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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
DANIELE DE SANTANA ROCHA
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE Toxoplasma gondii EM LEITE DE OVELHAS
CRIADAS NO SUL DA BAHIA
ILHÉUS - BAHIA
2013
DANIELE DE SANTANA ROCHA
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE Toxoplasma gondii EM LEITE DE OVELHAS
CRIADAS NO SUL DA BAHIA
ILHÉUS – BAHIA
2013
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de
Santa Cruz como exigência para obtenção do título de
Mestre em Ciência Animal.
Área de concentração: Ciência Animal
Orientador: Prof. Dr. George Rego Albuquerque
iii
DANIELE DE SANTANA ROCHA
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE Toxoplasma gondii EM LEITE DE OVELHAS
CRIADAS NO SUL DA BAHIA
Ilhéus – BA, 29/07/2013
_______________________________________
George Rego Albuquerque – DSc
DCAA/UESC
_______________________________________
Alexandre Dias Munhoz – DSc
DCAA/UESC
_______________________________________
Walter Flausino – DSc
DPA/UFRRJ
ILHÉUS – BAHIA
2013
iv
R672 Rocha, Daniele de Santana.
Identificação molecular de Toxoplasma gondii em leite de ovelhas criadas no sul da Bahia / Dani- ele de Santana Rocha. – Ilhéus, BA: UESC, 2013. xv, 54f. : il.; anexos. Orientador: George Rego Albuquerque. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Inclui referências.
1. Ovelhas – Doenças - Bahia. 2. Leite – Con- taminação. 3. Sorologia veterinária. 4. Toxoplas- mose. 5. Reação em cadeia de polimerase. I. Título. CDD 636.31
v
“Porque dEle e por Ele, e para Ele, são todas as coisas; glória, pois, a Ele eternamente. Amém.”
(Romanos 11:36)
“Senhor não quero que os meus olhos percam o brilho do primeiro amor por Ti.”
(Aline Barros)
vi
AGRADECIMENTOS
O primeiro agradecimento faço ao Senhor, por sempre estar me abençoando e
proporcionando saúde e sabedoria para trilhar caminhos que me farão chegar
onde desejo. Cada vitória agradeço a Ti. ''Aquele que não ama não conhece a
Deus; porque Deus é amor" (1 João 4:8)
Aos meus pais Ivanete Cirilo de Santana e Vanderlino de Souza Rocha pela
educação, formação do caráter, além do apoio, da confiança, torcida e orações.
Em especial à minha mãe por segurar a minha mão até os dias de hoje.
Ao meu sobrinho Samuel Cerqueira Rocha, por todos os sorrisos,
demonstrações de amor e por fazer de mim seu porto seguro. Por sua vida,
que fortalece os meus dias e me faz querer ser exemplo de vitória e boa
conduta. Por despertar em mim um amor que eu ainda não sabia que seria
possível existir, e por tamanha cumplicidade.
Ao meu irmão Danilo de Santana Rocha e minha cunhada Ana Mara Cerqueira
Rocha por me darem o melhor presente que recebi na vida. Além das orações,
torcida, vibração e apoio.
À Marly Santos Silva, pela torcida e orações. E por ter me dado o prazer de ter
uma irmã, Ana Cecília.
À minha família pelo carinho e atenção, e pelas reuniões em que eu pude estar
presente.
Ao meu orientador Professor Dr. George Rego Albuquerque, por TUDO. Pela
confiança no meu desempenho, por apostar em mim e me proporcionar
diferentes trabalhos e aprendizados. Pela atenção e cobrança que me fizeram
crescer profissionalmente todos os dias. Obrigada por ser um pai acadêmico e
nunca me deixar desamparada.
vii
Ao Prof. Alexandre Dias Munhoz, por toda ajuda, esclarecimento e
preocupação com o meu trabalho.
Aos meus amigos acadêmicos, que SEMPRE torceram por mim, me
incentivaram, ensinaram e contribuíram para o meu crescimento, além do
companheirismo, alegria e respeito. Em especial Luciana Guimarães, Rodrigo
Bezerra, Carlos Mendonça, Valter Almeida, Fábio Carvalho, Mônia Souza,
Hannah Thame, Joana Oliveira e Luciana Teixeira.
A Roberta Moura, por sua amizade, pela alegria nos trabalhos e pela
contribuição e ajuda na condução desse trabalho.
Aos meus amigos “de casa”, por compreenderem os momentos de ausência,
pela amizade verdadeira e extremamente sincera que sempre proporcionaram
a mim. Especialmente Juliana Silveira e Elionay Senna.
Aos bolsistas de Iniciação Científica, que foram os melhores que alguém
poderia ter tido no Mestrado, por toda ajuda, disponibilidade e interesse em
participar e colaborar com esse trabalho. A ajuda de Pedro Alcântara, Taiane
Dórea, Emilli Anjos, Luana Nogueira e Michele Brito foi de extrema importância.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, pela disponibilidade e
prestação de serviços durante todo o curso. Em especial, Eduardo Góes Viana.
Aos funcionários do Hospital Veterinário, pelo apoio, carinho, pela paciência e
atenção. Em especial, Joilson, Josiene, Fabiana e Luana.
À Müller Ribeiro Andrade e Luis Fernando Pita Gondim, pela colaboração no
final da execução desse trabalho.
À Sofia Aline Amaral, pela companhia no laboratório e nos momentos de lazer,
pela troca de experiências no trabalho e na vida e por toda ajuda.
viii
Aos proprietários das fazendas estudadas por terem acreditado na importância
deste projeto e disponibilizarem alguns animais para estudo, permitindo a
realização da coleta de sangue e leite de suas ovelhas, material utilizado para
a realização deste trabalho.
Aos animais que fizeram parte desse trabalho, por possibilitar a ocorrência do
mesmo. Meu respeito e gratidão eterna.
Muito obrigada!
ix
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE Toxoplasma gondii EM LEITE DE OVELHAS
CRIADAS NO SUL DA BAHIA
RESUMO
Objetivou-se com o presente trabalho verificar a possibilidade de eliminação de DNA
de Toxoplasma gondii através do leite de ovelhas infectadas naturalmente na região
Sul da Bahia e correlacionar com os estágios agudo e crônico da infecção pelo
protozoário. Para este fim foram utilizadas 185 ovelhas lactantes, criadas
extensivamente em 13 propriedades, distribuídos em seis municipios. Foi utilizada a
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a pesquisa de DNA de T. gondii nas
amostras de leite. Para a detecção de anticorpos anti-T. gondii IgM e IgG, foi utilizado
o Teste de Hemaglutinação Indireta (HAI) e Reação de Imunofluorescência Indireta
(RIFI), respectivamente, ambos com ponto de corte de 1:64. Foi possível determinar a
presença de DNA do parasito em 9,7% (18/185) dos animais estudados. Anticorpos
IgM e IgG anti-T. gondii estavam presentes na proporção de 18,3% (34/185) e 31,9%
(59/185), respectivamente. Houve correlação entre a eliminação do protozoário no leite
e a presença de IgM em 16,7% (3/18) e de IgG em 38,9% (7/18), e não houve
associação em 44,4% (8/18) dos animais analisados. A elevada ocorrência de
soropositivos e presença do parasito no leite, permite concluir que o parasito está
presente na população ovina do sul da Bahia, e existe a possibilidade de infecção
através do consumo de leite in natura.
Palavras-chave: Leite. Ovelha. PCR. Sorologia. Toxoplasmose.
x
MOLECULAR IDENTIFICATION OF Toxoplasma gondii IN EWE’S MILK
RAISED IN THE SOUTHERN BAHIA
ABSTRACT
This study aimed to verify the possibility of elimination of Toxoplasma gondii DNA in
milk of naturally infected sheep in southern Bahia region and correlate with the acute
and chronic stages of infection by the protozoan. For this purpose were utilized 185
lactating ewes, raised extensively in 13 properties located in six municipalities.
Polymerase Chain Reaction ( PCR ) was used for the detection of T. gondii DNA in
milk samples and for the detection of anti-T . gondii IgM and IgG was used the indirect
hemagglutination test ( IHA) and Immunofluorescence Assay (IFA ), respectively, both
with a cutoff 1:64. It was possible to determine the presence of parasite DNA in 9.7%
(18 /185) of the animals studied. IgM and IgG antibodies anti -T. gondii were detected
18.3 % (34 /185) and 31.9 % (59 /185), respectively. There was a correlation between
the elimination of the parasite in the milk and the presence of IgM in 16.7 % ( 3/18 )
and IgG in 38.9 % ( 7/18 ) , and no association was verified in 44.4% ( 8/18 ) of animals
analyzed . The high occurrence of seropositive and presence of the parasite in milk
allows the conclusion that the parasite is present in the sheep population of southern
Bahia, and there is the possibility of infection through the consumption of fresh milk.
Keywords: Milk. Ewes. PCR. Serology. Toxoplasmosis.
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1. Esquema da estrutura celular de Toxoplasma gondii com
suas organelas (AJIOKA et al., 2001) ..................................
19
2. Taquizoíto de T. gondii em células de exsudato peritoneal
de um camundongo (DUBEY et al., 1998) ...........................
20
3. Esquema de divisão assexuada de T. gondii por
endodiogenia (modificado de FERGUSON et al., 2009) .....
20
4. Cisto tecidual de T. gondii em cérebro de camundongo,
contendo centenas de bradizoítos (DUBEY et al., 1998).....
21
5. Diferença morfológica entre taquizoíto (esquerda) e
bradizoíto (direita) de T. gondii (modificado de DUBEY et
al, 1998) ...............................................................................
22
6. Oocistos de T. gondii. (A) Oocisto não esporulado. (B)
Oocisto esporulado com dois esporocistos (setas indicam
a presença de quatro esporozoítos no esporocisto da
direita) (DUBEY et al., 1998) ...............................................
23
7. Ciclo biológico de T. gondii (modificado de DUBEY et al.,
1998) ....................................................................................
25
8. Rebanho ovino da raça Santa Inês e SRD .......................... 32
9. Coleta de sangue de ovelha mediante punção da veia
jugular externa .....................................................................
33
10. Resultado para a presença de DNA de Toxoplasma gondii
através da PCR. (MM) Marcador molecular; (POS)
Amostras positivas; (NEG) Amostras negativas; (CN)
Controle negativo; (CP) Controle positivo ............................
36
11. Resultado para anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii
através da RIFI. (A) Animal soronegativo para a diluição
1:64; (B) Animal soropositivos para a diluição testada ........
36
xii
12. Resultado para anticorpos IgM anti-Toxoplasma gondii
através do HAI. (A) Animal soropositivo para as três
diluições testadas (1:64; 1:128; 1:256); (B) Animal
soronegativo para ambas diluições testadas .......................
37
xiii
LISTA DE TABELA
Tabela Página
1. Pesquisas de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em
ovinos no Brasil, nos últimos 10 anos ..................................
29
2. Distribuição da pesquisa de anticorpos IgG anti-
Toxoplasma gondii em ovelhas lactantes nos municípios
no sul da Bahia ....................................................................
37
3. Distribuição da pesquisa de anticorpos IgM anti-
Toxoplasma gondii em ovelhas lactantes nos municípios
no sul da Bahia ....................................................................
37
xiv
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
DNA Ácido Desoxirribonucléico
ELISA “Enzyme Linked Imuno Sorbent Assay”
HAI Hematoaglutinação
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IFI Imunofluorescência Indireta
LAT Teste de Aglutinação em Látex
MAT Teste de Aglutinação Modificada
PBS Solução Fosfato Salina
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
RIFI Reação de Imunofluorescência Indireta
rpm rotações por minuto
xv
SUMÁRIO Pág.
Resumo............................................................................................... viii
Abstract.............................................................................................. ix
Lista de figuras .................................................................................. x
Lista de tabela ................................................................................... xii
Lista de abreviações e siglas........................................................... xiii
1. INTRODUÇÃO………….……………………………………………… 16
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..………………………………………... 18
2.1. Histórico de Toxoplasma gondii .......................................................... 18
2.2. Morfologia e biologia de Toxoplasma gondii ....................................... 18
2.2.1. Taquizoítos........................................................................................... 19
2.2.2. Bradizoítos .......................................................................................... 21
2.2.3. Oocistos ............................................................................................. 22
2.3. Ciclo biológico de Toxoplasma gondii.................................................. 23
2.4. Transmissão de Toxoplasma gondii..................................................... 25
2.5. Presença de Toxoplasma gondii no leite ............................................. 26
2.6. Toxoplasmose em ovinos .................................................................... 27
2.6.1. Distribuição da toxoplasmose ovina .................................................... 28
2.6.2. Patogenia da toxoplasmose ovina ....................................................... 28
2.6.3. Diagnóstico da toxoplasmose ovina .................................................... 30
3. OBJETIVOS ........................................................................................ 31
3.1. Objetivo geral ...................................................................................... 31
3.2. Objetivos específicos .......................................................................... 31
4. METODOLOGIA ............................................................................... 32
4.1. Área de estudo e período de coleta ................................................... 32
4.2. População de estudo e coleta de amostras ........................................ 32
4.3 Sorologia ............................................................................................. 33
4.3.1. Hemaglutinação Indireta (HAI) ........................................................... 33
4.3.2. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) ................................... 34
4.4. Identificação genética do leite ............................................................. 34
4.4.1. Extração de DNA de amostras de leite ............................................... 34
4.4.2. Amplificação do DNA de Toxoplasma gondii por PCR ....................... 34
5. RESULTADOS .................................................................................... 36
xvi
6. DISCUSSÃO ....................................................................................... 38
7. CONCLUSÃO ..................................................................................... 41
REFERÊNCIAS ................................................................................... 42
ANEXOS ............................................................................................. 50
17
1. INTRODUÇÃO
A ovinocultura é uma atividade econômica explorada em todo o mundo,
sob as mais diversas características bioclimatológicas (LEITE, 2004). No Brasil
o rebanho ovino apresenta um pouco mais de 17 milhões de animais, sendo
que 57,2% do rebanho total concentra-se na região Nordeste com 10.112.726
milhões (BRASIL, 2011). Nessa região, a ovinocultura representa uma
alternativa para oferta de carne, leite e derivados, proporcionando melhores
condições de vida da população rural (LEITE; SIMPLICIO, 2005). Somado a
isso, a carne ovina apresenta sabor diferenciado e características nutricionais
desejáveis, como baixo teor de gordura e alto valor proteico, o que contribui
para o consumo e consequentemente a produção (CUENCA et al., 2008).
A Bahia é o segundo maior produtor nacional, com um efetivo de
3.072.176 ovinos (BRASIL, 2011). Após a crise da monocultura do cacau, a
ovinocultura surgiu como uma alternativa para diversificação e consorciação de
culturas agrossilvopastoris do sul da Bahia, revelando um crescimento nesse
setor (ALVARES, 2005). Entretanto, a produção desses animais no clima
quente e úmido também pode favorecer a ocorrência de adversidades tanto em
aspectos produtivos (NEIVA et al., 2004) e também sanitários (GUIMARÃES et
al., 2013), contribuindo para o aumento na incidência de enfermidades. Dessa
forma, é de importância os estudos sobre doenças que influenciam na
produtividade do rebanho, a exemplo da toxoplasmose.
Toxoplasma gondii é um protozoário que parasita diversos hospedeiros
animais e também humanos, causando toxoplasmose. Esse parasito já foi
relatado em diversos animais de produção (TENTER et al., 2000), como
suínos, ovinos, caprinos e aves, o que demonstra seu potencial de infecção
para a população humana através do consumo de carne contaminada crua ou
mal cozida. O leite in natura não está entre as principais vias de transmissão do
parasito para outros animais e seres humanos, porém já foi confirmado casos
de toxoplasmose humana através do consumo de leite não pasteurizado de
cabras (CHIARI; NEVES, 1984).
A presença de T. gondii no leite apesar de pouco descrita, tem sido
relatada em diversas espécies animais, tais como cabras (VITOR et al., 1991),
18
cadelas (BRESCIANI et al., 2001), gatas (POWELL et al., 2001) e camelas
(ISHAG et al., 2006).
A toxoplasmose ovina merece atenção especial por causar distúrbios
reprodutivos, tais como má formação fetal, nascimento de cordeiros fracos e
principalmente abortamentos (BUXTON et al., 2007), acarretando em um
impacto econômico. Estudos sobre a presença do parasito em leite de ovinos
são escassos, porém já foi detectado a presença de seu DNA em amostras de
animais naturalmente infectados (FUSCO et al., 2007; CAMOSSI et al., 2011),
demonstrando a possibilidade de ingestão através do consumo in natura.
19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Histórico de Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii é um protozoário que foi encontrado e descrito quase
que concomitantemente em 1908 por Nicolle e Manceaux, na Tunísia enquanto
pesquisavam sobre leishmaniose em um roedor africano, o Ctenodactylus
gundi (NICOLLE; MANCEAUX, 1908 apud FERGUSON et al., 2009), e por
Splendore, no Brasil que o identificou em um coelho (Oryctolagus cuniculus)
(SPLENDORE, 1908). Ambos acreditaram se tratar de uma forma particular de
Leishmania. No ano seguinte, Nicolle e Manceaux notaram que haviam
descoberto um novo organismo e o denominou Toxoplasma gondii (NICOLLE;
MANCEAUX, 1909), baseado na sua morfologia (toxo = arco, plasma = forma)
e no hospedeiro encontrado.
A toxoplasmose humana foi relatada no Brasil na década de 20 por
Torres (1927 apud DUBEY et al., 2012), em uma criança de dois dias de idade
que apresentava espasmos musculares generalizado. A necropsia revelou
lesões correspondentes à infecção por T. gondii, tais como meningoencefalite,
miocardite e miosite, além da presença do parasito em cortes histológicos de
diversos órgãos.
Em ovinos, a toxoplasmose foi descrita primeiramente em 1942, por
Olafson e Monlux (DUBEY, 2008), e, desde 1954 T. gondii é descrito como
agente causador de problemas reprodutivos nessa espécie, especialmente
abortamentos (BUXTON, 1990). Esses prejuízos reprodutivos geram impactos
econômicos, e por esse motivo a toxoplasmose ovina merece destaque.
2.2. Morfologia e biologia de Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii é um parasito eucarioto intracelular que parasita
diversos tecidos, células nucleadas e líquidos orgânicos de diferentes animais
homeotérmicos (LEVINE, 1961; DUBEY, 1998), o que demonstra sua baixa
especificidade. Estruturalmente (Figura 1), apresenta organelas que exercem
diferentes funções, porém a presença de uma organela que auxilia na invasão
20
e manutenção na célula hospedeira, denominada roptria, o difere dos demais
protozoários (SMITH, 1995).
Figura 1. Esquema da estrutura celular de Toxoplasma gondii com suas
organelas (AJIOKA et al., 2001).
O mecanismo de invasão é rápido e ativo, pois dura alguns segundos e
tem início quando a porção anterior do parasito reconhece a célula hospedeira
e adere a esta com firmeza. Em seguida ocorre contração e protrusão do
conóide, promovendo a movimentação do parasito e secreção de micronemas
e outros produtos provenientes das roptrias. Após a invasão, todos esses
produtos permanecerão no vacúolo parasitóforo que o envolve e o protege
(MORISAKY et al., 1995; BLACK; BOOTHROYD, 2000).
Esse parasito apresenta três formas, potencialmente infectantes para
seus hospedeiros intermediários e definitivos: taquizoítos em colônias
celulares, bradizoítos contidos em cistos teciduais e esporozoítos em oocistos
esporulados (DUBEY et al., 1998).
2.2.1. Taquizoítos
Os taquizoítos (Figura 2) apresentam-se na forma de meia lua e medem
aproximadamente 2x6μm. São encontrados no período agudo da infecção, na
forma livre ou proliferativa dentro da célula hospedeira. Penetram na célula
pelo mecanismo de penetração ativa da membrana, tornando-se rodeado por
um vacúolo parasitóforo, que o envolve e protege dos mecanismos de defesa
do hospedeiro (DUBEY, 2004).
21
Figura 2. Taquizoíto de T. gondii em células de exsudato peritoneal de um
camundongo (DUBEY et al., 1998).
A multiplicação de taquizoítos ocorre de forma assexuada e de maneira
rápida por endodiogenia (Figura 3), ou seja, divisões binárias repetidas que
promovem a ruptura da célula hospedeira. Após um determinado número de
divisões, estes se diferenciam em bradizoítos (DUBEY, 2004).
Esta forma é muito sensível às condições ambientais, sendo facilmente
destruído fora do hospedeiro por desidratação e variações de osmolaridade,
além de apresentar também menor resistência à tripsina ou pepsina.
Taquizoítos são mortos por pasteurização e aquecimento (DUBEY, 1998;
TENTER et al., 2000). Desempenham papel importante na transmissão vertical
de T. gondii pela placenta, transfusão de sangue (TENTER et al., 2000), ou
pelo leite (CHIARI;NEVES, 1984).
Figura 3. Esquema de divisão assexuada de T. gondii por endodiogenia
(modificado de FERGUSON et al., 2009).
22
2.2.2. Bradizoítos
Depois de sucessivas divisões, taquizoítos diferenciam-se em
bradizoítos que formarão os cistos teciduais (Figura 4), se apresentam de
tamanho variável (5 a 70 μm) e podem conter centenas de bradizoítos (JONES;
DUBEY, 2010). Cistos crescem intracelularmente, tornam-se imunologicamente
inertes e permanecem se multiplicando lentamente por endodiogenia. Os
bradizoítos estão presentes em infecções crônicas e são também chamados de
cistozoítos (DUBEY, 1998; DUBEY, 2008).
Figura 4. Cisto tecidual de T. gondii em cérebro de camundongo, contendo
centenas de bradizoítos (DUBEY et al., 1998).
Bradizoítos diferem ligeiramente de taquizoítos pela localização do
núcleo que está situado na direção posterior final, enquanto que em taquizoítos
é centralizado (Figura 5), além de serem mais delgados e menos suscetíveis à
destruição pelas enzimas proteolíticas (DUBEY et al., 1998; DUBEY, 2004).
Cistos teciduais podem se desenvolver em diversos órgãos, incluindo
pulmões, fígado e rins, porém eles apresentam maior prevalência em olhos e
tecidos musculares e nervosos, incluindo musculaturas esquelética e cardíaca
e cérebro, devido ao acesso restrito de anticorpos a esses locais, e podem
persistir durante a vida do hospedeiro (DUBEY et al., 1998), ou ainda serem
transmitidos através do leite (PETTERSEN, 1984) .
Esta forma é relativamente resistente à digestão gástrica e mudanças de
temperatura permanecendo infeccioso sob refrigeração (1 a 4ºC) por até três
semanas e congelamento entre -1 e -8ºC por mais de uma semana. Porém,
muitos são inativados a temperaturas de -12ºC ou menor, por 24 horas e em
23
temperatura de aquecimento à 67ºC. Alguns cistos podem permanecer
infecciosos, se o processo de cozimento da carne for desigual, como por
exemplo, com o uso de microondas (DUBEY, 1998; TENTER et al., 2000).
Um estudo realizado por Warnekulasuriya et al. (1908) demonstra que o
procedimento comercial de cura não destrói todos os parasitos presentes na
carne, podendo permanecer alguns ainda viáveis. Dessa forma, os cistos são
importantes no ciclo de vida do T. gondii, pois hospedeiros carnívoros podem
ser infectados pela ingestão de carne infectada (DUBEY, 2008).
Figura 5. Diferença morfológica entre taquizoíto (esquerda) e bradizoíto
(direita) de T. gondii (modificado de DUBEY et al, 1998).
2.2.3. Oocistos
Os oocistos (Figura 6) são produtos da reprodução sexuada do parasito
em um processo denominado gametogonia, que ocorre no interior das células
do epitélio intestinal dos felídeos, os hospedeiros definitivos e se apresentam
de forma esférica, medindo aproximadamente 10 a 12 μm de diâmetro
(DUBEY, 2004). São excretados em milhões através das fezes (DUBEY, 1998)
sem potencial de infecção e no solo os oocistos sofrem um processo de
esporulação, que depende de temperatura, umidade e oxigenação favoráveis
para tornarem-se infectantes em até 21 dias. Oocistos esporulados contêm
dois esporocistos, com quatro esporozoítos cada (TENTER et al., 2000).
O período de eliminação de oocistos e a quantidade eliminada pelos
felídeos dependem da forma ingerida de T. gondii. No caso da ingestão de
24
taquizoítos ou oocistos o período pré-patente é maior, cerca de treze a dezoito
dias sendo que menos de 50% dos gatos eliminam oocistos, porém após a
ingestão de cistos teciduais ou bradizoítos, a eliminação ocorre entre três e dez
dias e quase todos os gatos eliminam oocistos (DUBEY, 2008; JONES;
DUBEY, 2010). Um único gato pode eliminar mais de 100 milhões de oocistos
no ambiente, isso ocorre principalmente após uma infecção primária por T.
gondii. A eliminação de oocistos após a reinfecção com T. gondii é rara, assim
como a re-eliminação pelo felino (DUBEY, 2004).
Os oocistos podem permanecer viáveis no ambiente em condições
favoráveis por até 18 meses, devido à presença de uma parede dupla, sendo,
portanto uma forma de resistência e de disseminação ambiental desse parasito
(TENTER et al., 2000).
Os oocistos são resistentes a agentes químicos e físicos da água,
aplicados atualmente nas estações de tratamento, incluindo a cloração, o
tratamento de ozônio e os raios ultravioletas (JONES; DUBEY, 2010). Oocistos
junto com as fezes dos gatos no ambiente podem contaminar água ou
alimentos e servir de fonte de infecção pós-natal dos animais herbívoros
durante a alimentação (da SILVA et al., 2006).
Figura 6. Oocistos de T. gondii. (A) Oocisto não esporulado. (B) Oocisto
esporulado com dois esporocistos (setas indicam a presença de quatro
esporozoítos no esporocisto da direita) (DUBEY et al., 1998).
2.3. Ciclo biológico de Toxoplasma gondii
Somente na década de 60, após a descoberta de que as fezes dos gatos
continham um estágio capaz de infectar hospedeiros intermediários, o ciclo de
vida de Toxoplasma gondii foi esclarecido. Posteriormente foi descoberto que
os estágios eram provenientes da reprodução sexual no intestino dos felídeos
25
(TENTER et al., 2000). Esse parasito possui ciclo de vida heteroxeno
facultativo (Figura 7) com duas fases distintas: a fase sexuada ou gametogonia
que ocorre exclusivamente no intestino de seus hospedeiros definitivos e a fase
assexuada que ocorre em quaisquer hospedeiros (DUBEY, 1998).
A gametogonia ocorre após sucessivas esquizogonias ou merogonias,
que originam cerca de cinco tipos morfologicamente distintos. Essa reprodução
enteroepitelial dará origem aos gametas masculinos e femininos no intestino
delgado dos felinos. O gameta masculino, denominado microgameta,
apresenta dois flagelos que permitem sua locomoção para penetrar o gameta
feminino ou macrogameta. Após fecundação, há a formação do ovo ou zigoto e
da parede do oocisto que, ao atingir a maturidade, rompe as células do epitélio
intestinal, sendo liberado para o meio ambiente junto com as fezes. No
ambiente ocorre esporogonia, multiplicação assexuada que torna o oocisto
infectante, contendo dois esporocistos com quatro esporozoítos cada (DUBEY;
FRENKEL, 1972; DUBEY, 1998).
O desenvolvimento extra-intestinal ou assexuado é composto de duas
fases. Na primeira, os taquizoítos realizam sucessivas endodiogenias gerando
duas células filhas, que rompem a célula mãe e se disseminam através do
sangue ou linfa pelo organismo do hospedeiro, caracterizando a fase aguda da
doença, que pode culminar com o aparecimento de sintomas clínicos. A
segunda fase ocorre nos taquizoítos de última geração, após o sistema imune
atuar no parasito, a partir daí o mesmo se refugia dentro das células por um
processo de diferenciação para bradizoítos, resultando na formação de cistos
teciduais. Dentro do cisto, estes se multiplicam lentamente por endodiogenia
permanecendo em estado de latência (DUBEY et al., 1998).
Apenas os felídeos exercem o papel de hospedeiros definitivos e
intermediários do parasito. Após serem ingeridos, cistos teciduais têm sua
parede digerida por enzimas proteolíticas do estômago e do intestino delgado,
liberando os bradizoítos, que penetram a lâmina própria do intestino e se
diferenciam em taquizoítos. Em algumas horas, T. gondii pode se difundir para
os tecidos extra-intestinais. Já os bradizoítos que permanecem nas células
epiteliais do intestino delgado se desenvolvem em várias gerações e depois
realizam a multiplicação sexuada (DUBEY, 2004).
26
Figura 7. Ciclo biológico de T. gondii (modificado de DUBEY et al., 1998).
2.4. Transmissão de Toxoplasma gondii
Existem duas vias principais de transmissão do parasito que podem
causar infecção por T. gondii e ocorrem com a participação das três formas
infectantes: a primeira via é a horizontal, através da ingestão de oocistos
esporulados presentes em água ou alimento contaminados, ou pela ingestão
de cistos teciduais encontrados em carne ou vísceras crua ou mal cozida; a
segunda via é a vertical, por taquizoítos circulantes através da placenta durante
a primo-infecção aguda materna (TENTER et al., 2000; DUNCANSON et al.,
2001).
Outras vias de transmissão de T. gondii podem ocorrer e, embora com
menor frequência, podem ser citadas e consideradas de importância:
transplante de órgãos ou medula, ocorrendo transferência do parasito para o
doador, ou reativação da infecção pela susceptibilidade, transfusão sanguínea
(TENTER et al., 2000), por via venérea (MORAES et al., 2010), ou através do
leite in natura (RIEMANN et al., 1975) com taquizoítos.
A infecção em humanos tem relação principalmente com o estilo de vida
do indivíduo, que representa um papel importante na forma como o parasito é
27
adquirido. Hábitos alimentares como consumo de carne crua ou mal cozida, ou
leite não pasteurizado aumentam as chances de ingestão de cistos teciduais e
taquizoítos, respectivamente tornando-se uma importante fonte de infecção,
enquanto que, para vegetarianos a maior fonte de infecção encontra-se em
legumes e vegetais contaminados com oocistos esporulados (FERGUSON,
2009).
2.5. Presença de Toxoplasma gondii no leite
A presença de T. gondii em leite tem sido questionada, pois até o
momento existem poucos estudos relacionados a esse tipo de transmissão.
Sabe-se que a prevalência da toxoplasmose é maior em animais mais velhos,
visto que estes possuem maior chance de contato com o parasito pelo tempo
de exposição (GUIMARÃES et al., 2013), a exemplo de fêmeas reprodutoras.
Animais lactantes podem eliminar o parasito através do leite na forma de
taquizoítos (CHIARI; NEVES, 1984) ou cistos teciduais (PETTERSEN, 1984), e
estes serem ingeridos pelos filhotes ou outros animais. Alguns parasitos podem
ser destruídos ao chegarem ao estômago, já outros podem penetrar a mucosa
oral (CHIARI; NEVES, 1984) e provocar a enfermidade e se desenvolver
formando cistos (DUBEY, 1998).
Na zona rural o leite e seus derivados são importantes fontes de
alimento e, na maioria das vezes, o seu consumo é realizado na forma não
pasteurizada (LEITE; SIMPLÍCIO, 2005), aumentando o risco de infecção por
T. gondii. Somado a isso, tem-se indivíduos tolerantes à lactose bovina e, por
esse motivo fazem uso do leite de pequenos ruminantes em substituição ao de
vacas (BRITO, 2006).
Experimentalmente, já foi demonstrada a eliminação de T. gondii pelo
leite em algumas espécies, tais como, cabras (VITOR et al., 1991), cadelas
(BRESCIANI et al., 2001), gatas (POWELL et al., 2001) e camelas (ISHAG et
al., 2006). Estudos realizados com camundongos revelam que a eliminação
pelo leite do parasito não ocorre apenas no período agudo da infecção, através
de taquizoítos, mas também na fase crônica pela excreção de cistos teciduais
(PETTERSEN, 1984; COSTA, LANGONI, 2010).
28
A eliminação do agente pelo leite em infecções naturais foram relatadas
em pequenos ruminantes, tais como cabras (CHIARI; NEVES, 1984), e ovelhas
(FUSCO et al., 2007; CAMOSSI et al., 2011). Para essas espécies há
preocupação devido à possibilidade de infectar humanos, como já foi relatado
em diversos estudos (SACKS et al., 1982; CHIARI; NEVES, 1984; RIEMANN et
al., 1975; HIGA et al., 2010).
Na Itália, Fusco et al. (2007) avaliaram a presença de T. gondii no leite
de 117 ovelhas naturalmente infectadas, e encontraram 3,4% de amostras
positivas. No Brasil, Camossi et al. (2011) detectaram DNA do parasito em
5,03% das 139 amostras avaliadas. Apesar de não ser considerada uma das
principais vias de transmissão, esses estudos destacam a existência da
possibilidade de infecção pela ingestão do leite in natura.
2.6. Toxoplasmose em ovinos
Ovinos são considerados hospedeiros intermediários de T. gondii, e a
infecção nessa espécie tem sido relatada desde 1957 (HARTLEY; MARSHALL,
1957 apud BUXTON, 1990). O Brasil conta com mais de 17 milhões de
animais, sendo que 57,2% da produção nacional ocorre na região Nordeste,
com 10.112.726 milhões (BRASIL, 2011), porém acredita-se que esses
números estão subestimados, devido a produção familiar em propriedades não
cadastradas.
A infecção toxoplásmica em ovinos é particularmente importante, por
causar problemas reprodutivos (PEREIRA-BUENO et al., 2004) e
consequentes perdas econômicas na produção. As desordens reprodutivas vão
desde má formação fetal, natimortos, nascimento de cordeiros fracos, até
abortamentos, considerada a principal consequência da infecção (BUXTON et
al., 2007).
A prevalência de T. gondii em pequenos ruminantes geralmente é
elevada devido à contaminação contínua de oocistos presentes nas pastagens
(DUBEY, 2004). Os estudos envolvendo diagnóstico de T. gondii na espécie
ovina geralmente estão limitados ao levantamento epidemiológico e avaliação
de fatores de risco associados à infecção, não diferenciando os estágios agudo
e crônico da infecção (CAMOSSI et al., 2011).
29
2.6.1. Distribuição da toxoplasmose ovina
Por ser uma zoonose cosmopolita, a toxoplasmose está presente no
mundo inteiro. Estudos de prevalência nessa espécie em diversos países
demonstram sua susceptibilidade ao parasito. No Brasil, ocorre variação de 7%
no Paraná (de MOURA et al., 2007) a 59% em Pernambuco (COSTA et al.,
2012) na prevalência de anticorpos anti-T. gondii nos últimos anos (Tabela 1).
2.6.2. Patogenia da toxoplasmose ovina
Toxoplasma gondii tem capacidade de colonização em diferentes órgãos
no período crônico da infecção, principalmente cérebro, olho, musculatura
esquelética e cardíaca, ou ainda em vísceras como pulmões, fígado, rins e
placenta (DUBEY, et al., 1998; TENTER et al., 2000 BUXTON et al., 2007).
Geralmente os abortos em ruminantes estão relacionados com outros
agentes, a exemplo de Brucella spp, Salmonella spp. e Campylobacter spp.
(HURTADO et al., 2001). A espécie ovina é susceptível ao aparecimento de
sintomas da toxoplasmose, principalmente os de caráter reprodutivo (BUXTON,
1990), deixando, portanto de ser assintomática como na maioria dos casos.
A severidade da infecção está relacionada ao tempo de gestação, pois
quanto mais cedo ocorre, maiores são as consequências (BUXTON et al.,
2007). Quando o parasito se instala nos placentomas provoca lesão pela
multiplicação acentuada, levando à reação inflamatória e necrose da placenta.
Devido ao processo gestacional o sistema imunológico é suprimido e, mãe e
filho tornam-se vulneráveis, não havendo resposta contra o parasito (BUXTON
et al., 2007).
As infecções que ocorrem até o 40º dia de gestação pode ocorrer morte
embrionária e reabsorção fetal, entre 40 e 120 dias maceração fetal,
mumificação ou abortamento, e após 120 dias pode gerar natimortos ou
nascimentos de cordeiros fracos (AHMED et al., 2008), ou ainda filhotes
clinicamente normais (BUXTON; INNES, 1995). A resposta imunológica do feto
é iniciada por volta do entre 60º-70º dia de gestação, e ainda assim não
garante proteção suficiente contra o parasito até o nascimento (BUXTON;
FINLAYSON, 1986).
30
Tabela 1. Pesquisas de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em ovinos no Brasil,
nos últimos 10 anos.
Referência Ano Estado Método N° animais
analisados
% animais
positivos
da Silva et al. 2003 Pernambuco IFIª 173 35,3%
Meireles et al. 2003 São Paulo ELISAb 200 31,0%
Ogawa et al. 2003 Paraná IFI 339 54,6%
Figliuolo et al. 2004 São Paulo IFI 597 34,7%
Silva; de La Rue 2006 Rio Grande do Sul LATc 144 30,5%
Clementino et al. 2007 Rio Grande do
Norte
ELISA 102 29,4%
de Moura et al. 2007 Paraná IFI 157 7%
Romanelli et al. 2007 Paraná IFI 305 51,5%
Ragozo et al., 2008 São Paulo MATd 495 24,2%
Soares et al. 2009 Rio Grande do
Norte
IFI 409 20,7%
Soccol et al. 2009 Paraná ELISA 167 25,7%
Pinheiro et al. 2009 Alagoas IFI 432 32,9%
Ueno et al. 2009 Distrito Federal IFI 1028 38,2%
Lopes et al. 2010 São Paulo IFI 488 54,0%
Filho et al. 2010 Pará HAIe 315 44,29%
Bispo et al. 2011 Pernambuco IFI 124 48,4%
Camossi et al. 2011 São Paulo MAT 139 50,4%
da Silva et al. 2011 São Paulo IFI 602 10,96%
Langoni et al. 2011 São Paulo IFI 382 18,6%
Costa et al. 2012 Pernambuco IFI 97 59,0%
Mendonça et al. 2013 Sergipe IFI 932 28,2%
Guimarães et al. 2013 Bahia IFI 795 30,2%
ªIFI = Reação de Imunofluorescência Indireta; bELISA = Enzyme Linked Imuno Sorbent
Assay; cLAT = Teste de Aglutinação em Látex; dMAT = Teste de Aglutinação
Modificada; eHAI = Hemaglutinação Indireta.
31
2.6.3. Diagnóstico da toxoplasmose ovina
Os sinais clínicos da toxoplasmose geralmente são inespecíficos, e, por
esse motivo, seu diagnóstico clínico é considerado difícil, sendo necessária a
utilização de técnicas laboratoriais para confirmação (da COSTA et al., 2007).
O isolamento do parasito pode ser realizado através do ensaio biológico em
camundongos ou cultura celular que proporcionam ainda seu crescimento
(DEROUIN et al., 1987).
A detecção de anticorpos ainda é considerada a forma mais eficaz, pois
possibilita o controle da toxoplasmose, visto que o quadro clínico da infecção
pode ser confundido com outras doenças (da SILVA et al., 2002). Os exames
sorológicos objetivam a identificação de anticorpos específicos anti-T.gondii, e
avaliam a infecção. Os mais utilizados são Método de Aglutinação Direta
(MAD) (da SILVA et al., 2002), Ensaio Imunoenzimático (ELISA) (MEIRELES et
al., 2003), Teste de Aglutinação do Látex (LAT) (SILVA; de LA RUE, 2006),
Teste de Aglutinação Modificada (MAT) (RAGOZO et al., 2008),
Hemaglutinação Indireta (HAI) (FILHO et al., 2010) e Imunofluorescência
Indireta (IFI) (GUIMARÃES et al., 2013).
O diagnóstico molecular confirma a presença do parasito através da
detecção de seu DNA (ABU-DALBOUH et al., 2012) em diversos tecidos ou
secreções animais. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) amplifica o
material genético do agente a ser pesquisado (SINGH, 1997), facilitando a sua
visualização. Contudo, essa técnica possui um custo elevado, o que restringe a
sua utilização.
32
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Determinar a possibilidade de eliminação de Toxoplasma gondii em leite
de ovelhas infectadas naturalmente no sul da Bahia e correlacionar com os
estágios agudo e crônico da infecção pelo parasito.
3.2. Objetivos Específicos
1. Identificar a presença de DNA de Toxoplasma gondii, através da Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) em amostras de leite de ovelhas criadas na
região Sul da Bahia;
2. Correlacionar a presença de DNA no leite com os anticorpos das classes de
IgM e IgG anti-Toxoplasma gondii em amostras de sangue de ovelhas criadas
na região Sul da Bahia.
33
4. METODOLOGIA
4.1. Área de estudo e período de coleta
O estudo foi realizado entre agosto de 2012 a junho de 2013. A área
selecionada para a coleta das amostras foi a microrregião de Ilhéus - Itabuna,
estado da Bahia. A Bahia é o terceiro maior estado brasileiro com uma área
total de 564.839.850 Km² e composta por 417 municípios divididos em 06
mesorregiões. A microrregião de Ilhéus–Itabuna é composta por 41 municípios.
4.2. População de estudo e coleta de amostras
Este estudo envolveu 185 ovelhas lactantes, de 13 propriedades
agrícolas cadastradas na Cooperativa de Produtores de Caprinos e Ovinos do
Sul da Bahia (COOPERVINO), distribuídas nos seis municípios de maior
população. O rebanho foi composto basicamente por animais da raça Santa
Inês ou sem raça definida (Figura 8). A idade dos animais foi estimada através
da cronologia dentária.
Figura 8. Rebanho ovino de raça Santa Inês e SRD.
As amostras de sangue dos animais selecionados foram coletadas
mediante punção da veia jugular externa (Figura 9), utilizando-se agulhas
descartáveis acopladas em tubos à vácuo sem anticoagulante. Para obtenção
34
dos soros, os tubos foram centrifugados a 1600g por 10 minutos,
acondicionados em microtubos e congelados a -20ºC até que os testes
sorológicos fossem realizados.
Figura 9. Coleta de sangue de ovelha mediante punção da veia jugular
externa.
As amostras de leite dos animais selecionados foram coletados no
volume de aproximadamente 10mL, mediante ordenha manual de ovelhas
lactantes, acondicionados e encaminhado ao Laboratório de Parasitologia
Veterinária da Universidade Estadual de Santa Cruz, sendo armazenados a
-20ºC até o momento da sua utilização. A realização do estudo foi aprovado
pelo comitê de ética (CEUA-UESC 031/09).
4.3. Sorologia
4.3.1. Hemaglutinação Indireta
Para pesquisa de anticorpos IgM contra T. gondii foi utilizada o Teste de
Hemaglutinação Indireta (HAI), considerando o ponto de corte de 1:64 (FILHO
et al., 2010). Os soros foram diluídos com a solução de 2-mercaptoetanol e
posteriormente foi adicionada a solução de hemácia, seguindo instruções do kit
comercial (Imuno-HAI Toxoplasmose Wama Diagnóstica®). Em seguida, a
35
placa foi incubada a 37ºC por uma hora. A leitura da reação foi realizada na
própria placa.
4.3.2. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)
Para pesquisa de anticorpos IgG contra T. gondii foi utilizada a Reação
de Imunofluorescência Indireta (RIFI), considerando ponte de corte de 1:64
(FIGLIUOLO et al., 2004). Os antígenos foram produzidos utilizando taquizoítos
de T. gondii da cepa RH, adicionados à lâminas de imunofluorescência e
armazenados a -20ºC até a sua utilização. Os soros diluídos em PBS (Solução
Fosfato Salina) e adicionados aos poços, incubadas e lavadas. Posteriormente,
foi adicionado o conjugado anti-ovino IgG FITC (SIGMA, F7634, St. Louis, MO,
USA), novamente incubadas e lavadas.
A leitura das lâminas foi realizada utilizando o microscópio com sistema
de epifluorescência (OLYMPUS, BX 51). Foi considerada positiva a reação com
completa fluorescência na periferia dos taquizoítos em 50% ou mais da lâmina.
4.4. Identificação de Toxoplasma gondii nas amostras de leite
4.4.1. Extração do DNA de amostras de leite
No laboratório de Parasitologia Veterinária foi retirado um volume de
200µl para a realização da extração do DNA utilizando o Kit Easy-DNA®
(Invitrogen). Após a realização da extração, as amostras de DNA foram levadas
ao Laboratório de Genética Animal, quantificadas em espectrofotômetro com
comprimento de onda de 260nm e padronizadas para 50 ng/μL de DNA. A
integridade do DNA foi avaliada em gel de agarose 1%, com coloração de
brometo de etídeo (0,5 μg/mL), fotodocumentados e estocado a -20°C até a
execução da PCR.
4.4.2. Amplificação do DNA de Toxoplasma gondii por PCR
A amplificação de DNA de T. gondii foi realizada utilizando o método
descrito por Homan et al. (2000). Primers Tox4
36
(3’CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG5’) e Tox5
(3’CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT5’) foram usados, resultando em um
fragmento com 529 bp (Genebank N0AFI46527) do DNA de T. gondii. O PCR
foi desenvolvido utilizando 4μl do DNA extraído e adicionado a 21μl de uma
mistura de 3,0mM de cada iniciador, 1,0 mM de dNTPs, 1,0 mM de MgCl2 e
0,2U de Taq DNA polimerase. A amplificação do DNA do parasito foi feita em
35 ciclos em um termociclador, usando as seguintes condições: 5 minutos a
94°C para desnaturação em um ciclo único, seguindo-se 35 ciclos de um
minuto a 94°C para desnaturação, um minuto a 60°C para anelamento e um
minuto a 72°C para extensão da Taq DNA Polimerase, seguido por uma
extensão final de 7 minutos a 72°C. Os produtos de cada PCR foram então
submetidos à eletroforese em gel de agarose à 2%, corados com brometo de
etídio e fotodocumentados. Foi utilizado DNA de taquizoíto de T. gondii como
controle positivo, e água ultra pura como controle negativo da PCR.
37
5. RESULTADOS
A presença de DNA de Toxoplasma gondii ocorreu em 9,7% (18/185)
das amostras de leite através da PCR (Figura 10). Foi possível correlacionar
sua eliminação com a presença de anticorpos IgM e IgG anti-T. gondii em
16,7% (3/18) e 38,9% (7/18), respectivamente, e não houve associação em
44,4% (8/18) dos animais analisados.
Figura 10. Resultado para a presença de DNA de Toxoplasma gondii através
da PCR. (MM) Marcador molecular; (POS) Amostras positivas; (NEG) Amostras
negativas; (CN) Controle negativo; (CP) Controle positivo.
Foram encontrados anticorpos IgG contra T. gondii através da RIFI
(Figura 11) em 33% (61/185) dos animais analisados e IgM em 18,3% (34/185)
pela HAI (Figura 12). Todas as propriedades apresentaram pelo menos um
animal sororeagente para os anticorpos analisados (Tabelas 2 e 3).
Figura 11. Resultado para anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii através da
RIFI. (A) Animal soronegativo para a diluição 1:64; (B) Animal soropositivo para
a diluição testada.
38
Figura 12. Resultado para anticorpos IgM anti-Toxoplasma gondii através do
HAI. (A) Animal soropositivo para as três diluições testadas (1:64, 1:128;
1:256); (B) Animal soronegativo para ambas diluições testadas.
Tabela 2 – Distribuição da pesquisa de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii
em ovelhas lactantes nos municípios no sul da Bahia.
Município Reativos a T. gondii (IgG)
Não reativos a T. gondii (IgG)
Total
n % N % n %
Canavieiras 1 6,7 14 93,3 15 8,1 Ibicaraí 7 41,2 10 58,8 17 9,2 Ilhéus 20 38,5 32 61,5 52 28,1 Itacaré 22 62,9 13 37,1 35 18,9 Itapé 6 17,1 29 82,9 35 18,9
Uruçuca 5 16,1 26 83,9 31 16,8
Total
61
33
124
67
185
100
Tabela 3 – Distribuição da pesquisa de anticorpos IgM anti-Toxoplasma gondii
em ovelhas lactantes nos municípios no sul da Bahia.
Município Reativos a T. gondii (IgM)
Não reativos a T. gondii (IgM)
Total
n % N % n %
Canavieiras 0 0 15 100 15 8,1 Ibicaraí 5 29,4 12 70,6 17 9,2 Ilhéus 13 25 39 75 52 28 Itacaré 8 22,8 27 77,2 35 19 Itapé 7 20 28 80 35 19
Uruçuca 1 3,2 30 96,8 31 16,7
Total
34
18,3
151
81,7
185
100
39
6. DISCUSSÃO
A presença de DNA de T. gondii foi detectada em 9,7% (18/185) das
amostras de leite de ovelhas analisadas. Até o momento não foram realizados
estudos para essa espécie na região Nordeste, porém esse resultado foi
semelhante ao encontrado por Bezerra et al. (2012) em cabras criadas em
Pernambuco (6,87%). Em ovinos, estudos realizados na Itália e no Brasil
identificaram a presença de DNA do parasito em 3,4% (FUSCO et al., 2007) e
5,03% (CAMOSSI et al. 2011), respectivamente.
Langoni et al. (2011) demonstraram que a positividade de T. gondii em
ovinos é mais baixa em Botucatu, local estudado por Camossi et al. (2011),
com valor de 18,6%. Guimarães et al. (2013) revelam que ovinos da Bahia,
local desse estudo, são mais expostos à infecção por T. gondii, com valor de
30,2%. Estes resultados evidenciam que os animais de Botucatu são menos
infectados por T. gondii que os da Bahia, justificando a diferença obtida nos
PCRs. O sul da Bahia possui características climáticas de umidade,
temperatura e precipitação pluviométrica estáveis durante todo ano e ideais ao
parasito. Além de ter uma extensa população de felídeos domésticos e
selvagens o que favorece o estabelecimento e proliferação de T. gondii.
A associação entre a presença de anticorpos IgM anti-T. gondii e o DNA
do parasito no leite ocorreu em 16,7% (3/18) dos animais testados. Fêmeas
com infecção aguda possuem taquizoítos circulantes no organismo e estes
podem ser eliminados através do leite, o que pode ter ocorrido com os animais
desse estudo, como já foi descrito em caprinos por Chiari e Neves (1984).
A presença concomitante de anticorpos IgG anti-T. gondii e o DNA do
protozoário no leite esteve presente em 38,9% (7/18) dos animais estudados.
Segundo Pettersen (1984), camundongos fêmeas infectadas
experimentalmente com T. gondii excretam cistos teciduais em seu leite. O
resultado obtido nesse estudo demonstra a possibilidade de eliminação do
parasito no leite das ovelhas cronicamente infectadas. Além disso, fêmeas tem
uma queda da imunidade durante a gravidez (ROBERTS, et al., 2001),
principalmente no período de periparto podendo ocorrer a reativação dos cistos
teciduais em taquizoítos gerando a contaminação do leite (CAMOSSI et al.,
2011).
40
No presente estudo 44,4% (8/18) dos animais apresentaram DNA de T.
gondii em seu leite com resultado negativo para ambos testes sorológicos.
Anticorpos IgM são encontrados poucos dias após a infecção e decaem
rapidamente, e em casos raros os anticorpos IgG não podem ser detectáveis
no início da infecção (MONTOYA, 2002; GRAS et al., 2004). A possibilidade é
que esses animais tiveram suas amostras de sangue coletadas no período
inicial, porém de transição da infecção, e por esse motivo, seus títulos de IgM
haviam decaído e de IgG ainda não apresentavam suficientemente elevados
para reagir ao teste utilizado.
A prevalência de anticorpos contra T. gondii em ovinos no Brasil varia de
7% no Paraná (de MOURA et al., 2007) a 59% em Pernambuco (COSTA et al.,
2012). Dos trabalhos realizados no Nordeste para a pesquisa de IgG,
resultados similares foram encontrados por Clementino et al. (2007) no Rio
Grande do Norte (29,4%), Mendonça et al. (2013) em Sergipe (28,2%),
Guimarães et al. (2013) na Bahia (30,2%) e Pinheiro Jr. et al. (2009) em
Alagoas (32,9%). Entretanto, foi superior aos valores encontrados por Soares
et al. (2009) no Rio Grande do Norte (20,7%) e inferior aos encontrados por da
Silva et al. (2003) em Pernambuco (35,3%).
Os resultados similares podem ser justificados pela semelhança
climática, tipo de criação familiar e extensiva entre as regiões estudadas. Com
relação aos valores superiores encontrados, pode-se afirmar que Soares et al.
(2009) estudaram animais do município de Mossoró (Rio Grande do Norte),
que possui clima semiárido com baixa umidade e temperaturas elevadas,
condições que afetam a presença de T. gondii. Quanto ao artigo de Silva et al.
(2003), que teve um resultado superior, foi utilizado um ponto de corte de 1:16
pode ter influenciado na maior ocorrência de animais positivos quando
comparado a este estudo, pois soros menos diluídos possibilitam a detecção
de anticorpos anti-T. gondii.
A diferença na ocorrência entre os anticorpos IgM e IgG são esperados,
Sedlak e Bartova (2006) encontraram resultados de IgM e IgG,
respectivamente, de 2,4% e 25,9% em cães, e 2,8% e 44,1% em gatos. Até o
momento não foram encontrados estudos que especifiquem a pesquisa de IgM
em soros de ovinos, dessa forma não existe a possibilidade de confrontar com
o resultado de 18,3% obtido nesse estudo.
41
A prevalência menor de anticorpos IgM quando comparada a
prevalência de IgG (33%) é justificada pelo tempo de produção e a meia vida
desses anticorpos. IgM é a classe de anticorpo detectada primeiramente,
aproximadamente até o 14º dias após a infecção por T. gondii e, após esse
período declina rapidamente à níveis indetectáveis, demonstrando uma meia
vida mais curta. Diferentemente, o IgG pode ser detectado após o 14º dia da
infecção e persiste por um tempo indefinido, apresentando uma meia vida mais
longa (MONTOYA, 2002; GRAS et al., 2004).
Dentre os municípios estudados, Canavieiras apresentou a menor
positividade (0% e 6,7%) na pesquisa de IgM e IgG, respectivamente. Apesar
dos municípios estarem localizados na mesma microrregião, a diferença de
soropositividade entre eles pode ter ocorrido devido ao desmatamento
acentuado da Mata Atlântica em Canavieiras, entre os anos de 2010 e 2011
(PIRES, 2012), elevando as temperaturas médias e reduzindo a umidade, o
que interfere nas condições ambientais favoráveis para a manutenção de
oocistos (GUIMARÃES et al., 2013), principal forma de contaminação para
ovinos (DUBEY et al., 2012).
Nesse estudo a determinação da infecção natural por T. gondii foi
constatada. Em propriedades rurais o leite é muito utilizado como fonte
alimento para famílias devido ao seu alto valor proteico, dessa forma seu
cosumo é economicamente importante (CAMOSSI et al., 2011) e em grande
parte de forma in natura. Não existe até o presente momento associação entre
a toxoplasmose clínica humana e a ingestão do leite de ovelhas, o que já foi
descrito para cabras (CHIARI; NEVES, 1984), com isso torna-se importante a
realização de mais estudos sobre o tema.
42
7. CONCLUSÃO
A elevada ocorrência de amostras de leite positivas para Toxoplasma
gondii em animais naturalmente infectados, permite concluir que existe uma
preocupação com a possibilidade de transmissão através do consumo de leite
in natura cru e seus derivados não-pasteurizados. É de relevância para a
saúde pública, visto que nas zonas rurais o leite é fonte de alimento para a
subsistência, e geralmente é consumido sem pasteurização ou fervura.
43
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51
ANEXOS
1. Protocolo para Hemaglutinação Indireta
1. Diluir os soros-teste com o 2-mercaptoetanol no ponto de corte 1:64 em uma
placa separadamente;
2. Adicionar à placa de fundo “V”, 25µl dos soros-controles positivo e negativo
em diferentes poços (os controles não precisam ser diluídos);
3. Adicionar à placa de fundo “V”, 25µl da diluição dos soros-teste
separadamente;
4. Adicionar aos controles e aos soros-teste 25µl da solução de hemácia;
5. Agitar a placa por 2-3 minutos;
6. Incubar a placa a 37ºC, em repouso por 1 hora;
7. Visualizar o resultado na própria placa.
52
2. Protocolo para Reação de Imunofluorescência Indireta
1. Lavar as lâminas sensibilizadas em PBS por 5 minutos;
2. Secar as lâminas em temperatura ambiente ou estufa a 37ºC;
3. Diluir o soro no ponto de corte 1:64;
4. Adicionar 10L da diluição dos soros-teste, controles positivo e negativo nas
lâminas;
5. Incubar a 37ºC por 30 minutos, em câmara úmida;
6. Lavar as lâminas duas vezes com PBS por 5 minutos
7. Secar as lâminas a temperatura ambiente ou estufa a 37ºC;
8. Adicionar 10L do conjugado diluído (1:400) em cada poço e proteger da luz;
9. Incubar a 37ºC por 30 minutos, em câmara úmida, protegendo da luz;
10. Lavar as lâminas duas vezes com PBS por 5 minutos (protegendo da luz);
11. Secar as lâminas a temperatura ambiente ou estufa a 37ºC (protegendo da
luz);
12. Adicionar uma gota de glicerina entre os poços e cobrir com lamínula;
13. Fazer a leitura em objetiva de 40x no microscópio com lâmpada de
mercúrio de alta pressão USH102 e filtro de seleção de comprimento de onda
de 450 nm.
53
3. Protocolo para Extração de DNA com o kit comercial Easy-DNA®
(Invitrogen), protocolo nº8 (adaptado)
3.1. Isolamento de DNA (1º dia)
1. Conservar a proteinase (Protein Degrader) à -20ºC. *Caso esta esteja turva
aquecer a 37º por 5 minutos.
2. Preparar o Mix em um microtubo contendo:
TE ------------------------------------------------------- 320µl
Solução A ----------------------------------------------- 20µl
Solução B ----------------------------------------------- 10µl
Proteinase ------------------------------------------------ 5µl
3. Adicionar 200µl da amostra do leite ao tubo com o mix e levá-lo ao banho-
maria overnight (12-20h) a 60°C.
3.2. Isolamento de DNA (2º dia)
1. Adicionar 300µl da solução A e 120µl da solução B e levar ao vortex até a
amostra ficar uniforme e viscosa (10seg – 1min)
2. Adicionar 750µl de clorofórmio e levar ao para vortex (1min) até diminuir a
viscosidade (caso o sobrenadante não esteja claro fazer banhos de clorofórmio
por 2-3 vezes)
3. Centrifugar por 10min a 4ºC na velocidade máxima e transferir a fase aquosa
superior para outro microtubo
3.3. Precipitação do DNA
1. Adicionar 1ml de álcool a 100% (-20ºC) à fase superior clara, levar ao vortex
e incubar em gelo durante 30 min.
2. Centrifugar por 10-15min a 4ºC, na velocidade máxima e remover o álcool
com uma pipeta de Pasteur.
3. Adiciona 500µl de álcool a 80% (-20ºC) e misturar invertendo o tubo por 2-3
vezes.
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4. Centrifugar por 3-5min a 4ºC, na velocidade máxima e remover o álcool com
uma pipeta de Pasteur.
5. Centrifugar por 1-3min a 4ºC, na velocidade máxima e remover o resíduo de
álcool. Secar por 5min.
6. Adicionar ao pellet 49µl microlitros de TE e 1µl de RNase e incubar a 37ºC
por 30min.
7. Armazenar o DNA pronto para uso a -20ºC.
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4. Protocolo para amplificação de DNA em Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR)
1. Para cada amostra analisada adicionar os seguintes itens e respectivos
volumes:
Água miliq ..................................................6,8μl
Taq ............................................................0,2μl
Tampão da Taq ...........................................6μl
Primer direto e reverso ................................3μl (cada)
MgCl2 ...........................................................1μl
dNTP ............................................................1μl
DNA extraído ................................................4μl
2. Colocar as amostras no termociclador;
3. Utilizar 40ml de água e 0,8g de agarose para fazer o gel de agarose à 2%;
4. Adicionar o marcador molecular, o controle positivo (taquizoítos de T. gondii),
controle negativo (água ultra pura) e as amostras a serem testadas;
5. Submeter o gel de agarose à eletroforese;
6. Corar com brometo de etídio por 20 minutos;
7. Fotodocumentar.