universidade estadual de campinas instituto de...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

LEANDRO POMPÍLIO SACCHI

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO INDICATIVO DE ESTABILIDADE PARA

ASSOCIAÇÃO DOS FÁRMACOS LOSARTANA POTÁSSICA E BESILATO DE ANLODIPINO EMPREGANDO CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA E CONCEITOS DE ANALYTICAL QUALITY BY DESIGN

CAMPINAS 2018

Leandro Pompílio Sacchi

Desenvolvimento de método indicativo de estabilidade para associação dos

fármacos losartana potássica e besilato de anlodipino empregando

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e conceitos de Analytical Quality by

Design

Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Química Analítica

Orientadora: Profª. Drª. Marcia Cristina Breitkreitz ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO LEANDRO POMPÍLIO SACCHI, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARCIA CRISTINA BREITKREITZ.

CAMPINAS 2018

DEDICATÓRIA

A todos os bravos estudantes de

pós-graduação que navegaram

por águas turbulentas e

superaram todas as suas

inerentes adversidades.

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao meu companheiro Murillo pelo apoio incondicional, pela

paciência nos momentos de estresse, pelo carinho que foram fundamentais durante

esta etapa que, embora engrandecedora do ponto de vista de conhecimento, veio

acompanhada de muito desgaste físico e emocional.

Agradeço aos meus pais Cláudia e Jeciel pelo esforço, dedicação e

confiança em minha educação.

Agradeço à profª Dra. Marcia Breitkreitz pela confiança, pela oportunidade,

pela motivação e por não me deixar desistir na primeira crise de ansiedade.

Agradeço à minha colega Luana Macedo pelo conhecimento transmitido

que me nortearam na execução de muitos experimentos.

Agradeço ao profº Dr. Paulo Rosa por estar sempre disponível, pelas

inúmeras dúvidas esclarecidas e pelos materiais concedidos.

Agradeço aos colegas de laboratório pelas conversas, risadas, desabafos

e trocas de conhecimento diários durante este período.

Agradeço à UNICAMP pela acolhida, pela excelente infraestrutura e pela

excelência.

Agradeço à CNPq e à FAPESP pelo apoio financeiro.

EPÍGRAFE

“O sucesso nasce do querer, da

determinação e persistência em se chegar a

um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo,

quem busca e vence obstáculos, no mínimo

fará coisas admiráveis.”

José de Alencar

RESUMO

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um método indicativo de estabilidade

linear, preciso, exato, robusto e seletivo, para uma associação de losartana potássica

e besilato de anlodipino, empregando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

e conceitos de Anaytical Quality by Design (A-QbD). Inicialmente, foram feitos testes

de sensibilidade dos fármacos às diversas condições de degradação forçada, nos

quais a losartana potássica mostrou-se sensível apenas à condição oxidativa ao

passo que o besilato de anlodipino mostrou-se sensível às condições ácida, básica e

oxidativa. Em seguida, foi feita uma triagem para determinar qual faixa de pH,

modificador orgânico e coluna cromatográfica ofereceriam as melhores respostas em

relação ao formato de pico e à seletividade. A coluna XSelect CSH Fluoro-Fenil 3,5

µm – 4,6x150 mm, utilizando-se metanol como modificador orgânico, se mostrou mais

promissora na faixa de pH de 2,5 a 6,0, empregando eluição por gradiente. Para

selecionar as condições ótimas durante o desenvolvimento de método, foi realizado

um planejamento Composto Central, o qual apontou para o uso de tampão formiato

de amônio 10 mmol L-1 em pH 3,2, vazão de 0,95 mL min-1 e temperatura de 36,25°C.

A seguir definiu-se o perfil de degradação potencial dos fármacos, submetendo-os às

condições de degradação forçada ácida, básica, oxidativa, térmica seca, térmica

úmida e exposição a íons metálicos nas condições selecionadas. Os ensaios

realizados na condição de degradação forçada térmica (úmida) apontaram para uma

incompatibilidade química entre a losartana potássica e besilato de anlodipino quando

colocados em contato direto; uma indicativo de incompatibilidade entre a losartana

potássica e seus excipientes também foi observado neste ensaio. Dificuldades no

fechamento do balanço de massas apontaram para uma degradação excessiva, e

indesejável, dos fármacos em estudo, com indicativo de perda ou mudança no grupo

cromóforo e consequente falta de detectabilidade empregando o detector por arranjo

de diodos (DAD). O método foi validado de acordo com a RDC nº166/2017.

Palavras-chave: Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE); Analytical Quality

by Design (A-QbD); Teste de estresse de fármacos; Estabilidade de medicamentos;

Validação.

ABSTRACT

This work describes the development of a linear, precise, accurate, robust and

selective stability indicating method for an association of losartan potassium and

amlodipine besylate using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and

concepts of Anaytical Quality by Design (A -QbD). Initially, drug sensitivity tests were

performed at various forced degradation conditions. Losartan potassium was sensitive

only to the oxidative condition, whereas amlodipine besylate was sensitive to acid,

basic and oxidative conditions. Then, a screening was performed to determine which

pH range, organic modifier and chromatographic column would offer the best

responses in relation to peak shape and selectivity. The XSelect CSH Fluoro-Phenyl

3.5 μm - 4.6 x 150 mm column using methanol as organic modifier showed to be the

most promising in the pH range of 2.5 to 6.0 with gradient elution. The development of

the method was performed using a Central Composite design, which allowed the

selection of 10 mmol L-1 ammonium formate buffer at pH 3.2, flow rate of 0.95 mL min-

1 and temperature of 36.25°C. The potential degradation profile of the drugs was

determined by submitting them to acid, basic, oxidative, dry thermal, wet thermal and

metal ion exposure conditions. The tests carried out in the condition of wet thermal

forced degradation pointed to a chemical incompatibility between losartan potassium

and amlodipine besylate when placed in direct contact; an indication of incompatibility

between losartan potassium and its excipients was also observed in this condition.

Difficulties in the mass balance closure pointed to excessive and undesirable

degradation of the drugs under study, indicating the loss or changes in the

chromophore group, with consequent lack of detectability by the diode array detector

(DAD). The method was validated according to the most recent Brazilian guideline

(RDC 166/2017).

Keywords: High Performance Liquid Chromatography (HPLC); Analytical Quality by

Design (A-QbD); Drug stress testing; Dug stability; Validation.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Fórmula estrutural da losartana potássica...................................................26

Figura 2. Produtos de degradação identificados para losartana potássica. (A)

losartana carboxaldeído, (B) Impureza L e (C) Impureza M...................................... 27

Figura 3. Mecanismo de dimerização de losartana, em meio ácido......................... 28

Figura 4. Fórmula estrutural do besilato de anlodipino.............................................. 29

Figura 5. Impureza D do besilato de anlodipino........................................................ 30

Figura 6. Mecanismo proposto para oxidação de diidropiridinas............................... 30

Figura 7. Estruturas propostas para produtos de degradação oriundos de degradação

forçada básica de besilato de anlodipino................................................................... 31

Figura 8. Imagem do medicamento LOTAR®, da empresa farmacêutica Aché, que

apresenta separação física entre os fármacos............................................................32

Figura 9. Perfis de degradação (A) “real”; (B) “potencial”............................................34

Figura 10. Exemplo de Design Space aplicado para dois CQA................................ 44

Figura 11. Medidas associadas ao cálculo da resolução........................................... 46

Figura 12. Separação de picos de acordo com a resolução..................................... 47

Figura 13. Medidas associadas ao cálculo do fator cauda......................................... 47

Figura 14. HPLC Waters Alliance 2695 com detector por arranjo de fotodiodos (PDA)

Waters 2998............................................................................................................... 60

Figura 15. Ilustração dos ensaios de sensibilidade dos fármacos à degradação.......61

Figura 16. Ilustração dos ensaios de degradação forçada realizados em solução.....65

Figura 17. Ilustração dos ensaios de degradação forçada realizados em

suspensão..................................................................................................................67

Figura 18. Diagrama de execução dos experimentos para obtenção do perfil de

degradação................................................................................................................ 71

Figura 19. Resultados dos ensaios iniciais em condições de estresse (A) ácido, (B)

básico e (C) oxidativo, para uma solução aquosa de losartana potássica...................85

Figura 20. Resultados dos ensaios iniciais em condições de estresse (A) ácido, (B)

básico e (C) oxidativo, para uma solução aquosa de besilato de anlodipino............. 85

Figura 21. Resultados dos ensaios de degradação forçada ácida para IFA de

losartana potássica realizados a partir de (A) uma solução aquosa e (B) uma solução

metanólica..................................................................................................................86

Figura 22. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e

besilato de anlodipino, empregando-se acetonitrila como modificador orgânico da fase

móvel e coluna cromatográfica XTerra MS C18 3,5 µm – 3,0x100 mm.......................86


besilato de anlodipino, empregando-se metanol como modificador orgânico da fase

móvel e coluna cromatográfica XTerra MS C18 3,5 µm – 3,0x100 mm.......................87



móvel e coluna cromatográfica XSelect HSS C18 5 µm – 4,6x150 mm.......................88



móvel e coluna cromatográfica XSelect HSS C18 5 µm – 4,6x150 mm.......................88



móvel e coluna cromatográfica Nova-Pak C18 4 µm – 3,9x150 mm............................89



móvel e coluna cromatográfica Nova-Pak C18 4 µm – 3,9x150 mm............................90



móvel e coluna cromatográfica CORTECS C18+ 2.7 µm – 4,6x150 mm.....................91



móvel e coluna cromatográfica CORTECS C18+ 2.7 µm – 4,6x150 mm.....................91



móvel e coluna cromatográfica XSelect CSH Fluoro-Fenil 3,5 µm – 4,6x150 mm.......92



móvel e coluna cromatográfica XSelect CSH Fluoro-Fenil 3,5 µm – 4,6x150 mm.......93

Figura 32. Curva de van Deemter para a coluna cromatográfica XSelect CSH Fluoro-

Fenil 3,5 µm – 4,6x150 mm, empregando-se naftaleno como analito e acetonitrila:água

55:45, v/v como fase móvel em eluição isocrática..................................................... 94

Figura 33. Curva de teor vs. tempo de exposição aos agentes degradantes........... 95

Figura 34. Sobreposição dos espectros de absorção, no ultraviolenta, de losartana

potássica e besilato de anlodipino.............................................................................. 96

Figura 35. Estudos de degradação forçada realizados em suspensão nas mesmas

condições, mas em semanas diferentes, para uma mistura de amostras degradadas

de besilato de anlodipino e losartana potássica......................................................... 97

Figura 36. Cromatogramas obtidos empregando-se eluição isocrática e

metanol:tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 pH 3,5 como fase

móvel..........................................................................................................................99

Figura 37. Cromatogramas obtidos empregando-se diferentes programas de eluição

por gradiente e metanol:tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 pH 3,5 como fase

móvel........................................................................................................................100

Figura 38. Continuação dos cromatogramas obtidos empregando-se diferentes

programas de eluição por gradiente e metanol:tampão formiato de amônio 10 mmol L-

1 pH 3,5 como fase móvel..........................................................................................101

Figura 39. Cromatogramas obtidos a partir da injeção das amostras de degradação

forçada utilizando-se o programa 6 de eluição por gradiente....................................102

Figura 40. Gráfico normal dos resíduos para fator cauda da losartana

potássica..................................................................................................................103

Figura 41. Gráfico de resíduos vs. valores previstos para pureza de pico da losartana

potássica..................................................................................................................104

Figura 42. Padrão “megafone” indicando heteroscedasticidade dos resíduos.........104

Figura 43. Gráfico de resíduos vs. ordem do experimento para eficiência do besilato

de anlodipino............................................................................................................105

Figura 44. Gráfico de valores previstos vs. valores reais para fator cauda da losartana

potássica..................................................................................................................106

Figura 45. Gráfico de superfície de resposta para eficiência do besilato de

anlodipino.................................................................................................................108

Figura 46. Gráfico de contorno para eficiência do besilato de anlodipino.............. 109

Figura 47. Design Space dos fatores vazão e pH para (A) T = 28,8°C; (B) 32,5°C e

(C) 36,3°C. A região em amarelo corresponde a T < 1,5 e a ★ corresponde às

condições selecionadas............................................................................................111

Figura 48. Gráfico de balanço de massas vs. teor para losartana potássica e besilato

de anlodipino............................................................................................................116

Figura 49. Espectros de absorção na região do ultravioleta para (A) besilato de

anlodipino e (B) um produto de degradação do besilato de

anlodipino.................................................................................................................117

Figura 50. Gráfico de dispersão dos resíduos da regressão com os respectivos

intervalos de confiança para (A) losartana potássica e (B) besilato de

anlodipino.................................................................................................................118

Figura 51. Teste de resíduos padronizados Jacknife após a primeira aplicação (A) e

após a segunda aplicação (B) para losartana potássica; e após a primeira aplicação

(C) e após a segunda aplicação (D) para besilato de anlodipino...............................119

Figura 52. Curvas analíticas obtidas para losartana potássica e besilato de

anlodipino.................................................................................................................120

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Revisão bibliográfica com recomendações acerca da execução dos estudos

de degradação forçada...............................................................................................36

Tabela 2. Limites para notificação, identificação e qualificação................................. 38

Tabela 3. Comparação da abordagem tradicional com a abordagem de Quality by

Design........................................................................................................................ 42

Tabela 4. Comparação entre Quality by Design e Analytical Quality by Design........ 43

Tabela 5. Figuras de mérito recomendadss de acordo com o tipo de ensaio a ser

realizado.................................................................................................................... 49

Tabela 6. Faixa de trabalho de acordo com a aplicação pretendida......................... 53

Tabela 7. Programa de eluição por gradiente empregado na etapa de triagem........ 63

Tabela 8. Programa de eluição por gradiente empregado nas análises das amostras

degradadas................................................................................................................ 66

Tabela 9. Programas de eluição por gradiente avaliados........................................... 69

Tabela 10. Programa de eluição por gradiente empregado na etapa de otimização do

método....................................................................................................................... 70

Tabela 11. Condições empregadas no planejamento experimental...........................70

Tabela 12. Diluições realizadas para os experimentos de linearidade....................... 78

Tabela 13. Diluições realizadas para os experimentos de exatidão........................... 80

Tabela 14. Definição do Analytical Target Profile (ATP)........................................... 81

Tabela 15. Definição dos Atributos Críticos de Qualidade (CQA).............................. 82

Tabela 16. Definição dos Parâmetros Críticos do Método (CMP).............................. 82

Tabela 17. Análise de Risco (RA) baseada no impacto previsto dos CMP sobre os

CQA........................................................................................................................... 83

Tabela 18. Disposição de dados para ANOVA gerados para avaliar os resultados de

eficiência do besilato de anlodipino...........................................................................107


eficiência de besilato de anlodipino, após retirada dos termos não

significativos.............................................................................................................108

Tabela 20. Resultados obtidos a partir da verificação do modelo proposto pelo

planejamento experimental.......................................................................................111

Tabela 21. Perfil de degradação para losartana potássica.......................................113

Tabela 22. Perfil de degradação para besilato de anlodipino....................................114

Tabela 23. Resumo dos resultados dos testes estatísticos realizados para

linearidade................................................................................................................121

Tabela 24. Massa média obtida para as cápsulas de LOTAR®................................122

Tabela 25. Valores obtidos experimentalmente no ensaio de precisão

(repetibilidade)..........................................................................................................123

Tabela 26. Valores obtidos experimentalmente para losartana potássica no ensaio de

precisão intermediária..............................................................................................123

Tabela 27. Valores obtidos experimentalmente para besilato de anlodipino no ensaio

de precisão intermediária..........................................................................................124

Tabela 28. Disposição de dados para ANOVA gerados para avaliar os resultados do

ensaio de precisão intermediária para a losartana potássica. .................................124

Tabela 29. Resultados para o ensaio de precisão intermediária para losartana

potássica..................................................................................................................124

Tabela 30. Disposição de dados para ANOVA gerados para avaliar os resultados do

ensaio de precisão intermediária para o besilato de anlodipino...............................124

Tabela 31. Resultados para o ensaio de precisão intermediária para o besilato de

anlodipino.................................................................................................................125

Tabela 32. Valores de recuperação obtidos para losartana potássica no ensaio de

exatidão....................................................................................................................125

Tabela 33. Valores de recuperação obtidos para besilato de anlodipino no ensaio de

exatidão....................................................................................................................126

Tabela 34. Resultados para a pureza de pico, resolução, eficiência e fator de causa

dos dois fármacos obtidos a partir de variações de vazão da fase móvel, pH e

temperatura da coluna..............................................................................................127

LISTA DE EQUAÇÕES

Equação 1. Fator de retenção................................................................................... 45

Equação 2. Fator de separação................................................................................. 46

Equação 3. Resolução.............................................................................................. 46

Equação 4. Fator cauda............................................................................................ 47

Equação 5. Número de pratos................................................................................... 48

Equação 6. Altura do prato........................................................................................ 48

Equação 7. Desvio padrão relativo percentual.......................................................... 51

Equação 8. Equação de Horwitz............................................................................... 51

Equação 9. Recuperação.......................................................................................... 52

Equação 10. Limite de detecção............................................................................... 53

Equação 11. Limite de quantificação......................................................................... 54

Equação 12. Teor de IFA........................................................................................... 66

Equação 13. Teor da Impureza................................................................................. 76

Equação 14. Correção da diferente de massa molar entre impureza e fármaco de

origem.......................................................................................................................116

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACC = antagonistas dos canais de cálcio

AML = besilato de anlodipino

ANOVA = Analysis of Variance ou análise da variância

ANVISA = Agência Nacional de Vigilância Sanitária

A-QbD = Analytical Quality by Design.

ATP = Analytical Target Profile ou perfil analítico alvo

BB = betabloqueadores

BRA = bloqueadores do receptor AT1 da angiotensina

CMA = Critical Material Attributes ou atributos críticos do material

CMP = Critical Method Parameters ou parâmetros críticos do método

CPP = Critical Process Parameter ou parâmetros críticos do processo

CQA = Critical Quality Attributes ou atributos críticos de qualidade

CV = coeficiente de variação

DoE = Design of Experiments ou planejamento experimental

DPR = desvio padrão relativo

DR = diuréticos

DS = Design Space

ECA = enzima conversora da angiotensina

EMA = European Medicines Agency

FDA = Food and Drugs Administration

HA = hipertensão arterial

HPLC = High Performance Liquid Chromatography, ou cromatografia líquida de alta

eficiência

ICH = International Conference of Harmonisation of Technical Requirements for

Registration of Pharmaceuticals for Human Use

IDR = inibidores diretos da renina

IECA = inibidores da enzima de conversão da angiotensina

IFA = insumo farmacêutico ativo

k = fator de retenção

LD = limite de detecção

LOS = losartana potássica

LQ = limite de quantificação

MeOH = metanol

MF = massa molar do fármaco

MIE = método indicativo de estabilidade

MLCK = Myosin Light-Chain Kinase ou quinase da cadeia leve da miosina

MMQO = método dos mínimos quadrados ordinários

MODR = Method Operable Design Region

MPD = massa molar do produto de degradação

MQep = média quadrática do erro puro

MQfaj = média quadrática da falta de ajuste

MQR = média quadrática da regressão

MQr = média quadrática dos resíduos

PA = pressão arterial

PDA = photodiode array ou arranjo de fotodiodos

PDMA = Pharmaceuticals and Medical Devices Agency

pH = potencial hidrogeniônico

pKa = constante de dissociação ácida

PTFE = politetrafluoretileno

QbD = Quality by Design

QTPP = Quality Target Product Profile ou perfil alvo da qualidade do produto.

RA = Risk Assessment ou análise de risco

RDC = resolução da diretoria colegiada

RP = reversed phase, fase reversa

Rs = resolução

s = desvio padrão

T = tailing factor ou fator cauda

UV = ultravioleta

VIS = visível

WHO = World Health Organization ou Organização Mundial da Saúde

SUMÁRIO

1. PREFÁCIO.......................................................................................................23

2. INTRODUÇÃO.................................................................................................25

2.1. Hipertensão arterial ...........................................................................................25

2.2. Losartana potássica...........................................................................................26

2.2.1. Propriedades físico-químicas da losartana potássica..................................26

2.2.2. Produtos de degradação da losartana potássica.........................................27

2.3. Besilato de anlodipino................. ......................................................................28

2.3.1. Propriedades físico-química da besilato de anlodipino.................................29

2.3.2. Produtos de degradação do besilato de anlodipino......................................30

2.4. Associação de losartana potássica com besilato de anlodipino.........................31

2.5. Pré-formulação e estabilidade farmacêutica......................................................32

2.6. Perfil de degradação..........................................................................................33

2.7. Estudo de degradação forçada .........................................................................34

2.8. Notificação, identificação e qualificação............................................................35

2.9. Métodos Indicativos de Estabilidade (MIE) ........................................................38

2.10. Quality by Design (QbD) ..................................................................................39

2.11. Analytical Quality by Design.............................................................................42

2.12. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.........................................................44

2.12.1. Parâmetros cromatográficos.......................................................................45

2.12.1.1. Fator de retenção, k...............................................................................45

2.12.1.2. Fator de separação (ou de seletividade), α............................................46

2.12.1.3. Resolução, Rs.......................................................................................46

2.12.1.4. Fator cauda (T) .....................................................................................47

2.12.1.5. Eficiência (N) ........................................................................................47

2.13. Validação de métodos analíticos.....................................................................48

2.13.1. As figuras de mérito da validação analítica ...............................................49

2.13.1.1. Seletividade ..........................................................................................49

2.13.1.2. Linearidade............................................................................................50

2.13.1.3. Precisão................................................................................................50

2.13.1.4. Repetibilidade........................................................................................51

2.13.1.5. Precisão intermediária...........................................................................52

2.13.1.6. Exatidão................................................................................................52

2.13.1.7. Intervalo.................................................................................................52

2.13.1.8. Limite de Detecção (LD) ........................................................................53

2.13.1.9. Limite de Quantificação (LQ) .................................................................53

2.13.1.10. Robustez.............................................................................................54

3. OBJETIVO.......................................................................................................55

4. JUSTIFICATIVA...............................................................................................56

5. MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................58

5.1. Materiais ...........................................................................................................58

5.1.1. Reagentes e solventes.................................................................................58

5.1.1.1. Grau cromatográfico................................................................................58

5.1.1.2. Grau analítico..........................................................................................58

5.1.2. Substâncias químicas de referência (padrões) ............................................58

5.1.3. Medicamentos..............................................................................................59

5.1.4. Equipamentos...............................................................................................59

5.1.5. Softwares......................................................................................................60

5.2. Métodos.............................................................................................................60

5.2.1. Testes de sensibilidade dos fármacos à degradação....................................60

5.2.2. Triagem para pH, modificador orgânico e colunas cromatográficas .............62

5.2.3. Curva de van Deemter .................................................................................63

5.2.4. Estudos de degradação forçada...................................................................64

5.2.4.1. Estudo de degradação forçada em solução.............................................64

5.2.4.2. Seleção do comprimento de onda............................................................66

5.2.4.3. Estudo de degradação forçada em suspensão........................................66

5.2.5. Preparo da amostra......................................................................................68

5.2.6. Desenvolvimento e otimização do método cromatográfico...........................68

5.2.6.1. Otimização dos programas de eluição.....................................................68

5.2.6.2. Otimização dos atributos críticos de qualidade (CQA) empregando

Planejamento Experimental (DoE) .............................................................................69

5.2.7. Verificação do modelo..................................................................................70

5.2.8. Perfil de degradação....................................................................................71

5.2.8.1. Preparo das soluções estoque.................................................................72

5.2.8.2. Degradação forçada ácida.......................................................................73

5.2.8.3. Degradação forçada básica.....................................................................73

5.2.8.4. Degradação forçada oxidativa.................................................................73

5.2.8.5. Degradação forçada térmica seca...........................................................74

5.2.8.6. Degradação forçada térmica úmida.........................................................74

5.2.8.7. Exposição fotolítica..................................................................................75

5.2.8.8. Exposição a íons metálicos......................................................................75

5.3. Validação da metodologia analítica....................................................................77

5.3.1. Seletividade..................................................................................................77

5.3.2. Linearidade ..................................................................................................77

5.3.3. Precisão........................................................................................................78

5.3.4. Exatidão........................................................................................................79

5.3.5. Robustez......................................................................................................80

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................81

6.1. Definição dos elementos do Analytical Quality by Design.................................81

6.2. Testes de sensibilidade dos fármacos à degradação.........................................84

6.3. Testes de triagem para pH, modificador orgânico e colunas cromatográficas....84

6.4. Curva de van Deemter.......................................................................................94

6.5. Estudo de degradação forçada..........................................................................94

6.5.1. Estudo de degradação forçada em solução..................................................94

6.5.2. Seleção do comprimento de onda................................................................96

6.5.3. Estudo de degradação forçada conduzidos em suspensão..........................97

6.6. Desenvolvimento e otimização do método cromatográfico................................98

6.6.1. Otimização das programações dos modos de eluição..................................98

6.6.2. Otimização dos atributos críticos de qualidade (CQA) empregando

Planejamento Experimental (DoE) ...........................................................................102

6.7. Verificação do modelo......................................................................................111

6.8. Perfil de degradação........................................................................................112

6.9. Validação analítica...........................................................................................117

6.9.1. Seletividade................................................................................................117

6.9.2. Linearidade.................................................................................................118

6.9.3. Precisão......................................................................................................121

6.9.3.1. Massa média das cápsulas....................................................................121

6.9.3.2. Cálculo dos limites de precisão..............................................................122

6.9.3.3. Precisão (repetibilidade) .......................................................................122

6.9.3.4. Precisão intermediária...........................................................................123

6.9.4. Exatidão......................................................................................................125

6.9.5. Robustez....................................................................................................126

7. CONCLUSÕES..............................................................................................128

REFERÊNCIAS........................................................................................................130

APÊNDICE I – Varredura de comprimento de onda. ...............................................140

APÊNDICE II – Perfil de degradação. ......................................................................144

P á g i n a | 23

1. PREFÁCIO

A hipertensão arterial (HA) é uma doença crônica caracterizada por

pressões sanguíneas acima de 130 por 80 mmHg (WHELTON & CAREY, 2017).

Segundo Whelton e Carey (2017), 45,6% da população dos Estados Unidos é

hipertensa. No Brasil, ainda não há levantamentos recentes, levando-se em conta as

novas diretrizes (WHELTON & CAREY, 2017) para hipertensão arterial lançada em

06 de novembro de 2017. Estima-se que cerca de 70% dos indivíduos hipertensos

necessitem de combinação medicamentosa dupla para atingir valores de pressão

arterial normal (120 por 80 mmHg) (KOHLMANN et al., 2010).

No medicamento Lotar©, disponível comercialmente e empregado neste

trabalho, a redução da pressão arterial se dá através da ação de dois agentes: um

antagonista do receptor da angiotensina II (losartana potássica) e um antagonista dos

canais de cálcio (besilato de anlodipino). A ação desses dois componentes se faz de

maneira sinérgica, com a losartana bloqueando as ações da angiotensina II, que

apresenta uma potente ação de vasoconstrição (contração dos vasos) e exerce

importante papel na regulação da pressão arterial pelo rim; e o anlodipino, que

apresenta efeito de dilatação nos vasos arteriais da circulação periférica. A ação

conjunta dos dois medicamentos contribui para reduzir a pressão arterial e mantê-la

em níveis normais (LOTAR, 2014).

O teor do fármaco, ou seja, sua concentração no produto final, deve

permanecer dentro dos limites especificados durante todo o período de validade do

produto, de forma a garantir sua eficácia e segurança.

Na etapa de pré-formulação, os testes de estabilidade química fornecem

informação sobre o fármaco antes do desenvolvimento da formulação farmacêutica.

(PANDEY et al., 2011). Os ensaios de estresse, por exemplo, visam obter informações

acerca da degradação e mecanismos de formação de impurezas, de forma isolada e

em conjunto com os excipientes. Desta forma, também é possível determinar quais as

combinações de excipientes, sais e substâncias ativas mais promissoras do ponto de

vista da estabilidade farmacêutica (RHEIN, 2013). Para auxiliar na avaliação da

estabilidade de um medicamento, deve-se utilizar um método indicativo de

estabilidade, ou seja, um método capaz de mensurar com exatidão, ao longo do

P á g i n a | 24

tempo, o teor do insumo farmacêutico ativo, produtos de degradação e outros

componentes de interesse, sem interferências.

Uma abordagem recente para o desenvolvimento farmacêutico é a de

Quality by Design (QbD), introduzida pelo ICH (International Conference on

Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for

Human Use) (ICH Q8), um grupo que reúne autoridades reguladoras e associações

de indústrias farmacêuticas para discutir registro de medicamentos. A iniciativa de

Quality by Design preconiza que a qualidade não deve ser testada nos produtos ao

final da cadeia produtiva e sim planejada e construída durante os processos de

desenvolvimento e de produção, explora o desenvolvimento sistemático e prospectivo,

conduzido pela conhecimento do risco dos fatores que afetam os atributos críticos de

qualidade do produto, bem como a modelagem matemática dos mesmos.

Recentemente, o conceito de Quality by Design foi expandido para a área analítica

gerando a vertente denominada Analytical Quality by Design (A-QbD), sendo os

mesmos princípios então aplicados ao desenvolvimento de métodos. Nesta

conjuntura, a abordagem QbD caracteriza-se como uma estratégia promissora para o

desenvolvimento de métodos analíticos, de forma a obter flexibilidade regulatória,

favorecer a transferência de tecnologia, apresentar alto grau de robustez e melhor

custo efetivo. (CHAVES, 2017).

P á g i n a | 25

2. INTRODUÇÃO

2.1 Hipertensão arterial

A hipertensão arterial (HA) é uma doença crônica caracterizada por

pressões sanguíneas acima de 130 por 80 mmHg (WHELTON & CAREY, 2017).

Segundo Whelton e Carey (2017), 45,6% da população dos EUA é hipertensa. No

Brasil, ainda não há levantamentos levando em conta as novas diretrizes (WHELTON

& CAREY, 2017) para hipertensão arterial lançada em 06 de novembro de 2017.

A complexidade dos mecanismos na fisiopatologia da HA torna difícil o seu

controle através de um único fármaco (monoterapia). No entanto, estudos mostraram

que o uso da associação sequencial de fármacos prejudica a adesão e a persistência

ao tratamento (FIGUEIREDO & BRANDÃO, 2013). Em contrapartida, a terapia

combinada, isto é, a terapia envolvendo medicamentos que contenham

simultaneamente dois ou mais fármacos, em doses fixas, tem demonstrado maior

eficiência no controle da pressão arterial (PA) (SBC, 2014). Estima-se que cerca de

70% dos indivíduos hipertensos necessitem de combinação medicamentosa dupla

para atingir níveis normais de pressão arterial (KOHLMANN et al., 2010). Nas

combinações medicamentosas fixas, devem ser empregados fármacos que possuem

diferentes mecanismos no controle da HA, bem como compatibilidade

farmacocinética. Desta forma, o controle da pressão arterial é atingido mais

rapidamente, existe menor taxa de eventos adversos, uma vez que a redução da PA

pode ser obtida com doses menores de cada fármaco, e verifica-se maior adesão do

paciente ao tratamento, devido à posologia de dose única (KOHLMANN et al., 2010).

De acordo com seu mecanismo de ação, os fármacos utilizados para

controle da pressão arterial podem ser classificados como diuréticos (DR),

betabloqueadores (BB), inibidores da enzima de conversão da angiotensina (IECA),

bloqueadores do receptor AT1 da angiotensina (BRA), antagonistas dos canais de

cálcio (ACC) e inibidores diretos da renina (IDR).

P á g i n a | 26

2.2 Losartana potássica

O sistema renina-angiotensina tem um papel importante no tratamento da

hipertensão arterial humana. Em resposta à diminuição do volume sanguíneo efetivo,

a renina é liberada pelo aparelho justaglomerular (nos rins). No sangue, a renina é

responsável pela conversão do angiotensinogênio (liberado pelo fígado) em

angiotensina I e esta, por sua vez, ao entrar em contato com uma enzima denominada

Enzima Conversora da Angiotensina (ECA) é convertida em angiotensina II. Para

exercer sua atividade biológica, a angiotensina II liga-se, preferencialmente, ao

receptor de alta afinidade AT1 estimulando o córtex adrenal a sintetizar e secretar

aldosterona e, com isso, diminuir a excreção de sódio, aumentar a excreção de

potássio e, consequentemente, fazendo com que a pressão arterial aumente. (RANG

et al, 2007; CASSIS, 2008). A losartana potássica (Figura 1) é um antagonista ao

receptor AT1 da angiotensina II e liga-se de forma seletiva e competitiva a este

receptor, bloqueando a ligação da angiotensina II e, consequentemente, neutralizando

os efeitos da aldosterona. (MAGALHÃES, 2006). Segundo auditoria da IMS Health,

em 2014, a losartana potássica foi o medicamento mais vendido no Brasil, com vendas

que ultrapassaram R$ 515 milhões de reais (CFF, 2015).

Figura 1. Fórmula estrutural da losartana potássica. (DRUG BANK, 2018).

2.2.1 Propriedades físico-química da losartana potássica

A losartana potássica possui fórmula molecular C22H22ClKN6O e é

denominada pela IUPAC como 2-Butyl-4-chloro-1-{[2’-(1H-tetrazol-5-yl)(1,1’-

biphenyl)-4-yl]methyl}-1H-imidazole-5-methanol monopotassium salt. Possui

aparência de um pó fino, de coloração branca, com ponto de fusão entre 263-265°C

P á g i n a | 27

e massa molar de 461,001 g mol-1. Seu logP (octanol/água) previsto é de 4,48 e seu

pKa é de 4,15 (DRUG BANK, 2018), caracterizando-se como um ácido fraco.

2.2.2 Produtos de degradação da losartana potássica

Os produtos de degradação da losartana potássica foram estudados por

Zhao et al. (1999). Três produtos de degradação foram identificados em comprimidos

de losartana potássica fortemente estressados (armazenados por 3 anos a 40 °C/75%

RH): o primeiro é um aldeído, formado por oxidação do grupo hidroxil da losartana,

identificado como losartana carboxaldeído; e os outros dois são dímeros, formados

por condensação de duas moléculas de losartana seguido pela eliminação de uma

molécula de água, identificados como Impureza L e M (EUROPEAN

PHARMACOPEIA, 2016). As estruturas dos produtos de degradação da losartana

potássica são mostradas na Figura 2.

Figura 2. Produtos de degradação identificados para losartana potássica. (A) losartana carboxaldeído, (B) Impureza L e (C) Impureza M.

A dimerização não foi observada em condições básicas, segundo Zhao et

al. (1999). No entanto, em condições ácidas, o grupo alcóolico na fração imidazol da

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517304006611?via%3Dihub#bib33

P á g i n a | 28

molécula de losartana reage com o grupo amina da fração tetrazol através de

substituição nucleofílica SN2, conforme mostrado na Figura 3.

Figura 3. Mecanismo de dimerização da losartana, em meio ácido.

A formação da losartana carboxaldeído ocorre a partir da oxidação do

grupo alcoólico da molécula.

2.3 Besilato de anlodipino

O íon cálcio (Ca2+) é um importante mensageiro intracelular, sendo

fundamental nos mecanismos de excitação e contração da musculatura lisa do

miocárdio e dos vasos. Ele penetra no citoplasma celular através de diferentes canais

(OIGMAN & FRITSCH, 1998). Existem pelo menos cinco tipos diferentes de canais de

cálcio em seres humanos L, N, P/Q, R e T. Os medicamentos do grupo dos

bloqueadores dos canais de cálcio, como o besilato de anlodipino (Figura 4), da classe

das diidropiridinas, diminui a contratibilidade do músculo liso arterial e subsequente

vasoconstrição, inibindo o influxo de íons de cálcio através dos canais de cálcio do

P á g i n a | 29

tipo L. Os íons de cálcio, que entram na célula através desses canais, se ligam à

calmodulina que, por sua vez, ativa a quinase da cadeia leve da miosina (MLCK) ao

ligar-se ao cálcio. A MLCK ativada catalisa a fosforilação da subunidade da cadeia

leve regulatória da miosina, um passo chave na contração muscular. A amplificação

do sinal é conseguida pela liberação do cálcio armazenado no retículo

sarcoplasmático, através de receptores de rianodina. A inibição do influxo inicial de

cálcio diminui a atividade contrátil das células do músculo liso arterial e resulta em

vasodilatação. Os efeitos vasodilatadores do anlodipino resultam em uma diminuição

geral da pressão arterial. (DRUG BANK, 2018)

Figura 4. Fórmula estrutural do besilato de anlodipino. (DRUG BANK, 2018)

2.3.1 Propriedades físico-química da besilato de anlodipino

O besilato de anlodipino possui fórmula molecular C26H31ClN2O8S e é

denominado pela IUPAC como 2-[(2-Aminoethoxy)-methyl]-4-(2-chlorophenyl)-1,4-

dihydro-6-methyl-3,5-pyridinedicarboxylic acid 3-ethyl 5-methyl ester benzene

sulfonate.

Possui aparência de um pó fino, de coloração branca, com ponto de fusão

entre 199-201°C e massa molar de 567,05 g mol-1. Seu logP (octanol/água) previsto

é de 1,64 e seu pKa é de 9,45 (DRUG BANK, 2018), caracterizando-se como uma

base fraca.

P á g i n a | 30

2.3.2 Produtos de degradação do besilato de anlodipino

Os produtos de degradação do besilato de anlodipino foram estudados por

Damale et al. (2013). Cinco produtos de degradação foram identificados no fármaco

besilato de anlodipino em estudo de degradação forçada combinada (degradação

forçada ácida em HCl 5 mol L-1 por 6 horas a 80°C; degradação forçada básica em

NaOH 1 mol L-1 por 2 horas a 80°C e degradação forçada oxidativa em H2O2 30% por

6 horas a 80°). Apenas um produto de degradação, formado a partir de degradação

oxidativa e também pela degradação ácida, foi reconhecido e identificado como

Impureza D (EUROPEAN PHARMACOPEIA, 2016), cuja estrutura está mostrada na

Figura 5.

Figura 5. Impureza D do besilato de anlodipino (EUROPEAN PHARMACOPEIA, 2016).

Na Figura 6 é apresentado um mecanismo de oxidação de diidropiridinas,

proposto por Ortiz et al. (2004) para a formação da Impureza D do besilato de

anlodipino.

Figura 6. Mecanismo proposto para oxidação de diidropiridinas. (ORTIZ et al. 2004)

P á g i n a | 31

Outros 4 produtos de degradação (Figura 7), oriundos de degradação

forçada básica, tiveram suas estruturas propostas por Damale et al. (2013), embora

não sejam produtos de degradação reconhecidos pela farmacopeia..

Figura 7. Estruturas propostas para produtos de degradação oriundos de degradação forçada

básica de besilato de anlodipino. (DAMALE et al.,2013)

2.4 Associação de losartana potássica com besilato de anlodipino

A redução da pressão arterial causada pelo uso do medicamento Lotar© se

dá através da ação de dois agentes: um antagonista do receptor da angiotensina II

(losartana potássica) e um antagonista dos canais de cálcio (besilato de anlodipino).

A ação desses dois componentes se faz de maneira sinérgica, com a losartana

bloqueando as ações da angiotensina II, que tem uma potente ação de vasoconstrição

(contração dos vasos) e exerce importante papel na regulação da pressão arterial pelo

rim; e o anlodipino, que tem efeito na dilatação nos vasos arteriais da circulação

periférica. A ação conjunta dos dois medicamentos contribui para reduzir a pressão

arterial e mantê-la em níveis normais (LOTAR, 2014).

Embora a combinação de losartana potássica com besilato de anlodipino

seja muito interessante do ponto de vista farmacológico, existe a necessidade de

separação dos dois ativos, devido ao efeito da gelificação da losartana, que causa

problemas na dissolução em pH baixos, com consequente bloqueio do besilato de

anlodipino no interior da formulação (RAMA, 2013). O medicamento Lotar®, da

empresa farmacêutica Aché, é apresentado como uma cápsula contendo um

granulado de losartana potássica e um comprimido revestido de besilato de

P á g i n a | 32

anlodipino, caracterizando-se como uma forma farmacêutica com separação física

entre os ativos (Figura 8). Devido à esta incompatibilidade, existe a necessidade de

desenvolvimento de métodos analíticos seletivos, sensíveis e robustos para análise

destes fármacos, de forma a dar suporte para o desenvolvimento de novas formas

farmacêuticas contendo os dois fármacos.

Figura 8. Imagem do medicamento LOTAR®, da empresa farmacêutica Aché, que apresenta separação física entre os fármacos.

2.5 Pré-formulação e estabilidade farmacêutica

Os estudos de pré-formulação têm por objetivo conhecer um fármaco antes

da fase de desenvolvimento da formulação farmacêutica, através de testes como

solubilidade, velocidade de dissolução, tamanho e forma da partícula, estabilidade

química, entre outros. (PANDEY et al., 2011)

As indústrias farmacêuticas realizam testes de estresse durante a pré-

formulação do medicamento a fim de obter informações acerca dos produtos de

degradação e mecanismos de formação dos mesmos, de forma isolada e em conjunto

com os excipientes. Desta forma, também é possível determinar quais as

combinações de excipientes, sais e substâncias ativas mais promissoras, do ponto de

vista da estabilidade farmacêutica (RHEIN, 2013).

O teor do fármaco, ou seja, sua concentração no produto final, deve

permanecer dentro dos limites especificados durante todo o período de validade do

produto, de forma a garantir sua eficácia e segurança. A estabilidade de produtos

P á g i n a | 33

farmacêuticos depende de fatores ambientais, como temperatura, umidade e luz; e de

outros relacionados ao próprio produto, como propriedades físicas e químicas de

substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma farmacêutica e sua

composição, processo de fabricação, tipo e propriedades dos materiais de embalagem

(BRASIL, 2015). No caso de associações de fármacos em um mesmo medicamento,

deve-se também considerar a compatibilidade química entre os mesmos, uma vez que

uma possível incompatibilidade pode gerar produtos de degradação e,

consequentemente, diminuição no teor de ambos ou ainda toxicidade.

2.6 Perfil de degradação

Segundo o Guia nº4 da ANVISA (BRASIL,2015), o perfil de degradação

representa o conjunto de produtos de degradação observados no insumo

farmacêutico ativo (IFA) ou no medicamento quando exposto a uma determinada

condição. Em geral, o que se entende por perfil de degradação é, na verdade, o perfil

de degradação “potencial”, já que o perfil de degradação “real” é aquele obtido após

a exposição do medicamento, ou IFA, à condições de temperatura e umidade pré-

estabelecidos de acordo com a zona climática do país, durante um período

equivalente a sua vida útil de prateleira (teste de estabilidade de longa duração).

Realiza-se o perfil de degradação “potencial” por meio de estudos degradação forçada

(ou ensaios de estresse ou testes de estresse), devido ao fato de que nos ensaios de

estabilidade de longa duração, muitas vezes, observa-se apenas uma ligeira redução

do teor, sem a formação de produtos de degradação.

O perfil de degradação “real” deve estar contido no perfil de degradação

“potencial”, levando em consideração que os ensaios de estresse deverão resultar na

formação de todos os potenciais produtos de degradação, os quais não seriam

necessariamente observados durante os testes de estabilidade de longa duração.

Este conceito é ilustrado na Figura 9 (BAERTSCHI et al., 2011).

P á g i n a | 34

Figura 9. Perfis de degradação (a) “real”; (b) “potencial”. (BAERTSCHI et al., 2011)

Além do estudo de degradação forçada, o perfil de degradação contempla

ainda uma revisão bibliográfica prévia acerca dos princípios ativos e excipientes, com

a finalidade de gerar informações sobre grupos funcionais mais suscetíveis a

degradação, sobre os possíveis produtos de degradação, bem como a probabilidade

de degradação de grupos cromóforos (BRASIL, 2015).

2.7 Estudo de degradação forçada

A ação de expor um material a condições muito diferentes de seu estado

natural (condições de estresse) é um procedimento que visa verificar o seu

comportamento nessas condições e conhecer seus potenciais produtos de

degradação, bem como permitir o desenvolvimento de métodos analíticos indicativos

de estabilidade. Na área farmacêutica, os testes de estresse são realizados em novas

moléculas e em suas interações com objetivo de conhecer substâncias que possam

influir na eficácia delas ou induzir efeitos biológicos tóxicos e até mutagênicos.

Não existe uma metodologia padronizada para se realizar o estudo de

degradação forçada. A Tabela 1 reúne diferentes recomendações acerca da

realização dos estudos de degradação forçada.

Segundo a RDC n°53 de 2015 (BRASIL), que estabelece novos

parâmetros para produtos de degradação em medicamentos, a empresa deverá

apresentar estudos submetendo a amostra às seguintes condições de estresse:

P á g i n a | 35

I – aquecimento;

II – umidade;

III - solução ácida;

IV - solução básica;

V - solução oxidante;

VI - exposição fotolítica e

VII - exposição a íons metálicos.

Com exceção de exposição fotolítica, não há, para as outras condições,

instruções acerca do tempo de exposição, da concentração, da natureza dos agentes

estressantes ou temperatura a serem utilizados. Isso se deve a variabilidade de

estabilidade dos fármacos. Exige-se, no entanto, que os testes promovam

degradações superiores a 10% e inferiores àquelas que levariam à degradação

completa das amostras, comprometendo o teste. Uma degradação muito superior a

20%, no entanto, pode levar a degradação dos próprios produtos de degradação, um

caso de degradação não representativa daquilo que de fato ocorreria em condições

normais de prateleira. (BAERTSCHI, 2011; BLESSY et al., 2013). Em condições de

estabilidade, onde a degradação observada é inferior a 10%, a RDC 53/2015

(BRASIL) preconiza que a empresa deve apresentar justificativa técnica

fundamentada.

2.8 Notificação, identificação e qualificação

De acordo com a RDC 53/2015 (BRASIL, 2015), a necessidade de

notificação, identificação e qualificação do(s) produto(s) de degradação no decorrer

do estudo de estabilidade do medicamento deverá ser avaliada com base nas

informações contidas na Tabela 2.

P á g i n a | 36

Tabela 1. Revisão bibliográfica com recomendações acerca da execução dos estudos de degradação forçada.

Tipo de

degradação Referência Recomendações

Hidrólise

ácida

ICH-Q1A(R2) Recomenda a condução do ensaio tanto em solução quanto em suspensão numa larga faixa de pH.

ANVISA, 2015 Expor amostra a solução tampão em pH abaixo de 7,0 ou um ácido mineral, como ácido clorídrico

(HCl)

ALSANTE et al.,

2007

Utilizar uma solução de HCl ou H2SO4 0,1 a 1 mol L-1 como agente estressante, expondo a

amostra em solução ou suspensão.

BAERTSCHI,

2005

Expor a amostra a uma solução de HCl a 0,1 mol L-1, em temperatura superior a 70°C, de 1 a 7

dias.

SEHRAWAT et

al., 2010 Solução do fármaco a 1 mg mL-1 em HCl 0,1 a 1 mol L-1 em temperatura ambiente ou superior.

Hidrólise

básica

ICH-Q1A(R2) Recomenda a condução do ensaio tanto em solução quanto em suspensão uma larga faixa de pH.

ANVISA, 2015 Expor amostra a solução tampão em pH acima de 7,0 ou um hidróxido de metal alcalino, como

hidróxido de sódio (NaOH).

ALSANTE et al.,

2007

Utilizar solução de NaOH, LiOH ou KOH em concentração 0,1 a 1 mol L-1 como agente

estressante, expondo a amostra em solução ou suspensão.

BAERTSCHI,

2005

Expor a amostra a uma solução de NaOH a 0,1 mol L-1 ou outra em pH 8,0, em temperatura acima

de 70°C, de 1 a 7 dias.

SEHRAWAT et

al., 2010 Solução do fármaco a 1 mg mL-1 em NaOH 0,1 a 1 mol L-1, em temperatura ambiente ou superior.

Oxidativa

ICH-Q1A(R2) Deve-se incluir a condição oxidativa no estudo (não informa como conduzi-lo).

ANVISA, 2015 Expor a amostra a peróxido de hidrogênio (H2O2) ou outro agente oxidante.

ALSANTE et al.,

2007

Pode ser conduzido em atmosfera de O2 ou na presença de peróxidos. Recomenda-se a utilização

de iniciadores de radicais livres. Utilizar solução da substância em solvente adequado com 5 a

20% do iniciador de radical livre em pressão atmosférica. Pode-se aumentar a pressão

atmosférica do teste com O2 e aumentar a temperatura do sistema de modo a estressar ainda

mais a substância. Para sólidos utilizar uma comparação de ambiente de argônio vs ambiente de

oxigênio dentro de um ambiente fechado.

P á g i n a | 37

BAERTSCHI,

2005 Utilizar solução de 0,3% de H2O2 em temperatura ambiente, protegido da luz, de 1 a 7 dias.

SEHRAWAT et

al., 2010

Utilizar O2 e agente iniciador em acetonitrila:água 80:20 (v/v) a 40°C, de 1 a 7 dias; ou solução de

H2O2 0,3 a 3%, em temperatura ambiente, protegido da luz, por algumas horas até 7 dias.

Térmica

ICH-Q1A(R2) Incrementar 10°C acima do estudo de estabilidade acelerado

ANVISA, 2015

Térmica seca: devendo ser feita sem aumento de umidade no ambiente, sem dissolver o produto;

Térmica úmida: devendo ser feita no produto sem dissolver, mas com umidade relativa controlada

e acima da umidade ambiente, não necessitando ser feita para formas farmacêuticas líquidas e

semissólidas de base aquosa.

ALSANTE et al.,

2007

Sólido: 50°C ou mais e umidade relativa superior a 75%. Utilizar cinética de Arrhenius para

determinar a temperatura e duração adequada para a substância.

REYNOLDS et

al., 2002

Sólido: verificar a energia de ativação necessária para conduzir um estudo com incrementos de

temperatura que represente um ensaio relativo ao estudo acelerado.

BAERTSCHI,

2005 Sólido: expor a 70°C durante uma semana, pode-se utilizar umidade relativa e 75°C.

SEHRAWAT et

al., 2010 70°C e umidade relativa de 75% por mais de 2 semanas.

Fotolítica

ICH-Q1B

As amostras devem ser expostas, lado a lado, à luz, proporcionando uma iluminação de pelo

menos 1,2 milhões de lux.h e uma energia ultravioleta próximo integrada de pelo menos 200

watts.h.m-2. Deve-se expor ainda uma amostra controle (coberta com folha de alumínio). Utilizar

recipientes inertes e transparentes. Limitar a exposição caso haja extensiva decomposição e

aumentar a exposição em caso de substância fotoestáveis.

ANVISA, 2015 Deve ser feito variando-se a quantidade de lux hora e/ou watt hora por metro quadrado.

ALSANTE et al.,

2007

Para estudos de degradação forçada utilizar 2 vezes o recomendado pelo guia ICH-Q1B. Para

estudos em solução, deve-se utilizar a acetonitrila como solvente.

BAERTSCHI,

2005 Expor a amostra sólida e aquosa 2 a 3 vezes mais do que o recomendado pelo guia ICH-Q1B.

P á g i n a | 38

Tabela 2. Limites para notificação, identificação e qualificação.

Dose Máxima Diária1 Limites2

Limites de Notificação

≤ 1 g 0,10%

> 1 g 0,05%

Limites de Identificação

< 1 mg 1,0% ou 5 µg ATD, o que for menor

1 mg - 10 mg 0,5% ou 20 µg ATD, o que for menor

> 10 mg - 2 g 0,2% ou 2 mg ATD, o que for menor

> 2 g 0,10%

Limites de Qualificação

< 10 mg 1,0% ou 50 µg ATD, o que for menor

10 mg - 100 mg 0,5% ou 200 µg ATD, o que for menor

>100 mg - 2 g 0,2% ou 3 mg ATD, o que for menor

> 2 g 0,15% 1 Quantidade máxima do IFA administrado por dia.

2 Limites dos produtos de degradação são expressos como a porcentagem do IFA ou como

administração total diária (ATD) de um produto de degradação.

O(s) produto(s) de degradação com percentual acima dos limites de

notificação estabelecidos deverá(ão) ser reportado(s) no estudo de estabilidade e

estar incluído(s) no limite de impurezas totais. (BRASIL, 2015)

O(s) produto(s) de degradação com percentual ou valor correspondente

acima dos limites de identificação estabelecidos deverá(ão) ter sua estrutura química

identificada e realizada a quantificação individual. (BRASIL, 2015)

O(s) produto(s) de degradação com percentual ou valor correspondente

acima dos limites de identificação e abaixo dos limites de qualificação que apresentem

na sua estrutura química características que conduzam à classificação de produto

potencialmente tóxico deverá(ão) ter seu perfil de segurança estabelecido através da

avaliação da segurança biológica. (BRASIL, 2015)

2.9 Métodos Indicativos de Estabilidade (MIE)

Segundo o FDA (Food and Drugs Administration), em seu documento

“Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods Validation”, um Método

Indicativo de Estabilidade pode ser definido como

P á g i n a | 39

“um procedimento analítico quantitativo e validado que pode

monitorar, ao longo do tempo, os resultados dos estudos de

estabilidade e, com isso, detectar as mudanças nas

propriedades pertinentes da substância do fármaco e do

medicamento, de modo a garantir segurança, eficácia e

qualidade”.

São métodos específicos capazes de mensurar, ao longo do tempo, com

exatidão o teor do insumo farmacêutico ativo, produtos de degradação e outros

componentes de interesse, sem interferência.

De acordo com o Guia n°4/2015 da ANVISA (BRASIL, 2015), a

classificação de um método como indicativo de estabilidade também depende da

finalidade à qual ele é proposto. Um método pode ser indicativo de estabilidade

somente para teor, sendo capaz de quantificar um IFA em meio aos seus produtos de

degradação sem quantificar todos os produtos de degradação relevantes; ou somente

para produtos de degradação, sendo capaz de quantificar todos os produtos de

degradação relevantes, mas não o IFA; ou ainda indicativo de estabilidade para

ambos, ou seja, para teor e para produtos de degradação.

2.10 Quality by Design (QbD)

De acordo com definição da ICH (International Conference of

Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for

Human Use), em seu Guia ICH Q8 (R2), Quality by Design (QbD) pode ser definido

como

“uma abordagem sistemática para o desenvolvimento

farmacêutico que começa com objetivos pré-definidos e enfatiza

a compreensão do produto e do processo com base em ciência

sólida e gerenciamento de risco de qualidade”,

o que pode ser interpretado como o desenvolvimento de conhecimento com a

finalidade de permitir a definição de uma região robusta de trabalho conhecida como

P á g i n a | 40

Design Space, dentro do qual a garantia de qualidade é mantida mesmo com

pequenas modificações (BAERTSCHI et al., 2011). Para tal é necessária a

compreensão de como as variáveis de formulação e processo influenciam na

qualidade do produto. A estratégia de QbD identifica as características que são críticas

para a qualidade de determinado produto e avalia de maneira quantitativa os fatores

relacionados aos materiais e processos que afetam estas características, de modo a

produzir consistentemente o produto com as características desejadas (GAWADE et

al., 2013), ou seja, com a qualidade embutida.

Para a compreensão de como são aplicados os princípios de QbD, é

necessário introduzir a definição dos elementos citados mais frequentemente na área

de desenvolvimento farmacêutico, que são:

Quality Target Product Profile (QTPP): o QTPP é a base do projeto de

desenvolvimento do produto e é basicamente um resumo das características de

qualidade de um medicamento que idealmente devem ser alcançadas, levando em

conta a segurança e a eficácia do medicamento.

Critical Quality Attributes (CQA): são as propriedades ou

características físico-químicas, biológicas ou microbiológicas do produto acabado e

que devem estar dentro de um limite, intervalo ou distribuição adequada, de modo a

garantir a qualidade desejada do produto. Os CQA relevantes podem ser identificados

por um processo iterativo de gerenciamento e experimentação de risco de qualidade,

que avalia em que medida a sua variação pode afetar a qualidade do produto.

Critical Process Parameters (CPP): parâmetros de processo cuja

variabilidade impacta um atributo crítico de qualidade e, portanto, deve ser monitorado

ou controlado de forma a garantir que o processo produza a qualidade desejada.

Critical Material Attributes (CMA): propriedades fisico-químicas das

matérias-primas e materiais utilizados no processo, cuja variabilidade impacta um

atributo crítico de qualidade e, portanto, devem ser monitoradas ou controladas de

forma a garantir a qualidade desejada no produto final.

Risk Assessment (RA): é uma ferramenta para a identificação do risco

associado a cada um dos atributos de materiais e parâmetros do processo sobre os

CQA do produto. É uma tarefa multidisciplinar realizada com base no conhecimento

técnico da equipe sobre o produto e processo.

P á g i n a | 41

Design of Experiments (DoE): métodos de planejamento experimental

são ferramentas multivariadas que permitem determinar efeitos das variáveis de

entrada (CPP e CMA) sobre uma ou mais respostas (CQA), bem como as interações

entre estas variáveis. De acordo com DAS (2017) a abordagem do DoE em Analytical

Quality by Design inclui os seguintes estágios:

a. Triagem: este estágio identifica os vários parâmetros críticos do

processo (CPP) a serem considerados para os experimentos de otimização;

b. Otimização: as medidas quantitativas dos CQA são incorporadas e

transformadas, de modo a construir uma base para a compreensão cientifica da

relação entre as variáveis de entrada e as variáveis de saída, que mostrarão seu efeito

no desempenho do produto;

c. Seleção das ferramentas de DoE: deve ser ser feita com base no número

de CPP e no conhecimento científico sobre os parâmetros e os CQA.

d. Gráficos de superfície: gerado por modelos matemáticos e permitem

mostrar o impacto das CPP e CMA sobre os CQA.

e. Validação dos modelos: realizada pela condução de experimentos nas

condições previstas pelos modelos e comparação entre os valores reais e previstos.

Design Space (DS): combinação multidimensional de interação de

variáveis de entrada (CPP e CMA) que proporcionam a garantia de qualidade do

produto, ou seja, que garantem que os CQA sejam atingidos.

De uma maneira resumida, a aplicação dos princípios de QbD no

desenvolvimento de produtos farmacêuticos visa identificar os Atributos Críticos de

Qualidade (Critical Quality Attributes, CQA), os Parâmetros Críticos do Processo

(Critical Process Parameters, CPP) e os Atributos Criticos de Materiais (Critical

Material Attributes, CMA) e, com base em Avaliações de Risco (Risk Assessment,

RA), empregar métodos multivariados de Planejamento Experimental (Design of

Experiments, DOE) para conectar os CPP/CMA aos CQA e gerar o Design Space,

cujo objetivo é garantir medicamentos com a qualidade, eficácia, segurança bem

como flexibilidade regulatória esperados. (PRAMOD et al., 2016, ICH Q8 (R2)).

De acordo com Chaves (2017), a abordagem de desenvolvimento de

produtos por QbD é uma alternativa à abordagem tradicional, a qual é realizada de

forma empírica e impulsionada pelos resultados, o que pode originar problemas de

P á g i n a | 42

qualidade, reprodutibilidade e de fabricação de difícil identificação da causa raiz,

gerando um aumento de custo, principalmente na fase de escalonamento devido ao

desconhecimento das fontes de variabilidade. A Tabela 3 mostra uma comparação

entre as abordagens tradicional e por QbD.

Tabela 3. Comparação da abordagem tradicional com a abordagem de Quality by Design

TRADICIONAL QbD

Inicia com uma abordagem empírica de tentativa e erro.

Inicia com uma abordagem baseada em ciência com objetivos definidos.

Performance do método é avaliada durante a validação.

A performance é avaliada durante o estabelecimento dos ATP.

Pouco entendimento das variáveis analíticas.

Avaliação sistemática das variações individuais e suas interações.

Qualidade do método baseada na validação.

A qualidade é desenhada durante o desenvolvimento pela robustez e reprodutibilidade.

Verificação e transferência do método são atividades

separadas.

Qualificação de desempenho e verificação são atividades contínuas.

Não existe flexibilidade regulatória às mudanças.

Alterações dentro Design Space não são consideradas mudanças e não exigem submissões

pós-registro.

Não há espaço para melhorias. Flexibilidade na implementação de melhorias.

2.11 Analytical Quality by Design

Recentemente o conceito de Quality by Design foi expandido para a área

analítica gerando a vertente denominada Analytical Quality by Design (A-QbD), sendo

os mesmos princípios então aplicados ao desenvolvimento de métodos. De acordo

com Jayagopal & Shivashankar (2017) e Peraman et al. (2015) é possível fazer uma

comparação entre QbD e A-QbD com relação aos objetivos dos elementos em cada

uma dessas abordagens. Essa comparação pode ser vista na Tabela 4.

P á g i n a | 43

Tabela 4. Comparação entre Quality by Design e Analytical Quality by Design. (JAYAGOPAL & SHIVASHANKAR, 2017; PERAMAN et al., 2015).

Quality by Design Analytical Quality by Design

Etapa Elemento Objetivo Elemento Objetivo

1

Quality

Target

Profile

(QTPP)

Definir a forma de

dosagem, a

farmacocinética, a

estabilidade esperada

da formulação

Analytical

Quality

Profile (ATP)

Definir o que quantificar e

como quantificar.

2

Critical

Quality

Attributes

(CQA)

Definir os atributos

físicos, a

identificação, o

ensaio, a dissolução,

os requisitos de perfil

de impurezas e outras

expectativas de

qualidade

Critical

Quality

Attributes

(CQA)

Definir os requisitos de

separação, identificação,

precisão, exatidão e

robustez.

3

Critical

Process

Parameters

(CPP)

Identificar os

parâmetros do

processo que podem

ter impacto na

qualidade, como nível

de agitação,

temperatura, pH.

Critical

Method

Parameters

(CMP)

Identificar os parâmetros do

método que poderiam ter

impacto no desempenho do

método, como o pH do

tampão, a temperatura do

forno, o volume da injeção,

a concentração do

modificador orgânico.

4

Critical

Material

Attributes

(CMA)

Avaliar matérias-

primas utilizadas na

formulação

Critical

Material

Attributes

(CMA)

Avaliar os reagentes e as

concentrações utilizadas na

análise.

5

Design of

Experiments

(DoE)

Identificar efeitos dos

fatores, construir

modelos e definir um

design space.

Design of

Experiments

(DoE)

Identificar efeitos dos

fatores, construir modelos e

definir um design space.

6 Process

validation

Estabelecer provas

práticas de que um

processo é confiável

trazendo produtos de

qualidade.

Method

validation

Estabelecer provas práticas

de que o método é

confiável trazendo

resultados de qualidade.

7 Control

strategy

Garantir a produção

do produto com

qualidade desejada

Control

strategy

Garantir o desempenho do

método com os resultados

adequados.

Um exemplo de Design Space, também denominado Method Operable Design

Region (MODR) em metodologias analíticas, é mostrado na Figura 10, onde é possível

P á g i n a | 44

observar em amarelo uma região que satisfaz dois atributos de qualidade

selecionados, neste exemplo, a pureza e simetria de pico.

Figura 10. Exemplo de Design Space aplicado para dois CQA (fator cauda e pureza de pico).

2.12 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência é muito importante dentro do

escopo das técnicas de separação, tendo em vista a grande capacidade de separar e

quantificar misturas com um grande número de substâncias similares em poucos

minutos, com alta resolução, eficiência e detectabilidade. É um tipo de cromatografia

que emprega colunas recheadas com uma grande variedade de materiais e uma fase

móvel que é eluída sob altas pressões. (COLLINS et al., 2006)

As fases estacionárias mais utilizadas em HPLC para separação de

compostos orgânicos operam no modo fase reversa e são baseadas em sílica com

grupos octadecil quimicamente ligados (C18). As fases móveis utilizadas em HPLC em

fase reversa são misturas de metanol:água, acetonitrila:água ou tetraidrofurano:água

com ajuste de seletividade e força cromatográfica da fase móvel para obter resolução

(Rs) adequada para que ocorra a separação de todos os picos cromatográficos. A

adição de modificadores, como ácido fórmico, acetato de amônio, ou a utilização de

P á g i n a | 45

tampões, ocorre de modo a desfavorecer a ionização dos analitos através do ajuste

de pH do meio e, com isso, melhorar suas interações com a fase estacionária. (SILVA

& COLLINS, 2011). A cromatografia líquida de alta eficiência tornou-se a técnica de

cromatografia mais popular em laboratórios farmacêuticos (SIDDIQUI et al., 2017).

Historicamente, a cromatografia líquida foi definida na primeira década do século

passado, pelos trabalhos do botânico russo, Mikhail S. Tswett. Seus estudos eram

focalizados na separação de pigmentos em uma coluna recheada com partículas,

pigmentos estes extraídos de plantas usando solventes (LANÇAS, 2009; COLLINS,

2009). Geralmente, atribui-se a Csaba Horváth ao redor de 1970 a proposta da sigla

HPLC (inicialmente significando “High Pressure Liquid Chromatography” e,

posteriormente, com a evolução da técnica, “High Performance Liquid

Chromatography”) (LANÇAS, 2009). Em 1975, a instrumentação de cromatografia

líquida foi descrita pela Farmacopeia dos Estados Unidos. (ADAMOVICS, 1997)

Métodos baseados em HPLC são adequados para uma variedade de

compostos orgânicos de polaridade média a alta e volatilidade baixa, ou ainda elevada

instabilidade térmica, características essas que estão relacionadas a maioria dos

fármacos e que seriam incompatíveis com a análise em cromatografia gasosa, por

exemplo. (SILVA & COLLINS, 2011)

2.12.1. Parâmetros cromatográficos

2.12.1.1. Fator de retenção, k

Na cromatografia em coluna, o fator de retenção é determinado pela razão

das quantidades das suas moléculas que ficam retidas na fase estacionária nS, ou

percorrendo a coluna na fase móvel, nM; ou ainda pela razão dos tempos em que elas

ficam na fase estacionária e na fase móvel, conforme a Equação 1 (COLLINS et al.,

2006)

𝑘 = 𝑛𝑆

𝑛𝑀=

(𝑡𝑅 − 𝑡0)

𝑡0=

𝑡𝑅′

𝑡0 (1)

onde tR é o tempo de retenção do analito, tR‘ é o tempo de retenção ajustado, e t0 é o

tempo de retardamento da fase móvel.

P á g i n a | 46

2.12.1.2. Fator de separação (ou de seletividade), α

O fator de separação (α) compara a retenção de um componente (tR1’) com

o de outro mais retido (tR2’). Indica o quanto a fase estacionária, ou a fase móvel,

interage com uma substância em relação a outra, e até que grau o sistema

cromatográfico está resolvendo (separando) essas substâncias. O cálculo de fator de

separação é feito a partir da Equação 2. (PALLASTRELLI, 2013)

α =𝑡𝑅2′

𝑡𝑅1′ (2)

2.12.1.3. Resolução, Rs

Em cromatografia em coluna, a resolução é calculada a partir da distância

que separa os pontos máximos dos picos e das médias das larguras de suas

respectivas bases, wb, ou das larguras a meia altura, wh., conforme exemplificado na

Figura 11. A separação dos picos de acordo com a resolução é mostrada na Figura

12; Rs = 1,0 indica 2% de sobreposição (coeluição) dos picos; Rs = 1,25 é aceita para

fins quantitativos e Rs = 1,5 indica separação completa até a linha de base. O cálculo

da resolução é feito a partir da Equação 3. (COLLINS, et al., 2006)

𝑅𝑠 =2(𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1)

(𝑤𝑏2 + 𝑤𝑏1)=

1,177(𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1)

(𝑤ℎ2 + 𝑤ℎ1) (3)

Figura 11. Medidas associadas ao cálculo da resolução.

P á g i n a | 47

Figura 12. Separação de picos de acordo com a resolução.

2.12.1.4. Fator cauda (T)

A exatidão na integração do pico é prejudicada quando o mesmo apresenta

cauda, devido à dificuldade de se determinar em qual posição do tempo o pico termina.

A Equação 4 é utilizada no cálculo de fator cauda, de acordo com o exemplo mostrado

na Figura 13, onde a e b são as medidas das metades do pico a 5% de altura a partir

da linha de base. (PALLASTRELLI, 2013)

𝑇 =𝑎 + 𝑏

2. 𝑎 (4)

Figura 13. Medidas associadas ao cálculo do fator cauda.

2.12.1.5. Eficiência (N)

A eficiência representada por um cromatograma é medida em termos de

número de pratos. Um prato pode ser considerado como uma etapa de equilíbrio entre

as duas fases, análogo aos pratos da teoria de destilação. Quanto maior for o número

de pratos, maior será o número de equilíbrios e, consequentemente, maior será a

P á g i n a | 48

eficiência de separação. A Equação 5 mostra como é feito o cálculo do número de

pratos, em cromatografia em coluna. (COLLINS et al., 2006)

𝑁 = 16 (𝑡𝑅

𝑤𝑏)

2

= 5,545 (𝑡𝑅

𝑤ℎ)

2

(5)

O número de pratos pode ser afetado por diversos fatores como a

concentração da amostra, o tipo de soluto e o tamanho da coluna, desta forma torna-

se difícil a comparação deste parâmetro para diferentes colunas. Deste modo, a

comparação de eficiência entre colunas é feita a partir da altura equivalente a um prato

(H), dada pela razão entre o comprimento da coluna (L) e o número de pratos (N)

(Equação 6). (COLLINS et al., 2006)

𝐻 =𝐿

𝑁 (6)

2.13. Validação de métodos analíticos

A validação de um procedimento analítico tem como objetivo demonstrar a

adequabilidade da metodologia para o propósito pretendido (Validation os analytical

procedures, Q2(R1) ICH), isto é, a validação deve comprovar que o método analítico

produz resultados seguros e é adequado ao escopo a que se destina (BRASIL, 2017).

Segundo a RDC 166/17 da ANVISA (BRASIL, 2017), os figuras de mérito

típicas a serem considerados para validação dependem do ensaio a ser realizado e

estão dispostos na Tabela 5.

P á g i n a | 49

Tabela 5. Figuras de mérito recomendadas de acordo com o tipo de ensaio a ser realizado.

Figura de mérito avaliada

Identificação

Teste de Impurezas Doseamento - dissolução

(quantificação) - uniformidade de

conteúdo - potência

Quantitativo Ensaio limite

Exatidão não sim não sim

Precisão Repetibilidade

não sim não sim

Precisão Intermediária

não sim (1) não sim (1)

Seletividade (2) sim sim sim sim

Limite de Detecção não não (3) sim não

Limite de Quantificação

não sim não não (3)

Linearidade não sim não sim

Intervalo linear não sim não sim

(1) Nos casos em que foi conduzida a reprodutibilidade, não é necessário conduzir a precisão intermediária. (2) Nos casos de ensaios de identificação, pode ser necessária a combinação de dois ou mais procedimentos analíticos para atingir o nível necessário de discriminação. (3) Pode ser necessário em alguns casos.

2.13.1. Figuras de mérito da validação de métodos analíticos

2.13.1.1. Seletividade

A seletividade tem como objetivo garantir a identidade do ativo que se

deseja determinar (LEITE, 2008). Deve ser comprovada por meio da sua capacidade

de identificar ou quantificar o analito, inequivocamente, na presença de substâncias

que podem estar presentes na amostra, como impurezas, diluentes e componentes

da amostra (BRASIL, 2017).

Para demonstrar a seletividade de um método cromatográfico, realizam-se

análises com injeções das soluções na presença e na ausência do analito. A matriz

da amostra também é chamada de placebo ou excipientes, e refere-se à mistura de

todas as substâncias que compõem a amostra, excetuando o analito de interesse, nas

mesmas condições previstas para a solução teste. Segundo a legislação, devem ser

realizadas análises com soluções de: branco ou diluente (solvente da amostra); fase

móvel; padrão do analito puro; analito com seus excipientes; excipientes; amostra;

P á g i n a | 50

produtos de degradação identificados e não identificados; amostra e 00excipientes

oriundos de estudos de degradação e subprodutos de síntese. (PALLASTRELLI,

2013)

O método é considerado seletivo se os cromatogramas das soluções que

não contêm o analito não possuírem respostas no tempo de retenção dos picos de

interesse, e se a resposta desses picos não for afetada pelos demais solutos testados.

Recomenda-se ainda, comprovar a pureza de pico para demonstrar que o pico

cromatográfico corresponde a uma única substância. (PALLASTRELLI, 2013)

2.13.1.2. Linearidade

A linearidade é a capacidade que o método possui de demonstrar que os

resultados experimentais obtidos são diretamente proporcionais à concentração do

analito na amostra, respeitando um intervalo especificado (BRASIL, 2017). A

linearidade deve ser demonstrada por meio de sua capacidade de obter respostas

analíticas diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, sendo que

toda a faixa estabelecida para o método deverá respeitar uma relação linear (BRASIL

2017).

Os experimentos devem ser realizados utilizando-se, no mínimo, 5

concentrações diferentes da Substância Química de Referência (SQR) para soluções

preparadas em, no mínimo, triplicata (BRASIL, 2017). A faixa recomendada para a

definição das concentrações é motivo de discussão. Para teor, a ANVISA recomenda

uma faixa de trabalho de 80% a 120%; a IUPAC de 0% a 150% ou de 50% a 150%; e

o ICH define 20% do valor declarado (LEITE, 2008).

2.13.1.3. Precisão

O primeiro passo para a verificação da confiabilidade de uma análise é

investigar se análises repetidas fornecem resultados concordantes, considerando

uma margem de variabilidade pré-determinada. Ao resultado desta análise é dado o

nome de precisão, que deve ser realizada de maneira sistêmica (repetibilidade) e em

situação adversa (precisão intermediária) (LEITE, 2008), como em dias diferentes e

realizada por analistas diferentes, por exemplo.

P á g i n a | 51

De acordo com a RDC 166/2017 (BRASIL, 2017), a precisão deve ser

demonstrada pela dispersão dos resultados obtidos, calculando-se a estimativa do

desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV) da série de medições de

acordo com a Equação 7.

𝐶𝑉 = 𝐷𝑃𝑅(%) =𝐷𝑃

𝐶𝑀𝐷𝑥100 (7)

onde DP é a estimativa do desvio padrão e CMD é a concentração média determinada.

Existem três níveis de precisão: a repetibilidade, a precisão intermediária e

a reprodutibilidade. Os dois primeiros serão discutidos abaixo enquanto o último é

conduzido em ensaios interlaboratoriais, ou seja, diferentes laboratórios realizando a

mesma análise da mesma amostra.

2.13.1.4. Repetibilidade

A repetibilidade é avaliada sob as mesmas condições de operação, analista

e instrumentação, em uma única corrida analítica e utilizando-se, no mínimo, nove

determinações, contemplando três níveis (baixo, intermediário e alto) do intervalo

linear em triplicata. Alternativamente é possível realizar 6 réplicas a 100% da

concentração do teste, com amostras individualmente preparadas. (BRASIL, 2017). A

CP N°129 de 2016 (BRASIL, 2016) estabelece que o valor limite aceito, para

repetibilidade, deve ser igual a dois terços do valor calculado a partir da equação de

Horwitz (Equação 8).

𝐷𝑃𝑅 (%) = 2(1−0,5 log 𝐶) (8)

onde C = concentração em mesma unidade de fração mássica (µg µg-1 ou mg mg-1 ou

g g-1 e assim por diante).

P á g i n a | 52

2.13.1.5. Precisão intermediária

A precisão intermediária é avaliada realizando-se o mesmo experimento

descrito para repetibilidade, contudo, em pelo menos dois dias distintos e operadores

diferentes. (BRASIL, 2017). A CP N°129 de 2016 (BRASIL, 2016) estabelece que o

valor limite aceito, para precisão intermediária, deve ser igual ao valor calculado a

partir da equação de Horwitz (Equação 8)

2.13.1.6. Exatidão

A exatidão traduz a concordância dos valores experimentais com o valor

aceito como verdadeiro (LEITE, 2008). Deve ser verificada a partir de, no mínimo, 9

determinações, contemplando o intervalo linear do método analítico, ou seja, 3

concentrações (baixa, média e alta), com 3 réplicas em cada nível. (BRASIL, 2017).

A exatidão deve ser expressa pela relação percentual de recuperação do

analito de concentração conhecida adicionado à amostra ou pela relação entre a

concentração média, determinada experimentalmente, e a concentração teórica

correspondente. Essas relações são expressas pela Equação 9. (BRASIL, 2017).

𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜(%) = 𝐶𝑀𝐸

𝐶𝑇𝑥100

=𝐶𝐴 (𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑎) − 𝐶𝐴 (𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑜 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑜𝑥100 (9)

onde CME = concentração média experimental; CT = concentração teórica e CA =

concentração experimental do analito.

2.13.1.7. Intervalo

A faixa de trabalho ou intervalo deve ser estabelecida a partir dos estudos

de linearidade, juntamente com os resultados de precisão e exatidão, sendo

dependente da aplicação pretendida, conforme mostrado na Tabela 6.

P á g i n a | 53

Tabela 6. Faixa de trabalho de acordo com a aplicação pretendida

Aplicação Faixa de trabalho

Mínimo (%) Máximo (%)

Teor 80 120

Uniformidade de conteúdo 70 130

Dissolução -20* +20*

Determinação de impurezas LQ 120

Determinação de teor e impurezas LQ 120

* da concentração esperada a partir do perfil de dissolução.

2.13.1.8. Limite de Detecção (LD)

O limite de detecção é a menor quantidade do analito em uma amostra que

pode ser detectada (BRASIL, 2017) e pode ser determinado das seguintes maneiras:

Método visual: menor concentração para o qual é possível constatar a

presença do sinal do analito;

Razão sinal/ruído: deve ser maior do que 2:1;

Baseado em parâmetros da curva analítica: neste caso, deve ser

calculado a partir da Equação 10. (BRASIL, 2017)

𝐿𝐷 =3,3. 𝑠

𝐼𝐶 (10)

onde IC é a inclinação da curva analítica e s é a estimativa do desvio-padrão, que

pode ser obtido por três formas:

desvio padrão do intercepto com o eixo y de, no mínimo, 3 curvas

analíticas construídas com concentrações próximas ao LD;

desvio padrão residual da linha de regressão;

estimativa do ruído a partir da análise de amostras do branco.

2.13.1.9. Limite de Quantificação (LQ)

O limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra

que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis (BRASIL, 2017). Para

P á g i n a | 54

determinação deste parâmetro, deve ser seguido o mesmo procedimento adotado

para limite de detecção, sendo a razão sinal/ruído de no mínimo 10:1. (BRASIL, 2017)

Para determinações com base em parâmetros da curva analítica, o LQ

pode ser calculado pela Equação 11. (BRASIL, 2017)

𝐿𝑄 =10. 𝑠

𝐼𝐶 (11)

onde IC é a inclinação da curva analítica e s pode ser obtido da mesma maneira que

para o LD.

2.13.1.10. Robustez

De acordo com a RDC 166/2017 da ANVISA (BRASIL, 2017), a robustez é

realizada para avaliar se o método analítico é capaz de resistir a pequenas e

deliberadas variações das condições analíticas. Ainda que esteja descrito na RDC

166/2017 (BRASIL, 2017), a robustez não está presente entre os parâmetros a serem

considerados em uma validação analítica (Tabela 4).

Para cromatografia líquida, as condições a serem variadas para avaliação

da robustez do método são:

pH da fase móvel;

composição da fase móvel;

diferentes lotes ou fabricantes de colunas;

temperatura;

vazão da fase móvel.

P á g i n a | 55

3. OBJETIVO

O principal objetivo deste trabalho é desenvolver e validar um método

indicativo de estabilidade para uma associação de losartana potássica e besilato de

anlodipino, em conformidade com a legislação vigente no Brasil (BRASIL, 2015), e

otimizá-lo utilizando conceitos de Analytical Quality by Design.

P á g i n a | 56

4. JUSTIFICATIVA

Em 2005, a ANVISA determinou, em sua Resolução n°01 (BRASIL, 2005),

que as indústrias farmacêuticas deveriam realizar testes de estabilidade de produtos

farmacêuticos a fim de prever, determinar ou acompanhar o seu prazo de validade.

Estes testes devem contemplar a quantificação de produtos de degradação bem como

o método analítico correspondente.

Em seu Informe Técnico n° 01 de 15 de julho de 2008, a ANVISA definiu

como e em quais condições os chamados estudos de estresse deveriam ser

realizados, desconsiderando o fato de que substâncias ativas são estruturalmente

diferentes umas das outras e, consequentemente, a estabilidade dessas substâncias

também é diferenciada. Desta maneira, ao se limitar o modo de fazer os estudos, uma

determinada substância pode se mostrar completamente estável às condições

estabelecidas, ao passo que outra substância pode degradar-se completamente.

De modo a corrigir os equívocos cometidos em seu Informe Técnico n° 01,

e a fim de normatizar os estudos de estresse, a ANVISA lançou, em 2012, a Consulta

Publica n°11 (BRASIL, 2012). De modo a alinhar a legislação brasileira às práticas

internacionais, a ANVISA lançou, recentemente, a RDC n°53/2015 (BRASIL, 2015),

que estabelece parâmetros para a notificação, identificação e qualificação de produtos

de degradação em medicamentos com substâncias ativas sintéticas e semissintéticas,

classificados como novos, genéricos e similares.

Em 2016, a ANVISA foi aceita como membro do ICH e deverá se adequar

ao conjunto de cinco guias, no que diz respeito, principalmente, às ações de

Farmacovigilância, Pesquisa Clínica, implementação do Common Technical

Document (CTD) e do Medical Dictionary for Regulatory Activities (MedDRA).

Levando-se em conta a contemporaneidade do assunto, onde as indústrias

ainda estão se adequando às novas regras já sancionadas e à outras ainda que virão,

este trabalho visa demonstrar a importância e contribuir com a discussão acerca de

assuntos como o desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade e da

realização dos estudos de degradação forçada, bem como da definição do perfil de

degradação para uma associação de fármacos incompatíveis quimicamente, mas

muito relevantes do ponto de vista farmacológico.

P á g i n a | 57

Somado a isso, a aplicação de conceitos de Analytical Quality by Design,

já amplamente difundidos pelas principais agências reguladoras do mundo, como

FDA, EMA e PDMA, e que começa a ser conduzido pelo ICH, é uma oportunidade de

conhecimento do que há de mais recente e moderno em termos de garantia de

qualidade aplicada ao desenvolvimento farmacêutico.

P á g i n a | 58

5. MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Materiais

5.1.1 Reagentes e solventes

5.1.1.1 Grau cromatográfico

Acetonitrila, J. T. Baker;

Metanol, J. T. Baker;

Metanol, Honeywell;

Água deionizada por um sistema de purificação Millipore Direct Q, filtrada

em membrana de PTFE de porosidade 0,22 µm.

5.1.1.2 Grau analítico

Formiato de amônio (Fluka);

Acetato de amônio (J. T. Baker);

Ácido acético (Synth);

Ácido fórmico (Synth);

Ácido clorídrico (Vetec);

Hidróxido de sódio (Ecibra);

Peróxido de hidrogênio (Synth);

Sulfato de cobre (Honeywell).

5.1.2 Substâncias químicas de referência (padrões)

Losartana potássica; N° CAS: 124750-99-8; Pureza: ≥ 99,5%, Sigma

Aldrich. Lote: LRAA4718. Validade 31/12/2019;

Besilato de anlodipino; N° CAS: 111470-99-6; Pureza ≥ 98,0%, Sigma

Aldrich. Lote: LRAA9004. Validade: 31/12/2020.

P á g i n a | 59

5.1.3 Medicamentos

Produto farmacêutico comercial, LOTAR®, da farmacêutica Aché, na

apresentação de cápsula, onde cada cápsula contém: 50 mg de losartana

potássica e 6,944 mg de besilato de anlodipino (equivalente a 5 mg de

anlodipino base);

Insumo farmacêutico ativo (IFA) de losartana potássica, Galena;

Insumo farmacêutico ativo (IFA) de besilato de anlodipino, Purifarma.

5.1.4 Equipamentos

Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência, Waters (Alliance 2695),

equipado com desgaseificador in-line, com quatro bombas e injetor

automático. Detector por arranjo de fotodiodos (PDA) Waters 2998 (Figura

14);

Forno Yamato modelo ADP-21;

Medidor de pH - 827 pH lab, Metrohm;

Aparelho de ultrassom, Logen Scientific;

Balança analítica CP225D, com precisão de quatro casas decimais,

Sartorius;

Membranas filtrantes descartáveis de PTFE de porosidade 0,45 µm para

fase móvel, Millipore;

Materiais de laboratório como balões volumétricos, provetas, béqueres,

pipetas, erlenmeyers, almofariz com pistilo, kitasato, vials, seringas;

Micropipeta, de 100 a 1000 µL e de 1000 a 5000 µL, Eppendorf;

Filtro de seringa de PTFE de porosidade 0,45 µm, Analítica;

Coluna cromatográfica XTerra MS C18 3,5 µm – 3,0x100 mm, Waters;

Coluna cromatográfica CORTECS C18+ 2.7 µm – 4,6x150 mm, Waters;

Coluna cromatográfica XSelect HSS C18 5 µm – 4,6x150 mm, Waters;

Coluna cromatográfica Nova-Pak C18 4 µm – 3,9x150 mm, Waters;

Coluna cromatográfica XSelect CSH Fluoro-Fenil 3,5 µm – 4,6x150 mm,

Waters;

P á g i n a | 60

Figura 14. HPLC Waters Alliance 2695 com detector por arranjo de fotodiodos (PDA) Waters 2998.

5.1.5 Softwares

Sistema de aquisição e processamento de dados para cromatografia

líquida de alta eficiência e espectrometria de massas (MassLynx v4.1,

Waters).

Software de processamento estatístico de dados do planejamento

experimental Design-Expert® v10, STAT-EASE, 2017.

Software de análises estatísticas, realizadas no escopo da validação

analítica (Action Stat, ESTATCAMP, 2018);

Editor de planilhas eletrônicas (Microsoft Office Excel 2013).

5.2 Métodos

5.2.1 Testes de sensibilidade dos fármacos à degradação

Inicialmente, foram realizados testes de sensibilidade dos fármacos em

condições de estresse combinado (agente estressante + temperatura) para identificar

se os mesmos eram, de fato, suscetíveis a degradação forçada. Para isto, soluções

de ácido clorídrico (HCl) a 1 mol L-1, hidróxido de sódio (NaOH) a 1 mol L-1 e peróxido

P á g i n a | 61

de hidrogênio (H2O2) a 3% (v/v) foram adicionadas às soluções aquosas e metanólicas

dos IFA, conforme descrito a seguir.

Solução estoque metanólica: preparou-se uma solução 3 mg mL-1

transferindo-se 30 mg do IFA para um balão volumétrico de 10 mL e completando-se

o volume do balão com uma solução de metanol:tampão acetato de amônio 10 mmol

L-1 pH = 5, 60:40 (v/v). A solução foi homogeneizada em ultrassom por 5 minutos.

Solução estoque aquosa: preparou-se uma solução 1 mg mL-1 transferindo-

se 25 mg do IFA para um balão volumétrico de 25 mL e completando-se o volume do

balão com água deionizada. A solução foi homogeneizada em ultrassom por 5

minutos.

Os experimentos foram realizados transferindo-se 1 mL da solução estoque

e 1 mL do agente estressante para balão volumétrico de 10 mL. Em seguida,

submeteu-se o meio reacional ao aquecimento em banho-maria a 60°C por 2 horas,

conforme ilustrado na Figura 15. Após este período, o meio foi neutralizado, caso

necessário, e o balão volumétrico teve seu volume completado com a fase móvel.

Figura 15. Ilustração dos ensaios de sensibilidade dos fármacos à degradação.

Empregou-se modo de eluição isocrático, utilizando-se metanol:tampão

acetato de amônio 10 mmol L-1 pH = 5, 60:40 (v/v) como fase móvel, vazão de 1 mL

min-1, temperatura do forno a 25°C, volume de injeção = 10 µL e detecção em 237 nm.

A coluna cromatográfica utilizada foi uma coluna de fase reversa Symmetry C18

(WAT045905) 5 µm 4,6 mm x 150 mm (Waters).

P á g i n a | 62

5.2.2 Triagem para pH, modificador orgânico e colunas cromatográficas

Realizou-se uma triagem para avaliar a influência do pH do tampão (de 2,5

a 6,0), o modificador orgânico (acetonitrila e metanol) a ser empregado na fase móvel

e a química de colunas de fase reversa com diferentes características, de acordo com

a fabricante:

i. XTerra MS C18 3,5 µm – 3,0x100 mm, com partícula híbrida de primeira

geração, que confere maior estabilidade química quando comparado aos suportes

convencionais, podendo ser utilizado em uma faixa ampla de pH e temperatura.

ii. CORTECS C18+ 2,7 µm – 4,6x150 mm, são de propósito geral,

apresentam núcleos rígidos, não porosos, cobertos por uma camada porosa de

caminhos curtos de difusão, conferindo alta eficiência, retenção equilibrada de ácidos,

bases e neutros, em pH abaixo de 7,0.

iii. XSelect HSS C18 5 µm – 4,6x150 mm, com tecnologia de partícula HSS

(High Streght Silica ou sílica de alta resistência) é uma coluna de fase ligada, de

propósito geral, que oferece formato de pico superior para compostos básicos. São

totalmente capeadas e de alta cobertura.

iv. Nova-Pak C18 4 µm – 3,9x150 mm, com partícula de sílica convencional,

é uma coluna de propósito geral que, comparada a uma coluna com partícula de 5

µm, oferece maior resolução, maior eficiência e corridas mais rápidas;

v. XSelect CSH Fluoro-Fenil 3,5 µm – 4,6x150 mm, com tecnologia CSH

(Charge Hybrid Surface ou híbrida de superfície carregada), projetada para maximizar

as diferenças de seletividade.

Solução teste: foi preparada uma solução teste, transferindo-se 10 mg de

losartana potássica e besilato de anlodipino, e 1 mg de uracila para um balão de 10

mL. O balão teve seu volume completado com uma solução de metanol:tampão

formiato de amônio 10 mmol L-1 50:50 (v/v) e foi levado ao ultrassom, por 5 minutos,

para homogeneização. A uracila foi utilizada apenas para determinação do tempo de

retardamento da fase móvel.

Soluções-tampão (pH 2,5 – 4,0): foram preparadas soluções tampão a 10

mmol L-1 em pH 2,5, 3,0 e 4,0, transferindo-se 0,612 g de formiato de amônio (97%)

para um balão volumétrico de 1 L, cujo volume foi completado com água deionizada.

P á g i n a | 63

Os valores de pH foram alcançados adicionando-se ácido fórmico, sob agitação

constante, e com monitoramento através de um medidor de pH.

Soluções-tampão (pH 5,0 – 6,0): foram preparadas soluções tampão a 10

mol L-1 em pH 5,0 e 6,0, transferindo-se 0,755 g de acetato de amônio (98%) para um

balão volumétrico de 1 L, cujo volume foi completado com água deionizada. Os pH

foram alcançados pipetando-se ácido acético, sob agitação constante, e com

monitoramento através de um medidor de pH.

As condições cromatográficas utilizadas foram: volume de injeção de 10

µL, temperatura do forno da coluna de 25°C, detecção em 237 nm e vazão de 1 mL

min-1. A fase móvel aquosa utilizada foi tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 e um

programa de eluição por gradiente conforme mostrado na Tabela 7.

Tabela 7. Programa de eluição por gradiente empregado na etapa de triagem.

Tempo (min) Fase orgânica (%) Tipo de gradiente

0 – 25 10 → 90 Linear

25 – 35 90 patamar

5.2.3 Curva de van Deemter

Selecionada a coluna cromatográfica mais promissora para os

experimentos, foi construída uma curva de van Deemter para determinar a faixa de

vazão que ofereceria melhor eficiência para esta coluna.

Solução teste: foi preparada uma solução teste, transferindo-se 2 mg de

naftaleno e 6 mg de uracila para um balão volumétrico de 10 mL, que teve seu volume

completado com a fase móvel. Levou-se ao ultrassom, por 5 minutos, para

homogeneização.

As condições cromatográficas utilizadas foram: volume de injeção de 10

µL, temperatura do forno da coluna em 25°C e detecção em 275 nm, onde o naftaleno

apresenta máximo de absorção. A fase móvel empregada foi acetonitrila:água 55:45,

(v/v) em modo de eluição isocrático. O ensaio foi realizado variando-se a vazão de 0,1

a 1,9 mL min-1.

P á g i n a | 64

5.2.4 Estudos de degradação forçada

De acordo com Ito (2012), não há padronização na condução de estudos

de degradação forçada, conforme mostrado na Tabela 1, onde se observa uma grande

variedade de referências bibliográficas com diferentes recomendações.

Desta maneira, buscou-se, com o auxílio dessas recomendações, delinear

um conjunto de procedimentos que fosse adequado para a realização do estudo de

degradação forçada para a losartana potássica e o besilato de anlodipino.

5.2.4.1 Estudo de degradação forçada em solução

Com base nos resultados obtidos no teste de sensibilidade (ítem 5.2.1),

prepararam-se os ensaios de degradação forçada em condições ácida, básica e

oxidativa para o besilato de anlodipino, sabendo-se que ele é sensível a estas

condições e apenas em condição oxidativa para losartana potássica.

Diluente da solução estoque: acetonitrila:água 70:30 (v/v), uma vez que os

analitos apresentam elevada solubilidade nesta proporção dos solventes.

Diluente da amostra: metanol:tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 em

pH 3,5, 50:50 (v/v), uma vez que se assemelha à fase móvel utilizada.

Solução estoque de losartana potássica: preparou-se uma solução a 5 mg

mL-1, transferindo-se 50 mg de losartana potássica para um balão volumétrico de 10

mL e completando-se o volume do balão com diluente da solução estoque. A solução

foi homogeneizada em ultrassom por 5 minutos.

Solução estoque de besilato de anlodipino: preparou-se uma solução a 5

mg mL-1, transferindo-se 50 mg de besilato de anlodipino para um balão volumétrico

de 10 mL e completando-se o volume do balão com diluente da solução estoque. A

solução foi homogeneizada em ultrassom por 5 minutos.

Ensaio de degradação forçada ácida: transferiu-se 1 mL da solução

estoque e 0,5 mL de HCl a 0,5 mol L-1 para um balão volumétrico de 5 mL. O balão

volumétrico foi mantido no armário, conforme ilustrado na Figura 16, por períodos de

tempo pré-definidos (10 minutos, 1, 4 e 7 dias) e, após estes períodos, neutralizado e

P á g i n a | 65

completado o volume com diluente da amostra. A amostra foi homogeneizada em

ultrassom por 5 minutos e injetada no cromatógrafo a líquido.

Figura 16. Ilustração dos ensaios de degradação forçada realizados em solução.

Ensaio de degradação forçada básica: transferiu-se 1 mL da solução

estoque e 0,5 mL de NaOH 0,5 mol L-1 para um balão volumétrico de 5 mL. O balão




ultrassom por 5 minutos e injetada no cromatógrafo a líquido.

Ensaio de degradação forçada oxidativa: transferiu-se 1 mL da solução

estoque e 0,5 mL de H2O2 a 3% para um balão volumétrico de 5 mL. O balão




ultrassom por 5 minutos e injetada no cromatógrafo líquido.

As condições cromatográficas utilizadas foram: volume de injeção de 5 µL,

temperatura do forno de coluna de 30°C, vazão de 1,0 mL min-1, detecção em 237 nm.

A fase móvel utilizada foi metanol e tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 em pH

3,5 e uma programação de gradiente exploratória conforme mostrado na Tabela 8.

A coluna cromatográfica utilizada foi uma XSelect CSH Fluoro-Fenil 3,5 µm

– 4,6x150 mm.

P á g i n a | 66

Tabela 8. Programa de eluição por gradiente empregado nas análises das amostras

degradadas.

Tempo (min) Metanol (%) Tipo de gradiente

0 - 25 10 → 85 linear

25 - 35 85 patamar

Para determinação do teor dos analitos nas amostras, injetou-se uma

solução padrão contendo losartana potássica e besilato de anlodipino a 1 mg mL-1,

em sextuplicata. A média aritmética das áreas foi utilizada para o cálculo do teor por

meio da Equação 12.

𝑇𝑒𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝐼𝐹𝐴(%) = (Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑜 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜)𝑥(𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜)

(Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜)𝑥(𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜)𝑥100 (12)

5.2.4.2 Seleção do comprimento de onda

No decorrer do estudo de degradação forçada, observou-se a necessidade

de selecionar um comprimento de onda onde fosse possível detectar o maior número

de picos de produtos de degradação. Para isto, realizou-se a análise de uma mistura

contendo alíquotas de igual volume de amostras degradadas, provenientes do

experimento descrito em 5.2.4.1. Homogeneizou-se a mistura em ultrassom por 5

minutos e analisou-se no cromatógrafo a líquido.

As condições cromatográficas utilizadas foram as mesmas descritas no

item 5.2.4.1, variando-se o comprimento de onda de detecção de 200 a 375 nm.

5.2.4.3 Estudo de degradação forçada em suspensão

Com base nos resultados obtidos nos ensaios de degradação em solução

(item 5.2.4.1), prepararam-se os ensaios de degradação forçada em suspensão nas

condições ácida e básica para o besilato de anlodipino, sabendo-se que ele é sensível

a estas condições e apenas em condição oxidativa para losartana potássica. Os

tempos de exposição às condições de estresse foram definidos de acordo com os

resultados obtidos no estudo de degradação forçada em solução (5.2.4.1).

P á g i n a | 67

Diluente da amostra: metanol:tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 em

pH 3,5, 50:50 (v/v), uma vez que se assemelha a fase móvel utilizada.

Degradação forçada ácida para besilato de anlodipino: transferiu-se 10 mg

do fármaco e 1 mL de HCl a 0,5 mol L-1 para um mesmo balão volumétrico de 10 mL,

formando-se uma suspensão, conforme ilustrado na Figura 17. O balão volumétrico

foi mantido no armário por 7 dias e, após este período, neutralizado e completado o

volume com o diluente da amostra. A amostra foi homogeneizada em ultrassom por 5

minutos.

Figura 17. Ilustração dos ensaios de degradação forçada realizados em suspensão.

Degradação forçada básica para besilato de anlodipino: transferiu-se 10 mg

do fármaco e 1 mL de NaOH a 0,5 mol L-1 para um mesmo balão volumétrico de 10

mL, formando-se uma suspensão, conforme ilustrado na Figura 17. O balão

volumétrico foi mantido no armário por 3 dias e, após este período, neutralizado e


ultrassom por 5 minutos.

Degradação forçada oxidativa para losartana potássica: transferiu-se 10

mg do fármaco e 1 mL de H2O2 a 3% para um mesmo balão volumétrico de 10 mL,

formando-se uma suspensão, conforme ilustrado na Figura 17. O balão volumétrico

foi mantido no armário por 1 dia e, após este período, completado o volume com

diluente da amostra. A amostra foi homogeneizada em ultrassom por 5 minutos.

De modo qualitativo, transferiu-se para um mesmo vial alíquotas de igual

volume das amostras degradadas, após os tempos de exposição descritos.

Homogeneizou-se a mistura em ultrassom por 5 minutos e analisou-se no

cromatógrafo a líquido.

P á g i n a | 68

Repetiu-se o procedimento após 1 semana a fim de se avaliar a

repetibilidade do ensaio.

As condições cromatográficas utilizadas foram as mesmas descritas no

item 5.2.4.1, com detecção em 254 nm.

5.2.5 Preparo da amostra

Antes de iniciar a etapa de desenvolvimento do método, foi necessário

obter uma amostra representativa, na qual fosse possível detectar o maior número de

produtos de degradação formados tanto para losartana potássica quanto para besilato

de anlodipino em um mesmo cromatograma.

De modo qualitativo, transferiu-se para um mesmo vial alíquotas de igual

volume das amostras de degradação forçada em solução, onde se observou

degradação num intervalo de 10 a 30%. Homogeneizou-se a mistura em ultrassom

por 5 minutos e utilizou-se na etapa de desenvolvimento e otimização da qualidade e

eficiência da separação cromatográfica do método.

5.2.6 Desenvolvimento e otimização do método cromatográfico

5.2.6.1 Otimização dos programas de eluição

Foi testada, inicialmente, o modo de eluição isocrátic utilizando-se metanol:

tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 em pH 3,5 como fase móvel, nas proporções:

80:20, 70:20, 60:20 e 50:50 (v/v). Na tentativa de se obter a melhor separação entre

os picos associados aos IFA e seus produtos de degradação, também foram testados

programas de eluição por gradiente. A Tabela 9 apresenta um resumo dos programas

testados.

A amostra utilizada durante toda a etapa de desenvolvimento e otimização

do método cromatográfica foi preparada conforme descrito no item 5.2.5. Para todas

as análises, foi utilizado detecção em 254 nm, onde a maior parte dos produtos de

degradação absorve, a partir dos dados provenientes do experimento descrito no ítem

5.2.4.2, vazão de 1 mL min-1, temperatura do forno da coluna de 30°C, volume de

injeção da amostra de 5 µL.

P á g i n a | 69

Tabela 9. Programas de eluição por gradiente avaliados.

Programa Tempo (min) Metanol (%) Tipo de gradiente

1 0 - 35 10 → 85 linear

35 - 45 85 patamar

2 0 - 30 10 → 85 linear

30 - 40 85 patamar

3

0 - 10 10 → 40 linear

10 - 15 40 → 45 linear

15 - 25 45 → 85 linear

25 - 35 85 patamar

4

0 - 7 10 → 30 linear

7 – 17 30 → 40 linear

17 - 28 40 → 85 linear

28 - 38 85 patamar

5

0 – 4 10 → 20 linear

4 – 14 20 → 40 linear

14 - 24 40 → 50 linear

24 - 29 50 → 75 linear

29 - 39 75 patamar

6

0 – 4 10 → 30 linear

4 – 14 30 → 50 linear

14 - 24 50 → 60 linear

24 - 29 60 → 85 linear

29 - 39 85 patamar

5.2.6.2. Otimização dos atributos críticos de qualidade (CQA) empregando

Planejamento Experimental (DoE)

As condições cromatográficas utilizadas na otimização dos atributos

críticos de qualidade foram: metanol e tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 como

fase móvel, utilizando-se o programa de gradiente selecionado na etapa anterior

(Tabela 10), detecção em 254 nm e volume de injeção de 5 µL. A amostra utilizada

para o desenvolvimento do método foi preparada conforme descrito no item 5.2.5.

P á g i n a | 70

Tabela 10. Programa de eluição por gradiente empregado na etapa de otimização do método.

Tempo (min) Metanol (%) Tipo de gradiente

0 - 4 10 → 30 linear

4 - 14 30 → 50 linear

14 - 24 50 → 60 linear

24 - 29 60 → 85 linear

29 - 39 85 patamar

Com a finalidade de otimizar os atributos críticos de qualidade: pureza de

pico, fator cauda, eficiência e resolução, utilizando-se de conceitos de Analytical

Quality by Design (A-QbD), realizou-se um planejamento experimental composto

central com três fatores (α = 2), duplicata de injeção em todos os pontos e triplicatas

autênticas no ponto central, conforme mostrado na Tabela 11.

Tabela 11. Condições empregadas no planejamento experimental.

Fatores Mínimo (-1) Máximo (+1) - α + α Respostas

pH do tampão 3 4 2,5 4,5 Pureza de pico,

eficiência,

resolução, fator

cauda.

Temperatura do

forno (°C) 28,8 36,3 25 40

Vazão (mL min-1) 0,8 1 0,7 1,1

5.2.7 Verificação do modelo

Após a definição do método, utilizando-se o modelo matemático obtido pelo

planejamento experimental, verificou-se a exatidão dos valores previstos aplicando-o

a 6 amostras preparadas de maneira independente, conforme descrito no item 5.2.5.

Após as análises cromatográficas, compararam-se os valores de pureza de pico e

fator cauda obtidos experimentalmente com os valores teóricos fornecidos pelo

modelo.

P á g i n a | 71

5.2.8 Perfil de degradação

Após desenvolvido e otimizado o método cromatográfico, a etapa seguinte

do desenvolvimento do método indicativo de estabilidade foi a definição do perfil de

degradação. Sabendo-se previamente as condições que resultariam na degradação

de pelo menos 10% dos fármacos, com base nos resultados obtidos a partir dos

experimentos descritos em 5.2.4.1, realizou-se um estudo de degradação forçada

completo, considerando o efeito dos excipientes. Deste modo, submeteu-se os

excipientes, o produto acabado, os IFA isolados e os IFA com seus excipientes à todas

as condições de degradação forçada, conforme ilustrado na Figura 18, para condição

ácida.

Figura 18. Diagrama de execução dos experimentos para obtenção do perfil de degradação.

Conforme já mencionado na Introdução, os dois fármacos são separados

fisicamente no produto final (Figura 8), isto é, um granulado de losartana potássica e

um comprimido revestido de besilato de anlodipino. Por este motivo, existem

excipientes específicos para a losartana potássica (excipientes 1) e outros para o

besilato de anlodipino (excipientes 2).

Os excipientes utilizados foram os mesmos presentes na formulação

comercial e as proporções utilizadas foram determinadas com base nos valores

farmacêuticos usuais de cada um deles, de acordo com o Handbook of

Pharmaceutical Excipients (ROWE et al., 2009).

P á g i n a | 72

5.2.8.1 Preparo das soluções estoque

Foi preparada, para cada amostra mostrada no esquema da Figura 15, uma

solução estoque para ser submetida às condições de estresse no estudo de

degradação forçada, conforme as condições descritas abaixo:

Diluente da solução estoque: acetonitrila:água, 70:30 (v/v), devido à

elevada solubilidade dos analitos a estas proporções dos solventes.

Diluente da amostra: metanol:tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 e pH

3,5 50:50 (v/v), devido à similaridade com a fase móvel utilizada.

Solução estoque de besilato de anlodipino: transferiram-se 50 mg de

besilato de anlodipino para um balão volumétrico de 10 mL e completou-se o volume

do balão com diluente da solução estoque, resultando numa solução de 5 mg mL-1 do

fármaco.

Solução estoque de losartana potássica: transferiram-se 50 mg de

losartana potássica para um balão volumétrico de 10 mL e completou-se o volume do

balão com diluente da solução estoque, resultando numa solução de 5 mg mL-1 do

fármaco.

Solução estoque de losartana potássica + besilato de anlodipino:

transferiram-se 50 mg de losartana potássica e 50 mg de besilato de anlodipino para

um balão volumétrico de 10 mL e completou-se o volume do balão com diluente da

solução estoque, resultando numa solução de 5 mg mL-1 de cada fármaco.

Solução estoque de besilato de anlodipino + mistura de excipientes 2:

transferiram-se 50 mg de besilato de anlodipino e 94 mg da mistura de excipientes 2

para um balão volumétrico de 10 mL e completou-se o volume do balão com diluente

da solução estoque, resultando numa solução de 5 mg mL-1 do fármaco.

Solução estoque de losartana potássica + mistura de excipientes 1:

transferiram-se 50 mg de losartana potássica e 250 mg de excipientes 1 para um balão

volumétrico de 10 mL e completou-se o volume do balão com diluente da solução

estoque, resultando numa solução de 5 mg mL-1 do fármaco.

Solução estoque de excipientes: transferiram-se 250 mg de excipientes 1 e

94 mg de excipientes 2 para um balão volumétrico de 10 mL e completou-se o volume

do balão com diluente da solução estoque.

P á g i n a | 73

Solução estoque de produto acabado: transferiram-se 400 mg de produto

acabado macerado (LOTAR® da Aché) para um balão volumétrico de 10 mL e

completou-se o volume do balão com diluente da solução estoque.

5.2.8.2 Degradação forçada ácida

Para cada amostra, separadamente, foi transferido 1 mL da correspondente

solução estoque e 0,5 mL de uma solução padronizada de HCl 0,5 mol L-1 para um

balão volumétrico de 5 mL. Homogeneizou-se em ultrassom por 5 minutos e

acondicionou-se no armário por 7 dias (definido a partir dos resultados provenientes

dos ensaios descritos no item 5.2.4.1). Ao fim do período, neutralizou-se a amostra

com 0,5 mL de uma solução padronizada de NaOH 0,5 mol L-1 e completou-se o

volume do balão com o diluente de amostra. Homogeneizou-se por mais 5 minutos

em ultrassom. Filtrou-se a amostra, transferiu-a para um vial, e analisou-a no


5.2.8.3 Degradação forçada básica

Para cada amostra, separadamente, foi transferido 1 mL da solução

estoque e 0,5 mL de uma solução padronizada de NaOH 0,5 mol L-1 para um balão

volumétrico de 5 mL. Homogeneizou-se em ultrassom por 5 minutos e acondicionou-

se no armário por 7 dias as amostras contendo losartana potássica e por 3 dias as

amostras contendo besilato de anlodipino (definido a partir dos resultados

provenientes dos ensaios descritos no item 5.2.4.1). Ao fim do período, neutralizou-se

a amostra com 0,5 mL de uma solução padronizada de HCl 0,5 mol L-1 e completou-

se o volume do balão com diluente de amostra. Homogeneizou-se por mais 5 minutos

em ultrassom. Filtrou-se a amostra, transferiu-a para um vial, e analisou-a no


5.2.8.4 Degradação forçada oxidativa

Para cada amostra, separadamente, foi transferido 1 mL da solução

estoque e 0,5 mL de uma solução de H2O2 3% para um balão volumétrico de 5 mL.

P á g i n a | 74

Homogeneizou-se em ultrassom por 5 minutos e acondicionou-se no armário por 7

dias as amostras contendo besilato de anlodipino e por 1 dia as amostras contendo

losartana potássica (definido a partir dos resultados provenientes dos ensaios

descritos no item 5.2.4.1). Ao fim do período, completou-se o volume do balão com

diluente de amostra. Homogeneizou-se por mais 5 minutos em ultrassom. Filtrou-se a

amostra, transferiu-a para um vial, e analisou-a no cromatógrafo a líquido.

5.2.8.5 Degradação forçada térmica seca

Para cada amostra, separadamente, foram transferidos 50 mg de cada

fármaco para um frasco de vidro de 10 mL. Para as amostras que continham

excipientes, foram transferidos também 250 mg dos excipientes 1 e/ou 94 mg dos

excipientes 2. Para o produto acabado, macerou-se o conteúdo de 2 cápsulas e

transferiam-se 400 mg do produto macerado. Todos os frascos, cada um contendo

uma amostra diferente, foram levados para uma estufa, onde permaneceram abertos

e em aquecimento a 70°C, por 7 dias.

Após este período, as amostras foram transferidas, separadamente, para

balões volumétricos de 10 mL que foram, posteriormente, completados com diluente

da solução estoque. As amostras foram homogeneizadas em ultrassom por 5 minutos.

Para cada amostra, separadamente, transferiu-se 1 mL da solução recém-

preparada para um balão volumétrico de 5 mL e completou-se o volume do balão com



5.2.8.6 Degradação forçada térmica úmida

Para cada amostra, separadamente, foram transferidos 50 mg de cada

fármaco para um frasco de vidro de 10 mL. Para as amostras que continham

excipientes, foram transferidos também 250 mg dos excipientes 1 e/ou 94 mg dos

excipientes 2. Para o produto acabado, macerou-se o conteúdo de 2 cápsulas e

transferiram-se 400 mg do produto macerado. Todos os frascos, cada um contendo

uma amostra diferente, foram colocados em um recipiente de vidro fechado contendo

solução saturada de cloreto de sódio (NaCl) e levado para uma estufa de aquecimento

P á g i n a | 75

onde permaneceram em aquecimento a 70°C por 7 dias. A solução saturada de NaCl

confere ao ambiente dentro do recipiente fechado, umidade média relativa de 75%

(ROCKLAND, 1960), condição esta que simula o clima quente e úmido de países

presentes na zona 4B, como Brasil, segundo o draft da WHO (World Health

Organization, 2016).

Após este período, as amostras foram transferidas, separadamente, para

balões volumétricos de 10 mL que, posteriormente, tiveram seus volumes

completados com diluente da solução estoque. As amostras foram homogeneizadas

em ultrassom por 5 minutos.

Para cada amostra, separadamente, transferiu-se 1 mL da solução recém-

preparada para um balão volumétrico de 5 mL e completou-se o volume do balão com



5.2.8.7 Exposição fotolítica

Estudos de degradação forçada realizados por Haritha et al. (2016) sobre

o besilato de anlodipino e a losartana potássica, indicaram estabilidade dos fármacos

quando submetidos a exposição fotolítica, em experimento nos quais os mesmos

foram colocados em câmara de ultravioleta durante 24 horas. Devido à falta de

disponibilidade de câmaras de fotoestabilidade, esta etapa do estudo não foi realizada

neste trabalho.

5.2.8.8 Exposição a íons metálicos

Para cada amostra, separadamente, foram transferidos 1 mL da solução

estoque e 0,5 mL de uma solução de CaSO4 a 0,05 mol L-1 para um balão volumétrico

de 5 mL. Homogeneizou-se em ultrassom por 5 minutos e acondicionou-se no armário

por 24 horas. Ao fim do período, completou-se o volume do balão com diluente de

amostra. Homogeneizou-se por mais 5 minutos em ultrassom. Filtrou-se a amostra,

transferiu-a para um vial, e analisou-a no cromatógrafo a líquido.

P á g i n a | 76

Excetuando os ensaios de degradação térmica (seca ou úmida), todos os

demais experimentos foram realizados em temperatura ambiente (aproximadamente

25°C), tendo em vista que em temperaturas mais elevadas a degradação ocorre de

forma incontrolável, tornando o ensaio pouco reprodutível. Além disso, desejava-se

obter um perfil de degradação onde se pudesse avaliar a degradação, em

determinada condição, de forma isolada e, portanto, sem a interferência de outros

fatores. O forno, onde foram realizados os experimentos de degradação térmica, teve

o seu vidro protegido com papel alumínio para que não houvesse interferência de luz

no experimento.

Para a avaliação da pureza de pico dos fármacos, utilizou-se a ferramenta

de Peak Purity do software MassLynx que, de acordo com o fabricante, correlaciona

5 espectros em diferentes pontos do pico e esta correlação é apresentada em termos

percentuais que vai de 0 (pico totalmente impuro) a 100% (pico totalmente puro)

(WATERS, 2002). Utilizou-se ainda o cálculo de balanço de massas, ou seja,

quantificou-se os produtos de degradação e comparou-se com a perda do teor do

fármaco. O balanço de massas é aceito quando totaliza aproximadamente 100%, isto

é, quando a diminuição do composto original é completamente convertida em produto

de degradação (LUKULAY & HOKANSON, 2005).

A determinação do teor dos produtos de degradação foi feita de forma

relativa utilizando-se a Equação 13, cuja área do padrão diluído foi calculada com

base na média aritmética das áreas obtidas a partir da injeção, em sextuplicata, de

uma solução padrão em concentração de 0,05 mg mL-1 de besilato de anlodipino e

losartana potássica. O comprimento de onda foi fixado em 254 nm para a

quantificação, visto que este é o comprimento de onda onde foi observado o maior

número de picos de produtos de degradação.

𝑇𝑒𝑜𝑟 𝑑𝑜 𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎çã𝑜 (%)

= (Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑜 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜)𝑥(𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑑𝑖𝑙𝑢í𝑑𝑜)

(Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑑𝑖𝑙𝑢í𝑑𝑜)𝑥(𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎)𝑥100 (13)

P á g i n a | 77

5.3 Validação da metodologia analítica

De acordo com a RDC 166/2017 (BRASIL, 2017), as figuras de mérito

recomendadas para doseamento são: exatidão, precisão (repetibilidade e precisão

intermediária), seletividade, linearidade e robustez.

5.3.1 Seletividade

A seletividade foi avaliada a partir das análises das amostras obtidas na

definição do perfil de degradação. Os experimentos foram descritos no ítem 5.2.8.

Além dos experimentos descritos, foram analisadas soluções independentes dos

agentes estressantes contendo o diluente de amostra, bem como a fase móvel

utilizada.

5.3.2 Linearidade

Solução estoque: para a realização dos testes de linearidade, preparou-se

uma solução estoque contendo losartana potássica a 2 mg mL-1 e besilato de

anlodipino a 0,278 mg mL-1. Para tal, foram transferidos 50 mg do padrão de losartana

potássica e 6,95 mg do padrão de besilato de anlodipino para um balão de 25 mL,

utilizando uma solução de acetonitrila:água, 70:30 (v/v) como diluente da solução

estoque.

Diluições: foram realizadas diluições para balão de 5 mL, de modo a

compreender uma faixa de trabalho de 50 a 120% da concentração do produto

acabado na formulação, conforme mostrado na Tabela 12. Os balões foram

completados com solução de metanol:tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 pH 3,2

(50:50, v/v), devido a maior similaridade com a fase móvel utilizada, e

homogeneizados, agitando-se o balão para cima e para baixo por 30 vezes, e depois

levados ao ultrassom por 5 minutos. As amostras foram transferidas para um vial e

analisadas no cromatógrafo a líquido. Ainda que a legislação brasileira recomende

uma faixa de trabalho de 80 – 120% (BRASIL, 2017) para teor, decidiu-se por

empregar uma faixa mais ampla, com a finalidade de demonstrar a linearidade em

todo o intervalo de doseamento utilizado na obtenção do perfil de degradação.

P á g i n a | 78

Tabela 12. Diluições realizadas para os experimentos de linearidade.

Níveis de concentração dos

fármacos no produto (%)

Concentração de LOSARTANA

(mg mL-1)

Concentração de AMLODIPINO

(mg mL-1)

Volume (mL) da solução estoque transferido para balão de 5 mL

120 1,20 0,167 3,000

110 1,10 0,153 2,750

100 1,00 0,139 2,500

90 0,90 0,125 2,250

80 0,80 0,111 2,000

70 0,70 0,097 1,750

60 0,60 0,083 1,500

50 0,50 0,069 1,250

Para cada nível de concentração, foram preparadas triplicatas

independentes a partir de diluições da solução estoque. Para cada replicata

independente, foram realizadas duplicatas de injeção, resultando num total de 48

corridas.

Os parâmetros da regressão foram calculados pelo método dos mínimos

quadrados (MMQ). Em seguida, os gráficos de dispersão de resíduos foram

construídos e os pontos fora do intervalo de confiança (± t(0,95;n–2)sres), sendo sres o

desvio padrão dos resíduos da regressão, foram indicados como outliers.. Os outliers

foram confirmados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife (BELSLEY et al.,

1989), que foi aplicado sucessivamente até que novos outliers não fossem detectados,

ou até uma exclusão máxima de 22,2% no número original de resultados.

Os testes estatísticos realizados, referentes à análise de regressão foram:

normalidade (RYAN & JOINER, 1976), homoscedasticidade (COCHRAN, 1947) e

testes de F para verificar o ajuste ao modelo linear por meio da avaliação dos valores

de significância da regressão (DRAPPER & SMITH, 1998).

Todos os resultados apresentados basearam-se nas recomendações da

ANVISA em sua RDC 166/2017 (BRASIL, 2017), artigo 27.

5.3.3 Precisão

Inicialmente calculou-se o peso médio do conteúdo das cápsulas, medindo-

se a massa de 9 cápsulas em balança analítica e calculando-se uma média aritmética

das medidas.

P á g i n a | 79

Macerou-se o conteúdo da cápsulas utilizando-se almofariz com pistilo e

transferiu-se o equivalente à massa média calculada para um balão volumétrico de 10

mL. Completou-se o volume do balão com uma solução de acetonitrila:água, 70:30

(v/v) e homogeneizou-se, agitando-se o balão para cima e para baixo por 30 vezes e

depois levou-se ao ultrassom por 20 minutos. Transferiu-se uma alíquota de 1 mL da

solução preparada para um balão de 5 mL ao qual foi completado com solução de

metanol:tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 pH 3,2 (50:50, v/v) e homogeneizado

da mesma forma. A amostra foi então filtrada, transferida para um vial e analisada no


Para a determinação da repetibilidade, prepararam-se 6 amostras de

maneira independente desde o início do processo, conforme descrito acima. Para a

determinação da precisão intermediária, prepararam-se 6 amostras de maneira

independente desde o início do processo, conforme descrito acima, em dias diferentes

e preparadas por analistas diferentes.

A precisão foi demonstrada pela dispersão dos resultados e calculada em

termos de estimativa de desvio padrão relativo (DPR), utilizando-se a Equação 7.

5.3.4 Exatidão

Para a determinação da exatidão, preparou-se uma solução estoque

contendo losartana potássica a 5 mg mL-1 e besilato de anlodipino a 0,6944 mg mL-1.

Para tal, foram transferidos 125 mg de padrão de losartana potássica e 17,36 mg de

padrão de besilato de anlodipino para um balão volumétrico de 25 mL contendo a

matriz da amostra que, neste caso, são os excipientes do produto. O balão volumétrico

teve seu volume completado com uma solução de acetonitrila:água, 70:30 (v/v) como

diluente da solução estoque e homogeneizado conforme descrito no ítem 5.3.3. Foram

realizadas as diluições para balão de 5 mL a partir de uma mesma solução estoque,

contemplando o intervalo linear do método analítico em 3 concentrações diferentes:

50, 100 e 120% da concentração original do produto, conforme mostrado na Tabela

13. As determinações foram realizadas em triplicatas independentes a partir das

diluições.

A recuperação foi calculada a partir da Equação 9.

P á g i n a | 80

Tabela 13. Diluições realizadas para os experimentos de exatidão.

Níveis de concentração

dos fármacos no produto (%)

Concentração de losartana (mg mL-1)

Concentração de anlodipino (mg mL-1)

Volume (mL) da solução estoque transferido para balão de 5 mL

120 1,2 0,167 1,200

100 1 0,139 1,000

50 0,5 0,069 0,500

5.3.5 Robustez

A robustez foi avaliada já no desenvolvimento do método a partir de um

planejamento experimental, descrito no item 5.2.6.2.

P á g i n a | 81

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Definição dos elementos do Analytical Quality by Design

De acordo com as Informações descritas na introdução, foram definidos o

perfil analítico alvo (Analytical Target Profile ATP), Tabela 14, os atributos críticos de

qualidade (Critical Quality Attributes, CQA),Tabela 15, os parâmetros (experimentais)

críticos do método (Critical Method Parameters, CMP), Tabela 16, e a Análise de Risco

(Risk Assessment, RA), Tabela 17, onde se definiu as estratégias a serem adotadas

para cada CQA de acordo com os CMP.

Tabela 14. Definição do Analytical Target Profile (ATP). (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2017; CDER, 1994; BRASIL 2017).

ATP Alvo

Justificativa Losartana Anlodipino

Resolução > 2,0 Os limites foram estabelecidos de acordo com os compêndios oficiais (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2017).

Fator cauda < 2,0 O limite foi estabelecido de acordo com os compêndios oficiais (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2017).

Eficiência (nº de pratos)

> 3000 Os limites foram estabelecidos de acordo com os compêndios oficiais (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2017).

Pureza de pico (%)

≥ 99 De modo a garantir a seletividade do método, o pico precisa estar puro.

DPR (%) Precisão

(repetibilidade) < 3,8 < 5,1

Os limites foram estabelecidos a partir da equação de Horwitz (item 6.9.3.2).

DPR (%) Precisão

(intermediária) < 5,7 < 7,6

Os limites foram estabelecidos a partir da equação de Horwitz (item 6.9.3.2).

Teor (%) 95 - 105 90 - 110 Os limites foram estabelecidos de acordo com os compêndios oficiais (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2017).

Fator de retenção (k)

> 2,0 O limite foi estabelecido de acordo com orientações do FDA (CDER, 1994).

Coeficiente de correlação (r)

> 0,990 De acordo com a RDC 166/2017 (BRASIL, 2017) da ANVISA, o valor de r deve ser superior a 0,990, deve-se avaliar a homoscedasticidade.

Coeficiente angular

≠ 0 De acordo com a RDC 166/2017 (BRASIL, 2017) da ANVISA, o coeficiente angular deve ser significativo, ou seja, diferente de zero

Faixa de trabalho (%)

80 - 120 A faixa de trabalho para validação analítica, para teor, foi estabelecida de acordo com a RDC 166/2017 (BRASIL, 2017) da ANVISA.

P á g i n a | 82

Tabela 15. Definição dos Atributos Críticos de Qualidade (CQA)

CQA Justificativa

Resolução, Rs É necessário que haja resolução apropriada entre os picos para que

os analitos sejam quantificados adequadamente.

Pureza de pico

Para que se possa afirmar que um método é seletivo para

determinado analito, é necessário assegurar que nada esteja

coeluindo com este analito, ou seja, é preciso garantir a pureza de

pico.

Eficiência, N Maximizando a eficiência, há melhora na seletividade, tendo em vista

que a picos mais finos tendem a apresentar melhor resolução

Fator cauda, T

Minimizando-se o fator cauda, há maior precisão e exatidão na

integração dos picos cromatográficos e há também melhora na

resolução entre os mesmos.

Tabela 16. Definição dos Parâmetros Críticos do Método (CMP)

CMP Justificativa

pH do Tampão

Tendo em vista que os analitos possuem grupamentos ácidos e

básicos, o pH do tampão é um parâmetro importante e que pode

influenciar diretamente sobre diversos CQA como a seletividade, já

que pode haver mudanças na retenção do analito conforme se altera

o pH; na simetria de pico, uma vez que é esperado picos mais

assimétricos conforme se aumenta o pH, devido a interação dos

analitos com silanois residuais nessas condições; eficiência,

sabendo-se que dependendo do pH utilizado, o analito assume

formas neutras ou iônicas podendo interagir mais ou menos

intensamente com a fase estacionária.

Temperatura

A temperatura tem grande influência sobre a transferência de massa

e a difusão longitudinal em uma separação cromatográfica, deste

modo, afeta a maior parte das respostas.

Vazão

A vazão está diretamente relacionada à velocidade linear em um

processo cromatográfico e transferência de massa, o que implica

diretamente sobre a eficiência do método.

Modificador

orgânico

O modificador orgânico está relacionado à polaridade e à força

cromatográfica da fase móvel. Em cromatografia de fase reversa

(fase estacionária mais apolar que a fase móvel), quanto maior a

concentração de modificador orgânico (apolar), maior é a força de

eluição, ou seja, mais rápida é a eluição do soluto através da coluna

cromatográfica, o que afeta a retenção, resolução e eficiência.

Fase

estacionária

O tamanho e material das partículas pode influir diretamente na

eficiência da coluna e, consequentemente na resolução, seletividade

e detectabilidade, já que quanto mais finos e altos são os picos,

menor a chance de coeluição e interferência com outros analitos, e

portanto, melhor é o limite de detecção.

P á g i n a | 83

Tabela 17. Análise de Risco (RA) baseado no impacto previsto dos CMP sobre os CQA.

CQA

Experimento previsto Resolução

Pureza de pico

Eficiência Fator cauda

CMP

pH do Tampão Médio Médio Alto Alto

O CMP será, inicialmente, analisado em uma triagem para estabelecer a faixa a ser utilizada no DoE. No DoE será avaliada a sua influência sobre os CQA de forma quantitativa.

Temperatura Alto Médio Alto Alto Será avaliada a sua influência sobre os CQA em um DoE.

Vazão Alto Médio Alto Alto

Será definida, inicialmente, uma faixa ótima de vazão a partir de uma curva de van Deemter e esta faixa será considerada em um DoE, onde será avaliada a sua influência sobre os CQA.

Tipo de solvente orgânico

Alto Médio Alto Alto Será avaliado qual a melhor opção de solvente orgânico (acetonitrila ou metanol) em uma triagem.

Fase estacionária

Alto Alto Alto Alto Será avaliada qual a melhor opção de fase estacionária em uma triagem.

P á g i n a | 84

6.2 Testes de sensibilidade dos fármacos à degradação

A partir dos experimentos realizados, observou-se que o besilato de

anlodipino mostrou-se sensível à degradação em todas as condições, sobretudo à

condição básica onde observou-se uma degradação superior aos 60%, por outro lado,

a losartana potássica mostrou-se sensível apenas à condição oxidativa, e em

condição ácida na presença de metanol, conforme mostrado nas Figuras 19, 20 e 21.

Os cromatogramas são apresentados em escala adequada à visualização dos picos

menores, referentes aos produtos de degradação.

Observa-se a formação de um pico de produto de degradação quando o

ensaio de estresse ácido, para losartana potássica, é realizado na presença de

metanol (Figura 21.b), ao passo que, quando o mesmo ensaio é realizado em solução

aquosa (Figura 21.a) este pico não é observado. Isto se deve, segundo Baertschi

(2011), ao fato de que o metanol pode participar da reação de degradação, atuando

como nucleófilo e atacando os sítios eletrofílicos das moléculas ou intermediários nas

vias de degradação. Sabendo-se que o metanol não está presente em formulações

farmacêuticas, e de modo a não gerar produtos de degradação não representativos,

ele deve ser evitado na preparação de soluções que serão submetidas aos ensaios

de estresse, podendo ser substituído por acetonitrila, quando a amostra for insolúvel

ou pouco solúvel em água (BAERTSCHI, 2011).

6.3 Testes de triagem para pH, modificador orgânico e colunas cromatográficas

A partir dos experimentos propostos para triagem, foram obtidos os

cromatogramas mostrados nas Figuras de 22 a 31. Para todos os cromatogramas, o

pico de maior intensidade corresponde a losartana potássica e o de menor intensidade

ao besilato de anlodipino. Na legenda de cada figura está descrito a coluna

cromatográfica e o modificador orgânico utilizados.

P á g i n a | 85

Figura 19. Resultados dos ensaios iniciais em condições de estresse (A) ácido, (B) básico e (C) oxidativo, para uma solução aquosa de losartana potássica.

Figura 20. Resultados dos ensaios iniciais em condições de estresse (A) ácido, (B) básico e (C) oxidativo, para uma solução aquosa de besilato de anlodipino.

P á g i n a | 86

Figura 21. Ensaios de degradação forçada ácida para IFA de losartana potássica realizados a partir de (A) uma solução aquosa e (B) uma solução metanólica.

Figura 22. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se acetonitrila como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica XTerra MS C18 3,5 µm – 3,0x100 mm.

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Figura 23. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se metanol como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica XTerra MS C18 3,5 µm – 3,0x100 mm.

Ainda que não apresente picos com caudas, uma vez que a fase

estacionária é capeada com baixa atividade de silanois residuais, os resultados para

a coluna XTerra MS C18 apresentaram falta de seletividade para os analitos em

questão em toda a faixa de pH utilizando-se metanol como modificador orgânico da

fase móvel (Figura 23). Ainda que apresentasse seletividade os resultados utilizando-

se acetonitrila, como modificador orgânico da fase móvel (Figura 22), apresentaram

separação insuficiente para os fins deste trabalho, onde picos de impurezas tendem

a se formar na região entre os picos dos fármacos e, deste modo, preconiza-se alta

resolução. Dito isso, descartou-se a utilização dessa coluna nas etapas subsequentes.

P á g i n a | 88

Figura 24. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se acetonitrila como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica XSelect HSS C18 5 µm – 4,6x150 mm.

Figura 25. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se metanol como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica XSelect HSS C18 5 µm – 4,6x150 mm.

P á g i n a | 89

Da mesma forma que para a coluna XTerra, a XSelect HSS C18 também é

uma coluna capeada e, desta forma, os cromatogramas gerados utilizando-se esta

coluna apresentaram um bom formato de pico, uma vez que a atividade dos silanóis

residuais é baixa, no entanto, observa-se falta de seletividade para os analitos em

questão, sobretudo para pH mais baixo, utilizando-se metanol como modificador

orgânico da fase móvel (Figura 25). Ao utilizar acetonitrila como modificador orgânico

da fase móvel (Figura 24), observou-se uma melhora em resolução, mas insuficiente

para os propósitos do trabalho, onde pode haver formação de picos de produtos de

degradação na região entre os picos dos fármacos. Por estes motivos, também

descartou-se a utilização desta coluna nas etapas subsequentes.

Figura 26. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se acetonitrila como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica Nova-Pak C18 4 µm – 3,9x150 mm.

P á g i n a | 90

Figura 27. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se metanol como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica Nova-Pak C18 4 µm – 3,9x150 mm.

Ainda que apresente fase estacionária capeada, a atividade dos silanois

para a coluna Nova-Pak C18 é de nível médio e, de fato, nos cromatogramas gerados

utilizando-se esta coluna (Figuras 26 e 27) se nota a formação de cauda para o pico

correspondente ao besilato de anlodipino, conforme se aumenta o pH, o que é

esperado devido ao caráter básico desta molécula (pKa = 8,6, TOXNET). Devido a

uma diminuição no tamanho de partícula nesta coluna, quando comparada a coluna

com partículas de 5 µm, observa-se uma melhora na resolução, como esperado.

Apesar da melhora na resolução, a deformação do pico correspondente ao besilato

de anlodipino levou a descartar o uso desta coluna nas etapas subsequentes do

trabalho.

P á g i n a | 91

Figura 28. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se acetonitrila como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica CORTECS C18+ 2.7 µm – 4,6x150 mm.

Figura 29. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se metanol como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica CORTECS C18+ 2.7 µm – 4,6x150 mm.

A partir dos cromatogramas obtidos utilizando-se a coluna cromatográfica

CORTECS C18+, observa-se pouca influência do pH quando se utilizou metanol como

P á g i n a | 92

modificador orgânico da fase móvel (Figura 29), isto é, a retenção das moléculas na

fase estacionária é quase indiferente à variação do pH do tampão. Nota-se ainda

cauda acentuada para o pico associado ao besilato de anlodipino e cauda frontal para

o pico associado à losartana potássica, independentemente do pH do tampão

utilizado. Ao utilizar acetonitrila como modificador orgânico da fase móvel (Figura 28),

a variação na retenção com a mudança do pH é pronunciada, no entanto, há formação

de cauda para o pico correspondente ao besilato de anlodipino conforme se aumenta

o pH do tampão, o que não era esperando tendo em vista que se trata de uma coluna

capeada com atividade baixa de silanóis. Ainda que apresente uma boa resolução, só

seria possível utilizar essa coluna com acetonitrila e soluções tampão em pH 2,5 ou

3,0, o que não conferiria robustez ao método, uma vez que uma ligeira variação em

pH, acarretaria na formação de cauda no pico, desta forma, descartou-se a utilização

desta coluna em etapas subsequentes.

Figura 30. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se acetonitrila como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica XSelect CSH Fluoro-Fenil 3,5 µm – 4,6x150 mm.

P á g i n a | 93

Figura 31. Avaliação da influência do pH sobre os analitos losartana potássica e besilato de anlodipino, empregando-se metanol como modificador orgânico da fase móvel e coluna cromatográfica XSelect CSH Fluoro-Fenil 3,5 µm – 4,6x150 mm.

Apesar de não apresentar fase estacionária capeada, a coluna XSelect

CSH apresentou excelente desempenho cromatográfico, mesmo para pH mais

elevados, utilizando-se metanol como modificador orgânico da fase móvel (Figura 31).

Os picos apresentaram simetria adequada e uma alta resolução em toda a faixa de

pH empregada. Nos cromatogramas onde utilizou-se acetonitrila como modificador

orgânico da fase móvel (Figura 30), observa-se que, semelhantemente ao que ocorre

com a coluna CORTECS C18+, há uma ligeira formação de cauda para o pico

correspondente ao besilato de anlodipino com o aumento do pH.

Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que, de todas as

colunas testadas, a XSelect CSH Fluoro-Fenil mostrou-se ser a coluna cromatográfica

mais promissora, assim como a utilização do metanol como modificador orgânico da

fase móvel, já que permitiram a utilização de tampão em toda a faixa de pH testada

sem deformação no formato dos picos, além da boa resolução entre os picos dos

fármacos.

P á g i n a | 94

6.4 Curva de van Deemter

Após a seleção da coluna cromatográfica foi construída a curva de van

Deemter para esta coluna, conforme mostrado na Figura 32. Observa-se que a faixa

de velocidade linear correspondente a menor altura de prato e, portanto, a que oferece

maior eficiência vai de 0,11 a 0,14 cm s-1 ou, em unidade de vazão, de 0,7 a 0,9 mL

min-1. Esta informação foi utilizada no delineamento da faixa de vazão do

planejamento experimental na etapa de desenvolvimento e otimização do método

cromatográfico.

Figura 32. Curva de van Deemter para a coluna cromatográfica XSelect CSH Fluoro-Fenil 3,5 µm – 4,6x150 mm, empregando-se naftaleno como analito e acetonitrila:água 55:45, v/v como fase móvel em eluição isocrática.

6.5 Estudo de degradação forçada

6.5.1 Estudo de degradação forçada em solução

A partir do estudo de degradação forçada em solução foi possível

estabelecer o tempo necessário para degradar os fármacos em um intervalo de 10 a

30%. Na Figura 33 são mostrados os gráficos de variação do teor do IFA em relação

ao tempo de exposição aos agentes degradantes. O retângulo em preto indica a região

limite correspondente ao intervalo de degradação de 10 a 30%.

P á g i n a | 95

Figura 33. Curva de teor vs. tempo de exposição aos agentes degradantes para (A) losartana potássica e (B) besilato de anlodipino.

Observa-se que, para losartana potássica, após apenas 1 dia, houve

degradação superior a 10% quando exposto a condição de estresse oxidativo. Para o

besilato de anlodipino, a degradação superior a 10% foi alcançada para as amostras

com exposição de 7 e 3 dias para as condições de estresse ácido e básico,

respectivamente; para condição oxidativa não houve mudança significativa no teor,

indicando estabilidade do fármaco nesta condição em temperatura ambiente. Sabe-

se, contudo, que o único produto de degradação que seria formado em condição

P á g i n a | 96

oxidativa para besilato de anlodipino, é também formado em condição ácida, não

comprometendo a representatividade do ensaio.

6.5.2 Seleção do comprimento de onda

A partir da sobreposição dos espectros de absorção no ultravioleta, obtidos

para os picos de losartana potássica e besilato de anlodipino (Figura 34), observa-se

uma região ótima de absorção que vai de 220 a 260 nm, onde é possível detectar os

dois fármacos com boa absortividade.

Além disso, com base nos cromatogramas obtidos em vários comprimentos

de onda, dispostos no Apêndice I, definiu-se 254 nm o comprimento de onda onde a

maior parte dos produtos de degradação absorve. Em comprimentos de onda

ligeiramente mais elevados, observa-se um aumento na detectabilidade de alguns

produtos de degradação, contudo há diminuição na intensidade dos picos dos

fármacos. Desta forma, o comprimento de onda de 254 nm foi adotado em todos os

experimentos subsequentes.

Figura 34. Sobreposição dos espectros de absorção, no ultravioleta, de losartana potássica e besilato de anlodipino.

P á g i n a | 97

6.5.3 Estudo de degradação forçada conduzidos em suspensão

A partir do estudo de degradação forçada conduzido em suspensão,

observou-se que os resultados obtidos de experimentos realizados em semanas

diferentes não se repetiram, conforme mostrado na Figura 35.

Figura 35. Estudos de degradação forçada realizados em suspensão nas mesmas condições, mas em semanas diferentes, para uma mistura de amostras degradadas de besilato de anlodipino e losartana potássica.

Se por um lado esperava-se uma degradação controlada nos testes

realizados em suspensão, devido a menor quantidade de água nestes ensaios, o que

se observou foram perfis de degradação diferentes. Acredita-se que, pelo fato de não

se ter uma solução homogênea, o agente estressante pode concentrar-se mais em

algumas regiões da amostra do que em outras e, desta forma, gerar microrregiões

onde a degradação ocorre de forma mais acentuada (overstressing) e em outras em

que ela quase não ocorre (understressing) e, com isso, gerar resultados pouco

reprodutíveis, no caso de repetição do ensaio.

Além dos problemas de repetibilidade, durante a execução dos estudos de

degradação forçada conduzidos em suspensão, observou-se a formação de grumos

P á g i n a | 98

dos fármacos nas paredes do balão volumétrico, que não se solubilizaram

completamente com a adição do diluente de amostra, o que acarretaria erros

grosseiros na quantificação dos analitos.

A partir dos resultados observados, chegou-se à conclusão de que os

ensaios de degradação forçada devem ser realizados sempre em solução homogênea

não metanólica de modo que o agente estressante possa reagir uniformemente com

a amostra sem a interferência de um potencial nucleófilo que não seria observado nas

condições normais de prateleira. Por este motivo, os ensaios de degradação forçada

posteriores foram realizados apenas em solução aquosa contendo acetonitrila como

solvente orgânico, considerado mais inerte para realização de testes de estresse.

(BAERTSCHI, 2011)

6.6 Desenvolvimento e otimização do método cromatográfico

6.6.1 Otimização do modo de eluição

Empregando a eluição isocrática, observou-se desempenho

cromatográfico insatisfatório para a amostra, conforme apresentado na Figura 36.

Nas condições testadas, os compostos eluiram antes de 5 minutos,

apresentando baixa retenção na fase estacionária (fator de retenção, k < 2), segundo

orientações para validação de métodos cromatográficos do FDA (CDER, 1994). Deste

modo, optou-se por eluição por gradiente que iniciasse com uma fase móvel de baixa

força cromatográfica, para que os picos de produtos de degradação ficassem

suficientemente retidos na coluna e, a partir disso, a força cromatográfica foi

aumentada gradativamente, com diferentes programas de eluição por gradiente, em

busca de uma condição que oferecesse a melhor separação entre os picos. Os

cromatógrafos utilizando-se eluição por gradiente são mostrados nas Figuras 37 e 38.

P á g i n a | 99

Figura 36. Cromatogramas obtidos empregando-se eluição isocrática e metanol:tampão formiato de amônio 10 mmol L-1 pH 3,5 como fase móvel.

As setas indicam problemas de separação ou de baixa resolução entre os

picos, fatores considerados cruciais nesta etapa. Desta maneira, os programas de

eluição por gradiente que apresentaram baixa resolução foram descartados. Os

programas 3 e 6 foram os que apresentaram melhor desempenho. O programa 6

mostrou-se o mais promissor, devido a uma melhor separação entre o pico referente

a losartana potássica e o pico de produto de degradação em 24 minutos, e também

devido a uma maior resolução entre os picos dos fármacos. Por este motivo, o

programa de eluição por gradiente selecionado para a etapa de otimização foi o

programa 6.

Na Figura 39 são apresentados os resultados das análises das amostras

degradadas, injetadas separadamente, utilizando-se o programa de eluição por

gradiente escolhido (programa 6), onde se observa a seletividade do mesmo. Na

Figura 39 também é possível visualizar de forma mais clara alguns picos de produtos

de degradação de baixa intensidade que ficaram ocultos no cromatograma referente

ao programa 6 da Figura 38.

P á g i n a | 100

Figura 37. Cromatogramas obtidos empregando-se diferentes programas de eluição por gradiente e metanol:tampão formiato de amônio 10

mmol L-1 pH 3,5 como fase móvel.

P á g i n a | 101

Figura 38. Continuação dos cromatogramas obtidos empregando-se diferentes programas de eluição por gradiente e metanol:tampão formiato

de amônio 10 mmol L-1 pH 3,5 como fase móvel.

P á g i n a | 102

Figura 39. Cromatogramas obtidos a partir da injeção das amostras de degradação forçada utilizando-se o programa 6 de eluição por gradiente.

6.6.2 Otimização dos atributos críticos de qualidade (CQA) empregando

Planejamento Experimental (DoE)

Antes da definição do Design Space, foi necessário avaliar a qualidade dos

ajuste dos modelos gerados pelo planejamento experimental e, para isso, existem

algumas ferramentas do software Design Expert (STAT-EASE, 2017) que auxiliam

nesta tarefa.

A análise dos resíduos é fundamental para avaliar o grau de ajuste de um

modelo às observações. Em um modelo bem ajustado, os resíduos devem se

comportar de modo semelhante ao que se esperaria dos erros aleatórios, ou seja, os

mesmos devem seguir uma distribuição Normal (NETO, 2001). Portanto, foi avaliado

o gráfico normal dos resíduos, e, caso os resíduos sigam uma distribuição normal, os

pontos estarão sobre a linha reta (ou com uma leve curvatura) (VINING, 2011).

Baseado nesses princípios, pode-se admitir que os resíduos obtidos para o modelo

linear ajustado para o fator cauda da losartana potássica, mostrado como exemplo na

P á g i n a | 103

Figura 40, seguem uma distribuição normal. Resultados semelhantes foram

observados para os demais CQA analisados.

Figura 40. Gráfico normal dos resíduos para fator cauda da losartana potássica.

Outra ferramenta de diagnóstico disponível é o gráfico de resíduos vs

valores previstos, que testa a hipótese de variância constante (homoscedasticidade)

dos resíduos. O gráfico deve ser uma dispersão aleatória (intervalo constante de

resíduos) não devendo apresentar nenhum padrão ou tendência, conforme

exemplificado na Figura 41. Caso exista alguma tendência, preconiza-se a

necessidade de uma transformação matemática nas respostas (VINING, 2011). De

acordo com estes princípios, pode-se concluir que os resíduos do modelo, de

interação envolvendo 2 fatores, ajustado aos valores de pureza de pico da losartana

potássica (Figura 42), podem ser considerados homoscedásticos, ou seja,

apresentam variância constante ao longo de toda a faixa estudada. Resultados

semelhantes foram observados para os demais CQA analisados.

P á g i n a | 104

Figura 41. Padrão “megafone” indicando heteroscedasticidade dos resíduos.

Figura 42. Gráfico de resíduos vs. valores previstos para pureza de pico da losartana potássica.

Para verificar a presença de fatores externos, que podem influenciar na

resposta durante a execução do experimento, deve-se analisar o gráfico de resíduos

vs ordem de execução dos experimentos, que deve mostrar uma dispersão aleatória.

A Figura 43 apresenta os resultados para os resíduos do modelo quadrático

Design-Expert® SoftwarePureza LOS

Color points by value ofPureza LOS:

99,745

99,54

Valores previstos

Resíd

uo

s p

adro

niz

ado

s inte

rna

men

te

Resíduos vs. Valores Previstos

-3,00

-2,00

-1,00

0,00

1,00

2,00

3,00

99,55 99,6 99,65 99,7 99,75

3

-3

0

P á g i n a | 105

modificado, ajustado aos valores de eficiência do besilato de anlodipino. É possível

verificar que não foram observadas tendências ao longo da execução dos

experimentos, uma vez que o gráfico mostrou dispersão aleatória dos resíduos.

Resultados semelhantes foram observados para os demais CQA analisados.

Figura 43. Gráfico de resíduos vs. ordem dos experimentos para eficiência do besilato de anlodipino.

Com a finalidade de verificar se há algum valor, ou grupo de valores, que

não são facilmente previstos pelo modelo, deve-se avaliar o gráfico de valores

previstos vs valores reais, que deve apresentar pontos próximos da reta (VINING,

2011). De acordo com esta premissa, os resultados obtidos para fator cauda da

losartana potássica (Figura 44) apresentam previsão satisfatória do modelo linear, já

que estão próximos à reta. Resultados semelhantes foram observados para os demais

CQA analisados.

P á g i n a | 106

Figura 44. Gráfico de valores previstos vs. valores reais para fator cauda da losartana potássica.

Uma outra forma de avaliar a qualidade do ajuste de um modelo é a partir

da Análise da Variância, ANOVA (Analysis of Variance). Para testar se uma a equação

da regressão é estatisticamente significativa, calcula-se a Média Quadrática da

Regressão (MQR) e Média Quadrática dos Resíduos (MQr) e verifica-se se a razão

entre estas médias segue uma distribuição F. Quando esta razão tem valor calculado

maior do que o Ftabelado, considera-se a Regressão significativa, ou seja, tem-se

evidência estatística suficiente para acreditar que a variação observada nos dados

não é apenas devido a erros aleatórios, mas existe pelo menos um efeito significativo

(NETO, 2011).

Além da análise visual dos resíduos, a partir das ferramentas de

diagnóstico, é possível avaliar se há falta de ajuste no modelo a partir de um teste F.

Para avaliar se o modelo está bem ajustado às observações, pode-se usar um teste

F da razão entre a Média Quadrática da Falta de Ajuste (MQfaj) e a Média Quadrática

do Erro Puro (MQep). Se a MQfaj for estatisticamente superior MQep existe evidência

de falta de ajuste no modelo proposto. As Médias Quadráticas da Falta de Ajuste e

Erro Puro são derivadas da Soma Quadrática devida à Falta de Ajuste e da Soma

Quadrática devido ao Erro Puro que, por sua vez, são uma decomposição da Soma

Quadrática dos Resíduos (NETO, 2001).

P á g i n a | 107

A Tabela 18 apresenta os resultados da Análise de Variância para

eficiência do besilato de anlodipino, nela pode-se ver que o modelo proposto é um

modelo quadrático, uma vez que há a inclusão dos termos quadráticos (A², B² e C²) e

tem-se o valor de F alto para o modelo, indicando que a regressão é significativa e

valor de F baixo para falta de ajuste, indicando que não há falta de ajuste no modelo.

Uma das maneiras de descrever a importância dos coeficientes do modelo

é por meio do valor de p (p-value). Os valores de p indicam a área sob a curva da

distribuição F que está além do valor F observado, isto é, valores pequenos de p

(menores que 0,05 para 95 % de confiança) indicam que aquele coeficiente é

importante para o modelo. Analisando os valores de p da Tabela 18 nota-se que os

coeficientes AC, BC e A² não são estatisticamente significativos, bem como a falta de

ajuste, conforme dito anteriormente. Retirando-se os termos com maiores valores de

p, neste caso AC e BC, tem-se um modelo quadrático modificado e um maior número

de graus de liberdade para avaliar a falta de ajuste. Os dados de Análise de Variância

deste novo modelo são mostrados na Tabela 19.

Nota-se que, após a modificação, o valor de p para o modelo diminuiu

mostrando que a regressão é ainda mais significativa agora e o valor de p para falta

de ajuste aumentou, indicado melhor ajuste do modelo.


eficiência do besilato de anlodipino.

Fonte SQ GL MQ Fcalculado Valor

de p Resultado

Modelo 6,70E+08 9 7,44E+07 26,36 0,0011 Significativo

A-Vazão 1,01E+08 1 1,01E+08 36,01 0,0018 Significativo

B-pH 4,03E+07 1 4,03E+07 14,3 0,0129 Significativo

C-Temperatura 8,19E+07 1 8,19E+07 29,05 0,0030 Significativo

AB 1,09E+08 1 1,09E+08 38,64 0,0016 Significativo

AC 4,08E+05 1 4,08E+05 0,14 0,7192 Não significativo

BC 6,43E+05 1 6,43E+05 0,23 0,6532 Não significativo

A² 1,29E+07 1 1,29E+07 4,56 0,0857 Não significativo

B² 3,21E+08 1 3,21E+08 113,89 0,0001 Significativo

C² 2,74E+07 1 2,74E+07 9,73 0,0263 Significativo

Resíduos 1,41E+07 5 2,82E+06

Falta de Ajuste 5,84E+06 3 1,95E+06 0,47 0,7333 Não significativo

Erro Puro 8,26E+06 2 4,13E+06

Total 6,83E+08 14

P á g i n a | 108


eficiência do besilato de anlodipino, após retirada dos termos não significativos.

Fonte SQ GL MQ Fcalculado valor de

p Resultado

Modelo 6,68E+08 7 9,54E+07 44,08 < 0,0001 Significativo

A-Vazão 1,01E+08 1 1,01E+08 46,92 0,0002 Significativo

B-pH 4,03E+07 1 4,03E+07 18,63 0,0035 Significativo

C-Temperatura 8,19E+07 1 8,19E+07 37,85 0,0005 Significativo

AB 1,09E+08 1 1,09E+08 50,35 0,0002 Significativo

A² 1,29E+07 1 1,29E+07 5,95 0,0449 Significativo

B² 3,21E+08 1 3,21E+08 148,39 < 0,0001 Significativo

C² 2,74E+07 1 2,74E+07 12,67 0,0092 Significativo

Resíduos 1,51E+07 7 2,16E+06

Falta de Ajuste 6,89E+06 5 1,38E+06 0,33 0,8604 Não significativo

Erro Puro 8,26E+06 2 4,13E+06

Total 6,83E+08 14

Onde SQ = soma quadrática; GL = graus de liberdade e MQ = média quadrática

Para avaliar a presença de interações entre os parâmetros do método e o

modo como estes parâmetros influenciam as respostas, deve-se analisar o gráfico de

superfície de resposta, conforme mostrado na Figura 45.

Figura 45. Gráfico de superfície de resposta para eficiência do besilato de anlodipino.

P á g i n a | 109

Na Figura 45, observa-se que o modelo proposto é quadrático e, portanto,

a superfície de resposta apresenta curvatura. É possível verificar que as arestas da

superfície não são paralelas, conforme apontado pelas setas, indicando que há

interação entre os CMP que, neste caso, são vazão e pH. Uma importante informação

que se pode avaliar a partir de uma superfície é o caminho que maximiza ou minimiza

uma resposta. Neste caso, a eficiência do anlodipino é maximizada em vazões mais

baixas conforme caminha-se para pH mais baixos, alcançando um máximo em pH 3,4.

Essa informação fica mais clara quando se observa o gráfico de contorno (Figura 46).

Figura 46. Gráfico de contorno para eficiência do besilato de anlodipino.

Uma vez avaliados os modelos obtidos para cada CQA, pode-se delimitar

o Design Space e definir as condições cromatográficas de acordo com o Analytical

Target Profile (Tabela 14). Os resultados do planejamento experimental mostraram

que, na região experimental estudada, a pureza de pico para ambos os fármacos foi

superior a 99% em quase todos os experimentos, enquanto que, a resolução (Rs)

entre os picos dos fármacos ficou acima de 19 e a eficiência (N) superior a 40000

pratos para ambos os picos dos fármacos em todos os pontos. O fator cauda (tailing

factor, T) variou entre 1,4 a 1,7 para besilato de anlodipino e entre 1,3 a 1,6 para

losartana potássica.

P á g i n a | 110

Considerando-se que, em suas orientações para validação de métodos

cromatográficos, o FDA (CDER, 1994), bem como os compêndios oficiais (UNITED

STATES PHARMACOPEIA, 2017), recomenda T < 2,0; Rs > 2 e N > 2000, os

resultados obtidos mostraram que os CQA satisfazem a essas recomendações em

todos os experimentos, desde já caracterizando o método como robusto. Contudo,

segundo Neto (2009), dependendo do analito, fator cauda superior a 1,5 devem ser

evitados ou corrigidos, já que podem comprometer a análise, sobretudo no que diz

respeito à precisão da integração, bem como à resolução que também pode ser

afetada em determinados casos. Por este motivo, decidiu-se buscar, dentro da região

experimental estudada, resultados que satisfizessem T < 1,5, tornando o fator cauda

um CQA determinante na escolha das condições cromatográficas a serem adotas.

Devido ao caráter básico da molécula de besilato de anlodipino (pKa = 8,6,

TOXNET) e às interações com silanóis residuais em pH mais próximos do neutro, já

era esperado que os valores para fator cauda para esta molécula fossem superiores

aos valores de fator cauda para losartana potássica, que é uma molécula de caráter

ácido (pKa = 5,5, TOXNET).

Buscaram-se, portanto, resultados que oferecessem, para ambos os

fármacos, valores de T < 1,5 e pureza de pico superior a 99%, uma vez que desejava-

se um método que fosse indicativo de estabilidade. O Design Space define a região

experimental (em amarelo, na Figura 47) em que mudanças nos parâmetros do

método não afetam significativamente os resultados, o que confere robustez ao

método conforme ele vai sendo desenvolvido e assegura uma maior chance de uma

validação bem sucedida. Procurou-se um ponto, dentro da região do Design Space,

que estivesse contido na região em amarelo em toda a faixa de temperatura. Optou-

se, conforme indicado com uma estrela na Figura 47, pela condição correspondente

a pH de 3,2; vazão de 0,95 mL min-1 e temperatura de 36,3 ºC que, teoricamente,

devem apresentar pureza de pico e fator cauda para losartana potássica de 99,7% e

1,4, respectivamente; e pureza de pico e fator cauda para besilato de anlodipino de

99,3% e 1,5, respectivamente.

P á g i n a | 111

Figura 47. Design Space dos fatores vazão e pH para (A) T = 28,8°C; (B) 32,5°C e (C) 36,3°C.

A região em amarelo corresponde a T< 1,5 e a ★ corresponde às condições selecionadas.

6.7 Verificação do modelo

Foram preparadas 6 amostras de forma independente e injetadas no

cromatógrafo nas condições cromatográficas definidas no item anterior, isto é, a pH

de 3,2,, vazão de 0,95 mL min-1 e temperatura de 36,3 ºC. Os resultados para o fator

cauda são mostrados na Tabela 20.

Tabela 20. Resultados obtidos a partir da verificação do modelo proposto pelo planejamento experimental.

Besilato de anlodipino Losartana potássica

Am. tR a b T Am. tR a b T

1 14,31 0,115 0,200 1,4 1 20,71 0,170 0,250 1,2

2 14,32 0,130 0,210 1,3 2 20,73 0,160 0,240 1,3

3 14,32 0,120 0,210 1,4 3 20,72 0,160 0,250 1,3

4 14,31 0,120 0,205 1,4 4 20,71 0,170 0,240 1,2

5 14,30 0,120 0,205 1,4 5 20,74 0,160 0,240 1,3

6 14,32 0,120 0,215 1,4 6 20,72 0,180 0,270 1,3

s: 3,0E-02 s: 2,5E-02

Média: 1,4 Média: 1,2

DRP(%): 2,2 DRP(%): 2,0

onde Am. = Amostra; tR = tempo de retenção; a e b = comprimentos das duas metades

do pico, conforme esquematizado na Figura 13.; T = fator cauda; s = estimativa de

desvio padrão; e DPR(%) = estimativa de desvio padrão relativo.

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P á g i n a | 112

A partir da análise dos dados obtidos, conclui-se que o modelo proposto é

adequado para a finalidade pretendida, ou seja, prever as condições que minimizem

o fator cauda, já que os valores experimentais foram ainda melhores que os valores

teóricos (Tlosartana = 1,4; Tanlodipino = 1,5), com uma estimativa de desvio padrão relativo

aceitável de acordo com o Analytical Target Profile (Tabela 14).

Os valores para pureza de pico obtidos foram todos superiores a 99%, o

que também está de acordo com os valores teóricos, confirmando-se a

adequabilidade do modelo proposto.

6.8 Perfil de degradação

Os resultados obtidos para a degradação forçada da losartana potássica e

besilato de anlodipino realizados conforme descrito no item 5.2.8 e utilizando o método

desenvolvido, são mostrados, respectivamente, nas Tabelas 21 e 22. Os

cromatogramas estão dispostos no Apêndice II.

Para os experimento de degradação forçada térmica (úmida) observa-se

uma diminuição significativa no teor quando o teste foi realizado misturando os dois

fármacos, indicando que, de fato, há incompatibilidade química quando eles são

misturados e confirmando-se a necessidade de uma formulação onde os dois ativos

estejam separados fisicamente. Ainda que essa incompatibilidade tenha ficado

evidente também para o produto acabado, é necessário lembrar-se que os testes

foram realizados com o produto macerado e misturado, deste modo, há interação

direta entre os dois fármacos e os seus excipientes, levando a uma degradação ainda

mais proeminente.

Para alguns experimentos nos quais o ativo em contato com seus

excipientes foram submetidos à uma condição de estresse, como na degradação

forçada térmica (úmida) para losartana potássica, observou-se a diminuição do teor

do fármaco mostrando que também pode haver incompatibilidade do ativo com seus

excipientes, no entanto outros experimentos seriam necessários para confirmar este

fato, preferencialmente utilizando outras técnicas analíticas, como Calorimetria

Diferencial de Varredura (DSC).

P á g i n a | 113

Tabela 21. Perfil de degradação para losartana potássica

Degradação forçada ácida

Amostra Tempo de exposição

(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA LOS 7 103 1 104 99

IFA LOS + AML 7 98 0 98 99

IFA LOS + exc 7 106 0 106 99

Produto acabado 7 96 0 96 99

Degradação forçada básica


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA LOS 7 106 0 106 99

IFA LOS + AML 3 98 0 98 99

IFA LOS + exc 7 101 0 101 99


Degradação forçada oxidativa


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA LOS 1 77 15 92 100

IFA LOS + AML 1 94 4 98 99

IFA LOS + exc 1 92 7 99 99


Degradação forçada térmica (seca)


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA LOS 7 99 0 99 99

IFA LOS + AML 7 89 0 89 99

IFA LOS + exc 7 101 0 101 99


Degradação forçada térmica (úmida)


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA LOS 7 99 0 99 99

IFA LOS + AML 7 71 21 92 100

IFA LOS + exc 7 70 20 90 100


P á g i n a | 114

Tabela 22. Perfil de degradação para besilato de anlodipino

Degradação forçada ácida


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa (%)

Pureza de pico (%)

IFA AML 7 83 7 90 99

IFA LOS + AML 7 86 8 94 99

IFA AML + exc 7 72 14 86 99


Degradação forçada básica


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA AML 3 67 11 78 100

IFA LOS + AML 3 75 9 84 99

IFA AML + exc 3 72 13 85 99


Degradação forçada oxidativa


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA AML 7 95 2 97 99

IFA LOS + AML 1 91 3 94 99

IFA AML + exc 7 83 5 88 99


Degradação forçada térmica (seca)


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA AML 7 99 0 99 99

IFA LOS + AML 7 98 0 98 99

IFA AML + exc 7 94 0 94 99


Degradação forçada térmica (úmida)


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA AML 7 101 0 101 99

IFA LOS + AML 7 58 16 74 100

IFA AML + exc 7 99 0 99 99

Produto acabado 7 2 37 39 NA

P á g i n a | 115

Exposição a íons metálicos


(dias)

Teor (%)

Impurezas (%)

Balanço de massa

Pureza de pico (%)

IFA AML 1 92 3 95 99

IFA LOS + AML 1 NA NA NA NA

IFA AML + exc 1 95 3 98 99

Produto acabado 1 NA NA NA NA

NA = não avaliado; IFA = insumo farmacêutico ativo; AML = besilato de anlodipino; LOS = losartana potássica; exc = excipiente

Observa-se que, na maioria dos experimentos, não foi possível a obtenção

de balanço de massas de 100%, que indica que todo o fármaco degradado foi

integralmente convertido em produto de degradação, e isto pode acontecer por

diversos motivos. Um dos motivos é a degradação excessiva (overstressing) do

fármaco que pode vir acompanhada da degradação dos produtos de degradação,

podendo haver perda do grupo cromóforo, não sendo possível a detecção

empregando o detector PDA e, consequentemente, tornando impossível a

quantificação. Avaliando os valores de teor após a degradação vs. balanço de massas

(Figura 48) para ambos os fármacos, observa-se que, para degradações mais

acentuadas, com teores inferiores a 70% (e, portanto, com degradação superior a

30%), o balanço de massas é prejudicado, ficando distante do valor esperado. Isto

confirma a premissa de que degradações excessivas podem vir acompanhadas de

degradação dos produtos de degradação, podendo haver perda de grupo cromóforo

dos analitos, e não são desejadas. Deste modo, recomenda-se que a redução do teor

esteja entre 5 a 10%.

P á g i n a | 116

Figura 48. Gráfico de balanço de massas vs Teor para losartana potássica e besilato de anlodipino.

A reta em vermelho representa os valores onde teor = balanço de massas,

desta forma, apenas os pontos acima dessa curva representam os experimentos onde

foi possível a detecção e quantificação dos picos de produtos de degradação.

Outro motivo para o balanço de massas não fechar em 100% é a diferença

na resposta que o produto de degradação pode ter em relação ao fármaco de origem,

devido à alterações estruturais nos grupos cromóforos e, consequentemente,

mudanças no espectro de absorção, conforme exemplificado na Figura 49, onde se

observa o espectro de absorção de um produto de degradação do besilato de

anlodipino com espectro de absorção significativamente diferente do obtido para o seu

precursor. Em casos de diferentes espectros de absorção, a quantificação é

prejudicada já que, ao quantificar, o comprimento de onda é fixado, podendo

determinar um teor menor do que o esperado.

O último motivo é a necessidade de correção da diferença de massa molar

entre o fármaco de origem e o produto de degradação a partir da Equação 14.

%𝐹á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜 𝑑𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎𝑑𝑜 = %𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎çã𝑜 𝑥𝑀𝐹

𝑀𝑃𝐷 (14)

onde MF é a massa molar do fármaco de origem e MPD do produto de degradação.

Para este último caso, há necessidade de se conhecer a identidade do produto de

degradação (LUKULAY & HOKANSON, 2005).

P á g i n a | 117

Figura 49. Espectros de absorção na região do ultravioleta para (A) besilato de anlodipino e

(B) um produto de degradação.

Ainda que não se tenha obtido balanço de massas de 100%, obteve-se

entre 99 e 100% de pureza de pico para os picos correspondentes aos fármacos em

todas as amostras, mostrando que há seletividade para os mesmos. Não foi

observada a formação de produtos de degradação para os experimentos envolvendo

apenas os excipientes separadamente, conforme mostrado no Apêndice II.

Não foi possível realizar os testes de exposição de losartana potássica à

íons Cu2+, uma vez que há formação de um complexo insolúvel, descrito por

Lachowicz (2009).

6.9 Validação analítica

6.9.1 Seletividade

Os resultados de seletividade são mostrados no Apêndice II. A etapa de

desenvolvimento do método, utilizando-se ferramentas do Analytical Quality by

Design, foi conduzida de modo a garantir a seletividade na etapa de validação. Deste

modo e, de acordo com os cromatogramas apresentados, não se observa a presença

de picos de interferentes nos tempos de retenção da losartana potássica e besilato de

anlodipino, caracterizando-se o método como seletivo para estes analitos. As purezas

dos picos, conforme mostrado nas Tabelas 21 e 22, encontram-se no intervalo entre

99 e 100%, confirmando-se esta seletividade.

P á g i n a | 118

6.9.2 Linearidade

Os resultados obtidos nos experimentos para avaliação da linearidade das

curvas analítica de losartana potássica e besilato de anlodipino estão mostrados nas

Figuras 50, 51 e 52 e na Tabela 23. A Figura 50 ilustra os gráficos de dispersão dos

resíduos da regressão e os pontos situados fora do intervalo de confiança (±t(0,95,n-

2)*sres), indicado por uma linha tracejada, sugerem a presença de outliers. Aplicando-

se o teste de resíduos padronizados Jacknife (Figura 51), estes outliers foram

confirmados (indicados em vermelho), tendo em vista que o valor de Jei calculado foi

superior ao valor de t(0,95,n-p-1) (indicado por uma linha tracejada) para estes pontos em

questão. Os valores foram então rejeitados e o teste Jacknife novamente aplicado

para os pontos remanescentes. Após a segunda aplicação do teste Jacknife não foram

identificados outliers e a regressão pelos mínimos quadrados foi refeita. As

representações gráficas das curvas após a retirada dos outliers podem ser vistas na

Figura 52. As equações das retas de regressão de y em x, estimada pelo método dos

mínimos quadrados, já contendo o intervalo de confiança, também são apresentadas

no gráfico.

Figura 50. Gráfico de dispersão dos resíduos da regressão com os respectivos intervalos de confiança para (A) losartana potássica e (B) besilato de anlodipino.

P á g i n a | 119

Figura 51. Teste de resíduos padronizados Jacknife após a primeira aplicação (A) e após a segunda aplicação (B) para losartana potássica; e após a primeira aplicação (C) e após a segunda aplicação (D) para besilato de anlodipino.

P á g i n a | 120

Figura 52. Curvas analíticas obtidas para (A) losartana potássica e (B) besilato de anlodipino.

A homoscedasticidade foi confirmada uma vez que a variabilidade dos

resíduos da regressão ao longo das concentrações estudadas se manteve constante,

tendo em vista que os valores calculados de C de Cochran (0,3437 e 0,2051 para

losartana potássica e besilato de anlodipino, respectivamente) não excederam o valor

crítico de 0,3595.

P á g i n a | 121

O teste de Ryan-Joiner indicou que os resíduos seguem distribuição

Normal, uma vez que os coeficientes de correlação - 0,9947 para losartana potássica

e 0,9910 para o besilato de anlodipino - são maiores que os valores críticos - 0,9814

e 0,9880 respectivamente. Desta maneira, não é possível rejeitar a hipótese de que a

amostra provém de uma população normal, a um nível de 95 % de confiança.

A regressão mostrou-se significativa, uma vez que os valores de F

calculados para a razão MQR/MQr (3864 e 2478 para losartana potássica e besilato

de anlodipino, respectivamente) superaram os valores críticos F(0,95,p-1,n-p) (4,08 e 4,06

para losartana potássica e besilato de anlodipino, respectivamente), deste modo,

rejeitou-se H0 e consideramos a regressão significativa.

A Tabela 23 mostra um resumo do estudo estatístico realizado.

Tabela 23. Resumo dos resultados dos testes estatísticos realizados para linearidade.

Estatística Losartana

(LOS) Anlodipino

(AML) Crítico (LOS)

Crítico (AML)

Número de observações

n 43 47

Coeficiente de correlação

r 0,9947 0,9910

Coeficiente de determinação

R² 0,9895 0,9822

Normalidade (Ryan-Joiner)

R 0,9814 0,9880 0,9947 0,991

Homocedasticidade (Cochran)

C 0,3437 0,2051 0,3595 0,3595

Regressão

F 3864 2478 4,08 4,06

6.9.3 Precisão

6.9.3.1 Massa média das cápsulas

As medidas observadas para 9 determinações de massa das cápsulas do

produto LOTAR®, são mostradas na Tabela 24. O valor da massa média, calculado

por média aritmética, é igual a 385,34 mg.

P á g i n a | 122

Tabela 24. Massa média obtida para as cápsulas de LOTAR®.

Cápsula Massa (mg)

1 382,90

2 382,28

3 386,38

4 380,03

5 388,31

6 391,70

7 388,07

8 386,38

9 381,99

Média: 385,34

6.9.3.2 Cálculo dos limites de precisão

Considerando 1 mL = 1 g, tem-se que Closartana = 0,001 mg mg-1 e Canlodipino

= 0,000139 mg mg-1.

De acordo com a Equação 8, tem-se que os valores limites a serem

adotados são:

𝐷𝑃𝑅 (%) = 2(1−0,5 log 𝐶)

𝐷𝑃𝑅𝐿𝑜𝑠𝑎𝑟𝑡𝑎𝑛𝑎 (%) = 2(1−0,5 log 0,001) = 𝟓, 𝟕 (𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠ã𝑜 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑖á𝑟𝑖𝑎)

2

3𝐷𝑃𝑅𝐿𝑜𝑠𝑎𝑟𝑡𝑎𝑛𝑎 (%) =

2

3. 5,7 = 𝟑, 𝟖 (𝑟𝑒𝑝𝑒𝑡𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒)

𝐷𝑃𝑅𝐴𝑛𝑙𝑜𝑑𝑖𝑝𝑖𝑛𝑜 (%) = 2(1−0,5 log 0,000139) = 𝟕, 𝟔 (𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠ã𝑜 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑖á𝑟𝑖𝑎)

2

3𝐷𝑃𝑅𝐴𝑛𝑙𝑜𝑑𝑖𝑝𝑖𝑛𝑜 (%) =

2

3. 5,7 = 𝟓, 𝟏 (𝑟𝑒𝑝𝑒𝑡𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒)

6.9.3.3 Precisão (repetibilidade)

Os resultados obtidos a partir dos ensaios realizados para precisão

(repetibilidade) são mostrados na Tabela 25.

P á g i n a | 123

Tabela 25. Valores obtidos experimentalmente no ensaio de precisão (repetibilidade).

Replicata Respostas

Losartana potássica Besilato de anlodipino

1 140788 10797

2 138171 10665

3 131976 10221

4 140613 10073

5 135384 10276

6 135695 10257

Média 137105 10382

s 3413,6 283,05

DPR experimental (%) 2,5 2,7

DPR crítico (%) 3,8 5,1

De acordo com os ensaios realizados, observa-se que os valores

experimentais para estimativa de desvio-padrão (DPR) encontram-se abaixo dos

valores críticos calculados a partir da equação de Horwitz no item 6.9.3.2, deste modo,

o método pode ser considerado preciso.

6.9.3.4 Precisão intermediária

Os resultados obtidos a partir dos ensaios realizados para precisão

intermediária são mostrados nas Tabelas 26 e 27.

Tabela 26. Valores obtidos experimentalmente para losartana potássica no ensaio de precisão intermediária.

Dia Analista Resposta Dia Analista Resposta

1

A

140788

2

A

130891

138171 137176

131976 131682

140613 139635

135384 137704

135695 132573

B

133362

B

134357

134397 136238

129174 137710

128461 139412

133505 130769

134001 139911

P á g i n a | 124

Tabela 27. Valores obtidos experimentalmente para besilato de anlodipino no ensaio de precisão intermediária.

Dia Analista Resposta Dia Analista Resposta

1

A

10797

2

A

10454

10665 10740

10221 9791

10073 9886

10276 10203

10257 10236

B

11355

B

9827

10750 10157

10587 9982

10758 10031

10869 10091

11558 10222

Realizou-se a Análise de Variância (ANOVA), a partir do software

ActionStat, onde foi avaliado se existem diferenças significativas entre os dias e

analistas. Os resultados para a ANOVA são mostrados nas Tabelas 28, 29, 30 e 31.

Tabela 28. Disposição de dados para ANOVA gerados para avaliar os resultados do ensaio de precisão intermediária para a losartana potássica.

G.L. Soma dos quadrados

Quadrados Médios

Estatística F

P-Valor

Dia 1 6542748,37 6542748,375 0,1061 0,799

Analista 1 18359253,4 18359253,38 0,2978 0,682

Repetitividade 20 218826581 10941329,03

Tabela 29. Resultados para o ensaio de precisão intermediária para losartana potássica.

Desvio-padrão DPR experimental (%) DPR crítico (%)

Repetitividade 3308 2,4

Analista 0 0

Dia 0 0

Precisão Intermediária 4404 3,3 5,7

Tabela 30. Disposição de dados para ANOVA gerados para avaliar os resultados do ensaio de precisão intermediária para o besilato de anlodipino.

G.L. Soma dos quadrados

Quadrados Médios

Estatística F

P-Valor

Dia 1 1785421,5 1785421,5 2,036 0,389

Analista 1 279072,6667 279072,6667 0,318 0,673

Repetitividade 20 1862929,667 93146,48333

P á g i n a | 125

Tabela 31. Resultados para o ensaio de precisão intermediária para o besilato de anlodipino.

Desvio-padrão DPR experimental (%) DPR crítico (%)

Repetitividade 305,19909 2,9

Analista 0 0

Dia 275,12858 2,6

Precisão Intermediária 547,26281 5,3 7,6

De acordo com o teste estatístico, os valores de p foram superiores a 0,05

(5% de significância), deste modo as diferenças tanto para o fator Dia quanto para o

fator Analista não devem ser consideradas significativas. Em relação as estimativas

dos desvios-padrão relativos (DPR), observa-se que os valores experimentais estão

abaixo dos valores críticos calculados a partir da equação de Horwitz no item 6.9.3.2,

deste modo, confirma-se que não há diferenças significativas entre os fatores e o

método pode ser considerado preciso.

6.9.4 Exatidão

Os resultados obtidos a partir dos ensaios realizados para exatidão para

losartana potássica e besilato de anldipino, são mostrados nas Tabelas 32 e 33.

Tabela 32. Valores de recuperação obtidos para a losartana potássica no ensaio de exatidão.

Rep. Nível Resposta Conc.

(teórica), mg mL-1

Conc. (curva), mg mL-1

Média (mg mL -1)

Recup. (%)

1 Baixo (50%)

68395

0,499

0,491

0,504 101 2 71002 0,511

3 70998 0,511

1 Médio (100%)

139545

0,999

1,027

1,025 103 2 139732 1,028

3 138447 1,019

1 Alto

(120%)

168538

1,199

1,245

1,259 105 2 169325 1,251

3 173462 1,282

A faixa crítica estabelecida pelos compêndios oficiais para recuperação do

losartana potássica é de 95 a 105%, conforme indicado na Tabela 14. Uma vez que

os valores de recuperação encontram-se dentro dos limites estabelecidos pelos

compêndios oficiais, o método pode ser considerado exato para losartana potássica.

P á g i n a | 126

Tabela 33. Valores de recuperação obtidos para o besilato de anlodipino no ensaio de

exatidão..

Rep. Nível Resposta Conc.

(teórica), mg mL-1

Conc. (curva), mg mL-1

Média (mg mL -1)

Recup. (%)

1 Baixo (50%)

5759

0,071

0,066

0,068 96 2 6017 0,070

3 5838 0,068

1 Médio (100%)

11495

0,142

0,143

0,144 101 2 11463 0,143

3 11629 0,145

1 Alto

(120%)

14066

0,170

0,178

0,180 106 2 14269 0,180

3 14425 0,182

A faixa crítica estabelecida pelos compêndios oficiais para recuperação do

besilato de anlodipino é de 90 a 110%, conforme indicado na Tabela 14. Uma vez que

os valores de recuperação encontram-se dentro dos limites estabelecidos pelos

compêndios oficiais, o método pode ser considerado exato para besilato de

anlodipino.

6.9.5 Robustez

A partir do planejamento experimental realizado, descrito no item 5.2.6.2,

foram obtidos os resultados que são mostrados na Tabela 34. Após o tratamento dos

dados utilizando-se o software Design Expert (STAT-EASE, 2017), definiu-se um

Design Space (Figura 47) que satisfizesse os limites estabelecidos pelos compêndios

oficiais (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2017), mostrados na Tabela 14. O

Design Space pode ser considerado uma região robusta, tendo em vista que

mudanças concebidas dentro desta região possuem desempenho conhecido e estão

de acordo com os compêndios. Uma vez que o método foi desenvolvido de acordo

com as condições cromatográficas definidas a partir dos resultados do Design Space,

o método pode ser considerado robusto. Uma das grandes vantagens de se utilizar

ferramentas de Analytical Quality by Design, como o Design Space, no

desenvolvimento de metodologia analítica é ter a qualidade do método testada desde

o início, deste modo, surpresas desagradáveis são evitadas na etapa de validação.

P á g i n a | 127

Tabela 34. Resultados para a pureza de pico, resolução, eficiência e fator de causa dos dois fármacos obtidos a partir de

variações de vazão da fase móvel, pH e temperatura da coluna.

Vazão (mL min-1)

pH Temp (°C)

Pureza (LOS)

Pureza (AML)

Resolução Eficiência

(LOS) Eficiência

(AML)

Fator cauda (LOS)

Fator cauda (AML)

0,8 3,0 28,8 99,6 98,9 29,7 45839 62495 1,4 1,4

1,0 4,0 28,8 99,5 99,5 20,3 53030 52921 1,7 1,5

0,9 3,5 25,0 99,6 99,5 22,8 47279 58217 1,5 1,5

0,8 4,0 28,8 99,6 99,3 20,3 62460 50935 1,7 1,6

1,0 3,0 36,3 99,7 98,9 30,3 48322 54649 1,4 1,3

0,8 4,0 36,3 99,7 99,5 19,8 70737 54340 1,7 1,6

0,9 3,5 32,5 99,6 99,6 24,3 60117 65633 1,5 1,4

0,8 3,0 36,3 99,7 98,3 31,7 54406 66522 1,5 1,3

1,1 3,5 32,5 99,7 99,4 23,2 52886 58595 1,5 1,4

0,9 3,5 32,5 99,7 99,5 24,5 60244 69589 1,6 1,4

0,9 3,5 32,5 99,6 99,5 24,4 60243 68420 1,6 1,5

0,7 3,5 32,5 99,6 99,5 25,1 69716 70618 1,6 1,5

0,9 3,5 40,0 99,6 99,6 24,5 29043 67983 1,6 1,3

1,0 3,0 28,8 99,7 99,8 27,9 40457 51474 1,4 1,3

1,0 4,0 36,3 99,7 98,3 20,3 66728 58986 1,5 1,5

P á g i n a | 128

7 CONCLUSÕES

Houve muitos desafios, sobretudo no que se refere ao modo de se conduzir

os estudos de degradação forçada. Ainda que a legislação não defina o modo de se

fazer os estudos, concluiu-se que há alguns modos mais adequados do que outros.

Ao conduzir os ensaios em suspensão, por exemplo, observou-se que, ainda que se

realize o procedimento sistematicamente da mesma maneira, os resultados não se

repetem. Da mesma maneira que, ao se conduzir os ensaios em solução e na

presença de metanol, este age como nucleófilo em condições de estresse, gerando

resultados não representativos, devido à ausência deste solvente nas formulações

farmacêuticas. Concluiu-se que o melhor modo de se conduzir os experimentos era

em solução contendo acetonitrila, como solvente orgânico, de modo a gerar

degradação de, no máximo, 10%, evitando-se uma degradação excessiva

(overstressing) indesejado e não representativo nas condições normais de prateleira.

Observou-se que um overstressing pode gerar degradação dos próprios

produtos de degradação, podendo vir acompanhada de perda de grupo cromóforo,

impossibilitando-se a detecção destas impurezas secundárias (ou posteriores) por

método espectrofotométrico.

Os resultados obtidos a partir de ensaios de degradação forçada térmica

(úmida) apontaram para uma incompatibilidade química entre os fármacos losartana

potássica e besilato de anlodipino, notada a diminuição de teor expressiva quando

colocados os fármacos em contato direto durante a execução do experimento.

Observou-se ainda, um indicativo de incompatibilidade entre a losartana potássica e

os componentes dos seus excipientes, visto que, em contato direto, há degradação

expressiva deste fármaco na condição de estresse térmico (úmido).

Somada a dificuldade de definir as condições de degradação mais

adequadas para os analitos em questão, estava a concentração do fármaco. A

dosagem do medicamento de referência (Lotar®) apresentava um fármaco dez vezes

mais concentrado do que o outro (losartana potássica a 50 mg e besilato de anlodipino

a 5 mg). Ao degradar uma amostra contendo os fármacos nesta concentração,

observava-se apenas os produtos de degradação da losartana, que estava em maior

concentração. Ao aumentar a concentração do besilato de anlodipino, no entanto,

havia um alargamento excessivo do pico referente da losartana potássica, que coeluia

P á g i n a | 129

com impurezas adjacentes. A adoção da concentração equimolar dos fármacos na

condução dos estudos de degradação forçada, mostrou-se adequada, tendo em vista

que foi possível a detecção dos produtos de degradação de ambos os fármacos, em

mesma ordem de grandeza.

A etapa de triagem foi fundamental para a determinação da melhor opção

de pH, química de colunas e modificador orgânico da fase móvel, diminuindo-se,

consideravelmente a quantidade de CMP levados para a etapa de otimização da

metodologia analítica, utilizando-se DoE.

O procedimento de preparação de amostra, mostrou-se apropriado para os

fins pretendidos, tendo em vista que se gerou uma amostra representativa, contendo

todos os prováveis produtos de degradação em um mesmo cromatograma, facilitando-

se, com isso, o desenvolvimento da metodologia analítica. Mais adequado teria sido

realizar o desenvolvimento do método utilizando-se padrões dos produtos de

degradação, onde seria possível identificar essas impurezas e, com isso, designá-las

no DoE e otimizar a resolução entre elas.

As ferramentas de Analytical Quality by Design, utilizadas durante toda a

etapa de desenvolvimento da metodologia analítica, foram especialmente úteis na

validação já que, uma vez que a qualidade dos CQA foi testada desde o início,

parâmetros como seletividade e robustez já haviam sido avaliados e não houveram

surpresas desagradáveis. Com relação aos outros parâmetros de validação, o método

se mostrou adequado também para linearidade, precisão e exatidão.

Por fim, com base nos dados obtidos a partir de um estudo de degradação

forçada e, consequentemente, com a definição do perfil de degradação potencial para

uma associação de losartana potássica e besilato de anlodipino, conclui-se que foi

possível desenvolver e validar um método indicativo de estabilidade, utilizando-se

técnicas e conceitos de Analytical Quality by Design (QbD).

P á g i n a | 130

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P á g i n a | 140

APÊNDICE I Varredura dos comprimentos de onda

P á g i n a | 141

P á g i n a | 142

P á g i n a | 143

0

Tempo (min)

P á g i n a | 144

APÊNDICE II Perfil de degradação

P á g i n a | 145

A – Produto acabado; B – IFA de losartana + excipientes; C – IFA de anlodipino + excipientes; D- IFA de losartana + IFA de

anlodipino; E – IFA de losartana; F – IFA de anlodipino; G – Padrão; H – Excipientes; I – Fase móvel; J – Diluente + estressante.

P á g i n a | 146



P á g i n a | 147



P á g i n a | 148


anlodipino; E – IFA de losartana; F – IFA de anlodipino; G – Padrão; H – Excipientes; I – Fase móvel; J – Diluente.

P á g i n a | 149


anlodipino; E – IFA de losartana; F – IFA de anlodipino; G – Padrão; H – Excipientes; I – Fase móvel; J – Diluente.

P á g i n a | 150

A – IFA do anlodipino + excipientes; B – IFA do anlodipino; C – Padrão; D- Excipientes; E – Fase móvel; F – Diluente +

estressante.

universidade estadual de campinas instituto de...

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