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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

“Estudos de derivados de fluoresceína visando o desenvolvimento de

fármacos para Terapia Fotodinâmica”

Dissertação apresentada por Vagner Roberto Batistela ao Programa de Pós-Graduação em Química do Departamento de Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Estadual de Maringá como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Química

MARINGÁ, MAIO/2007

Livros Grátis

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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)

Batistela, Vagner Roberto B326e Estudo de derivados de fluoresceína visando o

desenvolvimento de fármacos para Terapia Fotodinâmica / Vagner Roberto Batistela. -- Maringá : [s.n.], 2007.

xvii, 102 f. : il. color., figs., tabs. Orientador : Prof. Dr. Noboru Hioka Co-orientador : Prof. Dr. Vagner Roberto de Souza Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de

Maringá. Programa de Pós-graduação em Química, 2007. 1. Físico-química. 2.Terapia fotodinâmica.

3.Derivados de fluoresceína. 4. Análise multivariada. 5.Modelagem molecular. 6. LED. I. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-graduação em Química.

Cdd 21.ed. 541.3

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Dissertação de Mestrado Estudos de derivados de fluoresceína visando o desenvolvimento

de fármacos para Terapia Fotodinâmica

Vagner Roberto Batistela Orientador: Prof. Dr. Noboru Hioka Co-orientador: Prof. Dr. Vagner Roberto de Souza

Maringá, maio de 2007

ii

Aos meus tios Marcos e Ilídia, incentivadores e pilares da minha vida

iii

"Não deve haver nenhuma barreira para a

liberdade do inquérito. Não há nenhum

lugar para o dogma na ciência. O cientista

está livre, e deve estar livre para fazer toda

pergunta, duvidar de qualquer afirmação,

para procurar toda a evidência e corrigir

quaisquer erros." Julius Robert

Oppenheimer (1904 - 1967), físico

estadunidense diretor do Projeto Manhattan

para o desenvolvimento da bomba atômica.

"Tenha em mente que tudo que você aprende

na escola é trabalho de muitas gerações.

Receba essa herança, honre-a, acrescente a

ela e, um dia, fielmente, deposite-a nas mãos

de seus filhos". Albert Einstein, físico e

humanista alemão (1879 - 1955), autor da

teoria da relatividade e de importantes

estudos em ondulatória.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Albert_Einstein

iv

AGRADECIMENTOS

À Deus por me permitir a vida

Ao Prof. Hioka pela orientação científica, amizade, confiança e transmissão de seus

conhecimentos

Ao Prof. Vagner pela co-orientação, apoio e incentivo

Ao Diogo, Fran e Juliana pela amizade e grande auxílio na execução dos experimentos

À Adriana, Ana Cláudia, Ana Paula, André, Augusto, Jaime e a todos os colegas de

laboratório

À Profa. Ieda, da Universidade Estadual de Londrina, pelos valiosos conhecimentos

sobre as ciências quimiométricas

Ao Prof. Antônio Eduardo, da Universidade Federal de Uberlândia, pelos ensinamentos

sobre modelagem molecular

Ao Prof. Hueder, da Universidade do Vale do Paraíba, pelas discussões

Ao Prof. Willian pelo apoio nos experimentos de titulação potenciométrica

Ao Prof. Bento pelas medidas de potências dos LEDs e discussões

Ao oftalmologista Emerson Oymaguchi pela consultoria prestada neste trabalho

Ao Prof. Dimas, da Universidade Estadual de Londrina, pelos espectros de absorção no

infravermelho

Ao Prof. Adelar pela utilização do fluorômetro na obtenção dos espectros de emissão

dos LEDs

Aos professores Adley, Alfredo, Cláudio, Ervim, Maria Helena, Ourides e Silvana pela

contribuição em minha formação

Aos funcionários do DQI, em especial à Claudemir, Cristina e Ivânia, pela solicitude

Aos meus grandes amigos Fábio e Juliano pela amizade sincera e leal

Ao CNPq pela bolsa concedida

v

RESUMO A pesquisa de novos fármacos para Terapia Fotodinâmica (TFD), uma modalidade

médica alternativa no tratamento de doenças caracterizadas por altas taxas de crescimento

celular, tem motivado muitos investigadores a obter novos fotossensitizadores (FS) e fontes

de luz mais acessíveis (aliando custo, eficiência e aplicabilidade). Neste sentido,

fluoresceína e seus derivados (compostos xantênicos) podem ser promissores FS para

TFD especialmente nos casos de tratamentos de doenças oculares, sendo necessário,

entretanto, um estudo detalhado de suas propriedades em meio aquoso. A determinação

espectrofotométrica dos pKas em água dos seguintes compostos: fluoresceína (FSC),

eosina Y (EOS), rosa de bengala (RBB), tetranitrofluoresceína (TNF) e acridina-

fluoresceína (N-FSC) mostrou a alta proximidade dos pKa entre os grupos ácido-base de

cada corante, a intensa sobreposição de bandas das espécies protolíticas (catiônica,

neutra, monoaniônica e dianiônica) e a existência de processos de auto-agregação das

formas hidrofóbicas. Contudo, aplicando as metodologias quimiométricas de Análise

Multivariada: Método Q de Imbrie, seguido das rotações Varimax e projeção oblíqua de

Imbrie, obteve-se valores confiáveis de pKas condizentes com os efeitos esperados aos

substituintes. Adicionalmente, com o Método da Matriz-K foram estimados os espectros de

cada espécie permitindo, inclusive, a visualização espectral das espécies intermediárias,

estas de difícil detecção. Nos estudos de modelagem molecular das espécies protolíticas

da FSC com DFT (Teoria do Funcional de Densidade), determinou-se as estruturas

tautoméricas mais estáveis em meio aquoso. Os espectros de absorção de cada espécie

também foram simulados com TD-DFT (Teoria do Funcional de Densidade no Domínio do

Tempo) e resultaram em perfis muito semelhantes aos obtidos com o Método da Matriz-K.

Em pH fisiológico, a espécie dianiônica é a predominante para todos os

fotossensitizadores. Quando irradiada com luz na região de 500 nm (fonte de luz LED), a

TNF apresentou-se foto-estável, porém, os demais corantes sofreram foto-decomposição.

Com exceção da RBB, a foto-decomposição foi mais lenta em soluções aeradas sugerindo

a ação do oxigênio como um supressor do estado excitado (não formando

necessariamente 1O2, considerada a mais importante espécie reativa de oxigênio para TFD

do tipo II). Na RBB a foto-decomposição foi mais rápida em soluções aeradas indicando a

participação de espécies como o 1O2 nesse processo. O índice de Atividade Fotodinâmica

Química, mensurada via ácido úrico, numa metodologia matemática adaptada para luz

policromática, permitiu quantificar a formação de 1O2 pelos diversos fotossensitizadores. A

vi

RBB, seguida da EOS, é o corante que mais gera 1O2 proporcionalmente à potência de luz

absorvida. Experimentos com Artemia salina confirmaram a ação fotodinâmica da RBB e

da EOS in vivo e a ação da N-FSC (provavelmente por um mecanismo TFD tipo I). Diante

desse quadro, os sistemas de LED foram excelentes para as investigações efetuadas e a

rosa de bengala foi o fotossensitizador que apresentou as melhores características para

TFD, seguida da eosina.

vii

ABSTRACT The search for new medicines to apply in Photodynamic Therapy (PDT), an

alternative medical modality in the treatment of illnesses characterized by a high rate of

cellular growth, has motivated much research to obtain new photosensitizers (PS) and more

accessible light sources (allying cost, efficiency, and applicability). In that way fluorescein

derivatives (xanthenes compounds) can turn out to be promising PS for PDT especially in

the treatment of eyes diseases; however a profound study should still be performed on their

properties. The spectrophotometric pKa determination in water of the following compounds:

fluorescein (FSC), eosin Y (EOS), bengal rose (RBB), tetranitrofluorescein (TNF) e acridin-

fluorescein (N-FSC) has shown the high proximity of their pKa values for each PS, intense

spectral band overlay among their protolytic species (cationic, neutral, monoanionic and

dianionic), and self-aggregation process of hydrophobic forms. However, when applying

chemometric tools of Multivariate Analysis - Imbrie Q-mode factor analysis followed by

Varimax rotation and Imbrie’s Oblique Projection - confident pKa values were determined

which are in agreement with their substituent effects. Additionally, when applying the K-

matrix method for each protolytic species the spectra were simulated (especially for

intermediates, which are not easy to detect). Studies on Molecular Modeling applying the

Density Functional Theory (DFT) for each protolytic species of FSC showed its most stable

tautomeric form. The absorption spectra of these structure were simulated with TD-DFT

(Time Dependent Density Functional Theory) and resulted in a very similar profile to that

one obtained by K-Matrix method. The dianionic specie is the predominant form in a

physiological pH medium for all PS investigated. Under the irradiation of TNF at 500 nm

(LED light), this compound showed photo-stability, however all other dyes underwent some

photo-reaction. Except for RBB, the photo-bleaching reaction was slower in aerated solution

suggesting that the oxygen is an excited state quencher (not necessarily producing singlet

oxygen (1O2), considered the main reactive specie for PDT type II). For RBB, the photo-

bleaching in an aerated medium was faster suggesting that there was 1O2 participation. The

Chemical Photodynamic Activity Index was measured by the presence of uric acid, using a

mathematical methodology adapted from polychromatic light, which permitted to quantify

the 1O2 yield for all PS. RBB, followed by EOS, is the compound which showed the highest

amount of 1O2 production. Experiments with Artemia salina confirmed the photodynamic

action of RBB and EOS in vivo and the N-FSC activity (probably type I PDT). From these

viii

results it was possible to determine some properties of fluorescein derivatives relevant to

PDT. Bengal rose was the PS that presented the best PDT characteristics, followed by

eosin. The built LED system is excellent to execute PDT experiments and it may be useful

in clinical applications.

ix

SUMÁRIO LISTA DE ESQUEMAS....................................................................... xi

LISTA DE FIGURAS........................................................................... xii

LISTA DE TABELAS........................................................................... xv

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................... xvii

I Introdução............................................................................................ 1

I.1 A visão: a detecção das imagens e cores............................................. 1

I.2 Terapia Fotodinâmica (TFD).................................................................. 4

I.3 Diagnóstico de doenças nos olhos........................................................ 8

I.4 Propriedades de corantes xantênicos................................................... 9

I.4.1 A fluoresceína e suas propriedades...................................................... 10

I.4.2 A eosina................................................................................................. 14

I.4.3 A rosa de bengala.................................................................................. 16

I.4.4 Nitroderivados de fluoresceína.............................................................. 18

I.5 Derivados de fluoresceína e a TFD....................................................... 18

I.6 Propriedades fotofísicas úteis aos fotossensitizadores aplicados em

TFD........................................................................................................

19

II Objetivos.............................................................................................. 21

III Materiais e Metodologias.................................................................... 21

IV Resultados e discussão...................................................................... 28

IV.1 Estudos da fluoresceína (FSC).............................................................. 28

IV.1.1 Determinação dos pKas da fluoresceína em solução aquosas............. 28

IV.1.2 Estudo das estruturas protolíticas da fluoresceína por modelagem

molecular...............................................................................................

34

IV.2 Síntese e caracterização estrutural de derivados de fluoresceína........ 46

IV.2.1 Síntese da acridina-fluoresceína (N-FSC) e tetranitrofluoresceína

(TNF).....................................................................................................

46

IV.2.2 Estudo da reatividade da fluoresceína em reações de substituição

eletrofílica aromática.............................................................................

50

IV.3 Determinações de pKa dos demais corantes fotossensitizadores em

soluções aquosas..................................................................................

52

IV.3.1 Os pKas da eosina (EOS)..................................................................... 52

IV.3.2 Os pKas da rosa de bengala (RBB)...................................................... 60

x

IV.3.3 Os pKas da tetranitrofluoresceína......................................................... 63

IV.3.4 Os pKas da acridina-fluoresceína.......................................................... 66

IV.3.5 Comparação dos pKas dos derivados................................................... 69

IV.4 Características das fontes de luz LED................................................... 71

IV.5 Propriedades fotofísicas dos corantes fotossensitizadores................... 72

IV.5.1 Características absortivas dos fotossensitizadores em meio aquoso

de pH neutro..........................................................................................

72

IV.5.2 Estudos de foto-decomposição............................................................. 73

IV.5.3 Determinação de formação de oxigênio singlete.................................. 78

IV.5.4 Ensaios in vivo com Artemia salina....................................................... 80

IV.5.5 Resultados gerais das propriedades dos derivados de fluoresceína.... 82

V Conclusões.......................................................................................... 83

VI Perspectivas para trabalhos futuros................................................. 84

VII Referências bibliográficas.................................................................. 85

VIII ANEXO 1: Estruturas dos derivados de fluoresceína 94

IX ANEXO 2: Estudo de equilíbrios complexos através de métodos

quimiométricos.......................................................................................

95

X ANEXO 3: Modelagem molecular.......................................................... 99

xi

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema I Diagrama de Jablonski.................................................................. 2

Esquema II Síntese da fluoresceína................................................................. 10

Esquema III Equilíbrios protolíticos da fluoresceína.......................................... 10

Esquema IV As duas partes componentes da fluoresceína: xantênica e

benzênica e o processo de transferência eletrônica fotoinduzida

12

Esquema V Rota sintética da rosa de bengala................................................. 17

Esquema VI Estruturas protolíticas da fluoresceína.......................................... 35

Esquema VII Numeração atômica da fluoresceína............................................. 37

Esquema VIII Estruturas protolíticas da fluoresceína mais estáveis em meio

aquoso, segundo cálculos teóricos...............................................

41

Esquema IX Numeração atômica para a FSC e N-FSC, seguindo a IUPAC.... 47

Esquema X Estruturas protolíticas da EOS e os valores de pKa..................... 60

Esquema XI Estruturas propostas para as espécies protolíticas da RBB e os

valores de pKas............................................................................

63

Esquema XII Equilíbrios protolíticos propostos para a N-FSC........................... 68

Esquema XIII Mecanismos propostos para a formação dos intermediários no

processo de foto-decomposição dos corantes xantênicos............

78

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Anatomia dos olhos....................................................................... 1

Figura 2 Dois fotossensitizadores utilizados em TFD clínica no combate a

doenças em olhos.........................................................................

7

Figura 3 Fluoresceína................................................................................. 8

Figura 4 Estrutura da fenolftaleína e dos xantenos: fluoresceína e

rodamina.......................................................................................

9

Figura 5 Estrutura da eosina Y e eosina B................................................. 15

Figura 6 Estrutura da hematoxilina............................................................. 16

Figura 7 Estrutura do ácido úrico................................................................ 20

Figura 8 Espectros da FSC em soluções aquosas de diversos pHs e

variação da absorbância contra pH em comprimentos de onda

específicos....................................................................................

28

Figura 9 Curvas de concentração relativa e de fração das espécies

protolíticas da fluoresceína em diversos pHs...............................

31

Figura 10 Espectros das espécies protolíticas da fluoresceína calculados

com o método da matriz K............................................................

32

Figura 11 Curvas de absorbância experimental e simulada para a

fluoresceína através das frações das espécies e dos

coeficientes de absortividade molares em 437 e 490 nm.............

33

Figura 12 MEPS das formas protolíticas mais estáveis da fluoresceína em

água..............................................................................................

40

Figura 13 Correlação entre os espectros obtidos com o método da matriz

K e os simulados com TD-DFT.....................................................

43

Figura 14 Orbitais HOMO e LUMO de maior contribuição para a banda de

absorção em 490 nm da espécie dianiônica da fluoresceína.......

45

Figura 15 Espectros de absorção no IV dos sólidos da FSC e N-FSC......... 47

Figura 16 Espectros de absorção no IV dos sólidos da FSC e TNF............. 49

Figura 17 Estrutura da TNF........................................................................... 49

Figura 18 Orbitais HOMO e LUMO da fluoresceína catiônica....................... 51

Figura 19 Curva de titulação potenciométrica da EOS com HCl................... 53

xiii

Figura 20 Curva de titulação potenciométrica da EOS, previamente

acidificada com HCl e posterior adição de NaOH.........................

54

Figura 21 Espectros da EOS em meios tamponados aquosos..................... 55

Figura 22 Curvas de absorbância da EOS em sistemas aquosos contra pH

e aplicação do método das derivadas na determinação de pKa...

55


protolíticas da EOS em diversos pHs............................................

56

Figura 24 Variação da absorbância em 540 nm para soluções da EOS em

diversos pHs.................................................................................

57

Figura 25 Espectros das espécies puras da EOS estimados pelo método

da matriz K....................................................................................

58

Figura 26 Curvas de absorbância experimental e simulada para a EOS

com o pH em 517 nm....................................................................

59

Figura 27 Espectros da RBB em soluções tamponadas aquosas e

variação da absorbância em comprimentos de onda específicos

61


protolíticas da RBB em diversos pHs............................................

62

Figura 29 Espectros das espécies puras da RBB estimados pelo método

da matriz K....................................................................................

63

Figura 30 Espectros da TNF em soluções aquosas de diversos pHs e


específicos....................................................................................

64


protolíticas da TNF em diversos pHs............................................

65

Figura 32 Espectros das espécies puras da TNF estimados pelo método

da matriz K....................................................................................

66

Figura 33 Espectros da N-FSC em soluções aquosas de diversos pHs e


específicos....................................................................................

67


protolíticas da N-FSC em diversos pHs........................................

68

Figura 35 Espectros das espécies puras da N-FSC estimados pelo

método da matriz K.......................................................................

69

xiv

Figura 36 Espectros de emissão dos LEDs em termos de potência média

individual ...................................................................................... 72

Figura 37 Espectros de absorção dos corantes em meio aquoso a pH 7,25

e variação da absorbância nos respectivos λmax com a

concentração.................................................................................

73

Figura 38 Variação temporal da foto-decomposição dos corantes em

soluções de aeração normal e desaeradas..................................

74

Figura 39 Espectros de potência luminosa absorvida considerando as

características emissoras dos LEDs utilizados.............................

75

Figura 40 Porcentagens de morte totais das Artemia salina nos ensaios

FS/LED..........................................................................................

81

Figura 41 Representação espacial das componentes principais em um

conjunto de dados.........................................................................

96

xv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Propriedades fotofísicas da fluoresceína e de alguns de seus

haloderivados em água.................................................................

14

Tabela 2 Dados sobre as soluções estoques e λmax e εmax usados na

padronização dos corantes...........................................................

23

Tabela 3 Composição das soluções aquosas usadas no controle de pH.... 24

Tabela 4 Valores de pKa da FSC por método das derivadas...................... 29

Tabela 5 Análise das componentes principais da FSC................................ 30

Tabela 6 Coeficientes de absortividade molar das espécies protolíticas da

FSC nos λmax obtidos por quimiometria.........................................

32

Tabela 7 Energia de formação das estruturas protolíticas da fluoresceína

no vácuo e em água (Onsager).....................................................

34

Tabela 8 Momento dipolar calculado das formas NEQ e NEL..................... 37

Tabela 9 Momento dipolar calculado das formas MAC e MAF.................... 39

Tabela 10 Valores de ϕ1 e ϕ2 para as espécies protolíticas da fluoresceína. 42

Tabela 11 Transições mais representativas no visível das espécies

protolíticas da fluoresceína calculadas com TD-DFT 3-21+G*.....

44

Tabela 12 Proposta de atribuição dos deslocamentos químicos de RMN da

FSC e da N-FSC em CD3OD.........................................................

48

Tabela 13 Análise das componentes principais da EOS................................ 56

Tabela 14 Coeficientes de absortividade molar das espécies protolíticas da

EOS reportados na literatura e obtidos por métodos

quimiométricos..............................................................................

58

Tabela 15 Análise das componentes principais da RBB................................ 61

Tabela 16 Análise das componentes principais da TNF................................ 65

Tabela 17 Valores de pKa para a N-FSC obtidos por metodologias

tradicionais....................................................................................

67

Tabela 18 Análise das componentes principais da N-FSC............................ 67

Tabela 19 Valores de pKa determinados com métodos quimiométricos

para os derivados da fluoresceína em solução aquosa................

70

Tabela 20 Valores de potência luminosa absorvida total e t1/2 para as

reações de foto-decomposição dos corantes fotossensitizadores

76

xvi

Tabela 21 Atividade Fotodinâmica Química (AFQ) para os

fotossensitizadores em solução aquosa de pH 7,25 após 360

minutos de iluminação..................................................................

79

Tabela 22 Resumo das características dos derivados de fluoresceína

investigados neste trabalho..........................................................

82

xvii

LISTA DE ABREVIATURAS

AFQ - Atividade Fotodinâmica Química

CT - catiônica

DA - dianiônica

DFT - Density Functional Theory

EOS - eosina Y

FSC - fluoresceína

IUPAC - International Union of Pure and Applied Chemistry

MAC - monoaniônica carboxilato

MAF - monoaniônica fenolato

MEP - Mapas de Potencial Elestrostático (Eletrostatic Potential Map)

NBO - orbitais naturais de ligação (Natural Bond Orbital)

NEL - neutra lactona

NEQ - neutra quinoidal

NEZ - neutra zwitteriônica

N-FSC - acridina-fluoresceína

PCA - Principal Component Analisys

RBB - rosa de bengala B

TD-DFT - Teoria do Funcional de Densidade no Domínio do Tempo (Time-Dependent

Density Function Theory)

TFD - Terapia Fotodinâmica

TNF - tetranitrofluoresceína

t1/2 - tempo para a concentração de uma substância diminuir à metade

λmax - comprimento de onda de máxima absorção

ε - coeficiente de absortividade molar

1

I. INTRODUÇÃO

Várias áreas das ciências sempre estiveram atreladas à medicina devido ao

desenvolvimento de técnicas e medicamentos, incluindo-se nesse sentido a química.

Sua participação compreende desde o princípio ativo, a sua formulação e mecanismo de

ação até a determinação analítica de componentes e metabólitos.

I.1. Visão: a detecção das imagens e cores

O processo de visualização de imagens e cores decorre da propriedade de

radiações eletromagnéticas estimularem células receptoras presentes em nossos olhos,

proporcionando um dos mais fantásticos sentidos humanos: a visão. Essas radiações

são ondas eletromagnéticas cujas energias situam-se entre 2,5 x 10-19 J e 5,7 x 10-19 J

que correspondem, em comprimento de onda, a região de 350 a 800 nm, a chamada luz

visível.

Juntamente à etapa básica e fundamental da interação da luz com as células foto-

receptoras são necessárias diversas outras etapas subseqüentes para a condução do

sinal ao cérebro. Os olhos possuem uma complexa anatomia, ilustrada na Figura 1. Um

dos componentes do interior dos olhos é a retina, um conjunto de aproximadamente dez

camadas onde estão contidos os receptores visuais (células cones e bastonetes) e mais

quatro tipos de neurônios que transformam os feixes luminosos em pulsos elétricos.

Quando feixes luminosos incidem no olho, a radiação passa por lentes (como o

cristalino) que os direcionam para uma região específica da retina, a mácula e a fóvea,

possuidoras de uma alta densidade de células foto-receptoras (Ryan, 2006).

Figura 1. Anatomia dos olhos.

2

A mácula é uma porção maior que circunda a fóvea central, uma região afinada

que contém células cônicas (Ganong, 1995) e não contém bastonetes. As células

bastonetes são assim chamadas pela aparência fina, em bastão, de seus segmentos

externos; elas são extremamente sensíveis à luz e são os principais receptores que

atuam na visão noturna, contudo não permitem reconhecer detalhes e contornos dos

objetos ou de determinar sua cor. Já os cones geralmente apresentam segmentos

internos grossos e segmentos externos cônicos, embora sua morfologia varie

dependendo da sua localização na retina; caracteriza-se por promover acuidade visual

muito maior que os bastonetes e são responsáveis pela visão colorida. Assim é a

mácula, a região rica em células cone, a responsável pela chamada visão central que

permite distinguir faces, efetuar leituras, destacar objetos entre outros (Ryan, 2006;

Yamane, 2003).

A interação da luz com a matéria

Os processos de interação dos pigmentos oculares com a luz, bem como diversos

outros processos fotofísicos podem ser representados através do Diagrama de

Jablonski, apresentado no Esquema I. Este diagrama mostra os processos de absorção

e emissão de luz por compostos fotossensíveis, além de alguns processos de

desativação térmica representando os estados quânticos de uma molécula e

correlacionando-os com os processos que provocam a mudança na energia associada a

seus elétrons (Lakovicz, 1999; Valeur, 2002).

Esquema I. Diagrama de Jablonski.

3

A grande maioria das moléculas encontra-se no estado quântico fundamental

singlete, indicando que o elétron isolado apresenta apenas uma possibilidade de

orientação em um campo magnético externo. Quando um fóton incide sobre uma

molécula no estado quântico fundamental singlete S0, pode ocorrer uma transição

eletrônica do elétron do estado S0 para um nível quântico de maior energia igualmente

singlete (S1, S2, S3, etc.); a transição ocorre se a energia do fóton for igual à diferença de

energia entre os dois níveis (Esquema I). Nesse estado mais energético (estado

excitado), a molécula tende a dissipar essa energia adicional de várias formas. Numa

primeira possibilidade, pode colidir com partículas vizinhas num processo chamado de

conversão interna (CI). Esse tipo de desativação ocorre com maior probabilidade em

fase condensada (líquida e sólida) e depende essencialmente da viscosidade do

solvente e da temperatura. A segunda possibilidade também envolve o processo

colisional, porém, nesse caso ocorre uma inversão de spin eletrônico. O elétron, antes

caracterizando um estado singlete excitado, passa agora ao estado triplete excitado,

processo este chamado de conversão inter-sistema (CIS), processo dito proibido

(Harryvan e col., 1996).

Em geral, esse estado triplete apresenta menor energia que o singlete e sua

formação é favorecida quando o processo colisional envolve moléculas com átomos

pesados (Z > 80) e/ou moléculas com muitos substituintes (baixa rigidez estrutural)

(Azenha e col., 2002). Além disso, a presença de espécies paramagnéticas presentes no

meio também facilita o cruzamento inter-sistema. Em todas essas condições, favorece-

se a proximidade entre os valores das energias do nível vibracional zero do estado S1 e

de algum nível vibracional do estado T1, induzindo mais facilmente acoplamentos spin-

órbita que aumentam a probabilidade da inversão do spin e a conseqüentemente

mudança de multiplicidade (Skoog e col., 2002). Ambas CI e CIS são chamadas de

processos não radiativos porque envolvem basicamente os níveis vibracionais dos

estados eletrônicos de uma molécula podendo ocorrer inclusive devido a mudanças

térmicas. Assim, dependendo do tempo de vida dos estados S1 e T1, processos como

transferência de energia e transferência de elétron podem levar à desativação da

molécula ao estado fundamental, ou a transformações químicas, resultando em novas

moléculas (Lakovicz, 1999).

Por outro lado existe um outro conjunto de processos de desativação: o radiativo.

Nesse caso, a molécula dissipa sua energia através da emissão de fótons (obviamente

com energia menor que a dos fótons absorvidos). Quando a emissão radiativa ocorre a

4

partir do estado S1 para o S0, tem-se uma transição permitida por envolver mesma

multiplicidade cuja velocidade atinge tempos da ordem de 109 s-1; nesse caso tem-se a

luz de fluorescência F (Esquema I). A emissão de luz de fluorescência de diversos

compostos é aproveitada para inúmeras aplicações tecnológicas dentre as quais citam-

se: as análises químicas de biomoléculas como DNA e proteínas, a análise de minerais,

análise de compostos químicos orgânicos (por exemplo, análises forenses), usos na

indústria cosmética e de limpeza, uso como marcadores para fins diversos, dentre

outras. Compostos que emitem alta intensidade de luz fluorescente também são muito

usados em detecção de doenças, por exemplo, em exames clínicos por contraste.

Ainda ilustrado no Esquema I um outro processo radiativo é o provocado pela

transição de T1 para So, conhecido como luz de fosforescência P. Como esta transição

também é proibida (por inversão de spin), o tempo de vida do estado excitado T1 é

apreciável (maior do que o de S1). Esta sobrevida no estado T1 é suficientemente longa

a permitir a ocorrência de processos de colisão, entre outros com o oxigênio natural que

tem multiplicidade triplete (3O2); no caso, reações envolvendo reativos de mesmo spin

são permitidas. Desta reação tem-se a formação de espécies de oxigênio, como o

oxigênio singlete (1O2), que é uma molécula altamente reativa (Esquema I).

I.2. Terapia Fotodinâmica (TFD) A Terapia Fotodinâmica (TFD) tem sido utilizada no tratamento de várias doenças

que tem como característica comum um crescimento anormal de tecidos, tais como

artrite reumatóide, vitiligo, câncer, miopia patológica, degeneração macular da retina,

arteriosclerose, micose e infestações bacterianas (Levy, 1995; Sternberg e Dolphin,

1996; Simplicio e col., 2002; Sternberg e col., 1998; Spikes e Glad, 1964; Mainwright,

1998). Sem dúvida os maiores avanços da TFD têm sido no tratamento do câncer

(Dolmans e col., 2003; Hassan e col., 2003), porém outras doenças estão sendo

investigadas devido ao potencial terapêutico da técnica.

A base da TFD consiste num princípio ativo (fármaco) fotossensível (FS) que

pode ser alocado em tecidos alterados (nocivos/doentes); uma vez aguardado o tempo

necessário para obter-se máximo acúmulo local deste, incide-se luz de comprimento de

onda adequado sobre a área afetada (Lukšienė, 2003; Henderson e Dougherty, 1992). O

FS é promovido ao estado eletrônico excitado singlete (1FS*) que pode sofrer a

conversão inter-sistema atingindo o estado triplete (3FS*). Por sua vez, com o 3FS* pode

ter-se reação diretamente com substratos biológicos formando espécies radicalares e

5

algumas espécies reativas de oxigênio (TFD tipo I) ou transferir sua energia para o

oxigênio normal existente nos tecidos celulares (3O2) gerando o oxigênio singlete. Essa

espécie de altíssima reatividade é considerada a principal via de ação da TFD (chamada

de tipo II, Foote e Clennan, 1995; Macdonald e Dougherty, 2001; Mang, 2004;

Henderson e Dougherty, 1992). Essas ações gerando espécies citotóxicas in situ levam

os tecidos biológicos à necrose e apoptose.

Em situações clínicas, o medicamento é introduzido no paciente via injeção intra-

venosa para agir em órgãos internos ou por aplicação tópica nos casos de doenças na

superfície corpórea. Uma vez acumulado, o composto é excitado através de uma dose

regulada de luz, sendo esta normalmente realizada por LASER devido à alta potência da

radiação incidente. Para regiões internas, utiliza-se de LASERs acoplados a fibras óticas

e para regiões na superfície, a luz pode ser incidida diretamente (Mang, 2004; Wilson e

Patterson, 1986). A radiação deve desencadear o efeito tóxico ao tecido alterado agindo

sobre toda a extensão do tecido indesejado de modo amplo e profundo. Porém, o grau

de penetração da luz é limitado por compostos endógenos no organismo que absorvem

luz ou outros que provocam o espalhamento da radiação incidente, diminuindo

conseqüentemente a eficácia do processo de excitação do FS em áreas mais profundas

do tecido. Esses efeitos negativos relativos ao grau de penetração da luz são mais

relevantes com radiações luminosas de maior energia (menores comprimentos de onda);

assim as radiações mais comumente utilizadas em TFD situam-se entre 600 a 800 nm

(janela foto-terapêutica). Acima desta região, situa-se a região infra-vermelho que causa

aquecimento, processo indesejável a TFD (Simplicio e col., 2002; Sternberg, 1998).

Cuidado maior com a potência da luz deve-se ter na aplicação da TFD para doenças nos

olhos devido a efeitos indesejáveis como queima da retina pela radiação incidente

(Novartis, 2006).

Apesar da eficiência comprovada da TFD e da relativa simplicidade de aplicação,

uma das principais limitações ao seu uso é o alto custo decorrente do preço de

medicamentos e da fonte de luz LASER. Mesmo com equipamentos a base de diodo,

relativamente baratos, a situação é ainda bastante difícil para países pobres e em

desenvolvimento como o Brasil (Machado, 2000). Quanto aos medicamentos, às

dificuldades de síntese alia-se um grande conjunto de características necessárias a um

eficiente princípio foto-ativo (com poucos efeitos colaterais), tornando seus preços muito

elevados. Dessa forma, há a necessidade de desenvolver novos medicamentos e fontes

de luz de custos reduzidos que combinem poucos efeitos colaterais e alta eficiência.

6

TFD aplicada a doenças oculares

A TFD esta sendo utilizada no combate a doenças nos olhos como a

Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI), uma alteração morfológica que está

associada à perda de acuidade visual principalmente em indivíduos acima de 50 anos

(CIGNA Healthcare Coverage, 2006). Estima-se que 25 % da população com idade

superior a 75 anos apresentem alguma forma de DMRI. Existem duas formas dessa

doença, a não-exsudativa (também chamada de atrófica ou seca) e a exsudativa (ou

molhada).

A forma não-exsudativa provoca o aparecimento de drusas, ou seja, pequenos

depósitos amarelados localizados abaixo do epitélio pigmentar da retina; esta forma

seca da DMRI é a mais comum (85% dos casos), porém a acuidade visual dos pacientes

normalmente não é drasticamente afetada. Por outro lado, a forma exsudativa é a

responsável pela grande maioria dos casos de perda visual severa ou total; é a principal

causa de cegueira em indivíduos com idade superior a 60 anos (CIGNA Healthcare

Coverage, 2006). Nesse caso, vasos sanguíneos anômalos crescem logo atrás da retina

no espaço sub-retiniano, região da mácula, causando vazamento de sangue ou plasma

(daí o termo exsudativo). Com o tempo, esses neovasos se proliferam aumentando o

sangramento ou formando uma cicatriz no fundo do olho. Uma vez formada essa

cicatriz, não existe nenhum tratamento curativo. Nessa doença, o principal tratamento

empregado até recentemente era a fotocoagulação desses neovasos com um LASER

térmico, secando o sistema de neo-vascularização antes do seu extravasamento o que

evita a ampliação da cicatriz; entretanto a necessidade de uso de LASER de alta

potência afeta as células da retina conduzindo à perda de acuidade visual decorrente do

próprio tratamento (CIGNA Healthcare Coverage, 2006). Mesmo assim, acrescenta-se

que poucos casos podiam ser tratados dessa forma, pois a possibilidade de tratamento

dependia do tamanho, da localização e da boa visualização dos neovasos nos exames

angiográficos; adicionalmente, as chances de reincidência eram elevadas. Como é a

mácula a área afetada, a doença compromete principalmente a visão central limitando a

qualidade de vida dos pacientes.

A aplicação da TFD em DMRI se dá nos casos onde a lesão ocorre no espaço

subfoveal e tem apresentado sucesso na interrupção do processo de perda de visão.

Atualmente, a TFD é considerada como o único recurso terapêutico eficiente em reduzir

o risco de perda moderada e grave da visão nestes casos (Câmara Técnica de

Oftalmologia, 2006; Mittra e Singerman, 2002). Normalmente, a TFD pode ser aplicada

7

aproximadamente 4 vezes ao ano, obedecendo a intervalos de 60 a 90 dias, sem danos

consideráveis a retina, uma vez que a fonte de luz utilizada tem potência moderada e o

tempo de iluminação é curto.

Uma outra enfermidade tratável com a TFD é a miopia patológica, também

conhecida como miopia degenerativa (CIGNA Healthcare Coverage, 2006), um estado

de crescimento anormal do olho associado a mudanças degenerativas na sua estrutura

(exemplos: “Lacquer cracks” - rupturas cicatriciais e mecânicas do complexo epitélio

pigmentar retiniano, membrana de Bruch e coriocapilar, com freqüência de 4,3% em

olhos alto míopes - neovascularização coroidal, atrofia corioretinal e deslocamento da

retina). Com o avanço da doença, pode-se ter um intenso erro refrativo que pode evoluir

para até mesmo a perda definitiva da visão (Novartis, 2006). O fator determinante

nesses casos é o genético, podendo estar presente na infância e se agravar na vida

adulta. Uma característica desta forma de miopia é que mesmo com o uso de lentes

graduadas, há pouca melhoria na acuidade visual do paciente. Historicamente, as

opções de tratamento para miopia patológica têm incluído foto-coagulação com LASER,

translocação macular, cirurgia submacular e cirurgia que altera a curvatura da córnea

(Novartis, 2006), porém todas com resultados pouco eficientes, podendo inclusive

ocorrer perda permanente da acuidade visual em decorrência do próprio tratamento. No

entanto, em casos específicos de miopia patológica, por exemplo àqueles associados

com neovascularização coroidal, a TFD tem sido aplicada com sucesso (Fondazione per

la Macula, 2006; Maia e col., 2005; Lam e col., 2004). Nos casos de doenças nos olhos,

os medicamentos para TDF já em uso no Brasil são o Visudyne® (cujo princípio ativo é o

BPDMA) e a Indocianina verde®, cujas estruturas estão ilustradas na Figura 2.

N

CH CH

(CH2)4

SO3

(CH CH)2 CH

N(CH2)4

SO3Na

C

OCMeO OH

N HN

NNH

C

C

O

O

O

CH3O

CH3O

(OMe)(HO)

Indocianina Verde BPDMA

Figura 2. Dois fotossensitizadores utilizados em TFD clínica no combate a doenças em

olhos.

8

Atualmente, uma estimativa de custo de aplicação da técnica é: com o Visudyne

(em torno de R$ 3.300,00 por ampola contendo 15 mg) e da Indocianina (ao redor de

R$ 1.300,00) que devem ser somados ao custo do médico e do emprego do LASER

(aproximadamente R$ 2.000,00).

I.3. Diagnóstico de doenças nos olhos

Paralelamente, para a detecção das doenças oculares citadas acima e outras, os

oftalmologistas recorrem a angiografia, técnica que não guarda relação com a TFD. Para

esse exame clínico, o médico injeta um corante contraste que permite avaliar a dinâmica

circulatória no interior dos olhos (sistema vascular). Um dos compostos mais utilizados

para esse propósito é a fluoresceína, um composto da classe dos xantenos, Figura 3

(Williams e Williams, 2005; Maia, 2003) por apresentar alta solubilidade em meio

aquoso, forte capacidade de acumulação no sistema vascular dos olhos e às suas

excelentes propriedades fluorescentes. Esse composto é formulado em tampão pH ~ 7,2

a 10-20% em água e injetado na veia antecubital do paciente sendo rapidamente

transportado aos olhos (Ryan, 2006). A seguir, o oftalmologista utiliza o angiógrafo para

foto-excitar o composto com radiações no intervalo de 465 a 490 nm

(ε490 ~ 105 L.mol.cm-1) e detectar a luz fluorescente emitida entre 520 e 530 nm (Maia,

2003; McIntyre, 1967). O médico registra, sob diversos ângulos, várias fotografias que

permitem avaliar a microcirculação retiniana diagnosticando a existência de danos no

sistema ocular, como a presença de lesões ou mesmo o rompimento de vasos

sangüíneos. A angiografia fluoresceínica detecta alterações da perfusão e da

permeabilidade vasculares da retina e coróide sendo também muito útil no estudo dos

tumores e malformações corio-retinianas (Maia, 2003).

O O

COO-

O-

Figura 3. Fluoresceína.

9

Estima-se que cerca de 20% da fluoresceína seja transportada na corrente

sanguínea (pH 7,2) na forma livre e os 80% restantes complexada com proteínas (Ryan,

2006; Maia, 2003; Silva, 1999). Uma vez que a soro-albumina é a principal proteína

presente no interior dos olhos (Tripathi e col., 1989), acredita-se que o principal

mecanismo de transporte do fármaco aos olhos envolve o complexo fluoresceína-

albumina. Uma vez no sistema ocular, o corante acumula-se no interior das células

devido ao gradiente de pH que se estabelece entre o interior da célula (pH neutro ou

ligeiramente alcalino) e o líquido extracelular (pH mais ácido) (Braginskaja e col., 1993);

a mitocôndria e os lisossomos são, possivelmente, as organelas celulares onde hajam

maiores concentrações do composto (Masereeuw e col., 1994; Oseroff e col., 1986).

No seu uso em angiografia a fluoresceína não provoca efeitos colaterais muito

severos nos pacientes, sendo estes náuseas e vômitos em cerca de 12 a 20% dos

pacientes e chance de 1 em 12.000 a 20.000 de reação de hipersensibilidade. No

entanto, estes sintomas podem ser atenuados se a injeção do medicamento for lenta

(~10 s).

I.4. Propriedades de corantes xantênicos

No século XIX, os xantenos representavam uma classe nova de compostos cuja

aplicação inicial foi o tingimento de roupas, porém, foram logo abandonados devido a

perda de coloração à medida que a roupa tingida com o corante era exposta à luz

(fotobranqueamento). Posteriormente foram usados como indicadores ácido-base

(Bayer, 1880), sendo novamente abandonados devido aos seus complexos sistemas

protolíticos. Atualmente esses compostos têm sido empregados de diversas maneiras.

Os xantenos têm estrutura química muito semelhante à da fenolftaleína (um

corante trifenilmetano), ilustrada na Figura 4, através da fluoresceína e da rodamina.

O

COOH

HO O NH2+

COOH

H2N

fenolftaleína rodamina 110

O

COOH

HO O

fluoresceína Figura 4. Estrutura da fenolftaleína e dos xantenos, fluoresceína e rodamina. A parte

selecionada na molécula de fluoresceína é a unidade estrutural xantênica.

10

Conforme ilustrado, dois anéis benzênicos são unidos por um átomo de carbono e

um de oxigênio em posição para de um em relação ao outro, formando a estrutura

tricíclica característica dos xantenos. A presença do átomo de oxigênio adicional em

relação a fenolftaleína confere alta rigidez e propriedades fotofísicas bem distintas. Essa

estrutura constitui o esqueleto base para vários outros compostos, como a eosina,

eritrosina, rosa de bengala, rodamina 6G, etc.

I.4.1 - A fluoresceína e suas propriedades

A fluoresceína é também conhecida como resorcinolftaleína sódica ou uranina ou

ainda uranina amarela. Sua síntese foi realizada por Bayer em 1871 através de

condensação do anidrido ftálico com resorcinol em meio ácido com ZnCl2 (Bayer, 1871),

conforme representada no Esquema II.

O

O

O

HO OH

O O

COOH

HO

anidrido ftálico

resorcinol

fluoresceína

2ácido

Esquema II. Síntese da fluoresceína.

Dependendo do solvente e pH, os derivados de fluoresceína podem,

normalmente, existir nas formas catiônica (FH3+), neutra (FH2), monoaniônica (FH-) e

dianiônica (F2-), conforme os equilíbrios mostrados no Esquema III. O elevado número

de grupamentos ácido-base proporciona a esse corante um complexo equilíbrio

protolítico.

FH3+ FH2 FH-

F2-

Esquema III. Equilíbrios protolíticos da fluoresceína.

As reações de transferência de prótons são de importância fundamental em

meios diversos incluindo-se os biológicos uma vez que o pH do meio determina a

estrutura de uma substância protolítica e, conseqüentemente, suas propriedades físicas,

11

químicas e fotoquímicas. Assim, as propriedades fluorescentes da fluoresceína são

drasticamente afetadas pelo meio. Dentre as quatro espécies, a forma dianiônica é a

que prevalece em pH fisiológico e também é a mais fluorescente em meio aquoso

(φf = 0,93, Sjöback e col., 1995). Devido a esse valor de φf próximo da unidade, a

fluoresceína é considerada como o composto mais fluorescente conhecido,

proporcionalmente à sua massa (daí seu uso em angiografia). Ela apresenta

fluorescência verde que pode ser detectada a olho nu em 1 em 40.000.000 partes

(Neckers, 1987). Com a protonação, formando a espécie monoaniônica, a propriedade

fluorescente diminui bastante (φf = 0,37) e é aproximadamente zero em meios muito

ácidos (FH2 e FH3+).

A emissão fluorescente da fluoresceína pode ser explicada pela transferência

fotoinduzida de elétrons (photoinduced electron transfer - PeT), um mecanismo muito

aceito para a supressão da fluorescência onde se sugere que a transferência de elétrons

diminui essa via emissiva do grupo fluoróforo (Valeur, 2002). No caso da fluoresceína e

seus derivados este processo envolve as duas partes da estrutura dos corantes: a

benzênica (B) e a parte xantênica (X) (Miura col., 2003; Nagano e col., 2003; Nagano e

col., 2004), ilustradas no Esquema IV. Segundo Nagano, a parte X é a responsável pela

fluorescência enquanto que a B é a parte controladora desta fluorescência. Com a

absorção de luz pode haver, no estado excitado, a transferência de elétrons entre essas

partes. Quando ocorre a transferência de um elétron da parte xantênica para a B, diz-se

que o processo é d-PeT (doador) e, o inverso, quando migra para a parte xantênica, a-

PeT (aceptor). Seguindo essa premissa, a espécie F2- apresentaria elevada

fluorescência devido à ortogonalidade entre os seus anéis (xantênico e benzênico;

Yamagushi e col., 1997). Nesse caso, como existe má sobreposição de orbitais

moleculares entre as duas partes, a ressonância eletrônica não é tão efetiva o que torna

cada um dos anéis quase que independente do outro (Osborn & Rogens, 1975). Assim,

na absorção de luz, o elétron estaria confinado na parte xantênica o que explicaria a alta

fluorescência.

As demais estruturas protolíticas da fluoresceína apresentam baixa fluorescência

podendo um dos motivos ser o fato das transições eletrônicas envolverem mudanças de

posição do elétron na molécula, ou seja, na transição o elétron é transferido da parte X

para a B, ou vice-versa.

12

Esquema IV. As duas partes componentes da fluoresceína: a parte xantênica (X)

responsável pela fluorescência e a benzênica (B) controladora da fluorescência.

Ainda de acordo com Nagano, o potencial de redução da parte B é o fator mais

importante na determinação do rendimento quântico de fluorescência da fluoresceína.

Para comprovar sua teoria, foram sintetizados diversos derivados com grupos captores

eletrônicos (ésteres, haloderivados, benzenoderivados) ligados à parte B e medidos os

potencias de redução dessa parte da molécula. Apesar dos comprimentos de onda de

absorção e emissão (λabs e λem) dos derivados serem muito semelhantes, os compostos

cuja parte B apresentavam potencial de redução mais negativa que -2,1 V em relação ao

ESC (eletrodo padrão de calomelano), apresentaram elevados valores de rendimento

quântico de fluorescência (φf) e tempos de vida de fluorescência (τf). Para potenciais de

redução mais positivos que -2,1 V vs ESC, esses valores diminuíam até atingir

aproximadamente emissão zero para alguns derivados (Nagano, 2003).

A estabilidade e o tempo de vida do estado excitado mostram-se dependentes da

temperatura. O aumento da temperatura leva a diminuição da fluorescência pelo

aumento da desativação da energia por meio de processos não-radiativos que estão

associados a colisões com o solvente e também com outras moléculas do próprio

corante (Lakovicz, 1999). Entretanto, mesmo em temperaturas elevadas, as constantes

de desativação não-radiativas para a F2- ainda são baixas e a principal forma de

desativação é através da emissão de luz de fluorescência (Arik e col., 2005).

Por causa de suas propriedades fluorescentes, a fluoresceína é utilizada na

fabricação de fibras óticas (Saari & Seitz, 1982; Fuh e col., 1987; Tan e col., 1992), na

conversão e armazenamento de energia solar (Chen & Bolton, 1980), em LASER de

corantes (Peterson e col., 1971), na confecção de placas de sinalização em rodovias, na

13

marcação de biomoléculas como DNA e proteínas (Stirling, 1986; Babcock, 1983). Outra

importante aplicação da fluoresceína é na medida do pH no interior celular, atuando

como sonda pH-fluorescente (Slavik, 1994). Um de seus usos em análises químicas é

como indicador para titulações de precipitação de haletos com Ag+, seguindo o método

de Fajans (Baccan e col., 2001). O corante também é muito utilizado para detectar

compostos de importância biológica como NO e íons Ca2+ (Minta e col., 1989; Kojima e

col., 1998; Walkup e col., 2000; Hirano e col., 2000), além de ser empregado na

angiografia, como anteriormente citado.

Propriedades oriundas do estado triplete de compostos derivados da fluoresceína

A presença de substituintes na fluoresceína tende a diminuir a propriedade

fluorescente devido a efeitos de relaxação vibracional. Nesses compostos, a conversão

inter-sistemas com formação do estado triplete é mais favorecida (bem como todos os

processos fotofísicos subseqüentes desse estado).

A síntese de derivados de fluoresceína geralmente é realizada através de

derivados do anidrido ftálico e do resorcinol, resultando em produtos com os

substituintes em posições bem definidas (Yang e col., 2005; Sun e col., 1997; Krafft e

col., 1988). Nesses procedimentos, a pureza dos produtos é muito grande. Nas sínteses

por reações de substituição eletrofílica, pode-se também partir da própria fluoresceína

para obtenção dos derivados. Porém, nesses casos, a tendência à formação de sub-

produtos é alta.

Derivados de fluoresceína com substituintes halogenados (I, Br, Cl e F) são

extensivamente utilizados como foto-iniciadores de reações de polimerização, conversão

de energia solar e como sensitizadores na ação fotodinâmica em materiais biológicos

(Neckers, 1987; Paczkowski e col., 1985) por gerarem grande quantidade de oxigênio

singlete, como pode ser verificado pelos altos valores de rendimento quântico de

formação de oxigênio singlete, φ 1O2. Tais valores estão mostrados na Tabela 1

juntamente com outras propriedades fotofísicas da fluoresceína e de alguns de seus

haloderivados.

14

Tabela 1. Propriedades fotofísicas da fluoresceína e de alguns de seus haloderivados

em água (Neckers, 1987)

Composto Substituintes λabs / nm φ f φ 1O2

Fluoresceína - 491 0,93 0,1

Eosina 4 x Br 514 0,63 0,4

Eritrosina 4 x I 525 0,08 0,6

Rosa de bengala 4 x I + 4 x Cl 548 0,08 0,8

Com o aumento do número de substituintes (e das massas molares), verifica-se

um deslocamento dos comprimentos de onda de absorção devido à diminuição das

energias dos orbitais LUMO envolvidos nessas transições eletrônicas. Seguindo essa

tendência, ocorre uma diminuição do rendimento quântico de fluorescência devido ao

efeito do átomo pesado (Lakovicz, 1999) favorecendo a conversão inter-sistemas e

conseqüentemente, propiciando o aumento do rendimento quântico de oxigênio singlete.

No caso dos derivados de fluoresceína, esse efeito é mais pronunciado quando os

substituintes encontram-se na parte xantênica, sobretudo na posição orto relativa às

hidroxilas fenólica e quinoidal (Neckers, 1987; Gandin e col., 1983).

I.4.2 - A eosina

A eosina foi sintetizada pela primeira vez por Emi Fischer em 1872. Trata-se de

um derivado bromado da fluoresceína, sendo que existem dois compostos comumente

referidos como eosina. A primeira, a eosina Y também conhecida como eosina

amarelada, é um corante alaranjado-rosa derivado do alcatrão que apresenta

fluorescência avermelhada. Esse é comumente usado como corante na indústria têxtil,

de cosméticos e para proporcionar a coloração alaranjada da gasolina (chemicalland21,

2006). A outra é a eosina B, também conhecida como eosina azulada, um corante que

apresenta uma fraca emissão de fluorescência no azul. Ambos tem suas estruturas

representadas na Figura 5.

15

O

COO-

OBr Br

NO2NO2

O O

COO-

OBr Br

BrBr

O

eosina B eosina Y Figura 5. Estruturas da eosina Y e eosina B.

Uma das mais importantes aplicações das eosinas é na coloração de células.

Quando se deseja visualizar um tecido biológico deve-se preparar a amostra para que

seja possível sua observação no microscópio óptico. Devido à obrigatoriedade dos

tecidos serem extremamente finos para se obter uma boa imagem, a amostra apresenta-

se incolor. Por isso, são adicionados alguns corantes orgânicos que se ligam aos

componentes do material permitindo a sua visualização. A ação desses corantes é

devida principalmente à interação seletiva dos grupamentos ácidos ou básicos dos

corantes aos tecidos. Assim, corantes carregados negativamente tendem a colorir

estruturas carregadas positivamente e vice-versa.

Freqüentemente utiliza-se uma combinação de corantes para visualizar ambos

tipos de estruturas. Um dos métodos mais amplamente utilizados é o método HE que

contém uma mistura dos corantes hematoxilina e eosina (Clark, 1981). A hematoxilina

(Figura 6) tem grande afinidade por componentes celulares básicos, conferindo-lhes

coloração azulada. Esse corante reage com diversos componentes das células e

tecidos, os quais incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos, grupos sulfatos de

glicosaminoglicanas e grupos carboxilato das proteínas. Estruturas celulares que podem

ser coradas incluem heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da

cartilagem e, por isso, a hematoxilina colore principalmente o núcleo celular. Essa

habilidade de grupos aniônicos reagirem com corantes básicos é chamada basofilia e,

portanto, estruturas celulares que se coram com esses corantes são denominadas

basófilas.

16

O

HO

OH

OH

HO

HO

Figura 6. Estrutura da hematoxilina.

Para a visualização de outras partes celulares, complementando a ação da

hematoxilina, utilizam-se corantes ácidos. Nesse contexto, desde o século XIX as

eosinas são utilizadas para corar componentes catiônicos celulares como o citoplasma e

seus filamentos, proteínas ricas em aminoácidos como fibras colágenas e fibras

extracelulares além de outras substâncias ácidas das células, chamadas de eosinófilos.

Para esse fim, a eosina Y é o corante mais amplamente utilizado e colore as estruturas

celulares em laranja ou rosa; permitindo, inclusive, mostrar inclusões e alterações

citoplasmáticas. A eosina é geralmente preferida dentre outros corantes ácidos (como

fucsina ácida, azul de anilina e orange G) porque permite atuar satisfatoriamente tanto

em meio aquoso quanto etanólico devido à sua solubilidade e também a sua intensidade

de coloração

I.4.3 - A rosa de bengala

A eritrosina e a rosa de bengala são usadas na indústria alimentícia (Gava, 1981;

Allen & Mc Keller, 1980) especialmente devido às suas colorações avermelhadas. A rosa

de bengala possui esse nome devido ao seu uso original como cosmético usado pelas

mulheres da região de Bengala (Índia) que pintavam o cabelo como uma forma

simbólica de divulgar para toda comunidade que eram casadas (Neckers, 1987).

A primeira síntese da rosa de bengala foi realizada por Schultz em 1881 (Rose,

1926). A rota sintética comercial da rosa de bengala é semelhante à da síntese de Bayer

para a fluoresceína, apresentada no Esquema V. O resorcinol e anidrido cloroftálico são

aquecidos em cloreto de zinco a aproximadamente 180 ºC. Depois de resfriado é tratado

com NaOH ou KOH; o produto é iodado com uma solução alcoólica de I2. A pureza do

corante é determinada comparando os coeficientes de absortividade molar do produto

com o do corante puro.

17

O

O

O

SbCl5O

ClCl

Cl

Cl

O

O

OHOH

2

ZnCl2 NaOHI2

O

Cl

COONaCl

Cl

I

NaO

I I

O

I

Cl

+

Esquema V. Rota sintética da rosa de bengala (Neckers, 1987).

A rosa de bengala possui um alto valor de absortividade molar

ε543 ~ 105 L.mol-1.cm-1 (Jirsa & Raban, 1962), semelhante ao da fluoresceína. Porém,

devido ao efeito dos átomos pesados (Cl, I) apresenta baixa fluorescência como

mostrado na Tabela 1. As reações da rosa de bengala no estado triplete incluem a

formação de radicais livres mediante a interação com doadores de hidrogênio ou a

transferência de energia para o oxigênio gerando ¹O2 (Gollnick, 1968).

Assim como a fluoresceína, a rosa de bengala também é utilizada na detecção de

doenças que afetam os olhos, especificamente, a Síndrome de Sjögren (Zoukhri, 2006).

Esta é uma doença auto-imune crônica, na qual o sistema imunológico do próprio

paciente, erroneamente, ataca as glândulas produtoras de lágrimas e saliva devido à

infiltração de linfócitos (um tipo de célula branca do sangue) nestas glândulas. Como

principal conseqüência, há a diminuição da produção de lágrimas e saliva podendo

também afetar outros órgãos, inclusive os rins, vasos sangüíneos, pulmões, fígado,

pâncreas e cérebro. Para sua detecção, realiza-se a medida da produção lacrimal com o

Teste de Schirmer e a avaliação das características do filme lacrimal através do teste

com o corante rosa de bengala (Nikitatis e col., 2003). A coloração proporcionada com

este corante através de lâmpada especial é de grande utilidade porque cora áreas de

descontinuidade do filme lacrimal e colore tanto células desvitalizadas quanto células

sadias (Universovisual, 2006).

18

Um outro uso da rosa de bengala na área médica envolve a detecção de doenças

hepáticas (Folder e col., 1985). O corante utilizado contém o radioisótopo de 131I no anel

xantênico. O corante, após ser injetado na corrente sangüínea, segue uma rota definida

no organismo que passa pelo fígado. Posteriormente a urina é examinada

espectroscopicamente buscando por sub-produtos da rosa de bengala, podendo indicar

alguns tipos de lesões no fígado.

I.4.4 - Nitroderivados de fluoresceína

Uma outra classe de derivados da fluoresceína envolve os seus nitroderivados.

Tais compostos já haviam sido sintetizados no final do século XIX / começo do século

XX (Bayer, 1876; Hewitt & Perkins, 1900), porém ainda não são obtidos em escalas

industriais. Existem poucos trabalhos fotofísicos e fotoquímicos sobre essas substâncias

(Rtishchev e col., 2001; Mchedlov-Petrossyan e col., 2005). Normalmente suas sínteses

são realizadas através da substituição eletrofílica da fluoresceína em reações de

nitração aromática, com a ligação dos substituintes preferencialmente às posições em

orto aos oxigênios fenólicos, com ácido nítrico fumegante ou misturas de ácido nítrico e

sulfúrico concentrados (Hewitt & Pekins, 1900; Samoilov e col., 1999).

O comportamento dos nitroderivados em soluções depende da quantidade e das

posições dos grupamentos nitro nas moléculas. Um modo conveniente de separação

dos produtos dinitrado e tetranitrado (majoritários dessa reação) é através da digestão

da mistura em solução de acetato de sódio ou através da dissolução da mistura em

solução aquosa de hidróxido de sódio a quente onde é adicionado ácido acético glacial

para precipitar o derivado dinitro; a solução é resfriada antes da filtração, pois o dinitro é

levemente solúvel em água quente (Hewitt & Perkins, 1900).

I.5. Derivados de fluoresceína e a TFD

A ação de compostos xantênicos na morte de micro-organismos mediante luz

(solar) foi mostrada pela primeira vez por Raab em 1904 (Raab, 1904). Num outro

estudo da mesma época, Von Tappeiner e Jodbauer mostraram o efeito de todos os

corantes derivados de fluoresceína até então conhecidos sobre a paramécia (Von

Tappeiner & Jodbauer, 1904) sem, no entanto, compreender claramente esses efeitos.

Essas propriedades fotoquímicas somente foram esclarecidas após a descoberta da

ação fotodinâmica, um efeito conjunto do corante e da luz que conduzem à morte de

micro-organismos.

19

Em estudos mais recentes, descobriu-se que a rosa de bengala e outros xantenos

halogenados são efetivos na foto-inativação de enzimas (Tsai e col.,1985) e destruição

de citocromos em mitocôndrias (Giulivi e col., 1990) através da geração de espécies

reativas de oxigênio, como o oxigênio singlete. A rosa de bengala já tem sua ação

fotodinâmica bem compreendida em materiais biológicos (Paczkowski e col., 1985;

Gandin e col., 1990; Shen e col., 2000). Em 1990, Gandin estudou o efeito fotodinâmico

da rosa de bengala em soluções de ácidos graxos, histidina e partículas

submitocondriais verificando que o oxigênio singlete foto-oxidou essas estruturas

mostrando-se eficiente na destruição dessas entidades.

O rendimento quântico de formação de oxigênio singlete da rosa de bengala e de

outros derivados de fluoresceína, cujos estados tripletes excitados apresentam longos

tempos de vida, são muito altos. Para a rosa de bengala este valor é de 0,76 em

metanol (Schenck & Goolnick, 1964), um dos maiores dentre todos os corantes

fotossensitizadores atualmente conhecidos, sendo utilizado como referencial em escalas

de quantificação de oxigênio singlete para outros corantes.

I.6. Propriedades Fotofísicas úteis aos fotossensitizadores aplicados em TFD

No desenvolvimento de fármacos fotossensitizadores e formulados para TFD

deve-se buscar uma série de propriedades desejáveis aos medicamentos visando a

obtenção de melhores efeitos no combate a tecidos doentes, conforme a descrição a

seguir (Sternberg e col., 1998; Boyle e Dolphin, 1996; Simplicio e col., 2002):

(i) alta absorção de luz na região de comprimentos de onda em que a luz é menos

absorvida e/ou espalhada por compostos endógenos do organismo. Em realidade, essa

região depende muito do órgão a ser tratado.

(ii) alto valor de rendimento quântico de 1O2. Como explicitado anteriormente, esta é

a principal espécie foto-ativa na TFD (mecanismo do tipo II). Sua formação é

influenciada por uma série de fatores, como a complexação do FS com biopolímeros,

processos de auto-agregação, desativação e reações laterais; para vários FS, o

rendimento quântico de oxigênio singlete varia entre 0,3 e 0,8 (Lang, 2004).

Na avaliação da quantidade de 1O2 formada por um FS e conseqüentemente na

sua ação pelo mecanismo TFD do tipo II, pode-se utilizar o ácido úrico (AU), Figura 7,

um captor eficiente de oxigênio singlete (Maestrin e col., 2004). A diminuição da

intensidade de absorção em 290 nm é correlacionada com a produção de oxigênio

singlete formada por um fotossensitizador irradiado por luz. A foto-oxidação do AU

20

mediante 1O2 conduz a produtos como a triuréia, a alantoxaidina, o íon oxanato e CO2

(Canellakis e Cohen, 1955).

N

N N

N

HO

OH

H

O

H

Figura 7. Estrutura do ácido úrico.

(iii) Alta fotoestabilidade. Um fotossensitizador deve ser razoavelmente estável contra

a foto-degradação e contra a oxidação provocada pelo 1O2 ou outras espécies reativas

de oxigênio geradas in situ (MacDonald e Dougherty, 2001; Bonnett e Martinéz, 2001).

(iv) Atóxico no escuro e foto-tóxico. A ação do FS somente deve ser observada

quando da presença de luz. Sem iluminação o composto deve ser “inerte” no organismo,

sem causar danosos efeitos co-laterais. Estudos de toxicidade de vários compostos e

efluentes aquáticos têm sido efetuados com Artemia salina, um organismo bioindicador

de poluição ambiental e de toxicidade de fácil manuseio (Bizukoje e col., 2005; Guerra,

2001). Além disso diversos trabalhos tentam correlacionar a toxicidade sobre Artemia

salina com atividades biológicas tais como antifúngica, antiviral, antimicrobiana,

parasiticida, antitumoral e tripanossomicida (MacRae e Hudson, 1988; Sahpaz e col.,

1994).

(v) Retenção específica e controlada no organismo. O FS deve ser

convenientemente e rapidamente transportado até o tecido problemático através de

biomoléculas como soro-albumina e lipoproteínas de baixa densidade, p.ex. Em seguida,

deve permanecer por um tempo adequado para a ação fotodinâmica ter-se completado

e findo esse processo, deve ser facilmente excretado do organismo (Henderson e

Dougherty, 1992).

(vi) Solubilidade adequada. A solubilidade do FS em meio aquoso é importante em

aplicações intravenosas diretas e no transporte para o tecido doente.

(vii) Presença de uma única espécie do FS em meio fisiológico. Importante para a

melhor avaliação das propriedades do FS e suas interações com outras moléculas.

21

Dessa forma, frisa-se que todas essas características devem ser consideradas na

proposição de um fármaco para Terapia Fotodinâmica como um medicamento eficaz e

comercialmente viável.

Uma vez que a fluoresceína já é utilizada para o diagnóstico de doenças em olhos

sendo, portanto, bem tolerada pelo organismo e facilmente excitada nos tecidos

oculares, acredita-se numa primeira análise que derivados de fluoresceína, em geral,

tendem também a apresentarem essas mesmas propriedades. Além disso, os derivados

que apresentam elevados rendimentos de formação de oxigênio singlete podem vir a ser

fármacos em potencial para o combate de doenças como a degeneração macular da

retina e a miopia patológica através da Terapia Fotodinâmica.

Apesar da eficiência da TFD, o custo do tratamento ainda é um fator limitante de

sua maior utilização. Nesse sentido, os sistemas de iluminação LED apresentam custos

muitíssimo menores que os LASERs atualmente utilizados, apesar de menos potentes;

entretanto essa última característica pode vir a ser vantajosa à aplicações em doenças

oculares (devido a menor queima da retina).

II. OBJETIVOS

Visando o desenvolvimento de fármacos derivados de fluoresceína para Terapia

Fotodinâmica, sobretudo para futuras aplicações em doenças oculares, o presente

trabalho se destina a investigar propriedades físico-químicas, fotofísicas e fotoquímicas

dessa classe de compostos. Adicionalmente, deseja-se avaliar o uso de sistemas de

iluminação alternativos construídos com diodos emissores de luz (LED).

Com isso pretende-se avaliar a aplicação de novos princípios ativos e fontes de

iluminação para a TFD, combinando alta eficiência, redução de custo, menor efeito co-

lateral e alta aplicabilidade.

III. MATERIAIS E METODOLOGIAS

Todos os solventes utilizados são de grau analítico e foram usados sem

purificação prévia. Os corantes fluoresceína (FSC, Carlo Erba), eosina Y (EOS, Reagen)

e rosa de bengala (RBB, Nuclear) tiveram a pureza atestada por análises de RMN. A

tetranitrofluoresceína (TNF) e a acridina-fluoresceína (N-FSC), não disponíveis

comercialmente, foram sintetizadas em nosso laboratório.

22

Síntese da acridina-fluoresceína (N-FSC)

Esse derivado foi obtido por um método adaptado de Reverdin, descrito em

Samoilov e col. em 1999. Para a síntese da N-FSC, foram dissolvidos 0,50 g

(1,3 x 10-3 mol) de fluoresceína em 25 mL de hidróxido de amônio concentrado (Synth).

A mistura reacional foi mantida sob agitação (agitador magnético), à temperatura

ambiente, durante 24 h e protegida da luz. Depois desse período, adicionou-se 10 mL de

ácido clorídrico concentrado (Synth) o que levou à precipitação de um sólido arroxeado.

O sólido obtido foi seco em dessecador, sob vácuo, na presença de sílica. O rendimento

dessa reação foi de 70% do produto puro (C20H12O4N; 331,3 g.mol-1). O composto

N-FSC é pouco solúvel em água, muito solúvel em DMSO e etanol.

Síntese da tetranitrofluoresceína (TNF)

Esse derivado foi obtido por um método semelhante ao proposto por Samoilov e

col., 1999. Em um balão contendo uma mistura de 12 mL de H2SO4 concentrado (Synth)

em 10 mL de HNO3 concentrado (Nuclear) foi adicionado 0,505 g (1,34 x 10-3 mol) de

fluoresceína dissódica. O meio reacional foi mantido sob agitação, temperatura ambiente

e protegido da luz durante 4 h. Finalizada a reação, a solução foi mantida em

temperatura ambiente (7 dias), no escuro, para precipitação. O sólido formado foi filtrado

num funil de vidro sinterizado e lavado com diversas porções de água gelada. A

recristalização foi feita dissolvendo-se o sólido em 5 mL de acetona (Nuclear) e

adicionando-se lentamente esta solução a 20 mL de água gelada. O sólido obtido foi

seco em dessecador, sob vácuo, na presença de sílica. O rendimento da reação junto

com a purificação foi de 51% do produto puro (C20H12O13N4; 512,3 g. mol-1). A TNF é

pouco solúvel em água e metanol, mas solúvel em etanol e DMSO.

Caracterização estrutural dos derivados

As estruturas dos compostos sintetizados, N-FSC e TNF, foram confirmadas por

RMN de 1H e 13C em 1D (H simples, C desacoplado e DEPT) e 2D (COSY e HMQC),

todos em CD3OD, obtidos num espectrômetro Varian, modelo Mercury plus BB, 300 MHz

(H) e 75MHz (C). Os espectros de infravermelho foram obtidos com amostras em

pastilhas de KBr num espectrômetro infravermelho FT-IR Thermo Nicolet Modelo Nexus

470. Para a discussão das estruturas, utilizou-se a numeração oficial adotada pela

IUPAC, mostrada no Esquema IX (pág 47).

23

Espectros de absorção molecular

Os espectros de absorção eletrônica na região do visível foram obtidos no

espectrofotômetro Varian Cary-50 ou em um Beckman DU-70, com controle de

temperatura Peltier. Preparo das soluções estoques

As soluções estoque dos corantes foram preparadas em água ou DMSO e

padronizadas periodicamente utilizando os coeficientes de absortividade molar (ε) em

tampão aquoso de pH 9, conforme a Tabela 2.

Tabela 2. Dados sobre as soluções estoques e λmax e εmax usados na padronização dos

corantes em solução aquosa de pH 9,0

Corante Estoque λmax / nm ε / L.mol-1.cm-1

FSC água 490a 76.900

EOS água 517c 97.100

TNF DMSO 404b 15.100

RBB água 543c 109.000

N-FSC DMSO 490c 76.700 a Sjöback e col., 1995; b Samoilov e col., 1999; c Determinados neste trabalho.

Determinação de pKa

Os valores de pKa em água foram determinados através da análise

espectrofotométrica dos corantes em soluções de diversos pHs na região de –1 a 15

(de 25 a 90 amostras), a 30,0 ºC em soluções tampão e extremos com HCl ou NaOH. A

composição de cada solução está descrita na Tabela 3. O pH das soluções foi ajustado

mediante a adição de mínimas quantidades de NaOH ou HCl concentrados (>10 mol.L-1)

e determinado em um pHmetro Meterlab pHM 240 com eletrodo combinado de vidro. A

manutenção de força iônica foi realizada com [NaCl] 0,1 mol L-1.

Para a obtenção dos valores de pKa utilizou-se metodologias tradicionais de

análise em comprimento de onda analítico individuais (Previdello e col. 2006) e também

metodologias quimiométricas com o auxílio de programas desenvolvidos no Laboratório

de Quimiometria em Ciências Naturais da Universidade Estadual de Londrina pela prof.

Dra. Ieda Spacino Scarmínio, conforme fundamentação matemática descrita no Anexo I

24

deste trabalho. Seguiu-se a convenção onde os valores de pKa3 refere-se ao grupo

menos ácido, pKa2 ao grupo intermediário e pKa1 ao grupo mais ácido.

Tabela 3. Composição das soluções aquosas usadas no controle do pH

pH Composição / mol.L-1

-1 a 2 [HCl] em várias concentrações

2 a 8 [Na2HPO4] = [Ac. Cítrico] = 7,5 x 10-3

[NaCl] = 0,1

[HCl] ou [NaOH] q.s.p.

8 a 10 [H3BO3] = 7,5 x 10-3

[NaCl] = 0,1

[NaOH] q.s.p.

10 a 12 [NaHCO3] = 7,5 x 10-3

[NaCl] = 0,1

[NaOH] q.s.p.

12 a 15 [NaOH] em várias concentrações

qsp: quantidade suficiente para

A partir das concentrações relativas das espécies calculadas pelos métodos

quimiométricos, os valores de pKa puderam ser determinados por duas maneiras

equivalentes. Na primeira, os valores de pKa são os pHs obtidos quando as

concentrações relativas de duas espécies protolíticas são iguais (ou seja, pelo pH de

intersecção entre duas curvas de concentração relativas de espécies envolvidas num

equilíbrio protolítico). Na segunda, os pKas são determinados aplicando-se as

concentrações relativas das duas espécies na equação de Henderson-Hasselbalch.

Ambas metodologias resultam em valores de pKa iguais para um dado equilíbrio, porém

a escolha de uma ou outra ocorre em função da dispersão dos pontos experimentais nas

curvas de concentrações relativas.

Uma outra técnica empregada para a determinação de pKa da EOS e da RBB em

soluções aquosas foi a titulação potenciométrica acompanhando-se a variação do

potencial (pH) com a adição do titulante. Adotou-se dois procedimentos distintos: a de

titulação direta e a titulação por retorno. No primeiro, titulou-se uma solução aquosa de

EOS (2,01 x 10-3 mol.L-1) com HCl (9,96 x 10-2 mol.L-1). O segundo método foi aplicado

tanto para a EOS (6,09 x 10-4 mol.L-1) quanto para a RBB (7,45 x 10-4 mol.L-1); nesse

25

caso, as soluções foram inicialmente acidificadas com HCl (1,17 mol.L-1) sendo então

tituladas com NaOH (0,13 mol.L-1) isento de carbonato (Vogel, 2002). Os valores de pKa

foram calculados com o Método de Gran modificado (Costa e col., 1992; Costa e col.,

1987) através de programas desenvolvidos em linguagem Fortran pelo prof. Dr. Willian

Ferreira da Costa da Universidade Estadual de Maringá.

Modelagem Molecular

Para efetuar os cálculos de modelagem molecular das espécies protolíticas da

fluoresceína, utilizou-se as estruturas propostas na literatura (Sjöback e col., 1995). Em

todas aplicou-se o programa Gaussian 2003 para se determinar as conformações

rotacionais mais estáveis através de cálculos de scan usando HF/STO-3G. As estruturas

tiveram suas geometrias otimizadas com a Teoria do Funcional de Densidade (DFT)

usando o conjunto de bases B3LYP/3-21+G*, considerando água como solvente e

segundo modelo de Onsager (Onsager, 1936). A verificação dos mínimos globais de

energia foi realizada mediante a ausência de freqüências de vibração negativas. Para a

discussão das estruturas utilizou-se a numeração mostrada no Esquema IX. A partir das

estruturas otimizadas em água fez-se cálculos de NBO (Natural Bond Orbital) aplicando

B3LYP/6-311 e também gerou-se os MEPs (mapas de potencial eletrostático) com o

programa MOLEKEL 4.3. Os espectros de UV-Vis dessas estruturas foram simulados

com a Teoria do Funcional de Densidade no Domínio do Tempo (TD-DFT), usando

B3LYP/3-21+G* e calculando 20 transições. Os fundamentos teóricos dessas técnicas

computacionais utilizadas estão sucintamente descritos no Anexo II.

Sistemas de fontes de luz LED

Para os experimentos envolvendo os foto-processos construiram-se dois

conjuntos de iluminação com LED (fabricante SunLed): um com máximo de emissão em

500 nm e outro em 520 nm (ambos verdes), sendo cada conjunto constituído por seis

dispositivos. Os espectros de emissão dos LEDs foram obtidos num espectrofluorômetro

SPEX Fluorolog2 modelo 1680 e a potência individual de cada LED foi medida com um

Handheld Laser Power Meter (Edmund Optics Inc.), no comprimento de onda de máxima

emissão de cada dispositivo. Esses sistemas de iluminação foram utilizados para os

estudos de foto-decomposição dos corantes, formação de oxigênio singlete e ensaios

com Artemia salina.

26

Foto-decomposição

Os estudos de foto-decomposição (photobleaching) dos fotosensitizadores foram

realizados em soluções de aeração normal e desaeradas. As últimas foram preparadas

mediante a passagem de gás N2 na solução durante uma hora; este fluxo foi mantido

efetuando-se, paralelamente, uma seqüência de três etapas de

congelamento/descongelamento da solução para remoção total do oxigênio.

Acompanhou-se a variação das bandas de absorção dos FS na região de 500 nm

nesses meios, iluminando as amostras de: FSC (1,05 x 10-5 mol.L-1), N-FSC

(6,28 x 10-6 mol.L-1) e TNF (6,05 x 10-5 mol.L-1) com o conjunto de LEDs de λmax de

emissão em 500 nm e as de EOS (4,20 x 10-6 mol.L-1) e RBB (3,12 x 10-6 mol.L-1), de

520 nm. As soluções eram tamponadas a pH 7,25 e iluminadas por 6 horas num foto-

reator construído no grupo com a temperatura mantida ao redor de 24 ºC.

Para a estimativa quantitativa desses resultados utilizaram-se os espectros de

transmitância dos compostos e os espectros de emissão do respectivo LED. Para cada

comprimento de onda, determinou-se a fração de luz do LED que foi absorvida pelo

corante (PFS/LED). Para cada corante a somatória dessas frações foi correlacionada com

o tempo de meia-vida t1/2 observado nas curvas cinéticas de decaimento foto-

degradativo.

Ensaios da atividade fotodinâmica química - Teste do ácido úrico

A habilidade do FS de formar oxigênio singlete avaliada pelo teste do ácido úrico

(Maestrin e col., 2004; Serra e col., 2002) pode ser chamada de atividade fotodinâmica

química (AFQ). À uma solução aquosa de pH 7,25 contendo ácido úrico (Vetec,

10-4 mol.L-1), foram adicionadas alíquotas dos corantes de tal forma que suas

concentrações fossem iguais às dos experimentos de foto-decomposição. As soluções

foram irradiadas com os sistemas LED por 6 horas, registrando-se espectros de

absorção a cada cinco minutos. O cálculo do índice de atividade fotodinâmica química

(AFQ) foi adaptado para sistemas irradiados com luz policromática, Equação 1, que

permitiu comparar a quantidade de oxigênio singlete formada para o par LED / FS.

(Eq. 1)

FS/LED

5

P x t10 x ΔAUAFQ =

27

onde ΔAU é a variação da absorbância do ácido úrico em seu máximo de absorção

(293 nm), PFS/LED representa a potência de luz absorvida pelo corante naquela condição

experimental e t o tempo de irradiação (min).

Ensaio in vivo da atividade fotodinâmica - Artemia salina

Para a verificação da atividade fotodinâmica dos FS em sistema biológico

adaptou-se o teste com Artemia salina (fornecedor: Maramar) para TFD a partir da

metodologia de Meyer (Meyer e col., 1982). Os ovos do micro-crustáceo foram deixados

em água salina (NaCl 0,1 mol.L-1) em pH 7,25, controlado por Na2HPO4 (7,5 x 10-3 mol.L-

1), a temperatura de aproximadamente 25 ºC num recipiente retangular, constituído por

duas partes interligadas (uma iluminada e outra mantida no escuro). Os ovos foram

adicionados na parte protegida da luz. O outro lado, iluminado com lâmpada branca de

60 W, serviu para atrair as cobaias eclodidas. Após 48 horas, foram transferidos cerca

de 20 animais maduros para cada tubo de ensaio utilizando uma pipeta do tipo Pasteur.

Adicionaram-se quantidades conhecidas de cada FS para atingir 25 µmol.L-1 e

250 µmol.L-1, em 3 mL de amostra.

Na seqüência constituiu-se quatro grupos de amostras: grupo I - controle, as que

não continham corante nem foram irradiadas com LED; grupo II - controle, as que não

continham corante mas foram irradiadas. Nesses dois grupos, com a N-FSC e TNF

adicionou-se DMSO num volume igual ao dos experimentos com estes FS, por ser este

o solvente das suas soluções estoque; grupo III - controle, as que continham corante e

não foram irradiadas; e grupo IV, as que continham corante e foram irradiadas com LED.

Após uma hora de finalizada a iluminação, realizou-se a contagem dos animais vivos e

mortos de cada tubo. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os

resultados estão apresentados em termos de porcentagem de morte, cujos valores estão

corrigidos pelo branco (grupo I).

28

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO IV.1. Estudos da fluoresceína IV.1.1 - Determinação dos pKas da fluoresceína (FSC)

Conforme já apresentado na Introdução, a fluoresceína apresenta três equilíbrios

protolíticos (Sjöback e col., 1995), ilustrados abaixo:

FH3+ + H2O FH2 + H3O+ pKa1

FH2 + H2O FH- + H3O+ pKa2 FH- + H2O F2- + H3O+ pKa3

onde FH3+ refere-se a forma catiônica, FH2 a neutra, FH- a monoaniônica e F2- a

dianiônica. A partir dos espectros UV-Vis apresentados na Figura 8A foi possível

monitorar os processos protolíticos e determinar os pKas existentes entre pH 0 e 13.

0 2 4 6 8 10 12 140,00

0,15

0,30

0,45

0,60

0,75490 nm

474 nm

452 nm

437 nm

Abs

pH

B) A)

350 400 450 500 550 600

0,00

0,15

0,30

0,45

0,60

0,75

ed

c

b

a

Abs

Comprimento de onda / nm

Figura 8. A) Espectros de absorção da FSC (8,76 x 10-6 mol.L-1) em soluções aquosas a

diversos pHs: (a) 0,31; (b) 3,36; (c) 5,39; (d) 7,25; (e) 13,04, força iônica = 0,1 mol.L-1 e

30,0 oC. B) Variação da absorbância (Abs) contra pH em comprimentos de onda

específicos.

Conforme ilustrado na Figura 8A, verifica-se intensa sobreposição de bandas para

as diversas formas protolíticas da fluoresceína. A espécie catiônica tem uma banda em

437 nm e a espécie dianiônica tem uma banda com máximo em 490 nm. As espécies

intermediárias (neutra e monoaniônica) não têm os espectros bem definidos.

29

A variação da absorbância com o pH para alguns comprimentos de onda

analíticos (437, 452, 474 e 490 nm) está mostrada na Figura 6B; esses comprimentos de

onda são atribuídos às regiões que correspondem a máxima absorção da forma

catiônica, neutra, monoaniônica e dianiônica da fluoresceína, respectivamente (conforme

Sjöback e col., 1995). Nota-se a presença de três pontos de inflexão que são mais

facilmente visualizados pelo monitoramento em 437 e 452 nm: (i) um na região de

pH = 2,0 indicando o pKa1; (ii) um segundo na região de 4,2 e (iii) um terceiro na região

de 6,3.

A determinação dos pKas através dos métodos tradicionais foi realizada com o

método das derivadas (Previdello e col., 2006) em 27 comprimentos de onda individuais

de 380 a 510 nm de 5 em 5 nm, resultando nos valores de pKa indicados na Tabela 4.

Os valores mostram dispersão relativamente pequena, exceto para o pKa1. Na mesma

tabela estão incluídos os valores encontrados na literatura.

Tabela 4. Valores de pKa da FSC em meio aquoso determinados com métodos das

derivadas empregando-se 27 comprimentos de onda analíticos. Incluiu-se as faixas de

valores de pKa encontrados na literatura.T= 30,0 oC. Força iônica 0,1 mol.L-1.

*Mchedlov-Petrossyan e Kleshchevnikova, 1994; Sjöback e col., 1995; Diehl e Horchak-

Morris, 1987.

Experimental Literatura*

pKa1 1,7 - 2,0 2,0 - 2,3

pKa2 4,3 - 4,4 4,2 - 4,5

pKa3 6,2 - 6,3 6,0 - 6,8

Pela Tabela 4 pode observar-se que os intervalos de pKa obtidos

experimentalmente estão razoavelmente concordantes com os encontrados na literatura.

Porém, fica evidente que ambas faixas são largas o que denota claramente a dificuldade

de determinações confiáveis dos valores de pKa pela intensa sobreposição espectral e

proximidade dos supostos pKas. Dessa forma, a determinação empregando-se apenas

um único comprimento de onda analítico (como é tradicionalmente feito) sugere a

existência de erros na interpretação dos dados.

Como já é conhecido, a validade da determinação dos valores dos pKas depende

do método analítico e envolve desde questões experimentais como solvente,

30

concentração, força iônica e temperatura, até o tratamento dos resultados. No que tange

a metodologia matemática, a utilização dos métodos quimiométricos (Ver Anexo I)

mostra-se adequada para sistemas como o caso da fluoresceína devido ao fato da

análise ser feita sobre todos os pontos do conjunto espectral; dessa forma, consegue-se

obter a contribuição de cada espécie em cada comprimento de onda, maximizando a

qualidade das informações espectrais em cada pH e assim, obtendo valores de pKas

mais confiáveis.

Para o caso da fluoresceína, a Análise das Componentes Principais (PCA)

mostrou que a presença de quatro espécies explica 99,996% da variância contida nos

dados, conforme reportado a Tabela 5. Este resultado indica que o conjunto espectral

reúne informações para a proposição da existência de quatro espécies protolíticas.

Tabela 5. Análise das componentes principais para a FSC.

N o de variáveis Variância explicada (%) Variância acumulada (%)

1 72,3623 72,3623

2 25,3325 97,6947

3 2,2741 99,9688

4 0,0269 99,9958

5 0,0018 99,9975

Com a aplicação do teste Q de Imbrie e das rotações Varimax e projeção oblíqua

de Imbrie, obtiveram-se as curvas das concentrações relativas nos diversos pHs,

ilustrada na Figura 9A.

As concentrações relativas calculadas pelos métodos quimiométricos (Figura 9A)

estão normalizadas pelo comprimento dos vetores espectrais mais divergentes e não

correspondem exatamente às frações das espécies. Para a obtenção dessas frações

aplica-se os valores de pKa obtidos com a quimiometria nas equações referentes às

frações de cada espécie em cada pH (Baccan e col., 2001), formando o diagrama

ilustrado na Figura 9B.

POL][Hα13+

=POL

]Ka3[Hα22+

= POLKa1Ka2Ka3α4 =

POL]Ka3Ka2[Hα3

+

=

onde: Ka3Ka2Ka1]Ka3Ka2[H]Ka3[H][HPOL 23 +++= +++

31

8

6

4

2

0

Figura 9. (A) Curvas de concentração relativa da fluoresceína em diversos pHs e (B)

Frações das espécies protolíticas da fluoresceína em diversos pHs.

A Figura 9B mostra que a espécie catiônica prevalece em pHs menores que 2. A

espécie neutra predomina num pequeno intervalo de pH (entre 2 e 3,5) devido a

proximidade dos pKa1 e pKa2. Entre pHs 4 e 6, prevalece a espécie monoaniônica e

acima de pH 7, a espécie dianiônica é a majoritária. Para vislumbrar-se um pouco da

complexidade do sistema, tome-se como exemplo a solução a pH 3; nesta a espécie que

prevalece é a FH2, no entanto as espécies FH3+ e FH- também estão presentes em

quantidades não desprezíveis.

Métodos quimiométricos para a determinação de pKa da fluoresceína foram

utilizados por Kubista e col. em 1993 e por Sjöback e col. em 1995. Nesses casos foram

usados algoritmos Nipals para a obtenção das curvas de concentrações relativas.

Comparando os valores de pKa encontrados com tal metodologia (2,1, 4,3 e 6,4) com os

encontrados com o método Q (2,5, 3,8 e 6,1), os pKa3 apresentam-se próximos; porém,

os valores de pKa1 e pKa2 são discordantes. Essa divergência pode ser explicada pela

quantidade limitada de espectros em pHs ácidos nos estudos da literatura.

Ainda, a aplicação do teste da matriz-K permitiu estimar os espectros das

espécies protolíticas puras (sem a sobreposição espectral), ilustrados na Figura 10. O

teste da matriz-K mostrou que os espectros das espécies intermediárias, neutra (FH2) e

monoaniônica (FH-), estão completamente ocultados pelos espectros da espécie

catiônica (FH3+) e dianiônica (F2-).

0 2 4 6 8 100,

0,

0,

0,

0,

1,0

F2-

FH-FH2FH3+

Con

cent

raçã

o re

lativ

a

pH

0 2 4 6 8 100,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

fraçã

o de

esp

écie

s

pH

FH3+

FH2FH-

F2-

A) B)

32

Figura 10. Espectros das espécies protolíticas da fluoresceína calculados com o método

da matriz-K.

Os valores de coeficiente de absortividade molar (ε) de cada espécie junto ao seu

máximo de absorção puderam ser obtidos (Tabela 6) considerando o valor da espécie

dianiônica (ε490nm = 76.900 L.mol-1.cm-1, valor referencial) uma vez que acima de pH 8

tem-se apenas uma única espécie presente (a F2-).

Tabela 6. Coeficientes de absortividade molar das espécies protolíticas da fluoresceína

nos comprimentos de onda de máxima absorção (λmax) obtidos por quimiometria

Espécie λmax / nm ε / L.mol-1.cm-1

Catiônica 435 44.000

Neutra 434; 488 13.200; 3.400

Monoaniônica 448; 470 25.000; 23.100

Dianiônica 490 76.900

Pelo perfil espectral apresentado na Figura 10, a espécie dianiônica apresenta, no

mínimo, duas transições eletrônicas na região de maior absorção (uma em 490 nm e

outra do ombro em cerca de 460 nm). Já o perfil da banda da espécie catiônica é

aparentemente gaussiânico, mas na realidade não é verdadeiramente simétrica,

indicando, portanto, a contribuição de mais de uma transição eletrônica para essa

banda. Para a espécie neutra é mais nítida a contribuição de duas bandas principais,

sendo uma mais intensa na região de 430 nm e outra menor na região de 490 nm. Para

a espécie monoaniônica existem também duas bandas mais intensas, uma na região de

450 nm e outra na região de 470 nm; além dessas duas, nota-se uma banda de baixa

350 400 450 500 5500,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

FH2

FH-

FH3+

Abs

ortiv

idad

e m

olar

apa

rent

e / L

.mo


F2-

l-1.c

m-1

33

intensidade na região de 350 a 400 nm provavelmente devida a transições vibrônicas de

baixa intensidade. Essa descrição espectral será importante para a discussão dos

estudos das transições eletrônicas das espécies protolíticas da fluoresceína com

modelagem molecular, no item IV.2.2 na simulação teórica dessas bandas de absorção.

Para atestar a correlação dos resultados obtidos com a metodologia

quimiométrica e as informações experimentais, simulou-se a curva da variação da

absorbância em 437 e 490 nm através das frações das espécies calculadas a partir dos

pKas obtidos com o método Q e das absortividades molares aparentes de cada espécie

obtidas com o teste da matriz-K. As curvas resultantes estão apresentadas na Figura 11.

0 2 4 6 8 10 12 14

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4 437 nm

Abs

pH

Simulado Experimental

0 2 4 6 8 10 12 14

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

490 nm

Abs

pH

Simulada Experimental

Figura 11. Curvas de absorbância experimental e simulada para a fluoresceína através

das frações das espécies e dos coeficientes de absortividade molar, em 437 nm e 490

nm.

As curvas simuladas reproduzem bem a variação experimental verificada nesses

comprimentos de onda (principalmente na parte que corresponde ao pKa) confirmando a

eficiência da metodologia quimiométrica de determinação de pKas refletindo apenas

erros menores. Dentre alguns aspectos importantes dos métodos quimiométricos

destacam-se o tratamento matemático mais abrangente (vários comprimentos de onda

simultaneamente), a não necessidade de um conjunto de calibração (padrões) para a

análise e, também, a não necessidade de etapas de separação química das espécies

envolvidas reduzindo trabalho, custo e erros.

34

IV.1.2 - Estudo das estruturas protolíticas da fluoresceína por modelagem molecular

Apesar da fluoresceína ser muito conhecida e apresentar diversas aplicações em

pesquisas científicas e tecnológicas, poucos trabalhos se dedicaram ao estudo de seus

aspectos mais fundamentais principalmente àqueles referentes às estruturas das

espécies protolíticas, ilustradas no Esquema VI. Alguns poucos trabalhos, por exemplo,

ou abordam em seus estudos de modelagem molecular apenas algumas espécies

protolíticas ou utilizam um nível de cálculo pouco confiável para uma predição correta de

suas propriedades (Wang e col., 2001; Tamulis e col., 2003; Acemioğlu e col., 2001;

Jang e col. 2001; Hirano, 1983; Fabian e col., 1996). Devido a estes fatos, neste

trabalho, as estruturas protolíticas da fluoresceína, Esquema VI, foram investigadas

através da Teoria do Funcional de Densidade (Anexo II) uma vez que as geometrias

preditas pelos métodos de DFT tendem a reproduzir bem o comportamento experimental

(Anthoni e col., 1995; Wang e col., 2001; Markuszewski e Diehl, 1980; Ghelli e col.,

1996). Dessa forma, pode-se avaliar a principal estrutura responsável pelo

comportamento da fluoresceína em certos intervalos de pH e, assim, melhor entender o

comportamento desse corante.

Os valores de energia de formação (ΔHf) encontrados com os cálculos de

otimização para as diferentes estruturas protolíticas no vácuo e em água, segundo

modelo de Onsager, estão apresentados na Tabela 7.

Tabela 7. Energia de formação das estruturas protolíticas da fluoresceína no vácuo e em

água (Onsager) pelo método DFT e conjunto de bases 3-21*G+. Em negrito,

apresentam-se as energias das formas mais estáveis das espécies FH e FH-. 2

Estrutura E vácuo / a.u. E água / a.u. ΔE água-vácuo / kcal.mol-1

FH3+ CT -1139,73542795 -1139,73687026 - 0,9050

NEQ -1139,34643575 -1139,36537146 - 11,8757

FH2 NEL -1139,36061517 -1139,36445220 - 2,4064

NEZ NEL NEL NEL

FH- MAC -1138,83701200 -1138,86852224 - 22,0130

MAF -1138,84120822 -1138,86042736 - 12,0532

F2- DA -1138,24338475 -1138,26123660 - 11,1959

NEL : ocorre conversão da forma NEZ para a NEL durante a fase de cálculos.

35

CATIÔNICA

HO O OH

COOH

[CT]

[MAF] [MAC]

ZWITTERIÔNICA

HO O OH

COO

LACTONA

O OH

O

O

HO

QUINÓIDE

O O O

COOH

H

[NEQ] [NEL] [NEZ]

FENOLATO

O O

COOH

O-OO

COO

OH

CARBOXILATO

O OO

COO

[DA]

DIANIÔNICA

Esquema VI. Estruturas protolíticas da fluoresceína propostas por Sjöback e col. (1995).

36

No caso das espécies neutra e monoaniônica, onde existe a possibilidade de mais

de uma estrutura, os cálculos de modelagem molecular permitem determinar quais são

as predominantes em meio aquoso. Já as formas catiônica e dianiônica são propostas

pela literatura como uma única estrutura.

Segundo a literatura corrente, a FSC neutra encontra-se em equilíbrio tautomérico

envolvendo três estruturas possíveis (NEL, NEQ e NEZ); a proposição dessas formas

neutras está baseada em estudos de três estruturas cristalinas do corante (Anthoni e

col., 1995; Markuszewski e Diehl, 1980). Na forma de cristais apresentam padrões de

difração de pó distintos e seus espectros de absorção no infravermelho apresentam

bandas na mesma região, mas com variações em intensidade e localização dos sinais

(Anthoni e col. 1995). Assim, essas formas confirmadas no estado sólido foram

transpostas como espécies também presentes em solução.

Espécie neutra e a convergência da forma NEZ para a NEL

A literatura relata a existência da forma neutra lactona (NEL) em DMSO

baseando-se na detecção do estiramento da ligação C=O de lactonas (υmax = 1755 cm-1)

nos espectros de absorção no infravermelho da fluoresceína (Mchedlov-Petrossyan &

Mayorga, 1992). Tal estrutura já foi isolada no estado sólido a partir do congelamento de

uma solução de fluoresceína em dioxano anidro (Markuszewski e Diehl, 1980). Ainda por

dados da literatura, a forma zwitteriônica (NEZ) é proposta para a fluoresceína sólida

(amarela) mediante as semelhanças de seus espectros de infravermelho com os de sais

de pirílio (Anthoni e col. 1995; Markuszewski e Diehl, 1980) podendo sua existência ser

transposta para o meio aquoso.

Pelas estruturas otimizadas, tanto em vácuo quanto em água, a forma NEZ

convergiu para a NEL durante o processo de otimização (Tabela 7). Este efeito pode ser

interpretado pela proximidade espacial de duas cargas de sinais opostos na estrutura

NEZ que tendem a formar a ligação desses dois átomos. Essa interação é ainda mais

favorecida porque conduz à uma estrutura cíclica (aumento da estabilidade). Portanto, a

estrutura NEL é de existência mais provável que a NEZ.

Visando um melhor entendimento dessas estruturas, uma investigação mais

aprofundada sobre a estrutura otimizada da forma NEL mostrou que a distância entre o

oxigênio e o carbono (responsáveis pela ligação da lactona) é de 1,55 Å, cerca de 20%

maior que o comprimento de ligação de C-O de lactonas simples (Briggs e col., 1984).

Esta distância está de acordo com o encontrado experimentalmente na fluoresceína

37

lactona sólida (Ghelli e col.,1996), em alguns derivados de fluoresceína (Neckers, 1987)

e também no caso de rodaminas (Wang, e col., 2001). Os resultados teóricos indicam

que o substituinte benzênico aumenta o comprimento da ligação lactona diminuindo a

densidade eletrônica entre os átomos de carbono e oxigênio. Este fato, provavelmente,

pode ser o responsável pela proposição (ainda que equivocada) da forma NEZ como

uma estrutura possível para a fluoresceína neutra em meio aquoso.

Cálculos de NBO reafirmam a forma NEL como predominante sobre a NEZ

indicando a existência das seguintes interações entre orbitais moleculares que

estabilizam a ligação lactona em aproximadamente 37,35 kcal.mol-1: σ σ*C13-C14 C9-O,

σ* σ* σ* σ* σ*σC11-C12 C9-O, C13-C14 C9-O, C11-C12 C9-O (todas do anel pirano). A numeração

atômica pode ser visualizada no Esquema VII.

9

11

1213

14O OHO

OC O

H

Esquema VII. Numeração atômica da fluoresceína (IUPAC).

Espécie neutra (NEL e NEQ)

Continuando a análise da espécie neutra em meio aquoso, agora em relação às

formas NEL e NEQ, o meio aquoso (polar) estabiliza a forma NEQ em quase 12

kcal.mol-1 (Tabela 7), tornando-a a mais estável. Este efeito provavelmente é devido ao

maior momento dipolar elétrico da forma NEQ em relação a NEL, cujos valores estão

mostrados na Tabela 8.

Tabela 8. Momento dipolar calculado das formas NEQ e NEL

Estrutura μ vácuo / D μ água / D NEQ 11,8484 20,7244 NEL 6,1314 8,5821

38

As energias de formação de cada espécie em meio aquoso (Tabela 7) predizem

que a forma NEQ apresenta-se em maior quantidade que a NEL em meio aquoso (o que

é previsível, inclusive, pelo seu maior momento dipolar). Entretanto, este resultado

diverge do publicado por Klonis e Sawyer em 1996 que afirmaram a presença da

fluoresceína neutra como 70% na forma lactona, 15% na forma zwitteriônica e somente

os 15% restantes na forma quinoidal, baseados em ajustes matemáticos sobre

espectros de absorção no visível em meio aquoso. Porém, nossos resultados são

concordantes com a proposta de Sjöback e col. que em 1995 propuseram a forma NEQ

como majoritária em meio aquoso e também concordamos com a afirmação de que a

forma quinoidal colorida deve ser a predominante em solventes polares enquanto que a

forma lactona incolor prevalece em solventes apolares (Samoilov e col. 1999); inclusive

os espectros de RMN (1H e 13C) da FSC em metanol comprovam que a forma NEQ é a

mais favorável neste meio (Tabela 12).

Espécie monoaniônica (MAC e MAF ) Já para a espécie monoaniônica são apresentadas duas formas possíveis em

equilíbrio (MAC e MAF). Em 1996, Klonis e Sawyer indicaram que a MAF deveria

representar algo em torno de 0,1% do total das espécies monoaniônicas em estudos

sobre propriedades protolíticas da fluoresceína em meio aquoso.

No estudo teórico da espécie monoaniônica, a forma mais estável no vácuo é a

forma fenolato (MAF); isso ocorre devido a um efeito entálpico que envolve a

deslocalização da carga negativa sobre todo o anel xantênico e não apenas num dos

anéis benzênicos. Entretanto em água a forma MAC (com um próton ligado ao anel

hidroxi-xanteno) foi calculada como a mais estável, como proposto pelos experimentos

de Mchedlov-Petrossyan e col. (Mchedlov-Petrossyan e col., 1992; Mchedlov-Petrossyan

e col., 1994). Nesse caso, a carga negativa está deslocalizada sobre os dois oxigênios

do grupamento carboxilato e, assim, o principal fator que deve estabilizá-la é a

ressonância eletrônica nesse grupo. Aliado a esse fato existe o intenso efeito causado

pela solvatação que estabiliza essa carga do carboxilato. O aumento do momento

dipolar da estrutura MAC com a consideração do meio aquoso, como mostrado na

Tabela 9, torna a estrutura muito mais estável nesse solvente de alta constante

dielétrica. Enfatize-se a inversão de momento dipolar calculado no vácuo com o em

água.

39

Tabela 9. Momento dipolar calculado das formas MAC e MAF

Estrutura μ vácuo / D μ água / D

MAC 12,9983 27,6022

MAF 15,1856 20,6623

Esses efeitos aparentam serem mais intensos que a estabilização de ressonância

da carga negativa no anel xantênico, verificado no caso da MAF.

Contribuição da modelagem molecular na explicação dos valores de pKa da FSC

As considerações teóricas sobre as espécies protolíticas da fluoresceína são úteis

para a análise dos resultados de pKa obtidos dos dados espectrofotométricos e métodos

quimiométricos. O valor de pKa3 obtido para a protonação da espécie dianiônica é 6,1 e

segundo os dados de modelagem correspondem ao equilíbrio entre a forma DA e a

MAC, ou seja, esse pKa3 é relativo ao grupo fenólico. O valor 6,1 é bem menor que os

de compostos fenólicos sem substituintes, pKa = 10 (CRC Handbook of Physics and

Chemistry, 2005), assim no presente caso esse baixo valor deve ser conseqüência da

presença de grupos retiradores eletrônicos ligados aos anéis fenólicos.

A densidade eletrônica das espécies DA, MAC e NEQ, ou seja, as formas mais

estáveis das estruturas protolíticas em meios aquosos (faltando a CT), são ilustradas na

Figura 12, o que permite obter informações sobre o pKa2. Nesta figura a parte das

estruturas apresentando maior densidade eletrônica está representada em vermelho

escuro, regiões neutras em verde e menor, em azul escuro.

A forma DA apresenta maior densidade de carga negativa nos oxigênios

fenólicos. Com a protonação (passagem majoritária para a forma MAC), a densidade de

carga negativa diminui um pouco nos oxigênios e acentuadamente em toda a molécula,

particularmente mostrando forte diminuição no anel xantênico, o que sugere um alto

grau de deslocalização eletrônica neste anel.

No nosso estudo com a fluoresceína o valor de pKa2 encontrado foi 3,8 que é

ligeiramente menor que o encontrado para o ácido benzóico, pKa= 4,20 (CRC Handbook

of Physics and Chemistry, 2005), indicando que o anel xantênico exerce alguma

influência sobre essa protonação, especificamente aumentando a acidez daquele próton.

40

DA MAC NEQ Figura 12. Mapas de potencial eletrostáticos das formas protolíticas mais estáveis da

fluoresceína em água (região em vermelho: maior densidade de carga negativa; verde:

neutralidade; e azul: maior densidade de carga positiva).

Na forma DA, verifica-se que a densidade de carga está uniformemente

distribuída sobre os dois oxigênios do carboxilato, da mesma forma que o esperado para

o ácido benzóico. Com a protonação da fluoresceína (pKa3), no entanto, verifica-se a

perda desta uniformidade da distribuição eletrônica do carboxilato, na forma

monoaniônica. Assim, quando o carboxilato é protonado (pKa2), a distribuição eletrônica

sobre o carboxilato da fluoresceína não é a mesma da pressuposta para o ácido

benzóico. Dessa forma, a nuvem eletrônica do anel xantênico polariza a densidade de

carga no carboxilato e, por conseqüência, afeta sua protonação, explicando as

diferenças observadas nos valores de pKa.

41

Parâmetros estruturais

O interesse numa investigação teórica envolvendo parâmetros estruturais das

espécies protolíticas da FSC em fase gasosa (vácuo) e em solvente consiste no fato de

permitirem um melhor entendimento sobre os efeitos causados pelas dissociações

ácidas (e conseqüente mudança de estrutura) nas propriedades moleculares do

composto. Assim para facilitar a visualização ao leitor, transpomos novamente as

estruturas protolíticas mais estáveis em água da FSC segundo os métodos

computacionais (CT, NEQ, MAC e DA), Esquema VIII. Assim as discussões que se

seguem estão voltadas às espécies predominantes em meio aquoso, embora também

sejam feitas referências às demais.

[CT] [NEQ] [MAC] [DA]

HO O OH

COOH

O O OH

COOH

OO

COO

O10

9

OO

COO

OH

Esquema VIII. Estruturas protolíticas da fluoresceína mais estáveis em meio aquoso,

segundo cálculos teóricos.

A Tabela 10 mostra os valores de dois ângulos diedrais importantes; todas as

espécies protolíticas mais estáveis apresentam estruturas com um ângulo diedral (ϕ1),

de aproximadamente 90º, entre o grupo benzênico e o anel xantênico comprovando a

ortogonalidade entre os anéis, já estudada experimentalmente (Yamagushi e col., 1997).

Estes resultados estão em concordância com o previamente discutido na introdução,

onde se ressaltou a importância da ortogonalidade para a forma F2-, dado o

confinamento do elétron na parte xantênica (modelo de Nagano na explicação das

propriedades fluorescentes da fluoresceína). Com relação ao ângulo diedro (ϕ2) entre o

anel benzênico e o ácido carboxílico ao redor de zero, denota que este substituinte ácido

encontra-se orientado em paralelo ao anel.

42

Tabela 10. Valores de ϕ1 e ϕ2 para as espécies protolíticas da fluoresceína

ϕ1 ϕ2

CT 90,39388 0,49045

NEQ 95,72322 0,69768

MAC 108,44987 4,33319

DA 94,53538 0,08447

O valor de ϕ1 para a MAC é ligeiramente maior que 90º devido a conformação do

grupo carboxilato na parte benzênica que está orientada em direção ao anel xantênico,

numa estrutura semi-cíclica o que denota uma interação entre o C9 (Esquema VII) e um

dos oxigênios do carboxilato. Essa interação não existe nas outras espécies.

Simulação dos espectros de absorção no UV-Vis

Na simulação dos espectros de UV-Vis das espécies protolíticas da fluoresceína,

a utilização de um conjunto de base de maior nível teórico como 6-311++G** ou a

consideração de modelos de solvente como IEFPCM alteram a intensidade e a posição

das bandas, porém, tem-se manutenção qualitativa dos perfis espectrais em relação a

níveis de teorias mais simples. Assim, a escolha pelo método por DFT/3-21+G* ocorreu

por causa do menor tempo de máquina e boa correlação dos resultados teóricos com os

experimentais, conforme pode ser visualizado na Figura 13.

Como pode ser visualizado na Figura 13, embora os perfis teóricos sejam

semelhantes aos experimentais, as transições calculadas estão deslocadas para a

região do azul, fato este atribuído a uma sub-estimativa da energia dos orbitais HOMO

em muitas funcionais do método TD-DFT (Tamulis e col., 2003).

A fim de melhor visualizar os resultados da Figura 11, apresenta-se as

transições mais representativas de cada espectro (força do oscilador diferente de zero)

na Tabela 11. Nessa, os valores de comprimentos de onda das bandas determinadas

pela quimiometria (λquimio) estão correlacionados com os comprimentos de onda

calculados (λTD-DFT). Além disso, mostram-se os orbitais HOMO e LUMO envolvidos em

cada uma das principais transições eletrônicas bem como as suas contribuições nesses

processos (coeficiente de transição). A força do oscilador, um parâmetro equivalente ao

coeficiente de absortividade molar, também é apresentado.

43

Figura 13. Correlação entre os espectros obtidos com o método da matriz-K e os

simulados com TD-DFT.

Em relação à espécie catiônica, a proposição de que o espectro da forma CT não

segue um perfil gaussiânico (simétrico) é confirmada pelos cálculos teóricos por TD-DFT

que prevêem a existência de duas bandas uma em 382 nm (mais intensa) e outra em

336 nm.

No caso da espécie neutra, existem duas estruturas possíveis: a NEL e a NEQ. A

forma NEL não contribui para o perfil espectral desta espécie porque somente apresenta

bandas de absorção na região do ultravioleta (não investigada experimentalmente nesse

trabalho). O espectro da forma NEQ explica bem os espectros obtidos com o método da

matriz-K pois esta forma apresenta duas bandas de absorção, concordante com o

visualizado com os espectros experimentalmente.

A correlação qualitativa entre os resultados teóricos e os experimentais foi

melhor para a forma monoaniônica. Nesse caso, a forma MAC tem uma banda de

absorção calculada em 479 nm, muito próxima da banda em 470 nm, no espectro

experimental.

300 400 5000,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

catiônicaquimio

CTTD-DFT


ε / L

.mol

-1. c

m-1

0,0

0,2

0,4

0,6

força do oscilador

300 400 500 6000,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

neutraquimio NEQTD-DFT


ε / L

.mol

-1. c

m-1

0,0

0,2

0,4

0,6

força do oscilador

300 400 500 6000,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

monoaniônicaquimio MAFTD-DFT MAC

TD-DFT


ε / L

.mol

-1. c

m-1

0,0

0,2

0,4

0,6

300 400 500 6000,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

dianiônicaquimio

força do oscilador

DATD-DFT


ε / L

.mol

-1. c

m-1

0,0

0,2

0,4

0,6

força do oscilador

44

Tabela 11. Transições mais representativas das espécies protolíticas da fluoresceína

calculadas com TD-DFT 3-21+G*, na região do visível

Estrutura λ quimio

(nm)

λTD-DFT

(nm)

Orbitais envolvidos

na transição

Coeficiente de

transição

Força do

oscilador

CT

435

382

84 87

85 89

86 87

-0,20777

0,14298

0,59338

0,4427

416* 336 80 87

82 87

0,17323

0.65368

0,1069

488 426 84 87

86 87

-0,24599

0,55412

0,3313

NEQ

434

347

84 87

86 87

86 90

0,61321

0,17152

-0,13397

0,2387

MAC 470 479 86 90 0,68314 0,0868

MAF 448 445 86 88 0,57041 0,6764

490 437 81 87

86 87

0,11767

0,59359

0,5959

DA

470*

408

85 87

86 88

86 90

0,61217

0,19554

-0,12026

0,1052

* λ aproximado do ombro junto à banda principal.

Além disso, a forma MAF apresenta um máximo de absorção em 445 nm muito

próximo da banda em 448 nm no espectro da espécie pura. Mesmo em pequena

quantidade, esta espécie apresenta uma banda relativamente intensa por possuir um

alto valor de absortividade. A existência da região alargada entre 350-400 nm pode ser

atribuída a transições vibrônicas (transições vibracionais que favorecem a presença de

transições eletrônicas de pequena intensidade), não previstas nos cálculos com TD-

DFT.

As transições eletrônicas que mais contribuem para as bandas principais das

formas CT, NEQ e DA envolvem os orbitais HOMO-86 e LUMO-87 que correspondem a

transições em 382, 426 e 437 nm, respectivamente. Como a espécie dianiônica é a

45

predominante em pH fisiológico e também a de maior utilização tecnológica e na

medicina, uma investigação mais detalhada sobre a origem de seus espectros torna-se

pertinente e interessante. O espectro da espécie dianiônica é constituído basicamente

por duas transições: uma calculada em 437 nm (mais intensa) e outra em 407 nm,

correlacionadas a banda assimétrica em 490 nm. Na Figura 14, ilustram-se os orbitais

HOMO-86 e LUMO-87 da espécie DA.

81 87

86 87

Figura 14. Orbitais HOMO e LUMO de maior contribuição para a banda de absorção em

490 nm da espécie dianiônica da fluoresceína.

Como apresentado pela Figura 14, a transição envolvendo o orbital HOMO-86

(0,006 a.u.) e o LUMO-87 (0,117 a.u.) da espécie dianiônica envolve a mudança de

densidade eletrônica do anel xantênico. Nesse caso, os anéis fenólicos e os carbonos

em orto ao oxigênio têm sua densidade eletrônica deslocada para o oxigênio e o

carbono que mantém a estrutura da parte xantênica (C9 e O10, Esquema VIII).

A transição envolvendo o HOMO-81 (-0,037 a.u.) e o LUMO-87 também contribui

para a banda de absorção da forma dianiônica em 490 nm, porém sua contribuição é

46

bem menor, conforme apontado na Tabela 11. Nessa transição, a densidade eletrônica é

direcionada para todo o anel piranóide (anel central do grupo xantênico). Assim, de uma

maneira geral, as principais transições eletrônicas responsáveis pela banda de absorção

da espécie dianiônica em 490 nm envolvem uma grande variação da densidade

eletrônica no grupo xantênico; esta é direcionada dos anéis laterais (fenólico e quinoidal)

para o anel central (o piranoidal).

IV.2. Síntese e caracterização estrutural de derivados da fluoresceína

Além da fluoresceína, neste trabalho investigou-se as propriedades de mais

quatro corantes fotossensitizadores: dois comerciais, a eosina Y e a rosa de bengala B e

outros dois que foram sintetizados, o derivado tetranitrofluoresceína e a acridina-

fluoresceína. O interesse em derivados nitrados de fluoresceína deve-se ao fato de suas

propriedades ainda não estarem bem esclarecidas na literatura. No caso da acridina-

fluoresceína, um composto de cadeia similar a xantênica, a motivação é as acridinas

serem conhecidas geradoras de 1O2; a acridina em benzeno, por exemplo, tem φ 1O2 de

0,83 (Wilkinson e col., 1993).

IV.2.1 – Síntese da Acridina-fluoresceína (N-FSC) e da Tetranitrofluoresceína (TNF)

Caracterização da N-FSC

A proposição da estrutura da N-FSC, obtida pela modificação direta da FSC, pôde

ser realizada pelo desaparecimento da banda de absorção no IV em 1173 cm-1 referente

à ligação C-Opirano da FSC e o aparecimento de duas bandas na N-FSC: uma em

1245 cm-1 (N-Caromático) e em 1264 cm-1 (N=Caromático), conforme mostrado na Figura 15.

Os sinais de RMN 1H e 13C da N-FSC foram atribuídos mediante comparação com

os espectros da FSC, conforme mostrado na Tabela 12, juntamente com a numeração

adotada para os carbonos e hidrogênios, seguindo a IUPAC, ilustrada no Esquema IX.

Os acoplamentos entre os hidrogênios benzênicos não puderam ser determinados

devido a sobreposição dos sinais no espectro de RMN de próton. A dificuldade de

análise das multiplicidades e acoplamentos entre os prótons parece indicar a existência

de mais de uma estrutura protolíticas em metanol, para ambos corantes.

47

FSC

C-Opirano

N=Caromático

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

número de onda / cm-1

N-FSC

N-Caromático

Figura 15. Espectros de absorção no IV dos sólidos da FSC e N-FSC.

No espectro da FSC, o deslocamento químico (δ) de 13C RMN do C3 está em

161,1 ppm sendo atribuído a um carbono hidroxílico, enquanto que o sinal do C6

aparece em 182,2 ppm, indicando um carbono carbonílico. Além disso, não foi verificado

nenhum sinal entre 70 e 95 ppm, o que seria indicativo da ligação C-O de lactona.

Diante desses dados propõe-se que a estrutura preferencial da FSC em metanol é a

quinoidal (NEQ), fato que reforça nossos estudos teóricos que levaram a proposição

desta estrutura como a mais estável em água (solvente de alta polaridade). A ausência

de sinal do próton do grupo COOH reflete as trocas protônicas com o meio metanólico

(solvente polar prótico).

4'

O OO

COO1 8

14

13 12

11

2'

3'5'

6'1'

6

97

510

2

3

4 4

3

2

10 5

7

9

6

1'6'

5' 3'2'

111213

14

81

N OHO

COOH

H

4'

[ FSC ] [ N-FSC ] Esquema IX. Numeração atômica para a FSC e N-FSC, seguindo a IUPAC.

48

Tabela 12. Proposta de atribuição dos deslocamentos químicos (δ) de RMN da FSC e da

N-FSC em CD3OD.

Posição δH FSC δC FSC δH N-FSC δC N-FSC

1 7,06 (9,9 Hz; 2,1 Hz) 132,5 6,67 (12 Hz) 103,5

2 6,52 (11,1 Hz; 2,1 Hz) 123,8 6,55 (15 Hz) 113,7

3 - 161,1 - 161,5

4 6,52 (11,1 Hz; 2,1 Hz) 104,3 6,55 (15 Hz) 130,3

5 6,52 (11,1 Hz; 2,1 Hz) 104,3 6,55 (15 Hz) 130,3

6 - 182,2 - 136,0

7 6,52 (11,1 Hz; 2,1 Hz) 123,8 6,55 (15 Hz) 113,7

8 7,06 (9,9 Hz; 2,1 Hz) 132,5 6,67 (12 Hz) 103,5

9 - 141,6 - 111,5

11 - 160,3 - 166,7

12 - 113,4 - 154,2

13 - 113,4 - 154,2

14 - 160,3 - 181,9

1’ - 134,6 - 128,3

2’ - 172,2 - 169,4

3’ 8,00 130,5 8,01 126,0

4’ 7,55 130,0 7,70 131,1

5’ 7,55 130,0 7,77 136,5

6’ 7,20 130,8 7,21 125,5

Caracterização da TNF

O espectro de absorção no infravermelho da FSC na Figura 15 mostra um

conjunto de bandas na região de 1.300 a 1.500 cm-1, na região de ligações C=C de

aromáticos. Na TNF, estas bandas mudam de perfil: a banda em 1.390 cm-1 desaparece

e tem-se novas bandas referentes às ligações N-Onitro em 1352 e 1450 cm-1.

Além dessas duas bandas, tem-se uma banda em 1786 cm-1 referente à ligação

C-O de lactonas (Figura 16). A estrutura da TNF na forma sólida contém uma ligação

lactona ligando o anel benzênico ao xantênico. Essa estrutura é favorecida sobretudo

por efeitos causados pelo substituinte NO2, muito eletronegativo (Samoilov e col., 1999;

Mchedlov-Petrossyan e col., 2005).

49

C=Caromático

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

N-Onitro C-Olactona

TNF

FSC

número de onda / cm-1 Figura 16. Espectros de absorção no IV dos sólidos da FSC e da TNF.

Os deslocamentos químicos dos 10 hidrogênios da FSC foram apresentados na

Tabela 12. A quantidade de grupamentos nitros que se ligaram na TNF pôde ser

determinada comparando os espectros de 1H RMN da FSC (reagente) e da TNF (não

apresentado). Neste último, a somatória das integrais de todos os sinais totaliza 6

hidrogênios o que indica que quatro grupos nitro estão presentes na TNF. O

desaparecimento do sinal dos hidrogênios em δ 6,56 ppm da FSC, característico dos

hidrogênios em orto aos oxigênios xantênicos (posições 2, 4, 5 e 7), e a manutenção dos

outros sinais, confirma a estrutura proposta na Figura 17.

O OHHO

C

NO2 NO2

NO2NO2 O

O

Figura 17. Estrutura da TNF.

50

IV.2.2 - Estudo da reatividade da fluoresceína em reações de substituição eletrofílica

aromática

Muitos derivados de fluoresceína como a TNF, a eosina, a rosa de bengala e a

eritrosina apresentam substituintes nas posições 2, 4, 5 e 7. Todos esses compostos

guardam semelhanças por apresentarem grupamentos que são incorporados mediante

mecanismos reacionais de substituição eletrofílica aromática. Dada essa similaridade,

acredita-se que deve haver alguma característica estrutural da fluoresceína que explique

a preferência para a formação de derivados com os substituintes nessas posições.

A síntese da tetranitrofluoresceína, por exemplo, foi realizada adicionando a FSC

em mistura de ácido nítrico e sulfúrico concentrados. Nessa reação, o eletrófilo formado

é o íon nitrônio (NO2+), uma espécie carregada positivamente e altamente reativa obtida

da desidratação do ácido nítrico na presença de ácido sulfúrico (Clayden e col., 2000).

Como a fluoresceína apresenta um amplo sistema aromático, esperar-se-ia que a

nitração ocorresse em diversos sítios da molécula. Entretanto, experimentalmente, tem-

se a ligação de dois ou quatro substituintes em posições específicas do corante

conduzindo à formação de produtos di ou tetranitrados (Hewitt & Pekins, 1900; Samoilov

e col., 1999).

A preferência pelo produto di ou tetranitrado depende das condições sintéticas. O

derivado tetranitro, que contém os quatro grupamentos nitro nas posições 2, 4, 5, 7, é

formado mediante aquecimento brando do meio reacional por longo tempo. No entanto,

se a reação for realizada em temperaturas baixas e interrompida logo após a mistura

dos reagentes, forma-se majoritariamente o produto dinitrado nas posições 4 e 5,

produto cinético (Samoilov e col., 1999). Esse mesmo tipo de comportamento é

observado não apenas no caso de reações de nitração, mas também na síntese da

eosina (tetrabromado) (Cronin, 1980) e na de outros derivados halogenados.

Com os resultados da modelagem molecular da espécie CT da FSC (FH3+),

verificou-se que na parte benzênica, os átomos de carbonos estão todos em

ressonância, o que lhes garante grande estabilidade e, portanto, menor reatividade.

Contudo os carbonos do anel xantênico apresentam elevada característica de ligações

duplas (não ressonantes), o que provavelmente os torna sítios mais reativos.

Para o entendimento da reatividade de compostos orgânicos os orbitais de

fronteira têm significados especiais (Clayden e col., 2000): o orbital molecular ocupado

de maior energia (HOMO) representa a distribuição e a energia dos elétrons com menor

51

energia numa molécula e o orbital molecular desocupado de menor energia (LUMO)

descreve o caminho mais fácil para a adição de mais elétrons numa molécula. Visando o

entendimento da reatividade da fluoresceína, as geometrias dos orbitais HOMO e LUMO

(HOMO 86 e LUMO 87) da espécie catiônica da FSC estão apresentadas na Figura 18.

Nessa espécie, a energia do orbital de fronteira HOMO 86 é de - 0,377 a.u. enquanto a

do LUMO 87 é - 0,249 a.u.

LUMO 87

HOMO 86

Figura 18. Orbitais HOMO e LUMO de fronteira da espécie catiônica da fluoresceína.

Conforme pode ser visualizado na Figura 18, a maior parte da densidade

eletrônica do orbital HOMO está na parte xantênica. Nesse anel, a densidade eletrônica

decorrente de elétrons sobre os carbonos 2 e 4 e os carbonos 5 e 7 constituem-se de

um mesmo lóbulo, o que indica semelhantes tendências de reatividade nesses pares de

átomos. Uma investigação das cargas elétricas de NBO dos carbonos da parte

xantênica mostra que os átomos de carbono 4 e 5 apresentam valores de cargas iguais

(- 0,271); esta similaridade é devida a elevada simetria da densidade eletrônica na parte

xantênica. Portanto como esses centros são praticamente equivalentes e possuem as

maiores densidades negativas na molécula, os eletrófilos tendem a se ligar

preferencialmente nessas posições.

Por outro lado, os carbonos 2 e 7 também apresentam valores de carga iguais e

são os seguintes mais negativos apresentando cargas de NBO de - 0,257. Assim, estes

52

seriam os seguintes a se ligarem aos eletrófilos. Já os carbonos 1 e 8 são os que

apresentam os menores valores de carga de NBO, ambos iguais a - 0,115. Esses

pequenos valores de cargas negativas limitam a reação desses carbonos com

eletrófilos. Dessa forma, justifica-se a ligação preferencial dos eletrófilos nos carbonos 2,

4, 5 e 7.

IV.3. Determinações de pKa dos demais corantes fotossensitizadores em soluções

aquosas

As propriedades dos corantes FS com vários grupamentos ácido-base são

altamente dependentes do pH. Tal questão torna-se mais complexa ao considerarmos

que alguns fármacos acumulam-se preferencialmente em certos órgãos (estômago,

intestino, dentre outros) ou em tecidos tumorais, afinal tais regiões apresentam pHs

diferentes do fisiológico. A seguir apresenta-se os resultados de pKa para os demais

derivados.

IV.3.1 - Os pKas da Eosina (EOS)

Segundo Mchedlov-Petrossyan & Kleshchevnikova (1994) o valor de pKa1 da

EOS é de –2,0 de acordo com a escala Hammet (valor médio dos pKas encontrados em

misturas de água/H2SO4, água/HCl e água/HClO4). Esse menor valor de pKa1 em

relação ao da fluoresceína (2,5) é atribuído à presença dos quatro substituintes bromo,

grupo retirador de densidade eletrônica, tornando o composto mais ácido. Essa região

de elevada acidez não foi estudada no presente trabalho.

Uma primeira tentativa de determinação de pKa da eosina na região da escala de

pH foi através da titulação potenciométrica. A variação de pH da solução de EOS com a

adição de HCl (9,96 x 10-2 mol.L-1) está apresentada na Figura 19. A região de volume

de HCl entre 0 e 100 μL corresponde a uma região onde essa variação é devida

somente à adição de HCl. Após esse intervalo, dever-se-ia encontrar dois pontos de

inflexão (relativos ao pKa2 e pKa3) que, de acordo com a estequiometria entre o HCl e a

EOS (2:1) e as concentrações das soluções utilizadas, estariam em torno de 200 μL e

400 μL. Porém detectou-se apenas um ponto de inflexão, em 450 μL. Com a aplicação

do método de Gran modificado aos valores de potencial (E) e de volume de HCl,

determinou-se o valor de pKa em 4,4 (pKa2).

53

0 500 1000 1500 2000

2

3

4

5

pH

V HCl / μL

-3Figura 19. Curva de titulação potenciométrica da EOS (2,01 x 10 mol.L-1) com a adição

de HCl (9,96 x 10-2 mol.L-1), a 25,0 ºC.

No entanto, a confiança nesse valor de pKa é pequena pois em regiões ácidas

(pH < 2,5) observou-se a formação de precipitados, ou seja, têm-se outros equilíbrios no

meio (além do protolítico); esses outros devem envolver auto-agregados de EOS uma

vez que algumas estruturas deste são hidrofóbicas (Valdes-Aguilera & Neckers, 1989).

Uma outra limitação é a força básica do titulado. Considerando o valor de Kw

determinado experimentalmente de 2,35 x 10-14 e o valor obtido de Ka = 3,98 x 10-4,

verifica-se que o valor de Kb referente a este processo é muito baixo (Kb = Kw/Ka

= 5,90 x 10-11), o que limita a confiança no ponto de inflexão. Como alternativa, efetuou-

se a titulação da EOS com NaOH (titulação por retorno, excesso de HCl) pois nesse

caso a força ácida da EOS é muito maior que a força básica correspondente. A variação

de potencial de uma amostra de EOS (previamente acidificada com HCl) com a adição

de NaOH está apresentada na Figura 20.

A curva da Figura 20 apresenta duas inflexões. A primeira com volume de

equivalência em torno de 900 μL refere-se a titulação do HCl enquanto que a segunda

inflexão, em torno de 1100 μL, à desprotonação do corante. Portanto, novamente, teve-

se apenas um único valor de pKa para a EOS. Aplicando os pares pH e volumes da

região dessa inflexão no Método de Gran modificado, o valor de pKa obtido foi de 4,0.

Nessas condições de titulação potenciométrica, empregou-se uma concentração menor

de EOS visando minimizar os efeitos da agregação/precipitação; mesmo assim a

solução apresentou-se turva quando acidificada.

54

0 200 400 600 800 1000

2

4

6

8

10

pH

V NaOH / μL

-4Figura 20. Curva de titulação potenciométrica da EOS (6,09 x 10 mol.L-1), previamente

acidificada com HCl e posterior adição de NaOH , a 25,0 ºC.

Porém, nesse momento, mais importante que a acuracidade no valor de pKa

encontrado são a estrutura do corante e as considerações da literatura (Mchedlov-

Petrossyan e col., 1994; Ledlain & Fompeydie, 1985) que indicam a existência de dois

pKas para a EOS. Dessa forma, de maneira similar à FSC, efetuou-se a determinação

de pKa por espectrofotometria pois nessa metodologia usa-se menor concentração de

composto (~ 10-6 mol.L-1), reduzindo a probabilidade de ter-se os equilíbrios paralelos de

agregação. Os espectros da eosina em meio aquoso em diversos pHs estão ilustrados

na Figura 21. Com o aumento de pH, as soluções mudam de coloração rósea para

alaranjada.

A presença das bandas, em 517 nm (extremo básico até pH 7,25) e em cerca de

480 nm (extremo ácido até pH 0,31) da Figura 21, juntamente com os resultados das

titulações potenciométricas, apontou novamente a presença de apenas duas espécies

protolíticas da eosina, mostrando um único pKa. O formato aparentemente mono-

sigmoidal das curvas de absorbância contra pH nesses comprimentos de onda,

conforme ilustrado a Figura 22A, reforçava essa idéia (com pKa ~3,0). Através dos

gráficos de primeira e segunda derivadas da curva em 517 nm e aplicando o método das

derivadas (lembrando que o valor de pKa é o pH cujo valor da primeira derivada é

mínimo ou máximo e o da segunda derivada é zero) obtém-se, apesar de não nítido, um

valor de pKa entre 2,0 e 2,8 (Figura 22B).

55

350 400 450 500 550 600

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

e

d

c

b

a

Abs


-6Figura 21. Espectros da EOS (4,16 x 10 mol.L-1) em meios tamponados aquosos a

30,0 ºC, força iônica 0,1 mol.L-1 e soluções a pH: (a) 0,31; (b) 1,53; (c) 2,29; (d) 2,95; (e)

7,25.

Figura 22. Eosina em sistemas aquosos: A) Curvas de absorbância contra pH. B)

Aplicação do método das derivadas na determinação de pKa.

Mesmo com a aplicação de outros métodos matemáticos tradicionais para cálculo

de pKa baseados na equação de Henderson-Hasselbalch (Previdello e col., 2006),

analisando-se os comprimentos de onda analíticos individualmente (geralmente

escolhidos em regiões de máximos), encontrou-se apenas um valor de pKa ao invés de

dois (seguindo a nomenclatura utilizada neste trabalho seria o pKa2 e o pKa3). Nesses

casos, os espectros estão indicando que esses dois valores de pKas são muito próximos

e que as espécies protolíticas da EOS possuem espectros muito semelhantes entre si

(alta sobreposição espectral).

0 2 4 6 8 10 12 140,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 2 4 6 8-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

2 Der

1 Der

Der

ivad

a

pH

517nm

H

517nm

490nm

A) B)

Abs

p

56

Além disso, a ausência de ponto isosbéstico nos espectros sobrepostos na Figura

21 mostra claramente a existência de mais de um equilíbrio protolítico consecutivo

(Espenson, 1981). Portanto, o cálculo de pKa conduzido da maneira tradicional na

análise de dados espectrofotométricos não é adequado para este sistema. Dessa forma,

para não ficarmos restrito a análises em comprimentos de onda individuais, aplicou-se

os métodos quimiométricos de maneira semelhante a FSC. A Análise das Componentes

Principais mostrou que a presença de três espécies (e, portanto, dois pKas) explica

99,97% das informações contidas no conjunto espectral (Tabela 13).

Tabela 13. Análise das componentes principais para a EOS.

oN de variáveis Variância explicada (%) Variância acumulada (%)

1 92,0375 92,0375

2 7,7146 99,7521

3 0,2145 99,9666

4 0,0168 99,9834

5 0,0066 99,9900

Assim, considerando a presença das três espécies, obteve-se a curva de

concentração relativa das espécies em função do pH, mostrada na Figura 23A. A partir

dos dados da Figura 23A conseguiu-se extrair dois valores de pKa (pKa2 = 2,0 e pKa3 =

3,8).

0 1 2 3 4 5 60,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

E2-EH-EH2

Con

cent

raçã

o re

lativ

a

pH0 1 2 3 4 5 6

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

E2-EH-

EH2

fraçã

o da

s es

péci

es

pH

A) B)

Figura 23. EOS: A) Curvas das concentrações relativas calculadas em diversos pHs. B)

Fração das espécies calculadas através dos pKas obtidos com métodos quimiométricos.

57

Na Figura 23B são apresentadas as frações das espécies protolíticas a cada pH

calculadas por esses pKas. Esses cálculos somente foram possíveis utilizando-se das

análises do conjunto espectral de cada espécie como um todo e tomando-se uma

quantidade elevada de soluções (28 amostras). Como pode-se notar os pKas são

próximos entre si.

Apesar da dificuldade de obter-se esses pKas pelas variações de intensidades de

absorção em comprimentos de onda analítico fixos é possível como é ilustrado na Figura

24, encontrar-se regiões onde as absorbâncias refletem os dois pKas. Nessa figura

mostra-se o monitoramento da região de 540 nm os quais, embora com variações pouco

expressivas, permitem vislumbrar este fato. Entretanto para encontrar-se esse

comprimento de onda examinou-se toda a região visível do espectro individualmente (de

1 em 1 nm), trabalho esse geralmente não efetuado em situações normais. Assim,

reforça-se a idéia de que o conjunto espectral contém informações sobre os dois pKas.

Porém, mesmo assim pela Figura 24, percebe-se o alto grau de proximidade entre os

pKas o que leva a erros em suas determinações.

0 2 4 6 8

0,02

0,04

0,06

Abs

540

nm

pH

Figura 24. Variação da absorbância em 540 nm para soluções da EOS em diversos

pHs.

Adicionalmente, ainda com a aplicação do método da matriz-K, pôde-se obter

espectros estimados das três espécies puras (Figura 25). Nota-se que a banda da

espécie neutra EH2 apresenta um desvio com relação ao espectro do composto em pH 0

(onde a espécie neutra representa quase 100%). Este problema pode ser devido à

junção de dois fatores: (i) a baixa intensidade da absorbância dessa espécie e/ou (ii) aos

processos de rotação Varimax e projeção oblíqua de Imbrie que geram alguns ruídos

nas curvas espectrais calculadas. Na Figura 25, verifica-se também que as bandas das

58

espécies EH- 2- e EH estão totalmente sobrepostas à banda da espécie E2 (dianiônica) e

que a banda da espécie EH-, por ser intermediária às duas outras espécies, não seria

visualizada pelos métodos tradicionais.

350 400 450 500 550 600

0,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

8,0x104

1,0x105

EH2

Exp.

EH-

E2-

abso

rtivi

dade

mol

ar a

pare

nte

/ L.m

ol-1.c

m-1

comprimento de onda / nm

Figura 25. Espectros das espécies puras da EOS estimados pelo método da matriz-K.

Incluiu-se o espectro experimental da forma EH (obtida em meio ácido, Exp.). 2

Em 1980, Mchedlov-Petrossyan & Adamovich já discutiam a dificuldade de

projeção do espectro da espécie EH- da eosina (intermediária), devido à elevada

sobreposição de bandas; na Tabela 14 apresentam-se as estimativas desses autores

para os valores de absortividade molar (ε) nos máximos de absorção (λmax) bem como

os valores obtidos neste trabalho.

Tabela 14. Coeficientes de absortividade molar das espécies protolíticas da EOS

reportados na literatura e obtidos pelos métodos quimiométricos

literatura quimiometria

Espécie λmax (nm) ; ε (L.mol-1 -1.cm ) λmax (nm) ; ε (L.mol-1 -1.cm )

Neutra, EH 483 ; 8.500 470 ; 7.500 2

Monoaniônica, EH- 518 ; 81.900 519 ; 51.700

Dianiônica, E2- 515 ; 96.700 515 ; 96.700*

*valor referencial

Com as frações das espécies calculadas pelos pKas (Figura 23B) e os valores de

ε das três espécies obtidos pelos métodos quimiométricos, reconstruiu-se a curva da

59

variação da absorbância com o aumento de pH em 517 nm e comparou-se com a

experimental, conforme ilustrado na Figura 26.

0 1 2 3 4 5 6

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abs

rela

tiva

517n

m

pH

Experimental Simulado

Figura 26. Curvas de absorbância experimental e simuladas para a EOS com o pH em

517 nm.

Conforme pode ser notado na Figura 26, a correlação das informações espectrais

obtidas com os métodos quimiométricos resultou num perfil semelhante ao experimental,

mesmo com todas as limitações já discutidas anteriormente. Assim, reforça-se a

eficiência dos métodos de análise multivariada na resolução desses sistemas

complexos.

As estruturas de cada uma das espécies protolíticas da EOS estão apresentadas

a seguir no Esquema X juntamente com os valores de pKa dos equilíbrios de protonação

(Mchedlov-Petrossyan e col., 1994; Ledlain & Fompeydie, 1985). Os referidos pKas são

os intervalos que englobam os valores apresentados nas referências citadas

determinados em soluções aquosas.

O O

Br Br

Br Br

COOH

OO O

Br Br

Br Br

COOH

HO O O

Br Br

Br Br

COO

OpKa2 pKa3

EH2 EH E2

2,0 3,8

Esquema X. Estruturas protolíticas da EOS e os valores de pKas, da literatura.

60

Nota-se pelo Esquema X que, ao contrário da FSC, o grupo menos ácido (pKa3)

refere-se ao carboxílico enquanto que o pKa2 refere-se ao grupo fenólico. Essa inversão

é devida ao aumento da acidez do grupo fenólico em relação a FSC e é causada pela

presença dos quatro átomos de Br. Esse aumento é tão pronunciado que torna o pKa do

grupo fenólico menor que o do carboxílico.

O valor de pKa3 reportado na literatura (3,7 a 3,8) compara-se bem com o

encontrado (3,8); entretanto o pKa2 (região de 2,8 a 3,3 da literatura) é bem diferente

(2,0). Parte das justificativas seriam as condições experimentais utilizadas (força iônica,

temperatura, efeitos de agregação, etc.) e também as dificuldades provenientes dos

cálculos empregados dada a proximidade dos pKa e a alta sobreposição espectral das

estruturas protolíticas.

IV.3.2 - Os pKas da Rosa de Bengala B (RBB)

A titulação potenciométrica direta da rosa de bengala com NaOH apresentou os

mesmos problemas verificados no caso da eosina (um único pKa e efeitos de

agregação/precipitação), comprometendo novamente a acuracidade do valor encontrado

(pKa 4,3).

O estudo espectrofotométrico da RBB em soluções aquosas de diversos pHs (44

amostras) mostrou que em meios muito ácidos as soluções são incolores. Porém, com o

aumento do pH tem-se o aparecimento de uma banda em 543 nm com um ombro na

região de 507 nm (perfil espectral semelhante ao da eosina), conforme mostrado na

Figura 27A. As curvas de absorbância contra pH em comprimentos de onda analíticos

específicos mostram perfil mono-sigmoidal, novamente sugerindo apenas um único pKa

(Figura 27 B). O valor encontrado com métodos tradicionais (derivadas) foi de pKa3 =

3,7, concordante com o encontrado na literatura de 3,72 (Valdes-Aguilera & Neckers,

1989). Apesar dos resultados apontarem a existência desse único equilíbrio protolítico,

novamente não se verifica ponto isosbéstico (Figura 27A), ou seja, de modo similar a

EOS, a RBB apresenta mais de um equilíbrio.

Na aplicação da Análise das Componentes Principais, Tabela 15, verificou-se que

a presença de duas espécies protolíticas (somente um pKa) explica 99,67% da

informação contida nos espectros. No entanto como descrito no parágrafo anterior tem-

se a existência de mais espécies protolíticas; considerando três espécies, a variância

61

acumulada é de 99,91%, refletindo um alto grau de correlação entre o conjunto espectral

e a existência dessa quantidade de espécies.

Figura 27. RBB (3,0 x 10-6 mol.L-1) em tampões aquosos a 30,0 ºC e força iônica = 0,1

mol.L-1. A) Espectros em soluções de pH: (a) 1,71; (b) 3,28; (c) 3,58; (d) 3,99; (e) 7,40.

B) Variação da absorbância em comprimentos de onda específicos.

Além disso, nos espectros da RBB na região do UV (não mostrados) tem-se uma

banda em 250 nm que reflete a existência de um segundo equilíbrio ácido-base por volta

de pH 2. Apesar desse pKa ser mais facilmente visualizado na região do UV, os

espectros na região do visível também refletem sua existência quando observados

minuciosamente; saliente-se a importância dos métodos quimiométricos na resolução

desses problemas.

Tabela 15. Análise das componentes principais para a RBB


1 77,5522 77,5522

2 22,1132 99,6654

3 0,2427 99,9081

4 0,0409 99,9491

5 0,0171 99,9662

Os resultados da determinação quimiométrica dos pKas da RBB estão

apresentados na Figura 28 A. Como os pontos nas proximidades dos pKas estão muito

dispersos, os valores de concentrações relativas calculadas das espécies envolvidas em

300 350 400 450 500 550 600

0,0

0,1

0,2

0,3 e

d

c

b

a

Abs


A)

2 4 6 8

0,0

0,1

0,2

0,3

507 nm

543 nm

Abs

pH

B)

62

cada equilíbrio foram aplicados na equação de Henderson-Hasselbalch (conduta

alternativa descrita nos Materiais e Métodos), obtendo-se pKa2 = 1,9 e pKa3 = 3,9.

1 2 3 4 50,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

R2-RH2 RH-

Con

cent

raçã

o re

lativ

a

pH

0 2 4 60,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

fraçã

o da

s es

péci

es

pH

RH2 RH- R2-

A) B)

Figura 28. RBB. A) Curvas das concentrações relativas calculadas. B) Fração das

espécies protolíticas em diversos pHs.

A partir da curvas de concentrações relativas e dos espectros das amostras,

aplicou-se o método da matriz-K para a obtenção dos espectros das espécies puras da

RBB, ilustrados na Figura 29. O método permitiu estimar o espectro da espécie RH-,

apesar da alta sobreposição com as R2- e RH2. As estruturas propostas para as três

formas protolíticas da RBB estão ilustradas no Esquema XI.

400 500 6000,0

4,0x104

8,0x104

1,2x105

abso

rtivi

dade

mol

ar a

pare

nte

/ L.m

ol-1.c

m-1


R2-

RH-

RH2

Figura 29. Espectros das espécies protolíticas puras da RBB estimados pelo método da

matriz-K.

63

Um ponto interessante envolve a atribuição desses valores de pKa aos grupos

funcionais presentes na molécula. Sabe-se que a protonação do grupo fenolato afeta

mais a porção cromofórica da molécula proporcionando uma maior variação espectral

em comparação ao benzoato (Pavia e col., 1996). O fato da EOS e da RBB terem

mostrado apenas um pKa no λmax quando analisados com a metodologia tradicional

indica que esse pKa deve refletir a protonação do grupo fenolato. Assim, como na EOS

o pKa determinado com essa metodologia foi de 2,0 indicando que este refere-se ao

grupo fenolato desse corante; logo, na RBB o pKa de 3,9 é o pKa do grupo fenolato e o

pKa de 1,9 é o pKa do carboxilato.

pKa3pKa2 O O

COO

O

I

I I

I

Cl

Cl

Cl

Cl

O O

COO

HO

I I

II

Cl

Cl

Cl

Cl

O O

COOH

HOI

I I

I

Cl

Cl

Cl

Cl

3,91,9

RH- R2-RH2

Esquema XI. Estruturas propostas para as espécies protolíticas da RBB e os valores de

pKas determinados neste trabalho.

Assim como no caso da eosina, o grupo carboxílico apresenta uma acidez menor

que o fenólico. Tal efeito é decorrente do intenso poder dos átomos de iodo em retirar

densidade eletrônica da ligação O-H, o que aumenta fortemente a acidez desse grupo.

Em meio muito alcalino (pH > 12) a RBB sofre degradação muito rápida (o mesmo

ocorre com a tetranitrofluoresceína). Este fato pode ser creditado a reação de hidrólise

alcalina de clivagem do anel pirano nesses corantes xantênicos, favorecida por efeitos

específicos dos substituintes iodo e nitro (Samoilov e col., 1999).

IV.3.3 - Os pKas da Tetranitrofluoresceína (TNF)

As soluções da TNF em meio muito ácido são praticamente incolores,

apresentando uma intensa banda de absorção em 330 nm (e uma pequena banda em

509 nm), como mostrado na Figura 30A. Com o aumento do pH, as soluções tornam-se

rosadas e o máximo de absorção aparece em 505 nm. Em pHs ainda maiores, a banda

64

em 505 nm diminui de intensidade e surge uma banda em 404 nm refletindo a mudança

de coloração para alaranjado. Acima de pH 12, a absorbância em 505 nm diminui

enquanto que em 404 nm aumenta; porém como já citado existe um processo cinético

envolvendo a ruptura do anel pirano (Samoilov e col., 1999) e, em um tempo total menor

que 5 min, a solução torna-se incolor.

Figura 30. TNF (1,0 x 10-5 mol.L-1) em meio aquoso, força iônica= 0,1 mol.L-1, 30,0º C.

A) Espectros de absorção em função do pH: (a) 1,01; (b) 2,29; (c) 2,69; (d) 7,25; (e)

12,01. B) Variação da absorbância em alguns comprimentos de onda específicos.

A Figura 30B mostra a presença de, no mínino, dois valores de pKa: um em 1,0 e

outro em 2,0, cujos valores são iguais aos encontrados em 50% de água/etanol

(Samoilov e col. 2000). Esses pKas em meio 100% água não haviam sido determinados

provavelmente devido à limitada solubilidade da TNF nesse meio.

Para efetuar as análises quimiométricas, considerou-se somente a região de pH

entre -1,1 e 6,0 (apesar de valores negativos extrapolarem a escala de pH. A Análise

das Componentes Principais mostrou que a presença de três espécies explica 99,96 %

da informação contida no conjunto espectral, conforme mostrado na Tabela 16.

350 400 450 500 550 600

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

e

d

c

a

b

e

dcb

a

Abs

comprimento de onda / nm-2 0 2 4 6 8 10 12 14

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

505 nm

404 nm

330 nmA

bs

pH

A) B)

65

Tabela 16. Análise das componentes principais para a TNF oN de variáveis Variância explicada(%) Variância acumulada (%)

1 75,3216 75,3216

2 16,2832 91,6048

3 8,3545 99,9592

4 0,0253 99,9846

5 0,0099 99,9944

A consideração da presença de três espécies resultou em dois valores de pKa:

pKa2 = 0,4 e pKa3 = 2,5, conforme ilustrado na Figura 31.

-1 0 1 2 3 4

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

T2-

TH-

TH2

fraçã

o da

s es

péci

es

pH-1 0 1 2 3 4

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

T2-TH-TH2

Con

cent

raçã

o re

lativ

a

pH

B) A)

Figura 31. TNF. (A) Curvas das concentrações relativas calculadas. (B) fração das

espécies protolíticas em diversos pHs.

2-Com relação às estruturas, a forma neutra (TH ) e a dianiônica (T2 ) apresentam

estrutura lactona enquanto que a monoaniônica encontra-se na forma fenolato

(Mchedlov-Petrossyan, 2005). Na Figura 32 mostram-se os espectros das espécies

puras calculadas pelo teste da matriz-K.

66

350 400 450 500 550

0,0

5,0x103

1,0x104

1,5x104

2,0x104

2,5x104

abso

rtivi

dade

mol

ar a

pare

nte

/ L. m

ol-1.c

m-1


TH-

T2-TH2

Exp.

Figura 32. Espectros das espécies puras da TNF estimados com o método da matriz-K.

Inclui-se o espectro experimental da forma TH (Exp.). 2

Segundo Mchedlov-Petrossyan e col. (2005), a forma lactona da TH2, de grande

estabilidade mesmo em soluções aquosas, é a responsável pela absorção máxima em

404 nm, ao contrário de outros oxixantenos comuns que absorvem preferencialmente na

região entre 490 e 560 nm. Esta estrutura é mantida pelo efeito dos grupos nitro nas

posições 2 e 7 que retiram densidade eletrônica do grupamento xantênico, favorecendo

a lactonização (Samoilov e col., 2000). Essa estrutura não é verificada para a

fluoresceína e eosina, mas são típicos para a tetranitrofluoresceína e alguns outros

derivados nitrados (Ghelli e col., 1996).

IV.3.4 - Os pKas da Acridina-fluoresceína (N-FSC)

A estrutura da N-FSC é muito semelhante a da FSC sugerindo que ambos os

corantes devam apresentar espectros relativamente similares e valores de pKa

próximos. No entanto, a obtenção dos valores de pKa no caso da N-FSC é muito mais

complexa porque envolve um equilíbrio adicional referente à protonação do nitrogênio

acridínico (pKaN), cujo valor deve situar-se entre pH 5 - 6.

Na Figura 33A estão mostrados os espectros da N-FSC em soluções aquosas.

Nessa figura, visualiza-se que os espectros da N-FSC são muito semelhantes aos da

FSC. Das análises das curvas da Figura 33B obtém-se somente três valores de pKas,

cujos valores calculados pelas metodologias tradicionais estão apresentados na Tabela

17. Por esses resultados, verifica-se que um dos pKas (pKaN ou pKa3) está mascarado.

67

0 4 8 12

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

A

pH

490 nm

476 nm

452 nm

435 nm

350 400 450 500 550 600

e

Figura 33. N-FSC (6,5 x 10-6 mol.L-1) em água, 30,0 °C e força iônica = 0,1 mol.L-1. A)

Espectros em tampões aquosos: (a) pH 0,18; (b) pH 3,49; (c) pH 5,04; (d) pH 7,21;(e) pH

14,00. B) Variação da absorbância em alguns comprimentos de onda.

Tabela 17. Valores de pKa para a N-FSC obtidos pelas metodologias tradicionais

pKa

pKa1 1,9 - 2,3

pKa2 4,3

pKaN ou pKa3 6,2

Para a obtenção dos possíveis quatro valores de pKa (correspondentes a cinco

espécies protolíticas) foram aplicados os métodos quimiométricos a uma grande

quantidade de amostras (mais de 90) visando maximizar a quantidade de informação

espectral disponível. Os resultados da Análise das Componentes Principais estão

mostrados na Tabela 18.

Tabela 18. Análise das componentes principais para a N-FSC


1 75,4266 75,4266

2 22,2929 97,7195

3 2,1872 99,9066

4 0,0538 99,9604

5 0,0199 99,9803

6 0,0052 99,9855

0,0

1

2

3

0,4

50,

0,

0,

0,

d

c

b

a

Abs


B) A)

68

Pela análise da Tabela 18, a presença de cinco variáveis consegue explicar

99,98% das informações contidas no conjunto espectral, o que é consistente com a

proposição da existência de cinco espécies. Com essa consideração, obteve-se as

curvas de concentrações relativas mostradas na Figura 34A.

0 2 4 6 8

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

NF2-

NFH-

NHFH

NHFH2

+

NHFH32+

fraçã

o da

s es

péci

espH

0 2 4 6 80,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Con

cent

raçã

o re

lativ

a

pH

A) B)

2+ +Figura 34. A) Curvas das concentrações relativas da N-FSC: ( ) NHFH ; ( ) NHFH3 2 ;

(▲) NHFH; (▼) NFH- ; (●) NF2- . B) Frações das espécies protolíticas da N-FSC em

diversos pHs.

Pelas curvas apresentadas na Figura 34A, o valor de pKa1 é próximo a 3 e o

pKa3 (atribuído em função da semelhança com a FSC) está ao redor de 6. Os valores

de pKa2 e pKaN são de determinação mais difícil devido à (i) grande proximidade entre

os pKas; (ii) intensa sobreposição de bandas; (iii) pequena mudança espectral com a

variação do pH e; (iv) relativa dispersão dos pontos nas curvas de concentração relativa.

Considerando que este último fator é minimizado quando os valores de concentrações

relativas são aplicados na equação de Henderson-Hasselbalch, obteve-se o pKa1 = 2,8,

pKa2 = 3,9, pKaN = 5,6 e pKa3 = 6,2; nota-se a elevada proximidade entre os valores de

pKa.

A partir desses pKas pôde-se construir as curvas de fração das espécies

protolíticas da N-FSC, ilustradas na Figura 34B. Considerando-se a estrutura do corante

e os resultados com a FSC, sugere-se que os equilíbrios de protonação da N-FSC

podem ser representados como no Esquema XII.

pKa1 pKa2 pKaN pKa3

Esquema XII. Equilíbrios protolíticos propostos para a N-FSC.

NH-FH3⎤ 2+ NH-FH2⎤ + NH-FH N-FH⎤ - N-F⎤ 2-

69

Os espectros das espécies puras da N-FSC foram estimados com o método da

matriz-K (Figura 35). Confirma-se a semelhança do perfil desses espectros com os da

fluoresceína e nota-se a similaridade entre as bandas das espécies NH-FH 2+⎤ 3 e

NH-FH ⎤ + 2

300 350 400 450 500 550 600

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

e

d

c

b a

Abs


Figura 35. Espectros estimados das espécies puras da N-FSC com o método da matriz-

K: (a) NH-FH3⎤ 2+; (b) NH-FH2⎤

+; (c) NH-FH; (d) N-FH⎤ -; (e) N-F⎤ 2-.

O estudo da N-FSC tem importância adicional uma vez que a literatura apresenta

poucas informações sobre suas propriedades; atualmente, no Chemical Abstracts,

existem apenas duas referências sobre sua síntese e algumas propriedades

espectroscópicas (Loffe e col., 1964; Loffe e col., 1966).

IV.3.5 - Comparação dos pKas dos derivados

Os valores de pKa determinados com os métodos quimiométricos para todos os

derivados estudados neste trabalho estão mostrados na Tabela 19. Nessa parte,

discutimos os efeitos dos substituintes sobre a acidez dos grupos protonáveis desses

corantes. Aqui é adotada uma nova nomenclatura para os pKas devido à inversão na

acidez do grupo fenólico em relação ao grupo carboxílico em alguns derivados, visando

facilitar a compreensão pelo leitor. A Tabela 19 apresenta os valores de pKa do

grupamento carboxílico (pKaCOOH) e os pKas dos dois oxigênios fenólicos: pKafenol1

referindo-se ao fenol mais ácido e pKafenol2 referente ao menos ácido.

70

Tabela 19. Valores de pKa determinados com os métodos quimiométricos para os

derivados de fluoresceína em solução aquosa, a 30,0 oC e força iônica 0,1 mol.L-1

pKafenol1 pKaCOOH pKafenol2

N-FSC* 2,8 3,9 6,2

FSC 2,5 3,8 6,1

EOS < 0 3,8 2,0

RBB < 0 1,9 3,9

TNF < 0 2,5 0,4

* não está sendo apresentado o pKaN = 5,6.

De um modo geral, na Tabela 19, chama-se a atenção quanto a alta proximidade

entre os pKas, especialmente na FSC e na N-FSC. Nesses, a acidez referente aos

pKaCOOH e pKafenol2 são iguais entre ambos FS e a presença do átomo de nitrogênio (em

lugar do oxigênio da FSC) afeta o pKafenol1 em apenas 0,3 unidades (positivamente).

Esse efeito pode ser decorrente de um caráter de ligação dupla entre o nitrogênio e o

carbono quaternário (C11, Esquema IX) no anel acridínico, sugerida pelos espectros de

RMN. Nesse caso o caráter de dupla aumenta a densidade eletrônica sobre a ligação O-

H do grupo fenol1, favorecendo a manutenção do próton e conseqüente aumenta o valor

do pKafenol1.

O pKa típico de um próton fenólico é em torno de 10 (CRC Handbook of Physics

and Chemistry, 2005). Na presença de substituintes aromáticos, como na FSC, a

densidade eletrônica da ligação O-H desse grupamento é diminuída devido aos efeitos

de ressonância, acarretando em maior acidez relativa ao pKafenol2 e pKafenol1 como o

encontrado para todos os derivados de fluoresceína.

Comparando todos os derivados verifica-se que a FSC apresenta os maiores

valores de pKa. No pKafenol2, os substituintes retiradores eletrônicos (Br, I e NO2) ligados

aos carbonos 2, 4, 5 e 7 aumentam fortemente a acidez deste grupo em relação à FSC.

Os bromos causam a diminuição do pKafenol2 da EOS até 2,0 por serem muito

eletronegativos. Na RBB, os átomos de iodo, não tão eletronegativos, diminuem pouco o

pKafenol2, que atinge o valor 3,9. Na TNF este efeito é ainda mais acentuado (pKafenol2 =

0,4) refletindo a ação dos grupos nitros, substituinte de maior efeito retirador eletrônico

que os halogênios.

Na fluoresceína, o valor de pKaCOOH (grupo ligado ao anel benzênico) é de 3,8,

ligeiramente menor que o pKa do ácido benzóico, de 4,20 (CRC Handbook of Physics

71

and Chemistry, 2005), assim indicando que a parte xantênica aumenta a acidez do

grupo carboxílico na fluoresceína, apesar da ortogonalidade entre os anéis xantênico e

benzênico verificada nos estudos com modelagem molecular. Além disso, na forma

dianiônica verifica-se que a densidade de carga está uniformemente distribuída sobre os

dois oxigênios do carboxilato (mostrados com os MEPs, Figura 12), de modo similar ao

que ocorre no ácido benzóico. Com a protonação da fluoresceína (pKafenol2), no entanto,

verifica-se a perda desta uniformidade da distribuição eletrônica do carboxilato na

espécie monoaniônica. Assim, quando o carboxilato é protonado (pKaCOOH) a

distribuição eletrônica sobre este grupo na fluoresceína não é a mesma da pressumida

para o ácido benzóico pois a nuvem eletrônica deste grupo (carboxilato) está sendo

afetada pelo anel xantênico o que, conseqüentemente, altera sua força de protonação;

estes fatos podem explicar a diferença encontrada nos valores de pKaCOOH da FSC com

o do ácido benzóico (igualmente para a N-FSC, EOS, RBB e TNF). Na EOS e na N-FSC

acredita-se que o anel xantênico não altere significativamente o pKaCOOH. Porém,

quando na presença de substituintes volumosos como o iodo e o gupo nitro, há uma

influência desses grupos levando a pKas menores que o da FSC (1,9 na RBB e 2,5 na

TNF).

IV.4. Características das fontes de luz LED

Para a realização dos experimentos envolvendo luz, utilizou-se de dois conjuntos

constituídos por seis unidades de LED de cor verde (chamados de LED500 e LED520 em

função da região de comprimento de onda onde ocorre máxima emissão), cujos

espectros de luz emitida estão apresentados na Figura 36.

Os espectros de emissão dos LEDs apresentados na Figura 36 foram obtidos

num espectrofluorímetro, com o uso de monocromador. Os valores de potência dos

LEDs foram medidos junto aos respectivos máximos de emissão, obtendo-se 7,57 mW

para o LED500 e 2,11 mW para o LED520. Estes valores são referentes a um único

dispositivo do conjunto LED e foram obtidos posicionando o dispositivo frontalmente e

encostado ao sensor do equipamento medidor de potência (d= 0 mm).

72

450 500 550 6000

2

4

6

8

Inte

nsid

ade


LED520

LED500

d = 0 mm

Figura 36. Espectros de emissão dos LEDs.

Verifica-se que os LEDs emitem luz na região de absorção dos derivados de

fluoresceína e que a potência do LED500 é aproximadamente quatro vezes maior que a

do LED520, entretanto a cada par LED/corante deve ser quantificado o grau real de

absorção de luz pelo corante. Neste trabalho, escolheu-se para a EOS e RBB (corantes

de alta absortividade molar) o LED520 enquanto que para a FSC, N-FSC e TNF optou-se

pelo LED . 500

IV.5. Propriedades fotofísicas dos corantes fotossensitizadores

Devido ao interesse em doenças nos olhos e ao fato do interior ocular apresentar

um pH ao redor de 7,3, as propriedades desses FS associados à TFD foram

investigadas nesse pH.

IV.5.1 - Características absortivas dos fotossensitizadores em meio aquoso de pH

fisiológico

Em pH 7,25, valor próximo ao fisiológico, todos os corantes apresentam-se

predominantemente na forma dianiônica; seus espectros estão reapresentados na

Figura 37A. Todos os estudos envolvendo aspectos fotofísicos dos corantes xantênicos

foram realizados em concentrações que obedecem a Lei de Beer, conforme mostrado a

Figura 37B.

73

0,0 1,0x10-5 2,0x10-5 3,0x10-5 4,0x10-5 5,0x10-5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

d

e

b, c

a

Abs

Concentração (mol/L)300 400 500 600

0,0

4,0x104

8,0x104

1,2x105

e

d

c

b

aabso

rtivi

dade

mol

ar /

L.m

ol-1.c

m-1


A) B)

Figura 37. Corantes em meio aquoso a pH 7,25. A) Espectros de absorção. B) Variação

da absorbância nos respectivos λmax com a concentração. (a) TNF; (b) FSC; (c) N-FSC;

(d) EOS; (e) RBB.

Os espectros da FSC e da N-FSC são muito parecidos (similaridade estrutural),

inclusive com coeficientes de absortividade molar (ε) iguais. Com relação à fluoresceína

a presença de substituintes provoca o deslocamento do λmax para o vermelho na EOS e

ainda maior na RBB; a presença de átomos pesados e volumosos atua diminuindo a

energia dos estados excitados (Lakowicz, 1999) provocando este deslocamento. Além

disso, verifica-se pequeno aumento do ε de ambos FS. Esses efeitos são considerados

benéficos a TFD, pois quanto mais próximo do vermelho, maior a penetrabilidade da luz

através de tecidos biológicos. Quanto a TNF verifica-se deslocamento para o azul e

diminuição acentuada da banda da espécie dianiônica, ambos efeitos indesejáveis a

TFD; essa pequena absorção de luz do TNF é um indicativo de processos de auto-

agregação em água. Este processo com este derivado deve ser estudado mais

profundamente.

IV.5.2 - Estudos de foto-decomposição

Os espectros dos corantes em solução mantém-se inalterados no escuro; porém

quando são irradiados com luz na região adequada (~ 500 nm) verificou-se perda

gradativa da coloração devido ao processo de foto-decomposição (foto-branqueamento).

Na Figura 38 estão mostradas as curvas cinéticas da banda de absorção na região de

74

500 nm, em soluções de aeração normal (A) e desaeradas (D), cujas absorbâncias em

cada tempo estão normalizadas pelos valores iniciais. Nota-se pela análise da Figura 38

que, de uma maneira geral, a foto-decomposição é mais rápida em soluções desaeradas

que em aeradas (exceto para a RBB). Já no caso da TNF observa-se a alta foto-

estabilidade independentemente das condições de aeração.

0 60 120 180 240 300 360

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

TNF D RBB D EOS D FSC D N-FSC D

Abs

nor

mal

izad

a

t / min

0 60 120 180 240 300 3600,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abs

nor

mal

izad

a

t / min

TNF A RBB A EOS A FSC A N-FSC A

Figura 38. Variação temporal da foto-decomposição dos corantes (normalizadas) em

soluções com aeração normal (A) e desaeradas (D), monitorada nas bandas da região

de 500 nm, com iluminação do sistema de LED, a 24º C.

Exceto a TNF, todas as cinéticas de foto-degradação ajustaram-se bem a um

modelo cinético bi-exponencial (envolvendo duas cinéticas consecutivas de primeira

ordem). Além disso, a inexistência de ponto isosbéstico nas repetições espectrais

durante o processo de foto-decomposição reforça a proposição de um mecanismo

seqüencial. Devido à complexidade das etapas cinéticas de foto-decomposição, na

busca de um parâmetro cinético quantitativo para a análise da foto-decomposição,

escolheu-se os valores de t1/2 obtidos diretamente dos gráficos de concentração em

função do tempo pois independe de ordem ou mecanismo de reação.

Adicionalmente, para todos os foto-processos estudados com luz LED, as

análises dos resultados são bastante complexas porque envolvem: (i) as características

dos conjuntos dos pares LED-corante (as amostras de FSC, N-FSC e TNF foram

irradiadas com LED enquanto que a EOS e RBB, com LED500 520), ou seja, a

sobreposição da região de emissão do LED com a de absorção dos corantes; (ii) a

potência de cada LED; e (iii) a concentração dos corantes. Normalmente esses tipos de

experimentos são comparativos quando a fonte de luz é um LASER, onde se considera

75

a intensidade de absorção do FS junto ao comprimento de onda da luz monocromática.

Contudo nos estudos com luz policromática devem ser considerados os fótons

absorvidos pelo composto em todos os comprimentos de onda através da relação entre

luz emitida (LED) e absorvida (FS).

Dessa forma, neste trabalho estabeleceu-se um parâmetro nomeado de “potência

de luz absorvida” (PFS/LED). Esse parâmetro é determinado mediante uma sequência de

etapas: inicialmente, a partir do espectro de transmitância do corante (que fornece a

porcentagem de luz não absorvida), determina-se a partir do espectro de intensidade

emitida pelo LED, a luz transmitida ao passar pela solução do FS a cada comprimento

de onda; este permite determinar a fração porcentual de luz efetivamente absorvida pelo

FS a cada comprimento de onda obtendo-se uma curva como um “espectro de potência

de luz absorvida pelo corante no par corante-LED”. Nessa metodologia, a área da curva

corresponde a luz absorvida em escala de potência (PFS/LED, mwatts) que é diretamente

relacionada à quantidade de fótons absorvidos pelo FS.

Na Figura 39 apresenta-se as frações de luz absorvidas para os diferentes

sistemas em cada comprimento de onda e a área desses espectros corresponde a

PFS/LED, para um dispositivo LED. O fato da disposição geométrica no foto-reator ter sido

igual nos experimentos (independente do corante ou LED) permite analisar as

Figura 39. Espectros de “potência de luz absorvida”

tendências qualitativas à foto-degradação de cada FS.

considerando as características

450 500 550 6000

1

2

3

4

5

e

d

c

b

a

Inte

nsid

ade

abso

rvid

a


emissoras do LED utilizado, sem correções com a concentração. (a) TNF; (b) FSC; (c)

N-FSC; (d) EOS; (e) RBB.

76

As potências absorvidas normalizadas pela concentração do respectivo corante

estão

abela 20. Valores de potência luminosa total absorvida (PFS/LED) e t1/2 para as reações

(105 l-1)

t1/2 desaeradas /

apresentadas na Tabela 20 juntamente com os valores de t1/2 resultantes para os

experimentos em condições de aeramento normal e desaeramento.

Tde foto-decomposição dos corantes fotossensitizadores, a 24º C

PFS/LED/c t

mW.L.mo1/2 aeradas /

min min

FSC 1 2,59 03,1 51,0

N -FSC 3,19 117,5 41,2

RBB 2,34 164,5 205,4

EOS 1,74 169,9 150,1

TNF 0,39 - -

ssim, como já citado, a TNF apresenta-se foto-estável (ressalte-se a pouca

absorç

ficam

eviden

6 ns

em cic

A

ão de luz no par corante-LED). Com exceção deste composto, os valores de

PFS/LED são semelhantes entre os demais FS (Tabela 20) mostrando que esses corantes

(no par com o respectivo LED) absorvem quantidades aproximadamente iguais de

fótons, o que permite efetuar comparações diretas das suas foto-decomposições.

As velocidades de foto-branqueamento menores na presença de oxigênio

tes pelos t1/2 (Tabela 20), fenômeno que pode ser justificado pela supressão de

energia realizada pelo oxigênio presente no estado fundamental sobre o estado excitado

dos corantes, efeito que depende da natureza do composto e do meio (Valeur, 2001). A

reatividade do oxigênio é dependente da difusão, ou seja, a viscosidade do solvente é

importante, e essa supressão de energia do FS pode ocorrer por dois caminhos (Arik e

col., 2005): (i) por processo não radiativo ou; (ii) pela geração de oxigênio singlete.

No primeiro caso, compostos com um longo tempo de vida como naftaleno (9

lohexano) e pireno (410 ns em etanol) são particularmente sensíveis à presença

de oxigênio. Além disso, a supressão por oxigênio é eficiente em meios aquosos e em

solvente de baixa viscosidade (Lakovicz, 1999; Valeur, 2001); dessa forma, tal proposta

explica a tendência de foto-decomposições mais rápidas em sistemas desaerados para

a FSC, N-FSC e EOS. Quanto a FSC e a N-FSC, ambas apresentaram as maiores

reatividades frente à irradiação e suas velocidades na presença de oxigênio decaíram

77

em mais de 50 %, provavelmente devido ao processo de decaimento não radiativo

causado pela supressão com o oxigênio. Esse efeito na EOS foi menos acentuado.

Na segunda possibilidade, quando o mecanismo envolve foto-decomposição

decorrente do ataque do oxigênio singlete ao FS (reação de foto-oxidação auto-

sensitizada) a reação deve ser mais rápida em meio aerado. Por isso, como a RBB é o

corante que apresenta o maior rendimento quântico de 1O2 dentre todos os derivados

(Tabela 1), esta espécie pode ser a responsável pela maior velocidade de foto-

decomposição da RBB em meio aerado. Essa proposta é coerente com o fato desse

corante apresentar a menor velocidade de foto-degradação dentre os FS, à exceção da

TNF, na ausência de oxigênio. O mecanismo de foto-decomposição da RBB já havia

sido parcialmente estudado em soluções líquidas (Dibbern-Brunelli e col., 1995;

Tanigami e col., 1994; Peppas e Merril, 1976). Por esses estudos, durante o processo de

foto-degradação, a RBB perde sequencialmente os átomos de halogênios ligados à sua

estrutura formando como foto-produto a FSC na forma leuco (lactona).

Já com respeito ao mecanismo reacional do fotobranqueamento da fluoresceína

excitada, pode se ter dois tipos de intermediários (Linden & Neckers, 1988; Kasche &

Lindqvist,1964). O mais mencionado é uma espécie semi-reduzida formada a partir da

doação eletrônica de uma espécie oxidável do meio, que pode ser uma outra molécula

de FSC (Esquema XIII A). Esse radical semi-reduzido do corante pode subtrair átomos

de hidrogênio de moléculas vizinhas conduzindo à redução da parte quinoidal do anel

xantênico, num processo de transferência eletrônica redutiva. A outra proposta é que a

excitação do corante gera uma ligação lactona, o que favorece a doação eletrônica do

oxigênio quinoidal (parte xantênica) para uma das espécies de características redutoras

presentes no meio, formando assim uma espécie semi-oxidada (Esquema XIII B).

Ambos mecanismos são plausíveis dependendo do meio e também do substituinte na

estrutura do corante decisivos na estabilidade do intermediário.

O O

O

O

O

O O

O

O

O

H

H

h

e-

hν

A. Processo de transferência eletrônico redutivo.

78

O O

O

O

O

O O

O

O

O

h

e-

O O

O

O

O

rad rad

rad hν

B. Processo de transferência eletrônico oxidativo. Esquema XIII. Mecanismos propostos para a formação dos intermediários no processo

de foto-decomposição de corantes xantênicos.

A estabilidade e as condições em que os intermediários de cada substância são

formados são peças-chave para o entendimento da foto-decomposição dos corantes

xantênicos e fazem parte de um campo de pesquisas futuras. Particularmente

enfocando-se a TFD, reações de foto-degradação podem ser inconvenientes pois o FS

estará perdendo suas características absortivas durante a irradiação. Contraditoriamente

estas reações eventualmente podem ser benéficas uma vez que podem auxiliar na bio-

eliminação do composto pelo organismo. Neste caso deve-se considerar efeitos tais

como foto-processo razoavelmente lento para garantir estabilidade mínima e não

geração de produtos nocivos à saúde do paciente.

IV.5.3 - Determinação de formação de oxigênio singlete

O ácido úrico (AU) apresenta uma banda com máximo de absorção em 293 nm e

não absorve na região do visível. Ao efetuar-se a foto-excitação do FS com o LED

observou-se a diminuição da banda do AU, pois este é um conhecido aniquilador de 1O2.

Para a medida da quantidade de 1O2 produzida, AFQ, as absorbâncias em 293 nm foram

corrigidas pelo fato dos corantes também absorverem luz nessa região sofrendo foto-

decomposição.

Normalmente a irradiação do FS é realizada com LASER e para o cálculo da AFQ

aplicam-se os valores da potência do LASER (P) e de ΔAU, a variação da absorbância

do ácido úrico em seu máximo de absorção (293 nm), à equação 2:

(Eq. 2)

irrad x At x P

10 x ΔAUAFQλ

5

=

79

onde t é o tempo de irradiação e Aλ irrad é a absorbância do FS junto ao comprimento de

onda de irradiação. Entretanto, essa equação somente é válida quando a irradiação

incidente é monocromática. No caso de LEDs, o largo intervalo espectral da luz emitida

e da absorção pelo FS requer modificações da equação 2 levando-se em conta a

sobreposição entre a região emitida e a absorvida; assim, introduziram-se modificações

baseadas na técnica já descrita no item de foto-degradação através do termo

envolvendo a somatória das frações de luz do LED absorvida pelo FS a cada

comprimento de onda (PFS/LED, corrigida para os 6 dispositivos LEDs), permitindo efetuar

o cálculo de AFQ pela Equação 1 (já apresentada nos Materiais e Métodos e aqui

reapresentada para facilitar o leitor).

(Eq. 1) FS/LED

5

P x t10 x ΔAUAFQ =

Desse modo independentemente do par LED / corante utilizado, a Eq. 1 permite

efetuar-se comparações diretas de AFQ entre os FS investigados. Os dados necessários

aos cálculos de AFQ para um tempo de 360 minutos de iluminação em condições

normais de aeração estão apresentados na Tabela 21. Para facilitar a comparação

transportamos os φ 1O citados na Tabela 1 (Introdução). 2

Tabela 21. Atividade Fotodinâmica Química (AFQ) para os fotossensitizadores em

solução aquosa de pH 7,25 após 360 minutos de iluminação

1 P (mW) AFQ AFQ / [FS]Δ Abs φ OFS/LED AU 2

( 106 ) aRBB 0,632 4,2 41,8 0,8 14,0 aEOS 0,638 4,7 37,9 0,4 8,7

N-FSC 0,600 12,0 13,9 ND 2,2 aFSC 0,618 16,0 10,7 0,1 1,0 bTNF 0,053 8,5 1,7 0,3 0,2

a Gandin e col, 1983. b em 50% água/etanol, Mchedlov-Petrossyan e col., 2005.

ND = não encontrado.

Os cálculos realizados usando-se 360 min ou 60 min resultaram em valores

relativos próximos de AFQ demonstrando a validade da equação independentemente do

80

tempo de iluminação. Para todos os FS, exceto a TNF, os valores de ΔAbsAU são muito

semelhantes (~0,6), o que poderia sugerir que os corantes apresentam a mesma

eficiência fotodinâmica. Porém, tais valores são dependentes da quantidade de fótons

absorvida pela amostra e também da concentração do FS.

A ordem de tendência de diminuição da AFQ pela concentração dos corantes

seguiu a ordem de φ 1O2. Mesmo absorvendo pequenas quantidades de fótons

(PFS/LED), a RBB e EOS apresentam valores semelhantes de ΔAbsAU aos da FSC e N-

FSC, indicando a tendência desses corantes em produzirem 1O2 (altas AFQ). O índice

AFQ para a TNF é muito pequeno refletindo a sua baixa tendência de produzir 1O2 em

meio aquoso, devido a baixa solubilidade e provável auto-agregação. Nesse caso, auto-

agregados e precipitados do corante atuam dissipando a energia do estado excitado dos

FS (auto supressão de energia) ao invés de levarem a formação do 1O2.

A RBB e a EOS são os corantes mais promissores pois são os que mais formam

oxigênio singlete (mecanismo TFD tipo II) em meio aquoso, enquanto que o φ 1O2 decai

drasticamente para a FSC e TNF. A presença de um átomo de nitrogênio na N-FSC

aumentou a atividade fotodinâmica em relação à FSC sugerindo que o nitrogênio auxilia

na formação do estado triplete do corante. IV.5.4 – Ensaios in vivo com Artemia salina

A atividade fotodinâmica dos derivados de fluoresceína sobre as Artemia salina,

sistema modelo biológico, para duas concentrações dos fotossensitizadores (25 µmol.L-1

e 250 µmol.L-1) está apresentada na Figura 40. Os valores apresentados para os grupos

II, III e IV foram corrigidos pelo respectivo branco (grupo I) para minimizar os efeitos

causados pelo uso de diferentes solventes nos estoques dos corantes (DMSO e água).

Com base nas Figuras 40A e Figura 40B observa-se uma pequena mortandade

das Artemia salina no grupo II (luz sem FS); este fato pode ser causado por um pequeno

aquecimento proveniente do LED.

No grupo III (FS sem luz) constatou-se que todos os corantes levam à mortalidade

dos micro-crustáceos no escuro; os maiores efeitos foram visualizados para a RBB e a

EOS (em ambas concentrações testadas) e para a N-FSC a 250 µmol.L-1. Nesse

corante, o aumento da concentração aproximadamente triplicou sua ação.

Já no grupo IV (FS e luz por uma hora) verifica-se que todos os

fotossensitizadores apresentaram letalidade potencializada pela luz, com exceção para a

FSC onde o efeito foi semelhante ao encontrado no grupo III, efeito este causado por

81

causa de sua baixa AFQ, e também para a TNF, fotossensitizador com grande tendência

à agregação o que minimiza a ação fotodinâmica.

FSC EOS RBB TNF NFSC0

4

8

12

16

20 II III IV

B)

%

mor

te

FSC EOS RBB TNF NFSC0

4

8

12

16

20 II III IVA)

orte

% m

Figura 40. Porcentagens de morte totais das Artemia salina nos ensaios FS/LED:

A) [FS] = 25 µmol.L-1. B) [FS] = 250 µmol.L-1.

Na Figura 40 verifica-se que a RBB e a EOS apresentam uma maior eficiência

fototóxica. Surpreendente foi a TNF, que mesmo apresentando baixo índice de atividade

química de geração de oxigênio singlete, apresentou foto-efetividade biológica razoável.

Este resultado sugere que o mecanismo de ação deste seja por TFD tipo I (sem oxigênio

singlete).

Na EOS e RBB, o aumento de concentração não refletiu em aumento de foto-

atividade possivelmente devido a efeitos de desativação de energia dos estados

excitados por colisões, formação de agregados (principalmente no caso da TNF –

hidrofóbica), interações específicas com sistemas biológicos e outras interações

complexas principalmente a altas concentrações do FS.

Embora os valores de mortandade das Artemia não sejam tão elevados, eles

permitem ordenar os FS em uma escala de atividade biológica que está de acordo com

as determinações de AFQ, permitindo eleger a RBB e a EOS como os FS que

apresentaram as melhores atividades fotodinâmicas tanto nos aspectos químicos quanto

nos biológicos (in vivo) investigados.

Porém, ressalta-se que a mortandade dos micro-crustáceos pode ser aumentada

com o uso de um sistema de formulação adequado, como misturas de água e solvente

orgânico ou micelas. Outras questões importantes envolvem o tempo de acúmulo do FS

no interior das Artemia e o tempo total de iluminação. Em ambos os casos, tempos

maiores favorecem a mortandade das Artemia.

82

IV.5.5 – Resultados gerais das propriedades dos derivados de fluoresceína

Na Tabela 22 apresenta-se um resumo geral das principais propriedades dos

derivados de fluoresceína estudados úteis para investigações em TFD.

Tabela 22. Resumo das características dos derivados de fluoresceína investigados

neste trabalho, em meio aquoso e pH 7,25

Propriedade FSC N-FSC TNF EOS RBB

Solubilidade alta razoável baixa alta alta

Quantidade de

espécies*

DA (93,5%)

MA (6,5%)

DA (91,8%)

MA (8,2%)

DA DA DA

λmax / nm 490 490 505 517 543

ε (λmax) /

L.mol-1.cm-1

76.900 76.700 3.100 97.100 109.000

Foto-estabilidade baixa baixa alta razoável razoável

AFQ (106)/ [FS] 1O2

1,0 2,2 0,2 8,7 14,0

Foto-atividade em

Artemia salina

baixa média razoável muito alta muito alta

* MA = monoaniônica; DA = dianiônica.

83

V. CONCLUSÕES

Os métodos quimiométricos mostraram-se adequados ao estudo dos equilíbrios

ácido-base dos derivados de fluoresceína em meio aquoso, mesmo sendo tais sistemas

altamente complexos com valores de pKa próximos entre si e com intensa sobreposição

espectral entre as espécies protolíticas. Os valores encontrados seguem tendência

coerente com os efeitos pressumidos para cada substituinte e junto com as simulações

feitas têm-se indicações de boa acuracidade quanto as metolodogias empregadas. A

espécie presente em meio pH fisiológico é majoritariamente a forma dianiônica para

todos os corantes.

Com relação às estruturas das espécies da fluoresceína, os cálculos de

modelagem molecular apontaram as formas mais estáveis dos intermediários protolíticos

da FSC, além de auxiliarem nas atribuições dos grupos associados a cada pKa.

Adicionalmente, os estudos mostraram que o anel xantênico afeta a acidez do grupo

carboxílico ligado ao anel benzênico indicando que esses anéis (X e B) não podem ser

considerados como partes isoladas da estrutura, apesar da comprovada ortogonalidade

entre ambos.

Os sistemas de LED foram eficientes na foto-excitação dos compostos e

mostraram-se bastante úteis aos ensaios. As baixas potências dos sistemas LED

abrandam o efeito de foto-branqueamento e devem apresentar riscos menores de

efeitos colaterais como queima de retina. Para a interpretação dos resultados fotofísicos

e fotoquímicos obtidos com luz policromática, a consideração da potência luminosa

absorvida em todos os comprimentos de onda (PFS/LED) mostrou ser um índice adequado

permitindo-se efetuar comparações diretas entre os fotossensitizadores independe do

LED utilizado.

Alguns derivados como a nitro, TNF, apresentam efetividade limitada que podem

eventualmente estar associada à baixa solubilidade em meio aquoso pH neutro (com

auto-agregação). Uma investigação mais detalhada dos derivados nitrogenados, N-FSC

e TNF, é interessante uma vez que existem poucos estudos desses compostos

disponíveis na literatura; um melhor sistema de formulação pode melhorar a atividade

fotodinâmica desses derivados.

Dentre todos os compostos, a RBB e a EOS foram os que apresentaram as

maiores eficiências foto-tóxicas com Artemia salina, cujos resultados são coerentes com

a maior geração de oxigênio singlete. A foto-decomposição desses corantes frente à luz

84

de LED é relativamente lenta comparada à FSC e à N-FSC. Estes derivados são

candidatos potenciais a fármacos para Terapia Fotodinâmica sobretudo para o

tratamento de doenças em olhos.

VI. PERSPECTIVAS PARA TRABALHOS FUTUROS - Sintetizar outros derivados de fluoresceína com diferentes classes de

substituintes no anel xanetênico e também ésteres, para uma melhor atribuição dos

valores de pKa. Na forma de éster permite-se diferenciar com o grupamento ácido-

básico da forma fenol-fenolato.

- Investigar através de modelagem molecular os demais derivados, caracterizando

densidades de cargas, pontos de vulnerabilidade a ataques químicos (auxílio em

modificações sintéticas), etc.

- Sintetizar derivados de N-FSC contendo halogênios pesados como Br e I, visando

um derivado com melhores desempenhos na geração de oxigênio singlete.

- Determinar parâmetros fotofísicos dos compostos como rendimento quântico de

fluorescência, rendimento quântico oxigênio singlete, tempo de vida do estados

excitados S1 e T1.

- Estudar os corantes TNF e N-FSC em sistema micelar de Tween-80, amplamente

usado na formulação de medicamentos, buscando favorecer a formação de espécies

que absorvem na região acima de 500 nm e diminuir a tendência de

agregação/precipitação em meio aquoso, visando sistemas de formulações mais

estáveis e efetivas.

- Aplicar a técnica quimiométrica de Planejamento Fatorial para quantificar os

efeitos mais significativos na morte das Artemia salina.

- Efetuar ensaios da ação fotodinâmica em micro-organismos patogênicos,

podendo estudar a inativação fotodinâmica em bactérias e fungos, dentre outros.

85

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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VIII. ANEXO 1: Estruturas dos derivados de fluoresceína

O ONaO

COONa

N OHHO

COOH

O ONaO

COONa

Br Br

Br Br

O OHO

COOH

NO2 NO2

NO2NO2

O ONaO

COONaCl

Cl

Cl

Cl

I I

II

fluoresceína

eosina Y

N fluoresceína tetranitrofluoresceína

rosa de bengala B

(N FSC) (FSC)

(EOS)

(RBB)

(TNF)

95

IX. ANEXO 2: Estudo de equilíbrios complexos através de métodos quimiométricos

Uma das características mais interessantes dos modernos instrumentos de

análise química é o grande número das variáveis que podem ser medidas

simultaneamente. Um exemplo notável é a técnica de espectrofotometria de absorção

UV-Vis na qual mais de mil comprimentos de onda podem ser rotineiramente registrados

em um único espectro. De posse de tal quantidade de dados, a necessidade de

ferramentas mais sofisticadas para tratá-los e extrair informações relevantes cresceu

muito rapidamente.

Adicionalmente, um dos grandes problemas enfrentados em análises químicas é

a necessidade de conhecer as propriedades e a composição de sistemas complexos, os

quais podem conter várias espécies de interesse, apresentar influência entre equilíbrios

e não fornecerem sinais analíticos bem definidos no conjunto de dados. Nesses casos,

os métodos matemáticos convencionais não explicam bem o comportamento

experimental ou o explicam apenas parcialmente.

Nesse sentido, o desenvolvimento da Análise Multivariada, um dos ramos da

Quimiometria, ciência que tem sido aplicada para melhorar e otimizar as investigações

de processos químicos (Brereton, 2000; Neto e col., 2006), tem sido uma alternativa de

grande valia para a obtenção de informações úteis e confiáveis desses sistemas através

de metodologias matemáticas, estatísticas e computacionais modernas. Por isso,

descrevemos a essência de algumas técnicas de Análise Multivariada utilizadas nesse

trabalho.

A Análise das Componentes Principais (PCA)

O método quimiométrico mais comum para o tratamento de dados é a Análise das

Componentes Principais (PCA) (Scarmínio e col., 1998; Sena, 2000, Beebe e col.,

1998), usada como procedimento genérico para a descrição das inter-relações dentro de

um conjunto de variáveis e que tem por objetivo principal a redução do número de

variáveis preservando a maior quantidade de informação (variância). Isso é realizado

através de uma nova representação dos dados considerando as componentes mais

representativas do sistema, as componentes principais. Tais componentes são obtidas

através de álgebra matricial a partir do agrupamento dos dados que contém informações

semelhantes (Everitt e Dunn, 1991; Correia e Ferreira, 2007).

96

Graficamente, como ilustrado na Figura 41, pode-se representar um dado

conjunto espectral no espaço, onde cada ponto refere-se a um espectro num pH

diferente, e definir os vetores que explicam a maior parte dos dados. Cada um desses

pontos pode ser projetado (decomposto em autovetores e autovalores) sobre os eixos

mais representativos do conjunto, as Componentes Principais (PC).

Figura 41. Representação espacial das Componentes Principais em um conjunto de

dados.

Na Figura 41, o modelo de uma componente principal (PC1) corresponde a uma

reta no espaço dimensional que contém a máxima informação estatística contida nos

dados. O modelo com duas componentes principais (PC1 e PC2) define duas retas

ortogonais onde a segunda reta está na direção da maior variância restante, após a

PC1. Finalmente, a PC3 explica o restante das informações contidas nos dados, de

forma a descrever todo o conjunto de dados. Dessa forma, tem-se a redução da

complexidade da matriz de dados.

A PCA permite a interpretação multivariada de informações que expressam as

inter-relações existentes entre as variáveis em gráficos bi ou tridimensionais, facilitando

o entendimento do comportamento das amostras sem perda significativa das

informações.

Análises do tipo-Q

Com os resultados das Componentes Principais, o estudo de sistemas

multivariados pode ser realizado de duas maneiras: através do modo tipo-R, o mais

utilizado em química, o qual se refere ao estudo da relação entre as variáveis; ou da

97

análise fatorial do tipo-Q, onde o mais importante é a relação entre os objetos. Tal

método pode ser usado na resolução de sistemas nos quais não se conhece nenhuma

informação a priori das espécies puras e, apesar de muito comum em geologia

(Reyment e col., 1976), ainda é pouco aplicado em química. Essencialmente não existe

diferença real entre o modo tipo-R e o tipo-Q. A especificidade do modo tipo-Q é o passo

de normalização, o qual está baseado na definição de uma relação de proporcionalidade

entre os objetos, chamado cos θ.

O modo tipo-Q permite definir a similaridade entre todos os possíveis pares de

objetos presentes nas amostras, considerando as proporções das espécies, e encontra

os objetos mais divergentes - ou seja, identifica os constituintes principais (as espécies

puras) - através da aproximação da matriz espectral por uma matriz de ordem menor

indicativa do número de vetores que são linearmente independentes.

A medida do grau de similaridade entre os objetos pode ser medida por um índice

chamado (cos θnm), proposto por Imbrie e Purdue (Sena e col., 2000). Para dois objetos,

n e m, que são os vetores linha de uma matriz de dados A, o coeficiente cos θnm é

definido pela equação 3:

(Eq. 3) ∑ ∑

∑

= =

==p

1j

p

1j

2mj

2nj

p

1jmjnj

nm

aa

aaθ cos

onde anj representa a j-ésima variável do n-ésimo objeto e p o número de variáveis. O

coeficiente cos θnm é o cosseno do ângulo entre dois vetores no espaço p-dimensional

cujos valores varia entre um, ou seja, nenhuma similaridade, e zero, identidade. Dessa

forma, todos os demais objetos podem ser considerados combinações lineares dos

constituintes principais e assim obtém-se o número de espécies constituintes de um

sistema químico e suas concentrações relativas determinados.

Entretanto, o resultado obtido pelo método de Imbrie diretamente não fornece um

conjunto de composições distintas e, por isso, nem sempre pode ser facilmente

interpretado (Reyment e col., 1976; Davis, 1973; Cooley, 1971; Sharaf, 1986; Forina,

1988). A rotação Varimax e a projeção oblíqua de Imbrie, descritas a seguir, tornam-os

de interpretação mais simples.

98

Na rotação Varimax (Miesch, 1976), os eixos Varimax são rodados até

coincidirem com os objetos mais divergentes para a determinação dos objetos mais

divergentes no espaço, equivalentes às espécies puras. Com a projeção oblíqua de

Imbrie, todas as outras amostras são definidas como proporções destes objetos e os

fatores passam a ser correlacionados a amostras reais. Assim, nessa etapa, obtém-se

as concentrações relativas das espécies constituintes de um sistema químico.

Outras informações úteis são os espectros das espécies puras. Para esta

finalidade aplica-se a lei de Lambert-Beer escrita na forma matricial (método da matriz-

K) combinando a matriz espectral com as concentrações relativas para a estimativa dos

espectros das espécies puras (Kramer, 1998; Lang, 2003; Sena, 2000). Dessa relação,

usando os resultados da Análise das componentes Principais, obtém-se uma estimativa

dos perfis dos espectros mais divergentes (as espécies puras).

Assim como qualquer método de tratamento de dados, as técnicas de Análise

Multivariada aplicadas à espectrofotometria tem sua eficiência limitada: (1) quando os

espectros não seguem a lei de Lambert-Beer; (2) pela quantidade de pontos

experimentais; (3) presença de componentes estranhos ao sistema – contaminantes

e/ou; (4) existência de erros instrumentais e/ou operacionais.

Entretanto a grande vantagem dos métodos quimiométricos é o fato de extrair

informações que não são obtidas aplicando metologias tradicionais, especialmente nos

casos onde: (1) há a existência de sobreposição de bandas intensa nos espectros; (2) a

qualidade do sinal analítico não é muito boa (razão sinal/ruído menor que 1, ou

influência da linha base nos espectros) e; (3) interferência entre equilíbrios químicos (por

exemplo, proximidade de pKas). Essa maior eficiência é obtida pela análise sobre todos

os comprimentos de onda conjuntamente ao invés de um único (analítico), como usado

nas metodologias tradicionais.

Além disso, uma das principais vantagens das metodologias quimiométricas é a

não utilização de um conjunto de calibração o que elimina a necessidade de processos

de separação química (diminui os erros experimentais). Por todas essas vantagens

esses métodos quimiométricos de Análise Multivariada estão sendo cada vez mais

utilizados na química.

99

X. Anexo 3: Modelagem Molecular

Uma grande contribuição da teoria quântica é o grande auxílio no entendimento e

na predição das mais diversas propriedades moleculares a partir de equações

fundamentais. A exatidão dessas previsões tem melhorado com o desenvolvimento de

novas metodologias matemáticas e de computadores mais velozes (Barden e Schaefer

III, 2000).

Os métodos quânticos considerados mais simples são os semi-empíricos. Nestes,

certas integrais são substituídas por dados espectroscópicos ou por outras propriedades

físicas, como as energias de ionização, para anular ou minimizar a importância de certas

integrais. Por causa dessas aproximações a precisão quantitativa é limitada e tais

métodos são mais indicados para sistemas com muitos átomos, onde o uso de teorias

mais sofisticadas demandaria um tempo de cálculo muito alto (Levine, 1995).

Dentre os métodos que não usam aproximações (ab initio) alguns estão baseados

nas equações de Hartree-Fock-Roothan, que determinam a energia de um sistema

mediante a resolução da equação de Schrödinger, Hψ = Eψ e do emprego de apenas

algumas constantes fundamentais (Levine, 1995).

Do ponto de vista quântico, as moléculas podem ser descritas em termos das

interações entre núcleos e elétrons e a geometria molecular em termos da energia

mínima dos arranjos espacial dos núcleos. Nesse sentido, a equação de Schröndinger

representa uma dada molécula (ou átomo) como um conjunto de prótons e elétrons.

Porém, uma solução exata para essa equação ainda não é possível exceto para alguns

sistemas triviais (hidrogenóides), tornando necessária uma série de aproximações para

a resolução de moléculas grandes. A primeira aproximação é a de Born-Oppenheimer

pela qual o movimento dos núcleos atômicos é independente do movimento eletrônico.

Assim, separa-se a equação de Schröndinger em duas componentes: nuclear e

eletrônica. Entretanto a componente eletrônica ainda é muito complexa em sistemas

multieletrônicos, tornando necessária uma segunda aproximação: a de Hartree-Fock,

que transforma uma única equação de vários elétrons em várias equações de apenas

um elétron. Nesse modelo o movimento de cada elétron é considerado independente do

outro, desconsiderando interações inter-eletrônicas. Assim, gera-se um sistema de

equações que podem ser resolvidas considerando que cada orbital molecular possa ser

expresso como uma combinação linear de orbitais atômicos descritos por um conjunto

de equações. Porém como se nota, tal teoria provê um tratamento inadequado da

100

correlação entre os movimentos dos elétrons contidos num sistema molecular,

especialmente a correlação entre elétrons de spins contrários (Levine, 1995).

A Teoria do Funcional de Densidade (DFT), método de natureza híbrida entre ab

initio e semi-empírico, é uma alternativa para resolução de sistemas com muitos elétrons

por não utilizar a equação de Schrödinger para descrever a função eletrônica molecular

(Levine, 1995; Morgon e Custodio, 1995, Geerlings e col., 2003). Esse método está

baseado no teorema provado em 1964 por Hohenberg e Kohn de que a energia e todas

as outras propriedades eletrônicas do estado fundamental são unicamente e exatamente

determinadas pela densidade de probabilidade eletrônica ρ (x,y,z). Seguindo esse

teorema, o estado de menor energia de uma molécula é uma única funcional (função de

uma função) de ρ. Em DFT, a energia total é decomposta em um caminho exato

formalmente em três termos: energia cinética, energia eletrostática e as energias de

exchange, onde inclui-se a correlação inter-eletrônica sobre a dinâmica dos movimentos

eletrônicos não considerados na teoria de Hartree-Fock.

A grande vantagem da DFT é sua estreita semelhança com os cálculos precisos

ab initio, porém com custo computacional muito inferior. A utilização da DFT é

especialmente interessante para: (i) cálculos de moléculas grandes e compostos

inorgânicos e organometálicos, onde os custos de métodos ab initio puros podem ser

proibitivos ou para os quais os métodos semi-empíricos não são suficientemente

acurados e; (ii) cálculos termoquímicos em particular aqueles que envolvem a formação

ou a quebra de ligações e cálculos de energia de ativação. Por outro lado, não é

recomendável para: (i) cálculos envolvendo moléculas pequenas e; (ii) otimização de

geometria onde a diferença de energia entre as espécies seja pequena.

Dentro da DFT existem diversas formas de resolução de moléculas. Becke, Lee,

Yang e Parr determinaram uma das melhores formas de obtenção das propriedades

moleculares através de um conjunto de técnicas de integrações numéricas. O método

chamado de B-LYP proporciona erros médios de apenas 0,02 Å e 2º nos comprimentos

e ângulos de ligação, 0,25 D nos momentos de dipolo e 5,5 kcal.mol-1 nas energias de

atomização. Comparados com os métodos ab initio puros os resultados obtidos com

DFT são superiores aos de HF e comparáveis aos de MP2, um dos mais acurados

métodos ab initio.

Dentro do B-LYP, o conjunto 3-21G é uma função única que pode ser escrita em

termos de 3 funções gaussianas. Esse conjunto de base representa os componentes

atômicos internos e externos em termos de 2 e 1 funções gaussianas, respectivamente.

101

Por sua vez, a função 3-21G* adiciona funções d para elementos da segunda linha da

tabela periódica e elementos pesados, mesmo que não estejam ocupados (Hehre,1998).

Os resultados encontrados nesse caso são mais próximos dos experimentais porque

consideram os efeitos da hibridização sobre as propriedades moleculares. Existe a

possibilidade de serem consideradas uma (*) ou duas funções de polarização (**); no

segundo caso, adiciona-se funções de polarização também para o hidrogênio.

Especialmente no estudo de ânions, pode-se considerar também as funções difusas (+

ou ++), que consideram efeitos de cargas elétricas.

Melhores correlações com o experimental têm sido obtidas com a consideração

de modelos de solvente sobre propriedades moleculares. O modelo de Onsager é uma

técnica simples que considera o soluto ocupando uma cavidade esférica de raio

constante igual raio de Bohr (a0) e de constante dielétrica semelhante à do solvente

considerado. Dessa forma, o dipolo do soluto é afetado pelo dipolo do solvente, levando

a variações de energia (Onsager, 1936).

Após a atribuição do prêmio Nobel de Química pra John Pople e Walter Kohn em

1998, a DFT prova ter conquistado a maturidade suficiente e tem sido aceita como uma

importante ferramenta em Química Quântica. Atualmente a DFT é um dos níveis de

teoria mais utilizados porque traz uma excelente relação precisão/tempo de máquina e

tem-se apresentado como um bom método para o estudo de reações orgânicas (Baker

col., 1995), geometrias moleculares (Mebel e col., 1995), energias de ligações de

hidrogênios (Barone e col., 1995) e energias de dissociação de ligações (Armstrong e

col., 1996).

A Teoria do Funcional de Densidade no Domínio doTempo (TD-DFT)

Antes da proposição da DFT (pelos teoremas de Hohenberg–Kohn), cálculos

envolvendo estados excitados e suas propriedades tinham de ser feitos por

aproximações indiretas. A Teoria do Funcional de Densidade no Domínio do Tempo (TD-

DFT) foi inicialmente desenvolvida na década de 80 (Runge e Gross, 1984), mas sua

aplicação direta em cálculos de excitação eletrônica foi introduzida posteriormente por

Casida (Casida e col., 1998). Desde então, a TD-DFT tem sido apontada como um

método robusto e acurado para a descrição de estados excitados de moléculas

conjugadas, especialmente de moléculas grandes (Guillaumont e Nakamura, 2000;

102

Bertolino e col., 2006; Casida, 2002; Onida e col., 2002; Maitra e col., 2003; Adamo e

Barone, 2000).

O princípio da TD-DFT consiste na interpretação de que um sistema, inicialmente

no estado fundamental, e exposto a uma perturbação dependente do tempo pode ter

sua energia potencial expressa como uma função aditiva dependente do tempo.

Mediante cálculos que envolvem a polarizabilidade dinâmica desse sistema é possível

calcular os espectros de excitação devido a relação entre a origem das bandas de

absorção com o momento dipolar de transição.

As intensidades de absorção obtidas por TD-DFT são expressas em termos da

força do oscilador e a correlação com a absortividade é dada pela Equação 4, abaixo

(Guillaumont e Nakamura, 2000):

(Eq. 4) 2/1max91032,4 ϖε Δ≈ −xf

onde εmax é o coeficiente se absortividade molar experimental (L.mol-1 -1.cm ) e Δω1/2 ao

comprimento da banda de absorção à meia altura (cm-1).

Apesar de muito usado, os cálculos com TD-DFT ainda apresentam alguns

problemas significativos. Um dos mais severos é a sub-estimativa das energias de

excitações de Rydberg e das correspondentes forças de oscilador (Matsuzawa e col.,

2001; Casida e Salahub, 2000). Espécies iônicas ou complexos com características de

transferência de carga também apresentam erros consideráveis que podem exceder 1

ou 2 eV (Neese, 2006). Além disso, estados caracterizados por duplas excitações,

comuns em complexos metálicos de transição, são inteiramente ausentes nos espectros

obtidos com TD-DFT (Neese, 2006).

Embora apresente essas deficiências comparadas com os métodos mais

avançados (como o CASPT2), os cálculos com a TD-DFT apresentam uma boa

eficiência qualitativa e boa relação com o tempo de cálculo computacional (Matsuzawa e

col., 2001; Casida e Salahub, 2000). Quando analisado em conjunto com detalhes

experimentais, podem fornecer informações importantes como exemplificado por muitas

publicações (Fiedler e col., 2005; Jackson e col., 2005; Schenker e col., 2005; Stich e

col., 2005). Mesmo assim, a predição correta do espectro de UV-Vis é ainda um campo

amplo para novas pesquisas.

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