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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Interação entre rúcula (Eruca sativa Miller) e rizobactéria (Bacillus subtilis
GB03): efeitos na oviposição e desenvolvimento larval da traça-das-
crucíferas, Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae)
Rafaela Cristina dos Santos
Piracicaba
2016
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestra em Ciências. Área de concentração:
Entomologia
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Rafaela Cristina dos Santos
Engenheira Agrônoma
Interação entre rúcula (Eruca sativa Miller) e rizobactéria (Bacillus subtilis GB03):
efeitos na oviposição e desenvolvimento larval da traça-das-crucíferas,
Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011
Piracicaba
2016
Dissertação apresentada para obtenção do título de
Mestra em Ciências. Área de concentração:
Entomologia
Orientador:
Prof. Dr. PAUL WHITAKER PARÉ
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
DIVISÃO DE BIBLIOTECA - DIBD/ESALQ/USP
Santos, Rafaela Cristina dos Interação entre rúcula (Eruca sativa Miller) e rizobactéria (Bacillus subtilis GB03):
efeitos na oviposição e desenvolvimento larval da traça-dascrucíferas, Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) / Rafaela Cristina dos Santos. - - versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2016.
55 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”.
1. PGPR 2.Voláteis de plantas 3. Interação microrganismo-planta-inseto 4. Microrganismos benéficos I. Título
CDD 635.5 S237i
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
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Dedicatória
Dedico este trabalho aos meus pais Valmir e Ione, à minha irmã Gabriela, às minhas avós Maria Joana e Regina e ao meu namorado
Felipe.
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Agradecimentos
A Deus e à Nossa Senhora Aparecida por estarem sempre comigo me abençoando, iluminando e protegendo. Aos meus pais Valmir e Ione, à minha irmã Gabriela e às minhas avós Maria Joana e Regina, por todo amor, incentivo, por sempre estarem ao meu lado sendo meu maior apoio. Ao meu namorado Felipe, pelo amor, companheirismo, compreensão, paciência, amizade e por ter sido meu apoio nas horas de fragilidade. Ao professor Paul Paré pelos ensinamentos e orientação durante o mestrado. Ao professor José Maurício Simões Bento, por todas as oportunidades oferecidas, por ter me recebido no laboratório de Ecologia Química e Comportamento de Insetos da ESALQ. À CAPES por ter me concedido bolsa para realização dos meus estudos durante o mestrado. À professora Cristiane Nardi por ser minha mãe entomológica. Ao professor Sérgio de Bortoli do Laboratório de Biologia e Criação de Insetos da Unesp, Jaboticabal, pelo fornecimento de pupas de P. xylostella para o início da criação. Ao professor Ítalo Delalibera e à Solange por permitirem o uso do Laboratório de Patologia de Insetos. À secretária do Departamento de Entomologia e Acarologia, Andrea, por sempre saber tudo, nos passar as informações que precisamos e salvar nossas vidas. À professora Maria Fernanda Peñaflor pelos ensinamentos, exemplo de pessoa e de vida e por estar sempre disposta a ajudar e passar o conhecimento.
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À Franciele Santos agradeço imensamente por toda disposição em me ajudar, principalmente nos momentos finais, pela amizade, apoio e paciência. À Arodí pelo auxílio com os equipamentos e análises e pelos puxões de orelha. À Patrícia Sanches, pela amizade, companheirismo, pelo exemplo de dedicação, por me ajudar com as minhas “filhas” e pelas descobertas estatísticas juntas. À Mariana Leite pela amizade, por alegrar meus dias e pela parceria nas disciplinas durante o mestrado. À Luiza por ter me recepcionado ao chegar a Piracicaba. Ao teacher Fernando Sujimoto pela ajuda com o inglês e com as disciplinas. À Kamila pelo auxílio com os cuidados da criação de Plutella. À Denise Alves e ao professor Luis Carlos Marchini por me darem permissão para utilizar o Laboratório de Insetos Úteis da ESALQ. A todos os integrantes do Laboratório de Ecologia Química e Comportamento de Insetos, minha hermana Natalia, mami Lucila, a sementinha da discórdia Aline, às Camila’s, ao Weliton, Davi, Diego, Janaína, Felipe e Fernando Cabezas, pela convivência, amizade, pelos cafés, conversas, momentos de descontração, por terem contribuído de alguma forma para o meu projeto e meu crescimento pessoal. A todos os meus colegas de turma do mestrado, por sofrermos juntos, pelos momentos de descontração e por tornarem a nossa turma muito especial, unida e descontraída. À minha amiga e colega de casa Gislaine, por estar sempre do meu lado, pelo companheirismo, apoio, conselhos e amizade. À minha mineira preferida Ana Clara, por ser uma simpatia em pessoa, por alegrar meus dias e por ser minha companheira em todos os momentos.
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“O pior erro que alguém pode cometer é desistir
de aprender o que quer que seja apenas
porque encontrou uma dificuldade.”
Professor Pier
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SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................. 11
ABSTRACT ............................................................................................................................. 13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .............................................................................. 15
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 19
2.1 Aspectos biológicos e importância econômica de Plutella xylostella ................................ 19
2.2 Família Brassicaceae ......................................................................................................... 21
2.3 Bacillus subtilis (GB03) ..................................................................................................... 22
2.4 Plantas como mediadoras de interações entre microrganismos radiculares e insetos de
parte aérea ................................................................................................................................. 23
3 METODOLOGIA ............................................................................................................. 25
3.1 Multiplicação e inoculação de B. subtilis (GB03) .............................................................. 25
3.2 Cultivo das plantas ............................................................................................................. 26
3.3 Criação de P. xylostella ...................................................................................................... 26
3.4 Crescimento de plantas de rúcula........................................................................................28
3.5 Desempenho de P. xylostella em plantas de rúcula ............................................................ 27
3.6 Bioensaio em olfatômetro ................................................................................................... 28
3.7 Teste de preferência de oviposição de P. xylostella ........................................................... 29
3.8 Coleta de voláteis ............................................................................................................... 30
3.9 Análise Estatística .............................................................................................................. 31
4 RESULTADOS ................................................................................................................. 33
4.1 Área foliar e biomassa seca de plantas de rúcula inoculadas e não inoculadas com B.
subtilis (GB03) ......................................................................................................................... 33
4.2 Ganho de peso de lagartas de P. xylostella e área foliar consumida de plantas de rúcula . 34
4.3 Preferência de oviposição de P. xylostella ......................................................................... 36
4.4 Voláteis emitidos por plantas de rúcula .............................................................................. 37
4.5 Análise dos componentes principais (PCA) .................................................................. 39
5 DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 41
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................ 45
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 47
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RESUMO
Interação entre rúcula (Eruca sativa Miller) e rizobactéria (Bacillus subtilis GB03):
efeitos na oviposição e desenvolvimento larval da traça-das-crucíferas,
Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae)
As rizobactérias promotoras de crescimento (PGPR) são microrganismos que ocorrem
naturalmente no solo, são conhecidas por proporcionar melhorias no desenvolvimento das
plantas atuando de diversas formas. Bacillus subtilis (cepa GB03) é uma PGPR disponível
para comercialização como fungicida biológico concentrado, utilizada no tratamento de
sementes de diversas culturas como algodão, soja, amendoim, trigo e cevada. Destaca-se pela
capacidade de promover o crescimento de plantas por meio da emissão de voláteis. Vários
estudos com Arabidopsis thaliana já comprovaram que B. subtilis (GB03) é capaz de auxiliar
no desenvolvimento da planta por meio da promoção de crescimento e pela supressão de
patógenos habitantes de solo. No entanto, o seu papel na proteção de plantas contra a
herbivoria de insetos ainda não é bem caracterizado. Deste modo, buscou-se avaliar os efeitos
da interação de B. subtilis (GB03) com plantas de rúcula (Eruca sativa) e Plutella xylostella
(traça-das-crucíferas). Este inseto pertence à ordem Lepidoptera, considerado praga de maior
importância no cultivo de Brassicaceae ao redor do mundo. Devido à sua alta prolificidade e
capacidade de adaptação e ao seu curto ciclo de vida, tornou-se uma das pragas mais
resistentes e de difícil controle da agricultura. Atualmente, os custos em escala mundial com o
controle da praga anualmente chegam em torno de US $ 4 a 5 bilhões. Foram utilizados dois
tratamentos, plantas inoculadas com B. subtilis (GB03) e controle (plantas não inoculadas).
Avaliou-se o crescimento de plantas de rúcula e o peso seco de parte aérea. Para avaliar o
desempenho e dano de P. xylostella em ambos tratamentos, previamente foram pesados
grupos de quinze lagartas e submetidas a alimentação de plantas de rúcula durante 24 horas.
Posteriormente, as lagartas foram retiradas e pesadas novamente e a área foliar consumida foi
calculada por meio do software editor de imagens ImageJ®. A preferência de oviposição do
inseto foi testada por meio de olfatometria, composta apenas de pistas olfativas e em arenas
contendo tanto pistas olfativas quanto visuais. A emissão de voláteis foi caracterizada
quantitativamente e qualitativamente por cromatografia gasosa e analisada por espectrometria
de massas. A inoculação com GB03 em plantas de rúcula promoveu melhor crescimento das
plantas em relação ao tratamento controle, ao mesmo tempo em que diminuiu os danos pelo
consumo alimentar do inseto na planta. P. xylostella não apresentou distinção entre os odores
das plantas nos testes de olfatometria. Entretanto, observou-se menor número de ovos em
plantas com GB03 nos bioensaios de arena. Não foram constatadas diferenças significativas
na emissão total de voláteis entre os tratamentos com e sem GB03, no entanto, foram
encontradas concentrações diferentes dos compostos (Z)-3-hexenol e 2-ethyl-1-decanol.
Outros testes devem ser realizados com a finalidade de estabelecer o papel desempenhado por
GB03 na indução de defesas de plantas contra insetos.
Palavras-chave: PGPR; Voláteis de plantas; Interação microrganismo-planta-inseto;
Microrganismos benéficos
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ABSTRACT
Arugula (Eruca sativa Miller) and rhizobacteria (Bacillus subtilis, GB03) interaction:
effects on oviposition and larval development of Diamondback moth,
Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae)
The plant growth promoting rhizobateria (PGPR) are microorganisms that naturaly live in the
soil, known by improving the plants’ development in many ways. Bacillus subtilis (strain
GB03) is a comercial available PGPR, sold as a concentrated biological fungicide, applied in
seed treatment of different cultures as cotton, soybean, peanut, wheat and barley. Moreover, it
stands out by its capacity of plant growth promoting via volatiles emission. Several studies
with Arabidopsis thaliana showed that B. subtilis (GB03) can help the plant development via
growth promotion and by soil pathogens supression. However, its role in plant protection
against insect herbivory has not been characterized yet. Thus, it aimed to evaluate the
interaction effects among B. subtilis (GB03), arugula plants (Eruca sativa) and Plutella
xylostella (Diamondback moth). This insect belongs to the order Lepidoptera and have been
considered the main pest in Brassicaceae fields around the world. Due to its high prolificacy
and plasticity in field survival, and its short life cycle, it has become one of the most resistant
and hard control pest in agriculture. Currently, the annualy world costs with this pest control
is about US $ 4-5 bilions. Here, it was used two treatments, innoculated plants with B. subtilis
(GB03) and control (non-innoculated plants). The arugula plants growth and dry mass of
shoots were evaluated. To analyze the performance and damage by P. xylostella in both
treatments, it was previously weighed groups with fifteen caterpillars and submitted to
feeding on arugula plants during 24 hours. After that, the caterpillars were removed and
weighed again and the consumed leaf area was calculated by the image editor software
ImageJ®. The insect oviposition preference was tested by olfactometry, with only olfactory
cues and in arenas containing both, olfactory and visual cues. Volatiles emission was
quantitatively and qualitatively characterized by gas chromatography and analyzed by mass
spectrometry. GB03 innoculation in arugula plants promoted a better growth when compared
to control, and, at the same time, there was an increasing in the plant damage by insect food
consumption. P. xylostella did not show distinction between odors of the plants in
olfactometry tests. Although, it was observed less number of eggs in plants with GB03 in
arena bioassays. It was not found significant differences in total volatile emission between
the treatments with and without GB03, even though different concentrations of (Z)-3-hexenol
and 2-ethyl-1-decanol were observed. Other tests must be performed in order to estabilish the
role played by GB03 in plant induction defense against insects.
Keywords: PGPR; Plants volatiles; Microrganism-plant-insect interaction; Benefics
microrganisms
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria
ISR Indução de Resistência Sistêmica
DDT Diclorodifeniltricloroetano
SAR Resistência Sistêmica Adquirida
AJ Ácido Jasmônico
AS Ácido Salicílico
TSA Ágar Triptona de Soja
DIC Detector de Ionização de Chama
KI Kovats
PCA Principal Component Analysis
COV Compostos orgânicos voláteis
EAG Eletroantenograma
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1 INTRODUÇÃO
A família Brassicacea é uma das famílias de olerícolas mais numerosas, composta por
muitas espécies de importância agrícola, compreendendo aproximadamente 340 gêneros e
3350 espécies (KOCH; HALBOULD; MITCHELL-OLDS, 2001). Entre as espécies
pertencentes a essa família a rúcula (Eruca sativa Miller) destaca-se por sua composição
nutricional e por seu odor e sabor característicos, alcançando cada vez mais espaço no
mercado e na alimentação humana (FILGUEIRA, 2003; TRANI e PASSOS, 1998). Em
contrapartida, a rúcula ainda é uma espécie pouco estudada e o crescente aumento do número
de produtores dessa olerícola indica a necessidade da implementação de ações
multidisciplinares para melhoria das suas táticas de manejo (MOURA et al., 2008).
Entre os fatores limitantes na produção dessas hortaliças pode-se destacar a ocorrência
da traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (Linnaeus, 1758), considerada a praga de maior
importância econômica no cultivo de brassicaceas ao redor do mundo, os danos ocasionados
por este lepidóptero reduzem drasticamente a produção e aumentam significativamente os
custos com controle (DICKSON et al., 1990; SHELTON; NAULT, 2004). A traça-das-
crucíferas foi o primeiro inseto a ser constatado o desenvolvimento de resistência a cepas de
Bacillus thuringiensis em vários países (FERRÉ et al.,1991; MORISHITA; AZUMA;
YANO, 1992; SHELTON et al., 1993; TABASHNIK et al., 1990). Além disso, o seu
curto ciclo de vida e sua alta fecundidade fazem com que muitas gerações sejam expostas à
ação de inseticidas usados rotineiramente pelos produtores, aumentando a pressão de seleção
e contribuindo para o desenvolvimento de resistência à maioria dos princípios ativos de
inseticidas encontrados atualmente no mercado (SAYYED; OMAR; WRIGHT, 2004),
As rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPR- Plant Growth
Promoting Rhizobacteria) ocorrem naturalmente no solo e vivem em simbiose com as raízes,
estimulando o crescimento das plantas (KLOEPPER, 1980). As PGPR podem interagir de
várias formas com os insetos acima do solo por meio das plantas, que atuam como
mediadoras dessas interações (ERB et al., 2009; PINEDA et al., 2010; VAN DER PUTTEN
et al., 2001). A promoção do crescimento de plantas é considerado o principal mecanismo
mediador de interações entre plantas, microrganismos e insetos. A importância das defesas
induzidas das plantas neste processo ainda tem sido pouco explorada, especialmente, o papel
da indução da resistência sistêmica (ISR) nessas interações (BEZEMER; VAN DAM, 2005;
VANNETTE; HUNTER, 2009).
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Algumas PGPR encontram-se disponíveis para comercialização para serem utilizadas
na agricultura, como é o caso de Bacillus subtilis (GB03), a qual é comercialmente produzida
como fungicida biológico concentrado (Kodiak®, Bayer CropScience), indicado para o uso
no tratamento de sementes de diversas culturas, como algodão, amendoim, feijão, soja, trigo,
cevada e milho. A capacidade de B. subtilis (GB03) em estimular o crescimento de plantas
por meio da emissão de voláteis, já foi comprovada em plantas de Arabidopsis (RYU et al.,
2003) e rúcula (CHOI et al., 2014), assim como a melhoria no desenvolvimento e bem estar
de plantas de Arabidopsis pelo aumento da capacidade fotossintética e tolerância à salinidade
(ZHANG et al., 2008; ZHANG et al., 2008b) e a melhoria na absorção de ferro em plantas de
mandioca (FREITAS et al., 2015). Além disso, sua habilidade em competir e inibir o
desenvolvimento de outros microrganismos também foi confirmada, sendo altamente efetiva
na supressão de patógenos de raíz, como Fusarium spp. e Rhizoctonia solani (BACKMAN;
BRANNEN; MAHAFEE, 1994; TURNER; BACKMAN, 1991). No entanto, os estudos sobre
os efeitos da inoculação das plantas com B. subtilis (GB03) sobre o comportamento e
desenvolvimento de insetos ainda são recentes, o que requer que mais estudos sejam
realizados nesta área.
Deste modo, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da rizobactéria B.
subtilis (GB03) sobre o crescimento de plantas de rúcula e seus efeitos na oviposição e
desempenho larval de P. xylostella. Assim como, identificar e quantificar as concentrações
dos voláteis emitidos por plantas de rúcula inoculadas ou não com a rizobactéria.
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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Aspectos biológicos e importância econômica de Plutella xylostella
Conhecida popularmente como traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (Linnaeus,
1958) (Lepidoptera: Plutellidae), é considerada a praga de maior importância no cultivo de
brássicas, devido à sua abrangência territorial e os danos às culturas (MORATÓ, 2000;
ULMER et al., 2002). Sua capacidade em causar altos níveis de dano está relacionada ao seu
elevado potencial reprodutivo e curto ciclo de vida, proporcionando várias gerações ao longo
do ano (FRANÇA et al., 1985). A temperatura é um fator abiótico determinante no
desenvolvimento deste inseto, de modo que, em regiões tropicais com temperaturas mais
elevadas, o inseto pode apresentar até 15 gerações anuais (DIAS; SOARES; MONNERAT,
2004; POELKING, 1992).
Acredita-se que a traça-das-crucíferas seja originária do sul da Europa, provavelmente
da região do Mediterrâneo e que migrou para outras partes do mundo, sendo considerada uma
praga cosmopolita (CHAPMAN et al., 2002). No Brasil, os primeiros relatos de ocorrência
deste lepidóptero foram realizados por Bondar (1928), em plantações de repolho na Bahia. O
sucesso da colonização de plantações ao redor do mundo deve-se principalmente ao alto
potencial biótico, a grande habilidade de dispersão a longas distâncias e a facilidade de
adaptação em diversos ambientes (CASTELO BRANCO; GATEHOUSE, 2001; METCALF,
1981).
Os adultos são microlepidópteros, possuem hábito noturno, medem 8 a 10 mm de
comprimento e apresentam coloração parda. Quando em repouso, a margem posterior das asas
assume um formato semelhante ao de um diamante, fato que tornou a espécie conhecida por
‘Diamondback moth’. O dimorfismo sexual nos adultos pode ser verificado nos últimos
segmentos do abdômen, onde pode-se observar duas manchas circulares de coloração
marrom-avermelhada nas fêmeas, enquanto que os machos possuem apenas uma mancha
alongada (GUIMARÃES; MICHEREFF FILHO; SETTI DE LIZ, 2011; VACARI, 2009).
As fêmeas são altamente prolíferas, podendo colocar mais de 300 ovos no decorrer do
ciclo reprodutivo. As posturas normalmente são realizadas próximas às nervuras e podem ser
agrupadas ou isoladas (THULER, 2009; TORRES; ZANUNCIO, 2001). Os ovos têm cerca
de 1 mm de diâmetro, são de coloração amarelada e arredondados. Após dois ou três dias da
oviposição, as lagartas começam a eclodir. No primeiro instar alimentam-se do mesófilo
foliar, em seguida abandonam as galerias e passam a se alimentar da epiderme (IMENES et
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al., 2002; MEDEIROS et al., 2003), passando por quatro instares até completar todo o seu
desenvolvimento larval. O tamanho máximo observado nessa fase do desenvolvimento é de 8
a 10 mm de comprimento. Posteriormente, as lagartas transformam-se em pupas de 5 a 9 mm
envoltas em um casulo branco de seda e podem apresentar colorações que variam de branco-
amarelado à esverdeado, tornando-se mais escuras próximo à emergência que ocorre cerca de
quatro dias após a formação das pupas (CASTELO BRANCO; FRANÇA; VILLAS BOAS,
1997).
O ataque de P. xylostella prejudica a comercialização das hortaliças, e os danos nas
plantas são ocasionados pela alimentação das lagartas, especialmente no quarto instar onde
observa-se o ataque mais severo da traça em todas as partes da planta (CAPINERA, 2015;
CASTELO BRANCO; FRANÇA; VILLAS BOAS; 1997). A traça-das-crucíferas pode
ocasionar danos à cultura durante todo o seu ciclo, apresentando maior importância na fase de
muda, sendo prejudicial para a formação de cabeça em brócolis, repolho e couve-flor
(CAPINERA, 2015). Em repolho as perdas podem atingir até 96% das cabeças comerciais
(CASTELO BRANCO, 1999), já na cultura da couve, dependendo da região, do clima e da
época de plantio, estima-se que os prejuízos causados à cultura podem chegar a 95%
(CZEPAK et al., 2005).
No início dos anos 90 o custo anual para controle da traça-das-crucíferas era estimado
em aproximadamente um bilião de dólares (JAVIER, 1992). No entanto, entre os anos de
1993 e 2009 ocorreu um aumento de cerca de 39% na área cultivada de plantas da família
Brassicaceae. Deste modo, observou-se que o custo com o manejo da praga teve um aumento
diretamente proporcional à área cultivada, chegando a custar atualmente cerca de 4 a 5 biliões
de dólares por ano (ZALUCKI et al., 2012).
Apesar do controle químico ser a forma mais utilizada para controlar P. xylostella, a
resistência a vários inseticidas tem sido um problema frequente (SHELTON et al., 1993). De
acordo com Thuler (2006), a manifestação da resistência em P. xylostella pode ser explicada
devido à sua elevada prolificidade e ao seu curto ciclo de vida, reduzindo drasticamente a
eficiência dos produtos utilizados (CASTELO BRANCO et al., 2001; GEORGHIOU;
LAGUNES-TEJADA, 1991).
Ankersmit (1953) fez os primeiros relatos sobre a resistência de P. xylostella ao
diclorodifeniltricloroetano (DDT), na Índia, apenas três anos após o início da sua utilização,
sendo o primeiro inseto a desenvolver resistência a esse princípio ativo. Também foi o
primeiro inseto que mostrou-se resistente as toxinas de Bacillus thuringiensis no campo
(KIRSCH; SCHUMUTTERER, 1988; TABASHINIK et al., 1990). Ao longo dos anos, a
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traça-das-crucíferas tornou-se o lepidóptero mais resistente à ação de inseticidas, sendo
constatada a resistência a mais de 51 princípios ativos utilizados no mundo (VASQUEZ,
1995).
A resistência de P. xylostella a inseticidas tem colaborado para o incentivo a pesquisas
visando técnicas de manejo mais adequadas e consequentemente o desenvolvimento de
estratégias dentro do manejo integrado de pragas (TALEKAR; SHELTON, 1993; THULER,
2006), destacando-se a rotação de culturas, controle biológico com parasitoides e fungos
entomopatogênicos (CASTELO BRANCO; MEDEIROS, 2001; MONNERAT et al., 2000),
cultivares resistentes e armadilhas com feromônio (EIGENBRODE; SHELTON; DICKSON,
1990; IMENES et al., 2002).
2.2 Família Brassicaceae
A família Brassicaceae é composta por diversas espécies de importância econômica,
tais como a couve-flor, brócolis, canola, repolho, couve e rúcula. As plantas pertencentes à
esta família podem ser encontradas e cultivadas no mundo todo, pois possuem elevada
capacidade de adaptação às variações climáticas (HONG et al., 2008). No Brasil, são
cultivadas principalmente na região centro-sul e apresentam custo de produção relativamente
baixo comparado com outras espécies olerícolas (FILGUEIRA, 2008).
Devido às características nutricionais e ao baixo custo, as brassicáceas participam da
base da alimentação mundial. Possuem em sua composição química grandes quantidades de
compostos fenólicos secundários, os glucosinolatos, que são responsáveis pelo aroma e sabor
característico dessa família e estão relacionados com a defesa da planta contra os insetos
(CARTEA, 2011; DIXON, 2007; KEHR; BUTZ, 2011).
Além das plantas cultivadas que exercem importância econômica dentro da família
Brassicaceae, pode-se também destacar a importância de Arabidopsis thaliana nesse grupo de
olerícolas. A. thaliana tem sido utilizada como planta modelo para diversos estudos, os quais
tem assumido papel importante na análise dos genomas de plantas, proporcionando melhor
entendimento dos processos que ocorrem em diversas espécies, até mesmo em humanos
(MEINKE et al., 1998; MEYEROWITZ; SOMERVILLE, 1994).
A. thaliana possui um genoma relativamente pequeno em relação a outras espécies,
com cinco cromossomos e cerca de 26000 genes, o que facilita seu estudo. Possui também
outras características que a tornam um bom modelo para realização de pesquisas, como: ciclo
relativamente curto (seis semanas), alta capacidade reprodutiva, o que garante um elevado
22
número de sementes, é facilmente cultivável e possui um número significativo de linhagens
geneticamente modificadas facilitando a análise e manipulação (FRANSZ et al., 1998;
MEINKE et al., 1998). Deste modo, as semelhanças genéticas, fisiológicas e biológicas
existentes entre as plantas pertencentes à família Brassicaceae podem auxiliar na aplicação em
plantas cultivadas dos estudos realizados utilizando-se como base A. thaliana.
2.3 Bacillus subtilis (GB03)
As rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (PGPR) são microrganismos
que ocorrem naturalmente no solo, colonizando raízes e estimulando o crescimento das
plantas. Estas bactérias são aplicadas a uma ampla variedade de espécies agrícolas para
melhorar o desenvolvimento das plantas, apresentando efeitos no aumento da emergência das
sementes, peso da planta e indução de resistência a pragas e doenças (KLOEPPER et al.,
1980).
B. subtilis (GB03) é uma PGPR que pode ser encontrada na região da rizosfera e
possui a capacidade de emitir e modificar o perfil de voláteis e promover o crescimento das
plantas (RYU et al, 2003; 2005). Estudos genéticos e fisiológicos em plantas de Arabidopsis
demonstram que B. subtilis (GB03) possui compostos orgânicos voláteis que mediam a
sinalização da auxina, expandindo a célula e permitindo a promoção do crescimento celular
(ZHANG et al., 2008).
Ryu et al. (2003) constataram que em interações de plantas e rizobactérias, uma
mistura de produtos químicos é liberado por cepas específicas de PGPR que pode desencadear
a promoção do crescimento e induzir a resistência sistêmica em Arabidopsis e mudas
vizinhas. Nesse estudo contatou-se que 2,3-butanodiol é um componente essencial bacteriano
responsável pela sinalização química no ar provocando o crescimento em Arabidopsis.
Em estudos realizados posteriormente, constatou-se que B. subtilis (GB03) e B.
amyloliquefaciens (IN937a) influenciaram plantas de Arabidopsis na promoção do
crescimento e na indução de resistência sistêmica através de emissões de compostos voláteis.
Foram detectados os metabólitos 2,3-butanodiol e 3-hidroxi-2-butanona (acetoína) em GB03 e
IN937a, enquanto esses mesmos compostos não foram detectados em outras cepas bacterianas
não promotoras do crescimento (RYU et al., 2004, FARAG et al., 2006).
23
2.4 Plantas como mediadoras de interações entre microrganismos radiculares e insetos
de parte aérea
As plantas são capazes de interagir de diversas formas com as mais variadas formas de
vida durante seu ciclo e atuam como mediadoras entre organismos que vivem no solo e na
parte aérea. Os microrganismos simbiontes que vivem no solo proporcionam melhorias no
desenvolvimento das plantas e podem desencadear mudanças fisiológicas que influenciam nas
interações com insetos de parte aérea. As PGPR atuam em simbiose com as plantas
promovendo o crescimento e melhorias na resistência contra estresses bióticos e abióticos
(ONGENA et al., 2007; PANGESTI et al., 2013; PINEDA et al., 2010).
Algumas PGPR são capazes de induzir a resistência sistêmica (ISR) nas plantas o que
comumente resulta na redução do crescimento do patógeno e afeta a alimentação e
desenvolvimento de insetos herbívoros. O mecanismo de ação desencadeado na ISR é
semelhante ao induzido por patógenos, a qual é conhecida como resistência sistêmica
adquirida (SAR) (RYU et al., 2004). A indução da SAR leva a um aprimoramento da
resistência contra maiores ataques do mesmo patógeno ou de um microrganismo diferente
(STICHER; MAUCH-MANI; MÉTRAUX, 1997). A ISR ocorre pela colonização da
rizobactéria na raiz em direção à parte aérea. O aumento da ISR pode ocorrer pela mediação
dos fitormônios ácido jasmônico (AJ) e ácido salicílico (AS) (RYU et al., 2004; WEI;
KLOEPPER; TUZUN, 1991).
Dependendo do hábito alimentar do inseto a ISR pode ser desencadeada via ácido
jasmônico/etileno ou via ácido salicílico, ativando diferentes conjuntos de genes associados à
defesa da planta (PANGESTI et al., 2013). Em geral, os insetos mastigadores são afetados
pelas vias de defesa mediadas pelo ácido jasmônico (HOWE; JANDER, 2008; VAN
OOSTEN et al., 2008; ZHENG et al., 2007), enquanto os insetos sugadores desencadeiam a
ISR via ácido salicílico (DE VOS et al., 2007; ZARATE; KEMPEMA; WALLING, 2007).
A ISR e a promoção de crescimento de plantas por PGPR já foi comprovada por
vários autores, como em plantas de tomate inoculadas com B. subtilis BsDN
(VALENZUELA-SOTO et al., 2010). Estudos em campo também comprovaram a eficiência
da utilização de PGPR afetando significativamente a população de crisomelídeos em plantas
de pepino, ao mesmo tempo que foi constatado que as plantas inoculadas apresentaram um
melhor desenvolvimento quanto ao tamanho e ao número de frutos (ZEHNDER et al., 1997).
O perfil de voláteis também pode ser alterado na presença de PGPR influenciando na
seleção hospedeira dos insetos. Em estudos recentes comprovou-se que a inoculação de
24
plantas de milho com Azospirillum brasilense aumentou a emissão do composto (E)-β-
cariofileno, agindo como repelente de larvas de Diabrotica speciosa onde observou-se uma
migração das larvas para as raízes das plantas sem a rizobactéria (SANTOS et al., 2014).
O grau de especialização do inseto também pode afetar as interações entre plantas,
insetos e microrganismos. Insetos herbívoros generalistas normalmente são mais afetados por
metabólitos tóxicos liberados por determinada espécie de planta, enquanto insetos
especialistas geralmente não são afetados, podendo até mesmo utilizar esses compostos para
reconhecimento de sua planta hospedeira (SCHOONHOVEN; VAN LOON; DICKE 2005).
Esse fato foi observado em Arabidopsis thaliana inoculada com Pseudomonas fluorescens e
avaliado seus efeitos sobre o desenvolvimento de um inseto especialista, Pieris rapae, e um
generalista Spodoptera exigua. Verificou-se que o inseto especialista não foi afetado pelo
mecanismo de ISR desencadeado por P. fluorescens, no entanto, a espécie generalista foi
afetada negativamente pela presença da rizobactéria (VAN OOSTEN et al., 2008). O mesmo
resultado foi observado quando se testou o efeito de A. thaliana inoculada com P. fluorescens
sobre o afídeo generalista Myzus persicae e o especialista Brevicoryne brassicae (PINEDA et
al., 2012).
25
3 METODOLOGIA
3.1 Multiplicação e inoculação de B. subtilis (GB03)
As colônias de B. subtilis (GB03) foram obtidas do acervo de microrganismos da
Texas Tech University, Lubbock, Texas, EUA. Para a repicagem do microrganismo utilizou-
se uma alça de platina flambada e fria, retirando-se as células bacterianas da placa colonizada
e deslizando a alça em zig-zag empregando o método de estriamento sobre uma nova placa de
Petri (9 cm de diâmetro) contendo o meio de cultura agar triptona de soja (TSA), composto
por 15g de caseína, 5g de peptona de soja, 5g de cloreto de sódio e 15g de ágar, para cada 1L
de água destilada. A combinação de caseína e peptona de soja fornece nitrogênio orgânico ao
meio, tornando-o nutritivo, o cloreto de sódio é responsável por manter o equilíbrio osmótico
e o ágar dá a consistência ao meio, deste modo, o meio TSA pode ser utilizado para uma série
de finalidades e suporta o crescimento de microrganismos não fastidiosos e moderadamente
fastidiosos. Posteriormente, as placas foram vedadas com papel filme e mantidas em câmara
incubadora tipo BOD à temperatura de 25±1°C e fotofase de 12 horas durante 24 horas para o
seu crescimento.
Para a inoculação das plantas com a rizobactéria, adicionou-se 10 mL de água
destilada autoclavada em cada placa contendo as colônias bacterianas e em seguida realizou-
se a raspagem com o auxílio de uma alça de Drigalski, obtendo-se uma suspensão aquosa
bacteriana. Para a quantificação das colônias, 180µL da suspensão bacteriana diluída por três
vezes foram colocados em uma Câmara de Neubauer e observados em microscópio óptico,
adequando-se até chegar a uma concentração final de 5x109 bactérias mL
-1. Após a
quantificação, adicionou-se 50µL da suspensão ao substrato juntamente com a semente de
rúcula no momento da semeadura (Figura 1).
26
Figura 1 – Metodologia utilizada para inoculação de sementes de rúcula com B. subtilis (GB03). A) Suspensão
de B. subtilis (GB03) contendo 5x109 bactérias mL
-1; B) Sementes sendo inoculadas com B. subtilis
(GB03).
3.2 Cultivo das plantas
Sementes de rúcula foram semeadas em tubetes com capacidade de 200 mL
preenchidos com substrato comercial Basaplant® e 2,5g do fertilizante Osmocote Plus® (15-
09-12). O cultivo das plantas com inoculação de B. subtilis GB03 foi realizado de acordo com
a metodologia descrita no item 3.1. As plantas foram mantidas em casa de vegetação até
completarem quarenta dias após emergência, sendo posteriormente utilizadas para a
realização de bioensaios.
3.3 Criação de P. xylostella
Para dar início à criação, foram fornecidas quarenta pupas de P. xylostella da criação-
estoque do Laboratório de Biologia e Criação de Insetos da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal. Os insetos foram criados no Laboratório de
Ecologia Química e Comportamento de Insetos, do Departamento de Entomologia e
Acarologia da ESALQ/USP, em sala climatizada, com temperatura de 25 ± 1°C, fotofase de
12 horas e umidade relativa de 70 ± 10%.
Os adultos recém-emergidos foram mantidos em gaiola de acrílico (30 cm de largura x
40 cm de altura x 30 cm de profundidade) com abertura frontal (13 cm de diâmetro) coberta
por “voile” para facilitar o manuseio dos insetos. Plantas de couve e rúcula cultivadas em
casa de vegetação foram colocadas no interior da gaiola como substrato para oviposição. A
27
alimentação dos adultos foi realizada por capilaridade, onde foram fornecidos pequenos
recipientes plásticos contendo algodão e solução de mel a 10% (Figura 2, A). Após a eclosão
das lagartas, as plantas do interior da gaiola foram substituídas por plantas novas e as lagartas
foram transferidas para potes plásticos (5 cm de altura x 15 cm de comprimento x 12 cm de
largura) e alimentadas com dieta natural a base de folhas de couve manteiga, sendo realizada
a troca de alimento diariamente até os insetos atingirem a fase pupal (Figura 2, B).
As pupas foram retiradas das folhas com o auxílio de uma pinça entomológica e
acondicionadas em potes plásticos (9 cm de diâmetro x 5 cm de altura) para obtenção dos
adultos.
Figura 2 – Criação de P. xylostella em laboratório. A) Gaiola de acrílico para manutenção dos adultos;
B) Recipiente contendo dieta natural à base de couve para alimentação das lagartas
3.4 Crescimento de plantas de rúcula
Plantas de rúcula com quarenta dias após a semeadura inoculadas e não inoculadas com
B. subtilis (GB03) foram avaliadas quanto à área foliar e ao peso seco de parte aérea. Para
isso, primeiramente as folhas das plantas foram retiradas e escaneadas para calcular a área
foliar utilizando-se o software editor de imagens ImageJ®. Em seguida, as folhas foram
mantidas em estufa a 160°C durante 72 horas, para a secagem do material com a finalidade de
se obter o peso seco da parte aérea.
3.5 Desempenho de P. xylostella em plantas de rúcula
Avaliou-se o desempenho de P. xylostella em plantas de rúcula inoculadas e não
inoculadas com B. subtilis (GB03) aos quarenta dias após a emergência, cada tratamento foi
28
composto por doze repetições. Deste modo, foram colocadas quinze lagartas de terceiro instar
previamente pesadas em cada planta. Em seguida, as plantas foram envoltas com sacos de
“voile” (20 cm de largura x 30 cm de comprimento) e amarrados com elástico para evitar a
dispersão dos insetos. As plantas foram mantidas em sala climatizada à temperatura de
25±1°C, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 horas (Figura 3).
Após 24 horas da montagem do bioensaio, as lagartas foram retiradas das plantas e
realizou-se novamente a pesagem para contabilizar o ganho de peso durante o período do
experimento. A área foliar consumida foi calculada por meio do software editor de imagens
Image J®.
Figura 3 – Bioensaio para verificar o desempenho de lagartas de P. xylostella em plantas de rúcula inoculadas e
não inoculadas com B. subtilis (GB03).
3.6 Bioensaio em olfatômetro
A resposta olfativa de fêmeas de P. xylostella foi avaliada utilizando-se um
olfatômetro em ‘Y’ para verificar a preferência do inseto quando exposto a dois odores
diferentes. Para a realização do bioensaio, previamente formou-se casais com os adultos
recém-emergidos para que ocorresse o acasalamento. Em seguida, as fêmeas fecundadas
foram individualizadas para a utilização nos testes em olfatômetro. Os ensaios foram
conduzidos em uma sala com condições controladas, mantida a 25±1°C, umidade relativa de
70±10% e fotofase de 12 horas. O olfatômetro utilizado consistiu de um tubo simples e dois
laterais cada um com 10 cm de comprimento e 2,5 cm de diâmetro. O sistema de olfatometria
foi conectado ao ‘ARS Volatile Collection System’ (ARS, Gainesville, FLA, 19 USA). Nesse
sistema, o fluxo de ar de entrada do equipamento passa por filtros de carvão, nos quais ocorre
a limpeza do ar, em seguida, o ar é empurrado para o interior das cubas de vidro fechadas
29
contendo as plantas dos tratamentos e para os braços laterais do olfatômetro por meio de
mangueiras flexíveis de Teflon®. O fluxo de ar dentro do sistema foi calibrado para 1,1 L/min
para cada braço lateral do olfatômetro (Figura 4).
Em cada avaliação, liberou-se uma fêmea no tubo central do olfatômetro e observou-
se por um período máximo de cinco minutos, registrando-se a escolha entre os tratamentos. A
escolha do inseto por um dos tratamentos foi considerada após o cruzamento de uma linha que
divide a metade dos braços laterais. A cada três avaliações os lados do olfatômetro foram
invertidos e a cada dez repetições o olfatômetro e as plantas foram trocados.
Para avaliar os efeitos dos odores das plantas de rúcula na resposta olfativa de P.
xylostella, utilizou-se as seguintes combinações de tratamentos: (i) Branco (cuba sem planta)
vs. Controle (Plantas não inoculadas com B. subtilis (GB03)) e (ii) Controle vs. Planta
inoculada com B. subtilis (GB03). Cada combinação foi constituída de 30 repetições.
Figura 4 - Sistema de olfatometria utilizado para verificar a resposta olfativa de fêmeas fecundadas de P.
xylostella quando exposta a diferentes odores
3.7 Teste de preferência de oviposição de P. xylostella
A preferencia de ociposição de P. xylostella por plantas de rúcula inoculadas ou não
inoculadas com B. subtilis (GB03) foi avaliada em arena de isopor (8L, 26 cm de
comprimento, 11 cm de largura e 22 cm de altura). Fêmeas fecundadas foram inseridas
individualmente nas caixas contendo uma planta controle e uma planta inoculada, totalizando
30
doze repetições. Para evitar a fuga dos insetos, a superfície superior da caixa foi vedada com
tecido “voile” (Figura 5). As fêmeas permaneceram nessas condições durante 24 horas e após
12 horas as plantas foram trocadas para a contagem do número de ovos de cada período do
dia.
Figura 5 - Arenas utilizadas para testes de preferência de oviposição de P. xylostella mediante dois tratamentos
diferentes. A) Interior da arena e local de inserção dos tubetes com os tratamentos; B) Arena
contendo os tratamentos e coberta com “voile” para evitar a saída dos insetos
3.8 Coleta de voláteis
O sistema de coleta de voláteis de plantas utilizado foi baseado na metodologia
descrita por Turlings et al. (1998). As plantas de rúcula foram acondicionadas em câmaras de
vidro (10 cm de diâmetro x 5 cm de altura) previamente lavadas com acetona e hexano e
acopladas ‘ARS Volatile Collection System’ (ARS, Gainesville, FLA, 19 USA), com fluxo de
entrada de ar de 1.1 L/min, assim como o de saída, o qual foi mantido por meio de uma
bomba a vácuo conectada a filtros com 30 mg de polímero adsorvente Super-Q® conectados
às câmaras com plantas. As plantas de rúcula foram mantidas nesse sistema durante 24 horas,
em sala climatizada, com temperatura de 25±1°C, umidade relativa de 70±10% e fotofase de
12 horas. Foram coletados voláteis de oito plantas inoculadas e não inoculadas com B. subtilis
GB03. Os filtros de polímero foram trocados a cada 12 horas (7:00 horas e as 19:00), com o
objetivo de discriminar os voláteis emitidos no decorrer do dia e da noite (Figura 6).
Posteriormente, os filtros foram eluídos com 150 μL de solvente diclorometano. Os extratos
foram armazenados em frascos de vidro, vedados e mantidos em um freezer a -30ºC até a
análise.
31
A quantificação dos compostos foi realizada em GC-FID com coluna HP5, com o
injetor ajustado em splitless, detector de ionização de chama (DIC) e hélio como gás de
arraste (24 cm/s). A identificação dos compostos foi feita por meio de cromatografia gasosa
acoplado à espectrometria de massas (GC-MS- 2010 Plus) com coluna capilar HP1 MS (30m
x 0,25mm x 0,25μm). Após a injeção e uma alíquota de1 μl de cada amostra, a temperatura da
coluna foi mantida a 40°C por 1 min, elevada a uma velocidade de 5°C/min até atingir 150°C
e depois reduzida para 20°C/min até 250°C. Os compostos foram identificados pela
comparação dos espectros das amostras com a biblioteca NIST08, pelo cálculo do Índice de
Kovats (KI) utilizando padrões de n-alcano (C7-C30) e os tempos de retenção de cada
composto, assim como pela comparação dos espectros com os dos respectivos compostos
sintéticos.
Figura 6 – Sistema utilizado para a coleta de voláteis, ‘ARS Volatile Collection System’, composto por dois
ARS responsáveis pela entrada de ar nas cubas contendo as plantas de rúcula, conectados a elas por
mangueiras de teflon e filtro de carvão e uma bomba à vácuo utilizada para o fluxo de saída do ar,
conectada às cubas por filtros de polímero
3.9 Análise Estatística
A normalidade e homogeneidade dos dados foram verificadas pelos testes de Shapiro-
Wilk e Bartlett, respectivamente. Os dados referentes ao peso de lagartas de P. xylostella, a
área foliar e biomassa seca de plantas foram analisados pelo teste t não pareado, enquanto que
32
os dados correspondentes ao teste de preferência de oviposição foram analisados pelo teste de
Wilcoxon, não paramétrico. As proporções obtidas nos ensaios de preferência de P. xylostella
em olfatometria foram analisadas pelo teste de qui-quadrado. Estas análises foram conduzidas
no pacote estatístico R (versão 3.0.3) ( www.r-project.org).
Os dados referentes à emissão total de voláteis foram analisados utilizando o teste de
Tukey. Para averiguar se havia diferença na quantidade de cada composto entre os
tratamentos utilizou-se o teste de análise de variância não paramétrico Kruskal-Wallis
ranqueado.
Os dados de quantidade relativa (área de pico) dos voláteis emitidos pelas plantas de
rúcula foram avaliados por uma análise exploratória, a análise dos componentes principais
(ACP ou PCA – “Principal Component Analysis”) no pacote estatístico R (versão 2.15.3)
(www.r-project.org).
O PCA é um método de projeção de dados (ERIKSSON et al., 2001) que os
correlaciona de acordo com a máxima variância. A variação dos dados originais é condensada
em um número menor de dados, perdendo o mínimo possível de informação, denominados de
componentes principais (OLIVEIRA, 2007). As áreas de pico de cada composto foram
transformadas por log10 para posteriormente analisa-las por PCA (TOOKER; DE MORAES,
2007). O PCA faz uma correlação entre as variáveis, o coeficiente de correlação (r) varia
entre 1 e -1, deste modo, quanto mais próximos forem desses valores forem os valores de r de
cada variável maior é a correlação entre elas.
33
4 RESULTADOS
4.1 Área foliar e biomassa seca de plantas de rúcula inoculadas e não inoculadas com B.
subtilis (GB03)
Observou-se que as plantas de rúcula quando em simbiose com B. subtilis (GB03)
apresentaram maior área foliar em relação às plantas que não foram inoculadas com a PGPR
(Controle) (n=8; F= 12,603; P<0,006; Figura 7).
Figura 7 – Área foliar (cm²) de plantas de rúcula, aos quarenta dias após a semeadura, inoculadas e não
inoculadas (Controle) com B. subtilis (GB03). (*) Indica que os tratamentos diferem
significativamente entre si pelo teste t não pareado (P<0,05)
Do mesmo modo, verificou-se que as plantas de rúcula quando inoculadas com B.
subtilis (GB03) apresentaram maiores valores de peso seco da parte aérea (n=8; F=9,309;
P<0,01; Figura 8).
34
Figura 8 – Peso seco (g) da parte aérea de plantas de rúcula inoculadas e não inoculadas (Controle) com B.
subtilis (GB03) aos quarenta dias após a semeadura. (*) Indica que os tratamentos diferem entre si
pelo teste t não pareado (P<0,05)
4.2 Ganho de peso de lagartas de P. xylostella e área foliar consumida de plantas de
rúcula
Quanto ao peso das lagartas de terceiro instar de P. xylostella submetidas à
alimentação em plantas de rúcula na presença e ausência de simbiose com B. subtilis (GB03)
durante 24 horas, pode-se constatar que estas apresentaram ganho de peso similar em ambos
tratamentos (n=12; F=3,71; P<0,06; Figura 9).
35
Figura 9 – Ganho de peso de lagartas de terceiro instar de P. xylostella submetidas à alimentação durante 24
horas em plantas de rúcula inoculadas e não inoculadas (Controle) com B. subtilis (GB03). Não
houve diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t não pareado (P<0,05)
Entretanto, observou-se que o consumo da área foliar pelas lagartas praticamente
dobrou em plantas controle (não inoculadas) em relação às plantas inoculadas com a
rizobactéria (n=12; F=20,985; P<0,0001; Figura 10).
36
Figura 10 – Área foliar de plantas de rúcula inoculadas e não inoculadas (Controle) com B. subtilis (GB03)
consumida em 24 horas por lagartas de P. xylostella de terceiro instar. (*) Indica diferença
significativa entre os tratamentos pelo teste t não pareado (P<0,05)
4.3 Preferência de oviposição de P. xylostella
Ao testar-se o olfatômetro em “Y” notou-se que as fêmeas fecundadas de P. xylostella não
foram capazes de distinguir entre os odores dos tratamentos avaliados, não sendo observada
diferença na resposta olfativa do inseto (n=30; χ²=1,49; P<0,715; Figura 11).
Figura 11 - Resposta olfativa de P. xylostella quando submetida a plantas de rúcula inoculadas e não inoculadas
(Controle) com B. subtilis (GB03). Não houve diferença significativa pelo teste qui-quadrado
(P<0,05)
37
No entanto, ao avaliar-se a preferência de oviposição de P. xylostella em gaiolas de
isopor, disponibilizando tanto pistas visuais quanto olfativas aos insetos, constatou-se maior
número de ovos em plantas de rúcula não inoculadas com B. subtilis (GB03), tanto no período
da noite (W=368,5; P<0,005; Figura 12) quanto durante o dia (W=589; P<0,04; Figura 12).
Figura 12 – Oviposição de P. xylostella em plantas de rúcula inoculadas e não inoculadas (Controle) com B.
subtilis (GB03) nos períodos da noite e do dia. (*) Indica que os tratamentos diferem
significativamente entre si pelo teste não paramétrico de Wilcoxon (P<0,05)
4.4 Voláteis emitidos por plantas de rúcula
Ao analisar a quantidade total de compostos orgânicos voláteis (COV) emitidos pelas
plantas de rúcula, pode-se perceber que todos os tratamentos emitiram quantidades
semelhantes de voláteis. Deste modo não foi encontrada diferença entre os tratamentos
avaliados pelo teste de Tukey (Figura 14).
38
Figura 14 – Média relativa (± EP) do total de voláteis coletados durante o dia e noite de plantas de rúcula
inoculadas e não inoculadas (Controle) com B. subtilis (GB03). Letras iguais indicam que não
houve diferença significativa entre os tratamentos pelo teste de Tukey (P<0,05)
Por outro lado, observou-se diferenças no perfil de voláteis dos tratamentos analisados
(Tabela 1). Foram identificados cinco compostos liberados pelas plantas de rúcula,
inoculadas e não inoculadas com a rizobactéria GB03: (Z)-3- hexenol, 2-ethyl-1-decanol,
limonene, 2-ethyl-1-hexanol e α-farnesene e outros quatro compostos foram identificados
como voláteis de planta por meio de comparação dos espectros, no entanto, ainda é necessária
a confirmação exata dos nomes dos compostos. Plantas de rúcula inoculadas e não inoculadas
com B. subtilis (GB03) liberaram o composto (Z)-3-hexenol somente durante o dia (n=8;
F=15,96; P<0,001), e estas últimas não emitiram 2-ethyl-1-decanol durante a noite,
diferentemente dos demais tratamentos (n=8; F=11,28; P<0,01). O composto não identificado
4, foi emitido em maiores concentrações nas plantas não inoculadas durante à noite,
comparativamente ao dia, porém não apresentou diferença das plantas inoculadas em ambos
os períodos (n=8; F=8,27; P<0,04).
39
Tabela 1 - Composição dos perfis de voláteis liberados no decorrer do dia e da noite, por plantas de rúcula
inoculadas e não inoculadas com B. subtilis (GB03), classe dos compostos e Kovats (KI)
Composto Classe KI
(+)GB03
Dia
(-)GB03
Dia
(+)GB03
Noite
(–)GB03
Noite
ng/planta/12h (Média ± EP)
não indentificado 1
0,81 ± 0,175a 0,75 ± 0,06
a 1,09 ± 0,43
a 0,80 ± 0,18
a
não indentificado 2
0,99 ± 0,20a 0,88 ± 0,05
a 1,30 ± 0,60
a 0,82 ± 0,18
a
(Z)-3-hexenol Álcool
0,23 ± 0,09a 0,26 ± 0,19
a 0 ± 0
b 0 ± 0
b
2-ethyl-1-decanol Cetona 1009 2,16 ± 1,14a 0,58 ± 0,25
a 0,18 ± 0,05
a 0 ± 0
b
Limonene Sesquiterpeno 1022 0,26 ± 0,12a 0,25 ± 0,10
a 0,40 ± 0,14
a 0,34 ± 0,08
a
2-ethyl-1-hexanol Álcool 1046 0,61 ± 0,29a 0,33 ± 0,13
a 0,93 ± 0,36
a 0,72 ± 0,34
a
não identificado 3
1117 1,28 ± 0,55a 1,10 ± 0,36
a 1,99 ± 0,79
a 2,41 ± 0,71
a
não identificado 4
1281 0,12 ± 0,06ab
0 ± 0b 0,11 ± 0,05
ab 0,34 ± 0,12
a
α-farnesene Sesquiterpeno 1491 0,15 ± 0,04a 0,13 ± 0,03
a 0,22 ± 0,06
a 0,22 ± 0,08
a
Letras iguais não diferem entre si pelo teste de Kruskall Wallis (P<0,05).
4.5 Análise dos componentes principais (PCA)
O resultado do PCA mostrou que os dois primeiros componentes, PC1 e PC2,
representam 88,92% do total da variância, com 51,17 e 37,75%, respectivamente. O PC1
relacionou-se positivamente com todos os tratamentos, enquanto o PC2 agregou os
tratamentos diurnos e os separou dos noturnos, de acordo com as suas similaridades. O “plot”
das observações foi utilizado para definir qual dos compostos apresentaram maior
contribuição para a separação dos tratamentos. Os compostos (Z)-3-hexenol e 2-ethyl-1-
decanol, foram os principais responsáveis pela agregação dos tratamentos diurnos, já o
composto não identificado 4 foi o responsável pela agregação das variáveis noturnas. Os
demais compostos, estão localizados próximos à zero, indicando que exerceram baixa
influência na separação dos tratamentos (Figura 15).
40
Figura 15 – Análise dos componentes principais (PCA), PC1 com 51,17% e PC2 com 37,75%, dos tratamentos
com plantas de rúcula: inoculada com B. subtilis (GB03) Dia; não inoculada Dia (Controle Dia);
inoculada com B. subtilis (GB03) Noite; e não inoculada Noite (Controle Noite); bem como dos
compostos 2-ethyl-1-decanol, (Z)-3-hexenol, 2-ethyl-1-hexanol, limoneno, α-farneseno e não
identificados (NI) (P<0,05)
41
5 DISCUSSÃO
As PGPR são microrganismos que ocorrem naturalmente na região da rizosfera,
estando direta ou indiretamente envolvidas na promoção de crescimento das plantas. Além
disso, estimulam o desenvolvimento das plantas, aumentando sua produtividade, peso,
número de sementes germinadas e resistência contra estresses bióticos e abióticos. Algumas
rizobactérias como cepas de B. subtilis, B. amyloliquefaciens, e Enterobacter cloacae, são
capazes de promover o crescimento de plantas por meio da liberação de voláteis (RYU et al.,
2003).
No presente estudo, constatou-se que plantas de rúcula inoculadas com B. subtilis
(GB03) apresentaram maior área foliar (Figura 7) e maior biomassa seca (Figura 8)
comparadas as plantas que não foram tratadas com a rizobactéria. A promoção de crescimento
e aumento do peso fresco também foi observada em experimentos “in vitro” com plantas de
rúcula em contato com voláteis de B. subtilis (GB03) (CHOU, 2013). Do mesmo modo,
estudos anteriores com Arabidopsis thaliana demonstraram que as plantas quando em
interação com B. subtilis (GB03) apresentaram melhor crescimento e aumento da eficiência
fotossintética (RYU et al., 2003; ZHANG et al., 2008).
A utilização de PGPR possui grande importância para os ecossistemas agrícolas, pois
diminui a utilização de defensivos agrícolas, e seus danos sobre o ambiente (WEYENS et al.,
2009; YANG; KLOEPPER; RYU, 2009). Microrganismos benéficos podem auxiliar as
plantas contra patógenos e insetos herbívoros. Os efeitos desses microrganismos sobre a
herbivoria de insetos podem apresentar elevada variação (PINEDA et al, 2013), uma vez que
as plantas atuam como mediadoras de interações multitróficas em organismos benéficos e
prejudiciais a elas (DICKE; VAN LOON; SOLER, 2009; KAPLAN; DENNO, 2007;
PIETERSE; DICKE, 2007; SCHOONHOVEN; VAN LOON; DICKE, 2005) Deste modo, as
plantas podem atuar de maneira bidirecional entre membros de comunidades abaixo e acima
do solo, como PGPR e insetos herbívoros (BEZEMER; VAN DAM, 2005; ERB et al., 2009;
VAN DER PUTTEN et al., 2001) .
A promoção de crescimento de plantas por PGPR tem sido considerado o principal
mecanismo subjacente às interações entre microrganismos, plantas e insetos e mais
recentemente tem sido explorado o papel da ISR em tais interações (BEZEMER; VAN DAM,
2005; VALENZUELA-SOTO et al., 2010; VANNETTE; HUNTER, 2009; VAN OOSTEN et
al., 2008). Acredita-se que a influência das interações em microrganismo, plantas e insetos
podem variar de acordo com o grau de especialização do inseto. Insetos generalistas
42
normalmente são mais afetados por metabólitos tóxicos de certas espécies de plantas que
insetos especialistas, que muitas vezes podem usar tais compostos para localizar a plantas
hospedeira (SCHOONHOVEN; VAN LOON; DICKE, 2005).
No entanto, a ideia que os insetos especialistas são imunes às defesas da planta
hospedeira é muito difundida, porém errônea. Há diversos estudos que mostram os impactos
negativos das defesas da planta hospedeira sobre insetos especialistas (ADLER; SCHMITT;
BOWERS, 1995; AGRAWAL; KURASHIGE, 2003; BERENBAUM; ZANGERL; LEE,
1989; CORNELL; HAWKINS, 2003; ZALUCKI; BROWER; ALONSO‐M, 2001). Ao
mesmo tempo que outro estudo com A. thaliana mostra que o especialista Pieris rapae não foi
afetado pela interação entre Pseudomonas fluorescens e planta, enquanto que o generalista
Spodoptera exigua foi afetado negativamente (VAN OOSTEN et al., 2008).
Neste estudo constatou-se que lagartas de P. xylostella não foram afetadas por
antibiose, ou seja, em ambos os tratamentos testados, com e sem a inoculação de B. subtilis
(GB03), não houve diferença no ganho de peso das lagartas (Figura 9). Por outro lado,
observou-se efeitos do tipo antixenose, onde as lagartas alimentaram-se mais de plantas de
rúcula não inoculadas com B. subtilis (GB03), apresentando uma área consumida
significativamente maior do que plantas de rúcula inoculadas com a rizobactéria (Figura 10).
Da mesma forma, estudos realizados com duas espécies de Lepidoptera especialistas P. rapae,
P. xylostella. e uma generalista Mamestra brassicae, em cultivares de Brassica oleracea,
constataram que P. xylostella e M. brassicae apresentaram desempenho similar em todas as
cultivares testadas (POELMAN et al., 2008).
Quanto à preferência de oviposição de P. xylostella foi possível verificar que as
fêmeas não apresentaram distinção entre os odores de plantas de rúcula inoculadas e não
inoculadas com B. subtilis (GB03) (Figura 11). Entretanto, quando colocadas em arenas em
contato com as plantas observou-se maior oviposição em plantas não inoculadas com a
rizobactéria, tanto no período do dia quanto durante a noite (Figura 12). Do mesmo modo,
observou-se maior número de ovos no período da noite em relação ao dia (Figura 13).
Sabe-se que adultos da traça-das-crucíferas possuem hábito noturno e as fêmeas
normalmente começam a atividade de oviposição no final da tarde e continuam no decorrer da
noite, sendo contatado o pico de oviposição entre às 19:00 e 20:00 horas (PIVNICK et al.,
1990). A ausência de luz durante o dia pode servir de estímulo para oviposição, no entanto,
quando expostas à luz durante a noite a oviposição não é completamente inibida
(TABASHNIK, 1985). Além da luminosidade, outros fatores podem influenciar na
oviposição do inseto, como a emissão de voláteis de plantas, temperatura, tricomas, textura e
43
coloração das plantas (PIVNICK et al., 1990; TABASHNIK, 1985). Tais fatores podem
explicar os resultados obtidos neste trabalho, uma vez que a presença da rizobactéria pode
alterar a composição do perfil de voláteis da planta e suas características fisiológicas e
morfológicas.
Entre os tratamentos avaliados não foi observada diferença significativa entre a
quantidade total de voláteis emitidos (Figura 14), todavia observou-se diferença qualitativa
entre os compostos. O composto (Z)-3-hexenol foi emitido somente nos tratamentos diurnos e
concentrações de 2-ethyl-1-decanol não foram observadas no tratamento controle no período
da noite (Tabela 1). Esses dois compostos foram os responsáveis por agrupar os tratamentos
controle e inoculado com B. subtilis (GB03) do dia e separá-los dos tratamentos noturnos que
foram agrupados principalmente devido ao composto não identificado 4, na análise de
componentes principais (PCA). Os demais compostos encontrados nos tratamentos, 2-ethyl-
1-hexanol, limoneno, α-farneseno e os compostos não identificados 1, 2 e 3 não apresentaram
diferença significativa na concentração emitida em cada tratamento e não apresentaram
grande influência do gráfico do PCA, devido ao fato de encontrarem-se próximos à zero.
O composto (Z)-3-hexenol pode afetar diretamente a fisiologia e comportamento dos
insetos herbívoros, tanto positivamente quanto negativamente. Alguns estudos com
eletroantenografia (EAG) já demostraram que os insetos apresentam diferentes respostas ao
composto em questão (BRUCE; WADHAMS; WOODCOCK, 2005). Deste modo, acredita-se
que o composto (Z)-3-hexenol pode influenciar no comportamento de oviposição de P.
xylostella, uma vez que não foi observado concentrações desse composto durante a noite,
sendo assim sua presença no perfil de voláteis pode agir negativamente no comportamento de
oviposição do inseto. Contudo, testes com o composto em eletroantenografia ainda devem ser
realizados para comprovar tal hipótese. Quanto ao composto 2-ethyl-1-decanol, sugere-se que
a emissão desse composto pode ser influenciada pela presença de B. subtilis (GB03), uma vez
que sua emissão já foi detectada por cromatografia gasosa no perfil de voláteis de outros
microrganismos como o fungo Trichoderma harzianum FA1132 (SIDDIQUEE et al., 2012).
O limoneno encontrado em concentrações similares em todas os tratamentos
analisados, é um metabólito secundário emitido pelas plantas e possui efeito inseticida já
comprovado, podendo ser utilizado no controle de pragas na agricultura orgânica. A
concentração interna de limoneno nas plantas pode acarretar efeitos significativos no
comportamento e consumo alimentar de insetos herbívoros (IBRAHIM; KAINULAINEN;
AFLATUNI, 2008). O α-farneseno é um hidrocarboneto poliinsaturado que está presente em
diversas espécies de plantas, alguns trabalhos realizados utilizando esse composto observaram
44
alterações no comportamento e atratividade de insetos (HERN; DORN, 1999;
SUTHERLAND; HUTCHINS, 1972), deste modo, pode-se utilizá-lo em estudos posteriores
para verificação dos seus efeitos isoladamente sobre P. xylostella. Constatou-se ainda a
emissão do composto 2-ethyl-1-hexanol em todas os tratamentos analisados de forma similar.
Em estudos realizados com plantas de trigo também foi demonstrado que tais plantas
emitiram 2-ethyl-1-hexanol em altas concentrações durante o seu período vegetativo, sendo
observada uma queda na emissão dos níveis do composto durante a floração e enchimento de
grãos (BATTEN; STTUTE; WHELLER, 1995). Esses fatos sugerem que 2-ethyl-1-hexanol é
um composto ligado ao desenvolvimento vegetativo das plantas, desempenhando papel
importante no período de crescimento.
45
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo mostrou que a inoculação de plantas de rúcula com B. subtilis (GB03)
promoveu melhor desenvolvimento nas plantas, proporcionando maior área foliar e maior
peso seco de plantas em relação às plantas não inoculadas. A presença da rizobactéria também
proporcionou defesas do tipo antixenose contra o ataque de P. xylostella, o que fez com que o
inseto se alimentasse menos de plantas inoculadas com B. subtilis (GB03) em relação às não
inoculadas, no entanto, defesas do tipo antibiose não foram observadas, não diferindo no peso
dos grupos de lagartas submetidos a ambos tratamentos. Notou-se que a simbiose da planta
com a PGPR teve influência sobre o comportamento de oviposição do inseto ao serem
submetidos a pistas visuais e olfativas. No entanto, ao serem submetidas apenas a pistas
olfativas no olfatômetro em “Y”, as fêmeas adultas de P. xylostella não distinguiram entre os
odores dos tratamentos. Não foi observada diferença significativa entre a quantidade total de
voláteis emitidos pelos tratamentos, entretanto, o perfil de voláteis variou qualitativamente,
onde três compostos apresentaram diferença significativa na sua concentração nos diferentes
tratamentos testados: (Z)-3-hexanol, 2-ethyl-1-decanol e composto não identificado 4. A
identificação de todos os compostos ainda deve ser realizada, assim como testes individuais
em eletroantenografia com os compostos encontrados para comprovar a influência exercida
sobre o comportamento do inseto.
46
47
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