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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

STHENIA SANTOS ALBANO AMÓRA

VIGILÂNCIA ENTOMOLÓGICA E CONTROLE BIOLÓGICO DE Lutzomyia longipalpis NA CIDADE DE MOSSORÓ, RIO GRANDE DO NORTE

FORTALEZA 2009

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STHENIA SANTOS ALBANO AMÓRA

VIGILÂNCIA ENTOMOLÓGICA E CONTROLE BIOLÓGICO DE Lutzomyia longipalpis NA CIDADE DE MOSSORÓ, RIO GRANDE DO NORTE

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Carnívoros, Onívoros e Aves. Orientadora: Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua.

FORTALEZA 2009

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AGRADECIMENTOS

Ø A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao PPGCV da

UECE, por ter fornecido viabilidade para o desenvolvimento desse trabalho e pela atenção.

Ø Obrigada, “Senhor”! Desde o início dessa caminhada tu estiveste comigo... E agora que

alcancei meu objetivo, venho te louvar, te agradecer e oferecer humildemente o amor, a

felicidade e enfim, a vitória deste momento.

Ø Agradeço por ter me iluminado ao longo dessa jornada que se encerra e, diante de tanto amor,

é que rogo “Mãe Santíssima”, que olhe por mim na nova etapa que se inicia.

Ø Aos meus pais, Stheno Batista Albano Amóra e Solange Santos Albano Amóra, tesouro da

minha, a vocês devo minha existência e toda força que tenho para superar os obstáculos e

correr atrás dos meus sonhos. Não consigo mensurar nem descrever o quanto vocês são

importantes pra mim. Amo vocês com toda pureza da minha alma!

Ø A minha orientadora Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua. A Senhora antes de tudo

acreditou em mim, se interessou, se responsabilizou e trabalhou comigo com afinco... Apoiou

minhas decisões e vibrou com minhas vitórias. A Senhora dedico meu carinho,

reconhecimento, respeito, admiração e gratidão. Como sentirei sua falta...

Ø Minha grande amiga Profa. Dra. Nilza Dutra Alves. Tenho certeza que jamais deixarei de ser

sua discípula. A discípula que guardará na memória os seus ensinamentos, sua força,

determinação e ética; E no coração guardarei a gratidão, o respeito e infinito afeto. As

batalhas que você travou por mim e as vitórias que tivemos são impagáveis, mas como

amizade não se paga só tenho a lhe agradecer... Por ter confiado em mim, acreditado no meu

potencial e assumido todos os riscos apenas pelo desejo de me ver vencer. Obrigada por tudo!

Ø Ao meu namorado, Júlio César dos Reis Saraiva, amigo, companheiro e incentivador. Devo a

você muito de tudo que venho conquistando nesses seis anos de jornada, você sempre esteve

presente nos momentos mais difíceis e me mostrou do que eu sou capaz. Estar ao seu lado em

mais essa conquista é muito bom e acredito que não será a última... Muitas conquistas ainda

nos espera... Obrigada por tudo. Te amo!

Ø À minha família de São Paulo, Recife e de Mossoró. Em especial à minha madrinha – Rosa

Santos Radicchi, minha priminha Thatiane Santos Radicchi (saudades de vocês) e meus

primos Robson/Elaine Alves Santana. Obrigada por acreditarem em mim, por vibrar com

minhas vitórias e se indignar com as injustiças.

Ø À minha família por opção, minhas filhinhas, Márcia Viviane Alves Saraiva e Maria Luciana

Lira de Andrade. O dia-a-dia tem poder transformador... O colega torna-se amigo, torna-se

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companheiro, afinidades se apresentam, laços se formam... Hoje, temos um pouco da outra em

cada uma de nós... E por tudo e de tudo, a saudade há de ficar. Amo vocês, obrigada por me

tornar uma pessoa mais sensível, mais bonita e mais “convivível”! E como não falar dos seus

maridos, Vando Santiago de Sousa e Edilson Lopes Júnior, pessoas adoráveis... Não só por

fazê-las felizes, o que já é um grande motivo pra eu gostar deles, mas também por todo

carinho, respeito e consideração que sempre tiveram por mim.

Ø As minhas amigas/irmãs de longa data Ediane Fernandes de Almeida, Gabriela Medeiros

Gabriel, Kênia Suênia M. Araújo, Andressa Luara J. Rosado e Thalita Queiroz. E as amigas

mais recentes, mas não menos queridas, Maíra Aparecida Araújo, Romeika Hermínia M. A.

Pereira e Mariana Machado Matos. Por sempre me lembrar o que sou e de tudo que sou

capaz... Por zelar por mim, se preocupar, compartilhar, vibrar com minhas vitórias e me

encorajar nas derrotas. Amo vocês e sinto muita, muita saudades!

Ø As minhas “mais novas melhores amigas de infância”, Iara Tersia de Freitas Macedo e Lorena

Mayana Beserra de Oliveira. Obrigada por ter dado um novo sentido a minha passagem pelo

PPGCV, por terem sido presentes e prestativas, confidentes e companheiras, por todos os

momentos divertidos e difíceis que passamos juntas. Obrigada por tonar esse último ano de

doutorado insequecível! Vou sentir muita falta de vocês!

Ø A família do meu namorado, em especial seus pais Dra Maria Nilza R. Saraiva e Dr.

Francisco Saraiva da Silva, por terem me acolhido e me considerado sua filha... Por terem me

acompanhado, participado desses últimos passos. Por terem torcido por mim e pelo cuidado.

Com afeto e respeito lhes dedico minha gratidão.

Ø Aos casais Edilval Almeida / Leda Maria Fernandes de Almeida, José Hernesto Rocha Matos

/ Aldenora Machado Matos e José Antenor Saraiva / Maria do Socorro Alves, pois como pais

de amigas muito queridas e principalmente como pessoas maravilhosas que são sempre

cuidaram e se preocuparam comigo com muito zelo e carinho.

Ø A Profa Dra e amiga Ana Carolina Fonseca Lindoso Melo (UFPI), você abriu as portas do

Laboratório de Doenças Parasitárias (LABODOPAR) pra mim e me mostrou os caminhos

para chegar até a prof Claudia ☺... Foi amiga incondicional nos momentos mais difíceis que

passei durante o período de adaptação no doutorado e mais que isso, sempre acreditou em

mim mesmo antes de me conhecer. Muito obrigada!

Ø Ao meu co-orientador Prof. Dr. Francisco Marlon Carneiro Feijó, obrigada por todo incentivo

e apoio, por ter acreditado em mim e me orientado durante essa jornada. Obrigada também

pela amizade e carinho durante todos esses anos.

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Ø A Profa Dra Elza A. Luna-Alves Lima (UFPE) que gentilmente cedeu às cepas fúngicas

tornando possível a execução deste trabalho.

Ø Ao Prof Dr e amigo Fúlvio Aurélio M. Freire (UFERSA) pelo apoio científico nas estatísticas,

pelas sugestões e principalmente pelo carinho com que sempre me recebeu nas horas de

“aperreio”.

Ø Ao Prof Dr Marcos Fábio Gadelha Rocha (UECE), principalmente pelo apoio científico, mas

também pelas críticas e sugestões que em muito enriqueceu os resultados deste trabalho. Um

agradecimento especial também por ter aceitado o convite para participar da minha banca.

Ø A Dra Elizabeth Ferreira Rangel (FIOCRUZ) e Profa. Dra. Diana Magalhães de Oliveira

(UECE) por terem contribuído com seu conhecimento e experiência na área de flebotomíneos

e biologia molecular, respectivamente, e por terem aceitado o convite para participar da minha

banca.

Ø Aos Profs do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da UECE e aos Profs Drs

Rui Sales Júnior e Celicina M. S. B. Azevedo ambos da UFERSA. Meu respeito e gratidão

pela ajuda e atenção prestada.

Ø À Profa Dra Izabel Alencar B. Vasconcelos da UFC (in memorian). Porque todos aqueles que

passam em nossas vidas não passam em vão, levam um pouco de nós e deixam um pouco de

si. À Senhora dedico meu respeito e grande admiração.

Ø Aos demais amigos do LABODOPAR, Michelline do Vale Maciel, Cícero Temístocles

Coutinho Costa, Maria Vivina Barros Monteiro (e João Pedro), Marina Parissi Accioly, Vitor

Luz Carvalho, Fabrício Rebouças de Oliveira, Ana Carolina Moura Rodrigues, Eudson Maia

de Queiroz Júnior, Camila de Albuquerque Almeida, Bruno Grangeiro, Diana Romão

Bezerra, Marianna Colares Albuquerque. E em especial a Fernanda Cristina Macedo Rondon,

Rafaella Albuquerque Silva e Renata Simões Barros, que consquistaram um lugar especial no

meu coração por sua bondade, competência, prestatividade e carinho. Obrigada a todos!

Ø Aos meus colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da UECE e com

carinho a “colônia mossoroense” do PPGCV, Michelline do Vale Maciel (Michê), Aracely

Rafaelle F. Ricarte (Bacura), Suzana Aparecida A. da Costa e Tânia Valeska M. Dantas (Tâ).

Chega ao fim mais uma etapa das nossas vidas. Da convivência certamente tiraremos alguma

lição e de tudo fica a saudade, amizade e a gratidão. Em especial à Michê por dividir as

“pancadas e aperreios”, Bacura pelas noites de divã no apartamento e Tâ por todo apoio

administrativo e “memorial”.

Ø As alunas de iniciação científica da UFERSA, Romeika H. M. Assunção Pereira, Paula

Gabriela Melo de Oliveira, Gislayne C. Xavier Peixoto, Mariana Araújo Silva e também a

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Herbert Sousa Soares e Ana Carla Diógenes Suassuna. Por todo tempo dedicado aos nossos

experimentos, pelos finais de semana perdido, pela paciência e compreensão... Por terem feito

minha estadia na UFERSA mais divertida e prazerosa. Vocês foram essenciais na execução

deste trabalho, obrigada!

Ø Aos componentes do Núcleo de Genômica e Bioinformática Tarsísio Pimenta (NUGEN) da

UECE, especialmente a Samara Cardoso Silva, Michel Toth Kamimura, Ana Patrícia S. de

Lima e Eliana Matos Ribeiro, por terem me recebido com carinho e atenção, por todo apoio e

ensinamentos sobre biologia molecular. Obrigada a todos vocês por terem enriquecido este

trabalho.

Ø Aos profissionais, Raimundo Nonato de Souza, Nélio Batista Morais, Lindemberg Caranha e

Richristi A. Silva todos da Secretaria Estadual de Saúde do Ceará; Edmilson de Castro Dias,

Ana Claudia B. Mendonça e Sodré Rocha da Secretaria de Vigilância em Saúde de Mossoró,

por terem me recebido prontamente e pela assistência na coleção de flebotomíneos.

Ø Às secretárias do PPGCV, Adriana Maria S. Albuquerque e Ana Cristina S. Nascimento, ao

Antônio Cesar Camelo também da UECE e aos funcionários da Superintendência de Infra-

Estrutura da UFERSA representada pelo Sr Francisco Ilbernon Barboza Alves. A vocês, que

pela dedicação ao trabalho, me ofereceram condições de percorrer esse caminho, meu sincero

respeito e reconhecimento.

Ø Aos Senhores José Maria de Souza Filho e Antonieta Vieira de Souza do bairro

Quixabeirinha, Josias Torres da Silva do bairro Rincão e Tereza Linhares da Costa e João

Vieira da Costa do bairro Abolição IV, moradores das residências visitadas em Mossoró

durante o experimento, que me receberam sempre com muito carinho e boa vontade,

facilitando e contribuindo para a coleta de flebotomíneos.

Ø A família do Restaurante Balú por toda paciência e dedicação, por cuidar dos meus pais na

minha ausência, fazerem nossos caprichos e vibrar com nossas vitórias. Em especial à Otíla

Guedes e Rosa Santos pelo carinho especial que sempre tiveram por mim.

Ø Aos meus “filhos” (meus cachorros), Shaila e Sarinha (in memorian), Sophia e o récem

chegado Sheiky. Como pode um amor tão puro, tão fiel, tão desinteressado, tão desastrado...

Como sinto falta da minha pequinininha, insubstituível! Como aquele quintal ficou grande e

vazio sem o jeitão preguiçoso de Shailinha. Sophia, primogênita, aos 12 anos, quem diria

firme e forte, mais pedindo do que dando carinho... Mas com certeza a alegria da casa. E o

que dizer de Sheiky, um furacão, tão brincalhão, tão carinhoso e tão querido. Impossível não

amar essas criaturas!

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RESUMO

O uso do controle biológico com fungos entomopatogênicos é uma alternativa viável

para o controle do vetor da leishmaniose visceral (LV). Baseado no exposto, este estudo

objetivou uma investigação entomológica de flebotomíneos na cidade de Mossoró, Rio

Grande do Norte, e sua relação com as variáveis ambientais, bem como avaliar os efeitos dos

fungos Beauveria bassiana e Metharizium anisopliae var. acridum sobre os diferentes

estágios de Lu. longipalpis. Os flebotomíneos foram capturados mensalmente durante um ano,

no intra e peridomicílio das residências. A patogenicidade dos fungos sobre Lu. longipalpis,

foi avaliada em 5 concentrações de 1x104 a 1x108 conídios/mL, acompanhado do controle

negativo (Tween 80 0,05%) e controle positivo (cipermetrina 196 mg/mL). Os ovos não-

eclodidos, larvas e adultos mortos expostos aos fungos foram semeadas para reisolamento

fúngico, análise dos parâmetros de crescimento e revalidação por PCR e seqüenciamento.

Foram capturados 7.347 flebotomíneos, 94% eram Lu. longipalpis. Somente a temperatura

influenciou negativamente a densidade populacional desses insetos. A infecção com B.

bassiana reduziu em 59% a eclosão de ovos, ao passo que, M. anisopliae var. acridum

reduziu 40%. A mortalidade larvar dos flebotomíneos pós-infecção fúngica foi

significativamente aumentada e a longevidade dos adultos foi menor do que o controle

negativo (p < 0,001) para ambos os fungos. O efeito dos fungos sobre a eclosão dos ovos

postos pelas fêmeas infectadas também foi significativo e inóculo-dependente (p < 0,05).

Quanto aos parâmetros de crescimento fúngico pós-infecção, para B. bassiana apenas a

conidiogênese e esporulação foram significativamente maiores do que o fungo antes da

infecção (p < 0,001). Enquanto que, para M. anisopliae var. acridum somente o crescimento

vegetativo não foi significativo quando comparado ao fungo antes da infecção (p > 0,05). A

revalidação da identificação dos fungos reisolados foi confirmada pelo sequenciamento após a

infecção de todas as fases do inseto para B. bassiana e somente pós-passagem em adultos para

M. anisopliae var. acridum. Conclui-se que, Lu. longipalpis é o flebotomíneo predominante

em Mossoró. Além disso, B. bassiana foi eficaz contra Lu. longipalpis e no que se refere a

fecundidade de fêmeas infectadas com M. anisopliae var. acridum, os resultados foram

satisfatórios, demonstrando que o vetor da LV é susceptível à infecção com fungos

entomopatogênicos. Consequentemente, o uso desses fungos nos programas de controle de

flebotomíneos poderá reduzir o uso de inseticidas químicos, resultando em benefícios para os

seres humanos e o ambiente.

Palavras-chave: Leishmaniose visceral. Lutzomyia longipalpis. Sazonalidade do vetor.

Controle biológico do vetor. Fungos entomopatogênicos.

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ABSTRACT

The use of biological control with entomopathogenic fungi is a viable alternative to control

the vector of visceral leishmaniasis (VL). This study aimed a phlebotomine sandflies survey

in Mossoró, Rio Grande do Norte, and its relation with the environmental variables, as well as

to evaluate the effects of the fungi, Beauveria bassiana and Metharizium anisopliae var.

acridum on the different stages of Lu. longipalpis. Sandfly were captured monthly during one

year, in the intra and peridomicile of the houses. The Lu. longipalpis infected by fungi was

evaluated in five concentrations from 1x104 to 1x108 conidia/mL, accompanied by negative

control (Tween 80 0.05%) and positive control (cypermethrin 196 mg/ml). The unhatched

eggs, larvae and dead adults exposed to fungi were sown to reisolate the fungi, analysis of

parameters of growth and revalidation by PCR and sequencing. The overall sandflies

captured, were 7,347, 94% were Lu. longipalpis. Only temperature affected negatively the

density this insects. Infection with B. bassiana reduced by 59% the egg hatch, while M.

anisopliae var. acridum reduced in 40%. The larval mortality of sandflies after fungal

infection was significantly increased and the longevity of adults was lower than the negative

control (p < 0.001) for both fungi. The effects of the fungal infection on the hatching of eggs

laid by infected females were also significant and inoculum-dependent (p < 0.05). On the

fungal post-infection growth parameters, for B. bassiana only the germination and sporulation

were significantly higher than the fungus before the infection (p < 0.001). While for M.

anisopliae var. acridum only the vegetative growth was not significant when compared to the

fungus before the infection (p > 0.05). The revalidation of the identification of the reisolated

fungus was confirmed by sequencing post-passage in all insect stages for B. bassiana and

only from adult insect for M. anisopliae var. acridum. Thus, Lu. longipalpis the predominant

sandflies in Mossoró, represents a serious public health problem because it is the vector of a

zoonotic disease endemic in the city. Moreover, B. bassiana was effective against Lu.

longipalpis and in terms of infected females fecundity with M. anisopliae var. acridum the

results were significant, proving the vector of the VL is susceptible to infection with the

entomopathogenic fungi. Consequently, the use of these fungi in phlebotomine control

programs has potential as a means of reducing the use of chemical insecticides, resulting in

benefits to humans and the environment.

Keywords: Visceral leishmaniasis. Lutzomyia longipalpis. Seasonality of the vector.

Biological control of the vector. Entomopathogenic fungus.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Formas amastigotas de L. chagasi livres ou no interior de macrófagos corados pelo Giemsa..........................................................................................................................20 Figura 2. Formas promastigotas de L. chagasi encontradas no tubo digestivo do vetor.....20 Figura 3. Principais áreas endêmicas de leishmaniose visceral no mundo..........................21 Figura 4. Leishmaniose visceral: Casos no Brasil e Região Nordeste, 1980-2006..............22 Figura 5. Estágios imaturos de Lu. longipalpis observados em estereomicroscópio com aumento 80x: A – ovos e B – larva de 4o estágio.................................................................23 Figura 6. Adultos de Lu. longipalpis observados em estereomicroscópio com aumento 80x: A – macho e B – fêmea........................................................................................................24 Figura 7. Estruturas genitais de Lu. longipalpis utilizadas na identificação da espécie, observadas em microscópio: A – espermatecas da fêmea, setas (40x) e B – parâmero do macho, caixa (25x)...............................................................................................................24 Figura 8. Fêmea de Lu. longipalpis ingurgitada durante repasto sanguíneo em humano.................................................................................................................................26 Figura 9. Peridomicílios de residências propícios ao desenvolvimento de flebotomíneos, localizados em área endêmica para LV na cidade de Mossoró, Rio Grande do Norte.....................................................................................................................................27 Figura 10. Municípios brasileiros com transmissão de LV, notar que municípios com transmissão esporádica representam 82% dos municípios com casos confirmados de LV.........................................................................................................................................30 Figura 11. Coleira de pvc impregnada com deltametrina (A) e esquema do seu mecanismo de ação em cães (B)..............................................................................................................36 Figura 12. Esporos e cristais biopiramidais de Bacillus thuringiensis var. israelensis (1mm)....................................................................................................................................40 Figura 13. Bacillus sphaericus (1mm).................................................................................40 Figura 14. Ascogregarina chagasi, protozoário parasito natural de Lu. longipalpis...........41 Figura 15. Fêmea de Lu. longipalpis após 5 dias de infecção com 107 conídios/ml de B. bassiana................................................................................................................................42 Figura 16. A - Lu. longipalpis dissecado infectado com larvas filiformes de nematóide em torno do corpo (s) e das asas (w), sob microscopia interferência com o filtro azul. B – Ovos e larvas de nematode isoladas a partir de uma infecção flebotomíneos observada sob microscopia de fluorescência...............................................................................................42

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Figura 17. Beauveria bassiana: A - Macroscopia da colônia, filamento micelial de cor branca cilíndrico; B – Microscopia, hifas, comídios e conidióforos maduros, simples ou ramificados, ovóides e conídios globosos corados em azul de Amann (setas), 640x......................................................................................................................................45 Figura 18. Conídios de M. anisopliae var. acridum, formato ovóide e coloração esverdiado (400x)...................................................................................................................................49 Figura 19. Apressórios de M. anisopliae var. acridum ao longo do eixo hifal após 96h de cultivo em lâmina em BDA, corado com azul de Amann (400x)........................................49 Figura 20. M. anisopliae var. acridum: A - Macroscopia da colônia, filamento micelial de cor esverdeado. B – Microscopia, conidióforos ramificados corados em azul de Amann, 640x......................................................................................................................................50 Figura 21. Conidiogênese de conídios de B. bassiana (A) e M. anisopliae var. acridum (B) após 16h de inoculação em BDA, reisolados de Lu. longipalpis.........................................51 Figura 22. Cultivo em lâmina de B. bassiana em BDA corados em azul de Amann (1000x): Anastomose após 48h de crescimento (A - setas) e conidióforos maduros (B) após 120h......................................................................................................................................52 Figure 1 - DNA amplification of Beauveria bassiana from Lutzomyia longipalpis eggs at 8 days post-infection with varying conidia/ml concentrations: Lane Br: without DNA, Lane C+: B. bassiana DNA, Lane 2: 105, Lane 3: 106, Lane 4: 107, Lane 5: 108, Kb: Ladder. DNA from larvae on different days post-infection with 104 conidia/ml: Lane 13: 3 days, Lane 14: 5 days, Lane 15: 9 days, Lane 16: 10 days, Lane 17: 20 days…………………..73 Figure 1 - Amplification of M. anisopliae var. acridum DNA from Lu. longipalpis adults at different days post-infection with varying conidia/ml concentrations: Lane Br: no DNA, Lane C+: M. anisopliae var. acridum DNA, Lane 1: 1x106 at 7 days, Lanes 2-4: 1x107 at 1, 5 and 6 days, Lanes 5-7: 1x108 at 1, 6 and 10 days, Kb: Ladder………………………….94 Figure 1 - Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil and the neighborhoods, Aeroporto, Abolição and Rincão where the phlebotomine sandfly survey was conducted from January to December 2007..............................................................................................................109 Fig. 2: Temperature, relative humidity, rainfall and prevalence of sandfly Lutzomyia longipalpis and Lutzomyia evandroi captured during the 2007 phlebotomine sandfly survey in Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil……………………………………….....109

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LISTA DE TABELAS

Table 1 - Treatment efficacy of Beauveria bassiana and longevity of Lutzomyia longipalpis life stages. Data presented are means ± SD......................................................71 Table 2 - Conidia germination and vegetative growth of Beauveria bassiana reisolated from infected Lutzomyia longipalpis eggs, larvae and adults on PDA medium…..............72 Table 3 - Colony counting and sporulation of Beauveria bassiana (mean ± SD) reisolated from infected Lutzomyia longipalpis eggs, larvae and adults at 3, 6, 9, 12 and 15 days after inoculation on PDA medium................................................................................................72 Table 1 - Treatment efficacy of M. anisopliae var. acridum and longevity of Lu. longipalpis life stages…………...........................................................................................93 Table 2. Conidia germination and vegetative growth of Beauveria bassiana reisolated from infected Lutzomyia longipalpis eggs, larvae and adults on PDA medium...........................93 Table 3. Colony counts and sporulation of M. anisopliae var. acridum (mean ± SD) reisolated from infected Lu. longipalpis adults at 3, 6, 9, 12 and 15 days after inoculation on PDA medium...................................................................................................................94 Table 1 - Distribution of Lutzomyia spp. according to species, sex and place of capture during the 2007 phlebotomine sandfly survey in Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil..................................................................................................................................107 Table 2 - Prevalence of Lutzomyia longipalpis and mean environmental variables, including temperature (°C), relative humidity (%) and rainfall (mm), during the 2007 phlebotomine sandfly survey conducted in Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil…..…………………………………………………………………………………107 Table 3 - Analysis of the influence of environmental variables, including temperature, relative humidity and rainfall, on the population density of Lutzomyia longipalpis during the 2007 phlebotomine sandfly survey in Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil….…..……………………………………………………………………………...108 Table 4 - Distribution of Lutzomyia longipalpis in accordance with the location of capture (intra/peridomicile) during the dry period (July-Nov) and the rainy period (Dec-Jun) during the 2007 phlebotomine sandfly survey in Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil……………………………………………………………………………………..108

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

c2 - Chi-square test (teste Qui-quadrado)

mg - Microgram (micrograma)

ml - Microliter (microlitro)

°C - Grau Celsius

ACL - American Cutaneous Leishmaniasis (leishmaniose tegumentar

americana)

AFLP - Amplified fragment length polymorphism (polimorfismo do

comprimento do fragmento amplificado)

Bals. - Balsamo

BDA - Ágar batata dextrose

BHC - Hexacloro-ciclo-hexano

BOD - Biochemical Oxygen Demand (demanda bioquímica de oxigênio)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CDC - Centers for Disease Control (armadilha luminosa)

Cepa 291 - Cepa de Metharizium anisopliae var. acridum

Cepa CL1 - Cepa de Beauveria bassiana

CID - Coleiras impregnadas com deltametrin

cm - Centimeter (centímetro)

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

DDT - Diclorodifeniltricloroetano

DEPA - N-dietil fenil acetamida

df - Degree of freedom (grau de liberdade)

DIC - deltamethrin impregnated collars (coleiras impregnadas com

deltametrina)

DNA - Ácido desoxirribonucléico

dNTP - Desoxirribonucleotídeo trifosfatado

F - Análise de Variância (ANOVA)

FML - Fucose-mannose ligand (ligante fucose-manose)

H - Kruskal-Wallis

h - Hours (hora)

HCl - Hydrochloric acid (ácido clorídrico)

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IGS - Intergenic space (espaço ribossomal intergênico)

ITS - Internal transcribed spacer (espaço interno transcrito)

Kb - Kilobase (quilobase)

KCl - Cloreto de potássio

km - Kilometer (quilômetro)

LABODOPAR - Laboratório de Doenças Parasitárias

LTA - Leishmaniose tegumentar americana

LV - Leishmaniose visceral

LVC - Leishmaniose visceral canina

m - Meter (metro)

mg - Milligram (miligrama)

MgCl - Cloreto de magnésio

min - Minute (minuto)

ml - Milliliter (mililitro)

mm - Millimeter (milímetro)

mM - Milimoles

n - Areas counted per field (áreas contadas por campo)

no. - Number (número)

NS - No significance (sem significância)

NUGEN - Núcleo de Genômica e Bioinformática Tarsísio Pimenta

OMS - Organização Mundial de Saúde

P/ p - Probability (probabilidade)

pb - Pairs of base (pares de base)

PCR - Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia da polimerase)

PDA - Potato dextrose agar (ágar batata dextrose)

pH - Potencial hidrogeniônico

pM - Picomoles

PR - Paraná

pvc - Polyvinyl chloride (cloreto de polivinila)

r - Coeficiente de correlação de Pearson

r2 - Coeficiente de determinação

RAPD - Random amplification of polymorphic DNA (amplificação aleatória de

DNA polimórfico)

RFLP - Restriction fragment length polymorphism (polimorfismo do

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comprimento dos fragmentos terminais de restrição)

RH - Relative humidity (umidade relativa)

RNA - Ácido ribonucléico

s / sec - Second (segundo)

SD - Standard deviation (desvio padrão)

SESA - Secretaria Estadual de Saúde

U - Unidade internacional

UECE - Universidade Estadual do Ceará

UFERSA - Universidade Federal Rural do Semi-Árido

UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais

UFPE - Universidade Federal de Pernambuco

URM - Micoteca do Departamento de Micologia da Universidade Federal de

Pernambuco

UV - Ultra-violeta

VL - Visceral Leishmaniasis (leishmaniose visceral)

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................... 20

2 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................................... 21

2.1 LEISHMANIOSE VISCERAL.......................................................................................... 21

2.2 FLEBOTOMÍNEOS........................................................................................................... 23

2.2.1 Lutzomyia longipalpis................................................................................................ 25

2.3 CONTROLE DAS LEISHMANIOSES............................................................................ 28

2.3.1 Controle vetorial......................................................................................................... 30

2.3.1.1 Educação em saúde voltada ao controle de flebotomíneos............................... 31

2.3.1.2 Modificações ambientais................................................................................... 33

2.3.1.3 Controle químico............................................................................................... 35

2.3.1.4 Coleira impregnada com deltametrina.............................................................. 37

2.3.1.5 Vacina contra LVC como “bloqueadora de transmissão”................................. 38

2.3.1.6 Controle com plantas inseticidas....................................................................... 39

2.3.1.7 Controle biológico............................................................................................. 40

2.4 FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS.............................................................................. 44

2.4.1 Beuaveria bassiana.................................................................................................... 45

2.4.2 Metharizium anisopliae var. acridum........................................................................ 49

2.4.3 Diagnóstico da infecção pelos fungos B. bassiana e M. anisopliae var. acridum..... 50

2.4.3.1 Crescimento fúngico pós-infecção e características microscópicas.................. 50

2.4.3.2 Biologia molecular para diagnóstico de B. bassiana e M. anisopliae.............. 53

3 JUSTIFICATIVA............................................................................................................... 56

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA................................................................................................. 57

5 OBJETIVOS........................................................................................................................ 58

5.1 Objetivo Geral................................................................................................................ 58

5.2 Objetivos Específicos..................................................................................................... 58

6 CAPÍTULOS........................................................................................................................ 59

Capítulo I - Control of phlebotomines (Diptera: Psychodidae) vectors of

leishmaniasis…….................................................................................................................... 59

Capítulo II - Evaluation of the fungus Beauveria bassiana (Deuteromycotina:

Hyphomycetes), a potential biological control agent of Lutzomyia longipalpis (Diptera,

Psychodidae)…………….………………………………………………………………..…. 68

17

Capítulo III - The effects of the fungus Metarhizium anisopliae var. acridum infection on

Lutzomyia longipalpis………………………………....………….......................................... 76

Capítulo IV - Phlebotomine sandflies (Psychodidae: Phlebotominae) survey in an urban

transmission area of visceral leishmaniasis, in northeastern Brazil......................................... 95

7 CONCLUSÕES GERAIS................................................................................................... 110

8 PERSPECTIVAS................................................................................................................ 111

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 112

18

1 INTRODUÇÃO

A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose sistêmica que pode ser fatal quando não

tratada. Caracteriza-se pela infecção de fagócitos mononucleares pelo protozoário Leishmania

chagasi (sin. Leishmania infantum). É endêmica em grandes áreas dos trópicos, subtrópicos e

Bacia do Mediterrâneo (CHAPPUIS et al., 2007; LUKEŠ et al., 2007) afetando mais de 80

países em todo mundo (MONTEIRO et al., 2005). No Brasil é endêmica e até o momento, seu

principal transmissor é Lutzomyia longipalpis (DEANE; DEANE, 1955; ALENCAR et al.,

1956). Tal enfermidade tem o cão como principal reservatório doméstico, apresenta

transmissão peridomiciliar, principalmente pela adaptação do inseto vetor aos ambientes

naturais modificados (MADEIRA et al., 2003). Este fenômeno leva a uma redução do espaço

ecológico do vetor, facilitando a ocorrência de epidemias (MONTEIRO et al., 2005). Pois em

conseqüência das transformações ambientais este vetor circula no peridomicílio e

intradomicílio de residências urbanas e rurais (CABRAL et al., 1998).

O controle da LV destaca o inquérito sorológico canino e eutanásia dos cães

portadores, diagnóstico e tratamento dos casos humanos e a aplicação de inseticida residual à

base de piretróides. Entretanto, essas medidas, não têm apresentado efetividade na redução da

incidência da doença, determinando assim a necessidade de reavaliação das ações propostas

(AMÓRA et al., 2006). Nesse âmbito, estudos recentes (MONTEIRO et al., 2005;

MARESCA et al., 2009), sobre a dinâmica de transmissão da LV enfatizam duas variáveis a

serem consideradas nos programas de controle: a variação sazonal da população de

flebotomíneos e o número de cães infectados. Dessa forma, o controle do vetor pode então

oferecer solução menos onerosa e mais prática, o que conduziria a medidas preventivas

eficazes em um maior número de focos de leishmaniose.

Some-se a isto o fato de que a aplicação de inseticidas químicos pode resultar em

problemas ambientais, toxicológicos e na seleção de linhagens de insetos resistentes a esses

agentes. Resultando na necessidade de se desenvolver novas tecnologias de controle, na busca

por qualidade de vida. Uma alternativa sugerida é o uso do controle biológico do vetor.

Dentre os organismos que atuam no controle biológico de dípteros de interesse sanitário e

veterinário, os fungos entomopatogênicos em geral, apresentam taxas mais eficientes e exibe

maior especificidade sobre o inseto-alvo (hospedeiros) do que os inseticidas químicos

(BARRETO et al., 2004). Neste contexto, o fungo Beauveria bassiana tem sido isolado de

centenas de espécies de insetos (KAUFMAN et al., 2005), ocorre na forma epizoóticas

inclusive entre Diptera (ALVES; LECUONA, 1998 ), persisti por períodos longos e pode

19

infectar o hospedeiro em todas as fases de desenvolvimento (MACIEL et al., 2005). Estudos

sugerem que este fungo é também patogênico para vetores de leishmaniose (WARBURG,

1991; REITHINGER et al., 1997). Já Metarhizium anisopliae var. acridum que é conhecido

por sua eficácia no controle de gafanhotos no Brasil e em outros países (FARIA;

MAGALHÃES, 2001) sua patogenicidade sobre Diptera de interesse em saúde pública ainda

não foram suficientemente explorados, embora seus efeitos sobre organismos não-alvo

incluindo outros Orthoptera, Diptera e Hymenoptera tenha sido verificado. No Brasil, a

avaliação da ação patogênica de fungos sobre dípteros psicodídeos ainda está em fase inicial

de avaliação e o controle biológico poderia ser útil no manejo integrado de flebotomíneos e

beneficiar a saúde pública.

A LV é endêmica no Rio Grande do Norte, estado do Nordeste do Brasil. Nos últimos

anos, tem havido um aumento nos casos de LV relatados em muitos dos municípios do estado

(CORTEZ et al., 2007; XIMENES et al., 2007). No entanto, os dados que documenta a

presença e a distribuição de Lu. longipalpis na cidade de Mossoró são geralmente

insuficientes para traçar um perfil eco-epidemiológico da doença. Além disso, a alta

prevalência da LV em cães em diferentes localidades de Mossoró (AMÓRA et al., 2006;

MATOS et al., 2006) demonstra a necessidade de medir a frequência flebotomíneos em áreas

urbanas.

20

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 LEISHMANIOSE VISCERAL

As leishmanioses são zoonoses causadas por protozoários do gênero Leishmania (Fig.

1-2), importantes na saúde pública e afetam mais de 80 países em todo mundo. As

enfermidades apresentam transmissão peridomiciliar, principalmente devido à adaptação de

algumas espécies de insetos vetores aos ambientes modificados; assim como, em decorrência

do aumento da população humana associado à ocupação desordenada, sobretudo próxima às

encostas e/ou matas, acarretando a redução do espaço ecológico do vetor e favorecendo a

instalação de um ciclo extraflorestal (MADEIRA et al., 2003) o que facilita a ocorrência de

epidemias (MONTEIRO et al., 2005). Os principais determinantes dos níveis epidêmicos das

leishmanioses nos grandes centros são: convívio estreito entre homem/reservatório (cão),

aumento da densidade do vetor, desmatamento acentuado e o constante processo migratório.

Obrigatoriamente, outros fatores devem estar envolvidos, em especial o potencial de

transmissão decorrente da densidade vetorial e taxa de infecção dos vetores, além da

vulnerabilidade das pessoas suscetíveis ao desenvolvimento da doença (MONTEIRO et al.,

2005; MARESCA et al., 2009).

Figura 1. Formas amastigotas de L. chagasi (setas) livres ou no interior de macrófagos corados pelo

Giemsa. Fonte: http://www.vet.uga.edu

Figura 2. Formas promastigotas de L. chagasi (setas) encontradas no tubo digestivo do vetor.

Fonte: http://www.uni_tuebingen.de_leishmania

Nos últimos dez anos vem ocorrendo a urbanização das leishmanioses, consolidada

pelos surtos epidêmicos em diversas áreas do Mediterrâneo e em diversos países latino-

americanos (MAROLI; KHOURY, 2004). Essa expansão resultou no estabelecimento de

21

novas áreas endêmicas (MADEIRA et al., 2003), passando de doença quase que exclusiva de

áreas rurais para ampla distribuição em áreas urbanas.

A LV, especificamente, é endêmica em diversos países tropicais em todo o globo (Fig.

3). Esta doença tem sido considerada emergente e foi colocada entre as sete endemias de

prioridade pela Organização Mundial da Saúde (OMS) (MICHALSKY et al., 2009).

Figura 3. Principais áreas endêmicas de leishmaniose visceral no mundo.

Fonte: http://www.who.int/tdr/dw/leish_map.htm

Nas Américas a LV ocorre desde o México até a Argentina, tendo sido descrita em

pelo menos 12 países. Grande parte dos casos humanos descritos é procedente do Brasil onde

a doença é endêmica e até o momento (MICHALSKY et al., 2009), seu principal transmissor

pertence ao gênero Lutzomyia (MONTEIRO et al., 2005). Na década de 90, aproximadamente

90% dos casos notificados de LV ocorreram na região Nordeste. À medida que a doença se

expandiu para as outras regiões e atingiram áreas urbanas e periurbanas, esta situação veio se

modificando e, no período de 2000 a 2002, a região Nordeste apresentou redução para 77% e

em 2003 para 65% dos casos do país (Fig. 4) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Além dos

dados registrados na literatura científica onde constam registros de casos de LV em 19 das 27

unidades da federação, com aproximadamente 1.600 municípios apresentando transmissão

autóctone (GONTIJO; MELO, 2004). Atualmente a LV atinge todas as regiões brasileiras

com casos autóctones registrados também no Distrito Federal (GOVERNO DO DISTRITO

FEDERAL, 2009) e mais recentemente em municípios do Rio Grande do Sul (GOVERNO

DO ESTADO RIO GRANDE DO SUL, 2009).

Dessa forma, seja no espaço rural ou urbano, essas enfermidades ampliam sua área de

ocorrência (DANTAS-TORRES; BRANDÃO-FILHO, 2006). Por um lado, cães abandonados

22

vagando na periferia da cidade podem se infectar quando entram em contato com

reservatórios silvestres na presença do vetor e, ao retornarem para o interior da cidade, servem

de amplificadores da infecção para outros cães e humanos. Por outro, o vetor se adapta

facilmente às áreas depauperadas, explorando o acúmulo de matéria orgânica gerada por

animais domésticos e más condições sanitárias (COSTA; TAPETY; WERNECK, 2007). O

entendimento das interações entre mudanças do meio ambiente e os flebotomíneos vetores

constituem um pré-requisito para o desenvolvimento de ações apropriadas de prevenção e

estratégias de controle (GONTIJO; MELO, 2004).

2.2 FLEBOTOMÍNEOS

Os flebotomíneos (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) são vetores de importância

médica e veterinária, podendo transmitir leishmanioses, bartoneloses e algumas arboviroses

(PESSOA; MEDEIROS; BARRETT, 2007) como as fleboviroses (XU et al., 2007),

flaviviroses, orbiviroses (TRAORÉ-LAMIZANA et al., 2001) e vesiculoviroses (COMER;

TESH, 1991). Outros microrganismos também têm sido isolados incluindo fungos,

gregarinas, bem como evidências de outros tripanossomatídeos além de Leishmania, como

Endotrypanum. Sendo que, são os estudos sobre as leishmanioses que têm gerado muitas das

informações que existem atualmente sobre esses diferentes parasitas (SHAW et al., 2003).

Estes insetos são pequenos, frágeis, de atividade noturna e vôo direto e curto. As fêmeas

precisam de sangue para amadurecer os ovos e ambos os sexos precisam de açúcar para fins

Figura 4. Leishmaniose visceral: Casos no Brasil e Região Nordeste, 1980-2006.

Fonte: Ministério da Saúde, 2007

23

energéticos, obtidos principalmente a partir de tecidos vasculares de plantas. Os

flebotomíneos adultos abrigam-se durante o dia em lugares escuros e úmidos como buracos

em árvores e abrigos de animais ou sob rochas, podendo ser coletados por vários métodos,

quer enquanto descansam durante o dia ou em atividade durante a noite. Os ovos se

estabelecem em micro-hábitat terrestre rico em matéria orgânica, que fornece alimento para as

larvas (ALEXANDER, 2000). As formas imaturas são difíceis de encontrar e ainda há muito

a ser descoberto sobre os sítios de reprodução dos flebotomíneos dada sua alta capacidade de

recolonizar o que restringe as opções para controle vetorial (MAIA-ELKHOURY et al.,

2008).

No tocante a morfologia, os ovos são elípticos ou ovóides, alongados e pouco

encurvados, medindo 300-500 mm de comprimento por 70-150 mm de largura. Após a

postura são brilhantes e esbranquiçados e dentro de 2-3 horas escurecem e tomam a cor

definitiva que é castanha escura (Fig. 5-A) (SHERLOCK; SHERLOCK, 1959). As larvas são

pequenas, claras, vermiforme, com uma cápsula cefálica escura e mandíbulas robustas (Fig. 5-

B). As pupas possuem cefalotórax e abdômen, fixam-se imóveis ao substrato, esbranquiçadas

ou amareladas, escurecendo progressivamente à medida que se aproxima a eclosão do adulto,

que leva de 20-40 dias (MARCONDES, 2001).

O adulto possui corpo e as asas recobertas de espessa pilosidade, as antenas são longas

com 14 flagelômeros cilíndricos e a probóscida tem comprimento semelhante ao do restante

da cabeça apontado para o substrato, medem de 1-3 mm de comprimento. Possuem corpo

revestido por pêlos e são de coloração clara, castanho claro ou cor de palha (Fig. 6)

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).

Figura 5. Estágios imaturos de Lu. longipalpis observados em estereomicroscópio com aumento

100x: A – ovos, B – larva de 4o estágio. Fonte: AMÓRA, 2007

24

Machos e fêmeas distinguem-se morfologicamente em suas probóscidas, mais curta

nele do que nela, na qual é longa e adaptada para picar e sugar e pelos últimos segmentos

abdominais, modificados para constituir a genitália do inseto: nas fêmeas os segmentos

menores e discretos dispõem-se como estruturas telescopadas, as quais conferem aspecto

arredondado à genitália do inseto, denominda espermateca (Fig. 7-A), enquanto no macho

está presente um conjunto de apêndices bem desenvolvidos e ornamentados em forma de

ganchos formando o parâmero (Fig. 7-B) (BRAZIL; BRAZIL, 2003).

Os vetores de Leishmania spp compreendem mais de 40 espécies de Phlebotomus no

Velho Mundo e 30 espécies de Lutzomyia nas Américas (ALEXANDER; MAROLI, 2003).

Estes se caracterizam por abrigarem-se em florestas primárias, secundárias e em rochas

calcárias, preferencialmente. A adaptação que algumas espécies de flebotomíneos vêm

Figura 6. Adultos de Lu. longipalpis observados em estereomicroscópio com aumento 80x:

A – macho e B – fêmea. Fonte: AMÓRA, 2007

Figura 7. Estruturas genitais de Lu. longipalpis utilizadas na identificação da espécie,

observadas em microscópio: A – espermatecas da fêmea, setas (40x) e B – parâmero do macho, caixa (25x). Fontes: AMÓRA, 2007; NUVET, 2007

25

sofrendo, principalmente em locais que passaram por modificações humanas, aproxima os

vetores dos domicílios podendo facilitar a transmissão das leishmanioses (DIAS et al., 2007).

As características climáticas ideais para o desenvolvimento de fletomíneos são mais

comumente encontradas em áreas com teor de umidade e temperatura ambiente relativamente

alta, como observado em áreras de clima tropical. Fato que já havia sido observado por

Alencar, Holanda e Cavalcante (1956), durante suas pesquisas no Vale do Jaguaribe, Ceará,

onde foi observada maior concentração do vetor nas margens do rio Jaguaribe, onde o teor de

umidade e o calor da região eram consideráveis. A chuva beneficia os flebotomíneos quando

em níveis moderados ao longo da estação chuvosa (DIAS et al., 2007) amenizando a

temperatura e aumentando a disponibilidade de alimento para as larvas, o que ocorre em

virtude da queda das folhas com a entrada do outono, que podem, por sua vez, estimular a

pupação em massa, como foi observado no Estado de São Paulo (ODORIZZI; GALATI,

2007). Todavia, a chuva em níveis elevados prejudica esses dípteros inundando o solo,

destruindo os criadouros e matando as pupas (DIAS et al., 2007).

Na década de 50, Joaquin Alencar e os Deane, estudando a LV no Ceará e outros

estados vizinhos, verificaram que o inseto hematófago mais frequentemente encontrado no

intra e peridomicílio era Lu. longipalpis, estabelecendo a sua importância epidemiológica

como vetor. A partir de então, a presença de Lu. longipalpis foi associada com casos de LV

em grande área do continente americano, desde o norte do México até o sul da Argentina. A

distribuição coincidente de Lu. longipalpis e de LV reforçou a convicção dos Deane de que

esse flebotomíneo é o principal vetor da doença (LAINSON; RANGEL, 2005).

2.2.1 Lutzomyia longipalpis

No Brasil, a espécie Lu. longipalpis (Fig. 8) está distribuída em todas as regiões do

país e recentemente foi encontrado no Distrito Federal e Rio Grande do Sul onde foram

diagnosticados casos autóctones de LV (SILVA et al., 2008; GOVERNO DO DISTRITO

FEDERAL, 2009; GOVERNO DO ESTADO RIO GRANDE DO SUL, 2009). Esta espécie é

bem adaptada ao ambiente peridomiciliar, alimentando-se em uma grande variedade de

hospedeiros vertebrados, entre aves, homem e outros animais silvestres ou domésticos

(REBELO, 2001; QUEIROZ et al., 2009), podendo resistir as condições adversas e explorar

novos ambientes, facilitando assim a transmissão da LV (MICHALSKY et al., 2009).

26

A presença significativamente maior de flebotomíneos no peridomicílio foi observada

em muitos municípios do estado do Rio Grande do Norte (XIMENES et al. 2000; 2007) e em

Montes Claros, Minas Gerais, onde são capturados flebotomíneos próximo de abrigos de

animais domésticos (MONTEIRO et al. 2005). Estes dados podem se justificar pela

devastação de áreas selvagens para exploração econômica, o que leva a doença a periferia de

centros urbanos. Vetores e hospedeiros são forçados a migrar para o peridomicílio humano à

procura de alimento (MAROLI et al. 2001; BARATA et al. 2005). Também é importante

observar o elevado número de Lu. longipalpis que tem sido capturado no interior das casas,

ingurgitada após repasto sanguíneo em seres humanos ou animais. Estes dados ilustram o

comportamento endofílico do vetor e enfatizam a possibilidade de transmissão da LV

intradomícilo (MISSAWA; DIAS, 2007; XIMENES et al. 2007, MISHALSKY et al. 2009).

Adicionalmente, fêmeas de Lu. longipalpis alimentam-se avidamente de galinhas

domésticas (LAINSON; RANGEL, 2005), fato de considerável importância epidemiológica,

uma vez que não é habitualmente feito a borrifação de galinheiros com inseticidas. Um estudo

realizado no município de Raposa, Maranhão, área de transmissão de LV, reafirma a

importância dessas aves na epidemiologia de Lu. longipalpis, no qual se estudou 2.240 fêmeas

de Lu. longipalpis capturadas nos ambientes intra e peridoméstico, a investigação confirmou a

galinha como preferência alimentar do inseto (28,3%) seguido pelo cão (21,7%) (DIAS;

LOROSA; REBÊLO, 2003).

Áreas sem saneamento, drenagem de águas pluviais e com coleta de lixo irregular,

associado à presença de animais domésticos contribuem para a acumulação de matéria

orgânica e, por conseguinte, favorece a presença de Lu. longipalpis (Fig. 9) (MICHALSKY et

al., 2009). O predomínio do vetor da LV, Lu. longipalpis, também tem sido observado em

Figura 8. Fêmea de Lu. longipalpis ingurgitada durante repasto sanguíneo em humano. Fonte: http://iproweb.procempa.com.br

27

diversas áreas endêmicas para LV no Brasil (BARATA et al., 2005; MONTEIRO et al., 2005;

MISSAWA; DIAS, 2007; XIMENES et al., 2000; 2007; CORTEZ et al., 2007; OLIVEIRA et

al., 2008; MACEDO et al., 2008; MICHALSKY et al., 2009; QUEIROZ et al., 2009). Bem

como outros países, mesmo quando o vetor é outra espécie de flebotomíneo, tal como

Phlebotomus sergent no nordeste do Uzbequistão (MAROLI; KRASNONOS; GAFUROV,

2001), Phlebotomus arias no nordeste da Espanha (ARANSAY et al., 2004), Phlebotomus

perniciosus Itália (BONGIORNO et al., 2003; ROSSI et al., 2008), Phlebotomus papatasi em

Marrakesh, Morocco (BOUSSAA et al., 2005) e Lutzomyia pseudolongipalpis na Venezuela

Ocidental (FELICIANGELI et al., 2006). Em Porteirinha, Minas Gerais, além da abundância

do vetor ainda foi observada uma correlação positiva entre a densidade populacional de Lu.

longipalpis e os casos de leishmaniose visceral canina (LVC) (FRANÇA-SILVA et al., 2005).

Figura 9. Peridomicílios de residências propícios ao desenvolvimento de flebotomíneos, localizados em

área endêmica para LV na cidade de Mossoró, Rio Grande do Norte. Fonte AMÓRA, 2007

Estudos recentes da dinâmica de transmissão da LV enfatizaram duas variáveis a

serem consideradas nos programas de controle: variação sazonal da população de

flebotomíneos e o número de cães infectados (MONTEIRO et al., 2005). Obrigatoriamente,

outros fatores devem estar envolvidos, em especial o potencial de transmissão decorrente da

densidade vetorial e da taxa de infecção dos vetores, além da vulnerabilidade das pessoas e

animais suscetíveis ao desenvolvimento da doença. Os inquéritos sorológicos na população de

cães e os levantamentos entomológicos nas áreas endêmicas revelam em alguns locais, que a

alta prevalência da LV canina e a presença predominante e abundante do vetor redunda em

elevado risco de transmissão para o homem (MONTEIRO et al., 2005; MARESCA et al.,

2009). Camargo-Neves et al. (2001) consideraram ainda a necessidade de analisar a densidade

vetorial e correlacioná-la com os aspectos ambientais do peridomicílio, tais como presença de

28

vegetação, raízes, troncos de árvores e matéria orgânica no solo, representando possíveis

abrigos e criadouros para o vetor; e fatores abióticos como temperatura, umidade e chuvas.

No entanto, os dados quanto à presença e distribuição de espécies vetores de LV, em geral,

são insuficientes para caracterizar o perfil eco-epidemiológico da doença (MICHALSKY et

al., 2009).

2.3 CONTROLE DAS LEISHMANIOSES

No Brasil, as campanhas de controle da LV tiveram início na década de 50, sendo os

Estados do Ceará e Minas Gerais os principais alvos das atividades. Entretanto, durante a

década de 60, as ações foram interrompidas e apenas em 1982, o programa foi retomado,

quando a extinta Superintendência de Controle de Endemias (SUCAM) detectou um aumento

do número de casos de LV (ALVES; BEVILACQUA, 2004).

As medidas de controle das leishmanioese preconizadas pela OMS constam de

diagnóstico precoce e tratamento dos casos humanos, controle dos vetores e realização de

inquéritos sorológicos nas populações caninas seguidos da eliminação dos animais

soropositivos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006; 2007). No Brasil, essas ações foram sempre

descontínuas por diversas razões, tais como problemas orçamentários e escassez de recursos

humanos adequadamente treinados. Essas medidas não atingiram os efeitos esperados,

ocorrendo reinfestações dos ambientes e ressurgimentos dos casos humanos e caninos

(GONTIJO; MELO, 2004).

Tendo em vista as dificuldades de controle da doença, algumas modificações foram

propostas pelo próprio Ministério da Saúde (2006) para a vigilância, baseando-se em uma

melhor definição das áreas de transmissão ou de risco. O novo enfoque é incorporar os

estados e municípios silenciosos, ou seja, sem ocorrência de casos humanos ou caninos da

doença, nas ações de vigilância, visando assim minimizar os problemas referentes a este

agravo em áreas sem transmissão. Nas áreas com transmissão de LV, após estratificação

epidemiológica, as medidas de controle são distintas e adequadas para cada área trabalhada.

Entretanto, é de fundamental importância que as medidas usualmente empregadas no controle

da doença sejam realizadas de forma integrada e reavaliadas, para que possam ser efetivas,

reduzindo custos operacionais e contribuindo para sustentabilidade dos programas de controle

(WERNECK et al., 2002).

Estudos enfocando a estratégia de eliminação canina têm oferecido resultados

conflitantes, pelo menos quando utilizada separadamente do controle vetorial (COSTA;

29

TAPETY; WERNECK, 2007), já que a doença em cães precede o aparecimento de casos

humanos e as chances de infecção para os seres humanos aumentam em áreas com altas taxas

de prevalência da infecção canina, quando o vetor está presente (MAIA-ELKHOURY et al.,

2008; OLIVEIRA et al., 2008). De acordo com o manual de LV do Ministério da Saúde, áreas

sem casos de LV e áreas com uma média de até 2,4 casos em cinco anos, no último caso

classificadas como áreas com transmissão esporádica da doença, não incluem em suas

medidas de vigilância e controle o conhecimento da sazonalidade do vetor e nenhum tipo de

controle químico deve ser realizado (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006), ou seja, mesmo

sendo indispensável a presença do vetor para manutenção do ciclo da doença nada é feito para

controlar sua população, continuando as medidas centralizadas no controle do reservatório

canino, demonstrando mais uma vez que as medidas não são integradas e que muito

provavelmente essa é uma das maiores causas do insucesso do programa no controle da

doença.

Nessa situação a retirada dos cães se torna improdutiva, pois à medida que a população

de flebotomíneos aumenta, aumentará ainda mais o risco de humanos serem picados

considerando a clara adaptação de Lu. longipalpis ao ambiente domiciliar, onde encontra

abrigo e fonte alimentar (BARATA et al., 2005; MONTEIRO et al., 2005; MISSAWA;

DIAS, 2007; XIMENES et al., 2007; MISHALSKY et al., 2009). Portanto, os hábitos

alimentares dos vetores de LV podem ter implicações para a transmissão da doença em áreas

urbanas e peri-urbanas onde a privação de hospedeiros vertebrados para repasto das fêmeas

vetoras ou mesmo sua criação em íntimo contato com as pessoas pode favorecer a infecção de

humanos (BONGIORNO et al., 2003).

Se a vigilância epidemiológica da LV em áreas com transmissão esporádica incluísse o

controle vetorial, haveria um risco bem menor de aumentar a prevalência da doença

considerando que municípios brasileiros com essa classificação representam 82% dos

municípios com casos confirmados de LV (Fig. 10). E mesmo em áreas com transmissão

moderada e intensa de LV, ou seja, média de casos entre 2,4-4,4 e mais de 4,4 casos em cinco

anos, respectivamente, nenhuma medida de controle químico é recomendada no período pré-

chuvas, antes do aumento populacional do vetor, quando suas formas imaturas ainda estão por

evoluir e sendo estas formas também sensíveis à desinsetização (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2006). Esse fato permite que os insetos completem seu ciclo de vida garantindo sua

sobrevivência. Já o manual da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é mais cauteloso

nesse sentido, indicando especificamente que o período que antecede às chuvas ou

imediatamente após devem ser borrifados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).

30

O que sustenta a utilização do controle vetorial e de reservatórios como estratégias de

intervenção sobre as leishmanioses é a conjectura de que a incidência de infecção em

humanos está diretamente relacionada ao número de cães infectantes e a presença do vetor

(COSTA; TAPETY; WERNECK, 2007). Especificamente sobre o controle do vetor, mesmo

na ausência de informações detalhadas sobre fatores de risco (culturais, demográficos,

epidemiológicos, clínicos e geográficos), a utilização de redes impregnadas com inseticidas,

por exemplo, parece um método adequado de prevenção às leishmanioses, como observado

no Sudão (KOLACZINSKI et al., 2008). Mas, o controle utilizado não consegue atingir as

fases imaturas do inseto (PESSOA; MEDEIROS; BARRETT, 2007). Conseqüentemente, o

controle do vetor ainda depende exclusivamente do combate ao inseto em sua forma adulta

(ALEXANDER; MAROLI, 2003).

2.3.1 Controle vetorial

A interrupção do ciclo da LV através do controle químico do vetor pode oferecer uma

solução menos onerosa e mais prática, o que poderia conduzir a medidas preventivas mais

eficazes em um maior número de focos de LV (MAROLI; KHOURY, 2004). Entretanto, até o

presente momento, o controle do vetor preconizado pela OMS baseia-se na captura e

aplicação de piretróides residuais vinculados à procedência dos casos humanos

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006; 2007). Como são pouco conhecidos os locais de

Figura 10. Municípios brasileiros com transmissão de LV, notar que municípios

com transmissão esporádica representam 82% dos municípios com casos confirmados de LV. Fonte: Ministério da Saúde, 2007

31

procriação natural dos flebotomíneos e descanso diurnal dessas espécies, o controle utilizado

não consegue atingir as fases imaturas do inseto (FELICIANGELI, 2004). Apesar disso,

mesmo quando são realizadas campanhas contra o flebotomíneo adulto, a avaliação da

eficácia e do custo/benefício é difícil porque as estratégias são pouco controladas e raramente

são empregadas intervenções diferentes para que se possa comparar e escolher a melhor

estratégia (KILLICK-KENDRICK, 1999; GONTIJO; MELO, 2004).

É necessário identificar os fatores que tenham impacto no controle de Lu. longipalpis,

dada a sua alta capacidade de recolonizar o ambiente urbano bem como a complexidade de

identificar os sítios com suas formas imaturas. A utilização de informações como a presença

ou ausência do vetor, abundância e infestações no intra e peridomicílios ainda é limitado para

estimar o risco de transmissão da LV, uma vez que não existem parâmetros estabelecidos para

esses indicadores (MAIA-ELKHOURY et al., 2008).

2.3.1.1 Educação em saúde voltada ao controle de flebotomíneos

A forte relação apresentada pela ocorrência da leishmaniose visceral e os perfis

cultural, nutricional e socioeconômico da população atingida, remetem a questão do controle

para além das barreiras pertencentes ao contexto ambiental em que a doença está inserida

(BORGES et al., 2008).

Os manuais de LV e LTA recomendam as atividades de educação em saúde, devendo-

se inseri-las em todos os serviços que desenvolvem as ações de controle das leishmanioses,

requerendo o envolvimento efetivo das equipes multiprofissionais e multi-institucionais com

vistas ao trabalho articulado nas diferentes unidades de prestação de serviços (MINISTÉRIO

DA SAÚDE, 2006; 2007). Nesse âmbito, Sherlock (1996), já havia observado na Bahia e em

outras regiões do Brasil que a pobreza, a desnutrição e a alta densidade de flebotomíneos,

tanto no intra quanto no peridomicílio, estão associadas à elevada presença de animais

domésticos e péssimas condições sanitárias em áreas de transmissão da LV. Bem como em

Montes Claros, Minas Gerais, onde as habitações têm, em sua maioria deficiência na coleta de

lixo e de saneamento básico, em algumas áreas muitos moradores possuem baixos índices

sócio-econômicos, a convivência com animais domésticos é bastante elevada, resultando em

acúmulo de matéria orgânica, proporcionando condições favoráveis para a ocorrência da

transmissão da doença (MONTEIRO et al., 2005). Esse quadro, infelizmente, não mudou mas

tem se expandido também para população de bom nível sócio-econômico, tendo sido também

observado em Várzea Grande, Mato Grosso (MESTRE; FONTES, 2007) e em Belo

32

Horizonte, Minas Gerais, onde um estudo sobre o conhecimento da LV verificou que 50% dos

indivíduos acometidos pela doença desconheciam-na completamente quando foram infectados

e apenas 1,2% conheciam o vetor, além disso pessoas analfabetas tem oito vezes mais chance

de ser acometidas pela doença (BORGES et al., 2008).

O despreparo dos serviços de saúde focado em diagnosticar e tratar precocemente as

leishmanioses em humanos, medida de caráter eminentemente curativo, vem trazendo taxas

de letalidade preocupantes (COSTA; TAPETY; WERNECK, 2007). Fato agravado pela

desorganização de órgãos públicos de saúde, trocas constantes de especialistas em controle de

vetores que têm gerado a carência de pessoal capacitado para a execução de trabalhos de

controle (TEODORO et al., 2007), falta de informação da população e principalmente dos

profissionais de saúde. Luz et al. (2003), citam a educação como controle cultural para a LV,

por tornar participantes diversas camadas da população e por democratizar atitudes capazes de

beneficiar as práticas de controle.

Outro ponto crítico é a produção audiovisual sobre as leishmanioses voltada para a

população, a qual não tem dado conta de uma representação problematizada da doença,

entendendo-a, no contexto de suas relações sócio-culturais (PIMENTA; LEANDRO;

SCHALL, 2007). Na análise de materiais educativos impressos sobre as leishmanioses, Luz

et al. (2003) alertaram para um processo de imposição de discursos e reprodução de

preconceitos através de desenhos e fotografias. Assim sendo, seja nos contextos dos serviços

de saúde ou nas áreas de educação e comunicação, a escassez e a baixa qualidade do material

remetem à necessidade de uma reflexão crítica em torno dessa produção audiovisual e sobre a

possibilidade de propor novas abordagens sobre as leishmanioses. Estudos interdisciplinares

podem contribuir para a compreensão da doença em diversos campos da saúde coletiva, e a

antropologia da saúde e antropologia visual podem auxiliar numa maior compreensão a

respeito da produção audiovisual sobre as leishmanioses (PIMENTA; LEANDRO; SCHALL,

2007). A precariedade de informação, traduzida nesses resultados, aponta a necessidade da

realização de práticas educativas em diferentes frentes, que podem contar com a participação

de médicos e veterinários durante consultas, professores e agentes de saúde em palestras e

durante as visitas domiciliares (BORGES et al., 2008).

Para as doenças transmitidas por vetores ligadas às precárias condições sócio-

econômicas e sanitárias, além das medidas de controle realizadas de forma sistemática, são

necessárias definições de políticas públicas que garantam a resolução das distorções e

desigualdades existentes nos padrões de saúde, ultrapassando limites das ações desse setor,

onde novas alternativas deveriam ser incorporadas como acesso à educação, habitação, renda,

33

suplementação alimentar, saneamento básico e ambiental que provavelmente teriam um novo

impacto sobre a ocorrência dessas doenças (OLIVEIRA; ARAÚJO, 2003). Nesse âmbito, a

educação em saúde levando à população o conhecimento dos possíveis locais de procriação

do vetor dentro de uma localidade, pode resultar em redução significante na incidência da

doença. E as mudanças de atitudes numa população é meta a ser atingida com o tempo, pois

envolve variações na cultura; esta parece ser a explicação para a dificuldade em alcançar altos

índices de prevenção (BORGES et al., 2008).

Como em qualquer doença de importância em saúde pública, seu conhecimento

básico, geral e amplo deve ser disseminado (KISHORE et al., 2006), através de medidas

alternativas, pouco onerosas e práticas que possam ser incorporadas no dia-a-dia das

populações que vivem em áreas de risco. O que pressupõe que a prevenção e o controle desses

vetores requerem estudos de avaliação da efetividade com componentes da promoção da

saúde e participação imprescindível da comunidade em sua implementação, para assegurar

sua sustentabilidade (TEODORO et al., 2007). O potencial de proteção que tem o

conhecimento sobre a LV em Belo Horizonte, Minas Gerais, (BORGES et al., 2008) deixa

claro que ao se tornar consciente do agravo à população tem como contribuir, de forma ativa e

permanente, no controle do mesmo, sendo esta a chave para a execução, consolidação e

vigilância das ações de controle de endemias como as leishmanioses.

2.3.1.2 Modificações ambientais

Cada mudança ambiental através de fenômenos naturais ou por intervenção humana,

altera o equilíbrio ecológico e o contexto dentro dos quais vetores e parasitas se desenvolvem

e transmitem doenças (PESSOA; MEDEIROS; BARRETT, 2007). Os flebotomíneos, por sua

vez, procriam mais comumente em lugares escuros, em fendas de árvores na presença de

húmus e umidade. Contudo, em face a sua graduação adaptação também tem procriado em

pridomicílios ricos em matéria orgânica e entulhos. O princípio do manejo ambiental é

administrar o ambiente de forma a torná-lo inadequado ao vetor (KISHORE et al., 2006).

Os abrigos de animais domésticos construídos próximos das habitações humanas, a

ausência de boas condições de higiene no peridomicílio e a proximidade de pequenos capões

de mata, freqüentemente observado nas áreas rurais em diversas regiões do Brasil

(TEODORO et al., 2001), associado às áreas com solos úmidos e acúmulo de matéria

orgânica de origem vegetal e animal, promove condições para a formação de criadouros e

concentração de flebotomíneos no ambiente peridomiciliar (CASANOVA, 2001).

34

As medidas preconizadas no manual de LTA (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007),

como a poda de árvores para aumentar a insolação e diminuir o sombreamento do solo

evitando as condições favoráveis de temperatura e umidade para o desenvolvimento de larvas

de flebotomíneos, são mais claras e objetivas e conseguem atingir melhor os focos de

procriação do vetor quando comparadas as recomendações do manual de LV (MINISTÉRIO

DA SAÚDE, 2006).

Assim, uma alternativa para o controle de flebotomíneos pode-se dar através de

modificações do habitat favorável ao seu desenvolvimento, de alterações do microclima e do

ambiente. A exemplo dos trabalhos de reorganização e limpeza do peridomicílio, bem como a

desinsetização de edificações utilizados para o controle de flebotomíneos em Doutor

Camargo, Paraná, que diminuíram a freqüência desses dípteros no peri e intradomicílio, em

áreas endêmicas de LTA (TEODORO et al., 2004). Pessoa, Medeiros e Barrett (2007), após a

retirada dos troncos das árvores em uma floresta produtora de madeira na Amazônia, também

observaram que tanto a abundância vetorial quanto as taxas de fêmeas infectadas por

Leishmania, foram afetadas negativamente. A combinação de tratamento químico e manejo

ambiental de edificações também tem-se revelado eficaz na redução de vetores no

intradomicílio (MAIA-ELKHOURY et al., 2008).

Dessa forma, a importância vetorial dos flebotomíneos exige intensivas investigações

da ecologia destes dípteros como parte integrante da rotina dos serviços de saúde pública,

sobretudo nas regiões onde as leishmanioses são endêmicas (FRANÇA-SILVA et al., 2005).

Onde o entendimento das interações entre mudanças do meio ambiente urbano e os

flebotomíneos vetores constituem um pré-requisito para o desenvolvimento de ações

apropriadas de prevenção e estratégias de controle (GONTIJO; MELO, 2004).

2.3.1.3 Controle químico

A primeira tentativa de controle dos flebotomíneos usando inseticida foi feita com

diclorodifeniltricloroetano 5% (DDT) em focos de bartoneloses, no Peru, em 1944, com a

borrifação de cabanas, obtendo ação inseticida residual sobre Lutzomyia verrucarum por uma

semana (HERTIG; FAIRCHILD, 1948). Posteriormente, entre as décadas de 50 e 60, após

intenso trabalho para tentar erradicar a malária através do uso do DDT, observou-se que a

prevalência da leishmaniose em vários focos também caiu drasticamente, mas voltou aos

níveis prévios quando as borrifações foram suspensas (KISHORE et al., 2006). No Brasil,

esse inseticida foi usado pela primeira vez em 1954, contra focos de LTA no Rio de Janeiro

35

(NERY-GUIMARÃES; BUSTAMANTE, 1954). Tendo sido subseqüentemente utilizado em

campanhas de controle de Lu. longipalpis no Ceará, em algumas ocasiões os resultados foram

insatisfatórios, o que provavelmente se deveu a falha na aplicação do inseticida durante o

período apropriado (ALENCAR, 1961).

Devido às evidências decisivas contra o uso do DDT, conseqüência de seus efeitos

colaterais, ambiental e de risco a saúde humana (KISHORE et al., 2006), no Brasil, as

primeiras medidas restritivas se deram em 1971 quando foi proibida a fabricação e

comercialização de DDT e hexacloro-ciclo-hexano (BHC) para combate de ectoparasitos em

animais domésticos. Em 1985, proibiu-se em todo o território nacional a comercialização, o

uso e a distribuição de produtos organoclorados destinados à agropecuária. Mesmo assim,

esses inseticidas continuaram sendo permitidos em campanhas de saúde pública e em uso

emergencial na agricultura, a critério do Ministério da Agricultura (D’AMATO; TORRES;

MALM, 2002).

No momento a atenção está focada nos piretróides sintéticos, com aplicação destes

compostos nos domicílios e anexos do peridomicílio para o controle de flebotomíneos. Apesar

de amplamente utilizado, tem variado em eficácia, duração do impacto e no recurso requerido

pelas diferentes áreas endêmicas (GONTIJO; MELO, 2004; MAIA-ELKHOURY et al.,

2008). Os piretróides apresentam toxicidade nos mamíferos variando de baixa à moderada,

são pouco voláteis, tem alta atividade inseticida, seus efeitos independem do comportamento

do inseto e são necessárias baixas concentrações para causar efeito (KISHORE et al., 2006).

Foi o sucesso no uso de mosquiteiros impregnados com piretróides no controle do vetor da

malária que estimulou os estudos deste inseticida contra os flebotomíneos. Esta medida tem a

vantagem de poder ser empregada em nível doméstico/individual e pode ser disposta sem

grandes efeitos colaterais podendo ainda, controlar outros insetos picadores (MAROLI;

KHOURY, 2004). No Brasil, só há registro de um estudo controlado testando borrifações

intra e peridomiciliares com deltametrina para controle do vetor da LTA no estado do Espírito

Santo, onde embora tenha sido observado um bom efeito residual durante 12 meses pós-

tratamento, o inseticida só foi capaz de reduzir a densidade de flebotomíneos no

intradomicílio (FALCÃO et al., 1991).

Na prática a prevenção de doenças transmissíveis por vetores biológicos é bastante

difícil, ainda mais quando associada à existência de reservatórios domésticos e silvestres e aos

aspectos ambientais, incluindo aspectos físicos de utilização do espaço habitado (GONTIJO;

MELO, 2004). Nesse contexto, deve-se manter os animais domésticos distantes do

36

intradomicílio durante a noite, de modo a reduzir a atração dos flebotomíneos para este

ambiente (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007).

É importante ainda ressaltar que, em áreas rurais onde as habitações estão mais

dispersas e rodeadas por grandes populações de reservatórios, os resíduos das borrifações

realizadas nas casas podem ser ineficazes e não ter aplicabilidade, por razões logísticas

(MAROLI; KHOURY, 2004). O manual da LV, por exemplo, recomenda que o controle

químico seja realizado em todos os domicílios da localidade onde ocorreu a transmissão

(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Já o manual de LTA apresenta-se novamente mais

específico, indicando que a área a ser borrifada deve compreender um raio inicial de 500

metros em torno dos domicílios onde ocorreram os casos humanos, podendo esta distância ser

ampliada para um quilômetro quando as residências foram dispersas (MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2007).

Em resumo, o controle de flebotomíneos têm focado o uso de inseticidas químicos.

Essas medidas apesar de atrativas não são permanentes, além do que, a precariedade das

habitações, a descontinuidade e/ou o uso em épocas inapropriadas e os riscos ambientais

advindos da aplicação de inseticidas em ambientes silvestres, constituem fatores limitantes

para o controle de flebotomíneos (TEODORO et al., 2007).

2.3.1.4 Coleira impregnada com deltametrina

Também já foram tentadas experiências baseadas no controle do vetor e centradas no

reservatório canino, como os experimentos recentes com coleiras impregnadas com

deltametrina (CID) (Fig. 11), que têm mostrado resultados promissores na proteção dos

animais, com conseqüências na transmissão (GONTIJO; MELO, 2004).

Figura 11. Coleira de pvc impregnada com deltametrina (A) e esquema do seu mecanismo

de ação em cães (B). Fonte: http:// www.sin-mosquitos.com...index.asp

A B

37

Em áreas endêmicas para LV na Itália (MAROLI et al., 2001) e no Irã (MAZLOUMI

GAVGANI et al., 2002), foi demonstrado que cães usando a CID durante toda estação de

transmissão, apresentaram menor risco de infecção com Leishmania infantum. Outros estudos

também têm confirmado o efeito anti-picada do uso da CID contra Lu. longipalpis e

Lutzomyia migonei, com uma taxa de redução entre 81 e 100%, por até 35 semanas. Acredita-

se que o efeito epidemiológico da CID seja imediato não somente pela redução na taxa de

cães picados pelo vetor, como também pela elevada taxa de mortalidade dos flebotomíneos ao

tentarem alimentar-se nos cães com CID (DAVID et al., 2001). Acredita-se que como efeito

prático, a CID não só protege os cães como também reduz o risco de transmissão de

Leishmania em crianças, podendo atuar no controle da LVC e substituir a controversa

eutanásia de cães nos programas de controle de alguns países (MAZLOUMI GAVGANI et

al., 2002). Contudo, através de modelo matemático simulou-se comparativamente o controle

da LV através do uso da CID com a eutanásia de cães por um período de cinco anos,

observando-se que não houve diferença significativa entre os dois tratamentos

(REITHINGER et al., 2004).

Assim, a decisão de incluir a aplicação em massa da CID nos programas de controle

das leishmanioses no Brasil dependerá da sua aplicabilidade prática no campo, ou seja, uso

voluntário, eficiência na troca dos colares e do custo relativo da intervenção (MAZLOUMI

GAVGANI et al., 2002; DANTAS-TORRES, 2006), a fim de interromper o ciclo de

transmissão doméstico, sendo necessária para isso a implementação de estudos longitudinais

que demonstrem sua efetividade como medida de controle (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2006).

2.3.1.5 Vacina contra LVC como “bloqueadora de transmissão”

A primeira vacina contra a LVC, LeishmuneÒ da Fort Dodge Saúde Animal, foi

desenvolvida pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, a qual em testes de campo

foi capaz de proteger 92 a 95% dos cães vacinados contra LV (BORJA-CABRERA et al.,

2002). Apesar de ser uma medida diretamente voltada ao reservatório canino, estudos

experimentais demonstraram que fêmeas de Lu. longipalpis que se alimentam de cães

vacinados podem desenvolver receptores para os anticorpos produzidos pelo antígeno vacinal

ligante fucose-manose. Esses anticorpos, no intestino médio do vetor, bloqueiam o sítio de

ligação que seria usado pelo protozoário, não permitindo que novas formas de L. chagasi

ingeridas pelo inseto em outros repastos completem seu ciclo. Seus resultados foram

38

significativos tanto para L. infantum quanto para L. chagasi (SARAIVA et al., 2006). Os

achados deste estudo demonstraram que a vacina é um potencial bloqueador de transmissão,

abrindo uma nova perspectiva para o controle da LV através do bloqueio da transmissão

vetorial. Porém, ainda falta conhecimento sobre o impacto positivo que a vacina pode

provocar na saúde pública (DANTAS-TORRES, 2006). Por isso, o Ministério da Saúde ainda

não adotou a utilização desta vacina como medida de controle nas campanhas de saúde

pública contra LVC no Brasil. Além disso, os estudos até agora realizados não tem

demonstrado redução na incidência da LV humana, assim como ainda não há constatação de

seu custo-benefício e efetividade para o controle do próprio reservatório canino em programas

de saúde pública (WERKHAUSER, 2004).

Mais recentemente, foi lançada no mercado nacional uma vacina recombinante contra

LVC denominada Leish-TecÒ da Hertape Calier Saúde Animal S.A., desenvolvida por

pesquisadores da UFMG (HERMONT, 2008), esta vacina baseia-se em modificações

genéticas no DNA de L. chagasi e tem como antígeno a proteína recombinante A2

(FERNANDES, et al., 2008). Entretanto, até o presente momento não foram publicadas

pesquisas indicando possível efeito deste fármaco sobre o ciclo reprodutivo de Leishmania no

tubo digestvo do vetor.

2.3.1.6 Controle com plantas inseticidas

A necessidade de métodos mais eficazes e cada vez mais seguros no controle de

insetos também tem estimulado a busca de novos inseticidas em plantas (NOGUEIRA;

PALMÉRIO, 2001). As plantas têm sido importantes fontes de substâncias químicas ativas

contra insetos, tais como os piretróides (piretrina e aletrina) e os rotenóides. Estudos têm

demonstrado que alguns fitoquímicos agem em geral como tóxico contra adultos e larvas de

insetos, seja interferindo no crescimento e desenvolvimento do inseto e/ou na sua reprodução

ou produzindo ainda estímulo olfatório de atração ou repelência (ICMR Bulletin, 2003).

Os resultados comparativos do óleo de nim, Azadirachta indica, com N-dietil fenil

acetamida (DEPA) sobre P. papatasi demonstraram que o óleo utilizado por três dias nas

concentrações de 1% e 2% obteve efeito repelente significativamente superior

(SRINIVASAN; KALYANASUNDARAM, 2001). No Brasil, outro estudo testando

azadirachtina, um dos principais constituintes do neem, demonstrou que 0,1; 1,0 e 10,0g de

azadirachtina adicionados à dieta de larvas de Lu. longipalpis aumentou sua mortalidade em

mais de 70%, tendo as menores doses bloqueado a ecdise das larvas no terceiro estágio,

39

enquanto a maior dose chegou a bloquear a muda ainda no segundo estágio larvar. Os

resultados indicam que o neem como um potente inibidor do desenvolvimento de Lu.

longipalpis (COELHO et al., 2006).

Muitas outras espécies de plantas têm sido descritas na literatura como possuidoras de

atividade inseticida e/ou repelente. Luitgards-Moura et al. (2002) testaram o efeito de extratos

de Antonia ovata e Derris amazonica, sobre adultos de Lu. longipalpis tendo sido observada

taxa de mortalidade de 80% e de 100% respectivamente, após 72 horas de exposição. O efeito

repelente e anti-alimentar do óleo de alho (Allium sativum) foi avaliado sobre fêmeas de P.

papatasi, na diluição de 1% o óleo apresentou efeito repelente de 97% e anti-alimentar de

100% (VALERIO; MAROLI, 2005). Neste contexto, muitos trabalhos têm sido realizados

avaliando a atividade biológica de componentes de plantas contra um grande número de

patógenos e artrópodes (SHAALAN et al., 2005). Contudo muitos questionamentos sobre a

toxicidade dos princípios ativos dessas plantas ainda precisam ser elucidados antes de tornar

público o uso desses extratos.

2.3.1.7 Controle biológico

O uso indiscriminado de inseticidas, além do desenvolvimento de resistência, causa o

desequilíbrio ecológico, de maneira que outras espécies podem disseminar-se ou ter sua

população reduzida. Esses fatos associados às inúmeras doenças transmitidas por dípteros

resultaram na necessidade de desenvolver novas alternativas de controle. A exigência mundial

por produtos de qualidade força os países exportadores de insumos, a apresentarem menores

índices de agrotóxicos, reforçando a biotecnologia, na utilização de seres vivos, para o

desenvolvimento de processos e produção de bioinseticidas (CAMPOS et al., 2005). Estes são

geralmente mais específicos, exibindo nenhuma ou pouca toxicidade e são considerados

menos prejudiciais para o ambiente do que os praguicidas químicos (HYNES;

BOYETCHKO, 2006).

Uma alternativa sugerida é o uso de Bacillus thuringiensis var. israelensis (Fig. 12) ou

Bacillus sphaericus (Fig. 13), atualmente utilizados no controle de larvas de mosquitos e

moscas pretas.

40

No tocante aos flebotomíneos, experimentos laboratoriais avaliando o efeito de B.

thuringiensis var. israelensis sobre P. papatasi e Lu. longipalpis obtiveram resultados

satisfatórios sobre a mortalidade larvar (DE BARJAC; LARGET; KILLICK-KENDRICK,

1981). Ademais, foi demonstrado que larvas e pupas de P. papatasi alimentadas com dieta

contaminada com esse bacilo reduziram a longevidade de adultos de forma dose-dependente,

sugerindo que B. thuringiensis pode ser usado principalmente como adulticida (WAHBA;

LABIB; EL HAMSHARY, 1999). B. sphaericus também foi testado sobre Phlebotomus

martini com efeito adulticida significativo (ROBERT et al., 1997) e sobre P. papatasi com

redução do número de insetos sobreviventes e da fecundidade das fêmeas que emergiram das

pupas infectadas (WAHBA, 2000). Contudo, Hynes e Boyetchko (2006) relataram

dificuldades encontradas na fabricação destes produtos, com registro de ocorrência de

fermentação, problemas de formulação e pesquisas de mercado inadequadas, o que resultou

na retirada destes produtos do mercado.

Além de Leishmania spp. os flebotomíneos neotropicais também são hospedeiros de

outros protozoários, como as gregarinas (LEWIS; LAINSON; SHAW, 1970), cuja espécie

Ascogregarina chagasi (Fig. 14) é conhecida por reduzir tanto a longevidade como produção

de ovos de Lu. longipalpis e pode efetivamente destruir colônias em laboratório

(DOUGHERTY; WARD, 1991). Contudo, até que ponto este parasito poderia ser usado no

controle biológico de flebotomíneos ainda é questionável (LAINSON; RANGEL, 2005).

Vale ressaltar ainda que, entre os organismos que atuam no controle biológico natural

de dípteros, os fungos entomopatogênicos em geral, apresentam taxas mais eficientes e

exibem maior especificidade sobre o inseto-alvo do que os inseticidas químicos. As espécies

de fungos que atacam vários hospedeiros devem ser preferidas nos programas de controle,

Figura 12. Esporos e cristais biopiramidais de Bacillus thuringiensis var. israelensis (1mm).

Fonte: http://vietsciences.free.fr/...

Figura 13. Bacillus sphaericus (1mm). Fonte: http:// ambre.jaune.free.fr/dinosaure_suite.htm

41

porque podem ser usadas em várias áreas. Entre estas espécies destaca-se Beauveria bassiana

(BARRETO et al., 2004).

Figura 14. Ascogregarina chagasi, protozoário parasito natural de Lu. longipalpis. Fonte: http:// www.bio.ilstu...Ascogreg-bar.jpg

Na Colômbia, experimento com papel filtro embebido com conídios de B. bassiana

aumentou a mortalidade de P. papatasi e Lu. longipalpis (Fig. 15) adultos quando em contato

direto com o corpo do inseto e demonstrou também que esporos de B. bassiana não teve

nenhum efeito patogênico sobre P. papatasi quando diluído em solução de sacarose para

alimentação desses insetos (WARBURG, 1991). Estes dados são coerentes com o fato que a

maior parte dos fungos entomopatogênicos só infecta a hemocele após a penetração da

cutícula e não através do tubo digestivo. A cutícula serve então de primeira barreira à

infecção, as variações na topografia e composição química de superfície cuticular, incluindo

efeitos fungistáticos, afetam a suscetibilidade aos fungos (JAMES; BUCKNER; FREEMAN,

2003). Também foi observada uma significativa queda na postura de fêmeas infectadas,

chegando a não haver postura de Lu. longipalpis (WARBURG, 1991). Contudo, Reithinger et

al. (1997) não conseguiram reproduzir os mesmos resultados em laboratório com Lutzomyia

young, no qual o tempo de sobrevivência dos insetos tratados foi significativamente maior

quando comparado ao controle. Mas, na fase de campo em plantações de café também na

Colômbia, os resultados obtidos foram significativos.

42

Figura 15. Fêmea de Lu. longipalpis após 5 dias de infecção com 107 conídios/ml de B. bassiana. Fonte: AMÓRA, 2007

Recentemente, em Minas Gerais, foi caracterizado um nematóide parasito intestinal de

Lu. longipalpis. Seu ciclo de vida e morfologia mostra que o parasito é membro da ordem

Rhabditida e da família Steinernematidae, mas a descrição da espécie ainda não foi concluída

(Fig. 16). O ciclo é simultâneo ao de Lu. longipalpis e a transmissão é direta. Acredita-se que

situações de estresse para os insetos podem aumentar a colonização por esse parasito,

consequentemente interferindo no desenvolvimento do inseto. Sugere-se então, que num

futuro próximo este parasito possa ser utilizado no controle biológico deste vetor com

segurança, em face de sua habilidade infecciosa, poder letal sobre os flebotomíneos e ausência

de risco de contaminação aos vertebrados (SECUNDINO et al., 2002).

Figura 16. A - Lu. longipalpis dissecado infectado com larvas filiformes de nematóide em torno do corpo (s) e das asas (w), sob microscopia interferência com o filtro azul.

B – Ovos e larvas de nematode isoladas a partir de uma infecção flebotomíneos observada sob microscopia de fluorescência. Fonte: SECUNDINO et al., 2002.

B

43

Atualmente os estudos sobre controle biológico de flebotomíneos ainda são escassos e

como a aplicação de biolarvicidas nas condições de campo ainda é difícil, devido à

diversidade de habitat de procriação deste vetor, a aplicação prática deste método parece estar

limitada ao seu uso no controle de vetores adultos da LV (KISHORE et al., 2006).

2.4 FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS

Fungos entomopatogênicos são agentes naturais importantes no controle da muitos

insetos, incluindo várias pragas agrícolas. O controle biológico, em particular quando

realizado por estes patógenos é uma técnica que tem sido considerada como principal fator

nos programas de controle integrado de pragas, principalmente quando se almeja a redução na

densidade populacional de um determinado inseto (OLIVEIRA; NEVES; KAWAZOE, 2003).

O princípio deste método é que, mediante contato tarsal, esporos de fungos aderem-se

ao tarso, penetram a cutícula e crescem internamente, algumas vezes produzindo toxinas,

como a beuvericina e bassianolide de B. bassiana, por exemplo, que culminam na morte do

inseto (SCHOLTE et al., 2007). Esta é uma vantagem em relação a maioria dos outros agentes

de biocontrole, tais como bactérias, vírus, nematóides ou protozoários, os quais precisam ser

ingeridos pelo inseto-alvo. Estes patógenos têm mostrado ser um método alternativo de

controle contra muitos insetos (SOARES; TURCO, 2003).

Embora o efeito do fungo não seja imediato, o uso de entomopatógenos tem vantagens

importantes também sobre o uso de inseticidas químicos. É razoável supor que devido ao fato

de toxinas estarem envolvidas na patogenicidade do fungo há um risco menor de

desenvolvimento de resistência. Associado a isso, esses fungos não são nocivos para aves,

peixes ou mamíferos (ZIMMERMAN, 1993). A preocupação sobre a toxicidade destes

agentes surgiu devido aos seus supostos efeitos sobre a saúde humana quando utilizados em

ambientes fechados e/ou próximos de indivíduos imunocomprometidos (WARD et al., 2005).

Atualmente, este risco é considerado baixo devido à natureza do patógeno oportunista e a falta

de associação com os seres humanos. E por fim, o fato de entomopatógenos normalmente

serem aplicados em formulações reduz a possibilidade de contato com o homem (SCHOLTE

et al., 2007).

Assim, o conhecimento da patogenicidade de fungos e sua interação trófica são

indispensáveis para o entendimento e sua utilização em programas de controle biológico

(ALVES, 1998). Vários fungos entomopatogênicos já estão em uso para o controle de pragas

agrícolas e veterinárias, o que demonstra a viabilidade técnica deste biocontrole de no que diz

44

respeito à aceitabilidade e assuntos regulatórios (SCHOLTE et al., 2007). As espécies de

fungos que atacam vários hospedeiros são preferidas nos programas de controle biológico,

porque podem ser usadas em várias áreas. A exemplo destas espécies destaca-se, Beauveria

bassiana e Metarhizium anisopliae (BARRETO et al., 2004; WESTWOOD; HUANG;

KEYHANI, 2005).

2.4.1 Beauveria bassiana

O fungo entomopatogênico, B. bassiana (Balsamo) Vuillemin (Deuteromycotina:

Hyphomycetes) foi implicado como um inseto patógeno em 1835, quando Bassi mostrou que

esse fungo é o agente causador da muscardina do bicho-da-seda (XU et al., 2009). O interesse

atual em B. bassiana como um agente de controle biológico de insetos-praga e vetores de

doença decorre do fato de que é o fungo mais comumente isolado de insetos mortos e

moribundos na natureza (KAUFMAN et al., 2005; XU et al., 2009). No campo ocorre de

forma enzoótica e epizoótica em Coleoptera, Lepidoptera e Hemiptera e de forma enzóotica

sobre Diptera, Hymenoptera e Orthoptera (ALVES, 1998). De ocorrência cosmopolita, pode

ser freqüentemente coletado em insetos e amostras de solo, onde pode subsistir por longo

tempo atuando no hospedeiro em todos os estádios de desenvolvimento (MACIEL et al.,

2005; MEYLING; EILENBERG, 2006). É um importante fungo entomopatogênico

atualmente em desenvolvimento como bio-agente de controle de uma variedade de insetos-

praga (WESTWOOD; HUANG; KEYHANI, 2005).

Sua colônia tem as seguintes características: filamento micelial de cor branca (Fig. 17-

A), cilíndrico, 3,5 mm de diâmetro, hialino, septado, conidióforos simples ou ramificados

(Fig. 17-B), ovóides, célula conidiogênica em forma de garrafa com terminação em zigue-

zague, medindo de 1,5 a 5 mm e conídios globosos (0,5 a 1 mm) (MAcLEOD,1954).

O ciclo biológico apresenta duas fases distintas, uma fase sapróbia e outra parasitária.

Na fase sapróbia, os conídios germinam, produzindo tubos germinativos, que posteriormente

formam o micélio. Este que se caracteriza por hifas hialinas e septadas, que originam

conidióforos simples ou ramificados, estrutura na qual são formados os conídios, quando

então, o ciclo se repete (ALVES, 1998). A fase parasitária se inicia com a penetração

tegumentar devido à ação mecânica e enzimática, o que ocorre aproximadamente 12 horas

após contato com a cutícula do inseto (BROOME; SIKOROWWSKI; NORMENT, 1976).

Após a penetração, o micélio atinge a hemolinfa do inseto onde são formadas as estruturas

leveduriformes (LUNA-ALVES LIMA; TIGANO, 1989). Antes de ocorrer a morte do inseto,

o micélio invade gradualmente os tecidos. Depois da colonização do hospedeiro, as hifas

45

emergem para o exterior onde se desenvolvem os conidióforos e os conídios que são dispersos

no meio ambiente. A morte do inseto, que ocorre por destruição tecidual e ocasionalmente por

toxinas produzidas pelo fungo como a beuvericina, por exemplo (CONNOLE, 1969), marca o

final da fase parasitária do fungo (FERRON 1978).

Os fungos filamentosos são conhecidos por serem prolífico produtores de metabólitos

secundários (KELLER; TURNER; BENNETT, 2005), muitos dos quais poderão também

participar de várias interações bióticas incluindo processos patogênicos. Deste modo B.

bassiana produz vários metabólitos secundários de variadas estruturas, com destaque para

bauvericina e bassianolide. Estes exibem potente atividade antibiótica, antifúngica, herbicida,

insecticida e nematicida, inibem resistência por parte dos insetos, proliferação de células

cancerígenas e motilidade celular (HAMILL et al., 1969; CARMELIET, 2003; JOW et al.,

2004; ZHAN et al., 2007; JIRAKKAKUL et al., 2008; XU et al., 2009). No entanto, a

contribuição destes metabolitos para patogênese de B. bassiana ainda é desconhecida. Em

contrapartida, recentemente foi demonstrado que estes metabólitos embora significativos não

sejam fator essencial para a virulência de B. bassiana (XU et al., 2008; XU et al., 2009).

Assim, estes metabolitos, bem como outros metabólitos secundários de fungos, mesmo que

não tenha um papel direto na patogênese fúngica, pode agir na natureza como agentes de

competição, defendendo o nicho que favorece o crescimento fúngico atuando como

antibióticos, antifúngicos, inseticidas e nematicidas contra parasitas e saprófitas (XU et al.,

2009).

A velocidade de ação do fungo depende, além da dosagem, das espécies hospedeiras

envolvidas e da habilidade de seus conídios em reconhecer e produzir enzimas para degradar

Figura 17. Beauveria bassiana: A - Macroscopia da colônia, filamento micelial de cor branca cilíndrico; B – Microscopia, hifas, comídios e conidióforos maduros, simples ou ramificados, ovóides e conídios globosos corados em azul de Amann (setas), 640x. Fontes: AMÓRA, 2007; FEIJÓ, 2004.

A B

46

a cutícula do hospedeiro. Quando as condições de temperatura e umidade são favoráveis o

fungo cresce no exterior do corpo do hospedeiro, produzindo filamentos micelial de cor

branca, cilíndrico, textura veludosa ao algodonosa e/ou grumosa. Estas hifas externas

produzem conídios que amadurecem e são lançados no ambiente pela ação do vento e chuva

completando o ciclo (ALVES, 1998). B. bassiana também age através da penetração na

cutícula dos insetos com subseqüentemente infecção dos tecidos internos por uma

combinação de pressão mecânica e degradação enzimática (FERRON, 1978). Sendo

considerado o mais eficiente agente de controle microbiano de insetos praga (NEVES;

HIROSE, 2005).

Estudos sugerem que este fungo seja também patogênico a vários importantes vetores

de doenças, incluindo dípteros da subfamília Phlebotominae (WARBURG, 1991;

REITHINGER et al., 1997). Foi demonstrado que papel de filtro embebido com conídios de

B. bassiana aumentou a mortalidade de P. papatasi e de Lu. longipalpis adultos

(WARBURG, 1991), resultados semelhantes também foram obtidos por Reithinger et al.

(1997). Igualmente, foi demonstrada a patogenicidade deste fungo sobre outros dípteros como

Culex pipiens pipiens e Aedes aegypti (SIERRA et al., 1995), ovos de Haematobia irritans

(ANGEL-SAHAGÚN et al., 2005) e de Chrysomya albiceps (FEIJÓ et al., 2008), e sobre

ninfas do carrapato Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) (FERNANDES et al., 2003).

No que diz respeito à interação do controle químico e biológico, o efeito fungitóxico

in vitro de diferentes formulações de compostos químicos, incluindo piretróides, tem sido

avaliado sobre B. bassiana mostrando resultados promissores. O uso de alfacipermetrina,

ciflutrina e deltametrina em baixas concentrações, foi compatível com o fungo B. bassiana

(NEVES et al., 2001; OLIVEIRA; NEVES; KAWAZOE, 2003). Por conseguinte, após um

produto químico ter sido verificado como inócuo ao entomopatógeno em laboratório, ele irá,

sem dúvida, ser seletivo em condições de campo. Pois os estudos in vitro têm a vantagem de

expor o microrganismo aos produtos/formulações em todas as condições possíveis, o que não

ocorre sob condições de campo, onde vários fatores funcionam como barreiras contra essa

exposição, protegendo os entomopatógenos (ALVES, 1998). No campo, diminuir o impacto

ambiental de substâncias químicas tóxicas ao ambiente e aos fungos entomopatogênicos,

considerado os estudos de formulações compatíveis com o fungo em ensaios in vitro podem

ser seguros para uso nos programas de controle integrado de insetos (DIPIERI et al., 2005).

Outro importante fator a ser considerado é a seletividade dos entomopatógenos quando

comparados aos compostos químicos. Um estudo demonstrou que o parasitismo presente em

instalações avícolas tratadas com B. bassiana para controle da mosca doméstica, não diferiu

47

significativamente das instalações tratadas com piretrina, mas B. bassiana foi mais seletiva

quando comparada ao piretróide, pois não interferiu na população de um importante besouro

predador de larvas dessas moscas, Carcinops pumilio (Coleoptera: Histeridae), encontrados

em maior abundância nas instalações tratadas com B. bassiana (KAUFMAN et al., 2005).

No entanto, é evidente que o efeito patogênico de B. bassiana sobre adultos e larvas

seja baixo no período inicial pós-tratamento. Quando Kaufman et al. (2005) compararam o

uso desse fungo com a piretrina, foi observado que ambos sistemas de tratamento resultaram

em níveis semelhantes de atividade contra moscas domésticas. Na conclusão do estudo,

entretanto, destacou-se a importância de compreender que o período crítico de aumento

populacional desse inseto ocorre normalmente durante 4,8 semanas, período no qual foi

observado estabelecimento fúngico com efeito deletério sobre a larva de mosca doméstica

superior ao observado com o uso de piretrina. Deve-se ter em mente que a lentidão do

resultado esperado, comparativamente com a natureza de ação deste patógeno, de tal forma

que o controle biológico não funcionará em um surto populacional de moscas. Ou seja, é mais

útil que um produto como este seja usado como um método pró-ativo em vez de esperar o

problema se estabelecer. Por fim, o bom uso de B. bassiana vai exigir, sem dúvida, um

programa educacional aos produtores e técnico em saúde para introduzir o conceito de fungo

patogênico à base da gestão de controle de insetos de importância em saúde pública

(KAUFMAN et al., 2005).

No tocante à biossegurança, raramente são verificadas espécies de Beauveria como

agentes de infecção humana (HENKE et al., 2002). Contudo, os poucos casos relatados de B.

bassiana como agente de ceratite micótica e infecção pulmonar foram resolvidos com terapia

antifúngica sistêmica à base de anfotericina B e/ou itraconazol sem reicidiva (KISLA et al.,

2001; TUCKER et al., 2004). Uma justificativa para as ocorrências de micoses por B.

bassiana é que espécies desse gênero podem ter potencial para crescer em tecidos de

pacientes imunocomprometidos (BEAUMONT et al., 1985). Dessa forma, para determinar

sensibilidade a este organismo é necessária a identificação de alérgenos específicos de B.

bassiana a fim de proporcionar uma base de atenuação desses alérgenos originando produtos

de biocontrole mais seguros (WESTWOOD; HUANG; KEYHANI, 2005).

Até o momento, foi atribuído à B. bassiana biossegurança nível 1 sendo considerado

um bioinseticida absolutamente seguro para seres humanos, enquanto os membros restantes

do gênero ainda não foram classificados (HENKE et al., 2002). É importante ressaltar que

produtos à base de B. bassiana usados como inseticidas biológicos foram aprovados desde

48

1999 pela Agência de Proteção Ambiental norte-americana para uso em qualquer tipo de

comida e alimentos de colheita (TUCKER et al., 2004).

2.4.2 Metarhizium anisopliae var. acridum

A espécie Metarhizium anisopliae caracteriza-se pelo seu abundante crescimento em

meios artificiais e na superfície de insetos (AZEVEDO, 1985). Considerado o fungo de maior

grau de infectividade e patogenicidade contra gafanhotos (GOETTEL; JONSHON; INGLIS,

1995), vem sendo estudado com grande interesse no controle biológico de várias espécies de

insetos (KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004). Alves (1998) ressaltou que este fungo é capaz

de infectar mais de 200 espécies de insetos, e já foi usado para o controle de barbeiros dos

gêneros Panstrongylus, Rhodnius e Triatoma, transmissores da doença de Chagas (LUZ et al.,

1998).

O ciclo biológico de Metarhizium spp. pode apresentar duas fases: uma sapróbia e

outra parasitária. Na sapróbia, o ciclo pode se iniciar com a conidiogênese de conídios. Estes

emitem um ou mais tubos germinativos, que se diferencia em hifas, que se conduzem num

intrincado sistema de entrelaçamento, constituindo-se em micélio (RIBEIRO et al., 1992).

Neste, à medida que o fungo se desenvolve, surgem os conidióforos. Na extremidade destes,

diferenciam-se as fiálides, que produzem no ápice, conídios. Segundo Hamill (1981), os

conídios podem apresentar variação quanto à forma, à dimensão, e ao número de núcleos.

Quanto à coloração, em culturas jovens, os conidióforos e os conídios são de cor branca,

tornando-se esverdeados com o amadurecimento da colônia (Fig. 18). O ciclo se repete dando

origem a novos conídios (RIBEIRO et al., 1992). Na fase parasitária, estes fungos também

agem por penetração no tegumento, onde a hifa origina as estruturas leveduriformes dentro do

hospedeiro e estas formam os conídios que viabilizam a manutenção do fungo no cadáver do

inseto (ZACHARUK, 1971), os conídios germinam e formam apressórios (Fig. 19) que

penetram no hospedeiro por ação mecânica (FERRON, 1981) e enzimática (ROBINSON,

1966; ST. LEGER et al., 1996). No interior do inseto, diferenciam-se em estruturas

leveduriformes (LUNA-ALVES LIMA; TIGANO, 1989), as quais secretam toxinas que

invadem o tecido do inseto. Após a morte, as hifas emergem de dentro do inseto, formam

conidióforos e conídios, que se dispersam e reiniciam a fase sapróbia, fora do inseto.

49

Figura 18. Conídios de M. anisopliae var.

acridum, formato ovóide e coloração esverdiado (400x). Fonte: AMÓRA et al., 2007

Figura 19: Apressórios de M. anisopliae var. acridum ao longo do eixo hifal após 96h de

cultivo em lâmina em BDA, corado com azul de Amann (400x). Fonte: AMÓRA et al., 2007

Especificamente, M. anisopliae var. acridum (Ascomycota: Hypocreales) [ex-

Metarhizium flavoviride e agora reclassificado (DRIVER; MILNER; TRUEMAN, 2000)] foi

descrito pela primeira vez por Gams e Rozsypal (1973) e vem sendo estudado com grande

interesse no controle biológico de várias espécies de insetos (Fig. 20) (KUKLINSKY-

SOBRAL et al., 2004). É conhecido pela sua eficiência no controle de gafanhotos no Brasil e

no exterior (FARIA; MAGALHÃES, 2001).

Atualmente é comercializado sob a marca “Green Muscle” e “Green Guard” para o

controle de pragas e gafanhotos (Acrididae) na África e na Austrália, respectivamente (ENTZ;

JOHNSON; KAWCHUK, 2005). No Brasil tem sido utilizado de forma eficiente no controle

do gafanhoto Rhammatocerus schistocercoides (Orthoptera: Acrididae) com efeito patogênico

também sobre organismos não-alvo, incluindo outros Orthoptera, Diptera e Hymenoptera

(MAGALHÃES et al., 2001). Além disso, já foi testado sobre larvas de B. microplus com

eficácia de 97% (BAHIENSE; FERNANDES; BITTENCOURT, 2006) e adultos de

Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae) com 99% de eficácia em 19 dias (BANFORD;

THOMAS, 2001).

Apesar da importância desse entomopatógeno para a agricultura, seu aspecto biológico

e patogenicidade sobre dípteros de importância na saúde pública ainda não foram

suficientemente explorados (VIEIRA et al., 2007). Ademais, antes da liberação de um agente

biológico, a capacidade de identificar e acompanhar de perto o seu impacto sobre o inseto-

alvo, persistência e destino no ambiente deve ser demonstrada (ENTZ; JOHNSON;

KAWCHUK, 2005).

50

No Brasil, a avaliação da ação patogênica de fungos sobre dípteros psicodídeos tem

sido incipiente e o controle biológico pode ser de grande valia no manejo integrado de

flebotomíneos de interesse em saúde pública. No entanto, experimentos adicionais

considerando os meios de produção in vitro, fatores ambientais e métodos de exposição no

campo são necessários para determinar o momento, as freqüências das aplicações e assim

melhorar suas formulações. Uma análise mais aprofundada dos efeitos que os flebotomíneos

podem causar sobre a viabilidade e infectividade do fungo também precisam ser investigadas.

Com a implantação do controle biológico desses dípteros, menos inseticidas químicos terão de

ser usado, resultando em benefícios para o homem e para o ambiente.

2.4.3 Confirmação da infecção pelos fungos B. bassiana e M. anisopliae var. acridum

2.4.3.1 Crescimento fúngico pós-infecção e características microscópicas

Estudos de comportamento, tais como conidiogênese, esporulação, número de colônias

e crescimento radial (ALMEIDA; ALBUQUERQUE; LUNA-ALVES LIMA, 2005) são

importantes para definir a virulência de um isolado fúngico e realizados para auxiliar na

caracterização de fungos entomopatogênicos (LIU et al., 2003). Além de permitir a seleção de

linhagens que apresentem vantagens como produção massal de micélio e estabilidade de

inóculo, deste modo a infecção no hospedeiro ocorre de forma mais rápida, justificando a

eficácia no campo e potencializando a ação do controle biológico de insetos-praga (FEIJÓ et

al., 2007) e vetores de doenças. Vale ressaltar que, a manutenção da viabilidade do patógeno é

importante no controle microbiano, devendo-se manuseá-lo adequadamente para manter sua

Figura 20. M. anisopliae var. acridum: A - Macroscopia da colônia, filamento micelial de cor esverdeado. B – Microscopia, conidióforos ramificados corados em azul de Amann, 640x. Fontes:

AMÓRA, 2007; FEIJÓ, 2004

A B

51

virulência ou melhorá-la através de métodos genéticos, físicos, químicos e/ou processos

biológicos (ALMEIDA; ALBUQUERQUE; LUNA-ALVES LIMA, 2005).

A eficácia do crescimento radial ou vegetativo está diretamente associada à velocidade

de infecção no hospedeiro, mas também pode diferir entre isolados de uma mesma espécie

(FEIJÓ et al., 2007). De acordo com Kalsbeek, Pell e Steemberg (2001), o fungo apresenta

um número maior de esporos após passagem em insetos. A rápida esporulação pode ser um

importante critério para seleção de isolados fúngicos auxiliando na propagação de epizootias,

além de ser uma vantagem em relação às defesas humorais de insetos (MITCHELL, 2003).

Contudo, fatores abióticos como temperatura e umidade podem alterar a esporulação

(ALVES, 1998; TEFERA; PRINGLE, 2003) já que o crescimento vegetativo só vai ocorrer

ou se tornar viável dentro do corpo do hospedeiro e raramente em matéria de ambiente na

forma saprofítica (HIROSE et al., 2001; NEVES et al., 2001).

A conidiogênese (Fig. 21) outro fator importante, considerando que uma elevada taxa

de conídios germinados é diretamente proporcional à virulência do isolado. No entanto, esse

parâmetro pode ser influenciado pela forma de armazenamento, presença de nutrientes e

modo de exposição do fungo ao hospedeiro (ALVES, 1998; FERNANDEZ et al., 2001).

Figura 21. Conidiogênese de conídios de B. bassiana (A) e M. anisopliae var. acridum (B) após 16h de inoculação em BDA, reisolados de Lu. longipalpis. Fonte: AMÓRA. 2007

No que se refere aos aspectos morfológicos para B. bassiana, por exemplo, as

anastomoses (Fig. 22-A) são importantes para realização do ciclo parassexual, o qual se

processa através da plasmogamia, estabelecimento do heterocário e formação de diplóides e

recombinantes mitóticos (PACCOLA-MEIRELLES; AZEVEDO, 1991). Os conidióforos ao

longo do eixo hifal (Fig. 22-B), por sua vez, são característicos desta espécie (DE HOOG,

1972).

A B

52

Figura 22. Cultivo em lâmina de B. bassiana em BDA corados em azul de Amann (1000x): Anastomose após 48h de crescimento (A - setas) e conidióforos maduros (B) após 120h.

Fonte : AMÓRA, 2007

Quanto à identificação do gênero Metarhizium, tradicionalmente, este também é

realizado através da observação da morfologia, funcionalidades nos meios de cultura,

bioensaios em insetos-alvo, exame microscópico de conídios e estruturas associadas,

resultando no reconhecimento inicial de três espécies, M. anisopliae, M. flavoviride e

Metarhizium album. No entanto, sobreposição de conídios, tamanhos variados e outras

características levantam incertezas sobre as relações taxonômicas entre espécies desse gênero

o que dificultam sua identificação (ENTZ; JOHNSON; KAWCHUK, 2005). Dados

freqüentemente encontrados em condições ambientais e fisiológicas diferentes possibilitando

que conídios e blastosporos de M. anisopliae apresentem tamanhos e forma variável

(GLARE; MILNER; BEATON, 1996) podendo haver ainda diferenças na morfologia da

colônia entre isolados de uma mesma variedade (MILNER et al., 2003). Ademais, mesmo

estruturas comuns da espécie como os apressórios, sítios de aderência e produção de enzimas

que ajudam na penetração da cutícula do inseto-alvo e na nutrição (ST. LEGER et al., 1989),

podem não desenvolver-se a partir da infecção de agentes com uma estreita gama de

hospedeiros como é o caso de M. anisopliae var. acridum, indicando baixa conidiogênese no

inseto-alvo e prejudicando a identificação do patógeno (WANG; ST. LEGER, 2005). E

embora os bioensaios em insetos-alvo sejam utilizados como um método sensível para

detecção de M. anisopliae var. acridum, deve-se ter cautela, pois em geral, tem ocorrido

falhas na detecção de um isolado devido à temperaturas desfavoráveis no hospedeiro-alvo e,

consequentemente, baixos níveis do patógeno reisolado (ENTZ; JOHNSON; KAWCHUK,

2005).

A B

53

Os estudos citológicos, por sua vez, envolvem a variação na forma, dimensão e

número de núcleos como forma de caracterização de isolados fúngicos. São necessários para

se conhecer e compreender os fenômenos de variabialidade genética, contudo, o

aprimoramento de técnicas de coloração no nível óptico como também eletrônico renovaram

conceitos, dando maior significado ao estudo e conhecimento celular de estruturas vegetativas

e reprodutivas (FEIJÓ et al., 2007). No entanto, com o advento da biologia molecular,

atualmente é perfeitamente possível diferenciar linhagens mesmo quando estas apresentam

características citológicas e morfológicas semelhantes.

2.4.3.2 Biologia molecular para diagnóstico de B. bassiana e M. anisopliae

Presumi-se geralmente que um isolado fúngico obtido a partir de uma determinada

espécie está adaptado ao inseto que hospedam. No entanto, muitas infecções em insetos

podem ser causadas por associações de fungos oportunistas geralmente isolados. Tais

infecções podem comprometer o resultado de um bioensaio onde as condições fisiológicas do

teste podem favorecer uma variedade ecológica de hospedeiros e comprometer a

especificidade da infecção. Partindo da afirmativa que análises comparativas de seqüências de

nucleotídeos do complexo gênico do RNA ribossômico nuclear de fungos demonstraram

grande variação inter e intra-específica, essa informação deve ser utilizada para fins de

identificação (AQUINO DE MURO; MEHTA; MOORE, 2003), análise filogenética e

taxonômica (ENTZ; JOHNSON; KAWCHUK, 2005).

Marcadores moleculares têm sido utilizados para avaliar a variação genética entre os

isolados de B. bassiana e outros fungos entomopatogênicos, proporcionando assim meios para

identificar estirpes de interesse, determinar a origem dos isolados ou estudos populacionais

(CASTRILHO; VANDENBERG; WRAIGHT, 2003). Nesse contexto, impressões digitais de

DNA obtido a partir de RFLP, polimorfismo do comprimento dos fragmentos terminais de

restrição, são úteis para diferenciar mutantes de B. bassiana da sua estirpe parental

(BERRETTA et al., 1998). A análise AFLP, polimorfismo do comprimento do fragmento

amplificado, normalmente associada com cDNA (DNA complementar), também possui boa

reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (PATHAN et al., 2007), é um método

confiável de monitorização simultânea da expressão diferencial de vários genes, uma vez que

permite uma ampla análise genômica da expressão gênica, com a vantagem de não necessitar

de qualquer informação seqüencial (REIJANS et al., 2003). Estes métodos têm sido

amplamente utilizados para analisar variações genéticas entre cepas, bem como entre

54

populações de B. bassiana (BERRETTA et al., 1998; WANG et al., 2003; PATHAN et al.,

2007).

A técnica denominada RAPD (amplificação aleatória de DNA polimórfico) desde o

seu desenvolvimento (WILLIAMS et al., 1990) tem sido largamente utilizada na identificação

de vários organismos incluindo fungos entomopatogênicos da espécie M. anisopliae (FEGAN

et al., 1993; LEAL et al., 1994) e B. bassiana (CASTRILHO; VANDENBERG; WRAIGHT,

2003; FERNANDES et al., 2006). Do ponto de vista do controle microbiano, essa técnica

gera “impressões digitais” de isolados e permite que a eficácia e persistência de um

determinado isolado usado como agente biológico seja monitorizado (CASTRILHO;

VANDENBERG; WRAIGHT, 2003). Além disso, sua utilização pode gerar marcadores

específicos para distinguir isolados patogênicos de não-patogênicos (CRAVANZOLA et al.

1997). Todavia, RAPD obtidos com eletroforese em gel de agarose convencionais são difíceis

de quantificar devido ao deslocamento de bandas e outros artefatos relacionados com o gel.

Para minimizar estes problemas passou-se a utilizar o seqüenciamento automático de DNA

por laser (BARRETTA t al., 1998).

Genomas mitocondriais evoluem mais rapidamente do que os seus homólogos nuclear

(BURGER; GRAY; LANG, 2003). Por conter introns, elementos móveis e de regiões

intergênicas longa e variável (KOUVELIS; GHIKAS; TYPAS, 2004), exibem extensos

tamanhos e polimorfismo em amplicons de RFLP, RAPD e PCR (HEGEDUS;

KHACHATOURIANS, 1993; KOUVELIS et al., 2008), que podem ser analisados em nível

de nucleotídeos e fornecer resultados mais informativos/discriminatório (GHIKAS;

KOUVELIS; TYPAS, 2006). Pantou, Mavridou e Typas (2003) trabalhando com o fungo M.

anisopliae comprovaram que regiões mitocondriais intergênicas são ainda mais informativas

do que IGS, espaço ribossomal intergênico, região conhecida por ser a nuclear região mais

variável, uma vez que permitiu a discriminação entre isolados idênticos (GHIKAS;

KOUVELIS; TYPAS, 2006). Estudos similares trabalhando com a região mitocondrial nad3-

atp9 demonstraram através de PCR a amplificação de fragmentos com 425-436pb

(KOUVELIS et al., 2008), propondo que regiões mitocondriais intergênicas podem conter

informação para o desenvolvimento de ferramentas para inter-discriminação específica destes

fungos entomopatogênicos.

Em contraste com estudos populacionais de isolados de M. anisopliae e Lecanicillium

(Verticillium) para os quais a região ITS1-5.8S-ITS2 foram quase não-informativos (GHIKAS;

KOUVELIS; TYPAS, 2006), o uso dos primers Mac-ITS-spf e Mac-ITSspR desenhados a

partir da região ITS, espaço interno transcrito, do DNA genômico de M. anisopliae var.

55

acridum amplificaram com sucesso uma seqüência de 420pb do DNA genômico deste fungo.

Além disso, esses primers não amplificaram isolados de M. anisopliae var. anisopliae e M.

flavoviride ou outros fungos entomopatógenos, fitopatógenos, micopatógenos e saprófitas do

solo. O ensaio foi igualmente eficaz para a detecção de DNA de M. anisopliae var. acridum

na presença de DNA do solo e em extratos de gafanhotos infectados (ENTZ; JOHNSON;

KAWCHUK, 2005).

Esses estudos demonstram que independente da região que se deseje amplificar, as

técnicas moleculares são métodos confiáveis para o diagnóstico de infecções com

entomopatógenos.

56

3 JUSTIFICATIVA

Apesar de a LV ser uma zoonose de importante na saúde pública, seu controle

continua centrado no controle do reservatório canino. Entretanto, tal medida não tem

apresentado efetividade para redução da incidência da doença, determinando assim a

necessidade de reavaliação das ações propostas. Assim, estudos são necessários sobre a

sazonalidade do vetor, principal elo da cadeia epidemiológica desta doença. Soma-se a isso o

fato da aplicação de inseticidas residuais poderem resultar em problemas ambientais,

toxicológicos e seleção de insetos resistentes. Tudo isso implica na necessidade do

desenvolvimento de novas tecnologias de controle, na busca por qualidade de vida.

Nesse contexto, os fungos entomopatogênicos têm sido patogênico sobre mais de 700

insetos, apesar de ainda não se tenha resultados definitivos sobre a ação destes fungos sobre

flebotomíneos. Desta forma, o melhor conhecimento sobre a patogenicidade dos fungos sobre

flebotomíneos pode ser de grande valia, o que permitirá determinar a espécie mais adequada

para ser aplicada nesses insetos na tentativa de minimizar a transmissão da LV e seus

prejuízos subseqüentes.

57

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

Lutzomyia longipalpis é o flebotomíneo predominante em áreas de transmissão de

leishmaniose, estando presente durante todo ano.

Os fungos B. bassiana e M. anisopliae var. acridum são capazes de reduzir a

eclodibilidade dos ovos, o desenvolvimento larvar, a longevidade de adulto de Lu. longipalpis

e a eclosão de ovos a partir de fêmeas infectadas.

58

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Aprimorar o controle do principal vetor da leishmaniose visceral.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Realizar investigação entomológica de flebotomíneos em área de transmissão intensa de

LV na cidade de Mossoró, Rio Grande do Norte;

- Correlacionar à variação sazonal de Lu. longipalpis com o sexo, local de captura e as

variáveis ambientais: temperatura, umidade relativa e pluviometria, na cidade de Mossoró,

Rio Grande do Norte;

- Verificar a patogenicidade dos fungos B. bassiana e M. anisopliae var. acridum sobre

ovos, larvas e adultos de Lu. Longipalpis;

- Analisar os parâmetros de crescimento fúngico pós-infecção das diferentes fases de

desenvolvimento de Lu. longipalpis;

- Confirmar a infecção dos fungos B. bassiana e M. anisopliae var. acridum sobre as

diferentes fases de desenvolvimento de Lu. longipalpis.

59

6 CAPÍTULO I

Controle de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) vetores de leishmanioses

Control of Phlebotomine (Diptera: Psychodidae) Leishmaniasis Vectors

Neotropical Entomology, v. 38, n. 3, 2009

Submetido em 20 de fevereiro de 2008

Aceito em 05 de março de 2009

RESUMO

Os flebotomíneos são vetores de importância médica e veterinária, podendo transmitir

leishmanioses, bartoneloses e algumas arboviroses. A adaptação de algumas espécies a locais

que passaram por modificações humanas as aproxima dos domicílios, podendo facilitar a

transmissão das doenças, e as estratégias adotadas para seu controle têm sido controvertidas.

No tocante às leishmanioses, por exemplo, o que sustenta a utilização do controle vetorial e de

reservatórios como estratégias de intervenção é a conjectura de que a incidência de infecção

em humanos está diretamente relacionada ao número de cães infectantes e a fatores

entomológicos. Dessa forma, o controle do vetor pode então oferecer solução menos onerosa

e mais prática, o que conduziria a medidas preventivas eficazes em um maior número de

focos de leishmaniose. Não obstante, na complexidade dos fatores envolvidos, o controle

químico continua sendo indispensável e o uso de inseticidas biológicos e plantas inseticidas,

por exemplo, representam áreas de estudo a serem incentivadas e desenvolvidas, pois

apresentam resultados promissores. A análise em questão representa uma oportunidade de

avaliação das medidas até então adotadas, principalmente em relação aos métodos e à eficácia

dos componentes entomológicos dos programas de controle das leishmanioses.

68

6 CAPÍTULO II

Avaliação do fungo Beauveria bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes), um agente

potencial no controle biológico de Lutzomyia longipalpis (Diptera, Psychodidae)

Evaluation of the fungus Beauveria bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes)

a potential biological control agent of Lutzomyia longipalpis (Diptera, Psychodidae)

Biological Control, 2009, doi: 10.1016/j.biocontrol.2009.05.004

Submetido em 11 de março de 2009

Aceito em 21 de maio de 2009

RESUMO

A leishmaniose visceral é uma zoonose cujo principal vetor no Brasil é o flebotomíneo

Lutzomyia longipalpis. Atualmente, os esforços de controle do vetor não foram eficazes em

reduzir a prevalência da doença. Uma possível alternativa para as estratégias atuais é o

controle biológico do vetor utilizando fungos entomopatogênicos. Este estudo avalia os

efeitos do fungo Beauveria bassiana (Bals.) Vuilleman em diferentes fases de

desenvolvimento Lu. longipalpis. Cinco concentrações do fungo foram utilizadas variando de

104 a 108 conídios/ml, acompanhado dos controles. Os ovos não-eclodidos, larvas e adultos

mortos expostos a B. bassiana foram semeados para reisolaemento fúngico. O fungo foi

posteriormente identificado por PCR e sequenciamento de DNA. A exposição a B. bassiana

reduziu o número de ovos eclodidos em 59% (P <0,01). A longevidade dos adultos infectados

foi de 5 dias, significativamente inferior ao do controle negativo que foi de 7 dias (P <0,001).

Os efeitos da infecção fúngica sobre a eclosão dos ovos postos pelas fêmeas infectadas

também foram significativas e dose-dependente (P <0,05). No que diz respeito aos parâmetros

de crescimento fúngico pós-infecção, apenas conidiogênese e esporulação foram

significativamente maiores do que o fungo antes da infecção (P <0,001). A identidade do

reisolado fúngico foi confirmada por seqüenciamento pós-passagem em todas as fases inseto.

Esses dados mostram que B. bassiana tem bom potencial patogênico, principalmente sobre

larvas e adultos de Lu. longipalpis. Consequentemente, a utilização deste fungo em programas

de controle de flebotomíneos tem potencial para reduzir o uso de inseticidas químicos,

resultando em benefícios para os seres humanos e ao ambiente.

76

6 CAPÍTULO III

O efeito do fungo Metarhizium anisopliae var. acridum sobre Lutzomyia longipalpis

The effects of the fungus Metarhizium anisopliae var. acridum on Lutzomyia longipalpis

Acta Tropica

Submetido em 12 de maio de 2009

RESUMO

O controle do vetor da leishmaniose visceral (LV) é baseado na aplicação de inseticidas

químicos residuais. No entanto, esta estratégia não tem sido eficaz. A contínua busca de um

adequado controle vetorial pode incluir a utilização de controle biológico. Este estudo avalia

os efeitos do fungo Metarhizium anisopliae var. acridum sobre Lu. longipalpis. Cinco

concentrações do fungo foram utilizadas, 1x104 a 1x108 conídios/ml, acompanhado dos

controles. Os ovos não-eclodidos, larvas e adultos mortos foram colhidos a partir do material

infectado para reisolamento fúngico. O fungo foi identificado por PCR e seqüenciamento de

DNA. Metharizium anisopliae var. acridum reduziu a eclosão de ovos em 40%. A

mortalidade de larvas infectadas foi significativa. A longevidade dos adultos infectados foi

menor que a do controle negativo. A eficácia da infecção fúngica sobre a inibição da eclosão

dos ovos postos pelas fêmeas infectadas também foi significativa. No que diz respeito aos

parâmetros de crescimento fúngico pós-infecção, apenas o crescimento vegetativo não foi

significativamente maior que o crescimento do fungo antes da infecção. A identidade do

reisolado fúngico foi confirmada pós-passagem somente sobre o inseto adulto. Em termos de

mortalidade larval e a fecundidade das fêmeas infectadas os resultados foram significativos,

demonstrando que o principal vetor da LV é suscetível à infecção por este fungo

entomopatogênico no estádio adulto.

77

Acta Tropica – Original Paper 1

2

3

4

The effects of the fungus Metarhizium anisopliae var. acridum on Lutzomyia longipalpis 5

6

7

8

Sthenia Santos Albano Amóraa*, Claudia Maria Leal Bevilaquaa*, Francisco Marlon Carneiro 9

Feijób, Romeika Hermínia de Macedo Assunção Pereirab, Nilza Dutra Alvesb, Fúlvio Aurélio 10

de Morais Freireb, Michel Toth Kamimurac, Diana Magalhães de Oliveirac, Elza Áurea Luna-11

Alves Limad, Marcos Fábio Gadelha Rochaa 12 13 14 15

aPrograma de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, 16

Fortaleza, Ceará, 60740-000, Brazil 17 bLaboratório de Microbiologia Veterinária, Universidade Federal Rural do Semi-Árido, 18

Mossoró, Rio Grande do Norte, 59625-900, Brazil 19 cNúcleo de Genômica e Bioinformática Tarsísio Pimenta - Universidade Estadual do Ceará, 20

Fortaleza, Ceará, 60740-000, Brazil 21 dDepartamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de 22

Pernambuco, Recife, Pernambuco, 50741-040, Brazil 23

24

25

26

27

28

* Corresponding author, Tel.: +55 85-3101-9853; fax: +55 85-3101-9840,

E-mail address: [email protected] (S.S.A.Amóra),

[email protected] (C.M.L.Bevilaqua)

78

Abstract 29

The control of Visceral Leishmaniasis (VL) vector is based on the application of 30

chemical residual insecticide. However, this strategy has not been effective. The continuing 31

search for an appropriate vector control may include the use of biological control. This study 32

evaluates the effects of the fungus Metarhizium anisopliae var. acridum on Lu. longipalpis. 33

Five concentrations of the fungus were utilized, 1x104 to 1x108 conidia/ml, accompanied by 34

controls. The unhatched eggs, larvae and dead adults exposed to fungi were sown to reisolate 35

the fungi and analysis of parameters of growth. The fungi was subsequently identified by PCR 36

and DNA sequencing. Metharizium anisopliae var. acridum reduced egg hatching by 40%. 37

The mortality of infected larvae was significant. The longevity of infected adults was lower 38

than that of negative controls. The effects of fungal infection on the hatching of eggs laid by 39

infected females were also significant. With respect to fungal growth parameters post-40

infection, only vegetative growth was not significantly higher than that of the fungi before 41

infection. The revalidation of the identification of the reisolated fungus was confirmed post-42

passage only from adult insects. In terms of larvae mortality and the fecundity of infected 43

females, the results were significant, proving that the main vector species of VL is susceptible 44

to infection by this entomopathogenic fungus in the adult stage. 45

46

Key words: Biological control; Vector; Lutzomyia longipalpis; Entomopathogenic fungus; 47

Metarhizium anisopliae var. acridum; Visceral Leishmaniasis. 48

49

1. Introduction 50

Leishmaniasis is one of the most diverse and complex vector-borne diseases. Because 51

it involves several overlapping species and sandfly vectors, both the ecology and 52

epidemiology of the disease are multifarious (Singh, 2006). The sandfly Lutzomyia 53

longipalpis Lutz & Neiva, 1912 is the primary vector for the etiological agent of Visceral 54

Leishmaniasis (VL), Leishmania chagasi Cunha & Chagas, 1937, which constitutes a serious 55

public health problem in South America (Secundino et al., 2002). 56

The VL control strategy is comprised of a combination of early detection, human case 57

treatment, euthanasia of positive dogs, environmental management and chemical-based vector 58

control. However, these measures have not been effective (Amóra et al., 2006). In the absence 59

of an effective vaccine or an ideal drug treatment, the best method to interrupt any vector-60

borne disease is to reduce human-vector contact (Sharma and Sing, 2008). A search for 61

appropriate vector control methods to augment the current limited arsenal of tools is required, 62

79

and biological control is one promising avenue for this search (Scholte et al., 2007). As such, 63

vector reduction may prove to be a viable strategy for the control of VL. 64

Over the last decade, there have been major developments in biological, pesticide-65

based and integrated control strategies for mosquito vectors (Scholte et al., 2004). However, 66

little information is available on the biological control of sandflies. In laboratory studies, the 67

infection of sandflies with different organisms such as nematodes (Secundino et al., 2002), 68

bacilli (Robert et al., 1998; Wahba et al., 1999; Wahba, 2000) and fungi (Warburg, 1991; 69

Reithinger et al., 1997) inhibited egg hatching and caused larval and adult death, but these 70

results were variable. Meanwhile, there is little information on the pathological effects 71

parasites may produce on sandflies. 72

In particular, entomopathogenic fungi have been highlighted as the main agent in 73

insect control (Feijó et al., 2007). The principle of this method is that, upon tarsal contact, 74

fungal spores adhere to and penetrate the cuticle. They then grow internally and produce 75

toxins that kill the mosquito. This is an advantage over most other biocontrol agents (such as 76

bacteria, viruses, nematodes and protozoa), which must be ingested (Scholte et al., 2007). 77

These pathogens have been shown to be an alternative biological control method against 78

many insects (Soares and Turco, 2003), and they are consequently a promising alternative for 79

VL control. In this context, Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin (Ascomycota: 80

Hypocreales) is able to infect over 200 insect species (Alves, 1998), is considered to be a 81

highly infective pathogenic fungus against grasshoppers (Goettel et al., 1995) and has been 82

studied for the biological control of several other species of insects (Kuklinsky-Sobral et al., 83

2004). 84

Specifically, M. anisopliae var. acridum [formerly Metarhizium flavoviride Gams and 85

Rozsypal, but now reclassified (Driver et al., 2000)] is known for its effectiveness in the 86

control of grasshoppers in Brazil and elsewhere (Faria and Magalhães, 2001). Currently, this 87

fungus is being commercialized under the trade name “Green Muscle” and “Green Guard” for 88

grasshopper (Acrididae) control in Africa and Australia, respectively (Entz et al., 2005). In 89

Brazil, field tests have been conducted (Magalhães et al. 2001). Despite its importance to 90

agriculture, its biological characteristics (Vieira et al., 2007) and its pathogenicity in Diptera 91

that are related to public health issues have not yet been sufficiently explored. It is now 92

known that this pathogen can be used to efficiently control Rhammatocerus schistocercoides 93

Rehn, 1906 (Orthoptera: Acrididae) in Brazil (Magalhães et al., 2001), and its effects on non-94

target organisms, including other Orthoptera, Diptera and Hymenoptera, have been verified. 95

Thus, the biological potential of M. anisopliae var. acridum makes this fungus an ideal 96

80

candidate for sandfly control. To this end, the present study aimed to evaluate the effect of M. 97

anisopliae var. acridum on various stages of Lu. longipalpis development. 98

99

2. Materials and Methods 100

101

2.1. Lutzomyia longipalpis collection and identification 102

103

Lutzomyia longipalpis captured in the field were maintained in BOD incubators 104

acclimatized to 27°C, 80% RH with a photoperiod of 12 h (Rangel et al., 1985). To promote 105

oviposition, female sandflies were allowed to feed and obtain a blood meal from anesthetized 106

hamsters for 2 h. Forty-eight hours post-feeding, the adult females were individualized in 107

plastic pots measuring 4 cm in diameter and 4.5 cm in height that were internally coated with 108

sterile plaster to maintain moisture. After oviposition, the females were dissected (Aransay et 109

al., 2000) for identification (Galati, 2003). The hatched larvae were fed daily with a diet based 110

on rabbit feces and crushed dried cassava leaves until they reached the pupa stage. After 111

emergence, adults were transferred to nylon tulle cages measuring 20 cm3 in diameter, fed for 112

3 days with a glucose solution soaked in sterile cotton, and on the 4th day, an anesthetized 113

hamster was offered to provide a blood meal for the females. 114

115

2.2. Preparation of M. anisopliae var. acridum inoculum 116

117

Metharizium anisopliae var. acridum inoculum was obtained from strain 291 (URM-118

3800), kindly provided by the Mycology Collection of the Department of Mycology, 119

Universidade Federal de Pernambuco. The fungal cultures were kept in PDA medium (Potato 120

Dextrose Agar, VertecÒ), maintained at 28°C and diluted to prepare concentrations of 1x108, 121

1x107, 1x106, 1x105 and 1x104 conidia/ml in 0.05% v/v Tween 80. Conidia were quantified 122

via direct counting using an optical microscope with a Neubauer chamber. The average of 5 123

areas counted per field (n) was multiplied by a fixed factor (n x 4.106) to determine the 124

number of conidia in suspension (Alves and Moraes, 1998). 125

126

2.3. Lutzomyia longipalpis susceptibility to M. anisopliae var. acridum 127

128

The bioassays, in which eggs, larvae and adults were treated with 5 fungal 129

concentrations, were conducted with 2 control groups: 0.05% v/v sterile Tween 80 (negative 130

81

control) and 196 mg/ml of the pyrethroid, cypermethrin (positive control) (Feijó et al., 2008). 131

Randomized treatments (21) were performed; 7 for each insect stage, with each treatment 132

performed in 3 repetitions and each repetition in triplicate. Each repetition consisted of 30 133

samples totaling 630 individuals/repetition. 134

2.3.1. Egg Susceptibility. The eggs were placed in plastic pots similar to those used in 135

the maintenance of the colony. One of the fungal suspensions (3 ml), cypermethrin or Tween 136

80 was spilled on the walls and ground of the pots using a pipette. The containers were then 137

stored in BOD incubators at 27°C, 80% RH with a photoperiod of 12 h. The egg hatching was 138

observed daily and larval mortality was counted 8 days post-treatment. 139

2.3.2. Larval Susceptibility. First stage larvae were placed, maintained and infected as 140

described for the eggs. They were fed with the same diet used for the colony, and the larval 141

mortality counts were conducted daily until the pupa stage or until the death of all larvae. 142

2.3.3. Adult Susceptibility. Each repetition consisted of 15 males and 15 females used 143

48 h post-blood feeding. The insects were first cooled to -2°C for 5 min for immobilization. 144

Immediately after, they were treated with 3 ml of one of the fungal suspensions, cypermethrin 145

or Tween 80, and then maintained in nylon cages and fed glucose solution, as described 146

previously. The adult mortality was evaluated daily to determine longevity and to count the 147

eggs laid by treated females. Larvae hatched born from these eggs were quantified 8 days 148

post-infection to obtain egg-hatching rate. 149

150

2.4. Metharizium anisopliae var. acridum growth and microscopic features post-passage in 151

Lu. longipalpis 152

153

The unhatched eggs, larvae and dead adults were sterilized with 3 ml 70% ethanol, 3 154

ml 4% sodium hypochlorite and 3 ml sterile distilled water for 3 min each. The material was 155

then seeded in PDA medium until emergence of the fungus (Alves, 1998). The analyses of 156

fungal growth parameters were performed in triplicate, and microscopic aspects followed the 157

methodology outlined in Feijó et al. (2007). These data were compared to the parameters 158

observed before the fungal infection. 159

2.4.1. Conidiogenesis. A disc 5 mm in diameter was removed from a M. anisopliae 160

var. acridum culture after 12 days of growth and transferred to a test tube containing 10 ml 161

0.05% v/v Tween 80. The suspension was shaken to separate the conidia, diluted and adjusted 162

to 104 conidia/ml. From this suspension, 0.1 ml was spread on a Petri dish with PDA medium 163

using a Drigalski spatula. The number of conidia in the suspension was determined in a 164

82

Neubauer chamber at 16 h post-inoculation. A total of 500 conidia per Petri dish were counted 165

and categorized into 2 groups: germinated or having a germ tube in development, and not 166

germinated. 167

2.4.2. Vegetative growth. A disc 5 mm in diameter of M. anisopliae var. acridum was 168

sown in the center of a Petri dish with PDA medium. Growth was measured on day 15 post-169

inoculation. 170

2.4.3. Colony counting. The same dilution of M. anisopliae var. acridum used for the 171

conidiogenesis experiments was also used for colony counting. The dilution was spread on 172

Petri dishes (0.1 ml), and the colonies were counted 3, 6, 9, 12 and 15 days post-inoculation. 173

2.4.4. Sporulation. Using the same methodology used for the vegetative growth 174

experiments, at 3, 6, 9, 12 and 15 days post-inoculation, 10 ml of 70% ethanol was added to 3 175

Petri dishes with growing fungus for 5 min, for the purpose of conidia inactivation and drying. 176

The 70% ethanol (containing conidia) was retrieved from the surface of the Petri dish and 177

placed into a sterile receptacle. Subsequently, Petri dishes were washed 9 times with 10 ml 178

0.05% v/v Tween 80, and between washes, the Tween 80 solution was removed from the 179

plates and placed in the same container. The conidia were then quantified in a Neubauer 180

chamber. 181

2.4.5. Microscopic Aspects. An aliquot of fungal culture was aseptically placed at 4 182

equidistant points on a Petri dish with PDA medium and covered with a sterile cover slip. 183

These cultures were analyzed with an optical microscope after 24, 48, 72, 96 and 120 h. The 184

fungal structures were stained with Amann blue and observed at 100x, 400x and 1000x 185

magnification. 186

187

2.5. Genomic DNA Extraction and PCR 188

189

The genomic DNA of M. anisopliae var. acridum reisolated from infected Lu. 190

longipalpis eggs, larvae and adults was extracted using an InvisorbÒ Spin Plant Mini Kit 191

(Invitek, GmbH, Berlin-Buch), then resuspended in 100 ml TE and stored at -20°C, according 192

to the manufacturer's recommendations. 193

The primers Mac-ITS-spF (5’CTGTCACTGTTGCTTCGGCGGTAC3’) and Mac-194

ITS-spR (5’CCCGTTGCGAGTGAGTTACTACTGC3’) were designed based on the ITS1 195

and ITS2 regions of the rDNA sequence data for M. anisopliae var. acridum (Entz et al., 196

2005). PCR amplifications were performed in a total volume of 10 ml, containing 1x buffer 197

83

(20 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl), 50 mM MgCl2, 10 pM/ml of each primer, 10 mM 198

dNTP mix (InvitrogenÔ), 5 U/ml Platinum Taq DNA polymerase (InvitrogenÔ) and 0.1 ml of 199

the target DNA. The negative control contained sterile ultrapure water in place of DNA and 200

the positive control contained M. anisopliae var. acridum (291, URM-3800). The DNA 201

amplification was performed in a Primus 96 HPL thermocycler (MWG Biotech, Inc.) 202

programmed according to the recommendation of Entz et al. (2005): initial denaturation at 203

94°C x 5 min, 30 cycles of denaturing at 94°C x 1 min, annealing and extension combined at 204

72°C x 3 min. The amplicons were visualized on a 1% agarose gel containing 1 Kb Plus DNA 205

ladder (InvitrogenÔ), and stained with ethidium bromide and subjected to transillumination 206

with UV light (FB-TI-88). 207

208

2.6. DNA Sequencing 209

210

The amplicons were purified by isopropanol/ethanol precipitation according to the 211

manufacturer's recommendations (Applied Biosystems®) and sequenced using the BigDye 212

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem®) in an ABI PRISM® 3100 213

Genetic Analyzer (Applied Biosystems®). All fragments were sequenced in both directions 214

and data were processed by programs provided by the sequencer manufacturer. The 215

electrophoretograms generated were stored as files of the Chroma program and the nucleotide 216

sequences were submitted to GenBank. Data were then analyzed using BioEdit software 217

(Hall, 1999) for the purpose of verifying the sequence quality. The Chroma program was used 218

to transform the data output files into the FASTA format (default), giving quality values (0-219

99) for each nucleotide using algorithms to specify each peak’s intensity (height and width) 220

generated by the electrophoretogram. The sequences were also subjected to BLAST (Basic 221

Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1990) to verify the similarities of the obtained 222

fragment sequences to the sequences of other proteins in GenBank. 223

224

2.7. Statistical analysis 225

226

The design was completely randomized for all experiments. The effects of fungal 227

infection on egg hatching, larval mortality and adult longevity, as well as the data concerning 228

fungal growth parameters, were normalized when necessary and submitted to ANOVA and 229

Pearson correlation coefficient analyses. After analysis of variance, the means were compared 230

84

using a Student-Newman-Keuls test, and the growth parameters were compared using 231

Dunnett’s Method. For both, P < 0.05 (SigmaStat software 3.1, 2004). 232

233

3. Results 234

235

3.1. Susceptibility of Lu. longipalpis to entomopathogenic fungi 236

237

At the highest concentrations, M. anisopliae var. acridum infection reduced the 238

number of Lu. longipalpis eggs that hatched by 40% (H = 33.03, df = 6, P < 0.05), although 239

its effect was lower than that of the positive control. There was a direct and significant 240

correlation (r = 0.86) between fungal concentration and the inhibition of egg hatching (F = 241

22.80, df = 1, P < 0.001). An increase in mortality of the larvae born of these eggs was also 242

observed, and an index of 60% was found at higher concentrations (H = 27.17, df = 6, P < 243

0.05) (Table 1). 244

The fungus had a statistically greater effect on larval mortality than the control, and 245

the effect was inoculum-dependent, especially at the higher concentrations, reaching 87% (H 246

= 36.04; df = 6, P < 0.05) (Table 1). The mean larval survival time was 26.51 ± 6.75 days for 247

the treated group and 31.89 ± 4.48 for the negative control. However, only the positive control 248

(which caused instantaneous death) had a significant effect on mean larval survival time (H = 249

29.92, df = 6, P <0.05). 250

The longevity of adults infected with the fungus was significantly reduced, on average 251

by 7 days, but this effect did not overcome that of cypermethrin, which caused instantaneous 252

death (F = 43.54, df = 6, P < 0.05). Female infection significantly inhibited egg hatching, 253

especially at the highest concentration, which produced 85% efficacy (F = 53.57, df = 6, P < 254

0.05) (Table 1). There was a slightly significant direct correlation (r = 0.49) between fungal 255

concentration and inhibition of egg hatching (F = 13.61, df = 1, P < 0.05). 256

257

3.2. Growth and microscopic features of M. anisopliae var. acridum after passage in Lu. 258

longipalpis 259

260

M. anisopliae var. acridum was successfully reisolated post-infection only from Lu. 261

longipalpis adults. The conidiogenesis of the reisolated fungus was significantly higher than 262

that of the fungus before infection (F = 4.53, df = 3, P < 0.05), but vegetative growth was 263

similar (F = 2.40, df = 3, P = 0.14) (Table 2). 264

85

The number of fungus colonies was significantly higher post-passage in adult sandflies 265

(F = 13.05; df = 3, P < 0.05). Sporulation was also significantly higher post-passage, and it 266

was also higher than the fungus before infection and increasing over the entire observation 267

period (F = 158.50; df = 3, P < 0.001) (Table 3). 268

Metharizium anisopliae var. acridum microscopic structures were observed post-269

infection. Mycelium formation, anastomoses and apressoria were observed in the first 96 h, as 270

were primordia from the conidiophores and young conidiophores along the hyphal axis (data 271

not shown). There were no morphological differences between the fungus used for infection 272

and the fungus reisolated from Lu. longipalpis adults. 273

274

3.3. PCR and sequencing 275

276

Metharizium anisopliae was reisolated from Lu. longipalpis adults infected with 277

1x106, 1x107 and 1x108 conidia/ml 6 days post-infection. In all cases, M. anisopliae var. 278

acridum DNA was amplified by PCR (Figure 1). Metharizium anisopliae var. acridum DNA 279

could not be reisolated from eggs, larvae or adults infected with 1x104 and 1x105 conidia/ml, 280

but it was possible to observe mycelial growth on insects infected with 1x107 and 1x108 281

conidia/ml. No PCR products were amplified from the control group. 282

The DNA sequences obtained were approximately 394 bp in length. These were 283

compared with other sequences deposited in GenBank (NCBI), and this confirmed that the 284

reisolated fungal species was in fact a match to M. anisopliae var. acridum (Accession 285

number EF113338.1) with 100% homology (e-value 0.0). 286

287

4. Discussion 288

The eggs of insects are more resistant to infection than other developmental stages 289

(Ekesi et al., 2002). Although fungal infection reduced egg hatching significantly and 290

increased the mortality of larvae born from infected eggs, the effectiveness was around 40%. 291

In contrast, another biocontrol study showed that aqueous suspensions of Bacillus sphaericus 292

Meyer & Neide, 1904 (Bacillales: Bacillaceae) inhibited Phlebotomus duboscqi Leveu-293

Nemaire, 1906 and Sergentomyia schwetzi Adler, Theodor & Parrot, 1929 (Diptera: 294

Psychodidae) egg hatching by 95% (Robert et al., 1998). 295

The efficiency of M. anisopliae var. acridum at the concentration of 1x108 conidia/ml 296

was similar on larvae of Lu. Longipalpi, (87%) and Boophillus microplus Canestrini, 1887 297

(Acari: Ixodidae) (97%) (Bahiense et al., 2006). Comparing the susceptibility of sandfly 298

86

larvae to different biocontrols, the result of spraying fungus on Lu. longipalpis larvae was 299

better than offering a diet contaminated with Bacillus thuringiensis var. israelensis Goldberg 300

& Margalit (1977) (Bacillales: Bacillaceae) to Phlebotomus papatasi Scopoli, 1763 larvae 301

(Diptera: Psychodidae) (Wahba et al., 1999). Both of these had inoculum-dependent effects. 302

However, the fungus was not reisolated, and similar to P. papatasi larvae infected with B. 303

sphaericus, bacteraemia was not detected (Wahba, 2000). Biolarvicide application in the field 304

is difficult due to the diversity of sandfly breeding habitat, thus its application appears to be 305

limited to adult control. More research needs to be done to develop an efficient larvicide for 306

vector control. 307

Any reduction in mosquito longevity reduces the mean number of blood meals taken, 308

and the probability of the vector acquiring a disease agent and subsequently transmitting it to 309

other hosts is also reduced (Scholte et al., 2007). The longevity of Lu. longipalpis infected 310

with M. anisopliae var. acridum was significantly lower than that of uninfected sandflies, 311

except for sandflies infected at the concentration of 1x104 conidia/ml, whose longevity was 312

greater than the negative control. These data are similar to the effect of other 313

entomopathogenic fungi against P. papatasi, Lu. longipalpis (Warburg, 1991) and Aedes 314

aegypti Linnaeus, 1762 (Scholte et al., 2007) in that they show the highest mortality rates at 315

around seven days. 316

Although there was no significant decrease in infected female oviposition, there was a 317

significant reduction in egg hatching. Similar data were obtained with the same fungus in 318

grasshoppers. The reduced infectiousness of M. anisopliae var. acridum compared to other 319

entomopathogenic fungi could be related to its primary specificity for Acridids (Blanford and 320

Thomas, 2001). The reduction in longevity and fecundity may not decrease the vectorial 321

capacity of adult Lu. longipalpis in the short term, but it could still be effective over the long 322

term. It is possible that infected sandflies are more susceptible to factors such as predation and 323

secondary infections by other pathogens, and infection might also decrease insect migration 324

ability. 325

Traditionally, the identification of the genus Metarhizium is based on the observation 326

of morphological features on culture media and microscopic examination of spores and 327

associated structures (Entz et al., 2005). Fungal growth studies, such as analysis of 328

conidiogenesis, sporulation, colony counts and radial growth were conducted to assist 329

entomopathogenic fungus characterization, as recommended by Almeida et al. (2005), 330

because these parameters are important for defining the virulence of the fungal isolate (Liu et 331

al., 2003). The rates of radial and vegetative growth are directly linked to the speed of 332

87

infection in the host, and they may differ among isolates of the same species (Feijó et al., 333

2007). The vegetative growth of Metharizium anisopliae was slow, possibly explaining the 334

failure to reisolate it from Lu. longipalpis eggs and larvae. 335

The sporulation and conidiogenesis of M. anisopliae var. acridum was significantly 336

higher after reisolation, corroborating the results of Entz et al. (2005). These data suggest a 337

positive correlation between conidia production and time. Rapid sporulation may be an 338

important criterion for the selection of fungal isolates because it helps epizootic spread 339

(Mitchell, 2003). Conidiogenesis is another important parameter to consider, as the number of 340

germinated conidia is directly proportional to isolate virulence. The conidiogenesis rate may 341

be influenced by the storage form, the presence of nutrients and the mode of host exposure to 342

fungus (Alves, 1998). 343

The colony morphology of Metharizium anisopliae var. acridum was examined, and 344

conidia were found to be dark and green, similar to Canadian (Entz et al., 2005) and Mexican 345

(Milner et al., 2003) strains. However it is important to emphasize that difficulties in 346

identification are frequently encountered, and morphological differences can be exhibited 347

under varying environmental and physiological conditions. The spore morphology varies 348

within the same culture and between isolates of the genus Metarhizium. Conidia and 349

blastospores can be of variable size and shape (Milner et al. 2003). Therefore, M. anisopliae 350

var. acridum cannot be distinguished from other M. anisopliae varieties on the basis of spore 351

size and shape. Therefore, molecular tests should be performed (Lomer et al., 2001) that allow 352

differentiation of fungal strains with similar morphological and cytological characteristics 353

(Kouvelis et al., 2008). 354

The failure to reisolate fungus from treated eggs and larvae prevented completion of 355

the PCR, but its effect was observed statistically on Lu. longipalpis. The same situation was 356

observed in a previous study that involved the histological examination of Lutzomyia young 357

Feliciangeli & Murillo, 1987 (Diptera: Psychodidae) infected with Beauveria bassiana (Bals.) 358

Vuilleman (Deuteromycotina: Hyphomycetes), where the histological sections were negative 359

and no cuticle or tissue damage was observed, but the fungal mycelium was seen (Reithinger 360

et al., 1997), similar to our observations. With respect to adult Lu. longipalpis, the PCR and 361

sequencing proved that infection by the fungus had occurred at the two higher concentrations 362

on different days post-infection. 363

Comparative studies of nucleotide sequences of rDNA genes have provided significant 364

data for phylogenetic and taxonomic analyses (Entz et al., 2005). As expected, the Mac-ITS-365

spF and Mac-ITS-spR primers successfully amplified a 394 bp DNA sequence from the total 366

88

genomic DNA extracted from M. anisopliae var. acridum, similar to the results of Entz et al. 367

(2005). In that same study, no other species of Metharizium, other fungal entomopathogens, 368

or other microorganisms were detected by these primers, demonstrating their specificity (Entz 369

et al., 2005). 370

Although the effect of an entomopathogenic fungus is not immediate, it can minimize 371

the environmental contamination risk inherent in chemical insecticides (Oliveira et al., 2003). 372

Moreover, it is environmentally friendly and not harmful to birds, fish or mammals 373

(Zimmerman, 1993). At present, the potential risk of adverse effects of the fungus on human 374

health when used indoors and/or in the vicinity of immunocompromised individuals is 375

considered low due to the pathogen's opportunistic nature and its inability to survive at human 376

body temperatures (Scholte et al., 2007). 377

The finding that Lu. longipalpis is susceptible to infection with an entomopathogenic 378

fungus is the first step towards the final goal of using this fungus for VL vector control. 379

However, there are many more scientific issues to confront, such as the screening of other 380

fungal species and strains, finding the optimal dosages and application techniques, optimizing 381

the mass culture of the fungus, and determining its shelf life and the optimal solvent for its 382

conidia. In particular, fungal persistence following application must be substantial to 383

minimize the logistical challenges and cost of re-treatment (Scholte et al., 2007). Several 384

entomopathogenic fungi are already in use for agricultural and veterinary pest control, 385

demonstrating the feasibility of this biocontrol technique with respect to acceptability and 386

applicability. 387

The results presented here suggest a lack of pathogenicity of M. anisopliae var. 388

acridum against Lu. longipalpis eggs and larvae, leading to the conclusion that this pathogen 389

should not be used for the control of sandflies in their immature stages. However, in terms of 390

adult mortality and infected female fecundity, the results were significant, proving that the 391

primary vector species of VL is susceptible to entomopathogenic fungal infection in the adult 392

stage. These results encourage further studies on the use of M. anisopliae var. acridum as a 393

biocontrol agent. 394

395

Acknowledgments 396

We thank Dr. Nélio B. Morais, Richristi A. Silva, Raimundo Nonato de Sousa and 397

Lindemberg Caranha (Secretaria de Saúde do Estado do Ceará), Ana Claudia B. Mendonça 398

and Sodré Rocha (Secretaria Municipal de Saúde de Mossoró) for assistance in sandfly field 399

collections, Dr. Rui Sales Júnior, Dra. Celicina M. S. B. Azevedo (UFERSA). UFERSA 400

89

administrative staff for logistic support. To Msc Lorena M. B. Oliveira for reviewing and 401

improving the paper. As also the inhabitants of the studied areas for their patient and 402

kindness. 403

Financial support: Msc Amora has a grant from CAPES and Dr. Bevilaqua is a CNPq 404

researcher. 405

Ethical approval: Ceará State University, Committee of Ethics for the Use of Animals 406

(Process no. 07465297-4). 407

408

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522

523

524

525

526

527

528

529

530

531

532

533

93

Table 1. Treatment efficacy of M. anisopliae var. acridum and longevity of Lu. longipalpis 534

life stages. 535

Small letters represent a comparison of the lines in the same column (Student-Newman-Keuls test, P < 0.05). 536

537

538

539

540

541

Table 2. Conidia germination and vegetative growth of Beauveria bassiana reisolated from 542

infected Lutzomyia longipalpis eggs, larvae and adults on PDA medium. 543

Stages (mean ± SD) Germination (no.)*

16 h post-inoculation

Vegetative growth (cm)NS

15 days post-inoculation

Adults 413.00 ± 36.77a 4.07 ± 0.98a

Control# 255.00 ± 7.00b 3.07 ± 0.29a

Small letters represent a comparison of the lines in the same column (Dunnett’s Method, *(P < 0.05) 544

and NS(P = 0.14). 545 #Metharizium anisopliae var. acridum 291 (URM-3800) before infection of Lu. longipalpis. 546

547

548

549

550

551

552

Eggs Larvae Adults Treatments

(mean ± SD) % Reduction in

Hatching

% Larval

mortality % Mortality

Longevity

days

% Reduction in

Hatching

1x108 conidia/ml 41.67 ± 6.24a 49.83 ± 24.12a 86.67 ± 4.71a 7.29 ± 0.76a 84.76 ± 7.91ª

1x107 conidia/ml 40.00 ± 8.43a 37.60 ± 16.54a 83.81 ± 13.11b 6.86 ± 1.77a 72.12 ± 3.11b

1x106 conidia/ml 35.56 ± 2.72a 35.11 ± 8.53a 72.38 ± 5.35c 6.29 ± 1.38a 72.30 ± 4.97b

1x105 conidia/ml 30.00 ± 3.85b 27.02 ± 2.67b 71.90 ± 5.39c 6.57 ± 1.27a 64.54 ± 1.88b

1x104 conidia/ml 28.89 ± 8.61b 18.29 ± 6.51b 63.59 ± 18.28c 9.57 ± 1.51b 53.69 ± 10.20c

Tween 80 0.05% 12.78 ± 9.05c 0.00 ± 0.00c 40.48 ± 7.31d 8.71 ± 1.11b 39.26 ± 6.68d

Cypermethrin

196mg/ml 100.00 ± 0.00d - 100.00 ± 0.00e 0,00 ± 0,00c -

94

Table 3. Colony counts and sporulation of M. anisopliae var. acridum (mean ± SD) reisolated 553

from infected Lu. longipalpis adults at 3, 6, 9, 12 and 15 days after inoculation on PDA 554

medium. 555

Parameters Stages 3 days 6 days 9 days 12 days 15 days

Adults 8.50 ± 4.95a 846.00 ± 124.45a 40.50 ± 0.71a 62.50 ± 2.12a 17.00 ± 2.83a Colony

counting

(no. colony) Control# 0.00 ± 0.00b 276.00 ± 69.30b 7.00 ± 1.41b 0.50 ± 0.71b 0.00 ± 0.00b

12.62 ± 0.54a 40.11 ± 0.18a 53.38 ± 0.32a 148.48 ± 0.28a 164.66 ± 0.87aSporulation

(no. conidia)

Adults

Control# 4.06 ± 0.08b 26.27 ± 0.18b 59.16 ± 0.06b 115.19 ± 0.01b 161.40 ± 0.29b

Small letters represent comparisons of the lines in the same column (Student-Newman-Keuls test, P < 556

0.05). 557 #Metharizium anisopliae var. acridum 291 (URM-3800) before infection of Lu. longipalpis. 558

559

560

561

562 Figure 1: Amplification of M. anisopliae var. acridum DNA from Lu. longipalpis adults at different 563

days post-infection with varying conidia/ml concentrations: Lane Br: no DNA, Lane C+: M. 564

anisopliae var. acridum DNA, Lane 1: 1x106 at 7 days, Lanes 2-4: 1x107 at 1, 5 and 6 days, Lanes 5-7: 565

1x108 at 1, 6 and 10 days, Kb: Ladder. 566

567

95

6 CAPÍTULO IV

Pesquisa de flebotomíneos (Psychodidae: Phlebotominae) em área de transmissão

urbana de leishmaniose visceral no Nordeste do Brasil

Phlebotomine sandfly (Psychodidae: Phlebotominae) survey in an urban transmission area of

visceral leishmaniasis in northeastern Brazil

Memórias do Instituto Oswaldo Cruz

Submetido em 29 de maio de 2009

RESUMO

A leishmaniose visceral (LV) continua a ser um grande desafio para o campo da saúde pública

e particularmente em vários estados brasileiros, onde a doença é endêmica. Neste estudo, um

levantamento da fauna flebotomínea foi realizado em Mossoró, Rio Grande do Norte e os

resultados do inquérito foram comparados com as variáveis ambientais. Os flebotomíneos

foram capturados com armadilhas luminosas instaladas mensalmente no intra e peridomicílio

das residências. A análise dos dados foi baseada nos resultados do teste Qui-quadrado e

regressão linear. Do total de flebotomíneos capturados (7.347), 93,85% eram Lutzomyia

longipalpis e os restantes eram Lu. evandroi. Os flebotomíneos foram encontrados mais

comumente no peridomicílio e não houve diferença na proporção de machos e fêmeas. A

estação chuvosa, umidade relativa ou pluviometria não influenciaram a densidade

populacional dos flebotomíneos. No entanto, a temperatura teve um efeito negativo. Como

este estudo foi realizado em uma área endêmica, essas informações são importantes para as

agências saúde pública no intuito de auxiliar na concepção de medidas adequadas para o

controle do vetor da LV.

96

Full Paper 1

2

3

Phlebotomine survey in northeastern Brazil 4

5

6

Phlebotomine sandfly (Psychodidae: Phlebotominae) survey in an urban transmission 7

area of visceral leishmaniasis in northeastern Brazil 8

9

10

11

Sthenia Santos Albano Amóraa1, Claudia Maria Leal Bevilaquaa*, Francisco Marlon Carneiro 12

Feijób, Gislayne Christianne Xavier Peixotob, Raimundo Nonato de Sousac, Nilza Dutra 13

Alvesb, Michelline do Vale Maciela, Fúlvio Aurélio de Morais Freireb, Iara Tersia Freitas 14

Macedoa 15 16 17 18

aLaboratório de Doenças Parasitárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, UECE, Campus 19

do Itaperi, Av. Paranjana 1700, 60740-000 Fortaleza, CE, Brazil 20 bLaboratório de Microbiologia Veterinária, UFERSA, Mossoró, RN, Brazil 21

cNúcleo de Endemias Transmissíveis por Vetores, SESA-CE, Brazil 22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

1Corresponding authors: [email protected], [email protected]

Financial support: Ms Amora has a grant from CAPES and Dr. Bevilaqua is a CNPq researcher

Ethical approval: State University of the Ceará, Committee of Ethics for the Use of Animals (Process n.

07465297-4)

97

ABSTRACT 32

Visceral leishmaniasis (VL) remains a major challenge to the field of public health, 33

particularly in several Brazilian states where the disease is endemic. In this study, a 34

phlebotomine sandfly survey was conducted in Mossoró, Rio Grande do Norte, and the survey 35

results were compared with environmental variables. Sandflies were captured with CDC traps 36

installed monthly in both intra- and peridomicile settings. The data analysis was based on 37

results from the Chi-square test and linear regression. Of the total sandfly population captured 38

(7,347), 93.85% were Lutzomyia longipalpis and the remaining were Lu. evandroi. The 39

sandflies were found more commonly in the peridomicile setting, and there were no 40

difference in the proportions of males and females. Neither the season, the humidity, nor 41

rainfall influenced the population density. However, the temperature had a negative effect. As 42

this study was conducted in an endemic location, it provides important information to public 43

health agencies for designing adequate control measures for the VL vector. 44

45

Key words: Lutzomyia longipalpis - Lutzomyia evandroi – seasonality – climate - Rio Grande 46

do Norte state - Brazil 47

48

INTRODUCTION 49

In Brazil, visceral leishmaniasis (VL) is caused by Leishmania chagasi and is 50

transmitted to humans principally through the bites of infected females of Lutzomyia 51

longipalpis Lutz & Neiva, 1912 sandflies (Michalsky et al. 2009). This disease remains a 52

major challenge to public health, particularly in Brazilian states where the disease is endemic 53

(Paula et al. 2009). Studies focusing on vector and environmental conditions are of 54

fundamental importance in evaluating the risk of transmission of this tropical disease 55

(Michalsky et al. 2009). These studies additionally provide helpful information in determining 56

the most appropriate control methods for the vector (Dias et al. 2007). 57

Sandflies are frequently found in natural ecotopes, such as trees trunks, animal 58

shelters, fallen leaves, and cracks in rocks and caves (Galati et al. 2003), as well as in rural 59

and urban environments characterized by domestic animal shelters and human habitation. The 60

latter habitat demonstrates the adaptation of insects to anthropophilic environments (Barata et 61

al. 2008). Lu. Longipalpis are especially well adapted to living with humans and domestic 62

animals (Rebêlo 2001), are resistant to adverse conditions and can exploit new environments, 63

thereby facilitating VL transmission. 64

98

VL is endemic in Rio Grande do Norte, a state in northeastern Brazil. In recent years, 65

there has been an increase in VL cases reported by many of the municipalities (Cortez et al. 66

2007, Ximenes et al. 2007). However, data documenting the presence and distribution of Lu. 67

longipalpis in the locality of Mossoró are generally insufficient to draw an eco-68

epidemiological profile of the disease. In addition, the high prevalence of VL in dogs in 69

various localities of Mossoró (Amóra et al. 2006, Matos et al. 2006) demonstrates the need to 70

measure the sandfly frequency in urban areas. In this study, a phlebotomine sandfly survey 71

was conducted in intense VL transmission areas in Mossoró with the goal of correlating the 72

ecology of the sandfly with specific environmental variables. 73

74

MATERIALS AND METHODS 75

76

Study area - Mossoró city is located 285 km from Natal, the capital of Rio Grande do 77

Norte State, whose coordinates are 37° 20' 39" longitude west and 05° 11' 15" latitude south 78

and 16 m above see level. Occupying an area of 2.110.207 km², 85% of the population of 79

Mossoró (234,390) is concentrated in an urban area (IBGE, 2007). The average annual 80

temperature is approximately 27.5° C with a maximum of 36° C and a minimum of 21° C. 81

The average relative humidity is between 59% and 76%. The climate is semi-arid and 82

characterized by low rainfall and two well-defined seasons: the rainy season, concentrated 83

from January to April and extending as late as June (500 to 700 mm/ year) and dry season 84

(IDEMA 2002). 85

The entomological investigation was conducted at Abolição, Aeroporto and Rincão 86

districts of Mossoró city (Fig. 1). These three areas were classified as intense VL transmission 87

areas, as defined by a mean number of human VL cases > 4.4 in the last five years (Ministério 88

da Saúde 2006). 89

90

Entomological fauna capture and identification - The inclusion criterion for domiciles 91

in the study included recent Lu. longipalpis capture history, presence of abundant vegetation 92

in the peridomicile, domestic animals, and organic matter accumulation. The selected 93

domiciles also had poor sanitary conditions. The captures were carried out monthly from 94

January to December 2007 over four consecutive nights from 6:00 p.m. to 6:00 a.m. using 95

CDC light traps. Two traps were placed for each domicile, one in the interior and the second 96

in the peridomicile area, preferably in animal shelters, as proposed by the Brazilian Ministry 97

of Health (Ministério da Saúde 2006). 98

99

The captured insects were identified by the Laboratory of Veterinary Microbiology of 99

the Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA). The female specimens were 100

clarified dissected on slides and covered with slips for observation under an optical 101

microscope (Aransay et al., 2000). The sandfly identification was performed according to 102

Galati (2003). 103

104

Data analysis - The environmental variables including temperature (°C), relative 105

humidity (%) and rainfall (mm) were provided by the UFERSA weather station. The 106

male/female ratio, rainy season influence and capture site (intradomicile or peridomicile) 107

were analyzed by a Chi-square (c2) test. The correlation between environmental variables and 108

sandfly population density was modeled using a single or multiple linear regression analysis 109

and the strength of the relationship assessed by Pearson's correlation coefficient using the 110

software SigmaStat 3.1 (2004). 111

112

Ethics committee - The Ethical Committee of the University State of the Ceará 113

approved this study as part of the research project entitled “Biological control and 114

entomological surveillance of Lutzomyia longipalpis in the city of Mossoró, Rio Grande do 115

Norte” (protocol n. 07465297-4). 116

117

RESULTS 118

At the end of the study, 7,347 sandflies were captured, 93.85% of which were Lu. 119

longipalpis (c2= 2,825.12, df = 1, p < 0.05). The remaining sandflies were Lutzomyia 120

evandroi Costa Lima & Antunes, 1936. There was no difference in the number of male and 121

female Lu. Longipalpis captured, but more male Lu. evandroi were caught (c2 = 1.95, df = 1, 122

p < 0.05). The sandflies were found more commonly in the peridomicile (70.48%) in all 123

neighborhoods and in all months (c2 = 616.18, df = 1, p < 0.05) (Table I) of the study. Lu. 124

longipalpis was present every month of the year, with the peak prevalence in May and July (p 125

< 0.05) (Table II). 126

Figure 2 shows sandfly temporal variation and environmental variables. The LV 127

vector assumed a discrete seasonal distribution, with an increase in population size during 128

rainy periods. The density of Lu. longipalpis were statistically different for the different 129

months (p < 0.05), principally for monthly average rainfall, where March was the wettest 130

month. During the study it rained 943.2 mm and the average relative humidity for the rainy 131

100

period was 74.75% (c2 = 0.87, df = 1, p > 0.05). Temperature remained almost constant and 132

relative humidity varied slightly (Table II). The relative humidity and rainfall, isolated or 133

associated, did not influence the population density. However, the association of either 134

humidity or rainfall with the temperature negatively influenced sandfly density, as did 135

temperature alone (Table III). 136

The rainy season did not influence the number of Lu. longipalpis captured (c2 = 1.22, 137

df = 1, p > 0.05). This observation confirms that neither rainfall nor humidity have an 138

influence on the population density. Nevertheless, more insects were captured in the 139

intradomicile during the rainy season (c2 = 42.79, df = 1, p < 0.05) and in the peridomicile 140

during the dry season (c2 = 31.71, df = 1, p < 0.05) (Table IV). 141

142

DISCUSSION 143

The neighborhoods analyzed in this study are located in the periphery of the city, with 144

abundant vegetation, domestic animals and organic matter. As evidenced by our study, this 145

environment provides excellent conditions for sandfly breeding and population growth, and 146

our observations corroborate the studies of Ximenes et al. (2000). These conditions are known 147

to favor the presence of Lu. longipalpis (Michalsky et al. 2009), the predominant 148

phlebotomine species in the city. The predominance of Lu. longipalpis was also observed in 149

previous studies in VL endemic areas in Brazil (Barata et al. 2005, Monteiro et al. 2005, 150

Missawa & Dias 2007, Ximenes et al. 2000, 2007, Cortez et al. 2007, Oliveira et al. 2008, 151

Macedo et al. 2008, Michalsky et al. 2009, Queiroz et al. 2009). Predominance of the VL 152

vector has also been observed in other countries, where the VL vectors are other species of 153

sandflies, such as Phlebotomus sergent in northeastern Uzbekistan (Maroli et al. 2001), 154

Phlebotomus arias in northeastern Spain (Aransay et al. 2004), Phlebotomus perniciosus in 155

central Italy (Bongiorno et al. 2003), Phlebotomus papatasi in Marrakesh, Morocco (Boussaa 156

et al. 2005) and Lutzomyia pseudolongipalpis in western Venezuela (Feliciangeli et al. 2006). 157

Lutzomyia evandroi was found in the same ecotopes as Lu. longipalpis. Similar 158

distribution of the vector was observed in 30 others municipalities in Rio Grande do Norte 159

state; however, Lu. longipalpis remained the most prevalent sandfly (Ximenes et al. 1999, 160

2000, Queiroz et al. 2009). The scarcity of Lu. evandroi may be related to male predominance 161

in Lu. evandroi populations and/or the species still being in the process of adaptation, with its 162

preferred food still being wild animals (Ximenes et al. 1999, Queiroz et al. 2009). 163

101

Nonetheless, Lu. evandroi has not yet been implicated as a leishmaniasis vector (Lainson & 164

Rangel 2005). 165

Females are the transmitting agents of Leishmania due to their hematophagous feeding 166

habit, and they are consistently found year round. Nevertheless, there was no observed 167

difference in the prevalence of the two sexes of Lu. longipalpis, in contrast to previously 168

published studies where males were more prevalent than females (Ximenes et al. 2000, Barata 169

et al. 2005, Michalsky et al. 2009, Queiroz et al. 2009). 170

The increased presence of sandflies in the peridomicile was also observed in other ten 171

municipalities of the Rio Grande do Norte state (Ximenes et al. 2000, 2007). Similar 172

observations were made in Montes Claros, Minas Gerais state,where sandflies were captured 173

near domestic animals (Monteiro et al. 2005). The devastation of forest areas for economic 174

exploration is one factor contributing to the increased prevalence of sandflies in the 175

peridomicile. Specifically, land devastation ultimately results in introduction of VL to the 176

periphery of urban areas as both the vectors and hosts migrate to the peridomicile in search of 177

food (Maroli et al. 2001, Barata et al. 2005). It is also important to comment on the high 178

number of Lu. longipalpis captured inside the houses. These data illustrate the endophilic 179

behavior of the vector and emphasize the possibility of VL transmission in the intradomicile 180

(Barata, et al. 2005, Monteiro, et al 2005, Missawa & Dias, 2007, Ximenes et al. 2007, 181

Michalsky et al. 2009). Oftentimes, many of the Lu. longipalpis females captured inside the 182

residence were also engorged from a blood meal after having fed on humans or animals. 183

Several studies have demonstrated a clear relationship between abiotic factors, 184

including temperature, rainfall, and humidity and sandfly population density, citing the 185

interference in adult life cycles or modification of breeding sites (Scorza et al. 1968, Chaniotis 186

et al. 1971, Monteiro et al. 2005, Oliveira et al. 2008, Michalsky et al. 2009). A decrease in 187

the population is expected after peak rainfall as flooding will ultimately destroy the breeding 188

sites and kill the pupae in the soil (Dias et al. 2007). However, in this study, neither rainfall 189

nor humidity significantly affected sandfly density. Similar data have been observed in 190

Várzea Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil (Missawa & Dias 2007). However, it has 191

classically been reported that the rainy period favors the proliferation and survival of sandflies 192

(Deane & Deane 1955) during (Ximenes et al. 2006, Macedo et al. 2008, Queiroz et al. 2009) 193

or after the rainy months (Dias et al. 2007). In our study, more Lu. longipalpis were captured 194

during the dry season in the intradomicile as compared to the peridomicile, and most of the 195

specimens were collected during the rainy season. This trend could be explained as the insects 196

searching for a more humid environment. 197

102

The temperature remained constant but high throughout the study. Thus, high 198

temperature alone or temperature in combination with other variables was unfavorable to 199

sandfly population growth and can most likely be attributed to the long rainy season. This 200

inverse correlation between sandfly prevalence and temperature has also been observed in 201

Nísia Floresta in the same state (Ximenes, et al. 2006), in Campo Grande, Mato Grosso do Sul 202

State, Brazil (Oliveira et al. 2008) and Sobral, Ceará State, Brazil (Macedo et al., 2008). 203

However, studies conducted in Morocco with P. papatasi (Boussaa et al. 2005) and Nísia 204

Floresta with Lutzomyia spp. (Ximenes et al. 2000) have observed that these sandflies live in 205

high temperatures and have not measured a significant correlation between population density 206

and temperature. 207

Despite the absence of human VL cases in the houses included in the study, the large 208

vector population is associated with a high prevalence of canine VL (Amóra et al. 2006, 209

Matos et al. 2006) and is indicative of an area with potential risk of transmission of this 210

zoonosis to humans. Similar data were observed in Janaúba, Minas Gerais state, Brazil 211

(Michalsky et al. 2009). 212

In this study we observed that Lu. longipalpis, the predominant sandfly species in 213

Mossoró, is present in substantial numbers throughout the year. This finding demonstrates the 214

difficulty of establishing standardized measures for vector control, due to the particularities of 215

this region. Given the high number of insects caught in the intradomicile setting, we 216

recommend intensification of VL control measures in Mossoró and an increased emphasis on 217

health education. 218

In conclusion, the eco-epidemiological profile of VL is complex and displays 219

particularities in each area of transmission. For this reason, each entomological survey is 220

specific for the locality studied. Public health agencies can use these data to establish 221

adequate control measures for the VL vector. 222

223

ACKNOWLEDGMENTS 224

We thank Dr. Nélio B. Morais, Lindemberg Caranha and Richristi A. Silva 225

(SESA/CE) and Ana Claudia B. Mendonça and Sodré Rocha (Secretaria Municipal de Saúde 226

de Mossoró) for assistance in sandfly field collections, Dr. Rui Sales Júnior and Dr. Celicina 227

M. S. B. Azevedo (UFERSA) for their help and the administrative staff of the UFERSA for 228

logistic support. We also thank Msc Lorena M. B. Oliveira for reviewing the manuscript. In 229

addition, we are grateful to the inhabitants of the studied areas for their patience and kindness. 230

231

103

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336

337

338

339

340

341

342

343

344

345

346

347

348

349

350

351

352

353

354

355

356

357

358

359

360

361

362

363

107

TABLE I 364

Distribution of Lutzomyia spp. according to species, sex and place of capture during the 2007 365

phlebotomine sandfly survey in Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil. 366

Sex Place of capture Sandfly

Female Male Total Intradomicile Peridomicile Total

Lu. longipalpis 3,435Aa 3,460Aa 6,895a 2,071Aa 4,824Ba 6,895a

Lu. evandroi 205Ab 247Bb 452b 98Ab 354Bb 452b

Total 3,640A 3,707A 7,347 2169ª 5,178B 7,347

Capital letters compare the columns and small letters the lines. Different letters indicate 367

significantly different values by the chi-square test (p < 0.05). 368

369

370

TABLE II 371

Prevalence of Lutzomyia longipalpis and mean environmental variables, including 372

temperature (°C), relative humidity (%) and rainfall (mm), during the 2007 phlebotomine 373

sandfly survey conducted in Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil. 374

Lutzomyia longipalpis Environmental variables Months

Female Male Total Temperature Rainfall Humidity

January 63A 92B 155a 29.20a 9.70b 72.41ab

February 110A 142B 252b 27.96a 212.20e 77.29ab

March 157A 172B 329c 27.01a 389.30f 80.98b

April 351B 214A 565e 27.43a 141.20d 78.41ab

May 527A 469A 996h 27.07a 110.20d 74.85ab

June 366A 455B 821g 26.71a 42.40c 72.65ab

July 1,080B 791A 1871i 27.65a 5.00b 63.11ab

August 264A 395B 659f 27.65a 0.00a 55.76a

September 190A 238B 428d 28.46a 0.00a 57.00a

October 112A 154B 266b 28.73a 0.00a 58.47ab

November 133A 182B 315c 28.82a 0.00a 62.94ab

December 82A 156B 238b 28.80a 33.20c 66.63ab


significantly different values by the Chi-square test (p < 0.05). 376

377

108

TABLE III 378

Analysis of the influence of environmental variables, including temperature, relative humidity 379

and rainfall, on the population density of Lutzomyia longipalpis during the 2007 380

phlebotomine sandfly survey in Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil. 381

Pearson coefficient (analysis) Environmental Variables

R r2 df F p

Temperature -0.680 0.462 1 8.592 0.015*

Temperature + Humidity -0.816 0.666 2 8.980 0.007**

Temperature + Rainfall -0.819 0.670 2 9.154 0.007**

Humidity -0.178 0.032 1 0.329 0.579

Rainfall -0.098 0.009 1 0.096 0.762

Humidity + Rainfall -0.189 0.036 2 0.166 0.850

Asterisks indicate significantly different values by the Linear Regression (p < 0.05*; p < 382

0.01**). 383

384

385

TABLE IV 386

Distribution of Lutzomyia longipalpis in accordance with the location of capture 387

(intra/peridomicile) during the dry period (July-Nov) and the rainy period (Dec-Jun) during 388

the 2007 phlebotomine sandfly survey in Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil. 389

Intradomicile Peridomicile Rainfall

Female Male total Female Male total Overall

Rainy period 639a 607a 1246a 1017a 1093a 2110a 3356a

Dry period 361b 464b 825b 1364b 1296b 2660b 3485a

Total 1000A 1071A 2071 2381A 2389A 4770 6841


significantly different values by the Chi-square test (p < 0.05). 391

392

393

394

109

395

396 Fig. 1: Mossoró, Rio Grande do Norte State, Brazil and the neighborhoods, Aeroporto, Abolição and 397

Rincão where the phlebotomine sandfly survey was conducted from January to December 2007. 398

399

400

401 Fig. 2: Temperature, relative humidity, rainfall and prevalence of sandfly Lutzomyia longipalpis and 402

Lutzomyia evandroi captured during the 2007 phlebotomine sandfly survey in Mossoró, Rio Grande 403

do Norte State, Brazil. 404

110

7 CONCLUSÕES GERAIS

Em Mossoró, Rio Grande do Norte, a leishmaniose visceral pode ser transmitida

durante todo o ano e a temperatura influencia negativamente a densidade populacional de Lu.

longipalpis.

Os fungos B. bassiana e M. anisopliae var. acridum foram patogênicos principalmente

contra larvas e adultos de Lu. longipalpis e quando comparados entre si B. bassiana foi mais

patogênico do que M. anisopliae var. acridum. Além disso, a passagem pelo inseto aumentou

os parâmetros de desenvolvimento dos fungos, demonstrando sua viabilidade como agentes

de biocontrole.

Desta forma, foi demonstrado que o principal vetor da leishmaniose visceral é

susceptível à infecção com fungos entomopatogênicos. Consequentemente, o uso desses

fungos nos programas de controle de flebotomíneos poderá reduzir o uso de inseticidas

químicos, resultando em benefícios para os seres humanos e o ambiente.

111

8 PERSPECTIVAS

O conhecimento da dinâmica populacional de flebotomíneos somado ao uso de

técnicas moleculares para determinar a taxa de infecção desses vetores serão úteis para o

controle mais eficiente da leishmaniose visceral.

Para implantar o controle biológico do vetor é necessário outros experimentos relativos

à produção em massa de fungos, fatores ambientais e modo de exposição no campo para

determinar o momento, a frequência de aplicação e melhorar a formulações. Além disso, uma

análise dos efeitos que os flebotomíneos podem ter sobre a viabilidade e infectividade dos

fungos também precisa ser realizada.

112

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A524v Amóra, Sthenia Santos Albano

Vigilância entomológica e controle biológico de Lutzomyia

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Santos Albano Amóra.__ Fortaleza, 2009.

133p.; il.

Orientadora: Profa Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua

Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) - Universidade

Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.

1. Leishmaniose visceral. 2. Lutzomyia longipalpis. 3.

Sazonalidade do vetor. 4. Controle biológico. 5. Fungos

entomopatogênicos. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de

Veterinária.

universidade estadual do cearÁ prÓ-reitoria de … · Ø a dra elizabeth ferreira rangel...

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