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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

ALINE BARROS SANTANA

AVALIAÇÃO DAS EXPRESSÕES PROTEICAS TECIDUAIS E CONCENTRAÇÕES

SÉRICAS DE AMILÓIDE SÉRICA – A E ADIPONECTINA EM MULHERES COM

CÂNCER DE MAMA E RELAÇÃO COM OBESIDADE

CAMPINAS

2016


AVALIAÇÃO DAS EXPRESSÕES PROTEICAS TECIDUAIS E CONCENTRAÇÕES

SÉRICAS DE AMILÓIDE SÉRICA – A E ADIPONECTINA EM MULHERES COM

CÂNCER DE MAMA E RELAÇÃO COM OBESIDADE

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora

em Ciências Médicas, na área de concentração em

Ciências Biomédicas.

Orientadora: Profª. Drª. Sílvia de Barros Mazon

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA

ALINE BARROS SANTANA, E ORIENTADA PELA PROFª. DRª. SÍLVIA DE BARROS

MAZON.

CAMPINAS

2016

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO


ORIENTADOR: Sílvia de Barros Mazon

MEMBROS:

1. PROFª. DRª Sílvia de Barros Mazon

2. PROFª. DRª. Helenice Gobbi

3. PROFª. DRª. Márcia Carvalho Garcia

4. PROFª. DRª. Liliana Aparecida Lucci De Angelo Andrade

5. PROFª. DRª. Elaine Conceição de Oliveira

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de

Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca

examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 24/02/2016

Dedico este trabalho a

Nivaldir Antonio Santana e Theo Barros Santana

AGRADECIMENTOS

Profa. Dra. Sílvia de Barros Mazon - Departamento de Patologia Clínica/FCM,

pela orientação.

Profa. Dra. Maria Salete da Costa Gurgel - Departamento de Tocoginecologia/FCM.

Profa. Dra. Eliana Cotta de Faria - Departamento de Patologia Clínica/FCM.

Prof. Dr. José Vassalo – Departamento de Anatomia Patológica/FCM

Profa. Dra. Glauce Aparecida Pinto - Laboratório de Patologia Especializada (LAPE)

do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM.

Dra. Luciana Regina Moreira – Laboratório de Citopatologia do Hospital da Mulher

Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM

Marisa de Almeida Matsura - Laboratório de Patologia Especializada (LAPE) do

Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM

Carlos Ferreira Nascimento - Departamento de Patologia Investigativa do AC

Camargo Cancer Center

Cleide Aparecida Moreira Silva - Câmara de Pesquisa/FCM.

Aos funcionários da secretaria do Departamento de patologia Clínica: Paulo

Henrique de Oliveira e Bruna de Almeida Bianchine

Aos funcionários da Seção de Imunologia da Divisão de Patologia Clínica do

Hospital das Clínicas – UNICAMP.

Aos funcionários da Seção de Bioquímica da Divisão de Patologia Clínica do

Hospital das Clínicas – UNICAMP.

Aos funcionários do serviço de Enfermagem da Unidade de Internação - Seção

Oncologia do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM.

Rogéria Elias Malaquias (in memoriam) - Serviço de Arquivo Médico (SAME) do

Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM.

Aos funcionários da Divisão de Oncologia: Neuza Aparecida de Melo Balduci,

Débora Fernanda Glicério Andrade Fernandes e Sônia Aparecida Pianca.

Aos funcionários da Seção de Coleta de Exames da Divisão de Patologia Clínica do

HC/UNICAMP

Aos funcionários da Central de Recepção e Separação de Amostras da Divisão de

Patologia Clínica do HC/UNICAMP.

Higor Campos do Nascimento – Laboratório de Imunorregulação FCM/UNICAMP

A todas as pacientes da Unidade de Internação - Seção Oncologia do Hospital da

Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM, participantes desta pesquisa.

Aos meus pais, Renato e Alice.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), à

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), e ao

Fundo de Apoio ao Ensino, à Pesquisa e Extensão (FAEPEX).

Aos queridos amigos,

Muito Obrigada!

“Se temos de esperar, que seja para colher a semente boa que lançamos

hoje no solo da vida”.

(Cora Coralina)

RESUMO

Mulheres obesas apresentam risco aumentado para o câncer de mama, e este tem

sido associado a uma alteração de mediadores inflamatórios e adipocinas. A obesidade

cursa com um estado inflamatório subclínico e está intimamente relacionada a diversas

comorbidades, incluindo a síndrome metabólica (SM). Na vigência da inflamação

subclínica, as adipocinas amilóide sérica SAA e adiponectina APN, que possuem

funções antagônicas, têm suas concentrações séricas alteradas. Além disso, ambas

têm sido associadas com a instalação e a progressão do câncer de mama. O objetivo

deste trabalho foi investigar em pacientes com câncer de mama, as relações das

adipocinas SAA e APN com a obesidade, com a SM e com as características clínico-

patológicas da doença. Desta forma, 196 pacientes na pré- ou pós-menopausa foram

classificadas em três grupos: não obesas (NO), n= 42; sobrepeso/obesidade (SP/O),

n= 103; e sobrepeso/obesidade com síndrome metabólica (SP/O-SM), n= 51 e todas

foram submetidas à análise das concentrações séricas e da expressão proteica de SAA

e APN em espécimes cirúrgicos provenientes de mastectomia ou quadrantectomia. As

concentrações séricas de SAA foram determinadas por nefelometria e as de APN por

imunoensaio enzimático (ELISA). A expressão tecidual das adipocinas foi analisada

pelas técnicas de Tissue Microarray (TMA) e imunoistoquímica, em quatro diferentes

áreas teciduais: epitélio tumoral (T), epitélio não tumoral (NT), tecido adiposo

peritumoral (GP) e distante do tumor (GD). Os grupos SP/O (p=0,0028) e SP/O-SM

(p=0,0013), demonstraram concentrações séricas mais elevadas de SAA do que o

grupo NO e inversamente, concentrações mais reduzidas de APN (SP/O, p=0,0073 e

SP/O-SM, p=0,0002). Concentrações séricas mais elevadas de SAA foram observadas

em pacientes com tumores que não expressavam RE (RE-), tanto no grupo total

(p=0,009), quanto no subgrupo NO (p=0,043). Também foram detectadas

concentrações séricas mais elevadas de APN no grupo total de pacientes com tumores

RE- (p=0,011). Estes resultados foram independentes de obesidade (IMC e CA) e

estado menopausal. Em relação às análises de expressão proteica, no grupo total de

pacientes foram detectadas diferenças de expressão de SAA entre todos os tecidos (≤

0,0439), com expressão mais frequente nos tecidos adiposos GP (76,6%) e GD

(87,9%), seguidos dos epitélios NT (61,7%) e T (40%). Também foi verificada

expressão mais frequente de APN nos tecidos adiposos GP (94,4%) e GD (98,4%) em

relação aos epitélios T (82,9%, p≤ 0,0115) e NT (9%, p< 0,0001), sendo que a

diferença também foi significativa entre os epitélios T e NT (p< 0,0001). Quando os

tecidos foram analisados quanto à diferença de expressão entre as proteínas,

observou-se que a expressão de SAA no epitélio T foi 2,1 vezes menos frequente do

que a de APN (p< 0,0001) e no epitélio NT 6,9 vezes mais frequente do que APN (p<

0,0001). A análise de frequência entre as proteínas nos diferentes tecidos dentro de

cada subgrupo revelou expressão de SAA no epitélio NT aproximadamente 15 vezes

mais frequente do que a de APN no grupo SP/O-SM (p< 0,0001). Em relação à

associação da expressão das adipocinas com as características clínico-patológicas do

câncer de mama, verificou-se elevada frequência de pacientes com ECP III que não

expressavam SAA no tecido adiposo GP. Não foram detectadas associações entre as

concentrações séricas e as expressões teciduais das proteínas investigadas. A

demonstração de concentrações séricas mais elevadas de SAA e APN em pacientes

com tumores RE- sugere um estímulo de respostas sistêmicas antagônicas na vigência

de tumores mais agressivos. Já, a detecção de expressão diferencial de SAA e APN no

epitélio T poderia ser associada aos efeitos antiproliferativos e pró-apoptóticos de APN

no microambiente tumoral. Em contrapartida, SAA mais frequente no epitélio NT,

poderia sugerir a presença de maior atividade inflamatória no ambiente peritumoral,

que seria ainda mais exacerbada no grupo SP/O-SM.

Palavras-chave: SAA – APN – obesidade - síndrome metabólica – inflamação - câncer

de mama.

Abstract

Obese women are at increased risk for breast cancer, and this condition has been

associated with a change of inflammatory mediators and adipokines. Obesity is

associated with a low grade chronic inflammation and it is closely related to several

comorbidities including the metabolic syndrome (MetS). As part of low grade

inflammation, the antagonistic adipokines serum amyloid A (SAA) and adiponectin

(APN) have changes in their serum concentrations. In addition, both have also been

associated with the development and prognosis of breast cancer. This study aimed to

investigate the relationship of SAA and APN with obesity, MetS and with the clinical and

pathological features of breast cancer. Thus, 196 patients were classified into three

groups: non-obese (NO), n= 42; overweigh/obesity (OW/O), n= 103; and

overweight/obesity with MetS (OW/O-MetS), n= 51 and all of them have had SAA and

APN serum concentrations and protein expression in surgical specimens from

mastectomy and quadrantectomy analyzed. The serum concentrations of SAA and APN

were respectively determined by nephelometry and by enzymatic immunoassay (ELISA)

and the protein expression by immunohistochemistry tissue microarray (TMA), was

done for four different tissue tumor epithelium (T), non-tumor (NT), adipose tissue close

to tumor (GP) and adipose tissue distant from tumor (GD). The OW/O (p= 0.0028)

and OW/O-MetS (p= 0.0013) groups showed higher serum concentrations of SAA than

NO group, and conversely, lower concentrations of APN (OW/O, p= 0.0073 and OW/O-

MetS, p= 0.0002). Higher concentrations of SAA were observed in patients bearing RE-

tumors from total p= 0.009, and NO group p= 0.043. Higher APN serum concentrations

were also detected in patients with RE- tumors from the total group of patients (p=

0.011). Those results were independent of obesity (BMI and WC) and menopausal

status. Regarding protein expression in the total group of patients, adipose tissue close

to tumor (GP) and distant from tumor (GD) had the higher frequencies of SAA

expression, 76.6% and 87.0 respectively, followed by non-tumor (T), 61.7%, and tumor

epithelium (T), 40%. Higher frequencies of APN expression were observed in GD

(98.4%), GP (94.4%) and T (82.9%) samples, in contrast to 9.0% frequency in NT tissue

(p

group NT epithelium the expression frequencies of SAA was around 15 fold higher than

APN. Regarding the association of frequency expression of adipokines with the breast

cancer clinical and pathological features, we observed enhanced frequency of patients

with ECP III, with no expression of SAA in adipose tissue GP. The results demonstrate

direct and inverse association respectively of serum SAA and APN with obesity and

MetS, but no correlation between adipokines serum concentrations. The fact that the

concentrations of both, SAA as APN were related to RE- tumors, would suggest

antagonist systemic responses in those patients. Opposite frequency expression

between SAA and APN in T and NT epithelium could be associated with anti-

proliferative and pro-apoptotic functions of APN.

Keywords: SAA. APN. Obesity. Metabolic syndrome. Inflammation. Breast cancer.

LISTA DE ESQUEMAS E FIGURAS

Esquema 1: Mecanismo proposto para explicar a associação da obesidade com

tumores mamários RE positivos a partir da produção estrogênica extra

glandular.....................................................................................................................24

Esquema 2: Mecanismo proposto para explicar a associação da obesidade com

tumores mamários RE positivos a partir da hiperinsulinemia que pode acompanhar a

obesidade...................................................................................................................26

Esquema 3: Esquematização da ação sinérgica dos mecanismos propostos para

explicar a relação da obesidade com a

carcinogênese............................................................................................................29

Esquema 4: Constituição inicial dos grupos de estudo: NO (não obesas) e SP/O

(sobrepeso-

obesidade).................................................................................................................40

Esquema 5: Reagrupamento das pacientes em estudo: grupos NO, SP/O e SP/O-

SM.............................................................................................................................51

Figura 1: Blocos e lâminas pareadas e demarcadas com as áreas de interesse para confecção do TMA...........................................................................................................................45

Figura 2: Etapas geral do processo de construção dos blocos e obtenção dos cortes

de tissue microarray (TMA)........................................................................................45

Figura 3: Comparação das concentrações séricas de SAA e APN entre os três

grupos de estudo de pacientes com câncer de

mama.........................................................................................................................54

Figura 4: Imagem representativa da reação imunoistoquimica de SAA nas quatro

regiões

estudadas..................................................................................................................61

Figura 5: Imagem representativa da reação imunoistoquimica de APN nas quatro

regiões estudadas ....................................................................................................62

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Tabela 1: Escores finais obtidos pela análise simultânea dos parâmetros:

intensidade de reação e porcentagem de células reativas.......................................47

Tabela 2: Classificação das variáveis dicotômicas...................................................48

Tabela 3: Dados demográficos, antropométricos, bioquímicos e clinico-patológicos

entre os grupos NO e SP/O.......................................................................................50

Tabela 4: Dados demográficos, antropométricos, bioquímicos e clinico-patológicos

entre os grupos NO, SP/O e SP/O-SM......................................................................53

Tabela 5: Análise de correlação entre SAA e APN no grupo total e nos subgrupos de

pacientes com câncer de mama.................................................................................55

Tabela 6: Associação das concentrações séricas de SAA com as variáveis clínico-

patológicas da doença no grupo total e nos subgrupos NO, SP/O e SP/O-

SM............................................................................................................................57

Tabela 7: Associação das concentrações séricas de APN com as variáveis clínico-

patológicas da doença no grupo total e nos subgrupos NO, SP/O e SP/O-

SM.............................................................................................................................59

Tabela 8: Comparação entre as frequências de expressão proteica de SAA e APN

nos microarranjos T, NT GD e GP dos espécimes cirúrgicos de carcinoma ductal

invasivo da mama do grupo total de pacientes..........................................................64

Tabela 9: Comparação das frequências de expressão de SAA e APN entre os

microarranjos T, NT GD e GP dos espécimes de carcinoma ductal invasivo da mama

no grupo total de pacientes........................................................................................65

Tabela 10. Comparação da frequência da expressão entre SAA e APN nos


nos subgrupos NO, SP/O e SP/O-SM de pacientes..................................................67

Tabela 11. Comparação da frequência de expressão de SAA e APN entre os


nos subgrupos NO, SP/O e SP/O-SM........................................................................69

Quadro 1: Critérios para identificação de síndrome metabólica nas pacientes em

estudo........................................................................................................................41

Quadro 2: Especificações dos anticorpos.................................................................47

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Português Inglês

AdipoR1 receptor para adiponectina-1 adiponectin receptor-1

AdipoR2 receptor para adiponectina-2 adiponectin receptor-2

AKT ---------- Kinase B protein

AMPK ---------- AMP activated protein kinase

APN

Col-T

adiponectina

colesterol total

adiponectin

----------

CA circunferência abdominal ----------

ERK ---------- extracelular signal regulated kinase

Gli glicose ----------

HDL-Col lipoproteína de alta densidade high-density- lipoproteins

HER2 receptor para fatores de crescimento human epidermal growth factor receptor 2

IGF ---------- insulin-like growth factor

IMC índice de massa corpórea ----------

IL-1 ínterleucina-1 ----------

IL-6 interleucina-6 ----------

LDL-Col lipoproteína de baixa densidade low - density lipoprotein

MAPK ---------- mitogen activated protein

kinase

mTOR ---------- mammalian target of

rapamycin

PI3K ---------- phosphatidylinositol 3 kinase

RE receptor de estrógeno ----------

RP receptor de progesterona ----------

SAA amiloide sérica A serum amyloid A

SHBG globulina ligante de hormônio sexual sex hormone-binding globulin

SM síndrome metabólica ----------

TG triglicérides ----------

TLR4 ---------- toll like receptor 4

TMA microarranjo tecidual tissue microarray

TAM macrófagos associados ao tumor tumor associated macrophages

TNM T: extensão do tumor primário - N: ausência ou presença e a extensão de metástase em linfonodos regionais - M: ausência ou presença de metástase à distância

----------

TNF-α fator de necrose tumoral alfa tumor necrosis factor alpha

TNBC tumores mamários triplo negativos triple negative breast cancer

VR valor de referência

LISTA DE SÍMBOLOS

cm - centímetro

dL - decilitro

g - grama

h - hora

kg - quilograma

L - litro

M - molar

mg - miligrama

min - minuto

mL - mililitro

mmHg - milímetro de mercúrio

m2 - metro quadrado

n - tamanho da amostra

ng - nanograma

nm - nanômetro

p - p valor, nível de significância estatística

pg - picograma

rpm - rotação por minuto

ºC - graus Celsius

µg - micrograma

µL - microlitro

µm - micrômetro

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 21

2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 36

2.1. OBJETIVO GERAL .............................................................................................36

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................36

3. SUJEITOS E MÉTODOS .......................................................................................... 37

3.1. TIPO DE ESTUDO ................................................................................................ 37

3.2. TAMANHO AMOSTRAL.........................................................................................37

3.3. SELEÇÃO DOS SUJEITOS..................................................................................38

3.3.1 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO ..............................................................................................39

A. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO .....................................................................................39

B.CRITÉRIOS DE XCLUSÃO......................................................................................39

3.3.2 CONSTITUIÇÃO INICIAL DOS GRUPOS......................................................................39

3.4. COLETA DE SANGUE ....................................................................................... 40

3.5.QUANTIFICAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE COLESTEROL TOTAL E FRAÇÕES, TRIGLICERÍDEOS E GLICOSE ............................................................. 40

3.6. CARATERIZAÇÃO DA SÍNDROME METABÓLICA ENTRE AS PACIENTES ... 41

3.7. QUANTIFICAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE SAA ..................... 41

3.8. QUANTIFICAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE APN ..................... 42

3.9. COLETA DAS INFORMAÇÕES CLÍNICO PATOLÓGICAS ............................... 43

3.10. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA TECIDUAL DE SAA E APN NAS

QUATRO REGIÕES ESTUDADAS DA MAMA DAS PACIENTES COM CÂNCER DE

MAMA............................................................................................................................44

A- CONSTRUÇÃO DO MICROARRANJO DE TECIDOS - TISSUE MICROARRAY

(TMA).....................................................................................................................................44

B- ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA PARA INVESTIGAÇÃO DA EXPRESSÃO DAS

PROTEÍNAS SAA E APN .................................................................................................... 46

C- INTERPRETAÇÃO DO ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO................................................47

3.11. ANÁLISES DE DADOS............................................................................................48

4. RESULTADOS...........................................................................................................49

4.1 DADOS DEMOGRÁFICOS, ANTROPOMÉTRICOS, BIOQUÍMICOS E CLÍNICO-PATOLÓGICOS ENTRE OS GRUPOS NO E SP/O.......................................................49

4.2. DADOS DEMOGRÁFICOS, ANTROPOMÉTRICOS, BIOQUÍMICOS E CLÍNICO-PATOLÓGICOS ENTRE OS GRUPOS NO, SP/O E SP/O-SM ..................................... 51

4.3. COMPARAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DE SAA E APN ENTRE OS TRÊS GRUPOS DE ESTUDO ................................................................................................ 54

4.4 ANÁLISES DA CORRELAÇÃO ENTRE AS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE SAA E APN NO GRUPO TOTAL E NOS SUBGRUPOS NO, SP/O E SP/O-SM..................................................................................................................................55

4.5. ASSOCIAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS DE SAA E DE APN COM AS VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS DA DOENÇA NO GRUPO TOTAL E NOS SUBGRUPOS DE PACIENTES......................................................................................56 4.6. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA TECIDUAL DE SAA E APN DAS PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA ................................................................ .......60

4.6.1. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO PROTEICA DE SAA E DE

APN NOS MICROARRANJOS T,NT,GD E GP DOS ESPÉCIMES CIRÚRGICOS NO

GRUPO TOTAL DE PACIENTES.......................................................................................63

4.6.2. COMPARAÇÃO DAS FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO PROTEICA TECIDUAL DE

SAA E DE APN ENTRE OS MICROARRANJOS T, NT,GD E GP DOS ESPÉCIMES

CIRÚRGICOS NO GRUPO TOTAL DE PACIENTES............................................................64

4.6.3 COMPARAÇÃO ENTRE AS FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO PROTEICA DE SAA E

APN NOS MICROARRANJOS T, NT, GD, E GP DOS ESPÉCIMES CIRÚRGICOS NOS

SUBGRUPOS DE PACIENTES...........................................................................................66

4.6.4 COMPARAÇÕES DAS FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO PROTEICA DE SAA E APN

ENTRE OS MICROARRANJOS TECIDUAIS NOS SUBGRUPOS DE PACIENTES NO,

SP/O E SP/O-SM...................................................................................................................67

4.6.5 ASSOCIAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA TECIDUAL DE SAA E APN COM AS

CARACTERÍSTICAS CLÍNICO PATOLÓGICAS DOS TUMORES.......................................70

4.6.6 AVALIAÇÃO DAS CORRELAÇÕES ENTRE AS CONCENTRAÇÕES SÉRICAS E AS

FREQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO TECIDUAL DE SAA E APN NO GRUPO TOTAL DE

PACIENTES...........................................................................................................................70

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................ 70

6. CONCLUSÕES......................................................................................................... 77

7. REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 78

8. APÊNDICES...............................................................................................................112

9. ANEXOS.....................................................................................................................116

21

1. INTRODUÇÃO

A obesidade tem aumentado consideravelmente no mundo todo e sua

prevalência mais que dobrou no período entre 1980 e 2014 (WHO, 2015). Em

2014 a Organização Mundial de Saúde anunciou que 1,9 bilhões de adultos

apresentavam sobrepeso, e entre eles, mais de 600 milhões eram obesos

(WHO, 2015). No Brasil, pesquisas realizadas pelo Ministério da Saúde

mostraram que 52,5% dos adultos apresentavam sobrepeso. A incidência de

obesidade nos adultos era de 17,9%, com igualdade entre os gêneros e com

frequência mais elevada nas faixas entre 45-64 anos (Ministério da Saúde,

2015).

A obesidade impacta negativamente a saúde da mulher de muitas

formas: acarreta maior risco para o desenvolvimento de diabetes (Gallagher et

al., 2008) e doença arterial coronariana (Weiss et al., 2009), prejudica a

contracepção e a fertilidade (Lash e Armstrong, 2009), diminui a intenção, o

início e a duração da amamentação (Hilson et al., 2004) e contribui para o

aumento do risco de mortalidade neonatal e de malformações (Kristensen et

al., 2005 e Stothard, 2009). Também tem sido associada à depressão (Yu et

al., 2015; Arterburn et al., 2012), bem como ao alto risco para o

desenvolvimento de vários cânceres. Casos novos de câncer em adultos têm

sido atribuídos ao excesso de peso corporal (Arnold et al., 2015). Evidências

clínicas mostram que o aumento das medidas de obesidade, tais como, índice

de massa corpórea (IMC) e circunferência abdominal (CA), estão associadas

com o aumento da prevalência de certos cânceres, como próstata, pâncreas

(Pischon et al., 2008; Gonzalez et al., 2006; Calle et al., 2003; Renehan et al.,

2008; Wolin et al., 2010), endometrial (Kaaks et al., 2002; Jenabi et al., 2015)

cervical (Maruthur et al., 2009), ovariano (Leitzmann et al., 2009) e de mama

(Kuhl, 2005; Goodwin et al., 2015) e também pode prejudicar a resposta aos

tratamentos de quimioterapia e radioterapia, levando a um prognóstico inferior

ao esperado em indivíduos obesos (Vucenik et al., 2012; Griggs et al., 2005;

Wong et al., 2009).

A agência internacional de pesquisa em câncer (IARC/WHO) anunciou

uma estimativa de 14,1 milhões de novos casos de câncer em 2012. Entre

22

eles, o câncer de mama é o câncer mais frequentemente diagnosticado e

responsável pela causa de morte entre as mulheres no mundo todo, com uma

estimativa de 1,7 milhões de novos casos e 521,900 mortes em 2012,

contabilizando 25% dos casos e 15% das mortes causadas pelo câncer entre

as mulheres (WHO 2012; Torre et al., 2015).

No câncer de mama, em particular, a obesidade tem se mostrado

responsável pelo aumento de 30 a 50% na taxa de acometimento de mulheres

na pós-menopausa (Tehard, 2006). Todavia, em mulheres mais jovens o papel

da obesidade é controverso. Nessas mulheres, a obesidade poderia ser um

fator protetor para câncer de mama e não um fator de risco (Rose e Vona-

Davis 2010). Entretanto, outros autores demonstraram que mulheres obesas na

pré-menopausa apresentam risco aumentado para o câncer de mama, e este

tem sido associado a uma alteração de mediadores inflamatórios e adipocinas

(Alokail et al., 2009). Além do estado hormonal, alguns estudos indicam que o

aumento do IMC está associado ao câncer de mama mais agressivo e a um

período de sobrevida mais reduzido (Porter et al., 2006, Carmichael 2006;

Haakinson et al., 2012; Copson et al., 2015; Kamineni et al., 2013; Chan et al.,

2014). Diante do exposto, algumas teorias propõem mecanismos que poderiam

levar à compreensão parcial desta associação.

Entre as hipóteses propostas para explicar a associação entre câncer de

mama e obesidade na pós-menopausa, a primeira delas considera a

concentração mais elevada de estrógeno circulante proveniente da

aromatização de andrógenos no tecido adiposo de mulheres obesas em

comparação ao de mulheres magras na pós-menopausa (Lorincz e Sukumar,

2006). Nesta fase o estrógeno é produzido quase exclusivamente nos pré-

adipócitos do tecido adiposo pela aromatização do esteróide androestenediona

C19 em estrona (Judd et al., 1982; Key et al., 2003). O aumento do peso

corporal faz com que esta produção extraglandular de estrógeno também

aumente, elevando a concentração plasmática de estrógeno em mulheres

obesas na pós-menopausa. (Baglietto et al., 2009).

Além da aromatase, a enzima 17- β-hidroxiesteróide desidrogenase,

responsável pela conversão da estrona em estradiol biologicamente ativo, está

presente no tecido adiposo (Rose e Vona Davis 2014). A obesidade não só

23

aumenta a produção de estrógeno na pós-menopausa, como aumenta também

a sua biodisponibilidade. Cerca de 1 a 2 % do estradiol circula no plasma em

sua forma não ligada (livre); 30 a 50 % circula em sua forma não funcional, ou

seja, se liga com alta afinidade à globulina ligante de hormônio sexual (SHBG)

que controla a sua biodisponibilidade e acesso a células alvo; mas o restante

circula ligado fracamente à albumina se tornando uma potencial fonte de

estradiol livre (Vona-Davis e Rose 2013).

O estrógeno é um importante fator biológico na promoção de câncer de

mama e tem sido associado à progressão para fenótipo invasivo e metastático

em significativa parcela dos tumores mamários humanos (Vona-Davis e Rose,

2007). Todavia, a capacidade de responder à ação deste hormônio é

dependente da presença e concentração de receptores de estrógeno (RE) nas

células tumorais (Hemsell et al., 1974; Lorincz e Sukumar, 2006). Desta forma,

a associação do estrógeno com o desenvolvimento do câncer mamário poderia

ser decorrente de sua ação na proliferação das células epiteliais mamárias,

ativando vias de sinalização intracelular mediadas pelos RE (Yager 2000;

Strong et al., 2013) (esquema 1).

Este mecanismo poderia explicar a associação da obesidade com

tumores mamários RE positivos, mas não a relação da obesidade com tumores

RE negativos (Godden et al., 1992; Hou et al., 2007)

24

Esquema 1: Mecanismo proposto para explicar a associação da obesidade com tumores

mamários RE positivos a partir da produção estrogênica extraglandular. Adaptado de Wang X

et al., 2015.

Alguns estudos demonstram que altas concentrações séricas de glicose

têm sido associadas ao aumento do risco de câncer de mama tanto em

mulheres na pré- quanto na pós-menopausa (Alokail et al., 2009; Gunter et al.,

2009; Kabat 2009; Sieri et al., 2012).

A obesidade pode desencadear a resistência à insulina, com

consequente aumento da glicose circulante, que pode fazer com que o

pâncreas produza o hormônio insulina em excesso, na tentativa de equilibrar a

glicemia. Este estado hiperinsulinêmico, também está presente em indivíduos

que apresentam Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) (De Bruijin et al., 2013). A

literatura demonstra como segunda hipótese para explicar a associação do

câncer de mama com a obesidade que a resistência à insulina, hiperglicemia,

hiperinsulinemia e uma grande biodisponibilidade do fator de crescimento 1

semelhante à insulina (IGF-1) são anormalidades metabólicas diretamente

relacionadas com o risco de câncer de mama (Krebs et al., 2006; Larson et al.,

25

2007; Gunter et al., 2009; Kabat et al., 2009; Sundaram et al., 2013). A insulina

possui ações mitogênicas, e durante a formação tumoral, por meio de seu

receptor, pode ativar vias que conduzem a eventos proliferativos. (Garg et al.,

2014). A expressão dos receptores 1 de insulina (IRS1) é aumentada no tecido

mamário com câncer, particularmente naqueles com alto grau de diferenciação

(Sisci et al., 2007). Deste modo, a insulina pode ativar tanto a via ERK

(extracelular signal-regulated kinase) quanto a via PI3K (phosphatidylinositol 3-

kinase), levando ao desenvolvimento tumoral, pela perda de integridade

epitelial e aumento na migração e invasão celular (Chan et al., 2007; Frasca et

al., 2008). A insulina, tanto como seu receptor, possui alta homologia com o

IGF-1 e seu receptor, o IGF-1R, e desta forma, ambos os ligantes podem agir

por meio de ambos os receptores (Gunter et al., 2008).

Ao lado de suas ações mitogênicas, a insulina e o IGF-1 podem ativar a

transcrição do RE em linhagens celulares de câncer de mama (Moscho e

Mantozoros, 2002), como demonstrado pela ação sinérgica entre IGF-1 e

estradiol na ativação transcricional dos RE (Yee e Lee, 2000). De fato, a

produção estrogênica pode ser modulada pela insulina, levando à gênese

tumoral (Jalving et al., 2010) (esquema 2).

Adicionalmente, a hiperinsulinemia crônica inibe a síntese hepática da

SHBG. Esta globulina, que é uma glicoproteína plasmática se liga com alta

afinidade aos esteróides sexuais e controla a sua biodisponibilidade e acesso a

células alvo. Deste modo, a inibição da síntese de SHBG contribui para o

aumento da biodisponibilidade de andrógenos e estrógenos circulantes

(Madigan et al., 1998).

26

Esquema 2: Mecanismo proposto para explicar a associação da obesidade com tumores

mamários RE positivos a partir da hiperinsulinemia que pode acompanhar a obesidade.

Adaptado de Wang X et al., 2015.

Além das hipóteses acima, outros autores, ao relacionarem a obesidade

com câncer de mama, referem a importância de outros fatores secretados pelo

tecido adiposo coletivamente chamado de adipocinas ou adipocitocinas como:

adiponectina, leptina, resistina, TNF, IL-6, IL-8, IL1β, (Frayn et al., 2003;

Lorincz e Sukumar, 2006; Vona-Davis e Rose, 2007). Sugerindo assim, a

terceira hipótese.

O tecido adiposo é composto por adipócitos, pré-adipócitos, fibroblastos,

macrófagos e vasos sanguíneos. Integrados, estes componentes funcionais

revelam que o tecido adiposo não é apenas um depósito de energia, mas

também age como órgão endócrino que controla uma grande diversidade de

funções biológicas de forma, autocrina, parácrina e endócrina (Hotamisligil et

al., 1995; Skurk et al., 2007; Wang et al., 2015). Fatores secretados pelo tecido

adiposo estão envolvidos no controle de vários processos biológicos.

27

Na obesidade, a hipertrofia e hiperplasia do tecido adiposo conferem

uma característica disfuncional ao tecido. Este estado inicia uma ação crucial

em muitas doenças relacionadas à obesidade como inflamação, resistência à

insulina e câncer (P. Br 2015). O aumento do tecido adiposo, especialmente o

tecido adiposo branco, produz um grande número de citocinas ou adipocinas

(TNF, IL-6, IL-8, IL1β) que apresentam um aumento local e sistêmico em

mulheres obesas (Harvey et al., 2011 e Subbaramaiah et al., 2011).

A localização do tecido adiposo apresenta um papel fundamental nas

complicações metabólicas da obesidade. Por isso, o tecido adiposo intra-

abdominal, localizado próximo ao fígado, é especialmente associado a um

perfil metabólico anormal (Jensen et al., 2008). Em comparação à gordura

subcutânea, a gordura visceral apresenta maior infiltração macrofágica e o

aumento da concentração de citocinas inflamatórias na circulação do sistema

porta hepático, o que leva à inflamação crônica subclínica sistêmica (Fontana

et al., 2007; Harman-Boehm et al., 2007).

A inflamação crônica subclínica é causada pela secreção alterada de

adipocinas no tecido adiposo disfuncional e este estado pode alterar o

metabolismo lipídico e de glicose, além de contribuir para o risco de doenças

coronarianas em indivíduos com obesidade abdominal (Trayhum, 2005;

Ferrante et al., 2007).

A transformação maligna tem sido estreitamente associada à inflamação

crônica e as secreções de citocinas pró-inflamatórias e proteínas de fase aguda

podem representar a principal causa para esta estreita conexão. A inflamação

crônica aumenta o risco de vários cânceres e está associada com o

desenvolvimento e progressão tumoral (Sica et al., 2008; Hursting et al., 2010).

Em indivíduos obesos, os adipócitos, além de secretarem citocinas

inflamatórias e outras adipocinas, também secretam a proteína de fase aguda

amilóide sérica A (SAA), que possui ação pró-inflamatória (Poitou et al., 2006)

e os fatores de crescimento endotelial (VGF) e IGF-1 (Miyazawa-Hoshimoto et

al., 2003). VGF e IGF-1 estimulam a via de sinalização PI3K/Akt

(phosphatidylinositol 3-kinase / Kinase B protein), que controla a proliferação,

28

sobrevivência, migração e invasão celular promovendo hiperplasia,

crescimento tumoral e formação metastática (Ungefroren, 2015).

No câncer de mama, estudos revelam que a inflamação crônica

relacionada à obesidade estabelece um microambiente que favorece a

mutagênese, proliferação de células neoplásicas e formação tumoral com alto

potencial metastático (Lithgow e Covington, 2005; Rose e Vona Davis, 2014).

Sua associação com a promoção de carcinogênese tem sido demonstrada por

processos complexos, como a polarização de macrófagos associados ao tumor

(TAM), via ação de citocinas inflamatórias TNF, IL-6, IL-8, IL1β e subsequente

produção de fatores de crescimento tumoral (Ulrich et al., 2006; Schwertfeger

et al., 2006; De Nardo e Coussens, 2007).

A inflamação crônica pode induzir a angiogênese e grande número de

fatores angiogênicos incluindo VEGF, que é induzido por TNF- através da

ativação da via NF-kappa B (Yoshida et al., 1997). O processo de angiogênese

e adipogênese é coordenado por uma interação parácrina mediada

amplamente por VEGF secretado de pré-adipócitos e macrófagos. Esta íntima

relação é demonstrada em humanos pela associação direta entre IMC, gordura

corporal total e concentração plasmática de VEGF (Brakenhielm et al., 2004)

Nos últimos anos, as adipocinas SAA e APN, que possuem funções

antagônicas, têm recebido notável destaque na literatura por suas associações

com aspectos metabólicos e inflamatórios ligados à obesidade (Matsubara et

al., 2002; Hoffstedt et al., 2004; Kim et al., 2005; Yang Rog Ze et al., 2006;

Poitou et al., 2006; Lappalainen et al., 2008; Zhao et al., 2010; Esfahani et al.,

2015). Além disso, ambas têm sido relacionadas com o câncer de mama.

Estudos relatam que concentrações aumentadas de SAA (O’Hanlon et al.,

2002; Pierce et al., 2009) e, inversamente, concentrações diminuídas de APN

(Myoshi et al., 2003; Jarde et al., 2011) correlacionam-se com risco aumentado

para o desenvolvimento e o pior prognóstico do câncer mamário (esquema 3).

29

Esquema 3: Esquematização da ação sinérgica dos mecanismos propostos para explicar a

relação da obesidade com a carcinogênese. Adaptado de Mauro et al., 2015.

Amilóide Sérica-A (SAA)

Atualmente sabe-se que a inflamação crônica tem um papel no

desenvolvimento e progressão do câncer, e este processo pode ser associado

à secreção de citocinas pró-inflamatórias, entre outros mecanismos

fisiopatológicos (Schottenfeld, 2006).

A proteína amilóide sérica A (SAA) é uma biomolécula de fase aguda,

que atua tanto em processos homeostáticos quanto patológicos (Eklund et al.,

2012). Ela é sintetizada pelo fígado (Ramadori et al., 1985, Betts et al., 1991;

Raynes et al., 1991), e a sua secreção aumenta na presença de citocinas

inflamatórias (i.e. IL-1β, IL-6 and TNF-). No período entre 5 ou 6 horas após o

início da reação aguda, as concentrações de SAA no sangue podem aumentar

em até 1.000 vezes (Steel e Whitehead, 1994). Ela é uma proteína de 12 kDa,

que pertence a família de apolipoproteinas, (Levin et al., 1973, Anders et al.,

1975; Rosenthal et al., 1976; Bendit e Erikssen 1977; Skogen et al., 1979) e

atraiu interesse devido a deposição fibrosa de proteína amiloide A (AA) que é

produto da clivagem de SAA, em doenças inflamatórias crônicas associadas à

amiloidose (Bendit e Eriksen,1971). Embora a SAA tenha quatro isoformas, em

humanos, a SAA-1 é a isoforma mais abundante (Steel e Whitehead, 1994).

A SAA é secretada também pelo adipócito e está envolvida no transporte

de colesterol, na degradação da matriz extracelular e no recrutamento de

células inflamatórias para o sítio da inflamação (Schultz 1990; Ulhar 1999;

30

Manley et al., 2006, Poitou et al., 2009). A partir da detecção de sua síntese

pelo tecido adiposo (Sjöholm et al., 2005; Yang et al., 2006) esta proteína vem

sendo aventada como um sensível marcador biológico de obesidade, com

potencial uso clínico na avaliação de ganho e redução de adiposidade (Poitou

et al., 2006; Lappalainen et al., 2008).

Em relação às doenças malignas, há mais de três décadas a SAA já era

associada ao seu desenvolvimento, especialmente ao processo metastático

(Rosenthal et al., 1979) com o seu valor destacado no monitoramento de

câncer de próstata (Kaneti et al., 1984), e associação com inflamação e com o

estágio do câncer de mama (Weinstein et al., 1984; Biran et al. ,1986).

Posteriormente, em um estudo prospectivo, a SAA e a proteína C reativa (PCR)

foram consideradas fatores prognósticos para o câncer de mama, pela

detecção de concentrações mais elevadas de ambas, em portadoras de

tumores mais avançados. Desta forma, postulou-se que estas proteínas

poderiam ser utilizadas tanto na avaliação de risco, quanto na indicação da

progressão do câncer mamário (O’Hanlon et al., 2002; Dowling et al., 2012;

Zhang et al., 2012). E ainda, Pierce e colaboradores (2009) também

demonstraram que concentrações mais elevadas de SAA foram associadas à

sobrevida global reduzida destas pacientes.

Resultados de ensaios in vitro demonstram que a SAA é capaz de

estimular a síntese e secreção de citocinas pró-inflamatórias em neutrófilos e

monócitos humanos (Ribeiro et al., 2003). Por outro lado, citocinas pró-

inflamatórias, como IL-1, IL-6 e TNF-α agindo sobre os hepatócitos e monócitos

podem aumentar a síntese e liberação da SAA no organismo (Raynes e

McAdam 1991, Husby et al., 1994). Levando em conta a ação recíproca entre

SAA e citocinas inflamatórias presentes na obesidade, esta conexão garantiria

a manutenção do estado inflamatório crônico (Poitou et al., 2006; Lappalainen

et al., 2008). Além disso, a SAA, pela sua propriedade de se ligar a proteínas

da matriz extracelular, como laminina e heparina, somada à sua ação

quimiotática para monócitos e leucócitos (Urieli-Shoval et al., 2002; Preciado-

Patt et al., 1998), pode contribuir para a manutenção de um microambiente

inflamatório crônico. Ainda neste contexto, a modificação das proteínas da

matriz extracelular, poderia levar ao aumento da ativação de plasminogênio e

31

produção de metaloproteinases (MMPs), contribuindo para a redução de

interação entre células epiteliais e matriz extracelular, e subsequente para a

carcinogênese e invasão das células tumorais (Ancsin e Kisilevsky 1999).

Estudos in vitro demonstraram que a SAA é capaz de agir sobre os

receptores TLR4 de macrófagos e deflagrar uma resposta via ERK ½ / p-38 e

MAPK (mitogen-activated protein kinase), resultando na produção de óxido

nítrico (NO) (Sandri et al., 2008). O NO é considerado uma espécie reativa de

oxigênio (ROS), que ao entrar em contato com o oxigênio torna-se um radical

livre (NO•), o qual rapidamente se transforma em peroxinitrito (ONOO-). Esta

última molécula é responsável por lesar moléculas como DNA e RNA

(Vasconcelos et al., 2007). Desta forma, a SAA poderia estar indiretamente

envolvida neste mecanismo carcinogênico.

Embora a literatura ainda não tenha demonstrado a expressão proteica

de SAA no epitélio tumoral de pacientes com câncer de mama, a expressão de

SAA-3 foi relatada em células das linhagens tumorais mamárias MCF-7 e T47-

D (Larson et al., 2003). Sua alta expressão foi também detectada em células

tumorais de cabeça e pescoço, mas não em células não tumorais. (Shinriki,

2010). Além disso, a sua expressão também foi demonstrada em células

epiteliais de carcinoma de ovário, e revelou correlação direta com a

agressividade do tumor (Urieli-Shoval, 2010).

É conhecido que, no início do desenvolvimento tumoral, macrófagos

associados ao tumor (TAM) liberam citocinas pró-inflamatórias, tais como TNFα

e IL-6 (Zamarrom et al., 2011), que por sua vez possuem a capacidade de

induzir SAA (Raynes e McAdam 1991, Husby et al., 1994). Desta forma, a

presença de SAA favoreceria a amplificação da inflamação no ambiente

peritumoral.

Adiponectina (APN)

Com função antagônica à SAA, a APN é uma adipocina envolvida em

vários processos biológicos do corpo humano e foi descrita como o primeiro

peptídeo do tecido adiposo a apresentar concentrações diminuídas na

obesidade (Ouchi et al., 1999). A APN é uma proteína de 244 aminoácidos, 30

32

kD de peso molecular codificada no cromossomo humano 3q27. Ela é

secretada pelo tecido adiposo em quantidade inversamente proporcional ao

IMC (Takahashi et al., 2000; Rajala e Scherer, 2003; Ryan et al., 2003; Yuan et

al., 2006). Sua estrutura se origina de um domínio amino-terminal não-globular,

um domínio colágeno-símile e um domínio carboxi-terminal globular (Scherer et

al., 1995) e pode ser secretada nas formas de trímero (3 × 1) baixo peso

molecular (LMW), hexâmero (3 × 2) médio peso molecular e 18 monômeros (3

× 6) multímero, este último constituindo a forma de alto peso molecular (HMW)

(Rajala e Scherer, 2003; Pajvani et al., 2003; Wang et al., 2008). Em humanos,

as concentrações presentes na circulação sanguínea são relativamente altas,

variando de 0,5 a 30 µg/mL (Whitehead et al., 2006), entretanto é reduzida em

indivíduos com resistência à insulina e obesidade visceral (Lang e Ratke,

2009). Uma vez sintetizada pelos adipócitos, ela exerce seus efeitos biológicos,

principalmente por meio de seus receptores, AdipoR1 e AdipoR2 (Yamauchi et

al., 2003).

Baixas concentrações de APN também têm sido relacionadas com um

aumento no risco de cânceres associados à obesidade (Mauro et al., 2015).

Em relação ao câncer de mama, alguns estudos mostram a associação da

hipoadiponectinemia com risco aumentado para o seu desenvolvimento e pior

prognóstico (Myoshi et al., 2003; Jardé et al., 2011; Duggan et al., 2011; Dubois

et al., 2013).

Grande parte da ação da APN no câncer ocorre via AMPK (AMP-

activated protein kinase), que por sua vez, interfere na sinalização do

crescimento celular, por meio da via mTOR (mammalian target of rapamycin), e

inibe a promoção da carcinogênese (Shackelford et al., 2009; Taliaferro et al.,

2009).

O tratamento de linhagens celulares de carcinoma mamário com APN

recombinante humana demonstrou sua ação sobre a via PI3K/AKT, por

diminuir a fosforilação desta, com consequente redução do crescimento e

proliferação celulares (Fresno et al., 2004). E também, outros estudos in vitro,

com linhagens celulares de câncer de mama e endométrio mostraram que a

APN inibiu a sinalização da via ERK1/2, afetando sua função mitogênica e

33

exercendo efeitos anti-proliferativos e apoptóticos (Dieudonne et al., 2006;

Cong et al., 2007).

Ensaios realizados com as linhagens celulares de câncer mamário

humano, MDA-MB-231 e T47D, estimuladas com APN, demonstraram que

estas foram induzidas à apoptose e apresentaram significativa diminuição da

síntese de DNA e da proliferação celular (Kang et al., 2005; Wang et al., 2006).

Além disso, a APN inibiu o crescimento de outras duas linhagens celulares

Hs578T e SK-BR-3, mas não o crescimento das linhagens, MCF-7 e HCC-38

(Kang et al., 2005). Entretanto, outros pesquisadores demonstraram que o

crescimento das linhagens, MCF-7 foi negativamente regulado pela APN

(Dieudonne et al.,2006; Arditi et al., 2007). Em concordância com resultados

experimentais, baixas concentrações de APN sérica têm sido associadas com

um pior prognóstico em mulheres com câncer de mama na pós-menopausa

(Miyoshi et al., 2003; Mantzoros et al., 2004; Tworoger et al., 2007) e na pré-

menopausa (Korner et al., 2007), ao passo que, altas concentrações séricas

foram correlacionadas com aumento de sobrevida global (Duggan et al., 2011).

Todavia, um estudo caso-controle demonstrou que baixas concentrações

séricas de APN não se correlacionaram com o risco aumentado para o câncer

de mama (Gaudet et al., 2010). Por outro lado, Grossmann e colaboradores

(2010), reportam que hipoadiponectinemia tem sido associada ao aumento do

risco para câncer de mama e com a expressão de um fenótipo agressivo e

metastático.

Quanto à expressão tecidual, os estudos são ainda controversos.

Karaduman e seu grupo (2007) demonstraram que a expressão tecidual de

APN em pacientes com câncer de mama foi significativamente maior do que

em controles e sugeriram que a alta expressão de APN detectada no câncer de

mama estava associada ao aumento do risco para a neoplasia. A APN e seus

receptores foram associados à invasividade do câncer de mama (Jeong et al.,

2011) e a expressão de APN foi mais elevada no carcinoma ductal invasivo

(CDI) do que no in situ, forma menos grave da doença (Jardé et al., 2008).

Todavia, estes últimos autores demonstraram expressão maior de APN no

epitélio adjacente ao tumor do que no epitélio tumoral. Além disso, um estudo

recente mostrou a ausência de associação entre a expressão tecidual de APN

34

e tumores mamários triplo negativos (TNBC), considerados de pior prognóstico

(Cubukc et al., 2014). Sonmez e colaboradores (2011), por sua vez, sugerem

que os mecanismos regulatórios da APN parecem ser diferentes na circulação

e no tecido de pacientes com câncer de mama, pois as concentrações séricas

de APN foram inversamente correlacionadas com a sua expressão tecidual

tumoral.

Tanto a hipoadiponectinemia, como altas concentrações de SAA, além

de se correlacionarem com obesidade e câncer de mama, se associam com a

síndrome metabólica (SM) (Bremer et al., 2011).

A obesidade leva a várias disfunções, incluindo alterações no

metabolismo lipídico, da glicose e da função arterial, e estas alterações

encontram-se associadas com o estado inflamatório subclínico (Alberti et al.,

2009). A síndrome metabólica pode ser caracterizada por cinco critérios:

obesidade central, redução de HDL- colesterol, elevação de triglicérides,

hipertensão arterial e hiperglicemia, sendo que a presença de três destes

fatores é suficiente para o diagnóstico de SM (NCEP-ATP III, 2005). O depósito

do tecido adiposo que se relaciona fortemente com a SM é o tecido adiposo

visceral, que por ser o mais metabolicamente ativo é responsável pela

inflamação subclínica sistêmica, devido à secreção de citocinas pró-

inflamatórias. (Gilbert et al., 2013).

Nos últimos anos a síndrome metabólica (SM) tem sido associada ao

risco, tanto para o desenvolvimento, como para o pior prognóstico do câncer de

mama (Rosato et al., 2011; Bao et al., 2013). Um estudo de coorte, com

aproximadamente 20.000 mulheres, demonstrou associação entre SM e o risco

para o câncer de mama em mulheres na pós-menopausa, mas não em

mulheres na pré-menopausa (Agnoli et al., 2015). Alguns estudos demonstram

a sua associação com fenótipos mais agressivos em pacientes na pós-

menopausa. Healy e colaboradores (2010) relataram que 51% das pacientes

que possuiam tumores mamários entre os estágios II e IV apresentavam SM.

Além disso, Maiti e seu grupo (2010) observaram que a SM foi mais prevalente

em pacientes com tumores triplo negativos do que aquelas que não

apresentavam esta característica clínico-patológica, sugerindo possíveis

interações entre as alterações metabólicas e a gravidade dos tumores. Em

35

relação à sobrevida livre de progressão, em um estudo com 110 pacientes com

câncer mamário, acompanhadas por cinco anos, os autores demonstraram que

95% daquelas que apresentaram SM ao diagnóstico desenvolveram metástase

(Pasanisi et al., 2006).

Além disso, alguns estudos sugerem o desenvolvimento da SM na

vigência do tratamento quimioterápico (Levine et al.,1991; Campbell et al, 2007;

Arpino et al., 2015; Vagenas et al., 2016). Nestes estudos, pacientes que

faziam uso de quimioterapia adjuvante apresentaram um aumento significativo

na adiposidade corporal, seja no aumento da massa de gordura ou na

alteração da localização desta adiposidade e também apresentaram alteração

do perfil lipídico, com consequente desenvolvimento da SM. Todavia, ainda não

estão bem estabelecidos quais fatores poderiam levar ao desenvolvimento do

ganho de peso e subsequentes alterações metabólicas durante o tratamento do

câncer mamário.

Vários estudos demonstram o aumento de biomarcadores inflamatórios

na circulação sanguínea, na vigência da SM, sugerindo um estado pró-

inflamatório associado a ela (Eckel et al., 2005, Cornier et al., 2008). Bremer e

colaboradores (2011) compararam as concentrações de vários biomarcadores

inflamatórios circulantes e observaram concentrações de SAA mais elevadas e

de APN mais reduzidas em portadores de SM do que em indivíduos saudáveis.

Deste modo, a detecção da SM ao diagnóstico do carcinoma mamário através

de biomarcadores como a SAA e a APN, poderia auxiliar no manejo de tais

pacientes, tanto em relação ao tipo de terapia adjuvante, como no controle da

adiposidade e na mudança de estilo de vida.

Existem muitas pesquisas que buscam respostas para a influência da

obesidade e de suas alterações metabólicas sobre o câncer de mama,

incluindo sua relação com as adipocinas inflamatórias. Entretanto, devido à alta

complexidade das funções e interações dessas adipocinas na obesidade, os

mecanismos precisos ainda não foram elucidados. Além disso, como os

tumores mamários estão expostos tanto às adipocinas circulantes quanto às

produzidas localmente nos adipócitos adjacentes, a íntima asociação entre as

celúlas tumorais mamárias e os adipócitos poderia favorecer uma ação mais

direta das adipocinas sobre o microambiente tumoral. Neste cenário, a

36

exploração das relações das adipocinas SAA e APN com o câncer de mama,

obesidade e SM, constitui-se assunto ainda inesgotado. Desta forma, a

proposta do presente trabalho considera a possibilidade de que pacientes com

concentrações mais elevadas de SAA e mais reduzidas de APN apresentarão

características clínico-patológicas de maior gravidade e esta condição será

dependente de obesidade e SM. Já, nos espécimes cirúrgicos mamários

destas pacientes, espera-se encontrar expressão diferencial das adipocinas

pesquisadas, fato este ainda não demonstrado na literatura.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Investigar, em pacientes com câncer de mama, as relações das

adipocinas SAA e APN com a obesidade e com as características clínico-

patológicas da doença.

2.2. Objetivos Específicos

1- Comparar as concentrações séricas de SAA e APN entre os grupos de

pacientes não obesas (NO) e com sobrepeso/obesidade SP/O.

2- Investigar a presença de síndrome metabólica (SM) entre as pacientes em

estudo.

3- Comparar as características clínico-patológicas do câncer de mama:

estadiamento clínico-patológico (ECP), status dos receptores de estrógeno

(RE), de progesterona (RP) e do fator de crescimento epidérmico tipo 2

humano (HER2), entre os grupos de pacientes.

4- Investigar as correlações entre as concentrações séricas de SAA e APN no

grupo total e nos subgrupos de pacientes.

37

5- Investigar a associação das concentrações séricas de SAA e de APN com

as características clínico-patológicas do câncer de mama no grupo total e nos

subgrupos de pacientes.

6- Comparar a frequência de expressão entre as proteínas SAA e APN em

cada regiaõ tecidual do espécime cirúgico mamário das pacientes: epitélio

tumoral (T), epitélio não tumoral (NT), gordura peritumoral (GP) e gordura

distante do tumor (GD), no grupo total e nos subgrupos de pacientes.

7- Comparar as frequências de expressão de cada proteína entre as diferentes

regiões teciduais, no grupo total e nos subgrupos de pacientes.

8- Investigar a associação das frequências de expressão de SAA e de APN

com as características clínico-patológicas do câncer de mama no grupo total e

nos subgrupos de pacientes.

9- Investigar as correlações entre as concentrações séricas e as frequências de

expressão tecidual no grupo total e nos subgrupos de pacientes.

3.0 SUJEITOS E MÉTODOS

3.1. Tipo de Estudo

Trata-se de estudo transversal com portadoras de câncer de mama. As

pacientes foram atendidas nos ambulatórios de Patologia Mamária e Oncologia

Clínica do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti - Centro de

Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM) pertencente à Universidade

Estadual de Campinas (UNICAMP).

3.2. Tamanho Amostral

Para definição do tamanho amostral foi levada em consideração a

frequência de portadoras de câncer de mama não obesas, atendidas nos

ambulatórios de Patologia Mamária e Oncologia Clínica do CAISM-UNICAMP,

que corresponde a 37% do total de atendimentos (cerca de 350 casos/ano)

38

para essa doença (Zorlini et al., 2008). Desta forma, o tamanho da amostra

total (n= 258) foi determinado a partir de estimativa aproximada entre a

frequência de portadoras de câncer de mama não obesas (n= 129) pareada

com o número de portadoras com sobrepeso/obesidade.

Todavia, na prática, a soma de critérios (IMC e CA) para a composição do

grupo de não obesas (NO) impediu o alcance do tamanho amostral teórico. Isto

se justificou pelo fato da frequência de não obesas de 37% (Zorlini et al., 2008)

só ter levado em conta o IMC. Na realidade, a frequência de não obesas

verdadeiras (duplo critério) é bem mais baixa, devido à alta frequência de

adiposidade central entre as pacientes. Além disso, os critérios de seleção no

presente estudo limitaram ainda mais o alcance do tamanho amostral teórico.

Desta forma, a amostra final foi composta por 196 pacientes: 42 no grupo NO e

154 no grupo SP/O.

3.3. Seleção dos sujeitos

Entre 2009 a 2014 foram selecionadas, consecutivamente, pacientes

com diagnóstico de câncer de mama ductal invasivo que foram internadas na

unidade de Oncologia Cirúrgica do CAISM-UNICAMP para o tratamento

cirúrgico.

A agenda das pacientes que seriam submetidas à cirurgia mamária era

obtida na Divisão de Oncologia, com antecedência de 15 dias. No dia da

internação, com o objetivo de constatar a possibilidade de participação da

paciente na pesquisa, os dados eram verificados nos prontuários médicos e

segundo os critérios de inclusão e exclusão (Check List – Apêndice I) a

paciente era convidada ou não a participar do estudo.

Após leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido – (TCLE – Apêndice II) a paciente era entrevistada quanto aos

seus dados demográficos, hábitos alimentares e de atividade física

(Questionário – Apêndice III), e também eram obtidos os seus dados

antropométricos: peso, altura, circunferência abdominal (prega umbilical). O

índice de massa corpórea (IMC), foi calculado utilizando-se a fórmula peso (kg)

39

/ estatura (m)2, que foi categorizado segundo a classificação da OMS (2009),

IMC normal de 18,5-24,99 kg/m2, sobrepeso de 25,0-29,9kg/m2 e obesidade ≥

30 kg/m2. A aferição da circunferência abdominal (CA) foi realizada na altura da

prega umbilical e o ponto de corte para CA normal (≤ 88 cm) foi estabelecido

de acordo com Jansen et al., 2004.

3.3.1 Critérios de seleção

A- Inclusão

Para o grupo de pacientes com sobrepeso/obesidade: presença de

câncer de mama, IMC ≥ 25 kg/m2 (sobrepeso) ou ≥ 30 kg/m2 (obesidade) e /ou

presença de gordura abdominal (CA > 88 cm) e aceite em participar do estudo

proposto.

Para o grupo de pacientes não-obesas: presença de câncer de mama,

ausência de gordura abdominal, IMC ≤ 24.9 kg/m2 (CA ≤ 88 cm), ausência de

perda de peso acentuado e aceite em participar do estudo proposto.

B- Exclusão

Não foram incluídas no estudo pacientes com IMC abaixo do normal,

tratamento quimioterápico e/ou radioterápico prévio, presença de outro tipo de

câncer associado, sinais clínicos e/ou relato de infecções ou inflamações

agudas ou crônicas, relato de doença auto-imune, relato de doenças

pulmonares crônicas, recusa em participar do estudo proposto e reposição

hormonal.

3.3.2 Constituição inicial dos grupos

O grupo de pacientes com sobrepeso/obesidade (SP/O) foi composto

por pacientes com IMC ≥ 25 kg/m2 e CA > 88 cm e alguns casos de pacientes

com somente uma das duas medidas elevadas. Já o grupo de pacientes não

40

obesas (NO) foi composto exclusivamente por pacientes com IMC ≤ 24,9 kg/m2

e CA ≤ 88 cm (esquema 4).

Esquema 4: Constituição inicial dos grupos de estudo: NO (não obesas) e SP/O (sobrepeso-

obesidade).

3.4 Coleta de sangue

No dia da cirurgia, as pacientes em jejum prévio de 12 horas, foram

submetidas à coleta de duas amostras de 8 mL de sangue (em tubos

Vacuette® com gel separador e ativador de coágulo). Após 30 minutos à

temperatura ambiente, para retração do coágulo, o sangue foi centrifugado por

10 minutos, a 2.500 r.p.m. (centrífuga Beckman-GPR, Indianápolis, IN, EUA) a

25°C. O soro foi distribuído em alíquotas de 500 µL em microtubos tipo

eppendorf. Uma das alíquotas era encaminhada imediatamente para análise

bioquímica e as demais armazenadas a -80ºC até o momento das demais

análises.

3.5 Quantificação das concentrações séricas de colesterol total e frações,

triglicerídeos e glicose.

As concentrações séricas de colesterol total (Col-T) e frações (LDL-Col,

HDL-Col), triglicerídeos (TG) e glicose, foram determinadas por métodos

enzimático-colorimétricos no mesmo dia em que as amostras foram coletadas,

imediatamente após sua centrifugação, em sistema de automação (Boehringer

Mannhein Hitachi 917-Roche-Basileia, Suíça) utilizando reagentes comerciais

da Roche (Mannhein, Alemanha) e expressos em mg/dL. Estas análises são

rotineiramente realizadas na Seção de Bioquímica da DPC do HC/UNICAMP.

Para o perfil lipídico foram adotados os valores de referência que seguem as

recomendações da V Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da

41

Aterosclerose (2013) e para a glicose, as Diretrizes da Sociedade Brasileira de

Diabetes (2009). Valores de referência adotados: Col-T< 200 mg/dL, LDL-Col<

160 mg/dL, HDL-Col ≥ 50 mg/dL (para mulheres), TG< 150 mg/dL, Gli< 100

mg/dL.

3.6 Caracterização da síndrome metabólica (SM) entre as pacientes em

estudo.

Os resultados das análises bioquímicas foram utilizados para estimar a

frequência de pacientes com Síndrome Metabólica (SM), que, no presente

trabalho, foi definida a partir da presença de três ou quatro dos seguintes

critérios:

Quadro 1: Critérios para identificação de Síndrome Metabólica nas pacientes

Critérios Definição

Circunferência abdominal 88 cm

Glicemia de jejum# ≥ 100 mg/dL

Triglicérides ≥ 150 mg/dL

HDL-colesterol < 50 mg/dL

Adaptado de: National Cholesterol Education Program Adult Treatment

Panel III e #International Diabetes Federation. Worldwide definition of the

metabolic syndrome . Circulation. 2005; 112: 2735–52.

O parâmetro hipertensão arterial não foi considerado no presente

trabalho, pela impossibilidade de diagnóstico clínico fidedigno, visto que as

pacientes incluidas no estudo tiveram apenas um contato com o pesquisador, na

véspera do procedimento cirúrgico. Além disso, a maioria das pacientes era

encaminhada de outros serviços e a totalidade não apresentava registro de

diagnóstico de hipertensão arterial em seus prontuários.

3.7 Quantificações das concentrações séricas de SAA

As concentrações de SAA foram determinadas nas amostras de soro,

por meio do kit comercial SAA Látex N (SIEMENS, Marburg, Alemanha), de

alta sensibilidade (0,82 mg/L). As reações de micro-aglutinação em látex foram

42

realizadas de acordo com as recomendações do fabricante e detectadas por

nefelometria (BN Prospec, SIEMENS, Munique, Alemanha).

O método é inteiramente automatizado; partículas de poliestireno

revestidas com um anticorpo monoclonal específico para SAA humana, ao

serem misturadas com as amostras de soro, agregam-se com estas proteínas

formando micro-aglutinados. Esses agregados dispersam luz quando

irradiados. A intensidade desta dispersão é dependente das concentrações das

respectivas proteínas na amostra e a quantificação das concentrações séricas

é automaticamente realizada a partir de uma curva padrão, determinada a cada

ensaio. A curva padrão é realizada a partir de 7 diluições seriadas do padrão

SY SAA N, calibrado pelo padrão internacional da proteína SAA sérica - lote nº

92/680. Além disso, um controle interno (SY SAA), com concentração

conhecida, é aferido em cada corrida. Os coeficientes de variação intra e

interensaio foram menores do que 2% e 5%, respectivamente. Os ensaios

foram realizados exclusivamente para esta pesquisa, na Seção de Imunologia

da Divisão de Patologia Clínica (DPC) do HC/UNICAMP.

3.8 Quantificações das concentrações séricas de APN

As concentrações de adiponectina foram determinadas nas amostras de

soro, por meio do kit comercial de Imunoensaio Multiplex da marca Millipore

(Billerica, MA, EUA) Catálogo # HADK1MAG-61K (adiponectina) - Lote:

103203. A sensibilidade do kit para cada analito foi de 21pg/mL.

A tecnologia xMAP (MAP=MultipleAnalyteProfiling, x= sua variável ex:

citocinas, endócrino, oligo), envolve um processo exclusivo que cora

microesferas magnéticas com dois fluoróforos. Utilizando proporções precisas

de dois fluoróforos, podem ser criados 100 conjuntos diferentes de

microesferas – cada uma delas com uma assinatura baseada em “código de

cores” e que podem ser identificadas pelo instrumento MagPix™.

Anticorpos de captura específicos para o analito (adiponectina) estão

imobilizados nas microesferas através de ligações covalentes não reversíveis.

Após a incubação dos padrões e das amostras de soro diluídas com as

microesferas, o analito se liga aos anticorpos de captura localizados na

superfície das respectivas microesferas. Após ser feito o procedimento de

43

lavagem automatizada, para a retirada do excedente que não se ligou aos

anticorpos específicos, é feita a incubação com anticorpos de detecção

biotinilados. Outra lavagem é realizada, para eliminação do que não se ligou e

é feita uma incubação com o conjugado estreptavidina-ficoeritrina, que se liga

ao anticorpo biotinilado e emite sinal fluorescente. O resultado final é um

ensaio “sanduíche” realizado com microesferas, que é lido pelo equipamento

MagPix (Softwarex Ponent/Analyst versão 4.2.), onde as micoresferas são

capturadas por uma placa magnética e a classificação é feita por 2 lasers, o

primeiro detecta (classifica) a microesfera (o código de cor para o ensaio) e o

segundo quantifica o sinal de fluorescência em cada microesfera.

O ensaio foi considerado válido quando os controles de qualidade

estavam dentro da faixa esperada (Controle baixo: 21,9-45,6 pg/mL; Controle

alto: 126,8-263,5 pg/mL). Os coeficientes de variação intra e interensaio foram

menores do que 1%.

3.9 Coletas das informações clínico-patológicas

As informações clínico-patológicas das pacientes foram coletadas dos

prontuários médicos, com o auxílio da Profa Dra Maria Salete da Costa Gurgel,

do Departamento de Tocoginecologia – CAISM-FCM-UNICAMP,

aproximadamente 60 dias após a cirurgia mamária. Estas incluíram o

estadiamento clínico-patológico (ECP) da doença, bem como os resultados do

exame anátomo-patológico e o status dos receptores RE, RP e HER2. O ECP

foi determinado de acordo com o sistema TNM: T- extensão do tumor primário,

N- ausência ou presença e a extensão de metástases em linfonodos regionais,

M- ausência ou presença de metástase à distância (INCA, 2004).

As características anatomopatológicas dos tumores foram determinadas

a partir de amostras do tecido tumoral provenientes de peças cirúrgicas obtidas

por mastectomia ou quadrantectomia. Após análise macroscópica, os

fragmentos tumorais foram fixados em formalina, incluídos em parafina e

seccionados. Os cortes histológicos foram corados por hematoxilina e eosina,

para determinação do tipo histológico do tumor, bem como de seus graus de

diferenciação histológica e nuclear. Estes últimos são classificados de acordo

44

com os critérios de Scarff-Bloom-Richardson, modificado (Bloom et al., 1957;

Scarff et al., 1968; Frierson et al., 1995). Este exame é rotineiramente

realizado pelo Laboratório de Anatomia Patológica do Hospital das Clínicas

(HC) / UNICAMP. Os receptores hormonais RE, RP e a expressão do

oncogene HER2 foram avaliados pelo método imunohistoquímico. Estas

análises são realizadas rotineiramente no Laboratório de Patologia

Experimental do CAISM/UNICAMP utilizando-se a técnica da Estreptavidina-

Biotina-Peroxidase, de acordo com HSU, HAINE & FANGER, 1981.

3.10 Avaliação da expressão proteica tecidual de SAA e APN nas quatro

regiões estudadas dos espécimes cirúrgicos das pacientes com câncer

de mama.

A- Construção do microarranjo de tecidos - Tissue Microarray (TMA)

Primeiramente foi feito um levantamento do material de estudo

proveniente de peças cirúrgicas obtidas por mastectomia ou quadrantectomia,

fixadas em formalina e incluídas em blocos de parafina arquivados no

Departamento de Anatomia Patológica/FCM/UNICAMP (figura 1). Foram

selecionadas as lâminas histológicas originais de cada paciente, coradas

rotineiramente com hematoxilina e eosina (H&E) e os respectivos blocos de

parafina contendo as áreas de interesse: gordura distante do tumor (GD),

gordura peritumoral (GP), epitélio tumoral (T) e epitélio não tumoral (NT) da

margem da peça cirúrgica, evitando áreas de hemorragia e necrose. Após a

marcação das áreas selecionadas em duplicatas (Teleki et al., 2013) nas

lâminas histológicas pelo médico patologista, as mesmas áreas

correspondentes foram marcadas nos blocos (figura 1). O conjunto de lâminas

de HE e os respectivos blocos foram enviados para o Departamento de

Patologia Investigativa do AC Camargo Cancer Center onde foram realizadas

perfurações em duplicatas nos blocos de parafina com agulhas do aparelho de

TMA (Beecher Instruments Microarray Technology, Silver Spring, CA, USA), na

espessura de 1,0 mm. Os cilindros de tecidos foram retirados e ordenados

sobre o bloco receptor, com distância de 0,2 mm entre si. A confecção do TMA

foi realizada com o Manual Tissue Arrayer 1 (Beecher Instruments Microarray

Technology, Silver Spring, CA, USA). Foram realizados cortes histológicos em

45

lâminas silanizadas, submetidas à fixação por UV (Instrumedics Inc®,

Hackensack, NJ, EUA) e recobertas com adesivo, para impedir que o tecido se

movesse durante a técnica. Posteriormente, as lâminas sofreram um banho de

parafina e foram armazenadas em freezer a -20 °C, até o momento do uso para

reação imunoistoquímica. A figura 2 esquematiza todas as etapas do processo.

Figura 1. Blocos e lâminas pareadas e demarcadas com as áreas de interesse para confecção do TMA.

Figura 2: Etapas geral do processo de construção dos blocos e obtenção dos cortes de

tissue microarray (TMA).

46

B- Análise imunoistoquímica para investigação da expressão das

proteínas SAA e APN

A técnica de imunoistoquímica foi realizada no Laboratório de Patologia

Especializada (LAPE) do Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti-

CAISM. Após obtenção das lâminas de TMA, estas foram hidratadas em álcool

etílico nas concentrações decrescentes (100, 80, 50%) e lavadas com água

destilada corrente. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com três

banhos em água oxigenada a 10 volumes, cada um com duração de 3 minutos,

seguida de lavagem em água corrente e destilada. Para recuperação

antigênica foi utilizada a panela a vapor Pascal Dako, com o objetivo de expor

os antígenos. As lâminas foram imersas em tampão citrato de sódio 10 mM, pH

6,0, a 95ºC, durante 30 minutos. Em seguida, foram resfriadas em temperatura

ambiente durante 20 minutos e lavadas em água corrente e destilada. Após

esta etapa, os cortes histológicos foram incubados em câmara úmida com

anticorpo primário específico, nas diluições específicas padronizadas, a 4ºC,

overnight. Os anticorpos utilizados estão mencionados no quadro 2. Após a

incubação, as lâminas foram lavadas três vezes com PBS, sob agitação

(solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 a 7,6) e secas. Posteriormente

foram incubadas com ADVANCE™ HRP Detection System (Dako, Carpinteria,

California, Estados Unidos), a 37ºC, durante 1 hora e, a seguir, submetidas a

três lavagens com PBS, sob agitação. Após a incubação, a revelação foi feita

com substrato cromogênico DAB (3´- diaminobenzidine) (código D5637,

SIGMA, Saint Louis, Missouri, Estados Unidos) na proporção: 0,06g

DAB:100ml PBS: 500μl água oxigenada a 3%:1 ml dimetilsulfóxido (DMSO), a

37ºC, durante 5 minutos. Finalmente, as lâminas foram lavadas em água

corrente e contra-coradas com hematoxilina de Harris, durante 30 a 60

segundos. Os cortes foram desidratados em banhos de álcool etílico em

concentrações crescentes e diafanizadas em três banhos de xilol para, a

seguir, serem montadas com lamínula e resina. Controles internos e externos,

positivos e negativos, foram utilizados para validar as reações

imunoistoquímicas.

47

Quadro 2: Especificações dos anticorpos utilizados nas análises imunoistoquímicas

Anticorpos

Código

Diluição

Fabricante

Controle

Padrão de expressão

Soro Amilóide A

(SAA)

115 /ab687

1:500

Abcam,Inc

fígado

citoplasmático

Adiponectina

(APN)

ab22554

1:100

Abcam,Inc

pele

citoplasmático

C- Interpretação das reações imunoistoquímicas

Os critérios para a leitura das lâminas foram estabelecidos com base

nos trabalhos de Korner et al., 2007 e Pfeiler et al., 2010. As leituras foram

realizadas pela patologista Dra. Luciana Regina Moreira, do Laboratório de

Citopatologia do CAISM e acompanhadas pela pesquisadora. A patologista não

teve acesso às informações clínico-patológicas das pacientes (estudo cego).

O microscópio utilizado foi da marca Nikon-Eclipse E 200, com aumento de

400x. A interpretação do estudo imunoistoquímico foi realizada a partir de dois

parâmetros: intensidade da reação e porcentagem de células reativas, como se

observa na tabela 1. Como as lâminas de TMA foram confeccionadas em

duplicata, entre os dois resultados obtidos, utilizou-se o maior valor de

somatória dos escores (% + intensidade), com base nos trabalhos de

Makretsov et al., 2003 e Fadare et al., 2014.

Tabela 1 - Escores finais obtidos pela análise simultânea dos parâmetros: intensidade de

reação e porcentagem de células reativas

Intensidade da reação

% de células reativas 0 (negativo) 1 (leve) 2 (moderado) 3 (intenso)

0 0

1 (60) 4 5 6

Para a análise estatística da expressão proteica tecidual, os escores

foram transformados em variáveis dicotômicas. Positivo: presença de

48

expressão variando do escore 4 a 6. Negativo: ausência de expressão ou

expressão muito fraca, variando do escore 0 a 3 (tabela 2), com base no

trabalho de Bachmann et al, 2006.

Tabela 2 - Classificação das variáveis dicotômicas

Variável Significado da variável Escore

1 Positivo 4 a 6

2 Negativo a muito fraco 0 a 3

3.11. Análise dos dados

Devido à ausência de distribuição normal, as variáveis numéricas foram

transformadas em postos (ranks) e suas comparações entre os grupos foram

realizadas pelos testes não paramétricos de Mann-Whitney (2 grupos) ou

Kruskal-Wallis (3 grupos), acompanhado do teste post hoc de Dunn. A

comparação das variáveis categóricas entre os grupos foi realizada pelo teste

Qui-quadrado (X2) ou exato de Fisher e as análises de correlação entre as

variáveis numéricas foram feitas pelo teste de Spearman. Para comparar os

valores de SAA e APN entre as variáveis categóricas, foi utilizada a análise de

covariância (ANCOVA), com ajuste para IMC, CA, idade ou estado

menopausal.

As análises foram realizadas pelo programa GraphPad Prisma 5 e SPSS

(Statistical Package for the Social Sciences) versão 13.0 para Windows. O nível

de significância adotado foi de 5% (p< 0,05).

49

4. RESULTADOS

4.1. Dados demográficos, antropométricos, bioquímicos e clinico-

patológicos entre os grupos NO e SP/O.

A tabela 3 demonstra os dados demográficos, antropométricos,

bioquímicos e clínico-patológicos das pacientes com câncer de mama. Quanto

aos parâmetros antropométricos, observamos IMC (p

50

Tabela 3 - Dados demográficos, antropométricos, bioquímicos e clinico-patológicos entre

os grupos NO e SP/O. NO

n= 42

SP/O

n= 154 p

Idade (anos) a 50 (44–58) 54 (48–63) ns

IMC (kg/m2)

a 22,0 (21.4–23.6) 29.0 (26,3–3,.1) 88 cm; Grupo NO: IMC ≥18.5 e ≤ 24.99 kg/m2 e CA ≤ 88cm. Valores de referência: Col-T: ˂ 200 mg/dL; LDL-C: ≤ 160 mg/dL; HDL-C: ≥ 50 mg/dL; TG: ≤ 150 mg/dL; Gli: ˂ 100 mg/dL. ECP: estadiamento clínico-patológico, com base no sistema TNM (T-extensão do tumor primário; N-ausência ou presença de metástase em linfonodos regionais; M-ausência ou presença de metástase à distância); RE: receptor de estrógeno; RP: receptor de progesterona; HER2: Receptor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2; Triplo negativo: tumor mamário sem expressão de RE,RP

e HER2. Estado pós-menopausa: 12 meses consecutivos de ausência de menstruação. ªDados expressos como mediana e IQR (variação interquartil), comparações realizadas pelo teste de Mann-Whitney. bDados expressos como frequências absoluta (n) e relativa (%), analisados pelo teste Qui-quadrado ou exato de Fisher. *O nível de significância adotado foi de 5% (p < 0.05).

51

4.2. Dados demográficos, antropométricos, bioquímicos e clinico-

patológicos entre os grupos NO, SP/O e SP/O-SM.

A alta freqüência de parâmetros bioquímicos alterados no grupo SP/O

nos levou a identificar pacientes com a presença de Síndrome Metabólica (SM).

Verificamos que 51 (33,1%) pacientes do grupo SP/O apresentaram o número de

critérios suficientes para serem caracterizadas como portadoras de SM, e, diante

desta constatação, o grupo SP/O-SM (n=51) foi formado (esquema 5) e todas as

análises subsequentes foram realizadas para os três grupos de pacientes:

Esquema 5: Reagrupamento das pacientes em estudo: grupos NO, SP/O e SP/O-SM

52

Ao analisarmos as características demográficas e antropométricas entre

os 3 grupos (tabela 4), observamos que o grupo SP/O-SM apresentou idade mais

elevada tanto em relação ao grupo NO (p=0,0076), quanto ao grupo SP/O

(p=0,010). Estas diferenças se refletiram sobre as comparações relativas ao

estado menopausal, com frequência mais elevada de pacientes na pós-

menopausa no grupo SP/O-SM tanto em relação ao grupo NO (p=0,0386), quanto

ao grupo SP/O (p=0,0070). Ao analisarmos o estadiamento clínico-patológico

(ECP) não verificamos diferença entre os 3 grupos pelo teste de Kruskal-Wallis

(p=0,0802).

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