universidade de brasÍlia faculdade de agronomia...
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CLONAGEM POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR:
HISTÓRICO, APLICAÇÕES POTENCIAIS E PRINCIPAIS CÉLULAS DOADORAS DE
NÚCLEO
Daniel Barbosa Sousa
Orientador Prof. Dr. Ivo Pivato
BRASÍLIA - DF
NOVEMBRO/2015
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
I
CLONAGEM POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR:
HISTÓRICO, APLICAÇÕES POTENCIAIS E PRINCIPAIS CÉLULAS DOADORAS DE
NÚCLEO
Trabalho de conclusão de curso de
graduação em Medicina Veterinária
apresentado junto à Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinária da
Universidade de Brasília
Orientador Prof. Dr. Ivo Pivato
BRASÍLIA - DF
NOVEMBRO/2015
DANIEL BARBOSA SOUSA
II
Cessão de Direitos
Nome do Autor: Daniel Barbosa Sousa
Título do Trabalho de Conclusão de Curso: Clonagem por transferência nuclear:
histórico, aplicações potenciais e principais células doadoras de núcleo.
Ano: 2015
É concedida à Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta
monografia e para emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos
acadêmicos e científicos. O autor reserva-se a outros direitos de publicação e
nenhuma parte desta monografia pode ser reproduzida sem a autorização por
escrito do autor.
_______________________________
Daniel Barbosa Sousa
Sousa, Daniel Barbosa
Clonagem por Transferência Nuclear: histórico, aplicações potenciais
e principais células doadoras de núcleo. / Daniel Barbosa Sousa; orientação de Ivo
Pivato. – Brasília, 2015.
48 p.
Trabalho de conclusão de curso de graduação – Universidade de
Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2015.
III
LISTA DE FIGURA E QUADROS
FIGURA 1 - Apresentação esquemática dos diferentes eventos da TNCS em
ruminantes.............................................................................................................22
QUADRO 1 - Alguns exemplos de pesquisas em clonagem com utilização de
blastômeros como fontes doadoras de núcleo.......................................................5
QUADRO 2 - Alguns exemplos de pesquisas em clonagem com utilização de
células somáticas como fontes doadoras de núcleo...............................................6
QUADRO 3 - Marcos na transgenia e tecnologia reprodutiva em animais de
produção (bovinos, caprinos, ovinos e suínos)......................................................10
IV
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
6-DMAP = 6-Dimethylamino-purine
BSA = Albumina Sérica Bovina
CCO = Complexo Cumulus-Oócito
CT = Células-Tronco
CTE = Células-Tronco Embrionárias
CTM= Células-Tronco Mesenquimais
DNA = Ácido Desoxirribonucleico
Embrapa = Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FDA = Food and Drug Administration
FIV = Fertilização in vitro
G0 = Fase Quiescente, “GAP-Intervalo” zero do ciclo celular
GW = Geléia de Wharton
LOS = Large Offspring Syndrome
M = fase Mitose
MCI = Massa Celular Interna
MIV = maturação in vitro
MPF = Fator Promotor da Maturação
PIV = Produção in vitro
S = Fase Síntese do Ciclo Celular
SFB = Soro Fetal Bovino
SOF = Fluido do Oviduto Sintético
TG = Transgênicos
TN = Transferência Nuclear
TNCS = Transferência Nuclear de Células Somáticas
V
CLONAGEM POR TRANSFERÊNCIA NUCLEAR: HISTÓRICO, APLICAÇÕES
POTENCIAIS E PRINCIPAIS CÉLULAS DOADORAS DE NÚCLEO
Resumo
A clonagem animal representa um dos maiores avanços obtidos até hoje no
campo da biotecnologia animal. Os recentes resultados de clonagem por
transferência nuclear têm encorajado os pesquisadores cada vez mais a
elucidarem alguns aspectos ainda obscuros relativos a essa técnica. O processo
de clonagem pode ser definido como a produção de indivíduos geneticamente
idênticos. A transferência nuclear de células somáticas é realizada basicamente
de acordo com as seguintes etapas: I) preparação de citoplastos receptores II)
isolamento, sincronização e cultivo células somáticas doadoras de núcleo; III)
reconstrução embrionária e IV) criopreservação ou transferência dos embriões
para receptoras. A técnica despertou o interesse dos pesquisadores, sendo
relatada com êxito em diversas espécies, como em bovinos, suínos, equinos,
camundongos, caprinos, gatos e bubalinos. A geração de animais viáveis por
meio dessa técnica demonstra que o núcleo de células somáticas diferenciadas
de mamíferos pode ser reprogramado quando transferido a um ovócito enucleado.
Atualmente, células de vários tecidos e de animais de várias idades (fetos, recém-
nascidos, jovens, idosos e até mesmo de animais mortos após um período
relativamente curto) são relatadas como doadoras de núcleo. Porém, nota-se
baixa eficiência no procedimento. Ainda são necessários mais estudos sobre
fenômenos epigenéticos e de reprogramação nuclear, pois a produção de clones
tem importância em diversas aplicações, como na ciência básica, conservação
animal, transgenia, produção animal e medicina humana.
Palavras-chave: Biotecnologia, células somáticas, clonagem animal, reprogramação nuclear.
VI
CLONING BY NUCLEAR TRANSFER: HISTORICAL, POTENTIAL
APPLICATIONS AND MAJOR DONOR CELLS
Abstract
Animal cloning is one of the greatest advances made to date in the field of animal
biotechnology. The recent nuclear transfer cloning results have encouraged the
researchers increasingly elucidate some aspects of this technique that was still
obscure. The cloning process can be defined as the production of genetically
identical individuals. The somatic cell nuclear transfer is performed basically
according to the following steps: I) Preparation of cytoplasts receptors II) isolation,
synchronization and cultivation of the donor somatic cell nucleus III) embryonic
reconstruction IV) cryopreservation or transfer of embryos into receptors. The
technique aroused the interest of researchers, reported successfully in several
species, such as cattle, pigs, horses, mice, goats, cats and buffalo. The generation
of viable animals by this technique shows that the nucleus of differentiated
mammalian somatic cells can be reprogrammed if transferred to an enucleated
oocyte. Currently, cells of various tissues and animals of various ages (fetuses,
newborns, young, old and even dead animals after a relatively short period) are
reported as nuclear donors. However, there is low efficiency in the procedure.
Further studies are necessary on epigenetic reprogramming and nuclear
phenomena, for the production of clones is important in many applications, such
as in basic science, wildlife conservation, transgenic animal production and human
medicine.
Keywords: Biotechnology, somatic cells, animal cloning, nuclear reprogramming.
VII
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 3
2.1 Histórico e Evolução no Mundo e no Brasil ................................................... 3
2.2 Aplicações Potenciais ................................................................................... 7
2.3 Baixa eficiência da TN ................................................................................ 12
2.4 Linhagens de células doadoras de núcleo .................................................. 14
2.5 Sincronização do ciclo celular, tempo e cultivo das células doadoras de
núcleo ............................................................................................................... 18
2.6 Citoplastos Receptores ............................................................................... 20
2.7 Técnica de Transferência Nuclear .............................................................. 21
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................. 24
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 25
5. RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO OBRIGATÓRIO .................. 32
5.1 Planos de Atividades ................................................................................... 33
5.2 Atividades Desenvolvidas ........................................................................... 33
5.2.1 Lavagem e esterilização de material ..................................................... 34
5.2.2 Coleta e aspiração de ovários............................................................... 35
5.2.3 Obtenção de biópsias de pele para isolamento e cultivo de fibroblastos
....................................................................................................................... 35
5.2.4 Outras atividades de Laboratório .......................................................... 36
5.2.5 Atividades desenvolvidas a campo ....................................................... 36
5.3 Considerações finais sobre o estágio supervisionado ................................ 39
1 INTRODUÇÃO
A reprodução animal constitui-se num dos fatores de maior importância
que afeta diretamente a eficiência e a rentabilidade dos sistemas produtivos
(NEVES et al., 2010). As necessidades de produção animal são crescentes e
abrangem vários e diferentes aspectos (RODRIGUES & RODRIGUES, 2009).
Durante várias décadas, diferentes grupos de pesquisa buscam conhecer os
aspectos fisiológicos e embrionários envolvidos na reprodução e também obter
descendentes de animais geneticamente valiosos, sendo assim, estudaram a
utilização de um conjunto de biotécnicas como ferramentas para a realização de
tais objetivos (PEREIRA & FREITAS, 2009).
BERTOLINI & BERTOLINI (2009) agruparam os avanços biológicos e
tecnológicos em quatro gerações de tecnologias de reprodução: a 1ª geração
inclui inseminação artificial e criopreservação de gametas e embriões; a 2ª
geração compreende a superovulação e transferência de embriões. Na 3ª
geração, encontra-se a sexagem espermática e embrionária, a recuperação de
ovócitos e a fertilização in vitro. Já a 4ª geração envolve a clonagem por
transferência nuclear de células embrionárias ou somáticas, a transgenia e a
biologia de células-tronco.
Seguindo esta temática, biotécnicas de última geração foram
desenvolvidas, em especial, a transferência nuclear (TN) ou clonagem. (PEREIRA
& FREITAS, 2009). A clonagem animal representa um dos maiores avanços
obtidos até hoje no campo da biotecnologia animal. Os resultados de clonagem
por TN têm encorajado os pesquisadores cada vez mais a elucidarem alguns
aspectos ainda obscuros relativos a essa técnica. (MIGLINO,2004). Basicamente,
ela consiste na reprodução assexuada de um indivíduo em que a descendência
deste terá um genoma nuclear essencialmente idêntico ao seu (MULLINS et al.,
2003, citado por CORREIA & CORREIA, 2007).
Existe um consenso na comunidade científica em que a clonagem por
TN trouxe perspectivas promissoras de reprogramar núcleos de células adultas
buscando diretamente um estágio pluripotencial (CAMPBELL et al., 1996).
2
Os procedimentos de TNCS convencional necessitam de
equipamentos sofisticados e grau de habilidade técnica alto para sua
manipulação. Uma técnica que simplifica o processo é a técnica Handmade
Cloning. Ela supre a necessidade de utilizar micromanipuladores. No
procedimento, ovócitos devem estar livres de zona pelúcida (VAJTA et al., 2001).
No Handmade Cloning, a enucleação dos ovócitos maturados ocorre
pela bissecção com auxílio de microlâminas e o processo de formação do
complexo núcleo-citoplasma ocorre com a aproximação das duas metades do
ovócito enucleado ao núcleo doador, onde o núcleo se encontra ao centro e cada
uma das metades do ovócito são posicionadas nas extremidades do núcleo,
assim, o envolvendo totalmente com o citoplasma ovocitário (VAJTA et al., 2007).
O objetivo deste trabalho é fazer uma revisão de literatura sobre
clonagem por transferência nuclear, abordando principalmente seu histórico, suas
aplicações potenciais e os tipos celulares que podem ser utilizados no
procedimento; sendo essa técnica uma importante ferramenta no auxílio da
reprodução animal.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Histórico e Evolução no Mundo e no Brasil
A palavra clone vem do grego “klôn” e tem por significado “broto”.
Definida para representar as técnicas assexuadas de enxertia e brotamento para
a multiplicação de plantas (TRECENTI & ZAPPA, 2013). Em animais, o processo
de clonagem pode ser definido como a produção de indivíduos geneticamente
idênticos (HEYMAN & RENARD, 1996).
A TN foi proposta por SPEEMANN (1938), no intuito de conhecer o
papel do material genético na diferenciação celular, ou seja, que o núcleo de
células diferenciadas teria capacidade de iniciar e sustentar o desenvolvimento
embrionário, o que satisfaz a teoria da “equivalência nuclear”, determinando se a
cromatina sofreria algum tipo de modificação durante a diferenciação celular
(reprogramação). No caso, foi possível obter clivagens de um citoplasma
enucleado de um zigoto de anfíbio contendo o núcleo de um embrião de 8 a 16
células. Este processo ocorreu amarrando um fio de cabelo de boneca ao redor
do zigoto, assim, houve constrição do citoplasma em duas metades, sendo uma
contendo o núcleo e a outra enucleada. A porção que continha o núcleo se dividiu
até 8 – 16 células. Após, desfeita a constrição, o núcleo do blastômero passou
para a porção enucleada, assim ocorrendo, posteriormente, a clivagem
(YAMAZAKI, 2006; SARAIVA, 2010; TRECENTI & ZAPPA, 2013).
Entretanto, somente em 1952 que BRIGGS & KING realizaram com
sucesso a primeira TN em anfíbios (Rana Pipiens): procederam a enucleação de
ovócitos seguido pela injeção do núcleo de uma célula embrionária no estádio de
blástula diretamente no citoplasma receptor (ovócito enucleado), resultando na
reconstrução de 197 embriões, sendo que 27 retornaram ao desenvolvimento até
o estádio de girino. Os primeiros trabalhos de transferência nuclear utilizavam
blastômeros de embriões produzidos in vivo como fonte de núcleos (MELLO,
2003; YAMAZAKI, 2006; PEREIRA & FREITAS, 2009; NEVES et al., 2010;
TRECENTI & ZAPPA, 2013).
4
Na década de 60, GURDON & UELINGER (1966) demonstraram o
potencial de reprogramação de células diferenciadas utilizando rãs adultas
(Xenopus laevis) (PEREIRA & FREITAS, 2009). Somente em 1981 que a TN
obteve sucesso em mamíferos, quando os pesquisadores ILMENSEE & HOPPE
(1981) anunciaram o nascimento de três camundongos clonados utilizando
células de embriões como núcleos doadores. O dinamarquês WILLADSEN (1986)
foi o primeiro a conseguir resultados animadores com a TN. Utilizou ovócitos de
ovelhas maturados in vivo e obteve o nascimento de três cordeiros a partir do
núcleo de embriões. Após esses resultados, muitos pesquisadores empregaram o
método de WILLADSEN (1986) (utilizar células embrionárias como doadoras de
núcleo) e obtiveram, por exemplo, o nascimento de clones bovinos (PRATHER et
al., 1987; ROBL, 1988) e suínos (PRATHER et al., 1989).
Outro grande marco no desenvolvimento da clonagem em mamíferos
foi quando SMITH et al. (1988) provaram que mesmo núcleos advindos de células
do botão embrionário de embriões em fase de blastocisto mantinham o potencial
para reiniciar o desenvolvimento embrionário. Assim, a utilização dessas células
garantiria uma fonte ilimitada para produção de clones, fazendo com que
pesquisadores como CAMPBELL et al. (2007) confirmassem que núcleos
derivados de linhagens celulares embrionárias teriam capacidade de sustentar o
desenvolvimento a termo, ou seja, mesmo que as células que estivessem
completamente diferenciadas, poderiam ser utilizadas na TN (BORDIGNON &
SMITH, 2002).
Prova de que era possível clonar um mamífero utilizando células
somáticas completamente diferenciadas foi o nascimento da ovelha Dolly
(WILMUT et al., 1997). No experimento, células somáticas epiteliais da glândula
mamária de uma ovelha de seis anos de idade foram utilizadas. Com base nesses
resultados e observações, os autores provocaram uma das maiores revoluções
da ciência contemporânea e, além de responder ao questionamento de
SPEEMANN (1938), demonstraram a viabilidade da clonagem de indivíduos
adultos para todo o mundo, como mostram os quadros 1 e 2, onde há uma
evolução histórica das espécies animais submetidas à clonagem por TN com
resultados bem sucedidos.
5
A partir daí, a transferência nuclear de células somáticas (TNCS)
despertou ainda mais o interesse dos pesquisadores, sendo relatada com êxito
em diversas espécies, como em bovinos (CIBELLI et al., 1998; KATO et al.,
1998), suínos (BETHAUSER et al., 2000), equinos (GALLI et al., 2003),
camundongos (WAKAYAMA et al., 1998), caprinos (BAGUISI et al., 1999), cães
(LEE et al., 2005), gatos (SHIN et al., 2002) e bubalinos (SHIN et al., 2007).
QUADRO 1: Alguns exemplos de pesquisas em clonagem com utilização de
blastômeros como fontes doadoras de núcleo.
Ano Pesquisadores Espécie
1952 BRIGGS & KING Rãs
1966 GURDON & UEHLINGER Xenopus rãs
1981 ILMENSEE & HOPPE Camundongo
1986 WILLADSEN Ovino
1987 PRATHER et al.; ROBl et
al.
Bovino
1989 PRATHER et al. Suíno
6
QUADRO 2: Alguns exemplos de pesquisas em clonagem com utilização de
células somáticas como fontes doadoras de núcleo.
Ano Pesquisadores Espécie
1997 WILMUT et al. Ovino
1998 WAKAYAMA et al. Camundongo
1998
CIBELLI et al., KATO
et al.
Bovino
1999 BAGUISI et al. Caprine
2000 BETHAUSER et al. Suíno
2002 SHIN et al. Gato
2003 GALLI et al. Equino
2005 LEE et al. Canídeo
2007 SHIN et al. Bubalino
No Brasil, clones foram obtidos a partir de células embrionárias, fetais e
adultas. Em março de 2001, nasceu a bezerra “Vitória”, da raça Simental,
resultado do experimento da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
(Embrapa), em sua unidade de Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen).
Foi o primeiro animal produzido por TN na América Latina. No caso, utilizaram-se
células embrionárias e citoplasma de ovócitos pré-ativados com enucleação em
telófase II. “Vitória” apresentou comportamento e fertilidade normais e deu a luz
em 2004 à bezerra “Glória”, e em 2006 ao bezerro “Galante”, ambos gerados por
inseminação artificial. No dia 27 de abril de 2002, na Fazenda Panorama (Monte-
Mor, SP), nasce o “Marcolino” da USP, o primeiro clone a partir de célula
diferenciada jovem (fibroblasto fetal) de um feto bovino sem raça definida. O
animal apresentou desenvolvimento corporal, comportamental e sexual normal. O
clone brasileiro gerado a partir de célula diferenciada adulta foi chamado de
“Penta”, nascido em julho de 2002 em Jaboticabal-SP. No mês de dezembro de
2003, nasceu a “Bela” da USP, uma bezerra Nelore também obtida por TN de
7
célula diferenciada adulta. Ainda em 2003, no centro experimental Sucupira,
pertencente à Embrapa Cenargen, nasceu a “Lenda”, uma bezerra da raça
holandesa clonada a partir de células da granulosa de um ovócito retirado do
ovário de uma vaca morta. Com objetivo de fazer uma TN de um animal clone, foi
produzida a “Vitoriosa” da Embrapa – primeiro clone do clone da América Latina
(MELLO, 2003; MEIRELLES et al., 2007; RODRIGUES & RODRIGUES, 2009;
RUBIN et al., 2009; NEVES et al., 2010; TRECENTI & ZAPPA, 2013).
A geração de animais viáveis por meio dessa técnica demonstra que o
núcleo de células somáticas diferenciadas de mamíferos pode ser reprogramado
(mas nem sempre com reprogramação completa) quando transferido a um ovócito
enucleado (BRAGA & FRANCO, 2013).
Além das pesquisas e produções propriamente ditas de clones de
bovinos feitas pela Embrapa, algumas outras empresas realizam a produção de
clones comercialmente no Brasil, dentre elas podemos citar a In Vitro Brasil
Clonagem Animal S/A, a maior empresa de clonagem bovina, com entrega de
mais de 100 produtos aos seus clientes (IN VITRO, 2015).
Desde o ano de 2005, a empresa Vitrogen (empresa referência em
biotecnologia animal), em parceria com a Universidade de São Paulo – Câmpus
Pirassununga também produz clones em sua rotina (RODRIGUES &
RODRIGUES, 2009; VITROGEN, 2015).
Outra empresa importante no ramo é a Geneal, que, em parceria com a
Embrapa, oferece serviços de isolamento de células, de clonagem e suporte
necessário para registro animal junto a Associação Brasileira de Criadores de
Zebuínos.
2.2 Aplicações Potenciais
A produção de clones tem importância tanto para a ciência como para
a indústria. O interesse por essa biotécnica é explicado por sua gama de
aplicações na ciência básica, conservação animal, transgenia, produção animal e
medicina humana (SARAIVA, 2010). Dentre elas, podem-se citar as que visam
conhecer a interação núcleo-citoplasma na reprogramação nuclear, bem como
modificações após reconstrução, ou seja, melhor compreensão dos mecanismos
8
genéticos e epigenéticos envolvidos na embriogênese e também na interação
gênica no desenvolvimento embrionário e fetal (YAMAZAKI, 2006; PEREIRA &
FREITAS, 2009).
A clonagem também contribui para a conservação e regeneração da
biodiversidade (recursos genéticos), reproduzindo espécies em risco de extinção
(LANZA et al., 2000); por exemplo, em 1998, um grupo de pesquisadores da Nova
Zelândia clonaram a única fêmea bovina de uma raça extinta, Enderby Island, o
que resultou em 20 novas fêmeas, que serão inseminadas artificialmente
utilizando sêmen criopreservado de animais da mesma raça antes de serem
extintos (WELLS et al., 1998; MIRANDA, 2009). Ainda, mesmo se não estiverem
disponíveis ovócitos provenientes da mesma espécie que os animais doadores do
material genético, outra possibilidade é a clonagem interespécie. Nesse caso,
células doadoras de núcleo e ovócitos recipientes não pertencem à mesma
espécie (SILVA, 2013).
No tocante à produção animal, as escolhas para clonagem são animais
superiores em alguma característica fenotípica específica, de alto valor comercial,
valor afetivo ou de grande mérito genético. A clonagem favoreceu a multiplicação
de animais famosos (vivos e mortos) e ainda os que têm demanda de gametas
maior do que a produção. Ou seja, atualmente, a biotecnologia está restrita a
rebanhos de elite e animais com características especiais (MEIRELLES et al.,
2007). Na medida em que for possível sua aplicação comercial em larga escala, a
clonagem por TN terá um grande impacto na bovinocultura, assim, a espécie
bovina passa a ter uma condição semelhante com as espécies suína e aves, no
tocante a produção de linhagens (inclusive híbridas), a partir de um fenótipo
conhecido desejável (MEIRELLES, 2004).
Um passo importante no interesse comercial na produção de clones foi
a divulgação de um relatório elaborado pelo “Food and Drug Administration –
FDA”, afirmando, com base em uma série de estudos, que não há risco à saúde
humana associado ao consumo de produtos derivados (carne e leite) de clones
bovinos (HEYMAN et al., 2007; RUDENKO E MATHESON 2007 citado por
SARAIVA et al., 2010).
A clonagem terapêutica representa também outra área de pesquisa
com grande potencial de aplicação da TN, ela usa a biotécnica para produzir
9
células ou tecidos que possam ser utilizados em diferentes terapias, dentre elas
as doenças degenerativas, traumáticas ou de origem genética (RHIND et al., 2003
citado por TRECENTI & ZAPPA, 2013). Sendo uma importante ou a mais
importante aplicação da TN, a associação com a tecnologia de modificação
genética dos animais, os clones transgênicos (TG) (NEVES et al., 2010).
Os TG podem ser utilizados para a produção de proteínas humanas
recombinantes (biorreatores), xenotransplantes e estudos de doenças genéticas
humanas (NEVES et al., 2010). Atualmente, o termo transgenia é considerado
como a introdução de uma ou mais sequencias de DNA exógeno no genoma de
organismos pluricelulares capazes de serem expressas mediante a formação de
uma proteína funcional, modificação essa transmitida à progênie da espécie
manipulada (BRESSAN, 2008).
FU et al. (2008) afirmam que TG que expressam biofármacos ou
bioprodutos em suas excreções, a exemplo o leite, são chamados de biorreatores
e, ainda, esses animais são ferramentas úteis para a produção em massa de
proteínas humanas. Por exemplo, SCHINEKE et al. (1997) produziram ovelhas
que expressam no seu leite, o fator IX de coagulação sanguínea, sendo estes
bioprodutos muito úteis no tratamento de hemofilias. DENNING et al. (2001)
também produziram ovelhas biorreatores: no experimento, o gene da alfa-1-3-
galactosiltransferase (que causa rejeição aguda a transplantes) e da proteína PrP
(que causa doença da “vaca louca”) foram removidos do genoma, visando a
utilização dos órgãos dos animais para xenotransplantação.
Define-se Xenotransplante, o transplante de órgãos de outras espécies
para a espécie humana, a fim de reduzir o déficit de órgãos no mundo (MELO et
al., 2007), uma aplicação de maior controvérsia no ponto de vista social e ético
(SILVA, 2013).
Atualmente, o animal mais estudado em pesquisas de xenotransplante
é o suíno doméstico, pois, segundo RUMPF & MELO (2005), essa espécie possui
órgãos de tamanho, fisiologia e anatomia semelhante aos dos humanos; ainda,
esses animais crescem rapidamente, tornando-se maturos em curto período de
tempo; também têm alto índice de prolificidade e podem ser mantidos em
ambientes assépticos a custos baixos, além das técnicas de trasngênese para
alterar a imunogenicidade estão bem estabelecidas.
10
No quadro 3 estão indicados alguns dos grandes marcos na ciência e
na pesquisa quanto à utilização de animais transgênicos.
A criação de animais que sirvam como modelo experimental para
estudo de doenças humanas, consiste na produção de um animal designado a
expressar, em nível de genótipo ou fenótipo, certa doença humana (SILVA, 2013).
QUADRO 3: Marcos na transgenia e tecnologia reprodutiva em animais de
produção (bovinos, caprinos, ovinos e suínos).
Ano
Marco Referência
1985 -Primeiro suíno e
ovino transgênicos (TG)
(HAMMER et al.,
1985)
1986 -Clonagem
embriônica em ovinos
(WILLADSEN, 1986)
1991
-Primeiro bovino TG
-Alta produção de
biofármaco em leite de caprino
(KRIMPENFORT et
al., 1991)
(WRIGHT et al., 1991)
1992 -Primeiro suíno TG
resistente à infecção viral
(MULLER et al., 1992)
1994
-Primeiro suíno
expressando inibidores do
sistema complemento humano
(FODOR et al., 1994)
1996
-Primeira ovelha
expressando transgene no
folículo de lã
(DAMAK et al., 1996)
1997
-Clonagem somática
por TN em ovinos (Dolly)
-Primeiro animal TG
produzido por meio de TN
(WILMUT et al., 1997)
(SCHNIEKE et al.,
1997)
1998
-Primeiro bovino TG
produzido por meio de TN
(CIBELLI et al., 1998)
11
QUADRO 3: Marcos na transgenia e tecnologia reprodutiva em animais de
produção (bovinos, caprinos, ovinos e suínos). (continuação)
2000
-Primeira transgenia
por recombinação homóloga em
animal de produção
(MCCREATH et al.,
2000)
2001
-Primeira inativação
de um alelo em animal de
produção (heterozigoto)
(DENNING et al.,
2001)
2002
-Produção de fibra de
biopolímero a partir de células
(LAZARIS et al., 2002)
2003
-Primeiro bovino TG
capaz de produzir leite com
composição protéica alterada
-Primeira inativação
completa de um gene em
animal de produção
(BROPHY et al., 2003)
(PHELPS et al., 2003)
2004
-Primeira inativação
sequencial de dois genes em
bovinos
(KUROIWA et al.,
2004)
2005
-Primeiro bovino TG
resistente à infecção bacteriana
(mastite)
(WALL et al., 2005)
Fonte: Adaptado de RUMPF & MELO, 2007.
12
2.3 Baixa eficiência da TN
Apesar de vários relatos de bons resultados nos últimos anos, ainda
nota-se baixa eficiência no procedimento. A baixa viabilidade dos embriões
clonados é principalmente notada pela redução na taxa de implantação, pelo
aumento na taxa de mortalidade fetal e perinatal e ainda, pelas diversas
anomalias observadas nos recém-nascidos (MIGLINO, 2004; SARAIVA, 2010).
HEYMAN et al. (2002) citam alguns trabalhos apresentando que 0 a 5% dos
embriões transferidos obtiveram desenvolvimento a termo, fato este relacionado
ao impedimento de desenvolvimento pós-implantacional, mesmo em blastocistos
que aparentemente são normais.
CAMPBELL et al. (2007) relacionam o sucesso limitado da biotécnica
ser baixo com uma gama de razões, como tipo de célula doadora, fonte e
qualidade do ovócito ao início da maturação, método de cultivo embrionário,
falhas na reprogramação nuclear, expressão gênica anormal, variação entre
laboratórios, metodologias empregadas para as etapas de enucleação dos
ovócitos e reconstrução embrionária.
No embrião clonado, a reprogramação nuclear ocorre em ambiente
celular totalmente diferente e em curto período de tempo, o qual corresponde ao
intervalo entre a fusão do núcleo ao ovócito enucleado (citoplasto receptor) e a
ativação do genoma embrionário (SARAIVA, 2010).
Segundo PEREIRA et al. (2014), a origem da célula doadora de núcleo
define-se como o fator de maior importância biológica, podendo resultar em
variações nas taxas de sucesso da técnica, devido a três principais razões
imprevisíveis na escolha da célula: i) erros genéticos e epigenéticos no genoma
doador, ii) reprogramação genética ou epigenética incompleta e iii) associação de
ambas as razões.
Dependendo das células doadoras e da técnica utilizada, embriões
bovinos reconstituídos são capazes de desenvolver-se in vitro até o estágio de
blastocisto a uma taxa entre 20 e 60%, próxima à taxa de blastocisto de embriões
gerados por fertilização in vitro (FIV). (HEYMAN et al., 2005). Fato este
confirmado por MEIRELLES (2004): de 100 ovócitos manipulados em um dia por
um técnico experiente, pode-se produzir 50 zigotos, desses, 35 a 40% com taxa
13
de desenvolvimento a blastocisto semelhante aos processos de FIV. As taxas de
gestações também são semelhantes à FIV.
Todavia, a taxa de desenvolvimento do embrião ao estágio de
blastocisto não é o melhor indicador de qualidade embrionária, pois muitas das
alterações epigenéticas e de reprogramação nuclear incompleta não são
observadas na avaliação morfológica do embrião. Com isso, muitos embriões
morfologicamente “normais” que atingem o estágio de blastocisto são inovulados
em receptoras sincronizadas, mas que apresentam defeitos na reprogramação de
alguns genes e que podem se manifestar somente na prenhez (YAMAZAKI,
2006).
As principais anomalias observadas são cardiopatias, placentação
anormal, hidroalantóide, deficiência imunológica, disfunção renal, alterações no
metabolismo energético e hipertensão pulmonar (YOUNG et al., 1998; HEYMAN
et al., 2005; CAMPBELL et al., 2007).
Notam-se números inferiores de placentomas, além de placentomas
gigantes, grande quantidade de microcotilédones acessórios, grandes áreas sem
placentomas na membrana corioalantóide, edema das membranas placentárias e
aumento da espessura do cordão umblilical (HILL et al., 2000, MIGLINO et al.,
2007).
Segundo HILL et al. (2000), a falta ou ineficiente vascularização causa
um inadequado transporte da nutrição do saco vitelino para o alantoide, sendo um
causador das perdas iniciais em gestações de clones, também causada por
rejeição imune e as alterações nos placentomas. No diagnóstico aos 90 dias de
gestação, em mais da metade das prenhezes estabelecidas ocorre o aborto e, até
a obtenção do bezerro a termo, mais de 40% das gestações restantes são
perdidas (CIBELLI et al., 1998; HEYMAN et al., 2002).
Outro problema comum encontrado em bezerros clones é o elevado
peso ao nascer, também chamado de “Síndrome da Cria Gigante” (Large
Offspring Syndrome) (LOS). São observados aumento do tamanho fetal, aumento
da miogênese fetal e disfunção pulmonar, além das anomalias placentárias e
redução das taxas de gestação (YOUNG et al., 1998); 13,3 % dos bezerros
clones são afetados por essa síndrome (HEYMAN et al., 2007). Não se sabe
ainda se a LOS é um problema da clonagem, pois ela também já foi encontrada
14
em animais advindos de FIV, mas as taxas de ocorrência em clones são mais
altas (YAMAZAKI, 2006).
MEIRELLES (2004) afirma que a eficiência da técnica é baixa, mas
deve melhorar significativamente até que alcance a produção em larga escala. A
técnica tem evoluído bastante nos últimos tempos, porém ainda são necessários
mais estudos sobre fenômenos epigenéticos e de reprogramação nuclear, além
de requerer o trabalho de um veterinário especializado e extremamente
qualificado. Ainda, um estudo mais aprofundado sobre os processos de metilação
do DNA, sobre as alterações nas proteínas histonas e na ativação de genes
relacionados à pluripotência é de grande valia para que melhores índices de
obtenção de animais viáveis sejam alcançados (BRAGA & FRANCO, 2013).
2.4 Linhagens de células doadoras de núcleo
A grande diversidade de células reconhecidas em tecidos adultos é
derivada de uma única célula-ovo. Essa tem a propriedade de originar todos os
tecidos de um indivíduo adulto. Esse mecanismo acontece a partir da divisão da
célula-ovo, formando células idênticas e que, logo na formação do embrião, os
diferentes grupos celulares adquirem suas características específicas e vão
limitando sua capacidade de diferenciação (ALBERTS et al., 2010 citado por
GUASTALI, 2012). Essas células progenitoras são denominadas células-tronco
(CT).
As CT possuem três propriedades: I) auto renovação, ou seja,
capacidade de originar outra CT idêntica; II) habilidade de se diferenciar em mais
de uma linhagem celular; e III) capacidade de originar células funcionais nos
tecidos derivados da mesma linhagem (VERFAILLIE, 2002).
Sendo assim, por definição, as CT são células indiferenciadas capazes
de se diferenciar originando progenitores maduros, bem como células efetoras
especializadas (GUASTALI, 2012).
CT podem ser obtidas de diversos locais, tais como: embriões, sangue
do cordão umbilical, medula óssea, células mesenquimais, células de tecidos e
órgãos, células do sangue e células hematopoiéticas (DOSS et al., 2004 citado
por OLIVEIRA et al., 2006).
15
A classificação é dada de acordo com a potencialidade da célula,
podendo ser totipotente, pluripotente ou multipotente. Células capazes de gerar
todas as linhagens celulares embrionárias e extra-embrionárias (exemplo zigoto e
blastômero) são chamadas de totipotentes, enquanto que as pluripotentes têm
capacidade de originar todas as células que formam um embrião propriamente
dito e que são provenientes da massa celular interna (MCI) do blastocisto,
também chamadas de células-tronco embrionárias (CTE). Já as células
multipotentes são as que originam um subgrupo de linhagens celulares, por
exemplo, as células-tronco mesenquimais (CTM) (WAGERS & WEISSMAN,
2004).
Nesse contexto, tanto as CTE como as CTM podem ser utilizadas
como doadoras de núcleo na clonagem por TN. Utilizar CTE é superiormente
mais eficiente que células adultas, pois estudos comparativos demonstraram
evidentes diferenças na eficiência de várias linhagens ao obter um
desenvolvimento embrionário, onde os núcleos de células menos diferenciadas
suportaram melhor o completo desenvolvimento quando comparado com o núcleo
de células totalmente diferenciadas. Contudo, o uso delas possui limitações éticas
(JAENISCH et al., 2002; HOCHEDLINGER & JAENISCH, 2002).
Devido a essas limitações, células fetais tornaram-se uma fonte
alternativa para clonagem, haja vista sua menor quantidade de mutações e maior
habilidade proliferativa quando comparada às células somáticas adultas
(MIYOSHI et al., 2003).
A origem da célula doadora de núcleo consiste na etapa crucial para o
sucesso da técnica de TN, podendo ter efeitos importantes sobre a capacidade de
desenvolvimento pre-implantacional, fetal e pós-impantacional (PEREIRA &
FREITAS, 2009; FREITAS et al., 2013).
Com o sucesso nos experimentos utilizando linhagens fetais e adultas
(WILLADSEN, 1986 e WILMUT et al., 1997), diversas pesquisas evidenciaram
que células somáticas poderiam ser utilizadas com sucesso na TN. Atualmente,
células de vários tecidos e de animais de várias idades (fetos, recém-nascidos,
jovens, idosos e até mesmo de animais mortos após um período relativamente
curto) são relatadas como doadoras de núcleo na TNCS. Por exemplo: células da
glândula mamária, células musculares, fibroblastos de pele de orelha, células do
16
epitélio de oviduto, células do cumulus oophorus, células gonadais fetais,
fibroblastos fetais, fibroblastos da mucosa oral, células de Sertoli, células neurais,
(YAMAZAKI, 2006; ZHOU et al., 2007), leucócitos (GALLI et al., 1999) linfócitos B
e T (HOCHEDLINGER & JAENISCH, 2002), condrócitos (BEYHAN et al., 2000),
células do fígado e células uterinas (KATO et al., 2000).
E ainda assim não se conhecem quais são os tipos celulares mais
eficientes na TNCS, pelo fato de diferentes métodos serem utilizados na avaliação
e a eficiência da técnica ser baixa (MIYOSHI et al., 2003), o que se sabe é que
esses resultados são provas definitivas que o núcleo de uma célula somática
pode ser reprogramado a um estado pluripotente por fatores citoplasmáticos do
ovócito e que esse núcleo reprogramado pode desenvolver um indivíduo a termo
(MARTINS et al., 2008).
Rotineiramente, fibroblastos oriundos de fragmentos de pele são as
linhagens celulares mais utilizadas, pois sua manipulação é mais prática, as
condições de cultivo celular são bem conhecidas, tem produção de linhas
primárias estáveis, homogêneas, de alta capacidade mitótica e suportam bem a
criopreservação. Porém, seu grau de diferenciação é muito avançado, o que
compromete a reprogramação realizada pelo ovócito (HEYMAN et al., 2000). As
regiões da prega caudal e orelhas são os locais de maior facilidade de obtenção
de biópsias para isolamento de fibroblastos (MERIGUE, 2007; MARTINS et al.,
2008).
Segundo CREMONESI et al. (2011), as CTMs que têm sido isoladas
com maior sucesso na medicina veterinária são oriundas da medula óssea, pele,
tecido adiposo e sangue periférico. Os tecidos extra-embrionários, tecidos e
sangue do cordão umbilical, tecidos da placenta e fluido amniótico são tecidos
com células únicas e primitivas, o que indica serem boas fontes de CTMs fetais.
O fluido amniótico é composto por CTMs fetais com potencial de
especialização em multilinhagens, essas células apresentam capacidade para se
diferenciar em adipócitos, condroblastos, osteoblastos, tecido osteogênico e
linhagens de músculo liso (CREMONESI et al., 2011).
No mesmo sentido, as células do cordão umbilical possuem grande
potencial como doadoras de material genético em processos de reprogramação
nuclear, além de suas características pluripotentes, a natureza do procedimento
17
de isolamento não é invasiva e tem baixas implicações éticas. O cordão umbilical
é composto por veia e artérias umbilicais, matriz perivascular e, a mais importante
região para TN, a geléia de Wharton (GW) ou matriz do cordão umbilical. A GW é
um tecido conectivo mucoide composto por células fibroblastóides especializadas
e mastócitos ocasionais embebidos em uma substância rica em proteoglicanos,
que envolve as duas artérias e veia presentes na estrutura (CUNHA, 2013;
SILVA, 2013).
Também, a utilização do tecido adiposo vem sendo estudada; as
células são abundantes e acessíveis, a gordura subcutânea pode ser coletada de
maneira minimamente invasiva e ainda permite a extração de grande volume de
tecido (RODRIGUEZ et al., 2005, citado por SILVA, 2013).
Em experimentos com modelos animais, células derivadas do tecido
adiposo participaram na regeneração tecidual após transplante e apresentaram
um potencial de nova fonte de CT. Ou seja, a facilidade de coleta, a grande
quantidade que pode ser coletada e a multipotencialidade das CT derivadas de
adipócitos fazem com que elas sejam atrativas como fonte de células doadoras de
núcleo para TN em animais (RODRIGUEZ et al., 2005).
A eficácia da clonagem utilizando células do tecido adiposo como
doadoras de núcleo foi comprovada com o nascimento da bezerra Brasília, o
primeiro animal produzido por TN de células de gordura no mundo. Brasília é da
raça Guzerá, nascida nas dependências do Centro de Transferência de
Tecnologias de Raças Zebuínas com Aptidão Leiteira (CTZL) da Embrapa
Cerrados (Planaltina, DF), localizado no Gama (DF) (LOBATO, 2013).
Existe a possibilidade de utilizar as células doadoras de núcleo logo
após sua coleta ou após um período de cultivo, bem como antes ou depois da
criopreservação, no entanto, o cultivo prolongado pode resultar em alterações que
reduzem a eficiência da técnica. As modificações de cromatina e alterações
epigenéticas são um dos principais fatores que determinam o sucesso da TN
(GALLI et al., 1999, KUBOTA et al., 2000; CAMPBELL et al., 2007; SUTEEVUN et
al., 2006).
18
2.5 Sincronização do ciclo celular, tempo e cultivo das células doadoras de
núcleo
Uma série de processos perfeitamente coordenados entre si ocorre
durante o ciclo celular. O ciclo é subdivido nas fases grupo 1 (G1), síntese (S),
grupo 2 (G2) e mitose (M). A replicação do DNA nuclear ocorre em uma parte da
intérfase chamada de fase S. O intervalo entre o término da mitose e início da
síntese de DNA é denominado fase G1, enquanto que o intervalo entre final da
síntese de DNA e início da mitose é chamado de fase G2. Essas duas fases
propiciam o tempo para o crescimento celular. As células em G1 que ainda não
foram comprometidas com replicação de DNA podem ter seu crescimento
interrompido e passar para um estado de repouso, chamado de G0, no qual há
possibilidade de permanecerem por dias, semanas ou até mesmo anos antes de
voltarem a se multiplicar (ALBERTS et al., 2002 citado por TRECENTI & ZAPPA,
2013).
Núcleos em fase G0 (ou estado quiescente) são semelhantes às
células espermáticas no momento da fecundação, fato este importante para
correta ploidia do embrião. Núcleos de fase S ou G2 são impróprios para
reconstrução embrionária, pois ainda passam pela replicação de DNA e tornam os
embriões tetraploides (MELLO, 2003).
Segundo MIYOSHI et al. (2003), para que as células alcancem e
permaneçam em estado G0/G1, usualmente é realizada a redução de
concentração de soro no meio de cultivo de 10% para 0,5% ou pela inibição da
divisão celular pelo contato em células confluentes.
A sincronização do ciclo celular entre o núcleo da célula doadora com o
citoplasto receptor é importante para garantir que seja mantida a correta ploidia
após a reconstrução. Esse controle é realizado bioquimicamente pelo fator
promotor da fase M (MPF). Sua forma ativa atinge elevadas concentrações
citoplasmáticas e regula o processo de duplicação e divisão celular numa cascata
de eventos (quebra do envelope nuclear, condensação dos cromossomos,
reorganização do citoesqueleto e alterações na morfologia da célula), o que
permite que a célula entre em mitose ou meiose (NURSE, 1990, MASUI, 1992).
19
Na clonagem por TNCS, as células em G0/G1 têm baixos níveis de
MPF, enquanto que o ovócito receptor deve manter altos níveis de MPF, daí a
preferência de estar na fase de metáfase II, para que haja a correta
reprogramação nuclear antes das divisões celulares. Segundo WAKAYAMA et al.
(1998), a introdução do núcleo em fase G0 ou G1 diretamente no interior de
ovócitos enucleados em metáfase II promove uma exposição prolongada do
núcleo à níveis altos de MPF, com imediata quebra do envelope nuclear e
prematura condensação cromossômica, o que pode facilitar as modificações
nucleares essenciais para reprogramação e desenvolvimento.
Ainda, células sincronizadas em outras fases, como em fase M ou G2
também podem ser utilizadas na clonagem, porém, lança-se mão da utilização de
tratamento das células com algumas substâncias, exemplo nocodazole e
colchinina (WAKAYAMA et al., 1998 e LAI et al., 2002 citado por YAMAZAKI,
2006).
Geralmente, o protocolo para obtenção de linhagens celulares para TN
é basicamente o descrito no trabalho de MERIGUE et al. (2010); no caso, a
linhagem celular é fibroblasto de pele: A biópsia retirada do tecido do animal é
transportada para o laboratório em meio PBS. No laboratório, do tecido coletado,
são retirados pequenos fragmentos (aproximadamente 2 milímetros) e fixados em
uma placa de Petri. O cultivo é feito em meio DMEM e suplementado com 20% de
soro fetal bovino (SFB) e antibiótico. A incubação é realizada em temperatura de
aproximadamente 38,8ºC e atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Permanece
em estufa por uma semana sem mudar de meio, ou, mudando a cada três dias
por um novo, mas com as mesmas substâncias, até que apresente confluência de
crescimento celular no fundo da placa. A cada troca de meio ou manipulação das
células, é contada uma nova passagem.
Deve-se verificar se as células estão confluentes por no mínimo dois
dias antes de utilizá-las para a TN, o que se presume que elas encontram-se no
estágio G0 do ciclo celular. A desagregação celular é feita pela tripsina e, as
células desagregadas são colocadas na placa que será levada ao
micromanipulador para as próximas etapas do procedimento (SILVA, 2013).
Após atingir a confluência, as células podem ser transferidas para
outras placas, sendo as células utilizadas para TNCS após três ou quatro
20
passagens. Estas células são mantidas em confluência ou cultivadas em meio
suplementado com 0,5% de soro, a fim de aumentar a proporção de células em
G0 e G1(CHESNÉ, 2006).
CAMPBELL et al. (2007) afirmam que o cultivo prolongado das células
somáticas pode causar alterações importantes tanto no aspecto fisiológico, como
genético e epigenético, por exemplo os marcadores celulares, ploidia, estabilidade
genômica e grau de diferenciação celular. Porém, KUBOTA et al. (2000) disseram
que animais saudáveis podem ser produzidos através de células em diferentes
números de passagens (5 a 15) sem problemas pré e pós natais.
A utilização de células advindas de cultivos prolongados preocupa a
eficiência da TN quanto à senescência, a qual causa comprometimento das
divisões celulares e também pode desestabilizar os eventos biológicos
subsequentes após a enucleação, o que prejudica e interrompe o
desenvolvimento do embrião (CUNHA, 2013).
Resultados do trabalho de MERIGUE et al. (2010) confirmam os
melhores índices com utilização de células doadoras de passagens iniciais (3 a 5)
e intermediárias (6 a 8) do que passagens tardias (9 a 12). Além de zigotos
reconstituídos com células de passagens iniciais apresentarem maior capacidade
para o desenvolvimento a blastocisto. Ou seja, células doadoras de núcleo
cultivadas que tiveram muitas passagens diminuem a produção de blastocistos e
aumentam as chances de perdas na gestação.
2.6 Citoplastos Receptores
A fonte e a qualidade do citoplasma receptor (citoplasto ou ovócito
enucleado) representam importantes fatores para o sucesso na TNCS.
Geralmente, utilizam-se ovócitos maturados in vitro em estádio de metáfase II.
Ovários de abatedouro têm sido usados na rotina dos laboratórios, devido à
grande disponibilidade e baixos custos na aquisição (PEREIRA, 2010; SARAIVA
et al., 2010; SARAIVA, 2010).
Geralmente, o protocolo de coleta de ovários e maturação in vitro
(MIV) dos ovócitos é o descrito nos trabalhos de SILVA (2013), FORELL et al.
(2008) e GUASTALI (2012): Ovários são obtidos de abatedouro e mantidos em
21
solução fisiológica de 30ºC a 35ºC com antibiótico. Os Complexos cumulus-
ovócitos (CCO) são aspirados de folículos de diâmetro de 2 a 8 milímetros.
Ovócitos que apresentam citoplasma de aspecto homogêneo e escuro, e
compactação das células do cumulus, com duas a três camadas de células de
revestimento, são os melhores para seleção e MIV.
Os ovócitos selecionados são maturados em meio TCM199,
suplementado com 10% de SFB, antibióticos, hormônios e cobertos com óleo
mineral por um período de 12 a 24 horas em estufa, com temperatura de 38,5ºC,
atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Após o final da maturação, os CCO são
transferidos para meio HSOF, onde as células do cumulus oophorus são
removidas por pipetagem. Os ovócitos maturados selecionados são os que
apresentam corpúsculo polar e citoplasma com aspecto homogêneo (SILVA,
2013; GUASTALI, 2012; FORELL et al., 2008).
Para que ocorra a reconstrução do embrião através da TN, é
necessária a remoção dos cromossomos (enucleação) do ovócito receptor. A
enucleação é feita após a separação das células do cumulus e seleção criteriosa
dos ovócitos maturados. Essa separação se dá com a transferência dos ovócitos
em uma solução com hialuronidase e depois pipetados várias vezes com uma
pipeta fina (BORDIGON & SMITH, 2002).
No procedimento convencional, a enucleação é feita em um
micromanipulador, utilizando ovócitos em estádio de metáfase II. Ocorre a
aspiração do primeiro corpúsculo polar e de parte adjacente do citoplasma, onde
se encontra a placa metafásica, para o interior de uma micropipeta. Os
cromossomos em metáfase II não são bem visíveis em microscopia ótica, desse
modo, a maioria dos protocolos utiliza o corante específico de DNA Hoechst
33342, o qual reflete fluorescência azul quando exposto à radiação ultravioleta, o
que permite a visualização da cromatina dentro da micropipeta ou ausência de
fluorescência no ovócito e assim, confirma a enucleação (PEREIRA, 2010;
SARAIVA, 2010; SARAIVA et al., 2010; SILVA, 2013).
2.7 Técnica de Transferência Nuclear
22
Após os procedimentos de cultivo e sincronização celular, bem como
maturação e enucleação de ovócitos citados acima, a TNCS é realizada com a
reconstrução embrionária propriamente dita pela transferência de núcleo, fusão
dos complexos citoplasto-carioplasto, ativação do complexo e desenvolvimento
pré-implantacional in vitro e, após o cultivo embrionário, transferência dos
embriões reconstituídos para receptoras previamente sincronizadas. Todas essas
etapas influenciam no resultado final da técnica e estão descritas na figura 1
(PEREIRA et al., 2014).
FIGURA 1- Apresentação esquemática dos diferentes eventos da TNCS em ruminantes. Fonte: PEREIRA, 2010.
23
HEYMAN (2005) afirma que, para que ocorra a reconstrução do
embrião, o núcleo da célula doadora é transferido para o interior do ovócito
enucleado. Cada célula doadora, após período de cultivo e sincronização, é
inserida no espaço perivitelino do ovócito enucleado. Posteriormente, o complexo
sofrerá uma estimulação com pulso elétrico, o qual promove a fusão das
membranas adjacentes. Esse pulso elétrico não somente induz a fusão da célula
com o ovócito, mas também promove a liberação de cálcio intracelular que inicia o
processo de ativação. Deve-se utilizar meio de baixa condutância elétrica para
evitar produção e dispersão de calor, sendo uma das soluções mais utilizadas o
Manitol (BORDIGNON & SMITH, 2002).
A reconstrução é realizada no micromanipulador, onde se utiliza a
micropipeta para inserir uma única célula no citoplasma receptor (ovócito
enucleado), pelo mesmo orifício que foi feito para promover a enucleação (SILVA,
2013).
O evento característico da ativação ovocitária é o início das oscilações
intracelulares de cálcio, a exocitose de grânulos corticais, o recrutamento de
mRNAs, a formação dos pró-núcleos e o início da síntese de DNA (CAMPBELL et
al., 2005).
Ainda, a ativação dos complexos reconstruídos pode ocorrer por
exposição à substâncias químicas como a ionomicina, o 6-Deimethylamino-purine
(6-DMAP), o etanol, o cálcio ionóforo, o estrôncio e o cicloheximide, os quais
regulam o influxo de cálcio e podem ser utilizados individualmente ou em conjunto
(LIU et al., 1998; WAKAYAMA et al., 1998; NIEMANN & LUCAS-HAHN, 2012).
Por fim, os embriões reconstituídos são cultivados até o estádio de
blastocisto, utilizando sistemas de cultivo que são usados na rotina de produção
in vitro (PIV) de embriões. Geralmente, o cultivo necessita de uma suplementação
de componentes para auxiliar no desenvolvimento, mas que num período longo
de exposição, podem alterar negativamente a qualidade do embrião. Dentre
esses componentes, pode-se citar o SFB, albumina sérica bovina (BSA), fatores
de crescimento e vitaminas, fluido de oviduto sintético (SOF). Após o cultivo, os
embriões podem ser submentidos à criopreservação em nitrogênio líquido ou à
inovulação em fêmeas previamente sincronizadas (THOMPSON, 2000; KEEFER
et al., 2001; SILVA, 2013).
24
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
É notório o alto potencial da produção agropecuária do Brasil. Frente a
essa capacidade, o desenvolvimento da pecuária conta com a utilização de novas
biotecnologias em reprodução animal, visando à maximização do lucro, redução
dos custos com bons resultados e atendendo aos interesses das comunidades
interessadas. Nesse contexto, a tecnologia de clonagem por transferência nuclear
em bovinos surge como uma forte alternativa de auxílio na produção, gerando
grande impacto e interesse tanto na pesquisa quanto no setor produtivo.
Apesar de apresentar bons resultados, a eficiência da técnica ainda é
baixa e sua produção é em pequena escala devido às etapas complexas,
delicadas, mão-de-obra artesanal e muito especializada, e ainda o
desconhecimento de algumas falhas na reprogramação nuclear. Ou seja, o
“normal” atualmente ainda é o insucesso na maioria dos procedimentos. Portanto,
são necessários mais estudos sobre a interação celular e principalmente sobre a
reprogramação epigenética na TN, tornando a biotécnica mais acessível, de
protocolos de manipulação bem estabelecidos, até que se consiga uma
automatização e produção em larga escala, atingindo níveis comerciais e
acessíveis à grande maioria dos produtores. Além de contribuir para a saúde da
população humana, haja vista a possibilidade de produção de bioprodutos de
animais transgênicos, xenotransplantes e outras aplicações potenciais que essa
tecnologia oferece.
25
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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33
5. RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO OBRIGATÓRIO
O estágio foi realizado no Centro de Transferência de Tecnologias de
Raças Zebuínas com Aptidão Leiteira (CTZL), sob orientação do Dr. Carlos
Frederico Martins no período de 03 de Agosto de 2015 a 16 de Outubro de 2015,
na área de reprodução animal.
O CTZL é uma unidade da Embrapa Cerrados localizado no Núcleo
Rural Ponte Alta, DF 180, km 64, Gama-DF. Tem como missão “aglutinar ações e
parcerias em diferentes programas e instituições no sentido de otimizar recursos
financeiros e humanos. O centro é um instrumento de apoio à melhoria da
capacitação e do treinamento voltados à cadeia produtiva do leite e à agricultura
familiar. Concomitantemente, as ações desenvolvidas visam à atuação na
avaliação, caracterização, multiplicação, conservação e no fomento das raças
zebuínas com aptidão leiteira”, além de ser uma propriedade produtora de leite.
5.1 Planos de Atividades
- acompanhar a coleta de ovários no frigorífico;
- colaborar na aspiração folicular;
- acompanhar os experimentos de TN;
- colaborar no campo com manejo animal.
5.2 Atividades Desenvolvidas
Várias atividades foram desenvolvidas conforme descritas no quadro 1,
dentre elas, de rotina e outras esporádicas, quando houvesse necessidade.
Rotineiramente, toda segunda-feira, eram aferidos os níveis de
nitrogênio dos botijões criogênicos, com auxílio de uma régua específica era
mensurado o nível de nitrogênio e anotado no papel de registro semanal. O limite
mínimo adotado foi de 18 cm, sendo que quando os níveis estavam próximos do
limite, logo era solicitado o reabastecimento do botijão.
34
Também em todas as segundas-feiras, eram aferidos o nível de CO2
com a utilização do instrumento Bacharach e a temperatura das estufas utilizando
os termômetros que ficavam no interior delas, além de conferir se havia sujidades
e fungos no interior da estufa.
Os resultados aferidos eram confrontados com o que estava exposto
no painel das estufas e, caso houvesse divergência, imediatamente a responsável
pelo laboratório (Heidi Bessler) era chamada para tomar as devidas providências.
Caso fossem encontrados fungos e/ou qualquer sujidade na estufa, todo material
dela era transferido para outra estufa, e logo era lavada com detergente neutro
específico, enxaguado abundantemente em agua corrente. Após, também
enxaguado em água destilada e secagem a temperatura ambiente, era borrifado
álcool 70% e, após nova secagem, os utensílios eram recolocados na estufa. A
troca de água das estufas era feita em todas as terças-feiras, a água era destilada
e autoclavada no dia anterior, permanecendo na autoclave até o momento da
troca, assim, estaria em temperatura ideal para ficar na estufa.
.
5.2.1 Lavagem e esterilização de material
O laboratório de reprodução animal do CTZL conta com um ambiente
somente para lavagem e esterilização do material utilizado nos procedimentos. O
local contém uma pia, um destilador, três baldes para armazenar água destilada,
duas bacias para colocar os materiais sujos, duas estufas de secagem, uma
autoclave, um microondas e uma seladora.
De acordo com a frequência de uso dos materiais no laboratório, o
processo de lavagem e esterilização era feito uma vez por semana ou a cada 15
dias.
Das duas bacias, uma era somente para colocar materiais de FIV, os
quais requerem maiores cuidados e limpeza e não devem se misturar aos outros
utensílios do laboratório, sendo lavados primeiramente.
Na lavagem era utilizado detergente neutro específico e bucha de
cozinha comum. Após enxague em água corrente, os materiais eram submetidos
a três banhos em água destilada e depois encaminhados às estufas de secagem.
Os materiais totalmente secos, não apresentando sujidades nem arranhões
35
fortes, eram embalados com plástico apropriado e selados com a utilização da
seladora. Os materiais em plástico que derretem facilmente eram esterilizados em
micro-ondas por 5 min, enquanto que materiais mais resistentes e vidrarias eram
submetidos à autoclavagem. Após este processo, eram novamente
encaminhados às estufas de secagem e, quando totalmente secos, eram
acondicionados em seus respectivos locais.
5.2.2 Coleta e aspiração de ovários
Para realização dos experimentos no laboratório de micromanipulação,
são necessários ovócitos, estes eram aspirados de ovários de vacas abatidas em
frigorífico ou aspirados in vivo, o que não ocorreu no período de estágio.
Foram coletados ovários de frigoríficos localizados no GAMA-DF
(frigorífico Boa Carne) e em ANÁPOLIS-GO (frigorífico FriGoiás). Os ovários
coletados eram armazenados em frascos de 500 ml contendo solução fisiológica
salina (0,9%) e antibiótico. A solução era pré-aquecida e mantida a temperatura
de 34ºC e 36ºC até o momento da chegada ao laboratório de reprodução. Dentro
do laboratório, os frascos cheios de ovários eram colocados em banho-maria sob
temperatura de 35ºC e logo se procedia à aspiração folicular.
A aspiração era feita utilizando seringa de 10 ml e agulha 40x12. O
líquido aspirado era depositado em tubos de 15 ml, também mantidos em banho-
maria a 35°C e permanecendo no aparelho até que o conteúdo se sedimentasse
totalmente. Após essa etapa, os tubos eram encaminhados ao laboratório de
micromanipulação e lá era feito o rastreamento, seleção e escolha dos melhores
ovócitos.
5.2.3 Obtenção de biópsias de pele para isolamento e cultivo de fibroblastos
Duas bezerras da raça Gir foram utilizadas para obtenção de biópsias
de pele para cultivo de fibroblastos. Em uma ocasião, foi coletado pequeno
fragmento da região perineal (abaixo da cauda) dos animais e, em outro
momento, pequena região da orelha das bezerras foi extraída.
No procedimento, os animais foram contidos nos bretes de contenção e
submetidos à anestesia local com lidocaína 2%. O fragmento de pele foi extraído
36
com auxílio de uma tesoura e um bisturi. O material coletado foi depositado em
tubo falcon contendo meio PBS e levado ao laboratório.
Em comparação, foi mais fácil a separação das estruturas nos
fragmentos das orelhas do que dos fragmentos da região perineal, essa região é
abundante em gordura e isso dificulta a separação dos tecidos.
Após separação dos tecidos, pequenos fragmentos eram colocados em
placas contendo meio de cultivo e ali permaneciam por aproximadamente uma
semana, após, analisou-se o crescimento e confluência celular no fundo da placa.
Em duas ocasiões, orelhas de bovinos foram coletadas em frigoríficos
na intenção de obter fragmentos de tecidos e cultivar fibroblastos para analisar se
os meios de cultivo e os protocolos utilizados estão corretos, podendo assim
detectar e solucionar algumas falhas.
5.2.4 Outras atividades de Laboratório
Também houve acompanhamento nos procedimentos de
congelamento de células, onde palhetas eram envasadas com as células e meios
de congelamento (crioprotetores) e encaminhadas à Embrapa Hortaliças
(aproximadamente 3 km distante do CTZL), que gentilmente cede um espaço no
freezer do laboratório de virologia para que as células sejam congeladas a – 80ºC
e permanecendo lá por 24 horas. Após, no momento de buscar essas palhetas,
elas são submersas em nitrogênio líquido presente em uma pequena caixa de
isopor até que chegue ao CTZL, sendo então submetidas à criopreservação em
botijões criogênicos.
Ainda, houve o acompanhamento nos procedimentos de
micromanipulação das células cultivadas e dos ovócitos maturados in vitro, ou
seja, a enucleação ovocitária e a transferência de núcleo. Além de acompanhar
os procedimentos de eletrofusão e ativação do complexo.
5.2.5 Atividades desenvolvidas a campo
As atividades de campo foram desenvolvidas sob orientação do Médico
Veterinário funcionário da Embrapa Álvaro Moraes da Fonseca Neto. Umas das
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atividades foi o auxílio na coleta de sangue de novilhas para exame de brucelose
e acompanhamento do exame propriamente dito.
Outra importante tarefa foi o manejo de bezerros, tanto recém-nascidos
quanto nascidos há algum tempo. Infusão de soro fisiológico e vitaminas,
administração de medicamentos e sondagem foram algumas das incumbências,
além de pesagem dos animais PO e principalmente administração de leite por
mamadeira nos bezerros com algum tipo de dificuldade em mamar na vaca.
Ainda, tratamento de ferida causada por cerca de arame liso em uma bezerra da
raça Gir.
Também, me foi passado ensinamentos quanto à formulação de ração
para vacas produtoras de leite bem como a fabricação, utilizando basicamente
milho, soja, uréia e sal mineral.
Quanto a questões reprodutivas, diversas vezes utilizamos a
ultrassonografia para diagnóstico de gestação e detecção de problemas em vacas
(exemplo: luteomas, cistos, mucometra). As gestações, em sua maioria, eram
oriundas de transferência de embriões ou de inseminação artificial (IA). Houve
também o auxílio e acompanhamento de alguns procedimentos de IA e
inseminação artificial em tempo fixo (IATF), como administração de hormônios e
detecção de cio.
No período de estágio, ocorreu o auxílio em um parto, pois o bezerro
estava com um dos membros torácicos dobrados na região pélvica da mãe, o que
estava impedindo sua saída. No caso, foi feita a correção manual da posição do
animal e, depois de posicionado corretamente, fez-se leve tração com cordas
amarradas aos membros torácicos, assim, possibilitando o parto.
Ainda, novilhas de primeira cria da raça Gir foram submetidas à
“escolinha” de ordenha e verificou-se as dificuldades no manejo desses animais
no momento de amansá-los, o que exige muita paciência e tempo para que
estejam aptos para retirada do leite produzido.
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Quadro 1 – Atividades desenvolvidas no período de estágio
ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
NÚMERO
Conferência dos níveis de nitrogênio
dos botijões criogênicos e níveis de
CO₂ e temperatura das estufas
*
Lavagem de materiais da estufa
2
Lavagem e esterilização de materiais
utilizados no laboratório
12
Coleta de ovários em frigoríficos
10
Aspiração folicular de ovários de
frigoríficos
450
Coleta de biópsias em novilhas
4
Coleta de orelha de bovinos em
frigorífico
2
Congelamento de células a -80°C e
criopreservação em nitrogênio líquido
3
Palpação e ultrassonografia em vacas
60
Manejo de bezerros
5
Acompanhamento nos procedimentos
de Transferência Nuclear
2
39
Necrópsia em bezerra
1
Fabricação de ração
3
Inseminação Artificial em vacas
1
Auxílio em parto de vaca
1
“Escolinha “ em novilhas de primeira
cria
1
*Realizada toda segunda-feira
5.3 Considerações finais sobre o estágio supervisionado
Apesar de o estágio ser de um período relativamente curto, as
atividades desempenhadas nesse período foram de grande importância e
somaram muito no meu conhecimento acadêmico. Tecnologias que antes só
eram vistas em literatura foram observadas e acompanhadas na prática.
Poder ter estagiado em um centro de referência em pesquisa
agropecuária foi de grande valia para minha formação acadêmica, haja vista os
conhecimentos e ensinamentos a mim passados, os quais poderão ser utilizados
em um futuro próximo no meu exercício profissional.
A competência e paciência de todos os funcionários do CTZL fazem
com que o ambiente de trabalho se torne agradável e mais produtivo em todos os
sentidos, o que significa que o trabalho em equipe no local é bem desempenhado
e administrado.
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