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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
VETERINÁRIAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
GLÍCIA MENESES COSTA
QUANTIFICAÇÃO DE COLÁGENO EM LESÕES DE PELE EM
CÃES COM DOENÇAS ENDÓCRINAS
FORTALEZA – CEARÁ
2017
2
GLÍCIA MENESES COSTA
QUANTIFICAÇÃO DE COLÁGENO EM LESÕES DE PELE EM CÃES
COM DOENÇAS ENDÓCRINAS
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado Acadêmico em Ciências
Veterinárias do Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial à
obtenção do grau de mestre em Ciências
Veterinárias. Área de Concentração:
Reprodução e Sanidade Animal. Linha de
Pesquisa: Reprodução e sanidade de
carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.
Orientadora: Profa. Dra. Janaina Serra Azul
Monteiro Evangelista.
Fortaleza – CEARÁ
2017
3
4
5
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Maria Iracema Meneses Costa e Geraldo Antônio da Costa por todo
apoio que sempre recebi, pelo amor e dedicação incondicional e pela educação que tive
o privilegio de receber.
Aos meus irmãos, Vanessa Meneses de Carvalho e Lucas Meneses Costa que me
dedicam o verdadeiro amor de irmãos e amizade.
Ao Ivo Maia que desde o primeiro momento que escutou que eu estava pensando em me
dedicar à vida acadêmica, me incentivou e apoiou.
A minha orientadora Dra. Janaina Serra Azul por ter aceitado me orientar num projeto
diferente do que ela estava acostumava trabalhar e por todo conhecimento dividido.
Ao corpo docente e funcionários do curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias.
A Dra Régia Patrocinio e ao Dr. Dalgimar Bezerra de Menezes pela colaboração neste
projeto.
Aos membros da banca por terem aceitado participar da mesma.
Aos integrantes do MEC, por toda cooperação e ajuda prestada durante esse processo.
Em especial à Steffi, Nina, Félix Jr e João Alison pelas contribuições em alguns
momentos de dúvida.
Aos médicos veterinários que contribuíram encaminhando seus pacientes para a
participação no estudo. Em especial à Laís Paiva, Msc. Kelliani Mucida e Dr. Daniel
Viana.
Aos amigos que me apoiaram e ficaram felizes ao saberem da minha caminhada na vida
acadêmica.
A Deus por me guiar sempre;
A todos vocês, obrigada!
6
RESUMO
A dermatologia e a endocrinologia veterinária são especialidades em ascensão. As
dermatopatias endócrinas caninas representam 8,6% dos atendimentos dermatológicos,
sendo o sintoma clássico a alopecia bilateral simétrica não pruriginosa. As doenças
endócrinas sistêmicas mais frequentemente relacionadas às alterações cutâneas são o
hipotireoidismo (HpT) e o hiperadrenocorticismo (HAC). Ainda não há um padrão
histopatológico determinado das lesões cutâneas para cada uma dessas patogenias.
Desta forma, o objetivo deste estudo foi caracterizar morfologicamente por meio de
análise macroscópica, microscópica e imunohistoquímica as lesões dermatológicas em
cães com as endocrinopatias citadas. Foram utilizadas biópsias de peles de 24 cães que
foram divididos em 3 grupos de 8 cães com HAC, Hpt e 8 cães pertencentes ao grupo
controle, sem lesões dermatológicas evidentes. Esses fragmentos foram processados
pelas técnicas habituais histológicas com posterior confecção de lâminas para análise ao
microscópio. As colorações utilizadas foram Hematoxilina-Eosina (HE), Ácido
periódico de Schiff (PAS), Azul de toluidina, Tricrômio de Masson (TM) e Picrossirius
red (PSR). Outras secções foram marcadas por imunohistoquímica com anticorpos
Tireoglobulina, TSH e ACTH e revelados pela diaminobenzidina (DAB). Todo o
protocolo experimental foi submetido ao comitê de ética para experimentação animal
(CEUA), protocolo nº 1534880-2016. Uma analise quantitativa aleatória foi realizada
nas secoes de TM e PSR. Houve uma maior quantificação da percentagem de área de
colágeno nos animais com endocrinopatias usando a técnica PSR (hipotireoidismo = 47
± 0.89 e hiperadrenocorticismo = 44 ± 0.9). Houve um aumento estatisticamente
significativo da percentagem de área de colágeno dérmico em animais endocrinopatas
quando comparados aos animais do grupo controle (hipotireoidismo = 64 ± 0.082,
hiperadrenocorticismo = 51 ± 1 e controle = 57 ± 0.64) usando a técnica de coloaração
TM. Uma diferença estatisticamente significativa foi observada entre entre a técnica TM
e a PSR nos 3 grupos estudados, p <0.0001. Concluiu-se que que existe uma
superprodução de colágeno em na pele de pacientes com hipotireoidismo e
hiperadrenocorticismo.
Palavras-chave: hipotireoidismo. hiperadrenocorticismo. dermatopatias endócrinas.
exame histopatológico. imunohistoquímica.
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ABSTRACT
Veterinary dermatology and endocrinology are specialties on rise. The canine endocrine
dermatopathies account for 8.6% of dermatological consultations, the classic symptom
being non-pruriginous symmetric bilateral alopecia. The systemic endocrine diseases
most frequently related to skin changes are hypothyroidism (HpT) and
hyperadrenocorticism (HAC). There is still no established histopathological pattern of
skin lesions characteristic for each of these pathogens. Thus, the aim of this study was
to characterize the dermatological lesions in dogs with the mentioned endocrinopathies
by means of macroscopic, microscopic and immunohistochemical analysis. Skin
biopsies were used in 24 dogs that were divided into 3 groups of 8 dogs with HAC, 8
with Hpt and 8 dogs belonging to the control group, without evident dermatological
lesions. These fragments were processed by the classic histology techniques with
subsequent slides analysis. Stains used were Hematoxylin-Eosin (HE), Periodic Acid of
Schiff (PAS), toluidine blue, Masson’s Trichrome (MT) and Picrossirius red (PSR).
Other sections were marked by immunohistochemistry with antibodies Thyroglobulin,
TSH and ACTH and revealed by diaminobenzidine (DAB). The entire experimental
protocol was submitted to the Ethics Committee for Animal Experimentation (CEUA),
Protocol No. 1534880-2016. Random quantitative analysis was performed on MT and
PSR sections. There was a greater quantification of percentage of collagen area in
endocrinopathic animals (hypothyroidism = 47 ± 0.89 and hyperadrenocorticism = 44 ±
0.9) using PSR. There was a statistically significant percentage of dermal collagen area
in endocrinopathic animals when compared to control animals (hypothyroidism = 64 ±
0.082, hyperadrenocorticism = 51 ± 1 and control = 57 ± 0.64) using MT staining. An
statistically significant difference was observed between Masson’s trichrome technique
and picrosirius red staining technique under polarized light in the 3 groups studied , p
<0.0001. Then, we may conclude that an overproduction of collagen was demonstrated
in the skin of patients with hypothyroidism and hyperadrenocorticism.
Keywords: hypothyroidism. Hyperadrenocorticism. endocrine dermatopathies.
histopathological examination. Immunohistochemistry.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotomicrografia de pele normalde cão. Junção
dermoepidérmica......
14
Figura 2 - Digital analysis of lateral trunk skin sections from dogs with
hypothyroidism and hyperadrenocorticism, stained by
Picrosirius red under polarization. Representative epidermal-
dermal junction in circular polarization (A, B, C). Binarized
image (B). Regions marked in red corresponding to collagen
deposition in polarization (C). 10x.
57
Figura 3 - Photomicrographs of lateral trunk skin from control dogs and
dogs with hypothyroidism and hyperadrenocorticism, stained
by Hematoxylin and Eosin, Masson’s Trichrome and Picrosirius
Red. A, B and C. Epidermal-dermal junction from dogs with
normal skin, hypothyroidism skin, hyperadrenocorticism skin
in 1, 2 and 3, respectively. (A1) Control dogs showed normal
epidermal thickness (arrow). (A2) Hypothyroidism dogs showed
acanthosis with áreas of orthokeratosis and parakeratosis that
reaches the light of hair follicles forming keratin plugs
(comedones – thin arrow). Vacuolization of the pilo-erector
muscle (thick arrow). (A3) Hyperadrenocorticism dogs showed
mineralization of dermal collagen (calcinosis cutis – thick
arrows) and inflammatory infiltrate around it (triangles). 10x.
57
Figura 4 - Photomicrographs of lateral trunk skin from control dogs and
dogs with hypothyroidism and hyperadrenocorticism, stained
by Picrosirius Red (A, A1, A2). Photomicrographs B, B1, B2
showed the same area under polarized light. 10x.
58
Figura 5 - Percentage of collagen area found in the skin of dogs with
hypothyroidism and hyperadrenocorticism when compared to
the animals of the control group using the coloring technique of
Picrosirius red under polarized light.
59
Figura 6 - Percentage of collagen area found in the skin of dogs with
hypothyroidism and hyperadrenocorticism when compared to
the animals of control group using the coloring technique of
Masson’s trichrome.
59
Figura 7 - Comparing the use of the two staining techniques to analyze the
percentage of collagen area quantified in the control group,
hypothyroidism group and hyperadrenocorticism group.
60
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACTH Hormônio Adrenocorticotrófic
AINE’S Antiinflamatórios não esterioidais
ALT Alanina aminotransferase
CEUA Comitê de ética para experimentação animal
CRH Hormônio Liberador de Corticotrofina
DAB Diaminobenzidina
FA Fosfatase alcalina
fT3 Triiodotironina livre
fT4 Tiroxina livre
HAC Hiperadrenocorticismo canino
HE Hematoxilina-Eosina
HPD Hiperadrenocorticismo pituitário dependente
HpT Hipotireoidismo
LDDST Teste de supressão com doses baixas de dexametasona
MT Masson’s Trichrome
PAS Ácido periódico de Schiff
PD Polidipsia
PSR Picrossirius red
PU Poliúria
SID Uma vez por dia
rT3 Triiodotironina revertida
T3 Triiodotironina
T4 Tiroxina
TA Tumor na adrenal
TM Tricrômio de Masson
TR Receptor de hormônio da tireoide
TRH Hormônio liberador de tireotrofina
TSH Hormônio estimulante da tireoide
TT3 Triiodotironina total
TT4 tireoxina total
10
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................... 11
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................. 13
2.1 A PELE......................................................................................... 13
2.1.1 Epiderme...................................................................................... 14
2.1.2 Membrana basal......................................................................... 15
2.1.3 Derme........................................................................................... 16
2.1.4 Tecido subcutâneo....................................................................... 16
2.2 COLÁGENO................................................................................ 16
2.3 MECANISMO DE REGULAÇÃO FISIOLÓGICA................. 17
2.4 HIPOTIREOIDISMO.................................................................. 18
2.4.1 Classificação do hipotireoidismo............................................... 19
2.4.2 Sinais Clínicos do hipotireoidismo............................................ 20
2.4.3 Alterações Cutâneas no hipotireoidismo.................................. 21
2.4.4 Diagnóstico do hipotireoidismo................................................. 23
2.4.5 Tratamento do hipotireoidismo................................................. 26
2.5 HIPERADRENOCORTICISMO................................................. 27
2.5.1 Classificação do hiperadrenocorticismo................................... 27
2.5.2 Sinais Clínicos do hiperadrenocorticismo................................ 28
2.5.3 Alterações Cutâneas no hiperadrenocorticismo...................... 29
2.5.4 Diagnóstico do hiperadrenocorticismo..................................... 30
2.5.5 Tratamento do hiperadrenocorticismo..................................... 31
2.6 BIOPSIA CUTÂNEA................................................................. 33
2.6.1 Biopsia por “punch”.................................................................. 34
2.6.2 Biopsia elíptica............................................................................ 35
2.6.3 Biopsia excisional........................................................................ 35
2.7 COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS........................................... 35
3 JUSTIFICATIVA...................................................................... 37
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA........................................................ 38
5 OBJETIVOS............................................................................... 39
5.1 GERAL........................................................................................ 39
5.2 ESPECÍFICOS............................................................................. 39
6 CAPÍTULO 1............................................................................. 40
7 CONCLUSÕES.......................................................................... 61
8 PERSPECTIVAS....................................................................... 62
REFERÊNCIAS......................................................................... 63
11
1. INTRODUÇÃO
A dermatologia e a endocrinologia veterinária são especialidades em ascensão
na prática clínica do médico veterinário. Dos atendimentos realizados em hospitais e
clínicas veterinárias, 18,8% dos casos estão relacionados a problemas dermatológicos,
destas 8,6% são causadas por endocrinopatias (SCOTT & PARADIS, 1990).
No Brasil, Machado et al. (2004), observaram que a prevalência das
dermatopatias era distribuída por grupos de doenças: 44,4% de origem imunopática;
20% parasitária; 12,4% complexo seborreia-disqueratinização; 11,2% bacteriana; 6,4%
fúngica; 2,8% diversas; 2,0% endócrina e 0,4% congênita e hereditária. SOUZA et al.
(2009) encontraram porcentagem pouco maior de 2,6% para as dermatopatias
endócrinas, o que não foi observado por Gonçalves et al. (2009) em levantamento
realizado na região centro-oeste brasileira, revelando valor de 0,5% .
No período entre agosto de 1998 e dezembro de 2005, 4107 cães foram
atendidos na Clínica Veterinária Animália (Rio de Janeiro - RJ), destes 809 (19,7%)
foram encaminhados ao setor de Dermatologia, onde 266 (32,9%) apresentavam
dermatopatias associadas ao hipotireoidismo, correspondendo a 6,5% do total de
atendimentos (TEXEIRA, 2008).
A pele é um importante órgão, que possui diversas respostas às lesões, que
podem ser expressas em determinadas doenças. A união de todas as informações
oriundas das lesões cutâneas devem ser processadas de modo a determinar os padrões
de alterações teciduais (HILL, 2005).
Dentre as lesões teciduais encontradas em cães a alopecia assume grande
relevância, principalmente quando está associada a endocrinopatias (FRANK, 2006). Os
tipos de alopecia presentes em cães são a alopecia traumática induzida, alopecia
parasitária, alopecia infecciosa e não inflamatória, podendo ou não apresentar prurido.
(PARADIS & CERUNDOLO, 2003).
A alopecia não inflamatória é um problema frequente em cães, no entanto, a
patogenia deste grupo de doenças ainda permanece incerta e o diagnóstico baseia-se na
anamnese, achados clínicos e laboratoriais e histopatologia de biópsias de pele. Os
prováveis diagnósticos incluem hiperadrenocorticismo (HAC), hipotireoidismo,
hiperestrogenismo, alopecia X e alopecia recorrente do flanco (MÜNTENER, 2012).
Entre as dermatopatias endócrinas pertencentes ao grupo de alopecia não inflamatória,
as mais frequentes em ordem decrescente são hipotireoidismo, hiperadrenocorticismo,
hiperestrogenismo, nanismo hipofisário (SOUZA et al., 2009).
12
Scott et al. (2001), ao estudarem endocrinopatias com reflexos na derme,
observaram que as mudanças provocadas pelo aumento ou pela diminuição de
determinados hormônios podem causar alterações na foliculogênese, no processo de
pigmentação e na epidermopoiese. Com isso, as manifestações cutâneas clássicas das
endocrinopatias incluem alopecia bilateral simétrica, hiperpigmentação, repilação lenta
ou ausente e ausência de prurido (ARIAS & JERICÓ, 1997; PORTO et al., 2008;
SCARAMPELLA, 2011; MÜNTENER, 2012; NUNES et al., 2013).
Os hormônios influenciam e desempenham um papel no processo biológico
normal da pele (GRANDO, 1993). A deficiência na produção dos hormônios sexuais e
tireoidianos modifica todos os componentes da pele, independente da região e
característica anatômica, havendo na associação hipotireoidismo-castração, um
agravamento das alterações cutâneas (FERREIRA et al., 2003).
Através da realização do exame dermatológico pode ser determinada a origem
da alopecia. As alopecias inflamatórias comumente apresentam eritema, pápulas,
pústulas, furúnculos e crostas, diferentemente das alopecias não inflamatórias, que
levam a suspeita de displasias foliculares ou doenças endócrinas. A hiperpigmentação
da pele também é um fator primordial na avaliação dermatológica. Os cães que
apresentam alopecia simétrica devem passar por uma avaliação minuciosa para a
observação de outras alterações cutâneas, como comedões, espessura da pele e
deposições de cálcio (BOND, 2004).
O exame histopatológico é considerado uma das ferramentas mais poderosas em
dermatologia. Para se obter resultados satisfatórios, é importante que o clínico selecione
com precisão os locais a serem biopsiados e preserve cuidadosamente as amostras para
uma análise precisa e fidedigna (SCOTT, 2001 e CAMPANA, 2010).
Em estudo realizado por um grupo de pesquisadores do estado do Rio de
Janeiro, a biópsia de pele, associada ao exame histopatológico, foram os métodos mais
eficientes no diagnóstico do hipotireoidismo, com especificidade de 100% e
sensibilidade de 98,2%. As alterações microscópicas específicas encontradas foram a
hipertrofia com vacuolização dos músculos pilo-eretores e o mixedema. Observou-se
que estas alterações foram encontradas em 97,6% dos animais que tiveram o
diagnóstico da endocrinopatia confirmado pelo exame histopatológico. Devido à
elevada especificidade (100%) e sensibilidade (98,2%), o exame histopatológico foi o
método de diagnóstico mais eficaz para o hipotireoidismo (TEIXEIRA, 2008).
13
Scott (1982) observou que diferentes distúrbios endócrinos poderiam cursar com
diversos achados histopatológicos, sendo os mais frequentes são hiperqueratose,
queratose folicular, dilatação folicular, atrofia do folículo piloso, melanose epidérmica e
atrofia das glândulas sebáceas. Esses achados são indicativos de distúrbios endócrinos,
mas não são específicos para nenhuma dermatopatia endócrina.
O diagnóstico definitivo das alopecias é obtido por meio da análise em conjunto
com testes laboratoriais (exame microscópico do pelo, biópsias cutâneas, análises
sanguínea e urinária e testes hormonais) e achados clínicos. O tratamento do paciente
afetado pela alopecia endócrina vai depender da patologia diagnosticada (BOND, 2004).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A PELE
A pele constitui o maior órgão do organismo animal. Este órgão recobre toda a
superfície do corpo e desempenha inúmeras funções, tais como: proteção contra lesões;
termorregulação; proteção contra a radiação ultravioleta, entre outros. Além de receber
estímulos do ambiente, devido à abundante inervação sensorial (JUNQUEIRA,
CARNEIRO, 2013; SOUZA et al., 2009ᵃ ; YOUNG et al., 2007).
Este órgão é responsável pelo envio de informações do meio ambiente externo
para o organismo, existindo terminações nervosas na pele para esta função que
transmitem a mensagem para o sistema nervoso central. As células de Merkel são
mecanoreceptores que se localizam na camada basal da epiderme e se apoiam na
membrana basal, presas aos queratinócitos através dos desmossomos. Na base destas
células há uma estrutura em forma de disco, onde são inseridas fibras nervosas
aferentes, que conduzem impulsos para o sistema nervoso central (YOUNG et al.,
2007).
A pele participa do processo de termorregulação através das glândulas
sudoríparas, vasos sanguíneos e tecido adiposo. Os melanócitos produzem a melanina,
este pigmento é responsável pela proteção contra os raios ultravioleta. Estas células se
localizam na junção da derme com a epiderme ou na camada basal, entre os
queratinócitos. O aminoácido tirosina é transformado em dopa que, por sua vez, produz
a dopa-quinona. Esta, após várias transformações, converte-se em melanina para isso é
necessária à participação da enzima tirosinase (SOUZA et al., 2009ᵃ).
14
A pele é dividida morfologicamente em três camadas principais: a epiderme, a
derme (figura 1) e a hipoderme.
Figura 1. Fotomicrografia de pele normal de cão corada pelo método HE. Junção
dermoepidérmica onde observamos a presença da epiderme seguida pela derme
papilar. A fotomicrografia mostra a presença de folículos pilosos e de uma
arteríola. Microscópio Nikon® Eclipse Nis 4.0 com câmera acoplada Nikon® DS
RI1. Objetiva de 10x.
Fonte: arquivo do autor.
2.1.1 Epiderme
A epiderme tem origem mesodérmica e é a camada mais externa da pele, sendo
constituída por um epitélio estratificado, pavimentos e queratinizado. É composta por
diferentes células epiteliais, sendo os queratinócitos os mais abundantes e são os
produtores de queratina. As outras células encontradas na epiderme são os melanócitos
(produtoras de melanina), as células de Langerhans (responsáveis por reconhecer
antígenos) e as de Merkel (mecanoreceptores) (JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2013;
SOUZA et al., 2009ᵃ ; YOUNG et al., 2007).
A pele possui quatro padrões anatômicos que variam em diversos aspectos,
principalmente, em relação à espessura da mesma, sendo mais espessa e complexa na
palma da mão e na planta dos pés. Nestes locais, a pele é composta por cinco camadas
que se distribuem, na seguinte configuração:
15
Camada Basal: nesta camada as células são prismáticas ou cubóides e
basófilas. É o limite final da epiderme, logo a baixo está a derme. Responsável
ao lado da camada espinhosa pela renovação constante da epiderme,
apresentando intensa atividade mitótica (JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2013;
SOUZA et al., 2009ᵃ).
Camada Espinhosa: nesta região as células são cubóides ou ligeiramente
achatadas. Possui feixes de filamentos de queratina (tonofilamentos) que estão
presentes nas curtas expansões entre os citoplasmas. Essas expansões
citoplasmáticas se mantem unidas com as células vizinhas por meio dos
desmossomos, dando às células um aspecto espinhoso (JUNQUEIRA,
CARNEIRO, 2013; SOUZA et al., 2009ᵃ).
Camada Granulosa: os queratinócitos começam a perder a forma poliédrica e
vão se tornando achatadas na medida que se aproxima da superfície. As células
contêm grânulos basófilos e eletro-densos que são chamados de grânulos de
querato-hialina. Estes interagem com as tonofibrilas de citoqueratinas e juntos
irão produzir uma matriz amorfa que vai preenchendo gradativamente as células,
as tornando queratinizadas (SOUZA et al., 2009ᵃ ; YOUNG et al., 2007).
Camada Lúcida: composta por uma delgada camada de células achatadas,
eosinófilas e translúcidas. As células perderam seus núcleos e organelas
citoplasmáticas que foram digeridos por enzimas lisossomais. Ainda apresenta
desmossomos entre as células (SOUZA et al., 2009ᵃ ; YOUNG et al., 2007).
Camada Córnea: composta por escamas queratinizadas, as células estão
mortas, achatadas e não apresentam núcleos. Existe uma descamação constante
(JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2013; SOUZA et al., 2009ᵃ ; YOUNG et al.,
2007).
Na pele fina, as camadas granulosa e lúcida não estão presentes, apresentando
uma camada córnea muito reduzida (SOUZA et al., 2009ᵃ ; YOUNG et al., 2007).
2.1.2 Membrana basal
A membrana basal é responsável por manter a arquitetura da pele, sendo a
separação dermoepidérmica responsável pela fixação e aderência com a derme através
de hemidesmossomos. Na microscopia de luz utilizando a coloração HE, a região da
membrana basal é de difícil identificação. Os cortes corados pelo ácido periódico de
16
Schiff (PAS) podem demostrar a presença dessa zona, principalmente nos coxins, no
plano nasal e nas junções mucocutâneas de cães e gatos (AFFOLTER, V.K. & MOORE
K, 1994).
2.1.3 Derme
A derme é constituída de tecido conjuntivo propriamente dito, rico em colágeno
e fibras elásticas. É a responsável pela junção da pele ao tecido subcutâneo. As papilas
dérmicas são saliências na superfície externa irregular. Estas acrescem área de contato
da derme com a epiderme, aumentando a aderência entre a epiderme e a derme papilar.
Nesta camada encontramos vasos sanguíneos e linfáticos, glândulas sebáceas e
sudoríparas, nervos e folículos pilosos que são estruturas derivadas da epiderme
(JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2013; SOUZA et al., 2009ᵃ ; YOUNG et al., 2007).
Existem duas camadas que compõem a derme, onde o limite entre estas duas
regiões são poucos distintos: a superficial e a profunda.
Camada Papilar: é mais delgada e formada por tecido conjuntivo frouxo, que
forma as papilas dérmicas. Contém fibras colágenas muito delicadas, tramadas
com delgadas fibras elásticas. Possui arteríolas, alças capilares e vênulas,
capilares linfáticos e delicadas terminações nervosas sensitivas, como os
corpúsculos de Meissner.
Camada Reticular: é a mais espessa e constituída por tecido conjuntivo denso
não modelado. Como a derme superficial contem muitas fibras colágenas e
elásticas, responsável pela elasticidade da pele.
2.1.4 Tecido subcutâneo
Formado por tecido adiposo (panículo adiposo) compartimentalizado por septos
de tecido conjuntivo frouxo. Esta região une a derme aos órgãos subjacentes. O
panículo adiposo é uma reserva de energia que proporciona proteção contra o frio
(YOUNG et al., 2007).
2.2 COLÁGENO
O colágeno é uma proteína fundamental na constituição da matriz extracelular
do tecido conjuntivo, sendo o principal componente deste tecido e desempenha um
papel chave na arquitetura e integridade da sua matriz extracelular (GARTNER &
17
HIATT, 2007; WHITTAKER, 1991). É componente proteico mais abundante do corpo,
representa cerca de 1/3 de todas as proteínas (MILLER, 1976).
A síntese do colágeno ocorre intracelularmente em pequenas porções, depois
sendo exportado para fora da célula, onde, através da ação de enzimas polimerizantes, é
definido numa estrutura em hélice-tripla. Cada uma destas 3 "fitas" de proteínas são
formadas quase absolutamente por glicina (representando 1/3 da sequência), prolina e
lisina , e por mais dois aminoácidos que são modificados pelos ribossomos:
a hidroxiprolina e a hidroxilisina (TAZIMA et al., 2008).
Existem vários tipos de colágeno presente no corpo, sendo que a maior parte dos
tecidos encontrados no corpo é composta principalmente por fibras colágenas tipo I e
III. O colágeno tipo I é o mais abundante e o mais encontrado, ele é o maior
componente da pele, sendo responsável pela força tensora e possuindo elasticidade
limitada (JUNQUERIA et al., 1978).
O colágeno tipo III é confere resistência para a distensibilidade estrutural, porém
possui uma força tensora limitada e normalmente tende a estar associado com o tipo I
(JUNQUERIA et al., 1978). Inúmeras técnicas de colorações histológicas são utilizadas
com o intuito de diferenciar o tecido conjuntivo e aprimorar o estudo deste, assim
existem colorações especificas para corar fibras colágenas.
2.3 MECANISMOS DE REGULAÇÃO FISIOLÓGICA
O organismo possui vários mecanismos para regular os hormônios produzidos e
excretados pelas diversas glândulas endócrinas (CUNNINGHAM, 2004). Daremos
ênfase nos eixos hipotálamo-hipófise-tireoide e hipotálamo-hipófise-córtex da adrenal,
pois a partir deles teremos ideia de como ocorrem os distúrbios que levam ao
hipotireoidismo e ao hiperadrenocorticismo canino.
A regulação do eixo da tiroide depende da síntese e secreção diária de tiroxina
(T4). A produção de hormônios da tireoide é diretamente controlada pelo hormônio
estimulante da tireoide (TSH), que é produzido e secretado pelas células tireotróficas da
hipófise. Já a liberação de TSH é regulada pela produção de hormônio liberador de
tireotrofina (TRH), sendo este produzido em neurônios específicos no núcleo
paraventricular do hipotálamo (DUKES, 2007).
O T4 tem um papel em inibir respectivamente a síntese de TRH pelo hipotálamo
e de TSH na hipófise. Se houver uma redução na síntese de T4, nem o hipotálamo nem
as células tireotróficas são inibidas e tanto a TRH como a TSH aumentam sua liberação.
18
Em contrapartida, havendo um aumento na síntese de T4, produz-se uma maior
conversão de T4 em triiodotironina (T3), com inibição da TRH e da TSH. Os níveis
plasmáticos de hormônios tireoidianos são constantemente mantidos pelo mecanismo de
feedback negativo, que envolve a hipófise e o hipotálamo. Hormônios da tireoide livres
asseguram o bom funcionamento deste mecanismo de feedback. Os glicocorticoides e
andrógenos também inibem a secreção de TSH (CUNNINGHAM, 2004; DIXON,
2001).
O hipotálamo produz o hormônio liberador de corticotropina (CRH) que
estimula a hipófise a produzir e liberar a corticotropina (ACTH). A secreção dos
glicocorticoides pelas zonas fasciculada e reticular é controlada então por este eixo
hormonal. Esse eixo é controlado por um sistema de feedback negativo, no qual os
glicocorticoides inibem a liberação de CRH, o que resulta na diminuição da secreção de
ACTH pela hipófise. Existem evidências de que os glicocorticoides possuiriam efeito de
feedback negativo sobre a hipófise (CUNNINGHAM, 2004, DUKES, 2007).
2.4 HIPOTIREOIDISMO
O hipotireoidismo é a endocrinopatia mais frequentemente observada em cães e
tem como característica uma anormalidade estrutural e/ou funcional na glândula, o que
acarreta numa deficiência na produção dos hormônios tireoidianos (ETTINGER &
FELDMAN, 2010). Os hormônios da tireoide estimulam os diferentes órgãos e tecidos
do corpo, pois regulam a atividade de enzimas e proteínas que participam do
metabolismo celular. Assim sendo, causam grande variedade de sinais clínicos
sistêmicos observados nesta patologia.
A principal função da tireoide é controlar o metabolismo do organismo através
da secreção de seus hormônios: T4 e T3. Ambos são derivados iodados do aminoácido
tirosina e responsáveis pelo efeito fisiológico da glândula. É importante destacar que,
além das células foliculares que produzem os hormônios, a tireoide possui células
parafoliculares, produtoras de calcitonina (CUNNINGHAM, 2004; DUKES, 2007).
O hipotireoidismo é uma causa comum de alopecia em seres humanos e em
animais, especialmente em cães (DOSHI, BLYUMIN, KIMBALL, 2008; TSUJIO et
al., 2008; ARTANTAS, 2009). No folículo piloso humano, o receptor do hormônio da
tireoide (TR) participa do desenvolvimento do pelo (SCARAMPELLA, 2011; MORAN
& CHATTERJEE, 2015). Entretanto, poucas pesquisas são realizadas para estudar mais
19
profundamente os TRs e o pelo ou o mecanismo fisiopatológico responsável pela
alopecia causada pelo hipotireoidismo (TSUJIO et al., 2008).
Segundo a literatura, as raças com maior predisposição a sofrer esta patologia
são: Golden Retriever, Doberman Pinscher, Setter Irlandês, Schnauzer Miniatura,
Dachshund, Cocker Spaniel, Airdale Terrier, Boxer, Caniche, Borzoi, Beagle, Setter
irlandês e Old English Sheepdog (SCOTT-MONCRIEFF, 2007). Porém, em estudo
realizado por Teixeira (2008), os animais sem padrão racial definido foram os cães mais
acometidos pelo hipotireoidismo.
A idade em que os primeiros sinais clínicos começam surgir é bastante variável,
sendo que a idade média dos cães ao diagnóstico é de 7 anos (SCOTT-MONCRIEFF,
2007; NELSON & COUTO, 2009).
A predisposição sexual ainda é um fator de impasse entre os autores, alguns
dizem que existe predileção pelas fêmeas e outros dizem não existir predileção sexual
(PANCIERA, 1994; DIXON et al., 1999) . Em estudo realizado por Teixeira (2008),
dos 266 cães hipotireoideos, 154 eram fêmeas (57,9%), das quais 44 castradas e 110
não-castradas, 112 eram machos (42,1%), 32 castrados e 80 não-castrados,
demostrando não haver diferenças estatísticas em relação ao sexo.
Devido à sintomatologia bem diversificada e a associação aos resultados
laboratoriais variáveis ou dúbios, em parte, pela marcada flutuação fisiológica dos
valores dos hormônios tireoidianos, chegar ao diagnóstico definitivo do hipotireoidismo
difícil e o diagnóstico diferencial exaustivo. Apesar desses fatos, é o distúrbio endócrino
mais diagnosticado em cães (SCOTT et al., 2001; SCOTT-MONCRIEFF, 2007).
2.4.1 Classificação do Hipotireoidismo
O hipotireoidismo canino se classifica como primário, secundário ou terciário, e
ainda de ocorrência natural ou iatrogênica (FERGUNSON, 2007; SCOTT-
MONCRIEFF, 2007; ETTINGER & FELDMAN, 2010). A origem dessa
endocrinopatia ainda é extremamente discutida, e sua causa pode ter origem adquirida
ou genética.
As principais formas do hipotireoidismo primário são a tireoidite linfocítica
autoimune e a atrofia idiopática da tireoide. Ambas são bem frequentes, com cerca de
50% dos casos da doença são causados pela tireoidite linfocítica (KEMPPAINEN &
CLARK, 1994). A principal característica histológica da tireoidite linfocítica é a
presença um infiltrado linfocítico e de macrófagos que destroem a região folicular e
20
inviabilizam a produção de hormônios pela glândula (SCOTT et al., 2001; PORTO et
al., 2008).
Na atrofia idiopática há perda do parênquima e substituição por tecido adiposo e
fibras de tecido conjuntivo. Ocorre a degeneração individual das células foliculares com
a exfoliação das células dentro do coloide (ETTINGER & FELDMAN, 2010). A
presença de infiltrado inflamatório não é observada, mesmo em áreas onde os pequenos
folículos ou restos foliculares estão presentes (NELSON & COUTO, 2009).
O hipotireoidismo secundário é raro, e os distúrbios hipofisários, como
hiperplasia ou neoplasia desta glândula, causam a redução das funções tireoidianas
(SCOTT et al., 2001). As alterações associadas ao hipotálamo são classificadas como
uma causa central, mas ainda não foram descritas em cães, sendo citadas como
hipotireoidismo terciário (NELSON & COUTO, 2009; ETTINGER & FELDMAN,
2010).
O hipotireoidismo congênito é raramente diagnosticado em cães, tendo como
possíveis causas a deficiência de iodo, déficits na enzima tiroperoxidase ou defeitos no
desenvolvimento da glândula tireoide. O defeito na secreção de TSH é uma causa
menos comum, e o déficit de receptores de TSH ou TSH anômalo também podem ser a
origem da doença (SCOTT et al., 2001; CASTILLO et al., 2001; NELSON & COUTO,
2009).
O hipotireoidismo iatrogênico pode ser causado por administração de fármacos
antitireoidianos, tratamento com iodo e também tireoidectomia (SCOTT-MONCRIEFF,
2007).
2.4.2 Sinais Clínicos do hipotireoidismo
Os hormônios tireoidianos influenciam a função de muitos órgãos e tecidos de
diferentes sistemas, e por esse motivo os sinais clínicos sistêmicos do hipotireoidismo
são inespecíficos e de natureza bastante variável, raramente assumindo aspectos
característicos. Os sinais mais comuns desta endocrinopatia são os relacionados com o
decréscimo do metabolismo e às alterações dermatológicas. Menos comum, porém bem
documentados, são as manifestações neurológicas, efeitos no sistema cardiovascular, no
sistema reprodutor feminino, e incontáveis sinais clínicos observados no
hipotireoidismo congênito (SCOTT-MONCRIEFF, 2007; ETTINGER & FELDMAN,
2010).
21
Muitos cães apresentam propensão ao aumento de peso, mesmo sem aumentar o
consumo de alimento. Grande parte dos cães afetados pelo hipotireoidismo apresenta
algum grau de retardamento mental, letargia, intolerância ou aversão a exercícios. O
surgimento destes sinais ocorre de maneira gradual e insidiosa, muitas vezes não sendo
reconhecidos pelo proprietário. (NELSON &COUTO, 2009; SCOTT-MONCRIEFF,
2007).
O sistema nervoso central e periférico pode ser afetado pelo hipotireoidismo. Em
um estudo retrospectivo com 66 cães hipotireoideos, as anormalidades neurológicas
foram descritas em 29% dos cães, embora nem todos os sinais neurológicos descritos
possam ser atribuídos ao hipotireoidismo (PANCIERA, 1994). As causas da disfunção
neurológica no hipotireoidismo são pouco compreendidas. A deficiência de ATP leva
ao desequilíbrio na atividade da bomba de Na⁺/K⁺, podendo causar um retardamento do
impulso nervoso e uma disfunção dos nervos periféricos (SCOTT-MONCRIEFF, 2007).
A neuropatia periférica é a manifestação neurológica melhor documentada. Os
cães acometidos apresentam intolerância ao exercício, fraqueza, ataxia especialmente
dos membros pélvicos, tetraplegia ou paralisia, défices proprioceptivos e diminuição
dos reflexos espinhais (ETTINGER & FELDMAN, 2010).
As manifestações oftálmicas relacionadas ao hipotireoidismo incluem lipidose
corneal, úlcera de córnea, uveíte, glaucoma secundário, ceratoconjuntivite seca,
entretanto esses sinais não são comprovados cientificamente (FRANK, 2006).
A deficiência dos hormônios da tiroide possui o potencial de comprometer a
função cardíaca, sendo a bradicardia um sinal clínico observado quando realizado
exame clínico e ausculta (SCARAMPELLA, 2011). A fibrilação é a anormalidade
reportada no eletrocardiograma (SCOTT-MONCRIEFF, 2007).
As alterações reprodutivas atribuídas ao hipotireoidismo nas fêmeas incluem
ginecomastia e galactorreia em 25% das cadelas não castradas (SCOTT et al., 2002;
SCARAMPELLA, 2011). O provável motivo destes sintomas deve-se ao aumento
presumível da estimulação geral da hipófise pela TRH (DIXON, 2004). Outras
manifestações observadas são estros silenciosos, intervalo entre estro prolongado, falha
no ciclo estral, número reduzido de filhotes na ninhada, aborto espontâneo, filhotes
fracos ou natimortos e inércia uterina (ETTINGER & FELDMAN, 2010). As alterações
reprodutivas mais frequentemente encontradas nos machos são perda da libido
(CASTILLO, 2011), infertilidade e atrofia testicular (FRANK, 2006).
22
2.4.3 Alterações Cutâneas no hipotireoidismo
Os hormônios tireoidianos são extremamente importantes na manutenção da
função cutânea, eles desempenham papel regulatório na diferenciação epidérmica, em
parte por seus efeitos sobre os queratinócitos (DOSHI, BLYUMIN & KIMBALL,
2008). Assim, os sintomas dermatológicos constituem alterações importantes nos
animais com hipotireoidismo. Alguns dos sinais podem ser comuns a outras
dermatopatias endócrinas, tais como: hiperadrenocorticismo e hiperestrogenismo. A
principal característica é a alopecia simétrica bilateral não inflamatória, não pruriginosa,
e face trágica associada a outras alterações cutâneas (SCOTT et al., 2001; NELSON &
COUTO,2009; MÜNTENER et al., 2012).
Os sinais dermatológicos surgem mais tardiamente, quando a secreção de T4
está gravemente afetada. Entorno de 20% dos cães com hipotireoidismo não irão
apresentar alopecia generalizada, no entanto é comum observar a presença de seborreia
seca ou oleosa (CASTILLO, 2011).
A diminuição dos hormônios da tireoide mantém os folículos pilosos na fase
telógena e inibe a fase anágena, isso acarreta sinais de pelagem fosca, ressecada e
quebradiça (SCOTT et al., 2001; MÜNTENER et al., 2012). Tsujio et al. (2008)
observaram que grande parte dos folículos pilosos de ratos tireoidectomisados,
encontravam-se na fase telógena, além de demonstrarem uma atrofia folicular
envolvendo redução de espessura da bainhas externa e interna da raiz do folículo piloso.
A queda de pelos costuma ser o primeiro sintoma percebido pelo proprietário, ocorre de
forma bilateral e simétrica comumente na região dorsal do pescoço, ventral e lateral do
tórax, abdômen e cauda, a cabeça e as extremidades costumam ser poupadas (SCOTT-
MONCRIEFF, 2007). Uma característica bem marcante é a alopecia localizada na
cauda (SCOTT et al., 2001).
A hiperpigmentação é frequentemente observada em cães com hipotireoidismo,
o mecanismo de como ela ocorre ainda é desconhecido (SCOTT-MONCRIEFF, 2007;
SCARAMPELLA, 2011). A hiperpigmentação usualmente inicia-se nas áreas com
alopecia, essa alteração de pigmentação também atinge a região inguinal e faces mediais
dos membros. Nos cães acometidos por dermatopatias endócrinas, as áreas
hiperpigmentadas também podem apresentar hiperqueratose, quando relacionadas ao
prurido e a inflamação crônica da pele (SCOTT et al., 2001; SCOTT-MONCRIEFF,
2007).
23
Outras características dermatológicas são formação de comedões e cicatrização
lenta. Os comedões são lesões que comumente estão presentes também no
hiperadrenocorticismo, bem como a demodicose e displasia folicular (SCOTT et al.,
2001; SCOTT-MONCRIEFF, 2007).
Uma característica bastante comum nessa endocrinopatia é a seborréia seca, ela
surge na falta dos hormônios tireoidianos, pois a ausência destes acarreta descontrole da
secreção da glândula sebácea e deficiência na maturação celular nas camadas mais
superficiais de epiderme. Já a seborréia oleosa ocorre devido ao acúmulo de secreção na
glândula sebácea, que não consegue excretá-la (SCOTT et al., 2001; NELSON &
COUTO, 2009). As glândulas ceruminosas das orelhas e as glândulas sebáceas são
sueperestimuladas causando otite ceruminosa. O excesso de secreção predispõe ao
desenvolvimento de infecções secundárias (SCOTT et al., 2001).
Os hormônios tireoidianos estimulam a proliferação dos fibroblastos e a síntese
de colágeno, esses hormônios influenciam a espessura da pele por meio da regulação da
síntese e do catabolismo dos glicosaminoglicanos. A ausência de hormônios
tireoidianos leva à redução da atividade dos fibroblastos e o metabolismo do colágeno é
alterado. As feridas cutâneas cicatrizam mais devagar e, em áreas sujeitas a trauma,
pode-se observar uma deposição excessiva de tecido fibroso (SCARAMPELLA, 2011).
Em cães com hipotireoidismo, devido ao catabolismo mais lento dos
glicosaminoglicanos, o excesso de ácido hialurônico se acumula na derme, levando à
retenção de água. O mixedema resultante confere à pele maior espessura e uma
temperatura inferior a normal (SCARAMPELLA, 2011). O mixedema é normalmente
observado na face dos cães, ao redor da região frontal temporal, observa-se tumefação e
engrossamento das pregas cutâneas faciais, e as pálpebras superiores caídas, gerando a
famosa expressão facial trágica (SCOTT-MONCRIEFF, 2007).
O hipotireoidismo canino predispõe a infecções bacterianas recorrentes na pele,
sendo a piodermite reportada em 10-23% dos casos. Infecções por Malassezia sp. e a
demodicose também foram reportadas (SCOTT-MONCRIEFF, 2007).
2.4.4 Diagnóstico do hipotireoidismo
A obtenção do diagnóstico definitivo do hipotireoidismo canino é baseado no
histórico e nos achados clínicos que são sugestivos da doença, aliando-se a esses dados
os resultados dos exames laboratoriais e a resposta a terapia hormonal (CASTILLO,
2011). Muitas vezes é extremamente difícil confirmar esta doença; o diagnóstico final é
24
algumas vezes baseado na resposta positiva à terapia de substituição de T4
(KEMPPAINEN & BEHREND, 2001).
As alterações analíticas incluem anemia não regenerativa, normocítica e
normocrômica (DIXON, 2001; FRANK, 2006). As alterações bioquímicas mais
consistentes são hiperlipidemia, usualmente atribuída a hipercolesterolemia e, com
menor frequência, hipertrigliceridemia (FRANK, 2006; CASTILLO, 2011). Por vezes
observa-se aumento moderado das enzimas hepáticas ALT e FA (CASTILLO, 2011).
A biópsia cutânea revela achados sugestivos de dermatoses hormonais, como
hiperqueratose ortoqueratótica, dilatação folicular e/ou atrofia, folículos pilosos
predominantemente em fase telógena, atrofia das glândulas sebáceas, melanose
epidérmica e queratinização triquilemal excessiva (Müntener et al., 2012; Rojko et al.,
1978; Scott 1982, Scott et al., 2001).
A biopsia cutânea também pode revelar achados histopatológicos bastante
sugestivos de hipotireoidismo como a vacuolização e hipertrofia dos músculos pilo-
eretores que ocorrem em 74% dos cães acometidos por essa patogenia, o mixedema
também é uma características observadas nesses animais (TEIXEIRA, 2008). Müntener
et al. (2012) observaram uma baixa porcentagem de folículos pilosos na fase anágena,
além da existência do espessamento da derme e da epiderme.
No estudo realizado por Teixeira (2008), do total de 266 animais com
diagnóstico de hipotireoidismo, em 218 (81,9%), a histopatologia foi utilizada como
método de diagnóstico para a doença. Em 214 (98,2%) animais, foram observadas
alterações sugestivas de hipotireoidismo, enquanto em apenas quatro cães (1,8%) não
haviam sinais desta endocrinopatia, pelo exame microscópico da pele. Para as condições
onde o estudo foi realizado, biópsia de pele e o exame histopatológico, este foi o
método mais eficaz no diagnóstico do hipotireoidismo com especificidade de 100% e
sensibilidade de 98,2%.
Em um estudo realizado no Japão, a biopsia de pele pôde revelar através da
imunohistoquímica que existiu um decréscimo na expressão do TR e na atividade
proliferativa celular dos folículos pilosos em ratos tireoidectomizados, ou seja, com uma
falta de hormônios tireoidianos e isso resultou no retardo do crescimento do pelo
(TSUJIO et al., 2008).
Os hormônios tireoidianos mais frequentemente mensurados são, T4 total (TT4),
T3 total (TT3) e T4 livre (fT4). As concentrações de T3 livre (fT3) e T3 revertida (rT3)
são menos usadas (ETTINGER e FELDMAN, 2010).
25
A mensuração de T4 sérica pode ser utilizada como teste de triagem para o
diagnóstico de hipotireoidismo (NELSON & COUTO, 2009). A dosagem única da
concentração de TT4 no soro por radioimunoensaio só é valida se o valor estiver dentro
da normalidade ou elevado. Isso é significativo, pois o hipotireoidismo pode ser
excluído se valores normais forem encontrados. No entanto, um nível baixo de T4 não é
suficiente para a confirmação de hipotiroidismo (DIXON, 2001). Os cães com
hipotireoidismo podem, na grande parte dos casos, ser distinguido de cães normais com
base na concentração plasmática matinal de TT4 baixa, no entanto várias doenças não
tireoidianas e a administração de diferentes fármacos, incluindo glicocorticoides,
sulfamidas, anticonvulsivantes, AINE’S e agentes de radiocontraste, podem diminuir
“falsamente” as concentrações séricas de T4 (DIXON, 2001; KEMPPAINEN &
BEHREND, 2001; FERGUSON, 2007).
A fT4 é a fração de tiroxina circulante que não se conjugou com as proteínas
plasmáticas (normalmente 0,1% da TT4). A mensuração de fT4 provém uma análise da
concentração de hormônio disponível para os tecidos, foi demonstrado que existe uma
alta correlação entre o estado clínico do animal e a quantidade de T4 livre (DIXON,
2001; FERGUSON, 2007). A acurácia da medição é a chave para distinguir condições
ligadas a distúrbios na concentração plasmática de hormônio da tireoide relacionado às
doenças ou ao uso de fármacos (KEMPPAINEN & BEHREND, 2001; FERGUSON,
2007).
A concentração de TSH basal normalmente se encontra aumentada em cães com
hipotireoidismo (DIXON, 2001). O TSH é considerado a melhor ferramenta de
avaliação do eixo hipófise-tireoide, além de ser o marcador mais sensível para
determinar a funcionalidade dessa glândula. O aumento do TSH pode ser levado em
conta para o diagnóstico do hipotireoidismo, independente dos valores de T4
(CASTILLO, 2011).
Segundo Dixon (2001) a prova de estimulação com TSH é o método diagnóstico
mais confiável para a função da tiroide em cães. O princípio por trás deste teste é a
avaliação da concentração de TT4 despois da administração de TSH. É considerado o
teste ouro para a avaliação da função da glândula tireoide (KEMPPAINEN &
BEHREND, 2001; FERGUNSON, 2007). Entretanto, de acordo com Kemppainen e
Behrend (2001), o uso do teste de estimulação com TSH é insatisfatório. A
administração de TSH resulta em baixo ou inconsistente aumento plasmático de TT4
em cães eutireoideos.
26
Existem vários diagnósticos diferenciais para o hipotireoidismo, entre eles temos
hiperadrenocorticismo canino (HAC), dermatoses responsivas às alterações dos
hormônios sexuais, alopecia X, alopecia dos mutantes de cor, alopecia cíclica do flanco,
alopecia congénita adenite sebácea, efluvio telogênico/defluxo anagênico, alopecia de
padrão, dermatofitose, demodicose, pioderma superficial (SCARAMPELLA, 2011;
MÜNTENER et al., 2012).
2.4.5 Tratamento do Hipotireoidismo
O tratamento do hipotireoidismo tem como objetivo normalizar o eixo hipófise-
tiroide e os níveis de T4 em circulação (CASTILLO, 2011). No hipotireoidismo
primário o tratamento é continuo, por tanto o paciente será tratado por toda a vida
(SCOTT et al., 2002).
Recomenda-se o tratamento com levotiroxina sintética, com a finalidade de
restabelecer o estado de eutiroideo sem suprimir o eixo hipófise-tiroide (NELSON &
COUTO, 2009; CASTILLO, 2011). A dose recomendada de levotiroxina é de 11-22
µg/kg, administrada uma ou duas vezes ao dia, o ideal é começar com a dose mais baixa
e depois ir aumentando a dosagem gradualmente até alcançar a concentração desejada
(CASTILLO, 2011; TVARIJONAVICIUTE, 2013). Quando a medicação é
administrada juntamente com a alimentação ocorre uma diminuição da
biodisponibilidade do fármaco. O tratamento com a levotiroxina preserva a regulação
normal da conversão de T4 para T3, desta forma permite-se a regulação fisiológica das
concentrações de T3 nos tecidos, diminuindo o risco de hipertireoidismo iatrogênico
(ETTINGER & FELDMAN, 2010).
Quando existe uma absorção inadequada de T4, o tratamento com T3 sintética é
recomendado, pois a absorção gastrointestinal de T3 é de 100%. Entretanto, esse
tratamento não é o mais recomendado, pois este hormônio possui uma meia vida curta,
sendo necessário administra-lo três vezes ao dia. Além disso, é a causa mais comum de
hipertireoidismo iatrogênico (ETTINGER & FELDMAN, 2010).
O tratamento corrige a maioria das alterações cutâneas e metabólicas do
hipotireoidismo. Os animais tendem a perder o peso que haviam ganhado antes do
início do tratamento (TVARIJONAVICIUTE, 2013). Os cães com algumas mudanças
comportamentais, tendo como exemplo a letargia e a depressão, exibem uma resposta
rápida a levotiroxina (2-4 semanas). A resposta dermatológica ocorre de maneira mais
lenta e isso deve ser informado ao proprietário. A melhora das manifestações cutâneas
27
iniciais demora, no geral, cerca de quatro semanas para começar a ser percebida. A
maioria dos animais mostra a completa ou parcial recuperação da pele ao final de três
ou quatro meses, o crescimento do pelo pode levar mais tempo em raças de pelo longo
(SCOTT et al., 2002).
O acompanhamento do tratamento deve ser realizado a cada dois meses, com
colheita de amostras sanguíneas 3-4 horas após a administração da levotiroxina.
Dependendo dos resultados a dose do hormônio deve ser ajustada. Na sequência, a
reavaliação pode ser efetuada com uma periodicidade de 6-12 meses com a percepção
da melhora do paciente (CASTILLO, 2011).
2.5 Hiperadrenocorticismo (Síndrome de Cunshing)
O hiperadrenocorticismo é uma condição comum em cães e pode ser definida
como resultado de mudanças físicas e bioquímicas de uma exposição prolongada e
inapropriada de altas concentrações plasmáticas de cortisol. Essa desordem também é
conhecida como síndrome de Cushing (KOOISTRA & GALAC, 2009). Os principais
sinais clínicos no cão são poliúria, polidipsia, polifagia, barriga pendulada e mudanças
na pele e no pelo, como alopecia bilateral (NELSON & COUTO, 2009).
As raças pequenas exibem sinais clínicos mais clássicos e numerosos que as
raças de porte grande. Os animais idosos são mais sensíveis aos efeitos catabólicos dos
glicocorticoides e geralmente manifestam sinais clínicos mais exacerbados e mais cedo
que os mais jovens (SCOTT et al., 2002).
O HAC é frequentemente observado em raças pequenas, especialmente em
Poodle miniatura, Boxer, Dachshnund, Beagle e Boston Terrier (FRANK, 2006;
GRECO, 2007). Não se observa uma diferença significativa na predisposição sexual no
hiperadrenocorticismo pituitário-dependente (HPD), no entanto, as fêmeas
normalmente, desenvolvem cerca de três vezes mais tumores adrenocorticais que os
machos (BLATTER, 2012).
Os glicocorticoides influenciam o crescimento do pelo e a pigmentação do
folículo através da sua ligação a receptores intracelulares específicos existentes nas
células da epiderme interfolicular e nas células basais dos folículos pilosos
(SCARAMPELLA, 2011).
2.5.1 Classificação do Hiperadrenocorticismo
28
O hiperadrenocorticismo canino pode ser classificado em: iatrogênico e
endógeno. Este último pode ocorrer devido a tumores na glândula adrenal ou ser
pituitário dependente (CUNNINGHAM, 2004).
A forma iatrogênica, em muitos casos é devida à administração de
glicocorticoides para o tratamento de uma gama de alergias, doenças autoimunes,
inflamatórias e neoplásicas. O desenvolvimento dos sinais clínicos devido ao excesso de
glicocorticoides depende da severidade e duração do tratamento. A administração de
corticosteroides causa a indução e manutenção da supressão do eixo hipotalâmico-
hipófise – córtex da adrenal (KOOISTRA & GALAC, 2009).
A forma endógena mais comum de hiperadrenocorticismo é a pituitário-
dependente (HPD), afetando cerca de 85% dos casos (FRANK, 2006; KOOISTRA &
GALAC, 2010). Normalmente ocorre uma hipersecreção de ACTH por um adenoma
corticotrófico na hipófise (FRACASSI et al., 2007; KOOISTRA & GALAC, 2010)
resultando hiperplasia adrenocortical bilateral e em consequência um excesso de
produção de cortisol (SCARAMPELLA, 2011). Este excesso leva à falha do mecanismo
de feedback negativo sobre o ACTH. A síndrome é observada em cães adultos e com
maior incidência em animais idosos, em média de nove anos de idade (NELSON &
COUTO, 2009; SCARAMPELLA, 2011; BLATTER et al., 2012).
Os tumores adrenocorticais são responsáveis por 15 a 20% dos casos de
hiperadrenocorticismo endógeno. Estes tumores secretam de forma exagerada
glicocorticoides (KOOISTRA & GALAC, 2010). Normalmente, estas neoplasias
(adenomas ou adenocarcinomas) são unilaterais, não respondendo ao mecanismo de
controle do eixo hipotálamo-hipófise. Comumente se observa uma atrofia da glândula
contralateral (SCARAMPELLA, 2011).
2.5.2 Sinais Clínicos do hiperadrenocorticismo
A síndrome de Cushing costuma ter um início insidioso e progride lentamente
com o passar dos meses. A maioria dos proprietários interpreta o surgimento dos sinais
como uma consequência da idade avançada do seu animal (HERRTAGE, 2004).
Nos animais afetados por esta patologia são reconhecidos sinais sistémicos, que
variam conforme os glicocorticoides prejudicam o metabolismo dos diferentes órgãos.
A poliúria/polidipsia (PU/PD) constituem o sinal sistêmico inicial mais comum e pode
preceder as alterações cutâneas típicas da doença, em cerca de 6 a 12 meses
(SCARAMPELLA, 2011). Outra característica frequente é a polifagia, geralmente, os
29
proprietários tendem a deixar de lado este sinal, atribuindo-o a um estado saudável do
cão. O abdômen abaulado está presente em cerca de 90 a 95% dos cães afetados. Essa
característica se deve ao fato da redistribuição de gordura nas diversas áreas do
abdómen, da hepatomegalia, da bexiga urinária grande, cronicamente cheia e fraqueza
dos músculos abdominais (NELSON & COUTO, 2009). Letargia, fraca tolerância ao
exercício, respiração ofegante e claudicação são provavelmente sinais de fraqueza
muscular (ETTINGER &FELDMAN, 2010). Estes cães desenvolvem com frequência
infecção do trato urinário, podendo ser assintomáticos (FRANK, 2006).
Manifestações clínicas incomuns do HAC canino podem incluir sinais de
hipertensão, tromboembolismo pulmonar, diabetes mellitus, glomerulonefrite,
pielonefrite, pancreatite aguda, calcificação bronquial, sinais neurológicos, como
polineuropatia, miopatia, mudanças comportamentais, cegueira ou pseudomiotonia
(SCOTT et al., 2002; FRANK, 2006; GRECO, 2007; BLATTER et al., 2012).
2.5.3 Alterações Cutâneas no hiperadrenocorticismo
As manifestações dermatológicas do HAC incluem alopecia, que geralmente é
simétrica e bilateral, normalmente, a cabeça e as extremidades são poupadas, este sinal
clínico ocorre devido ao efeito inibitório do cortisol na fase anágena do folículo piloso.
O restante do pelo permanece sem brilho e seco porque se encontra na fase telógena. A
pele dos cães afetados por HAC é adelgaçada, hipotônica, frágil, seca e com pouca
elasticidade. São observadas flebectasia, comedões, hiperpigmentação cutânea,
pioderma e atrofia dérmica, demodiciose secundária e seborreia (SCARAMPELLA,
2011; GRECO, 2012; DOERR et al., 2013), sendo também resultado da circulação
excessiva de glicocorticoides e estão associadas ao aumento do catabolismo proteico e à
atividade enzimática destes hormônios.
Em cães afetados com HAC é normal encontrar a presença de infeções
(bacterianas, fúngicas e parasitárias) cutâneas secundárias. Os animais com infeções
deste tipo respondem de forma ineficaz ao tratamento e surgem recaídas, pouco tempo
depois de cessar o mesmo. Quando há uma fraca resposta à antibioticoterapia, é
recomendada a realização de raspagens cutâneas para detectar a possível presença de
demodicose (SCOTT et al., 2002).
A calcinose cutânea é uma ocorrência incomum, mas é uma característica
dermatológica em cães com HAC (FRANK, 2006; DOERR et al., 2013). Comumente
as áreas afetadas apresentam-se firmes, sob a forma de placas irregulares, inflamadas,
30
muito eritematosas, duras, pruríticas e dolorosas na pele ou por baixo desta. Esse sinal é
formado pela deposição de sais minerais inorgânicos e insolúveis na derme, subcutâneo
e raramente na epiderme. Geralmente a localização mais comum para estes depósitos
são a linha dorsal média, pescoço, abdómen ventral e áreas inguinais (ETTINGER &
FELDMAN, 2010; SCARAMPELLA, 2011; DOERR et al., 2013).
2.5.4 Diagnóstico do hiperadrenocorticismo
O diagnóstico do HAC canino baseia-se na suspeita clínica de acordo com o
histórico e exame clínico. Para a confirmação é necessário à realização de exames
laboratoriais, tais como hemograma, bioquímica sérica e urianálise completa com
cultura. A ultrassonografia abdominal, a analise histopatológica de biopsia de pele, a
tomografia computadorizada e a ressonância magnética também são exames que
auxiliam na confirmação do diagnóstico (ETTINGER & FELDMAN, 2010).
As mensurações hormonais são componentes essenciais no diagnóstico de HAC,
entretanto, estes não devem ser usados isoladamente e sim utilizados para confirmar a
suspeita clínica do médico veterinário. A mensuração do cortisol plasmático basal
matinal, sozinha não tem valor no diagnóstico de HAC, pois a secreção deste hormônio
nos cães é de natureza episódica, com variação ao longo do dia. Desta forma, a
mensuração de cortisol no soro só apresenta grande valia em provas de estimulação ou
supressão (NELSON & COUTO, 2009).
Os testes utilizados na prática clínica são os teste de supressão com doses baixas
de dexametasona (LDDST), o teste de estimulação por ACTH e a taxa
cortisol/creatinina na urina (KOOISTRA & GALAC, 2010).
No tese de supressão com dose baixa de dexametasona utiliza-se uma dose de
dexametasona de 0,01mg/kg/IV nos cães sob suspeita, são obtidas amostras plasmáticas
para determinar os níveis de cortisol imediatamente antes, 4 e 8 horas após
administração do glicocorticoide externo. Dosagens de cortisol plasmático às 8 horas
superiores a 40 nmol/L em cães com sintomatologia suspeita são confirmatórias para
HAC. As adrenais deixam de ser estimulada e, um cão com HPD, o cortisol plasmático
diminui até cerca de 3 ou 4 horas após administração da dexametasona, despois desse
período ocorre uma subida abrupta e seu valor encontra-se aumentado 8 horas após a
supressão. (PETERSON, 2007; GILOR & GRAVES, 2011).
No teste de estimulação com ACTH é administrada uma dose suprafisiológica de
5 µg/kg/IV, então serão coletadas amostras plasmáticas antes e uma hora depois da
31
aplicação hormonal. Em cães com HAC hipófise dependente, a capacidade do córtex da
adrenal de secretar cortisol é bem maior quedo que nos cães saudáveis, e o córtex da
adrenal é responsivo a ACTH. Na maioria dos cães com hiperadrenocorticismo HPD, a
concentração de cortisol pós ACTH será maior do que nos cães saudáveis. Este teste
permite distinguir entre HAC espontâneo e HAC iatrogênico, no entanto não é viável
para distinguir entre HPD e TA (PETERSON, 2007; GILOR & GRAVES, 2011).
Estudos realizados em seres humanos e em cães demonstram que o cortisol do
pelo está elevado em cães com hiperadrenocorticismo. A mensuração do cortisol no
pelo representa um novo método para acessar a superprodução de glicocorticoides em
cães e deve ser mais utilizada no futuro como um ensaio não invasivo para diagnosticar
o hiperadrenocorticismo em cães (OUSCHAN, KUCHAR & M€OSTL, 2013).
No hemograma observamos um leucograma de stress, caracterizado por
neutrofilia, eosinopenia, linfopenia, monocitose, também pode se observar trombocitose
(BOUJON et al., 1991; FRANK, 2006). As alterações bioquímicas mais frequentes são
(cerca de 90% dos casos) o aumento da fosfatase alcanina (FA) e da alanina
aminotransferase (ALT); pode ocorrer hiperglicemia ou a glicose, encontra-se no limite
superior dos valores de referência; encontra-se a presença de hipercolesterolemia e a
concentração de ureia no sangue pode estar normal ou diminuída (SCOTT et al., 2002;
FRANK, 2006; GRECO, 2007; BLATTER et al., 2012).
Na urianálise é encontrada uma diminuição da densidade urinária específica
(<1.010), bacteriúria, podendo haver glicosúria, proteinúria, com taxa
proteína/creatinina aumentada (> 1,0) e presença de cristais de oxalato de cálcio
(BOUJON et al., 1991; FRANK, 2006; GRECO, 2007).
O diagnóstico de imagem é utilizado como método auxiliar nos casos de HAC.
A ultrassonografia pode mostrar uma hepatomegalia, bexiga urinária distendida,
cálculos urinários, aumento das glândulas adrenais. Este aumento pode ser bilateral, por
hiperplasia adrenal bilateral em HPD, ou unilateral, por presença de tumores
adrenocorticais (PETERSON, 2007).
A biópsia cutânea pode ser usada para o diagnóstico desta síndrome. O exame
pode revelar alterações compatíveis com endocrinopatia, queratinização triquilemal,
atrofia dos folículos pilosos, hiperpigmentação epidérmica, atrofia das glândulas
sebáceas, calcinose cutânea e mineralização distrófica (MÜNTENER, 2012; DOERR,
2013). O exame histopatológico também pode mostrar pioderma secundário;
32
granulomas por corpos estranhos, estes associados à mineralização distrófica (SCOTT
et al., 2002).
2.5.5 Tratamento do Hiperadrenocorticismo
O tratamento do hiperadrenocorticismo pode ser realizado através da terapia
medicamentosa, cirúrgica e da radioterapia, o sucesso de cada uma delas varia bastante
em cada individuo. As medicações que podem ser utilizadas para o tratamento do HAC
incluem a administração de mitotano, trilostano, ketoconazol ou l-deprenyl (GRECO,
2007).
A maioria dos cães responde bem ao uso do mitotano. O objetivo da terapêutica
em paciente com HPD é induzir a um hipoadrenocorticismo que seja suficiente para
manter as necessidades fisiológicas do paciente, mas que este não responda a
estimulação continua do ACTH de um cão com HPD não tratado. Isso requer duas
etapas de tratamento a indução e a manutenção. Durante a fase de indução são
administradas 50 mg/kg/SID por 30 dias, após esse período se inicia a fase de
manutenção com a administração de uma dose de 25 mg/kg semanalmente durante um
mês. No terceiro dia desse período de indução, a terapia de reposição com
glicocorticoide e mineralocorticoide é iniciada e deve ser mantida ao longo da vida do
paciente. O monitoramento consiste na realização do teste de estimulação com ACTH
primeiramente a cada poucas semanas e depois a cada 3ou 4 meses; o cortisol pós
ACTH deve estar dentro dos padrões de normalidade. O mitotano deve ser administrado
com comida (GRECO, 2007; BROWN & GRAVES, 2007).
O trilostano (Vetoryl®) é um inibidor competitivo da 3-β-hidroxiesteroide
desidrogenase e bloqueia a produção do cortisol e da aldosterona. Estudos em cães com
HAC demonstraram que o trilostano é um inibidor efetivo de esteroides e que está
envolvido com mínimos efeitos colaterais (GRECO, 2007; BROWN & GRAVES,
2007). As doses recomendadas são: 30 mg/SID para animais que pesam menos de 5kg;
60 mg/SID para cães com peso entre os 5 e os 20 kg; e 120 mg/SID para cães com peso
superior a 20 kg. A reavaliação com o exame de estimulação com ACTH deve ser
realizada com 2 e 4 semanas e depois a cada 3 meses. O teste deve ser efetuado 2 a 6
horas após a administração do trilostano. A concentração plasmática do cortisol deve
encontrar-se dentro dos padrões de normalidade (BROWN & GRAVES, 2007).
O cetoconazol é um antifúngico que inibe a síntese do ergosterol, sendo usado
para tratamentos reversíveis de cães com hiperadrenocorticismo. Uma dose de 15
33
mg/kg/SID é dividida e oferecida duas vezes ao dia, essa dose é aumentada lentamente
(a cada 3 semanas) para 30 mg/kgSID, também dividida duas vezes ao dia. O
cetoconazol não é frequentemente utilizado em cães devido ao seu preço alto e também
por poder causar uma anemia severa devido ao seu uso continuo. O principal uso desse
medicamento é como um preparativo para os animais que irão passar pelo processo de
adrenolectomia ou radioterapia. Os níveis de cortisol após a estimulação com ACTH
devem estar de acordo com os padrões de normalidade (GRECO, 2007).
O tratamento cirúrgico do HAC consiste na adrenolectomia unilateral, um pré e
pós-operatório adequado é essencial para a obtenção de bons resultados. Suplementação
com glicocorticoides deve ser iniciada imediatamente antes da cirurgia para prevenir
uma síndrome de abstinência devido à cirurgia (GRECO, 2007).
A radioterapia é um método efetivo no tratamento de HPD, associado à baixa
morbidade (SCOTT et al, 2002), porém é uma terapia extremamente dispendiosa e
prolongada (3 semanas de duração). Entretanto, os sinais clínicos podem levar meses
para regredirem nos animais tratados desta forma (GRECO, 2007).
Com o controle do HAC, a pele pode exibir no início, um aumento da
descamação e da pigmentação, o crescimento de pelo novo ocorre, porém pode
apresentar textura e coloração diferentes das normais. Os sinais sistêmicos são
resolvidos de forma mais lenta (SCOTT et al, 2002).
2.6 Biopsia cutânea
A biopsia de pele aliada ao exame anatomopatológico é um procedimento
complexo. Esse exame possui inúmeras variáveis envolvidas para que se alcance o
objetivo de um diagnóstico correto e preciso. A partir do momento em que o médico
veterinário toma a decisão de realizar uma biopsia de pele até aquele em que recebe o
laudo da análise microscópica, diversos fatores podem interferir no sucesso da biopsia.
O resultado do exame é influenciado diretamente pelas etapas de decisão quanto ao
local anatômico e a lesão de pele que será colhida, qual técnica de biópsia será utilizada,
identificação, manuseio e fixação do fragmento, a maneira adequada de preencher a
requisição do exame anatomopatológico, análise macroscópica do fragmento de pele,
processamento histológico e confecção das lâminas, análise microscópica com
confecção do laudo e por fim a interpretação corretada do resultado do laudo
anatomopatológico (WERNER, 2009; CURTIS, 2001; LINDER, 2001).
34
Tradicionalmente a biopsia de pele com o estudo histopatológico é utilizado para
elucidação do diagnostico. Tumores ou lesões cutâneas onde se suspeitem de
malignidade e doenças inflamatórias de pele com diagnóstico clínico dúbio precisam de
um estudo mais profundo e preciso para definição do tratamento e da conduta médica. O
exame histopatológico também é utilizado para confirmar o diagnóstico clínico firmado
pelo médico veterinário. E este exame oferece com frequência o suporte de que o
médico veterinário precisa para tomar certas decisões terapêuticas. (WERNER, 2009;
CURTIS, 2001; LINDER, 2001).
Ironicamente, o patologista frequentemente é mais capaz de ajudar o clínico a
descartar certos diagnósticos diferenciais do que confirmar uma etiologia específica,
exemplo: alérgica, endócrina ou ectoparasitária. Entretanto, a correta classificação de
uma doença é o primeiro passo para um diagnóstico definitivo, de modo que descartar
diagnóstico é tão importante quanto confirmá-lo (CURTIS, 2001).
2.6.1 Biopsia por “punch”
Essa técnica de biópsia cutânea envolve o uso de um "punch" de pele, que está
disponível no mercado em diferentes tamanhos, entretanto os patologistas preferem os
com diâmetro mínimo de 6 mm. O procedimento é realizado utilizando-se um punch
para a coleta de pele com o auxilio de um anestésico local. Uma vez sedado, o local a
ser coletado deve ser cortado usando tesoura, a direção do crescimento do pelo
observada e a área delineada com uma caneta marcadora antes da injeção subcutânea de
0,5 a 1,0 mL de cloridrato de lidocaína a 1% ou 2%. A preparação do local com álcool,
etc., deve ser evitada, pois o material de diagnóstico pode ser removido da superfície da
pele. Uma vez que a pele é anestesiada, a biópsia com punch deve ser realizada
utilizando uma combinação de movimentos rotativos de pressão direta e unidirecional e
deve avançar para a profundidade da camada de gordura subcutânea. O pedaço de pele
destacada é então suavemente levantado em uma borda usando uma agulha estéril ou
uma pinça fina com dentes de rato e quaisquer marcas aderentes de gordura excisadas.
O excesso de sangue pode ser absorvido com um cotonete antes de colocar a amostra
em um recipiente com pelo menos 10 vezes seu volume de solução de formalina
tamponada 10%. A ferida é fechada rotineiramente e a região onde foi realizado o
procedimento pode então ser limpa. Aconselha-se que sejam colhidas múltiplas biópsias
representativas das lesões cutâneas que afetam o animal. No caso de pequenas pápulas,
pústulas e nódulos, as lesões devem ser excisadas na sua totalidade. O patologista deve
35
receber detalhes adequados do animal, história da doença e sinais clínicos e
dermatológicos específicos para maximizar a informação que ele / ela pode fornecer ao
veterinário. Quando se suspeita de doença infecciosa (por exemplo, dermatofitoses,
leishmanioses, infecção por micobactérias), devem ser solicitadas colorações especiais
no momento da submissão (TOLOSA et al., 2003; CURTIS, 2001; LINDER, 2001).
2.6.2 Biopsia elíptica
Esse tipo de técnica é particularmente útil para amostragem de lesões ulceradas,
a biópsia elíptica permite ao patologista que ele alinhe a amostra ao longo do seu eixo
longo para seccionamento, garantindo que a zona de junção entre a pele ulcerada e não
ulcerada não seja perdida durante o processamento. Contanto, que a elipse não seja
muito grande, este procedimento pode ser realizado sob sedação e anestesia local, mas
em amostras maiores é necessário o requerimento de anestesia geral. A preparação e a
fixação da amostra são realizadas como descrito no tópico anterior (CURTIS, 2001;
LINDER, 2001).
2.6.3 Biopsia excisional
Quando necessário remover uma massa epidérmica ou dérmica inteira por
motivos de saúde ou estética, a biópsia excisional de rotina pode ser realizada e uma
margem periférica de tecido saudável deve ser incluída sempre que possível. O nódulo
como um todo deve ser levado para o exame histopatológico. Grandes nódulos devem
ser transectados a intervalos de 1 cm para permitir a penetração adequada da solução de
formalina (CURTIS, 2001; LINDER, 2001).
2.7 Colorações histológicas
As colorações histoquímicas são fundamentais para visualizar os tecidos ao
microscópio de luz. As células e o material extracelular são usualmente transparentes e
os corantes ajudam na visualização das estruturas teciduais. Os corantes utilizados para
corar tecidos que foram anteriormente fixados são chamados corantes não vitais, como a
hematoxilina, eosina, fucsina, entre outros (TOLOSA et al., 2003).
Os corantes são compostos orgânicos aromáticos e coram seletivamente os
componentes teciduais, como as células e a matriz extracelular. De acordo com a carga
iônica, os corantes podem ser ácidos, básicos ou neutros. Os corantes ácidos possuem
carga elétrica negativa e afinidade por componentes básicos do tecido (catiônico (+)).
36
Sendo as estruturas coradas por corantes ácidos chamadas acidófilas, como, o
citoplasma e matriz extracelular. Um corante ácido bastante utilizado é a eosina. Os
corantes básicos possuem carga elétrica positiva e afinidade por componentes ácidos do
tecido (aniônico (-)). Sendo as estruturas coradas pelos corantes básicos chamadas
basófilas, como o núcleo. Um corante básico comumente utilizado é a hematoxilina
(TOLOSA et al., 2003; GARTNER & HIATT, 1999).
Normalmente para início de uma pesquisa utiliza-se uma coloração que
proporcione uma visão global de todo o tecido, esta irá permitir a identificação dos
elementos teciduais, propiciando uma análise histológica inicial. A coloração pela
hematoxilina (H) e pela eosina (E) cumpre de forma adequada esse papel. Nesta
coloração, os núcleos impregnados pela hematoxilina, são visualizados em roxo. O
citoplasma e os espaços intercelulares são visualizados em rosa e são corados pela
eosina (TOLOSA et al., 2003; GARTNER & HIATT, 1999).
As colorações de tricrômio são ditas específicas para corar fibras colágenas. A
coloração pelo tricrômio de Masson é uma destas técnicas e é bastante utilizada
(CONSTANTINE & MOWRY, 1968). É utilizada também para analisar
quantitativamente as fibras colágenas, conferindo coloração azul a todas estas fibras,
porém não permite a diferenciação entre os tipos I e III (TOLOSA et al., 2003).
A coloração por PSR tem sido usada como um método específico para a
detecção de colágeno em seções de tecido (JUNQUEIRA et al., 1979). Permite uma
análise qualitativa das fibras colágenas, por meio das diferentes interferências de cores,
intensidade e birrefringência dos tecidos corados. Consegue diferenciar as fibras tipo I e
tipo III. Nessa coloração as fibras do tipo I aparecem como fibras grossas, altamente
birrefringentes na cor vermelha e as fibras do tipo III se aparecem em feixes finos, com
fraca birrefringência na cor amarelo-esverdeado (JUNQUERIA et al., 1978).
37
3. JUSTIFICATIVA
As dermatopatias endócrinas causam desconforto e queda na qualidade de vida dos cães
de companhia, levando os proprietários a questionamentos sobre as causas e
consequências destas patologias na saúde dos cães e assim às intervenções médicas
veterinárias. Mediante essa problemática faz-se necessário um estudo mais aprofundado
sobre as lesões dermatológicas causadas por endocrinopatias, com o intuito de facilitar o
diagnóstico preciso, proporcionando aos cães a instituição de uma terapia mais efetiva,
que possibilite a melhoria na sua qualidade de vida, sanidade e bem estar animal.
38
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
Existem diferenças histopatológicas entre as Dermatopatias Endócrinas
(hipotireoidismo e hiperadrenocorticismo) que permitem caracterizar com detalhes as
alterações morfológicas as quais a pele sofre quando os cães são acometidos por uma
destas desordens.
39
5. OBJETIVOS
5.1 Geral
Caracterizar microscopicamente as lesões de pele em cães com
hiperadrenocorticismo e hipotireoidismo.
5.2 Específicos
Identificar os pacientes com hipotireoidismo e hiperadrenocorticismo,
comprovados mediante diagnóstico clínico, laboratorial (bioquímico e testes
hormonais) e de imagem, e que tenham lesões dérmicas;
Caracterizar morfologicamente e quantitativamente o colágeno presente na pele
dos cães diagnosticados com hipotireoidismo e hiperadrenocorticismo;
Diferenciar microscopicamente por imunohistoquímica a localização da
tireoglobulina, TSH e ACTH nas camadas da epiderme e derme em pacientes
com hipotireoidismo e hiperadrenocorticismo;
40
6. CAPÍTULO 1
Análise Morfológica de Colágeno Dérmico em Cães com Hipotireoidismo e
Hiperadrenocorticismo: um Avaliação Quantitativa
Morphological Analysis of Dermal Collagen in Dogs with Hypothyroidism and
Hyperadrenocorticism: a Quantitative Assessment
Periódico: Microscopy Research and Technique
(Submetido em 16 de Junho de 2017)
41
MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF DERMAL COLLAGEN IN DOGS WITH
HYPOTHYROIDISM AND HYPERADRENOCORTICISM: A QUANTITATIVE
ASSESSMENT
COSTA, G. M. 1*; ARAUJO, S. L. 1; XAVIER JÚNIOR, F. A. F. 1; MORAIS, G. B. 1;
SILVEIRA, J. A. M. 2; SOARES, W. C. 3; VIANA, D. A.⁴; EVANGELISTA, J. S. A.
M. 1
1 Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará
2 Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará
3 Fundação Núcleo de Tecnologia Industrial do Ceará
⁴ PATHOVET Anatomia Patológica e Patologia Clínica Veterinária
Running title: POLARIZATION MICROSCOPY FOR QUALITATIVE
EVALUATION OF COLAGEN IN SKIN OF DOGS WITH HYPOTHYROIDISM
AND HYPERADRENOCORTICISM.
*Corresponding author. Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias,
Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, Ceará,
Brazil. Av. Dr. Silas Munguba, 1700 – Campus Itaperi – 60740-903 – Fortaleza,
Ceará, Brazil. Tel.: +55 (85) 3101.9889; fax: +55 (85) 3101.9850. E-mail
address: [email protected] (G. M. Costa).
42
RESEARCH HIGHLIGHTS
Collagen quantification using Masson’s Trichrome and Picrosirius red under
circular polarization is tool for analyzing morphological changes in the dermis of
canine patients with Hypothyroidism and Hyperadrenocorticism.
43
ABSTRACT
Canine endocrinopathies can cause characteristic dermatological alterations,
such as hypothyroidism and hyperadrenocortism. Collagen fibers play a vital
role in maintaining structural integrity and also in determining tissue function
since the collagen is the main component in the dermis. The aim of this study
was to quantify the main component in the dermis, the total collagen content in
lateral trunk skin of dogs with endocrine dermatopathologies and comparing the
relative usefulness of picrosirius red with that by Masson’s trichrome (MT)
technique when applied to the delineation of dermal collagen in paraffin
sections. Skin samples were taken from the lateral trunk area of dogs with
hypothyroidism (n=8) and hyperadrenocorticism (n=8) were obtained and
analyzed by Hematoxylin and Eosin (HE), Masson’s Trichrome (MT) and
Picrosirius red under circular polarized light (PSRp). Random quantitative
analysis was performed on MT and PSRp sections. There was a greater
quantification of collagen area percentage in endocrinopathic animals
(hypothyroidism = 47 ± 0.89 and hyperadrenocorticism = 44 ± 0.9) using PSRp.
There was a statistically significant percentage of dermal collagen area in
endocrinopathic animals when compared to control animals (hypothyroidism =
64 ± 0.082, hyperadrenocorticism = 51 ± 1 and control = 57 ± 0.64) using MT
staining. An statistically significant difference was observed between MT
technique and PRSp technique under polarized light in the 3 groups studied , p
<0.0001.Then, it has been concluded that an overproduction of collagen was
demonstrated in the skin of patients with hypothyroidism and
hyperadrenocorticism.
Keywords: canine endocrinopathies; skin; picrosirius red; masson’s trichrome
44
INTRODUCTION
Canine endocrinopathies can cause characteristic dermatological alterations
like symmetrical bilateral alopecia, hyperpigmentation and absence of pruritus,
being these changes observed in several dogs affected by hypothyroidism and
hyperadrenocorticism (Scarampella, 2011). Hypothyroidism is the most
frequently observed endocrinopathy in dogs and hyperadrenocorticism is a fairly
common condition in those animals (Ettinger & Feldman, 2010; Kooistra &
Galac, 2009).
Cutaneous biopsy reveals findings suggestive of hormonal dermatoses such as
orthokeratotic hyperkeratosis, follicular dilatation and atrophy, predominantly
telogenic hair follicles, sebaceous gland atrophy, epidermal melanosis, and
excessive tricolemal keratinization (Müntener et al., 2012; Rojko et al., 1978;
Scott, 1982; Scott et al., 2001). Different degrees of inflammation, acanthosis,
parakeratosis, epidermal or folliculitis were observed in the histopathology of
hypothyroid animals (Scott, 1982).
Rojko et al. (1978) observed that there might be histologic evidence of
myxedema (separation of dermal collagen fibers together with deposition of
amorphous basophilic mucin –like material) in some dogs with hypothyroidism.
The collagen fibers play a vital role in maintaining structural integrity and also in
determining tissue function (Whittaker, 1991), since the collagen is the main
component in the dermis of the adult skin (Miller, 1976).
Usually, stains such as Masson’s trichrome and others forms of trichrome were
used to detect collagen fibers in tissue sections. These methods are not very
accurate to reveal very thin collagen fibers and, under certain situations, may
lead to a substantial underestimation of the collagen content (Kiernan, 2002;
Whittaker, Kloner, Boughner, & Pickering, 1994). Trichrome stains have
tendency to fade over time (Sweat et al, 1964); therefore, Picrosirius red (PSR)
was recommended for collagen staining since it doesn’t fade within a few month
and it stains fine collagen fibers more intensely and significantly increase their
birefringence (Constantine & Mowry, 1968).
45
The aim of this study was to quantify main component in the dermis, the total
collagen content in lateral trunk skin of dogs with endocrine dermatopathologies
and compare the relative usefulness of picrosirius red with Masson’s trichrome
(MT) technique when applied to the delineation of dermal collagen in
histological sections from animals with this pathologies.
MATERIAL AND METHODS
1. Experimental animals
The experimental group consisted of 16 dogs of different breeds, both sexes,
being 6 males and 10 females, aged between 2 and 14 years (7±2,5 years) and
evaluated in the Veterinary Hospital from State University of Ceará and private
veterinary clinics, Ceará, Brazil from march 2016 to march 2017. The animal
inclusion criteria were history of hypothyroidism or hyperadrenocorticism
through clinical and laboratory evaluation. The control group was compost of 2
healthy males and 6 healthy females.
2. Ethical aspects
This experiment was approved by the Ethics Committee for Animal Use of
Estate University of Ceara, according to the principles of the Brazilian College
of Animal Experimentation (CEUA 1534880/2016 – Memo no. 11585871-7/10).
All data were anonymously analyzed and a written consent was signed by the
animals’ owners.
3. Sample preparation
In this study, skin samples were taken from the lateral trunk area of 8 healthy
dogs, 8 dogs with hypothyroidism and 8 dogs with hyperadrenocorticism. The
samples were collected, fixed in 10% buffered formalin and processed by
standard histological processing techniques. Sections (4 µm) were stained by
Hematoxylin-Eosin (HE), Masson’s Trichrome (MT) and Picrosirius red (PSR)
modified technique by Constantine and Mowry (1968). The slides were
analyzed under light microscopy (Nikon® Eclipse Ni with an attached Nikon®
DS RI1camera).
46
4. Digital and quantitative analysis by image area
The quantitative analysis of cutaneous fibrosis per field area was performed
according to a modified technique by Morais et al. (2017). The morphometric
study of tissue sections stained by MT and PSR was performed by NIS
Elements software version 4.2. Skin sections stained by PSR were analyzed
separately under polarized light.
Random fields (n = 10) from the lateral trunk skin of each slide stained by PSR
(100X) were captured with circular polarization (Nikon® Eclipse Cipol
microscope with an attached Nikon DS-Ri2 digital camera). Digital images of
histological sections stained by MT were captured in a standardized way (100X)
through a trinocular microscope (Nikon® Eclipse Ni with an attached Nikon®
DS RI1camera). Random fields (n = 10) were captured from the skin biopse of
each animal (100X).
The captured images (TIFF format; 1608 x 1608 pixels, corresponding to 11
MB) were used to quantify the collagen present in the skin of the animals
affected by endocrine dermatopathologies. An initial arithmetic subtraction of
the background lighting was performed and images were readjusted to a RGB
Stack Model Software. Then, these images were adjusted by the threshold tool
and areas related to cutaneous fibrosis were delimited with subsequent
quantification of total collagen per area in each analyzed field.
The collagen area of each captured skin images was calculated and expressed
as a percentage of the total image area. The percentage of the total area
quantified in 10 random fields for each skin biopsy from each animal was
obtained according to the mathematical formula (R areas quantified%/10). All
measurements derived from the analysis were automatically transferred to a
Microsoft Excel spreadsheet and subjected to statistical analysis.
5. Picrosirius Polarized (PSRp)
The aim of this technique was distinguishing birefringent (bright) from
birrefringent (dark) materials. Captured skin color images were binarized (black
47
and white) and birefringent regions, which correspond to positive staining, were
converted to white. A threshold was set in and black areas were excluded, the
remaining white area volume was quantified in relation to the captured field area
(Morais et al., 2017) (Figure 1).
6. Statistical analysis
Data were expressed as mean and standard error of mean (p < 0.05) and
analyzed using the statistical software GraphPad PRISM® v7.0 (GraphPad
Software, CA, USA). In the collagen area evaluation, all the tables and graphs
that evaluated the quantification parameters were studied according to the
variable staining method and the data compiled in the status of the animal.
Differences between animal status were compared using One-Way ANOVA.
Differences between same status of animals with different staining among
groups were compared by Two-Way ANOVA, followed by Sidak post-test. The
statistical analysis was also used for the quantification of total collagen area by
regression model with Spearman's correlation coefficient and values of p <0.05.
RESULTS
1. Histopathological skin findings in hypothyroidism and
hyperadrenocorticism dogs
Control dogs showed normal epidermal thickness. Some animals had epidermal
hyperkeratosis areas and mild epidermal pigmentation. Most of hair follicles
were in telogen phase (Figure 2).
Hypothyroidism dogs had hyperpigmentation and caudal alopecia (7 dogs,
87,5%) All dogs had excessive epidermal scale. In this group was observed
concomitant clinical evidence of seborrhea (scales, crusts, rancid odor but
without pruritus) was observed. Skin histopathological sections of dogs with
hypothyroidism showed irregular acanthosis with areas of orthokeratosis and
parakeratosis that reaches the light of hair follicles, forming keratin plugs
(comedones). Vacuolization of the pilo-erector muscle was observed in 6 (75%)
dogs with hypothyroidism (Figure 2). The dermis presented inflammatory
infiltrate distributed mainly in the superficial dermis, consisting mainly of mast
cells.
48
Dogs with hyperadrenocorticism showed alopecia areas, however with different
degree of alopecia and hyperpigmentation. Abdominal distention and striae
were also observed in these animals. All dogs showed epidermal atrophy and
hyperkeratois. An excessive trichilemmal keratinization, follicular dystrophy or
follicular atrophy and sebaceous glands atrophy were increased in this group.
Mineralization of dermal collagen (calcinosis cutis) was present in 4 dogs
(50%), with a inflammatory infiltrate around it, consisted mainly of mast cells
(Figure 2).
2. Quantitative analysis of skin collagen and correlations
Quantative analysis of the collagen area percentage found in the skin of dogs
with hypothyroidism and hyperadrenocorticism when compared to the control
group using Picrosirius red under polarized light technique showed a significant
statistical difference (p <0.0001). It is suggested that presence of collagen fibers
(Figure 3). There was a greater quantification of percentage of collagen area in
endocrinopathic animals (hypothyroidism = 47 ± 0.89 and hyperadrenocorticism
= 44 ± 0.9). However, there was no statistical difference between animals
affected by hypothyroidism and hyperadrenocorticism (Figure 4).
Using Masson's trichrome staining, a statistically significant percentage of
dermal collagen area in endocrinopathic animals was observed when compared
to control animals (hypothyroidism = 64 ± 0.082, hyperadrenocorticism = 51 ± 1
and control = 57 ± 0.64). In this staining, a statistically significant difference was
observed between the animals with hypothyroidism and hyperadrenocorticism
(p <0.0001). The animals affected by hypothyroidism had a greater
quantification of percentage of dermal collagen area (Figure 5).
Comparing the use of the two staining techniques to analyze the percentage of
collagen area quantified in the groups studied, a statistically significant
difference was observed between Masson’s trichrome technique and Picrosirius
red staining technique under polarized light in the 3 groups studied (p <0.0001)
(Figure 6). The technique of Masson’s trichrome staining quantified a higher
percentage of collagen in the skin of the animals of the 3 groups (Figure 6).
49
DISCUSSION
The histopathological findings in this study in hypothyroidism and
hyperadrenocorticism dogs are compatible with described for hormonal
dermatosis (Müntener et al., 2012; Rojko et al., 1978; Scott, 1982; Scott et al.,
2001). These authors described sebaceous gland atrophy, epidermal
melanosis, excessive tricolemal keratinization, orthokeratotic hyperkeratosis,
follicular dilatation and atrophy and predominantly telogenic hair follicles.
Our results showed sebaceous glands atrophy; however, Rojko et al. (1978)
didn’t find sebaceous atrophy in dogs with hypothyroidism, only in
hyperadrenocorticism dogs. The presence of comedones were reportrd in dogs
affected by hyperadrenocorticism and hypothyroidism (Müntener et al., 2012)
and this study demonstrated the same thing. Mineralization of dermal collagen
(calcinosis cutis) was presented in 4 dogs (50%), and Rojko et al. (1978) found
a lower percentage. This sinal was not always present but was typical in
hyperadrenocorticism dogs.
The biochemical properties and morphopysiological characteristics of the skin
were based on the deposition of collagen types I, III and V which coassemble
into an unique macromolecule to form heterotypical fibers (Gelse et al., 2003;
Birk et al., 1990). Skin biopsy was normally used as a diagnostic procedure
since it revealed collagen accumulation in the dermis histopatologic features
(Martin et al., 2012).
Morphological changes in collagen fibrils have been described from quantitative
data at different sites in different circumstances, including normal growth
(Moore & De Beaux, 1987), changes due to anabolic steroids (Michna, 1986),
ageing (Breiteneder-Geleff et al., 1990) and repair (Wilson et al., 1990).
Morphological abnormalities of collagen have also been demonstrated as a
feature of different types of dysplasia including systemic sclerosis (Pasquali et
al., 1989; Martin et al., 2012), aspartylglycosuria (Nanto-Salonen et al., 1984)
and Ehlers-Danlos syndrome (EDS) in humans and domestic animals, although,
50
in the latter condition, only a few reports have provided quantitative information.
Brown et al. (1993) first reported a study on the collagen fibril morphology in an
EDS-like condition in rabbits, a major greater variability of dermal collagen fibrils
was founded when compared with normal rabbit skin. These changes were
statistically significant in terms of fibril area, fibril perimeter, volume density and
'form factor', a measure of irregularity of fibril shape.
Marijianowski et al. (1995) showed, in a quantitative study, that the total
collagen increased significantly in human hearts with dilated cardiomyopathy.
These changes in the intramyocardial collagen might be clinically relevant sime
they may affect cardiac rigidity and, therefore, eventually might render the heart
less compliant. Then, excess of collagen in tissues can cause disturbance in
their function.
Thyroid hormones stimulate fibroblast proliferation and collagen synthesis;
these hormones influenced the thickness of the skin by regulating synthesis and
catabolism of glycosaminoglycans. The absence of thyroid hormones leads to
reduced fibroblast activity and altered collagen metabolism. The cutaneous
wounds heal more slowly and in areas subject to trauma, excessive deposition
of fibrous tissue may be observed. In dogs with hypothyroidism, due to the
slower catabolism of glycosaminoglycans, excess hyaluronic acid accumulates
in the dermis leading to water retention. The resulting myxedema gives the skin
a thicker and lower temperature (Scarampella, 2011). In this study, there was a
greater amount of collagen percentage area in the lateral trunk skin of dogs with
hypothyroidism leading to deposition of fibrous tissue in the skin of dogs with
hypothyroidism.
Cortisol is responsible for the appearance of thin skin and diminished elasticity,
especially in the ventral region of dogs with hyperadrenocorticism (Mooney &
Peterson, 2004; Faure, 2006). The literature reports that dermatologic changes
that were seen in dogs with hyperadrenocorticism occurred because
glucocorticoids caused inhibition of fibroblast proliferation and collagen
production (Scott, 2001). Rojko et al. (1978) concluded that a general decrease
in dermal thickness was recognized in association with a decrease in fibrillarity,
51
and an increase in the amorphous nature of the thick collagen fibers of the
reticular dermis in the skin of dogs with hyperadrenocorticism. In our study,
animals with hyperadrenocorticism showed a greater quantification of
percentage of collagen area when compared to healthy dogs. This higher
percentage of collagen in this study may be due to the healing process of
dermatological lesions secondary to hyperadrenocorticism observed in the
studied animals.
Despite their documented limitations, staining methods such as Van Gieson’s
and different trichromes stainings are still used as specific for collagen. Many
published reports that used PSR staining for collagen did so in combination with
polarized light, with brightfield illumination to detect collagen (Moon et al., 2004;
Nart et al., 2004; Ophof et al., 2004). However, through this approach, either
collagen fiber color or brightness was uniform; in deep red appear the thicker
fibers, while in bright pink appear the thin fibers and they can be difficult to see.
Some studies used a computer-generated conversion of original color image to
black and white image based on the assignment of positive (red) collagen
staining to white. Non-collagen and interstitial space assigned to black for
attempting to quantify collagen content (Nart et al., 2004). This approach has
the potential to underestimate collagen content, especially in tissues containing
large amounts of thin fibers and provide just assessment of collagen content.
Rich & Whittaker (2005) emphasized circularly polarized light’s ability to reveal
structural detail and extend the initial application (collagen content
measurement) to assessment of the hue and spatial distribution of fibers. They
demonstrated that the combination of Picrosirius red staining, circularly
polarized light, and hue analysis provides a powerful tool for structural analysis
of collagen fibers.
The MT techniques intensely stain collagen fibers. Other areas like the basal
membrane are not selectively stained, not allowing the differentiation of these
structures during quantification, particularly when there were very thin collagen
fibers, which could have different colors in the same tissue section (Constantine
& Mowry, 1968; Montes & Junqueira, 1991; Street et al., 2014; Taboga & Vidal,
52
2003). The histological staining of MT allows the quantitative visualization and
analysis of the collagen fibers of the connective tissue giving is blue coloration
to all these fibers, but a background dyed stained red often becomes a
challenge to distinguish pure colors observed (Street et al., 2014). Our study
used PSR with circularly polarized light and MT to assess collagen content. MT
technique showed a greater quantify of collagen when compared with PSR with
circularly polarized light.
Our study goes against what Constantine and Mowry (1968) reported. These
authors showed that sections stained by PSR under polarization allowed to
distinguish and highlight thin fibers from collagen deposition in fibrotic regions,
as well as to increase fiber refrangibility in polarization. In their study, sirius red
did not impart birefringence to structures that lack it normally. This helps
distinguish collagen from other substances that are also stained by sirius red.
Constantine and Mowry (1968) reported that in a sample of dermal eccrine
cylindroma, stained with Picrosirius red F3BA with no additional counterstains
besides the picric acid, the hyaline material present in and around the tumor
lobules was bright red. When viewed by polarized light, the hyaline was not
birefringent, whereas collagen was intensely. May be this doesn’t happen with
tissues stain by MT. The exact technique and the counterstains used with dyes
that stain collagen determine largely their selectivity and adequacy for this
purpose.
Therefore, our study was the first in which collagen have been visualized and
quantified in skin of dogs with hypothyroidism and hyperadrenocorticism and
the results were compared with the skin of healthy dogs.
After analyzing our results it was possible to conclude that an overproduction of
collagen was demonstrated in the skin of patients with hypothyroidism and
hiperadrenocorticism. Collagen quantification could be an excellent tool for
analyzing the morphological changes that happened in dermis of canine
patients with endocrinopathies. Although, it is necessary more studies to
analyze which collagen fiber type is involved in this process. Our results have
53
validated the use of both methods of stain, MT and PSR in the polarized light
microscopy for dermatopathies.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Fundação Núcleo de Tecnologia Industrial do Ceará (NUTEC),
Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior (CAPES),
Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) and Fundação Cearense de Apoio ao
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) for providing all resources
necessary for this study development.
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57
FIGURE LEGENDS
Figure 1. Digital analysis of lateral trunk skin sections from dogs with
hypothyroidism and hyperadrenocorticism, stained by Picrosirius red under
polarization. Representative epidermal-dermal junction in circular polarization
(A, A1, A2). Binarized image (A1). Regions marked in red corresponding to
collagen deposition in polarization (A2). 10x.
Figure 2. Photomicrographs of lateral trunk skin from control dogs and dogs
with hypothyroidism and hyperadrenocorticism, stained by Hematoxylin and
58
Eosin, Masson’s Trichrome and Picrosirius Red. A, B and C. Epidermal-dermal
junction from dogs with normal skin, hypothyroidism skin, hyperadrenocorticism
skin in 1, 2 and 3, respectively. (A1) Control dogs showed normal epidermal
thickness (arrow). (A2) Hypothyroidism dogs showed acanthosis with areas of
orthokeratosis and parakeratosis that reaches the light of hair follicles forming
keratin plugs (comedones – thin arrow). Vacuolization of the pilo-erector muscle
(thick arrow). (A3) Hyperadrenocorticism dogs showed mineralization of dermal
collagen (calcinosis cutis- thick arrows) and inflammatory infiltrate around it
(triangles).10x.
Figure 3. Photomicrographs of lateral trunk skin from control dogs and dogs
with hypothyroidism and hyperadrenocorticism, stained by Picrosirius Red (A,
A1, A2). Photomicrographs B, B1, B2 showed the same area under polarized
light. 10x.
59
Figure 4. Percentage of collagen area found in the skin of dogs with
hypothyroidism and hyperadrenocorticism when compared to the animals of the
control group using the coloring technique of Picrosirius red under polarized
light.
60
Figure 5. Percentage of collagen area found in the skin of dogs with
hypothyroidism and hyperadrenocorticism when compared to the animals of
control group using the coloring technique of Masson’s trichrome.
Figure 6. Comparing the use of the two staining techniques to analyze the
percentage of collagen area quantified in the control group, hypothyroidism
group and hyperadrenocorticism group.
61
7. CONCLUSÕES
Conclui-se que houve uma super produção na quantidade de colágeno presente
na pele de cães com hipotireoidismo e hiperadrenocorticismo quando comparada a
quantidade de colágeno presente na pele de cães sem alterações dermatológicas
percepitíveis.
62
8. PERSPECTIVAS
Os resultados deste trabalho demonstraram que existem diferenças na
microscopia da pele de cães com hipotireoidismo e hiperadrenocorticismo. O colágeno
presente na pele sofreu alterações microscópicas estruturais evidentes nessas doenças
endócrinas. No entanto, são ainda necessários estudos mais refinados como a utilização
de outras técnicas como: colorações especificas para colágeno, imunohistoquímica e
microscópio eletrônico para que possamos analisar quais tipos de fibras colágenas
participam dessas alterações morfofisilógicas.
63
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