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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR CURSO DE OCEANOGRAFIA
Qualidade Microbiológica dos Mexilhões Perna perna (LINNAEUS,1758) In Natura e
Processados na Cooperativa de Maricultores da Penha, Santa Catarina
Amanda Massucatto
Itajaí, 2012
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR CURSO DE OCEANOGRAFIA
Qualidade Microbiológica dos Mexilhões Perna perna (LINNAEUS,1758) In Natura e
Processados na Cooperativa de Maricultores da Penha, Santa Catarina
Amanda Massucatto
Trabalho de Conclusão apresentado ao Curso de Oceanografia, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Bacharel em Oceanografia. Orientador: Marcus Adonai Castro da Silva
Itajaí, novembro, 2012
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"É exatamente disso que a vida é feita, de momentos. Momentos que temos que passar, sendo bons ou ruins, para o nosso próprio aprendizado. Nunca esquecendo do mais importante: Nada nessa vida é por acaso. Absolutamente nada. Por isso, temos que nos preocupar em fazer a nossa parte da melhor forma possível. A vida nem sempre segue a nossa vontade, mas ela é perfeita naquilo que tem que ser." Chico Xavier
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AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente à Deus, por proteger, guiar e iluminar meu caminho. Aos meus pais, a minha eterna gratidão por estarem sempre ao meu lado, por todo carinho, força e apoio que me proporcionam, por toda a luta e dedicação, por serem meu maior exemplo de vida. Ao meu companheiro Guilherme Zenni, por me incentivar a querer sempre mais, por tornar meus dias mais felizes com tanto amor e carinho. A todos meus amigos, que estando perto ou longe, influenciam todos os dias da minha vida e por propiciarem inúmeros momentos de bem estar e alegria. Aos amigos da faculdade, pelo companheirismo, encontros, festas, viagens, estudos e por acabarem construindo uma família "peixera". Ao meu orientador Marcus Adonai, pelo exemplo de profissionalismo, pela paciência, dedicação e valiosa orientação durante a realização deste trabalho. Ao Gilberto Manzoni, pela grande colaboração e viabilização em todo o desenvolvimento deste estudo. Ao pessoal do Laboratório de Microbiologia Aplicada, pelo inestimável auxílio nas análises laboratoriais e pelo bom convívio e descontração. Em especial aos Thiagos, sempre dispostos a ajudar, principalmente com a autoclavagem. A Cooperativa de Maricultores da Penha - COOPERMAPE, por terem cedidos as amostras para o presente estudo. A todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para realização desta pesquisa, o meu muito obrigada.
v
SUMÁRIO SUMÁRIO............................................................................................................................. iv
LISTA DE FIGURAS............................................................................................................. vi
LISTA DE TABELAS.............................................................................................................vii
LISTA DE ANEXOS.............................................................................................................viii
RESUMO.............................................................................................................................. ix
1. INTRODUÇÃO................................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS....................................................................................................................... 3
2.1 Objetivo Geral ..................................................................................................................3 2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................................3
3. FUNDAMENTAÇAO TEÓRICA.......................................................................................... 4
3.1 Espécie estudada...............................................................................................................4 3.2 Processamento do Mexilhão.............................................................................................5 3.3 Micro-organismos presentes no mexilhão de interesse a sáude pública ..........................7
4. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 10
4.1. Área de estudo ...............................................................................................................10 4.2. Amostragem ..................................................................................................................10 4.3. Análise Microbiológica dos Mexilhões.........................................................................11
4.3.1 Processamento de Amostras ....................................................................................11 4.3.2. Número Mais Provável (NMP) de Coliformes e de Escherichia coli ....................11 4.3.3. Contagem de Enterococos ......................................................................................11 4.3.4. Contagem de Staphylococcus aureus .....................................................................12 4.3.5. Contagem de Clostrídios sulfito redutores .............................................................12 4.3.6. Pesquisa de Salmonella ..........................................................................................12 4.3.7. Pesquisa de Listeria monocytogenes ......................................................................12
4.4 Variáveis físico-químicas ...............................................................................................13 4.5 Processamento e tratamento dos dados ..........................................................................13
5. RESULTADOS ................................................................................................................ 14
5.1 Análise de Microrganismos Indicadores ........................................................................14 5.2 Análise de microrganismos patogênicos ........................................................................17
6. DISCUSSÃO.................................................................................................................... 19
6.1 Coliformes totais e Echerichia coli ................................................................................19 6.2 Enterococos ....................................................................................................................21 6.3 Staphylococcus aureus ...................................................................................................22 6.4 Clostrídios sulfito redutores............................................................................................23 6.5 Salmonella ......................................................................................................................23
7. CONCLUSÔES................................................................................................................ 25
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................. 26
9. ANEXOS.......................................................................................................................... 29
vi
LISTA DE FIGURAS Figura 1: As imagens representam o processamento do mexilhão na COOPERMAPE, composta por imagens do mexilhão in natura, do caminhão frigorífico, do prédio da Cooperativa, do mexilhão cozido e desconchado, da área de trabalho e do produto embalado a vácuo. ................................................................................................................ 6
Figura 2: Processamento genérico de mexilhões (HUBER, 2004) ......................................... 6
Figura 3: Área de estudo, mostrando a localização do cultivo de mexilhões e a cooperativa onde são beneficiados (COOPERMAPE). ........................................................................... 10
Figura 4: Variação temporal das concentrações de coliformes totais, E. coli e enterococos encontradas no mexilhão in natura. ..................................................................................... 15
Figura 5: Variação temporal de UFC/ g de S. aureus na carne dos mexilhão in natura durante o período amostral. ................................................................................................. 15
Figura 6: Número Mais Provável por gramas de coliformes totais e E. coli encontradas no mexilhão cozido e embalado ao longo dos meses amostrados............................................ 16
Figura 7: Unidades Formadoras de Colônias por gramas de S. aureus e enterococos na carne dos mexilhão cozido e embalado durante o período amostral.................................... 16
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resultados do teste U de Mann e Whitney para comparação as concentraçoes de indicadores microbianos entre as amostras de mexillhão processado e in natura. Os valores sublinhados e em negrito correspondem aos que apresentaram mais que 90% de significância. ........................................................................................................................ 14
Tabela 2 – Matriz de correlação das variáveis ambientais e de micro-organismos indicadores. Apenas os resultados das análises de mexilhões in natura foram utilizados para avaliação das correlações. Os valores contendo um asterisco são significantes a um nível p inferior a 0,05....................................................................................................................... 17
viii
LISTA DE ANEXOS Anexo 1: Resultados das análises microbiológicas realizadas neste estudo........................ 29
Anexo 2: Critérios microbiológicos para moluscos bivalves segundo a legislação pertinente............................................................................................................................................. 29
Anexo 3: Classificação das amostras in natura de acordo com as análises de Escherichia coli (NMP) por 100g. ........................................................................................................... 30
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RESUMO
Os moluscos representam para a maricultura um dos grupos mais importantes em termos de
produção e economia. Em Santa Catarina o cultivo destes só vem aumentando ao longo dos
anos, porém eles representam uma possível fonte de contaminação aos seres humanos se
o local onde são beneficiados estiver comprometido. Desta forma, este trabalho tem como
objetivo avaliar a qualidade microbiológica dos mexilhões in natura e processados na
COOPERMAPE - Cooperativa de Maricultores da Penha, Santa Catarina. Para isto, no
período de março a outubro de 2012, amostras de mexilhões in natura e processados foram
analisadas para quantificar a concentração de micro-organismos indicadores, como
coliformes totais, Escherichia coli, enterococos e Staphylococcus aureuse e avaliar a
presença dos patógenos Salmonella e Listeria monocytogenes. Os coliformes totais e E. coli
foram quantificados através do método do Número Mais Provável pela técnica de tubos
múltiplos. Para os demais indicadores, foram utilizados métodos de contagem através de
culturas específicas, onde o número é obtido em Unidades Formadoras de Colônia por
mililitro. A confirmação da presença ou ausência dos patógenos, foi feita através de culturas
e posteriores testes bioquímicos específicos. Portanto, foi verificado que a ocorrência de
indicadores de contaminação fecal na carne dos mexilhões in natura, foi maior nos meses
mais quentes do que em meses mais frios. Porem para o mexilhão processado os
coliformes e E. coli apresentaram valores oscilantes durante o período de estudo, onde as
maiores concentrações foram de 1600 e 240 NMP/g, respectivamente. Ainda que, de
maneira geral, apresentam boa qualidade quanto a presença de E.coli, pois as concentração
estão dentro dos limites impostos pela legislação utilizada para este parâmetro. Outro fato
ocorrido, foram maiores concentrações de enterococos e Staphylococcus aureus observada
no mexilhão processado, indicando que o produto pode ter sofrido contaminação cruzada
durante alguma etapa de beneficiamento. Já a ocorrência de clostrídios foi pouco frequente,
apresentando apenas um valor alto (>636,174 UFC/g), este relatado em uma amostra do
mexilhão processado. Em relação aos micro-organismos patógenos, os mexilhões
apresentam boa qualidade, pois sua presença não ocorreu em nenhuma amostra durante os
meses estudados.
Palavras – chave: Salmonella, coliformes, qualidade microbiológica, mexilhão.
1
1. INTRODUÇÃO
A maricultura tem sido considerada importante na produção de alimentos, pois além
de elevar a produtividade de áreas costeiras, também contribui para o desenvolvimento
socioeconômico de regiões onde haja cultivo, diminuindo a pressão sobre os recursos
explorados pela pesca e tornando-se uma atividade rentável para as comunidades
artesanais (GELLI et. al., 1998). Para tanto, acaba sendo uma importante alternativa para
pescadores e ex pescadores, que vêm sendo afetados pela falta de perspectiva para a
pesca tradicional e que migram para a maricultura como atividade principal de geração de
renda (OSTRENSKY et al., 2008).
Os moluscos representam para a aqüicultura marinha um dos grupos mais
importantes em termos de produção e economia, já que seu custo de produção não são tão
elevados em relação à produção de outros grupos zoológicos (PAJERO, 1989). Desta
maneira, a malacocultura está incluída nos principais programas de desenvolvimento
econômico e social governamental, em função do alto valor do produto e da utilização de
técnicas simples. Seu sucesso se da também por estar envolvida em ambiente natural, não
necessitando de gastos com alimento, circulação de água e retirada de resíduos
(RESGALLA JR et al., 2008).
O desenvolvimento da malacocultura como atividade econômica no litoral de Santa
Catarina, tem passado por momentos importantes nos últimos anos, devido ao aumento
gradual da produção e da oferta, sendo o principal produtor nacional de moluscos bivalves,
o que corresponde a 95% da produção nacional (DE SOUZA et al., 2009). Segundo
EPAGRI (2011), o Estado produziu cerca de 15.965 toneladas na safra de 2011,
representando um aumento de 16,35% em relação à safra de 2010. Para isto, um
contingente de 599 mitilicultores atuaram na produção, distribuídos na faixa litorânea entre
os municípios de Palhoça e São Francisco do Sul, envolvendo também os municípios de
Governador Celso Ramos, Bombinhas, Penha e Florianópolis. Fatores como maior
disponibilidade de sementes provenientes de coletores artificiais, assentamento remoto e
extração de bancos naturais; estabelecimento de uma tabela de preço mínimo, protetoras do
mercado que garantem maior rentabilidade; campanhas de incentivo ao consumidor de
moluscos inspecionados, o que confere segurança alimentar, contribuíram para o aumento
da produção. O cultivo de moluscos é hoje a principal ou a segunda em importância
econômica para alguns municipios do Estado, isto tem possibilitado a integração entre
cultivo, turismo e gastronomia que revitalizou algumas localidades (OSTRENSKY et al.,
2008).
Entretanto, apesar do potencial socioeconômico existente nesta atividade, a prática
da maricultura não está isenta de riscos . Como todo produto animal, a legislação brasileira
exige que os moluscos tenham certificação de origem, isto é, que sejam beneficiados em
2
uma agroindústria ou entreposto vinculado ao serviço de inspeção, para que possam ser
comercializados legalmente (PANORAMA DA AQUICULTURA, 2009). Isto se torna
importante para os bivalves, pois refletem as condições ambientais em que vivem, por
serem organismos filtradores. Os moluscos são capazes de bioacumular uma série de
substâncias e agentes potencialmente nocivos, entre eles toxinas produzidas por
microalgas, metais pesados, bactérias e vírus. Portanto, seu consumo pode representar um
risco à saúde publica, sendo este ampliado pelo lançamento de esgoto doméstico e
despejos oriundos de atividades produtivas, industriais e agrícolas, desqualificando áreas já
utilizadas ou promissoras à obtenção de bivalves para consumo. Desta forma, quando o
local onde os moluscos são cultivados e beneficiados estiver comprometido, o seu consumo
torna-se responsável por inúmeros surtos epidêmicos e responde diretamente pelos
problemas de saúde pública (JOSÉ, 1996).
A intoxicação alimentar causada pelo consumo de mexilhões é decorrente do
consumo destes nas condições in natura ou ligeiramente cozidos, ou obtidos por um
processamento inadequado que não eliminou os micro-organismos patogênicos presentes
nos mesmos (SUPLICY, 1998). Desta forma, melhorias no processamento bem como
critérios de padronização são essenciais para que o produto final tenha assegurado sua
inocuidade (LIMA, 2010).
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2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a qualidade microbiológica dos mexilhões Perna perna in natura e
processados na Cooperativa dos Maricultores da Penha – COOPERMAPE
2.2 Objetivos Específicos
Determinar a concentração de coliformes, Escherichia coli, enterococos,
Staphylococcus aureus e clostrídios sulfito redutores em amostras de moluscos in natura e
processados na Cooperativa dos Maricultores da Penha – COOPERMAPE
Determinar a presença de Salmonella e Listeria monocytogenes em amostras de
moluscos in natura e processados na Cooperativa dos Maricultores da Penha –
COOPERMAPE
Avaliar a qualidade do produto ao contrastar resultados obtidos com os limites
estabelecidos na legislação vigente
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3. FUNDAMENTAÇAO TEÓRICA
3.1 Espécie estudada
De acordo com Rios (1994) o mexilhão cultivado no Brasil, sistematicamente,
pertence ao:
Phylum: MOLLUSCA
Classe: BIVALVIA (Linnaeus 1758)
Sub-classe: PTERIOMORPHA (Beurlen 1944)
Ordem: MYTILOIDA (Férussac 1822)
Superfamília: MYTILOIDEA (Rafinesque 1815)
Família: MYTILIDAE (Rafinesque 1815)
Subfamília: MYTILINAE (Rafinesque 1815)
Gênero: PERNA (Retzius 1788)
Espécie: PERNA PERNA (Linnaeus 1758)
O bivalve Perna perna (Linnaeus, 1758) é o maior mitilídeo do Brasil, podendo
alcançar 182 mm de comprimento (MAGALHÃES,1998). Em Santa Catarina é conhecido
popularmente como “marisco” e possui grande importância econômica no setor da
aquicultura, sendo atualmente a única espécie de mitilídeo cultivada comercialmente no
Brasil.
São organismos de hábitos bentônicos, e vivem aderidos por meio de fio de bisso a
um substrato rígido, formando colônias ou bancos naturais, constituindo assim um rico
ecossistema que abrange grande número de organismos que vivem associados a eles. É
uma espécie eurihalina, onde sua faixa de salinidade considerada ótima esta entre 34 e 36,
e euritérmica, podendo suportar temperaturas entre 5 e 30°C, porém sua faixa ótima esta
entre 21 e 28°C. Esta espécie habita, preferencialmente, os costões rochosos na região
entremarés até a zona infralitoral, e em profundidades variáveis, podendo chegar a 7
metros, porém a maior concentração dos mexilhões se dá na parte inferior da zona
entremarés, até um metro de profundidade (RESGALLA JR et al, 2008).
Os bivalves são caracterizados por duas conchas chamadas valvas, onde sua
principal função é proteger a estrutura interna do animal, sendo esta composta pelo manto,
que serve como abrigo aos outros órgãos. Também, observa-se as gônadas, estas são
formadas pelo conjunto de canais genitais e estão espalhadas pelo manto. O pé, que é
usado para sua locomoção quando ocorre o desprendimento do animal do substrato, e pelas
lâminas branquiais, onde devido ao batimento dos cílios, tem a função de efetuar a
5
respiração e a alimentação de microrganismos capturados pela corrente de água produzida
(BUSSANI, 1990; MARQUES, 1998).
Segundo Furlan et al. (2011), a composição bioquímica do mexilhão Perna pena,
varia em função da sazonalidade, bem como do local de origem, sendo maior a influência
sazonal. De forma geral é caracterizado como um alimento de excelente qualidade
nutricional, por ser constituído em média por 9,1% de proteína, 4,2% de carboidrato e 1,1%
de lipídeos, além de 83,8% de umidade. Constatando ser um alimento de importante fonte
proteica, reduzido conteúdo lipídico e calórico (62,8 kcal/100g).
3.2 Processamento do Mexilhão
A Cooperativa de Maricultores da Penha - COOPERMAPE, foi criada em 1998,
entretanto opera desde 2008 como unidade de beneficiamento, recebendo assessoria do
Centro Experimental de Maricultura (CEMar) - UNIVALI.
Para a realização do ciclo de produção do mexilhão algumas etapas são necessárias
(Figura 1 e 2). Inicialmente são realizadas colheitas feitas por embarcações com guinchos,
para ser realizado as atividades de manejo e a colheita nos long-lines, em seguida são
levados até a balsa, onde são lavados e selecionados por tamanho, ali mesmo é feito o
replantio da colheita, quando as sementes são colocadas nas redes de produção para se
desenvolverem. Posteriormente, são acondicionadas em caixas de plástico para serem
levadas até o caminhão frigorífico e transportadas até a cooperativa. Este transporte é
acompanhado pela Guia de Transporte Animal (GTA), para que ocorra uma efetiva
rastreabilidade do produto. Na cooperativa, são acondicionados a uma mesa específica,
onde são lavados a jato de alta pressão e em seguida é feito novamente a seleção e
limpeza dos mexilhões, para que se tenha um produto de melhor qualidade.
Na próxima etapa é feito o cozimento da carne, quando são colocados em caldeiras
de vapor ou em água doce fervente a 100°C, por em média 3 a 5 minutos, neste momento o
mexilhão é morto e sua concha se abre, nesta fase do processo é importante estar atento
quanto à qualidade da água do cozimento, pois pode refletir na qualidade do produto final.
Em seguida, são resfriados em tanques de gelo a 4ºC e levados para a mesa de desconche
(quando a concha é separada da carne) e assim seguem linhas distintas de acordo com o
tipo de produto que será fornecido ao consumidor. Na COOPERMAPE, são desenvolvidos
produtos apenas com a carne ou então a carne juntamente com a meia concha. As conchas
que não são utilizadas durante o beneficiamento, são trituradas, secadas ao sol e depois
depositadas no pátio da cooperativa para assim, haver o nivelamento do terreno. Após
serem desconchados e acondicionados em cestos de pesagem, são pesados e transferidos
para a câmara fria, onde serão embalados e identificados com o rótulo da empresa. No
rótulo consta a data de fabricação e validade e o número do lote processado e maricultor
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cooperado. Por fim são armazenados em caixas de plásticos higienizadas dentro da câmara
fria para então serem comercializados (NOLLI, 2010).
Figura 1: A ilustração representa o processamento do mexilhão na COOPERMAPE, composta por imagens do mexilhão in natura, do caminhão frigorífico, do prédio da Cooperativa, do mexilhão cozido e desconchado, da área de trabalho e do produto
embalado a vácuo.
Figura 2: Ilustração do processamento genérico de mexilhões (HUBER, 2004)
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3.3 Micro-organismos presentes no mexilhão de inter esse a sáude pública
Micro-organismos indicadores são grupos ou espécies que quando presentes em um
alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal,
sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial do alimento,
alem de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento,
produção ou armazenamento (FRANCO; LANDGRAF, 2006).
Os mexilhões podem apresentar em seu interior grande variedade de micro-
organismos. Muitos deles constituem a microbiota normal destes organismos, porém
espécies patogênicas, ou de interesse para a saúde pública também são observadas. A
flora mirobiana de moluscos varia muito, dependendo da qualidade da água de onde foram
retirados, da qualidade da água de lavagem e de outros fatores (JAY, 2005). Entre os
organismos de interesse para a saúde humana, temos organismos que vêm sendo utilizados
para avaliar a qualidade dos moluscos destinados ao consumo humano. Entre estes podem
ser citados as bactérias do grupo dos coliformes, a espécie Staphylococcus aureus, os
enterococos ou estreptococos fecais e os clostrídios sulfito redutores.
Os coliformes são formados por bactérias da família Enterobacteriaceae, capazes de
fermentar lactose com produção de gás, quando incubados a 35-37°C, por 48 horas. São
bacilos gram-negativos e não formadores de esporos. A pesquisa de coliformes no alimento
fornece informações sobre as condições higiênicas do produto e melhor condição de
eventual presença de enteropatógenos (FRANCO; LANDGRAF, 2006). Fazendo parte deste
grupo existe a espécie Escherichia coli, que é a única considerada exclusivamente de
origem entérico, uma vez que esse organismo é encontrado no conteúdo intestinal do
homem e animais de sangue quente e tem sido utilizada com indicadora de poluição fecal.
Estes micro-organismos estão entre os mais estudados na avaliação de moluscos cultivados
destinados ao consumo. Na área de estudo, os coliformes foram previamente estudados por
vários pesquisadores. Foi constatado que em geral os moluscos apresentam uma boa
qualidade em relação com este parâmetro, isto pode ser observado por Schmitt (1998) e
Sartori (2008), apesar de Nolli (2010) ter relatado amostras acima do limite estabelecido
pela legislação pertinente.
No entando, o grupo dos enterococos (gênero Enterococcus) podem ser melhores
indicadores da qualidade sanitária dos alimentos do que os coliformes, pois sobrevivem por
mais tempo que coliformes fecais no meio marinho, podendo ser úteis como indicadores de
poluição neste ambiente (JAY, 2005). Ainda, sua presença em números elevados em
alimentos indica práticas sanitárias inadequadas ou exposição do alimento a condições que
permitiram a multiplicação de organismos indesejáveis. Os enterococos são bacterias láticas
na forma de cocos ou cocobacilos gram-positivos, catalase negativos e anaeróbios
facultativos, possuem uma temperatura ótima de crescimento de 35ºC, porém, podem
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crescer em um intervalo de 10°C a 45°C (SILVA et al., 2001 ; FRANCO; LANDGRAF, 2006).
No parque de cultivo da praia de Armação do Itapocoróy, Silva (2000) notou que estes
organismos apresentam variação temporal, onde maiores valores foram encontrados no
inverno.
Como consequência direta da manipulação inadequada, pode surgir no pescado a
contaminação por Staphylococcus aureus, sendo esta de origem humana, encontrada nas
mucosas e superfície e que encontram no pescado ambiente favorável para sua
multiplicação (ADAMS et al., 1994; CARDONHA et al.,1994; GERMANO et al., 1993 apud
Galvão et al., 2006). As bactérias do gênero Staphylococcus pertencem à família
Micrococcaceae, são cocos gram-positivos e anaeróbios facultativos, apresentam
temperatura de crescimento na faixa de 7ºC a 47,8ºC, porém as enterotoxinas, as quais
podem produzir, apresentam crescimento ótimo entre 40ºC e 45ºC, onde os surtos de
intoxicação alimentar são provocados por alimentos que permaneceram neste intervalo de
temperatura por tempo variável (FRANCO; LANDGRAF, 2006).
Outros micro-organismos indicadores de contaminação fecal, são os clostrídios, não
são específicos de fezes humanas, mas por serem formadores de esporos podem persistir
nos alimentos mesmo quando a maioria dos micro-organismos entéricos forem destruídos.
Compreendem bacilos gram-positivos produtores de esporos, são anaeróbios estritos e
catalase negativos, com exceção de algumas espécies aerotolerantes (FRANCO;
LANDGRAF, 2006). Contudo as espécies C. botulinum e C. perfringens, são patógenos
importantes em toxinfecções de origem alimentar, por serem incapazes de crescer na
presença de oxigênio livre, o processo de cocção retira o oxigênio, criando condições
anaeróbias favoráveis para o crescimento de clostrídeos. Este fato é ainda mais relevante
para o C. botulinum, pois podem produzir a toxina botulínica em embalagens de atmosfera
modificada. O isolamento de pequenas quantidades de C. perfringens em alimentação não
significa, necessariamente, um perigo de intoxicação alimentar, apenas quando grandes
quantidades estão presente, pode-se dizer que há um perigo definido (FORSYTHE, 2005).
Dentre outros micro-organismos presentes na água que podem ser nocivos á saúde
humana, pode-se citar a bactéria Salmonella, gênero pertencente à família
Enterobacteriaceae e compreende bacilos gram-negativos não produtores de esporos, são
anaeróbios facultativos e produzem gás a partir de glicose (FRANCO; LANDGRAF, 2006).
A sua presença pode ser decorrente de ambientes contaminados principalmente pelo
homem ou por animais, porem, para peixes, moluscos e crustáceos a contaminação pode
ocorrer após a pesca ou em virtude das águas estarem contaminadas pela bactéria (VIEIRA,
2003). Desta forma, o contágio em seres humanos, pode ocorrer através do contato ou
ingestão da água contaminada, ou ingestão de organismos procedentes desta, tais como os
moluscos (WOOD, 1977). As bactérias do gênero Salmonella estão entre as mais
9
importantes causadores de doenças de origem alimentar, sendo altamente recomendado o
cozimento adequado deste produto anteriormente ao seu consumo (GALVÃO, 2004).
Listeria monocytogenes também tem grande importância em alimentos devido a sua
patogenicidade, ela encontra-se amplamente disseminada na natureza, tanto o homem
como animais servem de reservatórios a essa bactéria, é bastante conhecido por ser a
espécie causadora da listeriose. Compreendem bacilos gram-positivos não esporulados,
anaeróbios facultativo, apresentam crescimento na faixa de 2,5 a 44ºC, porem há relatos de
sua existência a 0ºC, podendo assim suportar repetidos congelamentos e
descongelamentos (FRANCO; LANDGRAF, 2006). O fato desta bactéria crescer em
temperatura de refrigeração é grande motivo de preocupação quanto à sua presença em
alimentos com atmosfera modificada (JAY, 2005).
Portanto, uma monitorização eficiente destes diferentes micro-organismos
patogênicos nos moluscos cultivados é fundamental para a qualificação deste importante
recurso alimentar. Para isso é importante aprimorar as técnicas de monitorização da
qualidade microbiológica dos moluscos cultivados, com o intuito de torná-las mais práticas e
mais eficientes em atingir a sua finalidade de assegurar ao consumidor um produto de boa
qualidade.
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4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Área de estudo
A área de estudo está situada no parque de cultivo de mexilhões, localizado na
Enseada da Armação do Itapocoroy, no Município de Penha (SC), Brasil, situada nas
coordenadas 26º 46’ de latitude S e 48º 36’ de longitude W. (Figura 3)
Figura 3: Área de estudo, mostrando a localização do cultivo de mexilhões e a Cooperativa onde são beneficiados (COOPERMAPE).
4.2. Amostragem
Foram coletadas amostras de mexilhões Perna perna provenientes do parque de
cultivo situado na Enseada da Armação do Itapocory, Penha, SC, bem como amostras de
mexilhões processados fornecidos pela Cooperativa dos Maricultores da Penha –
COOPERMAPE, localizada na Rua Lourival de Souza, 1700, cuja qual beneficia mexilhões
oriundos de áreas de cultivos de distintas cidades, como, Bombinhas, Florianópolis, Penha e
São Francisco do Sul. Estas amostragens foram realizadas no período de março a outubro
de 2012.
Do parque de cultivo, 10 a 15 indivíduos foram coletados diretamente de cordas de
cultivo, estes foram levados para o laboratório e analisados até um período não superior a 6
horas. Os mexilhões cozidos já embalados e prontos para o comércio foram cedidos pela
COOPERMAPE, que beneficiam moluscos cultivados na mesma região na qual foram
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coletadas as amostras para este trabalho. No total foram obtidas 14 amostras de mexilhões,
sendo 7 amostras do mexilhão in natura e 7 amostras do mexilhão cozido e embalado.
4.3. Análise Microbiológica dos Mexilhões
4.3.1 Processamento de Amostras
Para a análise as conchas foram lavadas externamente, com escova e água
corrente, em seguida abertas com o auxílio de bisturis e pinças estéreis. Vinte e cinco
gramas do material no interior das conchas, contendo os organismos juntamente com água
interna, foram coletados em assepsia e homogeneizados em 225 ml de solução específica
para cada análise microbiológica realizada com o auxílio da processadora Bag Mixer. O
mesmo procedimento foi realizado com o mexilhão cozido, porém, estes chegaram ao
laboratório sem a presença das conchas e devidamente embalado.
Assim sendo, para as análises de NMP de coliformes e Escherichia coli, e para a
contagem de Enterococos, Staphylococcus aureus e Clostridium, 25g da amostra descrita
acima foi homogeneizada em 225 ml de solução de Água Peptonada a 0,1%. Para a
determinação da presença ou ausência de Salmonella foi utilizado 225ml de Caldo Lactose
e para a determinação da presença ou ausência de Listeria monocytogenes, a solução
utilizada foi 225 ml de Caldo Enriquecimento Listeria (LEB).
4.3.2. Número Mais Provável (NMP) de Coliformes e de Escherichia coli
De acordo com a metodologia proposta pelo Bacteriological Analytical Manual (FDA,
1998), para a determinação do NMP de coliformes totais e Escherichia coli, foram feitas
duas diluições decimais (10-2 e 10-3) a partir do homogenizado da amostra da carne do
mexilhão, em tubos contendo 9ml de água peptonada 0,1%. Em seguida, foram retiradas
alíquotas de 1 ml e semeadas em uma série de 5 tubos contendo caldo Fluorocult LMX
Broth – Mofified Lauryl Sulfate Broth with MUG, e então incubados em estufa a 35°C por
24h. Após o período de incubação os tubos foram examinados para verificar se houve
crescimento de coliformes totais, sendo positivo quando o meio altera a sua cor inicial para
uma cor verde azulada. A presença de E. coli é confirmada ao emitir fluorescência azul
quando exposta a uma lâmpada de luz UV. Em função das diluições e seu números de
tubos positivos estima-se por uma tabela estatística o Número Mais Provável (NMP) de
coliformes totais e fecais (APHA, 1992).
4.3.3. Contagem de Enterococos
A contagem de Enterococos foi determinada utilizando-se ágar KF Streptococcus
suplementado com cloreto de trifenoltetrazolium (TTC), onde alíquotas de 0,1ml de diluições
do homogeneizado, foram inoculadas pela técnica de espalhamento em placas. As placas
12
inoculadas foram incubadas a 35ºC por 48 horas. Após este período, as colônias com
coloração vermelho-escuras e rosas foram contadas, o número é obtido em Unidades
Formadoras de Colônia por mililitro (UFC/ml) (APHA, 1992).
4.3.4. Contagem de Staphylococcus aureus
Para a contagem de Staphylococcus aureus, alíquotas de 0,1ml de diluições do
homogeneizado (100, 10-1 e 10-2), foram inoculadas pela técnica de espalhamento em
placas, feitas em placas de petri contendo ágar Baird Parker. As placas inoculadas foram
incubadas a 35ºC por 48 horas. Transcorrido o tempo de incubação, as colônias com
coloração preta e halo claro foram contadas. Após este procedimento o número de S.
aureus coaulase positivos foi obtido, em Unidades Formadoras de Colônia por mililitro
(UFC/ml) (APHA, 1992).
4.3.5. Contagem de Clostrídios sulfito redutores
Para a contagem de clostrídios sulfito redutores, placas de Agar TSC foram
inoculadas com diluições decimais da amostra homogeneizada e incubadas em anaerobiose
a 35ºC por 24 horas. Transcorrido o tempo de incubação, as colônias pretas foram
contadas, para a obtenção do número de clostrídios sulfito redutores na amostra
(RHODEHAMEL; HARMON, 2001).
4.3.6. Pesquisa de Salmonella
Para a pesquisa de Salmonella, a amostra diluída anteriormente descrita foi incubada
a 35ºC por 24 horas. Transcorrido o tempo de incubação, a cultura foi repicada para um tubo
de ensaio contendo Caldo Selenito Cistina, e novamente incubada por 24 horas a 35ºC.
Após esta nova incubação, placas de petri contendo ágar MacConkey e ágar Salmonella
Shigella foram inoculadas com esta cultura e incubadas nas mesmas condições. Após este
período, as placas contendo as amostras foram analisadas, as que apresentaram colônias
suspeitas de Salmonella (incolores ou incolores com centro negro) foram repicadas em ágar
TSA, incubadas por 48 horas a 35ºC (APHA, 1992).
Posteriormente são realizados testes bioquímicos para sua confirmação, tais como,
prova da Oxidase, reações em ágar três açúcares ferro (TSI), produção de uréase,
descarboxilação da lisina e motilidade no Meio SIM.
4.3.7. Pesquisa de Listeria monocytogenes
Para a pesquisa de Listeria monocytogenes, a amostra homogeneizada foi incubada
a 30ºC. Após 24 e 48 horas de incubação, placas de Petri contendo ágar Oxford e Palcam
foram inoculadas com alíquotas do enriquecimento e incubadas a 35ºC por 48 horas. Após a
incubação, colônias suspeitas de L. monocitogenes (arredondadas e enegrecidas) foram
13
repicadas para placas de ágar TSA suplementado com extrato de levedura e incubadas por
24 horas a 35°C, para sua identificação por métodos bioquímicos e morfológicos
(HITCHINS, 2001). Para isto, utiliza-se gotas de KOH e H2O2 para confirmação de catalase
positiva.
4.4 Variáveis físico-químicas
Os valores de temperatura e salinidade da área de coleta dos mexilhões foram
fornecidos através de tabelas do software Microsoft Excel, pelo Professor e Pesquisador
Gilberto Caetano Manzoni, onde foram calculadas as médias de ambas variáveis nos dias
17/abril, 17/maio, 28/junho, 02, 21 e 28/agosto e 01/outubro.
4.5 Processamento e tratamento dos dados
Os resultados obtidos das análises microbiológicas foram armazenados em planilhas
eletrônicas do software Microsoft Office Excel 2007, onde os dados foram plotados
graficamente.
As análises estatística foram feitas utilizando software Statistica. Para se obter a
relação entre as variáveis físico-químicas e os micro-organismos indicadores encontrados
no mexilhão in natura, foram feitas análises utilizando o coeficiente de correlação de
SPEARMAN. Para determinar se haviam diferenças significativas entre os micro-organismos
indicadores dos mexilhões in natura e dos mexilhões processados, foi realizada a Prova U
de MANN-WHITNEY.
14
5. RESULTADOS
Durante o período de estudo, de março a outubro de 2012, 14 amostras provenientes
da Cooperativa dos Maricultores da Penha – COOPERMAP, foram analisadas, destas 7
foram de mexilhão in natura e 7 de mexilhão processado. Nestas amostras foram
determinadas as concentrações de coliformes totais, Escherichia coli, enterococos,
Staphylococcus aureus e Clostridium, e a presença ou ausência dos microrganismos
patógenos do gênero Salmonella e de Listeria monocytogenes.
5.1 Análise de Microrganismos Indicadores
As concentrações de microrganismos indicadores variaram nas amostras analisadas.
A concentração de coliformes totais variou entre 0 e 1600NMP/g enquanto que de E. coli
variou entre 0 e 240NMP/g (Anexo 1). Em relação os enterococos, as concentrações
variaram entre 750 e 8,2x106UFC/g, e para Staphylococcus aureus, variaram entre 100 e
2,77x106UFC/g, sendo que em ambos o valor mais alto foi observado em mexilhão
processado e o mais baixo em mexilhão in natura (Anexo 1). Os clostrídios sulfito redutores
foram detectados em apenas 3 das 14 amostras analisadas, sendo uma amostra do
mexilhão in natura, que apresentou 200UFC/g destes micro-organismos, e duas amostras
do mexilhão processado, que apresentaram contagens iguais a 50UFC/g e >636174UFC/g
(Anexo 1).
Com a finalidade de comparar as concentrações dos micro-organismos indicadores
nos mexilhões processados e in natura foi realizado o teste U de Mann e Whitney, um teste
de hipótese não paramétrico. Por este teste foi verificado que as concentrações de
coliformes totais e E. coli não diferiram entre as amostras, enquanto que os mexilhões
processados apresentaram valores mais altos de enterococos e de S. aureus, em relação
com os mexilhões in natura (nível de p inferior a 0,1; Tabela 1).
Tabela 1. Resultados do teste U de Mann e Whitney para comparação as concentraçoes de indicadores microbianos entre as amostras de mexillhão processado e in natura. Os valores sublinhados e em negrito correspondem aos que apresentaram mais que 90% de significância.
Número Amostral Indicador Microbiano U p-level
Mexilhão Processado Mexilhão In natura Coliformes totais 23,5 0,89788 7 7 Escherichia coli 18 0,38959 7 7 Enterococos 9 0,03443 7 7 Staphylococcus aureus 11 0,08317 7 7
15
As concentrações de coliformes totais, E. coli e enterococos presentes na carne do
mexilhão in natura, apresentaram valores decrescentes ao longo dos meses quentes para
meses frios (Figura 4). Por outro lado, a contagem de S. aureus foi marcada por um padrão
inverso, onde as maiores concentrações se deram nos meses mais frios (Figura 5).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
01/abr 21/mai 10/jul 29/ago 18/out
NM
P o
u U
FC/g
Data
Coliformes totais
Escherichia coli
Enterococos
Figura 4: Variação temporal das concentrações de coliformes totais, E. coli e enterococos
encontradas no mexilhão in natura.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
01/abr 21/mai 10/jul 29/ago 18/out
Data
UF
C/g
Staphylococcusaureus
Figura 5: Variação temporal de UFC/ g de S. aureus na carne dos mexilhão in natura durante o período amostral.
Para o mexilhão processado, esses padrões sazonais não foram notados (Figura 6).
Desta forma as concentrações de coliformes totais e E. coli sofreram oscilações ao longo
dos meses estudados, sendo que a maior concentração de coliformes totais ocorreu no mês
de março, com valor igual a 1600NMP/g e a maior concentração de E. coli, no mês de
junho, com valor igual a 240NMP/g.
16
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
29/mar 03/mai 12/jun 02/ago 20/ago 27/ago 24/set
NM
P/g
Data
Coliformes totais
Escherichia coli
Figura 6: Número Mais Provável por gramas de coliformes totais e E. coli encontradas no mexilhão cozido e embalado ao longo dos meses amostrados.
A contagem de Staphylococcus aureus e enterococos na carne do mexilhão cozido e
embalado, apresentaram tendências semelhantes, evidenciando dois momentos com
elevadas concentrações, o primeiro momento no dia 29 de março e o segundo no dia 27 de
agosto (Figura 7).
0,0E+00
1,0E+06
2,0E+06
3,0E+06
4,0E+06
5,0E+06
6,0E+06
7,0E+06
8,0E+06
9,0E+06
11/fev 01/abr 21/mai 10/jul 29/ago 18/out
UFC
/g
Data
Enterococos
Staphylococcus aureus
Figura 7: Unidades Formadoras de Colônias por gramas de S. aureus e enterococos na
carne dos mexilhão cozido e embalado durante o período amostral.
Com o objetivo de avaliar a associação da temperatura e da salinidade com os
valores de coliformes totais, E. coli, enterococos e Staphylococcus aureus encontrados no
mexilhão in natura, foi realizada uma análise de correlação, utilizando o coeficiente não
17
paramétrico de Spearman. Foi verificado que os enterococos tiveram correlação positiva
significante com a temperatura e com a salinidade.
Tabela 2 – Matriz de correlação das variáveis ambientais e de micro-organismos indicadores. Apenas os resultados das análises de mexilhões in natura foram utilizados para avaliação das correlações. Os valores contendo um asterisco são significantes a um nível p inferior a 0,05.
Coliformes totais Escherichia coli Enterococos Staphylococcus aureus Temperatura 0,400 0,374 0,802* -0,252 Salinidade 0,582 0,512 0,757* -0,396
O Programa Nacional de Controle Higiênico Sanitário de Moluscos Bivalves
(PNCMB), instituído em conjunto pelo Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA) e Ministério
da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), estabelece requisitos mínimos
necessários para a garantia da inocuidade e qualidade dos moluscos bivalves destinados ao
consumo humano, através do monitoramento e controle de micro-organismos
contaminantes. Desta forma dispõe uma subdivisão onde determina padrões
microbiológicos por meio da estimativa da densidade média de Escherichia coli (NMP) em
100 gramas da parte comestível dos moluscos bivalves, não sendo estabelecido um padrão
para os níveis de coliformes totais. Assim o critério para retirada liberada de moluscos
bivalves é de um valor limite inferior 230 Escherichia coli (NMP) por 100 gramas, o critério
estabelecido para retirada liberada sob condição fica entre 230 e 46.000 NMP/100g e
acima desse valor a retirada fica suspensa (Anexo 2). Assim, considerando os
concentrações de E. coli determinadas nos mexilhões in natura, apenas a amostra analisada
no dia 28 de junho se manteve abaixo do limite estabelecido para retirada liberada (Anexo
3). Neste caso os moluscos bivalves provenientes destes locais podem ser destinados vivos
ao consumo humano, após os procedimentos de inspeção em estabelecimentos
processadores, sem necessidade de depuração prévia ou outro tratamento complementar.
As outras amostras seriam classificadas como liberadas sob condição, isto é, os moluscos
bivalves procedentes destes locais somente podem ser colocados no mercado para
consumo humano após depuração, processamento térmico que permita eliminar os micro-
organismos patogênicos ou remoção de vísceras e gônadas conforme a espécie processada
e tipo de produto obtido (BRASIL, 2012). É importante destacar que nenhuma amostra foi
identificada na condição de suspensa.
5.2 Análise de microrganismos patogênicos
Micro-organismos do gênero Salmonella e da espécie Listeria monocytogenes não
foram detectados em nenhuma das amostras analisadas (Anexo 2). Portanto, de acordo
18
com estes parâmetros todas as amostras analisadas se encontravam adequadas para o
consumo humano.
19
6. DISCUSSÃO
6.1 Coliformes totais e Echerichia coli
Nas análises microbiológica realizadas nos mexilhões provindos do parque de
cultivo, os valores de coliformes totais foram maiores em relação aos valores de E.coli, o
que é esperado, pois os coliformes totais envolvem um número maior de organismos. Em
geral, ambas apresentaram maiores valores nas amostras analisadas nos meses de abril e
maio, do que nos meses de junho, agosto e outubro (Figura 4), isto indica que
possivelmente no outono ocorra uma maior contaminação dos mexilhões, devido a
temperatura da água ser mais elevada que nos meses de inverno. Para o mexilhão Perna
perna, a temperatura na qual a taxa de filtração é máxima situa-se entre 20 e 25°C, sendo
que abaixo de 15°C ou acima de 30°C, os organismos respondem diminuindo sua taxa de
filtração (SILVA, 2000). A temperatura nos meses de outono apresentou média igual a 23ºC,
indicando máxima taxa de filtração. Este resultado é condizente com Silva (2000), onde
relatou no mesmo local de estudo, que existe uma variação temporal nos níveis de
coliformes totais e fecais, pois apresentaram maiores valores no outono, do que no inverno.
Outra possível explicação para os níveis colimétricos relatados durante o período
amostral, poderia ser a influência do aporte continental de efluentes como fonte de
contaminação sobre o parque aquícola local. A intensa ocupação humana aliada à carência
de infra-estrutura urbana, pode refletir no meio ambiente, ocasionando entre outros
problemas, o aumento de efluentes para os corpos hídricos, esta é uma realidade comum na
maioria das cidades brasileiras. Entretanto, este quadro é incompatível com o cultivo de
animais marinhos para o consumo humano (LOGULLO, 2005). No trabalho realizado por
Sartori (2008), foram detectados 33 pontos possíveis de contaminação ao longo da Enseada
onde esta localizado o cultivo. Sabe-se que, a inexistência de um sistema de coleta e
tratamento de efluentes domésticos pode prejudicar a produção de mariscos, pois estes
moluscos são filtradores da água e a sua contaminação certamente trará prejuízos aos
produtores e consumidores. Estima-se que os mexilhões filtram diariamente cerca de 40
litros de água, e caso ocorra um evento de contaminação em grande escala, poderá ocorrer
em 1 litro de água do mar a presença de 20 a 40 milhões de seres unicelulares, tornando-se
vetores potenciais de infecções transmitidas pela água (OLIVEIRA et al, 2004). Ainda,
segundo Turick et al (1998), os mexilhões podem reter densidades de coliformes fecais 15 a
20 vezes mais do que observado na água à sua volta. Devido ao fato de acumularem estes
micro-organismos no seu corpo, o perigo de se manter um cultivo em uma área sem
tratamento sanitário pode ser potencializado.
BALDEZ (1998) relata que micro-organismos fecais em moluscos são sempre
originados, ou pelo lançamento de esgotos próximo aos locais de captura ou pelos cuidados
20
de manipulação inadequada que podem ocorrer durante as etapas de empacotamento,
transporte, estocagem, reembalagem e apresentação ao consumidor. Os valores de
coliformes encontrados nos mexilhões processados, não foram significantemente maiores
do que os encontrados no mexilhão in natura (Tabela 1), porem isto indica que o
processamento pode não ter sido efetivo em alguma etapa, pois estes valores também não
foram inferiores, o que deveria ter ocorrido, pois um dos objetivos do beneficiamento do
produto é reduzir a carga microbiana e inibir o crescimento de bactérias, parasitas e vírus
patológicos ao homem (ANTONIOLLI, 1999 apud LIMA, 2010).
Devido a necessidade de monitoramento de microrganismos contaminantes em
moluscos bivalves, o Programa Nacional de Controle Higiênico Sanitário de Moluscos
Bivalves (PNCMB), instituído em conjunto pelo Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA) e
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) em maio deste ano, tem a
finalidade de garantir padrões mínimos de qualidade, como medida de prevenção de efeitos
nocivos à saúde do consumidor, considerando também a necessidade de estabelecer
requisitos de inspeção industrial e sanitária dos estabelecimentos de processamento de
moluscos bivalves, abrangendo etapas de retirada, trânsito, processamento e transporte dos
moluscos. Desse modo, conforme os resultados analisados, a retirada dos moluscos poderá
ser suspensa quando a concentração de E.coli for maior que 46.000 NMP por 100 gramas,
ou liberada quando o NMP/100g for menor que 230. Há ainda a possibilidade de a retirada
ser liberada sob condição, onde os valores ficam entre os descritos anteriormente, o que
significa que os moluscos deverão passar por um processo de depuração e/ou tratamento
térmico. Em Santa Catarina, Estado que responde pela maior produção de moluscos
bivalves no país, a Companhia Integrada de Desenvolvimento Agrícola de Santa Catarina
(CIDASC), possui convênio firmado com o MPA, sendo assim responsável pela execução do
PNCMB no Estado (MPA, 2012). Assim, observamos que, durante o período amostral,
apenas uma amostra analisada no mês de junho teria condições de ser utilizada direto para
consumo humano, e as demais ficaram liberadas sob condição, onde os mexilhões apenas
poderiam ser colocados no mercado para consumo humano após depuração, ou seja, após
processamento térmico que permite eliminar os micro-organismos patogênicos (Anexo 3).
Ainda que o consumo de mexilhões somente é realizado após o cozimento, esse quadro
seria portanto mais relevante para bivalves que são consumidos crus, como as ostras.
De acordo com Schmitt (1998) e Sartori (2008), que também analisaram os valores
de coliformes na carne dos mexilhões cultivados na Enseada da Armação do Itapocoroy,
constataram utilizando os padrões colimétricos estabelecidos Segundo a Divisão de
Vigilância Sanitária de Alimentos – DINAL – através da portaria n° 001/87, que 100% das
amostras coletadas indicaram níveis adequados para o comércio, segundo critério de
coliformes fecais.
21
6.2 Enterococos
O uso dos enterococos como indicador de contaminação fecal é mais indicado em se
tratando do ambiente marinho (BITTON, 1994), devido ao fato de serem menos numerosos
em fezes humanas do que a E. coli, deste modo, o teste para enterococos,
presumivelmente, reflete melhor a relação do número de patógenos intestinais, além de que
morrem mais lentamente em água do que os coliformes, desta forma sobrevivendo mais do
que o patógeno cuja presença eles devem indicar (JAY, 2005). Apesar disto, não existe em
nossa legislação padrões estabelecidos para enterococos, porém sabe-se que sua dose
infecciosa é no máximo de mil organismo (FORSYTHE, 2002). Seguindo esse padrão,
observa-se que todas as amostras coletadas para o mexilhão in natura apresentam-se
abaixo deste limite, já as amostras do mexilhão processado, apresentam-se na maioria
acima deste limite, onde exclui-se apenas duas amostras que não tiveram a presença deste
organismo. Ao aplicar a Prova U de Mann-Whitney, nota-se que existe variação nos níveis
de enterococos entre o mexilhão processado e o in natura, sendo que os mexilhões
processados foram os que apresentaram os maiores valores de enterococos. Mesquita
(2006) afirma que a os fatores que mais predispõem a contaminação vêm da inadequada
manipulação dos produtos, resultando assim em uma contaminação cruzada na exposição
dos produtos a temperaturas adequadas ao crescimento bacteriano. A contaminação
cruzada ocorre pela transferência de microrganismos de um local para outro, seja na etapa
de cozimento, no manuseio pelas desconchadoras e/ou no acondicionamento em
recipientes plásticos, onde posteriormente ocorre a pesagem, embalagem e expedição. Para
tanto, a má higiene dos materiais utilizados durante o processamento, depois do cozimento
(bancada, recipientes plásticos) ou então devido a má higiene dos funcionários que o
manipulam, podem ser possíveis causas para a contaminação (NOLLI, 2010). Forsythe
(2005) ainda afirma que a contaminação dos alimentos por enterococos geralmente se da
por má-higiene ou por manipuladores de alimentos doentes, onde estes podem infectar
centenas de indivíduos. Entretanto, durante a preparação dos alimentos, deve-se evitar o
contato direto ou indireto entre alimentos crus, semi-preparados e prontos para consumo,
afim de minimizar o risco de contaminação cruzada (BRASIL,2004).
Ao analisar a influência da temperatura e da salinidade, as concentrações de
enterococos encontrados no mexilhão in natura tiveram forte correlação com tais variáveis,
de acordo com teste de coeficiente de correlação de Spearman. Esta associação pode ter
ocorrido, pela preferência destes organismos a temperaturas e salinidades mais altas,
observado também por apresentarem maiores concentrações nos meses mais quentes do
que nos meses mais frios (Figura 4). Conclui-se que estes organismos durante os meses
22
estudados, apresentaram variação temporal. Porém, sugere-se que ocorra outros estudos
que comprovem esta análise.
6.3 Staphylococcus aureus
Em relação com as contagens de S. aureus não existem limites estabelecidos na
legislação pertinente para pescado. Portanto o limite para contagem de S. aureus coagulase
positiva de 103UFC/g (BRASIL, 2001) foi usado como referência para a avaliação das
amostras, assim como o número mínimo de S. aureus necessário para a produção de
toxinas (106/grama) segundo FDA (2011). Com base nesses critérios apenas as amostras
analisadas em 29/março e 27/agosto apresentam contagens de S aureus que invabilizariam
o consumo dos moluscos, sendo estas encontradas no mexilhão processado. Salán (2005),
ao avaliar o crescimento deste micro-organismos em tratamento térmico de mexilhão Perna
perna, observou que o maior crescimento de S. aureus, aconteceu no mexilhão cozido, onde
obteve contagem na ordem de 5,3 a 6,1x107UFC/g.
Este é um aspecto importante, uma vez que este organismo esta associado com
intoxicações alimentares e a enterotoxina ingerida é pré-elaborada em substratos
alimentícios em densidade populacional situada entre 106 e 108UFC/g. Silva (2000)
evidencia que a ingestão de alimentos contaminados com S. aureus é a terceira maior
causa que esta envolvida com intoxicação alimentar, causando problemas como
gastroenterites provocadas por alimentos de origem animal. Apesar dos manipuladores
serem, normalmente, a principal fonte de contaminação dos alimentos, quando há surtos, os
equipamentos e as superfícies também podem ser a fonte de contaminações por S. aureus
(FORSYTHE, 2005). Ao aplicar a Prova U de Mann-Whitney, esta observação pôde ser
concluída, pois com 95% de significância (p>0,05), as amostras do produto beneficiado
mostraram-se superiores as amostras do mexilhão in natura.
Normalmente tratamentos térmicos aplicados, como cocção da carne, e substâncias
químicas usadas como agentes de sanificação, destroem as cepas de S. aureus. A
presença após estes tratamentos podem indicar aquecimento ou sanificação insuficientes,
ou contaminação depois da cocção (INGHAN; SCHOELLER, 2001). Segundo Pigott e
Tucker (1990) os micro-organismos patogênicos são destruídos em temperaturas abaixo de
100ºC, sendo que, o efeito de aumentar a temperatura interna do alimento para 66ºC, é o
suficiente para tornar o alimento microbiologicamente seguro. Isto pôde ser observado por
Salán (2005), onde depois do aquecimento as concentrações de S. aureus reduziram dois
ciclos logarítmicos em todo tratamento utilizado.
23
6.4 Clostrídios sulfito redutores
Apesar de na legislação brasileira, não ter um limite estabelecido por sua ocorrência,
as análises foram realizadas para que se tivesse uma noção desses micro-organismos na
carne do mexilhão, assim como de sua qualidade higiênico-sanitária, e para entender o
significado dos valores, usou-se doses infecciosas apenas como referência. De acordo com
FDA (2011), para C. perfringes, os sintomas são causados pela ingestão de um número
inferior a 106 esporos por grama de alimento, pois a produção de toxinas no trato digestivo
está associada a esporulação. Nos resultados obtidos durante o período de estudo, apenas
3 coletas tiveram a presença de clostridium, sendo estas nos dias 12/junho e 21/agosto,
onde apresentaram valores iguais a 50 e 200UFC/g, respectivamente, demonstrando
concentrações muito abaixo da qual poderia causar algum tipo de sintoma, porém, a coleta
do dia 27 de agosto, no mexilhão processado, apresenta um valor maior que 636.174
UFC/g. Considerando que o mexilhão Perna perna, apresenta peso médio igual a 12,12
gramas, esta amostra estaria contaminada por no mínimo 7.710.428,88 C. perfringens, um
número superior a dose infecciosa. Já para C. botulinum, a dose infecciosa é de uma
quantidade extremamente pequena, um nanogramas da toxina pode causar a doença (FDA,
2011).
6.5 Salmonella
As análises para a Salmonellas sp. resultaram na ausência de cepas deste
organismo nas amostras durante todo o período amostral. A Resolução - RDC nº 12, de
janeiro de 2001, estabelece que este micro-organismo deve estar ausente em 25 gramas de
moluscos bivalves cozidos, resfriados ou congelados não consumidos crus, estando as
amostras analisadas enquadradas nesta lei. Silva (2000) e Sartori (2008), ao realizarem
trabalhos na região de cultivo da praia de Armação do Itapocoroy, também não constataram
a presença de Salmonella sp em nenhuma das amostras analisadas, estando de acordo
com os resultados encontrados neste estudo. Jacabi et al. (1999 apud FARIAS, 2006) afirma
que este micro-organismo não faz parte da microbiota natural de moluscos e crustáceos,
porém, podem ser incorporados a estes em virtude do contato com água contaminada ou
por manipulação inadequada após a captura.
Apesar de não terem sido encontrados neste estudo, a pesquisa de Salmonella sp é
de extrema importância em moluscos bivalves, pois estão relacionados com gastroenterites
e toxinfecções causadas pelo seu consumo cru ou precariamente cozidos (GALVÃO, 2004).
24
Desta forma, é bastante recomendado cozinhar o alimento até atingir a temperatura
necessária para sua eliminação (65 a 74 ºC), além da conservação do produto final em
temperaturas inferiores a 5 ºC ( JAY, 2005; VIEIRA, 2003).
6.6 Listeria monocytogenes
As análises realizadas durantes os meses de estudo, resultaram na ausência deste
micro-organismo em 100% das amostras (Anexo 1). Antoniolli et al. (1998 apud DESTRO,
2000), estudaram a incidência de L. monocytogenes em mexilhões (Perna perna) crus e
cozidos em diferentes áreas da costa de Santa Catarina, porém também relataram sua
ausência em todas as amostras, corroborando com o presente estudo.
Outros estudos relataram que a incidência deste organismo em peixes tropicais, foi
nula ou muito baixa, podendo ser explicado pelo fato de ocorrerem em águas onde a
temperatura varia entre 20ºC a 32ºC, desta forma, a elevada temperatura ambiente e a
competição microbiana podem inibir ou mascarar a presença de L. monocytogenes em
frutos do mar tropicais (FUCHS; SURENDRAN, 1989; MANOJ et al., 1991; KARUNASAGDR
et al., 1992; ADESIYUN, 1993 apud EMBAREK, 1994).
25
7. CONCLUSÔES
� Os moluscos cultivados na Armação de Itapocoróy, em geral, apresentaram uma boa
qualidade referente a Escherichia coli durante o período de estudo, enquadrando-se
dentro dos limites da legislação utilizada;
� As ocorrências dos indicadores de contaminação fecal encontrados na carne do
mexilhão in natura, apresentaram maiores concentrações nos meses de outono (abril
e maio), do que nos meses de inverno e início de primavera (junho, agosto e
outubro);
� Os níveis de enterococos e Staphylococcus aureus foram significantemente maiores
na carne do mexilhão processado, do que na carne do mexilhão in natura; indicando
possíveis falhas nas etapas de beneficiamento
� As variáveis físico-químicas, temperatura e salinidade, apresentaram forte correlação
com as concentrações de enterococos encontradas no mexilhão in natura, indicando
variação temporal deste organismo.
� Ocorrência de clostrídeos nas amostras analisadas, baixa ou pouco frequente, onde
apenas uma amostra relatou alta concentração, podendo ser um risco a saúde
pública.
� Durante todo período amostral, a presença dos patógenos Salmonella e Listeria
monocytogens não foram observadas, apresentando boa qualidade para estes
parâmetros.
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS A.P.H.A. Compendium of methods for the microbiological exami nation of foods , 3º ed. Washington, DC: American Public Health Association, 1992. 1219 p. BITTON, G. Wastewater Microbiology. New York: Wiley-Liss, 1994. 478 p. BRASIL, Ministério da Pesca e Aquicultura. Programa Nacional de Controle Higiênico Sanitário de Moluscos Bivalves (PNCMB) - IN nº7, 8 de maio de 2012. Brasília. BRASIL, Ministério da Saúde. Agência Nacional da Vigilância Sanitária (ANVISA) Resolução RDC 216, de 15 de setembro de 2004. Define o regulamento técnico de boas práticas para serviços de alimentação. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Legislação : Resolução – RDC n° 12, de 2 de janeiro de 2001. Brasília BUSSANI, Mario. Guia practica del cultivo del mejillon. Zaragoza: ACRIBIA, 1990. 252p DE SOUZA, R.V.; NOVAES, A. L. T.; DOS SANTOS, A. A.; RUPP, G. S.; SILVA, F. M. Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves no Litoral de Santa Catarina. Panorama da Aqüicultura , p. 54-59, 2009. EMBAREK, P. K. B. Presence, detection and growth of Listeria monocytogenes in seafoods: a review.. International Journal of Food Microbiology. Lyngby, Denmark, 1994
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9. ANEXOS Anexo 1: Resultados das análises microbiológicas realizadas neste estudo.
Amostra Data Coliformes totais
Escherichia coli Enterococos Staphylococcus
aureus Clostridium
Mexilhão processado 29/mar 1600 0 8,2x106 2,77x106 0
Mexilhão processado
03/mai 23 23 0 1,5x104 0
Mexilhão processado
12/jun 240 240 1000 0 50
Mexilhão processado
02/ago 540 2 3550 700 0
Mexilhão processado
20/ago 0 0 8825 300 0
Mexilhão processado
27/ago 220 130 1,66x105 8,3x105 >636174
Mexilhão processado
24/set 0 0 0 27250 0
Mexilhão in natura 17/abr 350 23 900 0 0
Mexilhão in natura 17/mai 350 240 750 250 0
Mexilhão in natura 28/jun 2 0 0 0 0
Mexilhão in natura 02/ago 94 23 0 100 0
Mexilhão in natura 21/ago 23 23 0 350 200
Mexilhão in natura 28/ago 94 23 0 3800 0
Mexilhão in natura 01/out 49 49 0 1200 0
Anexo 2: Critérios microbiológicos para moluscos bivalves segundo a legislação pertinente.
Norma Especificações
PNCMB n°7
08/05/2012
Critério para retirada liberada de moluscos bivalves:
NMP para E.coli em 100 gramas da parte comestível
dos moluscos bivalves < 230
Critério para retirada liberada sob condição de moluscos bivalves:
NMP para E.coli em 100 gramas da parte comestível
dos moluscos bivalves entre 230 e 46.000
Critério para retirada suspensa de moluscos bivalves:
NMP para E.coli em 100 gramas da parte comestível
dos moluscos bivalves > 46.000
RDC n°12
02/01/2001
Estabelece que Salmonella sp. deve estar
ausente em 25 gramas de carne de bivalve
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Anexo 3: Classificação das amostras in natura de acordo com as análises de Escherichia coli (NMP) por 100g.
Data Amostra NMP/100g PNCMB 17/abr In natura 2300 Liberada sob condição 17/mai In natura 24000 Liberada sob condição 28/jun In natura 0 Liberada 02/ago In natura 2300 Liberada sob condição 21/ago In natura 2300 Liberada sob condição 28/ago In natura 2300 Liberada sob condição 01/out In natura 4900 Liberada sob condição