controle microbiano de pulgÕes empregando … · vários fatores bióticos e abióticos...
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CENTRO DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL – CEP
CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES
CURSO TÉCNICO EM QUÍMICA
CONTROLE MICROBIANO DE PULGÕES EMPREGANDO FUNGOS
FILAMENTOSOS Isaria fumosoroseus (Paecilomyces
fumosoroseus) e Metarhizium anisopliae EM PLANTAS DE
CULTIVO DE MORANGO
Carlos Eduardo Mosena da Cruz
Lajeado, novembro de 2016
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Carlos Eduardo Mosena da Cruz
CONTROLE MICROBIANO DE PULGÕES EMPREGANDO FUNGOS
FILAMENTOSOS Isaria fumosoroseus (Paecilomyces
Fumosoroseus) e Metarhiziun anisopliae EM CULTIVO DE
MORANGO
Artigo apresentado na disciplina de
Estágio Supervisionado do Curso
Técnico em Química do Centro de
Educação Profissional, como exigência
para a obtenção do título de Técnico
em Química.
Orientador: Professor Mariano Rodrigues
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Lajeado, novembro de 2016
CONTROLE MICROBIANO DE PULGÕES EMPREGANDO FUNGOS
FILAMENTOSOS Isaria Fumosoroseus (Paecilomyces
fumosoroseus) e Metarhizium anisopliae EM CULTIVO DE
MORANGO
Carlos Eduardo Mosena da Cruz1
Cláudia Andreia Gräff2
Mariano Rodrigues3
Resumo: O cultivo orgânico de morango vem sendo bastante utilizado e estudado nas maiores
regiões produtoras dessa fruta. O fungo entomopatogênico Isaria fumosoroseus (Paecilomyces
fumosoroseus) é uma opção à ser utilizado para o controle microbiano de pulgões, onde esses
fungos filamentosos produzem exoenzimas que possuem ação direta na morte desses pulgões
quando ocorre o crescimento da parte vegetativa (micélio) do fungo no exoesqueleto desses insetos.
O objetivo desse trabalho foi avaliar qualitativamente atividade enzimática produzida pelo fungo Isaria
fumosoroseus (Paecilomyces fumosoroseus), em diferentes substratos em meio sólido. Avaliou-se a
produção de esporos em câmara Neubauer, preparou-se uma suspensão na concentração de 1x107
esporos/mL e inoculou-se 150uL de suspensão de esporos em placas de petri contendo meios
enriquecidos com 1% de amido, 10% de leite desnatado, 2% de óleo de oliva, aplicou-se 150mL de
uma suspensão de 1x105 esporos/mL do fungo Isaria fumosoroseus (Paecilomyces fumosoroseus)
utilizando fungo Metarhizium anisopliae como um controle, obtendo resultados diferentes da
significância de P ≤ 0,05% pelo teste de Tukey para a utilização do fungo Isaria fumosoroseus
(Paecilomyces fumosoroseus) como controle microbiano de pulgões. Realizando-se o controle de
pulgões em plantações de morangos, os resultados apresentaram diferença de variância de P ≥ 0,05,
significantes nas amostras controle antes e após a aplicação, onde para o controle do fungo
Metarhizium anisopliae, que também apresentou resultados variantes nas folhas medianas, e para o
fungo Isaria fumosoroseus, nas folhas apicais, indicando que nesses houve mortalidade de pulgões.
Palavras-chave: Exoesqueleto. Insetos. Enzimas.
1Aluno do Curso Técnico em Química no Centro Universitário Univates, Lajeado/RS. E-mail: [email protected] 2Mestre em biotecnologia pelo Centro Universitário Univates, Lajeado/RS. E-mail: [email protected] 3Professor e coordenador do Curso Técnico em Química do Centro Universitário Univates, Lajeado/RS. E-mail: [email protected]
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1 INTRODUÇÃO
No Brasil as maiores concentrações de produção de morangos estão
localizadas nas regiões do estado do Rio Grande do Sul (RS), São Paulo (SP), e
Minas Gerais (MG). Também são produzidos em regiões onde se encontram
diferentes tipos de solo e clima nos estados de Santa Catarina (SC), Paraná (PR),
Espírito Santo (ES), Goiás (GO) e Distrito Federal (DF), havendo uma produtividade
média por estado, em t/ha (tonelada por hectare), de 32,7 no RS; 21,3 no PR; 25,2
em MG; 34 no ES e SP. Na última década, verificou-se um interesse crescente pela
implantação da cultura, justificado pela grande rentabilidade (224%), quando
comparada a outros cultivos, como por exemplo o milho (72%). Assim a soma da
produção por hectares dos cinco estados resulta em 147,2 t/há, correspondendo a
22,2% no RS, 14,5% no PR, 17,1% em MG, 23,1% no ES e 23,1% em SP.
Conforme o gráfico 1 (ANTUNES; REISSER, 2007).
Gráfico 1 - Percentual dos Estados de maior produção por área (t/ha).
Fonte: Do autor, baseado em dados de Antunes e Reisser (2007).
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Os sistemas de produção convencionais com a utilização de produtos
químicos para o tratamento de doenças e eliminação de pragas, geralmente não
obedecem às regras técnicas pré-estabelecidas. Contudo quando o produtor utiliza-
se de um sistema de produção integrado. Em uma produção orgânica são utilizados
sistemas agrícolas equilibrados e mais estáveis, podendo ser produtivos em grande,
média e baixa escala, trazendo como resultado alimentos saudáveis, com um
elevado valor nutritivo e livres de resíduos tóxicos, utilizando meios naturais ocorre
menos agressão ao meio ambiente, barateando o sistema de produção e
proporcionando que o mundo seja mais saudável através de agrotóxicos (SANTI;
COUTO, 2014).
Tendo em vista a produção de alimentos isentos de resíduos químicos
(pesticidas), a agricultura vem buscando novos modelos de produção que não
afetem a saúde do homem e ao meio ambiente (FADINI et al., 2004).
O objetivo desse trabalho foi observar a produção de enzimática do fungo
Isaria fumosoroseus (Paecilomyces fumosoroseus) aplicando uma suspensão de
esporos/mL do fungo em cultivo de morango com infestação de pulgões e avaliar a
eficiência do fungo para controle microbiano de pulgões em cultivo de morango,
utilizando como parâmetro de controle o fungo Metarhiziun anisopliae.
1.1 Morango
O morango, é uma fruta rica em frutose e sacarose e com baixos níveis de
carboidratos, quando consumida balanceadamente nas refeições, ativa uma reação
química no nosso organismo, que triplica os índices de absorção de ferro presentes
em vegetais, ovos e carnes, contendo propriedades funcionais laxativas e diuréticas.
Supre a carência de minerais e vitaminas do complexo B e neutraliza a ação dos
radicais livres devido a presença de quercitina (flavonoide natural), retardando o
envelhecimento celular. Sendo assim, além de ser uma fruta saudável e gostosa
(saborosa), estimula o melhor funcionamento do nosso organismo e nos deixa com
uma aparência mais rejuvenescida (BRANDÃO, 2010).
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O cultivo continuo de moranguinhos em uma mesma área pode trazer a
incidência de doenças para a planta, sendo um dos principais e mais preocupantes
problemas para essa cultura. O cultivo de morangos em estufa tem se tornando
cada vez mais frequente por apresentar vários meios de proteção para a planta
como por exemplo, as adversidades climatológicas (geadas, chuva, vento, radiação
solar e umidade), tendo pontos positivos quanto a utilização de fertilizantes e
pesticidas para um controle de pragas (RADIN et al., 2008).
Em um sistema de produção orgânica é totalmente dispensável a utilização
de insumos como fertilizantes, pesticidas, reguladores de crescimento e aditivos.
Neste tipo de produção, se tem uma grande preocupação com a qualidade de vida
do produtor e dos consumidores, com a degradação do meio ambiente, e a perda da
resistência das plantas ao ataque de pragas naturais (BRANDÃO, 2010).
O grande número de pragas que afetam a produção de morangos, levam os
produtores a realizarem uma prática inadequada de controle dessas pragas, com o
uso excessivo de agrotóxicos, sem pensar no impacto que isso pode acarretar ao
ecossistema (LIMA et al., 2012). Atualmente a agricultura orgânica vem tendo uma
importância fundamental, tendo uma produção baseada em princípios ecológicos,
que abrange desde o manejo do solo, nutrição vegetal até a comercialização e
processamento desses alimentos (BRANDÃO, 2010).
Um sistema de controle biológico utilizando fungos entomopatogênicos vem
sendo bastante utilizado, mas para que esse controle seja eficiente é preciso que se
utilize linhagens apropriadas. Para que se obtenha resultados satisfatórios, é
necessário a realização de bioensaios, avaliando a mortalidade entre eles, e assim
selecionando os melhores isolados para utilização nos experimentos (FERNANDES,
2010).
1.2 História dos fungos entomopatogênicos
Os fungos foram descobertos como agentes patógenos de insetos a cerca de
200 anos atrás, por volta de 1834, a sua importância foi descoberta por Agostino
Bassi, considerado o pai da patologia (ALVES, 1992).
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Estima-se que sejam conhecidas mais de 1 milhão de espécies de insetos,
cerca de 10% desses insetos são considerados pragas da agricultura e pragas
urbanas, sendo assim se cada espécie de inseto for atacada por no mínimo um
agente microbiano patogênico, o controle microbiano pode ter uma grande
importância para o combate à essas pragas e na cura de doenças dos insetos
(GALLO et al., 1988). Para que o controle biológico utilizando fungos
entomopatogênicos seja eficiente, é preciso que se utilize linhagens apropriadas de
fungos que obtenham bons resultados, partindo-se de bioensaios, pois é de grande
importância avaliar a mortalidade entre eles, e assim conseguir selecionar os
melhores isolados (FERNANDES, 2010).
Os fungos mais utilizados no mundo para o controle de pragas agrícolas são:
M. anisopliae, B. bassiana, L. muscarium, L. longisporum, I. fumosorosea, todos
pertencentes ao grupo dos hypocreales. Esses fungos entomopatogênicos
encontram-se comercializados na forma de conídios em substratos sólidos (arroz)
(ROJAS, 2015).
Os fungos foram os primeiros agentes patógenos a serem utilizados no
controle microbiano de pragas e insetos da agricultura. Devido à grande
variabilidade genética entomopatógenica eles puderam ser considerados uma das
principais vantagens no biocontrole (ALVEZ, 1998).
Os fungos entomopatogênicos são os micro-organismos mais estudados e
que tem grande potencial para o controle de pragas e insetos no Brasil. Cerca de
80% das doenças em insetos têm como agentes etiológicos os fungos, pertencentes
à cerca de 90 gêneros e mais de 700 espécies, sendo que a maioria dos gêneros já
foi relatada no Brasil (ALVES, 1998). A formulação e armazenamento, a utilização
destes entomopatógenos é uma alternativa quem vem tendo destaque cada vez
mais para o controle dessas pragas. Dentre os fungos estudados, vários são
patogênicos a inúmeras espécies de pulgões (CAVALCANTI et al., 2009).
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1.2.1 Paecilomyces fumosoroseus
O fungo Paecilomyces fumosoroseus é umas das espécies de fungos mais
promissoras que vem sendo estudada para uso no controle de pragas, por
reduzirem elevados rendimentos de propágulos patogênicos. Esse fungo cresce
rapidamente formando um micélio de coloração branca, podendo mudar para cor
rosa ou purpura. Vários fatores bióticos e abióticos influenciam o crescimento, a
estabilidade e a patogenicidade desse fungo, entre esses fatores, os que se
destacam são a temperatura, umidade relativa e a luminosidade (ROJAS, 2015).
O Paecilomyces fumoroseus pode ser facilmente produzido pela fermentação
líquida. Alguns isolados desse gênero P. fumosoroseus são mais eficientes a um
inseto específico, como no controle da mosca - branca (Bemisia tabaci), entretanto
outros isolados são capazes de infectar uma grande parte de insetos e ácaros
(ROJAS, 2015).
A principais razões para a utilização do controle biológico para essas pragas é
a constatação da alta resistência ao ataque de produtos químicos (pesticidas) em
várias espécies de pragas, e a exigência que os próprios consumidores estão tendo
a cada dia para a redução desses produtos químicos, e consequentemente a
redução de resíduos gerados a partir de utilização destes produtos químicos
(CAVALCANTI et al., 2009).
1.2.2 Metarhizium anisopliae
A avaliação do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como agente
patogênico de insetos foi estudada no século XIX pelo russo Metschnikoff, quando
avaliou a eficácia de micoinsetidas a base de fungos filamentosos no controle de
pragas. A utilização do fungo Metarhizium anisopliae é bastante empregada na
região nordeste no controle de cigarrinha-da-folha em cana-de-açúcar (FARIA;
MAGALHÃES, 2001). Uma das vantagens desse fungo é a facilidade de produção e
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aplicação, baixo custo e redução do impacto ambiental (ORLANDELLI; PAMPHILE,
2011).
Em estudo realizado por Almeida et al. (2003), constatou-se que a utilização
do fungo Metarhiziun anisopliae não teve um resultado significativo. Sendo
necessário a aplicação do fungo nos meses de outubro e novembro, pois são meses
onde as incidências de insetos são mais frequentes nessas épocas do ano
(ALMEIDA et al., 2003).
A utilização do fungo Metarhiziun anisopliae, é considerado um dos maiores e
mais eficazes programas de biocontrole sobre a incidência de cigarrinha-da-raiz da
cana-de-açúcar (MASCARIN; PAULI, 2010).
1.3 Estruturas dos Fungos
Segundo Tortora et al. (2012) os fungos são seres eucariotos pertencentes ao
Reino Fungi, químico-heterotrófico. Todos são multicelulares, com exceção das
leveduras. Possuem organização unicelular, filamentosa e carnuda, nutrem-se por
absorção, possuem esporos sexuais e assexuais, não formam embriões e possuem
metabolismo limitado a heterotrófico, aeróbico, anaeróbico e facultativo.
Os fungos podem se apresentar como leveduras, não apresentando
pigmentos fotossintetizantes, podendo ser unicelulares ou como bolores,
apresentando filamentos (MADIGAN et al., 2010). Através da micologia (estudo dos
fungos), pode-se saber que eles trazem malefícios e benefícios para a vida do ser
humano, ocasionando graves infecções e auxiliando na produção de enzimas,
degradando matéria orgânica e através de micorrizas auxiliar as raízes das plantas a
absorverem minerais e água do solo (TORTORA et al., 2012).
São organismos aclorofilados e heterotróficos e a maioria com estrutura
filamentosa. Espalham-se por meio de esporos e armazenam glicogênio como fonte
de reserva, distribuindo-se em partes da natureza como no ar, água e no solo e tem
um alto desenvolvimento em vários tipos de substratos (FERNANDES, 2009). A
estrutura morfológica dos fungos está representada na Figura1.
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Dentre as estruturas de um fungo na planta hospedeira, o micélio é a
estrutura que apresenta a maior extensão e a maior biomassa em comparação com
os esporos (MELLONI; CARDOSO, 1999).
O crescimento fúngico é evidenciado macroscopicamente pela formação de
uma unidade estrutural denominada colônia. As colônias geralmente apresentam
morfologias típicas, quando estes são semeados em meios com a mesma
composição química e submetidos às mesmas condições de incubação. Através dos
Figura 1 - Estrutura morfológica dos fungos
Fonte: http://www.cientic.com/tema_fungo_img2.html
11
seus aspectos macroestruturais de uma colônia, é possível sugerir a espécie fúngica
presente na cultura (MACORIS et al., 2012).
Segundo Tortora et al. (2012), a estrutura vegetativa dos fungos é composta
de células envolvidas no catabolismo e no crescimento. Nos fungos filamentosos e
carnosos, o talo ou o corpo consiste em filamentos (hifas) longos de células
conectadas, as hifas, que por sua vez, podem crescer em imensas proporções, e na
maioria dos fungos filamentosos elas contem paredes cruzadas denominados septos
que fazem a divisão das hifas em unidades celulares uninucleadas que ganham o
nome de hifas septadas e quando essas hifas não apresentam septos mas
apresentam células longas e contínuas multinucleadas são chamadas hifas
cenocíticas, conforme demonstra a Figura 2.
1.4 Enzimas
A grande variedade das reações bioquímicas que fazem parte da vida são
mediadas por uma série de catalisadores biológicos conhecidos como enzimas
(VOET; D, VOET; J, 2013). Por serem catalisadoras biológicas extraordinariamente
eficientes e seletivos, cada uma das células vivas possui centenas de enzimas
Figura 2 - Apresentação da estrutura das hifas fungicas.
Fonte: TORTORA et al, 2012. Fig 12.1. pág. 331.
12
diferentes que realizam diversas reações essenciais à vida (MORAN et al., 2013).
Servindo como evidentes dispositivos moleculares, determinam os padrões de
transformação química, além de mediar a transformação de uma forma de energia
em outra (BERG et al., 2014).
Se as células vivas não possuíssem as enzimas, as diversas reações
metabólicas não ocorreriam em compatibilidade com a exigência fisiológica dos
organismos, pois uma das principais funções das enzimas é acelerar o metabolismo
para tornar a vida possível (MORAN et al., 2013).
Segundo Berg et al. (2014), a maioria das enzimas conhecidas são proteínas;
porém as proteínas não possuem o monopólio absoluto da catálise. As proteínas
pertencem a classe das macromoléculas e possuem atividade catalisadora
altamente efetivas para diversas reações químicas por possuírem a capacidade de
ligação específica com diversas moléculas. As enzimas realizam a aproximação dos
substratos e os orienta, sendo necessária para a formação e quebra das ligações
químicas, catalisando e estabilizando os estados de transição, podendo também
estabilizar seletivamente um estado de transição e determinar qual reação química
vai ocorrer (BERG et al., 2014).
As enzimas são altamente específicas se comparadas com os agentes
químicos por possuírem um grau de especificidade elevado para os substratos e
para os produtos, raramente formando produtos secundários (VOET; VOET, 2013).
O sitio ativo da reação enzimática é o local em que ocorre a catálise dos produtos
(BERG et al., 2014). As enzimas podem ser também estereoespecíficas, mas talvez
o papel fundamental das enzimas é o reacional, que produz substratos limpos livres
de impurezas ou substâncias tóxicas (MORAN et al., 2013).
A estrutura tridimensional enzimática determina a estrutura e a forma do seu
sítio ativo, que podem ser afetados por qualquer agente que tenha a capacidade de
provocar mudanças na conformação das proteínas, por isso que a ação enzimática
sofre influência de meios externos como o pH e a temperatura nos quais elas se
encontram (MARZZOCO; TORRES, 2015).
A grande parte das enzimas possuem um valor de pH ideal para que sua
atividade alcance o máximo de aproveitamento, sendo que a velocidade de reação
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diminui à medida que o pH se afaste desse valor ideal. Cada enzima possui um valor
especifico, mas o mais encontrado é o pH neutro. Dependendo do número e do tipo
dos grupos ionizáveis de cada enzima é que o pH ótimo decorre, sendo também
dependentes da sua estrutura primaria. As variações do pH também podem afetar a
carga das enzimas, que também contribuem para a eficiência da atividade
catalizadora das enzimas (MARZZOCO; TORRES, 2015).
A grande parte dos seres vivos sobrevive entre 0oC e 50°C, há exceções a
esses valores, como bactérias que sobrevivem a temperaturas que beiram os 100°C.
Com as enzimas funciona da mesma maneira, acima da temperatura ideal, as
mesmas desnaturam perdendo seu poder de catálise. Próximo de 0oC, a ação das
enzimas é baixa e aumenta conforme a temperatura, mas isso ocorre somente se a
enzima conservar sua estrutura nativa (MARZZOCO; TORRES, 2015).
As enzimas são classificadas de acordo com sua classe, subclasse, grupos
químicos específicos que participam da reação e a enzima propriamente dita, cada
enzima descrita recebe um número de classificação, conhecido por “E.C.” (Enzyme
Commission of the IUBMB). O comitê da União Internacional de Bioquímica e
Biologia Molecular mantem esse esquema de classificação, que divide as enzimas
em seis classes demonstradas a seguir (MORAN et al., 2013):
I. Oxiredutases
● Catalisam reações de oxidação-redução;
● Também chamadas de desidrogenases;
● Exemplos de enzimas: oxidases, peroxidases, oxigenases;
● Catalisa a conversão reversível de l-lactato em piruvato.
II. Transferases
● Catalisam reações de transferência de grupos;
● A maioria necessita de coenzimas;
● Inclui as quinases que catalisam a transferência de um grupo fosforil do ATP.
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III. Hidrolases
● Catalisam reações de hidrólise;
● Classe especial de transferases que possui a agua como aceptor do grupo
transferido;
● Exemplos: amilase, quitinase, protease, lipase.
IV. Liases
● Catalisam a lise de um substrato;
● Geram uma ligação dupla em reações que não sejam hidrolíticas nem
oxidativas;
● Inversamente, catalisa a adição de um substrato a uma ligação dupla de
outro.
V. Isomerases
● Catalisam alterações estruturais em uma molécula;
● Possui apenas um substrato e um produto (reação simples).
VI. Ligases
● Catalisam a união de dois substratos;
● Necessitam de energia potencial química;
● Também chamadas de sintetases.
As enzimas são importantes produtos obtidos para a necessidade humana
por meio de fontes microbianas. Esses micro-organismos são atualmente
considerados uma das primeiras fontes na indústria para a produção de enzimas.
Cerca de 50% são originárias de fungos e leveduras, 35% de bactérias e 15% de
plantas e/ou animais (FERNANDES, 2009).
Em confronto o fungo excreta uma certa quantidade de enzimas como as
proteases, quitinases, lipases, amilases e outras enzimas hidrolíticas, que degradam
a cutícula e por sua vez fornecem nutrientes para o fungo. Com o esgotamento
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desses nutrientes o fungo começa a invadir, com crescimento de micelas, todos os
órgãos do organismo hospedeiro, então as hifas atravessam a cutícula do inseto de
dentro para fora e surgem na superfície, iniciando a formação de esporos quando a
umidade relativa é ideal (ROJAS, 2015).
Os fungos entomopatogênicos apresentam uma ótima capacidade para
“driblar” o sistema de defesa do hospedeiro, que quando penetrado no organismo
produz enzimas extracelulares como proteases, quitinases, lipase e amilase,
podendo ser consideradas umas das principais enzimas envolvidas na causa de
uma infecção (FERNANDES, 2010).
1.4.1 Proteases
As proteases são enzimas hidrolíticas que realizam as ligações peptídicas nas
proteínas podendo também ser classificadas como enzimas degradativas que
catalisam a hidrolise total das proteínas (FERNANDES, 2009). As proteases estão
amplamente distribuídas na natureza e estão associadas a importantes processos
biológicos como: a digestão proteica, a coagulação sanguínea e morte celular
(NASCIMENTO et al., 2015).
Essas enzimas possuem várias aplicações, sendo a principal em indústrias de
detergentes, alimentos, curtumes e na indústria farmacêutica para manipulação de
alimentos. Para indústrias de panificações são usadas proteases microbianas pelo
alto poder que essa enzima tem de aumentar a hidrólise parcial e a elasticidade do
glúten (FERNANDES, 2009).
As proteínas são componentes que fazem parte da estrutura da cutícula de
mais de 60% dos insetos e para atravessar essa cutícula é preciso que os fungos
entomopatogênicos liberem proteases durante as primeiras penetrações nas
cutículas desses insetos (ROJAS, 2015).
Essas enzimas têm uma importante relação entre fungo-hospedeiro, além de
estarem envolvidas diretamente no processo de formação dos conídios. As
16
proteases oferecem uma função nutricional, onde são obtidas moléculas a partir da
quebra das cadeias polipeptídicas quando absorvidas pelo fungo (OLIVEIRA, 2013).
As proteases de origem microbiana, compreendem cerca de 40% de enzimas que
são comercializadas mundialmente. Essas enzimas fungicas têm sido muito
utilizadas devido à possibilidade de obtenção de enzimas em alta concentração no
meio de fermentação e uma boa vantagem distinta de enzimas bacterianas (SOUZA,
2015).
Ensaios qualitativos realizados por SOUZA (2015), para a seleção de fungos
filamentosos entomopatogênicos, mostrou que é provável a produção de proteases
apresentar resultado diferente para diferentes tipos de fungos, ou seja, a produção
de enzimas é especifica para um isolado e não para uma determinada espécie
(SOUZA, 2015).
Na relação entre fungo-hospedeiro, as proteases têm um papel fundamental
na formação e germinação de conídios, elas também possuem uma função
nutricional, onde é obtida pela quebra das cadeias polipeptídicas que são absorvidas
pelo fungo (ALVEZ, 1998).
1.4.2 Lipases
As lipases são enzimas que catalisam as hidrolises e a síntese de ésteres
formados a partir do glicerol e de ácidos graxos de cadeia longa, catalisam
numerosas reações diferentes, sendo amplamente utilizado em aplicações
industriais como na fabricação de alimentos e de lacticínios, couro e detergente
indústria, produção de cosméticos e produtos farmacêuticos e reações de síntese de
compostos orgânicos especialmente reações em meios não aquosos (SILVA et al.,
2004).
Os fungos são uma das mais importantes fontes de lipase para aplicação
industrial porque as enzimas fúngicas são normalmente excretados
extracelularmente, facilitando a extração a partir da da sua fermentação, destacando
os fungos filamentosos, como o Metarhizium anisopliae, que tem uma importância
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relevante e vem sendo estudado para controlo de muitos insetos – pragas, a
produção de proteases e quitinases no processo de infecção pelo fungo Metarhizium
anisopliae foi comprovada, e tem sido sugerido que as lipases podem também estar
envolvidos no processo de infecção desses insetos (SILVA et al., 2004).
As lipases são responsáveis pelo fracionamento dos óleos e gorduras que
situan-se na superfície dos insetos (OLIVEIRA, 2013). São encontradas em tecidos
de vários animais e plantas, e podem ser produzidas por fermentação usando várias
espécies de micro-organismos, como os fungos. Do ponto de vista econômico e
industrial, os micro-organismos são preferíveis do que as lipases de fontes animais e
plantas, devido ao alto custo do seu isolamento (DALLA-VECCHIA et al., 2004).
A produção de lipase é vasta entre os fungos e leveduras, mas são poucas as
lipases que desenvolvem características interessantes e em quantidades para a
aplicação industrial. Alguns componentes do meio de cultura podem inibir ou
estimular a produção de lipase, alguns estimulantes para a produção de lipases são
ácidos graxos de cadeias longas e fontes orgânicas de nitrogênio, sendo que os
inibidores mais comuns são a glicose e o glicerol (LOCK, 2007).
Temperatura e pH do meio, são variáveis que tem uma grande influência
quanto a produção de enzimas lipases, podendo ser produzidas por um grande
número de microrganismos, incluindo bactérias, fungos e leveduras. A produção
vinda dos fungos são os preferidos porque as enzimas produzidas por fungos
normalmente são enzimas extracelulares, o que facilita a extração do meio
fermentado. Na produção de lipases a partir de fungos, os substratos lipídicos atuam
como indutores em muitas espécies, nos quais as lipases são produzidas
constitutivamente (MARTINS et al., 2008).
Dependendo da fonte, as lipases podem apresentar uma ótima atividade em
uma faixa entre 20ºC e 40ºC, sendo que sua termoestabilidade varia muito em
função da sua fonte de origem, sendo as lipases microbianas as que mais
descatacam-se pela sua estabilidade térmica (VOLPATO, 2009).
Em estudo realizado por MARTINS et al., (2008), onde avaliou-se a atividade
lipolítica para biorremediação de óleos vegetais e hidrocarbonetos, identificaram que
as lipases possuem um elevado grau biotecnológico, onde fazem parte de uma larga
18
gama de enzimas que podem ser utilizadas industrialmente por sua alta capacidade
de especificidade e alta enantiosseletividade.
1.4.3 Amilases
Amilases são enzimas catalisadoras da hidrólise da amilopectina, da amilose
e do glicogênio em maltase e dextrinas. Na saliva encontra-se uma forma de alfa-
amilase denominada ptialina e no pâncreas, a amilase pancreática (GAVA,1984).
As amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais,
apresentando grande importância biotecnológica, tais como aplicações nas
indústrias têxteis, cervejas, bebidas destiladas, panificação, cereais para
alimentação infantil, liquefação e sacarificação do amido, ração animal, indústria
química e farmacêutica. Apesar de poderem ser derivadas de diversas fontes,
incluindo plantas, animais e microrganismos, enzimas microbianas geralmente
encontram grande demanda industrial. Atualmente, grandes quantidades de
amilases microbianas estão disponíveis comercialmente e têm aplicação quase
completa na hidrólise do amido em indústrias de processamento do amido (GAVA,
1984).
O amido é um dos principais polissacarídeos de reserva presentes nos
vegetais, onde é degradado por enzimas amilolíticas de vários microrganismos. As
amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais e são de grande
importância na biotecnologia atual, com o aumento de novas margens da
biotecnologia a aplicação das amilases tem se expandido para muitas outras áreas,
incluindo a clínicas, farmacêutico, médica e químico-analítica (OLIVEIRA et al.,
2007).
Em estudo realizado por OLIVEIRA et al. (2007) constatou-se que a
atividade amilolítica das bactérias está provavelmente associada com a produção de
biomassa. Os resultados descritos por SILVA et al. (2006), evidenciou que o
potencial de alguns isolados de fungos endofíticos de pinha e graviola em promover
19
atividades lipolíticas e proteolítica por alguns isolados, mostraram que endofíticos de
pinha e graviola podem ser uma fonte produtora de enzimas de interesse industrial.
1.5 Interação hospedeiro-patógeno
A cutícula dos insetos é constituída por uma barreira muito eficiente contra a
penetração de muitos micro-organismos entomopatogênicos. Essa película contém
uma procutícula e uma epicutícula, sendo a cutícula formada basicamente por 95%
de lipídeos, aminoácidos e amino-açucares, que servem como fonte de nutrientes e
para o crescimento do fungo. Na procutícula os principais componentes são
proteínas (61%), quitina (30%), e de lipídeos (7%) (FERNANDES, 2010).
Os fungos entomopatogênicos são capazes de causar infecção em insetos
devido á germinação de seus esporos quando penetrado na cutícula do inseto
através da hidrólise enzimática. Os fungos entomopatogênicos produzem uma
grande quantidade de enzimas degradantes correspondentes a diferentes polímeros
que são encontrados na cutícula desses insetos, produzindo enzimas para converter
os tecidos do inseto em nutrientes para o seu crescimento (FERNANDES, 2012).
O processo se inicia quando ocorre o crescimento de esporos com interações
hidrofóbicas entre as proteínas apolares, as hidrofobinas e a camada lipídica, após a
penetração as hifas que se formam a partir da formação de esporos sofrem um
engrossamento e se ramificam no tegumento do inseto hospedeiro ocasionando a
sua morte (FERNANDES, 2010).
Como hospedeiro define-se uma planta, animal, ou artrópode que é suscetível a
uma infecção por agente infeccioso, onde geralmente ocorre a replicação ou
desenvolvimento. Alguns dos tipos de hospedeiros podem ser definitivos, em que o
parasita atinge e efetua sua fase sexual de reprodução ou intermediário, em que o
parasita apresenta algum desenvolvimento, podendo ser de forma assexuada
(GOMES, 2013).
A maioria dos agentes é capaz de infectar um grande número de espécies de
hospedeiros. Isto tem particular importância para a sobrevivência dos agentes e
20
alguns hospedeiros podem funcionar como portadores ou reservatórios naturais do
agente. A susceptibilidade à infecção está relacionada com a capacidade do agente
se estabelecer no hospedeiro. Alguns agentes têm maior especificidade do que
outros (GOMES, 2013).
Muitos micro-organismos patogênicos têm especificidade pelo hospedeiro,
parasitando uma única espécie ou poucas espécies, não se conhece totalmente a
base da diferença de especificidade pelo hospedeiro, sabe-se que está, em parte,
relacionada com a necessidade de mecanismos de união específica entre hospedei
e o parasito. Alguns agentes infectam diversas espécies de hospedeiros mesmo
com resultados diferentes. Os micro-organismos que se comportam como patógenos
se diferenciam por seus efeitos aos diferentes tecidos de um mesmo hospedeiro
(GOMES, 2013).
1.6 Pulgão (Capitophorus fragaefolii)
A ocorrência de pragas em cultivares de morango depende bastante do tipo
de clima da região e da maneira de como se cultiva essas plantas, quando atacadas
por pragas os morangueiros tendem a sofrer destruições primeiramente nas suas
partes aéreas reduzindo significamente o seu ciclo produtivo (SANTOS, 2010).
Existem diversas pragas que atacam o cultivo do morango, como principais
agentes podemos citar os pulgões do gênero Capitophorus fragaefolii (pulgão claro)
e Cerosipha forbesi (pulgão escuro), as formigas cortadeiras (Atta spp. e
Acromyrmex spp.), lagarta rosca (Agrotis ípsilon) e alguns ácaros, podendo ser
muito danosos para a planta (FREITAS et al.; 2013). O ataque desses pulgões tem
como consequência a transmissão de viroses para a planta (FREITAS, 2014).
O ataque de pulgão claro (Capitophorus fragaefolii) e pulgão escuro
(Cerosipha forbesi), são pragas que não são muito frequentes nas regiões do Sul do
Brasil. Quando esses pulgões tacam os morangueiros sugam a seiva da planta e
causando uma possível transmissão de viroses, levando a planta a um
enfraquecimento e uma eventual morte dependo dos casos de incidência desses
21
pulgões, o que se faz necessário o uso de inseticidas quando pelo menos 5% das
plantas estão infestadas por eles (SANTOS, 2010).
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Cultivo do fungo
Utilizou-se fungo Isaria fumosorosea CCT 5825 (ARSEF 3669), cedido pelo
Instituto André Tosello oriundo da Coleção de Culturas. Recebeu-se em placas de
Petri, onde a cultura foi multiplicada e estocada através do método de repique em
placas de Petri, utilizando-se como meio de cultivo ágar para esporulação (ME).
2.2 Suspensão dos Esporos
Seguindo o método descrito pela Embrapa (2012), adaptado as condições de
estudo, obteve-se a suspensão dos esporos pelo método de raspagem, ajustando-
se a concentração de esporos/mL com câmara Neubauer. Realizou-se uma diluição
a partir da diluição inicial, pipeta-se 100µL em tubo de eppendorf e 900µL de água
destilada (diluição 1), agitou-se em agitador vortex por 1 minuto, ao final pipetou-se
100uL em câmara Neubauer e fez-se a contagem de esporos do quadrante C
(FIGURA 3), com auxílio de microscópio óptico Olympus CX31 com um aumento de
400x.
Figura 3 - Câmara de Neubauer.
Fonte: Adaptado de Embrapa, 2012.
22
A área total dos 9 quadrantes é de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B e
C) são quadrados de 1 mm2. Ao ser colocada a lamínula no microscópio óptico, a
distância da lamínula até a lâmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite obter
um volume de 0,1 mm³ (0,0001 cm3) em cada quadrante.
Portanto, para o cálculo da concentração de esporos/mL, procedeu-se:
N M EC ------------- 0,0001 cm3
X esporos ------------- 0,1 cm3 (1mL)
N M E C = Número médio de esporos por câmara.
2.3 Avaliação da viabilidade dos esporos
Seguindo o método descrito pela Embrapa (2012), adaptado as condições de
estudo, preparou-se duas placas Rodac com ágar batata (BDA). Pipetou-se 150μL
de uma diluição 108 da suspensão original no centro da placa e agitou-se em forma
de 8. Incubou-se em incubadora para fungos de 16h a 24h a 25°C.
Em aumento de 400 vezes do microscópio, contou-se os esporos germinados
e não germinados. Contou-se os 4 quadrados centrais, objetivando ter uma
contagem de 50 esporos em cada um deles. A partir disso, realizou-se a média dos
esporos germinados e calcula-se:
400 esporos germinados ------------------100%
N M E G ----------------- X%
N M E G= Nº médio de esporos germinados.
Somente utiliza-se os isolados que obtiveram uma viabilidade superior a 90%.
23
2.4 Aplicação do fungo nas estufas
Pulveriza-se em uma estufa com uma dimensão de 18 X 1 contendo cerca de
180 plantas, primeiramente coleta-se folhas de 15 plantas, sendo uma folha apical,
uma folha mediana e uma folha superficial, conta-se o número de pulgões presentes
nessas folhas, aplicasse um cálculo para obter a média de pulgões por planta. Em
seguida prepara-se uma solução de 150mL de contendo 1X105 esporos/mL e aplica-
se nas plantas com borrifador manual, espera-se a ação do fungo sobre os pulgões,
após 7 dias, realiza-se nova coleta das folhas.
2.5 Coleta das folhas do morango para contagem de pulgões.
A coleta procede-se em 15 plantas, de uma propriedade localizada na cidade
de Estrela (coleta realizada em novembro/2016), coletando-se uma folha apical, uma
folha mediana e uma folha superficial, armazena-se cada folha de cada planta em
sacos plásticos, identifica-se e faz-se a contagem de pulgões, após contagem,
realiza-se uma média de pulgões, para comparar as médias utilizou-se o teste de
Tukey, ao nível de significância de (P ≥ 0,05), com o auxílio do programa estatístico
BioEstat 5.0 (Ayres et al., 2007).
2.6 Determinação da atividade de Lipase
Para a avaliação da atividade lipolítica utilizou-se metodologia descrita por
Maciel, (2010), adaptado ás condições de estudo, onde inoculou-se 150µL de
suspensão 107 esporos/mL em placas de petri contendo ágar enriquecido com 2%
óleo de oliva, pH neutro, incubou-se e estufa BDO por 48 horas à 25ºC. Os
resultados considerados positivos foram os meios que apresentaram fluorescência
alaranjada em presença de luz ultravioleta ao redor da colônia formada, proveniente
da ativação interfacial ocasionada pela reação enzimática. Os testes foram
realizados em triplicatas acompanhados de brancos.
24
2.7 Determinação da atividade Amilase
Para a avaliação da atividade amilolitíca utilizou-se metodologia descrita por
Pereira (2012), adaptado ás condições de estudo onde inoculou-se 150µL de uma
suspensão de 107 esporos/mL centro da placa sobre papel filtro qualitativo
previamente autoclavado com diâmetro de 2 cm, incubou-se a uma temperatura de
25 ºC por 5 dias, para a revelação da reação aplicou-se solução lugol, deixou-se agir
por 10 minutos, observou-se a coloração formada ao redor da colônia, para
resultado positivo ocorre a formação de coloração translucida ao redor do inoculo.
Os testes são realizados em triplicatas acompanhados de branco.
2.8 Determinação da atividade Protease
Para a avaliação da atividade proteolítica utilizou-se metodologia descrita por
Silva, (2010), adaptado às condições de estudo, onde inoculou-se 150µL de uma
suspensão de 107 esporos/mL no centro da placa de petri sobre papel filtro
qualitativo autoclavado com diâmetro de 2cm, incubou-se à 25 ºC por 72h, sendo
acompanhado a cada 12h. Os isolados com atividade positiva formaram halos
translúcidos ou esbranquiçados ao redor das colônias. Os testes foram realizados
em triplicata acompanhando de branco.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 Produção enzimática
Para a produção enzimática obteve-se resultados positivos para produção de
algumas enzimas indicando que houve a possibilidade de aplicação à campo. Os
resultados positivos e negativos para a produção dessas enzimas se faz necessário
o enriquecimento do meio sólido com fontes específicas de carbono e nitrogênio
25
para a produção de cada tipo de enzima que venha a ter interesse no controle
microbiano. A seguir seguem os resultados obtidos.
3.1.1 Produção de lipase
Os resultados qualitativos obtidos para a produção lipolítica foram
considerados negativos, pois não houve a formação do halo alaranjado ao redor das
colônias quando submetido a luz UV, sendo necessário estudos mais específicos
para a avaliação da capacidade de formação de enzimas lipolíticas dos fungos
presente nesses substratos. Para a produção de lipases seguindo metodologia
descrita por Maciel, (2010), que em estudo avaliou a produção enzimática de lipase
utilizando concentrações de 0,001%, 0,007%, 0,6%, 1,5% e 2% de rodamina B em
meio sólido tendo papel revelador da ação enzimática no meio quando exposto a luz
UV de fluxo laminar, tendo resultado positivo para atividade lipolítica com uma
concentração de 0,007% de rodamina B. Em estudo realizado por Nascimento et
al.,(2015), avaliou-se a atividade proteolítica e lipolítica de dezenove isolados de
fungos filamentosos, onde somente 4 isolados apresentaram resultados positivos
para a produção de lipase em meio enriquecido com 1% de azeite de oliva e 14 para
a produção de protease. Já Sperb, et al., (2015) avaliando a atividade lipolítica de
isolados de resíduos oleosos, constatou que somente 2 isolados apresentaram
produção de lipase em meio contendo óleo de oliva e rodamina B. Sendo assim
sugere-se que o meio utilizado neste estudo não foi adequado para a produção
dessa enzima.
3.1.2 Produção de amilase
Os resultados obtidos nos isolados testados foram negativos para a enzima
amilase, contradizendo resultados obtidos por Silva (2011) indo de encontro aos
resultados obtidos por Pereira (2012), onde são considerados negativos, pois
nenhum dos testes apresentou a formação do halo para indicando que houve a
degradação amilolitica. Para a produção de amilase, seguindo metodologia descrita
26
por Pereira (2012), que analisando duas formulações diferentes de substrato, porém,
ambos contendo amido solúvel como única fonte para a produção de amilases, não
obteve resultados positivos em nenhuma das suas formulações testadas, mas após
avaliação mantendo seus perceberam que quando seus inóculos são mantidos
refrigerados a 4ºC, começaram a degradar o amido disponível no meio, formando
então pequenos halos.
Entretanto para Silva (2011), avaliando a atividade amilolítica de 11 espécies
diferentes de fungos, constatou que fungos do gênero Paecilomyces apresentaram
resultados positivos onde a formação de halos ao redor das colônias foi visível a
olho nu, indicando que houve ação de enzimas na degradação do amido presente
no meio sólido testado. No entanto no estudo de Soares, et al. (2010) , que
identificando o potencial amilolítico de linhagens mutantes do fungo filamentosos de
Aspergillus nidulans obteve resultados positivos em seus testes, mas um percentual
abaixo quando avaliado em meio BDA, comparado com o meio completo, devido ao
fato de que fungos desse gênero produzem tal enzima em meio completo (MC).
3.1.3 Produção de protease
Os resultados qualitativos obtidos para a produção proteolítica foram
considerados positivos, pois houve a formação do halo esbranquiçado ao redor das
colônias, indicando assim capacidade de degradação da proteína presente no
substrato. Para a produção de protease, seguindo metodologia descrita por Silva, et
al. (2010), onde em seu estudo avaliou a presença de enzimas proteolíticas de 20
fungos filamentosos, sendo que somente 12 (60%) apresentaram halos
esbranquiçados formados ao redor das colônias, indicando que houve capacidade
por parte desses fungos degradarem a proteína do leite adicionado ao meio sólido,
sendo desnecessário a utilização de qualquer tipo de solução reveladora. Da mesma
forma Souza (2015), avaliou a produção de protease em meio sólido, contendo
caseína leite, de 17 espécies de fungos filamentosos, sendo que 8 não
apresentaram atividade proteolítica, indicando para Silva, et al. (2010) e para Souza
(2015) que a produção enzimática proteolítica é variável dependendo da espécie do
27
fungo. Sendo assim os resultados obtidos neste vão ao encontro aos estudos
citados anteriormente.
3.1.4 Viabilidade de aplicação à campo
Realizando-se o controle de pulgões em plantações de morangos na cidade
de Estrela. estado do RS, aplicados no mês de novembro de 2016, os resultados
apresentaram diferença de variância de P > 0,05 (TABELA 1), significantes nas
amostras controle antes e após a aplicação, onde para o controle do fungo
Metarhizium anisopliae, que também apresentou resultados variantes nas folhas
medianas, e para o fungo Isaria fumosoroseus, nas folhas apicais, indicando que
nesses houve mortalidade de pulgões.
Diferente do encontrado por Fernandes (2010), avaliando o potencial de
espécies de fungos filamentosos para controle de M. doméstica em camas de
aviário, entre eles o fungo Isaria fumosoroseus (Paecilomyces fumosoroseus)
CG301 e Metarhiziun anisopliae, constatou-se que o fungo Metarhiziun anisopliae é
Isaria fumosoroseus Metarhiziun anisopliae Controle
Antes Depois Antes Depois Antes Depois
Apical 4,47±0,90 a 1.47±0,67 b 3,73±1,33 a 1,33±0,37 a 12±3,54 a 1,6±0,37 b
Mediana 8,67±1,76 a 4.33±1,30 a 5,13±0,96 a 2,27±0,90 b 13,33±2,59 a 3,53±0,90 b
Basal 8,87±2,18 a 4.2±0,97a 3,57±0,71 a 5,93±1,49 a 16,33±4,69 a 6±1,49 b
Tabela 1 – Resultados da aplicação dos fungos Isaria fumosoroseus e
Metarhizium anisopliae em cultura de plantas de morangos pelo teste de Tukey.
Fonte: Do autor, 2016.
Média (± Erro padrão) seguida da mesma letra não difere entre si pelo teste tukey ao nível de
significância de 5%.
28
um dos fungos mais promissores para esse fim. Isso se deve também ao contato
que moscas sadias têm com infectadas, ocorrendo uma transmissão desse fungo
filamentoso, no entanto para a utilização do fungo Isaria fumosoroseus
(Paecilomyces Fumosoroseus) CG301 o mesmo não apresentou resultados
variantes de mortalidade em nenhuma das diferentes concentrações de suspensão
de esporos/mL em que foi aplicado
4 CONCLUSÃO
A partir do presente estudo foi possível concluir que a produção enzimática a
partir de fungos filamentos do genêro Isaria fumosoroseus (Paecilomyces
fumosoroseus) e Metarhiziun anisopliae está absolutamente ligada ás fontes de
carbono e nitrogênio especificas para cada enzima presente no meio de cultivo,
sendo necessário um tempo de 72 horas de incubação, observando-se somente
produção de proteases por ambos os fungos, indicando que há a possibilidade de
aplicação do fungo Isaria fumosoroseus (Paecilomyces fumosoroseus) para controle
de pragas, pois houve produção enzimática de protease em meio enriquecido. Para
a viabilidade de aplicação e atuação à campo é necessário a utilização de outras
metodologias de aplicação, coleta e contagem de pulgões, sendo necessário
também mais tempo de ação do fungo podendo ser monitorados por vários dias a
atuação do mesmo.
Para estudos futuros sugere-se a avaliação quantitativa de micotoxinas
produzidas pelo fungo filamentoso testado, pois dependendo ao fator de estresse
que fungos filamentosos são expostos produzem micotoxinas, podendo afetar a
produção de morangos pela planta, bem como mais testes avaliativos de eficiência
do fungo Isaria fumosoroseus como um controle microbiano de pulgões.
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