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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ - UESC
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
MARIA APARECIDA DA RESSURREIÇÃO BRANDÃO
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DA OSTRA Crassostrea
rhizophorae PROVENIENTES DO LITORAL SUL DA BAHIA
ILHÉUS, BAHIA
2015
MARIA APARECIDA DA RESSURREIÇÃO BRANDÃO
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DA OSTRA Crassostrea
rhizophorae PROVENIENTES DO LITORAL SUL DA BAHIA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência Animal da Universidade
Estadual de Santa Cruz, como requisito parcial para
a obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profª. Drª. Bianca Mendes Maciel
Co-orientadora: Profª. Drª.Guisla Boehs
ILHÉUS, BAHIA
2015
B817 Brandão, Maria Aparecida da Ressurreição.
Avaliação da qualidade microbiológica da ostra
Crassostrea rhizophorae provenientes do Litoral Sul
da Bahia / Maria Aparecida da Ressurreição Brandão.
– Ilhéus, BA: UESC, 2015.
44 f. : il.
Orientadora: Bianca Mendes Maciel.
Co-orientadora: Guisla Boehs.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual
de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em
Ciência Animal.
Referências bibliográficas: f. 34-44.
1. Ostra. 2. Contaminação microbiana. 3. Ostreicultura. 4. Alimentos – Análise. 5. Testes microbiológicos. I. Título.
CDD 594.4
MARIA APARECIDA DA RESSURREIÇÃO BRANDÃO
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DA OSTRA Crassostrea
rhizophorae PROVENIENTES DO LITORAL SUL DA BAHIA
Ilhéus, BA- 06/2015
____________________________________________
Bianca Mendes Maciel - Dra.
Universidade Estadual de Santa Cruz/DCB
(Orientadora)
____________________________________________
Rachel Passos Rezende - Dra.
Universidade Estadual de Santa Cruz
_____________________________________________
Soraia Barreto Aguiar Fonteles - Dra.
Universidade Federal do Recôncavo da Bahia
DEDICATÓRIA
A minha mãe Elza e ao meu esposo Fernando Mário, pela paciência, compreensão e apoio, nas horas mais difíceis de cansaço e desânimo e a Deus meu porto seguro, por mais uma conquista.
AGRADECIMENTOS
À Profª Dra. Bianca Mendes Maciel por ter depositado sua confiança em mim mesmo sem me
conhecer. Obrigada pela sua dedicação, presteza, paciência nestes dois anos de estudo, foi de
grande valia esta experiência para a construção do meu conhecimento. Muito obrigada!
À co-orientadora Profª Drª Guisla Boehs, por ceder às amostras de Camamu e o material
didático sobre as ostras. Obrigada pela prestatividade e disponibilidade em me co-orientar.
Em especial a Amanda e Maria Tereza pela amizade e por me nortear e “por a mão na massa”
desde o início até o final da pesquisa, o que muito contribuiu para o meu aprendizado.
As alunas de Iniciação Científica Taiane, Emilly e Maíra pela dedicação durante toda a
pesquisa e análises das amostras e a Fabiana Técnica do Laboratório pela contribuição no
período de pesquisa.
Á Mariza Fukuda pela disponibilidade e presteza por trazer as amostras de Maraú.
A minha mãe Elza, pelo incentivo nas horas mais difíceis e aos meus amigos Aisla, Leon,
Maria Rita, Netinha, Clara e Saul pelo apoio.
Ao meu querido esposo Fernando Mário, companheiro e amigo pela compreensão dos dias
ausentes nesses dois anos de estudo.
À Fernanda, pela contribuição nos procedimentos no laboratório no início da pesquisa.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia - FAPESB, pelo financiamento do
projeto e a UESC pelo espaço cedido ao conhecimento.
Ao Dr. Eduardo Azevedo, pesquisador da CEPLAC, por disponibilizar os dados
pluviométricos da região de Camamu.
A todos os docentes do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal pela contribuição na
minha formação profissional.
Aos colegas do curso de mestrado, que fez parte de mais um capítulo de minha história.
E a Deus por ter me iluminado nesta caminhada.
“O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas
incomparáveis”
Fernando Pessoa
v
RESUMO
A qualidade microbiológica dos moluscos bivalves está relacionada às condições do ambiente
onde estes se encontram, uma vez que são organismos filtradores. O objetivo deste trabalho
foi avaliar a qualidade microbiológica da ostra Crassostrea rhizophorae proveniente do
Litoral Sul da Bahia, através da pesquisa de bactérias patogênicas pelo método
microbiológico rápido Compact Dry. As coletas das ostras foram realizadas a cada bimestre
durante o período de um ano (junho de 2013 a maio de 2014) na Baía de Camamu (nas
localidades de Porto Campo e Maraú) e no estuário do Rio Cachoeira (nas localidades do
Banco da Vitória e Teotônio Vilela). Em cada ponto de coleta foram retirados 40 exemplares,
sendo 240 amostras por ponto, totalizando 920 ostras. As ostras provenientes do estuário do
Rio Cachoeira apresentaram maior nível de contaminação bacteriana durante todo o ano, com
aumento significativo (p< 0,0001) para coliformes totais (106,59 ufc. g-1), Escherichia coli
(105,59 ufc. g-1 ) e Enterobactérias (106,62 ufc. g-1) no bairro Teotônio Vilela nos meses com
menor precipitação pluviométrica. A presença de Vibrio parahaemolyticus foi detectada
somente no período do outono com média de 102,9 ufc. g-1, tanto no estuário do rio Cachoeira
quanto na localidade de Porto Campo (Baía de Camamu). Todas as amostras foram negativas
para Vibrio vulnificus, Staphylococcus aureus e Salmonella spp. Em relação ao antibiograma,
isolados de E. coli apresentaram maior resistência a amicacina, ampicilina, ácido nalidíxico e
cefoxitina, dependendo da localidade estudada, enquanto que os isolados de V.
parahaemolyticus apresentaram resistência a ampicilina. Comparando nossos resultados com
estudos prévios, podemos concluir que as ostras provenientes da Baía de Camamu têm
apresentado níveis baixos de contaminação bacteriana, enquanto que no estuário do rio
Cachoeira, provavelmente devido à crescente descarga de esgotos sanitários e industriais não
tratados, está ocorrendo um aumento da contaminação microbiana ao longo do tempo.
Palavras-chave: Ostreicultura, contaminação microbiana, ostra-do-mangue, controle da
qualidade microbiológica, método microbiológico rápido.
ABSTRACT
The microbiological quality of the bivalve mollusks is dependent of the environmental
conditions. The objective of this study was to evaluate the microbiological quality of the
oyster Crassostrea rhizophorae from the south coast of Bahia, through the search of
pathogenic bacteria by the rapid microbiological method Compact Dry. The oysters were
sampled every two months during the period of one year (June 2013 to May 2014) in the Bay
of Camamu (Porto Campo and Maraú) and in the Cachoeira River estuary (Banco da Vitória
and Teotônio Vilela). In each collection point, 40 oysters were collected (240 samples per
point), totaling 920 oysters. Oysters from the Cachoeira River estuary showed greater level of
bacterial contamination throughout the year, with a significant increase (p <0.0001) for total
coliforms (106,59 cfu. g-1), Escherichia coli (105,59 cfu. g-1 ) and Enterobacteria (106,62 cfu. g-1)
in Teotonio Vilela, in the months with less rainfall. The presence of Vibrio parahaemolyticus
has been detected only in the autumn period (average 102,9 cfu. g-1), both in the Cachoeira
River estuary and in the Porto Campo (Camamu Bay). All samples were negative for Vibrio
vulnificus, Staphylococcus aureus and Salmonella spp. Regarding to the antibiogram, E. coli
isolates showed greater resistance to amikacin, ampicillin, cefoxitin and nalidixic acid,
depending on the sample location, whereas V. parahaemolyticus isolates were resistant to
ampicillin. Comparing our results with previous studies, we conclude that oysters from the
Camamu Bay have shown low bacterial contamination levels, while in the Cachoeira River
estuary there is an increase microbial contamination over time, probably due to the increasing
discharge of sanitary and industrial untreated sewage.
Keywords: Oyster cultivation, microbial contamination, mangrove oyster, microbiological
quality control, rapid microbiological method.
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Técnica de ostreicultura em sistema long line. Cultivo de ostras em
Porto do Campo, Baía de Camamu (Bahia)...........................................................
05
Figura 2. Lanterna de ostras Ostras da espécie Crassostrea rhizophorae,
(Guilding, 1828)........................................................................................
05
Figura 3. Ostras da espécie Crassostrea rhizophorae, (Guilding,
1828).........................................................................................................
07
Figura 4. Micro-organismos associados aos surtos de Doenças Transmitidas
por Alimentos (DTAs) no Brasil.................................................................
10
Figura 5. Mapa da área de estudo, sinalizando os pontos de coleta. Porto
Campo (PC); Estuário do rio Maraú (MA); Teotônio Vilela (TV), Banco da
Vitória (BV)...............................................................................................
Figura 6: Placas de Compacty Dry: Coliformes Totais e Escherichia coli
(Compact Dry EC), Enterobactérias (Compact Dry ETB), Salmonella spp.
(Compact Dry SL), Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus (Compact Dry
VP) e Staphylococcus aureus (Compact Dry XSA)........................................
Figura 7: Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados de Escherichia coli em ostras.....................................................................................
18
20
27
Figura 8. Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados de Vibrio
parahaemolyticus em ostras...................................................................................
28
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Cepas de referência e iniciadores utilizados dna PCR para a
confirmação dos patógenos em ostras..........................................................
21
Tabela 02. Tabela 2: Precipitação pluviométrica (mm).........................................
Tabela 03. Análises microbiológicas da ostra Crassostrea rhizophorae provenientes do Litoral Sul da Bahia (n=920)...............................................
24
25
ix
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................................... V
ABSTRACT ...................................................................................................... Vi
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... Vii
LISTA DE TABELAS ...................................................................................... Viii
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1
2. OBJETIVOS................................................................................................. 2
2.1. Objetivo Geral............................................................................................. 2
2.2. Objetivos Específicos................................................................................. 2
3. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................... 3
3.1. Panorama da aquicultura no Brasil.............................................................. 3
3.2. A ostreicultura no Brasil......................................................................... 3
3.3. Aspectos gerais das ostras.............................................................................. 5
3.4. Monitoramento da qualidade microbiológica em ostras.............................. 7
3.5.Principais bactérias patogênicas ao homem associadas ao consumo de
pescados e ostras.........................................................................................
9
3.5.1.Salmonella spp. .......................................................................................... 10
3.5.2. Escherichia coli......................................................................................... 11
3.5.3. Staphylococcus aureus.............................................................................. 13
3.5.4.Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus.......................................... 14
3.6. Aspectos gerais das áreas de estudo........................................................
3.6.1. Baía de Camamu (povoado de Porto Campo e estuário do rio Maraú)...
3.6.2 Estuário do Rio Cachoeira (bairros Teotônio Vilela e Banco da
Vitória).....................................................................................................
4. MATERIAL E MÉTODOS
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16
4.1. Área de Estudo............................................................................................ 17
4.2. Coleta das amostras..................................................................................... 18
x
4.3. Processamento das amostras ....................................................................... 19
4.4. Análises Microbiológicas............................................................................. 19
4.5. Reação em Cadeia de Polimerase para a confirmação dos patógenos......... 21
4.6. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos............................................ 22
4.7. Análise Estatística....................................................................................... 22
5. RESULTADOS............................................................................................. 24
5.1. Resultados biométricos............................................................................... 24
5.2. Dados da Precipitação pluviométrica Análises............................................
5.3.Análise microbiológicas...............................................................................
24
24
5.3. Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos........................................... 25
6. DISCUSSÃO.................................................................................................. 29
7. CONCLUSÕES............................................................................................
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................
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1
1. INTRODUÇÃO
A aquicultura é uma prática mundial com resultados positivos e deve ser praticada
de modo sustentável. Dentre os tipos de cultivo, a ostreicultura (cultivo de ostras) é uma
opção que minimiza os impactos ambientais nos ecossistemas aquáticos. A ostreicultura
tem crescido no país nos últimos tempos e está sendo cada vez mais associada ao
emprego e renda das comunidades ribeirinhas. Entretanto, por serem moluscos que se
nutrem através do processo de filtração e, portanto, por terem função bioacumuladora,
as ostras podem veicular micro-organismos patogênicos presentes nos ambientes
poluídos, proporcionando elevado risco à saúde quando consumidas in natura.
O Estado da Bahia possui características propícias para a ostreicultura, devido ao
clima adequado, vasta área costeira e regiões estuarinas. Dentre as áreas estuarinas,
destaca-se a Baía de Camamu e o estuário do Rio Cachoeira, sendo que ambos são de
fundamental importância para os municípios circunvizinhos como fonte pesqueira e
econômica das populações ribeirinhas.
Desde 2006, a Universidade Estadual de Santa Cruz vem desenvolvendo a
aquicultura familiar na Baía de Camamu, ressaltando a ostreicultura, realizando
pesquisas com a ostra-do-mangue Crassostrea rhizophorae, pois esta espécie se
reproduz continuamente nessa região e, portanto, pode-se obter sucessivas coletas de
sementes durante todo o ano.
Devido à relevância social e econômica que a ostra representa na região sul da
Bahia, tanto pelo cultivo quanto pelo extrativismo, torna-se fundamental o controle de
patógenos microbianos, visando a garantia de um alimento de qualidade sanitária
satisfatória. Desta forma, a utilização de testes microbiológicos rápidos constitui uma
importante ferramenta para o controle da qualidade microbiológica de alimentos, pois
possibilita identificar e quantificar múltiplos micro-organismos em pouco tempo.
Diante do exposto, o presente estudo visou avaliar a qualidade microbiológica da
ostra C. rhizophorae proveniente do Litoral Sul da Bahia, destinada ao consumo
humano. Pudemos concluir com esta pesquisa que as ostras provenientes do cultivo
monitorado apresentaram níveis baixos de contaminação bacteriana em relação às ostras
provenientes de áreas extrativistas.
2
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Avaliar a qualidade microbiológica da ostra-do-mangue (Crassostrea
rhizophorae) proveniente do Litoral Sul da Bahia, através da pesquisa de bactérias
patogênicas.
2.2 . Específicos
• Verificar o nível de contaminação microbiana através do Compact Dry;
• Confirmar as espécies de bactérias isoladas através da Reação em Cadeia da
Polimerase;
• Verificar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos isolados
bacterianos;
• Comparar o nível de contaminação microbiana de ostras provenientes do cultivo
na Baía de Camamu (Porto Campo e Maraú) e do extrativismo no estuário do
Rio Cachoeira (cidade de Ilhéus).
3
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Panorama da aquicultura no Brasil
A produção de alimentos através da Aquicultura vem sendo relevante nos
últimos anos. Isto se dá devido à demanda crescente de pescados no mundo, por serem
alimentos facilmente digeríveis, com elevada quantidade de proteínas, baixa caloria e
ótimas fontes de vitaminas e minerais (CAMPA – CÓRDOVA et al., 2011).
A produção de pescado e a aquicultura mundial correspondem a,
aproximadamente, 158 milhões de toneladas (FAO, 2014). O Brasil contribuiu com 2,5
milhões de toneladas de pescado em 2012 e a região Nordeste prosseguiu registrando o
maior índice no país: 454.216,9 toneladas. Em relação aos moluscos, em 2012, a
produção no cenário nacional atingiu 20.699 mil toneladas (PANORAMA DA PESCA
E AQUICULTURA NO BRASIL, 2014).
Na última década houve aumento no consumo de pescado no Brasil e,
atualmente, a ingestão média desse alimento é de aproximadamente 14,5 kg/hab./ano
(MPA, 2014). Devido à existência de vastos recursos hídricos, as atividades
relacionadas à aquicultura no país estão em expansão.
Cada região se especializa em determinado pescado. A região Norte investe no
tambaqui e no pirarucu, já a Sudeste produz tilápia, no Sul predominam carpas, tilápias,
ostras e mexilhões, no Centro-Oeste predominam o tambaqui, o pacu e pintado e no
Nordeste, as tilápias e o camarão marinho (MPA, 2014).
Segundo a Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa
Catarina (EPAGRI, 2013), o estado de Santa Catarina continua detendo a maior parte da
produção de ostras do país, com a produção de 19.082 toneladas em 2012, sendo
responsável por 90% da produção nacional.
Atualmente, o cultivo de moluscos bivalves em larga escala tem representado
uma opção economicamente viável. Além disso, contribuem para a sustentabilidade
ambiental, pois gera a diminuição da eutrofização causada pela ação antrópica (CAMPA
– CÓRDOVA et al., 2011). Na cidade de Camamu, além da piscicultura, evidencia-se a
ostreicultura, com ênfase na sustentabilidade familiar (SANTOS, 2011).
3.2. A ostreicultura no Brasil
4
Vários autores vêm realizando pesquisas sobre a ostra-do-mangue desde a
primeira metade do século XX. Nos anos de 1930 a 1940, Besnard (1949), efetuando
trabalhos junto a Secretaria de Agricultura e Abastecimento de São Paulo, analisou a
potencialidade da ostreicultura na cidade de Cananéia, no estado de São Paulo. Após
algumas décadas Wakamatsu (1973) e Absher (1989) instituíram as bases práticas e
teóricas do cultivo de ostras nos municípios de Cananéia (estado de São Paulo), Baía de
Todos os Santos (estado da Bahia) e Paranaguá (estado do Paraná).
No Brasil, a ostreicultura teve início no ano de 1971, em Salvador, através da
Universidade Federal da Bahia e da Universidade Federal de Santa Catarina
(LAVANDER et al., 2013). Assim, em 1972 iniciou-se, no Canal de Itaparica, na cidade
de Jiribatuba (Bahia), o cultivo de C. rhizophorae. Após três anos de pesquisas, o
primeiro cultivo foi instalado, mas devido à mortalidade dessas ostras causadas por
patógenos no ano de 1985, a atividade sucumbiu (POLI et al., 2004).
Porém, em outros estados obteve-se sucesso no cultivo de ostras, como, por
exemplo, em São Paulo e no Espírito Santo (LENZ, 2008). Em 1974, as primeiras
amostras da ostra japonesa C. gigas foram importadas da Grã-Bretanha, pelo Instituto
de Pesquisa da Marinha (IPM). Posteriormente, em 1983 a Universidade Federal de
Santa Catarina começou a ostreicultura (FERREIRA; OLIVEIRA NETO, 2006).
A região Nordeste possui ecossistemas aquáticos com fatores abióticos
apropriados para o cultivo de ostras. No estado da Bahia, pesquisas foram realizadas
pelo Projeto Ostreicultura da Universidade Estadual de Santa Cruz (Ilhéus / BA) para
implantação de técnicas de cultivo de ostras, destacando-se o sistema espinhel ou long-
line (Fig. 1). Este é constituído por uma corda com comprimento até 100 m, com poitas
ou âncoras para ancoragem e com bóias para manter o sistema flutuando. No sistema de
cultivo de ostras em espinhel, a distância entre um espinhel e outro deve ser de 5 a 15 m
e a profundidade deve ser superior a 3 metros, utilizando-se, geralmente, de 4 a 40 m de
profundidade (FERREIRA; OLIVEIRA NETO, 2009). Para acomodar as ostras,
utilizam-se lanternas (Fig. 2), que são afixadas a linha principal com intervalos de 80cm
a 1,00 m. A quantidade de amostras de um espinhel depende da produtividade primária
(LAVANDER, 2008; SANTOS, 2011).
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Figura 1. Técnica de ostreicultura em sistema long-line.
Figura 2. Lanterna de ostras.
O sucesso do cultivo depende direta ou indiretamente de vários fatores
ambientais. Faz-se necessário monitorar todas as etapas do cultivo, desde a semeadura
até a época apropriada da pesca, quando as ostras estarão prontas para a comercialização
(NASCIMENTO, 1982).
3.3. Aspectos gerais das ostras
B
6
Azevedo (2011) relatou que existem mais de 130.000 espécies de moluscos,
sendo o Filo Mollusca dividido em sete classes, incluindo a classe dos gastrópodes, dos
cefalópodes e dos bivalves. As ostras pertencem à família Ostreidae (RIOS, 2009).
Os bivalves nutrem-se de fitoplâncton, de micro-organismos e de matéria
orgânica. Por serem filtradores, podem acumular elevado número de patógenos,
causando problemas à saúde dos humanos quando consumidos in natura (PEREIRA;
VIANA; RODRIGUES, 2007). As ostras podem filtrar de 19 a 50L de água por hora,
com baixa capacidade seletiva (PRUZZO; GALLO; CANESI, 2005).
Dentre os bivalves, as ostras destacam-se não apenas pelo seu gosto e nutrição,
mas por serem herbívoras, garantindo melhor percentagem de conversão do alimento
ingerido (NASCIMENTO, 1982).
Estes bivalves têm elevada taxa de fecundação, crescimento acelerado e
comercialização rentável, sendo esta última característica atribuída ao gênero
Crassostrea. São distribuídas da faixa equatorial, de 65º de latitude no hemisfério
Norte, a 44º no hemisfério Sul (AZEVEDO, 2011).
Habitam tanto regiões estuarinas, com baixa salinidade, quanto extensões
oceânicas com elevada salinidade, situadas em áreas de 50-60 metros de profundidade
(WAKAMATSU, 1973).
De acordo com Azevedo (2011), os cultivos de Crassostrea gigas (Thunberg,
1795) ocorrem nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, enquanto Crassostrea brasiliana
(Lamarck, 1819) e Crassostrea rhizophorae (Guilding, 1828) são cultivadas no Sul,
Sudeste e Nordeste. As três espécies possuem valor alimentício e são suscetíveis para a
ostreicultura nacional (LENZ; BOEHS, 2011).
Nas regiões tropicais brasileiras, a espécie mais prevalente é a Crassostrea
rhizophorae (Fig.3) conhecida também por ostra nativa ou ostra- do-mangue. Essa ostra
fixa-se principalmente a rizóforos (raízes) de Rhizophorae mangle, o mangue vermelho
(MENDONÇA; MACHADO, 2010), mas pode fixar-se também em costões rochosos
ou em outros substratos inconsolidados (NALESSO et al., 2008). É uma espécie
hermafrodita, distribuída desde as Índias Ocidentais ao Caribe até o estado de Santa
Catarina, no Sul brasileiro (POLI et al., 2004). Sobrevive em habitats aquáticos com
salinidade variáveis entre 7,2 e 28,8%, de acordo pesquisas realizadas por Fernandes da
Costa (1975) e tolera temperaturas variadas entre 8 e 33ºC; e para se reproduzir, a faixa
de temperatura deve ser inferior a 30ºC (GALTSOFF, 1964). Crassostrea rhizophorae é
ovípara e quando adulta, mede cerca de 7 cm de altura e 3,7 de comprimento,
7
apresentando concha fina em forma de folha, com valva direita escavada e a esquerda
achatada (GALTSOFF, 1964).
Figura 3. Ostras da espécie Crassostrea rhizophorae (Guilding,
1828).
Nas regiões costeiras, os manguezais são ecossistemas com alta biodiversidade
e, entre os invertebrados comestíveis presentes neste hábitat, as ostras se sobressaem
(NASCIMENTO, 1982; RODRIGUES; FARRAPEIRAS, 2008). Nestas áreas, quando
próximas de centros urbanos, pode ocorrer o derramamento de efluentes domésticos e
industriais nos estuários, sem tratamento prévio apropriado, levando à contaminação
dos bivalves com micro-organismos patogênicos (PEREIRA, et al., 2006).
3.4. Monitoramento da qualidade microbiológica em ostras
A qualidade microbiológica das ostras está intimamente relacionada às
condições ambientais onde estas se localizam, uma vez que são exímias filtradoras e
bioacumuladoras, por isso, são empregadas como bioindicadoras de contaminação fecal
(HENRIQUES et al., 2000). Logo, pesquisar a presença de patógenos nesses bivalves
pode implicar em contaminação do ecossistema, como também auxilia na avaliação da
qualidade da ostra utilizada para o consumo humano, já que a ingestão in natura pode
veicular micro-organismos patogênicos, causando surtos de toxinfecções (FORCELINI;
KOLM; ABSHER, 2009). Essa contaminação ocorre principalmente pelo
derramamento de esgotos domésticos e industriais no hábitat desses invertebrados
(SOUZA et al., 2012).
8
No Brasil, até 2012, era inexistente uma legislação específica que controlasse a
higiene sanitária dos moluscos bivalves. Porém, nesse mesmo ano, o Ministério da
Pesca e Aquicultura (MPA) promulgou a Normativa Interministerial nº7, Programa
Nacional de Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves (PNCMB) (MPA,
2012). Essa Normativa monitora a cadeia produtiva desde o cultivo e extração até a
venda desses moluscos (MIOTTO, 2009). A Portaria nº 204 (MPA, 2012) institui a
coleta de moluscos e água para análise, complementando a PNCMB, e a portaria 175
(MPA, 2013) contém tabelas para decodificar os resultados encontrados em
monitoramentos.
A realização do monitoramento da qualidade dos moluscos bivalves eleva,
assim, a segurança microbiológica desde a coleta até o consumo desses alimentos,
assegurando a saúde do consumidor (MIOTTO, 2009). Neste contexto, a utilização de
testes microbiológicos rápidos constitui uma importante ferramenta para o
monitoramento da qualidade desse alimento, pois possibilita identificar e quantificar
múltiplos micro-organismos filtrados pelas ostras, fornecendo resultados em 24 a 48
horas.
O surgimento dos testes rápidos ocorreu a partir dos anos 70 com o objetivo de
minimizar o tempo de análise microbiológica das amostras e aperfeiçoar a
produtividade dos resultados laboratoriais. Esses métodos proporcionam vários
benefícios, como o controle de qualidade, diminuição da demanda de mão de obra,
economia de vidrarias e equipamentos, maior rapidez e facilidade ao ler os resultados
encontrados, além de apresentar especificidade e alta sensibilidade em relação às
práticas convencionais (HAJDENWURCEL, 1998).
Em contrapartida, apresentam algumas desvantagens, como valor elevado do
material e maior número de resultados falso-positivos. Os resultados negativos obtidos
nestes métodos são avaliados como definitivos, enquanto os positivos são presumíveis,
ou seja, devem ser confirmados com outros métodos oficiais, pois geralmente os
métodos rápidos são utilizados para controlar a qualidade do alimento (FENG, 1995).
De acordo com Silveira (2006), os métodos rápidos classificam-se em: 1-
métodos para avaliação da qualidade do alimento, dentre os quais estão inseridos os
Métodos de Contagem Direta (p. ex., Técnica de Membrana Filtrante, Epifluorescência
Direta, técnica Fluorogênica e Sistemas Pronto para Uso, tais como as placas de
Petrifilm™ e placas de Compact Dry) e Métodos de Contagem Indireta (p.ex.,
Bioluminescência, Impedância/condutância, e Placas SimplateTM); 2- métodos para
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avaliação da inocuidade do alimento, dentre os quais estão incluídos os Métodos
Bioquímicos e Moleculares.
Dentre as novidades tecnológicas concebidas para a realização de enumeração de
micro-organismos como opção as práticas convencionais, destacam-se as placas
Compact Dry. Trata-se de um método rápido e simples, constituído por kits de material
descartável para identificação e contagem de patógenos. O meio de cultura é constituído
por enzimas inibidoras cromogênicas que promovem a identificação dos micro-
organismos em cores específicas; apresenta alta sensibilidade e proporciona uma
eficiência maior quando comparada aos métodos convencionais (CESAROTTI;
PAULA; ROSSI, 2007).
As análises mais comumente utilizadas para monitorar a qualidade
microbiológica das ostras referem-se à contagem de coliformes totais e contagem de
coliformes termotolerantes, que são utilizados como indicadores de contaminação fecal
(SANDE et al., 2010).Os coliformes termotolerantes (ou fecais) são formados por
bactérias capazes de realizar fermentação da lactose no período de 24 horas e toleram
temperaturas superiores a 40ºC. Já os coliformes totais não são somente constituídos por
micro-organismos de procedência fecal (como Escherichia coli) estando nesse grupo
também inseridos micro-organismos de origem não fecal, isto é, de origem ambiental,
como bactérias dos gêneros: Klebsiella, Citrobacter e Enterobacter (SILVA et al.,
2007).
A decisão de utilizar coliformes totais não define com tanta precisão a
contaminação aquática por materiais fecais. Desta forma, a contagem específica de E.
coli está sendo cada vez mais utilizada, pois a mesma é encontrada naturalmente na
microbiota do intestino de animais endotérmicos (DOI; BARBIERI; MARQUES,
2014).
3.5. Principais bactérias patogênicas ao homem associadas ao consumo de pescados e ostras
No Brasil foram registrados 92 casos de surtos veiculados por pescados, frutos
do mar, de 2000 a 2014 (BRASIL, 2014). Essas notificações ainda são insuficientes
devido a informações inexistentes ou precárias fornecidas pelos municípios e estados
sobre os micro-organismos, alimentos, fatores de risco e populações humanas
envolvidas nos surtos (WELKER et al., 2010). Dentre os micro-organismos
10
responsáveis pela transmissão de enfermidades através de alimentos, as bactérias
destacam-se como o grupo mais relevante devido a sua variedade e patogenia (Fig. 4)
(BRASIL, 2014).
Figura 4: Micro-organismos associados aos surtos de DTA no Brasil. Fonte: Elaborado a partir de dados da VE/DTA-www.anrbrasil.org.br (2014).
Conforme estudos realizados por Pereira et al. (2006), DePaola et al. (2010) e
Sande et al. (2010), os principais micro-organismos relacionados à surtos de
toxinfecções alimentares por consumo de frutos do mar (destacando-se os mariscos) são
E. coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus e Vibrio spp.
3.5. 1. Salmonella spp.
Mundialmente, várias pesquisas relatam a existência de bactérias do gênero
Salmonella em produtos marinhos, como, por exemplo, em moluscos bivalves e
camarões (BRANDS et al., 2005; GUIMARÃES, 2008; NORHANA et al., 2010).
Estes micro-organismos vivem em ecossistemas contaminados por dejetos urbanos e,
consequentemente, nos alimentos disponíveis neste hábitat, que associados à
temperatura adequada favorecem a multiplicação desse patógeno (AMAGLIANI;
BRANDE; SCHIAVANO, 2012).
A salmonelose, infecção causada por Salmonella spp., é uma das infecções
alimentares mais relevantes, tendo altivo impacto na Saúde Pública mundial devido à
ocorrência de endemias e apresenta morbidade elevada, principalmente, por ser de
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
11
difícil controle (MALORNY et al., 2008). A ocorrência de surtos de Salmonella spp.
causados por alimentos contaminados provavelmente é superior ao número de casos
notificados, uma vez que a maior parte dos alimentos pode, potencialmente, veicular
este patógeno (CARDOSO; CARVALHO, 2006).
As enfermidades ocasionadas por bactérias do gênero Salmonella são
comumente agrupadas em: a) febre tifóide - provocada pela Salmonella enterica
sorotipo Typhi, tendo como sintomas principais: septicemia, febre elevada, diarreia e
vômitos; b) febres entéricas, provocadas pela Salmonella enterica sorotipo Paratyphi
(A, B, C), com sintomatologia similar à febre tifóide, com permanência de 15 dias; c)
enterocolites- causadas por outros grupos de salmonelas, caracterizadas por diarreia,
febre, dores abdominais e náuseas (CARDOSO; CARVALHO, 2006).
No período de 1988 a 2007 foram analisados 4.093 surtos de Doenças
Transmitidas por Alimentos (DTAs) em vários países (Canadá, União Soviética,
Austrália, Nova Zelândia e EUA). Desse total, 70% foram causados por Salmonella
spp., Norovírus e E. coli (GREIG; RAVEL, 2009). Dos 606 casos de DTAs relatados
na Áustria no ano de 2005, Salmonella spp. foi responsável por 76% e na China, nos
anos de 1994 a 2005, notificou-se 1.082 surtos de DTAs, nos quais 17% destes foram
relacionados à Salmonella spp. (OLIVEIRA et al., 2010).
No Brasil, pesquisas realizadas entre os anos 2000 a 2014 constataram que
dentre os 9.802 surtos de DTAs, 1.564 foram causados por Salmonella spp., o que
corresponde a 38,2% do total (BRASIL, 2014). Porém, até o período de agosto de 2014,
foram relatados apenas quatro surtos. Dos alimentos responsáveis por surtos de DTAs,
os pescados, frutos do mar e processados respondem por 1,8% (BRASIL, 2014).
Estudos realizados nos Estados Unidos com ostras in natura mostraram que
7,4% desses bivalves continham Salmonella spp. (BRANDS et al., 2005).
No município de São Francisco do Conde (BA), em 2010, foi realizada a análise
microbiológica da água de áreas onde comumente retiravam-se ostras do gênero
Crassostrea. Das amostras analisadas, 54,54% foram confirmadas para a presença de
Salmonella spp. (SILVA et al., 2011).
No estuário do rio Cocó, em Fortaleza (CE), 30 exemplares de ostras
C.rhizophorae foram analisados, dos quais 21 (70%) foram positivos para Salmonella
spp. (SILVA et al., 2003).
3.5.2. Escherichia coli
12
Escherichia coli é um agente etiológico encontrado com frequência em amostras
fecais dos seres humanos e de animais ditos “de sangue quente” (homeotermos), pois é
intrínseco da microbiota intestinal de ambos (SANTOS et al., 2009). A maior parte das
linhagens é inofensiva, mas outras podem causar infecções graves principalmente
através da ingestão de alimentos e água contaminada. As cepas patogênicas provocam
infecções urinárias, digestivas, dores abdominais, diarreia sanguinolenta, entre outros
sintomas. No período de dez dias os indivíduos contaminados se restabelecem, porém,
esporadicamente essa enfermidade torna-se fatal (WHO, 2015).
Segundo Newell et al. (2010), as estirpes patogênicas são classificadas em seis
grupos relacionados quanto aos sintomas clínicos, mecanismos de patogenicidade,
epidemiologia e virulência. Estão desse modo, compreendidas em: E. coli
enterotoxigênica (ETEC); E. coli enteroinvasora (EIEC); E.coli enteroagregativa
(EAGGEC); E. coli difusamente aderente (DAEC); E.coli produtora de citotoxina Vero
(VTEC) e E. coli enteropatogênica (EPEC).
Conforme Silva et al. (2003), o maior surto de E. coli através de alimentos
ocorreu em 1996, em Sakai, Osaka (Japão), onde foram registrados cerca de 8.000
casos. Um surto de E. coli aconteceu também na Alemanha no ano de 2011, quando
foram registrados mais de 3.000 casos, sendo o maior surto com este micro-organismo
ocorrido naquele país (PAULA; CASARIN; TONDO, 2014). Estes mesmos autores
relatam que na União Europeia os surtos causados por esse patógeno correspondem a
50% dos casos notificados. Nos Estados Unidos, no ínterim de 1982 a 2002, foram
registradas 73.000 infecções causadas por esse agente etiológico, sendo 52% destas
veiculadas por alimentos, com a ocorrência de 350 surtos e 40 óbitos (RANGEL et al.,
2005).
De acordo o Ministério da Saúde do Brasil, no período de 2000 a 2014,
ocorreram 547 surtos de E. coli, o que equivale a 13,3% das DTAs notificadas no país
nesse período. Destes, 85 foram relacionados a pescados, processados e alimentos
marinhos. Até agosto de 2014, foram notificados 14 casos, segundo a Vigilância
Epidemiológica de Doenças Transmissíveis por Alimentos - VE/DTA (BRASIL, 2014).
Na cidade de Florianópolis (SC), em pesquisa efetivada nos anos de 2003 e
2004, 90 amostras de ostras C. gigas foram analisadas, sendo 45 provenientes de áreas
de cultivo e 45 de estabelecimentos do comércio local. Escherichia coli foi detectada
em quatro (9%) exemplares da área de cultivo e em 16 (35,5%) de amostras obtidas em
estabelecimentos comerciais (PEREIRA et al., 2006).
13
Em uma pesquisa realizada em 2005 na Praia do Futuro (CE), 60 amostras da
ostra C. rhizophorae in natura foram analisadas e 115 isolados de E. coli foram obtidos
(BARROS et al., 2005). Também no Ceará, no estuário do rio Pacoti, (VIEIRA et al.,
2008) obtiveram resultados a partir da pesquisa em 15 ostras de cultivo, obtendo 29
isolados de E. coli.
3.5.3. Staphylococcus aureus
As regiões estuarinas são ótimas fontes para a sobrevivência de patógenos,
incluindo Staphylococcus aureus (ABDELZAHER et al., 2010). Por ser halotolerante
(capaz de crescer na presença de cloreto de sódio até o limite de 20%), essa espécie de
bactéria suporta grande variação de salinidade do ambiente (SANTOS et al., 2007). A
intoxicação alimentar provocada por essa bactéria ocorre através das enterotoxinas
termoestáveis que permanecem no alimento mesmo depois da cocção (BRESOLIN;
DALL'STELLA; FONTOURA-DA-SILVA, 2005).
Mundialmente, esse micro-organismo é responsável por 4,5% das intoxicações,
o que se deve à manipulação inadequada dos alimentos (CUNHA-NETO; SILVA;
STAMFORD, 2002). É importante salientar que os moluscos bivalves são
contaminados por esse micro-organismo, principalmente, pela falta de higiene dos
manipuladores (GALVÃO et al., 2006).
No Brasil, de 9.802 casos notificados de DTAs nos últimos 14 anos, esse
patógeno foi responsável por 798 casos, correspondendo a 19,5% do total de casos
(BRASIL, 2014). Possivelmente, existe um número maior de casos de intoxicação que
não são registrados nem notificados (SANTANA et al., 2006). Fato é que, até meados
de agosto de 2014, apenas um caso foi notificado (BRASIL, 2014).
Pesquisas efetivadas em Minas Gerais relataram que mais de 30 pessoas foram
acometidas por intoxicação alimentar, na qual S. aureus foi o responsável pelo surto
(CARMO et al., 2003).
Estudos realizados no Ceará por Evangelista-Barreto e Vieira (2003)
constataram que 60% dos funcionários de uma empresa de pescados eram hospedeiros
assintomáticos de S. aureus.
Ayulo, Machado e Scussel (1994) observaram uma porcentagem de 60% de S.
aureus em bivalves, em pesquisa realizada em Santa Catarina.
14
Em uma pesquisa realizada no norte de Pernambuco por Batista (2013)
constatou-se que, dos 48 exemplares de moluscos bivalves in natura coletados na praia,
41 cepas de Staphylococcus foram identificadas. E das 33 amostras coletadas em um
estabelecimento comercial, foram observadas a presença de 38 cepas desse mesmo
patógeno.
3.5.4. Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus
Vibrio parahaemolyticus é uma bactéria patogênica humana, que pode ocorrer
naturalmente no ecossistema marinho (RODRIGUES; FILHO, 2012).
Rodrigues e Filho (2011) relataram que V. parahaemolyticus é frequentemente
encontrado em peixes e moluscos, principalmente em ostras. Todavia, o consumo
desses moluscos crus ou mal cozidos, quando contaminados por esse patógeno, causa
náuseas, diarreias, vômitos e, com menos frequência, pode ocorrer dor abdominal,
cefaleias e, em casos mais severos, a septicemia. A contaminação está associada a
práticas de higiene inadequadas e contaminação fecal (RODRIGUES; FILHO, 2011).
Vibrio parahaemolyticus foi identificado pela primeira vez em 1953, quando foi
responsável pela intoxicação alimentar na província de Osaka (Japão), em que foram
infectados 272 indivíduos, dos quais 20 vieram a óbito (MANCILLA, 2005).
Segundo García-Lázaro et al. (2010), esse micro-organismo corresponde a 20%
dos surtos diarréicos em países em desenvolvimento, sendo que no Japão o percentual
equivale a 24% das intoxicações por alimentos causadas, principalmente, por ingestão
de pescados crus. Nos Estados Unidos, o consumo de ostras cruas também é associado a
casos de diarreia por este patógeno.
Na China, em pesquisas realizadas no período de 1994 a 2005, de 1.082 surtos
relatados, V. parahaemolyticus foi responsável por 19,5% do total de casos (OLIVEIRA
et al., 2010).
Pesquisas realizadas no Brasil com 84 amostras de ostras provenientes da Baía
de Todos os Santos (BA) indicaram a presença de V. parahaemolyticus em 85,7% dos
casos (RODRIGUES; FILHO, 2011). Em São Paulo, foi detectada a presença desse
patógeno em 13 amostras de um total de 20 ostras (RODRIGUES, 1998).
No Brasil, durante os anos de 2000 a 2014, foram registradas seis ocorrências
comprovadas desse agente etiológico, correspondendo a 0,1% das DTAs notificadas
(BRASIL, 2014).
15
Doenças causadas pelo Vibrio vulnificus proporcionam uma das principais
razões de mortes relacionadas a alimentos marinhos (DePAOLA et al., 2010). A
contaminação ocorre através da ingestão de frutos do mar e ainda por lesões existentes
na cútis, sendo as ostras os principais veículos de transmissão (REBOUÇAS, 2008).
Essa bactéria causa infecções extra-intestinais em lesões, além de gastrenterite e
septicemias primárias. A infecção generalizada geralmente está relacionada a indivíduos
infectados com doenças hepáticas, hematológicas, imunossupressoras e renais
(DaSILVA et al., 2012).
No período 1997 a 1998, foram analisadas 40 ostras em 15 restaurantes da
cidade do Rio de Janeiro. Destas, 170 cepas bacterianas foram isoladas, sendo 14
identificadas como V. vulnificus (PEREIRA; VIANA; RODRIGUES, 2007). Conforme
a Vigilância Epidemiológica, não há casos notificados nos últimos 14 anos no Brasil
(BRASIL, 2014). No entanto, existem pesquisas que afirmam a presença de diversas
espécies de vibrios, presumindo-se que sejam casos não informados. Na Baía Sul de
Santa Catarina, principalmente no verão, foi encontrado V. vulnificus na ostra C. gigas
(RAMOS, 2007).
3.6. Aspectos gerais das áreas de estudo:
3.6.1. Baía de Camamu (povoado de Porto Campo e estuário do rio Maraú)
A Baía de Camamu ocupa a terceira posição em volume de água no País, sendo
superada pelas baías de Guanabara, localizada no estado do Rio de Janeiro e pela Baía
de Todos os Santos, situada na Bahia, de acordo estudos realizados por Silva,
Albuquerque e Nascimento (2013). Faz limites com as cidades de Camamu, Ituberá,
Igrapiúna e Maraú. Esta área apresenta clima quente e úmido e temperatura mediana
anual de cerca de 25ºC, segundo o Centro de Estatísticas e Informação (CEI, 1994), e
vegetação densa com mata perenifólia, arbórea e abundantes manguezais (DÓCIO;
RAZERA; PINHEIRO, 2009).
Essa região faz parte da Área de Proteção Ambiental (APA), abarcando 118.000
mil hectares de área juntamente com outros municípios tais como: Maraú, Itacaré e
Camamu, de acordo a Secretaria do Meio Ambiente da Bahia (SEMA, 2012).
O povoado de Porto Campo encontra-se localizado na Baía de Camamu. Esse
povoado limita-se ao leste com Cajaíba, ao Norte com a Ilha do Camarão, a sul com
16
Conduru e Matapera e com enseadas a região oeste. A comunidade do local sobrevive
da aquicultura familiar, ressaltando-se o cultivo da ostra-do-mangue (GOMES, 2008).
A região estuarina do Rio Maraú possui uma área aquática de 119,39 km², sendo
que mais de 40% corresponde a manguezais. Este estuário pertence, também, à Baia de
Camamu (AMORIM, 2005). Apresenta clima quente e úmido e temperatura média
anual de 24ºC, revelando características apropriadas para a maricultura (CEI, 1994).
3.6.2 Estuário do Rio Cachoeira (bairros Teotônio Vilela e Banco da Vitória)
O Rio Cachoeira é um ecossistema relevante do sul baiano, banhando diversos
municípios, inclusive Ilhéus, uma das cidades mais importantes do estado da Bahia. A
população utiliza as águas desse rio para o banho, utilidades domésticas e a pesca,
sustentando várias famílias ribeirinhas além de outros proveitos.
A bacia do rio Cachoeira localiza-se no centro-leste baiano e está limitada ao
norte pelo rio de Contas e Almada, ao sul pelos rios Pardo e Una, fazendo fronteira a
leste com o Oceano Atlântico e a oeste com o Rio Pardo. O Rio Cachoeira nasce na
serra de Ouricana, no município de Itororó, apresentando ao longo do seu percurso
trechos com floresta tropical e temperatura média anual de 24°C, com períodos secos e
chuvosos, com precipitação média anual de cerca de 800 mm (SILVA, 2007). É um
ecossistema bastante poluído devido ao despejo de esgotos não tratados, oriundos dos
centros urbanos e de indústrias, que contaminam os moluscos com micro-organismos
patogênicos (PEREIRA et al., 2006).
As coletas foram efetuadas no rio Cachoeira, na altura dos bairros Teotônio
Vilela e banco da Vitória, localizados no município de Ilhéus. O município localiza-se
na região cacaueira no Sul da Bahia, ocupando uma área de 1.841km². Possui como
limite Norte os municípios Aurelino Leal, Uruçuca e Itacaré; a Oeste com Itajuípe e
Coaraci; a Noroeste com Itapitanga; a Sudoeste com Itabuna e Buerarema; e a
Leste com o Oceano Atlântico (ANDRADE, 2003). Por se situar na zona litorânea, sua
maior altitude é de aproximadamente 55 metros e a menor é de 3 metros acima do nível
do mar (SEPLANTEC/CEI, 1996).
Dentre os ecossistemas da cidade destacam-se os manguezais, permeando na
vida da população ribeirinha com função social e econômica fundamentando-se,
principalmente, na exploração de peixes, crustáceos e moluscos, constituindo em fonte
de renda para essas comunidades (RODRIGUES; FARRAPEIRAS, 2008). A região
17
estuarina ocupa uma área correspondente a 1.272 hectares, onde são encontradas plantas
características dos gêneros Rhizophora, Avicennia e Laguncularia (FIDELMAN, 1999).
Os bairros Teotônio Vilela e Banco da Vitória apresentam áreas de manguezais e
nesses locais são realizadas atividades de extrativismo. Os locais citados têm arcado
com os resultados do desenvolvimento desordenado de Ilhéus, que é percebido através
da localização desses bairros praticamente ilhados por manguezais.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1.Área de Estudo
O presente estudo foi realizado em quatro locais distintos situados no Litoral Sul
da Bahia, região Nordeste do Brasil: (1) no povoado de Porto Campo [PC] (coordenadas
13°40’02”S e 39°09’06”W), localizado na Baía de Camamu, no município de Camamu,
(2) no estuário do rio Maraú [MA] (coordenadas 13°40,02’S; 39° 09,06’W), no
município de Maraú, (3) no bairro Teotônio Vilela [TV] e (4) no Banco da Vitória
[BV], ambos situados no estuário do Rio Cachoeira (coordenadas 14º49’63”S e
39º03’49”W e 14º50’57”S e 39º03’14”W), no município de Ilhéus (Fig. 5).
Dados da precipitação pluviométrica das áreas de estudo foram obtidos pelo
INMET (Instituto Nacional de Meteorologia) em relação à área de Ilhéus e ao estuário
do rio Maraú, e CEPLAC (Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira) em
relação à Camamu.
18
Figura 5: Mapa da área de estudo, sinalizando os pontos de coleta. Porto Campo (PC); Estuário do rio Maraú (MA); Teotônio Vilela (TV), Banco da Vitória (BV). Fonte: Neta (2013) (adaptado).
4.2. Coleta das amostras
As coletas foram realizadas a cada bimestre durante o período de um ano (junho
de 2013 a maio de 2014). Em cada local foram recolhidos lotes de 40 ostras, totalizando
240 ostras por ponto de coleta e 920 ostras no total. Os exemplares de Ilhéus foram
provenientes do extrativismo local e retirados de bancos naturais do estuário do Rio
Cachoeira Os exemplares do povoado de Porto Campo (Baía de Camamu) e do estuário
do Rio Maraú foram procedentes do cultivo de ostras em sistema espinhel (long-line).
As ostras foram coletadas manualmente, com auxílio de um facão, nas raízes do mangue
vermelho Rhizophorae mangle. Todas as amostras foram acondicionadas em caixas
isotérmicas hermeticamente fechadas e conduzidas ao Laboratório de Microbiologia do
Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Santa Cruz para o processamento
imediato.
19
4.3. Processamento das amostras
Com o auxílio de uma escova abrasiva estéril, as ostras foram lavadas sob água
corrente, removendo todos os resíduos aderidos às valvas. Os exemplares foram então
colocados sobre papel toalha até que a água escorresse e secasse naturalmente. Em
seguida, realizou-se a pesagem com valvas e tomaram-se as medidas da altura,
correspondente ao eixo dorso-ventral. Com uma faca esterilizada (flamblada), todas as
ostras foram abertas e o músculo foi igualmente medido e pesado. Em seguida, esse
material orgânico foi recolhido juntamente com os fluídos existentes no interior da
mesma e acondicionado em becker estéril e depois triturado em um triturador de tecido
(Novatécnica). Cem gramas do homogeneizado foram retirados para a realização da
análise microbiológica.
4.4. Análises Microbiológicas
As análises microbiológicas foram realizadas utilizando kits para identificação
rápida (Compact Dry®,Verus Medasa) para a contagem dos seguintes patógenos:
Enterobactérias (Compact Dry ETB), Salmonella spp. (Compact Dry SL), Coliformes
Totais e Escherichia coli (Compact Dry EC) Staphylococcus aureus (Compact Dry
XSA), Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus (Compact Dry VP) conforme figura
6. Os kits são devidamente certificados com a International Organization for
Standardization (ISO) e validados pela Internacional Methods of Analysis (AOAC). São
métodos reconhecidos pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (Brasil)
e pelo Food and Drug Administration, dos Estados Unidos (FDA/USA). As pesagens e
diluições iniciais das amostras foram realizadas de acordo com The International
Commision on Microbiological Specifications (ICMS) no qual se recomenda que a
diluição inicial para a análise microbiológica de moluscos bivalves seja 1:1 (p/v).
Foram adicionados 100 g de ostras previamente homogeneizadas em 100 mL de
água peptonada (Acumedia) e realizadas diluições seriadas de 10-¹ a 10-5. Em seguida, 1
mL de cada diluição foi semeado nas placas Compact Dry® específicas e incubadas a
37º C/18-24 h. Para a análise de Salmonella spp., as amostras diluídas 1:1 (p/v) foram
inicialmente pré-incubadas a 37ºC por 18-24 h antes de serem semeadas na placa
Compact Dry SL. Todas as análises foram realizadas em duplicata e conforme as
instruções do fabricante.
20
Após as 24 horas, 3 a 5 colônias típicas de cada patógeno foram repicadas e
inoculadas separadamente em 800µL de meio de enriquecimento específico para cada
patógeno e incubadas a 37º C por 18-24 h. As amostras de Vibrio vulnificus foram
armazenadas em caldo nutriente (Acumedia) contendo 0,5% NaCl e o Vibrio
parahaemolyticus em caldo nutriente contendo 3% de NaCl; as cepas de S. aureus
foram cultivadas em caldo cérebro coração (BHI) (Acumedia); e as amostras de
Salmonella spp. em caldo tripticato de soja (TSB) (Acumedia). As bactérias isoladas
foram armazenadas à -20ºC em meio contendo 20% de glicerol, com exceção do
V.vulnificus, que foi armazenado em temperatura ambiente, para a confirmação por
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), realização do antibiograma e para a coleção de
cultura bacteriana específica de micro-organismos isolados de ostras.
Figura 6: Placas de Compacty Dry: Coliformes Totais e Escherichia coli (Compact
Dry EC), Enterobactérias (Compact Dry ETB), Salmonella spp. (Compact Dry SL),
Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus (Compact Dry VP) e Staphylococcus
aureus (Compact Dry XSA).
21
4.5. Reação em Cadeia de Polimerase para a confirmação dos patógenos
Os resultados positivos pelo método Compact Dry foram confirmados através da
técnica de Reação em Cadeia de Polimerase. Os iniciadores utilizados para amplificar
cada micro-organismo estão especificados na Tabela 1. Cada 25 ul da reação continha:
1X tampão de PCR (Invitrogen); 1,25 mM MgCl2 (Invitrogen); 200 µM dNTP; 10 pmol
de cada iniciador (Invitrogen); 1,25U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e uma
colônia suspeita do patógeno. O volume da reação foi completado para 25 µL com água
estéril livre de nucleases. Como controles positivos, foram utilizadas as cepas de
referência conforme especificado na Tabela 1. Como controles negativos, foram
omitidas as colônia suspeitas na reação. Os ciclos de amplificação da PCR consistiram
em 5 min a 94°C para desnaturação inicial, seguido por 35 ciclos de 30 seg a 94°C, 30
seg a 58°C, 1 min 72ºC e um passo de extensão final de 10 min a 72°C. A visualização
do produto PCR ocorreu em gel de agarose a 1% corado com SYBER-Green e
examinado sob luz UV.
Tabela 1: Cepas de referência e iniciadores utilizados dna PCR para a confirmação dos patógenos em ostras.
Cepa de
referência
Gene alvo
( acessoGenBank )
Iniciadores (5’-3’)*
pb Referência
Salmonella
Enteritidis PT4
(IOC)
Salmonella specific
fragment
(AE006468.1)
F (ST15):
GGTAGAAATTCCCAGCGGGTACTG
R (ST11):
AGCCAACCATTGCTAAATTGGCGCA
429 Aabo et al.
1993
Escherichia coli phoA(FJ546461) F: GGTAACGTTTCTACCGCAGAGTTG
R: CAGGGTTGGTACACTGTCATTACG
468 Shome et al.,
2011
S. aureus
ATCC 6538
Nuc
(NC_002758.2)
F: GCGATTGATGGTGATACGGTT
R: CAAGCCTTGACGAACTAAAGC
276 Brakstad et
al., 1992
Vibrioparahaemol
yticus
INCQS 00081
(ATCC 17802)
tlh
(AB012596.1)
F: AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG
R: GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC
450 Bej et al. 1999
Vibrio vulnificus
INCQS 00630
(ATCC 27562)
vvhAe B
(AB124802.1)
F: CTCACTGGGGCAGTGGCT
R: CCAGCCGTTAACCGAACCA
383 Wang et al.
1997
* Temperatura de anelamento dos iniciadores: 58ºC
22
4.6. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos
A verificação da susceptibilidade dos isolados bacterianos a diferentes
antibióticos foi realizada pelo método de ágar-difusão em Agar Mueller-Hinton
(Acumedia) conforme instruções do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI,
2014). Os antibióticos testados estão descritos no quadro 1.
O halo de inibição de cada disco de antibiótico foi medido com o auxílio de um
paquímetro digital e comparado com os valores fornecidos no quadro 1, determinando
se os micro-organismos são sensíveis, resistentes ou apresentam resposta intermediária
aos antibióticos testados.
4.7. Análise Estatística
As médias e desvio padrão das quantidades de bactérias foram calculados,
submetidos à análise de variância (ANOVA) e posteriormente comparados pelo teste de
Tuckey em relação à variação entre épocas do ano e localidades estudadas. Valores de p
≤ 0,05 foram considerados significativos. Os dados foram analisados através do
Software Graphpad Prims 5.
23
Quadro 1:Antibióticos utilizados na realização do antibiograma.
Halos de inibição (mm)
E.coli S. aureus V.parahaemolyticus
Classe Agente Cód. Conc. R I S R I S R I S
Amino- Glicosídeos
Amicacina AMI 30 µg ≥17 15-16 ≤14 14 15-16 17 - - -
Gentamicina GEN 10µg ≤12 13-14 ≥15 12 13-14 15 - - -
Carbapenems
Imipinem IPM 10 µg ≤19 20-22 ≥23 13 14-15 16 - - -
Cefens
Cefuroxima CRX 30 µg ≤14 15-22 ≥23 14 15-17 18 - - -
Cefoxitina CFO 30µg ≤14 15-17 ≥18 21 --- 22 - - -
Cefepime CPM 5 µg ≤14 15-17 ≥18 14 15-17 18 - - -
Fenicol Cloranfenicol CLO 30 µg ≤12 13-17 ≥18 12 13-17 18 ≤12 13-17 ≥18
Fluoroquinolonas
Ciprofloxacina CIP 5µg ≤15 16-20 ≥21 15 16-20 21 - - -
Levofloxacin LVX 5 µg ≤13 14-16 ≥17 18 19-21 22 - - -
Folatos Trimetroprim/ Sulfametaxazol
SUT 1.25/ 23.75µg
- - - 10 11-15 16 ≤12 13-16 ≥17
Trimetoprim TRI 5 µg - - - 10 11-15 16 ≤10 11-15 ≥16
Inibidores β-Lactâmicos
Ampicilina+ Sulbactan
ASB 10/10 µg
≤11 12-14 ≥15 11 10-14 15 - - -
Amoxicilina+ Clavulanato
AMC 20/10 µg
≤13 14-17 ≥18 - - - - - -
Penicilina
Ampicilina AMP 10 µg ≤13 14-16 ≥17 28 ---- 29 ≤13 14-16 ≥17
Quinolonas
Ácido nalidíxico
NAL 30 µg ≤13 14-18 ≥19 - - - - - -
Tetraciclinas
Doxiciclina
DOX 30 µg ≤14 15-16 ≥17 12 13-15 16 - - -
Tetraciclina
TET 5µg - - - 15 15-18 19 ≤14 11-15 ≥19
R= Resistente S=Sensível I=Intermediário Fonte: CLSI, 2014 (Adaptado)
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5. RESULTADOS
5.1. Resultados biométricos
O tamanho das ostras com valvas variaram de 3,41± 0,65 cm a 9,0±1,21 cm; e
sem valvas, as ostras apresentaram tamanho de 2,51±0,49 cm a 7,10±0,79 cm.
Quanto ao peso, os exemplares com valvas variaram entre 28,5±11,5 g a 261±
67,7 g e sem valvas 2,6±1,1 a 40,3±10,9 g.
5.2. Dados da Precipitação pluviométrica
Os totais da precipitação pluviométrica foram recolhidos durante o
período das coletas conforme tabela 2.
Tabela 2: Precipitação pluviométrica (mm)
MUNICÍPIO JUN-JUL
2013
AGO-SET
2013
OUT-NOV
2013
DEZ 2013
JAN 2014
FEV-MAR
2014
ABR-MAI
2014
Ilhéus 26 (±3,5) 16 (±19,8) 107 (±148,5) 42 (±27,6) 50 (±17,0) 30 (±9,0)
Maraú 16 (±7,1) 82 (±25,5) 284 (±175,4) 130 (±89,1) 50 (±9,9) 37 (±23,3)
Camamu 189(±9,97) 207(±24,3) 298(±258,8) 156 (±75,0) 232(±22,8) 69 (±17,5)
5.3. Análises microbiológicas
Todas as amostras analisadas foram negativas para Salmonella spp.,
Staphylococcus aureus e Vibrio vulnificus (Tabela 3).
As amostras que apresentaram maior contaminação microbiana foram
provenientes do estuário do rio Cachoeira (município de Ilhéus), destacando-se as
amostras do bairro Teotônio Vilela, no período de junho e julho de 2013. Conforme
mostra a tabela 2, neste período a análise microbiológica de coliformes totais equivaleu
a 106,59 ufc.g-1, E. coli correspondeu a105,59 ufc.g-1 e Enterobactérias a 106,62 ufc.g-1 com
diferença significativa (p< 0,0001) em relação aos outros locais e períodos.
Apenas nos meses de abril e maio de 2014 foi observada a presença de V.
parahaemolyticus em Porto Campo, Banco da Vitória e Teotônio Vilela, com uma
média de 102,9 ufc.g-1, não apresentando diferença significativa entre as localidade
(Tabela 3).
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Tabela 3. Análises microbiológicas da ostra Crassostrea rhizophorae proveniente do
Litoral Sul da Bahia (n = 920).
Período
Microrganismos (Log10)
a
JUN-JUL
2013
AGO-SET
2013
OUT-NOV
2013
DEZ 2013
JAN 2014
FEV-MAR
2014
ABR-MAI
2014
média/ região
Coliformes totais
PC 3,40 3,06 3,90 3,71 3,71 3,54 3,55 MA 2,89 4,20 2,78 NC 2,30 2,40 2,91 BV 3,24 3,04 2,88 3,27 2,35 2,42 2,87 TV 6,59b 4,66 3,55 4,31 3,80 4,38 4,55
média/período 4,03 3,74 3,28 3,76 3,04 3,19
E. coli
PC 1,42 2,27 0,00 0,00 0,00 2,12 0,97 MA 0,00 1,22 0,00 NC 0,00 0,00 0,24 BV 3,24 2,86 2,65 0,00 0,00 2,24 1,83 TV 5,59b 3,16 2,40 2,34 2,74 4,38 3,44
média/período 2,56 2,38 1,26 0,78 0,69 2,19
Enterobactérias
PC 3,40 3,06 3,90 3,71 3,71 3,54 3,55 MA 3,26 4,24 3,53 NC 4,06 3,28 3,67 BV 5,01 4,53 4,59 4,59 3,59 4,59 4,48 TV 6,62b 4,59 3,40 4,21 3,76 3,66 4,37
média/período 4,57 4,11 3,86 4,17 3,78 3,77
V. parahaemolyticus
PC 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3,57 0,60 MA 0,00 0,00 0,00 NC 0,00 0,00 0,00 BV 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,21 0,37 TV 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3,03 0,51
média/período 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,90
PC (Porto Campo); MA ( Maraú) - Baía de Camamu. BV (Banco da Vitória); TV (Teotônio Vilela) - Estuário do Rio Cachoeira, Ilhéus. aresultados referentes a média entre as duplicatas do experimento em três diluições (10-
1, 10-2, 10-3). As amostras foram negativas para Salmonella spp., Staphylococcus aureus e Vibrio vulnificus. b indica diferença significativa (p< 0,0001) pelo teste de Tuckey em relação aos outros locais e épocas de coletas. NC – amostra não coletada
5.3. Perfil de suscepitibilidade aos antimicrobianos
Das cepas de E. coli isoladas pelo método Compact Dry, 26 foram confirmadas
através da PCR e submetidas ao antibiograma.
Na localidade de Porto Campo, as seis cepas isoladas de E. coli apresentaram
80% de sensibilidade aos antibióticos levofloxacin (LVX) amoxicilina + clavulanato
(AMC), cefepime (CPM) e cefoxitina (CFO), e 100% de sensibilidade a gentamicina
26
(GEN), ampicilina + sulbactam (ASB) e cloranfenicol (CLO). Em relação ao antibiótico
amicacina (AMI) as bactérias apresentaram 50% de resistência (Fig. 7A).
Na localidade de Maraú, somente duas cepas de E. coli foram confirmadas,
apresentando 100% de resistência para o fármaco ampicilina e 50% para o imipinem.
Para os demais antibióticos, as cepas foram sensíveis (Fig. 7B).
No estuário do rio Cachoeira, no bairro Banco da Vitória, foram isoladas oito
amostras de E. coli. Estas foram sensíveis aos antibióticos levofloxacin, imipinem,
gentamicina, doxiciclina, cefepime, cloranfenicol, ciprofloxacin, amoxicilna +
clavulanato e amicacina, com porcentagem superior a 80%. Em contrapartida,
mostraram 50% de resistência ao ácido nalidíxico e apresentaram resposta intermediária
em torno de 80% ao fármaco cefuroxima (Fig. 7C).
Também no estuário do rio Cachoeira, no bairro Teotônio Vilela foram isoladas
10 amostras de E. coli, sendo que estas apresentaram 80% de sensibilidade aos
antibióticos imipinem, amoxicilina + clavulanato e porcentagem superior a esse valor
citado aos fármacos levofloxacin, gentamicina, doxiciclina, cefepime, cloranfenicol,
ciprofloxacin e ampicilina + sulbactam, 60% foram resistentes ao antibiótico cefoxitina,
e 70% apresentaram resposta intermediária ao fármaco cefuroxima (Fig. 7D).
27
Figura 7: Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados de Escherichia coli em ostras.
Um total de seis amostras de V. parahaemolyticus foram isoladas e identificadas.
Destas, três foram encontradas em Porto Campo e apresentaram 100% de resistência a
ampicilina (Fig. 8A). No Banco da Vitória, dois isolados apresentaram resposta
intermediária a ampicilina (Fig. 8B) e o único isolado proveniente do bairro Teotônio
Vilela apresentou resistência a este antibiótico (Fig. 8C). Todos os isolados foram
sensíveis aos demais antibióticos (Fig. 8A, B, C).
28
Figura 8: Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados de Vibrio parahaemolyticus em ostras.
Dentre os antibiogramas realizados com os isolados de E. coli, os antibióticos
com maior resistência em relação à área de estudo foram: ampicilina no estuário de
Maraú, ácido nalidíxico e cefoxitina no estuário do rio Cachoeira, nos bairros Banco da
29
Vitória e Teotônio Vilela, respectivamente (Fig. 7). Quanto ao V. parahaemolyticus, os
isolados apresentaram maior resistência a ampicilina em Porto Campo e no Teotônio
Vilela (Fig. 8).
6. DISCUSSÃO
A qualidade e a segurança dos alimentos tornaram-se mundialmente questões de
Saúde Pública, devido à ocorrência de surtos de toxinfecções causadas por alimentos
contaminados por patógenos (CUNHA, 2006). Ultimamente, a área da microbiologia de
alimentos tem utilizado técnicas rápidas de diagnóstico devido a sua eficiência e
rapidez, tornando-as grandes aliadas para o controle da qualidade.
As localidades situadas às margens do estuário do rio Cachoeira (nos bairros
Banco da Vitória e Teotônio Vilela) apresentam relevância para a comunidade
ribeirinha devido à pesca extrativista, incluindo a extração de ostras. No entanto, este
ecossistema recebe descarga de dejetos que prejudica a saúde desses moluscos e,
consequentemente, oferece riscos à população.
No presente estudo, a área localizada no bairro Teotônio Vilela foi a que
apresentou maior grau de contaminação das ostras, ressaltando o período de junho e
julho de 2013, no qual o número de coliformes totais e de enterobactérias ultrapassou
106 ufc.g-1 e E. coli foi acima de 105 ufc.g-1(Tabela 3).
Pesquisas realizadas por Kolm e Absher (2008) na Baía de Paranaguá (Paraná)
relataram números mais elevados de coliformes totais e E. coli no período do verão, e
estão de acordo com Forcelini (2009), que também encontrou um número elevado E.
coli nessa mesma estação. Na nossa pesquisa, os números elevados desses patógenos
ocorreram no período de inverno, corroborando com o trabalho de Neta (2013).
Provavelmente isto se deve a precipitação pluviométrica, que variou de 23 a 28 mm
neste período, valores menores do que os ocorrentes nos meses de novembro a março,
considerado o período mais chuvoso da região, com pluviosidade média de 66 mm,
segundo o Instituto Nacional de Metereologia (INMET, 2015).
Quanto menor a pluviosidade maior é a concentração dos patógenos na água, e o
aumento da chuva diminui a retenção de micro-organismos nas ostras. Os números
elevados de E. coli provavelmente são indicadores da presença de outros agentes
veiculadores de enfermidades através da água.
30
Em 2006, Sande et al. (2010) realizaram análises da água e de moluscos bivalves
(C. rhizophorae) no estuário do rio Cachoeira (bairro Teotônio Vilela) e obtiveram
resultados de 102 ufc.g-1 para coliformes totais. Já em 2012, um estudo realizado por
Neta (2013) no mesmo local atestou resultados próximos de 104 ufc.g-1 também para
coliformes totais..Nossa pesquisa encontrou uma média de 104,55 ufc.g-1 (Tabela 3), o
que sugere um aumento da contaminação microbiana ao longo do tempo, que está
pautado na crescente ação antrópica através da descarga de dejetos sanitários e
industriais nessa região.
Em contrapartida, nosso estudo apresentou valores superiores aos dos trabalhos
supracitados, talvez pela alta sensibilidade do método rápido Compact Dry, o que foi já
foi comprovado pelo trabalho de Lopes et al. (2013) analisando ostras C. rhizophorae.
Essa técnica mostrou-se mais sensível do que o método padrão para o cômputo de
Enterobactérias, Coliformes totais e E. coli.
Percebe-se que em Porto Campo a contaminação se manteve estável
comparando com os resultados citados no trabalho de Neta (2013). Possivelmente este
achado está associado a alguns fatores, entre eles: essa área estuarina recebe menor
quantidade de esgotos, tem menor impacto de desmatamento, inexistência de construção
de açudes, e baixa densidade populacional. Além da contribuição dos fatores citados
para essa estabilidade, é provável também que esse fato tenha ocorrido devido à maior
precipitação pluviométrica que ocorreu em todo o período da coleta quando comparado
com as outras áreas de estudo (Tabela 2).
A presença de V. parahaemolyticus foi detectada somente no período de abril e
maio de 2014 nas localidades de Porto Campo, com valores de 103,57 ufc.g-1, e no
estuário do rio Cachoeira (com 103,0 ufc.g-1 no bairro Teotônio Vilela e 102,21 ufc.g-1 no
Banco da Vitória).
Geralmente essas bactérias são encontradas em números mais elevados no verão
(PEREIRA; VIANA; RODRIGUES, 2007). Porém, neste estudo, esse patógeno foi
identificado no período do outono, com possibilidade para meses com temperaturas
mais baixas, com precipitação pluviométrica entre 23 a 37 mm em Ilhéus e de 57 a 82
mm em Camamu (Tabela 2).
Conforme Rodriguez-Camacho (2014), V. parahaemolyticus é encontrado no
período mais frio em sedimentos marinhos, sendo afetado pelas alterações dos fatores
abióticos do ambiente aquático onde o mesmo é encontrado. Mas, outro estudo afirma
que essa bactéria tem potencialidade de reprodução em todo período anual
31
(RODRIGUES; FILHO, 2011). Os resultados do presente estudo convergem com
pesquisas anteriores confirmando a presença desse patógeno em moluscos bivalves.
Essa bactéria foi encontrada na Baía de Todos os Santos e em Valença ambos no estado
da Bahia (BARBONI, 2003). Em Cachoeira (BA) encontraram-se resultados positivos
para esse micro-organismo em ostras C. rhizophorae, com valores equivalentes a nossa
pesquisa (RODRIGUES; FILHO, 2012). Em pesquisa com C. rhizophorae realizada no
estuário do rio Cachoeira, Porto do Campo e Taperoá, os resultados foram negativos
para esse patógeno (NETA, 2013).
No presente trabalho todas as amostras analisadas foram negativas para
Salmonella spp., S. aureus e V. vulnificus.
A presença do S. aureus em alimentos costuma estar associada à manipulação e
higienização inadequadas dos alimentos e utensílios. Entretanto, pesquisa realizada
recentemente no estuário do rio Cachoeira, Taperoá e Camamu por Neta (2013)
encontrou resultados positivos para esse agente etiológico em ostras coletadas
diretamente do ambiente estuarino, ou seja, em amostras não manipuladas para o
consumo, indicando que esta bactéria pode ter origem ambiental.
Dentre os patógenos, Salmonella spp. é um dos mais proeminentes veiculadores
de enfermidades através da ingestão de alimentos. A presença dessa bactéria na
alimentação traz implicações sérias à Saúde Pública, pois a mesma está frequentemente
relacionada a surtos alimentares (SANTOS, 2010).
Estudos realizados por Lopes et al. (2013), Ramos et al. (2012), Ramos (2007) e
Pereira et al. (2006) também foram negativos para a presença de Salmonella spp. em
ostras. Em contraposição, pesquisas mostram resultados positivos para esse micro-
organismo (FARIAS, 2013; EVANGELISTA-BARRETO, 2014), incluindo estudos
prévios realizados no estuário do Rio Cachoeira (NETA, 2013; SANDE et al., 2010).
Vibrio vulnificus é considerado um agente etiológico relevante à Saúde Pública,
especialmente em indivíduos imunocomprometidos e que ingerem moluscos in natura,
e, portanto, deve ser investigado em alimentos marinhos. Nossa pesquisa não detectou a
presença dessa bactéria, mas existem pesquisas realizadas em Santa Catarina com C.
gigas que mostram resultados positivos (RAMOS, 2012).
Devido à alta sensibilidade do método Compact Dry, o que pode dar resultados
falsos positivos (HAJDENWURCEL, 1998; CESAROTTI; PAULA; ROSSI, 2007), foi
necessária a confirmação dos isolados bacterianos por PCR, por ser uma técnica
32
molecular rápida que detecta fragmentos gênicos específicos. Posteriormente foi
realizado o antibiograma dos isolados de E.coli, e V. parahaemolyticus.
Os resultados do antibiograma mostraram que a maioria das cepas da E. coli foi
sensível aos antibióticos testados, porém a amicacina em Porto Campo teve resistência
de 50%. No estuário de Maraú, essas bactérias foram 100% resistentes ao antibacteriano
ampicilina; no estuário do rio Cachoeira em Banco da Vitória apresentaram 50% de
resistência ao ácido nalidíxico e em Teotônio Vilela mostraram resistência de 60% a
cefoxitina (Fig. 7).
Essa resistência pode estar pautada não restritamente a despejos de dejetos
domésticos sem tratamento adequado nos ecossistemas, mas vindouros de ambientes
hospitalares, industriais, funções na área veterinária, ou da própria aquicultura,
podendo elevar a distribuição de cepas contendo genes de resistência a esses
antibióticos (OLIVEIRA; PINHATA, 2008). É preocupante a presença desses
patógenos resistentes, especialmente nas áreas onde ocorrem o cultivo e o extrativismo
de ostras.
Estudos realizados relatam resistência da E. coli a cefoxitina e sensibilidade a
cloranfenicol e a tetraciclina (BARROS et al., 2005; MORELLI et al., 2003), mas de
acordo com relatos do segundo autor supracitado, essa bactéria mostrou resistência de
70% a ampicilina. Assim também aconteceu nas análises de ostras do estuário do Rio
Pacoti, realizadas por Atayde (2007), que registrou 80% de resistência ao imipinem e
48% a ampicilina. Os resultados dessa considerável resistência relatada nestas pesquisas
estão de acordo com nosso estudo.
Segundo Vieira et al.(2008), E. coli apresentou 80% de resistência ao fármaco
imipinem. Os autores relatam que essas bactérias foram sensíveis à maioria dos
antimicrobianos avaliados. Em nosso trabalho, as cepas isoladas apresentaram 50% de
resistência ao imipinem e também apresentou sensibilidade alta a maior parte dos
fármacos testados. Em Cruz das Almas (BA) foi realizada uma pesquisa com moluscos
e E. coli registrou 23,5% de resistência a ampicilina (SAMPAIO, 2013).
Nos resultados da susceptibilidade aos antimicrobianos na pesquisa recente,
chama-se atenção para 100% de resistência dos V. parahaemolyticus ao antibiótico
ampicilina em duas áreas de estudo: Porto Campo e Teotônio Vilela.
Resultados com porcentagem alta de resistência (mais de 67%) a esse
antibacteriano por bactérias da família Vibrionaceae, a qual pertence esse patógeno,
foram encontrados em sistema de cultivo em Minas Gerais (CARNEIRO et al., 2007).
33
O mesmo ocorreu nos estudos realizados com produtos marinhos por Costa (2008) que
relatou 75% de resistência do V. parahaemolyticus ao antibiótico ampicilina, mas a
porcentagem é inferior em comparação com os achados do presente estudo.
Em outro estudo em Recife foram extraídas 16 cepas de V. parahaemolyticus em
molusco bivalves sendo 14 resistentes a ampicilina (MONTEIRO, 2013). Em estudos
realizados com ostras, 80% de resistência por Vibrio sp. foi detectado para a ampicilina
(RAMOS, 2012).
De acordo com as indicações promulgadas pelo Centers for Disease Control and
Prevention, não é aconselhável utilizar este antibiótico para combater infecções
causadas por esse micro-organismo, uma vez que este acontecimento não é recente
(MONTEIRO, 2013). Segundo esse mesmo autor, nos Estados Unidos no ano de 1978,
mais dos 160 isolados desse patógeno ofereceram 90% de resistência a esse fármaco.
A dispersão de micro-organismos com resistência a antibióticos nos
ecossistemas aquáticos tem sido uma questão preocupante para a Saúde Pública, tendo
em vista que a veiculação hídrica acarreta em forte impacto epidemiológico
(VASCONCELOS et al., 2010).
7. CONCLUSÕES
• As ostras provenientes do cultivo monitorado na Baía de Camamu têm
apresentaram níveis baixos de contaminação bacteriana;
• No estuário do rio Cachoeira, ostras provenientes do extrativismo têm
apresentado um aumento de contaminação dos micro-organismos E. coli,
Coliformes totais e Enterobactérias ao longo do tempo;
• A ação antrópica continua sendo um dos principais fatores que contribui para a
contaminação ambiental e, consequentemente, para a baixa qualidade
microbiológica das ostras da cidade de Ilhéus;
• Isolados de E. coli apresentaram maior resistência a amicacina, ampicilina, ácido
nalidíxico e cefoxitina, dependendo da localidade estudada;
• Isolados de V.parahaemolyticus apresentaram resistência a ampicilina.
34
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