universidade estadual de santa cruz pro-reitoria de

1

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRO-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Programa de Pós-graduação em Ciência Animal

MARCONI BOMFIM DE SANTANA

ALTERNATIVAS AOS ANTIMICROBIANOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO PARA LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS

DESAFIADOS COM E. coli K99+

ILHÉUS - BAHIA - BRASIL

2013

2




Dissertação apresentada à

Universidade Estadual de Santa

Cruz, como parte das exigências

para obtenção do título de Mestre

em Ciência Animal. Área de

concentração: Comportamento e

Produção Animal.

ILHÉUS – BAHIA - BRASIL

2013

3




Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Comportamento e Produção Animal.

Ilhéus – BA, 22/02/2013

BANCA EXAMINADORA

Leandro Batista Costa – DSc

UESC/DCAA

(Orientador)

Luís Gustavo Tavares Braga - DSc

UESC/DCAA

Valdomiro Shigueru Miyada – PhD

ESALQ/USP

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DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO – UESC/BA

S232 Santana, Marconi Bomfim de. Alternativas aos antimicrobianos promotores de crescimento para leitões recém-desmamados desafiados com E. coli K99+ / Marconi Bomfim de Santana. - Ilhéus: UESC, 2013 64f. Orientador: Leandro Batista Costa. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Mestrado em Ciência Animal. Inclui referências e apêndices.

1. Nutrição animal. 2. Alimentação animal. 3. Suínos- Alimentação. 4. Suínos - Nutrição. I. Costa, Leandro Batis- ta (orientador). II. Título.

CDD – 636.085

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”

5

DEDICATÓRIA

“Dedico esta dissertação a minha família pela fé e confiança demonstrada”

“Aos meus amigos pelo apoio incondicional”

“Aos professores pelo simples fato de estarem dispostos a ensinar”

“Aos orientadores pela paciência demonstrada no decorrer do trabalho”

“Enfim, a todos que de alguma forma tornaram este caminho mais fácil de ser”

6

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por me dar saúde, conceber forças para

sempre prosseguir na jornada da vida, por proporcionar sempre no meu interior

fé incondicional.

Ao meu pai José Raimundo Silva de Santana pelo incontestável exemplo de

vida, inspiração como pai e como homem, amor incondicional.

À minha mãe Tânia C. Bomfim de Santana, por seu carinho e preocupação

com esse filho querido, amor incondicional.

Ao meu orientador Leandro Batista Costa, pelos ensinamentos, pela confiança

e por essa grande oportunidade em minha vida.

Aos eternos amigos e companheiros André Bomfim, Keko, Ivan Ferraz,

Neomara Lisboa, Arthur Sampaio, Ives Samir, Renan Bombinho, Roberto

Marinho a quem sempre posso contar, irmãos que escolhi.

À minha namorada Erica Novaes, pelo carinho, compreensão, respeito e acima

de tudo, amor.

Aos grandes amigos e colegas Diego Brandão e Daniel Cruz pelo incontestável

apoio, e por estarem presentes em todos os momentos desta jornada.

À Gabriela Borges, Inara Leal e Tainá Coutinho pela amizade e pela ajuda na

conclusão deste trabalho.

7

Às amigas do laboratório de micologia Poly, Clarinha, Candice e Gilvia pela

amizade e carinho.

Aos colegas de sala Junior Oliveira, Kauana, Felipe e Licuri.

À colega Carla Andrade (ESALQ/USP) pela ajuda na realização das análises

estatísticas.

Aos amigos da UFLA – MG, Vinícius Cantarelli, Cezar Garbossa, Fernando

Moraes, Josiane Nascimento, Hebert e toda galera do NESUI pelo apoio,

receptividade e amizade.

À Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC pela estrutura acadêmica para

que eu pudesse concluir este trabalho.

À Universidade Federal de Lavras - UFLA pelo apoio e parceria para realização

do experimento.

À empresa Auster Nutrição Animal LTDA pelo apoio e fornecimento de

materiais para a conclusão deste trabalho.

À FAPESB pelo apoio financeiro através da bolsa de estudo.

Aos professores que contribuíram com as análises do experimento,

Roberta Hilsdor (UFLA), José Augusto Azevêdo, Fabiana Lessa Silva, Amauri

Arias Wenceslau, Antônio Roberto Paixão, João Luciano Andreoli, George

Albuquerque e Renato Fontana (UESC).

8

ALTERNATIVAS AOS ANTIMICROBIANOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO PARA LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS DESAFIADO S

COM E. coli K99+

RESUMO

Foi conduzido um experimento para avaliar os efeitos da mistura de

extratos vegetais, butirato de sódio e nucleotídeos, sobre o desempenho, a

histologia do epitélio intestinal, a morfometria dos órgãos e o pH do conteúdo

digestório de leitões recém-desmamados desafiados com E. coli K99+. Foram

utilizados 90 leitões híbridos comerciais, com idade média de 21 dias e peso

médio inicial e final de 6,35 ± 0,34 e 17,15 ± 2,08 kg, respectivamente. Os

leitões foram distribuídos em um delineamento em blocos casualizados

completos, com cinco tratamentos, seis repetições por tratamento e três

animais por unidade experimental (dois machos e uma fêmea ou duas fêmeas

e um macho). Os tratamentos testados foram: Controle - dieta basal;

Antimicrobiano – dieta basal com 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm –

dieta basal com 1000 ppm de extratos vegetais + butirato de sódio +

nucleotídeos; 1500 ppm – dieta basal com 1500 ppm de extratos vegetais +

butirato de sódio + nucleotídeos e 2000 ppm – dieta basal com 2000 ppm de

extratos vegetais + butirato de sódio + nucleotídeos. Os aditivos foram

compostos de 32% de butirato de sódio, 2% a 3% de nucleotídeos obtidos da

hidrólise da levedura Saccharomyces cerevisiae e 5% de extratos vegetais,

sendo 2% de Glycyrrhiza glabra (raiz doce), 1,5% de Rosmarinus officinalis

(alecrim) e 1,5% de Peumus boldus (bodo). No sétimo dia de experimento (28

dias de idade) os animais foram privados de água e ração por 3 horas.

9

Posteriormente receberam via intragástrica 60 mL da solução de bicarbonato

de sódio na concentração de 1,4 % (p/v) para neutralizar o pH gástrico.

Decorridos 30 minutos, os leitões foram infectados com E. coli - K99+, na

concentração de 5,0 x 109 ufc/mL, voltando a receber ração e água a vontade

após 2 horas da infecção. O experimento teve duração de 35 dias e ao final,

após jejum de 12h, foi abatido um animal por gaiola (unidade experimental)

para avaliação da histologia do epitélio intestinal, da morfometria de órgãos e

do pH do conteúdo digestório. O animal abatido foi escolhido de acordo com o

peso vivo sendo aquele que apresentava o peso mais próximo da média do

peso dos animais de cada unidade experimental. Para determinação das

variáveis de desempenho, os animais foram pesados no início, aos 14 dias e

aos 35 dias de experimentação, sendo quantificadas as rações consumidas e

as sobras. Não foram observadas diferenças (P<0,05) para o desempenho,

para a histologia intestinal, para a morfometria dos órgãos e para o pH do

conteúdo digestório através da análises de polinômios ortogonais ou mesmo

pelos contrastes de interesse. De um modo geral, o sulfato de colistina e a

combinação de extratos vegetais, de butirato de sódio e de nucleotídeos não

foram eficientes em promover melhora nas características produtivas de leitões

recém-desmamados desafiados com E. coli K99+.

Palavras-chave: butirato de sódio, extratos vegetais, nucleotídeos, nutrição, suínos

10

ALTERNATIVES TO ANTIMICROBIAL GROWTH PROMOTERS FOR

WEANLING PIGS CHALLENGED WITH E. coli K99+

ABSTRACT

An experiment was conducted to evaluate the effects of plant extracts

mixture, sodium butyrate and nucleotides on the performance, intestinal

epithelial histology, morphometry of organs and pH of the digestive contents of

weanling pigs challenged with E. coli K99+. A total of 90 commercial hybrid

piglets were used; these piglets had a average age of 21 days and average

initial and final weights of 6.35 ± 0.34 and 17.15 ± 2.08 kg, respectively. The

piglets were distributed in a randomized complete block design with five

treatments, six replication per treatment and three animals per experimental unit

(two males and one female or two females and one male). The treatments

were: Control – basal diet; Antimicrobial – basal diet with 40 ppm colistin

sulfate; 1000 ppm – basal diet with 1000 ppm of a mixture of plant extracts +

sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm – basal diet with 1500 ppm plant

extracts + sodium butyrate + nucleotides; and 2000 ppm – basal diet with 2000

ppm plant extracts + sodium butyrate + nucleotides. The additives were

composed of 32% sodium butyrate, 2% to 3% nucleotides prepared from

Saccharomyces cerevisiae yeast hydrolysis and 5% plant extracts, including 2%

Glycyrrhiza glabra (sweet root), 1.5% Rosmarinus officinalis (rosemary) and

1.5% Peumus boldus (boldo). The animals were deprived of food and water for

3 h on the seventh day of the experiment (28 days old). Subsequently, the

piglets received 60 mL of a sodium bicarbonate solution at a concentration of

11

1.4% (w/v) intragastrically to neutralize the gastric pH. After 30 minutes, the

piglets were infected with E. coli K99+, at a concentration of 5.0 x 109 cfu/mL,

and were given food and water ad libitum 2 h after infection. The experiment

lasted 35 days, and at the end, following a 12 h fast, one animal per pen

(experimental unit) was slaughtered to assess the intestinal epithelium

histology, morphometry of the organs and pH of the digestive contents. The

selected slaughtered animal was the animal whose live weight was closest to

the animals’ average weight in each experimental unit. The animals were

weighed to assess the performance variables at the beginning of the

experiment, at day 14 and at day 35 of the experiment, quantifying the

consumed feed and the excess. No differences were found (P < 0.05) regarding

the performance, intestinal histology, morphometry of the organs and pH of the

digestive contents through the analysis of orthogonal polynomials or even by

the contrasts of interest. In general, colistin sulfate and the combination of plant

extracts, sodium butyrate and nucleotides were not effective in promoting

improvement of the productive characteristics of weanling pigs challenged with

E. coli k 99+.

Keywords: , herbal extracts, nucleotides, nutrition, pigs, sodium butyrate

12

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fórmula molecular do butirato de sódio………………………...…..…26

13

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 15

2. OBJETIVO ............................................................................................................ 17

3. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 18

3.1. SISTEMA DIGESTÓRIO DE LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS E INCIDÊNCIA DE DIARREIA ................................................................................... 18

3.2. Escherichia coli (E. coli) .................................................................................... 20

3.3. NUCLEOTÍDEOS .............................................................................................. 22

3.4. ÁCIDOS ORGÂNICOS ..................................................................................... 24

3.5. EXTRATOS VEGETAIS ................................................................................... 26

4. ARTIGO CIENTÍFICO ......................................................................................... 31

4.1. Introduction ........................................................................................................ 34

4.2. Materials and Methods ..................................................................................... 36

4.2.1.Animals and facilities ............................................................................... 37

4.2.2.Experimental diets ................................................................................... 37

4.2.3.Animal infection ....................................................................................... 38

4.2.4.Samplings and measurements ................................................................ 39

4.2.5.Statistical analysis ................................................................................... 40

4.3. Results ................................................................................................................ 40

4.3.1.Performance preinfection 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day ......... 40

4.3.2.Performance from day 1 to day 14 .......................................................... 40


4.3.4.Intestinal epithelium histology .................................................................. 41

4.3.5.Morphometry ........................................................................................... 41

4.3.6.pH of the digestive contents .................................................................... 41

4.4. Discussion .......................................................................................................... 41

14

4.4.1.Performance preinfection 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day ......... 41



4.4.4.Intestinal histology ................................................................................... 46

4.4.5.Morphometry ........................................................................................... 47

4.4.6.pH of the digestive contents .................................................................... 48

4.5. Conclusion ......................................................................................................... 49

4.6. References ........................................................................................................ 49

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 59

APÊNDICES ........................................................................................................... 662

ANEXOS ................................................................................................................. 74

15

1. INTRODUÇÃO

A globalização da suinocultura moderna tem ocasionado mudanças

importantes na produção suinícola mundial. A intensificação da produção de

carne suína, no intuito de atender à demanda populacional cada vez maior,

tornou este produto a fonte de proteína animal mais produzida e mais

consumida em todo o mundo (FAO, 2013)

No entanto, a produção cada vez mais intensiva da suinocultura

predispõe os animais ao estresse, tornando-os mais susceptíveis a problemas

entéricos, causando alterações na microbiota intestinal responsáveis pela

diminuição da produtividade. A diarreia pós-desmame é um dos principais

problemas entéricos na produção de suínos, podendo ser causada pela

colonização do epitélio intestinal por microrganismos patogênicos como

Escherichia coli enterotoxinogênica, Salmonella typhimurium e Clostridium spp

(STEWART; CHESSON, 1993).

Desde a década de 50, os aditivos antimicrobianos vêm sendo utilizados

na produção de suínos com o intuito de aumentar a produtividade dos animais

criados em condições cada vez mais intensivas, aumentando a taxa de

crescimento e a eficiência alimentar, por inibir o metabolismo bacteriano,

reduzindo a competição direta pelos nutrientes entre as bactérias e o

hospedeiro (BUTOLO, 1999).

Apesar da comprovada capacidade de aumentar o desempenho de

suínos, o uso de antimicrobianos como promotores de crescimento vem sendo

restringido em vários países. Desde a proibição do uso de antibióticos na

alimentação animal pela União Europeia em 2006, os estudos vêm sendo

intensificados na busca por produtos alternativos que garantam máximo

crescimento dos animais sem afetar a qualidade do produto final. Dentre estes

produtos estão os probióticos, prebióticos, ácidos orgânicos, nucleotídeos,

óleos essenciais, extratos vegetais e outros ingredientes alimentares

adicionados às dietas dos animais (LALLÈS et al., 2009).

Na literatura há evidências dos efeitos benéficos da utilização de

extratos vegetais (HUANG et al., 2010; OETTING et al., 2006; WINDISCH et

16

al., 2008; YAN et al., 2012), ácidos orgânicos (MANZANILLA et al., 2006; PIVA

et al., 2002; ROTH; KIRCHGESSNER, 1998) e nucleotídeos (ABREU et al.,

2010; ANDRADE et al., 2011; CARLSON; VEUM, 2001) na alimentação de

suínos. No entanto, os conhecimentos sobre a eficácia desses grupos de

aditivos, utilizados conjuntamente em dietas para leitões recém-desmamados,

são escassos e pouco conclusivos, necessitando de mais estudos que possam

comprovar seus efeitos como potenciais substitutos dos antibióticos e

quimioterápicos promotores de crescimento de suínos.

17

2. OBJETIVO

Avaliar os efeitos de extratos vegetais, butirato de sódio e nucleotídeos

sobre o desempenho, a histologia do epitélio intestinal, a morfometria dos

órgãos e o pH do conteúdo digestório de leitões recém-desmamados

desafiados com E. coli K99+.

18

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1. SISTEMA DIGESTÓRIO DE LEITÕES RECÉM-DESMAMADOS

E INCIDÊNCIA DE DIARREIA

Na suinocultura, para que haja máximo aproveitamento do potencial

genético dos animais, é necessário que sejam supridos de adequados aportes

de nutrientes (carboidratos, lipídios, aminoácidos, minerais e vitaminas), sendo

que tal processo ocorre pela digestão dos alimentos e absorção dos nutrientes.

Digestão é o processo no qual as macromoléculas são quebradas em

moléculas menores. Por outro lado, a absorção é o transporte destas pequenas

moléculas através da membrana plasmática das células intestinais. Estes dois

processos são extremamente importantes para assimilação de nutrientes pelo

organismo e, consequentemente, para o desenvolvimento do animal. Não há

absorção sem uma prévia digestão, da mesma forma que é inviável se os

nutrientes digeridos não puderem ser absorvidos. Para que ocorra um processo

de digestão e absorção eficiente faz-se necessário a manutenção da

integridade das células epiteliais da mucosa intestinal (MAIORKA et al., 2002).

Dentro do sistema de produção da suinocultura intensiva é praticada a

desmama dos leitões dos 14 aos 28 dias de idade, conhecida como desmama

precoce, com o intuito de maximizar a produção. Esta prática é comercialmente

vantajosa, contudo é considerada um evento bastante estressante para os

neonatos. Em muitos casos está ligada ao crescimento de bactérias

patogênicas no trato gastrintestinal, à atrofia das vilosidades intestinais, ao

aumento na incidência de diarreia (FRYDENDAHL, 2002), ao baixo

desempenho (ODLE et al., 1996) e ao aumento da mortalidade dos animais

(McCRACKEN et al., 1999).

Os leitões possuem sistema digestório imaturo, no qual é insuficiente a

secreção de ácido clorídrico (HCl) no estômago, além de limitada produção e

atividade de enzimas pancreáticas e intestinais, propiciando menor digestão e

absorção de nutrientes. Além disso, a desmama precoce causa alterações na

fisiologia dos leitões e induz à elevação do pH estomacal, provocando redução

na atividade bactericida gástrica (HENTON; HUNTER, 1994).

19

O sistema digestório dos leitões está adaptado ao leite materno,

havendo, nesta fase, maior produção de lactase (enzima responsável pela

degradação da lactose do leite). No entanto, com o amadurecimento do animal

e a ingestão de dietas sólidas, há redução na atividade desta enzima e

produção de outra enzima (pepsina). O fornecimento gradativo de dieta sólida,

substituindo os produtos lácteos por fontes de proteína vegetal, irá estimular a

produção de HCl no estômago, promovendo a queda do pH. Além disso,

através de estímulos hormonais, a chegada do quimo mais ácido ao intestino

delgado estimulará a produção de enzimas pancreáticas (tripsina,

quimotripsina, amilase e lipase) e intestinais (maltase, sacarase e

aminomeptidase dentre outras) promovendo maior digestão dos nutrientes da

dieta (CUNNINGHAM, 1992).

No entanto, com a desmama é observado histologicamente redução na

altura dos vilos e aumento na profundidade de criptas. A atrofia das vilosidades

pode ser provocada por redução na taxa de renovação celular e ou maior taxa

de perda celular (COSTA et al., 2011), predispondo os animais à problemas

entéricos (diarreia).

A diarreia é o aumento da frequência de defecação ou maior volume de

fezes, que pode estar relacionada ao desequilíbrio entre os mecanismos

secretórios, absortivos e regulatórios relacionados ao trato gastrintestinal. A

diarreia pode ser classificada em três principais categorias: diarreia secretória,

mal absortiva e efusiva (MOESER; BLIKSLAGER, 2007). Na diarreia secretória

ocorre excesso de secreção de fluidos ultrapassando a capacidade absortiva

do intestino resultando em disfunção fisiológica. Esse tipo de diarreia é

causada principalmente pelas toxinas termolábeis (LT) e termoestáveis (ST)

produzidas por Escherichia coli. A toxina LT liga-se a receptores presentes nos

enterócitos causando secreção de cloreto e saída de sódio e água da célula

por osmose. A ST inibe a absorção de água pelos enterócitos. Além destas

toxinas, outros fatores estão associados à diarreia secretória através da

estimulação de reflexos nervosos como prostaglandinas, citocinas, histaminas

e quininas (DUBREUIL, 2008).

A diminuição da área absortiva do intestino grosso, independente da

causa, resulta na redução de absorção de água e eletrólitos. Este excesso de

água e solutos não absorvidos pelo intestino delgado passam para o intestino

20

grosso, ultrapassando sua capacidade absortiva, resultando em diarreia

malabsortiva. Lesões na mucosa do epitélio intestinal como microlesões ou

esfoliações da membrana celular podem favorecer a passagem de fluidos

intersticiais para a luz intestinal, promovendo a diarreia efusiva (BROWN et al.,

2007).

3.2. Escherichia coli (E. coli)

A E. coli faz parte de um grupo pertencente à família das

enterobactérias, denominados como bacilos gram-negativos, anaeróbicos

facultativos e que colonizam o trato gastrintestinal da espécie humana e

animais homeotérmicos. Em leitões, a E. coli é a principal responsável pela

diarreia, doença do edema e septicemia. Contudo, as maiores perdas

econômicas para a suinocultura intensiva estão associadas com as duas

primeiras patologias, sendo a diarreia causada pelas cepas de E. coli uma das

principais responsáveis pela morbidade e mortalidade em leitões recém-

desmamados (WILSON; FRANCIS, 1986).

De um modo geral, a E. coli permanece inofensiva no trato

gastrintestinal dos animais, no entanto, em situações adversas, no qual o

hospedeiro encontra-se enfraquecido e imunologicamente debilitado, cepas

não patogênicas destas bactérias podem causar infecções. As fezes são a

principal fonte de contaminação para animais susceptíveis e, em condições

ideais de umidade e temperatura, a E. coli pode sobreviver por até 11 semanas

(BRITO et al., 1999). O mecanismo de ação da sua patogenicidade está

baseado na lesão denominada “Attaching and Effacing” que é caracterizado

pela fixação do microrganismo às paredes do epitélio intestinal havendo

destruição das vilosidades (TRABULSI et al., 2002).

A E. coli é considerada uma das espécies mais versáteis em virtude da

sua capacidade de adaptação a diferentes ambientes e também pela

particularidade quanto ao mecanismo de patogenicidade e virulência. Ela é

capaz de provocar infecções entéricas conhecidas como Escherichia coli

diarreiogênicas (DEC) que são classificadas principalmente em: E. coli

enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli produtora de

toxina de shigas (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli

21

enteroinvasora (EIEC) e E. coli que adere de forma difusa à parede do epitélio

intestinal (DAEC) (KAPER et al., 2004).

A identificação de cepas de E. coli pode ser realizada através da técnica

de reação em cadeia da polimerase (PCR) por determinação de fatores de

virulência como hemolisinas, exotoxinas, sideróforos, endotoxina e adesinas

presentes na parede celular do microrganismo. Além disso, a E. coli também

apresenta diversos sorotipos de acordo com a presença de diferentes

antígenos fimbriais, somáticos e capsulares, os quais podem ser determinados

pela utilização de antisoros (BERTSCHINGER et al., 1990).

A tipificação sorológica é fundamental para caracterização da espécie.

Este agente é classificado em sorogrupos e sorotipos com base em seus

antígenos de superfície e fimbriais: antígenos (O) somáticos, antígenos (H)

flagelares, antígenos (K) capsulares e (F) fimbriais, que são importantes na

patogênese (KAPER et al., 2004). Na literatura existem 183 antígenos O, 53

antígenos H e 100 antígenos K (ORSKOV; ORSKOV, 1992).

A maior enfermidade entérica que acomete suínos neonatos e recém-

desmamados é a colibacilose, podendo ser provocada por cepas de ETEC.

Esta enfermidade, na maioria dos casos, pode provocar diarreia branda sem

nenhuma evidência de desidratação até sinais de severa desidratação

caracterizados por fezes amareladas e aquosas ou sanguinolentas

(BERTSCHINGER et al., 1990).

Esta bactéria adere-se a mucosa intestinal dos leitões através da

presença de adesinas fimbriais, como por exemplo a K88 (F4) e a K99 (F5),

que são responsáveis pela ligação a receptores específicos nas células do

epitélio intestinal com posterior produção de toxinas termolábeis (LT I e LT II) e

termoestáveis (STa e STb). Dentre as fímbrias, a F4 e a F5 são as principais

encontradas em isolados de fezes de leitões recém-desmamados com diarreia

(LUA et al., 1977), sendo que o gene responsável por sua expressão está

localizado no mesmo plasmídeo que apresenta o gene da hemolisina.

As toxinas LT estão correlacionadas tanto em função quanto em

estruturas às enterotoxinas da cólera, expressa pelo Vibrio cholerae (SIXMA et

al., 1993). Estas toxinas são divididas em dois grupos sendo a LT I presente

em cepas de E. coli patogênica tanto para humanos como para animais e a LT

II raramente observadas em humanos, porém são encontradas principalmente

22

em cepas isoladas de animais. As toxinas ST são responsáveis por causar

danos histológicos às células epiteliais devido à atrofia parcial ou perda das

vilosidades intestinais (CHAO; DREYFUS, 1997).

Além de suínos, outras espécies animais como ruminantes, macacos,

cães e humanos podem ser acometidos pela EPEC (TENG et al., 2004).

Contudo, é na suinocultura que os problemas com diarreia neonatal e pós-

desmama estão associados à presença deste microrganismo. A EPEC adere-

se às células epiteliais do intestino delgado e grosso, contudo, o duodeno e o

ceco são os locais de maior prevalência destes microrganismos

(BERTSCHINGER et al., 1990). A adesão da E. coli ao epitélio intestinal

provoca degeneração dos enterócitos, causando rearranjo no citoesqueleto da

célula e encurtamento das microvilosidades (GYLES; FAIRBROTHER, 2004).

3.3. NUCLEOTÍDEOS

Os nucleotídeos são compostos naturais, essenciais por participar de

processos metabólicos importantes como a produção de DNA e RNA. É

formado por uma base nitrogenada, um monossacarídeo pentose, e de um a

três grupos fosfato. Quando há ausência do grupo fosfato o composto é

conhecido como nucleosídeo. As bases nitrogenadas podem ser púricas

(adenina, guanina) ou pirimídicas (citosina, timina e uracila) (CHAMPE;

HARVEY, 1996).

O núcleo das células (nucleoproteína) é a principal fonte de nucleotídeo

das dietas. O processo de digestão inicia-se quando as nucleoproteínas são

clivadas pelas proteases, liberando ácidos nucleicos. Em seguida sofrem

hidrólise parcial no estômago, havendo exposição às fosfoesterases e às

nucleases pancreáticas, dando origem aos nucleotídeos e aos nucleosídeos,

no qual mais de 90% de todo o nucleotídeo ingerido é absorvido pelo

organismo (UAUY et al., 1994).

Os nucleotídeos atuam em vários processos bioquímicos essenciais

para o funcionamento do organismo (LEHNINGER et al., 1995). A principal

função dos nucleotídeos, no animal, é a reação de transferência de grupos

fosfatos tanto do ATP como de outros nucleotídeos trifosfato. Atuam como

transportadores imediatos na síntese de alguns carboidratos, lipídios e

23

proteínas, além de componentes estruturais de coenzimas essenciais, como a

coenzima A (CoA), a flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e a nicotinamida

adenina dinucleotídeo (NAD+) (RODWELL et al., 2002). Os nucleotídeos não

são considerados essenciais nutricionalmente, pois é sintetizado pelo

organismo pela via de novo utilizando aminoácidos como precursores ou a

partir da degradação de nucleotídeos e aminoácidos da dieta por via de

salvamento. Contudo, em circunstância de rápido crescimento, estado de

doença, distúrbio endógeno ou consumo limitado de nutrientes, o organismo

necessita de quantidades maiores do que são sintetizados ou absorvidos,

passando a ser considerado semi ou até mesmo essenciais (GARCIA, 2007).

Em tecidos e órgãos como o cérebro, medula óssea, eritrócitos e

mucosa intestinal, onde a divisão mitótica é extremamente rápida, os

nucleotídeos dietéticos apresentam papel importante tornando disponíveis

bases e nucleosídeos que podem ser prontamente utilizados na síntese de

nucleotídeos via salvamento. Além disso, os nucleotídeos podem favorecer o

crescimento de algumas bactérias benéficas da microbiota intestinal como as

bifidobactérias, semelhantes às encontradas no leite materno. Esses

microrganismos, em virtude do seu metabolismo, diminuem o pH do meio

inibindo o crescimento de enterobactérias responsáveis por inúmeras doenças

e distúrbios entéricos como a diarreia (PELÍCIA et al., 2010).

Os nucleotídeos desempenham importante papel na manutenção e

desenvolvimento do trato gastrintestinal (UAUY et al., 1994). Além disso,

apresentam efeitos benéficos na altura das vilosidades e na profundidade das

criptas (DELL’ORTO, et al., 2002). Uauy et al. (1994) observaram que a

suplementação de 0,8% de nucleotídeos em dietas para ratos jovens promoveu

maior altura de vilosidades e aumento no conteúdo de proteína total e de DNA

no intestino. Andrade et al. (2011), estudando diferentes concentrações de

nucleotídeos em dietas para leitões recém-desmamados, observaram redução

linear (P<0,01) da profundidade de criptas e aumento linear (P<0,01) da

relação altura de vilosidade/profundidade de cripta no duodeno dos leitões com

a inclusão de níveis crescentes de nucleotídeos.

Apesar dos resultados favoráveis encontrados por alguns autores

(ABREU et al., 2010; ANDRADE et al., 2011; PELÍCIA et al., 2010), ainda são

24

necessários mais estudos para esclarecer os modos de ação e os níveis ideais

deste aditivo na alimentação de leitões recém-desmamados.

3.4. ÁCIDOS ORGÂNICOS

Os ácidos orgânicos (ácidos graxos de cadeia curta) são constituintes

naturais de tecidos animais e de plantas, estando amplamente distribuídos na

natureza podendo, também, ser produzidos a partir da fermentação de alguns

microrganismos no trato gastrintestinal de suínos (PARTANEN; MROZ, 1999).

Contêm uma ou mais carboxilas em sua molécula, apresentando de um a sete

carbonos dissociados, sendo considerados ácidos fracos, podendo ser

encontrados na forma livre e em sais de potássio, cálcio e sódio (DIBNER;

BUTTIN, 2002).

Na indústria alimentícia, os ácidos orgânicos são utilizados há algumas

décadas como conservantes de alimentos, protegendo contra microrganismos

e aumentando a conservação de alimentos fermentados, como as silagens

(CANIBE et al., 2001), além de conferir odor, sabor e cor às bebidas e aos

alimentos de uma forma geral (MROZ, 2005). Na alimentação animal tem-se

explorado o uso de acidificantes em diferentes combinações e níveis, buscando

melhorar cada vez mais os índices produtivos. Na literatura são encontrados

trabalhos com resultados satisfatórios na digestibilidade das proteínas, dos

aminoácidos e da energia (BLANK et al., 1999; GABERT; SAUER, 1995), além

do seu efeito antimicrobiano sobre patógenos existentes no trato gastrintestinal

dos animais (HANSEN et al., 2007; WALSH et al., 2007).

Os ácidos orgânicos, na sua forma livre, são voláteis apresentando

sabor e odor muito forte, além de pouca solubilidade em água. Contudo, a

utilização destes aditivos na alimentação animal ocorre após o encapsulamento

das moléculas com coadjuvantes lipídicos, permitindo que estes ácidos não

volatilizem, não interferindo na palatabilidade e, consequentemente, no

consumo dos animais (MROZ, 2005). O processo de encapsulamento faz com

que os ácidos possam chegar ao intestino delgado sem que sofram uma prévia

hidrólise no estômago. Desta forma, o ácido poderá chegar intacto as partes

posteriores do trato digestório (duodeno, jejuno íleo e intestino grosso)

podendo promover a redução do pH intestinal, aumentando sua eficiência no

25

controle de microrganismos patogênicos que competem com o hospedeiro

pelos substratos digeridos (MROZ et al., 2000).

Para os ácidos orgânicos, quanto maior for a constante de dissociação

(K) menor será o pKa do ácido, sendo assim, maior será o poder acidificante

deste aditivo e, consequentemente, mais eficiente a inibição da atividade

microbiana. A forma não dissociada dos ácidos permite que estes adentrem o

citoplasma dos microrganismos através da membrana celular. No interior da

célula microbiana o ácido pode dissociar-se em cátions e prótons reduzindo o

pH citoplasmático, no qual até então é mantido em torno de 7,0, promovendo a

morte da célula do microrganismo por desnaturação da proteína e do DNA,

além de comprometer outros processos vitais (CHERRINGTON et al., 1991),

como transporte de substratos e fosforilação oxidava (VIOLA; VIEIRA, 2003).

A inibição de alguns microrganismos que habitam a microbiota intestinal

de suínos como a E. coli e a Salmonella, que competem com o animal pelos

nutrientes e, consequentemente, causa diversos problemas entéricos, é um

importante objetivo da utilização dos ácidos orgânicos. Alguns estudos têm

demonstrado o efeito antimicrobiano de ácidos orgânicos em combater

microrganismos patogênicos, diminuindo a mortalidade de leitões recém-

desmamados (CANIBE et al., 2001; PAPENBROCK et al., 2005). Knarreborg et

al. (2002), avaliando a eficiência de alguns ácidos orgânicos sobre a população

de coliformes observaram diminuição do crescimento destas bactérias, no qual

o ácido benzóico apresentou maior efeito quando comparado ao ácido

propiônico.

Blank et al. (2001), estudando a utilização de ácido fumárico em dietas

para suínos, observaram redução da atividade microbiana no intestino delgado,

verificado a partir das baixas concentrações de produtos da sua fermentação

como amônia, aminas, ácido láctico e lipopolissacarídeos (usados como

indicador do número de bactérias gram-negativas). Kasprowicz-Potocka et al.

(2009) observaram efeito modulador no padrão de AGV no intestino delgado de

suínos alimentados com formiato de sódio e com ácido benzóico. Os ácidos

orgânicos podem ter efeito direto na histologia do epitélio intestinal, uma vez

que produtos da fermentação microbiana como AGV estimulam a proliferação

de células intestinais (PARTANEN; MROZ, 1999). Owusu-Asiedu et al. (2003),

avaliando a adição de ácido fumárico em dietas para suínos, observaram maior

26

altura das vilosidades e maior relação altura de vilosidades/profundidade de

cripta do jejuno, podendo o ácido fumárico ter reduzido a colonização de

bactérias patogênicas no trato gastrintestinal dos animais.

Dentre os ácidos orgânicos estudados como substitutos dos

antimicrobianos na dieta de leitões recém-desmamados, destaca-se o butirato

de sódio (forma molecular C4H7O2Na) (Figura 1).

Figura 1. Fórmula molecular do butirato de sódio

Os benefícios da adição do butirato de sódio na alimentação animal

estão relacionados à modulação da microbiota intestinal (CASTILLO et al.,

2006), a maior absorção de água e sódio (BOND et al., 1976), além de

importante função reguladora na proliferação e na diferenciação de células

intestinais (SENGUPTA et al., 2006). Segundo Costa et al. (2011) o butirato de

sódio é considerado um possível substituto dos antimicrobianos promotores de

crescimento em dietas para leitões recém-desmamados.

3.5. EXTRATOS VEGETAIS

A utilização de extratos vegetais e plantas medicinais para o tratamento

de doenças e enfermidades é considerada uma prática milenar. Desde a Idade

Média, os árabes utilizavam os extratos de plantas e óleos essenciais na

conservação de alimentos, para embalsamamento de corpos, como anti-

inflamatórios e analgésicos locais (BAKKALI et al., 2008). Esses aditivos fazem

parte de uma classe de produtos como potenciais substitutos aos

antimicrobianos e, devido à preocupação da população por alimentos mais

saudáveis, vêm sendo utilizados em diversas pesquisas relacionadas à

alimentação animal. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a

27

melhor fonte para obtenção de drogas são as plantas medicinais (BRASIL,

2006).

Os óleos essenciais são produtos voláteis extraídos de plantas com

potencial medicinal, através do processo de destilação por arrastamento com

vapor de água ou destilação sob pressão. Estes são misturas altamente

complexas que podem conter inúmeras substâncias com composições

químicas variadas. A principal diferença entre óleo essencial e extrato vegetal é

o método de extração (LANGHOUT, 2005). Os extratos são preparados por

percolação e maceração, utilizando como solvente o etanol ou a água ou outro

carreador que posteriormente possa ser eliminado (ANVISA, 2005).

Estas plantas possuem diferentes mecanismos de defesa podendo ser:

mecânicas (espinhos, células pétreas, folhas com bordas cortantes) e as

químicas (substâncias que tornam as folhas, raízes e outras partes das plantas

indigeríveis, tóxicas ou impalatáveis) (OETTING, 2005). Atravez de técnicas

laboratoriais foi possível isolar princípios ativos presentes em diferentes fontes

vegetais. Segundo Martins et al. (2000) princípios ativos são componentes

químicos que podem estar presentes em diferentes partes das plantas, ou

áreas especificas, conferindo às plantas medicinais alguma atividade

terapêutica.

As substâncias ativas presentes em diferentes partes das plantas podem

ser classificadas de acordo com suas características físicas, químicas ou

biológicas. De acordo com Martins et al. (2000), glucosídeos, alcalóides,

saponinas, compostos fenólicos, mucilagem, terpenoides, flavonóides, taninos

e óleos essenciais são os principais princípios ativos produzidos pelas plantas.

Segundo a ANVISA (2005), os extratos vegetais devem conter os princípios

aromáticos, sápidos, voláteis e fixos correspondentes ao respectivo produto

natural. No entanto, o processo de interação das plantas com o meio ambiente

pode influenciar diretamente na composição e na qualidade dos extratos

vegetais, além dos métodos de extração que também podem influenciar na

qualidade do produto final.

Para os extratos vegetais, todas as moléculas são extraídas totalmente

(extrato bruto), não havendo interesse no isolamento específico de uma ou

mais substâncias. A presença de vários compostos em apenas um só produto

pode apresentar efeitos sinérgicos, conferindo aos extratos vegetais maior

28

vantagem quando comparados aos antimicrobianos tradicionais com apenas

um princípio ativo (KAMEL, 2000).

Os principais benefícios associados ao uso de extratos vegetais estão

relacionados com a melhora na palatabilidade da ração, no estímulo da

secreção de enzimas endógenas, na modulação da microbiota intestinal e na

redução de infecções subclínicas (LAUGHOUT, 2005). Segundo Kohlert et al.

(2000), os compostos presentes nos extratos vegetais são rapidamente

metabolizados e absorvidos no trato digestório dos animais, levando a acreditar

que haja um risco mínimo de acúmulo nos tecidos, tornando este aditivo

fitogênico uma alternativa aos antibióticos promotores de crescimento.

A atividade antimicrobiana é mais um dos efeitos relacionados ao uso

dos extratos vegetais, que é determinada pela quantidade de substância

necessária para inibir o crescimento de um determinado microrganismo

(OSTROSKY et al., 2008). O método mais utilizado e recomendado para

determinação da atividade antimicrobiana é o de microdiluição em placas, pois

esta metodologia possibilita maior número de repetições, aumentando a

confiabilidade do resultado (MENDES et al., 2011).

Yan et al. (2012), estudando a atividade antimicrobiana de extratos

vegetais de trigo, tomilho, cúrcuma, pimenta do reino e gengibre em dietas para

leitões recém-desmamados, concluíram que a mistura de extratos foi capaz de

diminuir a concentração de E. coli fecal e melhorar o desempenho dos leitões.

Huang et al. (2011), avaliando a atividade antimicrobiana de diversas plantas

chinesas como alternativas aos antibióticos, concluíram que a combinação de

extratos possibilitou diminuição na contagem de coliformes no cólon dos

leitões.

A atividade antimicrobiana de extratos vegetais e óleos essenciais deve-

se à capacidade de interação com a membrana celular do microrganismo,

promovendo desestabilização destas, através da alteração dos gradientes de

íons de Hidrogênio (H+) e Potássio (K+), provocando desnaturação e

coagulação das proteínas, resultando em perda do controle quimiosmótico da

célula afetada e, consequentemente, morte da bactéria (DORMAN; DEANS,

2000). A característica lipofílica, intrínseca aos extratos vegetais, é a

responsável pelo seu acúmulo na parede celular dos microrganismos e

posterior rompimento. As bactérias gram-negativas como E. coli e Salmonella

29

apresentam carácter hidrofílico devido a composição de sua membrana celular

(lipossacarídeos), formando uma barreira contra a permeabilidade de

substâncias hidrofóbicas como os extratos vegetais e óleos essências,

tornando estes microrganismos mais resistentes aos aditivos fitogênicos

(DORMAN; DEANS 2000).

Outra importante função dos extratos vegetais é seu efeito antioxidante

que está relacionado com a presença de compostos fenólicos, além de outros

compostos como terpenóides (presentes no carvacrol, eugenol e timol) e

flavonóides (presentes no tomilho e orégano).

Existem dois tipos de classificação para os antioxidantes: antioxidantes

primários, substâncias que interrompem a reação de oxidação lipídica através

da doação de hidrogênio (H+) ou elétrons aos radicais livres, transformando-os

em produtos mais estáveis e os antioxidantes secundários, compostos que

podem reduzir ou retardar a taxa de oxidação por hidroperóxidos (SHAHIDI;

NACZK, 2004). Os extratos vegetais retardam a oxidação dos constituintes

lipídicos presentes nos alimentos, aumentando a vida útil destes produtos. Na

indústria ainda é comum o uso de antioxidantes sintéticos como o BHT (butil

hidroxitolueno) e o BHA (butil hidroxianisol). Contudo, devido à possível

toxicidade destes e à demanda atual por produtos mais saudáveis, diversos

estudos têm sido desenvolvidos avaliando a adição de antioxidantes naturais

como alternativas mais saudáveis (HUANG et al., 2011; SELANI, 2010;

TRAESEL et al., 2011; YAN et al., 2012).

Henn et al. (2010), avaliando o potencial antioxidante do óleo essencial

de orégano em dietas para leitões recém-desmamados, concluíram que o

aditivo fitogênico é um excelente antioxidante, principalmente em inibir a

oxidação de ácidos graxos. Em outro estudo, no qual foi avaliado o efeito da

inclusão de flavonóides juntamente com mananoligossacarídeos na ração de

frangos de corte, foi observado menor oxidação da gordura da carcaça das

aves em comparação a outros aditivos (probióticos e antibióticos) (BATISTA,

2005). Outros trabalhos têm demonstrado efeito benéfico dos extratos vegetais

como antioxidantes em dietas para animais não-ruminantes (JANG et al., 2008;

WANG et al., 2006; WANG et al., 2008; ZHANG et al., 2009).

Outro efeito dos extratos vegetais está relacionado à maior eficiência na

digestão dos alimentos por proporcionar pH ideal e estimular maior síntese de

30

enzimas digestivas. Segundo Mellor (2000), os extratos vegetais podem

aumentar a produção de saliva e dos sucos gástricos e pancreáticos,

favorecendo a digestão dos alimentos. Wang et al. (2011) observaram que

plantas medicinais chinesas foram capazes de melhorar o metabolismo,

aumentar a secreção de sucos digestivos e a atividade de enzimas digestivas

em leitões. Huo et al. (2004) observaram aumento na digestibilidade da matéria

seca (MS) e melhora na conversão alimentar de frangos de corte alimentados

com dieta contendo mistura de plantas chinesas (Radix astragali, Radix

atractylodis, Radix codonopsis e Rhizoma smilacis glabrae). Yakhkeshi et al.

(2011) avaliaram os efeitos de ácidos orgânicos, probióticos e extratos vegetais

em dietas para frangos e observaram melhor desempenho e redução na

população de bactérias patogênicas do trato gastrintestinal das aves que

receberam a mistura dos três aditivos quando comparado àquelas que

receberam o tratamento antibiótico.

A utilização de extratos vegetais como promotores de crescimento na

alimentação de suínos tem gerado maior aceitação, dado à preocupação dos

riscos decorrentes da utilização de antibióticos na alimentação animal. No

entanto, é necessário maior aprofundamento em estudos relacionados à

composição química deste aditivo, aos modos de ação, aos princípios ativos e

níveis ideais de adição, buscando o uso seguro e racional deste produto.

31

4. ARTIGO CIENTÍFICO

Alternatives to antimicrobial growth promoters for weanling pigs challenged with E.

coli k99+

Santana, M.B.1; Costa, L.B.1*; Cantarelli, V.S.2; Melo, A.D.B.1; Cruz, D.R.1; Garbossa,

C.A.P2; Andrade, C.3

1Santa Cruz State University (Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC) – Dept. of Agricultural and Environmental Sciences (Depto. de Ciências Agrárias e Ambientais), Rod. Jorge Amado km 16 - Salobrinho - 45662-900 – Ilhéus, BA Bahia – Brazil.

32

[email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]; +55 (73) 3680-5262.

2Federal University of Lavras, Department of Animal Science (Universidade Federal de

Lavras, Departamento de Zootecnia), Caixa Postal 3037, CEP: 37200-000, Lavras –

MG Minas Gerais – Brazil. [email protected]; [email protected]; +55 (41)

9918-2442.

3University of São Paulo/"Luiz de Queiroz” College of Agriculture – Department of

Animal Science (Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de

Queiroz” – USP/ESALQ – Departamento de Zootecnia), C.P. 09 – 13418-900 –

Piracicaba, SP – Brazil. [email protected]; +55 (19) 3429-4135.

*Corresponding author: [email protected]

33

Abstract

An experiment was conducted to evaluate the effects of plant extracts mixture,

sodium butyrate and nucleotides on the performance, intestinal epithelial histology,

morphometry of organs and pH of the digestive contents of weanling pigs challenged

with E. coli K99+. A total of 90 commercial hybrid piglets were used; these piglets had

a average age of 21 days and average initial and final weights of 6.35 ± 0.34 and 17.15

± 2.08 kg, respectively. The piglets were distributed in a randomized complete block

design with five treatments, six replication per treatment and three animals per

experimental unit (two males and one female or two females and one male). The

treatments were: Control – basal diet; Antimicrobial – basal diet with 40 ppm colistin

sulfate; 1000 ppm – basal diet with 1000 ppm of a mixture of plant extracts + sodium

butyrate + nucleotides; 1500 ppm – basal diet with 1500 ppm plant extracts + sodium

butyrate + nucleotides; and 2000 ppm – basal diet with 2000 ppm plant extracts +

sodium butyrate + nucleotides. The additives were composed of 32% sodium butyrate,

2% to 3% nucleotides prepared from Saccharomyces cerevisiae yeast hydrolysis and

5% plant extracts, including 2% Glycyrrhiza glabra (sweet root), 1.5% Rosmarinus

officinalis (rosemary) and 1.5% Peumus boldus (boldo). The animals were deprived of

food and water for 3 h on the seventh day of the experiment (28 days old).

Subsequently, the piglets received 60 mL of a sodium bicarbonate solution at a

concentration of 1.4% (w/v) intragastrically to neutralize the gastric pH. After 30

minutes, the piglets were infected with E. coli K99+, at a concentration of 5.0 x 109

cfu/mL, and were given food and water ad libitum 2 h after infection. The experiment

lasted 35 days, and at the end, following a 12 h fast, one animal per pen (experimental

unit) was slaughtered to assess the intestinal epithelium histology, morphometry of the

organs and pH of the digestive contents. The selected slaughtered animal was the animal

34

whose live weight was closest to the animals’ average weight in each experimental unit.

The animals were weighed to assess the performance variables at the beginning of the

experiment, at day 14 and at day 35 of the experiment, quantifying the consumed feed

and the excess. No differences were found (P < 0.05) regarding the performance,

intestinal histology, morphometry of the organs and pH of the digestive contents

through the analysis of orthogonal polynomials or even by the contrasts of interest. In

general, colistin sulfate and the combination of plant extracts, sodium butyrate and

nucleotides were not effective in promoting improvement of the productive

characteristics of weanling pigs challenged with E. coli k 99+.

KEYWORDS: herbal extracts, nucleotides, nutrition, pigs, sodium butyrate

4.1. Introduction

In intensive pig farming, the post-weaning period is considered as the most

critical phase in a piglets life because different stressors affect these animals, giving

them a predisposition to enteric problems. Those problems are linked to the piglets

gastrointestinal tract immaturity, resulting in an incomplete digestion of proteins and

carbohydrates and thus providing a medium rich in substrates for the development of

pathogenic bacteria (Oetting et al., 2006).

In piglets, E. coli is mainly responsible for diarrhea, edema disease and

septicemia. However, the greatest economic losses in intensive pig production are

associated with the first two conditions, being diarrhea caused by strains of E. coli

responsible for morbidity and mortality in weanling pigs (Wilson and Francis, 1986).

Traditionally, antibiotics have been used in pig feed as growth promoters and in

the treatment of gastrointestinal infections to alleviate such enteric problems. However,

35

the possible bacterial resistance to antibiotics and presence of antibiotic residues in

animal manure led European Union ban on the use of antibiotics as growth promoters in

pig feed, starting in January 2006. Thus, new substitutes of these additives shall be

developed to ensure productivity in the pork production chain. These potential

substitutes include nucleotides, organic acids, plant extracts, enzymes, probiotics,

prebiotics and symbiotics.

The main benefits associated with the use of plant extracts are related to

improvement in palatability of the feed, stimulating the secretion of endogenous

enzymes, modulating the intestinal microbiota, reducing subclinical infections and

performance improvement (Ao et al., 2011; Huang et al., 2010; Langhout, 2005).

According Kohlert et al. (2000), the compounds present in plant extracts are rapidly

metabolized and absorbed in the digestive tract of animals, leading to believe that there

is a minimal risk of accumulation in tissues, so that these additives may be possible

alternatives for antibiotic growth promoter.

Although the antimicrobial effects of various plant extracts have been proven in

in vitro experiments (Kalemba and Kunicka, 2003; Lambert et al., 2001), their

mechanisms of action are still unknown. According to Costa et al. (2011) and Oetting et

al. (2006), the antimicrobial activity of extracts lies in their ability to disrupt bacterial

cells the alteration of membrane permeability. However, further studies are needed to

confirm this effect in vivo. Furthermore, plant extracts may supposedly promote other

effects, namely, antioxidant and anti-inflammatory effects (Huang et al., 2010;

Windisch et al., 2008).

Sodium butyrate is a salt derived from butyric acid, and its molecular formula is

C4H7O2Na. Initially, the main function of organic acids in pig feed was to maintain the

stomach pH and thereby improve nutrient digestion, promoting balance of the intestinal

36

microbiota (Roth and Kirchgessner, 1998). However, the organic-acid effect correlates

not only with a decrease in the gastric pH but also with a decrease in the dietary

buffering capacity, stimulation of the production of pancreatic secretions and reduced

colonization with pathogenic microorganisms, both in the feed and in the

gastrointestinal tract of animals (Knarreborg et al., 2002).

Nucleotides are intracellular compounds that are involved in numerous

metabolic processes and are essential for cell growth (Mateo et al., 2004). Nucleotides

act as precursors of deoxyribonucleic acids (DNA) and ribonucleic acid (RNA) and are

key sources of energy, especially in the form of ATP. The benefits of supplementing

with nucleotides may be related to improvement in histological features (Andrade et al.,

2011) and also to the growth of bifidobacteria, similar to that found in breast milk,

promoting improved intestinal health in piglets (Uauy, 1994).

However, results regarding the mechanisms of action of these additives and their

real effect on pig development are still inconsistent. The aim of the present study was to

evaluate the effects of plant extracts mixture, sodium butyrate and nucleotides on the

performance, intestinal epithelium histology, morphometry of the organs and pH of the

digestive contents of weanling pigs challenged with E. coli K99+.

4.2. Materials and Methods

The experiment was approved by the Ethics Committee on Animal Use

(Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA) of Santa Cruz State University

(Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC), Ilhéus – Bahia, protocol number

029/2009.

37

4.2.1. Animals and facilities

The experiment was conducted at the Swine Research Station (Centro

Experimental de Suínos - CES) of the Federal University of Lavras (Universidade

Federal de Lavras - UFLA) in Lavras, MG. The two nurseries where the animals were

kept have 56 metal pens, arranged in four groups of seven pens each. Each pen has an

area of 3.5 m2 including a feeder, a piglet nipple waterer and ancillary heating provided

by a brooder with 300 W incandescent light bulbs. Steel trays were placed below the

pens to measure the axcess with greater accuracy. The entire facility was previously

disinfected and whitewashed before starting the experiment.

A total of 90 commercial hybrid piglets were used. These piglets had average

age of 21 days, average initial weight of 6.35 ± 0.34 kg and average final weight of

17.15 ± 2.08 kg. The piglets were distributed according to a randomized complete block

design, with five treatments, six replication per treatment and three animals per

experimental unit (two males and one female or two females and one male). The

animals received water and feed ad libitum throughout the experimental period (35

days). The temperature was recorded daily in the morning and afternoon, with average

of 28.5 ºC for the maximum and 24 ºC for the minimum temperature.

4.2.2. Experimental diets

The experimental treatments were: Control – basal diet; Antimicrobial – basal

diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm – basal diet with 1000 ppm of a mixture of

plant extracts + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm – basal diet with 1500 ppm

plant extracts + sodium butyrate + nucleotides; and 2000 ppm – basal diet with 2000

ppm plant extracts + sodium butyrate + nucleotides. The additives (commercial product

38

- Auster Animal Nutrition Ltda) were composed of 32% sodium butyrate, 2% to 3%

nucleotides prepared from Saccharomyces cerevisiae yeast hydrolysis and 5% plant

extracts, including 2% Glycyrrhiza glabra (sweet root), 1.5% Rosmarinus officinalis

(rosemary) and 1.5% Peumus boldus (boldo). These additives were through a process of

microencapsulation to reduce the odor and/or flavor of these products in the feed to

avoid negatively affecting the piglets intake.

The experimental diets (Table 1) were isocaloric and isonitrogenous, formulated

to meet the requirements of piglets in the pre-initial (day 1 to day 14 of the experiment)

and initial (day 14 to day 35 of the experiment) phases of the experiment, as

recommended by Rostagno et al. (2005).

4.2.3. Animal infection

The inoculum was prepared with Escherichia coli K99+ provided by the Osvaldo

Cruz Foundation (Fundação Osvaldo Cruz - FIOCRUZ). A scoop of the sample from

FIOCRUZ was transferred to an Erlenmeyer flask containing 50 mL tryptic soy broth

(TSB) and incubated at 37 °C for 24 h. The growth curve of E. coli was determined to

prepare the inoculum; this curve was estimated by assessing the optical density at a

wavelength of 600 nm and a subsequent plate count (Tortora, 2005). Then, the exact

concentration of the inoculum was determined using the absorbance measured by a

spectrophotometer SP-22 (Biospectro) and the E. coli growth curve.

All the animals were deprived of food and water for 3 h on the seventh day of

the experiment (28 days old). Subsequently, the piglets received 60 mL of a sodium

bicarbonate solution at a concentration of 1.4% (w/v) intragastrically to neutralize the

gastric pH. After 30 minutes, the piglets were infected with E. coli K99+, at a

39

concentration of 5.0 x 109 cfu/mL, and were given food and water ad libitum 2 h after

infection.

4.2.4. Samplings and measurements

To assess the performance variables (daily feed intake, daily weight gain and

feed conversion), the animals were weighed at the beginning, at day 14 and at day 35 of

the experiment, quantifying the feed intake and the axcess. At the end of the

experiment, after fasting for 12 h, one animal per pen (experimental unit) was

slaughtered to assess the intestinal epithelium histology, morphometry of the organs and

pH of the digestive contents. The slaughtered animal was chosen according to live

weight as the animal whose weight was closest to the average weight of the animals in

each experimental unit.

Following slaughter, the abdominal cavity was opened by longitudinal incision,

and the digestive organs (stomach, jejunum and cecum) were removed to measure the

pH of their respective contents. Then, the empty stomach, liver and cecum were

weighed for the morphometric analysis. For the intestinal histology analyses, samples of

approximately 3 cm in length from the duodenum (removed at 15 cm from the pyloric

sphincter) and the jejunum (removed at 1.5 m from the ileocecal junction) were washed

with saline solution (NaCl, 0.9%) and fixed in buffered formalin (10.0%).

Subsequently, these samples were transported to the Histopathology Laboratory of the

Department of Veterinary Medicine, Santa Cruz State University (Universidade

Estadual de Santa Cruz – UESC), where they were embedded in paraffin and

microtomized to mount them on slides. Then, the villus height (VH) and crypt depth

40

(CD) ratio were measured on images taken with a light microscope (Olympus DP71)

then calculated relationVH:CD.

4.2.5. Statistical analysis

The data were submitted to analysis of variance using the PROC GLM of SAS

(Statistical Analysis System, 2001). The degrees of freedom of the factor level were

broken down into their individual components (linear, quadratic and cubic) by

orthogonal polynomials. Contrasts were also tested: C1 (Control treatment x

Antimicrobial treatment); C2 (Control treatment x mean 1000, 1500 and 2000 ppm) and

C3 (Antimicrobial treatment x mean 1000, 1500 and 2000 ppm) on all of the variables

using a significance level of 5%.

4.3. Results

4.3.1. Performance preinfection 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day

Growth performance preinfection and postinfection was not affected by dietary

treatment (Table 2).

4.3.2. Performance from day 1 to day 14

The piglets’ live weight at day 14 (P14), average daily feed intake (ADFI),

average daily gain (ADG) and feed conversion (FC) were not affected (P > 0.05) by the

treatments (Table 3) during the experimental period from day 1 to day 14.

41


The piglets’ live weight at day 35 (P35), ADFI, ADG and FC were not affected

(P > 0.05) by the treatments (Table 4) during the experimental period from day 1 to day

35.

4.3.4. Intestinal epithelium histology

The piglets’ intestinal epithelium histology was not affected (P > 0.05) by the

treatments (Table 5).

4.3.5. Morphometry

The piglets’ organ morphometry was not affected (P > 0.05) by the treatments.

However, Antimicrobial showed an increase of 11.86% compared with Control in the

relative liver weight (Table 6).

4.3.6. pH of the digestive contents

The pH of the digestive contents of the piglets was not affected (P > 0.05) by the

treatments (Table 7).

4.4. Discussion

4.4.1. Performance preinfection 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day

42

Though beneficial effects faced by different studies on the benefits of plant

extracts (Czech et al., 2009; Kim et al., 2010; Windisch et al., 2008) organic acids (Piva

et al., 2002; Zanelato et al., 2008) nucleotides (Yu et al., 2002) on performance, no

effects were observed for present experiment.

Bhandari et al. (2008), who found no difference in the performance of piglets

infected with E. coli K88+ according author in this experiment, the level of disease

induced by the E. coli challenge model occurred within a 24- to 48-h period, and by d

14 postinfection the animals were fully recovered. Also find no differences in intestinal

pH, plasma urea nitrogen, intestinal ammonia, and VFA or in intestinal villus

morphology. These criteria were measured to provide an indication of the effect of feed

additives on intestinal health. However, these measures may be considered an index of

recent events in the gut and are not necessarily good indicators of past infections, unless

they were severe (Nagy and Fekete, 2005).


The data from this study are consistent with those found by Bhandari et al.

(2008), who found no difference in the performance of piglets infected with E. coli

K88+ use of blood plasma, probiotics and organic acids as alternatives to feed

antibiotics. Botsoglou et al. (2002b) also found no improvement in the performance of

supplemented animals compared to those fed the control diet, free of any growth

promoter, while studying two levels of essential oil (50 and 100 mg/kg feed) added to

broiler feed.

Conversely, Abreu et al. (2010) found that a treatment consisting of swine

plasma and nucleotides enabled greater daily weight gain and daily feed intake than the

43

negative control treatment while studying nucleotides, glutamine and swine plasma as

alternatives to antibiotics. Carlson and Veum, (2001) found that piglets supplemented

with yeast extract showed higher growth than those fed a diet containing blood plasma.

In the literature, there is great disagreement regarding the effects of plant

extracts, organic acids and nucleotides on piglet performance. Some studies show

results favorable to the inclusion of such supplements (Oetting et al. 2006; Yan et al.

2012), and others show no effect (Botsoglou et al., 2002b; Cross et al., 2003; Utiyama

et al., 2006).

Plant extracts, sodium butyrate and nucleotides added together to the

experimental diets did not improve the piglets' performance during the evaluation

period. A basal diet composed of quality and highly digestible ingredients is believed to

limit the development of pathogenic bacteria in the intestinal tract and, consequently,

would hinder the effect of additives in providing improved animal performance (Lee et

al., 2003).

The aim of infection with E. coli in the present study was to alter the

experimental conditions to approximate those found under commercial conditions,

allowing the growth-promoting additives to express their potential as performance

enhancers. However, the piglets fed the negative control diet showed similar

performance compared to the animals receiving the other treatments. The absence of

challenges in the experimental facilities or the use of a complex and highly digestible

diet may have contributed to the lack of effect of the growth-promoting additives.


These results from the present study agree with those found by Fukayama et al.

(2005), who also observed no difference between treatments regarding ADFI, ADG and

44

FC from day 1 to day 42 when studying extract as an additive in broiler feed. Similarly,

Weber and Kerr (2007) also found no difference when studying the effect of sodium

butyrate on the performance of newly weaned piglets.

In contrast, there are studies in the literature showing the positive effect on the

performance of piglets resulting from diet supplementation with plant extracts (Huang

et al., 2011; Yan et al., 2012), organic acids (Piva et al., 2002; Manzanilla et al., 2006)

or nucleotides (Carlson and Veum, 2001).

Kiarie et al. (2011) found an increased daily feed intake of piglets infected with

E. coli K88+ and fed Saccharomyces cerevisiae yeast extract in contrast to those fed the

control diet. In another study, Muhammad et al. (2012) found that a treatment with 6 g

of an herbal mixture diluted with water resulted in a greater weight gain of animals than

the negative control treatment, when assessing the anticoccidial effect of different

sources of plant extracts in broilers challenged with sporulated oocysts.

The beneficial effects of plant extracts may be linked to increased digestive

secretions, immune stimulation, antimicrobial and anticoccidial activity as well as

antioxidant and antiviral properties (Yan et al., 2012).

The K99+ antigen found in Escherichia coli strains is responsible for causing

diarrhea in piglets in calves and lambs. The binding of antigens to the animals’

intestinal mucosa occurs through the expression of the active glycolipid receptors found

in enterocytes. Teneberg et al. (1990), when studying the expression of active glycolipid

receptors in the intestinal mucosa of 3-day-old newborn piglets and adult pigs, only

detected the expression of these receptors in younger animals.

In the present experiment, the challenge provided to animals using E. coli K99+

was ineffective because it failed to impair the piglets’ performance. A possible

explanation for this lack of E. coli-induced negative effects is the decreased expression

45

of active glycolipid receptors in the piglets’ intestinal mucosae, hindering bacterial

colonization in the gastrointestinal tract, because the piglets were infected at 28 days of

age, when their digestive tract is still in a developmental stage. In recent decades,

antibiotics have been used in pig diets as growth promoters due to their antimicrobial

effect. However, this effect is highly dependent on the state of animal health and the

health and safety conditions of the herd (Chesson, 1994; Mateo et al., 2006) in addition

to the quality and digestibility of the feed ingredients (Costa et al., 2011).

Costa et al. (2007) found a better FC in piglets that were fed a combination of

two antimicrobials than in those fed the other treatments while studying the

supplementation of newly weaned piglets’ diet with extracts of cloves, oregano and

antibiotics (75 ppm colistin sulfate + 75 ppm tiamulin). In another experiment, Oetting

et al. (2006) found improvements in the P35, ADFI and ADG of piglets receiving an

antimicrobial treatment consisting of 50 ppm zinc bacitracin + 50 ppm olaquindox + 50

ppm colistin sulfate in contrast to those that received the control treatment or a

treatment with increasing levels of plant extracts. In the present study, another possible

explanation for the lack of improvement in the performance of the animals from the

positive control treatment relative to the negative control may result from the low

concentration of colistin sulfate or the non-combination of antimicrobials in the piglets

diet because the combination or increased levels of antimicrobials provide improved

performance in commercial conditions. Antimicrobials may interfere with animal

metabolism and control subclinical diseases, thereby promoting improved efficiency in

the use of nutrients from food, with a significant effect on animal performance (Menten,

1995).

46

4.4.4. Intestinal histology

In the post-weaning period, there is usually intestinal villous atrophy, given the

higher rate of epithelial peeling caused by solid feed intake, adhesion of pathogenic

bacteria to enterocytes and toxin production (Oetting et al., 2006).

The results of the present study corroborate those found by Abreu et al. (2010),

who found no differences in the duodenum and jejunum regarding VH, CD and VH:CD

while assessing the effects of glutamine, nucleotides and swine plasma in feeds for

weaned piglets. Oetting et al. (2006) also found no differences between treatments in

the duodenum and jejunum regarding VH and CD while studying the effect of

antibiotics and plant extracts on piglets’ intestinal morphology at 56 days of age.

In another study, Demir et al. (2003) found a decrease (P < 0.05) in the CD of

broilers fed thyme in contrast to those fed the control treatment. While studying

different concentrations of nucleotides in feeds for recently weaned piglets, Andrade et

al. (2011) found a linear decrease (P < 0.01) in CD and a linear increase (P < 0.01) in

VH:CD in the piglets’ duodenum with the inclusion of increasing levels of nucleotides.

The positive effects of additives on the piglets’ intestinal histology may be

related to the decreased turnover rate of mature cells from the intestinal epithelium,

promoting decreased turnover of enterocytes and, thereby, maintaining their increased

integrity. This process leads to an increased production of enzymes, improved feed

digestion and, consequently, an increased absorption of nutrients (Cera et al., 1988).

Short-chain fatty acids, especially sodium butyrate, have been linked to

intestinal development by stimulating epithelial cells and promoting further

development of intestinal villi (Costa et al., 2011). However, Biagi et al. (2006) found

no difference in acetic, propionic, butyric and n-butyric acid synthesis in the jejunum,

47

ileum and cecum of animals, thereby showing no effect on the intestinal epithelium

morphology, while studying pig-feed supplementation with levels of gluconic acid.

According to these authors, a possible reason for the lack of a gluconic-acid effect on

these animals’ intestinal morphology may be their age because the tissue samples were

collected at the end of the experiment, six weeks after weaning, from animals with a

more-developed digestive system.

4.4.5. Morphometry

The current experimental results agree with those found by Oetting et al. (2006),

who found no difference in the relative weight of the liver, empty stomach and empty

cecum while studying different levels of plant extracts in weanling pigs’ feed. Andrade

et al. (2011) also found no difference in the morphometry of the stomach, liver and

pancreas of newly weaned piglets while studying treatment with nucleotide levels in

substituted of antibiotics.

Conversely, Bhandari et al. (2008) noted a higher relative liver weight of piglets

infected with E. coli K88+ that received a combination of additives (blood plasma +

probiotics + organic acids) in contrast to the control-treatment piglets.

In the present study, the animals receiving antimicrobial treatment showed,

numerically, an increased relative liver weight. The enlarged liver may be indicative of

this organ’s increased activity in the digestive process, leading to an increase in its size.

According Utiyama et al. (2006), the animal's metabolism can be enhanced by using

antimicrobials, promoting increased cytosolic enzyme activity with incorporation into

liver proteins by the activation of amino acids and, consequently, affecting animal

48

performance. However, in the current experiment, no increase was found in the live

weight of the animals that received antimicrobial treatment at day 35 of the experiment.

4.4.6. pH of the digestive contents

The current experimental results agree with those some studies, wherein

supplementing the piglets’ feed with plant extracts (Costa et al., 2011; Wang et al.,

2011) or organic acids (Biagi et al., 2007) had no effect on the pH of the digestive

contents of the stomach, jejunum and cecum. Conversely, Manzanilla et al. (2004)

found an increase in the pH of the stomach contents of weanling pigs fed formic acid or

plant extracts in comparison to the control treatment. Risley et al. (1992) found a

decrease in gastric pH in treated animals compared to animals without additives in their

feed while using organic acids in the diet of newly weaned piglets.

Costa et al. (2011) also found no changes in the pH of the stomach, jejunum and

cecum contents of weanling pigs fed phytogenic additives or sodium butyrate.

According to these authors, a possible explanation for the lack of change in the pH of

digestive contents could be the buffering capacity of the feed. Patience and Wolynetz

(1990) defined the buffering capacity as the amount of HCl needed to lower the pH

down to 3 to 4, depending on the mineral and protein content found. The basal diet for

this experiment consisted of kaolin clay (mineral), protein sources and other sources of

minerals, possibly increasing the buffering capacity of the feed and precluding pH

variation in the contents of such organs.

49

4.5. Conclusion

The combination of plant extracts, sodium butyrate and nucleotides or colistin

sulfate did not yield improvements in performance, changing the pH of the digestive

contents or affecting the morphometry of the organs and the intestinal epithelium

histology of weanling pigs challenged with E. coli K99+ and fed with complex and

highly digestible diets.

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Ingredients (%) Pre-Initial Diet Initial Diet

(day 1 to day 14) (day 14 to day 35) Corn 48.88 52.35 Soybean meal (46%) 27.10 21.94 Milk product1 15.27 5.60 Micronized soybean 1.57 6.86 Soybean oil 1.11 2.56 Sugar 1.11 1.01 L-Lysine.HCl (78%) 0.77 0.31 DL-Methionine (99%) 0.18 0.03 L-Threonine (98,5%) 0.37 0.07 L-Tryptophan (98%) 0.08 0.02 Dicalcium phosphate 1.99 1.43 Limestone 0.85 0.67 Common salt 0.41 0.35 Vitamin supplement2 0.05 0.05 Mineral supplement3 0.05 0.05 Kaolin and/or growth promoter4 0.20 6.69 Calculated Values Metabolizable energy (kcal/kg) 3363 3270 Crude protein (%) 19.76 17.92 Calcium (%) 0.98 0.72 Total phosphorus (%) 0.75 0.62 Digestible lysine (%) 1.52 1.08 Digestible threonine (%) 0.96 0.62 Digestible tryptophan (%) 0.26 0.18 Digestible methionine (%) 0.43 0.28 Lactose (%) 10.92 4.00

1Commercial product, Prius L68 – Auster Animal Nutrition Ltda. 2Amount per kg of feed: vit. A – 11.500 UI; vit. D3 – 5.850 UI; vit. E – 45 UI; vit. K3 – 3 mg; thiamine – 1.8 mg; riboflavin – 5.1 mg; pyridoxine – 3.5 mg; vit. B12 – 24 mcg; folic acid – 0.82 mg; pantothenic acid – 18 mg; niacin – 37.5 mg; biotin – 0.14 mg; selenium – 0.35 mg; ethoxyquin – 0.042 mg. 3Amount per kg of feed: manganese – 60 mg; zinc – 150 mg; iron – 100 mg; copper – 10 mg; iodine – 1.2 mg. 4Growth promoter; Commercial Product, Auster Animal Nutrition Ltda.

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Table 2 - Means of initial live weight (P1), live weight at day 14 (P14), average daily feed intake (ADFI), average daily gain (ADG) and feed conversion (FC) for the period preinfection from 0 to 7 day and postinfection 7 to 14 day the experiment

Trectments1 Contrasts2

Variable Control Antimicrobial 1000 ppm

1500 ppm

2000 ppm

C1 C2 C3 SE3

Initial BW (kg)

6.36 6.35 6.35 6.35 6.36 - - - -

7 day BW (kg)

7.32 7.14 7.17 7.14 7.08 0.26 0.15 0.93 0.08

14 day BW (kg)

9.10 8.94 8.96 9.03 8.79 0.48 0.35 0.94 0.09

ADG (g)

Preinfection, d 0 to 7

138 113 118 114 123 0.28 0.31 0.77 0.01

Postinfection, d 7 to 14

254 257 256 270 244 0.89 0.89 0.98 0.01

ADFI (g)


180 154 163 187 134 0.31 0.37 0.71 0.01


457 446 458 450 455 0.69 0.91 0.70 0.01

FC (g)


1.37 1.37 1.59 1.71 1.18 0.99 0.56 0.57 0.08


1.81 1.74 1.78 1.68 1.92 0.54 0.89 0.54 0.04

1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.

3Pooled standard error.

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Table 3 - Means of initial live weight (P1), live weight at day 14 (P14), average daily feed intake (ADFI), average daily gain (ADG) and feed conversion (FC) for the period from day 1 to day 14 of the experiment

Variables Treatments1 Contrasts2

SE3

Control Antimicrobial 1000 ppm

1500 ppm

2000 ppm

C1 C2 C3

P1 (kg) 6.36 6.35 6.35 6.35 6.36 - - - -

P14 (kg) 9.10 8.94 8.96 9.03 8.79 0.48 0.35 0.94 0.085

ADFI (g) 318 298 310 318 302 0.34 0.60 0.51 0.007

ADG (g) 196 185 187 192 173 0.51 0.38 0.94 0.006

FC 1.63 1.63 1.68 1.66 1.77 0.96 0.35 0.31 0.029 1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.


Table 4 - Means of initial live weight (P1), live weight at day 35 (P35), average daily feed intake (ADFI), average daily gain (ADG) and feed conversion (FC) for the period from day 1 to day 35 of the experiment

Variables Treatments1 Contrasts2 SE3


1500 ppm

2000 ppm

C1 C2 C3

P1 (kg) 6.36 6.35 6.35 6.35 6.36 - - - -

P35 (kg) 17.19 16.76 17.31 17.49 16.69 0.58 0.53 0.97 0.23

ADFI (g) 591 544 589 618 542 0.30 0.30 0.86 0.01

ADG (g) 309 294 315 318 285 0.50 0.52 0.82 0.01

FC 1.92 1.82 1.87 1.94 1.93 0.30 0.22 0.96 0.03 1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.


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Table 5 - Mean villus height (VH, μm), crypt depth (CD, μm) and the ratio of villus height:crypt depth (VH: CD) in the duodenum and jejunum of the piglets according to treatments

Variables

Treatments1 Contrasts2 SE3


1500 ppm

2000 ppm

C1 C2 C3

Duodenum VH (μm) 224.72 221.24 227.27 192.49 200.27 0.48 0.16 0.56 11.80 CD (μm) 97.48 94.50 81.20 94.72 73.09 0.86 0.40 0.29 5.14 VH:CD 2.24 2.78 2.92 2.06 2.83 0.17 0.51 0.31 0.11 Jejunum VH (μm) 201.76 197.02 223.75 178.74 209.35 0.75 0.57 0.89 5.17 CD (μm) 87.16 83.64 95.6 79.23 83.36 0.76 0.85 0.90 3.52 VH:CD 2.47 2.43 2.40 2.29 2.60 0.91 1.00 0.88 0.09



Table 6 - Mean live weight at day 35 (P35) and mean relative weights (percentage of live weight) of the stomach, liver and cecum, according to the treatments

Variables Treatments1 Contrasts2

SE3 Control Antimicrobial

1000 ppm

1500 ppm

2000 ppm

C1 C2 C3

P35 17.19 16.76 17.31 17.49 16.69 0.58 0.53 0.97 0.23 Empty stomach (%)

0.71 0.72 0.74 0.79 0.78

0.17 0.93 0.08 2.47

Liver (%) 2.23 2.53 2.26 2.38 2.39 0.35 0.24 0.99 8.88 Empty cecum (%)

0.21 0.22 0.21 0.19 0.22

0.21 0.76 0.07 1.01



58

Table 7 - pH values of the stomach, jejunum and cecum contents

Organs Treatments1 Contrasts2

SE3 Control Antimicrobial

1000 ppm

1500 ppm

2000 ppm

C1 C2 C3

Stomach 1.34 1.58 1.77 1.54 1.34 0.52 0.92 0.50 0.12

Jejunum 6.69 6.14 6.16 6.45 6.68 0.14 0.33 0.40 0.12

Cecum 6.10 5.98 6.28 6.09 6.08 0.58 0.35 0.77 0.07 1Control: basal diet; Antimicrobial: basal diet with 40 ppm colistin sulfate; 1000 ppm: basal diet with 1000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides; 1500 ppm: basal diet with 1500 of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides and 2000 ppm: basal diet with 2000 ppm of a combination of plant extract + sodium butyrate + nucleotides. 2C1: Control X Antimicrobial; C2: Control X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm; C3: Antimicrobial X mean of 1000, 1500 and 2000 ppm.


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66

APÊNDICES

67

APÊNDICE A - Peso vivo (kg) dos animais ao 1º, 14º e 35º dia do período experimental, considerando a média da unidade experimental

Dias de experimento Bloco

Tratamentos1

Controle Antimicrobiano 1000 ppm

1500 ppm

2000 ppm

1 6,91 6,89 6,85 6,83 6,90 2 6,62 6,62 6,63 6,64 6,66

1° dia 3 6,36 6,36 6,36 6,35 6,37 4 6,25 6,26 6,26 6,26 6,25 5 6,06 6,05 6,06 6,05 6,05 6 5,95 5,92 5,94 5,99 5,94

Média 6,36 6,35 6,35 6,35 6,36

1 9,71 9,02 9,82 9,27 9,11 2 8,70 9,36 8,28 8,99 9,27

14° dia 3 8,93 9,08 9,01 9,20 8,36 4 9,71 9,49 9,36 9,62 8,44 5 8,97 8,21 8,25 8,28 8,75 6 8,60 8,49 9,07 8,82 8,80

Média 9,10 8,90 9,00 9,00 8,80

1 18,13 18,81 19,26 17,11 15,68 2 16,11 16,95 16,13 18,13 17,33

35° dia 3 16,49 17,35 17,05 17,50 15,29 4 19,38 17,69 18,68 18,39 17,46 5 16,18 16,77 15,93 16,73 17,81 6 16,87 12,97 16,79 17,10 16,57

Média 17,20 16,80 17,30 17,50 16,70 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo.

68

APÊNDICE B - Consumo diário de ração por leitão (g) nos períodos de 1 a 14 e

1 a 35 dias, considerando a média da unidade experimental

Dias de experimento

Tratamentos1

Blocos Controle Antimicrobiano 1000 ppm

1500 ppm

2000 ppm

1 0,35 0,27 0,34 0,31 0,28 2 0,26 0,34 0,21 0,3 0,33

1° ao 14° dia 3 0,30 0,31 0,30 0,35 0,28 4 0,39 0,33 0,37 0,37 0,33 5 0,29 0,25 0,29 0,26 0,28 6 0,33 0,30 0,34 0,32 0,30

Média 0,32 0,30 0,31 0,32 0,30

1 0,67 0,65 0,65 0,59 0,49

1° ao 35° dia 2 0,52 0,58 0,47 0,61 0,58 3 0,59 0,61 0,56 0,66 0,51 4 0,65 0,60 0,68 0,65 0,53 5 0,52 0,54 0,58 0,56 0,59 6 0,60 0,28 0,59 0,64 0,55


69

APÊNDICE C - Ganho diário de peso por leitão (g) nos períodos de 1 a 14 e 1 a 35 dias, considerando a média da unidade experimental

Dias de experimento Blocos

Tratamentos1


1500 ppm

2000 ppm

1 0,20 0,15 0,21 0,18 0,16 2 0,15 0,20 0,12 0,17 0,19

1° ao 14° dia 3 0,18 0,19 0,19 0,20 0,14 4 0,25 0,23 0,22 0,24 0,16 5 0,21 0,15 0,16 0,16 0,19 6 0,19 0,18 0,22 0,21 0,20

Média 0,20 0,19 0,19 0,19 0,17

1 0,32 0,34 0,35 0,29 0,21 2 0,27 0,30 0,28 0,33 0,30

1° ao 35° dia 3 0,29 0,31 0,31 0,32 0,25 4 0,38 0,33 0,35 0,35 0,29 5 0,29 0,31 0,28 0,30 0,34 6 0,31 0,18 0,31 0,32 0,30

Média 0,31 0,29 0,31 0,32 0,28 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo

70

APÊNDICE D - Conversão alimentar nos períodos de 1 a 14 e 1 a 35 dias, considerando a média da unidade experimental

Dias de experimento Blocos

Tratamentos1


1500 ppm

2000 ppm

1 1,77 1,77 1,61 1,80 1,79 2 1,72 1,72 1,79 1,76 1,78

1° ao 14° dia 3 1,62 1,58 1,60 1,74 1,99 4 1,57 1,45 1,67 1,52 2,09 5 1,38 1,60 1,87 1,61 1,46 6 1,72 1,63 1,53 1,56 1,49

Média 1,63 1,63 1,68 1,66 1,77

1 2,08 1,92 1,84 2,00 2,26

1° ao 35° dia 2 1,93 1,96 1,67 1,87 1,90 3 2,02 1,93 1,83 2,07 2,00 4 1,74 1,84 1,91 1,87 1,81 5 1,80 1,75 2,05 1,83 1,77 6 1,91 1,56 1,91 2,02 1,80


71

APÊNDICE E – Valores de altura de vilosidade (AV μm), profundidade de cripta (PC μm), relação altura de vilosidade:profundidade de cripta (AV:PC) dos animais abatidos ao final do período experimental

Tratamentos1 Bloco AV

Duodeno PC

Duodeno AV:PC

Duodeno AV

Jejuno PC

Jejuno AV:PC Jejuno

1 299,32 119,44 2,51 156,50 44,56 3,51

2 200,60 83,49 2,40 179,43 77,37 2,32

3 174,90 66,14 2,64 196,39 82,79 2,37

Controle 4 210,47 128,16 1,64 264,06 92,68 2,85

5 177,33 77,78 2,28 173,04 85,97 2,01

6 285,70 109,90 2,60 241,15 139,58 1,73

Média 224,72 97,49 2,35 201,76 87,16 2,47

1 394,05 144,60 2,73 198,01 69,58 2,85

2 327,74 95,82 3,42 210,28 69,67 3,02

3 196,89 55,98 3,52 229,47 104,12 2,20

Antimicrobiano 4 210,52 116,31 1,81 205,36 112,66 1,82

5 219,65 102,44 2,14 181,40 82,02 0,45

6 158,60 51,88 3,06 157,61 63,80 2,47

Média 221,24 94,50 2,78 197,02 83,64 2,14

1 386,46 148,02 2,61 238,83 90,28 2,65

2 198,52 52,93 3,75 229,18 112,53 2,04

3 235,04 97,44 2,41 211,81 96,64 2,19

1000 ppm 4 181,85 75,31 2,41 219,95 116,27 1,89

5 154,74 50,00 3,09 219,05 79,78 2,75

6 207,01 63,51 3,26 223,69 78,11 2,86

Média 227,27 81,20 2,92 223,75 95,60 2,40

1 262,87 100,32 2,62 168,64 73,77 2,29

2 155,93 66,20 2,36 185,99 75,31 2,47

3 189,88 88,02 2,16 174,15 90,86 1,92

1500 ppm 4 150,37 93,52 1,61 192,02 86,85 2,21

5 207,26 122,28 1,70 187,35 64,46 2,91

6 188,61 98,29 1,92 164,29 84,11 1,95

Média 192,49 94,77 2,06 178,74 79,23 2,29

1 193,15 66,46 2,91 204,31 90,16 2,27

2 239,15 92,68 2,58 192,62 91,53 2,10

2000 ppm 3 207,27 83,52 2,48 186,61 93,43 2,00

4 - - - - - -

5 163,72 72,69 2,25 217,51 77,68 2,80

6 198,07 50,14 3,95 245,73 64,00 3,84

Média 200,27 73,10 2,83 209,35 83,36 2,60 1Controle: dieta basal; Antimicrobiano: dieta basal + 40 ppm de sulfato de colistina; 1000 ppm: dieta basal + 1000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 1500 ppm: dieta basal + 1500 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo; 2000 ppm: dieta basal + 2000 ppm de uma combinação de extrato vegetal + butirato de sódio + nucleotídeo

72

APÊNDICE F - Pesos (kg) dos órgãos digestórios estômago, ceco e fígado e

peso vivo (kg) dos animais abatidos ao final do período experimental

Órgãos Blocos

Tratamentos1


1500 ppm

2000 ppm

1 0,12 0,15 0,14 0,11 0,13 2 0,12 0,13 0,12 0,13 0,15

Estômago vazio 3 0,13 0,13 0,13 0,12 0,12 4 0,14 0,12 0,13 0,16 0,15 5 0,11 0,11 0,12 0,14 0,15 6 0,13 0,11 0,14 0,13 0,13

Média 0,13 0,12 0,13 0,13 0,14

1 0,34 0,44 0,36 0,28 0,40 2 0,40 0,44 0,30 0,38 0,36

Ceco vazio 3 0,34 0,40 0,46 0,32 0,42 4 0,44 0,34 0,40 0,32 0,34 5 0,26 0,36 0,34 0,26 0,38 6 0,42 0,28 0,32 0,32 0,38

Média 0,37 0,38 0,36 0,31 0,38

1 0,42 0,49 0,45 0,39 0,44 2 0,40 0,42 0,40 0,41 0,46

Fígado vazio 3 0,42 0,45 0,41 0,38 0,43 4 0,55 0,44 0,39 0,42 0,39 5 0,28 0,39 0,32 0,42 0,42 6 0,32 0,41 0,40 0,38 0,41

Média 0,40 0,44 0,40 0,40 0,42

1 18,1 18,8 19,3 17,1 15,7 2 16,1 17,0 16,1 18,1 17,3

Peso vivo 3 16,5 17,4 17,1 17,5 15,3 4 19,4 17,7 18,7 18,4 17,5 5 16,2 16,8 15,9 16,7 17,8 6 16,9 13,0 16,8 17,1 16,6


73

APÊNDICE G - Valores de pH do estômago, do jejuno e do ceco

Órgãos Blocos

Tratamentos1


1500 ppm 2000 ppm

1 0,71 1,15 3,77 3,18 2,48 2 1,35 2,22 1,29 1,02 1,40

Estômago 3 1,21 1,74 1,47 1,00 0,97 4 2,06 1,66 1,30 1,35 0,97 5 1,35 1,15 1,18 1,11 1,39 6 1,33 1,55 1,60 1,55 0,82

Média 1,34 1,58 1,77 1,54 1,34

1 5,99 6,27 4,68 7,25 6,44 2 8,03 5,93 7,29 7,02 6,88

Jejuno 3 6,34 6,04 6,89 6,44 7,12 4 6,53 5,84 6,05 6,14 6,49 5 6,67 6,06 6,22 4,87 6,65 6 6,58 6,67 5,85 6,95 6,51

Média 6,69 6,14 6,16 6,45 6,68

1 5,91 6,42 5,76 5,80 5,91 2 5,90 5,25 6,09 5,55 6,36

Ceco 3 6,64 5,45 6,26 5,73 5,55 4 6,30 6,44 6,43 6,79 6,79 5 5,92 6,34 6,36 6,60 6,11 6 5,90 5,95 6,75 6,05 5,76


74

ANEXOS

75

NORMAS DA REVISTA LIVESTOCK SCIENCE

INTRODUCTION

Types of article

1. Original Research Articles (Regular Papers)

2. Review Articles

3. Short Communications

4. Position Papers

5. Technical Notes

6. Book Reviews

Original Research Articles should report the results of original research.

The material should not have been previously published elsewhere, except in a

preliminary form. They should not occupy more than 12 Journal pages.

Review Articles should cover subjects falling within the scope of the

journal which are of active current interest. Reviews will often be invited, but

submitted reviews will also be considered for publication. All reviews will be

subject to the same peer review process as applies for original papers. They

should not occupy more than 12 Journal pages.

A Short Communication is a concise but complete description of a limited

investigation, which will not be included in a later paper. Short Communications

may be submitted to the journal as such, or may result from a request to

condense a regular paper, during the peer review process. They should not

occupy more than 5 journal pages (approximately 10 manuscript pages)

including figures, tables and references.

Position Papers are informative and thought-provoking articles on key

issues, often dealing with matters of public concern. These will usually be

invited, but a submitted paper may also be considered for publication. They

should not occupy more than 12 Journal pages.

A Technical Note is a report on a new method, technique or procedure

falling within the scope of Livestock Science. It may involve a new algorithm,

computer program (e.g. for statistical analysis or for simulation), or testing

method for example. The Technical Note should be used for information that

cannot adequately incorporated into an Original Research Article, but that is of

sufficient value to be brought to the attention of the readers of Livestock

76

Science. The note should describe the nature of the new method, technique or

procedure and clarify how it differs from those currently in use if cannot be

incorporated. They should not occupy more than 5 Journal pages. Book

Reviews will be included in the journal on a range of relevant books which are

not more than two years old.

Ethics in publishing

For information on Ethics in publishing and Ethical guidelines for journal

publication

seehttp://www.elsevier.com/publishingethics and http://www.elsevier.com/ethica

lguidelines.

Policy and ethics

The work described in your article must have been carried out in

accordance with The Code of Ethics of the World Medical Association

(Declaration of Helsinki) for experiments involving

humanshttp://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html; EU

Directive 2010/63/EU for animal

experimentshttp://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_

en.htm; Uniform Requirements for manuscripts submitted to Biomedical

journals http://www.icmje.org. This must be stated at an appropriate point in the

article. Unnecessary cruelty in animal experimentation is not acceptable to the

Editors of Livestock Science.

Language (usage and editing services)

Please write your text in good English (American or British usage is

accepted, but not a mixture of these). Authors who feel their English language

manuscript may require editing to eliminate possible grammatical or spelling

errors and to conform to correct scientific English may wish to use the English

Language Editing service available from Elsevier's

WebShop http://webshop.elsevier.com/languageediting/ or visit our customer

support sitehttp://support.elsevier.com for more information.

Referees

77

Please submit, with the manuscript, the names, addresses and e-mail

addresses of three potential referees. Note that the editor retains the sole right

to decide whether or not the suggested reviewers are used.

PREPARATION

Article structure

Manuscripts should have numbered lines, with wide margins and double

spacing throughout, i.e. also for abstracts, footnotes and references. Every

page of the manuscript, including the title page, references, tables, etc., should

be numbered. However, in the text no reference should be made to page

numbers; if necessary, one may refer to sections. Avoid excessive usage of

italics to emphasise part of the text.

Manuscripts in general should be organised in the following order:

• Title should be clear, descriptive and not too long

• Abstract

• Keywords (indexing terms)

• Introduction

• Material studied, area descriptions, methods, techniques

• Results

• Discussion

• Conclusion

• Acknowledgment and any additional information concerning research grants,

and so on

• References

• Figure captions

• Figures (separate file(s))

• Tables (separate file(s))

Essential title page information

• Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval

systems. Avoid abbreviations and formulae where possible.

• Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous

(e.g., a double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation

78

addresses (where the actual work was done) below the names. Indicate all

affiliations with a lower-case superscript letter immediately after the author's

name and in front of the appropriate address. Provide the full postal address of

each affiliation, including the country name and, if available, the e-mail address

of each author.

• Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at

all stages of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that

phone numbers (with country and area code) are prov ided in addition to

the e-mail address and the complete postal address. Contact details must

be kept up to date by the corresponding author.

• Present/permanent address. If an author has moved since the work

described in the article was done, or was visiting at the time, a 'Present address'

(or 'Permanent address') may be indicated as a footnote to that author's name.

The address at which the author actually did the work must be retained as the

main, affiliation address. Superscript Arabic numerals are used for such

footnotes.

Abstract

A concise and factual abstract is required. The abstract should state

briefly the purpose of the research, the principal results and major conclusions.

An abstract is often presented separately from the article, so it must be able to

stand alone. For this reason, References should be avoided, but if essential,

then cite the author(s) and year(s). Also, non-standard or uncommon

abbreviations should be avoided, but if essential they must be defined at their

first mention in the abstract itself. The abstract should not be longer than 400

words.

Keywords

Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using

American spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts

(avoid, for example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only

abbreviations firmly established in the field may be eligible. These keywords will

be used for indexing purposes.

79

Nomenclature and units

Follow internationally accepted rules and conventions: use the

international system of units (SI). If other quantities are mentioned, give their

equivalent in SI. You are urged to consult IUB: Biochemical Nomenclature and

Related Documents: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/ for further information.

Authors and Editors are, by general agreement, obliged to accept the

rules governing biological nomenclature, as laid down in the International Code

of Botanical Nomenclature, the International Code of Nomenclature of Bacteria,

and the International Code of Zoological Nomenclature.

All biotica (crops, plants, insects, birds, mammals, etc.) should be identified by

their scientific names when the English term is first used, with the exception of

common domestic animals. All biocides and other organic compounds must be

identified by their Geneva names when first used in the text. Active ingredients

of all formulations should be likewise identified.

Math formulae

Present simple formulae in the line of normal text where possible and use

the solidus (/) instead of a horizontal line for small fractional terms, e.g., X/Y. In

principle, variables are to be presented in italics. Powers of e are often more

conveniently denoted by exp. Number consecutively any equations that have to

be displayed separately from the text (if referred to explicitly in the text).

Equations should be numbered serially at the right-hand side in parentheses. In

general only equations explicitly referred to in the text need be numbered.

The use of fractional powers instead of root signs is recommended. Powers of e

are often more conveniently denoted by exp. Levels of statistical significance

which can be mentioned without further explanation are *P< 0.05,**P< 0.01

and***P< 0.001.

In chemical formulae, valence of ions should be given as, e.g. Ca2+ , not

as Ca++. Isotope numbers should precede the symbols, e.g. 18O.

The repeated writing of chemical formulae in the text is to be avoided where

reasonably possible; instead, the name of the compound should be given in full.

Exceptions may be made in the case of a very long name occurring very

frequently or in the case of a compound being described as the end product of a

gravimetric determination (e.g. phosphate as P2O5).

80

Footnotes

Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively

throughout the article, using superscript Arabic numbers. Many wordprocessors

build footnotes into the text, and this feature may be used. Should this not be

the case, indicate the position of footnotes in the text and present the footnotes

themselves separately at the end of the article. Do not include footnotes in the

Reference list. Table footnotes Indicate each footnote in a table with a

superscript lowercase letter.

Artwork

Electronic artwork

General points

• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.

• Embed the used fonts if the application provides that option.

• Aim to use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times New

Roman, Symbol, or use fonts that look similar.

• Number the illustrations according to their sequence in the text.

• Use a logical naming convention for your artwork files.

• Provide captions to illustrations separately.

• Size the illustrations close to the desired dimensions of the printed version.

• Submit each illustration as a separate file.

A detailed guide on electronic artwork is available on our website:

http://www.elsevier.com/artworkinstructions

You are urged to visit this site; some excerpts fro m the detailed

information are given here.

Formats

If your electronic artwork is created in a Microsoft Office application

(Word, PowerPoint, Excel) then please supply 'as is' in the native document

format. Regardless of the application used other than Microsoft Office, when

your electronic artwork is finalized, please 'Save as' or convert the images to

one of the following formats (note the resolution requirements for line drawings,

81

halftones, and line/halftone combinations given below): EPS (or PDF): Vector

drawings, embed all used fonts. TIFF (or JPEG): Color or grayscale

photographs (halftones), keep to a minimum of 300 dpi.

TIFF (or JPEG): Bitmapped (pure black & white pixels) line drawings, keep to a

minimum of 1000 dpi. TIFF (or JPEG): Combinations bitmapped line/half-tone

(color or grayscale), keep to a minimum of 500 dpi.

Please do not:

• Supply files that are optimized for screen use (e.g., GIF, BMP, PICT, WPG);

these typically have a low number of pixels and limited set of colors;

• Supply files that are too low in resolution;

• Submit graphics that are disproportionately large for the content.

Color artwork

Please make sure that artwork files are in an acceptable format (TIFF,

EPS or MS Office files) and with the correct resolution. If, together with your

accepted article, you submit usable color figures then Elsevier will ensure, at no

additional charge, that these figures will appear in color on the Web (e.g.,

ScienceDirect and other sites) regardless of whether or not these illustrations

are reproduced in color in the printed version. For color reproduction in print,

you will receive information regarding the costs fr om Elsevier after receipt

of your accepted article. Please indicate your preference for color: in print or

on the Web only. For further information on the preparation of electronic

artwork, please see http://www.elsevier.com/artworkinstructions.

Please note: Because of technical complications which can arise by converting

color figures to 'gray scale' (for the printed version should you not opt for color

in print) please submit in addition usable black and white versions of all the

color illustrations.

Tables

Number tables consecutively in accordance with their appearance in the

text. Place footnotes to tables below the table body and indicate them with

superscript lowercase letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of

82

tables and ensure that the data presented in tables do not duplicate results

described elsewhere in the article.

References

References concerning unpublished data and "personal communications"

should not be cited in the reference list but may be mentioned in the text.

Reference style

Text: All citations in the text should refer to:

1. Single author: the author's name (without initials, unless there is ambiguity)

and the year of publication;

2. Two authors: both authors' names and the year of publication;

3. Three or more authors: first author's name followed by 'et al.' and the year of

publication. Citations may be made directly (or parenthetically).

Groups of references should be listed first alphabetically, then

chronologically. Examples: 'as demonstrated (Allan, 2000a, 2000b, 1999; Allan

and Jones, 1999). Kramer et al. (2010) have recently shown ....'

List: References should be arranged first alphabetically and then further sorted

chronologically if necessary. More than one reference from the same author(s)

in the same year must be identified by the letters 'a', 'b', 'c', etc., placed after the

year of publication.

Examples:

Reference to a journal publication:

Van der Geer, J., Hanraads, J.A.J., Lupton, R.A., 2010. The art of writing a

scientific article. J. Sci. Commun. 163, 51–59.

Reference to a book:

Strunk Jr., W., White, E.B., 2000. The Elements of Style, fourth ed. Longman,

New York.

Reference to a chapter in an edited book:

Mettam, G.R., Adams, L.B., 2009. How to prepare an electronic version of your

article, in: Jones, B.S., Smith , R.Z. (Eds.), Introduction to the Electronic Age. E-

Publishing Inc., New York, pp. 281–304.

83

Journal abbreviations source

Journal names should be abbreviated according to Index Medicus

journal abbreviations: http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html;

List of title word abbreviations: http://www.issn.org/2-22661-LTWA-

online.php; CAS (Chemical Abstracts Service):

http://www.cas.org/content/references/corejournals.

Video data

Elsevier accepts video material and animation sequences to support and

enhance your scientific research. Authors who have video or animation files that

they wish to submit with their article are strongly encouraged to include links to

these within the body of the article. This can be done in the same way as a

figure or table by referring to the video or animation content and noting in the

body text where it should be placed. All submitted files should be properly

labeled so that they directly relate to the video file's content. In order to ensure

that your video or animation material is directly usable, please provide the files

in one of our recommended file formats with a preferred maximum size of 50

MB. Video and animation files supplied will be published online in the electronic

version of your article in Elsevier Web products, including

ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. Please supply 'stills' with your

files: you can choose any frame from the video or animation or make a separate

image. These will be used instead of standard icons and will personalize the link

to your video data. For more detailed instructions please visit our video

instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions. Note: since

video and animation cannot be embedded in the print version of the journal,

please provide text for both the electronic and the print version for the portions

of the article that refer to this content.

Supplementary data

Elsevier accepts electronic supplementary material to support and

enhance your scientific research. Supplementary files offer the author additional

possibilities to publish supporting applications, high-resolution images,

background datasets, sound clips and more. Supplementary files supplied will

be published online alongside the electronic version of your article in Elsevier

84

Web products, including ScienceDirect:http://www.sciencedirect.com. In order

to ensure that your submitted material is directly usable, please provide the data

in one of our recommended file formats. Authors should submit the material in

electronic format together with the article and supply a concise and descriptive

caption for each file. For more detailed instructions please visit our artwork

instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions.

Submission checklist

The following list will be useful during the final checking of an article prior

to sending it to the journal for review. Please consult this Guide for Authors for

further details of any item.

Ensure that the following items are present:

One author has been designated as the corresponding author with

contact details:

• E-mail address

• Full postal address

• Phone numbers

All necessary files have been uploaded, and contain:

• Keywords

• All figure captions

• All tables (including title, description, footnotes)

Further considerations

• Manuscript has been 'spell-checked' and 'grammar-checked'

• References are in the correct format for this journal

• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice

versa

• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other

sources (including the Web)

• Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on

the Web (free of charge) and in print, or to be reproduced in color on the Web

(free of charge) and in black-and-white in print

• If only color on the Web is required, black-and-white versions of the figures are

also supplied for printing purposes

85

For any further information please visit our customer support site

at http://support.elsevier.com.