universidade de lisboa faculdade de...

DIAGNÓSTICO

ORIENTAÇÃO : DR. JOSÉ M

M

Diana Isabel Heitor Delgado

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FARMÁCIA

MONOGRAFIA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DO VÍRUS DE EPSTEIN BARR

M IGUEL AZEVEDO PEREIRA

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS

Diana Isabel Heitor Delgado

LISBOA 2011

BARR


Mestrado em Análises Clínica Diana Delgado 109

ÍNDICE

Resumo .................................................................................................................... 112

Abstract .................................................................................................................... 112

Introdução ................................................................................................................. 113

Enquadramento Teórico ........................................................................................... 114

Família Herpesviridae ............................................................................................... 116

Estrutura ............................................................................................................... 117

Replicação ............................................................................................................ 118

Vírus de Epstein-Barr ................................................................................................ 120

Replicação Viral .................................................................................................... 120

Epidemiologia ........................................................................................................ 122

Manifestações Clínicas ......................................................................................... 123

Mononucleose InfeCciosa .................................................................................. 123

Poder Oncogénico ............................................................................................. 124

Métodos diagnósticos do EBV .................................................................................. 126

Testes não Específicos ......................................................................................... 126

Aminotransferases ............................................................................................. 126

Hemograma ....................................................................................................... 126

Pesquisa de Anticorpos Heterófilos ................................................................... 127

Paul-Bunnel ................................................................................................... 128

Paul-Bunnel-Davidsohn .................................................................................. 128

Monoteste ...................................................................................................... 128

Testes específicos................................................................................................. 129

Anticorpos Específicos do EBV .......................................................................... 129

Técnicas Laboratoriais ................................................................................... 130

Imunofluorescência Indireta ........................................................................ 131

Ensaios Imunoenzimáticos (ELISA/EIA) ..................................................... 131



Teste de avidez .......................................................................................... 132

Resultados serológicos e sua interpretação ................................................... 133

Carga Viral do EBV ............................................................................................ 134

Conclusão ................................................................................................................. 135

Bibliografia ................................................................................................................ 136



ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 - Herpes Vírus16 .......................................................................................... 117

Figura 2 - Ciclo de replicação do Herpes vírus10 ....................................................... 119

Figura 3 - Ciclo de Replicação do EBV ..................................................................... 120

Figura 4 - Linfócitos Reativos17 ................................................................................. 127

Figura 5 - Cassetes de reação .................................................................................. 129

Figura 6 - Abreviaturas e descrições dos antigénios virais9 ...................................... 130

Figura 7 - Imunofluorescência Indireta ...................................................................... 131

Figura 8 - ELISA indireto ........................................................................................... 132

Figura 9 - Resultados serológicos e sua interpretação9 ............................................ 134



RESUMO

O Epstein Barr é um vírus pertencente à família Herpesviridae, que apresenta tropismo

para os linfócitos B. A primoinfeção pode ser assintomática, mas pode também

manifestar-se através da mononucleose infecciosa e em casos muito específicos pode

conduzir a síndromas linfoproliferativos do tipo linfoma.

É um vírus ubiquitário e com distribuição mundial e a infeção por este vírus

transmite-se pela saliva e objetos contaminados.

A sua deteção é feita através da realização de várias técnicas laboratoriais, técnicas

essas que estão englobadas em dois tipos de técnicas, as não especificas

(aminotransferases, hemograma e pesquisa de anticorpos heterófilos) e as especificas

(doseamento de anticorpos especificos do EBV e deteção de carga viral).

Este trabalho permitiu aprofundar os conhecimentos sobre este vírus, assim como as

respetivas técnicas de diagnóstico laboratorial, sendo a existência destes métodos de

diagnóstico e a sua complementaridade determinantes para um diagnóstico correto da

infeção por EBV.

ABSTRACT

The Epstein Barr virus is a virus belonging to the Herpesviridae family, which has

tropism for B lymphocytes. The primary infection may be asymptomatic, but can also

manifest as infectious mononucleosis and in very specific cases can lead to lymph

proliferative syndromes as lymphoma. It is a ubiquitous virus, with worldwide

distribution. Infection with this virus is transmitted by saliva and contaminated objects.

Its detection is done by performing various laboratory techniques, which are mainly of

two types: not specific (aminotransferase, CBC and heterophil antibodies) and specific

(assay of EBV-specific antibodies and detection viral load).

This work allows further knowledge about this virus, as well as the respective

laboratory diagnostic techniques, and the existence of these diagnostic methods and

their complementary determining factors for a correct diagnosis of EBV infection.



INTRODUÇÃO

No âmbito do Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia, foi solicitada

a elaboração de uma monografia. O tema escolhido foi o diagnóstico laboratorial do

Vírus de Epstein Barr, que versa os seguintes conteúdos:

- Conceitos introdutórios;

- Especificações do Vírus de Epstein Barr;

- Métodos de Diagnóstico.

A presente monografia tem como objetivo produzir um documento que sistematize a

informação existente sobre o diagnóstico deste vírus, e com isso demonstrar os

conhecimentos que me permitam completar com êxito o Mestrado em Análises

Clínicas.



ENQUADRAMENTO TEÓRICO

A Virologia é o estudo dos vírus e das suas propriedades, sendo que os vírus são as

menores partículas infecciosas, cujo diâmetro varia de 18 nm a quase 300 nm

(partículas com menos de 200 nm não podem ser observadas ao microscópio ótico).

Muitos destes microrganismos estão associados a patologias humanas. Os vírus

consistem numa molécula de ADN ou ARN e proteínas associadas, necessárias para

a replicação e desenvolvimento da doença (patogenia). Esses componentes estão

circundados por uma camada proteica, com ou sem invólucro lipídico. Os vírus são

verdadeiros parasitas, necessitando de células hospedeiras para a sua replicação, por

este motivo o desenvolvimento de uma infeção viral numa população implica a

existência de:

- Um vírus (agente patogénico transmissível);

- Um modo de transmissão, que varia de vírus para vírus (via fecal-oral, via aérea, via

sexual, via salivar, via iatrogénica, transmissão por animais e entre pessoas-animais e

vetores);

- Indivíduos, membros de uma coletividade, aptos a receber o agente infecioso10.

Os vírus causam doença após romperem as barreiras protetoras normais do corpo,

escaparem ao controlo imunológico e matarem células de um tecido importante (por

exemplo do cérebro) ou desencadearem resposta imunológica e inflamatória

destrutiva. O resultado da infeção viral é determinado pela natureza do vírus, pela

interação entre o vírus e o hospedeiro e pela resposta do hospedeiro à infeção.

A resposta imunológica constitui o melhor tratamento, mas frequentemente contribui

para a patogenia da infeção viral. O tecido alvo do vírus determina a natureza da

doença e dos seus sintomas. Fatores virais e do hospedeiro determinam a gravidade

da doença. Esses fatores incluem a carga viral, o tamanho do inóculo e o estado geral

de saúde da pessoa infetada. A capacidade com que a resposta imunológica do

indivíduo infetado controla a infeção determina a gravidade e a duração da doença.

Uma determinada doença pode ser causada por vários vírus que possuem tropismo

tecidular comum (por exemplo, hepatite, fígado; encefalite, sistema nervoso central).

Por outro lado, um determinado vírus pode causar diferentes doenças ou nenhum

sintoma. Por exemplo o vírus do herpes simples tipo 1 pode causar gengivoestomatite,

faringite, herpes labial, herpes genital, encefalite ou ceratoconjuntivite, dependendo do

tecido afetado, ou pode não causar nenhuma doença. Embora geralmente benigno,



esse vírus pode tornar-se potencialmente fatal num recém-nascido ou num

imunodeprimido.

Numerosos vírus codificam fatores de virulência que promovem a eficiência da

replicação e transmissão virais, o acesso e ligação do vírus à célula, ou o facto do

vírus fugir às defesas do hospedeiro. Esses fatores podem não ser essenciais para o

crescimento do vírus em células in vitro, mas são necessários para a patogenicidade

ou para a sobrevivência do vírus no hospedeiro. A perda desses fatores de virulência

resulta na atenuação do vírus.

No organismo, a doença viral progride através de etapas definidas, de forma

semelhante à replicação viral na célula. As etapas são as seguintes:

- Aquisição (entrada no organismo);

- Início da infeção no local de entrada;

- Período de incubação, quando o vírus se replica e pode disseminar-se para um local

secundário.

O período de incubação pode ocorrer sem sintomas (assintomático) ou pode produzir

sintomas iniciais pouco específicos. Os sintomas da doença são provenientes da lesão

tecidular e dos efeitos sistémicos e são causados pelo vírus e pelo sistema

imunológico. Esses sintomas podem continuar através da fase de convalescença,

quando o organismo recupera da infeção. Em geral, o indivíduo desenvolve uma

memória imunológica para futura proteção contra um contacto semelhante com o

mesmo vírus.

O vírus consegue penetrar no organismo através de soluções de continuidade da pele

ou através das membranas mucoepiteliais que revestem os orifícios do corpo (olhos,

vias aéreas, boca, órgãos genitais e trato gastrointestinal). Por outro lado, a pele é

uma excelente barreira à infeção, e os orifícios são protegidos pelas lágrimas, pelo

muco, pelo epitélio ciliado, ácido gástrico, bílis e imunoglobulina A. Após penetrar no

organismo, o vírus replica-se nas células que expressam recetores virais e que

possuem maquinaria biossintética apropriada. Numerosos vírus iniciam a infeção na

mucosa oral e nas vias aéreas superiores. Os sintomas podem acompanhar a

replicação viral no local de entrada. O vírus pode replicar-se e permanecer no local de

entrada ou pode disseminar-se para outros tecidos através da corrente sanguínea,

através dos fagócitos mononucleares e sistema linfático ou através das células

cerebrais, sendo a corrente sanguínea e o sistema linfático os principais meios de

transferência viral no organismo.



A infeção pode resultar numa rápida replicação dos microrganismos e destruição das

células infetadas, ou numa prolongada relação latente com a célula hospedeira, com

uma possível integração da informação genética viral no genoma do hospedeiro. Os

fatores que determinam quais desses dois rumos será seguido são apenas

parcialmente compreendidos, mas são as células que os vírus infetam, a capacidade

intrínseca dos vírus e o resultado da infeção que ditam a natureza da manifestação

clínica.

FAMÍLIA HERPESVIRIDAE

A família Herpesviridae engloba mais de cem vírus, que infetam muitos tipos de

vertebrados. Estes vírus são ubíquos, induzem uma grande variedade de doenças e,

após primoinfeção, permanecem no organismo sob forma latente. As infeções,

geralmente benignas, podem contudo causar, em indivíduos imunodeprimidos,

morbilidade e mortalidade significativas.

Os herpesvírus humanos são classificados em três subfamílias com base em

diferentes características virais (estrutura do genoma, tropismo celular, efeito

citopatológico e local de infeção latente), bem como na patogenia da doença e suas

manifestações. Estas subfamílias são: Alphaherpesvirinae (α-herpesvirinae),

Betaherpesvirinae (β-herpesvirinae) e Gammaherpesvirinae ( γ-herpesvirinae).

Foram caracterizados até ao momento oito herpesvírus patogénicos para o homem: o

Herpesvirus simples ou simplex tipos 1 e 2 (HSV – 1 e HSV – 2), o Vírus da varicela e

da zona ou Vírus varicela-zóster (VZV), o Citomegalovirus (CMV) ou o Vírus das

inclusões citomegálicas, o Vírus de Epstein-Barr (EBV), o Herpesvirus humano tipo 6

(HHV – 6), o Herpesvirus humano tipo 7 (HHV – 7) e o Herpesvirus humano tipo 8

(HHV – 8), estando este último associado ao sarcoma de Kaposi.

Os herpesvírus são um importante grupo de grandes vírus de ADN com as seguintes

características em comum: morfologia do virião, forma básica de replicação e

capacidade de estabelecer infeções latentes e recorrentes. A imunidade mediada por

células é também importante no controlo da infeção por esses vírus e na produção de

sintomas. Os herpesvírus codificam para proteínas e enzimas que facilitam a

replicação e interação do vírus com o hospedeiro. Estes vírus podem causar infeções

líticas, persistentes, latentes/recorrentes e, no caso do EBV, as células infetadas

podem ser transformadas por este vírus, de modo a que por exemplo se multipliquem

indefinidamente, podendo por isso levar ao desenvolvimento de tumores.



As infeções por herpesvírus são comuns, e os vírus são ubíquos, mas felizmente estes

vírus codificam para proteínas/enzimas que se podem constituir em alvos de

moléculas antivirais.

ESTRUTURA

Os herpesvírus são vírus grandes, com invólucro, contendo cadeia dupla de ADN. O

virião possui um diâmetro aproximado de 150 nm e apresenta a morfologia

característica apresentada na figura 1. O ADN é circundado por uma cápside

icosaédrica que contém 162 capsómeros (12 pentões ou pentâmeros e 150 hexões ou

hexâmeros). Esta cápside é circundada por um invólucro que contém glicoproteínas.

Os herpesvírus codificam várias glicoproteínas que são determinantes na fixação do

vírus, fusão e escape do controlo imunológico. O espaço entre o invólucro e a cápside,

denominado tegumento, contém proteínas e enzimas virais que ajudam a iniciar a

replicação. Como vírus com invólucro, os herpesvírus são sensíveis aos ácidos,

solventes, detergentes e ao calor. Os genomas dos herpesvírus são constituídos por

ADN linear de cadeia dupla, mas diferem no tamanho e na orientação genica.

Sequências repetidas diretas ou invertidas constituem regiões únicas do genoma

(região única longa [UL], região única curta [US]), permitindo a circulação e a

recombinação no interior do genoma. A recombinação entre repetições invertidas no

HSV, CMV e VZV permite que grandes porções do genoma modifiquem a orientação

dos seus segmentos génicos UL e US um em relação ao outro11.

Figura 1 - Herpes Vírus 16



REPLICAÇÃO

A replicação dos herpesvírus é iniciada pela interação das glicoproteínas virais com

recetores presentes na membrana celular. O tropismo de alguns herpesvírus (por

exemplo o EBV) é restrito, como resultado da expressão célula-específica dos seus

recetores. A nucleocápside é a seguir libertada no citoplasma através da fusão do

invólucro com a membrana plasmática. As enzimas e os fatores de transcrição são

transportados para o interior da célula no tegumento. A nucleocápside fixa-se à

membrana nuclear e liberta o genoma no núcleo, onde é transcrito e replicado.

A transcrição do ADN genómico pela ARN polimerase e a síntese de proteínas virais

ocorrem de forma coordenada e regulada em três fases (imediata, precoce e tardia):

- Proteínas precoces imediatas (α), que consistem em proteínas de ligação do ADN,

importantes para a regulação da transcrição genética, que atuam na transcrição e na

modulação da resposta do hospedeiro à infeção;

- Proteínas precoces (β), que consistem em vários fatores de transcrição e enzimas,

incluindo a ADN polimerase, permitindo a síntese de novas moléculas de ADN;

- Proteínas tardias (γ), há produção de ARN mensageiro necessário à síntese de

proteínas estruturais, são geradas após o início da replicação do genoma viral.

Segue-se a fase de síntese e reunião das proteínas estruturais e a encapsidação do

genoma viral. À aquisição do invólucro, por passagem através da membrana nuclear,

segue-se a saída do vírus por gemulação.

A replicação do ADN começa no núcleo da célula cerca de 4 horas após a entrada do

vírus na célula. A síntese do ADN viral decorre no núcleo da célula infetada,

necessitando, contudo, de enzimas virais, especialmente a timidina-cinase, para o

caso do HSV e VZV e, ainda, de uma ADN-polimerase. Estas enzimas constituem,

portanto, um bom alvo para a quimioterapia seletiva, estritamente antiviral e pouco

tóxica.

A encapsidação do ADN faz-se no núcleo, onde se acumula material viral que é

responsável pelas inclusões nucleares nas células infetadas. As nucleocápsides saem

do núcleo, adquirindo o invólucro ao atravessarem as membranas nucleares ou

intracitoplasmáticas do aparelho de Golgi. Os viriões são libertados da célula por

exocitose ou por lise celular.

A transcrição do genoma viral realizada pela ARN polimerase é regulada por fatores

nucleares e celulares codificados pelos vírus. A inter-relação desses fatores determina

Mestrado em Análises Clínica

se a infeção será lítica, persistente ou latente. As células que promovem infeção

latente transcrevem apenas os genes específicos sem a replicação do genoma. A

progressão para a expressão de genes precoces e tardios resulta em morte celular e

infeção lítica.

A replicação do genoma viral é realizada pela ADN polimerase codificada pelo v

também as enzimas que fornecem substratos de desoxiribonucleotidos para a

polimerase são codificadas por este e atuam como alvos para agentes antivirais.

Essas e outras enzimas virais facilitam a replicação do vírus em células em fase de

não crescimento e que necessitam de desoxiribonucleótidos e enzimas suficientes

para a síntese de ADN viral (por exemplo, os neurónios).

A transcrição, a síntese de proteínas, o processamento das glicoproteínas e a

libertação da célula por exocitose são processos rea

Figura 2 - Ciclo de replicação do Herpes vírus


Mestrado em Análises Clínica Diana Delgado




A replicação do genoma viral é realizada pela ADN polimerase codificada pelo v




ento e que necessitam de desoxiribonucleótidos e enzimas suficientes

para a síntese de ADN viral (por exemplo, os neurónios).


libertação da célula por exocitose são processos realizados pela maquinaria celular

Ciclo de replicação do Herpes vírus 10

119




A replicação do genoma viral é realizada pela ADN polimerase codificada pelo vírus e




ento e que necessitam de desoxiribonucleótidos e enzimas suficientes


lizados pela maquinaria celular11.



VÍRUS DE EPSTEIN-BARR

O vírus Epstein-Barr (EBV, designado também por Human Herpes Vírus 4 (HHV4)), foi

identificado em 1964 por Epstein (M.A.Epstein) e Barr (B.G.Achong) a partir da

observação de viriões típicos de herpesvírus humanos em linhas celulares de Linfoma

de Burkitt. Este vírus pertence à família Herpesviridae, tem um tropismo para os

linfócitos B, onde estabelecem vários processos de latência. A primoinfeção pode ser

assintomática, mas pode manifestar-se através da mononucleose infecciosa. A

reativação do vírus na população imunocompetente é normalmente assintomática, em

contrapartida em indivíduos imunodeprimidos pode conduzir a síndromas

linfoproliferativos do tipo linfoma.

REPLICAÇÃO VIRAL

A transmissão deste vírus faz-se principalmente através da saliva, o vírus entra no

organismo pela cavidade oral, infetando as células epiteliais da orofaringe e as

glândulas salivares9. Com efeito, a replicação do EBV tem lugar ao nível do epitélio

orofaríngeo, onde posteriormente, por exemplo numa reativação as partículas virais

completas são libertas na saliva a partir dos linfócitos B infetados3. Então entram na

corrente sanguínea onde infetam os linfócitos B e se multiplicam. Nos linfócitos B o

EBV replica-se liticamente. Entra posteriormente numa fase latente, possuindo a

capacidade de transformar as células infetadas9.

Figura 3 - Ciclo de Replicação do EBV



O processo de replicação ocorre da seguinte forma:

1- O invólucro viral (glicoproteína gp350/220) funde-se com a membrana

citoplasmática dos linfócitos B, através do recetor CD21;

2- A cápside, contendo o genoma viral, penetra no citoplasma;

3- Utilizando o citoesqueleto da célula, a cápside migra em direção ao núcleo;

4- O ADN viral penetra no núcleo através dos poros da membrana nuclear e

adquire forma circular;

5- Dá-se o processo de transcrição, em que ocorre a síntese de ARN mensageiro

a partir da sequência de bases dos nocleótidos do ADN. Quando uma secção

da molécula de ADN se desenrola e as suas cadeias se separam, uma das

cadeias de ADN serve de molde para a formação do ARN mensageiro1;

6- O ARN mensageiro (ARNm) migra para o citoplasma onde se processa a

síntese das primeiras proteínas virais que se deslocam para o núcleo,

continuando o processo de transcrição do ADN viral e posterior tradução em

proteínas virais;

7- O ADN viral replica-se dando origem a novas moléculas que permanecem no

núcleo;

8- Inicia-se então uma nova fase de transcrição do ADN viral, formando-se os

ARNm responsáveis pelas proteínas estruturais do vírus;

9- Após a sua síntese, as proteínas estruturais migram para o núcleo e envolvem

o genoma viral;

10- Estas estruturas (pró-cápsides) penetram na membrana nuclear após fusão

com a sua parede interna, ganhando assim um “invólucro temporário” que as

rodeia durante a sua curta estadia no espaço perinuclear. Este invólucro

funde-se com a parede exterior da membrana nuclear. libertando as

pró-cápsides no citoplasma;

11- No citoplasma as cápsides virais utilizam o retículo endoplasmático para

sintetizar glicoproteínas virais que, através das vesículas do aparelho de Golgi,

migram até à membrana citoplasmática, modificando-a;

12- No citoplasma, determinadas proteínas virais ligam-se às cápsides virais,

formando o tegumento;

13- As novas partículas virais fundem-se com vesículas citoplasmáticas,

adquirindo um invólucro maduro, sendo transportadas até à membrana

citoplasmática;



14- O virião sai então da célula por exocitose, utilizando zonas modificadas da

membrana citoplasmática9.

O EBV replica-se produzindo inúmeras partículas virais assumindo depois a forma

latente. Este vírus estabelece infeção latente permanecendo sob a forma de ADN

extracromossómico (epissoma).

Dependendo de determinados cofatores o genoma viral integra-se no ADN da célula

hospedeira, expressa seis genes virais (EBNA 1 a 6) que transformam os linfócitos B

de forma a permanecerem continuamente em divisão.

EPIDEMIOLOGIA

O EBV é um vírus ubiquitário e com distribuição mundial. A infeção por este vírus

transmite-se pela saliva e objetos contaminados, (escovas de dentes, louça, etc.) ou

por transfusões sanguíneas. A partilha de saliva entre adolescentes e adultos jovens

contribui para a propagação do vírus sendo, por isso, a mononucleose infecciosa

também designada por “doença do beijo”.

Em países com condições socioeconómicas muito precárias e deficientes hábitos de

higiene, a infeção pelo EBV ocorre muito precocemente, ou seja, logo que os

anticorpos maternos desaparecem. As infeções primárias na criança são, geralmente,

subclínicas ou com fraca sintomatologia. Na maioria dos casos, após a primoinfeção, o

vírus permanece latente no organismo sem se manifestar.

Estudos realizados em alguns países tropicais revelaram uma seropositividade de

90% para as crianças com cerca de seis anos de idade, enquanto que, nos países

mais desenvolvidos, a infeção pelo EBV ocorre mais tarde, preferencialmente nos

adolescentes e adultos jovens. Nestes países, a seropositividade é de 30 a 40% nas

crianças de 6 anos e de 70% para os adultos com cerca de 30 anos.

Um número elevado de adultos, seropositivos para o EBV, elimina partículas virais de

forma intermitente nas secreções orofaríngeas, ao longo de toda a vida, apesar de

permanecerem assintomáticos. Há numerosas variantes genómicas do EBV, apesar

de se conhecer um só serotipo10.



MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

O período de incubação para o EBV varia entre 2 semanas e 2 meses, sendo que, nos

adolescentes e nos jovens adultos, o EBV pode causar uma Mononucleose Infecciosa

(MNI) também designada por doença de Pteiffer (febre glandular) ou doença do beijo.

Nas crianças mais novas, as infeções por EBV são frequentemente assintomáticas3.

A mononucleose infecciosa corresponde à primoinfeção pelo EBV. Este tem também

sido associado, não só ao Linfoma de Burkitt, mas ainda ao carcinoma da nasofaringe

e ao carcinoma das glândulas salivares. Este vírus tem sido também relacionado com

a Leucoplasia Oral Pilosa que ocorre em indivíduos imunodeprimidos.

MONONUCLEOSE INFECCIOSA

A Mononucleose Infecciosa é uma doença linfoproliferativa sistémica, de curta

evolução e geralmente benigna. Caracteriza-se por um aumento do volume dos

gânglios linfáticos, hepatoesplenomegália acompanhada de amigdalite, cefaleias,

náuseas, mal-estar, prostração e febre prolongada, mas moderada, com picos

noturnos10.

No plano biológico, existe uma síndroma mononucleósica com uma hiperlinfocitose

sanguínea e linfócitos atípicos hiperbasófilos que correspondem a linfócitos T CD8+

ativos, que proliferam em resposta à proliferação dos linfócitos B induzidos pelo EBV.

A hiperleucocitose moderada (15.000/mm3) apresenta células mononucleares com

citoplasma azulado de 15 a 20 µm, com relação núcleo-citoplasma baixa, e gânglios

inflamatórios com hiperplasia dos folículos linfoides.

A estimulação dos linfócitos B está na origem das manifestações de autoimunidade,

como a anemia hemolítica autoimune com teste de coombs direto positivo,

crioaglutininas e púrpura trombocitopénica idiopática.

Os sinais de citólise hepática com aumento das transaminases são quase constantes.

A evolução é favorável em algumas semanas persistindo apenas a astenia. As

complicações são raras: púrpura trombocitopénica, encefalite, meningite, síndroma de

Guillain-Barré, paralisia facial, rotura do baço, pericardite, miocardite, artrite e nefrite.

No indivíduo imunodeprimido foi descrita uma forma grave de infeção primária por

EBV, o síndroma de Purtilo ou doença de Duncan que atinge rapazes com um défice



imunitário ligado ao cromossoma X. A proliferação massiva infiltra-se no fígado e nos

órgãos linfoides e a mortalidade é de dois em cada três casos7.

É importante realizar um diagnóstico diferencial para toxoplasmose, CMV e HIV7.

PODER ONCOGÉNICO

Aquando da primoinfeção, muitos linfócitos B entram num ciclo lítico, ou seja, dão

origem a novas partículas virais. A maior parte dos linfócitos B, ao serem infetados,

recebem estímulos que conduzem à divisão celular e à produção de anticorpos. Os

linfócitos infetados adquirem a capacidade de se multiplicarem continuamente in vitro,

característica comum às células neoplásicas, que se denomina por “imortalização” ou

“transformação”. A doença linfoproliferativa que resultaria deste processo é

interrompida pela ação da imunidade celular (linfócitos T CD8+ “atípicos”), o que reduz

a um pequeno número os linfócitos B infetados. Nos estados de imunodeficiência

característicos dos pacientes transplantados é relativamente comum o aparecimento

de doenças linfoproliferativas pós-transplante, que podem ser designadas por

neoplasias oportunistas, desencadeadas pela replicação não controlada do vírus de

Epstein-Barr. Também na SIDA ocorrem linfomas extranodulares agressivos,

especialmente do sistema nervoso central, devido à proliferação monoclonal ou

policlonal de linfócitos B, nos quais está presente o genoma viral. Este vírus é

provavelmente um fator importante na formação de tumores de distribuição geográfica

restrita, como o linfoma de Burkitt (África) e o carcinoma anaplásico da orofaringe

(China). Há evidências crescentes da sua importância na doença de Hodgkin15.

Como já foi referido existem várias manifestações malignas associadas ao EBV, tais

como:

- Linfoma de Burkitt: Este linfoma é o tumor mais frequente em crianças da África

Central e Oriental, é endémico na África Equatorial e pode ocorrer de forma

esporádica ou associada a casos de SIDA, em diferentes regiões do globo. Os tecidos

tumorais contêm sequências de ADN do EBV, exprimem o antigénio viral EBNA e, por

vezes, permitem a deteção de partículas virais por microscopia eletrónica. Nesta

patologia ocorre uma proliferação monoclonal de linfócitos B, ligada a uma

translocação no cromossoma 8 (Q24) e um dos cromossomas 2,14 ou 22. O perfil

molecular deste linfoma é típico pois é sempre monoclonal7. Estas translocações

conduzem a uma desregulação do proto-oncogene c-myc, possivelmente ao nível do

controlo transcricional.



Estudos seroepidemiológicos revelaram a presença de anticorpos anti-VCA e anti-EA

em títulos elevados, precedendo, em cerca de cinco anos, a deteção clínica deste

tumor10.

- Carcinoma da nasofaringe: atinge mais frequentemente o homem entre os 20 e os 50

anos, é endémico no Sul da China, pouco frequente em África e raro na Europa,

estando ligado ao vírus em 100% dos casos7. As células alvo são as células epiteliais,

embora os tumores apresentem infiltrações de numerosos linfócitos.

A associação do EBV com este carcinoma foi descoberta através de estudos

serológicos e, mais tarde, confirmada pela presença do genoma viral em produtos

obtidos por biopsia. A demonstração da presença de ADN viral nas células epiteliais

tumorais, mas não nos linfócitos presentes no tumor, pode ser feita por hibridação in

situ e, ainda, por transplantação do tumor para cobaias que desenvolvem neoplasia.

Os pacientes com carcinoma da nasofaringe possuem teores elevados de anticorpos

anti-VCA e anti-EA, especialmente da classe IgA.

Na génese deste tumor parecem intervir, não só o EBV, como certos fatores genéticos

e geográficos10.

As adenopatias cervicais são reveladoras e demonstram a difusão metástica precoce.

Associam-se a manifestações otorrinolaringológicas e neurológicas7.

- Adicionalmente, outras doenças estão associadas ao EBV: o genoma do EBV

encontra-se em células tumorais da doença de Hodgkin (células de Sternberg). Certos

linfomas das células T estão associados ao EBV (linfomas nasais, gastrointestinais,

pulmonares ou ganglionares).

- No decorrer da infeção por HIV encontram-se certas patologias associadas ao EBV:

A leucoplasia da língua (produção de EBV pelas células epiteliais da língua) é

frequente, esta leucoplasia apresenta-se como uma lesão esbranquiçada nas margens

da língua, podendo encontrar-se na mucosa bucal. A observação destas lesões pode

alertar para uma possível infeção pelo HIV, visto que, virtualmente, todos os pacientes

com esta leucoplasia são seropositivos para o HIV10.

Por vezes a infeção por EBV também está associada aos linfomas não Hodgkin com

localizações sobretudo extraganglionares (tubo digestivo, espinal medula e sistema

nervoso central)7.



MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DO EBV

O diagnóstico da Mononucleose Infecciosa (MNI) baseia-se principalmente em

sintomas clínicos (anginas, febre e linfoadenopatia). A serologia é utilizada para

confirmar o diagnostico da MNI e excluir outras patologias, tais como o linfoma e a

leucemia, que podem apresentar sintomas comparáveis aos da MNI. A síndroma de

mononucleose pode também ser causada por outros agentes patogénicos (o

citomegalovírus, o HHV6, o adenovírus, o vírus da rubéola, o vírus da papeira, o HIV,

o vírus da hepatite A, os vírus da influenza A e B e Toxoplasma gondii).

O diagnóstico serológico do EBV inclui testes específicos, bem como não específicos,

como a deteção dos anticorpos heterófilos.

TESTES NÃO ESPECÍFICOS

AMINOTRANSFERASES

As aminotransferases são enzimas que catalisam a transferência do grupo amina de

um aminoácido para um ácido alfa-cetónico. Passam para o soro em caso de hemólise

hepática ou muscular.

Avaliam-se normalmente a atividade da alanina-aminotransferase (ALT ou TGP)

essencialmente presente no fígado e da aspartato-aminotransferase (AST ou TGO)

presente no coração e em menor quantidade no fígado6.

Relativamente ao EBV, apesar de, aquando da infeção por este vírus ser infrequente a

icterícia, a elevação moderada das enzimas acima mencionadas ocorre em cerca de

90% dos casos, devido à lesão hepática, provocada pelo vírus15.

HEMOGRAMA

O hemograma compreende a contagem dos elementos figurados do sangue (glóbulos

vermelhos, brancos, plaquetas e eventualmente reticulócitos) e o cálculo dos índices

eritrocitários, como o volume globular sanguíneo médio (VGM) e a concentração

média de hemoglobina globular (CHGM) a partir do doseamento da hemoglobina e do

hematócrito, o cálculo do número e percentagem das diferentes categorias de glóbulos

brancos – Fórmula Leucocitária (neutrófilos, linfócitos, eosinófilos e basófilos)6.



Na infeção pelo EBV é típica a presença de uma leucocitose com linfocitose.

Há em geral mais de 50% de linfócitos, entre os quais 10% ou mais são descritos

como "atípicos", ou "células de Downey". Estas células correspondem a linfócitos T

CD8+ supressores/citotóxicos ativados e surgem não só na mononucleose, como

também noutras infeções virais (rubéola, hepatite…) e noutras causas da síndroma

adenomegálica, como toxoplasmose aguda, citomegalovirose, primoinfeção pelo vírus

da imunodeficiência humana, doença de Chagas aguda e alergia a drogas. O que

sobressai na mononucleose pelo vírus de Epstein-Barr é o seu grande número. Apesar

disso, o hemograma pode apenas tornar-se característico uma semana após o início

da doença.

Figura 4 - Linfócitos Reativos 17

PESQUISA DE ANTICORPOS HETERÓFILOS

Na primoinfeção pelo vírus de Epstein-Barr, o estímulo inespecífico à produção de

anticorpos eleva em cerca de 50% a concentração sérica de anticorpos da classe IgG

e em cerca de 100% a de anticorpos da classe IgM, o que aumenta a quantidade de

muitos anticorpos normalmente indetetáveis ou presentes em baixas concentrações.

Estes anticorpos são denominados "heterófilos", pois os testes utilizados para o seu

doseamento utilizam antigénios que não estão relacionados com as causas

determinantes da formação dos anticorpos. Estes testes têm menor positividade na

infância, tornam-se reativos após duas semanas de doença e podem estar presentes

até um mês após o inicio da infeção15. Estes testes podem ser o Monoteste, o

Paul-Bunnel e o Paul-Bunnel-Davidsohn.



PAUL-BUNNEL

Este teste deteta anticorpos que aglutinam hemácias de carneiro15. Estes anticorpos

podem apresentar títulos significativos em várias alterações clínicas que cursam com a

ativação policlonal dos linfócitos B, tais como na presença de imunocomplexos

circulantes, hepatite viral, leishmaniose visceral e HIV.

PAUL-BUNNEL-DAVIDSOHN

Tal como o anterior, também este teste deteta anticorpos que aglutinam hemácias de

carneiro, a diferença reside no facto de a reação ser repetida após o soro em estudo

ser exposto a antigénios de rim de cobaia. Como, dos vários anticorpos heterófilos, os

da mononucleose causada pelo vírus de Epstein-Barr são os únicos sem qualquer

afinidade com estes antigénios, apenas se se tratar desta infeção o soro conservará a

maior parte do seu poder aglutinante, sendo nas outras patologias intensamente

inativado pela fixação dos anticorpos aos antigénios de rim de cobaia7.

MONOTESTE

Este teste, tal como os anteriores é um teste qualitativo. A modalidade mais antiga

deste teste era um teste em lâmina que detetava anticorpos através do uso de

eritrócitos de cavalo formolizados. Os testes mais recentes detetam também

anticorpos heterófilos da Mononucleose Infecciosa em sangue total, soro ou plasma

mas através de um sistema imunocromatográfico de fluxo lateral. Neste teste o

antigénio é extraído de eritrócitos de bovino e é imobilizado na região da linha de teste

do dispositivo. Durante o teste, a amostra reage com partículas cobertas de antigénio

extraído de eritrócitos bovinos que foram aplicadas ao longo da membrana. Esta

mistura migra cromatograficamente ao longo do teste e interage com o antigénio

extraído dos eritrócitos bovinos.

Se a amostra apresentar anticorpos heterófilos da mononucleose infecciosa, uma linha

colorida aparecerá na região da linha de teste, indicando um resultado positivo. Se a

amostra não apresentar anticorpos heterófilos da mononucleose infecciosa, não



aparecerá nesta região da linha de teste uma linha colorida, indicando um resultado

negativo.

Para verificação de procedimento, aparecerá sempre na região da linha de controlo

uma linha colorida, indicando que o volume da amostra foi suficiente e que absorção

da membrana ocorreu2.

Figura 5 - Cassetes de reação

Este teste tem boa correlação com a reação de Paul-Bunnell-Davidsohn, a qual

tendem a substituir, por serem mais sensíveis e de mais fácil execução.

TESTES ESPECÍFICOS

Estes testes baseiam-se na deteção dos anticorpos produzidos pelo hospedeiro em

resposta aos diferentes antigénios produzidos durante o ciclo viral.

ANTICORPOS ESPECÍFICOS DO EBV

A produção de anticorpos específicos do EBV está associada à presença de

antigénios virais, que são os seguintes:

Abreviaturas Nome Completo Descrição

EBNA Antigénio Nuclear Proteína não estrutural. IgG anti-EBNA são sintetizadas numa fase tardia da infeção primária.

VCA Antigénio da Cápside Viral

Proteína estrutural IgM anti-VCA são sintetizadas nas infeções assintomáticas e na Mononucleose Infecciosa. IgG anti-VCA são sintetizadas em todo o tipo de patologias associadas ao EBV.

EA Antigénio Precoce Proteína precoce, existe em duas formas, restrito (R) e difuso (D).

EA(D) Antigénio Precoce Difuso

Proteína difusa encontra-se presente no citoplasma e no núcleo. IgG anti-EA (D) são sintetizadas na Mononucleose Infecciosa mas raramente nas infeções assintomáticas.

EA(R) Antigénio Precoce Restrito Proteína restrita encontra-se presente no



Abreviaturas Nome Completo Descrição

citoplasma. IgG anti-EA (R) são sintetizadas nas infeções assintomáticas.

MA Antigénio Membranar Proteínas virais presentes na membrana linfocitária.

EMA Antigénio Membranar Precoce Sintetizado no inicio da infeção viral, não produzem resposta humoral.

LMA Antigénio Membranar Tardio Sintetizado após a infeção viral, não produzem resposta humoral.

LYDMA Antigénio Membranar Tardio Detetado por reação linfocitária.

Figura 6 - Abreviaturas e descrições dos antigénios virais 9

A resposta imunitária humoral é, no início, dirigida aos antigénios da fase lítica. Depois

o vírus entra numa fase de latência associada à expressão de proteínas nucleares

(EBNA) e de membrana (LMP), este processo inicia uma resposta imunitária dirigida

contra as proteínas de latência. A seguir aparecem sucessivamente anticorpos

primeiro dirigidos contra os antigénios do invólucro viral (anti-MA), depois contra os

antigénios da cápside (anti-VCA) e posteriormente contra as proteínas precoces

(anti-EA). Por fim, anticorpos dirigidos contra proteínas da fase de latência

(anti-EBNA)7. Os anticorpos anti-EA vão diminuir até desaparecer, enquanto que os

anticorpos anti-VCA e anti-EBNA vão persistir. A resposta imunitária tem um papel

fundamental para limitar a infeção primária e para controlar a fase de latência.

No inicio da MNI, os anticorpos heterófilos aparecem em 60 a 80% dos casos, os

anticorpos anti-EA em 70 a 80% dos casos, os anticorpos anti-VCA IgM em 100% dos

casos e os anticorpos anti-VCA IgG em perto de 100%.

Durante a fase da convalescença os anticorpos anti-VCA IgG persistem e,

aproximadamente 95% das pessoas, apresentam anticorpos anti-EBNA IgG (1, 2, 3, 4

e 5). Se os 5 anticorpos forem medidos existem cerca de 32 possibilidades de

diferentes padrões serológicos3.

TÉCNICAS LABORATORIAIS

Para a pesquisa da presença destes anticorpos são normalmente utilizadas técnicas

de imunofluorescência indireta e ensaios imunoenzimáticos (ELISA/EIA), tendo estes

últimos uma sensibilidade superior às técnicas de imunofluorescência indireta.

Para se distinguir uma infeção recente de uma não recente pode também realizar-se o

teste de avidez.



IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

A técnica da imunofluorescência utiliza moléculas de anticorpo marcadas com um

composto fluorescente para detetar os respetivos

antigénios.

Baseia-se no comportamento de certas moléculas que

fluorescem quando expostos a determinados comprimentos

de onda (frequentemente luz ultravioleta) no microscópio de

fluorescência.

Cada corante emite luz num comprimento de onda.

Exemplos de tais moléculas são a fluoresceína

(amarelo-esverdeada) e a rodamina (laranja-avermelhada).

Os anticorpos podem ser ligados a estas moléculas: são

então denominados anticorpos marcados ou fluorescentes.

Na imunofluorescência indireta um anticorpo não marcado é

inicialmente aplicado a um esfregaço de células infetadas

com o EBV. Na etapa seguinte, um segundo anticorpo

fluorescente contra a imunoglobulina da espécie animal utilizada para preparação do

anticorpo inicial, é adicionado e então esta mistura é incubada. Este procedimento liga

o anticorpo fluorescente ao anticorpo específico que reagiu com o antigénio presente

nas células. Após a lavagem da lâmina para retirar os anticorpos não ligados, o

esfregaço é observado ao microscópio de fluorescência. Se a amostra fluoresce, o

anticorpo que se associa ao segundo anticorpo marcado está presente.

ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS (ELISA/EIA)

As técnicas EIA dividem-se em dois grandes grupos:

– EMIT “enzime-multiplied immunoassay techniques”

– ELISA “enzime-linked immunosorbent assays”

Nas técnicas EMIT a reação ocorre num meio líquido homogéneo e a separação entre

reagentes ligados e não ligados não é satisfeita.

Nas técnicas ELISA, parte das reações ocorrem em meio sólido que também serve

para separar os imunocomplexos dos reagentes não ligados. Esta técnica consiste na

deteção ou quantificação de um antigénio (Ag) ou anticorpo (Ac) usando um ligando

Figura 7 - Imunofluorescência Indireta



(anti-Ag ou anti-Ac) conjugado com uma enzima cuja reação se traduz na alteração de

cor do substrato.

Tem por base a capacidade de um Ac reconhecer um dado epítopo (parte estrutural

de um Ag reativo). É um método sensível, reprodutível e não radioativo, mais usado no

estudo Ag-Ac.

Atendendo a que o pretendido é a deteção de anticorpos, o tipo de ELISA mais

apropriado será o ELISA indireto, cuja reação ocorre da seguinte forma:

Figura 8 - ELISA indireto

Existem também técnicas que associam o método imunoenzimático em duas etapas

com uma deteção final em fluorescência (ELFA)3.

TESTE DE AVIDEZ

O teste de avidez baseia-se no princípio de que a afinidade das moléculas de IgG para

o seu antigénio aumenta progressivamente com o tempo durante o estabelecimento

da resposta imunológica.

Nos anticorpos com alta afinidade com o seu antigénio, a ligação antigénio-anticorpo é

forte e estável, enquanto que nos anticorpos com baixa afinidade a ligação é mais

fraca e instável.

Através da determinação da avidez dos anticorpos do tipo IgG para um determinado

vírus é possível saber se a amostra de soro analisada foi colhida recentemente ou

remotamente, após a infeção primária, sendo que quando a avidez é baixa indica-nos

que a infeção é recente e quando a avidez é alta a infeção é antiga9.

anticorpo específico liga-se ao antigénio

antigénio absorvido no poço



RESULTADOS SEROLÓGICOS E SUA INTERPRETAÇÃO

Utiliza-se o teste de pesquisa de anticorpos específicos anti-EBV em doentes com

suspeita de infeção aguda por EBV sem anticorpos heterófilos, bem como em

pacientes com infeções atípicas. Os testes serológicos são particularmente úteis em

crianças pequenas que muitas vezes não produzem anticorpos heterófilos. Os títulos

de anticorpos IgM e IgG contra o antigénio da cápside viral (VCA) mostram-se

elevados no início da doença. O anticorpo IgM dirigido contra o VCA é útil para o

diagnóstico da mononucleose infecciosa aguda, visto que só está presente em títulos

elevados nos primeiros dois meses da doença. Em contraste, o anticorpo IgG

anti-VCA é muitas vezes utilizado para avaliar uma exposição antiga ao EBV, devido à

sua persistência durante o resto da vida.

Detetam-se anticorpos dirigidos contra antigénios precoces (EA) num padrão difuso no

núcleo e no citoplasma de células infetadas (anticorpo EA-D) ou restrito ao citoplasma

(anticorpo EA-R). Esses anticorpos podem ser detetados três a quatro semanas após

o aparecimento dos sintomas em pacientes com mononucleose infecciosa. Cerca de

70% dos indivíduos com mononucleose infecciosa, sobretudo os que apresentam

doença relativamente grave, produzem anticorpos EA-D durante a evolução da

doença. Em geral, esses anticorpos só persistem durante três a seis meses. Os níveis

de anticorpos EA-D também são elevados em pacientes com carcinoma da

nasofaringe ou infeção ativa crónica por EBV. Os anticorpos EA-R são apenas

ocasionalmente detetados em pacientes com mononucleose infecciosa, todavia, são

muitas vezes encontrados em níveis elevados em pacientes com linfoma de Burkitt

africano ou com infeção ativa crónica por EBV.

Os anticorpos IgA contra antigénios do EBV são úteis na identificação de pacientes

com carcinoma nasofaríngeo e de indivíduos com alto risco de desenvolverem a

doença. A seroconversão para positividade dos EBNA também é útil no diagnóstico da

infeção por EBV aguda. Os anticorpos anti-EBNA são detetáveis num estádio

relativamente tardio (3 a 6 semanas após o início dos sintomas) em quase todos os

casos de infeção aguda por EBV e persistem durante toda a vida do paciente. Estes

anticorpos podem estar ausentes em pacientes imunodeficientes e naqueles que

apresentem uma infeção por EBV crónica ativa.



Anticorp os anti -EBV

Infeção IgG anti-EBNA IgG anti-VCA IgM anti-VCA IgG anti-EA

Suscetibilidade - - - -

Recente -/+ +/++ + -/+

Antiga +/++ +/++ - -

Reativação +/++ ++/+++ - +/++

Linfoma de Burkitt ++ ++ - ++ (EA-D)

Carcinoma da Nasofaringe

++/+++ ++/+++ - ++/+++ (EA-R)

- negativo; + borderline; + positivo (1/10 -1/160); ++ positivo “forte” (1/320 – 1/640); +++ positivo “muito forte” (1/1280/>1/2560)

Figura 9 - Resultados serológicos e sua interpretaç ão9

CARGA VIRAL DO EBV

A deteção de ADN, de ARN ou de proteínas do EBV tem sido importante para

demonstrar a associação do vírus a diversas neoplasias. A reação de polimerase em

cadeia (PCR) tem sido utilizada para detetar o ADN do EBV no líquido

cefalorraquidiano de alguns pacientes com SIDA que apresentam linfomas, bem como

para monitorizar a quantidade de ADN do EBV no sangue de pacientes com doenças

linfoproliferativas. Este parâmetro pode ser utilizado para fazer um diagnóstico precoce

e para monitorizar a eficácia da terapia. Para além disso, a carga viral do EBV é

frequentemente elevada em pacientes com carcinoma da nasofaringe e o nível dessa

elevação corresponde ao estádio do tumor. Nos doentes com SIDA, a amplificação de

ADN do EBV no líquido cefalorraquidiano, tal como já foi referido, é indicativa de

linfoma cerebral e pode ser utilizada para monitorizar a eficácia do tratamento

posterior.

A quantificação da carga viral do EBV em soro, plasma e leucócitos de sangue

periférico é utilizada em pacientes de alto risco e para monitorizar a resposta à

terapêutica para EBV no grupo de pacientes acima descrito14.



CONCLUSÃO

A realização deste trabalho foi importante para a aquisição de novos conhecimentos e

maturação de alguns já existentes relativamente à família Herpesviridae, mais

especificamente ao Vírus Epstein-Barr.

Este é um vírus ubiquitário e com distribuição mundial e os danos causados no

hospedeiro infetado variam conforme o estado imunológico do mesmo, logo os efeitos

causados podem ir de ligeiros a severos, sendo necessário um rápido e conclusivo

diagnóstico para que o clínico possa proceder ao tratamento mais correto e eficaz.

Nesta fase, ressalvo a importância das diversas técnicas existentes e da sua

complementaridade no diagnóstico laboratorial da infeção por EBV.

Concluo também este trabalho com a certeza da importância da evolução da Medicina

e da Genética no conhecimento deste vírus, o que possibilitou o desenvolvimento de

técnicas cada vez mais sensíveis e específicas para o diagnóstico laboratorial do EBV

e das diversas patologias associadas.



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universidade de lisboa faculdade de...

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