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UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ - UNOCHAPECÓ
Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais
Riciéri Naue Mocelin
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA SOBRE PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS EM PEIXES-ZEBRA
Chapecó – SC, 2015
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UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ
Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA SOBRE PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS EM PEIXES-ZEBRA
Riciéri Naue Mocelin
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Universidade Comunitária da região de Chapecó, como parte dos pré-requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais.
Orientadores: Prof. Dr. Angelo Piato Prof. Dra. Leila Zanatta
Chapecó – SC, 2015
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RESUMO MOCELIN, Ricieri Naue. Efeitos da N-acetilcisteína sobre parâmetros comportamentais em peixes-zebra. Dissertação (Mestrado). Universidade Comunitária da Região de Chapecó, 2014, 44p. Os transtornos de ansiedade apresentam elevada prevalência e podem causar impactos importantes na qualidade de vida dos indivíduos. Para o tratamento desses transtornos são utilizados ansiolíticos, fármacos com eficácia limitada e com relevante incidência de efeitos adversos. Dessa forma, é fundamental a busca por novos compostos mais eficazes e com menos efeitos adversos. Nesse contexto, considerando o papel da N-acetilcisteína (NAC) como modulador de importantes sistemas de neurotransmissão relacionados a psicopatologias, o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da exposição à NAC sobre parâmetros comportamentais em peixes-zebra. Peixes-zebra de ambos os sexos foram expostos à NAC (0,1, 1,0 e 10,0 mg/L), fluoxetina (10,0 mg/L) ou bromazepam (1,5 mg/L) por 10 minutos. Posteriormente, os animais foram individualmente submetidos aos testes comportamentais. Os protocolos experimentais foram aprovados pela CEUA-Unochapecó (nº 019/13). Os resultados foram analisados por ANOVA de uma ou duas vias seguida do post-hoc de Tukey (n=12-15). Inicialmente, avaliou-se o efeito da NAC e fluoxetina no teste de tanque novo por 6 min. NAC não alterou nenhum parâmetro comportamental, enquanto que animais expostos à fluoxetina apresentaram significativamente aumento no tempo de permanência na porção superior do aquário (p<0,01 x controle). No segundo protocolo, avaliou-se o efeito da NAC em um modelo de estresse agudo por perseguição. Após os tratamentos, animais foram perseguição com uma rede por 2 minutos e submetidos ao teste de tanque novo. NAC preveniu as alterações comportamentais induzidas pelo estresse agudo por perseguição. No terceiro protocolo, peixes-zebra foram expostos aos tratamentos anteriores e submetidos ao teste de claro-escuro. Animais expostos à NAC aumentaram significativamente o tempo de permanência no lado claro do aparato em relação ao controle (p<0,05). Esse efeito foi comparável ao ansiolítico bromazepam. Os resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez que a NAC possui propriedades anti-estresse e tipo-ansiolítica em peixes-zebra, com o potencial de prevenir desordens psiquiátricas induzidas pelo estresse, tais como ansiedade e depressão. Mais estudos são necessários para justificar o uso da NAC em transtornos psiquiátricos. Palavras-chave: N-acetilcisteína; Ansiedade; Estresse; Peixe-zebra.
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ABSTRACT MOCELIN, Ricieri Naue. Effects of N-acetylcysteine on behavioral parameters in zebrafish. Dissertation (Master). Universidade Comunitária da Região de Chapecó, 2014, 44p. Anxiety disorders have high prevalence and may cause significant impacts on the life quality of the individuals. For the treatment of these disorders are used anxiolytics, drugs with limited effectiveness and significant incidence of adverse effects. Thus, it is essential to search for new compounds, more effective and with fewer side effects. Considering the role of N-acetylcysteine (NAC) as a modulator of important neurotransmission systems related to psychopathology, the aim of this study was to evaluate the effects of exposure to NAC on behavioral parameters in zebrafish. Zebrafish of both sexes were exposed to NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L), fluoxetine (10.0 mg/L) or bromazepam (1.5 mg/L) for 10 minutes. After, the animals were individually subjected to behavioral testing. The experimental protocols were approved by CEUA-Unochapecó (No. 019/13). Results were analyzed by one or two ways ANOVA followed by Tukey post-hoc (n= 12-15). Initially we evaluated the effect of NAC and fluoxetine in the novel tank test for 6 min. NAC did not change any behavioral parameters evaluated, while animals exposed to fluoxetine showed significantly increased time in the upper portion of the tank (p<0.01 x control). In the second protocol, we evaluated the effect of NAC in an acute stress model for persecution. After the treatments, animals were chased with a net for 2 minutes and submitted to the novel tank test. NAC prevented the behavioral changes induced by acute stress. In the third protocol, zebrafish were exposed to previous treatments and subjected to the light-dark test. Animals exposed to NAC significantly increased the time spent in the light side of the apparatus compared to control (p<0.05). This effect was comparable to bromazepam. The results of this study demonstrated for the first time that NAC has anti-stress properties and anxiolytic-like effects in zebrafish, to potentially prevent the stress-induced psychiatric disorders such as anxiety and depression. More studies are needed to justify the use of NAC in psychiatric disorders. Keywords: N-acetylcysteine; anxiety; stress; Zebrafish.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Schematic representation of the experimental protocol................................. 33
Figura 2 - Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total
distance traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom
(D), time in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the novel tank
test in zebrafish............................................................................................................... 34
Figura 3 - Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total
distance traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom
(D), time in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the acute stress
test in zebrafish............................................................................................................... 35
Figura 4 - Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and BMZ (1.5 mg/L) on time in the
lit side of the tank (A), latency to first crossing (B) and number of crossings (C) in the
light/dark test.................................................................................................................. 36
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Principais ansiolíticos utilizados na clínica................................................... 11
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LISTA DE ABREVITAURAS
5-HT Serotonina
AMPA α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiônico
BZP Benzodiazepínicos
DSM-V Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais 5ª (V) edição
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
GABA Ácido Gama-aminobutírico
GSH Glutationa
ISRS Inibidor Seletivo da Recaptação de Serotonina
mGluR Receptor Glutamatérgico do tipo Metabotrópico
NAC N-acetílcisteína
NMDA N-metil-D-aspartato
NOR Noradrenalina
SNC Sistema Nervoso Central
TST Tail Suspension Test (Teste de Suspensão pela Cauda)
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 09
2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 17
2.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 17
2.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 17
3 ARTIGO CIENTÍFICO ......................................................................................... 18
3.1 Introduction ............................................................................................................. 21
3.2 Materials and Methods ............................................................................................ 22
3.3 Results ..................................................................................................................... 24
3.4 Discussion ............................................................................................................... 25
Referênces ..................................................................................................................... 28
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 37
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 39
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1 INTRODUÇÃO
As psicopatologias causam impactos importantes na vida das pessoas e na
sociedade. Uma meta-análise realizada por Walker e colaboradores (2015) mostrou que
a mortalidade é maior entre os pacientes com algum tipo de transtorno mental em
comparação à população geral. Alterações no estado mental são responsáveis por cinco
a cada dez das principais causas da incapacidade e morte prematura (Insel et al., 2013).
O custo global para o tratamento de distúrbios de saúde mental em 2010 foi de 2,5
trilhões de dólares e deverá aumentar para 6,5 trilhões até 2030 (Bloom et al., 2011).
Além disso, é estimado que aproximadamente 14% das mortes em todo mundo seja
atribuída a algum transtorno mental (Walker et al., 2015). Esse panorama é agravado
pelo fato de que indústrias farmacêuticas estão investindo cada vez menos em pesquisa
e desenvolvimento de novos psicofármacos e retirando ou redirecionando seus esforços
para outras áreas (Insel and Sahakian, 2012). Um dos motivos para essa perda de
interesse é que os psicofármacos atualmente disponíveis no mercado apresentam
eficácia limitada e alta incidência de efeitos adversos. Além disso, apesar do grande
número de novos compostos satisfatoriamente avaliados em estudos pré-clínicos, a
maior parte desses candidatos falha nos estudos clínicos (Insel, 2012). Sabe-se que
aproximadamente 80% de indiferentes compostos já testados falharam na Fase II dos
ensaios clínicos e 70% dos resultados pré-clínicos não são replicáveis (Kola and Landis,
2004).
A ansiedade é um transtorno psiquiátrico crônico e frequentemente
incapacitante, representando um alto custo para os indivíduos, para as famílias e para a
sociedade (Kessler et al., 2007). Esse transtorno induz importante morbidade
neuropsicológica, sendo a forma mais comum de transtorno psiquiátrico, afetando cerca
de 25 a 30% da população e ocorrendo em pelo menos um episódio durante a vida
(Kessler et al., 2005). De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos
Mentais (DSM-V, 2014), os transtornos de ansiedade são classificados em: transtorno
de ansiedade de separação, transtorno de pânico, agorafobia, transtorno de ansiedade
social (fobia social), transtorno de ansiedade generalizada, transtorno de ansiedade
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induzida por substância, transtorno de ansiedade associado a outra condição médica e
transtorno de ansiedade sem outras especificações.
O tratamento dessa psicopatologia é realizado através de assistência psicológica
e farmacoterapia; no entanto, se estima que cerca de 40-50% dos pacientes são
refratários (Wu et al., 2012). Os fármacos de primeira escolha para o tratamento são os
ansiolíticos (benzodiazepínicos e não-benzodiazepínicos), os antidepressivos (inibidores
seletivos da recaptação de serotonina (5-HT) (ISRS) e os inibidores da recaptação de 5-
HT e noradrenalina (NOR)). No entanto, esses fármacos causam diversos efeitos
colaterais, incluindo sonolência, sedação e diminuição da coordenação motora (no caso
dos benzodiazepínicos (BZP)), disfunções sexuais, gastrointestinais e de sono (no caso
dos antidepressivos) (Wu et al., 2012), O uso crônico dos BZP pode provocar tolerância
e/ou dependência, além de síndrome de abstinência e altas doses podem ser fatais,
principalmente se utilizadas com outros depressores do SNC (Goodman and Gilman,
2012). Além disso, os ISRS funcionam adequadamente em apenas 30-40% dos
pacientes (Stein and Andrews, 2015). Tanto o uso de BZD como o de ISRS está
associado ao aumento na taxa de suicídio, sendo esse aumento de 31% e 45% para
antidepressivos e BZD, respectivamente (Tiihonen et al., 2015).
Os principais ansiolíticos (e nomes comerciais), o mecanismo de ação e os
principais efeitos adversos estão descritos na tabela 1 abaixo.
Tabela 1: Principais ansiolíticos utilizados na clínica.
Princípio Ativo Nome Comercial Mecanismo de Ação Efeitos Adversos
Benz
odia
zepí
nico
s
(BZP
)
Diazepam Valium® Modula os efeitos pós-sinápticos da transmissão de GABAA, resultando num aumento da inibição pré-sináptica.
Sedação, leve perda de memória, diminuição do estado de alerta, tempo reação retardado, déficit visuais-espaciais, reações amnésicas, irritabilidade
Clonazepam Rivotril®
Oxazepam Serax®
Bromazepam Somalium®
Lorazepam Lorax®
Alprazolam Frontal®
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Ago
nist
a 5-
HT 1
A
Buspirona Buspar® Agonista parcial seletivo nos receptores 5-HT1A e 5-HT2 de 5-HT. Possui moderada afinidade por receptores D2 de dopamina. Sem qualquer efeito sob GABA.
Tontura, sonolência, náusea, dor de cabeça, visão turva, confusão, diarreia, insônia, tremor.
Gabapentina Neurotin® Análogo de GABA, modula a ação da enzima ácido glutâmico descarboxilase e da enzima glutamato sintetase.
Depressão do SNC, tontura, sonolência, ataxia, edema periférico, fadiga.
Ant
idep
ress
ivos
ISR
S
Fluoxetina Prozac® Medeia a recaptação de 5-HT no terminal pré-sinaptico; bloqueia a recaptação resultando em neurotransmissão serotoninérgica aumentada e prolongada, provocando estimulação de autorreceptores 5-HT.
Cefaléia, náusea e outros efeitos Gastrointestinais, tremor, insônica, disfunção sexual.
Sertralina Zoloft®
Paroxetina Paxil®
Citalopram Celexa®
Escitalopram Lexapro®
Ant
idep
ress
ivos
IRSN
Venlafaxina Efexor XR® Inibem tanto a recaptação de 5-HT quanto noradrenalina. Provocam aumento da neurotransmissão serotoninérgica e/ou noradrenérgica, induzindo a ativação de autorreceptores 5-HT.
Náusea, tontura, boca seca, cefaleia, elevação da pressão arterial.
Duloxetina Cymbalta® Náusea, tontura, insônia, cefaleia, constipação.
Fontes: As Bases Farmacológicas da Terapêutica (Goodman & Gilman, 12ª, 2012); Farmacologia Básica e Clínica (Katzung, 12ª, 2014); Guia de Farmacoterapia (Martin & Talbert, 1ª, 2015); MEDSCAPE, disponível em: www.medscape.com, acesso em: 20 de Junho de 2015.
As bases neurobiológicas dos transtornos de ansiedade não são completamente
conhecidas. Diversos sistemas de neurotransmissores estão envolvidos aos transtornos
de ansiedade, como por exemplo, gabaérgico, serotonérgico, glutamatérgico, além de
outros neurotransmissores, neuromoduladores e peptídeos (Freitas-Ferrari et al., 2010).
Estima-se que 20-30% dos neurônios do SNC são gabaérgicos, sendo o principal
neurotransmissor inibitório (Olsen and Sieghart, 2009; Ulrich and Bettler, 2007). Os
receptores GABAA são os alvos moleculares dos BZP que atuam sobre receptores
ionotrópicos e metabotrópicos. Os receptores ionotrópicos mediam a transmissão
inibitória rápida do SNC, potencializando a afinidade do GABA pelo receptor. Logo,
ocorre abertura de canais de cloreto e hiperpolarização do neurônio pós-sináptico
provocando inibição de processos intracelulares (Rudolph and Knoflach, 2011). São
divididos em dois tipos principais: A e B. O receptor GABAA contém duas subunidades
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α, duas subunidades β e uma subunidade γ com dois sítios de ligação formados por
subunidades α e β. Já o receptor GABAB ou metabotrópico funcionam como
autorreceptores pois inibem a liberação de GABA e são divididos em GABABR1 e
GABABR2 (Rudolph and Knoflach, 2011).
O sítio de ligação dos BZP é formado por uma das subunidades α (α1, α2, α3 ou
α5) e uma subunidade γ (possivelmente γ2 por estar presente em 90% dos receptores
GABAA) (Goodman and Gilman, 2012). A identificação das funções fisiológicas e
farmacológicas dos diferentes subtipos de receptores GABAA (Low et al., 2000;
Crestani et al., 2001; Crestani et al., 2002) é essencial para a busca e desenvolvimento
de fármacos com menores efeitos colaterais que os BZP (ex.: ansiolíticos não-sedativos)
ou compostos com indicações distintas dos BZP (ex.: fármacos de melhora cognitiva e
analgésicos) através de uma maior afinidade apenas ao subtipo do receptor desejado, a
exemplo do valor terapêutico para danos cognitivos da esquizofrenia de agonistas
seletivos de receptores GABAA de subunidade α1 e α2 (Rudolph and Knoflach, 2011).
Constituído por receptores acoplados à proteína G (5-HT1, 5-HT2, 5-HT4-7) e
receptor de canal iônico (5-HT3), os receptores de serotonina são classificados em 14
subtipos (5-HT1A, 1B, 1D, 1E, 1F, 2A, 2B, 2C, 3, 4, 5A, 5B, 6 e 7) (Goodman and Gilman, 2012). A
serotonina e seus receptores desempenham papéis críticos na regulação da cognição,
comportamento alimentar e sexual e humor (Lambe et al., 2011). Os receptores são
expressos no córtex pré-frontal humano e desenvolvem excitabilidade desta região do
SNC, agindo como um neuromodulador para regulação emocional e resiliência (Bland
et al., 2003; Holmes, 2008; Krystal and Neumeinster, 2009).
Desequilíbrios no sistema serotonérgico estão relacionados à etiologia de
diversos transtornos psiquiátricos (Hetrick et al., 2007; Olivier et al., 2010). Receptores
de serotonina do tipo 5-HT1A e 5-HT2A parecem ter efeitos opostos sobre a ansiedade;
por exemplo, a inibição de receptores 5-HT1A (Lanzenberger et al., 2007) e ativação de
receptores 5-HT2A (Weisstaub et al., 2006) podem estar relacionados à atividade tipo-
ansiolítica em ratos. A inibição do receptor 5-HT5A pode influenciar nas condições
ansiolíticas sob estresse (Lambe et al., 2011). A buspirona, prescrito para transtornos de
ansiedade, é um agonista parcial dos receptores 5HT1A e classificado como um não-
BZP. Atua sobre os receptores serotonérgicos 5HT1A pré-sinápticos acarretando na
13
diminuição da frequência de liberação de serotonina e noradrenalina (Goodman and
Gilman, 2012). O efeito terapêutico não é observado com o uso agudo do fármaco,
necessitando de vários dias de tratamento para que a resposta farmacológica se torne
evidente.
Anormalidades no sistema glutamatérgico têm sido observadas em várias
doenças psiquiátricas, como esquizofrenia e transtorno obsessivo compulsivo
(Deepmala et al., 2015). O glutamato extracelular é regulado principalmente pelo
trocador cistina-glutamato localizado nas células gliais (Bauzo et al., 2012). Esse
sistema troca cistina extracelular por glutamato intracelular (Kupchik et al., 2012),
também possui importante papel na produção de glutationa (GSH), sintetizada por L-
cistina, desempenhando a regulação do estresse oxidativo (Wang and Cynader, 2000).
Os receptores glutamatérgicos são classificados em ionotrópicos e
metabotrópicos. Os ionotrópicos são divididos em α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-
isoxazol propiônico (AMPA), N-metil-D-aspartato (NMDA) e Cainato. Os
metabotrópicos são subdivididos em grupo 1, 2 e 3 (mGluR) (Goodman & Gilman,
2012). O sistema glutamatérgico tem se mostrado importante na fisiopatologia e
terapêutica de doenças psiquiátricas, em transtornos de humor, o sistema foi proposto
com base em dados pré-clínicos de antagonistas NMDA (Zarate et al., 2006).
Um excesso de glutamato pode levar a ativação NDMA que por sua vez provoca
danos e degeneração neuronal devido a um possível e significativo influxo de Ca2+ nos
neurônios (Barger and Basile, 2001; Piani and Fontana, 1994; Sattler and Tymianski,
2001). A ativação de receptores metabotrópicos tipo 1 (mGlu1) pode ser neurotóxico
por inibir a neuroproteção contra espécies reativas de oxigênio (EROs) e uma
significativa perda de GSH intracelular (Deng et at., 2004).
A partir da década de 80, o sistema glutamatérgico passou a ser alvo de estudos
e vem ganhando grande interesse na pesquisa relacionada a distúrbios psiquiátricos e
comportamentais. Evidência dessa ação é marcadamente destacada pela rápida ação
antidepressiva do antagonista de receptores NMDA cetamina quando administrada em
diferentes doses (Murrough et al., 2013; Sos et al., 2013; Zarate et al., 2012; Zarate et
al., 2006), o que pode sugerir um novo alvo de resposta clínica antidepressiva de
maneira eficaz com ação em 3 horas (Diazgranados et al., 2010). Sendo o glutamato
14
uma molécula presente em todo o sistema nervoso central, cuja transmissão está sujeita
a uma fina regulação e que ao mesmo tempo em que é modulado também modula vários
outros sistemas de neurotransmissores, se tornando um alvo farmacológico importante
na área de psiquiatria (Hashimoto, 2011).
A alta incidência de transtornos psiquiátricos na população, especialmente os
transtornos de ansiedade, associada à falta de eficácia clínica dos ansiolíticos e a alta
incidência de efeitos adversos, funciona como um motivador na busca de compostos
com melhor eficácia clínica e menor incidência de efeitos adversos.
A N-acetilcisteína (NAC) é um antioxidante, mucolítico e também utilizado no
tratamento de intoxicação por paracetamol (Dean et al., 2011a). Esse fármaco apresenta
boa tolerabilidade e baixa incidência de efeitos adversos (Whyte et al., 2007), apesar de
não existir estudos a longo prazo. Alguns efeitos adversos com altas doses foram
pontualmente relatados, como hipertensão arterial em ratos (Palmer et al., 2007) e
estado epilético com hipertensão intracraniana e posterior morte do paciente (Bailey et
al., 2004). Apesar disso, baixas doses a NAC podem ser utilizadas como adjuvante para
o tratamento de epilepsia (Devi et al., 2006).
Estruturalmente, a NAC é derivada de N-acetil do aminoácido L-cisteína.
Precursora de cisteína, a NAC age no trocador cistina-glutamato presente em astrócitos,
aumentando a quantidade de glutamato extrassináptico (Baker et al., 2008). Essa
elevação promove uma maior ativação de receptores metabotrópicos de glutamato
(mGlu2/3) localizados no espaço extra sináptico, resultando em diminuição da liberação
sináptica de glutamato e consequente redução na ativação de receptores glutamatérgicos
pós-sinápticos, especialmente do tipo NMDA (Dean et al., 2011b).
O efeito da NAC em modelos pré-clínicos (Herrmann et al., 2014; Lee et al.,
2014; Costa-Campos et al., 2013; Linck et al., 2012; Bauzo et al., 2012) e clínicos
(Dean et al., 2015; Oliver et al., 2015; Prado et al., 2015; Nikoo et al., 2015; Liu et al.,
2014; Grant et al., 2014; Berk et al., 2013; Berk et al., 2008) têm sido recentemente
avaliados. Herrmann e colaboradores (2014) demonstraram a capacidade da NAC em
prevenir a hipersensibilidade induzida por anfetamina no modelo de isolamento social
em camundongos, sugerindo assim que o composto pode ser útil na intervenção de
pacientes com riscos de desenvolver psicoses. O uso da NAC também já foi
15
preliminarmente documentado em transtornos de ansiedade, como por exemplo, na
tricotilomania (Grant et al., 2009), mas seu efeito ansiolítico não foi caracterizado em
modelos animais, que podem identificar usos específicos bem como potenciais efeitos
adversos. Outra particularidade da NAC está na sua capacidade de reduzir as citocinas
pró-inflamatórias (IL-1β e TNF-α) conferindo assim uma atividade anti-inflamatória
(Chen et al., 2008; Khan et al, 2004; Malhi and Berk, 2007; Oja et al., 2000).
A ansiedade pode causar estresse oxidativo, o qual pode ser definido como o
desequilíbrio entre a formação e remoção de agentes oxidantes no organismo,
decorrente da geração excessiva de EROs incluindo radicais livres, e/ou diminuição de
antioxidantes endógenos (Ng, et al., 2008). A GSH é um antioxidante endógeno e a
NAC induz a reposição de GSH no SNC, podendo trazer resultados positivos
relacionados a doenças psiquiátricas, como a ansiedade (Fries and Kapczinski, 2011).
Estudos apontam ainda que a introdução de modeladores de glutamato como a NAC,
pode ser uma possibilidade promissora para o tratamento de distúrbios de humor, uma
vez que o glutamato é considerado como o caminho final comum de tratamento
terapêutico para a depressão e outros distúrbios de humor como a ansiedade (Costa-
Campos, et al., 2013).
Os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento da ansiedade apresentam
limitações como síndrome de abstinência, tolerância, dependência, além de alguns
apresentarem baixa eficácia e outros ainda necessitarem de mais estudos para
elucidação de seu mecanismo de ação. Com isso, torna-se necessária a busca de novos
compostos ou então propor um novo uso a um conhecido fármaco já disponível na
clínica, com menores efeitos adversos e melhor eficácia clínica em transtornos
psiquiátricos além do mecanismo de ação inovador. Com isso, existe uma oportunidade
de os cientistas praticarem o que chamam de “Repurposing” de compostos que já
superaram e passaram pelos obstáculos de desenvolvimento, verificando assim possíveis
relações com a psiquiatria (Insel et al., 2013).
Nesse contexto, considerando o papel da NAC como agente modulador em
diversas vias relevantes aos transtornos psiquiátricos, o objetivo desse trabalho foi
avaliar os efeitos comportamentais da NAC em peixes-zebra.
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos comportamentais da N-acetilcisteína (NAC) em peixes-zebras.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Avaliar os efeitos comportamentais da exposição à NAC (0,1, 1,0 e 10
mg/L) e fluoxetina (10,0 mg/L) no teste de tanque novo em peixes-zebra.
2.2.2 Avaliar os efeitos comportamentais da exposição à NAC (0,1, 1,0 e 10
mg/L) em peixes-zebra submetidos a um protocolo de estresse agudo;
2.2.3 Avaliar os efeitos comportamentais da exposição à NAC (0,1, 1,0 e 10
mg/L) e bromazepam (1,5 mg/L) no teste de claro/escuro em peixes-zebra.
17
3 MATERIAIS E MÉTODOS, RESULTADOS E DISCUSSÃO Os tópicos descritos acima fazem parte de um artigo submetido à Revista Pharmacology, Biochemistry and Behavior (carta de submissão a seguir).
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N-acetylcysteine prevents stress-induced anxiety behavior in zebrafish
Ricieri Mocelina,1, Ana P. Herrmannb,1, Matheus Marcona, Cassiano L. Ramboc, Aline
Rohdena, Fernanda Bevilaquaa, Murilo Sander de Abreud, Leila Zanattaa, Elaine
Elisabetskyb, Leonardo J.G. Barcellosd,e, Diogo R. Larac,g, Angelo L. Piatof,g(*)
a Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais, Universidade Comunitária da Região de Chapecó.
Av. Senador Attílio Fontana, 591E, 89809-000, Chapecó, SC, Brazil. b Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul. Rua Ramiro Barcelos, 2600, 90035-000, Porto Alegre, RS, Brazil. c Laboratório de Neuroquímica e Psicofarmacologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e
Molecular, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. Av. Ipiranga, 6681, 90619-900, Porto
Alegre, RS, Brazil. d Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Universidade Federal de Santa Maria. Campus
Universitário, Camobi, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil. e Programa de Pós-Graduação em Bioexperimentação, Universidade de Passo Fundo.
BR 285, 99052-900, Passo Fundo, RS, Brazil.
f Laboratório de Psicofarmacologia e Comportamento, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e
Terapêutica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Av. Sarmento Leite 500/202, 90050-170, Porto
Alegre, RS, Brazil. g Zebrafish Neuroscience Research Consortium (ZNRC). 1 These authors contributed equally for this article.
(*) Correspondence to:
Angelo L Piato, Ph.D.
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e Terapêutica, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Av. Sarmento Leite 500/305, Porto Alegre, RS, Brazil
90050-170
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E-mail address: [email protected]
19
Abstract
Despite the recent advances in understanding the pathophysiology of anxiety
disorders, the pharmacological treatments currently available are limited in efficacy and
induce serious side effects. A possible strategy to achieve clinical benefits is drug
repurposing, i.e., discovery of novel applications for old drugs, bringing new treatment
options to the market and to the patients who need them. N-acetylcysteine (NAC), a
commonly used mucolytic and paracetamol antidote, has emerged as a promising
molecule for the treatment of several neuropsychiatric disorders. The mechanism of
action of this drug is complex, and involves modulation of antioxidant, inflammatory,
neurotrophic and glutamate pathways. Here we evaluated the effects of NAC on
behavioral parameters relevant to anxiety in zebrafish. NAC did not alter behavioral
parameters in the novel tank test, prevented the anxiety-like behaviors induced by an
acute stressor (net chasing), and increased the time zebrafish spent in the lit side in the
light/dark test. These data may indicate that NAC presents an anti-stress effect, with the
potential to prevent stress-induced psychiatric disorders such as anxiety and depression.
The considerable homology between mammalian and zebrafish genomes invests the
current data with translational validity for the further clinical trials needed to
substantiate the use of NAC in anxiety disorders.
Key words: N-acetylcysteine; Anxiety; Stress; Zebrafish.
20
1. Introduction
Despite the recent advances in understanding the pathophysiology of psychiatric
disorders, pharmaceutical industries are increasingly abandoning drug development
programs in this field. Exorbitant financial losses consequent to high failure rates in
early stage clinical trials are the most likely explanation for this current situation, which
includes arrested development of agents once considered as promising novel treatments
(Insel 2012). A possible strategy to bypass this drug pipeline drain is the repurposing of
available drugs, which reduces uncertainty regarding safety and pharmacokinetic issues
and allows a faster track to achieve clinical benefits (Ashburn and Thor 2004; Insel et
al. 2013).
N-acetylcysteine (NAC) – a commonly used mucolytic and paracetamol antidote
– has emerged as a promising molecule for the treatment of several neuropsychiatric
disorders, such as bipolar disorder, schizophrenia and drug addiction (Dean et al. 2011a;
Berk et al. 2013). The myriad of positive clinical data is related to the multi-target
profile of NAC, which modulates antioxidant, inflammatory, neurotrophic and
glutamate pathways (Dean et al. 2011b). Specifically for glutamate, NAC activates the
astrocytic cystine-glutamate antiporters, leading to glutamate release, stimulation of
extra-synaptic metabotropic glutamate receptors (mGluRs) and decreased
neurotransmitter synaptic release (Baker et al. 2002; Moran et al. 2005).
When an organism is subjected to stressful situations, the innate stress response
activates several biologic systems in order to elicit coping strategies and restore
homeostasis (Chrousos and Gold 1992; McEwen 2007; Gold 2015). There are,
however, maladaptive responses to stressors, which are closely linked to the
development of anxiety disorders and depression (Sapolsky et al., 2000). Although no
approved treatment for stress and anxiety targets the glutamatergic system, there is
consistent experimental evidence implicating glutamate in the pathophysiology of
anxiety disorders (Cortese and Phan 2005; Riaza Bermudo-Soriano et al. 2012; Griebel
and Holmes 2013; Pitsikas 2014).
Anxiety is the most prevalent psychiatric disorder (Kessler et al. 2005), affecting
millions of people globally. NAC has already been proposed as a potential drug for the
management of anxiety, but clinical and pre-clinical data are limited (Lafleur et al.
21
2006; Berk et al. 2009, 2009, 2014; Egashira et al. 2012; Bloch et al. 2013). Our aim is
to add experimental evidence to the body of knowledge on this field, and thus subsidize
the required future clinical trials. Here we evaluated the effects of NAC on behavioral
parameters relevant to anxiety in zebrafish.
2. Materials and Methods
2.1 Animals
A total of 234 wild-type short-fin strain adult zebrafish (Danio rerio, 4-6 months
old, 50:50 male:female ratio) were obtained from the heterogeneous breeding stock of
Universidade de Passo Fundo. The fish were kept in 40-L aquariums (80-100 fish per
tank), filled with non-chlorinated filtered water, with a light/dark cycle of 14/10 hours
(lights on at 7:00 AM), for at least 2 weeks before experiments. Tank water was
partially changed every 7 days and maintained under appropriate conditions for this
species: 26 ± 1 °C; pH 7.0 ± 0.20; dissolved oxygen at 7.0 ± 0.5 mg/L; total ammonia at
< 0.01 mg/L; total hardness at 5.8 mg/L and alkalinity at 22 mg/L CaCO3. Water was
not changed for at least 1 day before experiments. The fish were fed twice a day with a
commercial flake fish food (Alcon BASIC®, Alcon, Brazil). All protocols were
approved by the Ethics Committee of Unochapecó (#019/2013).
2.2 Chemicals
N-acetylcysteine (NAC) was acquired from Sigma-Aldrich (St Louis, Missouri,
USA). Bromazepam (BMZ, Lexotan®) was acquired from Roche (Rio de Janeiro,
Brazil) and fluoxetine (FLU, Daforin®) from Sigma Pharma (São Paulo, Brazil).
2.3 Experimental design
The experimental design is shown in Figure 1. Four fish at the time were placed
(10 min) into a beaker filled with 400 mL of each of the following solutions (treatment
groups): control (water), fluoxetine (FLU, 10.0 mg/L), bromazepam (BMZ,1.5 mg/L) or
NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L). Fluoxetine and bromazepam were used as positive
controls since they are widely prescribed for anxiety disorders. Fresh solutions were
22
prepared for every group of four fish. Immediately after treatment, animals were
individually transferred to the unfamiliar behavioral apparatus, video recorded and latter
analyzed by the ANY-Maze software (Stoelting Co., USA). Tests were performed
between 08:00 and 11:00 AM. Separate groups of fish received each drug and
completed each assay.
2.4 Behavioral tests
2.4.1 Novel tank
The novel tank test consists of a 2.7-L tank (24 x 8 x 20 cm) filled with water up
to 15 cm (Gebauer et al. 2011; Piato et al. 2011). The apparatus was virtually divided
into three equal horizontal zones (bottom, middle and upper). The following parameters
were evaluated for 6 minutes: total distance traveled, number of crossings among
different zones, maximum swimming speed, time in the bottom, middle and upper zones
of the tank. Vertical location in a novel environment is considered a parameter of
anxiety in zebrafish analogous to the thigmotaxic behavior that rodents display in an
open field (Levin et al., 2007).
2.4.2 Acute stress
The acute stress protocol was performed according to (Abreu et al. 2014). After
the 10-min treatment, fish were chased for two minutes with a net before transferred to
the novel tank test for 6 minutes; the same parameters described above were noted. The
same trained experimenter executed the net chasing stress in all tests (circular clock-
wise movements with the net in the beaker, at a regular speed of approximately 40 turns
per minute).
2.4.3 Light/dark
The light/dark test was performed according to Gebauer et al. (2011). The
apparatus consists of a glass tank (18 x 9 x 7 cm) divided by a sliding guillotine-type
partition (9 x 7 cm) in two equally sized dark and white compartments. The water level
was 3 cm and the partition was raised 1 cm above the tank floor to allow zebrafish to
23
swim freely between the two sides of the tank. Fish were individually placed in the light
zone of the apparatus immediately after treatment and the time spent in the light
compartment, the latency to enter the dark compartment, and the number of crossings
between compartments were recorded for 5 min.
2.5 Statistics
The data is expressed as mean ± standard error of mean (S.E.M). The normal
distribution of the data was confirmed by Kolmogorov-Smirnov and Levene tests, and
results analyzed by one- or two-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. Two-
way ANOVA was used to identify the main effects of stress and treatment, as well as
their interactions. Differences were considered significant at p<0.05.
3. Results
Figure 2 shows the effects of FLU (10.0 mg/L) and NAC (0.1, 1.0 and 10.0
mg/L) in the novel tank test. As expected, FLU significantly decreased the time spent in
the bottom (Fig. 2D) and increased the time spent the upper (Fig. 2F) part of the tank
(F4,66 = 3.4, p<0.01 and F4,66 = 2.8, p<0.01, respectively), whereas NAC was devoid of
effects. Neither FLU nor NAC altered any of the other novel tank parameters.
Figure 3 shows the effects of NAC in the acute stress test in zebrafish, and table
1 summarizes the two-way ANOVA analysis. Treatment with NAC prevented the
effects of stress on total distance traveled (Fig. 3A), and attenuated the stress-induced
decrease on number of crossings among the horizontal zones of the tank (Fig. 3B). For
maximum speed (Fig. 3C), post hoc analyses did not indicate significant differences
among the groups. Zebrafish submitted to acute stress test significantly spent more time
in the bottom (Fig. 3D) and less time in the middle and upper zones of the tank (Fig. 3E
and 3F), and NAC prevented these effects.
Figure 4 shows the effects of BMZ (10.0 mg/L) and NAC (0.1, 1.0 and 10.0
mg/L) in the light/dark test. Both BMZ and NAC significantly increased the time spent
in the lit side of the tank when compared to control (F4,62 = 6.4, p<0.001, Fig. 4A). NAC
significantly decreased the latency to first crossing (F4,62 = 5.3, p<0.001, Fig. 4B). The
24
number of crossings between the light and dark compartments was not altered by any of
the treatments (F4,62 = 1.5, p>0.05, Fig. 4C).
4. Discussion
Here we demonstrate for the first time that NAC has anti-stress and anxiolytic
properties in zebrafish, adding to a cross-species body of evidence for NAC anxiolytic
effects. NAC increased the time zebrafish spent in the lit side in the light/dark test, a
protocol that has been pharmacologically validated with benzodiazepines, buspirone and
fluoxetine (Gebauer et al. 2011; Maximino et al. 2013a). NAC also clearly prevented
the anxiety-like behaviors induced by an acute stressor (net chasing).
NAC treatment failed to induce significant changes per se in the behavior of
zebrafish in the novel tank test. Vertical location in a novel environment has been
typically considered a parameter of anxiety in zebrafish, analogous to the thigmotaxic
behavior that rodents display in an open field (Levin et al., 2007). The main anxiolytic
class of benzodiazepines, however, does not increase the distance of fish from the tank
bottom, but reduce thigmotaxis in rodents (Choleris et al. 2001). In contrast, different
classes of antidepressants have been repeatedly shown to increase exploration of upper
zones when exposed to a novel tank without a previous stressor (Egan et al. 2009;
Sackerman et al. 2010; Gebauer et al. 2011). On the other hand, time spent in the lower
half increases when fish are exposed to threat, chronic unpredictable stress high-dose
caffeine and to alarm pheromone (Egan et al. 2009; Piato et al. 2011; Luca and Gerlai
2012). Taken together, these studies suggest that increased exploration of the upper
zone may be related to a more ‘elevated mood state’ or less anxiety, and staying in the
bottom zone may reflect avoidance, depressive-like or fear-related behavior. Thus, the
results showing no effect of NAC on fish behavior per se suggests that is does not have
an antidepressant or anxiolytic effect. This is in line with clinical data showing non-
antidepressant effect of NAC in depressed patients (Berk et al, 2013), i.e., when they are
already depressed. However, NAC was effective in our study in preventing the
behavioral response to stressors, which may lead to depressive-like behavior in animals
and depression in humans. This suggests that NAC treatment may increase resilience to
stress and prevent new depressive episodes, rather than recovery from depression. Of
25
note, clinical observations of putative efficacy of NAC in nail biting (Berk et al. 2009;
Ghanizadeh et al. 2013), a typical behavior elicited by stress, are in line with this
proposal.
There are abnormal levels of glutamate and glutamate receptors in the brains of
patients with anxiety disorders (Bergink et al. 2004; Cortese and Phan 2005; Krystal et
al. 2010), and stressors increase synaptic glutamate levels in rodents (Popoli et al.
2011). NAC modulates glutamate by stimulating the inhibitory extra-synaptic
metabotropic receptors, a mechanism of action relevant when the glutamate tonus is
such that enough synaptic spill over is in place. Accordingly, considering that the
light/dark apparatus (with its limited dimensions and low water level) is more stressful
to fish than exploring a novel tank, the behavioral data presented here suggests that a
significant level of stress is required to reveal the effects of NAC. This is consistent
with the findings reported by Smaga et al. (2012), where NAC treatment only reduced
immobility time in the forced swimming test in olfactory bulbectomized but not in sham
rats. Overall, these data suggest that NAC may present an anti-stress effect, perhaps
with the potential to prevent stress-induced psychiatric disorders such as anxiety and
depression, and relapse in recovered patients – this possibility, however, awaits direct
testing in clinical trials designed to address these questions.
Recent studies have pointed to the direct involvement of oxidative stress in
anxiety-like behavior in rodents (Hovatta et al. 2005; Bouayed et al. 2007; Hassan et al.
2014). There are also data linking oxidative stress and certain anxiety disorders in
humans (Kuloglu et al. 2002; Bulut et al. 2013). As NAC increases glutathione levels
and act as a free radical scavenger, this may be an additional advantage considering the
role of oxidative metabolism in the regulation of anxiety. Despite these beneficial
effects, given the acute exposure to stress in our behavioral experiments, the antioxidant
effects of NAC are less likely to play a significant role.
Current drugs used in the treatment of anxiety disorders present limitations in
safety and efficacy, including sedation, tolerance, dependence, and withdrawal issues,
which justifies the pursuit of new medications with better therapeutic efficacy and
adverse effects profile. Several mGluR2/3 agonists present anxiolytic effects in rodent
models, and clinical trials are currently underway for these and other drugs that
26
modulate glutamate (Swanson et al. 2005). Among such newer drugs that target
glutamate, NAC has the advantage of being a low-cost alternative, devoid of serious
adverse effects and available as over-the-counter supplement (Whyte et al. 2007; Berk
et al. 2013; Samuni et al. 2013).
The zebrafish possesses significant genetic, endocrine and anatomic homology
with humans and rodents in relation to anxiety traits, and has been used as a model
organism in translational psychiatry research (Piato et al. 2011; Maximino et al. 2013b;
Kalueff et al. 2014a; Nguyen et al. 2014; Stewart et al. 2014). Unfortunately,
pharmacokinetic data is not available for the majority of drug studies in zebrafish,
which is a limitation of this study as well and merits further investigation. This
organism is sensitive to a wide range of anxiogenic and anxiolytic drugs, mostly in
agreement with rodent and clinical data for these agents (Kalueff et al. 2014b). This
significant correspondence in both physiology and drug response in reference to anxiety
invest the current data with translational validity for the further clinical trials needed to
substantiate the use of NAC in anxiety disorders.
Acknowledgments
This work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico - Brazil (CNPq, Proc. 472715/2012-7). L.J.G.B. holds CNPq research
fellowship (CNPq, Proc. 302073/2011-6). The authors are grateful to Eduardo
Herrmann and Samuel Biron Rodrigues for their invaluable assistance with artwork
drawing and design.
27
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31
Figure captions
Figure 1. Schematic representation of the experimental protocol.
Figure 2. Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total
distance traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom
(D), time in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the novel tank
test in zebrafish. The data are presented as the mean ± S.E.M. One-way ANOVA
followed by Tukey post hoc test. n=11-16. *p<0.01 Vs. control group.
Figure 3. Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total
distance traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom
(D), time in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the acute stress
test in zebrafish. The data are presented as the mean ± S.E.M. Two-way ANOVA
followed by Tukey post hoc test. n=12. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 Vs. control
group; #p<0.05 Vs. stressed control group.
Figure 4. Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and BMZ (1.5 mg/L) on time in the
lit side of the tank (A), latency to first crossing (B) and number of crossings (C) in the
light/dark test. The data are presented as the mean ± S.E.M. One-way ANOVA
followed by Tukey post hoc test. n=10-19. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 Vs. control
group.
32
Figure 1:
33
Figure 2:
34
Figure 3:
35
Figure 4:
36
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez que a NAC
possui propriedades anti-estresse e tipo-ansiolítica em peixes-zebra. Não houve
diferença significativa entre a NAC e controle em relação à distância total percorrida,
número de cruzamentos entre as diversas porções do aquário e velocidade máxima.
Dessa forma, a exposição à NAC não causa alterações motoras relevantes nos animais.
Nesse teste, animais expostos à fluoxetina apresentaram aumento no tempo de
permanência na porção superior do aquário. Esses dados já foram observados em
estudos anteriores com fluoxetina na concentração de 100 µg/L por duas semanas (Egan
et al., 2009).
O modelo de estresse agudo por perseguição foi capaz de diminuir a distância
total percorrida, o número de cruzamentos, o tempo de permanência na porção média e
o tempo de permanência na porção superior e, consequentemente, aumentar o tempo de
permanência na porção inferior do aparato. A partir desses resultados pode-se afirmar
que o protocolo foi ansiogênico para os animais. Entretanto, a exposição à NAC foi
capaz de prevenir todas essas alterações induzidas pelo estresse.
No teste de claro/escuro, NAC foi capaz de aumentar o tempo de permanência
no lado claro do aparato, com resultado comparável ao ansiolítico bromazepam. Além
disso, NAC diminuiu a latência para o primeiro cruzamento nas três concentrações
utilizadas no estudo.
Os resultados mostram que a NAC foi capaz de prevenir claramente o
comportamento ansiogênico induzido pelo protocolo de estresse agudo, podendo ser
interpretado como um efeito anti-estresse. Pode-se sugerir que a NAC possui um alto
potencial de prevenir ou atuar como um adjuvante no tratamento de transtornos
psiquiátricos que podem ser induzidas pelo estresse como ansiedade e depressão.
Contudo, mais estudos são necessários para justificar o uso da NAC em estresse e
transtornos psiquiátricos associados.
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