Universidade de São PauloCentro de Energia Nuclear na Agricultura

SILÍCIO NA INDUÇÃO DE FATORES DESILÍCIO NA INDUÇÃO DE FATORES DEDEFESA DE DEFESA DE CitrusCitrus jambhirijambhiri

Orientada: Enga. Agra. Elena Pérez Faggiani

Orientadora: Dra. Siu Mui Tsai

Novembro/2002

OBJETIVOS• GERALGERAL::

Contribuir ao conhecimento do potencial do silício na indução dos fatoresde defesa de plantas cítricas à doenças utilizando como modelo opatossistema Limão rugoso (C. Jambhiri Lusk) - Phytophthora nicotianae.

Efeito do silício solúvel no controle de Pythium ultimum em plantas de pepino crescendo em condiçõeshidropônicas. Esquerda: Si (-) P. (+). Direita: Si (+) P (+). Si= 100 ppm.Fonte: Chérif, M. Use of Potassium Silicate Amendments in Recirculating Nutrient Solutions toSupress Pythium ultimum on Long English Cucumber. Plant Disease 76:1008-1011

ANTECEDENTESANTECEDENTES• SILÍCIO

• Características gerais

• Silício no controle das doenças

• Modo de ação do Si

2. RESISTÊNCIA DAS PLANTAS A PATÓGENOS

• Indução de resistência

• Mecanismos envolvidos na indução de resistência a doenças

• Proteínas relacionadas com a patogênese (PR-proteínas)

Características gerais da relação planta - SiCaracterísticas gerais da relação planta - Si

• Segundo elemento mais importante na litosfera

•Conteúdo na solução do solo depende do tipo ecomposição de minerais do solo

•Absorvido pelas plantas como ácido silícico

•Presença de Si nas plantas: conteúdo e seu papel

Epstein (1994, 2001), Birchal (1995), Exley (1998), Gascho (2001)

Efeito benéfico do silícioEfeito benéfico do silício

Estresse abiótico

Estresse biótico

Doenças

Pragas

Condições climáticas:

Ventos fortes, frio e baixa luminosidade

Déficit hídrico

Estresse mineral:P; M n; Al; N .

Em condições de estresse, melhora o rendimento e/ou crescimento das culturas

SILÍCIO NO CONTROLE DE DOENÇASSILÍCIO NO CONTROLE DE DOENÇAS

ESPÉCIE VEGETAL PATÓGENO AUTOR Arroz Vários Japoneses (cit. Datnoff et al

1997) Pepino Oídio Wagner (1940) Arroz Pyricularia oryzae Volk (1958) Arroz P. oryzae e Bipolaris oryzae Datnoff et al (1987, 1988) Arroz B. oryzae Datnoff et al (1994) Arroz Curvularia, Helminthosporium,

Fusarium, Magnaporte grisea Köndorfer et al (1999); Santos et al (2002)

Cana de azúcar Leptosphaeria. sacchari e Puccina melanocephala

Raid et al (1992)

Cebada Erysiphe graminis Jiang et al (1989) Pepino Sphaerotheca fuliginea (oídio) Adatia & Besford (1986) Pepino Sphaerotheca fuliginea (oídio) Miyake & Takahashi (1983) Pepino Sphaerotheca fuliginea (oídio) Menzies et al (1991) Pepino Pythium ultimum Chérif & Bélanger (1992) Pepino/Melao/Abóbara Sphaerotheca fuliginea (oídio) Menzies et al (1992) Videira Uncinola necator (oídio) Bowen et al (1992) Citrus Sanidade geral Matichencov et al (1999)

INTERAÇÕES PLANTA-PATÓGENO

(AMBIENTE)

RESISTÊNCIARESISTÊNCIA

(ocorre na maioria das interações)

SUSCETIBILIDADE - SUSCETIBILIDADE - DoençaDoença

(não frequente)

• Resistência constitutiva

• Órgão específica

• Idade do tecido

• Raça específica

• Resistência induzida

CompatívelIncompatível

RResistênciaesistência dasdas plantas aosplantas aos patógenos patógenos

Entre m. plasmática eparede celular

Em torno ao sítio depenetração,

ESTRUTURAS DE DEFESACELULAR

Acumulação deSilício na parede

celular

MECANISMOS BIOQUÍMICOS ENVOLVIDOS NAMECANISMOS BIOQUÍMICOS ENVOLVIDOS NAINDUÇÃO DE RESISTÊNCIAINDUÇÃO DE RESISTÊNCIA

Klarynski et al. (2001)

• Estímulo intenso de caminhos metabólicos secundários;

• Reforço da parede celular pelo depósito demacromoléculas (proteínas, glicoproteínas, polímerosaromáticos, etc...);

• Produção de peptídeos e de proteínas de defesadenominadas como PR-proteínas (PathogenesisRelated Proteins).

MODO DE AÇÃO DO SILÍCIO NO CONTROLE DE DOENÇASMODO DE AÇÃO DO SILÍCIO NO CONTROLE DE DOENÇAS

PATOSSISTEMA MODO DE AÇÃO AUTOR

Arroz-P. oryzae Formação depapilasBarreirasestruturais

Volk, 1958:Takahashi, 1995

Pepino-oídioVideira-oídio

Formação depapilas

Samuels et al1991a, 1991b, 1994;Bowen et al 1992.

Pepino-damping off -Não barreirasfísicas-Acúmulo decompostosfenólicos?

Chérif &Bélanger, 1992Chérif et al 1992

Pepino-oídio Fitoalexinas Fawe et al 1998

Pepino- damping off quitinases,peroxidases epolifenoloxidases

Chérif et al 1994

Fonte: Bowen, P.; Ehret,D.L.; Menzies, J.G. 1995.Soluble silicon. Its Role inCrop and DiseaseManagement of GreenhouseCrops. Plant Disease79:329-335.

RESISTÊNCIA INDUZIDARESISTÊNCIA INDUZIDA

CARACTERÍSTICASCARACTERÍSTICAS

•Local ou sistêmica

• Longa duração (persistência do efeito protetor)

• Amplo espectro: efetiva contra vírus, bactérias e fungos

•Se estabelece em certo tempo depois da indução

•Dependente da temperatura e luz – fatores abióticos

•Induzida por fatores bióticos, químicos e naturais

Copia de Sylvia GuzzoSeminario CENA-2002

INDUÇÃO DE RESISTÊNCIAINDUÇÃO DE RESISTÊNCIAINDUÇÃO DE RESISTÊNCIA1- TRATAMENTO PRÉVIO

COM INDUTOR

2- INOCULAÇÃO COMPATÓGENO

* Redução: n0 de lesões, tamanho de lesões, extensão daesporulação. Retardamento do aparecimento de sintomas.

INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA(ATIVAÇÃO DOS MECANISMOS DE DEFESA)

3- 0BSERVAÇÃO DOS SINTOMAS

REDUÇÃO DA SEVERIDADE DA DOENÇA*

PR - ProteínasPPRR - Proteínas - Proteínas

• Agrupadas em famíliasM em bros d e u m a m esm a fa m ília estã o rela cion a d ossorológica m en te, tem sim ila rid a d e n a seqü ên cia d en u cleotíd eos e a m in oá cid os e exibem pon to isoelétrico

bá sico ou á cid o.

•Famílias mais pesquisadasPR -1, PR -2 (ß-1,3 glu ca n a se), PR -3 (qu itin a se) e PR -5(O sm otin a )

• Quitinase e ß-1,3 glucanase En zim a s lítica s qu e hid roliza m a qu itin a (polím erod e N -a cetilglicosa m in a ) e ß-1,3 glu ca n a srespetiva m en te. N a s pla n ta s cu m plem vá ria s fu n çoesfisiológica s, a lém d o pa pel n a d efesa a pa tógen os.

Experimento 2: DETERMINAÇÃO DO EFEITO DO SILÍCIO NA EXPRESSÃODAS ENZIMAS QUITINASE E ß-1,3 GLUCANASE EM PLANTAS DE LIMÃO

RUGOSO UTILIZANDO P. nicotianae COMO AGENTE INDUTOR

LAVAGEM eDESINFECÇÃO

de RAÍZES

EM ÁGUA - 5 DIAS

Continuação MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostragem:• de 2 plantas por U.E: ~0,1 g de raízes e 6folhas do meio do caule•pesagem, gelo e ultrafreezer

Determinação:•Macerado das amostras (frio)•extração das enzimas (tampão)•colorimetria 300 µL tampão

300 µL amostra 200 µL substrato 38 ou 40 ºC por 2 horas

- bloqueio da reação com 200 µL HCl 2N- centrifugação e leitura absorvância

Cont. Experimento 2: DETERMINAÇÃO DO EFEITO DO SILÍCIO EXPRESSÃO...

Continuação MATERIAIS E MÉTODOS

EFEITO DO SILÍCIO NA RESISTÊNCIA DE PLANTAS DE LIMÃORUGOSO A P. nicotianae

EXPERIMENTO 1 EXPERIMENTO 2 EXPERIMENTOS 3 e 4

Método: Jeffers et al. (1981) Método: Afek e Sztejnberg (1990)

Efeito do silício na resistência de plantas de limão rugosoa P. nicotianae

Tabela 8 Tamanho medio das lesôes em caules de plantas de limâo rugoso inoculadas

com discos de micélio de P. nicotianae, que cresceram em meio nutritivo líquido

incrementado com 0 ou 100 ppm de SiO2.a,b

Si-H+ Si+H+

0.57±0.10 0.29±0.10*

a) expressa em centímetros

b) media ± ds de 10 plantas por cada tratamento

c) CV 74 %

d) * Diferenças entre Si- e Si+ são significativas com P= 0.10 (ANAVA)

R E S U L T A D O S

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

med

ia

02468

1012141618

plantaapós 4 dias da inoculação"

após 7 dias da inoculação

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

med

ia

02468

1012141618

incr

emen

to l

esão

(mm

)

planta

Após 4 dias da inoculaçãoapós 7 dias da inoculação

Incremento no tamanho de lesões emcaules de plantas de limão rugosoirrigadas com solução nutritiva sem silícioe inoculadas com P.n. pv. parasitica

Incremento no tamanho de lesões em caulesde plantas de limão rugoso irrigadas comsolução nutritiva com silício e inoculadas comP.n. pv. parasitica.

Incremento no tamanho das lesões em cada planta inoculadaIncremento no tamanho das lesões em cada planta inoculada

3. Efeito do Silício na resistência de plantas de limão rugoso a P. nicotianae

Experimento 2. Teste Experimento 2. Teste em caulesem caules

SEM SILÍCIO

COM SILÍCIO

22

3950

50

020406080

100

folha

s co

m

sint

omas

(%)

48 72horas

com silício sem silício

Porcentagem de folhas de limão rugoso infectado com P.n. pv.parasitica, após de 48 e 72 hs da inoculação.

Experimento 4. Avaliação da resistência em folhas

Experimento 3. Teste Experimento 3. Teste em folhasem folhas

Com Silício

Sem Silício

2. Efeito do Silício na expressão das enzimas quitinases e ß-1,3 glucanases em plantas de limão rugoso infectadas com P. nicotianae

2.1 Análise de quitinases em raízes

Tabela 3. Atividade da enzimas quitinases em raízes de plantas de limão rugoso que cresceram em

meio nutritivo líquido incrementado com 0 ou 100 ppm de SiO2. (Atividade expressa pela absorvância em 550 nm (Abs550nm) por 0.1 g de tecido fresco)

Tempo (em dias)

Si-H+a,b,c Si+H+a,b,c Si+H-a,b,c

0 0.72 ± 0.08 a A B 0.62 ± 0.04 a b B 1.01 ± 0.08 a A

2 0.52 ± 0.05 b ns 0.47 ± 0.09 b ns 0.49 ± 0.05 b ns

7 0.80 ± 0.08 a ns 0.67 ± 0.08 a ns 0.66 ± 0.06 b ns

a) Dados seguidos da mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente (Teste de Duncan, ao nível de 0.1% de probabilidade).

b) Dados seguidos da mesma letra maiúscula na fila não diferem significativamente (Teste de Duncan 0.01% de probabilidade), ns= não

significativo.

c) Si- media ±SD de três plantas que cresceram en meio nutritivo liquido com 0 ppm de SiO2; Si+ media ± SD de três plantas crescendo em meio nutritivo liquido com 100 ppm SiO2 ; H+ tratamento inoculado com patógeno; H- Controle inoculado com água destilada estéril.

2.2 Análise de ß-1,3 glucanases em raízes

Tabela 4. Atividade das enzimas β-1,3-glucanases em raízes de plantas de limão

rugoso que cresceram em meio nutritivo liquido incrementado com 0 ou 100 ppm de

SiO2 . (Atividade expressa pela absorvância em 600nm (Abs600nm) por 0.01 g de tecido fresco)

Tempo (em dias)

Si-H+ Si+H+ Si+H-

0 0.08 ± 0.01 a B 0.11 ± 0.01 a B 0.16 ± 0.04 a A

2 0.08 ± 0.03 a ns 0.07 ± 0.01 b ns 0.10 ± 0.06 a b ns

7 0.14 ± 0.08 a ns 0.04 ± 0.02 c ns 0.06 ± 0.02 b ns

a) Dados seguidos da mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente (Teste de Duncan, ao nível de 0.1% de

probabilidade), n.s.= não significativo

b) Dados seguidos da mesma letra na fila não diferem significativamente (Teste de Duncan 0.01% de probabilidade),

ns= não significativo.

c) Si- media ±SD de três plantas que cresceram en meio nutritivo liquido com 0 ppm de SiO2; Si+ media ± SD de três plantas que

cresceram em meio nutritivo liquido com 100 ppm SiO2 ; H+ tratamento inoculado com patógeno; H- Controle inoculado com água

destilada estéril.

2.3 Análise de quitinases em folhas

Tabela 5. Atividade das enzima quitinase em folhas de plantas de limão rugoso que

cresceram em meio nutritivo líquido incrementado com 0 ou 100 ppm de SiO2. (Atividade expressa pela absorvância em 550 nm (Abs550nm) por 0.1 g de tecido fresco)

Tempo (em dias)

Si-H+ Si+H+ Si+H-

0 0.70 ± 0.08 a ns 0.79 ± 0.03 a ns 0.57 ± 0.09 a b ns

2 0.28 ± 0.04 b ns 0.27 ± 0.03 c ns 0.27 ± 0.03 b ns

7 0.54 ± 0.10 a b ns 0.46 ± 0.06 b ns 0.64 ± 0.09 a ns a) Dados seguidos da mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente (Teste de Duncan, ao nível de 0.1% de

probabilidade), n.s.= não significativo

b) Dados seguidos da mesma letra na fila não diferem significativamente (Teste de Duncan 0.01% de probabilidade),

ns= não significativo.

c) Si- media ±SD de três plantas crescendo en meio nutritivo liquido com 0 ppm de SiO2; Si+ media ± SD de três plantas crescendo em meio nutritivo liquido com 100 ppm SiO2 ; H+ tratamento inoculado com patógeno; H- Controle inoculado com água destilada estéril

2.4 análise de ß-1,3 glucanases em folhasTabela 6. Atividade das enzimas β-1,3-glucanases em folhas de plantas de limão rugoso que cresceram em meio nutritivo incrementado com 0 ou 100 ppm de SiO2 . (Atividade expressa pela absorvância em 600nm (Abs600nm) por 0.01 g de tecido fresco) Tempo (em dias)

Si-H+ Si+H+ Si+H-

0 0.19 ± 0.03 a ns 0.23 ± 0.03 a ns 0.20 ± 0.02 a ns 2 0.18 ± 0.03 a B 0.17 ± 0.02 b B 0.24 ± 0.03 a A 7 0.15 ± 0.01 a ns 0.15 ± 0.03 b ns 0.19 ± 0.04 a ns a) Dados seguidos da mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente (Teste de Duncan, ao nível de 0.1% de

probabilidade), n.s.= não significativo

b) Dados seguidos da mesma letra na fila não diferem significativamente (Teste de Duncan 0.01% de probabilidade),

ns= não significativo.

c) Si- media ±SD de três plantas crescendo en meio nutritivo liquido com 0 ppm de SiO2; Si+ media ± SD de três plantas que

cresceram em meio nutritivo liquido com 100 ppm SiO2 ; H+ tratamento inoculado com patógeno; H- Controle inoculado com água

destilada estéril.

Variação no peso da matéria fresca, altura da parte aérea e número

de folhas de plantas de limão rugoso, após de 60 dias de irrigadas

com 0 ou 100 ppm de Si02. d,e.

Peso da materia

fresca a,c

Altura parte aérea b,c Número de

folhasc

Si- Si+ Si- Si+ Si- Si+

2.930±980 4.200±1420** 379±139 494±147* 6,75±4,12 6,44±3,33

a) expressa em miligramas; b) expresso em milímetros; c) média ± SD de 16

plantas por tratamento.

d) **, * Diferenças entre Si- e Si+ são significativas com P= 0.01 e 0.05

respetivamente (ANAVA) para cada parámetro avaliado;

e+ fonte de silício = escorias de silicato de cálcio..

EFEITO DO SILÍCIO NO DESENVOLVIMENTO DEEFEITO DO SILÍCIO NO DESENVOLVIMENTO DEPLANTAS DE LIMÃO RUGOSOPLANTAS DE LIMÃO RUGOSO

EFEITO DO SILÍCIO NO DESENVOLVIMENTO DEEFEITO DO SILÍCIO NO DESENVOLVIMENTO DEPLANTAS DE LIMÃO RUGOSOPLANTAS DE LIMÃO RUGOSO

Variação na materia seca de plantas de limão rugoso, após de 60

dias de irrigadas com 0 ou 100 ppm de Si02.a,b.

Planta total parte aérea raízes

Si- Si+ Si- Si+ Si- Si+

102,68 124,12 68,62 83,5 34,06 40,62

a) expressa em miligramas; b) média de 16 plantas por tratamento.

H2SiO4 Depositado em capas superficiais Diminuitranspiraçãocuticular

Evita estresse pordéficit de água

Evitafechamento

dos estômatos

Mantêmfolhas eretas

Melhorapenetração de luzna comunidade

Promove fotossínteses

Promoveassimilaçãode amônio

Aumentaquantidadecarboidratos

Aumenta materialFormador parede

celular

Aumentatolerânciaaltas doses N

Melhoraresistênciadoenças

Aumentaatividaderadicular

Melhoraresistênciamecânica decaules

Promoveabs. água enutrientes

Melhoraenergia deoxidaçãoradicular

Melhoraresistência avuelco

Desintoxicação desubstancias redutoras (Fe, Mn, Zn)

Adaptado de Takahashi, e. 1995. Uptake mode and physiological functions of silica In: Science of the rice plant. Tokio, 1995 cap. 5 p. 420-433

solú

vel

CONCLUSÕES

Em função dos antecedentes, e dados obtidos nesta pesquisapossivelmente o silício tenha um papel no desenvolvimento e

sanidade das plantas cítricas.

Estudos posteriores deverão ser realizados para:

• Confirmar o efeito benéfico do silício nos citrus,

• Estudar o modo de ação envolvido no controle de doenças

• Conhecer os fatores de estresse que permitem a expressãodo efeito do silício no crescimento das plantas

Com Silício