012, Rollemberg et al.,

2011). Deve-se observar ainda que a morbidade da doença pode comprometer o

crescimento e desenvolvimento cognitivo de crianças com idade entre 5-14 anos,

contribuíndo, na maioria dos casos, para interrupção da frequência escolar

(Ezeamama et al., 2012).

A natureza crônica e debilitante da doença resulta em altos custos para saúde

pública e perdas de produtividade nos países em desenvolvimento. De acordo com a

Organização Mundial da Saúde (OMS) a esquistossomose causa, anualmente,

perdas entre 1 a 7 e 4 a 5 milhões de “Disability Adjusted Life Years”, ou seja, soma

dos anos potenciais de vida perdidos devido aos anos de vida produtivos perdidos e

a mortalidade devido à enfermidade (Utzinger & Keiser, 2004, Gryseels et al., 2006).

Helmintos do gênero Schistosoma são agentes etiológicos da

esquistossomose. As três espécies descritas como mais importantes, até o

momento, para a saúde humana são Schistosoma mansoni (Sambon 1907), S.

haematobium (Bilhartz, 1852) e S. japonicum (Katsurada,1904). Estas apresentam

características morfológicas e fisiológicas particulares, diferentes hospedeiros

intermediários, distinta localização no hospedeiro definitivo e diferentes distribuições

geográficas (Steinmann et al., 2006).

A doença está distribuída de maneira endêmica em 78 países da África,

Caribe, Américas, Oriente Médio e Ásia (Figura 1) (Gryseels et al., 2006, Hotez et

al., 2009). Estimativas sugerem que, juntas, estas espécies de Schistosoma sp

infectam cronicamente, mais de 207 milhões de pessoas ocasionando entre 280 a

300 mil mortes anualmente (Gryseels et al., 2006, King, 2010).

18

Introdução

Figura 1: Distribuição mundial da esquistossomose. WHO, 2015.

No Brasil, onde apenas a espécie S. mansoni tem sua ocorrência descrita, a

esquistossomose é endêmica em 19 estados e distribui-se, mais frequentemente,

numa faixa de terras contínuas ao longo de quase toda costa litorânea com maiores

casuísticas nas regiões Nordeste, Sudeste e Centro-este (Figura 2). Estima-se que

aproximadamente 25 milhões de pessoas residem em áreas de risco de infecção e

cerca 5 a 7 milhões de indivíduos estão infectados, vivendo em áreas isoladas sem

diagnóstico e tratamento sendo, portanto, o país com maior número de casos

notificados na América do Sul (Scholte et al., 2014, Meltzer & Schwartz, 2013,

Lambertuci, 2010).

O mapeamento de focos de transmissão da esquistossomose é essencial para

a viabilidade dos programas de controle da doença (Brooker et al., 2009). No

entanto a prevalência da esquistossomose no Brasil, sobretudo nas regiões Norte e

Nordeste, é focal e está diretamente relacionada a distribuição de áreas mais

propícias ao desenvolvimento dos caramujos, hospedeiros intermediários do gênero

Biomphalaria. Além disso, variáveis climáticas e indicadores de pobreza se associam

aos fatores de risco de transmissão e disseminação da doença (Scholte et al., 2014).

19

Introdução

Figura 2: (A) Prevalência da esquistossomose no Brasil no período de 2005 a 2009; (B) Distribuição da prevalência média de risco de infecção por esquistossomose no Brasil em 2014. Scholte et al., 2014.

O padrão de transmissão, por meio do contato com águas contaminadas por

cercárias do parasita, devido a diversas atividades diárias como: cozinhar, lavar

roupas ou para fins de geração de renda, como agricultura e pesca, estão

associadas às características socioeconômicas e culturais das populações que

vivem em áreas endêmicas (Sarvel et al., 2011, Silva & Domingues, 2011).

Além da complexidade do mecanismo de transmissão, dificuldades de acesso

aos serviços de saúde, movimentos migratórios, transposição de rios e as más

condições de tratamento de água e esgoto atuam como condicionantes e contribuem

para transmissão da esquistossomose, em maior ou menor intensidade, em

comunidades rurais e urbanas (Freitas et al., 2010, Souza et al., 2011).

As diretrizes da maioria dos programas de controle das helmintíases

preconizam tratamento em massa, utilizando fármacos incluídos na lista da

Organização Mundial de Saúde (WHO, 2006).

Atualmente, o tratamento da esquistossomose baseia-se no uso do

praziquantel (PZQ) administrado via oral (40 - 60 mg/kg). O PZQ é eficaz contra

vermes adultos de todas as espécies de Schistosoma que infectam humanos e

apresenta pouco efeito colateral (Caffrey, 2015). Contudo, apresenta baixa

efetividade sobre esquistossômulos e formas jovens do parasita, proporcionando

redução das taxas de cura em áreas de alta endemicidade (Cioli & Pica-Mattoccia,

2003; Doenhoff et al., 2008).

20

Introdução

O emprego do PZQ em larga escala e os tratamentos sequenciais, exibem

uma suscetibilidade reduzida sobre algumas linhagens de Schistosoma sp. em

diferentes regiões geográficas e pode desencadear a seleção de linhagens

tolerantes e resistentes (Doenhoff et al., 2008, Greenberg, 2013).

Considerando o atual cenário da esquistossomose, faz-se necessário

investigar novas alternativas medicamentosas que atuem sobretudo, contra estágios

imaturos de S. mansoni podendo complementar ou associar-se ao PZQ. Nesse

sentido, pesquisas com plantas medicinais torna-se uma alternativa promissora com

expectativa de obtenção de fitoterápicos e/ou fitofármacos, bem como novas

contribuições para prevenção, controle e tratamento da esquistossomose (Allegretti

et al., 2012, Neves et al., 2015).

No presente estudo, avaliou-se o efeito do óleo essencial e sesquiterpenos de

Baccharis trimera (Less) por meio de ensaios in vitro, utilizando sondas

fluorescentes específicas a fim de identificar possíveis sítios de ação, sobre o

sistema excretor e integridade do tegumento do S. mansoni. Este estudo teve ainda

como objetivo, realizar ensaios in vivo, contra diferentes estágios de

desenvolvimento do parasita para melhor compreensão do potencial

esquistossomicida desta espécie vegetal.

A atividade esquistossomicida de B. trimera foi descrita previamente por De

Oliveira et al. (2012 e 2014) evidenciando o potencial efeito, in vitro e in vivo, de

extratos orgânicos e frações de diferentes polaridades, sobre vermes jovens e

adultos de S. mansoni, linhagem BH. Neste mesmo estudo De Oliveira e

colaboradores (2012), também avaliaram a composição química do óleo essencial

por meio da Cromatografia a Gás acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM).

As análises evidenciaram que o óleo apresenta em sua composição 84,76% de

substâncias da classe sesquiterpenos.

Devido a variedade de substâncias químicos, os óleos essenciais apresentam

diferentes ações farmacológicas, se tornando potencias fontes de pesquisa para o

desenvolvimento de novos fármacos (Edris, 2007).

Alfa-humuleno, trans-carofileno e espatulenol pertencem a classe dos

sesquiterpenos e são considerados componentes majoritários da constituição

química de óleos essenciais de diferentes espécies de plantas utilizadas na

medicina popular do Brasil (Pinho- da Silva et al., 2012). Além disso, têm sido

descritos por apresentarem efeito antiinflamatório, ocasionar inibição de canais de

21

Introdução

Ca2+ e apresentar efeito imunomodulador (Fernandes et al., 2007, Pinho-da-Silva et

al., 2012, Ziaei et al., 2011).

De acordo com Antony et al. (2005) os princiapais efeitos dos óleos

essenciais estão atribuídos as atividades imunomoduladoras e antiparasitária.

Entretanto, segundo Verlinde e colaboradores (2001) a pesquisa de princípios ativos

com propriedade antiparasitária é baseada, principalmente, na investigação de vias

metabólicas ou bioquímicas relacionadas à interação parasito-hospedeiro, com a

finalidade de identificar possíveis alvos terapêuticos.

A relação parasito- hospedeiro de S. mansoni têm sido estudada com base no

seu ciclo de vida. Contudo, sabe-se que este parasita apresenta um complexo

biológico, implicando em numerosas alterações morfológicas, fisiológicas e

bioquímicas, no hospedeiro intermediário e definitivo tendo, portanto, um sofisticado

sistema de escape (Salzet et al., 2000). Segundo Silva et al. (2007), uma das formas

de escape desse parasita consiste na expressão de antígenos de superficie do

tegumento, causando modulação da resposta imune no hospedeiro.

Nesse sentido, o tegumento do S. mansoni tem sido um dos principais alvos de

estudos para o desenvolvimento de novos fármacos (Xiao et al., 2000; Doenhoff et

al., 2008). Esta estrutura sincincial desempenha papel vital na proteção, absorção de

nutrientes, incluindo aminoácidos, lipídios, lipoproteínas e outros, além da

capacidade de excreção de produtos catabólicos como o ácido lático (Skelly et al.,

2006, Xavier et al., 2010, Faghiri et al., 2010).

Além do tegumento, o sistema excretor do S. mansoni tem recebido maior

atenção devido à sua importância na excreção de metabólitos e xenobióticos para

sobrevivência. No entanto, evidências sugerem que este sistema possui um

importante papel na interação parasito-hospedeiro (Kusel et al., 2009; Wilson &

Webster 1974).

No entanto, para estudo detalhado destes sistemas, técnicas aplicadas a

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e microscopia de fluorescência, com o

uso de marcadores específicos, têm possibilitado o entendimento da biologia e

comportamento do S. mansoni e S. japonicum, em diferentes fases de

desenvolvimento, bem como o esclarecimento de mecanismos de ação e sítio de

atuação de fármacos, elucidando questões relevantes sobre da relação parasito –

hospedeiro (Kusel et al., 2009, Mulvenna et al., 2010, De Oliveira et al., 2014, Fan

et al., 2015).

22

Revisão de Literatura

2.Revisão de Literatura

23


2.1 Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs)

As Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs) compreendem infecções

crônicas debilitantes, causadas por parasitas, bactérias e fungos, que afetam em

sua maioria, populações de baixa renda, politicamente marginalizadas que vivem em

zonas rurais e urbanas, cujas condições de moradia, saneamento básico e serviços

à saúde são precárias (Hotez et al., 2007).

A OMS relata a ocorrência de várias DTNs no Brasil, com prevalência variável

de acordo com as diferentes regiões geográficas, que segundo Hotez et al., 2008 e

Lindoso, 2009, estão concentradas principalmente nas regiões Norte e Nordeste.

Atualmente, 18 enfermidades estão na lista de DTNs da WHO, incluíndo entre as

principais dengue e chikungunya, doença de Chagas, leishmanioses,

tripanossomíase americana, hanseníase, helmintíases transmitidas pelo solo e

esquistossomose (OMS, 2015). Estas enfermidades, incapacitam ou podem matar

milhões de pessoas e representam uma necessidade de Saúde Pública importante

que permanece não atendida (Hotez et al., 2009).

Estima-se que atualmente cerca de 1 bilhão de pessoas - um sexto da

população mundial sofre de uma ou mais DTNs (Hotez et al., 2009). Diferentes

medidas de intervenção podem ser utilizadas para controlar e reduzir a morbidade

destas doenças, bem como prevenir ou interromper a transmissão. Essas medidas

incluem, principalmente, saneamento ambiental, quimioterapia, controle vetorial,

abastecimento de água e educação ambiental e em saúde (Barakat, 2013).

Embora as medidas preventivas e a quimioterapia para algumas das DNTs

sejam conhecidas, algumas delas não estão disponíveis nos países com um grau

elevado de pobreza (Gray, 2011). Além disso, as opções terapêuticas são

insuficientes e apresentam problemas, tais como baixa eficácia sobre as formas

jovens e larvais, elevada toxicidade e, em alguns casos, emergência de linhagens

tolerantes e/ou resistentes (Guido & Oliva, 2009).

O problema é particularmente grave uma vez que os investimentos em

Pesquisa & Desenvolvimento (P&D), tradicionalmente, não revertem no

desenvolvimento de novos produtos para tratamento, diagnósticos rápidos e

medidas profiláticas, como por exemplo, o desenvolvimento de vacinas (Nwaka et

al., 2008, Ekins et al., 2011).

http://www.who.int/entity/denguecontrol/en/index.html

24


Um estudo recente realizado pela Iniciativa de Medicamentos para Doenças

Negligenciadas (DNDi), uma organização de P&D sem fins lucrativos, mostra que

faltam ensaios clínicos relacionados às DNTs, sendo que, dos quase 150.000

estudos clínicos registrados para descoberta de novos fármacos em dezembro de

2011, somente 1% eram relacionados ao tratamento das DNTs (DNDi, 2013).

No entanto, as indústrias farmacêuticas argumentam que a P&D é um

procedimento caro e arriscado para investir em DNTs, uma vez que afetam

predominantemente países em desenvolvimento trazendo, consequentemente, o

baixo retorno financeiro (Kola et al., 2004).

Diante desse complexo paradigma, esforços globais entre governo,

universidades e principalmente indústrias farmacêuticas, são fundamentais para a

criação e manutenção de programas de P&D voltados a descoberta de novas

alternativas para tratamento e controle das DNTs, a fim de diminuir o número

expressivo de pessoas que sofrem com as consequências destas doenças

sobretudo, a esquistossomose (Guido & Oliva, 2009).

2.2 Biologia do Schistosoma mansoni

A espécie S. mansoni pertence ao Filo Platyhelminthes e classe Trematoda.

Esse parasita intravascular apresenta dimorfismo sexual na fase adulta e são

digenéticos. Segundo Platt & Brooks (1977), o dimorfismo sexual foi acompanhado

de alterações fenotípicas como o afilamento do corpo das fêmeas e o aparecimento

da protandria nos machos. O desenvolvimento de S. mansoni ocorre com o resultado

da expressão de um conjunto de genes, responsáveis por mudanças estruturais,

fisiológicas e bioquímicas, devido às adaptações observadas durante seu ciclo vida

(Han et al., 2009, Kunz 2001).

O ciclo de vida deste parasita envolve duas fases: uma no hospedeiro definitivo

vertebrado, onde ocorre a maturação e reprodução sexuada dos vermes; e a outra

(fase aquática) no hospedeiro intermediário invertebrado - caramujos pulmonados do

gênero Biomphalaria - onde ocorre a poliembrionia (Figura 3). O parasita passa por

seis estágios de desenvolvimento: ovo, miracídio, esporocistos, cercária,

esquistossômulo e vermes adultos (Gryseels et al., 2006, Han et al., 2009).

25


Cercária OvoEsquistossômulo Vermes adultos

EsporocistoMiracídio

ÁguaHospedeiro

intermediárioÁguaHospedeiro definitivo

Figura 3: Estágios de desenvolvimento do S. mansoni. Adaptado de Han et al., 2009.

Dentro do hospedeiro intermediário, os esporocistos se transformam em

milhares de cercárias, que são liberadas de forma intermitente na água (Figura 4). O

desenvolvimento do S. mansoni no homem se inicia com a penetração ativa de

cercárias na epiderme, por ação mecânica e enzimática, iniciando, desta forma, o

processo de transformação em esquistossômulos. Estes, por sua vez, através da

circulação, chegam aos pulmões entre 2 a 7 dias (Wilson, 2009).

Após este período, os esquistossômulos deslocam-se pela circulação e

passam pelo coração. Somente quando alcançam o sistema porta hepático, começa

o processo de maturação sexual e acasalamento (Miller & Wilson, 1980). Uma vez

desenvolvidos, os vermes adultos acasalados deslocam-se ativamente contra a

corrente circulatória do sistema porta hepático e migram para as veias mesentéricas

onde ocorrerá a eliminação dos ovos (Katz & Coelho, 2008, Utzinger et al., 2003).

A fêmea de S. mansoni necessita da participação do macho para seu

crescimento e desenvolvimento, bem como para completar o processo de

fertilização dos ovos (LoVerde & Chen, 1991). A oviposição inicia-se 30 a 45 dias

após penetração das cercárias no hospedeiro definitivo. Muitos destes ovos são

carreados para o lúmen intestinal, sendo eliminados para o ambiente através das

fezes do indivíduo infectado. Enquanto isso, outra parte dos ovos são levados pela

corrente sanguínea e ficam retidos nos tecidos, principalmente do fígado (Gryseels

et al., 2006).

Sequencialmente, uma resposta imunológica é gerada contra antígenos

liberados pelos ovos presentes nos tecidos, formando ao redor destes uma reação

26


granulomatosa, principal causa da morbidade e patogenia da esquistossomose

(Rollinson & Simpson, 1987, Katz & Almeida, 2003).

S. mansoni consegue atingir altos índices de longevidade, vivendo mais de 5

anos no sistema porta hepático do hospedeiro definitivo (Harris et al., 1984). Este

fato reflete bem a notável capacidade adaptativa deste parasita às atividades de

defesa, inerentes ao sistema imunológico do hospedeiro, com o desenvolvimento de

estratégias de escape e sobrevivência (Rocha et al., 1985, Smithers & Terry, 1969).

Figura 4: Ciclo Biológico do Schistosoma mansoni. Fonte: Minas Gerais Genome Network.

27


2.3 Patogenia e Formas Clínicas da Esquistossomose

O principal fator na patogênese da esquistossomose está diretamente

relacionado ao desenvolvimento de reações inflamatórias do tipo granulomatosa,

decorrente da resposta aos antígenos solúveis do ovo maduro, evoluíndo para um

quadro de fibrose (Andrade, 2009, Hams et al., 2013). Este fator também está

relacionado às diferentes linhagens e espécies de Schistosoma, carga parasitária,

estado imunológico e nutricional do indivíduo infectado (Kinoti, 1987, Yoshioka et al.,

2002).

A esquistossomose em suas diferentes formas clínicas assemelha-se a muitas

outras doenças. No entanto, a sintomatologia faz com que a doença seja dividida

nas seguintes fases: uma aguda e outra crônica (Lambertucci, 2010).

Na fase aguda muitos indivíduos infectados, dependendo da intensidade de

infecção, permanecem assintomáticos. Contudo, as manifestações clínicas estão

relacionadas a um quadro de febre (febre Katayama) e eosinofilia, como reação de

hipersensibilidade sistêmica em decorrência da migração dos esquistossômulos

alguns dias após a penetração da cercária (fase pré-postural) (Lambertucci, 2010,

Gryseels et al., 2006). Após 30 a 60 dias de infecção, coincidindo com o início da

eliminação dos ovos nas fezes (fase postural) o indivíduo pode apresentar dores

abdominais e diarréia mucosanguinolentas (Pearce & Mcdonald, 2002, Andrade,

2009).

Em relação a fase crônica da esquistossomose, o quadro clínico é dividido nas

formas intestinal, hepatointestinal e hepatoesplênica, considerado mais grave

(Andrade, 2009). Os sintomas mais comuns da forma intestinal estão relacionados

com dores abdominais crônicas ou intermitentes, perda de apetite e diarréia. Em

relação aos sintomas das formas hepatointestinal e hepatoesplênica, estes estão

associados a uma infecção duradoura, de alta intensidade, caracterizada por fibrose

severa, hipertensão portal, hepatoesplenomegalia e, em alguns casos, varizes

esofageanas (Davis,1996). Eventualmente, estas varizes esofagianas se rompem

provocando fortes hemorragias, responsáveis por um número considerável de óbitos

(Tanabe, 2003).

A fase crônica pode ser caracterizada pela presença de numerosos

granulomas periovulares em vários órgãos, especialmente no fígado e baço,

podendo ser encontrados também, no intestino e pulmão (Hams et al., 2013).

28


Durante o processo granulomatoso, ocorre uma intensa migração de macrófagos,

neutrófilos e eosinófilos em torno dos ovos depositados nos tecidos. Nessa fase, as

células inflamatórias são substituídas por fibroblastos, que se orientam em camadas

concêntricas, com posterior produção de colágeno extracelular (Lenzi et al., 2006,

Burke et al., 2009, Chuah et al., 2014). De modo geral, o granuloma é constituído

por blocos celulares e componentes da matriz extracelular, que são articulados, de

forma particular, para cada estágio do seu desenvolvimento (Lenzi et al.,2006).

A forma neurológica ou neuroesquistossomose, também pode ocorrer na fase

crônica da esquistossomose. Embora considerada rara, se comparada com a forma

intestinal e hepática, é subdiagnosticada por falta de recursos técnicos nas principais

áreas endêmicas da doença (Pimenta et al., 2010).

A neuroesquistossomose é uma complicação ectópica, causada pela

embolização dos ovos ou a migração de casais de vermes para regiões como o

sistema nervoso central (SNC) mais precisamente, a medula espinhal (Ferrari et al.,

2008). As três espécies principais, Schistosoma japonicum, S. mansoni e S.

haematobium estão envolvidas na infecção aguda da neuroesquistossomose.

Contudo, o maior número de casos (4%) tem sido relatado entre indivíduos de faixa

etária entre 10 - 40 anos, infectados com S. japonicum (Hayashi, 2003).

A doença pode acometer o SNC do homem, provocando lesões focais com

importantes repercussões clínicas como quadro encefálico, meníngeo, paralisias e

paresias dos membros inferiores (Carod-Artal 2009, Souza et al., 2011). Em alguns

casos, pode haver um fenômeno vascular do tipo vasculite, ao redor dos ovos do

parasita, sem processo granulomatoso, geralmente acompanhado de “amolecimento

medular”, resultando em infartos ocasionados pela vasculite (Matas, 2001).

O diagnóstico da neuroesquistossomose é definido por meio de biópsia do

tecido nervoso e confirmado a partir de achados de ovos do parasita (Peregrino et

al., 2002). No entanto, quando o diagnóstico sobre o acometimento do sistema

neurológico é precoce o tratamento com PZQ na dosagem de 40 a 60 mg/kg,

associado com corticosteróides, proporciona melhora significativa. Ao contrário,

quando o diagnóstico é tardio, podem ocorrer danos irreversíveis no SNC (Blanchard

et al., 1993).

Desta forma, na maioria dos casos, o tratamento da neuroesquistossomose

deve ser realizado com corticóides para reduzir o edema cerebral e granulomas em

torno do cerebelo, bem como, reduzir a severidade da reação inflamatória na medula

29


espinhal ou parênquima cerebral e evitar a destruição tecidual (Carod-Artal, 2009). A

intervenção cirúrgica só é realizada nos casos granulomatosos em que o diagnóstico

prévio é de um processo expansivo tumoral intracraniano (Matas, 2001).

2.4 Tratamento da Esquistossomose e desenvolvimento de

tolerância e resistência ao praziquantel

A ausência de uma vacina como medida profilática faz com que a quimioterapia

ainda seja o principal recurso adotado pelos programas de controle da

esquistossomose (Colley, 2014).

Desde os anos de 1970, a estratégia global para o controle desta parasitose é

baseada na terapêutica dos portadores com o uso do PZQ (Figura 5). Este fármaco

apresenta efeito principalmente sobre vermes adultos de todas as espécies de

Schistosoma que causam esquistossomose humana. Contudo, apresenta baixa

eficácia terapêutica sobre as formas de esquistossômulos e vermes jovens (Cioli &

Pica-Mattoccia, 2003).

Figura 5: Fórmula molecular do praziquantel

A dependência de um único medicamento é uma preocupação vigente, visto

que há relatos de falha terapêutica, proporcionando redução das taxas de cura em

áreas hiperendêmicas, além do desenvolvimento de tolerância e resistência sobre

algumas linhagens de Schistosoma sp. (Doenhoff et al., 2008, Greenberg, 2013).

Entretanto, para muitos autores, ainda não há evidências clínicas convincentes

do desenvolvimento de resistência, visto que o PZQ ainda é efetivo para todas as

espécies de Schistosoma sp (Caffrey 2007). Contudo, alguns autores consideram a

diminuição da eficiência do PZQ não como resistência ao fármaco, mas proveniente

da intensidade de infecção ou das condições imunológicas inerentes ao hospedeiro,

30


necessitando aumentar a dose terapêutica e o período de tratamento (Gryseels,

2012, Danso-Appiah & De Vlas 2002, Liu et al., 2014).

A redução da cura clínica e falha terapêutica da esquistossomose, utilizando

PZQ foi reportada pela primeira vez no Egito e Senegal (Stelma et al., 1995, Ismail

et al., 1999), embora tenha sido um caso particular, em foco de transmissão

contínua no qual a falha terapêutica estava relacionada à presença das formas

imaturas do parasita, onde se observaram reinfecções constantes dos indivíduos

residentes daquela região (Botros et al., 2005).

Assim, para confirmar tal hipótese, ovos provenientes de pacientes egípcios

que receberam tratamento com PZQ e não obtiveram cura terapêutica, foram

utilizados experimentalmente para infectar hospedeiros intermediários e originaram

vermes menos sensíveis ao fármaco (Ismail et al., 1996).

Além da baixa eficácia sobre as formas jovens de S. mansoni, alguns autores

consideram que a diminuição da eficiência do PZQ esteja relacionada a fatores

como: alta intensidade parasitária, estado imunológico do hospedeiro, porcentagem

e frequência com que os indivíduos são tratados, dose terapêutica administrada,

bem como a frequência de casos de reinfecções e não ao aparecimento de vermes

resistentes (Gryseels et al., 2006, Danso-Appiah & Sake, 2002).

Estudos indicam que o mecanismo de resistência de S. mansoni ao PZQ está

relacionado às proteínas SmMRP1 e SMDR2. Evidências mostram que há um

aumento da expressão destas proteínas em resposta ao PZQ, indicando que estas

podem atuar como substrato deste fármaco. Contudo, níveis mais elevados de

SMDR2 são observados nas fêmeas do parasita, enquanto a SmMRP1 é encontrada

em maior quantidade nos vermes machos (Wang et al., 2012).

Sabe-se também que a resistência ao PZQ pode ser induzida

experimentalmente em laboratório, onde parasitos expostos a concentrações sub-

letais por várias gerações produzem vermes menos sensíveis ao fármaco (Ismail et

al., 1999, Fallon et al., 1995). De acordo com Greenberg (2005), mutações na

subunidade β dos canais de cálcio ou diferenças na expressão de genes que

codificam estes canais, parecem estar relacionadas com pelo menos um dos

mecanismos de resistência ao praziquantel.

Os mecanismos moleculares relacionados ao efeito do PZQ, in vitro e in vivo,

sobre S. mansoni ainda não foram completamente elucidados (Doenhoff et al.,

2008). Sabe-se que após exposição de S. mansoni a baixas concentrações do

31


fármaco, são observadas alterações tegumentares, caracterizadas por

vacuolizações, peeling do tegumento, tubérculos e espinhos, aumento da

permeabilidade da membrana e influxo da bomba de Ca2+ , ausência de fosforilação

nas subunidades α1 e β de canais de cálcio, depolarização de membrana dos

vermes adultos e esquistossômulos, além da contração e paralisia muscular,

atuando sobre neurotransmissores do parasita (Xiao et al., 2007; Lorsuwannarat et

al., 2013).

Reconhecidamente, desde a descoberta do PZQ nos anos 1970, houve uma

significativa melhora da eficiência terapêutica da esquistossomose mansônica,

devido ao fato do PZQ apresentar eficácia contra todas as espécies de Schistosoma

sp, reduzindo a morbidade da doença, sendo também classificado como um fármaco

acessível à população mais carente, apresenta baixa toxicidade e não apresenta

riscos mutagênicos, carcinogênicos ou teratogênicos (Frohberg 1989, Kramers et al.

1991),

Além disso a Food and Drug Administration (FDA), agência controladora de

medicamentos, classificou o PZQ como um fármaco seguro para ser administrado

em gestantes. Entretanto é recomendado que mulheres lactantes, suspendam a

amamentação por 48 horas após o tratamento (Olds, 2003).

Após a descoberta do PZQ, pouco avanço foi obtido no que diz respeito à

busca de novos fármacos e compostos que atuem em outras fases de

desenvolvimento do parasita – esquistossômulos e vermes jovens- as quais o PZQ

não apresenta boa eficácia (Doenhoff et al., 2008).

Desta forma, tendo em vista a possibilidade de desenvolvimento de linhagens

resistentes ao PZQ, além de diferenças de suscetibilidade aos tratamentos entre as

linhagens de Schistosoma sp. fica clara a necessidade da busca novas alternativas

com o objetivo de previnir estes fatores.

2.5 Associação de fármacos com PZQ para terapêutica da Esquistossomose

Algumas linhas de pesquisas relacionadas à quimioterapia das

esquistossomoses estão direcionadas à associação terapêutica de novos princípios

ativos com PZQ. Esse recurso é eficaz para retardar, minimizar ou evitar o

aparecimento de resistência além de diminuir os efeitos colaterais e tóxicos.

32


De acordo com a OMS (2001), a associação terapêutica baseia-se no

potencial sinérgico de dois ou mais princípios ativos a fim de melhorar a eficácia

terapêutica, bem como minimizar o desenvolvimento de resistência aos fármacos

comumente utilizados no tratamento de doenças específicas.

A resistência à fármacos é usualmente definida como a perda da

sensibilidade do organismo, permanente ou transitória, às determinadas

concentrações nas quais estes se mostravam previamente sensíveis (Coelho et al.,

1997). Em contraste, a tolerância à fármacos é observada quando o organismo

apresenta diminuição a resposta terapêutica que se deve à administração repetitda

ou prolongada de alguns fármacos (Coles et al., 1986).

O desenvolvimento de resistência aos fármacos esquistossomicidas é um

eminente perigo para a proteção da saúde de milhões de pessoas. Segundo El Ridi

et al. (2013) a associação de novos princípios ativos com PZQ, usando dosagens

menores do que aquela considerada curativa, é uma promissora alternativa uma vez

que pode potencializar a eficácia terapêutica do PZQ e minimizar a possibilidade de

resistência.

O uso combinado de alguns derivados da artemisinina (ARTs) + PZQ tem sido

efetivo para o tratamento de infecções por S. mansoni e S. haematobium em

crianças de idade escolar residentes em zonas endêmicas da África Subsaariana,

onde as reinfecções ocorrem com frequência (Borrmann et al., 2001, Wikman-

Jorgensen et al., 2012, Pérez Del Villar et al., 2012). A associação do PZQ com

ARTs apresenta benefícios para o tratamento das esquistossomoses, devido a

comprovada eficácia desses derivados contra as fases imaturas e vermes adultos

destas espéceis de Schistosoma (Xiao et al., 2002).

2.6 Planejamento e descoberta de novos fármacos esquistossomicidas a partir de espécies vegetais

Considerando o presente cenário epidemiológico da esquistossomose no

Brasil, esforços dirigidos ao desenvolvimento e introdução de novas alternativas de

tratamento e controle da doença são bem acolhidos.

O processo de descoberta e desenvolvimento de novos fármacos de modo

geral é complexo, demorado e de alto custo, requerendo auxílios ligados às

inovações científicas e tecnológicas (Guido et al., 2010).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Borrmann%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11679932

33


Produtos naturais podem representar uma fonte promissora de novos

candidatos à fármacos para o tratamento da esquistossomose. A diversidade de

constituintes químicos e diferentes efeitos biológicos demonstram que

aproximadamente 25% dos medicamentos prescritos em todo mundo, são oriundos

de espécies vegetais (Newman, 2009, Tagboto et al., 2011, Cragg & Newman,

2013).

A partir da descoberta do primeiro princípio ativo isolado de uma espécie

vegetal no início do século 19 (Brahmachari et al., 2011), a avaliação científica das

plantas medicinais tornou-se uma prática adotada para o tratamento de uma série de

doenças parasitárias, incluindo a esquistossomose (Allegretti et al., 2012; De Moraes

2015; Cragg & Newman, 2013).

Tendo em vista a biodiversidade da flora nativa no território brasileiro, nos

últimos anos, a comunidade científica vem pesquisando uma variedade de óleos

essenciais e extratos orgânicos de diferentes espécies vegetais, quanto ao potencial

esquistossomicida, principalmente por meio de ensaios in vitro e alguns estudos in

vivo, sobre diferentes linhagens de S. mansoni (Allegretti et al., 2012; De Oliveira

2012, 2014, Newman & Cragg, 2012; Kayser et al., 2003).

Contudo, apesar da importância do screening de extratos e óleos essenciais,

metabólitos secundários como substâncias isoladas, pertencentes a diferentes

classes química, vêm ganhando destaque na terapêutica experimental da

esquistossomose, sobretudo, aqueles com validação biológica sobre as fases

adultas e imaturas de S. mansoni (Allegretti et al., 2012, De Oliveira et al., 2014, De

Moraes et al., 2011, Guimarães et al., 2015).

Baccharis trimera (Less) DC

Conhecida popularmente por “carqueja”, B. trimera é uma erva consumida

principalmente na forma de chá (Verdi et al., 2005) (Figura 6). As principais

indicações terapêuticas estão relacionadas ao tratamento de disfunções intestinal -

anti-diarréica e anti-espasmódica - (Gamberini et al.,1991), além de se destacar

quanto ao potencial antiiflamatório, imunomodulador e hepatoprotetor, atribuídos

principalmente às saponinas e sesquiterpenos presentes nos extratos óleo essencial

desta espécie (Gené et al., 1996, Paul, 2009, Simões- Pires et al., 2005, Verdi et al.,

2005).

34


Figura 6: Baccharis trimera ( Less) DC. Cultivar do CPQBA. Fonte: arquivo pessoal

Quimicamente a espécie B. trimera é caracterizada por apresentar substâncias

pertencentes à classe dos terpenóides (Moreira et al., 2003; Verdi et al., 2005), além

de flavanóides e saponinas (Gené et al., 1996). Dentre os principais grupos, os

terpenos se destacam por apresentar uma variedade de classes estruturais com

destaque para os monoterpenos, diterpenos, triterpenos e sesquiterpenos (Cowan et

al, 1999).

O óleo essencial desta espécie está enriquecido com monoterpeno e

sesquiterpeno como: trans-cariofileno, alfa-humuleno, espatulenol, alfa e β-pineno,

palustrol, nerolidol, acetato de carquejila, germacreno-D e biciclogermacreno

(Amaral et al., 2010; De Oliveira et al., 2012, De la Torre, 2013).

Óleos essenciais são considerados uma mistura de substâncias naturais

voláteis, provenientes de metabólitos secundários de plantas, principalmente de

substâncias lipofílicas como monoterpenos, sesquiterpenos e seus derivados

oxigenados (álcoois, aldeídos, ésteres, éteres, cetonas, fenóis e óxidos), comumente

associadas a importantes atividades biológicas (Giordani et al., 2008, Bakkali et al.,

2008).

De acordo com Bakkali e colaboradores (2008) as atividades biológicas dos

óleos essenciais não estão atribuídas a um único mecanismo de ação, uma vez que

estes apresentam grande variedade de constituintes químicos.

Segundo Yoon (2000) em células eucarióticas, os óleos essenciais podem

provocar despolarização da membrana mitocondrial, afetando o efluxo de canais

iônicos, como por exemplo, de Ca2 + (Richter & Schlegel, 1993). Além disso, provoca

35


redução do gradiente pH, afetando as bombas de prótons e a fusão de ATP

(Adenosina Trifosfato), principalmente em bactérias.

Recentemente os sesquiterpenos alfa-humuleno, trans-cariofileno e

espatulenol, presentes na composição química da maioria dos óleos essenciais,

foram descritos por apresentar efeito antiinflamatório, inibidores de canais de Ca2 + e

efeito imunomodulador (Fernandes et al., 2007, Akram et al., 2011, Pinho-da-Silva et

al., 2012, Ziaei et al., 2011). Outras atividades biológicas de óleos essencias contra

agentes patogênicos humanos incluíndo, bactérias, fungos e parasitas já foram

descritas (Botelho et al., 2007, Cavaleiro et al., 2006, Monzote et al., 2006).

Em relação ao efeito parasitológico, já foi comprovada a atividade

esquistossomicida, in vitro, do óleo essencial, de B. trimera contra vermes adultos de

S. mansoni (De Oliveira, et al., 2012).

De forma semelhante, foi observado o efeito esquistossomicida contra

diferentes espécies Schistosma de uma variedade de substâncias pertencentes a

classe dos terpenóides (Neves et al., 2015). Acredita-se que um dos possíveis

mecanismos de ação das substâncias pertencentes a esta classe está relacionado

ao estresse oxidativo, provocando peroxidações lipídicas, oxidação de proteínas,

resultando possivelmente em apoptose, ocasionando a morte do parasita Antony et

al., 2005, Armstrong et al., 2006).

No quadro abaixo (Tabela 1) estão sumarizados alguns terpenóides isolados

de espécies vegetais com atividade esquistossomicida comprovada. Contudo, é

importante observar que a maioria dos estudos direcionada à busca de novos

princípios ativos contra S. mansoni, se concentra na ação in vitro destes, contra a

fase adulta do parasita. Desta forma, há uma necessidade de realização de ensaios

in vivo contra todas as fases de desenvolvimento de S. mansoni sobretudo, as fases

esquistossômulos e vermes jovens, estágios em que o PZQ apresenta falha

terapêutica.

36


Tabela 1: Terpenóides com atividade esquistossomicida comprovada. Adaptado de (Neves et al.,

2015, De Moraes et al., 2015).

Composto isolado

Classe Química

Fórmula Molecular

Origem

Efeito esquistossomicida

Referências

Acetato de carvacrol

Monoterpeno

Derivados de carvacrol

In vitro contra vermes adultos de S.mansoni

de Moraes et al., 2013b

(+) limoneno epóxido

Monoterperno

Diversas espécies vegetais


de Moraes et al., 2013a

Rotundifolona

Monoterperno

Mentha villosa

In vitro e in vivo contra vermes adultos de

S.mansoni

Matos-Rocha et

al., 2013

Fitol

Diterpeno


In vitro e in vivo contra vermes adultos de

S.mansoni

de Moraes et al., 2014

Balsaminol F

Triterpeno

Momordica balsamina

L.

In vitro e in vivo contra

vermes adultos de S.mansoni

Ramalhete et

al., 2012a

Betulin

Triterpeno

Schefflera vinosa


Cunha et al., 2012a

Karavilagenin C

Triterpeno

Momordica balsamina

L.


Ramalhete et al., 2012a

Sais de

trifenilfosfónio

Triterpeno

Derivados de betulin

In vitro contra esquistossômulos e

vermes adultos. In vivo contra vermes adultos de

S.mansoni

Spivak et al.,

2014

Artemisinina

Sesquiterpeno

Artemisia annua

In vivo contra vermes adultos de S. japonicum

Liu et al., 2014

37


Arteméter

Sesquiterpeno

Derivados

da Artemisinina

In vitro e In vivo contra

esquistossômulos e vermes adultos de S.

japonicum

Utzinger et al.,

2011

Artesunato

Sesquiterpeno

Derivados da

Artemisinina

In vitro e In vitro contra esquistossômulos e vermes adultos de

S.mekongi

Jiraungkoorskul et al., 2006

Diidroartemisinina

Sesquiterpeno

Derivados da

Artemisinina

In vitro e In vivo contra esquistossômulos e

vermes adultos de S. japonicum

Liu et al., 2014

Budlein- A

Sesquiterpeno

Viguiera asteraceae

In vitro contra vermes adultos de

S. mansoni

Cunha et al., 2012a

4α,5-

dihydrobudlein A

Sesquiterpeno

Derivados de budlein-

A

In vitro contra vermes adultos de

S. mansoni

Sass et al., 2014

Nerolidol

Sesquiterpeno


In vitro contra vermes

adultos de S. mansoni

Silva et al.,

2014

38

Objetivos

3.Objetivos

39

Objetivos

3.1 Objetivo geral

Avaliar o potencial esquistossomicida e estudar os possíveis sítios de ação

do óleo essencial de Bacharis trimera, frações e sesquiterpenos por meio de

ensaios in vitro, utilizando sondas fluorescentes específicas. Realizar ensaios in

vivo, contra diferentes fases de desenvolvimento de Schistosoma mansoni, para

melhor compreensão do potencial esquistossomicida desta espécie vegetal.

3.2 Objetivos específicos

Obter o óleo essencial, frações e caracterizar as principais substâncias

químicas, por meio de técnicas cromatográficas e métodos

espectrométricos de análise;

Realizar triagem in vitro das frações e substâncias majoritárias do óleo

essencial, sobre vermes adultos de S. mansoni;

Identificar o efeito dos sesquiterpenos sobre o sistema excretor e

integridade de membrana de S. mansoni, após exposição in vitro, utilizando

marcadores fluorescentes específicos;

Analisar as possíveis alterações morfológicas dos parasitas por meio da

microscopia eletrônica de varredura (MEV), após tratamentos in vitro e in

vivo;

Avaliar, in vivo, o efeito dos tratamentos com o óleo essencial e

sesquiterpenos, em diferentes períodos de infecção da esquistossomose

experimental, analisando os seguintes parâmetros parasitológicos: redução

da carga parasitária, quantidade os ovos eliminados nas fezes (OPG),

classificação dos ovos distribuídos no tecido intestinal (Oograma), efeito dos

tratamentos na formação de granulomas hepático, por meio de observações

histológicas.

Avaliar in vivo, a associação entre o Óleo Essencial + PZQ (OE+PZQ)

contra os diferentes estágios de desenvolvimento (esquistossômulos,

vermes jovens e adultos) de S. mansoni.

40

Material & Métodos

4.Material & Métodos

41

Material & Métodos

4.1 Material Vegetal

Esta etapa do trabalho foi realizada na Divisão de Química Orgânica e

Farmacêutica (DQOF) do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas

e Agrícolas (CPQBA) - Unicamp.

4.1.1 Obtenção do óleo essencial (OE) da B. trimera

A obtenção do óleo essencial da B. trimera (Figura 7) foi realizada por

hidrodestilação em sistema do tipo Clevenger, a partir das folhas frescas e talos da

B. trimera. A extração também foi realizada em larga escala por arraste a vapor em

equipamento de inox de 210 L durante três horas. O óleo resultante foi separado da

fase aquosa em funil de separação e estocado em freezer em frasco apropriado.

Figura 7: Obtenção do óleo essencial a partir das folhas frescas da B. trimera através do sistema de hidrodestilação

(DQOF). Fonte: arquivo pessoal.

4.1.2 Fracionamento do óleo essencial (OE) em Coluna Cromatográfica do

tipo Seca (CS)

Para fracionamento de 1g do OE utilizou-se como suporte da fase

estacionária uma membrana de acetato de celulose de 32 cm de comprimento e

1,7 cm de diâmetro. Inicialmente, a membrana foi preenchida com 50 g de sílica gel

60 Merck® (0,063 -0,200 mm). Sequencialmente, adicionou-se 1 g de OE sobre a

sílica. Após adição do OE procedeu-se a eluição com fase móvel (diclorometano

70: 30 v/v). Ao término da eluição, a coluna foi dividida em três frações de 8 cm

cada, denominadas FCS-1, FCS-2, e FCS-3. Posteriormente, as frações foram

42

Material & Métodos

filtradas em balões de fundo redondo de 250 mL, utilizando-se funil de placa

porosa, e evaporadas a vácuo em rotaevaporador até a total remoção do solvente.

4.1.3 Fracionamento do óleo essencial (OE) em Coluna Cromatográfica do

tipo Clássica- (CC)

Para fracionamento do OE por CC (Figura 8) utilizou-se como suporte da

fase estacionária uma coluna clássica de vidro. A coluna foi preenchida com 50 g

de sílica gel 60 Merck® (0,040 -0,63 mm) para coluna de flash. Sequencialmente,

adicionou-se 1 g de OE, seguido do eluente diclometano (70: 30 v/v). Ao iniciar a

eluição as frações foram recolhidas em 53 tubos de ensaios, sendo que os 10

primeiros estavam totalmente cheios, e os demais, apresentavam metade do

eluição da coluna. Após recuperação das frações, foi adicionada uma solução 1:1

de diclometano + acetado de etila, para total eluição da coluna. O conteúdo foi

recolhido em erlenmeyer de 250mL.

Figura 8: Obtenção das frações de OE por coluna clássica. (A) - Obtenção das frações em tubos de ensaios (B) - eluição

final em erlenmeyer de 250 mL (DQOF). Fonte: arquivo pessoal.

4.1.4 Análises Cromatográficas 4.1.5 Cromatografia por Camada Delgada (CCD)

Para avaliar o perfil químico das frações do OE, obtidas por CS e CC, utilizou-

se a Cromatografia por Camada Delgada- CCD (Figura 9). Para isto, utilizou-se

cromatoplacas de sílica gel 60 F254 – Merck® (0,063 - 0,200 mm).

43

Material & Métodos

Para preparo das amostras foi utilizado como fase móvel diclorometano (97:3

v/v). Com auxílio de uma microseringa foi aplicado 1µL de cada amostra nas

cromatoplacas. Sequencialmente, as placas foram colocadas em cubas de vidro

fechadas, contendo diclorometano para dar inicio ao processo de evaporação e

condensação da fase móvel. Após este processo, as placas foram retiradas das

cubas e a revelação dos compostos foi realizada primeiramente por irradiação sob

lâmpada Ultravioleta – UV a 254 e 366 nm. Em seguida, as placas foram

pulverizadas com solução de anisaldeído (ácido acético: ácido sulfúrico:

anisaldeído 50, 0:1, 0:0,5 v/v) para revelação das placas e colocadas em estufa

aquecida a 100º C por 5 min (Wagner & Bladt, 1996).

4.1.6 Cromatografia de Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM)

As frações do OE, obtidas por coluna clássica (CC), foram diluídas em 1mL

de acetato de etila e analisadas por CG/EM em cromatógrafo Agilent 6890 N e

detector de espectrometria de massas Agilent 5975 e coluna HP5-MS (J&W

Scientific) contendo 5% de Fenilmetilsiloxano, com 30 mm de comprimento, 0,25

mm de diâmetro e 0,25 μm de espessura de filme. As condições cromatográficas

foram: Temperaturas: injetor= 220°C, detector= 250°C, coluna= 60°C, 3°C.min-1,

240°C e vazão do gás de arraste (He) 1,0 mL.min-1. Para todas as análises o

detector de espectrometria de massas foi operado com temperaturas de fonte

230°C, do quadrupolo a 150 °C e energia de ionização de 70 eV.

As substâncias foram identificadas por comparação dos espectros de massas

obtidos com os da biblioteca espectral do equipamento NIST-0 (Natural Institute of

Standards and Technology), co-injeção de padrões de hidrocarbonetos para

calcular os índices de retenção (IR’s), e análise dos dados obtidos como descritos

por Adams (2007).

4.2. Substâncias e Sondas fluorescentes

Os sesquiterpenos (Figura 9) foram obtidos na Sigma-Aldrich® (St. Louis, MO,

USA). O princípio ativo praziquantel (PZQ) foi obtido na Merck® (São Paulo, SP,

Brazil). As sondas fluorescentes, Resorufin foi obtida na Sigma-Aldrich® (St. Louis,

MO, USA) e Hoechst 33258 na Life Technologies®.

44

Material & Métodos

Figura 9: Fórmulas moleculares dos sesquiterpenos e sondas flurescentes.

Especificações das sondas fluorescentes

Resorufin: É um sal sódico (7-hidroxi 3-fenoxazina), de natureza

fluorescente considerado um substrato específico da P-glicoproteína

(Pgp). Essa sonda difunde-se passivamente através do tegumento dos

vermes adultos de S. mansoni sendo excretada através da Pgp, proteína

expressa no epitélio excretor do S. mansoni (Couto et al., 2010). Desta

forma, é possível avaliar o efeito dos compostos sesquiterpernos (alfa-

humuleno e trans-cariofileno) sobre o funcionamento do sistema excretor

do parasita.

Hoechst 33258 (bis-Benzamida): É uma sonda hidrofílica usada

como marcador de DNA específico. Esta sonda se difunde para o

interior da célula quando há lesões, atuando como indicador da

integridade de membrana (Oliveira et al., 2006). Assim, é possível

avaliar o efeito dos compostos (alfa-humuleno e trans-cariofileno)

sobre possíveis alterações na membrana tegumentar de vermes

adultos de S. mansoni.

45

Material & Métodos

4.3 Modelo Biológico

4.3.1 Parasitas e infecção dos animais

Para realização dos ensaios biológicos, foi utilizada a linhagem BH de S.

mansoni oriunda de Belo Horizonte, MG, Brasil. Esta linhagem é mantida em

moluscos planorbídeos Biomphalaria glabrata e camundongos Mus musculus

Swiss-SPF no departamento de Biologia Animal do Instituto de Biologia da

Unicamp laboratório de Helmintologia.

A infecção dos camundongos foi realizada através da imersão caudal em

suspensão cercariana contendo 70 cercárias de acordo com Oliver & Stirewalt

(1952). Para realização dos ensaios in vitro, foram infectados camundongos Swiss-

SPF fêmeas. Para os ensaios in vivo foram infectados camundongos Balb/C

fêmeas ambas linhagens com 30 dias de idade. Os animais foram fornecidos pelo

Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Unicamp.

4.3.2 Ensaios de atividade esquistossomicida in vitro

Preparo das amostras

O óleo essencial, as frações (FCS1, FCS2, FCS3), frações (FCC 1 a FCC11),

os sesquiterpenos alfa-humuleno, trans-cariofileno e o PZQ, foram solubilizados em

solução tampão Phosphate Buffered Saline (PBS) acrescida de 0,1% de Tween 80

(Polysorbate) Merck®. Para auxiliar a solubilização foi utilizado aparelho de

ultrassom e Vórtex (Merse ®).

Concentrações avaliadas

Foram avaliadas quatro concentrações de cada amostra: 25 μg/mL; 50 μg/mL;

100 μg/mL e 200 μg/mL. Os vermes do grupo controle farmacológico foram

expostos a concentração de 10 μg/mL de PZQ. Enquanto que os do controle foram

mantidos apenas em meio RPMI-1640 sem adição fármacos.

46

Material & Métodos

4.3.3 Obtenção dos vermes e cultura in vitro dos parasitas Após 45 dias de infecção dos camundongos, vermes adultos de S. mansoni

foram obtidos por meio da perfusão do sistema porta hepático e veias

mesentéricas, de acordo com Smithers & Terry (1965). Os vermes recuperados

foram cuidadosamente lavados duas vezes em meio de cultura RPMI 1640

(Nutricel®) suplementado com 0.05 g/L de estreptomicina, 10.000 UI/ml de

penicilina, 0.3 g/L de L-glutamina, 2.0 g/L de D-glucose, 2.0 g/L de NaHCO3 e

5.958 g/L de Hepes.

Após lavagem dos vermes, foi transferido um casal para cada poço de uma

placa de cultura de 24 poços (TPP, St. Louis, MO, USA). Foram adicionadas as

concentrações 25 - 200 μg/mL das respectivas amostras e 10 μg/mL do PZQ

(controle farmacológico), totalizando um volume final de 2 mL de RPMI-1640 para

cada poço. Sequencialmente as placas foram incubadas em estufa de CO2 5% a

temperatura de 37ºC e observadas conforme os parâmetros citados abaixo.

Parâmetos avaliados

A maioria dos parâmetros avaliados durante os ensaios in vitro foram

qualitativos, conforme descrito por outros autores (Barker et al., 1966; Da-Silva &

Noel, 1995; Beckmann & Grevelding, 2010; De Oliveira et al., 2012 e 2014, Frezza,

2012). Todos os ensaios foram realizados em cinco réplicas. As placas foram

observadas em intervalos de 2 a 6h, 24h, 48h e 72h por meio de microscópio

invertido Leica® DMI-500.

A) Avaliação da motilidade: foi atribuída uma escala de 0 a 3 para

avaliação da motilidade dos parasitas: sendo- (0) para ausência de motilidade; (1)

para motilidade baixa; (2) para motilidade moderada e (3) para motilidade intensa.

B) Acasalamento: observou-se a separação dos casais de vermes após

a exposição as amostras avaliadas nas primeiras horas de incubação.

C) Capacidade reprodutiva: Foram quantificados os ovos eliminados

após a exposição as amostras avaliadas nas primeiras horas de incubação.

D) Alterações morfológicas e tegumentares: considerou-se alterações

morfológicas aquelas observadas nos órgãos internos e ventosas, oral e

acetabular. Considerou-se alterações no tegumento quando houve peeling e/ou

destruição de tubérculos dos vermes machos (Figura 10).

47

Material & Métodos

Figura 10: (A) alteração do órgão interno na região anterior da fêmea;(B) -alterações na ventosa oral e descamação do tegumento do verme macho e fêmea.

E) Mortalidade dos parasitas: este parâmentro foi avaliado de forma

quantitativa onde considerou-se morto os parasitas que apresentavam ausência de

movimento até pelo menos 1 minuto de observação.

4.3.4 Avaliação da atividade do sistema excretor de S. mansoni após

incubação in vitro com alfa-humuleno e trans-cariofileno utilizando a sonda

Resorufin

A avaliação do sistema excretor de vermes adultos de S. mansoni foi

realizada de acordo com Couto et al. (2010), com pequenas modificações. Após

recuperação dos vermes adultos, conforme descrito no item 4.3.3, um casal de

vermes separados foi transferido para cada poço de uma placa de cultura de 24

poços contendo 2mL de meio RPMI-1640 (Nutricel®), suplementado com 5% de

Soro Fetal Bovino (SBF), 0.05 g/L de estreptomicina, 10.000 UI/ml de penicilina, 0.3

g/L de L-glutamina, 2.0 g/L de D-glucose, 2.0 g/L de NaHCO3 e 5.958 g/L de Hepes

e incubados por 30 minutos em estufa de CO2 5% a temperatura de 37ºC.

Após incubação, foi adicionado 10 μL de Resorufin (solução estoque de 10

mg/mL). Sequencialmente as placas foram incubadas por mais 30 minutos.

Após esse período, os vermes foram lavados cinco vezes com meio RPMI-

1640 contendo 0.3% de Soro Albumina Bovina (BSA), para retirar o excesso da

sonda. Após lavagem, adicionou-se um novo meio de cultura suplementado com

Soro Fetal Bovino (SBF) e acrescentou-se 200 μL de alfa-humuleno e trans-

cariofileno, totalizando um volume final de 2 mL por poço. Os vermes do grupo

B

48

Material & Métodos

controle farmacológico foram expostos a concentração de 2 μg/mL de PZQ e

incubados por 15 minutos.

Após adição das amostras, as placas foram incubadas por quatro horas em

estufa de CO2 5% a temperatura de 37ºC. Os vermes do grupo controle foram

mantidos por quatro horas em meio RPMI-1640 acrescido de 10 μL de Resorufin.

Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

Ao término da incubação, os vermes foram lavados por mais cinco vezes com

meio RPMI-1640, contendo 0.3 % de BSA e foram transferidos para lâminas de

microscopia, demarcadas com vaselina e cobertos com uma lamínula. As

observações do sistema excretor e as imagens foram obtidas em Microscópio de

Fluorescência Zeiss® Axion Imager - A.2, utilizando filtro rodamina com excitação

máxima 571/585 nm.

4.3.5 Avaliação da integridade de membrana de S. mansoni após incubação in

vitro com alfa-humuleno e trans-cariofileno utilizando a sonda Hoechst 33258

Os vermes foram coletados e incubados, conforme descrito acima. Após 30

minutos de incubação foi adicionado 200 μL dos sesquiterpenos alfa-humuleno e

trans-cariofileno, totalizando um volume final de 2mL por poço. As placas foram

incubadas por 4 horas em estufa de CO2 5% a temperatura de 37ºC. Os vermes do

grupo controle farmacológico foram expostos a concentração de 2 μg/mL de PZQ e

incubados por 15 minutos.

Após esse período os vermes foram lavados cinco vezes com meio RPMI-

1640 contendo 0.3% de Soro Albumina Bovina (BSA) para retirar o excesso dos

compostos e fármaco. Sequencialmente, adicionou-se 10μL Hoechst 33258

(solução estoque de 10mg/mL) e as placas foram incubadas por 15 minutos.

Vermes do grupo controle foram mantidos por quatro horas em meio RPMI-1640

acrescido de 10 μL de Hoechst. Os experimentos também foram realizados em

triplicata. Ao término da incubação os vermes foram lavados por mais cinco vezes

com meio RPMI-1640, contendo 0.3% de BSA e foram transferidos para lâminas de

microscopia demarcadas com vaselina e cobertos com uma lamínula. As

observações da integridade de membrana e as imagens foram feitas em

Microscópio de Fluorescência Zeiss® Axion Imager-A.2, utilizando filtro DAPI com

excitação máxima 33258 a 352/455 nm.

49

Material & Métodos

4.3.6. Análises Morfológicas e Tegumentares dos parasitas por Microscopia

Eletrônica de Varredura (MEV)

Para análise deste parâmetro foram realizados ensaios in vitro e in vivo. Para

os ensaios in vitro, os vermes foram expostos a concentração de 100 μg/mL e

incubados por 24 horas em estufa de CO2 5% a 37°C. Após incubação os vermes

foram lavados em tampão Cacodilato de sódio (pH 7.2). Para os ensaios in vivo, os

vermes foram recuperados 48 horas após tratamentos com trans-cariofieno (100

mg/kg, 56 dias pós infecção (dpi) e OE+PZQ (100+40 mg/kg, 56 dpi). Os vermes

foram fixados, separadamente, em glutaraldeído 2.5 % (pH 7.4) durante 24 horas e

pós fixadas em tetróxido de ósmio 1% por 1 hora. A desidratação foi realizada em

uma série crescente (50, 70, 80, 90 e 100%) de etanol. Após desidratação, as

amostras foram secas em uma câmara de ponto crítico. Sequencialmente, as

mesmas foram montadas sobre stubs e cobertas com uma fina camada de ouro no

sputter coat. O material foi analisado e fotografado em Ultramicroscópio Eletrônico

de Varredura de Jeol- JSM- 820.

4.3.7 Ensaios de atividade esquistossomicida In vivo

Formação dos grupos experimentais

Para estudos in vivo, foram alocados oito grupos experimentais (n=10)

animais que receberam dose única de 100 mg/kg das amostras avalidas em

diferentes períodos de infecção da esquistossomose.Também avaliamos a

associação do OE+PZQ (07, 21 e 56 dpi). Os animais do grupo controle - infectado

e não tratado- receberam 0.3mL PBS, nos respectivos períodos de infecção (07, 21

e 56 dpi) (Figura 11).

50

Material & Métodos

Figura 11: Esquema dos grupos experimentais nos diferentes períodos dos tratamentos. (n=10 animais para cada

período de tratamento.

4.3.8 Acompanhamento e análises dos tratamentos

Após tratamentos em diferentes períodos de infecção os camundongos foram

analisados conforme ilustrado na Figura 12. Os animais foram eutanasiados por

deslocamento cervical e submetidos à perfusão do sistema porta-hepático de

acordo com Pellegrino & Siqueira, (1956). Os vermes recuperados foram colocados

em placa de Petri, contendo solução fisiológica 0.9%. Estes foram quantificados e

identificados segundo o sexo e vermes acasalados, bem como a localização em

que se encontravam (veia porta, mesentério e órgãos).

Figura 12: Esquema de infecção, períodos dos tratamentos, perfusão e análise dos camundongos.

51

Material & Métodos

4.3.9 Parâmetros parasitológicos avaliados

Redução do número de vermes

Para avaliar a eficácia dos tratamentos, foram calculadas as taxas de redução

do número de vermes (RV) recuperados após a perfusão do sistema porta-

hepático. As porcentagens de redução foram obtidas de acordo com Delgado et al.

(1992), por meio da fórmula:

(%) RV = a – b x 100

a

Onde: a = média do número de vermes recuperados do grupo controle; b = média do número de vermes recuperado dos grupos tratados.

Contagem de ovos eliminados nas fezes (OPG)

Antes da eutanásia foram coletadas as fezes dos animais para quantificar os

ovos eliminados após os tratamentos. Para este parâmetro foi empregado o

método quantitativo de Kato-Katz (Katz et al., 1972). Para avaliar a eficácia dos

tratamentos, também foram calculadas as taxas de redução do número de ovos

(RO) por gramas de fezes.

Onde: a = média do número OPG do grupo controle; b = média do número OPG dos grupos tratados.

Oograma

Para análise deste parâmetro, foi retirado um fragmento (1cm) do intestino

grosso (cólon ascendente) de cada animal tratado para avaliar o efeito dos

tratamentos sobre a oviposição e maturação dos ovos: 1º a 4º estágios (ovos

imaturos) 5º estágio (ovos maduros), ovos mortos e cascas. Para tanto, foram

analisados 10 campos aleatórios em microscópio óptico com aumento de 10x

52

Material & Métodos

vezes. A classificação dos estágios de desenvolvimento dos ovos está de acordo

com o critério proposto por Hermeto et al. (1994).

Histopatologia

Para estudos histológicos foi retirado o lóbulo direito do fígado de três

animais, escolhidos aleatoriamente, e fixados em formol 10%. Os fragmentos

fixados em formaldeído 10% foram desidratados em concentrações crescentes de

etanol, diafanizadas em xilol, e incluídos em parafina. Esse experimento teve como

objetivo quantificar, medir os diâmetros e observar o infiltrado celular inflamatório

ao redor dos granulomas. Para tais avaliações utilizou-se a microscopia de campo

claro. Foram quantificados todos os granulomas presentes em 10 campos

aleatórios do corte histológico. Porém, somente foram medidos os diâmetros, maior

e menor, dos granulomas que apresentavam um ovo de S. mansoni no seu interior.

Os diâmetros foram medidos através do software Leica®. Para uma melhor

delimitação da reação granulomatosa, os cortes histológicos foram corados com

Tricrômio de Masson. As imagens foram captutadas em Fotomicroscópio com

auxílio do software Leica® LAS EZ4 HD.

5. Ensaios Toxicológicos

A determinação da toxicidade aguda do óleo essencial foi realizada com uma

linhagem de queratinócitos humanos (HaCaT) (de Oliveira et al., 2012). Os ensaios

com sesquiterpenos foram baseados nos estudos descritos na literatura por

Fernandes et al. (2007) e Ziaei et al. (2010).

5.1 Análises Estatísticas

Para a análise estatística dos dados foi aplicado o teste Two-way ANOVA

utilizado para comparar as medianas das respostas entre os grupos experimentais

com os grupos controles, considerando-se estatisticamente significativos os valores

de P˂0.05. Os testes estatísticos foram realizados com auxílio do software

Graphpad Prism (versão 6.0).

53

Material & Métodos

5.2 Comitê de Ética

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de

Ética para Uso de Animais CEUA/Unicamp, de acordo com os princípios éticos de

experimentação animal, adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

(COBEA) sob protocolo nº 2753-1.

54

Resultados & Discussão

6. Resultados e Discussão

55


6.1 Análise Fitoquímica

6.1.1 Obtenção e rendimento das frações obtidas a partir do óleo de B.

trimera

Nos fluxogramas abaixo (Figuras 13 e 14), está esquematizado o

fracionamento por Coluna Cromatográfica do tipo Seca (CS) e por Coluna

Cromatográfica do tipo Clássica (CC), a partir de 1g do óleo e seus respectivos

rendimentos. Foram obtidas três frações por CS e cinquenta três frações por CC.

No entanto, as frações obtidas por CC, foram analisadas previamente por

cromatografia gasosa. Após análises, observou-se semelhantes perfis químicos,

então, as frações foram reagrupadas, obtendo-se um total de onze frações. Após

análises cromatográficas, as amostras foram submetidas aos ensaios de atividade

biológica, in vitro, contra vermes adultos de S. mansoni linhagem BH. Os

rendimentos finais de cada fração foram considerados baixos e apresentaram

valores variados, sendo estes calculados de acordo com a massa inicial do óleo

essencial.

Figura 13: Fluxograma dos rendimentos das frações (FCS1, FCS2 e FCS3) obtidas a partir de 1g do óleo essencial de B.

trimera por coluna cromatográfica do tipo seca (CS).

Figura 14: Fluxograma dos rendimentos das frações (FCC1 a FCC11), obtidas a partir de 1g do óleo essencial de B.

trimera por coluna cromatográfica do tipo clássica (CC).

56


6.1.2 Análises Cromatográficas por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

A investigação preliminar dos constituintes químicos de uma determinada

espécie vegetal possibilita o conhecimento prévio das substâncias presentes,

facilitando a escolha de técnicas cromatográficas (Maciel et al., 2002). Na química

orgânica a Cromatografia de Camada Delgada (CCD) pode ser utilizada como uma

ferramenta eficaz de análise qualitativa, para a identificação de compostos por

comparação de padrões existentes na literatura, que pode direcionar estudos para

isolamento e purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis

de uma mistura (Silva et al, 2009, Wagner & Blad, 1996).

Neste estudo as análises por CCD referentes ao fracionamento por coluna

cromatográfica do tipo seca (Figura 15) e do tipo clássica (Figura 16) relevaram

bandas de coloração e intensidades características, para cada classe de

compostos identificados, quando os cromatogramas foram observados sob a

irradiação UV (λ 254 e 366 nm) utilizando solução de anisaldeído e comparados

com padrões da literatura.

Figura 15: Perfil cromatográfico do OE e frações obtidas por coluna cromatográfica do tipo seca (CS), revelando substâncias de diferentes polaridades. Eluente: CH2Cl2 (97:3 v/v) e revelador anisaldeído.

57


Figura 16: Perfil cromatográfico das frações obtidas por coluna cromatográfica do tipo clássica (CC), revelando substâncias

de diferentes polaridades. Eluente: CH2Cl2 (97:3 v/v) (97:3 v/v) e revelador anisaldeído.

6.1.3 Análises por Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrômetro de Massas

(CG-EM)

A cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas é um dos

métodos mais indicados para identificar a composição química dos óleos

essenciais (Adams, 1995). Quimicamente, a grande maioria dos óleos essenciais é

constituída de derivados fenilpropanóides ou de terpenóides, sendo que estes

últimos predominam (Simões & Spitzer, 2007).

Neste estudo, as substâncias identificadas no óleo essencial da espécie B.

trimera, pertencem a classe dos monoterpenos e sesquiterpenos, conforme

sumarizado na tabela 2. Os monoterpenos identificados foram β- pineno e β-

mirceno. Os demais compostos, pertencem a classe dos Sesquiterpenos, sendo

alguns, identificados com maiores índices de % relativa (trans-cariofileno,

Germacreno D, Biciclogermacreno, alfa-humuleno e espatulenol), representados na

tabela 2.

No entanto, a constituição química dos óleos essenciais pode variar de

acordo com períodos sazonais. Um estudo fitoquímico realizado por Della Torre

(2013) revelou que os compostos majoritários presentes no OE de B. trimera, no

58


período de doze meses, foram: biciclogermacreno (12,64% a 22,18%), trans-

cariofileno (12,14% a 16,72%), germacreno D (7,03% a 14,15%), β-pineno (4,98%

a 10,66%), globulol (3,68% a 7,62%), β-mirceno (2,39% a 7,40%) e δ-cadineno

(5,11% a 6,56%).

Observamos neste estudo, que após o fracionamento do óleo essencial por

coluna seca (CS) o perfil cromatográfico da FCS1 apresentou semelhança com o

cromatograma do OE (Figura 17). Contudo, nas FCS2 e FCS3, observou-se

menores porcentagens de monoterpenos e maiores porcentagens de

Sesquiterpenos. (Figuras 18 a 20).

As análises cromatográficas das frações do OE, obtidas por Cromatografia

do tipo Clássica (CC) também revelaram, com predominância, compostos

pertencentes a classe dos terpenóides e ausência de monoterpenos quando

comparados com o OE puro. Estas análises podem ser visualizadas nos

cromatogramas representados nas figuras 22 a 25.

Substâncias terpenóides são formadas por unidades do isopreno (C5H8).

Entretanto os monoterpenos são formados por duas unidades do isopreno (10

carbonos), os sesquiterpenos, por sua vez, são formados por três unidades do

isopreno (15 carbonos), os diterpenos por 20 unidades de carbonos, os triterpenos

por 30 unidades de carbono e os tetraterpenos por 40 unidades de carbono

(Bruneton, 1991).

Dentre os terpenóides, os terpenos são a principal classe, ou seja, são os

principais componentes dos óleos essenciais. Entre as substâncias identificadas na

composição química do OE de B. trimera, (trans-cariofileno, alfa-humuleno e

espatulenol), apresentaram-se nas frações FCC1, FCC6 e FCC9, respectivamente

(Figuras 18 a 22).

59


Tabela 2: Relação das substâncias do OE de B. trimera identificados por CG-EM. Foram identificados maior índice de retenção de compostos Sesquiterpenos. tR: tempo de retenção, IRcal: índice de retenção calculado; IRlit: índice de retenção obtido com dados na literatura (Adams, 2007).

Tr (min) Substâncias Fórmula

Molecular

IRcal IRlit % Relativa

7,17 β-Pineno C10H16 978 979 2,25

7,54 β-Mirceno C10H16 991 990 2,11

22,91 α-Copaeno C15H24 1375 1376 1,18

23,60 β-Elemeno C15H24 1392 1390 1,20

24,83 Trans-cariofileno C15H24 1421 1419 14,77

25,51 α-Guaieno C15H24 1438 1439 2,55

26,10 α-Humuleno C15H24 1453 1454 2,05

27,14 -Muuroleno C15H24 1478 1479 2,95

27,34 Germacreno D C15H24 1483 1485 15,31

27,95 Biciclogermacreno C15H24 1498 1500 14,67

28,02 α-Muuroleno C15H24 1500 1500 1,25

28,22 -Guaieno C15H24 1505 1509 1,40

28,54 -Cadineno C15H24 1513 1513 1,37

28,96 -Cadineno C15H24 1524 1523 6,83

31,00 Espatulenol C15H24O 1577 1578 2,04

31,25 Globulol C15H26O 1584 1590 4,19

31,53 Viridiflorol C15H24 1591 1592 2,00

31,91 Ledol C15H26O 1601 1602 1,30

33,41 -Muurolol C15H26O 1642 1642 3,00

33,87 α-Cadinol C15H26O 1654 1652 2,34

60


Figura 17: Cromatograma do Óleo essencial de B. trimera obtido por CG- EM. Onde foram identificadas substâncias

pertencentes a classe dos terponóides, monoterpenos e sesquiterpenos.

Figura 18: Cromatograma da fração FCS1 obtida por Coluna Cromatográfica Seca (CS) e analisada por CG- EM. Foram

identificadas semelhanças com o perfil químico do OE entre os índices de retenção de monoterpenos e de sesquiterpenos.

61


Figura 19: Cromatograma da fração FCS2 obtida por Coluna Cromatográfica Seca (CS) e analisada por CG- EM. Onde

foram identificados menores índice de retenção de monoterpenos e maiores índicies de sesquiterpenos.

Figura 20: Cromatograma da fração FCS3 obtida por Coluna Cromatográfica Seca (CS) e analisada por CG- EM. Onde

foram identificados menores índices de retenção de monoterpenos e maiores índicies de sesquiterpenos.

62


Figura 21: Cromatograma da fração FCC1 obtida por Coluna Cromatográfica Clássica (CC) e analisada por CG- EM. Onde

foram identificados maior índice de retenção de sesquiterpenos com maior % relativa de trans- cariofileno.

Figura 22: Cromatograma da fração FCC5 obtida por Coluna Cromatográfica Clássica (CC) e analisada por CG- EM. Onde

foram identificados maior índice de retenção sesquiterpenos com maior % relativa de alfa-humuleno.

63


Figura 23: Cromatograma da fração FCC6 obtida por Coluna Cromatográfica Clássica (CC) e analisada por CG- EM onde

foram identificados maior índice de retenção de Sesquiterpenos.


foram identificados maior índice de retenção de sesquiterpenos.

64




Figura 26: Cromatograma da fração FCC9 obtida por Coluna Cromatográfica Clássica (CC) e analisada por CG- EM. Onde foram identificados maior índice de retenção de sesquiterpenos com maior % relativa de espatulenol.

65




.

66


6.2 Resultados e Discussão: Ensaios in vitro

67


6.2.1 Efeito do Óleo essencial, Frações e Sesquiterpenos sobre a atividade

motora de S. mansoni.

Os primeiros estudos para avaliação da atividade motora de S. mansoni

expostos a fármacos foram realizados qualitativamente, em escala visual (Bennett &

Bueding, 1971). Desde então, o sistema neuromotor de S. mansoni representa um

importante alvo para o estudo de novos fármacos esquistossomicidas.

No presente estudo seguiu-se o mesmo parâmetro qualitativo, no qual

estabeleceu-se uma escala de movimentação de 0 - 3 para avaliação da motilidade

dos parasitas, expostos a diferentes tratamentos onde foi possível observar uma

redução significativa (p< 0,0001) na motilidade dos vermes machos e fêmeas após

72 horas de incubação. As frações FCC 2, 3, 4 e 11 não apresentaram efeito

esquistossomicida para nenhum parâmetro in vitro avaliado.

Observou-se que a redução da atividade motora dos parasitas foi diretamente

proporcional a concentração e período de incubação das amostras avaliadas,

sobretudo, àquelas que não ocasionaram um efeito letal nos parasitas (Tabelas 3 a

9).

Entretanto, as amostras que ocasionaram maior atividade sobre a motilidade

dos vermes em menor período de incubação, onde observamos uma escala de

movimentação (1), nas primeiras seis horas de incubação e ausência de motilidade

após 24 horas, nas concentrações de 50 a 200 µg/mL, foram: OE (Tabela 3), FCS3

(Tabela 4), FCC6 e FCC7 (Tabela 7), e frações FCC8 e FCC9, respectivamente

(Tabela 8).

Estas amostras apresentaram um efeito dose-resposta, quando comparadas

com os parasitas do grupo controle, mantidos apenas em RPMI- 1640 no qual os

vermes permaneceram com motilidade intensa (3) até o final das observações, ou

seja, 72 horas. Os tratamentos com os sesquiterpenos alfa- humuleno e trans-

cariofileno ocasionaram redução da motilidade significativa somente após 24 horas

de incubação nas concentrações de 100 e 200 2. Contudo, observou-se ausência de

movimento para estas concentrações, após 72 horas de incubação em 20 e 80 %

dos vermes, respectivamente (Tabelas 1 e 2).

A elevada sensibilidade deste ensaio também permitiu observar diferenças

sutis entre os grupos avaliados, desde a paralisia dos vermes a variações de

68


movimentos, os quais se diferenciaram entre ondulatórios, peristálticos prolongados

ou rápidos, através do encurtamento corporal e perda de aderência da ventosa

ventral e capacidade de fixação sobre a placa de cultura após a aplicação das

amostras nas primeiras horas de incubação.

De acordo com Pêssoa et al. (2005) o controle da atividade motora de S.

mansoni é mediado por importantes neurotransmissores ou neuromoduladores os

quais são sintetizados e secretados pelo parasita. Alguns destes neurotransmissores

execercem funções particulares como exemplo, a serotonina, que atua como

neuromodulador excitatório da contração muscular do verme (Bruckner et al., 1974),

dopamina, sendo responsável pela motilidade e tônus muscular, a acetilcolina é

responsável pela parasilia muscular, a noradrenalina e glutamato, são responsáveis

pela motilidade e contração muscular (Mair et al., 2000, Noel, 2008, Mendonça –

Silva et al., 2004). Também estão envolvidos no controle da atividade motora do S.

mansoni os aminoácidos do tipo γ-ácido aminobutírico (GABA) e aos neuropeptídeos

(peptídeos da família FMRF-amidas - FaRPs) (Mair et al., 2000; Mendonça-Silva et

al., 2004).

As primeiras evidências farmacológicas sobre alterações na motilidade de

vermes machos e fêmeas de S. mansoni foram comprovadas quando os parasitas

foram expostos à oxamniquina, metrifonato, hicantona, lucantona e PZQ. Acredita-se

que estes fármacos atuam nos receptores de acetilcolina, noradrenalina e glutamato,

provocando paralisia e contrações musculares nos parasitas, respectivamente

(Dubois et al., 2009; Mendonça-Silva et al., 2004, Neves et al., 2010).

Nossos resultados corroboram com estudos anteriores os quais adotaram o

mesmo critério qualitativo para realização de ensaios in vitro com substâncias

esquistossomicidas isoladas de espécies vegetais em que os tratamentos

ocasionaram redução na motilidade de S. mansoni diretamente proporcional a

concentração e período de incubação (Magalhães et al., 2010, Moraes et al., 2010,

de Oliveira et al., 2012, Moraes et al., 2014, Guimarães et al., 2015).

Infere-se, portanto, que os tratamentos com OE e frações de B. trimera podem

atuar como receptores de alguns neurotransmissores do parasita, sobretudo,

noradrenalina e acetilcolina, proporcionando redução da motilidade e paralisia dos

adultos de S. mansoni. No entanto, estudos mais específicos são necessários para

confirmar esta hipótese.

69


Tabela 3: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes concentrações

do OE e Alfa-humuleno, até 72h de incubação.

Amostras (µg/mL)

Período de incubação

(horas)

Redução da atividade motora

___________________________________

Óleo essencial

Intensa Moderada Baixa Ausência

3 2 1 0

0 a 6 2 25 µg/mL 24 2

48 1 72 0 0 a 6 2

50 µg/mL 24 1 48 0 72 0 0 a 6 2

100 µg/mL 24 1 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

Alfa-humuleno

0 a 6 2 25 µg/mL 24 2

48 2 72 2 0 a 6 2

50 µg/mL 24 2 48 2 72 2 0 a 6 2

100 µg/mL 24 1 48 1 72 1 0 a 6 2

200 µg/mL 24 1 48 1 72 0

PZQ 0 a 6 0

CTRL 72 3

PZQ: Controle farmacológico. Vermes expostos a concentração de 10 µg/mL. Ausência de motilidade nas primeiras seis horas de incubação.

CRTL: Os vermes do grupo controle mantidos apenas em RPMI-1640, apresentaram motilidade intensa até 72 horas de incubação. Todos os ensaios foram realizados em cinco réplicas.

70



de Trans-cariofileno e FCS1, até 72h de incubação.

Amostras (µg/mL)


(horas)


_____________________________________

Trans-cariofileno Intensa Moderada Baixa Ausência

3 2 1 0

0 a 6 2 25 µg/mL 24 2

48 2 72 2 0 a 6 2

50 µg/mL 24 2 48 2 72 1 0 a 6 2

100 µg/mL 24 1 48 1 72 1 0 a 6 2

200 µg/mL 24 1 48 1 72 0

FCS 1

0 a 6 3 25 µg/mL 24 2

48 2 72 2 0 a 6 3

50 µg/mL 24 2 48 1 72 1 0 a 6 1

100 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

PZQ 0 a 6 0

CTRL 72 3



71



da FCS2 e FCS3, até 72h de incubação.

Amostras (µg/mL)


(horas)


_____________________________________

FCS2 Intensa Moderada Baixa Ausência 3 2 1 0

0 a 6 2 25 µg/mL 24 2

48 2 72 1 0 a 6 2

50 µg/mL 24 1 48 1 72 0 0 a 6 1

100 µg/mL 24 1 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

FCS 3

0 a 6 2 25 µg/mL 24 2

48 2 72 2 0 a 6 1

50 µg/mL 24 1 48 0 72 0 0 a 6 1

100 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

PZQ 0 a 6 0

CTRL 72 3


CRTL: Os vermes do grupo controle mantidos apenas em RPMI-1640, apresentaram motilidade intensa até 72

horas de incubação. Todos os ensaios foram realizados em cinco réplicas.

72


Tabela 6: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes

concentrações da FCC1 e FCC5, até 72h de incubação.

Amostras (µg/mL)


(horas)


_____________________________________

FCC1 Intensa Moderada Baixa Ausência 3 2 1 0

0 a 6 3 25 µg/mL 24 3

48 2 72 2 0 a 6 3

50 µg/mL 24 2 48 2 72 2 0 a 6 2

100 µg/mL 24 1 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

FCC 5

0 a 6 2 25 µg/mL 24 1

48 1 72 1 0 a 6 1

50 µg/mL 24 1 48 1 72 0 0 a 6 1

100 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

PZQ 0 a 6 0

CTRL 72 3



73


Tabela 7: Motilidade dos vermes adultos de S. mansoni após exposição à diferentes

concentrações da FCC6 e FCC7, até 72h de incubação.

Amostras (µg/mL)


(horas)


_____________________________________

FCC6 Intensa Moderada Baixa Ausência

3 2 1 0

0 a 6 2

25 µg/mL 24 1 48 1 72 1 0 a 6 1

50 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

100 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

FCC7

0 a 6 1 25 µg/mL 24 0

48 0 72 0 0 a 6 1

50 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

100 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

PZQ 0 a 6 0

CTRL 72 3 PZQ: Controle farmacológico. Vermes expostos a concentração de 10 µg/mL. Ausência de motilidade nas primeiras seis horas de incubação.


74



da FCC8 e FCC9, até 72h de incubação.

Amostras (µg/mL)


(horas)


_____________________________________

FCC 8 Intensa Moderada Baixa Ausência

3 2 1 0

0 a 6 1

25 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

50 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

100 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

FCC 9

0 a 6 1 25 µg/mL 24 0

48 0 72 0 0 a 6 1

50 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

100 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

PZQ 0 a 6 0

CTRL 72 3 PZQ: Controle farmacológico. Vermes expostos a concentração de 10 µg/mL. Ausência de motilidade nas primeiras seis horas de incubação.


75



da FCC10, até 72h de incubação.

Amostras (µg/mL)


(horas)


_____________________________________

FCC10 Intensa Moderada Baixa Ausência 3 2 1 0

0 a 6 2 25 µg/mL 24 1

48 1 72 1 0 a 6 1

50 µg/mL 24 1 48 0 72 0 0 a 6 1

100 µg/mL 24 0 48 0 72 0 0 a 6 1

200 µg/mL 24 0 48 0 72 0

PZQ 0 a 6 0

CTRL 72 3


CRTL: Os vermes do grupo controle mantidos apenas em RPMI-1640, apresentaram motilidade intensa até 72

horas de incubação. Todos os ensaios foram realizados em cinco réplicas.

76


6.2.2 Efeito in vitro do Óleo essencial, Frações e Sesquiterpenos sobre o

acasalamento e eliminação de ovos de S. mansoni

S. mansoni apresenta dimorfismo sexual acentuado e exibe uma co-

dependência entre machos e fêmeas (Galanti et al., 2012), uma vez que na ausência

do verme macho, as fêmeas não completam seu desenvolvimento e maturação

sexual (Armstrong 1965, Popiel et al., 1984). De acordo com LoVerde (2002) uma

parte do desenvolvimento da fêmea de S. mansoni acontece no canal ginecóforo,

estrutura presente nos vermes machos, onde ocorre o acasalamento e

consequentemente a maturação sexual e produção de ovos.

Nesse sentido, investigar a ação de substâncias que interferem no

acasalamento e na eliminação de ovos das fêmeas de S. mansoni, tornou-se um

alvo terapêutico importante. Fêmeas adultas eliminam grande número de ovos por

dia (cerca de 300) os quais são responsáveis tanto pela transmissão, como pela

patogênese da esquistossomose (Gryseels, et al., 2006).

Neste estudo investigamos, in vitro, a influência do OE, frações e compostos

alfa-humuleno e trans-cariofileno sobre o acasalamento e eliminação de ovos após

incubação das amostras até 72 horas.

Observou-se que todas as amostras avaliadas ocasionaram a separação dos

casais em todas concentrações testadas em diferentes períodos de incubação. No

entanto, 100% dos casais de vermes expostos as frações FCS2, FCS3, FCC5 a

FCC9, separaram nas primeiras 6 horas de incubação (Tabela 10).

De acordo com Popiel et al. (1984), a separação dos casais de vermes de S.

mansoni em cultura in vitro reduz significativamente a cinética de eliminação de

ovos. Outros estudos mostram que após a separação dos casais ocorre atrofia das

glândulas vitelínicas nas fêmeas regredindo para um estado imaturo em um período

de até 24 horas. Além disso, ocorre um decréssimo da expressão de genes

específicos, nesse caso o P14, que pode retardar ou suprimir a eliminação de ovos

(Galanti et al., 2012). Ainda de acordo com Galanti et al. (2012), a involução das

glândulas vitelínicas está associada a fatores como apoptose celular, diminuindo a

proliferação destas, na ausência do verme macho.

Nossos resultados mostram que os tratamentos ocasionaram redução na

eliminação de ovos, e supressão de 100% para os tratamentos com OE e frações

obtidas por coluna cromatográfica do tipo seca e do tipo clássica, em todas

77


concentrações avaliadas, sobretudo, nas concentrações que ocasionaram a

separação dos casais de vermes nas primeiras horas de exposição. Desta forma,

acreditamos que o principal evento responsável pela supressão de oviposição pode

estar relacionado a teoria de Galanti e colaboradores (2012), ou seja, à fatores como

apoptose das glândulas vitelínicas dos vermes fêmeas após separação dos casais

de vermes.

Em relação aos parasitas expostos aos sesquiterpenos, alfa-humuleno e trans-

cariofileno, observou-se a eliminação de ovos, com morfologia normal, nas

concentrações de 25 a 100 µg/mL a partir das primeiras 6 e 24 horas de incubação,

respectivamente (Tabela 10).

De acordo com Barth et al. (1996), fêmeas adultas de S. mansoni quando

cultivadas in vitro, apresentam três fases na cinética de eliminação de ovos. Nas

primeiras horas de incubação (pequena eliminação de ovos); após 24 horas

(eliminação progressiva); durante a fase final do cultivo (redução progressiva).

Nossos dados corroboram com a teoria de Barth e colaboradores (1996), uma

vez que observamos eliminação progressiva de ovos, nos tratamentos com alfa-

humuleno e trans-cariofileno e grupo controle, mantido apenas em RPMI- 1640,

entre 24 e 48 horas de incubação.

78

Tabela 10: Efeito dos tratamentos sobre a separação de casais de S. mansoni e eliminação de ovo até 72horas de incubação.

Controle*= Vermes mantidos em meio RPMI-1640 por 72 horas sem adição de compostos ou fármacos.

PZQ*= Controle farmacológico avaliado na concentração padrão de 10 µg/mL (de Oliveira et al., 2012).

*Todos os ensaios in vitro foram realizados em cinco réplicas.

Amostras Avaliadas

0- 6 horas

24 horas

48 horas

72 horas

(%) Separação de

casais

(%) oviposição/h

(%) Separação de

casais

Taxa de oviposição/h

(%) Separação de

casais

(%) Oviposição/h

(%) Separação de

casais

(%) oviposição/h

Óleo

essencial

80 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

Alfa-humuleno

0%

10%

40 %

60%

40 %

80%

40 %

80%

Trans-cariofileno

0%

0%

0 %

20%

20 %

40%

40 %

40%

FCS 1

60%

0%

100%

0%

100%

0%

100%

0%

FCS 2

100%

0%

100%

0%

100%

0%

100%

0%

FCS 3

100%

0%

100%

0%

100%

0%

100%

0%

FCC 1

80%

0%

100%

0%

100%

0%

100%

0%

FCC 5

100 %

0 %

100 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

FCC 6

100 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

FCC 7

100 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

FCC 8

100 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

FCC 9

100 %

0%

100 %

0 %

100 %

0 %

100 %

0 %

FCC 10

60 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

100 %

0%

PZQ*

10%

20 %

10 %

20 %

10 %

20 %

10 %

20 %

Controle*

0 %

40 %

0%

60%

20%

100%

20%

100%

79


6.2.3 Efeito do Óleo essencial, Frações e Sesquiterpenos sobre a Mortalidade

de S. mansoni

A triagem in vitro de substâncias químicas tem sua aplicação biológica

quando nos permite observar alterações fisiológicas, morfológicas ou provocar

efeito letal sobre o organismo estudado.

Neste parâmetro observou-se que a mortalidade dos vermes, machos e

fêmeas, ocorreu de forma dose - dependente, ou seja, foi diretamente dependente

da concentração avaliada e do período de exposição. Todas as amostras

provocaram mortalidade dos vermes, porém em diferentes porcentagens. Os

melhores resultados foram observados quando os parasitas foram expostos a

concentração de 200 µg/ mL do OE, o qual ocasionou 80% da mortalidade dos

vermes machos e fêmeas nas primeiras seis horas de incubação (Figura 28-A).

Adicionalmente, observamos que as concentrações de 100 e 200 µg/ mL das

frações FCS1 e FCS3 (Figura 29 A e C), bem como das frações FCC5 a FCC10

(Figuras 30 e 31), ocasionaram mortalidade de 100% dos vermes após 24 horas de

exposição. Em relação aos tratamentos com os compostos alfa-humuleno e

transacariofileno, observou-se baixas taxas de mortalidade dos vermes nas

concentrações de 100 a 200 µg/mL, representadas na figura 28 - B e C,

respectivamente.

Não se observou diferenças significativas em relação à sensibilidade aos

tratamentos, entre vermes machos e fêmeas, evidenciando que as amostras

avaliadas excercem ação esquistossomicida sobre ambos os sexos. Como controle

farmacológico, foi utilizada a concentração padrão (10µg/mL) do PZQ, estabelecida

por de Oliveira et al. (2012 e 2014). Observou-se 100% de mortalidade dos vermes

machos e fêmeas após 6 horas de incubação. Os parasitas mantidos em meio

RPMI- 1640, sem adição de amostras ou fármacos permaneceram viáveis até o

final do experimento, ou seja, 72 horas. As taxas de mortalidade dos vermes

adultos de S. mansoni, em um período exposição de até 72 horas, podem ser

observadas nas figuras 25 a 28.

Disparidades entre a suscetibilidade de vermes machos e fêmeas de S.

mansoni expostos a compostos naturais por meio de triagens in vitro já foram

descritas por alguns autores. Entre eles, Silva et al. (2014) relataram que vermes

machos são mais suscetíveis aos tratamentos com o terpeno nerolidol. Em

80


contraste, Mitsui et al. (2009), relataram que as fêmeas de S. mansoni, linhagem

Porto Rico, são mais sensíveis aos tratamentos com o composto sesquiterpeno

artesunato nas concentrações de 5, 10, 20 e 40 µg/mL.

Nossos dados corroboram o estudo realizado por Parreita et al. (2010), que

observaram taxa de mortalidade semelhante entre vermes machos e fêmeas de S.

mansoni, expostos ao óleo essencial de B. dracunculifolia, em 24 horas de

incubação. Resultados semelhantes também foram descritos por Mafud et al.

(2016) que avaliaram o monoterpeno dihydro citronellol sobre vermes adultos de S.

mansoni expostos a concentração de 80 µM e observaram 100 % de mortalidade

dos parasitas no mesmo período de exposição, 24 horas.

Segundo Mostafa & Soliman (2002), fêmeas de S. mansoni são menos

sensíveis aos tratamentos in vitro pelo fato de ficarem acasaladas no canal

ginecóforo dos vermes machos, tornando-se menos expostas aos fármacos

avaliados no microambiente. Entretanto, de acordo com Liang et al. (2010) a

suscetibilidade entre os sexos está relacionada a fatores genéticos e linhagem do

parasita.

81


Figura 28: Efeito do Óleo essencial de B. trimera (A) alfa-humuleno (B) trans-cariofileno (C) sobre a taxa de mortalidade dos

vermes adultos de S. mansoni em relação à concentração avaliada e período de incubação de 72 horas. Controle

farmacológico exposto a 10 µg/mL de PZQ.

0

20

40

60

80

100

25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL 200 µg/mL PZQ CTRL

Taxa

de

mo

rtal

idad

e d

os

verm

es

(%)


FCS3

0-6 h

24 h

48 h

72 h

0

20

40

60

80

100

25 µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL 200 µg/mL PZQ CTRL

Taxa

de

Mo

rtal

idad

e d

os

verm

es

(%)


FCS 2

0-6 h

24 h

48 h

72 h

0

20

40

60

80

100

25µg/mL 50 µg/mL 100 µg/mL 200 µg/mL PZQ CTRLTaxa

de

Mo

rtal

idad

e d

os

verm

es

(%)


FCS 1

0-6 h

24 h

48 h

72 h

A

CB

Figura 29: Efeito das frações (A) FCS1; (B) FCS2 e (C) FCS3, obtidas por Coluna Seca (CS) sobre a taxa de mortalidade

dos vermes adultos de S. mansoni em relação à concentração avaliada e período de incubação de 72 horas. Controle

farmacológico exposto a 10 µg/mL de PZQ.

FCS2 FCS3

82


Figura 30: Efeito das frações (A) FCC1; (B) FCC5; (C) FCC6 e (D) FCC7, obtidas por Coluna Clássica (CC) sobre a taxa de

mortalidade dos vermes adultos de S. mansoni em relação à concentração avaliada e o período de incubação de 72 horas. Controle farmacológico exposto a 10 µg/mL de PZQ.

Figura 31: Efeito das frações (A) FCC 8; (B) FCC 9; (C) FCC 10, obtidas por Coluna Clássica (CC) sobre a taxa de

mortalidade dos vermes adultos de S. mansoni em relação à concentração avaliada e o período de incubação de 72 horas. Controle farmacológico exposto a 10 µg/mL de PZQ.

83


6.2.4 Avaliação da atividade do sistema excretor e integridade de membrana de S. mansoni após incubação in vitro com sesquiterpenos alfa–humuleno e trans-cariofileno utilizando as sondas, Resorufin e Hoechst 33258

Maiores detalhes dos resultados e discussão destes ensaios estão em forma de artigo submetido ao Periódico Interantional Journal of Parasitology.

Após marcação do S. mansoni com Resorufin e posterior exposição aos

Sesquiterpenos, alfa-humuleno e trans-cariofileno e do PZQ (controle

farmacológico), observou-se uma marcação acentuada da sonda no tubo principal

e nas ramificações dos ductos excretores dos vermes fêmeas, evidenciando que os

tratamentos não influenciaram na atividade excretora do parasita (Figura 32 - A, C

e E). Contudo, observou-se que os vermes machos, apresentaram completa

inibição da atividade excretora, caracterizada pelo bloqueio do fluxo da resorufin

nos ductos excretores e ramificações do sistema excretor do parasita, onde foi

possível observar difusão da sonda em outros tecidos da extenção corporal do

verme (Figura 32 - B, D e F). Os vermes do grupo controle (expostos apenas a

resorufin) apresentaram completa absorção da sonda através do tegumento e um

acúmulo da sonda no ducto principal, evidenciando nítida atividade do sistema

excretor do parasita (Figura 32- G e H).

84


Figua 32: S. mansoni adultos após incubação com alfa-humuleno, transcariofileno e PZQ, marcados com Resorufin. (A) Verme fêmea exposta a 200 µg/mL de alfa-humuleno durante 4 horas, mostrando a atividade excretora normal através dos ductos excretores na região posterior do verme; (B) Verme macho exposto a 200 µg/mL de alfa-humuleno durante 4 horas, mostrando a atividade excretora bloqueada ; (C) Verme fêmea exposta a 200 µg/mL de trans-cariofileno mostrando intensa atividade do sistema excretor no ducto principal e ramificações; (D) Verme macho exposto a 200 µg/mL de trans-cariofileno durante 4 horas, mostrando a difusão de resorufin e atividade excretora bloqueada na região posterior do verme; (E) Verme fêmea exposta a 2 µg/mL de PZQ durante 15 min, apresentando uma contração muscular, porém com atividade do sistema excretor (F) Verme macho exposto a 2µg/mL de PZQ durante 15 min , mostrando a difusão de Resorufin e ausência da atividade excretora em toda extrenção corporal; (H e F) Verme fêmea e macho do grupo controle, marcados apenas com Resorufin apresentando atividade normal do sistema excretor nos ductos laterais na porção mediana e posterior, respectivamente. (tp)- tubo principal.

85


A fim de avaliar a integridade da membrana dos vermes machos e fêmeas

após exposição aos tratamentos, Hoechst 33258 foi usada como marcador de DNA

específico. Esta sonda se difunde para o interior da célula quando há lesões,

atuando como indicador da integridade de membrana (Figura 33).

Após quatro horas de incubação, observou-se pequenos pontos lesionados

no tegumento e nas ventosas, oral e acetabular, dos vermes machos e fêmeas

expostos ao alfa-humuleno e trans-cariofileno, evidenciados pela marcação mais

intensa pela sonda (Figura 33 A - D). Os vermes expostos ao PZQ 2 µg/mL

apresentaram uma contração muscular além de lesões no tegumento (Figura 33 E -

F). Parasitas do grupo controle, marcados apenas com hoechst 33258

apresentaram a membrana tegumentar íntegra, sem pontos mais intensos de

marcação (Figura 33 G-H).

Este estudo é o primeiro a investigar a interação de sesquisterpenos naturais

alfa-humuleno e transcariofileno sobre o sistema excretor e a integridade de

mebrana do tegumento de S. mansoni, utilizando marcadores fluorescentes.

Segundo Messerli et al. (2009), a atividade do sistema excretor do S. mansoni

é mediada por uma proteína de transporte, a P-glycoprotein (Pgp) - produto do

gene MDR2 localizada nas células do epitélio excretor do parasita. A Pgp está

envolvida no processo de absorção, distribuição, metabolismo e excreção de

diferentes agentes quimioterápicos (Sparreboom et al., 2003).

O tegumento é a única estrutura de dupla membrana que representa um

papel crucial na modulação da resposta imune do hospedeiro e sobrevivência

desse parasita (Van Hellemond et al., 2006). Nesse sentido, tem sido um

importante alvo de estudo para avaliação de novos fármacos. Alterações na

topografia do tegumento foi demonstrada por diversos pesquisadores em estudos

in vitro e in vivo (De Oliveira et al., 2014, Mostafa et al., 2011, Frezza et al., 2013).

Os ensaios in vitro deste estudo evidenciaram que o emprego das sondas

Resorufin e Hoechst 33258 foram essenciais para demonstrar o efeito dos

tratamentos com alfa-humuleno e trans-cariofileno sobre duas estruturas

importantes para estudo de alvo terapêutico.

86


Figura 33: S. mansoni adultos marcados com Hoechst, após incubação com alfa-humuleno, trans-cariofileno e PZQ. (A) Verme fêmea exposta a 200 µg/mL de alfa-humuleno durante 4 horas; (B) Verme macho exposto a 200 µg/mL de alfa-humuleno durante 4 horas; (C) Verme fêmea exposta a 200 µg/mL de trans-cariofileno (D) Verme macho exposto a 200 µg/mL de trans-cariofileno durante 4 horas (E) Verme fêmea exposta a 2 µg/mL de PZQ durante 15 min, (F) Verme macho exposto a 2 µg/mL de PZQ durante 15 min (H e F) Verme fêmea e macho do grupo controle, marcados apenas com Hoechst.

A

G

F E

D C

B

H

♀

♀

♀

♀

♂

♂

♂

♂

87


6.2.5 Efeito dos tratamentos sobre a Morfologia e Tegumento de S. mansoni

No intuito de confirmar de forma mais detalhada as primeiras alterações

morfológicas e tegumentares dos parasitas, observadas inicialmente por meio da

Microscopia Óptica (MO) utilizou-se como ferramenta a Microscopia Eletrônica de

Varredura (MEV). Nesse estudo foram selecionadas as amostras que

apresentaram melhores resultados nos ensaios in vitro (FCS3, FCC6, FCC7,

FCC9) e dois tratamentos in vivo (trans-cariofileno e OE+PZQ) realizados 56 dpi.

Os primeiros estudos detalhados em relação à superfície tegumentar de S.

mansoni ocorreram na década de 1950, quando Gönnert (1955) descreveu, por

meio de microscopia de luz, as diferenças existentes entre os vermes machos e

fêmeas, em que relatou a presença de espinhos em ambos os sexos, porém

maiores e mais numerosos nos vermes machos. No entanto as primeiras análises

dessa estrutura, por meio da MEV, tiveram início a partir da década de 1980 sendo

utilizada como ferramenta para elucidar o mecanismo de ação de fármacos

empregados no tratamento da esquistossomose (Becker et al.,1980, Kohn et

al.,1982, Shaw & Erasmus,1983).

Neste estudo, as análises dos parasitas expostos aos tratamentos in vitro

durante 24h de incubação evidenciaram alterações morfológicas e tegumentares

semelhantes sobre os vermes machos e fêmeas. As principais alterações

observadas, relacionadas aos vermes fêmeas, correspondem a descamação do

tegumento, retração e alterações das ventosas, oral e acetabular, contração e

enrugamento da musculatura e perda das papilas sensoriais. Em relação as

alterações observadas nos vermes machos, estas correspondem ao peelling dos

tubérculos e espinhos, alterações nas ventosas oral e acetabular e em alguns

tratamentos, edema na região dorsal do verme. Em contraste, os parasitas do

grupo controle, mantidos em RPMI-1640 sem adição de fármacos, não foram

observadas alterações, evidenciando a topografia normal do tegumento, tubérculos

e espinhos, papilas sensoriais e ventosas oral e acetabular de ambos os sexos

(Figura 34).

As alterações observadas nos vermes do grupo controle farmacológico,

expostos a (10 µg/mL) de PZQ (Figura 35), correspondem principalmente à

contração muscular, efeito característico deste fármaco, seguida de destruição de

tubérculos e espinhos. O PZQ induz o influxo de cálcio através do tegumento e das

88


células musculares do S. mansoni, causando contração imediata do parasita.

Paralelamente ao efeito deste fármaco sobre os músculos do verme, ocorrem

alterações morfológicas, tais como vacuolização do sincício tegumentar e a

formação de bolhas na superfície do tegumento (Cioli & Pica-Mattoccia 2003).

Em relação as alterações observadas nos vermes recuperados, após 48

horas dos tratamentos in vivo com trans-cariofileno e associação entre OE+PZQ,

observou-se que os vermes machos apresentaram retração da ventosa acetabular,

edemas em regiões pontuais do corpo e algumas protuberâncias, além de

descamação do tegumento, acompanhada da redução do tamanho dos tubérculos,

resultando na perda dos espinhos (Figura 41-D). Quanto as alterações observadas

nos vermes fêmeas, estas apresentaram enrugamento do tegumento e contração

da musculatura, principalmente aquelas submetidas ao tratamento em associação

OE+PZQ. As figuras (34 a 41) representam as alterações observadas sobre

vermes machos e fêmeas de S. mansoni expostos aos tratamentos in vitro e in

vivo, além dos grupos controles.

No presente estudo infere-se que os danos tegumentares observados nos

vermes machos e fêmeas, expostos aos diferentes tratamentos in vitro e in vivo,

podem estar diretamente relacionados a morte dos parasitas, corroborando a

hipótese de Shaw & Erasmus (1998) que, segundo estes autores, o dano

tegumentar é considerado fator primordial para ocasionar a morte do S. mansoni.

Acreditamos ainda que as lesões provocadas no S. mansoni resultaram no

aumento da exposição de antígenos e consequentemente sua morte. Além disso,

as alterações observadas nas ventosas, oral e acetabular dos vermes machos e

fêmeas, podem ser considerados outro fator primordial para eliminação do parasita

no hospedeiro, uma vez que estas alterações interferem na capacidade de fixação

dos parasitas nos vasos mesentéricos, sendo, portanto, facilmente eliminado do

hospedeiro definitivo.

Observações similares a este estudo foram descritas por outros autores que

avaliaram o efeito de compostos pertencentes a classe dos terpenóides sobre o

tegumento deste parasita. Por exemplo, Shuhua et al. (2000) relataram que o

sesquiterpeno arterméter provocou danos no tegumento dos vermes machos e

fêmeas, porém com maior intensidade nas fêmeas. Nossos resultados também

apresentam similaridade com as alterações induzidas pelos sesquiterpenos

89


artemisinina e ácido artesúnico sobre as linhagens BH e SJ de S. mansoni

descritas por Frezza et al. (2013).

De Moraes et al. (2014) avaliaram o efeito do diterpeno fitol, e observou

alterações morfológicas e tegumentares nos vermes machos e fêmeas expostos

aos tratamentos in vitro em diferentes concentrações. Mafud e colaboradores

(2016), também constataram o efeito do terpeno dihydro citronellol sobre o

tegumento de S. mansoni por meio da microscopia confocal.

Somados ao estudo do tegumento de S. mansoni também podemos citar os

trabalhos realizados por Lima et al. (2011) que avaliaram a ultraestrutura dos

vermes adultos de S. mansoni expostos a alicina – princípio ativo presente no

Allium sativum em experimentos in vivo. El Ridi et al. (2010), demostraram que o

ácido aracdônico provoca extensas alterações no aspecto dos tubérculos dos

vermes machos, ocasionando a redução de tamanho e perda dos espinhos, além

de alterações nas ventosas dos vermes machos e fêmeas.

Figura 34: Vermes adultos de S. mansoni (grupo controle) mantidos em meio RPMI- 1640 sem adição de fármacos por 24 horas. (A e B) - Vermes fêmeas; (C e D) - vermes machos, apresentando morfologia íntegra. (TG) - tegumento, (VO) - ventosa oral; (VA) - ventosa acetabular; (ES) - espinhos; (CG) - canal ginecóforo.

90


Figura 35: Vermes adultos de S. mansoni (grupo controle farmacológico) expostos a 10 µg/mL de PZQ por 24 horas. (A) Casal de vermes contraídos com alterações no tegumento; (B) - verme fêmea apresentando contração muscular (C) - verme macho, apresentando contração muscular e peeling do tegumento; (D) -Tegumento do verme macho apresentando perda de tubérculos e espinhos.

Figura 36: Vermes expostos a 100 µg/mL da fração FCS3 - obtidas por coluna cromatográfica seca (CS). (A e B) – vermes fêmeas. As setas indicam alterações na ventosa oral (VO); descamação do tegumento e enrugamento em algumas regiões do corpo; (C e D) - Casal de vermes adultos e verme macho. As setas indicam a perda de tubérculos e espinhos, resultando em áreas lisas no corpo do verme, além do enrugamento no corpo do verme fêmea.

91


Figura 37: Vermes expostos a 100 µg/mL da fração (FCC6) - obtidas por cromatografia de coluna clássica (CC), enriquecida de alfa- humuleno. (A e B) - vermes fêmeas. As setas indicam alterações no corpo do verme, caracterizada pelo enrugamento em toda extenção do corpo. Além disso, observa-se alterações na ventosa; (C e D) - vermes machos. As setas indicam a desprendimento do tegumento, resultando na perda dos espinhos desta superfície.

Figura 38: Vermes expostos a 100 µg/mL da fração (FCC7) - obtidas por (CC) enriquecida de trans-cariofileno. (A e B) vermes fêmeas. As setas indicam o desprendimento do tegumento, além da presença de “ sulcos” na região dorsal do verme (C e D) vermes machos. As setas indicam alterações no tegumento, caracterizada pela perda de tubérculos e espinhos da região anterior e dorsal do verme.

92


Figura 39: Vermes expostos a 100 µg/mL da fração (FCC9) - obtidas por cromatografia de coluna clássica (CC) enriquecida de espatulenol. (A e B) - vermes fêmeas. As setas indicam errugamento e leve contração do corpo do verme, além de alterações (retração) da ventosa acetabular. (C e D) vermes machos. As setas indicam descamação do tegumento, resultando em áreas lisas da superfície do corpo do verme.

Figura 40: Vermes rescuperados após 48 horas do tratamento in vivo em dose única (100 mg/kg) de trans-cariofileno (A e B) - vermes fêmeas. As setas indicam regiões do corpo do verme com “ondulações e “sulcos”, além da retração da ventosa acetabular e contração do corpo do verme. (C e D) - verme macho. As setas indicam alterações no tegumento, caracterizada pela perda de tubérculos e espinhos de protuberâncias na região ventral do corpo.

93


Figura 41: Vermes rescuperados após 48 horas do tratamento in vivo em associação OE+PZQ (100 + 40 mg/kg). (A e B) vermes fêmeas. As setas indicam contração da musculatura, retração da ventosa acetabular e descamação do tegumento. (C e D) vermes machos. As setas indicam a perda de tubérculos e espinhos, evidenciando uma redução de tamanho dos tubérculos e protuberâncias na superfície dorsal do corpo, além de alterações caracterizada pela retração da ventosa oral e acetabular (E e F) - vermes do grupo controle, mostrando a morfologia normal do verme macho e fêmea.

94


6.3 Resultados e Discussão: Ensaios in vivo

95


6.3.1 – Importância dos Ensaios in vivo

Os ensaios in vivo são indispensáveis para avaliação pré-clínica de

substâncias quando, na maioria das vezes, estas passaram por uma triagem

primária in vitro. No entanto, para a abordagem in vivo é indispensável o uso do

modelo animal (Katz & Coelho 2008). Desta forma, para execução desta etapa

foram utilizados camundongos fêmeas Balb/C - SPF.

Para investigação de novos fármacos na terapêutica experimental da

esquistossomose é importante avaliar seu efeito contra todas as fases de

desenvolvimento do parasita. Nesse sentido, deve-se considerar alguns critérios

quantitativos os quais podem evidenciar uma resposta farmacológica. Segundo

Pellegrino & Katz (1968) os critérios para avaliação da atividade de uma substância

são: avaliação da carga parasitária (sobrevida dos vermes) dos animais tratados;

proporção entre o número de casais, machos e fêmeas recuperados do sistema

porta-hepático e das veias mesentéricas; avaliação dos estágios de

desenvolvimento dos ovos de S. mansoni no intestino (oograma); quantificação dos

ovos eliminados pelas fezes e avaliação do efeito modulador sobre os granulomas

hepáticos. Desta forma, neste estudo, seguimos todos os critérios propostos por

Pellegrino & Katz (1968) a fim de avaliar a atividade de B. trimera, sobre os

diferentes estágios de desenvolvimento de S. mansoni.

96


6.3.2 Efeito do Óleo essencial e Sesquiterpenos sobre a carga parasitária de

(esquistossômulos, vermes jovens e adultos) de S. mansoni

No presente estudo, foram avaliados diferentes esquemas terapêuticos

administrados em dose única (100 mg/kg) e associação entre OE+PZQ (100 mg/kg

+ 40 mg/kg) este último, administrado separadamente em um intervalo de 4 horas,

nos diferentes períodos de infecção da esquistossomose (07, 21 e 56 dpi). O

objetivo desta associação foi verificar a ação destas duas substâncias contra as

fases jovens do S. mansoni, complementando, desta forma, o efeito do PZQ. Além

disso, a associação de tratamentos consiste em uma alternativa terapêutica bem

suscedida para minimizar os efeitos do possível desenvolvimento de resistência a

fármacos. Utilizamos a dose sub-curativa de 40 mg/kg do PZQ, por ser a dose

padrão adotada nos programas de controle da esquistossomose. Como controle

farmacológico desta associação, utilizamos o mesmo esquema terapêutico entre

PZQ+PZQ (100 + 40 mg/kg).

Um dos primeiros estudos da eficácia entre a associação de fármacos para o

tratamento da esquistossomose foi realizado por Botros et al. (1989) que avaliaram a

combinação de oxamniquina (OXA) com PZQ nos diferentes estágios da infecção, e

observaram taxa de redução de vermes de 96%, seguida da ausência de ovos no

fígado e intestino dos animais, quando o tratamento foi realizado em um intervalo de

4 horas.

No presente estudo, os tratamentos realizados contra esquistossômulos (7 dpi),

foram considerados estatisticamente significativos e evidenciaram melhor eficácia da

associação OE+PZQ (p< 0,0001) apresentando taxa de redução de vermes de 61%.

(Figura 42-A). Os tratamentos em dose única com OE puro (p˂ 0,001) e com alfa-

humuleno (p˂ 0,0001) também foram considerados significativos, onde observou-se

menores porcentagens de recuperação de vermes e taxas de redução de 54% e

47%, respectivamente, quando comparados com o grupo controle, infectado e não

tratado (Figura 42-A).

A quimioterapia sobre esquistossômulos e vermes jovens de S. mansoni

exerce um efeito quimioinibidor uma vez que “abortaria” a infecção, evitando o

desenvolvimento do estágio adulto, reduzindo a morbidade e patogenia da doença

nos seus hospedeiros definitivos (Utzinger et al., 2003). Por outro lado, sabe-se que

97


a maioria dos fármacos utilizados para o tratamento das esquistossomoses

apresentam melhor eficácia sobre a fase adulta do parasita (Brindley et al., 1987).

Em relação aos tratamentos realizados contra vermes jovens (21 dpi),

observou-se resultados semelhantes aos tratamentos 07 dpi entretanto, com

maiores porcentagens de redução de vermes para os tratamentos em associação do

OE+PZQ (68%), seguido dos tratamentos com espatulenol (p< 0,0001), OE p˂

0,001) e trans-cariofileno (p< 0,0001), com taxas de redução de vermes em 62%, 57

e 55%, respectivamente (Figura 43-B). Em relação aos tratamentos com PZQ (p<

0,05) em dose única e PZQ+PZQ (p< 0,01) comprovamos que, de fato, este fármaco

apresenta baixa eficáfica sobre as formas jovens de S. mansoni apresentando taxas

de redução de vermes de 13 % e 25 %, respectivamente. (Figura 43).

Os resultados deste estudo corroboram os dados de Utzinger et al. (2003) que

avaliaram a associação de arteméter + PZQ (150 + 75 mg/kg) contra vermes jovens

(21 dpi) de S. mansoni e observaram redução da carga parasitária em 66 %.

Outro estudo pré-clínico realizado por El-Beshbish et al. (2013a) demonstraram

a eficácia terapêutica do sesquiterpeno, arteméter administrado em dose única de

400 mg/kg contra as formas de esquistossômulos e vermes jovens (7 e 21 dpi) da

linhagem Egípcia de S. mansoni, apresentando taxas de redução de vermes de 86 e

91%, respectivamente.

Finalmente, em relação aos tratamentos realizados sobre a formas adultas (56

dpi) de S. mansoni mais uma vez observamos que a associação entre OE+PZQ,

apresentou resultados significativos (p< 0,0001), com taxa de redução de vermes de

63 %. Também se observou correspondência entre os tratamentos sobre as formas

jovens, com resultados estatisticamente significativos para os compostos

espatulenol (p< 0,0001) e alfa- humuleno (p< 0,0001) apresentando taxas de

redução total de vermes em 65% e 54 %, respectivamente (Figura 44-C). A redução

do número de vermes recuperados após tratamentos realizados com OE puro,

também foram semelhantas àqueles observados nos tratamentos sobre os vermes

jovens com porcentagem de 57%. Não se observou diferenças estatísticas em

relação aos tratamentos com PZQ e PZQ+PZQ. Comprovando, desta forma, que

sua melhor eficácia está relacionada aos vermes adultos (Figura 44-C).

A associação de espéceis vegetais com PZQ foi descrita por Mantway et al.

(2011), que avaliaram o efeito in vivo da associação do PZQ com extrato de Allium

98


sativum (alho) e Allium cepa (cebola) sobre vermes adultos (45 dpi) de S. mansoni

linhagem Egípcia e observaram taxas de redução de vermes em 99.1 e 99.3%,

respectivamente.

Os dados gerados no presente estudo inferem que os tratamentos em dose

única com OE e compostos sequiterpernos de B. trimera, bem como a associação

entre OE+PZQ, atuaram em todas as fases de desenvolvimento de S. mansoni

reduzindo consideravelmente a carga parasitária dos grupos tratados. No entanto, o

mecanismo de ação relacionado à atividade esquistossomicida sobre estas formas

ainda não está claro.

A hipótese para estes resultados, pode estar relacionada ao possível

mecanismo de ação atribuído aos óleos essenciais e compostos sesquiterpenos, os

quais apresentam propriedade lipofílica, podendo exercer ação biológica ao

atravessar as membranas celulares do parasita, interagindo com as bicamadas

fosfolipídicas, ocasionando danos estruturais no tegumento e/ou comprometimento

das suas funções resultando, consequentemente, na morte dos vermes.

Adicionalmente, acreditamos que a associação entre OE + PZQ, possa estar

relacionado ao efeito antagônico envolvendo os canais de cálcio de S. mansoni.

Sabe-se que PZQ atua como receptor farmacológico da subclasse de Ca2+ do tipo L,

promovendo uma hiperpolarização da membrana do parasita por meio do efluxo do

cálcio, provocando contração muscular, paralisia espástica e danos no tegumento do

parasita. Em contraste, tem sido descrito que os óleos essenciais e seus compostos

secundários, provocam despolarização da membrana, por meio do influxo dos

canais de Ca2 +. Desta forma, infere-se que a associação destas substâncias

desempenha papel importante sobre a permeabilidade de membrana do S. mansoni,

através dos canais de cálcio, princial resultado observado pela MEV.

99


Figura 42: Total de vermes recuperados no sistema porta-hepático e Taxas de redução de vermes após análises dos tratamentos adimistrados em dose única (100 mg/kg) e associação entre OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 7 dpi – contra esquistossômulos. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE+PZQ (p< 0,0001***); OE (p˂0,001***); alfa-humuleno (p˂ 0,0001***); trans-cariofileno (p˂ 0,01*); PZQ+PZQ (p< 0,01*); PZQ (p< 0,05*).

100


Figura 43: Total de vermes recuperados no sistema porta-hepático e Taxas de redução de vermes após análises dos tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação entre OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 21 dpi – contra vermes jovens. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE+PZQ (p< 0,0001***); trans-cariofileno (p˂ 0,0001***); espatulenol (p< 0,0001***); OE (p˂0,001***); alfa-humuleno (p˂ 0,001**); PZQ (p< 0,01*); PZQ+PZQ (p< 0,05*).

101


Figura 44: Total de vermes recuperados no sistema porta-hepático E Taxa de redução de vermes após análises

dos tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação entre OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 56 dpi – contra vermes jovens. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE+PZQ (p< 0,0001***); espatulenol (p< 0,0001***); alfa-humuleno (p˂ 0,0001***); OE (p˂0,0001***); trans-cariofileno (p˂ 0,001**); PZQ (p< 0,05*); PZQ+PZQ (p< 0,001**).

102


6.3.3 Efeito dos tratamentos sobre Casais, Machos e Fêmeas nas diferentes

fases de desenvolvimento de S. mansoni

Uma vez observada a redução da carga parasitária dos esquistossômulos,

vermes jovens e adultos, evidenciando ação terapêutica das amostras avaliadas

sobre estas formas, é importante seguir os critérios adotados por Pellegrino & Katz

(1968), em relação a proporção de casais, machos e fêmeas recuperados para

avaliar a suscetibilidade destas formas aos tratamentos. Segundo Lenzi e

colaboradores (2008) em infecções experimentais, a proporção entre casais,

machos e fêmeas varia dependendo do modelo animal utilizado e do período de

infecção em que foram realizados os tratamentos.

Em relação aos resultados deste estudo, quanto a este parâmetro, observou-se

que os vermes fêmeas foram mais sensíveis aos tratamentos, obtendo-se menores

proporções de vermes recuperados em todos os períodos de tratamento (7, 21 e 56

dpi).

Nos tratamentos realizados 7 dpi foi observado maior suscetibilidade das

fêmeas ao OE puro (p˂0,0001) seguido dos tratamentos entre a associação

OE+PZQ (p˂0,0001) (Figura 45). Semelhanças foram observadas no tratamento

com o composto trans-cariofileno (p˂0,0001). Em contraste, não se observou

diferenças estatísticas entre a suscetibilidade de machos e fêmeas para o

tratamento com alfa-humuleno, corroborando os resultados observados em relação

ao PZQ (p< 0,01) (Figura 45). Não se observou diferenças significativas em relação

a proporção de casais resuperados neste período de infeção.

Para os tratamentos realizados 21 dpi, mais uma vez foi evidenciada maior

suscetibilidade dos vermes fêmeas aos tratamentos com OE puro (p˂0,0001)

seguido dos tratamentos em associação OE+PZQ (p˂0,0001). O composto

espatulenol (p˂0,0001), avaliado neste período de infecção, também apresentou

melhor ação sobre as fêmeas de S. mansoni (Figura 46). No entanto, curiosamente,

neste período de tratamento, observou-se maior ação do composto alfa-humuleno

sobre os vermes fêmeas, onde não se observou diferenças de suscetibilidade entre

machos e fêmeas no período de 7dpi. Da mesma forma, observou-se que neste

período (21 dpi) o composto trans-cariofileno (p˂0,0001) não apresentou diferenças

entre as proporções de machos e fêmeas recuperadas, corroborando mais uma vez,

103


com os resultados observados nos tratamentos realizados com PZQ+PZQ (p< 0,05).

(Figura 43).

Em relação aos tratamentos sobre as formas adultas de S. mansoni, realizados

na fase crônica da esquistossomose (56 dpi) foi observada, respectivamente, melhor

eficácia entre a associação OE+PZQ (p˂0,0001) sobre fêmeas adultas; seguido dos

tratamentos com OE puro (p˂0,0001). O composto alfa-humuleno também

apresentou ação semelhante. Em relação aos tratamentos com o espatulenol, neste

período, não se observou diferenças estatísticas na suscetibilidade entre machos e

fêmeas. Entretanto, o composto transcariofileno (p< 0,001) apresentou proporções

semelhantes àquelas observadas com os tratamentos com PZQ+PZQ (p< 0,001)

(Figura 47).

A eficácia terapêutica de um composto/fármaco sobre vermes fêmeas de S.

mansoni é importante, uma vez que pode promover a diminuição de oviposição e

consequentemente, reduzir a morbidade e patogenia. Além disso, a redução da

eliminação de ovos no ambiente interfere no ciclo de transmissão da

esquistossomose (Delgado et al., 1992).

Figura 45: Total de casais, machos e fêmeas recuperados no sistema porta-hepático, após análises dos

tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 7 dpi – contra esquistossômulos. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE (p˂0,0001***); OE+PZQ (p< 0,0001***); trans-cariofileno (p˂ 0,0001*); alfa-humuleno (p˂ 0,001**); PZQ+PZQ (p< 0,01*); PZQ (p< 0,01*).

Nº d

e v

erm

es

re

cu

pe

ra

do

s

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

0

1 0

2 0

3 0

4 0

C o n tro le

A lfa H u m u le n o

T ra n s c a r io f i le n o

O le o e s s e n c ia l

P Z Q

O E + P Z Q

P Z Q + P Z Q

E fe ito d o s T ra ta m e n to s 7 d p i-

E s q u is to s s ô m u lo s

104



tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 21 dpi – contra vermes jovens. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE (p˂0,0001***); OE+PZQ (p< 0,0001***); espatulenol (p< 0,0001***); alfa-humuleno (p˂ 0,001**); trans-cariofileno (p˂ 0,0001***); PZQ (p< 0,01*) PZQ+PZQ (p< 0,05*).


tratamentos adimistrados em dose única (100mg/kg) e associação OE+ PZQ (100 mg/kg + 40 mg/kg) 56 dpi – contra vermes jovens. Diferenças estatísticas em relação ao grupo controle: OE+PZQ (p< 0,0001***); OE (p˂0,0001***); alfa-humuleno (p˂ 0,0001***); trans-cariofileno (p˂0,001**); PZQ+PZQ (p< 0,001**); espatulenol (p< 0,0001***); PZQ (p< 0,05*).

Nº d

e v

erm

es

re

cu

pe

ra

do

s

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

Casal

Mach

o

Fêm

ea

To

tal

0

1 0

2 0

3 0

4 0

C o n tro le

A lfa H u m u le n o

T ra n s c a r io f i le n o

E s p a tu le n o l

O lé o e s s e n c ia l

P Z Q

O E + P Z Q

P Z Q + P Z Q

E fe ito d o s T ra ta m e n to s 5 6 d p i-

V e rm e s A d u lto s

105


6.3.4 Efeito dos tratamentos sobre a oviposição de S. mansoni nos diferentes

períodos de infecção da esquistossomose mansônica

Análise do Oograma

Para avaliação desse critério que, de acordo com Pellegrino & Katz (1968) é

considerado o mais importante e fidedigno para avaliação de novos

compostos/fármacos esquistossomicida, foi aplicado o método do oograma, o qual

consiste em classificar e quantificar os estágios de desenvolvimentos dos ovos

(imaturos, maduros e mortos) de S. mansoni aderidos na porção intestinal (Cunha,

1982).

Sabe-se que a cinética de eliminação de ovos do S. mansoni, varia conforme

a linhagem do parasita (Yoshioka et al., 2002). No entanto, em infecções

experimentais balanceadas normalmente o parasita inicia a postura a partir do

trigésimo dia de infecção (Pellegrino et al.,1962). Portanto, quando se pretende

avaliar o efeito supressor de um composto/fármaco é desejável que os tratamentos

sejam realizados na fase pré-postural. Entretanto, os tratamentos realizados na fase

postural, tem como objetivo avaliar se houve parada de oviposição observando-se

ausência de ovos imaturos.

No presente estudo, não se observou ausência de nenhum dos estágios de

desenvolvimento dos ovos de S. mansoni. No entanto, se observou que nos

tratamentos realizados na fase pré- postural (7 e 21 dpi) foram encontradas

porcentagens maiores de ovos maduros (5º estágio), para os tratamentos com OE e

associação OE+PZQ, espatulenol e alfa-humuleno, respectivamente (Figura 48- A e

B).

Em relação aos tratamentos realizados na fase postural (56 dpi), observou-se

maiores porcentagens de ovos maduros nos tratamentos com OE e associação

OE+PZQ. Não foram observadas diferenças em relação a porcentagem de ovos

maduros relativos aos tratamentos com espatulenol (51 %) e alfa-humuleno (49 %)

nesta fase de infecção. No entanto, a maior porcentagem de ovos mortos (40 %) foi

observada nos tratamentos em associação OE+PZQ (Figura 48 - C).

De acordo com Prata (1957), o encontro de maiores porcentagens de ovos

maduros, após administração de um composto/fármaco é considerado um resultado

106


importante, uma vez que os ovos maduros permanecem viáveis no intestino por

cerca de doze dias, portanto, se o fármaco tem ação sobre a oviposição, o oograma

deverá apresentar maiores porcentagens de ovos maduros que de ovos imaturos em

decorrência de oviposições anteriores ao tratamento. Ainda de acordo com

Pellegrino & Katz (1968), compostos/fármacos que proporcionam a interrupção da

postura dos ovos irão mostrar o desaparecimento ou diminuição de um dos estágios

imaturos de desenvolvimento.

Esta observação corrobora estudos descritos previamente por De Oliveira et

al. (2014), que observaram efeito semelhante quando avaliaram extratos orgânicos

de B. trimera; somado aos estudos realizados por outros autores que avaliaram os

sesquiterpenos ARTs em diferentes linhagens de S. mansoni e diferentes períodos

de infecção da esquistossomose (El- Beshbishi et al., 2013b; Abdul- Ghani et al.,

2011, Seif El-din et al., 2011, Botros et al., 2010).

Comparando os diferentes períodos de tratamento, infere-se que os

tratamentos realizados na fase pré- postural (21 dpi) apresentaram maiores

porcentagens de ovos maduros para os tratamentos com OE, OE+PZQ, espatulenol

e alfa- humuleno, respectivamente. No entanto, não podemos confirmar que houve

interrupção de oviposição, uma vez que se observou a presença de ovos de

segundo e terceiro estágio.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0020751913000660#b0035

107


Figura 48: Oograma- Porcentagem do número de ovos encontrados nas análises dos animais tratados (7, 21 e 56 dpi). Ovos Imaturos (1º ao 4º estágio de desenvolvimento); Ovos Maduros (5º estágio de desenvolvimento) e Ovos mortos, referente aos tratamentos em dose única (100 mg/kg) com OE e sesquiterpenos e associação OE+PZQ (100+ 40 mg/kg) e PZQ+PZQ. Grupo controle farmacológico PZQ (100 mg/kg). Grupo controle negativo, foi administrado 0.3mL de PBS.

108


Análise de OPG

O efeito dos tratamentos sobre a quantidade OPG, eliminados nas fezes,

outro parâmetro considerado indispensável para a triagem in vivo, foi avaliado pelo

método quantitativo de Kato-Katz. Observou-se que as amostras diferiam em

relação a taxa de redução de OPG de acordo com o período de tratamento. Na fase

pré-postural, observamos maiores taxas de redução nos tratamentos realizados em

dose única, com alfa-humuleno, transcariofileno e espatulenol nos períodos de 07 e

21, respectivamente (Figura 49 A e B). Os tratamentos em associação OE+ PZQ

apresentaram maiores taxas de redução (85% e 97 %) nos períodos 07 e 56 dpi,

respectivamente (Figura 49 A e C). Em contraste, os tratamentos em dose única

com OE, apresentou taxas de redução semelhantes (87%) para estes períodos.

Resultados semelhantes foram descritos por Metwally et al. (2006) que avaliaram o

efeito do oléo essencial de Allium sativum (alho) e Allium cepa (cebola) e obervaram

taxas de redução de OPG de 74,4% e 82,15%, respectivamente. Somados a estes

estudos, os dados corroboram com Moraes et al. (2014), que avaliaram o efeito do

sesquiterpeno fitol em dose única de 40 mg/kg sobre a eliminação de OPG e

observaram taxa de redução de 76,6%.

No entanto, considerando o conjunto de parâmetros avaliados, acreditamos

que o efeito dos tratamentos sobre a oviposição, nos diferentes períodos de

infecção, pode estar diretamente relacionado à maior sucetibilidade dos vermes

fêmeas. Adicionalmente, considerando as alterações morfológicas observadas por

meio da MEV, infere-se que os diferentes esquemas terapêuticos provocaram

alterações degenerativas, sobretudo nos folículos vitelínicos e ovário das fêmeas,

além de modificações nos testículos dos machos, comprometendo a produção de

ovos.

109


Figura 49: Redução do número de OPG após tratamentos em dose única com OE, sesquiterpenos e associação OE+PZQ e PZQ+PQZ, realizados nos diferentes períodos de infecção da esquistossomose mansônica. (A) - Tratamentos realizados 07 dpi; (B) - Tratamentos realizados (21 dpi) ;(C) -Tratamentos realizados 56 dpi. Grupo controle farmacológico PZQ (100 mg/kg). Grupo controle negativo, foi administrado 0.3mL de PBS.

110


6.3.5 Efeito dos tratamentos sobre as reações granulomatosas em diferentes

fases de infecção da esquistossomose mansônica.

A patologia da esquistossomose humana e experimental está diretamente

relacionada ao desenvolvimento de reações granulomatosas, em decorrência da

liberação antígenos solúveis produzidos pelos ovos do S. mansoni, que induzem

uma resposta imune no hospedeiro (Hams et al., 2013).

Neste estudo avaliamos a ação dos sesquiterpenos alfa-humuleno, trans-

cariofileno e espatulenol, descritos na literatura por apresentar efeito antiiflamatórios

(Fernandes et al., 2007). Paralelamente, também foram avaliados os tratamentos

com OE e associação OE+PZQ. Como grupo controle farmacológico utilizou-se o

PZQ. Para avaliar este efeito, os tratamentos foram realizados em diferentes fases

de infecção da esquistossomose: a) 7 dpi (fase pulmonar); b) 21 dpi (fase pré-

postural- aguda); c) 56 dpi (fase postural – crônica).

Observou-se que os sesquiterpenos apresentam reduções significativas (p<

0,0001) do número de granulomas, sobretudo, nos tratamentos realizados nas fases

pulmonar (7dpi) e fase pré-postural (21 dpi), quando comparado com o controle -

infectado e não tratado (Tabela 11). Também se observou a presença do verme

macho no fígado dos animais tratados com trans-cariofileno (56 dpi) (Figura 50-E)

inferindo-se que houve “ fuga” do parasita para o órgão, uma vez que a partir da 6ª

semana de infecção os vermes adultos migraram para as veias mesentéricas. Além

disso, observou-se uma imunomodulação do infiltrado inflamatório e diferenças entre

os diâmetros dos granulomas hepáticos dos animais tratados, quando comparados

com o controle farmacológico e com o grupo controle- infectado e não tratado

(Figuras 48 a 50).

A explicação para estes resultados pode estar relacionada ao fato que alfa-

humuleno e trans-cariofileno apresentarem efeito antiinflamatório que, segundo

Fernandes e colaboradores (2007) este efeito está associado com a inibição de

citoquinas pró-inflamatórias, TNFa e IL-1, envolvidas na resposta imune celular

durante o processo inflamatório.

Em relação a eficácia do espatulenol, observamos menor número de

granulomas hepáticos nos dois períodos de tratamentos (21 e 56 dpi) e uma redução

111


do diâmetro médio, quando comparados com o controle negativo (Figura 50). Esse

composto tem sido descrito por apresentar efeito imunomodulador (Ziaei et al. 2010,

Chao et al., 2005). Desta forma, acreditamos que o espatulenol ocasionou

diminuição da proliferação das células inflamatórias, após liberação dos antígenos

dos ovos do parasita reduzindo, consequentemente, a resposta imune no

hospedeiro.

Para os tratamentos com o OE também se observou redução significativa (p<

0,0001), quanto ao número de granulomas e diâmetros no período de 56 dpi. Em

contraste a associação OE+PZQ, apresentou redução do número de granulomas,

(p< 0,001) mas não se observou diferenças entre a média dos diâmetros, quando

comparados com os grupos controles, farmacológico (p< 0,0209) e controle negativo

(Tabela 4). Resultados semelhantes foram observados em estudos realizados por

Abdul-Ghani et al. (2011) utilizando o sesquiterpeno arteméter contra linhagem

egípcia de S. mansoni.

Nesta análise, para todos os grupos tratados, observou-se a presença de

ovos com miracídios degenerados no interior dos granulomas. Além disso, observou-

se deposição de colágeno no tecido hepático, principalmente nos tratamentos

realizados 07 e 21 dpi, fase aguda da doença (Figuras 47 a 53).

Desta forma, os resultados observados estão de acordo com Burke et al.

(2009), que segundo estes autores a fase inicial exudativa e produtiva do granuloma

esquistossomótico é caracterizada pelo recrutamento de fibroblastos, que leva à

produção de fibras de colagéno da matriz extracelular do tecido, formando-se em

camadas concêntricas ao redor do mesmo. Adicionalmente, ainda de acordo com

Burke e colaboradores, a redução da resposta inflamatória ao redor da reação

granulomatosa está relacionda a morte do miracídio dentro do ovo, resultado

também observado neste estudo.

112


Tabela 11. Efeito dos tratamentos em dose única (100mg/kg) e associação OE+PZQ sobre granulomas hepáticos em diferentes períodos de infecção por S. mansoni.

. NA- Não avaliado neste período de infecção.

PZQ – Controle farmacológico dose única de 100 mg/kg.

Tratamentos (100 mg/kg)

07 (dpi )

Número de granulomas

Média dos

diâmetros (µm)

21 (dpi )


Média dos

diâmetros (µm)

56 (dpi )


Média dos diâmetros

(µm)

Alfa-

humueleno

10**

197±1

21

162±7

19*

182±9

Trans-

cariofileno

16**

183±2

19**

227±6

26

231±03

Espatulenol

N A

N A

8**

241±02

11**

233±5

Óleo

essencial

16**

241±8

23

261±05

36

194±3

OE+ PZQ

23

290 ±4

18**

266±02

28

237±5

PZQ

32

298±7

27

291±4

65

242±3

Controle

80

245±5

63

276±5

115

282±5

113


Figura 50: Cortes histológicos do tecido hepático de animais do grupo controle negativo (infectado e não tratado). (A e B) – Animais receberam 0.3 mL de PBS 07 dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) - Animais receberam 0.3 mL de PBS 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Animais receberam 0.3 mL de PBS 56 dpi (fase pós- postural- crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença

dos ovos com miracídio degenerado, presença de conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), presença de granulomas conjugados periovulares, além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória. Coloração Tricrômico de Masson. Escalas 50 e 100 μm.

50 µm 50 µm

100 µm

100 µm 100 µm

100 µm

114


Figura 51: Granulomas hepáticos de animais tratados em dose única (100 mg/kg) com alfa- humuleno em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica (A e B) -Tratamento realizado 07dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural-crônica) e analisado 70 dpi As setas indicam a

presença dos ovos degenerados no centro dos granulomas e a presença de conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória. Coloração Tricrômico de Masson. Escalas 50 e 100 μm.

50 µm

100 µm 50 µm

100 µm 100 µm

100 µm

115


Figura 52: Granulomas hepáticos de animais tratados em dose única (100 mg/kg) com trans-cariofileno em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica (A e B) -Tratamento realizado 07dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural-crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença do

verme macho no fígado, presença dos ovos com miracídios degenerados no centro dos granulomas, presença de conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), presença do Verme macho no corte histológico dos tratamentos realizados 56 dpi, além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória.

Coloração com Tricômico de Masson. Escala 100 μm.

50 µm

100 µm 100 µm

100 µm 100 µm

100 µm

116


Figura 53: Granulomas hepáticos de animais tratados em dose única (100 mg/kg) com espatulenol em duas fases de infecção da esquistossomose mansônica (A e B) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (C e D) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural-crônica) e analisado 70 dpi. As

setas indicam a presença dos ovos com miracídios degenerados no centro dos granulomas e a presença de conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória. Coloração com Tricômico de Masson Escalas 50 e 100 μm.

100 µm

100 µm 100 µm

100 µm

117


Figura 54: Granulomas hepáticos em cortes histológicos de animais tratados com OE (100 mg/kg) em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica. (A e B) - Tratamento realizado 07 dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural- crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença dos ovos com miracídios retraídos e degenerados no centro dos granulomas e a presença do infiltrado inflamatório com deposição de colágeno ao redor da reação granulomatosa. Coloração com Tricômico de Masson. Escala 50 e 100 μm.

118


Figura 55: Granulomas hepáticos em cortes histológicos de animais tratados com OE+ PZQ (100 + 40 mg/kg) em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica. (A e B) - Tratamento realizado 07 dpi (fase pulmonar) e analisado 45 dpi; (C e D) -Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase pós- postural- crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença dos ovos com miracídios retraídos e degenerados no centro dos granulomas e a presença do infiltrado inflamatório de fibras de colágeno ao redor da reação granulomatosa. Coloração com Tricômico de Masson. Escala 50 e 100 μm.

119


Figura 56: Granulomas hepáticos de animais do grupo controle farmacológico tratados com dose única de PZQ 100 mg/kg em diferentes fases de infecção da esquistossomose mansônica. (A e B) -Tratamento realizado 07 dpi (fase pulmomar) e analisado 45 dpi; (C e D) - Tratamento realizado 21 dpi (fase pré- postural- aguda) e analisado 45 dpi; (E e F) - Tratamento realizado 56 dpi (fase prós- postural- crônica) e analisado 70 dpi. As setas indicam a presença dos ovos com miracídios degenerados no interior dos granulomas, presença de granulomas conjugares com intenso conteúdo exudativo, fibrose no tecido hepático (coloração azul), além de infiltrado inflamatório ao redor da reação inflamatória. Coloração com Tricômico de Masson. Escala 50 e 100 μm.

120

Conclusões

7. Conclusões e Perspectivas

Com o desenvolvimento do presente trabalho foi possível observar através das

análises dos parâmetros parasitológicos avaliados, por meio dos ensaios in vitro e in

vivo, que o Óleo essencial, Frações e Sesquiterpenos apresentaram efeito

esquistossomicida contra as diferentes fases de desenvolvimento de S. mansoni

linhagem BH.

Nesse sentido, algumas hipóteses sobre o mecanismo de ação das amostras

avaliadas foram levantadas como por exemplo:

Pode ter ocorrido atuação das amostras sobre neutrotransmissores de S.

mansoni, influenciando na motilidade dos parasitas;

Pode ter ocorrido atuação sobre as glândulas vitelínicas dos vermes fêmeas

suprimindo a oviposição destas, in vitro;

Pode ter ocorrido atuação sobre o tegumento dos parasitas, ocasionando

lesões estruturais, e consequentemente, a morte dos vermes;

Pode ter ocorrido atuação sobre o sistema excretor dos vermes machos de S.

mansoni, comprometendo a expressão de proteínas de transportes,

responsáveis pela excreção de fármacos e metabólitos do parasita;

Observou-se redução das reações granulomatosa nos tratamentos realizados

com Sesquiterpenos, desta forma acreditamos que pode ter ocorrido efeito

antiinflamatório e imunomodulador sobre as reações granulomatosas nas

diferentes fases de infecção da esquistossomose.

Persperctivas:

Realizar estudos moleculares dos principais alvos de estudo (Tegumento e

Sistema excretor) a fim de confirmar as hipóteses levantadas.

Realizar estudos de imunohistoquímica dos granulomas hepáticos a fim de

avaliar, de forma mais precisa, o efeito imunomodulador observado neste

estudo.

121

Referências Bibliográficas

8. Referências Bibliográficas

Abdul-Ghani, R., Loutfy, N., Sheta, M., (2011). Artemether shows promising female schistosomicidal

and ovicidal effects on the Egyptian strain of Schistosoma mansoni after maturity of infection.

Parasitology Research. 108, 1199–1205.

Adams, R., P. (2007). Identification of essential oil componentes by gas chromatography/ mass spectrometry. Allured Publishing Corporation: Illinois, 4 th Ed. 804. Akram, Z., Mohammad, R., Louwrance, W., Christian, P., Bernd, S., Amirghofran, Z. (2011). Identification of Spathulenol in Salvia mirzayanii and the Immunomodulatory Effectsptr_3289 557. 562. Phytotherapy Research. 25: 557–562. Allegretti, S. M., Oliveira, C. N. F., Oliveira, R. N., Frezza, T. F., Rehder, V. L. G. (2012). The use of Brazilian medicinal plants to combat Schistosoma mansoni. In: Schistosomiasis, InTech Open Access Publisher: Rijeka. Amaral, A. S., Mossi, A. J., Radunz, L.L., Treichel, H., Teixeira, A. J. Lerin, L. A., Argenta, G. A. (2010). Crop of Baccharis trimera in nutrient solution with different concentrations of nitrogen, phosphorus and potassium. Perspective Erechim, 34, 25-34. Andrade, Z., A. (2009). Schistosomiasis and liver fibrosis. Parasite Immunology. 31, 656-663. Anthony, J., P., Fyfe, L., Smith, H. (2005). Plant active components – a resource for antiparasitic agents? Trends Parasitology. 21, 462–468. Armstrong, J.C. (1965). Mating Behavior and Development of Schistosomes in the Mouse. Journal of

Parasitology. 51, 605–616.

Armstrong, J.S. (2006). Mitochondrial membrane permeabilization: the sine qua non for cell death. Bio Essays 28, 253–260. Bakkali, F.; Averbeck, S.; Averbeck, B.; Idaomar, M. (2008). Biological effects of essential oils – a review. Food and Chemical Toxicology. 46: 446-475. Barker, L. R., Bueding, E., Timms, A. R. (1966). The possible role of acetylcholine in Schistosoma mansoni. Britsh Journal of Pharmacology. 26: 656-665. Barth, L. R., Fernandes, A. P., Rodrigues, V. (1996). Oviposition by Schistosoma mansoni during in vitro cultivation. Revista do Instituto de Medicina Tropical, Vol. 38, pp. 423-426. Barakat, R.M.R. (2013).Epidemiology of Schistosomiasis in Egypt: Travel through Time: Review. Journal of Advanced Research. 4, 5, 425–432.

Beckman, S. & Grevelding, C. G. (2010). Imatinib has a fatal impact on morphology, pairing stability and suvival of adult Schistosoma mansoni in vitro. International Journal for Parasitology. 40: 521-526. Becker, B., Mehlhorn, H., Andrews, P., Eckert, J. (1980). Light and electron microscopic studies on the effect of praziquantel on Schistosoma mansoni, Dicrocoelium dendriticum and Fasciola hepatica (Trematoda) in vivo. Parasitology Research. 63: 113-128. Bennet, J. & Bueding, E. (1971). Localization of biogenic amines in Schistosoma mansoni. Comparative Biochemistry and Physiology. 39: 859-867. Blanchard, T.T., Milne, L.M., Pollok, R., Cook, G.C. (1993). Early chemoterapy of imported neuroschistosomiasis. The Lancet, 341:959.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/20901232

http://www.sciencedirect.com/science/journal/20901232/4/5

122


Borrmann, S., Szlezák, N., Faucher, J.F., Matsiegui, P.B., Neubauer, R., Binder, R.K., Lell, B., Kremsner, P.G. (2001). Artesunate and praziquantel for the treatment of Schistosoma haematobium infections: a double blind, randomized, placebo-controlled study. Journal Infectious Disease.184:1363-6. Botelho, M.A., Nogueira, N.A., Bastos, G.M., Fonseca, S.G., Lemos, T.L., Matos, F.J., Montenegro, D., Heukelbach, J., Rao, V.S., Brito, G.A., (2007). Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol against oral pathogens. Brazilian Journal Medical Biological Research. 40, 349–356. Botros, S., Sayed, H., Amer, N., El-Ghannam, M., Bennett, J. L., Day, T. A. (2005). Status of sensitivity to praziquantel in a focus of potential drug resistance in Egypt. International Journal Parasitology.35:787–91. Botros, S., Soliman, A., El-Gawhary, N., Selim, M., Guirguis, N. (1989). Effect of combined low dose praziquantel and oxamniquine on different stages of schistosome maturity. Trans Royal Soc. Tropical Medicine Hygiene. 83:86-9. Botros, S.S., Hammam, O., Mahmoud, M., Bergquist, R. (2010). Praziquantel efficacy in mice infected

with PZQ non-susceptible S. mansoni isolate treated with artemether: parasitological, biochemical and

immunohistochemical assessment. APMIS, 118, 692–702.

Brahmachari G. (2011). Natural products in drug discovery: impacts and opportunities - an assessment. In: Bioactive Natural Products: Opportunities and Challenges in Medicinal Chemistry. Brahmachari G (Ed.), World Scientific Publishing Company, 1–199. Brindley, P.J., Sher, A. (1987). The chemotherapeutic effect of praziquantel against Schistosoma mansoni is dependent on host antidody response. Journal Immunology.39:215-20. Brooker, S., Kabatereine, N. B., Gyapong, J., O., Sthotard, J. R., Utzinger, J. (2009). Rapid mapping of schistosomiasis and other neglected tropical diseases in the context of integrad control programmes in Africa. Parasitology. 136 (13):1707-18. Bruckner, D.A., Voge, M. (1974). The nervous system of larval serotonin had such dramatic effects on the motility of pri- Schistosoma mansoni as revealed by acetylcholinesterase staining sporocysts, in that this stage of development is gener- Journal of Parasitology. 60, 437–446. Bruneton, J. (1991). Elementos de Fitoquímica y de Farmacognosia. Zaragoza: Editorial Acribia,

1991.

Burke, M.L., Jones, M., K., Gobert, G., N., Li, S. Y., Ellis, M. K., Mc Manaus, D.P. (2009) Immunopathogenesis of human schistosomiasis. Parasite Immunology. 31, 163–176. Caffrey (2015).Schistosomiasis and its treatment. Future Medicinal Chemical .7(6), 675–676. Caffrey, C.R. (2007) Chemotherapy of schistosomiasis: present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 11: 433–439. Carod-Artal, F. J. (2009).Tropical causes of epilepsy. Revista Neurologia. 49, 475–482. Cavaleiro, C., Pinto, E., Goncalves, M.J., Salgueiro, L. (2006). Antifungal activity of Juniperus

essential oils against dermatophyte, Aspergillus and Candida strains. Journal of Applied

Microbiology. 100, 1333-1338.

Chitsulo, L., Engels, D., Montresor, A., Savioli, L. (2000). The global status of schistosomiasis and its control. Acta tropica, 77(1), 41-51. Chuah, C., Jones, M.K., Burke, M.L., McManus, D. P., Gobert, G.N. (2014). Cellular and chemokine-mediated regulation in schistosome-induced hepatic pathology. Trends in Parasitology, 30, 141-149. Cioli, D. & Pica-Mattoccia, L. (2003). Praziquantel. Parasitology Research. 90: S3-S9.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19450373

123


Coelho, P. M. Z., Lima, F. C. S. & Nogueira, J. A. M. (1997). Resistance to oxamniquine of a Schistosoma mansoni strain isolate from a patient submitted to repeated treatments. Revista do

Instituto de Medicina Tropical de São Paulo.39,101–106. Coles, G.C., Bruce, J.I., Kinoti, G.K., Mutahi, W.T., Dias, E.P., Katz, N. (1986) Drug resistance in schistosomiasis. Transactions of Royal Society of Tropical Medicine Hygiene. 80:347. Colley, D.G. (2014). Morbidity control of schistosomiasis by mass drug administration: how can we do it best and what will it take to move on to elimination? Tropical Medicine Health, 42, 25–32. Couto, F.F.B, Coelho, P.M.Z, Araújo, N., kusel, J.R., Katz, N., Mattos, A.C.A. (2010). Use of fluorescent probes as a useful tool to identify resistant Schistosoma mansoni isolates to praziquantel. Parasitology. 137, 1791–1797. Cowan, M.M. (1999). Plant products as antimicrobial agents. Clinical Microbioogy Review. 12(4), 564–582. Cragg, G.M, Newman, D. J. (2013). Natural products: a continuing source of novel drug leads. Biochemical Biophys. Acta. 1830(6),3670–3595. Cunha, N. L., Uchôa, C.J., Cintra, L.S., Sousa, H. C., Magalhães, L.G., Gimenez, V.M.M., Silva, A., Cunha, W. R., Januário, A.H. (2012). In vitro schistosomicidal activity of some Brazilian cerrado species and their isolated compounds.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 173614. Cunha, A. S. (1982). Avaliação terapêutica da oxamniquine na esquistossomose mansoni humana pelo método do oograma por biópsia de mucosa retal. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. 24: 88-94. Chao, L.K., Hua, K.F., Hsu, H.Y., Cheng, S.S., Liu, J.Y., Chang, S.T. (2005). Study on the

antiinflammatory activity of essential oil from leaves of Cinnamomum osmophloeum. Journal of

Agricultural and Food Chemical. 53: 7274–7278.

Danso-Appiah, A., De Vlas, S.J. (2002). Interpreting low praziquantel cure rates of Schistosoma mansoni infections in Senegal. Trends in Parasitology. 18, 3, 125-129. Da-silva, S. P. & Noel, F. (1995). Time-course of the effect of praziquantel on Schistosoma mansoni attachment in vitro: comparision with its effects on worm length and motility. Parasitology Research. 81: 544-548. Davis, B.H., Kresina, T. F. (1996). Hepatic fibrogenesis. Clinics Laboratory Medicine.16(2): 361-375. Della Torre, A. (2013). Óleo essencial de Baccharis trimera (Less.) DC: Estudo Fitoquímico e avaliação in vitro das atividades antiproliferativa e mutagênica [ Dissertação de Mestrado] Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas. 2013. De Moraes, J., Almeida, A.A.C., Brito, M.R.M., Marques, T. H. C., Lima, T. C., Sousa, D.P., Nakano, E., Mendonça, R. Z., Freitas, R., M.(2013a). Anthelmintic activity of the natural compound (+)-limonene epoxide against Schistosoma mansoni. Planta medica. 79 (3–4), 253–258. De Moraes (2015).Natural products with antischistosomal activity. Future Medicine Chemical. 7(6), 801–820. De Moraes, J., Carvalho, A.A.L., Nakano, E., Marques, T.H., Andrade, L.N., de Freitas, R.M., de Sousa, D.P.(2013b). Anthelmintic activity of carvacryl acetate against Schistosoma mansoni. Parasitology Research. 112(2), 603–610.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Marques%20TH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23086444

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Andrade%20LN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23086444

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de%20Freitas%20RM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23086444

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de%20Sousa%20DP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23086444

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de%20Sousa%20DP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23086444

124


De Moraes, J., de Oliveira, R.N., Costa, J., P. Junior, A.L.G., Sousa, D.P., Freitas, R.M., Allegretti, S. M., Pinto, P.L.S. (2014). Phytol, a diterpene alcohol from chlorophyll, as a drug against neglected tropical disease Schistosomiasis mansoni. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8(1), e2617. De Oliveira, R.N., Rehder, V.L.G., Oliveira, A.S.S., Montanari Jr, I., Jeraldo, V.L.S., Linhares, A.X., de Ruiz, A.L.T.G., de Carvalho, J.E., Allegretti, S. M. (2012). Schistosoma mansoni: in vitro schistosomicidal activity of essential oil of Baccharis trimera (Less) DC. Experimetal Parasitology. 132,135–143. De Oliveira, R.N,, Rehder, V.L.G., Oliveira, A.S.S., Jeraldo, V.L.S., Linhares, A.X., Allegretti, S.M. (2014). Anthelmintic activity in vitro and in vivo of Baccharis trimera (Less) DC against immature and adult worms of Schistosoma mansoni. Experimental Parasitology. 139, 63–72. Delgado, V.S., Sufirez, D.P., Cesari, I.M., Incani, R.N. (1992). Experimental chemotherapy of

Schistosoma mansoni with praziquantel and oxamniquine: differential effect of single or combined

formulations of drugs on various strains and on both sexes of the parasite. Parasitology Research.

78: 648-654.

Doenhoff, M. J.; Cioli, D.; Utzinger, J. (2008). Praziquantel: mechanism of action, resistance and new derivatives for schistosomiasis. Current Opinion in Infectious Diseases. 21: 659-667. Dubois, F., Caby, S., Oger, F., Cosseau, C., Capron, M., Grunau, C., Dissous, C., Pierce, R. J. (2009). Histone Histone deacetylase inhibitors induce apoptosis, histone hyperacetylation and up-regulation of gene transcription in Schistosoma mansoni. Molecular and Biochemical Parasitology. 168, 7-15. Ekins, S., Williams, A. J., Matthew, D., Krasowski, M. D. & Freundlich, J. S. (2011). In silico

repositioning of approved drugs for rare and neglected diseases. Drug Discovery Today, 16, 298-

310.

El-Ridi, R., Aboueldahab, M., Tallima, H., Salah, M., Mahana, N., Fawzi, S., Mohamed, S. H., Fahmy, O. M. (2010). In vitro and in vivo activities of arachidonic acid against Schistosoma mansoni and Schistosoma haematobium. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54: 3383-3389. El Ridi, R.A.F., Tallima, H.A.M (2013). Novel therapeutic and prevention approaches for schistosomiasis. Journal of Advanced Research. 4, 467–478 El-Beshbish, S.N., Taman, A., El-Malky, M., Azab, M.S., El-Hawary, A., El-Tantawy, D.A. (2013a). In vivo effect of single oral dose of artemether against early juvenile satges of Schistosoma mansoni Egyptian strain. Experimental Parasitology. 135, 240-245. El-Beshbishi, S.N., Taman, A., El-Malky, M., Azab, M.S., El-Hawary, A.K., El-Tantawy, D. A. (2013b).

First insight into the effect of single oral dose therapy with artemisinin–naphthoquine phosphate

combination in a mouse model of Schistosoma mansoni infection. International Journal for

Parasitology. 43,521–530.

Edris, A. E. (2007). Pharmaceutical and therapeutic potentials of essential oils and their individual volatile constituents: a review. Phytotherapy Research. 21: 308-323. Engels, D., Chitsulo, L., Montresor, A., Savioli, L. (2002). The global epidemiological situation of

schistosomiasis and new approaches to control and research. Acta Tropica 82: 139-146.

Ezeamama, A.E., McGarvey, S.T., Hogan, J., Lapane, K.L., Bellinger, D.C. Acosta, L.P., Leenstra, T., Olveda, R., M., Kurtis, J.D., Friedman, J.F. (2012). Treatment for Schistosoma japonicum reduction of intestinal parasite load and cognitive test score improvements in school-aged children. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1634. Faghiri Z, Camargo, SMR, Huggel K , Forster IC, Ndegwa D , Verrey F , Skelly PJ. (2010). The Tegument of the Human Parasitic Worm Schistosoma mansoni as an Excretory Organ: The Surface Aquaporin SmAQP Is a Lactate Transporter. PLoS One. 5(5); e10451.

125


Fallon, P. G., Sturrock, R. F., Niang, A. C. & Doenhoff, M. J. (1995). Short report: diminished susceptibility to praziquantel in a Senegal isolate of Schistosoma mansoni. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 53, 61-62. Fan Y, Xi Y, Chen L, Liu W, Li X, Li Y, Xiaolin Fan X. (2015). Novel Upconversion Fluorescent Probe for Schistosoma japonicum Cercariae Imaging. Medicine chemical 5:6; 231-234. Fernandes, E.S, Passos, G.F, Medeiros, R, da Cunha, F.M, Ferreira, J Campos, M.M., Pianowski, L.J., Calixto, J.B. (2007). Anti-inflammatory effects of compounds alpha-humulene and (−) trans-caryophyllene isolated from the essential oil of Cordia verbenacea. European Journal of Pharmacology. 569, 228–236. Ferrari, T. C. A., Moreira, P. R. R., Cunha, A. S. (2008). Clinical characterization of neuroschistosomiasis due to Schistosoma mansoni and its treatment. Acta tropica. 108, 87-97. Freitas, A. R. R., Oliveira, A. C. P., Jachinto Silva, L. J. (2010). Schistosomal myeloradiculopathy in a low-prevalence area: 27 cases (14 758 autochthonous) in Campinas, São Paulo, Brazil. Memórias do Instituto Adolfo Lutz, 105, 398-408. Frezza, T.F. (2012). Ação de Cordia verbenacea sobre Schistosoma mansoni [Tese de Doutorado]

Instituto de Biologia- Universidade Estadual de Campinas- Unicamp. 2013.

Frezza, T.F., Oliveira, C.N.F., Banin, T.M., Rehder, V.L., Boaventura, Jr., Allegretti, S.M. (2013). Alterações tegumentares em duas diferentes linhagens de Schistosoma mansoni submetidas a tratamento com artemisinina e ácido artesúnico. Revista de Patologia Tropical. 42; 309-321.

Frohberg H. (1989).The toxicological profile of praziquantel in comparison to other anthelmintics drugs. Acta Leiden. 57, 201-15.

Galanti, S. E., Huang, S.C.C., Pearce, E.J. (2012). Cell Death and Reproductive Regression in

Female Schistosoma mansoni. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1509.

Gamberini, M. T., Skorupa, L.A., Souccar, C., Lapa, A.J.(1991). Inhibition of gastric secretion by awater extract from Baccharis triptera Mart. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 86, pp137–139. Gené, R. M., Marin, E., Adzet, T. (1996). Anti-inflammatory effect of aqueous extracts of three species of the genus Baccharis. Planta Medica, 58, 565–566. Giordani, R.; Hadef, Y.; Kaloustian, J. (2008). Compositions and antifungal activities of essential oils of some Algerian aromatic plants. Fitoterapia. 79, 199-203. Guimarães, M.A., de Oliveira, R.N., Véras, L.M.C., Lima, D.F., Campelo, Y.D.M, Campos, S.A., Allegretti, S.M., Moraes, J., Lolic, A., Verbic, T., Leite, J.R.S.A. (2015). Anthelmintic Activity In Vivo of Epiisopiloturine against Juvenile and Adult Worms of Schistosoma mansoni. PLoS Neglected Tropical Disease. 9(3): e0003656. Gönnert, R. (1955). Schistosomiasis studies. II. Übedie Eibildung bei Schistosoma mansoni und das Schicksal der Eier Wirtsorganismus. Zeitschrift für Tropenmedizin und Parasitologie. 6: 33-52. Gray, D. J. (2011). Diagnosis and management of schistosomiasis. British medical journal. 342, d2651, 1–11. Greenberg RM. (2005). Are Ca2+ channels targets of praziquantel action? International

Parasitology. 35:1-9. Greenberg, R.M. (2013). New approaches for understanding mechanisms of drug resistance in schistosomes. Parasitology. 140: 1534–1546. Gryseels, B., Polman, K., Clerinx, J., Kestens, L. (2006). Human Schistosomiasis. The Lancet. 368: 1106-1118.

126


Gryseels, B. (2012). Schistosomiasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26, 383-397.

Guido, R. V. C.; Andricopulo, A. D.; Oliva, G. (2010). Planejamento de fármacos, biotecnologia e química medicinal: aplicações em doenças infecciosas. Revista Estudos Avançados.24,81-98. Guido, R.V.C. & Oliva, G. (2009). Structure- based drug dicovery for tropical diseases. Current Tropical Medicine Chemical. 9, 824- 843. Hams, E. Aviello, G., Fallon, P.G. (2013). The Schistosoma granuloma: friend or foe? Front. Immunol. 4:89. Han, z., G., Brindley, P., J., Wang, S., Y., Chen, Z. (2009). Schistosoma gemomics: new perspectives on schistosome biology and host- parasite interaction. Annual Review of Genomics Human Genetics. 10, 211-240.

Hayashi, M. (2003). Clinical features of cerebral schistosomiasis, especially in cerebral and hepatosplenomegalic type. Parasitology International. 52: 375–83. Hermeto, M.V., Bicalho, R.S., Da Silva, R.E., De Melo, A.L. e Pereira, L.H. (1994). Oogram studies in mice infected with Schistosoma mansoni and treated with dexamethasone. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 36, 99-104. Hotez, J., P., Bottazzi, M., E., Francopparedes, C., Ault, S., K., Periago, M., R. (2008). The Neglected Tropical Diseases of Latin America and the Caribbean: A Review of Disease Burden and infections disiases. 3: 1274 -1285. Hotez, P. J., Fenwick, A.; Savioli, L.; Molyneux, D. H. (2009). Rescuing the bottom billion through control of neglected tropical diseases. The Lancet. 373: 1570-1575. Hotez, P.J., Molyneux, D.H, Fenwick, A., Kumaresan, J., Sachs, S, E., Sachs, J.D., Savioli, L. (2007). Control of Neglected Tropical Diseases. The New England Journal of Medicine. 357, 1018–1027. Ismail, M., Botros, S., Metwally, A., William, S., Farghally, A., Tao, L. F., Day, T. A., Bennett, J. L. (1999). Resistance to praziquantel: direct evidence from Schistosoma mansoni isolated from Egyptian villagers. American Journal of Tropical Medicine Hygiene. 60: 932-935. Ismail, M., Metwally, A., Farghaly, A., Bruce, J., Tao, L.F., Bennett, J.L. (1996). Characterization of isolates of Schistosoma mansoni from Egyptian villagers that tolerate high doses of praziquantel. Americam Journal Tropical Medicine Hygene. 55:214–8. Jiraungkoorskul, W., Sahaphong, S., Sobhon, P., Riengrojpitak, S., Kangwanrangsan, N. (2006). Schistosoma mekongi: the in vitro effect of praziquantel and artesunate on the adult fluke. Experimental Parasitology. 113(1), 16–23. Katz, N. & Almeida, K. (2003). Esquistossomose, xistosa, barriga d'água. Ciência e Cultura, 55, 38 – 41. Katz, N., Coelho, P. M. Z. (2008). Clinical therapy of schistosomiasis mansoni: the brazilian contribution. Acta tropica. 108: 72–78. Katz, N.; Chaves, A.; Pellegrino, J. (1972). A simple device for quantitative stool thickdmear technique in Schistosomiasis mansoni. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 14, 397- 400. Kayser, O., Kiderlen AF, Croft, S.L. (2003). Natural products as antiparasitic drugs. Parasitology Research. 90(Suppl. 2), S55–S62. King, C. H. (2010). Parasites and poverty: the case of schistosomiasis. Acta Tropica. 113, 95–104. Kinoti, G. K. (1987). The significance of variation in the susceptibility of Schistosoma mansoni to the antischistosomal drug oxamniquine. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 2: 151-156.

127


Kola, I. & Landis, J. (2004). Can the Pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Review Drug Discovery. 3, 711-716. Kohn, A., López-Alvarez, M.L., Katz, N. (1982).Transmission and scanning electron microscopical studies in the tegument of male Schistosoma mansoni after oxamniquine treatment. Annales de Parasitologie Humaine et Comparée.57: 285-291. Kramers, P.G.N., Gentile, J.M., Gryseels, B.J.M.A., Jordan, P., Katz, N., Mott, K.E., Mulvihill, J.J., Seed, J.L., Frohberg, H. (1991). Review of the genotoxicity and carcinogenicity of antischistosomal drugs: is there a case for a study of mutation epidemiology? Mutation Research. 257:49-89.

Kunz W. (2001). Schistosome male-female interaction: induction of germ-cell differentiation. Trends in Parasitology.17, 227-231. Kusel, J.R., Veigh, P.M., Thornhill, J. A. (2009). The schistosome excretory system: a key to regulation of metabolism, drug excretion and host interaction. Trends in Parasitology.25; 8; 353-358. Lambertucci, J., R. (2010). Acute schistosomiasis mansoni: revisited and reconsidered. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 105(4): 422-435. Lenzi, H. L.; Romanha, W. S.; Machado, M. P.; Mota, E. M.; Lenzi, J. A. (2008). Patologia experimental com enfoque no granuloma esquistossomótico. In: Carvalho, O. S.; Coelho, P. M. Z.; Lenzi, H. L. Schistosoma mansoni e Esquistossomose uma visão multidisciplinar, 569-654, Fiocruz: Rio de Janeiro. Lenzi, H.L., Romanha, W. S., Dos Santos, R. M. Z., Mota, E. M., Manso, P.P.A., Caputo, L.F. G., Pelajo-Machado, M. (2006). Four whole-istic aspects of schistosome granuloma biology: fractal arrangement, internal regulation, autopoietic component and closure. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 101, 219–231. Lindoso, J., A., L. (2009). Neglected Tropical Diseases in Brazil, Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, Vol, 51, pp. 247- 253. Lima, C. M. B. L., Freitas, F. I. S., Morais, L.C. S. L., Cavalcanti, M. G. S. Silva, L. F. Padilha, R. R., Barbosa, C. G. S., Santos, F. A. B., Alves, L. C., Diniz, M. F. F. M. (2011). Ultrastructural study on the morphological changes to male worms of Schistosoma mansoni after in vitro exposure to allicin. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical.44, 327- 330. Liu, Y.X., Wu, W., Liang, Y., J. (2014). New uses for old drugs: the tale of artemisinin derivatives in the elimination of schistosomiasis japonica in China. Molecules. 19(9), 15058–15074. Liang, Y. S., Wang, W., Dai, J. R., Li, H. J., Tao, Y. H., Zhang, J. F., Li, W., Zhu, Y. C., Coles, G. C.,

Doenhoff, M. J. (2010). Susceptibility to praziquantel of male and female cercariae of praziquantel-

resistant and susceptible isolates of Schistosoma mansoni. Journal of Helminthology. 84: 202-207.

Lorsuwannarat, N., Saowakon, N., Ramasoota, P., Wanichanon, C., Sobhon, P. (2013).The anthelmintic effect of plumbagin on Schistosoma mansoni. Experimental Parasitology. 133(1), 18–27. LoVerde, P. T., Chen, L.(1991). Schistosome female reproductive development. Parasitology. Today. 7, 303-308. LoVerde, P.T. (2002). Presidential address. Sex and schistosomes: an interesting biological interplay

with control implications. Journal Parasitology. 88, 3–13.

Maciel, M.A.M., Pinto, A.C., Veiga Jr., V.F. (2002). Plantas Medicinais: A Necessidade de Estudos Multidisciplinares. Quimica Nova, 25, 3, 429-438.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lorsuwannarat%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23085370

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Saowakon%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23085370

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ramasoota%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23085370

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wanichanon%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23085370

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sobhon%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23085370

128


Mafud, A. C., Silva, M.P.N., Monteiro, D.C., Oliveira, M.F., Resende, J.G., Coelho, M.L., Sousa, D.P., Mendonça, R.Z.M., Pinto, P.L.S., Freitas, R.M., Yvonne P. Mascarenhas, Y. P., Moraes, J. (2016). Structural parameters, molecular properties, and biological evaluation of some terpenes targeting Schistosoma mansoni parasite. Chemico-Biological Interactions. 244,129e139.

Magalhães, L. G., Machado, C. B., Morais, E. R., Moreira, E. B. C., soares, C. S., Silva, S. H., da Silva Filho, A. A., Rodrigues, V. (2010). In vitro schistosomicidal activity of curcumin against Schistosoma mansoni adult worms. Parasitology Research. 104: 1197-1201. Mair, G. R., Maule, A. G., Day, T. A., Halton, D. W. (2000). A confocal microscopical study of the musculature of adult Schistosoma mansoni. Parasitology. 121: 163-170. Matas, S. L. (2001). Neuroesquistossomose. Rev. Neurociências. 9 (1), 27-31. Mantawy, M. M., Ali, H. F., Rizk, M. Z. (2011). Therapeutic effects of Allium sativum and Allium cepa in Schistosoma mansoni experimental infection. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. 53: 155-163. Matos-Rocha, T.J., dos Santos Cavalcanti, M.G, Barbosa-Filho, J.M., Carneiro Lúcio, A.S.S., Veras, D.L., Feitosa, A.P.S., Siqueira Jr, J. P., Almeida, R.N., Marques, M.O.M., Alves, L.C., Brayner, F.A. (2013). In vitro evaluation of schistosomicidal activity of essential oil of Mentha x villosa and some of its chemical constituents in adult worms of Schistosoma mansoni. Planta Medica. 79 (14), 1307–1312. Meltzer, E., Schwartz, E. (2013). Schistosomiasis: Current Epidemiology and Management in Travelers. Current Infection Diseases Reports. 15, 211–215. Mendonça-Silva, D. L.; Gardino, P. F.; Kubrusly, R. C. De Mello, F. G.; Noel, F. (2004).

Characterization of a GABAergic neurotransmission in adult Schistosoma mansoni. Parasitology.

129: 137-146.

Messerli, S.M., Kasinathan, R.S., Morgan, W., Spranger, S.,Greenberg, R .M. (2009) Schistosoma mansoni P-glycoprotein levels increase in response to praziquantel exposure and correlate with reduced praziquantel Susceptibility. Molecular Biochemical Parasitology 167;(1); 54–59. Metwally, N. S. (2006). Potency of Allium sativum and Allium cepa Oils against Schistosoma mansoni Infection in Mice. The Egyptian Journal of Hospital Medicine.23, 319- 332. Mitsui, Y.; Miura, M.; Aoki, Y. (2009). In vitro effects of artesunate on the survival of worm pairs and egg production of Schistosoma mansoni. Journal of Helmintology. 83: 7-11.

Miller, P., Wilson, R.A. Migration of the schistosomula of Schistosoma mansoni from the lungs to the

hepatic portal system. Parasitology. 80(2), 267-88.

Monzote, L., Montalvo, A.M., Almanonni, S., Scull, R., Miranda, M., Abreu, J. (2006). Activity of the essential oil from Chenopodium ambrosioides grown in Cuba against Leishmania amazonensis. Chemotherapy. 52,130–136.

Moraes, J., Nascimento, C., Lopes, P. O. M. V., Nakano, E., Yamaguchi, L. F., Kato, M. J.; Kawano, T. (2011). Schistosoma mansoni: In vitro schistosomicidal activity of piplartine. Experimental Parasitology. 127: 357-364. Moreira, F. P. M., Coutinho, V., Montanher, A. B. P., Caro, M.S.B., Brighente, I. M. C., Pizzolatti, M. G. (2003). Flavonóides e triterpenos de Baccharis eudotenuifolia - Bioatividade sobre Artemisia salina. Química Nova. 26, 309-311. Mostafa, O.M., Eid, R.A., Adly, M.A. (2011). Antischistosomal activity of ginger (Zingiber officinale) against Schistosoma mansoni harbored in C57 mice. Parasitology Research. 109, 395–403. Mulvenna J, Moertel L, Jones MK, Nawaratna S, Lovas, E.M., Gobert, G.N, Colgrave, M. (2010). Exposed proteins of 623 the Schistosoma japonicum tegument. International Journal Parasitology. 40; 543-554.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Miller%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7367042

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wilson%20RA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7367042


129


Neves, J. K., Botelho, S. P., De Melo, C. M., Pereira, V. R., De Lima, M. D. O. C., Pittaida, R., Albuquerque, M. C., Galdino, S. L. (2010). Biological and immuniogical activity of new imidazolidines againts adults worms of Schistosoma mansoni. Parasitology Research. 107, 531-538. Neves, B.J., Andrade, C.H., Pedro V. L. Cravo, P.V.L. (2015). Natural Products as Leads in

Schistosome Drug Discovery. Molecules. 20, 1872-1903.

Newman, D.J, Cragg, G., M. (2009). Natural product scaffolds as leads to drugs. Future Medicine Chemical. 1(8), 1415–1427. Noel, F. (2008) Sistema neuromuscular e controle da motilidade do verme adulto. In: Carvalho, O.S., Coelho, P. M. Z., Lenzi, H. L. Schistosoma mansoni & Esquistossomose: Uma visão interdisciplinar. Rio de Janeiro: Fiocruz, pp.207-244. Nwaka, S. (2008). Advancing drug innovation for neglected diseases-criteria for lead progression. PLoS Neglected Tropical.Disesases.8, e440, 1-13. Olds GR. (2003). Administration of praziquantel to pregnant and lactating women. Acta Tropica. 86:185-95.

Oliver, L., Stirewalt, M. A. (1952). An efficient method for exposure of mice to cercária of Schistosoma mansoni. Journal of Parasitology. 38: 19-23. Parreira, N. A., Magalhães, L. G., Morais, D. R., Caixeta, S. C., Sousa, J. P. B.; Bastos, J. K., Cunha, W. R., Silva, M. L. A., Nanayakkara, N. P. D., Rodrigues, V., Silva Filho, A. A. (2010). Antiprotozoal, Schistosomicidal, an Antimicrobial Activities of the Essential Oil from the Leaves of Baccharis dracunculifolia. Chemistry & Biodiversity. 7: 993-1001.

Paul, E. L., Lunardelli, A., Caberlon, E., Oliveira, C. B., Santos, R. C., Biolchi, V., Bastos, C. M.,

moreira, K. B, Nunes, F. B., Gosmann, G., Oliveira, J. R. (2009). Anti-inflammatory and

immunomodulatory effects of Baccharis trimera aqueous extract on induced pleurisy in rats and

lymphoproliferation in vitro. Inflammation.32,419–425.

Pearce, E. J., Macdonald, A. S. (2002).The Immunobiology of Schistosomiasis. Nature Reviews – Immunology. 2, 499–511. Pellegrino & Siqueira, A. F. (1956) Técnica de perfusão para colheita de Schistosoma mansoni em

cobaias experimentalmente infectadas. Revista Brasileira Malariol. 8: 589-97.

Pellegrino, J. & Katz, N. (1968). Experimental chemotherapy of Schistosomiasis mansoni, Advances in Parasitology. 6, 233-290, 1968. Pellegrino, J., Oliveira, C. A., Faria, J., Cunha, A. S. (1962). New approach to the screening of drugs in experimental Schistosomiais mansoni in mice. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 11: 201-215. Pérez Del Villar, L., Burguillo, F.J., López-Aban, J., Muro, A. (2012). Systematic Review and Meta-Analysis of Artemisinin Based Therapies for the Treatment and Prevention of Schistosomiasis. PLoS ONE. 7(9), e45867. Pêssoa, R. F., Castro, N. G., Noel, F. (2005). Binding of [3] MK-801 in subcellular fractions of Schistosoma mansoni evidence for interaction with nicotinic receptors. Biochemical Pharmacology. 69: 1509-1516. Peregrino, A.J.P., Puglia, P.M.K., Nobrega, J.P.S., Livramento, J. A., DIAS, M.J.M., Scaff, M. (2002). Esquistossomose Medular: analises de 80 casos. Arquivos de Neuropsiquiatria, 60, 603-608. Pimenta, K.S.S., Corrêa, J.O.A., Mesquita, H.L. (2010). Neuroschistosomiasis: profile study of pathological and clinical diagnostic criteria. Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais. 2, 4, 120 – 125.

130


Pinho-da-Silva L, Mendes-Maia PV, Teófilo TMNG, Barbosa R, Ceccatto VM (2012) Trans-Caryophyllene, a Natural Sesquiterpene, Causes Tracheal Smooth Muscle Relaxation through Blockade of Voltage-Dependent Ca2+ Channels. Molecules. 17; 11965-11977. Popiel, I., Cioli, D., Erasmus, D., A. (1984). The morphology and reproductive status of female

Schistosoma mansoni following separation from male worms. International Journal Parasitolgy. 14,

183–190.

Platt, T.R., Brooks, D.R. (1977) Evolution of the schistosomes (Digenea: Schistosomatidae): the origin

of dioecy and colonization of the venous system. Journal of Parasitology 83: 1035-1044.

Prata, A. (1957). Tipos de ovos de Schistosoma mansoni. In: Biópsia retal na esquistossomose mansoni. Rio de Janeiro: Serviço Nacional de Educação Sanitária. 15-60. Ramalhete, C., Magalhães, L.G., Rodrigues, V., Mulhovo, S., Da Silva-Filho, A.A., Ferreira, M.J.U. (2012a). In vitro schistosomicidal activity of balsaminol F and karavilagenin C. Planta Medica. 78 (18), 1912–1917. Raso, P. & Neves, J. (1965). Contribuição ao conhecimento do quadro anatômico do fígado na forma toxêmica da esquistossomose mansônica através de punções biopsias. Anais da Faculdade de Medicina de Minas Gerais.22, 147-165. Richter, C., Schlegel, J. (1993). Mitochondrial calcium release induced by prooxidants. Toxicology Letters. 67, 119–127 Rocha, M. O. Coelho, P. M. Z., Mello, R. T. (1985). Schistosoma mansoni: importance of skin and

pulmonary phases to concomitant immunity in albino mice. Revista do Instituto de Medicina

Tropical de São Paulo.27,2,86-88.

Rollemberg, C.V.V., Santos, C.M.B., Silva, M.M.B.L., Souza, A.M.B., Silva, A. M., Almeida, J. A. P., de Almeida, R.P., Jesus, A.R. (2011). Epidemiological characteristics and geographical distribution of schistosomiasis and geohelminths, in the State of Sergipe, according to data from the Schistosomiasis Control Program in Sergipe. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 44(1):91-96. Rollinson, D., Simpson, A. (1987).The Biology of Schistosomes - From genes to Latrines. Academic Press. Salzet M, Capron A, Stefano GB. (2000). Molecular crosstalk in host-parasite relationships: schistosome- and leech-host interactions. Parasitology Today. 16 536-540. Sarvel, A. K., Oliveira, A. A., Silva, A., R., Lima, A. C. L., Katz, N. (2011). Evaluation of a 25-Year-Program for the Control of Schistosomiasis mansoni in an Endemic Area in Brazil. PLoS Neglected Tropical Diseases, 5, e990. Sass, D., C., Morais, G. O., Miranda, C. R. A., Magalhães, L. G., Cunha, W. R., Santos, R. A., Arakawa, N.S. (2014). Structurally modified natural sesquiterpene lactones constitute effective and less toxic schistosomicidal compounds. Organic and Biomolecules Chemical.12 (40), 7957–7964. Seif el-Din, H.S., Al-Hroob, A.M., Ebeid, F.A. (2011). Schistosoma mansoni: N-acetylcysteine

downregulates oxidative stress and enhances the antischistosomal activity of artemether in mice.

Experimental Parasitology .128, 230–235.

Silva, C. S., Silva, S.H., Pereira-Júnior, O.S., Cabral, F.J., Costa-Cruz, J.M., Rodrigues, V. (2007). Schistosoma mansoni: gene expression of the nucleotide excision repair factor 2 (NEF2) during the parasite life cycle, and in adult worms after exposure to different DNA-damaging agents. Acta tropica. 104(1);52-62.

Silva, R. S., Ribeiro, C.M.R., Borges, M.N., Blois, G.S.O. (2009). Óleo essencial de limão no ensino

da Cromatografia em Camada Delgada. Quimica Nova. 32 8, 2234-2237.

http://www.journals.elsevier.com/toxicology-letters/

http://www.journals.elsevier.com/toxicology-letters/

131


Silva, M.P.N., Oliveira, G.L.S., de Carvalho, R.B., Sousa, D. P., Freitas, R. M. Pinto, P.L.S. Moraes, j. (2014). Antischistosomal activity of the terpene nerolidol. Molecules.19(3), 3793–3803. Silva, P. C. V., Domingues, A.L.C. (2011). Aspectos epidemiológicos da esquistossomose hepatoesplênica no Estado de Pernambuco, Brasil. Epidemiologia e Serviços de Saúde, 20, 327-336. Simões- Pires, C. A., Queiroz, F. Henriques, A. T., Hostettmann, K. (2005). Isolation and on-line identification of antioxidant compounds from three Baccharis species by HPLC-UV-MS/MS with post-column derivatisation. Phytochem Analysis, 16, 307-314. Simões, C. M. O. & Spitzer, V. (2007). Óleos voláteis. In: Simões, C. M. O. Farmacognosia. Porto

Alegre: UFRGS. p. 387-415.

Scholte, R.G.C, Gosoniu, L., Malone, J.B., Chammartin, F., Utzinger, J., Vounatsou, P.(2014). Predictive risk mapping of schistosomiasis in Brazil using Bayesian geostatistical models. Acta Tropica 132, 57–63. Skelly, P.J, Wilson, R. A. (2006). Making sense of the schistosome surface. Advances in Parasitology. 65: 185:284. Smithers, S.R., Terry, R.J. Hockley D. J. (1969).Host antigens in shistosomiasis. Proc. Revist. Soc. Brasileira, 171-483. Smithers, S.R., Terry, R.J. (1965). The infection of laboratory hosts with cercariae of Schistosoma mansoni and the recovery of adults worms. Parasitology. 55: 695–700. Souza, F. P. C., Vitorino, R. R., Costa, A. P., Faria, F. C., Santana, L. A., Gomes, J. A. (2011). Esquistossomose mansônica, aspectos gerais, imunologia, patogênese e história natural. Revista Brasileira de Clínica Médica. 9, 300-307. Sparreboom, A., Danesi, R., Andoa. Y., Chana, J., Figg. W.D. (2003). Pharmacogenomics of ABC transporters and its role in cancer chemotherapy. Drug Resistance Updates.6, 71.84. Spivak, A.Y., Keiser, J., Vargas, M., Gubaidullin, R. R., Nedopekina, D. A., Shakurova, E. R. Khalitova, R. R., Odinokov, V.N. (2014). Synthesis and activity of new triphenylphosphonium derivatives of betulin and betulinic acid against Schistosoma mansoni in vitro and in vivo. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 22 (21), 6297–6304. Steinmann, P., Keiser, J. Bos, R. Tanner, M., Utzinger, J. (2006). Schistosomiais and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk. The Lancet Infectious Diseases. 6: 411-425. Stelma, F.F., Talla. I., Sow, S., Kongs, A., Niang, M., Polman, K., Deelder, A.M., Greyseels, B. (1995). Efficacy and side effects of praziquantel in an epidemic focus of Schistosoma mansoni. Americam Journal Tropical Medicine Hygene. 53:167–70. Shaw, M. K. & Erasmus, D. A. (1983). Schistosoma mansoni: dose-related tegumental changes after in vivo treatment with praziquantel. Parasitology Research. 69:643-653. Shaw, M. K. & Erasmus, D. A. (1998). Schistosoma mansoni: praziquantel-induced changes to the female reproductive system. Experimental Parasitology..65,31-42. Shuhua, X., Binggui, S., Chollet, J., Tanner, M. (2000). Tegumental changes in adult Schistosoma mansoni harboured in mice treated with praziquantel enantiomers. Acta Tropica. 76, pp. 107-117. Tagboto, S., Townson, S. (2011). Antiparasitic properties of medicinal plants and other naturally occurring products. Advances Parasitology. 50, 199–295.

132


Tanabe, M. (2003). Haemostatic abnormalities in hepatosplenic schistosomiasis mansoni. Parasitology International. 52 (4): 351-359. Utzinger, J., Keiser, J., Shuhua, X., Tanner, M., Singe, B.H. (2003). Combination Chemotherapy of Schistosomiasis in Laboratory Studies and Clinical Trials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1487–1495 Utzinger, J., Keiser, J. (2004). Schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: common drugs for treatment and controle. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 5: 263-285. Utzinger, J., Xiao, S., N’Goran, E. K., Bergquiste, R., Tanner, M. (2011).The potential of artemether for the control of schistosomiasis. International Journal for Parasitology. 31, 1549–1562. Van Hellemond, J.J., Retra, K., Brouwers, J.F.H.M., Balkom, B.W.M., Yazdanbakhsh, M., Shoemaker, C. B., Tielens, A.G.M. (2006). Functions of the tegument of schistosomes: Clues from the proteome and lipidome. International Journal for Parasitology. 36; 691–699. Verdi, L. G., Brighent, I. M. C., Pizzolatti, M. G. (2005). Gênero Baccharis (Asteraceae): Aspectos químicos, econômicos e biológicos. Química Nova.28, pp. 85–94. Verlinde, C. L., Hannaert, V., Blonski, C., Willson, M., Périé, J.J., Fothergill-Gilmore, L.A., Opperdoes, F.R., Gelb, M.H., Hol, W.G., Michels, P.A. (2001). Glycolysis as a target for the design of new anti-trypanosome drugs. Drug Resistence Updat 4,150-65. Wagner, H., Bladt, S. (1996). Plant drug analysis: A thin layer chromatography atlas. 2th. Berlin: Springer. Wang, W., Wang, L., Liang, Y.S. (2012). Susceptibility or resistance of praziquantel in human schistosomiasis: a review. Parasitology Research.111, 1871–1877. WHO - World Health Organization. (2006). Neglected Tropical Disease hidden successes, emerging opportunities. 1-52. WHO- World Health Organization. (2015). Preventive chemotherapy in human helminthiasis. Coordinated use of anthelminthic drugs in control interventions: a manual for health professionals and programme managers. Geneva: World Health Organization. Wikman -Jorgensen, P.E., Henriquez-Camacho, C.A., Sergio Serrano-Villar, S., Pérez-Molina, J.A. (2012).The role of artesunate for the treatment of urinary schistosomiasis in schoolchildren: a systematic review and meta-analysis. Pathogens and Global Health. 106, 397-404. Wilson RA, Webster LA. (1974). Protonephridia. Biologic Reviews. 49 127-160.

Wilson, R.A. (2009). The saga of shistosome migration and attrition. Parasitology. 136, 1581-1592. World Health Organization. Report of the WHO (2001). Informal consultation on schistosomiasis in low transmission areas control strategies and criteria for elimination. London 10-13 April 2001. WHO Document WHO/CDS/CPE/SIP/2001.1. Geneva, Switzerland. Xavier AM, Magalhães JA, Cunha Gdos S, Silva AC, Tavares DA, Sarro-Silva Mde F, de Moraes Neto AH. (2010). Morphological tegument alterations of adult Schistosoma mansoni, harbored in non anti-helminthic treated, high-immune-tolerogenic and low-inflammatory mice. Acta Tropica. 116, 195–99. Xiao SH, Hotez PJ, & Tanner M. (2003). Artemether, an effective new agent for chemoprophylaxis against schistosomiasis in China: its in vivo effect on the biochemical metabolism of the Asian schistosome. Sout. Asian Journal, of Tropical Medicine and Public Health. 31, 724-732.

Xiao, S. H., Keiser, J., Chollet, J., Utzinger, J., Doing, Y., Endriss, Y., Vennerstrom, J. L., Tanner, M. (2007). In vitro and in vivo activities of synthetic trioxolanes against major human schistosome species. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51: 1440-1445.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hannaert%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Blonski%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Willson%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=P%C3%A9ri%C3%A9%20JJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Fothergill-Gilmore%20LA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Opperdoes%20FR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Opperdoes%20FR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gelb%20MH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hol%20WG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Michels%20PA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11512153



133


Xiao, S.H., Tanner, M., N'Goran, E.K., Utzinger, J., Chollet, J., Bergquist, R., Chen, M., Zheng, J. (2002). Recent investigations of artemether, a novel agent for the prevention of schistosomiasis japonica, mansoni and haematobia. ActaTropica. 82,175-81. Xiao, S. H., Hotez, P. J., Tanner, M. (2000). Artemether, an effective new agent for chemoprophylaxis against schistosomiasis in China: its in vivo effect on the biochemical metabolism of the Asian schistosome. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 31, 724-732. Yoo, C.B., Han, K.T., Cho, K.S., Ha, J., Park, H.J., Nam, J.H., Kil, U.H., Lee, K.T. (2005). Eugenol isolated from the essential oil of Eugenia caryophyllata induces a reactive oxygen species-mediated apoptosis in HL-60 human promyelocytic leukemia cells. Cancer Letters. 225, 41–52. Yoshioka, L., Magalhães, E. M. Z., Magalhães, L. A., Linhares, A. X. (2002). Schistosoma mansoni:

estudo da patogenia Santa Rosa (Campinas-SP-Brasil) em camundongos. Revista da Sociedade

Brasileira de Medicina Tropical. 35: 203-207.

Ziaei, A., Ramezani, M., Wright, L., Paetz, C., Schneider, B., Amirghofran, Z. (2011). Identification of

Spathulenol in Salvia mirzayanii and the Immunomodulatory Effects. Phytotherapy Research. 25,

557–562.

134

Anexo

9. Apêndice

135

Anexo

136

Anexo

10. ANEXO

137

Anexo

138

Anexo

rosimeire nunes de oliveirarepositorio.unicamp.br/bitstream/reposip/321644/1/...amor, pelo afeto,...

Documents