UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

MATUSALEM CAMPOS SANTOS

ANÁLISES CITOGENÉTICAS EM VARIEDADES COMERCIAIS DE

MELOEIROS (Cucumis melo L.)

ILHÉUS-BAHIA Fevereiro de 2016

MATUSALEM CAMPOS SANTOS

ANÁLISES CITOGENÉTICAS EM VARIEDADES COMERCIAIS DE

MELOEIROS (Cucumis melo L.)

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal

Área de Concentração: Melhoramento Genético e Biotecnologia Orientadora: Profª. Drª. Margarete Magalhães de Souza Co-orientador: Dr. Cláusio Ferreira de Melo

ILHÉUS-BAHIA Fevereiro de 2016

MATUSALEM CAMPOS SANTOS

ANÁLISES CITOGENÉTICAS EM VARIEDADES COMERCIAIS DE

MELOEIROS (Cucumis melo L.)

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal

Área de Concentração: Melhoramento Genético e Biotecnologia

APROVADA: 19 de fevereiro de 2016

_______________________________________________________ Dra. Margarete Magalhães de Souza

(Orientadora - UESC)

________________________________________________________

Dra. Janay Almeida dos Santos Serejo

(EMBRAPA)

________________________________________________________

Dra. Polliana Silva Rodrigues

i

Aos meus pais Maria Antônia e Valter Campos (in memoriam), pelo apoio e

amor incondicional. Agradeço pelos esforços que tiveram durante as adversidades

para a minha formação.

Dedico

À minha noiva Adriana Alves,

pelo companheirismo, incentivo,

paciência e compreensão.

Ofereço

ii

AGRADECIMENTOS

À Deus pela dádiva da vida e a Nossa Senhora por sempre interceder por mim.

À Universidade Estadual de Santa Cruz, em especial ao Programa de Pós

Graduação em Produção Vegetal.

À Professora Dra. Margarete Magalhães de Souza, pela confiança,

disponibilidade em me orientar, pelos ensinamentos transmitidos e apoio no

desenvolvimento deste trabalho.

Ao meu co-orientador Dr. Cláusio Antonio Ferreira de Melo por ter contribuído

com grande parcela na realização desse trabalho.

À Coordenadoria do Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela concessão da bolsa de estudos.

À Prefeitura Municipal de Camacã por ter concedido licença sem vencimentos

durante esse período.

Aos colegas de laboratório de melhoramento de plantas (LAMEP) Artur, Analú,

Gonçalo, Ohana, Rita Sanches, Rita Moreira, Vanessa, Viviane por toda ajuda no

laboratório.

À Dra. Josie Clovianee aos colegas Pedro Paulo e Manuella pelo auxílio e dicas

na parte final desse trabalho.

Ao Mestre e amigo Joedson pelas dicas em algumas análises estatísticas.

À Maurílio Lima e Adriana Bispo por proporcionar um convívio movido por

confiança e companheirismo durante todo meu mestrado.

Aos irmãos do Rosa Mística da Legião de Maria em Camacã pelas orações.

Aos meus amigos e familiares que ajudaram direta e indiretamente na realização

desse trabalho.

Obrigado!

iii

SANTOS, M. C., M.Sc. Universidade Estadual de Santa Cruz, fevereiro de 2016. Análises citogenéticas em variedades comerciais de meloeiros (Cucumis melo L.). Orientadora: Dra. Margarete Magalhães de Souza. Co-orientador: Dr. Clausio Ferreira de Melo.

RESUMO

O melão (Cucumis melo L.) é uma fruta originária das regiões tropicais e subtropicais

da África, sendo um representante de destaque econômico na família das

Curcubitáceas. Tem se destacado no Brasil, em especial na região Nordeste, devido

ao aumento na sua produção nos últimos anos. O meloeiro apresenta grande

variabilidade fenotípica observada principalmente em descritores voltados para a

qualidade do fruto e a características vegetativas. O objetivo do presente trabalho foi

realizar análises cariotípicas em oito variedades comerciais de meloeiros para o

estabelecimento da morfometria cromossômica, observação do padrão da

distribuição da heterocromatina rica em AT e GC e mapeamento físico para a

localização de sítios de DNAr 5S, DNA centromérico e telomérico. As sementes

foram germinadas a 28 °C. As radículas foram pré-tratadas com 8-hidroxiquinolina

por 2 horas em temperatura ambiente, estocadas a +8 °C por uma hora e fixadas em

solução Carnoy I durante 3 horas em temperatura ambiente. As lâminas foram

preparadas pela técnica de esmagamento em ácido acético 45% e mantidas a -20

ºC até a aplicação das técnicas citológicas. A coloração convencional foi realizada

como uso de Giemsa 2% para contagem do número cromossômico e análise

morfométrica. Para o bandamento fluorescente foram utilizados fluorocromos base

específicos CMA3 e DAPI. Para a FISH, foram utilizadas sondas de DNAr 5S,

centromérico e telomérico. As sondas foram obtidas via PCR com primers

específicos para os sítios acima citados. As sondas de DNAr e telomérico foram

marcadas com digoxigenina-11-dUTP via Nick translation e a sonda de DNA

centromérico foi marcada com biotina-16-dUTP via Nick translation. O número

cromossômico observado em todos os acessos foi 2n = 24, corroborando com

estudos anteriores realizados na espécie. As variedades analisadas apresentaram

cariótipos simétricos e com diferença significativa para o comprimento cromossômico

total e tamanho cromossômico médio dentro e entre as variedades. Blocos CMA3+

foram observados nas regiões terminais que coincidiram com os satélites, bem como

iv

nas regiões centroméricas e pericentroméricas mostrando que a região centromérica

é rica em GC. A citogenética molecular através da FISH constatou a presença de

dois sítios de DNAr 5S em cada variedade com posições variáveis no cromossomo,

diferenciando do padrão encontrado em algumas espécies do gênero Cucumis onde

apresentam localizações terminais e sinais relativamente grande como observado

em Cucumis metuliferus. O DNA centromérico revelou hibridações em regiões

terminais, subterminais, pericentroméricas e centroméricas, indicando um

reposicionamento centromérico após ocorrência de inversões durante processos

evolutivos. O DNA telomérico proporcionou a marcação dos sítios teloméricos em

todos os cromossomos das variedades analisadas, não havendo marcações

intersticiais aparentes em C. melo. Os resultados obtidos nesse trabalho constatam

que há variação cariotípica intraespecífica nas variedades comerciais de meloeiro

analisadas.

Palavras-chave: Melão, morfometria cromossômica, bandamento CMA/DAPI, FISH.

v

SANTOS, M. C., M.Sc. Universidade Estadual de Santa Cruz, fevereiro de 2016. Cytogenetic analysis in commercial varieties of melon (Cucumis melo L.). Advisor: Margarete Magalhães de Souza. Co advisor: Clausio Ferreira de Melo.

ABSTRACT

The melon (Cucumis melo L.) is a native fruit of the tropical and subtropical regions

of Africa, with an economic prominent representative in the cucurbits family. It has

excelled in Brazil, especially in the Northeast, due to increased production in recent

years. The melon has great phenotypic variability observed mainly in descriptors

focused on fruit quality and vegetative characteristics. The aim of this study was to

perform karyotype analysis in eight commercial varieties of melon for the

establishment of chromosome morphology, observation of the pattern of distribution

of rich heterochromatin in AT and GC and physical mapping to the location of 5S

rDNA sites, DNA centromeric and telomeric. The seeds were germinated at 28 °C.

The root tips were pretreated with 8-hydroxyquinoline for 2 hours at room

temperature, stored at +8 °C for one hour and fixed in Carnoy solution I for 3 hours at

room temperature. Slides were prepared by technique crushing in acetic acid 45%

and kept at -20 °C until application of cytologic techniques. Conventional staining

was performed using 2% Giemsa for counting the chromosome numbers and

morphometric analysis. For fluorescent banding were used fluorochromes specific

basis CMA3 and DAPI for FISH were used probes 5S rDNA, centromeric and

telomeric. The probes were obtained by PCR with primers specific for the sites

mentioned above. The rDNA and telomeric probes were labeled with digoxigenin-11-

dUTP by Nick translation and centromeric DNA probe was labeled with biotin-16-

dUTP by Nick translation. The chromosomal number observed in all access was 2n =

24, corroborating with previous studies conducted in the species. The analyzed

varieties showed symmetrical karyotype and significant difference to the total

chromosomal length and average chromosomal size within and between varieties.

Blocks CMA3+ were observed in the terminal regions which coincide with the

satellites, as well as in the centromeric and pericentromeric regions showing that the

centromeric region is rich in GC. Molecular cytogenetics by FISH noted the presence

of two sites of 5S rDNA in each variety with variable positions on the chromosome,

vi

differentiating the pattern found in some species of the genus Cucumis which have

terminal locations and relatively large signs as observed in Cucumis metuliferus. The

centromeric DNA revealed, hybridization in terminal regions, subterminal,

pericentomeric and centromeric, indicating a centromere repositioning after

occurrence of inversion during evolutionary processes. The telomeric DNA marked all

sites in all chromosomes of the varieties analyzed, with no apparent interstitial

markings in C. melo. The results of this work realize that there karyotype intraspecific

variation in the commercial varieties of melon analyzed.

Key-words: Melon, chromosome morphometry, banding CMA / DAPI, FISH.

vii

SUMÁRIO

RESUMO ................................................................................................................... iii

ABSTRACT ................................................................................................................. v

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11

2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 13

2.1 Família Cucurbitaceae Juss. e o gênero Cucumis L. ................................... 13

2.2 Origem e diversidade do meloeiro ............................................................... 16

2.3 Importância econômica ................................................................................ 20

2.4 Origem e importância da Citogenética em plantas........................................ 21

2.5 Estudos citogenéticos para o gênero Cucumis L. ........................................ 23

3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 24

3.1 Material vegetal ................................................................................................ 24

3.2 Preparação cromossômica .............................................................................. 25

3.3 Análise cariotípica ............................................................................................ 26

3.4 Bandamento fluorescente ............................................................................... 27

3.5 Citogenética molecular ..................................................................................... 27

4. RESULTADOS ...................................................................................................... 29

4.1 Análises citogenéticas clássicas ...................................................................... 29

4.1.1 Análise cariomorfológica ...................................................................................... 29

4.1.2 Análise com fluorocromos .......................................................................... 38

4.2 FISH com uso de sondas DNAr 5S, centroméricas e teloméricas ................... 39

5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 44

6 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 50

7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 51

11

1 INTRODUÇÃO

O gênero Cucumis L., um dos maiores da família Cucurbitaceae Juss., que

já incluiu 34 espécies (ALMEIDA, 2006), passou a ter 32 espécies de acordo com a

última revisão taxonômica (KIRKBRIDE, 1993), posteriormente apresentando 33

após a nova espécie Cucumis canoxyi ter sido descrita (THULIN; Al-GIFRI, 1994).

Incluso nas espécies com maior destaque dessa família, o melão (Cucumis melo L.)

compreende duas subespécies de acordo com a pilosidade do ovário, a C. melo ssp.

melo, com ovário piloso e a C. melo ssp. agrestis, com ovário ceroso (JEFREY,

1980). Essa espécie apresenta-se como uma planta polimórfica anual, herbácea,

dicotiledônea, gamopétala, diploide, possuindo um sistema radicular superficial com

poucas raízes adventícias, caule com crescimento rasteiro prostrado,

frequentemente com gavinhas de sustentação oriundas dos nós com gemas

(FONTES; PUIATTI, 2005), com meiose regular e fertilidade do pólen superior a 90%

(LOPES et al. 2003). O fruto é um pepônio de forma esférica a ovóide ou alongada,

com coloração variável e sementes com germinação epígea com temperaturas

ótimas para germinação entre 24-35°C (ALMEIDA, 2006).

O melão é originário da África, espalhando-se para a Índia e posteriormente

para outras regiões (SIMMONDS, 1976). Acredita-se que o centro de origem são as

regiões tropicais e subtropicais da África, difundindo-se dessa região para a Índia e

Ásia (SEYMOUR; McGLASSON, 1993). Essa cultura é bastante antiga onde há

evidências de que seu cultivo na Europa e no Oriente Médio tenha ocorrido por volta

de 2000 a 1500 a.C., e sua exploração resultou na formação de vários centros de

origem secundários, como a Índia, Irã, Turquia, China e as repúblicas asiáticas

(KARCHI, 2000).

O melão foi introduzido no Brasil pelos escravos no século XVI, porém, sua

expansão ocorreu só após sua reintrodução feita por imigrantes europeus na década

de 60 nas regiões Sul e Sudeste, mas com produção limitante devido as condições

ambientais (PRIORI et al. 2010). Foi na região Nordeste na década de 80 que o melão

encontrou condições climáticas favoráveis ao seu cultivo o ano todo, contribuindo

para alta produção e qualidade da fruta principalmente nos estados do Ceará, Rio

Grande do Norte, Bahia e Pernambuco (NAKAMEA, 2004). O Brasil que antes era

12

tido como um país importador de melão basicamente da Espanha para

abastecimento de seu mercado interno, passou a se destacar na produção desta

fruta nas últimas décadas e deixou o status de importador para ser exportador

(IBRAF, 2015). Desta forma, o processo de otimização no uso do solo e cultivares

mais adaptadas serviram de incremento na produtividade e consequentemente na

diminuição da abertura de novas fronteiras agrícolas.

Hoje é possível encontrar melão com diferentes formas, cores e aromas,

pois são cultivados em regiões diversas devido à grande variabilidade genética que

proporciona adaptação de diferentes tipos em diversas condições agronômicas

(DEULOFEU, 1997). Os principais tipos produzidos comercialmente pertencem a

dois grupos: inodoros ou aromáticos. No grupo dos inodoros, tem-se o melão

Amarelo ou Espanhol e o Pele de Sapo, ambos produzidos em escala comercial no

Brasil e pertencentes ao grupo dos aromáticos têm-se quatro tipos: Cantaloupe,

Charentais, Gália e Orange (SENAR, 2014).

Cucumis melo L. apresenta 2n = 2x = 24, com meiose regular e fertilidade do

pólen superior a 90% (LOPES et al. 2003). A análise citogenética no gênero

Cucumis revelou variação no número cromossômico de 2n = 14, 20, 24, 48 e 72

cromossomos (DANE; TSUCHIYA, 1976). O número básico de cromossomos é

variável: 7 (Cucumis sativus), 11 (Citrullus spp., Mormordica spp., Lagenaria spp.,

Sechium spp., e Trichosanthes spp.), 12 (Benicasa hispida, Coccinia cordifolia,

Cucumis spp., Praecitrullus fistulosus), 13 (Luffa spp.) e 20 (Cucurbita), sendo os

casos de poliploidia pouco frequentes (JEFFREY, 1990). Técnicas de bandamento

cromossômico realizadas em C. sativus possibilitaram a observação da distribuição

da heterocromatina constitutiva (CHEN et al., 1998). Já em C. melo, a aplicação da

hibridação in situ fluorescente evidenciou a localização de sítios de DNAr 45S, 5S e

o padrão de distribuição do DNA repetitivo CentM (LIU et al., 2010).

Mediante importância que o gênero Cucumis L. possui na família

Curcubitaceae, verifica-se poucos estudos citogenéticos, e estes direcionados a um

grupo reduzido de espécies. Investigações citogenéticas têm servido de base para

estudos filogenéticos, a exemplo dos que sugeriram espécies ancestrais de C. melo

subgen. Melo dando origem aos de C. melo subgen. Cucumis, através de processos

de fusão ou translocação não homóloga (TRIVEDI; ROY, 1970; SINGH, 1990). A

montagem de sequências do genoma de pepino (Cucumis sativus) foi favorecida

13

após a localização física de marcadores genéticos, provenientes da construção de

mapas citogenéticos moleculares (HARPER; CANDE, 2000).

O Brasil possui diversidade genética em nível de acessos e variedades

cultivadas de melão como os tipos Pele de sapo, Orange, Amarelo, entre outros,

com variabilidade morfológica entre elas. Tendo em vista o potencial econômico que

o desenvolvimento de cultivares melhoradas e padronizadas de C. melo podem

apresentar e, considerando-se que existem poucas análises de diversidade

intraespecíficas, abordagens filogenéticas e em especial para as informações

pertinentes à citogenética clássica, este trabalho tem como objetivo caracterizar

citogenéticamente variedades comerciais de melão, por meio de técnicas clássicas e

citomoleculares através da utilização da hibridação in situ fluorescente (FISH),

buscando registrar seus números cromossômicos haploides e diploides, e

apresentar dados cariomorfológicos visando impulsionar a pesquisa, subsidiando a

utilização desses recursos genéticos em futuros programas de melhoramento de

plantas.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Família Cucurbitaceae Juss. e o gênero Cucumis L.

A família Cucurbitaceae Juss. pertence ao clado Curcubitales de acordo com

a classificação filogenética molecular (ZHANG et al., 2006; APG III, 2009). As

cucurbitáceas ocorrem principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do

mundo, e poucas em regiões temperadas; a maioria das espécies são

extremamente sensíveis a temperaturas próximas de zero, sendo esse um fator

limitante para sua distribuição geográfica e área de cultivo; apresenta cerca de 118

gêneros e aproximadamente 950 espécies, fazendo com que seja uma das famílias

mais numerosa e heterogênea existente (JUDD et al., 2009; SCHAEFER; RENNER,

2011). Na região tropical da América são descritos 53 gêneros nativos e

aproximadamente 325 espécies (NEE, 2007; SCHAEFER; RENNER, 2011). No

Brasil, verifica-se aproximadamente 29 gêneros no qual estão inseridas 155

espécies (GOMES-KLEIN et al., 2013), e somente na região Nordeste é possível

encontrar cerca de 52 espécies e 22 gêneros (GOMES-KLEIN, 2006). O gênero

14

Cucumis pertence à família Cucurbitaceae, subfamília Cucurbitoideae e atualmente

está colocado na tribo Benincaseae (JEFFREY, 2005); é um dos gêneros mais

importantes dessa família em termos econômicos e inclui muitas hortaliças

cultivadas, como pepino, melão, maxixe, bem como as ornamentais cabaça,

abóbora, entre outros; o pepino e o melão se destacam entre as hortaliças mais

cultivadas do mundo (PITRAT et al., 1999).

De maneira geral, as cucurbitáceas são perenes ou anuais com elevada

plasticidade nos caracteres morfológicos, podendo ser herbáceas escandentes ou

prostradas, monoicas ou dioicas com presença de gavinhas não axilares

posicionadas ao lado da base do pecíolo formando com este um ângulo de 90°.

Apresentam folhas simples, palmatilobadas ou compostas; com inflorescências

geralmente racemosas ou de flor única, a maioria das espécies tem flores

unissexuais nas axilas das folhas e têm cinco pétalas brancas ou amarelas. Há cinco

sépalas em cada flor; flores masculinas têm até cinco anteras, muitas vezes

fundidas ou unidas de forma complexa e flores femininas geralmente com três

carpelos. O fruto é geralmente um pepônio, podendo ser capsular (Luffa), bacoide

ou apresentar cápsula carnosa a exemplo da Momordica charantia L.; as sementes

apresentam forma achatada (JEFFREY; TRUJILLO, 1992; NEE, 2007;

WUNDERLIN, 1978).

Várias espécies cultivadas pertencentes à família Cucurbitaceae possuem

grande importância econômica, principalmente pelo uso de seus frutos e sementes

comestíveis. Alguns frutos são utilizados na indústria farmacêutica como fitoquímicos

medicinais pela presença de compostos bioativos, outros são usados secos no

comércio como utensílios, componentes para instrumentos musicais, esponjas etc.

(BEZERRA et al. 2002; PECKOLT, 1941; PEREIRA et al. 2010). No Brasil existe

diversidade de espécies pertencentes a essa família e suas formas de introdução

ocorreram de maneira diferenciada, principalmente no que diz respeito as espécies

de maior importância agronômica como é o caso da abóbora (Cucurbita pepo L.),

pepino (Cucumis sativus L.), maxixe (Cucumis anguria L.), melancia [Citrullus

lanatus (Thumb.) Matsun & Nakai] e o melão (Cucumis melo L., Figura 1) sendo este

último introduzido no Brasil por várias rotas através dos escravos africanos e dos

imigrantes europeus, principalmente no sul e sudeste do Brasil (PRIORI et al., 2010).

15

Figura 1 Ilustração botânica de Cucumis melo L.

Fonte: https://s-media-cache-ak0.pinimg.com/736x/90/c9/8c/90c98c4d50d71f52bc75d8f8012aab0.jpg

16

2.2 Origem e diversidade do meloeiro

Os melões (C. melo) são considerados originários da África tropical onde há

indícios de que foram inicialmente introduzidos na Ásia e Oriente Médio, por volta de

2000 a 1500 a.C., e sua exploração como cultivo resultou na formação de distintos

centros de origem secundários nos territórios que hoje correspondem à Índia, Irã,

China, Turquia e Repúblicas asiáticas (BURGER et al., 2010; KARCHI, 2000). A

Índia é o território onde os melões cultivados apresentam maior variabilidade

genética, apesar de não ser considerada como centro primário de origem

(ALVAREZ, 1997). É possível encontrar melões silvestres numa vasta faixa que vai

da África até a Ásia, verificando-se até na Austrália e nas ilhas do Pacífico

(KIRKBRIDE, 1993). O melão é uma espécie diploide (2n = 2x = 24) muito

polimórfica e apresenta duas subespécies de acordo a com a pilosidade do ovário:

C. melo subgen. Agrestis, com ovário ceroso, e C. melo subgen. Melo, com ovário

piloso, tendo para cada uma, diferentes variedades botânicas (JEFREY, 1980;

PITRAT et al., 1999).

Há registros do cultivo de melões em pinturas egípcias datadas de 2500

a.C., chegando a ser citado no antigo testamento da bíblia como um dos alimentos

consumido pelo povo judaico durante a travessia do deserto (CEAGESP, 2011). O

registro mais antigo de sua domesticação é no Egito, entre 2.000 a 2.700 a.C.

(ALMEIDA, 2006). Fatos evidenciam que trezentos anos após o inicio da era Cristã,

o melão já era uma fruta bastante difundida na Itália, sendo introduzido na França

por volta do Século XV. Nas Américas, esta hortaliça foi introduzida por intermédio

de Cristóvão Colombo, navegador e explorador, responsável por liderar a frota que

alcançou o continente americano; a fruta passou a ser utilizada pelos indígenas e se

espalhou rapidamente pelo continente (McCREIGHT et al., 1993). No Brasil, a

introdução foi feita pelos escravos africanos e imigrantes europeus e o Estado do

Rio Grande do Sul foi, possivelmente, o seu primeiro centro de cultivo no país. Foi

nessa região com diferentes variedades tradicionais que o melão Valenciano de

casca verde gerou um mutante de casca amarela, tornando-se uma variedade de

grande expressão econômica (PRIORI et al., 2010). A partir de 1970, a cultura

expandiu-se e surgiram importantes pólos de produção nos estados de São Paulo,

Bahia, Pernambuco e no Pará (NUNES et al., 2004). A cultura do meloeiro se

adaptou bem em diferentes partes do país, abrangendo diferentes sistemas de

17

produção destacando-se a região Nordeste pela produção comercial em alta escala

e a região Sul pelo cultivo agrícola familiar (FAO, 2013). Sementes das variedades

crioulas vão passando por gerações, caracterizando uma agricultura tradicional que

é fonte de variabilidade genética, e posteriormente armazenada em diferentes

bancos de germoplasma do país (PRIORI et al., 2010).

A vasta distribuição do melão em todo o mundo confirma o status de espécie

com maior variabilidade fenotípica do gênero Cucumis, sendo verificada nos frutos

com diferentes cores, formatos e aromas (JEFFREY, 1990; STEPANSKY et al.,

1999). A variação fenotípica fez com que os botânicos realizassem uma nova

classificação dentro da espécie, a partir do trabalho pioneiro proposto em 1859 pelo

botânico francês Charles Naudin e que serviu de base para as classificações

subsequentes em que a espécie C. melo foi dividida em dez variedades botânicas, a

partir das observações de uma coleção composta de 2.000 espécimes (HAMMER et

al., 1986; PITRAT, 1999). Posteriormente essa classificação foi simplificada, na qual

C. melo foi classificada em uma variedade silvestre denominada Agrestis e em seis

variedades ou grupos botânicos: cantaloupensis, inodorus, conomon, dudaim,

flexuosus e momordica (MUNGER; ROBINSON, 1991).

Os principais tipos produzidos comercialmente no Brasil (Figura 2)

pertencem a dois grupos: inodoros ou aromáticos. No grupo dos inodoros se pode

destacar dois tipos que são produzidos em escala comercial, denominados Amarelo

(Figura 2A) e Pele de Sapo (Figura 2B). O tipo Amarelo foi introduzido da Espanha e

por isso é conhecido como Melão Amarelo Espanhol, com seu formato redondo

ovalado e sua casca amarela com polpa entre branco a creme; é o tipo mais

cultivado, principalmente pelo fato de apresentar boa conservação pós-colheita

(SENAR, 2014). O tipo Pele de Sapo apresenta tamanho relativamente grande

quando comparado com os demais tipos comerciais e sua nomenclatura se deve ao

fato do mesmo possuir casca verde-clara com manchas verde-escuras, levemente

enrugada e dura; sua polpa possui a cor creme esverdeada de consistência firme

(SENAR, 2014). No grupo dos aromáticos têm-se quatro tipos: Cantaloupe (Figura

2C), Charentais (Figura 2D), Gália (Figura 2E) e Orange (Figura 2F). O Cantaloupe é

de origem americana, sendo o mais produzido no mundo, e requer um manejo pós-

colheita mais cuidadoso; apresenta a casca rendilhada com formato esférico e polpa

salmão (ARAGÃO, 2010). O tipo Charentais de origem francesa; apresenta polpa

18

salmão, casca lisa, verde-clara ou ligeiramente cinza e reticulada (costelada), forma

arredondada ou semi-ovalado e às vezes achatada; são muito aromáticos

(WHITAKER et al, 1986). O tipo Gália é de origem israelense; tem formato

arredondado, casca verde no início e amarela quando o fruto está maduro; a

coloração da polpa varia de branco a branco esverdeado, possui rendilhamento

menor que os Cantaloupes e seu peso médio varia entre 0,7 e 1,3 kg (ARAGÃO,

2010). Por fim, o tipo Orange apresenta frutos firmes com formato redondo e casca

lisa de cor creme, polpa laranja-escura ou creme-esverdeada (SENAR, 2014).

19

Figura 2 Tipos de melão comercializados no Brasil. A) Amarelo, B) Pele de Sapo, C) Cantaloupe, D) Charentais, E) Gália, F) Orange. Fonte 2A: http://www.cmd.sobressai.com.br; Fonte 2B: http://riogrande-donorte.all.biz; Fonte 2C: https://www.sementesfeltrin.com.br; Fonte 2D: http://www.elhuertodeclaudio.com; Fonte 2E: http://www.br.all.biz e Fonte 2F: http://www.extraplus.com.br.

20

2.3 Importância econômica

Até o final da década de 1950 o Brasil era um país importador de melão que

tinha seu mercado abastecido principalmente pelo Chile e Espanha. Foi a partir de

1960 que o Brasil passou a cultivar o melão em escala comercial primeiramente nos

estados de São Paulo e Rio Grande do Sul, sendo transferida posteriormente para a

região Nordeste no inicio de 1980 pelo fato da cultura apresentar uma melhor

adaptação fisiológica às condições climáticas (DELLA VECCHIA, 2013). Além do

Brasil, pode-se destacar outros países com produção comercial de melão bastante

relevante, como é o caso da China, Turquia, Irã, Espanha, EUA, Egito, Marrocos,

Itália, Índia, México e Guatemala e outros com perspectiva de abertura de novas

áreas de cultivo de melão como, por exemplo, em Angola (FAO, 2013).

O Brasil destinou uma área de 22.810 ha para o cultivo de melão no ano de

2012, produzindo 575.386 toneladas; no ano seguinte a área total plantada foi de

22.062 ha com uma produção de 565.900 toneladas, atingindo um rendimento médio

de 25.698 kg/ha, sendo a região Nordeste a responsável por 94,97% dessa

produção (IBGE, 2014). Os estados que mais se destacam em termos produtivos

são Rio Grande do Norte (44,98%), Ceará (37,53%), Bahia (5,91%) e Pernambuco

(3,61%) (IBGE, 2014). A cultura do melão encontrou na região semiárida do

Nordeste as condições ideais para seu desenvolvimento (intensidade e duração de

luminosidade, temperatura alta e precipitação pluviométrica baixa), garantindo o

crescimento, desenvolvimento e melhor conservação pós-colheita (FILGUEIRAS et

al., 2000).

O melão é uma das frutas brasileiras que tem se destacado nas últimas

décadas com relação às exportações. Em muitas safras mais de 40% da produção é

exportada e os índices mostraram que esses níveis de exportação passaram de 50,7

mil toneladas em 1989, para 177.828 toneladas em 2010; nesse mesmo ano o Brasil

importou apenas 28,2 toneladas de melão fresco, números bastante significativos

para a economia nacional, pois ajudam a fazer com que o país confirme o status de

exportador (IBRAF, 2015). Em 2012 as exportações brasileiras de melão registraram

o valor de US$ 134,1 milhões, o que significou uma alta de 4,49% frente ao ano

anterior, sendo notória a recuperação das vendas externas desde 2009 quando as

exportações registraram US$ 122 milhões com uma baixa de 19% (MDIC, 2013).

21

Todavia, apesar dessa expansão nas vendas externas, ainda não foi possível

superar o ocorrido no ano de 2008, quando as vendas alcançaram o valor recorde

de US$ 152,2 milhões (MDIC, 2013).

A União Europeia é o mercado que mais importa melão brasileiro, cerca de

90% das exportações de melão, destacando os meses de setembro e março que

coincidem com as estações de outono e inverno na Europa. Os países que

compõem em sua maioria esse macromercado têm preferência por frutos de

tamanho médio de 1 kg e forma arredondada, a única exceção ocorre no mercado

espanhol, que prefere melões grandes e de forma elíptica ou ovolada

(CRISÓSTOMO et al., 2008). Somente entre os períodos de agosto de 2014 e

agosto de 2015 o estado da Bahia exportou para a União Europeia 1.730 toneladas

de melões frescos (MDICE, 2016). Com todos esses indicativos, o melão tem

proporcionado o crescimento do agronegócio com destaque para participação de

pequenos, médios e grandes produtores, garantindo a alta produtividade e

competitividade junto ao mercado interno e externo, e gerando mais benefícios

econômicos e sociais (CRISÓSTOMO et al., 2008; DIAS et al., 1998).

2.4 Origem e importância da Citogenética em plantas

Quando a Citologia e a Genética passaram a ter seus conhecimentos numa

área comum deu origem a Citogenética, esta passou a ser um dos recursos de

avaliação em várias pesquisas, sendo fonte geradora de questionamentos que

impulsionaram a genética molecular, a biotecnologia e a engenharia genética, pois

compreende todo e qualquer estudo relativo ao cromossomo isolado ou em

conjunto, condensado ou distendido, tanto no que diz respeito a sua morfologia,

organização, função e replicação quanto a sua variação e evolução (GUERRA,

1986; SACCHET, 1999). A citogenética clássica desenvolveu-se, principalmente, a

partir do início do século passado, e seu crescente progresso acompanhou o

aprimoramento de técnicas e equipamentos de microscopia, fazendo com que a

sistemática de grupos de plantas fosse favorecida pelos estudos citogenéticos e

citotaxonômicos através de hipóteses filogenéticas, taxonômicas e evolutivas

(HESLOP-HARRISON, 2000; KUZOFF; GASSER, 2000).

22

A utilização de corantes acidófilos na citogenética clássica possibilitou a

visualização nítida dos cromossomos, revelando informações sobre diversos

parâmetros citogenéticos (PEÑALOZA, 2005). Nos estudos citogenéticos clássicos,

geralmente realizados em cromossomos metafásicos mitóticos e corados com

corante convencional como o Giemsa ou o Carmim Acético, procura-se definir as

características como número e comprimento cromossômico, razão entre braços,

padrão de condensação, além de características morfológicas adicionais, como

posição das constrições primárias e presença das constrições secundárias que

permitem a comparação de espécies e a identificação de variações cromossômicas

inter e intraespecíficas (GUERRA et al., 2002).

Com o advento de novas técnicas citogenéticas e surgimento da citogenética

molecular, tornou-se possível a obtenção de dados mais aprofundados a respeito do

cariótipo (SCHWEIZER, 1976). Tais dados incluem a localização de seqüências

ricas em bases especificas, ou bandas cromossômicas que permitem a visualização

de blocos de coloração diferenciada, através de coloração com fluorocromos como o

4’,-6’-diamidino-2-fenilindol (DAPI) que evidencia regiões heterocromáticas ricas em

bases AT, ou com a Cromomicina A3 (CMA3) que tem afinidade por regiões ricas em

bases GC (BRASILEIRO-VIDAL, 2002; GUERRA, 2002). O grande avanço desde a

introdução das técnicas de bandamento em 1970, até a análise digital de imagens e

a análise molecular com o CGH-matriz criou perspectiva de visualizar o genoma em

detalhes e em cores, o que permite esclarecer rearranjos e aneuploidias de forma

eficiente, sensível e precisa (GUERRA, 2004).

É possível localizar e mapear diversos tipos de seqüências específicas de

DNA (repetitivo ou de cópia única) diretamente ao longo do complemento

cromossômico através de hibridação fluorescente in situ (FISH–fluorescent in situ

hybridization) (LEITCH et al., 1994). Apesar da revolução provocada pela genética

molecular, a análise cromossômica continua sendo a única maneira de observar o

genoma de um eucarioto na forma de estruturas individualizadas de material

genético, fáceis de serem mensuradas, diferenciadas em subunidades e

manipuladas de diferentes formas, pois de nenhuma outra forma o material genético

é tão claramente observado (GUERRA et al., 2002).

Em estudos cromossômicos, a obtenção de bons resultados depende do

perfeito domínio de diferentes técnicas de coloração (GUERRA et al., 2002). A

23

caracterização citogenética detalhada, como o mapeamento físico cromossômico,

possibilita a descrição da homologia cariotípica de uma determinada cultivar ou

variedade, permitindo a utilização desses dados em programas de melhoramento de

plantas visando à transferência de genes de interesse (SINGH, 2002). Quando

associado a outras abordagens como morfologia e distribuição geográfica, uma

simples determinação do número cromossômico fornece informações importantes

para a compreensão da filogenia e evolução dos grupos (STEBBINS, 1971). A

cariotipagem é um método eficiente para caracterização de germoplasma, incluindo

o pré-melhoramento, devido ao fato de contribuir tanto para diversas áreas da

biologia vegetal e melhoramento de plantas, quanto à filogenia, taxonomia e

reprodução (MELO, C.A.F. et al., 2011). Sendo assim, quando são identificados

diferentes citótipos, tidos como importantes na conservação destes para a

manutenção do pool gênico de determinado táxon, informações citogenéticas

auxiliam na criação de estratégias para a conservação de recursos genéticos

(MELO, N.F. et al., 2011). A análise cromossômica sempre foi um dos campos

estimulantes da Citologia e da Genética, tendo relação entre estudos taxonômicos e

evolutivos, bem como no melhoramento genético e na caracterização de

germoplasma (SACCHET, 1999).

2.5 Estudos citogenéticos para o gênero Cucumis L.

O gênero Cucumis L., possui poucos estudos citogenéticos, que são

direcionados a um grupo reduzido de espécies. Mesmo assim, a citogenética tem se

tornado uma ferramenta importante para elucidar as relações filogenéticas do

gênero, fornecendo informações valiosas para obtenção e utilização dos recursos

genéticos, que podem ser utilizados para o melhoramento de culturas (KIRKBRIDE,

1993). Outro exemplo da aplicação dessas informações seria na construção de

mapas citogenéticos moleculares que auxiliaram no estudo do genoma em C.

sativus, unindo informações fornecidas por mapa genético com quantidade de

recombinação entre os marcadores ligados (HARPER; CANDE, 2000). Estudos no

gênero têm incorporado mapas genéticos e citológicos ao mapa de citogenética

molecular para uma melhor localização física dos marcadores genéticos intimamente

ligados e verificação de lacunas remanescentes (CHENG et al., 2001).

24

O centrômero de um cromossomo pode mover-se para uma nova posição

durante a evolução, o que pode resultar numa grande alteração da morfologia dos

cromossomos e cariótipo, através disso, técnicas citogenéticas têm sido utilizadas

para avaliar esse reposicionamento e o seu impacto no genoma de algumas

espécies pertencentes ao gênero Cucumis (HAN et al., 2009). Na elaboração de

mapas citogenéticos em Cucumis, a forma mais direta para localizar marcadores

genéticos é através da FISH. Porém, a maioria dos marcadores genéticos são

demasiadamente pequenos (0,5-4,0 kb) para gerar sinais consistentes da FISH nos

cromossomos (JIANG; GILL, 1994). A utilização de clones grandes como

cromossomo bacteriano artificial (BAC) ou cromossomos artificiais de levedura

(YAC) é suscetível de conter sequências repetitivas dispersas podendo causar sinais

de hibridação inespecífica na FISH (HANSON et al, 1995). Pelo fato de conter

menos sequências repetitivas dispersas em comparação aos clones grandes de

inserção de DNA, os pequenos clones de fosmídeos (30-40 kb) são mais indicados

na utilização como sondas de DNA e a construção de uma biblioteca de fosmídeo

para C. sativus linha pura 9930 serviu de base para o projeto internacional do

genoma do pepino (REN et al., 2009). Essas conquistas criaram a base para a

integração de mapas moleculares, genéticos e citológicos de algumas espécies do

gênero Cucumis, em especial para C. sativus, onde o mapeamento usando a FISH

com clones de DNA ancorados com marcadores de DNA geneticamente mapeados

para paquítenos bivalentes é uma abordagem muito eficiente para integrar mapas

genéticos com mapas cromossômicos (JIANG; GILL, 2006).

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material vegetal

Foram utilizadas oito variedades comerciais da espécie Cucumis melo L. (2n

= 2x = 24), sendo algumas sementes obtidas de frutos in natura provenientes do

comercio da cidade de Ilhéus localizada no sul da Bahia no Brasil e outras

provenientes de empresas que comercializam para o plantio (Tabela 1). Os frutos

foram despolpados manualmente, as sementes foram secadas a temperatura

ambiente e posteriormente armazenadas a + 8 ºC até o uso.

25

Tabela 1. Acessos de meloeiros com os seus respectivos códigos, tipo, características morfológicas do fruto e local de origem.

3.2 Preparação cromossômica

Sementes foram germinadas em placas de Petri com papel de filtro úmido a

28 ºC, por 36 a 48 horas. Radículas medindo aproximadamente 1,0 cm foram pré-

tratadas com 8-hidroxiquinolina a 2 mM por 2 h em temperatura ambiente (TA) e

estocadas a +8 ºC por 1 h. As raízes foram lavadas com água destilada 2x por 5 min

cada, fixadas em solução Carnoy I (etanol-ácido acético glacial [3:1, v/v];

JOHANSEN, 1940) durante 3 h em TA e estocadas em -20 ºC até o momento da

preparação cromossômica. Lâminas foram preparadas de acordo com MELO et al.

(2015). Pontas de raízes foram lavadas em água destilada 2x por 5 min cada, secas

em papel de filtro e transferidas para lâminas com 50 μl de solução enzimática

CÓDIGO TIPO DE FRUTO

GRUPO CARACTERÍSTICAS DO FRUTO/ LOCAL

MOL 1 Orange Aromatico Casca lisa, amarela. Melão orange. Supermercado

G Barbosa. Junho de 2013. Local: Ilhéus – BA.

MGA1 Gália Aromatico

Casca estriada, amarelo-laranja. Melão imperial 45(180). Empresa ISLA (Super Park – A super

semente). www.isla.com.br. Local: Poa/RS.

MPS 1 Pele de

sapo Não-

Aromatico

Verde. Melão português. Supermercado G Barbosa. Junho de 2013.

MAR 1 Amarelo Não-

Aromatico

Casca com gomos, amarela. Melão redondo gaúcho. Empresa Vidasul sementes (linha super).

vidasul@vidasul.com.br. Local: Xanxerê – SC.

MAO 1 Amarelo Não-

Aromatico

Casca amarela, forma oval. Melão Eldorado 3. Empresa ISLA (Super Pak – A super semente).

www.isla.com.br. Local: Poa/RS.

MAO 2 Amarelo Não-

Aromatico

Amarelo doce, forma oval. Poty Doce. Supermercado G Barbosa. Junho de 2013. Local:

Ilhéus-BA.

MAO 3 Amarelo Não-

Aromatico

Amarelo extra doce, forma oval, variedade Honey Dew. Fazenda Famosa. Supermercado G Barbosa. Maio de 2013. Local: Ilhéus-BA

MAO 4 Amarelo Não-

Aromatico

Amarelo extra doce, forma oval. Melão Rei. Produtor Itaueira. Supermercado G Barbosa. Julho

de 2013. Local: Ilhéus-BA.

26

contendo celulase a 2% e pectinase a 20%. As lâminas foram mantidas em câmara

úmida por 90 min a 37 ºC. Ainda nas lâminas, as amostras foram lavadas com água

destilada 2x por 5 min cada para remoção da enzima. O excesso de água foi retirado

com papel de filtro e com o auxílio de agulhas e sob microscópio estereoscópico, as

amostras foram maceradas em uma gota de ácido acético glacial a 45%. Foram

cobertas com uma lamínula e pressionadas firmemente entre papel de filtro para

espalhamento do material citoplasmático, as lamínulas foram removidas com lâmina

para bisturi, após congelamento em nitrogênio líquido, secas em TA e

posteriormente mantidas em -20 ºC até o uso.

3.3 Análise cariotípica

Para análise da morfometria cromossômica, as lâminas foram coradas com

Giemsa 2% (Merck®) por 20 min., secas em TA e montadas com Neomount

(Merck®). Para a construção de cariogramas e ideogramas foram obtidos valores

absolutos do comprimento do braço curto (BC), braço longo (BL) e satélites (SAT). O

comprimento dos satélites foi adicionado ao comprimento do braço cromossômico

correspondente. Foram calculados: i) razão entre braços (r = BL/BC [braço

longo/braço curto]); ii) comprimento cromossômico (CC = BL + BC + SAT); iii)

comprimento do lote haploide (CLH = soma da média dos pares cromossômicos

homólogos; iv) comprimento médio dos cromossomos (χ = ΣCC/número de

cromossomos); v) comprimento relativo (CR = CC ÷ CLH x 100); vi) índice de

assimetria (TF% = soma dos braços curtos do lote haploide ÷ CLH) (HUZIWARA,

1962); vii) fórmula cariotípica. Os homólogos foram determinados com base na

posição do centrômero e comprimento absoluto de cada cromossomo. Os cariótipos

foram determinados de acordo com o comprimento dos cromossomos, em ordem

decrescente, e com a posição do centrômero, de acordo com a nomenclatura

proposta por Levan et al (1964) utilizando a razão entre braços: metacêntrico (r = 1,0

- 1,7); submetacêntrico (r = 1,7 - 3,0); subtelocêntrico (r = 3,0 - 7,0) e telocêntrico (r

=7,0 - ∞). A fotodocumentação foi realizada em microscópio de luz Olympus BX41

equipado com câmera digital de 5M Olympus DP25 e com software DP2-BSW. Os

cromossomos foram mensurados usando o software Imagetool versão 3.0, com

escala de 10 µm. Os ideogramas foram confeccionados com base nas médias

simples das mensurações cromossômicas com a utilização do software Corel DRAW

X5 e os cariogramas foram confeccionados utilizando o software Adobe® Photoshop

27

CS5. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA),

considerando-se delineamento inteiramente ao acaso, com cinco repetições

(metáfases), utilizando o software estatístico SISVAR versão 5.0 (open source).

3.4 Bandamento fluorescente

Para a localização da heterocromatina base-específica rica em GC e AT,

foram utilizados os fluorocromos CMA3 e DAPI em conjunto com a distamicina (DA).

Lâminas foram envelhecidas por três dias e coradas com CMA3/DA/DAPI (MELO et

al., 2014). A coloração tripla consistiu de aplicação de 10 μl de CMA3 (0,25 mg/ml)

sobre a lâmina por 1 h; depois de lavadas com água destilada e secas com ar frio,

foi aplicado 10 μl de DA (0,1 mg/ml) por 30 min; depois de lavadas com água

destilada e secas com ar frio, foi aplicado 10 μl de DAPI/Vectashield (Vector®) (0,5

mg/ml) por 30 min. Após este tempo, as lâminas foram lavadas com água destilada,

secas com ar frio e montadas com 15 μl do meio de montagem glicerol/Macllvaine

(1:1 v/v) contendo 2,5 mM de MgCl2. As preparações foram cobertas com lamínula

de 20 x 20 mm, envelhecidas por três dias e mantidas a +10 ºC antes da análise. As

metáfases foram fotodocumentadas com a utilização do microscópio de

epifluorescência Olympus CX41 equipado com câmera digital 5M Olympus DP25 e

com software DP2-BSW. O filtro utilizado para detecção do CMA3 foi U-MWB

(excitação 450-480 nm/dicroicas com corte de 500 nm/emissão> 515 nm) e o DAPI

foi detectado com filtro U-UTH (excitação 330-385 nm/dicróicas com corte de

400/emissão> 420 nm).

3.5 Citogenética molecular

A localização de sequências específicas foi realizada com a técnica de FISH

(SOUZA et al., 2010), com modificações (BELO et al., 2015). Lâminas estocadas a -

20 ºC foram mantidas a 37 ºC por 30 min em estufa e posteriormente submetidas ao

tratamento com RNase a 100 μg/ml em tampão 2xSSC e incubadas em câmara

úmida por 1 h a 37 °C. Em seguida, as lâminas foram lavadas duas vezes por 5 min

28

em solução de 2xSSC em TA, seguido de imersão em formaldeído a 4% em TA por

10 min mais duas lavagens em 2xSSC por 5 min cada, em TA. As lâminas foram

desidratadas em série alcoólica 70% e 96% consistido de 5 min cada período de

desidratação. A mistura de hibridação foi preparada com o volume final de 15 μl,

contendo 50% formamida, 10% de dextran sulfato, 2xSSC, 0,13% de SDS mais 66

ng de sonda.

Sondas para a detecção dos sítios de DNAr 5S foram obtidas a partir do

produto da reação cadeia da polimerase (PCR) com a utilização dos seguintes

oligonucleotídeos iniciadores: para DNAr 5S (5’-TCTTGTGCAACCTCTTTAGGC-3’

e 5’-CACAACTAGTCCATTGGAAGAAAA-3’); DNA satélite centromérico de melão

(CentM) (5’-GCCCCAAAACGGGTCAAAAAGGGC-3’e 5’-

TTGGGGCGAAAACAAAAACTGACTCAC-3’)(KOO et al., 2008); e teloméricos (5’-

AAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATCCC-3’ e 5’-

TTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGCGTTTAGG-3’) (BELO et al.,

2015). As reações de amplificação foram realizadas com a adição de 2x tampão

para DNA Taq-polimerase, MgCl2 a 0,050 mM; dNTP a 1 mM; 1 pmol de Primer;

Taq-polimerase 2 U e 50 ng de DNA genômico de C. melo nas seguintes condições

de amplificação: desnaturação inicial 95 ºC por 4 min, seguido de 35 ciclos de

desnaturação 94 ºC por 1 min, anelamento a 55 ºC por 1 min, extensão 72º C por 2

min e extensão final de 72 ºC por 10 min. Os perfis das amplificações foram

verificados em gel de agarose a 2% corado com SYBR® safe (Invitrogen®) e

fotodocumentados em sistema Locus L-PIX (Locus Biotecnologia®). Os produtos das

amplificações foram purificados com a adição de 3 μl de acetato de sódio a 10% mais

200% do volume final de etanol P.A. gelado (-20 ºC), onde após o estoque overnight

a -20 ºC, o precipitado foi centrifugado a 14.000 rpm, seco em TA e ressuspendido

com água ultrapura. As sondas foram elaboradas via Nicktranslation seguindo o

protocolo proposto pelo fabricante (Roche Diagnostics®), com a adição de 16 μl do

produto amplificado, mais 4 μl do mix para marcação. As sondas centroméricas

foram marcadas com biotina-16-dUTP, enquanto que as sondas para sítios de DNAr

5S e para sítios de DNA teloméricos foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP.

A mistura de hibridização foi aquecida a 75 °C por 10 min em termociclador

e adicionada nas preparações citológicas, seguindo de desnaturação a 75 °C por 10

min em termociclador com adaptador para lâminas e incubadas overnight a 37 °C

29

em câmera úmida. Os banhos pós-hibridação foram realizados 2x por 5 min cada a

42 °C em 2xSSC, 0,1xSSC e novamente em 2xSSC, com a estringência de 76%. As

lâminas foram tratadas com BSA a 5% por 10 min, seguindo-se com a detecção dos

sítios de DNA centromérico com avidina-FITC em meio BSA a 5%, o DNAr 5S e o

DNA telomérico foi detectado com anti-digoxidenina-rodamina em meio BSA a 5 %.

A detecção foi realizada em câmera úmida a 37 °C por 1 h. O excesso de anticorpo

foi eliminado com três lavagens por 5 min cada em 4xSSC/0,2% Tween 20 em

agitação. As lâminas foram montadas e contra coradas com meio DAPI/Vectashield

e estocadas a +10 °C até a análise.

Os resultados foram visualizados com a utilização do microscópio de

epifluorescência Olympus BX41 com câmera digital acoplada 5M Olympus DP25

com a utilização do software DP2-BSW. A visualização dos sinais de avidina-FITC e

anti-digoxigenina-rodamina foi realizada com o uso dos respectivos filtros U-MWB

(excitação 450-480 nm/dicróicas com corte de 500 nm/emissão> 515 nm) e U-MWG

(excitação 510-550 nm/dicróicas com corte de 590 nm/emissão> 570 nm). As

confecções de pranchas, cariogramas e sobreposições foram realizadas com o uso

do software Adobe® Photoshop SC5.

4. RESULTADOS

4.1 Análises citogenéticas clássicas

4.1.1 Análise cariomorfológica

As variedades comerciais de meloeiro apresentaram número

cromossômico (2n = 24) (Figura 3). Levando-se em conta o menor e maior valor do

CC nas variedades, foram verificadas diferentes variações, sendo de 62% em

MAO2, 60% em MOL1, 59% em MPS1, 68% em MAR1, 58% em MAO1, 60% em

MAO3, 61% em MAO4 e 61% em MGA1 (Tabela 2).

A coloração convencional com Giemsa a 2% proporcionou a visualização

diferencial de satélites, sendo alguns mais evidentes (Figura 4 B, F e H), outros

menos evidentes (Figura 4 A, C, D e E) e em alguns casos não visualizados (Figura

30

4 G). Além disso, a variação na localização e posição dos satélites entre os acessos

foi observada (Figuras 4 e 5), sendo constatada a presença de dois pares

cromossômicos satelitados em MAO1 (par 1, braço curto e par 4, braço longo), um

par em MAO2 (par 1, braço longo), e um par no braço curto das demais variedades,

com exceção da MAO3.

Houve variação entre a menor e maior razão entre braços (r) nas

variedades, sendo de 29,71% em MAO2, 19,87% em MOL1, 25,16% em MPS1,

29,68% em MAR1, 25% em MAO1, 14,08% em MAO3, 28,65% em MAO4 e 30,23%

em MGA1 (Tabela 2). Comparando o menor e maior valor do CR, verificou-se uma

variação de 4,3 em MOL1, 4,1 em MGA1, 4,4 em MPS1, 3,1 em MAR1, 4,5 em

MAO1, 4,0 em MAO2, 4,2 MAO3 e 4,1 em MAO4. A variedade que apresentou

menor comprimento do lote haplóide (CLH) foi a MAR1 que variou 27,97% em

relação a variedade MAO1 que apresentou maior CLH (Tabela 2).

As variedades MOL1, MPS1, MAR1, MAO1 e MAO3 apresentaram fórmula

cariotípica 2n = 12m, enquanto as variedades MAO2, MAO4, MGA1 apresentaram

fórmula cariotípica 2n = 11m+1sm. Os cariótipos foram simétricos, com o maior

índice de assimetria para MAO3 e MGA1, ambos com um TF 43%. Enquanto o

menor índice foi 41%, observado para as variedades MAO2, MOL1, MPS1, MAO1 e

MAO4; portanto, houve uma variação de 2% entre as variedades. O comprimento

médio cromossômico (X) variou 25,16% entre as variedades MAR1 que apresentou

menor valor e MAO1 com maior (Tabela 3).

31

Figura 3 Metáfases mitóticas de variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24). A) MOL 1; B) MGA 1; C) MPS 1; D) MAR1; E) MAO 1; F) MAO 2; G) MAO3 e H) MAO 4. Barra = 10 µm.

32

Tabela 2. Características cariomorfológicas em cromossomos metafásicos de

variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24)

Continua...

Variedade Característica Valores por par cromossômico (µm)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

MOL1 BL 0,93 0,85 0,82 0,79 0,73 0,74 0,73 0,66 0,67 0,63 0,62 0,55

BC 0,69 0,63 0,57 0,53 0,56 0,51 0,47 0,48 0,44 0,46 0,43 0,44

CC 1,62 1,48 1,39 1,32 1,28 1,25 1,19 1,14 1,12 1,1 1,06 0,98

r 1,34 1,36 1,43 1,49 1,3 1,43 1,56 1,38 1,52 1,37 1,44 1,25

CR 10,8 9,9 9,2 8,8 8,6 8,4 8,0 7,6 7,5 7,3 7,1 6,5

Tipo m m m m m m m m m m m m

MGA1 BL 0,94 0,87 0,79 0,74 0,73 0,74 0,66 0,67 0,72 0,61 0,59 0,57

BC 0,66 0,57 0,58 0,56 0,54 0,51 0,55 0,52 0,42 0,48 0,47 0,42

CC 1,60 1,44 1,37 1,30 1,27 1,24 1,21 1,18 1,14 1,09 1,06 0,98

r 1,44 1,52 1,35 1,34 1,34 1,46 1,20 1,30 1,72 1,27 1,25 1,37

CR 10,7 9,7 9,2 8,7 8,5 8,3 8,1 7,9 7,6 7,3 7,1 6,6

Tipo m m m m m m m m sm m m m

MPS1 BL 1,15 1,1 0,97 0,95 0,93 0,93 0,87 0,82 0,84 0,79 0,76 0,64

BC 0,82 0,71 0,72 0,68 0,65 0,61 0,59 0,6 0,54 0,56 0,5 0,55

CC 1,97 1,81 1,69 1,63 1,58 1,53 1,46 1,42 1,39 1,34 1,26 1,18

r 1,40 1,56 1,36 1,41 1,43 1,52 1,49 1,37 1,55 1,42 1,51 1,16

CR 10,8 9,9 9,2 8,9 8,6 8,4 8,0 7,8 7,6 7,3 6,9 6,4

Tipo m m m m m m m m m m m m

MAR1 BL 0,79 0,76 0,70 0,71 0,70 0,69 0,72 0,69 0,63 0,63 0,56 0,56

BC 0,61 0,56 0,54 0,51 0,50 0,48 0,43 0,44 0,47 0,43 0,46 0,40

CC 1,40 1,32 1,24 1,23 1,20 1,17 1,15 1,13 1,10 1,06 1,02 0,96

r 1,31 1,37 1,3 1,39 1,41 1,42 1,66 1,55 1,34 1,46 1,2 1,38

CR 10,0 9,4 8,9 8,8 8,6 8,4 8,2 8,1 7,9 7,6 7,3 6,9

Tipo m m m m m m m m m m m m

MAO1 BL 1,26 1,08 1,11 1,03 0,97 0,96 0,93 0,85 0,89 0,83 0,75 0,70

BC 0,83 0,80 0,68 0,69 0,70 0,65 0,65 0,68 0,60 0,60 0,61 0,54

CC 2,09 1,89 1,79 1,72 1,67 1,61 1,58 1,53 1,49 1,42 1,36 1,23

r 1,53 1,35 1,65 1,50 1,39 1,49 1,42 1,26 1,48 1,38 1,23 1,30

CR 10,8 9,7 9,2 8,9 8,6 8,3 8,1 7,9 7,7 7,3 7,0 6,3

Tipo m m m m m m m m m m m m

MAO2 BL 1,15 1,09 0,95 1,06 1,01 0,98 0,88 0,84 0,84 0,73 0,77 0,69

BC 0,82 0,71 0,77 0,61 0,61 0,59 0,62 0,61 0,56 0,64 0,56 0,56

CC 1,97 1,81 1,72 1,67 1,62 1,57 1,5 1,45 1,4 1,37 1,33 1,24

r 1,41 1,53 1,24 1,75 1,64 1,64 1,41 1,36 1,5 1,14 1,39 1,23

CR 10,6 9,7 9,2 8,9 8,7 8,4 8,0 7,8 7,5 7,3 7,1 6,6

Tipo m m m sm m m m m m m m m

33

Tabela 2. Características cariomorfológicas em cromossomos metafásicos de

variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24)

(conclusão)

BL (braço longo), BC (braço curto), CC (comprimento cromossômico), r (razão entre braços), m (metacêntrico), sm (submetacêntrico).

Tabela 3 Parâmetros cariotípicos em variedades comerciais de Cucumis melo (2n =

24)

Variedade X (µm) CLH (µm) TF %

MOL1 1,246 14,948 41,59

MGA1 1,240 14,886 42,86

MPS1 1,523 18,272 41,15

MAR1 1,163 13,958 41,7

MAO1 1,615 19,379 41,35

MAO2 1,553 18,645 41,07

MAO3 1,227 14,723 43,4

MAO4 1,525 18,302 40,8

X (comprimento médio cromossômico), CLH (comprimento do lote haploide), TF%

(índice de assimetria).

Variedade Característica Valores por par cromossômico (µm)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

MAO3 BL 0,89 0,82 0,78 0,77 0,71 0,70 0,65 0,65 0,62 0,61 0,60 0,54

BC 0,66 0,63 0,61 0,58 0,59 0,53 0,53 0,50 0,49 0,47 0,43 0,39

CC 1,55 1,45 1,39 1,34 1,30 1,23 1,18 1,14 1,11 1,08 1,03 0,93

r 1,36 1,31 1,28 1,32 1,22 1,31 1,24 1,31 1,26 1,30 1,42 1,38

CR 10,5 9,8 9,4 9,1 8,8 8,3 8,0 7,7 7,5 7,3 7,0 6,3

Tipo m m m m m m m m m m m m

MAO4 BL 1,19 1,07 1,04 0,97 1,01 0,95 0,89 0,83 0,77 0,73 0,70 0,68

BC 0,75 0,75 0,69 0,68 0,57 0,59 0,61 0,62 0,59 0,58 0,54 0,51

CC 1,94 1,82 1,72 1,65 1,58 1,54 1,50 1,45 1,36 1,31 1,24 1,19

r 1,59 1,42 1,51 1,42 1,78 1,60 1,47 1,34 1,32 1,27 1,31 1,35

CR 10,6 9,9 9,4 9,0 8,6 8,4 8,2 7,9 7,4 7,1 6,8 6,5

Tipo m m m m sm m m m m m m m

34

Figura 4 Cariogramas de variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24). A) MOL 1; B) MGA 1; C) MPS 1; D) MAR 1; E) MAO 1; F) MAO 2; G) MAO 3 e H) MAO 4. Barra = 10 µm.

35

Figura 5 Ideogramas de variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24). Barra = 5 µm.

36

Foi verificada pela ANOVA a existência de diferença significativa (P < 0,01)

para os comprimentos cromossômicos entre variedades (Tabela 4); comprimento de

cada par cromossômico dentro de variedades (Tabela 5); e comprimento de cada

par cromossômico entre variedades (Tabela 6).

Tabela 4. Resumo da ANOVA para o comprimento médio cromossômico (X) entre

variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24)

FV GL QM

Variedade 7 0.159** Erro 32 0.019 CV% 9.86 -

FV= Fator de Variação, GL = Grau de Liberdade, QM = Quadrado Médio, CV% =

Coeficiente de Variação, ** P < 0,01.

Tabela 5. Resumo da ANOVA para o comprimento de cada par cromossômico (CC)

dentro de variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24)

FV GL QM

MOL1 MGA1 MPS1 MAR1 MAO1 MAO2 MAO3 MAO4

CC 11 0,14** 0,15** 0,26** 0,11** 0,28** 0,21** 0,17** 0,27**

Erro 48 0,03 0,01 0,01 0,02 0,03 0,04 0,01 0,01

CV% 13,54 7,18 6,49 13,20 11,19 13,60 9,33 6,93

FV= Fator de Variação, GL = Grau de Liberdade, QM = Quadrado Médio, CV% =

Coeficiente de Variação, CC = Comprimento Cromossômico, ** P < 0,01.

37

Tabela 6. Resumo da ANOVA para o comprimento de cada par cromossômico (CC) entre variedades comerciais de Cucumis melo

(2n = 24)

QM

FV GL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CC 7 0,28** 0,24** 0,22** 0,19** 0,17** 0,16** 0.15** 0.14** 0.13** 0.11** 0.10** 0.09** Erro 32 0,04 0,03 0,02 0,02 0,02 0,02 0.02 0.02 0.02 0.02 0.01 0.01 CV% 11,86 10,07 10,25 10,56 10,35 10.44 10.38 9.93 10.26 10.24 10.06 9.91

FV= Fator de Variação, GL = Grau de Liberdade, QM = Quadrado Médio, CV% = Coeficiente de Variação, CC = Comprimento Cromossômico,** P < 0,01.

38

4.1.2 Análise com fluorocromos

A coloração com CMA3/DA/DAPI não revelou bandas DAPI+, ricas em

pares de base AT. Foram observadas bandas CMA3+/DAPI- relacionadas aos

satélites (Figura 6 A-H), o que permitiu a confirmação de dois pares satelitados

em cada variedade estudada onde as variedades MGA1 e MAO4 apresentaram

satélites nos pares 1 e 4 (Figura 7 B e H) e as variedades MOL1, MPS1,

MAR1, MAO1, MAO2 e MAO3 apresentaram satélites nos pares 1 e 2 (figura 7

A, C, D, E, F e G), possibilitando a observação de satélites não visualizados

pela aplicação da coloração convencional. Também foram observados blocos

CMA3+/DAPI- na região pericentromérica e centromérica de todos os

cromossomos em todas as variedades, havendo variação entre os

cromossomos em relação ao tamanho do bloco CMA3+/DAPI- e intensidade da

coloração (Figura 6).

Foram observados quatro blocos terminais em MOL1 e MGA1 (Figura 6

A e B), dois blocos em MPS1, MAO1, MAO2, MAO3 e MAO4 (Figura 6 C, E, F,

G e H) e 4 blocos pericentroméricos e subteloméricos na variedade MAR1

(Figura 6 D), 2 blocos em MPS1, MAO1, MAO2, MAO3 e MAO4 (Figuras 6 C,

E, F, G e H). Em alguns cromossomos, cuja localização do bloco situa-se na

região pericentromérica ocorreu distensão de forma moderada, como

observado em MPS1 (Figura 6 C), e em alguns casos bem mais acentuada na

região terminal, como observado nas variedades MAO3 e MAO4 (Figuras 6 G e

H).

39

Figura 6 Bandamento CMA3/DA/DAPI em metáfases mitóticas de variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24): A) MOL1; B) MGA1; C) MPS1; D) MAR1; E) MAO1; F) MAO2; G) MAO3 e H) MAO4. Barra = 10 µm. (As setas indicam blocos terminais, e as setas pontilhadas blocos pericentroméricos e subteloméricos).

40

Figura 7 Cariogramas do Bandamento CMA3/DA/DAPI em metáfases mitóticas de variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24): A) MOL1; B) MGA1; C) MPS1; D) MAR1; E) MAO1; F) MAO2; G) MAO3 e H) MAO4. Barra = 10 µm.

41

4.2 FISH com uso de sondas DNAr 5S, centroméricas e teloméricas

Sítios de DNAr 5S, centroméricos e teloméricos foram mapeados em

todas as variedades analisadas (Figuras 8, 9 e 10). Cada variedade apresentou

dois sítios de DNAr 5S (Figura 8), indicando a exigência de um par

cromossômico dotado deste lócus ribossômico, variando na sua localização. As

variedades MOL1, MGA1, MPS1, MAR1, MAO1, e MAO3 apresentaram sítios

de DNAr 5S terminais (Figura 8 A, B, C, D, E e G), enquanto nas variedades

MAO2 e MAO4 a localização destes sítios foi subterminal (Figura 8 F e H).

Esses sítios de DNAr 5S foram localizados no par cromossômico 2 em MPS1,

no par cromossômico 3 em MOL1, MGA1, MAR1, MAO2, MAO3, MAO4 e no

par cromossômico 4 em MAO1. É possível verificar uma variação em relação à

intensidade dos sítios de DNAr 5S, onde MPS1, MAR1, MAO2, MAO3 e MAO4

apresentaram brilho mais intenso (Figura 8 C, D, F, G e H), e as variedades

MOL1, MGA1 e MAO1 apresentaram uma menor intensidade no sinal (Figura 8

A, B e E).

O DNA CentM foi mapeado em todos os cromossomos de todas as

variedades (Figura 9). O sitio de hibridização CentM foi restrito a região

centromérica, facilitando a localização do mesmo, confirmando da morfologia

cromossômica inferida inicialmente pelas medições morfométricas realizadas

pela coloração convencional.

Foram obtidos sinais de hibridação do DNA telomérico em todas as

variedades (Figura 10), porém, em alguns cromossomos foram observados

sinais bastante evidentes em uma extremidade, entretanto, na outra

extremidade sinais fracos ou inexistentes nas MOL1, MPS1, MAO3 e MAO4

(Figura 10 A, C, G e H). Além disso, marcações aparentes de sítios teloméricos

intersticiais (ITS) não foram observadas.

42

Figura 8 Hibridação in situ fluorescente (FISH) com sondas de DNAr 5S em metáfases mitóticas de variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24): A) MOL1; B) MGA1; C) MPS1; D) MAR1; E) MAO1; F) MAO2; G) MAO3 e H) MAO4. Barra = 10 µm. (setas indicam sinal de hibridação 5S).

43

Figura 9 Hibridação in situ fluorescente (FISH) com sondas de DNA centromérico em metáfases mitóticas de variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24): A) MOL1; B) MGA1; C) MPS1; D) MAR1; E) MAO1; F) MAO2; G) MAO3 e H) MAO4. Barra = 10 µm. (As setas indicam marcações centroméricas e as setas pontilhadas indicam marcações terminais).

44

Figura 10 Hibridação in situ fluorescente (FISH) com sondas de DNA telomérico em metáfases mitóticas de variedades comerciais de Cucumis melo (2n = 24): A) MOL1; B) MGA1; C) MPS1; D) MAR1; E) MAO1; F) MAO2; G) MAO3 e H) MAO4. Barra = 10 µm.

45

5 DISCUSSÃO

A caracterização cariotípica com a aplicação de técnicas citológicas

clássicas e moleculares contribui para o estudo taxonômico, evolutivo, para

identificação de espécies e melhoramento genético vegetal (CLARK; WALL,

1996; GUERRA; SOUZA, 2002). No presente trabalho, a caracterização

citogenética foi realizada em oito variedades comerciais de Cucumis melo. O

número cromossômico diploide observado em todas as variedades se

apresentou conservado, sugerindo que modificações cromossômicas

numéricas como disploidias não são comuns na espécie, corroborando com

observações anteriores para o táxon (DARYONO; KUMALAWATI, 2013;

HOSHI et al., 2013; RAJKUMAR et al., 2015). Foram observadas variações no

tamanho cromossômico dentro e entre as variedades; sendo que o maior

cromossomo (2,09 µm) apresentou mais que o dobro do tamanho

cromossômico em relação ao menor (0,93 µm). Em C. melo var. inodorus foram

encontradas variações no tamanho cromossômico entre 1,15 a 1,60 µm

(KARIMZADEH et al., 2010), Cucumis melo var. reticulatus 1,18 a 1,65 µm, C.

melo spp. Melo Pang. 0,91 a 1,55 µm (MA et al., 1994), Cucumis Melo var.

Bartek 1,11 a 1,89 µm (DARYONO; KUMALAWATI, 2013). Essas alterações no

comprimento cromossômico geralmente são associadas a rearranjos, como as

deleções e duplicações ocorridas ao longo da história evolutiva do táxon

(STEBBINS, 1971; AUGER; SHERIDAN, 2012).

Os valores observados através da razão entre braços permitiram a

verificação da morfologia cromossômica das variedades e o estabelecimento

de dois grupos conforme a formula cariotípica; um com variedades contendo

apenas cromossomos metacêntricos e outro grupo contendo variedades com

um par cromossômico submetacêntrico e os demais cromossomos

metacêntricos. Tais resultados foram bastante diferentes em relação aos

trabalhos realizados nas variedades C. melo var. agrestis (2m + 9sb + 1st), C.

melo var. ghurmi (3m + 8sm + 1st), C. melo var. momordica (3m + 9sm), C.

melo var. muskmelon (2m + 8sm + 2st), C. melo var. utilissimus (3m + 8sm +

1st) (SINGH et al. 1974). As variações observadas em relação a formula

cariotípica podem sugerir a existência de modificações cromossômicas

46

estruturais, as quais modificam a posição do centrômero devido à perda ou

ganho diferencial de DNA entre os braços cromossômicos (STEBBINS, 1971).

O reposicionamento centromérico e outras modificações estruturais já foram

observadas e ditas como rota de especiação entre espécies do gênero

Cucumis (HAN et al. 2009).

Ao mesmo tempo, as variações observadas nas fórmulas cariotipicas

entre acessos de C. melo (C. melo var. conomon, C. melo var. melo, C. melo

var. momordica, C. melo var. agrestis) , indicam a existência de variabilidade

intraespecifica para a morfologia cromossômica em C. melo (RAJKUMAR et

al., 2015). Adicionalmente, diferenças na morfologia cromossômicas podem

ocorrer em populações da mesma espécie ou em táxons interespecíficos, e são

denominados de citótipos ou raças cromossômicas (MOSCONE et al., 2007).

No gênero Cucumis os dados citogenéticos o classifica como grupo

heterogêneo do ponto de vista cariológico, apresentando variabilidade

interespecífica em relação ao número cromossômico, morfologia cromossômica

e posição de satélites (TEODORO-PARDO, 2007). Divergências entre os

dados apresentados na literatura quanto à morfologia cromossômica têm sido

encontrados com mais frequência na espécie C. sativus, sendo observados

dois pares cromossômicos metacêntricos, quatro submetacêntricos e um

subtelomérico (RAMACHANDRAN et al., 1986); cinco pares cromossômicos

metacêntricos e dois submetacêntricos (HOSHI et al.,1998); seis metacêntricos

e um cromossomo submetacêntrico (CHEN et al.,1998; KOO et al., 2002). Uma

das razões para tais discrepâncias entre as formulas cromossômicas

observadas na literatura em Cucumis, pode ser a dificuldade de observação do

centrômero pela coloração convencional, fato atribuído ao tamanho

cromossômico muito pequeno.

Outro parâmetro analisado foram as modificações na assimetria

cariotípica (TF%) que podem ocorrer tanto por meio do acumulo de diferenças

no tamanho relativo entre os complementos cromossômicos ou através da

mudança na posição do centrômero de metacêntrico para submetacêntrico, de

telomérico para subtelomérico (STEBBINS, 1971). O TF% permitiu inferir que a

predominância de cromossomos metacêntricos possibilitou a constituição de

cariótipos simétricos nas variedades. Espécies com cariótipo primitivo

apresentam TF% mais elevado por predominar cromossomos metacêntricos,

47

sendo um parâmetro útil na avaliação da evolução em plantas quanto às

modificações cromossômicas estruturais (MELO et at., 2014). Um cariótipo

simétrico, com muitos metacêntricos, sugere poucas modificações cariotipicas

ao nível de deleção e perda de porções de regiões cromossômicas. Um

cariótipo simétrico é mais primitivo do que o cariótipo assimétrico, onde

variedades apresentando cromossomos mais assimétricos em seu cariótipo

pode significar maior nível evolutivo que variedades contendo basicamente

cromossomos simétricos (SINGH, 1993).

A análise do comprimento do lote haploide (CLH) revelou uma variação

significativa pela ANOVA, indicando variações entre o CLH entre as variedades

avaliadas. Em Cucumis melo var. inodorus a variação encontrada no CLH foi

de 0,907 a 2,31 µm (KARIMZADEH et al., 2010). Tamanho médio do genoma

em torno de 40 µm é considerado por alguns autores como sendo genoma

pequeno (MOSCONE et al., 2003). Variações cariotípicas intraespecíficas são

geradas em consequência de rearranjos estruturais e podem significar

respostas desses genomas aos diferentes ambientes nos quais são

encontrados (TEODORO-PARDO et al., 2007)

A dupla coloração com fluorocromos base-espécificos revelou regiões

heterocromáticas ricas em GC, sugerindo que essas duas bases contribuem

com maior relevância ao componente repetitivo e DNA mais compactado em C.

melo, como ocorre em Solanum L. (MELO, C.A.F. et al., 2011). Os resultados

obtidos corroboram com estudos comparativos entre C. melo e C. sativus, onde

os blocos heterocromáticos mais evidentes nas variedades de melão

analisadas coincidiram com a coloração convencional e com sitos DNAr 45S;

em pepinos, todos sinais fortes de DNAr 18S e 45S foram localizados nas

mesmas regiões heterocromáticas CMA positivo e DAPI negativo (HOSHI et

al., 1999). Adicionalmente, blocos foram localizados nas regiões de satélite e

em regiões centroméricas em C. melo, sendo dois de natureza CMA3+/DAPI- e

outros dois satélites de natureza não específica (HOSHI et al., 2013). Neste

sentido, em C. melo a visualização de satélites e RONs (Regiões organizadora

de nucléolos) pode ser realizada com a aplicação de fluorocromos CMA3+,

sendo a hibridação in situ fluorescente com sonda 18S ou 45S técnicas que

apenas reforçam a localização de tais regiões cromossômicas.

48

Variedades de C. melo apresentam distensão cromossômica ou

alongamento na região centromérica neste trabalho, atestando que os genes

desta região são ricos em GC, como observado em estudos com genes do

RNA ribossomal em Curcubitaceas (KING et al., 1993); no pepino existe a

tendência do cromossomo 2 apresentar alongamento na região centromérica

(HOSHI et al., 1998; PLADER et al., 1998), com isso, foi concluído que um sitio

de DNAr ativo é localizada na região pericentromérica do cromossomo 2

(HOSHI et al., 1999).

A presença de blocos CMA3+/DAPI- peri- e centroméricos em C. melo,

indica que o DNA existente nessas regiões é rico em bases GC; sendo úteis

como marcadores para o centrômero e auxiliam a visualização do mesmo para

a inferência da morfologia cromossômica. Em Cucumis sativus se verificou

claramente CMA3+/DAPI- nessa região dos pares cromossômicos 1, 2, 3, 5 e 7;

e ligeiramente no cromossomo 6 (HOSHI et al.,1999). Os centrômeros e

satélites de C. melo foram confirmados mais tarde como sendo de natureza

CMA3+/DAPI- e consequentemente ricos em GC (HOSHI et al., 2013).

Da mesma forma, a localização do DNA ribossômico é importante, pois

se trata de sequências muito conservadas evolutivamente, mesmo o DNAr 5S

sendo mais variável que a sequência do DNAr 45S, geralmente cada espécie

possui uma só sequência de DNAr 5S repetida em tandem muitas vezes em

um único par cromossômico ou, menos freqüente em dois ou mais pares

(GUERRA, 2004). Todas as variedades de melão analisadas apresentaram

apenas um par de sítios DNAr 5S pequenos e bastante evidentes, porém, com

dois padrões de distribuição ao longo do cromossomo; sendo duas variedades

com sítios de localização em regiões subterminais e as demais variedades com

sítios DNAr 5S em regiões terminais do cromossomo. Foi observado o mesmo

número de sítios em C. melo e C. metuliferus, porém, nessa última, os sinais

eram relativamente grandes e terminais (HOSHI et al. 2013). O padrão de

localização cromossômica para os genes RNAr 5S parece não ser casual e

pode representar vantagem relacionada à organização desses genes no

genoma (GALETTI JÚNIOR; MARTINS, 2004). Em Coccinia grandis,

pertencente às curcubitáceas, apresenta um sitio de DNAr 5S adjacente a um

sítio de DNAr 45S (SOUSA; FUCHS; RENNER, 2012).

49

Outro marcador eficaz na detecção de sequências específicas de DNA,

o DNA centromérico é um importante marcador citológicos para as espécies do

gênero Cucumis, pois evidencia que os cromossomos de pepino podem ser

resultado da fusão a partir de cromossomos de espécies com 24 cromossomos

e também revelou diferentes posições centroméricas entre dois pares de

cromossomos de C. sativus e C. melo (KOOet al., 2010; LI et al., 2011). A

comparação das estruturas cromossômicas de melão e pepino sugeriu a

ocorrência de seis inversões, cinco paracêntricas e uma pericentrica nos

cromossomos 4, 5 e 7 durante a domesticação do pepino. Assim, a fusão

cromossômica e reposicionamento de centrômero ocorreram durante a

evolução dos cromossomos de pepino e melão (YANG, et al., 2012). Utilizando

a região marcada pelo DNA satélite centromérico como parâmetro para

classificação morfológica dos cromossomos ao invés da nomenclatura proposta

por LEVAN et al (1964), seria possível classificá-los em metacêntricos,

submetacêntricos e telocêntricos devido à variação na localização desses

sítios.

Em C. melo as sequencias teloméricas hibridaram em locais não

relacionados às regiões intersticiais ou pericentroméricas. Observações

semelhantes em Passiflora sublanceolata mostraram que os sítios de

hibridação observados se limitam a telômeros, desconsiderando modificações

cromossômicas envolvendo essas regiões (BELO et al., 2015). O cariótipo de

todas as variedades estudadas manteve-se estável, com ausência de

modificações na rota evolutiva das espécies envolvendo telômeros, não

havendo quebras cromossômicas ou fusões, como observado nos estudos

para localização de sequências teloméricas em plantas superiores (FUCHS et

al., 1995).

50

6 CONCLUSÕES

A coloração convencional é uma ótima ferramenta para contagem do

número cromossômico, porém, não é muito indicada para visualização de

satélites em C. melo uma vez que não foi possível a confirmação de todos

através desta.

A análise cariomorfológica revelou a existência de diversidade

intraespecífica nas variedades comerciais de meloeiro, com estabilidade no

número de cromossomos e variações que vão desde o comprimento

cromossômico ao número e localização de satélites.

Distribuição da heterocromatina rica GC (CMA3+/DAPI) permitiu

verificar que essas regiões não são restritas apenas aos satélites, mas, ao

centrômero e regiões pericentroméricas, constatando riqueza de GC no DNA

CentM.

Com o uso da FISH foi possível verificar que o número de dois sítios de

DNAr 5S foi padrão para todas as variedades analisadas entretanto, estes não

são exclusivamente terminais, havendo variação em sua localização.

O DNA CentM revelou variações na localização dos centrômeros,

sendo observado em regiões terminais, subterminais e centroméricas, sendo

técnica ideal para a confirmação da morfologia cromossômica através da

posição do centrômero.

As marcações teloméricas foram identificadas nas regiões terminais

dos cromossomos, indicando que durante a evolução da espécie, não houve

eventos de translocações ou inversões envolvendo telômeros.

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