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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
LORENA MAYANA BESERRA DE OLIVEIRA
ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DE PLANTAS TANINÍFERAS DO SEMIÁRIDO
NORDESTINO SOBRE NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS DE PEQUENOS
RUMINANTES
FORTALEZA - CEARÁ
2012
1
LORENA MAYANA BESERRA DE OLIVEIRA
ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DE PLANTAS TANINÍFERAS DO SEMIÁRIDO
NORDESTINO SOBRE NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS DE PEQUENOS
RUMINANTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito
parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de
Pequenos Ruminantes.
Orientadora: Profa. Dra. Claudia Maria Leal
Bevilaqua.
FORTALEZA - CEARÁ
2012
2
O48a Oliveira, Lorena Mayana Beserra de
Atividade anti-helmíntica de plantas taniníferas do semiárido nordestino sobre
nematoídes gastrintestinais de pequenos ruminantes / Lorena Mayana Beserra de
Oliveira. — 2012.
CD-ROM. 113f. il. (algumas color) ; 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico,
acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária,
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2012.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientação: Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua.
1. Taninos condensados. 2. Haemonchus contortus. 3. Pequenos ruminantes. I.
Título.
CDD: 636.089
3
4
AGRADECIMENTOS
À Deus merecedor de toda minha gratidão por mais esta conquista. Ao amigo fiel, conselheiro
verdadeiro e companheiro presente não só em momentos de sucesso como este, mas também
em momentos de insegurança e aflição. Meu eterno agradecimento àquele que me presenteou
com mais esta vitória;
Aos meus pais, Sueli Beserra de Oliveira e Afonso Barros de Oliveira, por serem responsáveis
por tudo que sou e por alimentarem os meus ideais, me incentivando a prosseguir sem medo
independente dos obstáculos; ao meu irmão, Afonso Barros de Oliveira Filho, simplesmente
por existir; às minhas avós Maria Vilany Barros de Oliveira (in memorian) e Giseuda Antônia
de Medeiros (in memoriam) que enquanto estavam comigo foram as melhores avós que
alguém poderia ter e que mesmo de longe fizeram que tudo desse certo;
Ao meu marido, Geraldo Cavalcante Neto, por ser cúmplice, companheiro e amigo. Por mais
que eu agradeça, nunca poderei retribuir todo amor, carinho e dedicação que me doou.
Obrigado por acreditar nos meus sonhos e se fazer presente em todos os momentos da minha
vida;
À Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua por ter dedicado seu tempo e compartilhado
comigo suas experiências para que minha formação fosse também um aprendizado de vida.
Minha eterna gratidão pelo incentivo nos momentos de desânimo e pela palavra amiga nas
horas de tristeza e, principalmente, por ter me tornado confiante de que sou capaz de
continuar esta jornada;
Aos atuais e ex-integrantes do Laboratório de Doenças Parasitárias (LABODOPAR) da
Universidade Estadual do Ceará (UECE), Ana Lourdes Camurça Fernandes Vasconcelos, Ana
Carolina Fonseca Lindoso Melo, Cícero Temístocles Coutinho Costa, Michelline do Vale
Maciel, Sthenia Santos Albano Amóra, Fernanda Cristina Macedo Rondon, Maria Vivina
Barros Monteiro, Iara Tersia Freitas Macedo, Rafaella Albuquerque e Silva, Roberta da
Rocha Braga, Renata Simões Barros, Fabrício Rebouças de Oliveira, Ana Carolina Moura
Rodrigues, Eudson Maia de Queiroz Júnior, Camila de Albuquerque Almeida, Aline Aragão,
Bruno Grangeiro Portela, Diana Romão Bezerra, Mariana Colares Albuquerque, Marina
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Parissi Accioly, Vitor Luz Carvalho, Francisca Jéssika Nunes de Moura, Mayara de Aquino
Mesquita, Jessica Maria Leite dos Santos, Juliana de Carvalho Riberio, Wesley Lyeverton
Correia Ribeiro, João Batista e Silva Júnior, Rafaele Almeida Sampaio, Kaline das Chagas
Silva, José Vilemar de Araújo Filho e Andressa Machado Panassol. Agradeço a todos vocês
pelos momentos que passamos juntos que foram uns dos maiores presentes que o doutorado
me deu, pois o tempo passará e cada um seguirá seu caminho, mas a amizade de vocês ficará
guardada para sempre;
À Profa. Dra. Selene Maia de Morais por ter colocado à minha disposição o Laboratório de
Produtos Naturais da UECE e por aceitado participar da minha banca examinadora; à equipe
do laboratório, em especial à Lyeghyna Karla de Andrade Machado por ter me auxiliado na
preparação e análise química dos extratos e ao Sr. Raimundo Nonato de Menezes pela ajuda
durante a coleta das plantas e preparação das exsicatas;
Ao Dr. Luiz da Silva Vieira por ter me acolhido no Laboratório de Parasitologia da Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) e por ter aceitado participar da minha
banca examinadora, contribuindo para o meu aprendizado; à equipe do laboratório, em
especial à Helena Araújo da Ponte e Felipe Cavalcante Machado por toda dedicação, e às
estagiárias Maximiana Mesquita de Sousa, Thayana Maria dos Santos Canuto do Nascimento
e Sueline Cavalcante Chaves;
À Dra. Adriana Rocha Tomé pela análise histológica;
Ao Dr. Helder Louvandini pela análise química das plantas;
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), em
especial ao Dr. David Rondina, ao Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha e à Dra. Maria de Fátima
da Silva Teixeira, que coordenaram o Programa durante o período que cursei o doutorado; aos
funcionários do programa, em especial Adriana Maria Sales Albuquerque, Frederico Rocha
Cavalcanti, Cristina Sabóia do Nascimento, Antônio César Camelo e Selmar Alves da Silva,
que pela dedicação ao trabalho me auxiliaram a percorrer esse caminho;
Aos colegas do PPGCV que fizeram parte dessa caminhada passando juntos por mais essa
etapa no caminho da nossa realização profissional;
6
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de
estudos;
Ao Banco do Nordeste (BNB) pelo financiamento do projeto de pesquisa;
À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) pela disponibilização de suas
instalações para execução do experimento in vivo;
Às demais pessoas que não foram citadas, mas que contribuíram direta ou indiretamente para
a realização desse sonho e para meu crescimento profissional e pessoal.
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RESUMO
O estudo de plantas taniníferas é uma alternativa que vem sendo pesquisada para o controle de
nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes. Portanto, o objetivo desse estudo foi
avaliar in vitro e in vivo a atividade a anti-helmíntica de plantas taniníferas do semiárido
nordestino, como Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan (angico), Leucaena leucocephala
(Lam.) de Wit (leucena), Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir (jurema preta) e Myracrodruon
urundeuva (Engl.) Fr. Allemão (aroeira), sobre nematóides gastrintestinais de pequenos
ruminantes. Para avaliação in vitro foram preparados extratos acetona:água (70:30) das folhas
e dos caules de cada planta. Os extratos foram analisados quimicamente e submetidos ao teste
de eclosão de ovos e teste de desembainhamento larvar artificial com Haemonchus contortus.
Os testes foram acompanhados de controle com polivinilpolipirrolidona (PVPP) para
confirmar o papel dos taninos. Para avaliação in vivo, 18 ovinos livres de nematóides
gastrintestinais foram divididos em três grupos (n=6). Os animais receberam ad libitum
durante 13 dias consecutivos (Dia -7 ao Dia 5) as seguintes plantas: grupo 1 - folhas de M.
tenuiflora; grupo 2 - caules de M. tenuiflora; grupo 3 (controle) - feno de Cynodon dactylon.
No Dia 0 cada animal foi infectado experimentalmente com 4.500 larvas de terceiro estágio
de H. contortus. No Dia 5 todos os ovinos foram sacrificados para contagem da carga
parasitária e análise histológica do abomaso. Os resultados dos ensaios in vitro e in vivo foram
submetidos a ANOVA e ao teste Kruskal-Wallis (p<0,05). Todos os extratos apresentaram
altos teores de fenóis e taninos. No teste de eclosão de ovos, o extrato das folhas e o extrato
dos caules de M. urundeuva demonstraram efeito dose-dependente, sendo o extrato das folhas
mais eficaz, pois apresentou CE50 (0,52 mg/mL) inferior à CE50 do extrato dos caules (2,44
mg/mL). No teste de desembainhamento larvar artificial todos os extratos demonstraram
100% de eficácia na concentração de 300 µg/mL. A pré-incubação dos extratos com PVPP
alterou significativamente o percentual de eclosão de ovos e desembainhamento larvar de H.
contortus quando comparado com os extratos não tratados com PVPP (p<0,05), confirmando
o papel dos taninos. O consumo das folhas e dos caules de M. tenuiflora não causou redução
do estabelecimento larvar de H. contortus nos ovinos (p>0,05). A análise histológica indicou
que o número de eosinófilos e linfócitos foi semelhante nos três grupos (p>0,05). Apesar dos
promissores resultados obtidos in vitro, as folhas e os caules de M. tenuiflora não apresentam
efeito sobre o estabelecimento larvar de H. contortus em ovinos.
Palavras-chave: Taninos condensados. Haemonchus contortus. Pequenos ruminantes.
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ABSTRACT
The study of tanniferous plants with anthelmintic activity is an alternative that has been
studied for control of gastrointestinal nematodes of small ruminants. Thus the aim of this
study was to evaluate in vitro and in vivo anthelmintic activity of plants tanniferous of
northeastern semi-arid, as Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan (angico), Leucaena
leucocephala (Lam.) de Wit (leucena), Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir (jurema preta) and
Myracrodruon urundeuva (Engl.) Fr. Allemão (aroeira), on gastrointestinal nematodes of
small ruminants. In the evaluation in vitro acetone:water (70:30) extracts were prepared from
leaves and stems of each plant. The extracts were chemically analyzed and subjected to egg
hatching test and larval artificial exsheathment assay with Haemonchus contortus. The tests
were accompanied by a control with polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) to confirm the role of
tannins. In the evaluation in vivo, 18 sheep free nematodes gastrointestinal were divided in
three groups (n=6). The animals received ad libitum for 13 consecutive days (Day -7 to Day
5) the following plants: group 1 - leaves of M. tenuiflora; group 2 - stems of M. tenuiflora;
group 3 (control) - hay of Cynodon dactylon. In Day 0 the sheep were experimentally infected
with 4,500 third-stage H. contortus each. In Day 5 all the sheep were slaughtered to count of
worm burden and histological analysis of the abomasum. The results of in vitro and in vivo
tests were submitted to ANOVA and Kruskal-Wallis test (p<0.05). All extracts showed high
levels of phenols and tannins. In egg hatching test, the leaves extract and the stems extract of
M. urundeuva demonstrated dose-dependente effect. The leaves extract of this plant was more
effective because it demonstrated EC50 (0.52 mg/mL) lower than the EC50 (2.44 mg/mL) of
the stems extract. In larval artificial exsheathment assay all extracts showed effectiveness of
100% at the concentration of 300 µg/mL. The pre-incubation with PVPP of the extracts
significantly changed the egg hatching and larval exsheathment of H. contortus when
compared to the non-treated extracts (p<0.05), confirming the role of tannins. The comsuption
of M. tenuiflora leaves and stems did not reduce the larval establishment of H. contortus in
sheep (p>0.05). The histological analysis indicated that the number of eosinophils and
lymphocytes was similar in the three groups (p>0,05). Despite promising in vitro results, the
leaves and stems of M. tenuiflora has no effect on larval establishment of H. contortus in
sheep.
Keywords: Condensed tannins. Haemonchus contortus. Small ruminants.
9
LISTA DE FIGURAS
Revisão de Literatura
Figura 1 - Estrutura química de tanino hidrolisável............................................................... 19
Figura 2 - Estrutura química de tanino condensado...............................................................
Figura 3 - Anadenanthera colubrina......................................................................................
Figura 4 - Leucaena leucocephala..........................................................................................
Figura 5 - Mimosa tenuiflora.................................................................................................
Figura 6 - Myracrodruon urundeuva......................................................................................
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29
30
31
31
Capítulo 2
Figure 1 - Effect of leaf extract of Myracrodruon urundeuva, with or without addition of
PVPP, on the process of artificial in vitro exsheathment of Haemonchus contortus third-
stage larvae induced by addition of a 2% hypochlorite
solution………………………………………………...........................................................
63
Figure 2 - Effect of stem extract of Myracrodruon urundeuva, with or without addition of
PVPP, on the process of artificial in vitro exsheathment of Haemonchus contortus third-
stage larvae induced by addition of a 2% hypochlorite solution……………………………
Capítulo 3
Figure 1 - Effect of leaf extract (a) and stem extract (b) of Anadenanthera colubrina, with
or without addition of PVPP, on the artificial in vitro exsheathment of Haemonchus
contortus third-stage larvae…………………………………………………………………
Figure 2 - Effect of leaf extract (a) and stem extract (b) of Leucaena leucocephala, with
63
77
10
or without addition of PVPP, on the artificial in vitro exsheathment of Haemonchus
contortus third-stage larvae…………………………………………………………………
Figure 3 - Effect of leaf extract (a) and stem extract (b) of Mimosa tenuiflora, with or
without addition of PVPP, on the artificial in vitro exsheathment of Haemonchus
contortus third-stage larvae…………………………………………………………………
Capítulo 4
Figure 1 - Mean levels of eosinophils and lymphocytes ± S.D. in the mucosa of sheep
abomasum after intake of Mimosa tenuiflora or Cynodon dactylon………………………..
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95
11
LISTA DE TABELAS
Revisão de Literatura
Tabela 1 - Resultados de experimentos in vitro para avaliação da atividade anti-helmíntica
de extratos de plantas ricas em taninos condensados.............................................................
22
Tabela 2 - Resultados de experimentos in vivo realizados em ovinos e caprinos para
avaliação da atividade anti-helmíntica de plantas ricas em taninos
condensados............................................................................................................................
23
Capítulo 1
Tabela 1 - Resultados de experimentos in vitro para avaliação da atividade anti-helmíntica
de extratos de plantas ricas em taninos condensados.............................................................
Tabela 2 - Resultados de experimentos in vivo realizados em ovinos e caprinos para
avaliação da atividade anti-helmíntica de plantas ricas em taninos
condensados............................................................................................................................
42
43
Capítulo 2
Table 1 - Mean efficacy (percentage ± S.E.) of leaf and stem extracts of Myracrodruon
urundeuva, with or without addition of PVPP, on Haemonchus contortus egg hatching…..
Capítulo 3
Table 1 - Total phenol and tannin contents of leaf and stem extracts of Anadenanthera
colubrina, Leucaena leucocephala and Mimosa tenuiflora………………………………...
Capítulo 4
Table 1 - Bromatological compositions of Mimosa tenuiflora and Cynodon dactylon……
62
76
93
12
Table 2 - Total phenol, total tannin and condensed tannin contents of Mimosa tenuiflora
and Cynodon dactylon………………………………………………….…………………...
Table 3 - Individual worm burdens, mean worm burdens ± S.D. and larval establishment
rates (%) ± S.D. of Haemonchus contortus in sheep after intake of Mimosa tenuiflora or
Cynodon dactylon…………………………………………………………………………...
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94
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADF
AL
BNB
CAPES
CE50/EC50
Acid detergent fiber
Alimentação larvar
Banco do Nordeste
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Concentração efetiva para inibir 50% da eclosão dos ovos/Effective
concentration to inhibit 50% of egg hatching
CNPq
CP
CP
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Carga parasitária
Crude protein
DBL
DVL
DM
DMSO
EC
EF
EMBRAPA
Desembainhamento larvar
Desenvolvimento larvar
Dry matter
Dimetilsulfóxido/Dimethylsulfoxide
Extrato dos caules
Extrato das folhas
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EL
EO
FeCl3
HPLC
Estabelecimento larvar
Eclosão de ovos
Ferric cloride
Cromatografia Líquida de Alta Performance
LE
L1
Leaf extract
Larvas de primeiro estágio /First-stage larvae
L3 Larvas de terceiro estágio/Third-stage larvae
LABODOPAR Laboratório de Doenças Parasitárias
ML
MS
NDF
Migração larvar
Matéria Seca
Neutral detergent fibers
Na2CO3
PEG
OPG/EPG
PBS
Sodium carbonate
Polietilenoglicol
Ovos por Grama de Fezes/Egg counts per gram of feces
Solução salina tamponada/ Phosphate buffer solution
PL Penetração larvar na mucosa abomasal
14
PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
PVPP
TEO/EHT
Polivinilpolipirrolidona/ Polyvinyl polypyrrolidone
Teste de Eclosão de Ovos/Egg hatching test
R2
SD
SE
SE
TC
TH
TP
TT
Coeficient of determination
Standart deviation
Stem extract
Standart error
Tanino condensado/ Condensed tannin
Tanino hidrolisável
Total phenol
Total tannins
UECE Universidade Estadual do Ceará
VL Viabilidade larvar
15
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 16
2 REVISÃO DE LITERATURA......................................................................................... 18
2.1 Taninos......................................................................................................................... 18
2.2 Efeitos dos taninos condensados sobre o parasitismo animal...................................... 20
2.3 Mecanismos de ação dos taninos condensados sobre nematóides gastrintestinais...... 24
2.4 Fatores que interferem na eficácia anti-helmíntica dos taninos condensados.............. 25
2.5 Plantas taniníferas do semiárido nordestino................................................................. 28
2.5.1 Anandenathera colubrina (Vell.) Brenan............................................................ 29
2.5.2 Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit................................................................ 29
2.5.3 Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir.......................................................................... 30
2.5.4 Myracrodruon urundeuva (Engl.) Fr. Allemão................................................... 31
3 JUSTIFICATIVA.............................................................................................................. 32
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA................................................................................................ 33
5 OBJETIVOS...................................................................................................................... 34
5.1 Objetivo geral.............................................................................................................. 34
5.2 Objetivos específicos................................................................................................... 34
6 CAPÍTULO 1
Plantas taniníferas e o controle de nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes..
35
7 CAPÍTULO 2
Effects of Myracrodruon urundeuva extracts on egg hatching and larval exsheathment
of Haemonchus contortus...................................................................................................
54
8 CAPÍTULO 3
Effect of six tropical tanniferous plant extracts on larval exsheathment of Haemonchus
contortus.............................................................................................................................
9 CAPÍTULO 4
Effects of Mimosa tenuiflora on larval establishment of Haemonchus contortus in
sheep……………………………………………………………………………………...
10 CONCLUSÕES................................................................................................................
11 PERSPECTIVAS.............................................................................................................
12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................
69
85
102
103
104
16
1 INTRODUÇÃO
A ovinocaprinocultura é uma importante atividade socioeconômica no Brasil,
principalmente no Nordeste, região na qual os pequenos ruminantes constituem uma das
principais fontes de proteína animal e renda para a população de baixo poder aquisitivo. Em
2010, o rebanho nacional era constituído por 17.380.581 ovinos e 9.312.784 caprinos e, nesse
mesmo período, o Nordeste concentrou aproximadamente 57% e 91% dos ovinos e caprinos,
respectivamente (IBGE, 2010). Embora a região Nordeste seja a maior produtora de pequenos
ruminantes do Brasil, o consumo é superior à produção, sendo necessária a importação de
carne e leite desses animais para suprir a demanda interna.
Um dos principais problemas limitantes da ovinocaprinocultura é o parasitismo
por nematóides gastrintestinais (VIEIRA, 2008). Além de diminuir a produtividade do
rebanho, esses parasitos causam elevada mortalidade, principalmente durante o período
chuvoso (PINHEIRO et al., 2000). Levantamentos epidemiológicos indicaram que a maioria
dos pequenos ruminantes do Nordeste brasileiro está parasitada por nematóides
gastrintestinais, sendo Haemonchus contortus a espécie mais prevalente (SOUZA et al.,
2012). Devido ao hábito hematófago desse parasito, animais com hemoncose apresentam
anemia, edema submandibular e ascite, além de letargia, fezes com coloração escura, queda
de lã e perda progressiva de peso. Nos casos hiperagudos, pode ocorrer morte súbita por
gastrite hemorrágica (URQUHART et al., 1998).
O controle dos nematóides gastrintestinais é realizado com anti-helmínticos
sintéticos. No entanto, o desenvolvimento de populações resistentes à maioria dos anti-
helmínticos disponíveis atualmente (MAX et al., 2009), o alto custo desses fármacos e a
possibilidade de contaminação dos produtos de origem animal e do ambiente com resíduos
químicos (ATHANASIADOU et al., 2008) tornaram imprescindível a busca por alternativas
de controle.
Dentre as alternativas que estão sendo pesquisadas para o controle do parasitismo
gastrintestinal, destaca-se o uso de plantas bioativas. Em alguns vegetais, os compostos ativos
já foram identificados, mas em outros ainda são desconhecidos. Na maioria dos casos, esses
compostos são os metabólitos secundários (ATHANASIADOU et al., 2008). Já que os
compostos polifenólicos, como os taninos, são os metabólitos secundários mais amplamente
encontrados nos vegetais, seus efeitos sobre a resiliência do hospedeiro e o parasitismo têm
sido os primeiros a serem estudados. Ademais, a virtual ausência de taninos hidrolisáveis
17
(TH) nas leguminosas forrageiras investigadas inicialmente direcionou a atenção para o papel
antiparasitário dos taninos condensados (TC) (HOSTE et al., 2006).
Plantas do semiárido nordestino utilizadas na alimentação de ovinos e caprinos,
como Anadenanthera colubrina, Leucaena leucocephala, Mimosa tenuiflora e Myracrodruon
urundeuva, possuem altas concentrações de TC (NOZELLA, 2001). Apesar disso, a atividade
antiparasitária dessas plantas ainda não foi avaliada cientificamente. Portanto, o objetivo
desse estudo foi avaliar in vitro e in vivo a atividade anti-helmíntica A. colubrina, L.
leucocephala, M. tenuiflora e M. urundeuva sobre nematóides gastrintestinais de pequenos
ruminantes.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Taninos
O metabolismo vegetal é dividido em primário e secundário. O metabolismo
primário está associado com a formação, manutenção e reprodução das plantas. Esse é o caso
das proteínas, carboidratos e lipídios. Os metabólitos secundários são derivados
biologicamente dos metabólitos primários e desempenham importante papel na adaptação das
plantas ao ambiente, pois estão envolvidos na defesa contra micro-organismos, insetos e
herbívoros. Esses compostos também estão envolvidos na proteção contra raios ultravioleta,
atração de polinizadores e animais dispersores de sementes, bem como em alelopatias.
Compostos polifenólicos, terpenos, esteroides e alcaloides são exemplos desses metabólitos
(BOURGAUD et al., 2001).
Os metabólitos secundários são utilizados tradicionalmente na medicina devido à
diversidade de suas atividades biológicas (BOURGAUD et al., 2001). Entretanto, são
moléculas instáveis cuja atividade depende da estrutura, além das propriedades químicas e
físicas. As variações ambientais e sazonais também podem alterar a síntese destes compostos
e afetar suas propriedades (ATHANASIADOU et al., 2007). Alguns metabólitos secundários,
como os compostos polifenólicos, possuem características potencialmente benéficas na
prevenção de doenças e proteção da estabilidade do genoma, agindo como antioxidante,
antimutagênica, anticarcinogênica, anti-inflamatória e antimicrobiana (SINGH et al., 2003).
Taninos são os compostos polifenólicos mais encontrados nas plantas (SINGH et
al., 2003). A quantidade sintetizada varia de acordo com a planta e as condições ambientais,
apresentando grande variabilidade (OTERO; HIDALGO, 2004). Em geral, alta temperatura e
luminosidade, escassez de água e solos pobres aumentam a concentração dessas moléculas.
Durante o crescimento, as plantas produzem muita biomassa e poucas fontes estão disponíveis
para a síntese de compostos fenólicos. Entretanto, quando o crescimento é reduzido, o excesso
de carbono fica disponível para a síntese de taninos. De acordo com a estrutura química, os
taninos são classificados em hidrolisáveis e condensados (FRUTOS et al., 2004). Os TH estão
presentes em folhas de árvores e arbustos lenhosos de regiões tropicais. Quimicamente, são
polímeros constituídos por um carboidrato central, como a D-glucose, com os grupos
hidroxila esterificados pelo ácido gálico ou elágico (Figura 1) (MIN et al., 2003). Nos
ruminantes, os TH podem ser degradados pelos micro-organismos ruminais e originar
compostos potencialmente tóxicos. Provavelmente, a toxicidade é causada pela absorção dos
19
produtos da degradação e alta concentração de fenóis no sangue, que é maior do que a
capacidade de detoxificação do fígado (MAKKAR et al., 2007).
OH
OH
OHO
OO
HO
OH
OH
O O
HO OH
OH
O
O OH
OH
OH
O
O
HO
HO
OH
O
O
Figura 1 - Estrutura química de tanino hidrolisável.
Os TC ou proantocianidinas são os taninos mais comumente encontrados em
leguminosas forrageiras, árvores e arbustos (MIN et al., 2003). Estruturalmente, são
polímeros formados por unidades de flavan-3-ol (catequina) ou flavan-3,4-diol (epicatequina)
unidas por ligações carbono-carbono, não suscetíveis à degradação enzimática anaeróbica
(Figura 2). Portanto, são relativamente estáveis no trato digestório dos ruminantes e raramente
tóxicos. Procianidinas e prodelfinidinas são as duas principais classes de TC. Procianidinas
são polímeros de catequinas e epicatequinas que possuem dois grupos hidroxila anexados ao
anel “B” do flavanol. Prodelfinidinas são polímeros de galocatequina e epigalocatequina, cada
um com três grupos hidroxila no anel “B”. O comprimento da cadeia dos TC pode variar
desde dímeros até polímeros com mais de 20 unidades de flavanol e normalmente existem
diversas estruturas de flavan-3-ol dentro de cada polímero. As principais variações estruturais
entre os TC incluem: número de grupos hidroxila nos anéis “A” e “B” das unidades flavanol;
posições dos grupos hidroxila; estereoquímica dos carbonos 2, 3 e 4 do anel “C”; posição e
tipo de ligações entre as unidades flavanol e número de unidades flavanol (WAGHORN,
2008). As diferenças estruturais podem produzir uma infinidade de estruturas químicas que
por sua vez afetam as propriedades físicas e biológicas dessas moléculas (MIN; HART,
2003).
20
OHO
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
19
8
7
6
510
4
3
21'
6'
5'
4'
3'
2'
(8a)
(4a)
A C
B
19
8
7
6
510
4
3
21'
6'
5'
4'
3'
2'
(8a)
(4a)
A C
B
19
8
7
6
510
4
3
21'
6'
5'
4'
3'
2'
(8a)
(4a)
A C
B
Figura 2 - Estrutura química de tanino condensado.
Os taninos possuem capacidade de complexação com outras moléculas devido à
presença de grupamentos hidroxila na estrutura química e, por esse motivo, são capazes de
exercer efeitos benéficos ou adversos, dependendo da sua concentração e natureza, espécie e
estado fisiológico do animal e composição da dieta. Estes compostos se complexam
primariamente com proteínas e, em menor extensão, com íons metálicos, aminoácidos e
polissacarídeos (MAKKAR et al., 2007). A formação do complexo tanino-proteína é
específica e depende do grau de afinidade química entre estes compostos. Tipo de polímero,
proporção de prodelfinidinas em relação às procianidinas, tipo de grupamentos terminais e
estrutura do potencial local de ligação devem ser considerados nos TC. Com relação às
proteínas, os fatores são: peso molecular, estrutura e conteúdo de prolina e de outros
aminoácidos hidrofóbicos (FRUTOS et al., 2004). A formação do complexo TC-proteína
ocorre principalmente por pontes de hidrogênio e ligações hidrofóbicas e é dependente do pH.
A ligação ocorre em pH neutro e a dissociação em extremos de pH (MIN et al., 2003).
2.2 Efeitos dos taninos condensados sobre o parasitismo animal
Há séculos, principalmente com base no conhecimento empírico popular, plantas
e extratos ricos em metabólitos secundários têm sido utilizados no controle do parasitismo em
algumas regiões do mundo. Recentemente, evidências científicas da atividade antiparasitária
de plantas ricas em TC têm sido geradas por um número crescente de estudos realizados para
verificar, validar e quantificar cientificamente seus efeitos. Duas abordagens têm sido
empregadas para essa finalidade: o fornecimento de plantas a animais natural ou
21
experimentalmente infectados e a preparação de extratos dessas plantas para avaliação in vitro
e in vivo (ATHANASIADOU et al., 2007).
A atividade anti-helmíntica in vitro dos TC é avaliada sobre diferentes estágios
dos nematóides, como ovos, larvas de primeiro estágio (L1), larvas de terceiro estágio (L3) e
adultos. Os efeitos registrados foram redução de eclosão, desenvolvimento, motilidade e
desembainhamento larvar e motilidade de adultos (HOSTE et al., 2006). As principais
vantagens dos testes in vitro são baixo custo, rapidez dos resultados permitindo a triagem de
uma grande quantidade de plantas e possibilidade de avaliar substâncias isoladas sem
interferência de outros compostos (GITHIORI et al., 2006). Normalmente, esses ensaios são
realizados com nematóides que parasitam ruminantes, porque resultados obtidos com
nematóides de vida livre, como Caenorhabditis elegans, nem sempre podem ser extrapolados
para nematóides parasitos, devido a diferenças biológicas entre as espécies (GEARY &
THOMPSON, 2001). Entretanto, estes testes avaliam o efeito do TC sobre os nematóides sem
a interferência da fisiologia animal. Na tabela 1 estão sumarizados resultados de experimentos
in vitro para avaliação da atividade anti-helmíntica de extratos de plantas ricas em TC.
Nos estudos in vivo de avaliação de atividade anti-helmíntica, os TC causam
reduções na carga parasitária, excreção de ovos nas fezes e fecundidade dos parasitos. O
efeito mais comumente observado é a diminuição do número de ovos por grama de fezes
(OPG), que geralmente está associada com redução da fecundidade dos nematóides (HOSTE
et al., 2006). O mecanismo relacionado com a baixa fecundidade permanece obscuro, mas a
possível ação dos taninos sobre o trato genital feminino dos nematóides deve ser explorada
(PAOLINI et al., 2003a). A redução do OPG pode diminuir a contaminação da pastagem e a
dinâmica da infecção no animal (HECKENDORN et al., 2007). Os TC também podem atuar
sobre a eclosão e o desenvolvimento das larvas dos nematóides, pois, como não são
absorvidos pelo trato gastrintestinal dos pequenos ruminantes, ocorre sua eliminação nas fezes
e redução da contaminação do pasto (MUPEYO et al., 2011).
Na maioria dos testes in vivo, o efeito dos TC é determinado a partir da
comparação da eficácia de plantas taniníferas com plantas que não contêm esses compostos
em hospedeiros natural ou experimentalmente infectados com nematóides gastrintestinais. Os
efeitos desses metabólitos também podem ser avaliados em animais tratados com
polietilenoglicol (PEG), um polímero sintético não nutritivo que se complexa com os TC,
inativando-os (MIN; HART, 2003). Na tabela 2 estão sumarizados resultados de
experimentos in vivo realizados em ovinos e caprinos para avaliação da atividade anti-
helmíntica de plantas ricas em TC.
22
Tabela 1 - Resultados de experimentos in vitro para avaliação da atividade anti-helmíntica de
extratos de plantas ricas em taninos condensados.
Família
(Subfamília)
Planta Efeito
(Redução)
Fonte
Anacardiaceae Schinopsis spp. ML ATHANASIADOU et al.,
2001
Acacia mearnsii AL MINHO et al., 2008a
Fabaceae
(Mimosaceae)
Leucaena leucocephala
ML e DBL
ALONSO-DÍAZ et al., 2008
Lysiloma latisiliquum ML e DBL ALONSO-DÍAZ et al., 2008
Hedysarum coronarium ML MOLAN et al., 2000
EO e DVL MOLAN et al., 2002
Lotus corniculatus ML MOLAN et al., 2000
EO e DVL MOLAN et al., 2002
Fabaceae
(Papilionaceae)
Lotus pedunculatus
ML
MOLAN et al., 2000
EO e DVL MOLAN et al., 2002
Onobrychis viciifolia ML MOLAN et al., 2000
EO e DVL MOLAN et al., 2002
ML BARRAU et al., 2005
DBL BRUNET et al., 2007
PL BRUNET et al., 2008b
AL. – Alimentação larvar; EO. – Eclosão de ovos; VL. – Viabilidade larvar; DVL. – Desenvolvimento larvar;
DBL. – Desembainhamento larvar; ML. – Migração larvar; PL. – Penetração larvar na mucosa abomasal.
23
Tabela 2 - Resultados de experimentos in vivo realizados em ovinos e caprinos para avaliação
da atividade anti-helmíntica de plantas ricas em taninos condensados.
Família
(Subfamília)
Planta Efeito
(Redução)
Fonte
Anacardiaceae Schinopsis spp. OPG e CP ATHANASIADOU et al., 2001
CP PAOLINI et al., 2003a
OPG PAOLINI et al., 2003b
Acacia cyanophylla OPG AKKARI et al., 2008
Acacia mearnsii OPG e CP MINHO et al., 2008b; MAX et
al., 2009
Fabaceae
(Mimosaceae)
Lysiloma latisiliquum
EL
BRUNET et al., 2008a
OPG MARTÍNEZ-ORTÍZ-DE-
MONTELLANO et al., 2010
Hedysarum coronarium OPG e CP NIEZEN et al., 2002
Lespedeza cuneata OPG e CP SHAIK et al., 2006; LANGE et
al., 2006; TERRILL et al., 2007
EL e OPG JOSHI et al., 2011
Fabaceae
(Papilionaceae)
Lotus corniculatus
CP
RAMÍREZ-RESTREPO et al.,
2005
OPG HECKENDORN et al., 2007
Onobrychis viciifolia DBL BRUNET et al., 2007
OPG HECKENDORN et al., 2007
OPG RÍOS-DE ÁLVAREZ et al.,
2008
OPG. – Ovos por grama de fezes; CP. – Carga parasitária; EL. Estabelecimento larvar; DBL. –
Desembainhamento larvar.
24
2.3 Mecanismos de ação dos taninos condensados sobre nematóides gastrintestinais
Para esclarecer os efeitos dos TC sobre os nematóides gastrintestinais de
pequenos ruminantes, foram desenvolvidas duas hipóteses baseadas na sua capacidade de
complexação com proteínas. A primeira é o efeito direto sobre larvas e adultos. De acordo
com essa hipótese, os TC se ligam com a cutícula dos nematóides, que é rica em prolina e
hidroxiprolina, e alteram suas propriedades físicas e químicas (ATHANASIADOU et al.,
2000b; HOSTE et al., 2006). Contudo, a atividade de extratos de plantas taniníferas sobre
adultos foi pouco avaliada in vitro (KOTZE et al., 2009). Ao contrário, diversos experimentos
demonstraram que a motilidade larvar foi adversamente modificada após contato com extratos
ricos em TC. Nesses estudos, os efeitos inibitórios sobre as larvas desapareceram após adição
de PEG aos extratos (MOLAN et al., 2000; BARRAU et al., 2005; ALONSO-DÍAS et al.,
2008; KOTZE et al., 2009). O efeito anti-helmíntico in vitro dos taninos apoia a teoria da ação
direta desses metabólitos. Entretanto, o mecanismo de ação sobre os diferentes estágios dos
nematóides permanece obscuro (BRUNET; HOSTE, 2006).
O consumo de plantas taniníferas por ovinos e caprinos foi associado com a
modulação da biologia de populações de parasitos adultos, pois afetou a excreção de ovos
(LANGE et al., 2006; HECKENDORN et al., 2007; MAX et al., 2009; JOSHI et al., 2011)
e/ou a carga parasitária (SHAIK et al., 2006; MINHO et al., 2008b; MAX et al., 2009). Essas
consequências provavelmente estão relacionadas com o efeito dos TC ao alterar a integridade
do parasito reduzindo sua fecundidade ou causando sua eliminação, o que diminui a
contaminação da pastagem. Experimentos in vivo indicaram que o consumo de plantas
taniníferas também diminuiu significativamente o estabelecimento de L3 (BRUNET et al.,
2007; BRUNET et al., 2008a; JOSHI et al., 2011). Alguns estudos in vitro confirmaram que
extratos dessas plantas reduzem o estabelecimento larvar ao afetar o desembainhamento ou a
associação dessas larvas com a mucosa (BRUNET; HOSTE 2006; BRUNET et al., 2007;
BRUNET et al., 2008b). O estabelecimento larvar pode ser prejudicado por uma falha no
desembainhamento causada pela presença de TC no trato digestório do hospedeiro (BRUNET
et al., 2008b).
A segunda hipótese proposta para explicar a atividade anti-helmíntica dos TC é o
efeito indireto ao aumentar a resposta imune de pequenos ruminantes contra parasitos. De
acordo com essa teoria, os TC protegem as proteínas da degradação ruminal, aumentando sua
disponibilidade no intestino delgado. A presença de surfactantes, como os ácidos biliares, no
intestino delgado pode ser muito importante para a dissociação do complexo TC-proteína
25
(ATHANASIADOU et al., 2000b; ATHANASIADOU et al., 2001; HOSTE et al., 2006).
Como uma maior disponibilidade protéica, aumenta a homeostase do hospedeiro e imunidade
contra parasitos, a melhora na utilização de nutrientes em hospedeiros que recebem taninos
pode contribuir para o aumento na resiliência de animais infectados com nematóides
gastrintestinais (WAGHORN; McNABB, 2003). Contudo, poucos estudos avaliaram o efeito
indireto dos taninos e seus resultados permanecem largamente inconclusivos (HOSTE et al.,
2006; BRUNET et al., 2008a). Ríos-de Álvarez et al. (2008) encontraram um maior número
de células inflamatórias na mucosa intestinal de ovinos após o fornecimento de uma planta
taninífera. Contudo, não foi registrada alteração significativa no número de células
inflamatórias da mucosa abomasal e intestinal de caprinos após o fornecimento de outra
planta rica em TC. Neste último experimento, tal fato foi atribuído ao curto período
experimental, que pode não ter sido suficiente para a expressão de resposta imune (BRUNET
et al., 2008a).
2.4 Fatores que interferem na eficácia anti-helmíntica dos taninos condensados
De acordo com a literatura, alguns fatores relacionados com as plantas, os
parasitos e os hospedeiros podem influenciar na atividade anti-helmíntica dos TC (MIN;
HART, 2003; HOSTE et al., 2006; ATHANASIADOU et al., 2007; RÍOS-DE ÁLVAREZ et
al., 2008). A concentração e estrutura dos TC parecem ser os dois principais fatores
moduladores da eficácia desses metabólitos contra nematóides. Uma revisão dos
experimentos realizados em ovinos e caprinos com plantas taniníferas sugeriu que deve existir
no mínimo 30 a 40g de TC/kg de matéria seca (MS) (3 a 4% de MS) para ser observada
atividade antiparasitária (HOSTE et al., 2006). Além desse efeito benéfico, tais concentrações
de TC também são importantes para aumentar a produtividade animal ao corrigir problemas
associados com a indiscriminada proteólise que ocorre nos ruminantes (OTERO; HIDALGO,
2004). No rúmem, que possui pH neutro, o complexo TC-proteína permanece estável,
contudo, posteriormente, ocorre sua dissociação, devido ao baixo pH do abomaso e alto pH do
intestino delgado. Dessa forma, as proteínas escapam da degradação ruminal e ficam
disponíveis para a digestão no abomaso e intestino delgado, aumentando a disponibilidade de
aminoácidos essenciais (MIN; HART, 2003). Além de reduzir a degradação ruminal de
proteínas, os TC aumentam a eficiência da síntese protéica microbiana devido à inibição ou
estimulação de micro-organismos. Os TC também reduzem a excreção de nitrogênio e
metano, diminuindo a contaminação ambiental (MAKKAR et al., 2007).
26
Entretanto, altas concentrações de TC nas plantas (6-10% da MS) podem causar
efeitos adversos, pois ocorre formação do complexo TC-proteína salivar durante a mastigação
que causa uma sensação de adstringência, aumenta a salivação, diminui a palatabilidade e o
consumo de alimentos (OTERO; HIDALGO, 2004). Esses compostos, em altas
concentrações, também diminuem a digestibilidade de matéria seca, matéria orgânica,
proteínas, carboidratos e fibras, afetando negativamente a produtividade (MIN et al., 2003).
Além do conteúdo de TC na dieta, suas características químicas e estruturais
também podem interferir na atividade antiparasitária (BRUNET; HOSTE et al., 2006; HOSTE
et al., 2006; BRUNET et al., 2008b). A proporção relativa dos monômeros de TC é um fator
que pode influenciar na eficácia sobre nematóides. Os monômeros das prodelfinidinas e
derivados do galoil apresentaram maior eficácia do que os monômeros das procianidinas
(MOLAN et al., 2000; BRUNET; HOSTE, 2006; BRUNET et al., 2008b). Uma possível
explicação para tal diferença é a habilidade dos TC de formar complexos com proteínas.
Devido à estrutura química, as prodelfinidinas podem formar mais pontes de hidrogênio com
essas macromoléculas (BRUNET et al., 2008b).
Outro aspecto considerado na modulação da eficácia anti-helmíntica dos TC é a
espécie de nematóide (HOSTE et al., 2006). Isso pode estar relacionado com a localização do
parasito ou biodisponibilidade dos taninos no trato gastrintestinal do hospedeiro
(ATHANASIADOU et al., 2007; HECKENDORN et al., 2007). Athanasiadou et al. (2000a),
Athanasiadou et al. (2000b) e Paolini et al. (2003a) demonstraram efeito sobre nematóides do
intestino. Espera-se que, devido às condições fisiológicas, os taninos estejam complexados
com as proteínas no abomaso e indisponíveis para exercer atividade anti-helmíntica sobre
espécies abomasais. Acredita-se que esses complexos se dissociem no intestino delgado e,
portanto, sejam mais efetivos contra parasitos intestinais (ATHANASIADOU et al., 2001).
Contudo, quando uma dieta é rica em proteína, os TC podem permanecer unidos a essas
macromoléculas no intestino delgado, apresentando pouca eficácia anti-helmíntica, pois
existirá pequena disponibilidade de taninos (ATHANASIADOU et al., 2007). Em outros
experimentos, verificou-se que os TC possuem eficácia sobre nematóides do abomaso
(PAOLINI et al., 2003b; HECKENDORN et al., 2007; MARTÍNEZ-ORTÍZ-
DEMONTELLANO et al., 2010). Shaik et al. (2006) constataram ação sobre espécies
abomasais e intestinais. A partir desses resultados, supõe-se que a eficácia dos taninos deve
estar mais relacionada com sua estrutura química e concentração do que com a espécie de
nematóide. Heckendorn et al. (2007) relataram ainda que a eficácia dos TC pode estar
relacionada com o sexo do parasito, pois foi registrada maior redução sobre a carga de fêmeas
27
do que de machos. Entretanto, como o mecanismo de ação dessas moléculas é desconhecido,
é difícil explicar essa diferença.
Outro aspecto que pode influenciar na eficácia anti-helmíntica dos TC é o estágio
de desenvolvimento do parasito (HOSTE et al., 2006; BRUNET et al., 2008a). Os taninos
afetam o estabelecimento larvar e, consequentemente, reduzem a carga parasitária quando
atuam sobre L3. Entretanto, quando o hospedeiro já está infectado com adultos, ocorre apenas
alteração da função reprodutiva dos nematóides, reduzindo, portanto, o OPG e a
contaminação da pastagem (PAOLINI et al., 2003a; PAOLINI et al., 2003b; MARTÍNEZ-
ORTÍZ-DEMONTELLANO et al., 2010; JOSHI et al., 2011). Contudo, Lange et al. (2006)
demonstraram que os TC foram mais eficazes sobre nematóides adultos do que sobre o
estabelecimento das larvas e atribuíram esses resultados à espécie de nematóide, estrutura dos
taninos e espécie de hospedeiro.
A eficácia dos TC também pode estar relacionada com as condições do trato
gastrintestinal do hospedeiro (HOSTE et al., 2006). Max et al. (2009) avaliaram a eficácia de
um extrato rico em TC em ovinos e caprinos e observaram redução do OPG e da carga
parasitária apenas nos ovinos. De acordo com esses autores, ao contrário dos ovinos, os
caprinos possuem adaptações fisiológicas no trato digestivo que inativam os taninos antes que
esses compostos possam atuar sobre os nematóides. A eficácia dos taninos em ovinos também
foi constatada em outros experimentos (ATHANASIADOU et al., 2001; HECKENDORN et
al., 2007; AKKARI et al., 2008; MINHO et al., 2008b). Entretanto, diversos estudos
constataram a eficácia desses metabólitos em caprinos (LANGE et al., 2006; SHAIK et al.,
2006; TERRIL et al., 2007; BRUNET et al., 2008a). Por esse motivo, mais estudos devem ser
realizados para comparar a eficácia de um mesmo tipo de tanino nessas duas espécies animais.
A presença de taninos nas plantas pode influenciar positivamente a sanidade de
pequenos ruminantes. Entretanto, seus efeitos dependem do tipo e da concentração desses
metabólitos. Dessa forma, não se tem uma indicação precisa de como utilizá-los no controle
de nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes. Alguns aspectos, como o mecanismo
de ação dos TC sobre nematóides gastrintestinais e os fatores relacionados com a
variabilidade de seus efeitos, ainda necessitam de mais investigação para que as plantas
taniníferas sejam consideradas alternativas efetivas de controle do parasitismo gastrintestinal
de pequenos ruminantes e, consequentemente, aumentem a produtividade da
ovinocaprinocultura.
28
2.5 Plantas taniníferas do semiárido nordestino
A vegetação nativa do semiárido nordestino é denominada caatinga. Esse bioma
cobre uma vasta área do Nordeste do Brasil ocupando aproximadamente 750.000 km2, uma
área que representa cerca de 10% do território nacional e cerca de 60% da região Nordeste,
incluindo parte dos estados do Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco,
Alagoas, Sergipe, Bahia e Minas Gerais (SILVA et al., 2012). A região semiárida é
caracterizada por um clima severo com seca acentuada. A média anual de precipitação da
região é de 800 mm, contudo as chuvas são mal distribuídas e estão concentradas em uma
curta estação chuvosa (MONTEIRO et al., 2006). Esse bioma é dominado por um dos poucos
tipos de vegetação cuja distribuição é totalmente restrita ao Brasil, mas há muitas décadas tem
sofrido forte influência humana, resultando em extensas áreas de pastagem ou terras agrícolas
e na colheita intensiva de produtos de madeira, especialmente como fonte de energia. Embora
a vegetação tenha sido muito devastada, muitas espécies de plantas da caatinga são
amplamente conhecidas e utilizadas na medicina popular e produção comercial de produtos
fitoterápicos (SILVA et al, 2012).
A caatinga é composta por plantas xerófilas, lenhosas, decíduas, em geral
espinhosas, com um padrão de arbóreo a arbustivo ou herbáceo estacional. Por sua
abundância e resistência à seca, essa vegetação tem sido utilizada para alimentação animal,
constituindo muitas vezes a única fonte de proteína e energia para os animais da região
(NOZELLA, 2006). As espécies arbóreas e arbustivas constituem-se nos mais importantes
recursos forrageiros, pois, ao contrário da maioria das espécies herbáceas, utilizam água e
nutrientes das camadas mais profundas da terra em função do desenvolvimento do seu sistema
radicular, além de outros mecanismos reguladores que possibilitam o armazenamento e a
utilização das reservas, garantindo a sobrevivência dessas espécies em condições adversas
(VIEIRA et al., 2002). As árvores e os arbustos compõem até 90% da dieta dos ruminantes,
principalmente durante os períodos críticos de seca. Apesar do seu potencial como fonte de
alimentos para ruminantes, a maioria das espécies arbóreas contém altos teores de taninos
(NOZELLA, 2006). Nozella (2001) avaliou a concentração de TC de plantas taniníferas do
semiárido nordestino utilizadas na alimentação de pequenos ruminantes, como A. colubrina,
L. leucocephala, M. tenuiflora e M. urundeuva, e constatou que possuem 9,00; 65,40; 69,20 e
43,50 g de TC/kg de MS, respectivamente.
29
2.5.1 Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan
A. colubrina, conhecida no Nordeste do Brasil como angico, é uma espécie
pertencente à família Fabaceae, subfamília Mimosaceae, que está amplamente distribuída no
semiárido nordestino (MAIA-SILVA et al., 2012). É uma árvore perenifólia a semicaducifólia
com 10 a 20 m de altura, podendo atingir até 25 m na idade adulta. Suas folhas são compostas
bipinadas, paripinadas; a raque apresenta 15 a 20 cm de comprimento, com 15 a 35 pares de
pinas multifoliados (CARVALHO, 2002). As inflorescências são formadas por flores
pequenas, brancas e com odor agradável. O tronco é acizentado, rugoso e com projeções
cônicas (MAIA-SILVA et al., 2012). Essa espécie tem sido utilizada na indústria para curtir
couro, bem como na medicina tradicional para tratar problemas respiratórios e inflamações
(MAIA, 2004). De acordo com Vieira (2002), as folhas fenadas ou secas do angico
constituem uma boa forragem para ruminantes.
Figura 3 - Anadenanthera colubrina (Fonte: http://www.cnip.org.br)
2.5.2 Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit
L. leucocephala, conhecida popularmente como leucena, pertencente à família
Fabaceae, subfamília Mimosaceae, é uma planta exótica que está adaptada aos trópicos e
subtrópicos e que suporta grandes diferenças de regimes de precipitação, luminosidade e
salinidade do solo. Essa espécie leguminosa, que está largamente difundida na caatinga, pode
atingir de 10 a 12 metros de altura (VIEIRA et al., 2002). Suas folhas são bipinadas, com 15 a
20 cm de comprimento, apresentando quatro a dez pares de pinas, cada uma com cinco a vinte
pares de folíolos em cada pina. Cada folíolo apresenta 7 a 15 mm de comprimento e 3 a 4 mm
de largura. A inflorescência é globosa e solitária sobre um pedúnculo com mais de 5 cm de
comprimento, apresentando numerosas flores brancas (OLIVEIRA, 2008). As folhas e os
30
galhos finos da leucena podem ser utilizados como forragem por pequenos ruminantes
podendo contribuir significativamente para a dieta desses animais (DRUMOND; RIBASK,
2010). Essa espécie é uma das forrageiras mais promissoras para o semiárido por sua
adaptação às condições edafoclimáticas da região, boa aceitação pelos animais, elevado teor
de proteína bruta e por ser alternativa na substituição parcial de concentrados protéicos em
dietas para ovinos em confinamento (BARROS et al., 2003). De acordo com Gamal-Eldeen et
al. (2007), L. leucocephala apresenta atividade anti-inflamatória.
Figura 4 - Leucaena leucocephala (Fonte: http://www.cnip.org.br)
2.5.3 Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir
M. tenuiflora, pertencente à família Fabaceae, subfamília Mimosaceae, conhecida
popularmente como jurema preta, é uma leguminosa que está amplamente distribuída na
região semiárida do Nordeste brasileiro (MAIA-SILVA et al., 2012). Trata-se de uma espécie
de porte pequeno, alcançando até 4 m de altura. As folhas são bipinadas com folíolos
reduzidos e as vagens são pequenas, articuladas e espiraladas (VIEIRA et al., 2002). Suas
inflorescências são reunidas em espigas, formadas por flores brancas, pequenas e suavemente
perfumadas. Possui tronco com casca de cor castanho escuro e ramos de cor castanha
avemelhada (MAIA-SILVA et al., 2012). Essa espécie pode crescer em matagais densos e
suas folhas, galhos finos e frutos são consumidos por ruminantes, contribuindo de forma
significativa para a dieta animal, apesar de sua baixa digestibilidade (BAKKE et al., 2007).
De acordo com Rivera-Arce et al. (2007), a jurema preta possui efeito antimicrobiano,
imunomodulador e cicatrizante.
31
Figura 5 - Mimosa tenuiflora (Fonte: http://www.cnip.org.br)
2.5.4 Myracrodruon urundeuva (Engl.) Fr. Allemão
M. urundeuva, pertencente à família Anacardiaceae, conhecida popularmente
como aroeira, é uma planta muito popular no Nordeste do Brasil. É uma árvore caducifólia
que pode atingir 5 a 20 m de altura. Suas folhas são compostas, imparipinadas, de inserção
alterna, com 5 a 7 pares de folíolos opostos, ovados, com até 5 cm de comprimento e 3 cm de
largura (CARVALHO et al., 2003). Suas inflorescências formam cachos com flores amarelas,
pequenas e perfumadas (MAIA-SILVA et al., 2012). No Nordeste, as folhas da aroeira são
utilizadas como forragem, principalmente na época seca (CARVALHO et al., 2003). Além
disso, é uma árvore muito conhecida devido às suas propriedades farmacológicas, sendo
considerada uma das principais plantas medicinais da região (MAIA-SILVA et al., 2012).
Localmente a aroeira é utilizada como um agente anti-inflamatório e no tratamento de
doenças do sistema geniturinário, bem como em processos de cicatrização (MONTEIRO et
al., 2006).
Figura 6 - Myracrodruon urundeuva (Fonte: http://www.cnip.org.br)
32
3 JUSTIFICATIVA
A utilização de plantas taniníferas do semiárido nordestino como uma alternativa
de controle das nematodeoses gastrintestinais de pequenos ruminantes pode aumentar a
produtividade da ovinocaprinocultura e atender a demanda do mercado consumidor por
produtos orgânicos.
33
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
Os TC contidos nas folhas e nos caules de A. colubrina, L. leucocephala, M.
tenuiflora e M. urundeuva possuem atividade anti-helmíntica sobre nematóides
gastrintestinais de pequenos ruminantes.
34
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo geral
Buscar uma alternativa para auxiliar no controle do parasitismo gastrintestinal de
pequenos ruminantes a partir de plantas taniníferas do semiárido nordestino.
5.2 Objetivos específicos
Caracterizar quimicamente as folhas e os caules de A. colubrina, L. leucocephala,
M. tenuiflora e M. urundeuva;
Avaliar in vitro o efeito dos extratos das folhas e dos caules de A. colubrina, L.
leucocephala, M. tenuiflora e M. urundeuva sobre a eclosão de ovos e o
desembainhamento larvar de H. contortus e confirmar o papel dos taninos
contidos nesses extratos após a adição de PVPP, um inibidor específico de
taninos;
Determinar in vivo o efeito direto e indireto do consumo das folhas e dos caules
de M. tenuiflora sobre o estabelecimento larvar de H. contortus em ovinos
infectados experimentalmente.
35
6 CAPÍTULO 1
Plantas taniníferas e o controle de nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes
(Tanniferous plants and control of gastrointestinal nematodes of small ruminants)
Periódico: Ciência Rural (Qualis B1), v.41, p.1967-1974, nov, 2011.
36
Resumo
Os nematóides gastrintestinais são responsáveis por acentuada redução na produtividade de
ovinos e caprinos. Na tentativa de controlar esses parasitos, são utilizados diversos anti-
helmínticos sintéticos, mas o desenvolvimento da resistência tem tornado esse controle pouco
eficaz. Na busca por alternativas de controle dos nematóides gastrintestinais, a utilização de
plantas taniníferas tem despertado interesse de pesquisadores em várias regiões do mundo.
Essa revisão visa a abordar os diversos aspectos relacionados ao fornecimento dessas plantas
a ovinos e caprinos, bem como os principais resultados obtidos em pesquisas utilizando
taninos para o controle de nematóides de pequenos ruminantes.
Palavras-chave: Ovinos. Caprinos. Atividade anti-helmíntica. Taninos.
37
Plantas taniníferas e o controle de nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes
(Tanniferous plants and control of gastrointestinal nematodes of small ruminants)
Lorena Mayana Beserra de Oliveira, Claudia Maria Leal Bevilaqua, Selene Maia de Morais,
Ana Lourdes Fernandes Camurça-Vasconcelos, Iara Tersia Freitas Macedo
- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA -
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará,
Fortaleza, Ceará, Brasil
* Autor para correspondência:
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias,
Universidade Estadual do Ceará,
Av Dede Brasil 1700, Campus do Itaperi,
60740–093, Fortaleza, Ceará, Brazil
Tel: +55 85 3101 9853; fax: +55 85 3101 9840
E-mail: [email protected]
38
Resumo
Os nematóides gastrintestinais são responsáveis por acentuada redução na produtividade de
ovinos e caprinos. Na tentativa de controlar esses parasitos, são utilizados diversos anti-
helmínticos sintéticos, mas o desenvolvimento da resistência tem tornado esse controle pouco
eficaz. Na busca por alternativas de controle dos nematóides gastrintestinais, a utilização de
plantas taniníferas tem despertado interesse de pesquisadores em várias regiões do mundo.
Essa revisão visa a abordar os diversos aspectos relacionados ao fornecimento dessas plantas
a ovinos e caprinos, bem como os principais resultados obtidos em pesquisas utilizando
taninos para o controle de nematóides de pequenos ruminantes.
Palavras-chave: Ovinos. Caprinos. Atividade anti-helmíntica. Taninos.
Abstract
The gastrointestinal nematodes are responsible for a marked reduction in the productivity of
sheep and goats. In an attempt to control these parasites, different synthetic anthelmintics are
used, but development of resistance has become this control little effective. In the search for
alternatives to control these nematodes, the use of tanniferous plants has attracted attention
from researchers in different regions of the world. This review aims to address the various
aspects related to the administration of these plants to sheep and goats, and the main results
obtained from studies using tannins to control nematodes in small ruminants.
Keywords: Sheep. Goats. Anthelmintic activity. Tannins.
Introdução
O parasitismo por nematóides gastrintestinais é o principal entrave da
ovinocaprinocultura, devido ao impacto que causa na produtividade e aos custos das medidas
de controle (KNOX & STEEL, 1996). Esse problema é acentuado nos países em
desenvolvimento, pois as fontes nutricionais são frequentemente insuficientes para os
pequenos ruminantes e, como consequência, a imunidade natural é comprometida, resultando
em baixa produtividade e alta mortalidade (KNOX et al., 2006).
39
O controle dos nematóides gastrintestinais é realizado com anti-helmínticos
sintéticos. No entanto, o desenvolvimento de populações resistentes à maioria dos anti-
helmínticos disponíveis atualmente (MAX et al., 2009) e a crescente preocupação com os
resíduos de drogas que podem entrar na cadeia alimentar e poluir o ambiente
(ATHANASIADOU et al., 2008) tornaram imprescindível a busca por medidas alternativas
de controle.
Dentre as alternativas que estão sendo pesquisadas para o controle do parasitismo
gastrintestinal, destaca-se o uso de plantas bioativas. Em alguns vegetais, os compostos ativos
já foram identificados, mas em outros ainda são desconhecidos. Na maioria dos casos, esses
compostos são os metabólitos secundários (ATHANASIADOU et al., 2008). Já que os
taninos, compostos polifenólicos, são os metabólitos secundários mais amplamente
encontrados nos vegetais, seus efeitos sobre a resiliência do hospedeiro e o parasitismo têm
sido os primeiros a serem estudados. Ademais, a virtual ausência de taninos hidrolisáveis
(TH) nas leguminosas forrageiras investigadas inicialmente direcionou a atenção para o papel
antiparasitário dos taninos condensados (TC) (HOSTE et al., 2006).
Portanto, o objetivo do presente estudo é revisar os efeitos de plantas taniníferas
sobre o parasitismo animal, enfatizando a importância do uso dessas plantas como medida
alternativa de controle de nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes.
Taninos
O metabolismo vegetal é dividido em primário e secundário. O metabolismo
primário está associado com a formação, manutenção e reprodução das plantas. Esse é o caso
das proteínas, carboidratos e lipídios. Os metabólitos secundários desempenham importante
papel na adaptação das plantas ao ambiente, pois estão envolvidos na defesa contra
microorganismos, insetos e herbívoros. Esses compostos também estão envolvidos na
proteção contra raios ultravioleta, atração de polinizadores e animais dispersores de sementes,
bem como em alelopatias. Compostos polifenólicos, terpenos, esteróides e alcalóides são
exemplos desses metabólitos (BOURGAUD et al., 2001).
Os metabólitos secundários são utilizados tradicionalmente na medicina devido à
diversidade de suas atividades biológicas (BOURGAUD et al., 2001). Entretanto, são
moléculas instáveis cuja atividade depende da estrutura, além das propriedades químicas e
físicas. As variações ambientais e sazonais também podem alterar a síntese destes compostos
e afetar suas propriedades (ATHANASIADOU et al., 2007). Alguns metabólitos secundários,
como os compostos polifenólicos, possuem características potencialmente benéficas na
40
prevenção de doenças e proteção da estabilidade do genoma, agindo como antioxidante,
antimutagênica, anticarcinogênica, anti-inflamatória e antimicrobiana (SINGH et al., 2003).
Taninos são os compostos polifenólicos mais encontrados nas plantas (SINGH et
al., 2003). A quantidade sintetizada varia de acordo com a planta e as condições ambientais,
apresentando grande variabilidade (OTERO & HIDALGO, 2004). Em geral, alta temperatura
e luminosidade, escassez de água e solos pobres aumentam a concentração dessas moléculas.
Durante o crescimento, as plantas produzem muita biomassa e poucas fontes estão disponíveis
para a síntese de compostos fenólicos. Entretanto, quando o crescimento é reduzido, o excesso
de carbono fica disponível para a síntese de taninos. De acordo com a estrutura química, os
taninos são classificados em hidrolisáveis e condensados (FRUTOS et al., 2004). Os TH estão
presentes em folhas de árvores e arbustos lenhosos de regiões tropicais. Quimicamente, são
polímeros constituídos por um carboidrato central, como a D-glucose, com os grupos
hidroxila esterificados pelo ácido gálico ou elágico (MIN et al., 2003). Nos ruminantes, os TH
podem ser degradados pelos microorganismos ruminais e originar compostos potencialmente
tóxicos. Provavelmente, a toxicidade é causada pela absorção dos produtos da degradação e
alta concentração de fenóis no sangue, que é maior do que a capacidade de detoxificação do
fígado (MAKKAR et al., 2007).
Os TC ou proantocianidinas são os taninos mais comumente encontrados em
leguminosas forrageiras, árvores e arbustos (MIN et al., 2003). Estruturalmente, são
polímeros formados por unidades de flavan-3-ol (catequina) ou flavan-3,4-diol (epicatequina)
unidas por ligações carbono-carbono, não suscetíveis à degradação enzimática anaeróbica.
Portanto, são relativamente estáveis no trato digestório dos ruminantes e raramente tóxicos.
Procianidinas e prodelfinidinas são as duas principais classes de TC. O comprimento da
cadeia do TC pode variar e dentro de cada polímero podem existir diversos monômeros
(WAGHORN, 2008). As diferenças estruturais podem produzir uma infinidade de estruturas
químicas que por sua vez afetam as propriedades físicas e biológicas dessas moléculas (MIN
& HART, 2003).
Os taninos possuem capacidade de complexação com outras moléculas devido à
presença de grupamentos hidroxila na estrutura química e, por esse motivo, são capazes de
exercer efeitos benéficos ou adversos, dependendo da sua concentração e natureza, espécie e
estado fisiológico do animal e composição da dieta. Estes compostos se complexam
primariamente com proteínas e, em menor extensão, com íons metálicos, aminoácidos e
polissacarídeos (MAKKAR et al., 2007). A formação do complexo tanino-proteína é
específica e depende do grau de afinidade química entre estes compostos. Tipo de polímero,
41
proporção de prodelfinidinas em relação às procianidinas, tipo de grupamentos terminais e
estrutura do potencial local de ligação devem ser considerados nos TC. Com relação às
proteínas, os fatores são: peso molecular, estrutura e conteúdo de prolina e de outros
aminoácidos hidrofóbicos (FRUTOS et al., 2004). A formação do complexo TC-proteína
ocorre principalmente por pontes de hidrogênio e ligações hidrofóbicas e é dependente do pH.
A ligação ocorre em pH neutro e a dissociação em extremos de pH (MIN et al., 2003).
Efeitos dos taninos condensados sobre o parasitismo animal
Há séculos, principalmente com base no conhecimento empírico popular, plantas
e extratos ricos em metabólitos secundários têm sido utilizados no controle do parasitismo em
algumas regiões do mundo. Recentemente, evidências científicas da atividade antiparasitária
de plantas ricas em TC têm sido geradas por um número crescente de estudos realizados para
verificar, validar e quantificar cientificamente seus efeitos. Duas abordagens têm sido
empregadas para essa finalidade: o fornecimento de plantas a animais natural ou
experimentalmente infectados e a preparação de extratos dessas plantas para avaliação in vitro
e in vivo (ATHANASIADOU et al., 2007).
A atividade anti-helmíntica in vitro dos TC é avaliada sobre diferentes estágios
dos nematóides, como ovos, larvas de primeiro estágio (L1), larvas de terceiro estágio (L3) e
adultos. Os efeitos registrados foram redução de eclosão, desenvolvimento, motilidade e
desembainhamento larvar e motilidade de adultos (HOSTE et al., 2006). As principais
vantagens dos testes in vitro são baixo custo, rapidez dos resultados permitindo a triagem de
uma grande quantidade de plantas e possibilidade de avaliar substâncias isoladas sem
interferência de outros compostos (GITHIORI et al., 2006). Normalmente, esses ensaios são
realizados com nematóides que parasitam ruminantes, porque resultados obtidos com
nematóides de vida livre, como Caenorhabditis elegans, nem sempre podem ser extrapolados
para nematóides parasitos, devido a diferenças biológicas entre as espécies (GEARY &
THOMPSON, 2001). Entretanto, estes testes avaliam o efeito do TC sobre os nematóides sem
a interferência da fisiologia animal. Na tabela 1, estão sumarizados resultados de
experimentos in vitro para avaliação da atividade anti-helmíntica de extratos de plantas ricas
em TC.
42
Tabela 1 - Resultados de experimentos in vitro para avaliação da atividade anti-helmíntica de extratos
de plantas ricas em taninos condensados.
Família (Subfamília) Planta Efeito Fonte
Anacardiaceae Schinopsis spp. ML ATHANASIADOU et al., 2001
Acacia mearnsii AL MINHO et al., 2008a
Fabaceae (Mimosaceae) Leucaena leucocephala ML e DBL ALONSO-DÍAZ et al., 2008
Lysiloma latisiliquum ML e DBL ALONSO-DÍAZ et al., 2008
Hedysarum coronarium ML MOLAN et al., 2000
EO e DVL MOLAN et al., 2002
Lotus corniculatus ML MOLAN et al., 2000
EO e DVL MOLAN et al., 2002
Fabaceae (Papilionaceae) Lotus pedunculatus ML MOLAN et al., 2000
EO e DVL MOLAN et al., 2002
Onobrychis viciifolia ML MOLAN et al., 2000
EO e DVL MOLAN et al., 2002
ML BARRAU et al., 2005
DBL BRUNET et al., 2007
PL BRUNET et al., 2008b
Efeito: Redução de AL. – Alimentação larvar; EO. – Eclosão de ovos; VL. – Viabilidade larvar; DVL. – Desenvolvimento
larvar; DBL. – Desembainhamento larvar; ML. – Migração larvar; PL. – Penetração larvar na mucosa abomasal.
Nos estudos in vivo de avaliação de atividade anti-helmíntica, os TC causam
reduções na carga parasitária, excreção de ovos nas fezes e fecundidade dos parasitos. O
efeito mais comumente observado é a diminuição do número de ovos por grama de fezes
(OPG), que geralmente está associada com redução da fecundidade dos nematóides (HOSTE
et al., 2006). O mecanismo relacionado com a baixa fecundidade permanece obscuro, mas a
possível ação dos taninos sobre o trato genital feminino dos nematóides deve ser explorada
(PAOLINI et al., 2003a). A redução do OPG pode diminuir a contaminação da pastagem e a
dinâmica da infecção no animal (HECKENDORN et al., 2007). Os TC também podem atuar
sobre a eclosão e o desenvolvimento das larvas dos nematóides, pois, como não são
absorvidos pelo trato gastrintestinal dos pequenos ruminantes, ocorre sua eliminação nas fezes
e redução da contaminação do pasto (MUPEYO et al., 2011).
Na maioria dos testes in vivo, o efeito dos TC é determinado a partir da
comparação da eficácia de plantas taniníferas com plantas que não contêm esses compostos
43
em hospedeiros natural ou experimentalmente infectados com nematóides gastrintestinais. Os
efeitos desses metabólitos também podem ser avaliados em animais tratados com
polietilenoglicol (PEG), um polímero sintético não nutritivo que se complexa com os TC,
inativando-os (MIN & HART, 2003). Na tabela 2, estão sumarizados resultados de
experimentos in vivo realizados em ovinos e caprinos para avaliação da atividade anti-
helmíntica de plantas ricas em TC.
Tabela 2 - Resultados de experimentos in vivo realizados em ovinos e caprinos para avaliação da
atividade anti-helmíntica de plantas ricas em taninos condensados.
Família (Subfamília) Planta Efeito Fonte
Anacardiaceae Schinopsis spp. OPG e CP ATHANASIADOU et al., 2001
CP PAOLINI et al., 2003a
OPG PAOLINI et al., 2003b
Acacia cyanophylla OPG AKKARI et al., 2008
Acacia mearnsii OPG e CP MINHO et al., 2008b; MAX et al.,
2009
Fabaceae (Mimosaceae) Lysiloma latisiliquum EL BRUNET et al., 2008a
OPG MARTÍNEZ-ORTÍZ-DE-
MONTELLANO et al., 2010
Hedysarum coronarium OPG e CP NIEZEN et al., 2002
Lespedeza cuneata OPG e CP SHAIK et al., 2006; LANGE et al.,
2006; TERRIL et al., 2007
EL e OPG JOSHI et al., 2011
Fabaceae (Papilionaceae) Lotus corniculatus CP RAMÍREZ-RESTREPO et al.,
2005
OPG HECKENDORN et al., 2007
Onobrychis viciifolia DBL BRUNET et al., 2007
OPG HECKENDORN et al., 2007
OPG RÍOS-DE ÁLVAREZ et al., 2008
Efeito: Redução de OPG. – Ovos por grama de fezes; CP. – Carga parasitária; EL. Estabelecimento larvar; DBL. –
Desembainhamento larvar.
44
Mecanismos de ação dos taninos condensados sobre nematóides gastrintestinais
Para esclarecer os efeitos dos TC sobre os nematóides gastrintestinais de
pequenos ruminantes, foram desenvolvidas duas hipóteses baseadas na sua capacidade de
complexação com proteínas. A primeira é o efeito direto sobre larvas e adultos. De acordo
com essa hipótese, os TC se ligam com a cutícula dos nematóides, que é rica em prolina e
hidroxiprolina, e alteram suas propriedades físicas e químicas (ATHANASIADOU et al.,
2000b; HOSTE et al., 2006). Contudo, a atividade de extratos de plantas taniníferas sobre
adultos foi pouco avaliada in vitro (KOTZE et al., 2009). Ao contrário, diversos experimentos
demonstraram que a motilidade larvar foi adversamente modificada após contato com extratos
ricos em TC. Nesses estudos, os efeitos inibitórios sobre as larvas desapareceram após adição
de PEG aos extratos (MOLAN et al., 2000; BARRAU et al., 2005; ALONSO-DÍAS et al.,
2008; KOTZE et al., 2009). O efeito anti-helmíntico in vitro dos taninos apoia a teoria da ação
direta desses metabólitos. Entretanto, o mecanismo de ação sobre os diferentes estágios dos
nematóides permanece obscuro (BRUNET & HOSTE, 2006).
O consumo de plantas taniníferas por ovinos e caprinos foi associado com a
modulação da biologia de populações de parasitos adultos, pois afetou a excreção de ovos
(LANGE et al., 2006; HECKENDORN et al., 2007; MAX et al., 2009; JOSHI et al., 2011)
e/ou a carga parasitária (SHAIK et al., 2006; MINHO et al., 2008b; MAX et al., 2009). Essas
consequências provavelmente estão relacionadas com o efeito dos TC ao alterar a integridade
do parasito reduzindo sua fecundidade ou causando sua eliminação, o que diminui a
contaminação da pastagem. Experimentos in vivo indicaram que o consumo de plantas
taniníferas também diminuiu significativamente o estabelecimento de L3 (BRUNET et al.,
2007; BRUNET et al., 2008a; JOSHI et al., 2011). Alguns estudos in vitro confirmaram que
extratos dessas plantas reduzem o estabelecimento larvar ao afetar o desembainhamento ou a
associação dessas larvas com a mucosa (BRUNET & HOSTE 2006; BRUNET et al., 2007;
BRUNET et al., 2008b). O estabelecimento larvar pode ser prejudicado por uma falha no
desembainhamento causada pela presença de TC no trato digestório do hospedeiro (BRUNET
et al., 2008b).
A segunda hipótese proposta para explicar a atividade anti-helmíntica dos TC é o
efeito indireto ao aumentar a resposta imune de pequenos ruminantes contra parasitos. De
acordo com essa teoria, os TC protegem as proteínas da degradação ruminal, aumentando sua
disponibilidade no intestino delgado. A presença de surfactantes, como os ácidos biliares, no
intestino delgado pode ser muito importante para a dissociação do complexo TC-proteína
(ATHANASIADOU et al., 2000b; ATHANASIADOU et al., 2001; HOSTE et al., 2006).
45
Como uma maior disponibilidade protéica, aumenta a homeostase do hospedeiro e imunidade
contra parasitos, a melhora na utilização de nutrientes em hospedeiros que recebem taninos
pode contribuir para o aumento na resiliência de animais infectados com nematóides
gastrintestinais (WAGHORN & McNABB, 2003). Contudo, poucos estudos avaliaram o
efeito indireto dos taninos e seus resultados permanecem largamente inconclusivos (HOSTE
et al., 2006; BRUNET et al., 2008a). RÍOS-DE ÁLVAREZ et al. (2008) encontraram um
maior número de células inflamatórias na mucosa intestinal de ovinos após o fornecimento de
uma planta taninífera. Contudo, não foi registrada alteração significativa no número de células
inflamatórias da mucosa abomasal e intestinal de caprinos após o fornecimento de outra
planta rica em TC. Neste último experimento, tal fato foi atribuído ao curto período
experimental, que pode não ter sido suficiente para a expressão de resposta imune (BRUNET
et al., 2008a).
Fatores que interferem na eficácia anti-helmíntica dos taninos condensados
De acordo com a literatura, alguns fatores relacionados com as plantas, os
parasitos e os hospedeiros podem influenciar na atividade anti-helmíntica dos TC (MIN &
HART, 2003; HOSTE et al., 2006; ATHANASIADOU et al., 2007; RÍOS-DE ÁLVAREZ et
al., 2008). A concentração e estrutura dos TC parecem ser os dois principais fatores
moduladores da eficácia desses metabólitos contra nematóides. Uma revisão dos
experimentos realizados em ovinos e caprinos com plantas taniníferas sugeriu que deve existir
no mínimo 30 a 40g de TC kg-1 de matéria seca (MS) (3 a 4% de MS) para ser observada
atividade antiparasitária (HOSTE et al., 2006). Além desse efeito benéfico, tais concentrações
de TC também são importantes para aumentar a produtividade animal ao corrigir problemas
associados com a indiscriminada proteólise que ocorre nos ruminantes (OTERO &
HIDALGO, 2004). No rúmem, que possui pH neutro, o complexo TC-proteína permanece
estável, contudo, posteriormente, ocorre sua dissociação, devido ao baixo pH do abomaso e
alto pH do intestino delgado. Dessa forma, as proteínas escapam da degradação ruminal e
ficam disponíveis para a digestão no abomaso e intestino delgado, aumentando a
disponibilidade de aminoácidos essenciais (MIN & HART, 2003). Além de reduzir a
degradação ruminal de proteínas, os TC aumentam a eficiência da síntese protéica microbiana
devido à inibição ou estimulação de microorganismos. Os TC também reduzem a excreção de
nitrogênio e metano, diminuindo a contaminação ambiental (MAKKAR et al., 2007).
Entretanto, altas concentrações de TC nas plantas (6-10% da MS) podem causar
efeitos adversos, pois ocorre formação do complexo TC-proteína salivar durante a mastigação
46
que causa uma sensação de adstringência, aumenta a salivação, diminui a palatabilidade e o
consumo de alimentos (OTERO & HIDALGO, 2004). Esses compostos, em altas
concentrações, também diminuem a digestibilidade de matéria seca, matéria orgânica,
proteínas, carboidratos e fibras, afetando negativamente a produtividade (MIN et al., 2003).
Além do conteúdo de TC na dieta, suas características químicas e estruturais
também podem interferir na atividade antiparasitária (BRUNET & HOSTE et al., 2006;
HOSTE et al., 2006; BRUNET et al., 2008b). A proporção relativa dos monômeros de TC é
um fator que pode influenciar na eficácia sobre nematóides. Os monômeros das
prodelfinidinas e derivados do galoil apresentaram maior eficácia do que os monômeros das
procianidinas (MOLAN et al., 2000; BRUNET & HOSTE, 2006; BRUNET et al., 2008b).
Uma possível explicação para tal diferença é a habilidade dos TC de formar complexos com
proteínas. Devido à estrutura química, as prodelfinidinas podem formar mais pontes de
hidrogênio com essas macromoléculas (BRUNET et al., 2008b).
Outro aspecto considerado na modulação da eficácia anti-helmíntica dos TC é a
espécie de nematóide (HOSTE et al., 2006). Isso pode estar relacionado com a localização do
parasito ou biodisponibilidade dos taninos no trato gastrintestinal do hospedeiro
(ATHANASIADOU et al., 2007; HECKENDORN et al., 2007). ATHANASIADOU et al.
(2000a), ATHANASIADOU et al. (2000b) e PAOLINI et al. (2003a) demonstraram efeito
sobre nematóides do intestino. Espera-se que, devido às condições fisiológicas, os taninos
estejam complexados com as proteínas no abomaso e indisponíveis para exercer atividade
anti-helmíntica sobre espécies abomasais. Acredita-se que esses complexos se dissociem no
intestino delgado e, portanto, sejam mais efetivos contra parasitos intestinais
(ATHANASIADOU et al., 2001). Contudo, quando uma dieta é rica em proteína, os TC
podem permanecer unidos a essas macromoléculas no intestino delgado, apresentando pouca
eficácia anti-helmíntica, pois existirá pequena disponibilidade de taninos (ATHANASIADOU
et al., 2007). Em outros experimentos, verificou-se que os TC possuem eficácia sobre
nematóides do abomaso (PAOLINI et al., 2003b; HECKENDORN et al., 2007; MARTÍNEZ-
ORTÍZ-DEMONTELLANO et al., 2010). SHAIK et al. (2006) constataram ação sobre
espécies abomasais e intestinais. A partir desses resultados, supõe-se que a eficácia dos
taninos deve estar mais relacionada com sua estrutura química e concentração do que com a
espécie de nematóide. HECKENDORN et al. (2007) relataram ainda que a eficácia dos TC
pode estar relacionada com o sexo do parasito, pois foi registrada maior redução sobre a carga
de fêmeas do que de machos. Entretanto, como o mecanismo de ação dessas moléculas é
desconhecido, é difícil explicar essa diferença.
47
Outro aspecto que pode influenciar na eficácia anti-helmíntica dos TC é o estágio
de desenvolvimento do parasito (HOSTE et al., 2006; BRUNET et al., 2008a). Os taninos
afetam o estabelecimento larvar e, consequentemente, reduzem a carga parasitária quando
atuam sobre L3. Entretanto, quando o hospedeiro já está infectado com adultos, ocorre apenas
alteração da função reprodutiva dos nematóides, reduzindo, portanto, o OPG e a
contaminação da pastagem (PAOLINI et al., 2003a; PAOLINI et al., 2003b; MARTÍNEZ-
ORTÍZ-DEMONTELLANO et al., 2010; JOSHI et al., 2011). Contudo, LANGE et al. (2006)
demonstraram que os TC foram mais eficazes sobre nematóides adultos do que sobre o
estabelecimento das larvas e atribuíram esses resultados à espécie de nematóide, estrutura dos
taninos e espécie de hospedeiro.
A eficácia dos TC também pode estar relacionada com as condições do trato
gastrintestinal do hospedeiro (HOSTE et al., 2006). MAX et al. (2009) avaliaram a eficácia de
um extrato rico em TC em ovinos e caprinos e observaram redução do OPG e da carga
parasitária apenas nos ovinos. De acordo com esses autores, ao contrário dos ovinos, os
caprinos possuem adaptações fisiológicas no trato digestivo que inativam os taninos antes que
esses compostos possam atuar sobre os nematóides. A eficácia dos taninos em ovinos também
foi constatada em outros experimentos (ATHANASIADOU et al., 2001; HECKENDORN et
al., 2007; AKKARI et al., 2008; MINHO et al., 2008b). Entretanto, diversos estudos
constataram a eficácia desses metabólitos em caprinos (LANGE et al., 2006; SHAIK et al.,
2006; TERRIL et al., 2007; BRUNET et al., 2008a). Por esse motivo, mais estudos devem ser
realizados para comparar a eficácia de um mesmo tipo de tanino nessas duas espécies animais.
A presença de taninos nas plantas pode influenciar positivamente a sanidade de
pequenos ruminantes. Entretanto, seus efeitos dependem do tipo e da concentração desses
metabólitos. Dessa forma, não se tem uma indicação precisa de como utilizá-los no controle
de nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes. Alguns aspectos, como o mecanismo
de ação dos TC sobre nematóides gastrintestinais e os fatores relacionados com a
variabilidade de seus efeitos, ainda necessitam de mais investigação para que as plantas
taniníferas sejam consideradas alternativas efetivas de controle do parasitismo gastrintestinal
de pequenos ruminantes e, consequentemente, aumentem a produtividade da
ovinocaprinocultura.
48
Agradecimentos
Ao Banco do Nordeste (BNB), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) pelo apoio financeiro.
Referências
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54
7 CAPÍTULO 2
Effects of Myracrodruon urundeuva extracts on egg hatching
and larval exsheathment of Haemonchus contortus
(Efeitos de extratos de Myracrodruon urundeuva sobre a eclosão de ovos e o
desembainhamento larvar de Haemonchus contortus)
Periódico: Parasitology Research (Qualis A2), v.109, n.3, p.893-898, set, 2011.
(doi: 10.1007/s00436-011-2331-6)
55
Resumo
A resistência anti-helmíntica tem limitado o controle dos nematóides gastrintestinais de
pequenos ruminantes e por isso tem incentivado o interesse pelo estudo das plantas taniníferas
como fonte de anti-helmínticos. Esses experimentos foram desenvolvidos para avaliar in vitro
a eficácia do extrato das folhas (EF) e do extrato dos caules (EC) de Myracrodruon
urundeuva sobre Haemonchus contortus. Um inibidor de taninos, polivilpolipirrolidona
(PVPP), foi utilizado para verificar se esses metabólitos estão envolvidos na atividade anti-
helmíntica dos extratos. Para avaliar o efeito ovicida, ovos de H. contortus foram incubados
com os extratos (0,31 a 5 mg/mL) durante 48 h. No teste de desembainhamento larvar
artificial, larvas de terceiro estágio desse nematóide foram incubadas com os extratos (0,31
mg/mL) durante 3 h e então foram expostas a uma solução de hipoclorito de sódio. O
processo de desembainhamento foi avaliado durante 60 min. Os resultados foram submetidos
ao teste Kruskal–Wallis (p<0,05). Os extratos apresentaram efeito ovicida dose-dependente,
embora o extrato das folhas tenha sido mais efetivo inibindo 97,73% da eclosão de ovos na
concentração de 1,25 mg/mL, enquanto o extrato dos caules inibiram 83,56% da eclosão na
concentração de 5 mg/mL. O contato com os extratos bloqueou o desembainhamento larvar
(p<0,05). A adição de PVPP confirmou o papel dos taninos, pois ocorreu um aumento
substancial dos percentuais da eclosão de ovos e do desembainhamento larvar. Esses
resultados sugerem que M. urundeuva pode ser utilizada para controlar os nematóides
gastrintestinais de pequenos ruminantes e que a atividade anti-helmíntica dessa planta está
provavelmente relacionada com os taninos; entretanto, estudos in vivo devem ser conduzidos.
Palavras-chave: In vitro. Taninos. Polivinilpolipirrolidona. Haemonchus contortus.
56
Effects of Myracrodruon urundeuva extracts on egg hatching
and larval exsheathment of Haemonchus contortus
(Efeitos de extratos de Myracrodruon urundeuva sobre a eclosão de ovos e o
desembainhamento larvar de Haemonchus contortus)
Lorena Mayana Beserra de Oliveira, Claudia Maria Leal Bevilaqua, Iara Tersia Freitas
Macedo, Selene Maia de Morais, Lyeghyna Karla Andrade Machado, Claudio Cabral
Campello, Mayara de Aquino Mesquita
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará,
Fortaleza, Ceará, Brazil
* Corresponding author:
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias,
Universidade Estadual do Ceará,
Av Dede Brasil 1700, Campus do Itaperi,
60740–093, Fortaleza, Ceará, Brazil
Tel: +55 85 3101 9853; fax: +55 85 3101 9840
E-mail: [email protected]
57
Abstract
The anthelmintic resistance has limited the control of gastrointestinal nematodes of small
ruminants and thus has awakened interest in the study of tanniferous plants as a source of
anthelmintics. These experiments were carried out to evaluate the in vitro efficacy of
Myracrodruon urundeuva leaf extract (LE) and stem extract (SE) against Haemonchus
contortus. An inhibitor of tannins, polyvinyl polypyrrolidone (PVPP), was used to verify if
these metabolites are involved in the anthelmintic activity of the extracts. To evaluate the
ovicidal effect, H. contortus eggs were incubated with the extracts (0.31 to 5 mg/mL) for 48
h. In the larval artificial exsheathment assay, third-stage larvae of this nematode were
incubated with extracts (0.31 mg/mL) for 3 h and then were exposed to a sodium hypochlorite
solution. The exsheathment process was evaluated for 60 min. The results were subjected to
the Kruskal–Wallis test (P<0.05). The extracts showed dose-dependent ovicidal effects,
although the LE was more effective, inhibiting egg hatching by 97.73% at 1.25 mg/mL, while
the SE inhibited hatching by 83.56% at 5 mg/mL. Contact with the extracts blocked the larval
exsheathment (P<0.05). The addition of PVPP confirmed the role of tannins, as there was a
substantial reduction in egg hatching and larval exsheathment percentage. These results
suggest that M. urundeuva can be used to control gastrointestinal nematodes of small
ruminants and that the anthelmintic activity of this plant is probably related to tannins;
however, in vivo studies should be conducted.
Keywords: In vitro. Tannins. Polyvinyl polypyrrolidone. Haemonchus contortus.
Introduction
Control of gastrointestinal nematode parasitism in small ruminants has been based
on administration of synthetic anthelmintics. However, the development of populations
resistant to most of the drug families currently available (Torres-Acosta and Hoste 2008) and
concerns regarding drug residues in food and in the environment have stimulated the search
for alternative control strategies. Amongst these alternatives, the use of bioactive plants has
received attention. In some plants, active compounds have been identified, but in others they
remain unknown. In most plants, active compounds are secondary metabolites (Athanasiadou
et al. 2008).
58
Many studies suggest that tannins might be one class of plant secondary
metabolites with potential anthelmintic properties. The effect of tannin-rich plant extracts and
isolated tannins on nematodes has initially been evaluated in vitro. Inhibition of egg hatching
and development, motility, and exsheathment of larvae were observed effects of these
compounds. In some of these studies, the role of tannins was confirmed by obtaining values
similar to controls after the addition of specific metabolite inhibitors, such as polyethylene
glycol or polyvinyl polypyrrolidone (PVPP) (Molan et al. 2003a; Barrau et al. 2005; Brunet
and Hoste 2006; Alonso-Díaz et al. 2008; Molan and Faraj 2010). However, the exact
mechanisms of action of tannins remain unclear and could differ according to the parasite, its
stage of development and the biochemical characteristics of the plant species (Hoste et al.
2006). Meanwhile, other secondary metabolites can also affect the biology of nematodes
(Molan et al. 2003b; Barrau et al. 2005).
Myracrodruon urundeuva Allemão, popularly known as aroeira-do-sertão, is a
plant that belongs to the family Anacardiaceae and is present in several countries in South
America, including Brazil, Argentina, Bolivia, and Paraguay (Leite 2002). This species has
high level of tannins (Souza et al. 2007; Araujo et al. 2008) and is used in ethnomedicine and
ethnoveterinary medicine (Monteiro et al. 2006) and in the feed of small ruminants (Santos et
al. 2008). In the current literature, we could find no published reports of anthelmintic activity
of M. urundeuva.
Thus, the present study was carried out to evaluate the effect of leaf and stem
extracts of M. urundeuva on egg hatching and larval exsheathment of Haemonchus contortus
in vitro and to confirm the activity of tannins contained in these extracts using an inhibitor of
these metabolites.
Materials and methods
Plant and extract preparation
Aerial parts of M. urundeuva were collected in December 2009 in Fortaleza,
Ceará, located in northeastern Brazil. Prior to the beginning of the trial, samples of the plant
were identified and authenticated by botanists at the Herbarium Prisco Bezerra of the
Universidade Federal do Ceará, Brazil. A voucher specimen was deposited under the number
46088.
M. urundeuva extracts were prepared as described by Barrau et al. (2005). Leaves
(150 g) and stems (150 g) of the plant were separately air-dried at 22°C, crushed to a powder
59
and then mixed with 2×900 mL of 70:30 acetone/ water (v/v). Extracts were obtained from
the resulting filtrate using filter paper. The acetone was removed under low pressure using a
rotary evaporator, and the aqueous solution was washed four times with 500 ml methylene
chloride to remove chlorophyll and lipids. The remaining fractions, called leaf extract and
stem extract of M. urundeuva, were freeze-dried and kept refrigerated at 4°C in airtight
containers until use.
Quantification of total phenols and tannins of extracts
The total phenol was determined using the Folin–Ciocalteu spectrophotometric
method (Bonoli et al. 2004). Briefly, 100 μL of each extract solution (150 ppm) was shaken
for 1 min with 500 μl of Folin–Ciocalteu reagent and 6 ml of distilled water. Then, 2 ml of
15% sodium carbonate (Na2Co3) was added and the mixture was shaken again for 30 s. The
solution was adjusted to 10 ml by adding distilled water. After 2 h, the absorbance at 750 nm
was evaluated using a spectrophotometer. The readings, with three replicates per sample, were
performed with a negative control. The total phenol content was assessed by plotting the
gallic acid calibration curve. For the total tannin content, 100 mg/mL PVPP was used to
isolate these metabolites from extract. Then total tannins were measured as the difference of
total phenol before and after treatment with PVPP.
Phytochemical study of extracts
The phytochemical test to detect the presence of hydrolysable or condensed
tannins was performed following the method described by Matos (2009). The extracts were
diluted in alcohol, three drops of ferric chloride (FeCl3) solution were added, and the mixture
was shaken. The formation of a dark blue precipitate indicated the presence of hydrolysable
tannins and a green precipitate indicated the presence of condensed tannins. Samples were
compared to a control, e.g., a mixture of water and ferric chloride solution.
Recovery of H. contortus eggs and larvae
One sheep was housed in a metabolic cage and treated with three anthelmintics
with different active ingredients on alternate days. After total clearance of natural infection,
5,000 H. contortus third-stage larvae (L3) were orally administered. This animal was used as
a source of H. contortus eggs and larvae. To recover eggs and L3, feces were directly
collected from the rectum of the animal and processed according to the techniques described
by Hubert and Kerboeuf (1992) and Roberts and O’Sullivan (1950), respectively. The eggs
60
were immediately used and the larvae were stored at 4°C until use. This study was approved
by the ethic committee of the Universidade Estadual do Ceará and registered under the
number 09657330-9/02.
Egg hatch test
This assay was based on the method described by Coles et al. (1992). Solutions of
the extracts were prepared, using 3% dimethylsulfoxide (DMSO) to increase solubility in
aqueous media. The final concentrations of the extracts were 0.31, 0.62, 1.25, 2.5, and 5
mg/L. Briefly, 250 μL of egg suspension, containing approximately 100 fresh eggs, was
incubated for 48 h at 27°C with 250 μL of each extract. After this period, Lugol drops were
added to stop egg hatching, and eggs and first stage larvae (L1) were counted under a
microscope. This test was conducted with the following two controls: a negative with 3%
DMSO and a positive with 0.025 mg/mL thiabendazole. Three repetitions, with five replicates
for each extract concentration and for each control, were performed.
Larval artificial exsheathment assay
This test was performed as described by Bahuaud et al. (2006). Twenty-four hours
before the experiment, 2- to 3-month-old larvae were brought to room temperature. The
viability and proportion of exsheathed larvae were checked. The extracts were diluted in
phosphate buffer solution (PBS), and the concentration evaluated was 0.31 mg/mL. Then,
approximately 1,000 ensheathed L3 were incubated for 3 h at 20°C with each extract. The
larvae were washed and centrifuged three times in PBS (pH 7.2). Thereafter, the L3 were
subjected to the process of artificial exsheathment by incubation in a solution of sodium
hypochlorite (2% v/v) diluted 1:300 in PBS. The kinetics of larval exsheathment were
monitored under a microscope, and exsheathed larvae were counted at 0, 10, 20, 30, 40, 50,
and 60 min after contact with the hypochlorite solution. PBS was used as a negative control.
Six replicates were performed for each extract and for the control.
Effects of PVPP addition to plant extracts on egg hatching and the larval exsheathment
process
To evaluate the role of tannins in these assays, PVPP (Sigma®), a specific
inhibitor of tannins, was added to leaf and stem extracts of M. urundeuva. The PVPP is
capable of forming bonds with tannins and to precipitate them from solutions, then
comparisons of the results obtained with extracts with or without PVPP confirmed the
61
involvement of these metabolites. Each extract was pre-incubated overnight with 50 mg/mL
PVPP (Alonso-Díaz et al. 2008) and then tested as previously described. In the egg hatch test,
the highest concentration of each extract, 5 mg/ mL, was used. A negative control with 3%
DMSO solution was run in parallel. In the larval artificial exsheathment assay, 0.31 mg/mL of
each extract was used and a negative control with PBS was included.
Statistical analysis
The efficacy of each treatment in the egg hatch test was determined by the
formula: number of eggs/ (number of eggs+number of L1)×100, while in the larval artificial
exsheathment assay, the following formula was used: number of exsheathed L3/ (number of
ensheathed L3+ number of exsheathed L3)×100. Data were initially subjected to the Shapiro–
Wilk and Bartlett tests to confirm the normality of distribution and the homogeneity of
variance between treatments, respectively. Even after data transformation, there was no
homoscedasticity; the Kruskal–Wallis test (P<0.05) was then applied using SAS (2002). Data
were expressed as mean±standard error (S.E.). The results, corresponding to the percentage of
egg hatching inhibition in relation to the concentration of extract used, were subjected to
regression analysis, and the model with the larger coefficient of determination (R2) was
selected.
Results
Quantification of total phenols and tannins and phytochemical study
The M. urundeuva leaf extract yield, after lyophilization, was 17.7%, whereas the
stem extract yield was 8.6%. The leaf extract showed the highest content of total phenols and
tannins, 166.03 and 153.95 mg gallic acid equivalents/g of extract, and the stem extract
demonstrated 102.60 and 85.99 mg gallic acid equivalents/g of extract, respectively. The
phytochemical test revealed the presence of condensed tannins in both extracts.
Egg hatch test
Table 1 shows the mean efficacy of M. urundeuva leaf and stem extracts on egg
hatching of H. contortus. Leaf extract showed ovicidal activity at all tested concentrations,
and for the three higher concentrations (5, 2.5, and 1.25 mg/mL), the effect was significantly
better than or similar to that of thiabendazole. At all concentrations except the lowest (0.31
mg/mL), the stem extract inhibited egg hatching. Comparing the two extracts, the leaf extract
62
had higher ovicidal activity than the stem extract. Regression analysis indicated that the
extracts had the following dose-dependent effects: leaf extract: y=70.22x+13.35; R2=0.940;
EC50= 0.52 mg/mL; stem extract: y=14.69x+14.14; R2=0.965; EC50=2.44 mg/ml (y is the
percent inhibition of egg hatching and x is the extract concentration).
The addition of PVPP was associated with a significant change in egg hatching
when compared to the non-treated extracts (P<0.05). However, the egg hatching percentage
remained significantly different from the negative control values (P<0.05) (Table 1).
Table 1 - Mean efficacy (percentage ± S.E.) of leaf and stem extracts of Myracrodruon
urundeuva, with or without addition of PVPP, on Haemonchus contortus egg hatching.
Concentration Leaf extract Stem extract
5 mg/mL 100.00 ± 0.0Aa
83.56 ± 1.26Bª
2.5 mg/mL 100.00 ± 0.0Aa
61.03 ± 1.23Bb
1.25 mg/mL 97.73 ± 0.95Ab
30.66 ± 2.05Bc
0.625 mg/mL 69.23 ± 2.03Ac
20.07 ± 1.2Bd
0.3125 mg/mL 24.93 ± 1.4Ad
16.82 ± 1.06Bef
5 mg/mL + PVPP 18.85 ± 1.15Ae
18.46 ± 1.32Ade
Thiabendazole (0.025 mg/mL) 96.45 ± 0.56Ab
96.45 ± 0.56Ag
Dimethylsulfoxide (3%) 15.13 ± 0.66Af
15.13 ± 0.66Af
Small letters compare means in the rows and capital letters compare means in the columns. Different letters
indicate significant differences (P < 0.05).
Larval artificial exsheathment assay
In the negative control, >99% of L3 were exsheathed 60 min after contact with the
sodium hypochlorite solution. Nevertheless, 3 h of contact with the leaf and stem extracts of
M. urundeuva completely inhibited the H. contortus exsheathment process (P<0.05; Figs. 1
and 2).
63
Figure 1 - Effect of leaf extract of Myracrodruon urundeuva, with or without addition of
PVPP, on the process of artificial in vitro exsheathment of Haemonchus contortus third-stage
larvae induced by addition of a 2% hypochlorite solution.
Figure 2 - Effect of stem extract of Myracrodruon urundeuva, with or without addition of
PVPP, on the process of artificial in vitro exsheathment of Haemonchus contortus third-stage
larvae induced by addition of a 2% hypochlorite solution.
The addition of PVPP to the leaf and stem extracts reversed the inhibitory effect
of the extracts on the larvae exsheathment process; 60 min after contact with the sodium
hypochlorite solution, the percentage of exsheathed larvae were 87.93% and 96.37%,
respectively. This change was significant when compared to the non-treated extracts with
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60
Exsh
eath
ed l
arv
ae
(%)
Time (min)
Control (PBS) Leaf extract Leaf extract + PVPP
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60
Exsh
eath
ed l
arv
ae
(%)
Time (min)
Control (PBS) Stem extract Stem extract + PVPP
64
PVPP (P<0.05). However, the exsheathment percentage remained significantly different from
that of PBS (P<0.05).
Discussion
The first objective of this study was to demonstrate in vitro that M. urundeuva
extracts inhibit egg hatching and larvae exsheathment of H. contortus. The anthelmintic
efficacy of plants belonging to the Anacardiaceae family has been well documented. An
extract from the bark of Schinopsis spp., popularly known as Quebracho, has been shown to
affect the larval viability of Teladorsagia circumcincta, H. contortus, and Trichostrongylus
vitrinus in a dose-dependent manner (Athanasiadou et al. 2001). Costa et al. (2002) reported
95.66% efficiency of egg hatching inhibition in H. contortus using 50 mg/mL of ethanolic
fraction from hexane extract obtained from Mangifera indica seeds. A concentration of 100
mg/mL of aqueous and ethanol extracts from Anacardium humile leaves inhibited 90.9% and
99.6% of larval development in gastrointestinal nematodes of sheep, respectively (Nery et al.
2010). To our knowledge, this is the first evidence of antiparasitic activity of M. urundeuva.
One of the principal goals regarding the potential anthelmintic activity of natural
products is to determine the active compounds. As mentioned, M. urundeuva was selected
because of its high tannin content. Thus, the second objective of this study was to show that
tannins can act on H. contortus eggs and larvae. Condensed tannins are likely the main
substance involved in this activity because the addition of ferric chloride solution during
phytochemical analysis produced a green precipitate, indicating the predominance of these
metabolites. The anthelmintic activity of condensed tannins has been confirmed by in vitro
assays that showed the effects on nematodes (Hoste et al. 2006). These assays are based on
the hypothesis that nematicidal activity observed in vitro would be indicative of potential in
vivo activity. The egg hatch test is one of the assays that have been routinely used. Molan et
al. (2002) showed that 200–500 μg/mL tannins extracted from Lotus pedunculatus, Lotus
corniculatus, Hedysarum coronarium, Onobrychus viciifolia, Dorycnium pentaphylum,
Dorycnium rectum and Rumex obtusifolius inhibited Trichostrongylus colubriformis egg
hatching. The flavan-3-ol gallates showed 100% inhibition of T. colubriformis egg hatching at
1,000 μg/mL, with epigallocatechin gallate being the most effective (Molan et al. 2003a).
Molan and Faraj (2010) found that about 53%, 68%, 51%, 60%, and 46% of T. circumcincta
eggs hatched after incubation with 900 μg/mL of condensed tannins from L. pedunculatus, L.
corniculatus, D. pentaphyllum, D. rectum, and R. obtusifolius, respectively. In these
65
experiments, the ovicidal efficacy was higher than that recorded in the present study, likely
because isolated condensed tannins or commercially purchased monomers of these
metabolites were used. According to Rates (2001), the plant extracts have small
concentrations of active compounds. However, our results showed that M. urundeuva extracts
have ovicidal efficacy that is superior to other tannin-rich extracts (Hounzangbe- Adote et al.
2005; Marie-Magdeleine et al. 2010; Max 2010).
The EC50 in ovicidal tests of M. urundeuva leaf extract was lower than that of the
stem extract. The higher content of tannins in the leaf extract could explain this difference.
However, the presence of condensed tannins with different chemical structures must not be
ignored. According to Hoste et al. (2006), the concentration and the structure of the
condensed tannins seem to be two main factors modulating efficacy against nematodes.
Another in vitro test that has been successfully used to evaluate the anthelmintic
effect of tannins is the larval artificial exsheathment assay. However, until now, such an
approach has been barely studied with tropical tanniferous plants (Alonso-Díaz et al. 2008).
The exsheathment of L3 is a key process in the life cycle of trichostrongylid nematodes
because it marks the transition from the free-living to the parasitic stage. Interruption of the
process of sheath loss prevents the establishment of L3 in the host and, consequently, the
infection (Hertzberg et al. 2002). The ability of tannins to bind to proline and hydroxyproline,
proteins present in the sheath of the nematode larvae (Hoste et al. 2006), could explain the
delay or total inhibition of the exsheathment of H. contortus and T. colubriformis after
incubation with tanniferous plant extracts (Bahuaud et al. 2006; Brunet et al. 2007; Alonso-
Díaz et al. 2008). Our results demonstrated that M. urundeuva extracts at 310 mg/mL
completely inhibited H. contortus larval exsheathment. The chemical structure of condensed
tannins present in M. urundeuva could be the main factor modulating the effect of these
metabolites on the exsheathment process because both extracts showed 100% efficacy at the
same concentration even though they have different total tannin contents.
The hypothesis that the tannins present in M. urundeuva extracts are the main
factors responsible for the antiparasitic effect observed against H. contortus was supported by
the results of the experiment performed using PVPP, a synthetic polymer that has the ability
to bind and inactivate tannins. Meanwhile, the partial restoration to control values after PVPP
addition to extracts might be explained by the presence of other plant secondary compounds
disturbing the hatching and exsheathment processes. Sesquiterpene lactones and flavonoid
glycosides (e.g., rutin, narcissin, and nicotiflorin) can also interfere with gastrointestinal
66
nematode biology (Molan et al. 2003b; Barrau et al. 2005). However, considering the extent
of restoration observed after addition of PVPP, the role of tannins appears to be substantial.
The results presented here indicate that M. urundeuva extracts can be used to
control gastrointestinal nematodes of small ruminants. However, toxicological studies and in
vivo efficacy tests must be conducted.
Acknowledgments
The authors would like to thank Banco do Nordeste (BNB) for financial support
and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for a
scholarship. Dr. Bevilaqua has a grant from the Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq).
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69
8 CAPÍTULO 3
Effect of six tropical tanniferous plant extracts on larval exsheathment of Haemonchus
contortus
(Efeito de seis extratos de plantas taniníferas tropicais sobre o desembainhamento larvar de
Haemochus contortus)
Periódico: Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária (Qualis B1), v. 20, n. 2, p. 155-160,
abr-jun, 2011.
70
Resumo
Plantas taniníferas representam uma promissora alternativa de controle dos nematóides
gastrintestinais de pequenos ruminantes. Esse experimento avaliou in vitro os efeitos dos
extratos das folhas e caules de Anadenanthera colubrina, Leucaena leucocephala e Mimosa
tenuiflora sobre o desembainhamento larvar de Haemonchus contortus e verificou o papel dos
taninos nesse processo. Larvas de terceiro estádio de H. contortus foram incubadas com 300
µg/mL de extrato por 3 h e expostas a uma solução de hipoclorito de sódio. O ensaio foi
acompanhado por controles: PBS e polivinilpolipirrolidona (PVPP). O desembainhamento
larvar foi avaliado durante 60 min e os resultados submetidos ao teste Kruskal-Wallis
(p<0,05). Os seis extratos bloquearam o desembainhamento larvar. Após adição de PVPP, um
inibidor de taninos, o percentual de desembainhamento foi similar ao PBS (p>0,05), exceto
nos extratos das folhas de L. leucocephala e M. tenuiflora. Entretanto, a pré-incubação desses
dois extratos com PVPP alterou significativamente o desembainhamento quando comparado
com extratos não tratados (p<0,05). Esses resultados sugerem que A. colubrina, L.
leucocephala e M. tenuiflora podem ser úteis no controle de nematóides gastrintestinais e que
os taninos são provavelmente os principais compostos envolvidos nos efeitos. Contudo,
estudos toxicológicos e in vivo são necessários.
Palavras-chave: In vitro. Taninos. Polivinilpolipirrolidona. Controle de helmintos.
Fitoterápicos.
71
Effect of six tropical tanniferous plant extracts on larval exsheathment of Haemonchus
contortus
(Efeito de seis extratos de plantas taniníferas tropicais sobre o desembainhamento larvar de
Haemochus contortus)
Lorena Mayana Beserra de Oliveira1; Claudia Maria Leal Bevilaqua
1*; Iara Tersia Freitas
Macedo1; Selene Maia de Morais
1; Maria Vivina Barros Monteiro
1; Claudio Cabral
Campello1; Wesley Lyeverton Correia Ribeiro
1; Emanuelle Karine Frota Batista
2
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará -
UECE
2Departamento de Veterinária, Universidade Federal do Piauí - UFPI
*Corresponding author:
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias,
Universidade Estadual do Ceará,
Av Dede Brasil 1700, Campus do Itaperi,
60740–093, Fortaleza, Ceará, Brazil
Tel: +55 85 3101 9853; fax: +55 85 3101 9840
E-mail: [email protected]
72
Abstract
Tanniferous plants represent a promising alternative for controlling gastrointestinal nematodes
of small ruminants. This experiment evaluated the effects of extracts from the leaf and stem of
Anadenanthera colubrina, Leucaena leucocephala and Mimosa tenuiflora on larval
exsheathment of Haemonchus contortus in vitro and verified the role of tannins in this
process. Third-stage larvae of H. contortus were incubated with extracts for 3 h and were
exposed to sodium hypochlorite solution. The extracts were tested at 300 µg.mL-1
and
accompanied by controls: PBS and polyvinyl polypyrrolidone (PVPP). The larval
exsheathment was evaluated for 60 min, and the results were subjected to the Kruskal-Wallis
test (p<0.05). The six extracts blocked larval exsheathment. After PVPP addition, a tannin
inhibitor, the exsheathment percentage was similar to the PBS (p>0.05), except for L.
leucocephala and M. tenuiflora leaf extracts. However, pre-incubation with PVPP of these
two extracts significantly changed larval exsheathment when compared to the non-treated
extracts (P < 0.05). These results suggest that A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora
could be useful in gastrointestinal nematode control and that tannins are probably the main
compounds involved in the observed effects. However, in vivo and toxicological studies
should be conducted.
Keywords: In vitro. Tannins. Polyvinyl polypyrrolidone. Helminth control. Phytotherapics.
Resumo
Plantas taniníferas representam uma promissora alternativa de controle dos nematóides
gastrintestinais de pequenos ruminantes. Esse experimento avaliou in vitro os efeitos dos
extratos das folhas e caules de Anadenanthera colubrina, Leucaena leucocephala e Mimosa
tenuiflora sobre o desembainhamento larvar de Haemonchus contortus e verificou o papel dos
taninos nesse processo. Larvas de terceiro estádio de H. contortus foram incubadas com 300
µg/mL de extrato por 3 h e expostas a uma solução de hipoclorito de sódio. O ensaio foi
acompanhado por controles: PBS e polivinilpolipirrolidona (PVPP). O desembainhamento
larvar foi avaliado durante 60 min e os resultados submetidos ao teste Kruskal-Wallis
(p<0,05). Os seis extratos bloquearam o desembainhamento larvar. Após adição de PVPP, um
inibidor de taninos, o percentual de desembainhamento foi similar ao PBS (p>0,05), exceto
nos extratos das folhas de L. leucocephala e M. tenuiflora. Entretanto, a pré-incubação desses
73
dois extratos com PVPP alterou significativamente o desembainhamento quando comparado
com extratos não-tratados (p<0,05). Esses resultados sugerem que A. colubrina, L.
leucocephala e M. tenuiflora podem ser úteis no controle de nematóides gastrintestinais e que
os taninos são provavelmente os principais compostos envolvidos nos efeitos. Contudo,
estudos toxicológicos e in vivo são necessários.
Palavras-chave: In vitro. Taninos. Polivinilpolipirrolidona. Controle de helmintos.
Fitoterápicos.
Introduction
Gastrointestinal nematode parasitism remains one of the main threats to the
farming of small ruminants in tropical countries. Haemonchus contortus is one of the most
significant species because of its high prevalence and pathogenicity (HOUNZANGBE-
ADOTE et al., 2005). Control of these parasites has been based on the administration of
synthetic anthelmintics. However, the development of populations resistant to all of the drug
families currently available (TORRES-ACOSTA; HOSTE, 2008) and concerns regarding
drug residue in food and in the environment have stimulated the search for alternative control
strategies (ATHANASIADOU et al., 2008).
An alternative for control of gastrointestinal nematode parasites that is being
researched is the use of tanniferous plants. Promising results to keep eggs from hatching, as
well as the development, motility and exsheathment of larvae, have been obtained after
incubation of tannin-rich plant extracts with nematodes (BARRAU et al., 2005; BRUNET et
al., 2007; MOLAN et al., 2010). Reduction of nematode egg excretion and worm burden have
been also recorded in goats and sheep fed with tanniferous plants (MARLEY et al., 2003;
LANGE et al., 2006; HECKENDORN et al., 2007; MINHO et al., 2008; MINHO et al.,
2010). Most studies have focused on forage legumes belonging to the Fabacea family, such as
Hedysarum coronarium, Onobrychis viciifolia, Lotus corniculatus, Lotus pedunculatus and
Lespedeza cuneata (HOSTE et al., 2006). Nevertheless, in many small ruminant production
systems, cultivated forage plants are not the main feed source because browser plants (bushes,
trees or shrubs) contribute significantly to the nutrition of these animals during a prolonged
dry period (MANOLARAKI et al., 2010), which occurs in tropical countries (SANON et al.,
2008).
74
The aim of this study was to evaluate the effect of leaf and stem extracts of
Anadenanthera colubrina, Leucaena leucocephala and Mimosa tenuiflora on the
exsheathment of infective H. contortus larvae in vitro. The role of tannins in this process was
analyzed after polyvinyl polypyrrolidone (PVPP), a tannin inhibitor, was added. These plants
were chosen because of their prevalence in semi-arid regions of Brazil and other tropical
countries; these species are also used in small ruminants’ feed and are tannin-rich (KANANI
et al., 2006; MONTEIRO et al., 2006; RIVERA-ARCE et al., 2007).
Materials and methods
Plant and extract preparation
Aerial parts of A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora were collected in
December 2009 in Fortaleza, State of Ceará, located in northeastern Brazil. Prior to the
beginning of the trial, samples of the plants were identified and authenticated by botanists at
the Herbarium Prisco Bezerra of the Universidade Federal do Ceará, Brazil. A voucher
specimen of each species was deposited under the numbers 46022, 45875 and 46018,
respectively.
A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora extracts were prepared as
described by Barrau et al. (2005). Leaves (150 g) and stems (150 g) of each plant were
separately air-dried at room temperature, crushed to a powder and then mixed with 2 x 900
mL of acetone/water (70:30). The acetone was removed under low pressure using a rotary
evaporator, and the aqueous solution was washed 4 times with 500 mL methylene chloride to
remove chlorophyll and lipids. The remaining fractions, called leaf extract and stem extract of
A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora, were freeze-dried and kept refrigerated at
4°C in airtight containers until use.
Chemical analysis of extracts
The phytochemical test to detect the presence of hydrolyzable or condensed
tannins was performed, following the method described by Matos (2009). The extracts were
diluted in alcohol, three drops of ferric chloride (FeCl3) solution were added and the mixture
was shaken. The formation of a dark blue precipitate indicated the presence of hydrolyzable
tannins, and a green precipitate indicated the presence of condensed tannins. Samples were
compared to a control, e.g., a mixture of water and ferric chloride solution.
75
The content of total phenol was determined using the Folin-Ciocalteu
spectrophotometric method (BONOLI et al., 2004). Briefly, 100 µL of each extract solution
(150 ppm) was shaken for 1 min with 500 µL of Folin-Ciocalteu reagent and 6 mL of distilled
water. Then, 2 mL of 15% sodium carbonate (Na2CO3) was added and the mixture was
shaken again for 30 seconds. The solution was adjusted to 10 mL by adding distilled water.
After 2 h, the absorbance at 750 nm was evaluated using a spectrophotometer. The readings,
with three replicates per sample, were performed with a negative control. The total phenol
content was assessed by plotting the gallic acid calibration curve. For the total tannin content,
100 mg/mL PVPP was used to isolate these metabolites from extract. Then total tannins were
measured as the difference of total phenol before and after treatment with PVPP.
Larval artificial exsheathment assay
To recover H. contortus third-stage larvae (L3), feces were collected directly from
the rectum of an experimentally infected sheep and were processed according to Roberts and
O'Sullivan (1950). The isolated of H. contortus is benzimidazole-resistant and has been
maintained in experimentally infected animals for about five years. The larvae were stored at
4°C. Twenty-four hours before the experiment, 2- to 3-months-old larvae were brought to
25ºC. The viability and proportion of exsheathed larvae were verified under microscope.
The test was performed according to Bahuaud et al. (2006). The extracts were
diluted in phosphate buffer solution (PBS), and the concentration evaluated was 300 µg/mL.
Then, approximately 1,000 ensheathed L3 were incubated for 3 h at 20°C with each extract.
The larvae were washed and centrifuged three times in PBS (pH 7.2). Thereafter, the L3 were
subjected to the process of artificial exsheathment by incubation in a solution of sodium
hypochlorite (2% w/v) diluted 1:300 in PBS and divided in 7 aliquots. The kinetics of larval
exsheathment were monitored under a microscope, and exsheathed larvae were counted at 0,
10, 20, 30, 40, 50 and 60 min after contact with the hypochlorite solution. The identification
and count of ensheathed and exsheathed larvae were realized after the addition of drops of
lugol. PBS was used as a negative control. Six replicates were performed for each extract and
for the control.
Effects of PVPP addition to plant extracts on larval exsheathment
To evaluate the role of tannins in the assay, PVPP, a specific inhibitor of tannins,
was added to leaf and stem extracts of A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora. PVPP
is capable of forming bonds with tannins and can precipitate them from solutions.
76
Comparisons of the results obtained with extracts with or without PVPP confirmed the
involvement of these metabolites. Each extract was pre-incubated overnight with 50 mg/mL
PVPP (ALONSO-DÍAZ et al., 2008a; 2008b) and then tested as previously described. A
negative control with PBS was included in the test.
Statistical analysis
The percentage of larval exsheathment in each treatment was determined by the
formula: number of exsheathed L3 / (number of ensheathed L3 + number of exsheathed L3) x
100. Data were initially subjected to the Shapiro-Wilk and Bartellet tests to confirm the
normality of distribution and the homogeneity of variance between treatments, respectively.
Even after data transformation, there was no homoscedasticity; then, the Kruskal-Wallis test
(p<0.05) was applied using SAS (2002). Data were expressed as mean ± standard error (S.E.).
Results
Chemical analysis of extracts
The yields of A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora leaf extracts, after
lyophilization, were 9, 8 and 11%, respectively, whereas the stem extract yields were 11, 13
and 17%, respectively. In all extracts, the presence of condensed tannins was detected. Table
1 shows the total phenols and tannins of the extracts.
Table 1 - Total phenol and tannin contents of leaf and stem extracts of Anadenanthera
colubrina, Leucaena leucocephala and Mimosa tenuiflora.
Plant Total phenols Total tannins
Anadenanthera colubrina
Leaf extract 48.23 40.68
Stem extract 99.58 78.44
Leucaena leucocephala
Leaf extract 58.81 45.21
Stem extract 37.66 24.07
Mimosa tenuiflora
Leaf extract 78.73 30.13
Stem extract 147.91 138.85
Results expressed as mg gallic acid per g of extract
77
Larval artificial exsheathment assay
Figures 1, 2 and 3 demonstrate the results of the larval artificial exsheathment
assay. In the negative control, >99% of H. contortus L3 were exsheathed 60 min after contact
with the sodium hypochlorite solution. Moreover, 3 h of contact with the leaf and stem
extracts of A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora completely inhibited the process,
as almost all of the larvae were ensheathed and the percentage obtained was different from the
PBS (p<0.05).
Figure 1 - Effect of leaf extract (a) and stem extract (b) of Anadenanthera colubrina, with or
without addition of PVPP, on the artificial in vitro exsheathment of Haemonchus contortus
third-stage larvae.
78
Figure 2 - Effect of leaf extract (a) and stem extract (b) of Leucaena leucocephala, with or
without addition of PVPP, on the artificial in vitro exsheathment of Haemonchus contortus
third-stage larvae.
79
Figure 3 - Effect of leaf extract (a) and stem extract (b) of Mimosa tenuiflora, with or without
addition of PVPP, on the artificial in vitro exsheathment of Haemonchus contortus third-stage
larvae.
Effects of PVPP addition to plant extracts on the larval exsheathment
Pre-incubation of A. colubrina leaf and stem extracts with PVPP completely
reversed the inhibitory effect on larval exsheathment; 60 min after the addition of sodium
hypochlorite solution, the percentage obtained was similar to negative control (p>0.05)
(Figures 1a and 1b).
After the addition of PVPP to L. leucocephala and M. tenuiflora leaf extracts, the
percentage of H. contortus larval exsheathment obtained 60 min after the addition of sodium
hypochlorite solution was 92.27% and 84.50%, respectively. This change was significant
80
when compared with extracts not treated with PVPP (p<0.05). However, the results remained
significantly different from the negative control values (p<0.05) (Figures 2a and 3a). Pre-
incubation of L. leucocephala and M. tenuiflora stem extracts with PVPP completely
reversed the inhibitory effect, as there were no significant differences when compared to the
results obtained with PBS (p>0.05) (Figures 2b and 3b).
Discussion
The main objective of this study was to demonstrate in vitro that A. colubrina, L.
leucocephala and M. tenuiflora extracts inhibited H. contortus larval exsheathment.
Leguminosae is the third largest family of angiosperms, comprising 650 genera and about
18,000 species, including three subfamilies: Caesalpinioideae, Mimosoideae and
Papilionoideae (BOUCHENAK-KHELLADI et al., 2010). Most studies have been conducted
with species of the Papilionoideae subfamily, whereas the Mimosoideae subfamily has not
been well studied. This study was the first to evaluate the antiparasitic effects of A. colubrina
and M. tenuiflora. With respect to L. leucocephala, the results obtained confirm those
demonstrated by Alonso-Díaz et al. (2008b). These authors demonstrated 90% efficacy on H.
contortus larval exsheathment using 1,200 µg/mL of L. leucocephala leaf extract, while this
study obtained 100% efficiency on larval exsheathment using 300 µg/mL. This difference
could be attributed to the plant chemical composition. Genetic factors, climate, soil, harvest
time and solar radiation can influence the composition and concentration of secondary
metabolites (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
The second objective of this study was to determine if tannins have an important
role in the antiparasitic activity of A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora on H.
contortus larvae. Condensed tannins are likely the main substances involved in the
antiparasitic activity of these plants because the addition of ferric chloride solution during
phytochemical analysis produced a green precipitate, indicating the predominance of these
metabolites. Two hypotheses, based on the direct and indirect effects of tannins, have been
proposed to explain their antiparasitic effect. However, the exact mechanisms of action of
these metabolites remain obscure and could differ depending on the parasite, its stage of
development and possibly, the biochemical characteristics of the forage species (HOSTE et
al., 2006).
The fact that tanniferous plant extracts demonstrated activity against nematodes in
vitro supports the hypothesis of a direct effect for tannins. The assay conducted in this study
81
has been routinely used in other experiments. Bahuaud et al. (2006), Brunet et al. (2007),
Alonso-Díaz et al. (2008a) and Alonso-Díaz et al. (2008b) found retardation or inhibition of
H. contortus and Trichostrongylus colubriformis larval exsheathment after incubation with
tanniferous plant extracts. The assumption is that condensed tannins complex with the sheath
proteins of nematodes, which have high proline content and prevent exsheathment (BRUNET
et al., 2007).
A relationship between the total phenol and tannin contents and effectiveness of
A. colubrina, L. leucocephala and M. tenuiflora extracts on H. contortus larval exsheathment
could not be established because the results were similar for different concentrations of these
metabolites. This observation supports the hypothesis that the chemical structure of
condensed tannins is one of the factors modulating their antiparasitic efficacy (HOSTE et al.,
2006). In vitro experiments showed that prodelphinidin monomers and flavan-3-ol gallates
were more active on the egg hatching, larvae motility and exsheathment of H. contortus,
Teladorsagia circumcincta, T. colubriformis than procyanidins monomers and flavan-3-ol
(MOLAN et al., 2003; BRUNET; HOSTE, 2006).
The supposition that the tannins in A. colubrina, L. leucocephala and M.
tenuiflora extracts are primarily responsible for H. contortus larval exsheathment inhibition
was confirmed by pre-incubation of extracts with PVPP, a synthetic polymer that has the
ability to bind tannins and to inactivate their biological properties. Although the addition of
this polymer to some plant extracts did not result in obtaining values similar to PBS, the
substantial restoration observed indicates an involvement of tannins in this process. However,
the action of other secondary metabolites should not be discarded. Barrau et al. (2005)
showed that flavonoid glycosides could also interfere with the biology of H. contortus and
emphasized the similarity between the chemical structures of tannins and flavonoids
glycosides, suggesting a similar or close mechanism of action for both types of compounds.
The results of this study indicate that A. colubrina, L. leucocephala and M.
tenuiflora extracts can be used to control gastrointestinal nematodes of small ruminants.
However, in vivo studies should be conducted to evaluate the toxicity and anthelmintic
activity of these plants.
Acknowledgments
The authors would like to thank Banco do Nordeste (BNB) for financial support
and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for a
82
scholarship. Dr. Bevilaqua has a grant from the Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq).
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85
9 CAPÍTULO 4
Effects of Mimosa tenuiflora on larval establishment of Haemonchus contortus in sheep
(Efeitos de Mimosa tenuiflora sobre o estabelecimento larvar de Haemonchus contortus em
ovinos)
Periódico: Veterinary Parasitology (Qualis A1). Submetido em outubro de 2012.
86
Resumo
A resistência anti-helmíntica tem limitado o controle dos nematóides gastrintestinais de
pequenos ruminantes e tem consequentemente incentivado o interesse pelo estudo das plantas
taniníferas como fonte de anti-helmínticos. Esse trabalho foi desenvolvido para avaliar o
efeito da ingestão de Mimosa tenuiflora, uma planta taninífera que é utilizada na alimentação
de pequenos ruminantes no nordeste do Brasil, sobre o estabelecimento larvar de Haemonchus
contortus em ovinos. Nesse experimento, 18 ovinos livres de nematóides gastrintestinais
foram divididos em três grupos (n=6) de acordo com o peso. O grupo 1 foi alimentado com as
folhas de M. tenuiflora; o grupo 2 foi alimentado com os caules de M. tenuiflora; o grupo 3
funcionou como grupo controle e foi alimentado com feno de Cynodon dactylon, uma planta
com baixa concentração de taninos.Os animais consumiram as plantas durante 13 dias (Dia -7
ao Dia 5). No Dia 0, os ovinos foram infectados experimentalmente com 4.500 L3 de
Haemonchus contortus cada. Cinco dias após a infecção (Dia 5), os ovinos foram sacrificados
para contagem da carga parasitária e análise histológcia do abomaso. A ingestão diária das
plantas e o ganho de peso vivo dos animais foram registrados. Os grupos que ingeriram as
folhas e os caules de M. tenuiflora consumiram menos matéria seca do que aqueles que
ingeriram C. dactylon (p<0,05). O consumo das folhas de M. tenuiflora não reduziu o
estabelecimento das L3 de H. contortus quando comparado com o controle (p>0,05). A
ingestão dos caules de M. tenuiflora mostrou uma tendência em diminuir o estabelecimento
larvar, mas a redução não foi significativa (p>0,05). Não foram observadas diferenças na
análise histológica e no ganho de peso entre os grupos. Esses dados demonstram que de
acordo com o protocolo utilizado, M. tenuiflora não apresentou efeito sobre o estabelecimento
larvar de H. contortus em ovinos.
Palavras-chaves: Taninos. Haemonchus contortus. Pequenos ruminantes.
87
Effects of Mimosa tenuiflora on larval establishment of Haemonchus contortus in sheep
Lorena Mayana Beserra de Oliveiraa, Iara Tersia Freitas Macedo, Luiz da Silva Vieira, Ana
Lourdes Fernandes Camurça-Vasconcelosa, Adriana Rocha Tomé
a, Rafaele Almeida
Sampaioa, Helder Louvandini
c, Claudia Maria Leal Bevilaqua
a
aPrograma de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará,
Brazil
bEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária/Caprinos e Ovinos, Brazil
cCentro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Brazil
*Corresponding author at:
Av. Dede Brasil, 1700, Campus do Itaperi
Fortaleza, Ceará, Brazil
CEP 60740-093
Tel: +55 85 3101 9853; fax: +55 85 3101 9840
E-mail address: [email protected] (C.M.L. Bevilaqua)
88
Abstract
Anthelmintic resistance has limited the ability to control the gastrointestinal nematodes of
small ruminants and has therefore awakened an interest in the study of tanniferous plants as a
source of anthelmintics. This work was carried out to evaluate the effect of Mimosa tenuiflora
intake, a tanniferous plant that is fed to small ruminants in northeastern Brazil, on the larval
establishment of Haemonchus contortus in sheep. In this experiment, 18 nematode-free sheep
were divided into three groups (n=6) according to live weight. Group 1 was fed M. tenuiflora
leaves; Group 2 was fed M. tenuiflora stems; Group 3 served as the control group and was fed
Cynodon dactylon, a plant with low levels of tannins. The animals consumed the plants for 13
days (Day -7 to Day 5). On Day 0, the sheep were experimentally infected with 4,500 third-
stage Haemonchus contortus each. Five days after infection (Day 5), the sheep were
slaughtered to count the worm burden and perform a histological analysis of the abomasum.
The daily plant intake and the live weight gain of the animals were recorded. The groups that
ingested M. tenuiflora leaves and stems consumed less dry matter than did those that ingested
C. dactylon (P<0.05). The consumption of M. tenuiflora leaves did not reduce the L3
establishment of H. contortus compared to the control (P>0.05). The intake of M. tenuiflora
stems tended toward decreasing larval establishment, but the reduction was not significant
(P>0.05). No significant differences were observed in the mucosal cellular response and live
weight gain among the groups. These data demonstrated that, with the protocol used, M.
tenuiflora has no effect on larval establishment of H. contortus in sheep.
Keywords: Anthelmintic. In vivo. Tannins. Gastrointestinal nematodes
Introduction
Gastrointestinal nematode parasitism remains one of the main threats to the farming
of small ruminants in tropical countries. Haemonchus contortus is one of the most significant
species because of its high prevalence and pathogenicity (Hounzangbe-Adote et al., 2005).
Control of these parasites has depended on the administration of synthetic anthelmintics.
However, the development of drug-resistant populations to most of the drug families currently
used (Torres-Acosta and Hoste, 2008) and concerns regarding drug residues in food and in the
environment have stimulated the search for alternative control strategies (Athanasiadou et al.,
2008).
89
An alternative for the control of gastrointestinal nematodes that is currently being
researched is the use of bioactive plants that are rich in secondary metabolites. For example,
many such bioactive plants with activity against nematodes are rich in polyphenols,
particularly tannins (Hoste et al., 2012). Tanniferous plants lead to a reduction of nematode
egg excretion or worm burden (Lange et al., 2006; Heckendorn et al., 2007; Minho et al.,
2010; Martínez-Ortíz-de-Montellano et al., 2010) and a reduction of infective larvae
establishment (Brunet et al., 2008; Joshi et al., 2011) in sheep and goats. However, most
studies have focused on legume forage that is adapted to temperate and/or Mediterranean
climatic conditions, such as plants belonging to the Fabaceae family: Hedysarum coronarium,
Onobrychis viciifolia, Lotus corniculatus and Lotus pedunculatus (Hoste et al., 2006).
However, in many small ruminant production systems, cultivated forage plants are not the
main source of food because browser plants (bushes, trees or shrubs) contribute significantly
to the nutrition of these animals during the prolonged dry periods (Manolaraki et al., 2010)
that occur in tropical countries (Sanon et al., 2008).
Mimosa tenuiflora (Leguminosae) is a tree known in Brazil under the popular
name of jurema-preta. The plant is distributed in areas of tropical deciduous forests in the
Americas, from the southeastern regions of Mexico to northern Brazil and Venezuela,
growing as secondary opportunistic vegetation (Camargo, 2000). This species has a high level
of tannins and is used in the feed of small ruminants (Guimarães-Beelen et al., 2007; Rivera-
Arce et al., 2007). A previous study demonstrated the in vitro activity of leaf and stem
extracts of M. tenuiflora on H. contortus using a larval artificial exsheathment assay. The role
of tannins in this assay was confirmed because the values were similar to those of the control
after the addition of a specific metabolite inhibitor, polyvinyl polypyrrolidone (PVPP)
(Oliveira et al., 2011). Nevertheless, the in vivo anthelmintic activity of M. tenuiflora was not
evaluated. Therefore, the present study was conducted to evaluate the effect of leaves and
stems of M. tenuiflora on the larval establishment of H. contortus in sheep.
Materials and methods
Plants
The aerial parts of M. tenuiflora were collected in December 2011 in Sobral, State
of Ceará, located in northeastern Brazil. Prior to the beginning of the trial, samples of the
plant were identified and authenticated by botanists at the Herbarium Prisco Bezerra of the
Universidade Federal do Ceará, Brazil. A voucher specimen was deposited under the number
90
50288. The aerial parts of Cynodon dactylon were commercially acquired. This vegetal
species contains low levels of tannins and was used as a control.
Nematode infective larvae
Third-stage larvae (L3) of H. contortus were obtained from donor sheep harboring
a monospecific infection. The isolated of H. contortus was benzimidazole-resistant. The
larvae were stored at 4°C until use. A single batch of 2- to 3-month-old larvae was used in the
experiment. Twenty-four hours before the experimental infection, the L3 were brought to
room temperature. The viability and proportion of exsheathed larvae were verified.
Animals
Eighteen female lambs of undefined breed, which were approximately 2 months
old and had an average weight of 16 kg, were kept indoors in individual floored pens and fed
with Cynodon dactylon hay, mineral salt and water ad libitum and concentrated feed (30 g/kg
live weight). The concentrated feed was obtained commercially. It contained maize grain,
soybean meal, sugar cane molasses, wheat bran and a mineral mix. The protein level of the
concentrate was 200 g/kg. The animals received three anthelmintics with different active
ingredients on alternate days to eliminate any natural gastrointestinal nematode infection. The
anthelmintics used were oxfendazole (Systamex®, Schering-Plough, Brazil, 5 mg/kg live
weight), levamisole (Ripercol®, Fort Dodge, Brazil, 5 mg/kg live weight) and ivermectin
(Ivomec®, Merial, Brazil, 0.2 mg/kg live weight). The withholding period of these
anthelmintics is less than 15 days. Fifteen days after treatment, fecal samples from each
animal were collected directly from the rectum to determinate fecal egg counts by McMaster
technique (Ueno and Gonçalves, 1998). Coprocultures were performed with feces using
Roberts and O’Sullivan (1950) method to confirm their worm-free status.
Experimental design
The study was based on the method described by Brunet et al. (2008). Sheep were
divided into three homogeneous groups (n=6) based on their live weight. The experiment was
carried out for 13 days (Day -7 to Day 5). From Day -7 onwards, Group 1 received fresh
leaves of M. tenuiflora; Group 2 received fresh stems of M. tenuiflora and Group 3 (control)
received C. dactylon hay. On Day 0, all of the sheep were experimentally infected with 4,500
H. contortus L3. Five days after infection (Day 5), the animals were sacrificed. The
91
proceedings of this study were approved by the ethics committee of the Universidade Estadual
do Ceará and registered under the number 09657330-9/02.
Plant administration, feed intake and live weight
The daily portions of M. tenuiflora were harvested early each morning. Fresh
leaves and stems of the plant were separated, crushed in machine forage, mixed to obtain a
homogeneous distribution of the metabolites, individually weighed before administration and
offered to the sheep ad libitum. The leftover feed was measured daily. Therefore, the daily
plant intake was known for each individual sheep and was used to estimate the consumption
of each group. The same protocol was performed for the C. dactylon hay. In addition, the live
weight of each animal was recorded on the first (Day -7) and last (Day 5) days of the
experiment to estimate the live weight gain.
Plant analysis
From Day 0 to Day 5, samples of the M. tenuiflora and C. dactylon that were
offered daily to the sheep were collected for chemical analysis. The samples were dried
separately at 50°C for 72 h, and pooled samples of each plant were obtained by mixing the
same proportion of the daily dried samples. The dry matter (DM), crude protein (CP), fat
content, ash, neutral detergent fibers (NDF), acid detergent fibers (ADF) and lignin were
determined according to AOAC procedures (1980).
The total phenol (TP) and total tannin (TT) contents were determined using the
Folin-Ciocalteu spectrophotometric method (Makkar, 2003). After the initial measurements of
TP, PVPP was added and then TT was calculated as the difference between TP measured with
or without the addition of PVPP. A tannic acid standard curve was plotted and the results
were expressed as tannic acid equivalents. The condensed tannin (CT) was measured using
the butanol-HCl assay (Makkar, 2003). A leucocyanidin standard curve was plotted and the
results were expressed as leucocyanidin equivalents.
Parasitological and histological analysis
The sheep were humanely sacrificed, complying with the local regulations on
animal welfare. At necropsy, the digestive tract of each sheep was collected immediately. The
abomasum was rapidly separated by double ligatures, opened at the major curvature and
washed to recover the larvae in the luminal contents. In addition, the mucosa was submitted to
incubation in a pepsin solution at 37°C. The total number of larvae was estimated from a 10%
92
aliquot of the luminal contents and a 10% aliquot of the mucosal digestion. The larvae
observed were late L3 and early fourth-stage larvae.
At necropsy, fragments of the abomasum were collected to determine the number
of eosinophils and lymphocytes. The mucosal samples were fixed in 10% buffered formalin,
embedded in paraffin and sectioned. The sections were then stained with hematoxylin-eosin.
The mean cell density for each cellular type was obtained from counts of 10 histological fields
that were randomly selected. The results were expressed as the mean number of cells per mm2
of mucosa.
Statistical analysis
Data on the plant consumption were subjected to analysis of variance (ANOVA)
and compared using the Tukey test (P<0.05). The rate of larval establishment was calculated
as the total number of larvae recovered at necropsy divided by the total number of L3 given
and multiplied by 100. The data on the worm burden and on the rate of larval establishment
were compared among the groups using the non-parametric Kruskal-Wallis test (P<0.05). The
comparisons regarding the histological data and live weight were performed using ANOVA
and the Bonferroni test (P<0.05). All of the data were analyzed using the GraphPad Prism 5.0
program by GraphPad Software (www.graphpad.com). No statistical analyses were performed
on the agronomical and analytical parameters of the plants, as these measurements were only
used to describe the forage.
Results
Plants analysis
The results of the bromatological analysis are provided in Table 1. Table 2
describes the TP, TT and CT contents. M. tenuiflora presented higher levels of TP, TT and
CT than did C. dactylon. The TP, TT and CT ratios between the leaves of M. tenuiflora and
C. dactylon were 10.32, 11.75 and 65.2-fold, respectively. Meanwhile, the ratios between the
stems of M. tenuiflora and C. dactylon were 6.79, 9.84 and 58.45-fold, respectively. The
ratios between the leaves and stems of M. tenuiflora were 1.51, 1.19 and 1.11-fold,
respectively.
93
Table 1 - Bromatological compositions of Mimosa tenuiflora and Cynodon dactylon.
Leaves of
Mimosa tenuiflora
Stems of
Mimosa tenuiflora
Cynodon dactylon
hay
Dry matter 41.90 59.90 96.05
Crude protein 15.05 3.77 6.90
Fat content 7.46 1.47 2.23
Ash 4.61 2.03 8.29
Neutral detergent fiber 38.63 75.83 71.51
Acid detergent fiber 23.44 60.15 36.19
Lignin 9.94 17.68 4.51
Results expressed as g/kg dry matter.
Table 2 - Total phenol, total tannin and condensed tannin contents of Mimosa
tenuiflora and Cynodon dactylon.
Leaves of
Mimosa tenuiflora
Stems of
Mimosa tenuiflora
Cynodon dactylon
hay
Total phenolsa 99.29 65.37 9.62
Total tanninsa 65.57 54.93 5.58
Condensed
tanninsb
34.56 30.98 0.53
aResults expressed as g tannic acid eq./kg dry matter.
bResults expressed as g leucocyanidin eq./kg dry matter.
Feed intake and live weight
During the experiment, the sheep from Groups 1 and 2 (leaves and stems of M.
tenuiflora) consumed significantly lower quantities of dry matter (average of 267.9 ± 30.1 g
and 248.2 ± 23.3 g/day, respectively) relative to those consumed by the control group
(average of 335.2 ± 32.2 g/day). The dry matter intake of Groups 1 and 2 was reduced by
20.1% and 25.9% compared to control-fed sheep. With respect to the intake of CT, the
chemical analyses and the consumption of dry matter indicated that the sheep of Groups 1 and
2 consumed an average of 0.5 g and 0.4 g CT/kg live weight/day, respectively, whereas those
of Group 3 consumed an average of 0.01 g CT/kg live weight/day.
On the first day of the experiment (Day -7), the mean live weights of the sheep
from Groups 1, 2 and 3 were 17.4 ± 5.1 kg, 16.9 ± 4.4 kg and 18.4 ± 3.6 kg, respectively. On
94
the last day of the experiment (Day 5), the mean live weights were 18.5 ± 4.0 kg, 18.6 ± 4.1
kg and 21.2 ± 3.1 kg, respectively. No significant differences were observed in the live weight
gain among the groups (P=0.082).
Parasitological and histological analysis
The effect of the leaves and stems of M. tenuiflora on the larval establishment of
H. contortus in sheep is shown in Table 3. The intake of leaves of M. tenuiflora did not
reduce the larval establishment rate, as the worm burden was similar to that of the control
group (P=0.297). The intake of stems of M. tenuiflora caused a tendency toward a decrease in
the larval establishment rate (27.9%); however, the reduction was not significantly different,
and the worm burden was similar to that of the control group (P=0.386).
Table 3 - Individual worm burdens, mean worm burdens ± S.D. and larval establishment rates (%) ± S.D.
of Haemonchus contortus in sheep after intake of Mimosa tenuiflora or Cynodon dactylon.
Leaves of
Mimosa tenuiflora
Stems of
Mimosa tenuiflora
Cynodon dactylon
hay
Individual worm burdens
Mean worm burdens ± S.D.
133
156
166
173
182
188
166.3 ± 19.8a
88
105
108
110
126
177
119.0 ± 30.8a
116
120
145
150
224
236
165.2 ± 52.1a
Larval establishment rates (%) ± S.D. 3.6 ± 0.4a 2.6 ± 0.6
a 3.6 ± 1.1
a
Small letters compare the means between columns. Different letters indicate significant differences (P<0.05).
Regarding the cell counts in the abomasal mucosa, no significant differences were
observed in the number of eosinophils and lymphocytes among the experimental groups (Fig.
1).
95
Figure 1 - Mean levels of eosinophils and lymphocytes ± S.D. in the mucosa of
sheep abomasum after intake of Mimosa tenuiflora or Cynodon dactylon.
Discussion
This work was carried out to identify a bioactive plant that could be used to help
control gastrointestinal nematodes in small ruminants. In particular, interest has turned to
tannin-rich plants, whose negative effects on gastrointestinal nematodes have been supported
by relatively consistent experimental results (Hoste et al., 2012). The possible antiparasitic
role of tannins has been supported by most in vitro assays and has usually been confirmed by
the results of in vivo tests. These studies with tanniferous plants have been performed in two
ways: administering the plant extracts to animals as a drench or feeding animals with the plant
as a nutraceutical (Alonso-Diáz et al., 2010). The main effect of tanniferous plants is probably
on larval establishment when incoming larvae are ingested and have contact with a tannin-rich
environment in the digestive tract (Hoste et al., 2006). Unlike tannin-rich plants some
conventional anthelmintics act primarily on adults and have a lowered efficacy against larval
stages.
Leguminosae is the third largest family of angiosperms, comprising 650 genera
and approximately 18,000 species, including three subfamilies: Caesalpinioideae,
Mimosoideae and Papilionoideae (Bouchenak-Khelladi et al., 2010). Most studies have
examined the species of the Papilionoideae subfamily, whereas the Mimosoideae subfamily
has not been well studied. M. tenuiflora was selected because of its local availability, high
tannin content, voluntary consumption by small ruminants and in vitro efficacy against H.
contortus. Therefore, to follow up on the in vitro anthelmintic effects of M. tenuiflora, this in
0
1
2
3
4
5
6
7
Eosinophils Lymphocytes
Cel
ls/m
m2
Type of cell
Mimosa tenuiflora (Leaves)
Mimosa tenuiflora (Stems)
Cynodon dactylon hay
96
vivo test was carried out to confirm or refute its activity. For example, Lysiloma latisiliquum,
a tropical tanniferous plant, exhibited in vitro reduction of the larval exsheathment of H.
contortus (Alonso-Diáz et al., 2008). An in vivo test then confirmed its activity on L3
establishment of H. contortus in goats (Brunet et al., 2008). The exsheathment of L3 is a key
process in the life cycle of trichostrongylid nematodes because it marks the transition from the
free-living to the parasitic stage. Interrupting the process of sheath loss prevents the
establishment of L3 in the host and consequently blocks the infection (Hertzberg et al., 2002).
Although the exact mechanism of tannins on L3 establishment remain unknown, the
assumption is that condensed tannins complex with the sheath proteins of nematodes, and
their high proline content prevents exsheathment (Brunet et al., 2007) and therefore larval
establishment. This hypothesis suggests a direct mode of action due to interactions between
the plant metabolites and the nematode structures (Hoste et al., 2012). However, the effect of
tannins on improving the immune response of the host cannot be ruled out. Therefore, the
indirect effect of these secondary metabolites was also evaluated in this study.
In the present experiment, the intake of leaves or stems of M. tenuiflora did not
significantly reduce the establishment of H. contortus infective larvae in sheep, refuting the
anthelmintic effect observed in the previous in vitro study. Leaf and stem extracts of M.
tenuiflora totally blocked larval exsheathment of H. contortus (Oliveira et al., 2011). A
number of factors can explain this discrepancy between the in vitro and in vivo results. One
possible explanation could be the applied chemical composition of the plants. Genetic factors,
climate, soil, harvest time and solar radiation can influence the composition and concentration
of secondary metabolites (Gobbo-Neto and Lopes, 2007). The concentration and structure of
the condensed tannins could modulate their antiparasitic efficacy (Hoste et al., 2012). The
influence of the tannin concentration was confirmed in studies performed in vitro and in vitro.
The dose-dependent effect of extracts rich in tannins was demonstrated on egg hatching,
larval motility and the exsheathment of nematodes (Molan et al., 2003; Alonso-Diáz et al.,
2008). Moreover, this effect was confirmed in experimental studies performed either in sheep
or goats receiving various levels of tanniferous plants (Athanasiadou et al., 2001; Terrill et al.,
2009). However, the diversity of methods used to measure tannins in plants can sometimes
make comparisons among studies difficult (Hoste et al., 2012). As previously mentioned, the
structure of condensed tannins can also influence their anthelmintic efficacy (Molan et al.,
2003; Brunet and Hoste, 2006). The host species could also justify the discrepancy in the
results. In certain host species (e.g., goat or deer vs. sheep or cow), the presence of tannin-
binding salivary proteins might not only reduce the potential negative effects of tannins but
97
also affect the anthelmintic properties by increasing the level of activity of these metabolites
relative to their concentration (Hoste et al., 2012). Moreover, according to Hoste et al. (2012),
the nutraceutical effects of plants are usually achieved following relatively long-term
consumption. The evidence behind a long-term feed and the consequent antiparasitic effect
was confirmed in studies performed either in sheep or goats receiving plants rich in tannins
(Athanasiadou et al., 2005; Akkari et al., 2008). The short-term consumption that was carried
out in this experiment could be responsible for the lack of an antiparasitic effect of M.
tenuiflora. In addition, the diet was available ad libitum to the sheep. This type of availability
increases the flow rates of digesta (Grovum and Hecker, 1973), which reduces the retention
time of the CT in the digestive tract and renders them less effective against parasites (Dawson
et al., 2011). Increased food intake has also been considered responsible for the reduced
efficacy of anthelmintic drugs in sheep due to an increased digesta passage rate (Ali and
Hennessy, 1995).
Despite the lack of an effect from M. tenuiflora on the establishment of nematode
L3 in this experiment, its utilization for small ruminant farming should not be discarded. This
plant can be used in situations of feed scarcity, for example, during dry periods. Although the
differences in live weight between the groups were remarkable, these differences were not
reflected by significant differences in the live weight gain between the feeding groups.
However, studies should be conducted to evaluate the toxicity of this plant after more long-
term of treatment. Further tests to evaluate the anthelmintic activity of M. tenuiflora in more
long-term courses of treatment or extract administration should be considered before
discarding this plant as a possible alternative for nematode gastrointestinal control in small
ruminants.
Acknowledgements
This study received the financial support from Banco do Nordeste (BNB),
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). The authors would like to
thank Helena Araújo da Ponte and Felipe Cavalcante Machado of EMBRAPA/CNPC for their
assistance.
98
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102
10 CONCLUSÕES
De acordo com o protocolo in vitro utilizado nesse estudo, os extratos das folhas e
dos caules de M. urundeuva apresentaram efeito dose-dependente sobre a eclosão de ovos de
H.contortus, enquanto que os extratos das folhas e dos caules de A. colubrina, L.
leucocephala, M. tenuiflora e M. urundeuva inibiram o desembainhamento larvar desse
nematóide. Entretanto, a avaliação in vivo demonstrou que as folhas e os caules de M.
tenuiflora não possuem efeito sobre o estabelecimento larvar de H. contortus em ovinos.
103
11 PERSPECTIVAS
Embora M. tenuiflora não tenha reduzido o estabelecimento larvar de H. contortus
em ovinos, a utilização dessa planta taninífera na ovinocaprinocultura não deve ser
descartada. Portanto, estudos para avaliar a eficácia anti-helmíntica de M. tenuiflora após um
maior período experimental ou após a administração de seus extratos devem ser realizados.
Outros estudos devem ser conduzidos para avaliar o efeito dessa planta sobre nematóides
adultos.
104
12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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