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UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO.
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
Stanley de Sousa Lima Galvão
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E CITOTÓXICA DE
Annona glabra L. (Araticum)
São Luís
2015
Stanley de Sousa Lima Galvão
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E CITOTÓXICA DE
Annona glabra L. (Araticum).
Dissertação de Mestrado em Biologia
Parasitária pela Universidade CEUMA
como parte dos requisitos para a obtenção
do Título de Mestre em Biologia Parasitária
Orientador: Prof. Dr. Valério Monteiro Neto
Co-Orientadora: Prof. Dra. Andrea de
Souza Monteiro
São Luís
2015
(FOLHA DE APROVAÇÃO)
Stanley de Sousa Lima Galvão
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E CITOTÓXICA DE
Annona glabra L. (Araticum).
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho de Mestrado em
Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / ,
considerou o(a) candidato(a)
( ) APROVADA ( ) REPROVADA
1) Examinador __________________________________
2) Examinador ___________________________________
3) Examinador ___________________________________
4) Presidente (Orientador)__________________________________
A Deus
A minha filha Ana Letícia
Aos meus pais Maria Antoniêta e João Luís
Aos meu irmãos Stenio e Stepheson
A minha namorada Sâmia
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por tudo o que tem proporcionado
em minha vida e por me dar forças nessa jornada
A minha família, meus pais Maria Antoniêta de Sousa Lima, João
Luís Leite Galvão e meus irmãos Stenio de Sousa Lima Galvão e
Stephenson de Sousa Lima Galvão pelo incentivo e carinho.
A minha filha Ana Letícia Lapa Galvão pela paciência,
compreensão, carinho e força. Você é uma verdadeira bênção na minha
vida.
A minha namorada Sâmia pela paciência, incentivo,
companheirismo e compreensão nessa fase onde tive que muitas vezes tive
que ausentar.
Agradeço a minha família em São Luís, meus tios Adriel e Elisete
pelo acolhimento e paciência. E meus primos Roberta, Alexandre e Renata
pelos sorrisos.
Aos meus colegas de trabalho do mestrado pelos momentos
Aos meus orientadores Valério e Andrea pela experiência e
conhecimento que adiquiri, pela amizade e oportunidades que me
propuseram.
Aos docentes do programa pelo companheirismo, conhecimento e
amizade.
A FAPEMA pelo auxílio financeiro.
A UFMA pela ajuda na identificação da planta
A UFMG, a Vera, e a todos do laboratório de microbiologia aplicada
onde realizei um estágio e todos que fizeram parte dessa etapa que passei
em Belo Horizonte.
Ao centro de pesquisa René Rachou (Fiocruz – MG), a Ezequias
pela amizade e auxílio nos ensaios químicos realizados.
“Tô saindo pra batalha pelo pão de cada dia, a fé que trago no peito é a minha garantia. Deus me livre das maldades, me guarde onde quer que eu vá, tô fazendo a minha parte, um dia eu chego lá.”
Tô fazendo a minha parte – Diogo Nogueira.
I
RESUMO
Annona glabra é uma planta pertencente à família Annonaceae e é conhecida por apresentar atividade antitumoral e imunomoduladora. Dentro da família existem outras espécies que tem apresentado atividade antimicrobiana e antitumoral, mas não há a devida comprovação da eficácia antimicrobiana e nem da citotoxicidade de A. glabra. Portanto, o objetivo desse estudo foi investigar a atividade antimicrobiana e citotóxica do extrato hidroalacoólico e das frações de A. glabra. Para a determinação da atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico, foram realizados ensaios de difusão em agar, seguido do ensaio de microdiluição para determinar concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) com estirpes de Staphylococcus aureus (ATCC 25923 e MRSA), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853 e cepas clínicas), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031) e Acinetobacter baunannii (ATCC 19606). Em seguida, foi realizada a análise fitoquímica do extrato e a sua partição com diferentes solventes (metanol, hexano, diclorometano, acetato de etila). As frações obtidas foram monitoradas por ensaios de susceptilidade antimicrobiana por microdiluição e pela determinação da citotoxicidade para células tumorais (HL-60, THP-1, JURKAT, MCF-7, MDA-MB-231 e HCT-116) com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Adicionalmente, foi realizado o fracionamento por cromatografia de permeação em gel e com as frações obtidas foram realizados novos ensaios antimicrobianos (CIM e CBM). A interação entre a fração ativa e bactéria P. aeruginosa foi avaliada através do potencial zeta (PZ) e por calorimetria isotérmica por titulação (ITC). A determinação da viabilidade bacteriana em diferentes tempos de exposição frente a fração ativa foi feita pelo método com MTT. A caracterização dos compostos obtidos na fração ativa foi realizada por espectrometria de massa (ESI). As partições do extrato revelaram uma ação antimicrobiana específica contra P. aeruginosa com uma CIM = 8 µg/mL e CBM = 16 µg/mL para todas as partições testadas. Nos ensaios de citotoxicidade, a IC50 só foi determinada com as células tumorais HL-60 e JUKART e as partições em metanol, hexano, acetato de etila e diclorometano com valores de 10 µg/mL. A associação entre os componentes da fração Fr.32-33, obtida por cromatografia de permeação em gel, com células de P. aeruginosa ATCC 27983, revelaram uma reação do tipo de endotérmica, após análise por ITC, possivelmente pela forte interação da fração com a superfície bacteriana. As análises do PZ mostraram uma variação na carga elétrica da superfície comprovando a interação dos componentes da fração Fr. 32-32 com a membrana bacteriana. Nos ensaios de viabilidade bacteriana foi observada uma redução de até 96% da atividade metabólica em 12 horas de contato. A análise química da fração Fr. 32-33 por ESI revelou os compostos (-)Epicatequina, Quercetina e Fisetina como possíveis compostos ativos para as atividades antimicrobianas e citotóxicas em células tumorais. Pelos resultados obtidos os compostos das folhas de A. glabra apresentam grande potencial para terapia in vivo contra infecções por P. aeruginosa, sendo necessários mais estudos para a determinação dos aspectos farmacológicos.
Palavras-chave: Annona glabra, Pseudomonas aeruginosa, Atividade antimicrobiana, citotoxicidade
II
ABSTRACT
Annona glabra is a plant belong to the Annonaceae family and is known to have anti-tumor and immunomodulatory activity. Within the family there are other species that has shown antimicrobial and antitumor activity, but there is no proper evidence of antimicrobial efficacy nor the cytotoxicity A. glabra. Therefore, the aim of this study was to investigate the antimicrobial and cytotoxic activity of hidroalacoólico extract and the fractions of A. glabra. To determine the antimicrobial activity of the hydroalcoholic extract, diffusion assays were performed in agar, followed by the microdilution assay to determine minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) with strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923 and MRSA) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853 and clinical strains), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031) and Acinetobacter baunannii (ATCC 19606). Then, the phytochemical analysis of the extract and its partition was performed using different solvents (methanol, hexane, dichloromethane, ethyl acetate). The fractions obtained were monitored for antimicrobial susceptilidade microdilution assays and determination of cytotoxicity for tumor cells (HL-60, THP-1, JURKAT, MCF-7, MDA-MB-231 and HCT-116) bromide with 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Additionally, the fractionation was performed by gel permeation chromatography and the fractions new antimicrobial assays were performed (MIC and MBC). The interaction between the active fraction and P. aeruginosa was evaluated by the zeta potential (PZ) and isothermal titration calorimetry (ITC). The determination of bacterial viability at different times of exposure across the active fraction was made by the method with MTT. The characterization of the active fraction obtained compounds was performed by mass spectrometry (ESI). The extract partitions revealed a specific antimicrobial activity against P. aeruginosa with an MIC of 8 µg/mL and CBM = 16 µg/ml for all tested partitions. In the cytotoxicity assays, the IC50 was determined only with tumor cells Jurkat and HL-60 and partitions in methanol, hexane, ethyl acetate and dichloromethane with values of 10 µg/mL. The association between the components of fraction Fr.32-33 obtained by gel permeation chromatography with cell P. aeruginosa ATCC 27983, showed a reaction of endothermic, after analysis by ITC, possibly by the strong interaction of the fraction with bacterial surface. Analyses of PZ showed a variation in the electrical charge of the surface proving the interaction of fraction Fr. 32-32 of the components with the bacterial membrane. In bacterial viability assays we observed a decrease of up to 96% of the metabolic activity 12 hours of contact. The chemical analysis of fraction Fr 32-33 revealed by ESI compounds (-) Epicatechin, quercetin and fisetin possible as active compounds for the antimicrobial and cytotoxic activity in tumor cells. The results obtained compounds of A. glabra leaves have great potential for in vivo therapy against P. aeruginosa infections, more research is needed to determine the pharmacological aspects.
KEYWORDS: Annona glabra, Pseudomonas aeruginosa, Activity Antimicrobial, cytotoxicity.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 18
1.1. A Baixada Maranhense ....................................................................... 20
1.2. Família Annonaceae ........................................................................... 23
1.3 Gênero Annona ................................................................................... 24
1.4 Annona glabra Linn. ............................................................................ 26
1.5 Flavonoides ......................................................................................... 28
1.5.1 Catequina e Epicatequina ............................................................. 32
1.6 Infecções bacterianas ......................................................................... 33
1.7 Pseudomonas aeruginosa ................................................................... 34
2. OBJETIVOS .............................................................................................. 37
2.1. Objetivo Geral ..................................................................................... 37
2.2. Objetivos Específicos .......................................................................... 37
3. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 38
3.1 Produtos naturais ................................................................................ 38
3.1.1 Coleta ........................................................................................... 38
3.1.2 Preparação do extrato hidroalcoólico ........................................... 39
3.2 Análise fitoquímica do extrato ............................................................. 39
3.2.1 Caracterização de Taninos ........................................................... 40
3.2.2 Caracterização de Taninos - 2 ...................................................... 40
3.3.3 Caracterização de Flavonóides .................................................... 40
3.3 Atividade antimicrobiana in vitro .......................................................... 41
3.3.1 Microrganismos utilizados ............................................................ 41
3.3.2 Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em
poços 41
3.3.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) .............. 42
3.3.4 Determinação da atividade bactericida mínima (CBM) ................. 43
3.4 Partição do Extrato .............................................................................. 43
3.5 Cromatografia em Camada Delgada ................................................... 44
3.6 Ensaios Antimicrobianos com partições .............................................. 44
3.7 Avaliação da atividade citotóxica em linhagens de células tumorais .. 44
3.8 Cromatografia de Exclusão Molecular ................................................. 46
3.9 Cromatografia em Camada Delgada das frações ............................... 46
3.10 Ensaios Antimicrobianos das frações .............................................. 46
3.11 Calorimetria Isotérmica de Titulação ................................................ 47
3.12 Potencial Zeta .................................................................................. 47
3.13 Ensaio de tempo de morte celular bacteriana com MTT .................. 48
3.14 Espectrometria de Massa (ESI) ....................................................... 49
4. RESULTADOS ......................................................................................... 51
4.1 Análise fitoquímica do extrato ............................................................. 51
4.2 Testes antimicrobianos com o extrato bruto de Anonna glabra .......... 51
4.2.1 Ensaios com cepas padrões ........................................................ 51
4.2.2 Ensaios antimicrobianos do extrato bruto de Anonna glabra com
Cepas Clínicas .......................................................................................... 52
4.4 Partição do Extrato .............................................................................. 55
4.5 Cromatografia de camada delgada das partições ............................... 55
4.5.1 Revelação dos compostos apolares ............................................. 55
4.5.2 Revelação dos compostos polares: .............................................. 57
4.6 Ensaios antimicrobianos com as partições ......................................... 59
4.7 Ensaios de atividade antitumoral ........................................................ 62
4.8 Cromatografia de Exclusão Molecular ou Permeação em Gel ............ 67
4.8.1 Cromatografia de Camada Delgada das Frações ............................ 67
4.9 Ensaios antimicrobianos das frações .................................................. 69
4.10 Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) ....................................... 71
4.11 Potencial ZETA ................................................................................ 73
4.12 Ensaio de viabilidade celular bacteriana com MTT .......................... 74
4.13 Espectrometria de Massa ................................................................ 77
5 DISCUSSÃO ............................................................................................. 82
6 CONCLUSÂO ........................................................................................... 89
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 90
III
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Mapa da Baixada Maranhense ....................................................... 21
Figura 2 – Folhas e fruto de Annona glabra .................................................... 27
Figura 3 - Estrutura química geral de um Flavonoide ...................................... 29
Figura 4- Estrutura das principais classes de flavonoides ............................... 30
Figura 5- Estrutura da catequina e seu isômero epicatequina ........................ 32
Figura 6 - Cromatografia em Camada Delgada das Partições (Compostos
Apolares) .......................................................................................................... 56
Figura 7 – Cromatografia de Camada Delgada das partições (Compostos
Polares) ............................................................................................................ 58
Figura 8 - Atividade antitumoral em células leucêmicas (promielócitos - HL60)
......................................................................................................................... 63
Figura 9 – Atividade antitumoral em células leucêmicas (linfócitos T - Jurkat) 64
Figura 10 - Atividade antitumoral em células leucêmicas (promonócitos THP-1)
......................................................................................................................... 64
Figura 11 - Atividade antitumoral em células (carcinoma de mama - MDA-MB-
231) .................................................................................................................. 65
Figura 12 - Atividade antitumoral com células (carcinoma de mama MCF-7) . 66
Figura 13 - Atividade antitumoral em células (carcinoma colorretal HCT-116) 66
Figura 14 - Cromatografia de Camada Delgada das frações obtidas por
cromatografia de gel filtração (360 nm) ............................................................ 68
Figura 15 - Fluxograma das frações obtidas pela Cromatografia de Exclusão
Molecular .......................................................................................................... 68
Figura 16 - Titulações calorimétricas da fração FR 32-33 e células de P.
aeruginosa ATCC 27853 em Água .................................................................. 71
Figura 17 – Perfil termodinâmico entre a fração FR 32-33 e células de P.
aeruginosa ATCC 27853 .................................................................................. 72
Figura 18- Alteração do Potencial zeta da membrana celular da Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 .................................................................................. 74
Figura 19 - Viabilidade celular bacteriana em função do tempo de exposição e
concentrações da fração FR 32-33 .................................................................. 76
IV
Figura 20 - Perfil Cromatográfico dos componentes da fração FR 32-33 da
Análise por Espectrometria de Massa .............................................................. 78
Figura 21 - Análise do pico do composto (-) Epicatequina .............................. 79
Figura 22 - Análise estrutural por fragmentação do pico para o composto (-)
Epicatequina ..................................................................................................... 80
Figura 23 – Análise do pico do composto Fisetina .......................................... 80
Figura 24 - Análise da fragmentação do pico para o composto Fisetina ......... 80
Figura 25 - Análise do pico para o composto Quercetina ................................ 81
Figura 26 - Análise da fragmentação do pico para o composto Quercetina .... 81
V
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Estudos sobre algumas plantas encontradas da Baixada
Maranhense ..................................................................................................... 22
Tabela 2 - Centro de origem e diversidade de algumas espécies de Annona . 25
Tabela 3 - Coloração observada de Compostos Flavônicos na Reação com
Ácido Clorídrico e Magnésio (Reação de Cianidina). ....................................... 40
Tabela 4 - Prospeção fitoquímica com HCL, NaOH, FeCl3 no extrato de
Anonna glabra .................................................................................................. 51
Tabela 5 - Testes antimicrobianos com o extrato bruto de Anonna glabra ...... 52
Tabela 6 - Concentração Inibitória e Bactericida Mínima do extrato
hidroalcoólico de Anonna glabra em cepas bacterianas clínicas ..................... 54
Tabela 7 - Concentração inibitória mínima das partições do extrato de Anonna
glabra em cepas ATCC .................................................................................... 60
Tabela 8 - Concentração inibitória mínima das partições do extrato de Anonna
glabra contra estirpes de S. aureus portadores do gene de resistência mecA. 61
Tabela 9 - Concentração inibitória mínima das partições do extrato de Anonna
glabra em cepas de P. aeruginosa ................................................................... 62
Tabela 10 - Concentração Inibitória do Crescimento de 50% das células
tumorais............................................................................................................ 67
Tabela 11 - Concentração inibitória mínima das frações obtidas por
Cromatografia de Exclusão Molecular .............................................................. 70
VI
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
µg/mL Microlitro por mililitro
A. baumannii Acinetobacter baumannii
A. glabra Annona glabra
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BHI Brain Heart Infusion
CBM Concentração Bactericida Mínima
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLSI Clinical Laboratory Standards Instintute
CO2 Gás Carbônico
CPG Cromatografia de Permeação em Gel
DCM Diclorometano
DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Médium
DMSO Dimetil-Sulfóxido
E. coli Escherichia coli
ESBL Extended spectrum beta-lactamase
ESI Electrospray Ionization Mass Spectrometry
EtOAc Acetato de Etila
FeCL3 Cloreto de Ferro
Fr Fração
Fr. Acet Fração Acetato
g/mL Gramas por Litro
H Horas
HCL Ácido Clorídrico
HCT-116 Células de Carcinoma Colorretal
Hex Hexano
HL-60 Células Leucêmicas – promielócitos
HPLC-HRMS
Cromatografia liquida de alta eficiência acoplado a
espectrometria de massa de alta resolução
IC50 Concentração Inibitória de 50 por cento das células
ΔinjHo Grau de entalpia de injeção
ITC Calorimetria de Titulação Isotérmica
VII
Jurkat Células Leucêmicas – Células T
K.pneumoniae Klebsiella pneumoniae
Kcal/mg Quilocalorias por miligrama
Km2 Quilometro Quadrado
LPS Lipopolissacarídeo
MCF-7 Células de Carcinoma de Mama
MDA-MB-231 Células de Carcinoma de Mama
MDR Mutldroga-Resistênte
MeOH Metanol
mL Mililitro
mL/min Mililitro por minuto
mm Milímetro
Mmol/L Milimol por Litro
Mol/L Mol por Litro
MRSA Meticilin Resistant Staphylococcus aureus
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenltetrazolium
mV Milivolts
NADH Dinucleótido de nicotinamida e adenina
NaOH Hidróxido de Sódio
nm Nanômetro
O.D. Densidade Óptica
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
Part Dcm Partição Diclorometano
Part Hex Partição Hexano
Part Met. Partição Metanol
Part. Acet Partição Acetato de Etila
PH Potêncial de hidrogênio
PZ Potencial zeta
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
S Segundos
S. aureus Staphylococcus aureus
S. mutans Streptococcus mutans
THP-1 Célula leucêmica – Monócitos
VIII
UFC/mL Unidade formadora de colônias por mililitro
UFMA Universidade Federal do Maranhão
UTI Unidade de Terapia Intensiva
UV Ultravioleta
V Voltz
β Beta
18
1. INTRODUÇÃO
O profundo conhecimento do arsenal químico da natureza pelos povos
primitivos e pelos indígenas pode ser considerado fator fundamental para a
descoberta de substâncias tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo. A
convivência e o aprendizado com os mais diferentes grupos étnicos trouxeram
valiosas contribuições para o desenvolvimento da pesquisa em produtos
naturais (LORENZI, 2002; VIEGAS-JÚNIOR et al., 2006;).
O uso dos produtos naturais iniciou-se há milhares de anos por várias
populações com o intuito de tratar diversas patologias. Atualmente, apesar do
avanço da medicina, é crescente o interesse em terapias alternativas e uso
terapêutico de produtos naturais, estando envolvidas no desenvolvimento de
44% de todas as novas drogas, sendo o Brasil, promissor em substâncias
bioativas por apresentar uma diversidade biológica que é estimada em 19 % do
total terrestre. Dentre as aplicações terapêuticas das plantas medicinais, uma
das mais estudadas é seu potencial como fonte de compostos com atividade
antimicrobiana (CRAGG et al., 1997; GIULIETTI et al., 2005; HEMAISWARYA
et al., 2008).
Poucas plantas medicinais têm ação medicinal comprovada; e muitos
dos seus efeitos adversos, interações medicamentosas e efeitos sobre
patologias pré-existentes, ainda não se encontram esclarecidos. Assim,
agregar garantias científicas a esta prática terapêutica trará inúmeras
vantagens, principalmente à população de baixa renda, tais como: baixo custo,
fácil acesso à matéria prima; a compreensão de efeitos adversos e dos
mecanismos envolvidos nos efeitos benéficos da fitoterapia em diferentes
patologias; e a eliminação ou redução dos riscos de intoxicação por uso
inadequado da mesma (ALVARENGA et al., 2007).
Define-se como medicamento fitoterápico todo produto de origem
vegetal com propriedades terapêuticas, sem agregação de nenhuma
substância farmacologicamente ativa, e que foram evidenciados por meio de
testes pré-clínicos e clínicos e aprovados pelo Ministério da Saúde
(FIGUEREDO, 2007). Os fitoterápicos atuam em função dos princípios ativos
que possuem as plantas, os quais são resultado do seu metabolismo
19
secundário que produzem uma enorme variedade de pequenas moléculas
antibióticas, geralmente classificadas como fitoalexinas. Sua natureza
estrutural é diversa, tendo terpenoides, glicosídeos, flavonoides e polifenóis.
(HEMAISWARYA et al., 2008).
Com o uso da antibioticoterapia, vários mecanismos de resistência aos
medicamentos foram descobertos nas últimas décadas, A facilidade de
transmissão dos genes de resistência continua a ser um problema importante
no tratamento das doenças infecciosas. Atualmente, existe uma necessidade
de criar ferramentas para o desenvolvimento de estratégias contra a
propagação de estirpes bacterianas multidroga-resistentes (MDR) (ADAMUS-
BIALEK et al., 2013.)
O aumento da resistência dos microrganismos aos antimicrobianos, a
oferta cada vez menor de novos antibióticos e a dificuldade na descoberta de
novos fármacos ativos contra micro-organismos patogênicos e resistentes tem
feito as indústrias farmacêuticas voltarem parte de suas pesquisas para a
busca de novas terapias baseadas em plantas medicinais, que tem fornecido
ao longo da história da humanidade uma gama de compostos para o
tratamento de doenças infecciosas no homem (DAVIES, 2011; LIVERMORE et
al., 2011). Acredita-se que aproximadamente 15 milhões de mortes por ano
sejam causadas por doenças infecciosas causadas por diversos agentes
patogênicos como vírus e bactérias (MATHERS; FAT; BOERMA, 2008; FAUCI;
MORENS, 2012).
A utilização de substâncias antibióticas ou antimicrobianas representa,
talvez, um dos maiores avanços da farmacologia. Estas substâncias estão
entre os fármacos mais utilizados em ambulatórios e hospitais e têm reduzido
drasticamente a incidência de muitas doenças infecciosas (FRANCO et al.,
2007). Entretanto, desde a introdução da penicilina, a implantação de qualquer
novo antibiótico foi seguida pela evolução da resistência clinicamente
significativa. Embora esteja claro que os antibióticos que tenham como alvo a
viabilidade celular são altamente eficazes, esse modo de ação impõe pressão
seletiva para a emergência de cepas resistentes a antibióticos. Há, portanto,
uma necessidade de desenvolver novas substâncias contra cepas multidroga
resistentes (MDR) (CLATWORTHY, PIERSON, HUNG, 2007; ADAMUS-
BIALEK et al., 2013;).
20
Dessa forma, devido a essa busca por novos fármacos que auxiliem na
terapêutica das infecções causadas por bactérias, deste objetivo do trabalho
consistiu em realizar uma investigação de atividade antimicrobiana em plantas
típicas da Baixada Maranhense cujo uso popular envolva o combate a alguma
doença infecciosa.
1.1. A Baixada Maranhense
A Baixada Maranhense é uma Microrregião com a extensão de 17.909
km2 e corresponde a aproximadamente 5,4% da área total de Maranhão, inclui
21 municípios. (Anajatuba, Arari, Bela Vista do Maranhão, Cajari, Conceição do
Lago Açu, Igarapé do Meio, Matinha, Monção, Olinda Nova, Palmeirândia,
Pedro do Rosário, Penalva, Peri-Mirim, Pinheiro, Presidente Sarney, Santa
Helena, São Bento, São João Batista, São Vicente Ferrer, Viana e Vitória do
Mearim), ela que faz parte de uma das sete regiões ecológicas do Maranhão,
representa o principal grupo de bacias lacustres no Nordeste e é um complexo
sistema ecológico que é composto por lagos temporários, rasos, marginais e
permanentes que são comumente inundados. Apesar de ser um sistema
ecológico interessante, a microrregião Baixada Maranhense tem atividades
como a extensa criação de búfalo, agricultura, projetos de irrigação e
construção de represa (IBGE, 1992; COSTA-NETO et al, 2002.)
A figura 1 representa a localização da região da Baixada Maranhense
tracejada de branco a região de Pinheiro e arredores.
21
Figura 1 - Mapa da Baixada Maranhense
FONTE: Google Maps
Baixada Maranhense é uma região de grande biodiversidade,
apresentando-se como detentora de expressivo potencial para o estudo de
novos fitoterápicos, e requerendo grande importância às pesquisas o quais
visam o uso racional dessa flora pela população, sobretudo aquela mais
carente de recursos. A Tabela 1, mostra algumas das espécies vegetais que
são típicas da Baixada Maranhense e suas indicações segundo a literatura:
22
Tabela 1 - Estudos sobre algumas plantas encontradas da Baixada Maranhense
Plantas (nome popular) Parte usada Tipo de extrato Ação Referência
Bixa orellana L (Urucum) Semente/
Raiz Alcoólico /
Aquoso
Anti-Helicobacter pylori e anti-Plasmoduim berghei e contra
problemas respiratórios
(COGO et al, 2010; GUERRA et al., 2010;
NASCIMENTO, CONCEIÇÃO, 2011)
Cassia corymbosa L (fedegoso)
Raiz Aquoso Antigripal e antipirética (NASCIMENTO, CONCEIÇÃO, 2011)
Stryphnodendron coraiceum Benth (barbatimão)
Casca Aquoso Terapêutica de feridas cutâneas e
gastrite (LOZANO et al., 2014)
Malva sylvestris L (malva-do-reino)
Folhas Aquoso Antigripal (FIGUEREDO, 2007)
Cecropia scyadophylla Mart (embaúba)
Folhas Aquoso Cálculo renal, anemia, anti-
inflamatório (NASCIMENTO, CONCEIÇÃO, 2011)
Euterpe oleracea
(açaí) Fruto Aquoso Contra patógenos respiratórios (SKYBERG et al., 2012)
Polygonum punctatum
(erva de bicho) - Aquoso
Problemas intestinais, estomacais e
cutâneos
(BIESKI et al, 2012)
Duguetia furfuracea
(araticum) - - Anti-Leishmania (DA SILVA et al., 2009)
23
1.2. Família Annonaceae
A família Annonaceae é composta por aproximadamente 120 gêneros e
aproximadamente 2.150 espécies que tem distribuição marcadamente tropical e
subtropical em todo o mundo, sendo o gênero Annona o mais importante com
mais de 50 espécies (JOLY, 1979; MABBERLEY, 1997). No Brasil, a família
compreende 26 gêneros e aproximadamente 260 espécies, desempenhando um
importante papel na composição da vegetação (MAAS et al., 2006 citado por
SCALOPPI JUNIOR, 2014). Cerca de 50 espécies desta família está presente no
Cerrado Brasileiro, dentre as quais o araticum é uma das mais importantes. A
maioria das espécies encontra-se vegetando e produzindo frutos em clima tropical
e subtropical; poucas são as espécies nativas de clima temperado (NAKASONE e
PAULL, 1998; JANICK e PAULL, 2006).
Por apresentar uma combinação de características marcantes, é uma das
mais uniformes tanto do ponto de vista anatômico como estrutural e uma das mais
primitivas entre as Angiospermas (SILVA et al., 2009). Porém, Segundo Pinto
(2005), existem variações importantes entre mudas de Annona na mesma
espécie, que afetam não só a folhagem e produtividade das plantas, mas também
o tamanho dos frutos, forma, cor, qualidade e número de sementes por fruto.
Devido a estas variações são muitas vezes conhecidas o suficiente para terem
resultados em vários nomes botânicos para a mesma espécie
Muitas espécies da família Annonaceae são bastante promissoras, com
grande potencial frutífero e medicinal. As espécies têm características químicas
muito ricas e são reconhecidas fontes de compostos bioativos como substâncias
aromáticas, ácidos fenólicos, taninos, flavonoides, substâncias benzênicas,
catequinas, proantocianidina, óleos essenciais, terpenos, esteroides, alcaloides,
acetogeninas, carboidratos, lipídios, proteínas, lactonas, vitaminas, carotenos,
saponinas, entre outros (NUNES et al., 2012.) que apresentam uso medicinal e
não medicinal, ocorrendo em diferentes partes da planta, principalmente em
sementes, frutos, casca, raiz e folhas (CORDEIRO et al., 2005; COSTA et al.,
2011; SCOTTI et al., 2012). Quanto aos compostos fenólicos, na família
24
Annonaceae os de maior ocorrência são os flavonoides (SIMÕES e SCHENKEL,
2004).
Plantas da família Annonaceae são conhecidas por produzir frutos
comestíveis, e muitas de suas partes são comumente usadas na medicina
popular. Existem relatos de que muitos metabólitos produzidos por várias
espécies de anonáceas possuem várias propriedades biológicas incluindo esses,
antitumoral, pesticida, imunomoduladora, antimalárica, antimicrobiana e
atividades anti-helmínticas (ZENG et al., 1996; SANTOS, PIMENTA;
BOAVENTURA, 2007).
1.3 Gênero Annona
O nome Annona deriva do latim e significa "colheita anual" (LIZANA e
REGINATO, 1990). O gênero apresenta inúmeras características unificadoras,
especialmente em relação à altura da planta, sistema de raiz, casca, caule,
biologia floral, polinização, frutificação e tipo de fruto (OCHSE et al., 1974;
GEURTS, 1981; LEÓN, 1987). As espécies do gênero são disseminadas
mundialmente, de acordo com estudos de Pinto e colaboradores (2005), A
distribuição do gênero se estende por diversas áreas em que uma numerosa
diversidade de espécies foi observada, por exemplo, os vales de elevação média
dos Andes e muitas partes do Brasil, México, Guatemala, Honduras e das
Antilhas (Tabela 2).
25
Tabela 2 - Centro de origem e diversidade de algumas espécies de Annona
Espécies Locais de Origens
A. aurantiaca Brasil (Mato Grosso, Goiás e Minas Gerais)
A. cacans Brasil (Cerrado)
A. cherimola Vale dos Andes no Equador, Peru e Chile.
A. coriacea Brasil (Mato Grosso do Sul) e Paraguai
A. crassifolia Brasil (São Paulo, Goiás e Bahia)
A. diversifolia Noroeste do México, Guatemala e El Salvador.
A. furfuracea Brasil (Mato Grosso, São Paulo, Goiás e Minas Gerais).
A. glabra América Central, Antilhas, Equador, Brasil.
A. longifolia México (Jalisco)
A. longipes México (Veracruz)
A. montana Oeste da Índia, Antilhas, América do Sul Topical.
A. muricata Antilhas, América Tropical
A. mutans Sudeste do Brasil, Paraguai, Norte da Argentina.
A. paludosa Guiana (Savanas)
A. purpurea Sul do México e América Central.
A. reticulata Antilhas, América tropical.
A. salzmannii Brasil (Pernambuco)
A. scleroderma Sul do México, Guatemala.
A. senegalensis Leste da África
A. spinescens Brasil (Piauí, Bahia, Goiás)
A. spraguei Panamá.
A. squamosa Antillhas, América tropical.
A. testudinea Guatemala, Honduras
A. xespertonium Brasil (Bahia)
Annona L. é o gênero mais importante já que, dentro de centenas de
espécies no mundo, apenas sete e um híbridos são plantados comercialmente,
abrangendo as espécies Annona cherimola Mill, Annona. diversifolia Saff.,
Annona glabra L., Annona muricata L., Annona reticulata L., Annona senegalensis
26
Pers., Annona squamosa L. e o híbrido Annona squamosa x Annona cherimola
(NAKASONE; PAULL, 1998; JANICK; PAULL, 2006).
No Cerrado brasileiro, A. crassiflora Mart. Araticum, é uma fruta pequena
popular, também usada na medicina tradicional (ALMEIDA et al., 1998), e agora
está recebendo a atenção da pesquisa.
1.4 Annona glabra Linn.
A espécie Annona glabra Linn. ocorre em toda a América tropical e no
Brasil, apresenta ampla distribuição geográfica, sendo encontrada
espontaneamente desde a Amazônia até o Estado de Santa Catarina (BRAGA,
1976). Nos locais de ocorrência natural, ocupa frequentemente áreas que estão
submetidas a inundações periódicas como ao longo de rios, margens de lagos e
em regiões salobras próximas ao litoral. (PAULA; ALVES, 1997; PROTECTION,
2004).
A adaptação a esses ambientes se deve às várias características
estruturais da planta, como intumescimento da base de seu tronco, raízes
adventícias, aerênquima nas raízes, tronco pequeno, frutos que boiam e à
dispersão das sementes na água (ZOTZ et al., 1997). Consegue sobreviver em
períodos de seca, porém seu crescimento torna-se severamente comprometido.
Os frutos flutuam e podem sobreviver por períodos prolongados quando imersos
em água, salobra ou não. A planta possui altura mediana, chegando a cerca de 4
metros de altura. As folhas são coriáceas, com cerca de 10 cm de comprimento
(PINTO; SILVA, 1996; PROTECTION, 2004) como mostra a figura abaixo:
27
Figura 2 – Folhas e fruto de Annona glabra
FONTE: Própria (2014)
Sinonímia botânica: Annona palustris L.; Annona chrysocarpa Small.;
Annona klainni Pierre ex Engler & Diels, tem seu nome comum em português:
araticum do brejo, anona lisa (LORENZI et al., 2006).
Sua classificação taxonômica:
Reino: Plantae
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopsida
Ordem: Magnoliales
Família: Annonaceae
Género: Annona
Espécie: A. glabra
Grande parte dos bioprodutos ativos de importância farmacológica
encontrada nos extratos vegetais é oriunda de uma variedade de metabolismos
secundários (FERREIRA; PINTO, 2010). Metabólitos secundários das plantas
possuem uma constituição complexa, sendo sintetizados como mecanismo de
defesa das mesmas, atuando em alvos moleculares específicos de seus
28
predadores, ou para modular seus próprios metabolismos (FERREIRA; PINTO,
2010). Estes metabólitos despertam grande interesse, não só pelas atividades
biológicas produzidas pelas plantas em resposta aos estímulos do meio ambiente,
mas pela imensa atividade farmacológica desses compostos (ALVES, 2001).
A biossíntese de metabólitos secundários é um processo complexo e está
sujeita à influência de diferentes variáveis. De fato, os metabólitos secundários
representam uma interface química entre as plantas e o ambiente circundante,
portanto, fatores bióticos e abióticos podem interferir com a qualidade e a
quantidade de produtos secundários resultantes do metabolismo de uma planta
em determinado momento (GOBBO-NETO; LOPES, 2007).
Vários estudos têm demonstrado grande quantidade de compostos de
natureza química diversificada como, por exemplo, alcalóides, as acetogeninas e
os diterpenos (OLIVEIRA et al., 2002; CHEN et al., 2004;) Estudos relatam que
extratos de Annona glabra tem atividades biológicas variadas como pesticidas,
anti-helmíntica , antimicrobiana e propriedades inseticida moderada, esporicida e
atividade citotóxica e antitumoral (OHSAWA, et al., 1991.; PADMAJA et al., 1995.;
CHEN et al., 2004; ZHANG et al., 2004; COCHRANE et al., 2008).
1.5 Flavonoides
Flavonoides são compostos polifenólicos biossintetizados a partir da via
dos fenilpropanoides e do acetato, são substâncias redutoras (SIMÕES et al.,
2004) derivados das chalconas. Ocorrem nas plantas em uma variedade de
formas estruturais, todas contendo 15 átomos de carbono em seu núcleo básico
(HARBONE, 1984) (Figura 3). Os flavonoides derivam compostos químicos com
esqueletos do tipo flavonas, flavonóis, antocianidinas e catequinas, entre outros
(DEWICK, 2002). Precursores de vários grupos de substâncias como
aminoácidos alifáticos, terpenoides, ácidos graxos dentre outros (MANN, 1987).
Eles participam de importantes funções no crescimento, desenvolvimento e na
defesa dos vegetais contra o ataque de patógenos (DIXON; HARRISON, 1990) e
estão presentes na maioria das plantas, concentrados em sementes, frutos,
cascas, raízes, folhas e flores (FELDMANN, 2001).
29
Figura 3 - Estrutura química geral de um Flavonoide
Fonte: YAO et al., 2004
A variação estrutural no anel C subdivide os flavonóides em 6 principais
subclasses (Figura 4): flavonóis (p.ex., quercetina, kaempferol, miricetina),
contendo uma hidroxila na posição 3 e carbonila na posição 4 do anel C; flavonas
(p.ex., luteolina, apigenina), com somente carbonila na posição 4; flavonóis (p.ex.
catequina) contendo apenas a hidroxila no C-3, mas sem a dupla ligação entre o
C-2 e C-3; flavanonas com apenas a carbonila no C-4, também sem a dupla
ligação entre o C-2 e C-3 (p.ex. hesperetina); antocianidinas (p.ex., cianidina,
pelargonidina) contendo a hidroxila no C-3; e isoflavonas (p.ex., genisteína,
daidzeina), na qual o anel B está localizado na posição C-3 do anel C
(HARBORNE, 1994; RIBANI, 2006; OTAKi et al., 2009;).
30
Figura 4- Estrutura das principais classes de flavonoides
Fonte: NUNES et al., 2012
31
Várias funções são conferidas aos flavonoides nas plantas, tais como,
proteção dos vegetais contra a incidência de raios ultravioleta e visível, proteção
contra insetos, fungos, vírus e bactérias, atração de animais para polinização,
controle da ação de hormônios vegetais e inibidores de enzimas. Quanto aos
efeitos bioquímicos e farmacológicos dos flavonoides destacam-se ações como
sequestro de radicais livres (antioxidantes), anti-inflamatórias, anti-hepatóxica,
antialérgica, antitumoral, antiparasitária, antimicrobiana, fungistática, antiviróticos,
entre outros (HUANG et al., 2007; BERNARDES, PESSANHA, OLIVEIRA, 2010;).
Os flavonoides são conhecidos por serem sintetizados por plantas em
resposta a uma infecção microbiana; assim, não é de surpreender que se tenha
constatado in vitro serem substâncias antimicrobianas eficazes contra uma ampla
variedade de microrganismos. Extratos de plantas ricas em flavonoides a partir de
espécies diferentes têm sido relatados como possuindo atividade antibacteriana
(PANDEY et al., 2010; MISHRA et al., 2011; MISHRA, KUMAR, PANDEY, 2013;
MISHRA et al., 2013;.). Vários flavonoides, incluindo apigenina, galangina, a
flavona e glicosídeos flavonoides, isoflavonas, flavanonas, e chalconas mostraram
possuir uma potente atividade antibacteriana (CUSHNIE, LAMB, 2005).
Os flavonoides podem atuar em diversos alvos celulares, em vez de um
local específico de ação. Uma das suas ações moleculares é para formar
complexos com proteínas não específicas através de forças, tais como, pontes de
hidrogénio e de efeitos hidrofóbicos, bem como por formação de ligação
covalente. Assim, o seu modo de ação antimicrobiana pode estar relacionado com
a sua capacidade para inativar adesinas microbianas (proteínas específicas
responsáveis pela adesão celular), enzimas, proteínas de transporte do envelope
celular. Flavonoides lipofílicos também podem romper as membranas celulares
(COWAN, 1999, MISHRA et al., 2009.)
Em relação aos flavonoides encontrados em espécies da família
Annonaceae, estes têm sido pouco descritos ou relatados. As classes mais
abundantes no gênero Annona são os flavonóis e seus derivados glicosilados,
estando presentes tanto os O-glicosídeos como os C-glicosídeos (SANTOS ;
SALATINO, 2000). Contudo, essa família se destaca pela biossíntese de
derivados da via do chiquimato que é responsável pela produção da maioria dos
32
derivados fenólicos produzidos por fontes vegetais. Os flavonoides podem sofrer
degradação em meio alcalino na presença de oxigênio e possuem intensa
absorção UV, aproximadamente em 350 nm devido à presença de ligações
duplas conjugadas com os anéis aromáticos; são ácidos fracos e, como são
substâncias polares ou moderadamente polares, eles são solúveis em etanol,
metanol e butanol e combinações de solventes com água (HARBORNE, 1994a).
Santos e Salatino (2000) isolaram e identificaram um total de 76 flavonas
e flavonóis, a partir das folhas de espécies de Annonaceae, sendo a maioria,
glicosídeos. Ainda, segundo Santos e Salatino (2000), todos os fenóis
encontrados foram glicosídeos de flavonas (apigenina, scutellareina, hispidulina e
luteolina) ou flavonóis (canferol, ramnocitrina, 6-hidroxiramnocitrina, quercetina,
isoramnetina e ramnetina), com predominância deste último, sobressaindo-se a
quercetina.
1.5.1 Catequina e Epicatequina
As catequinas são compostos polifenólicos, categorizados de acordo com
o grupo de flavonoides. Encontrados em muitas plantas medicinais (MANACH,
2004). São formas mais reduzidas da unidade de C3 em compostos flavonoídicos,
têm sido extensivamente estudadas em função da sua atividade antimicrobiana
(Figura 5).
Figura 5- Estrutura da catequina e seu isômero epicatequina
Fonte: MANACH,2004
33
As catequinas são compostos relatados pela sua atividade antibacteriana
in vitro contra Vibrio cholerae, Streptococcus mutans, Shigella sp (BORRIS, 1996;
MOERMAN, 1996). As catequinas demostraram inativar a toxina da cólera em
Vibrio cholerae e inibir glicosiltransferases bacterianas isoladas em S. mutans,
provavelmente devido às atividades complexantes (NAKAHARA et al, 1993;
BORRIS,1996;). Robinetin, miricetina, e (-) - epigalocatequina são conhecidos por
inibir a síntese de DNA em Proteus vulgaris. Mori e colaboradores (1987)
sugeriram que o anel B dos flavonoides pode intercalar ou formar ligação de
hidrogénio com o empilhamento de bases de ácido nucleico e ainda levar a
inibição de DNA e síntese de RNA em bactérias.
Trabalhando-se na hipótese de que as catequinas almejam a membrana
bacteriana e com a intenção de melhorar a capacidade de catequinas para
interagir com esta estrutura da célula, foram sintetizados derivados de 3-O-acil. A
análise posterior indicou que o 3-Ooctanoyl - (-) - epicatequina tem uma atividade
anti Staphylococcus aures resistente a meticilina (anti-MRSA) superior ao dos
flavonóides de ocorrência natural (-) - epicatequina galato, e sugeriu-se que este
derivado de acil pode ser útil como agente terapêutico tópico (STAPLETON et al.,
2004).
1.6 Infecções bacterianas
Diante dos índices impactantes de doenças infecciosas e de resistência
bacteriana aos antibióticos, e juntamente com a propagação ameaçadora de
micro-organismos, é premente a busca por estratégias minuciosas para obtenção
de novos compostos bioativos, como aqueles oriundos de plantas, os quais
representam novas possibilidades de terapia antimicrobiana (FRIEDMAN, 2007;
GOLDMAN; AUSIELLO, 2009; AGUIAR et al., 2012).
A questão da emergência das infecções está relacionada a mudanças a
nível proteico e molecular que, consequentemente, fortaleceram a resistência das
bactérias aos antibióticos, fazendo-as como importantes entidades mórbidas dos
tempos atuais. Mudanças de origem comportamental, tecnológica, econômica e
ambiental que permeiam as sociedades modernas, por exemplo, as mudanças de
34
estilos de vida, as mudanças no comportamento das populações (emigração e
imigração), as alterações ambientais (pressão antrópica), a elevação do consumo
indiscriminado de agentes antimicrobianos e a utilização destas substâncias em
rações para frango são alvos apontados como fatores associados ao
aparecimento de resistência antimicrobiana, permitindo a subsequente seleção de
espécies resistentes e tornando-se responsáveis por esse sério problema de
saúde pública mundial (ALVES, et al., 2000; RANG et al., 2007;
BRESOLIN;CECHINEL FILHO, 2010; MCPHEE; PAPADAKIS;RABOW, 2011;
AGUIAR et al., 2012). No Brasil, este quadro crítico levou ao ponto de tornar-se
necessária a edição da RDC 20/2011 pela ANVISA (Agência Nacional de
Vigilância Sanitária) com o objetivo de racionalizar o consumo de antimicrobianos
(BRASIL, 2011).
Estudos têm mostrado que as principais espécies Gram-negativas
relacionadas às infecções hospitalares são: Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii e Enterobacter
spp (ROSSI, 2011; GALES ET AL., 2012; THEURETZBACHER, 2012).
As bactérias gram-negativas, assim como as bactérias gram-positivas,
são micro-organismos que causam infecções provocando significante aumento
das taxas de mortalidade e morbidade. Estruturalmente as gram-negativas, são
constituídas por uma única camada de peptidoglicano sobreposta por uma
membrana externa lipoproteica. Neste grupo de bactérias, destacam-se aquelas
produtoras de enzimas β-lactamases de espectro estendido (ESBL), como
Pseudomonas aeruginosa e a Escherichia coli, substancialmente associadas a
doenças infecciosas (TRAGANTE et al., 2008; BASSETTI; RIGHI, 2013).
1.7 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa é uma das principais bactérias Gram-negativas,
não fermentadoras, e de interesse clinico. Pertence à família
Pseudomonadaceae, é um micro-organismo oxidase-positiva que apresenta
flagelos polares e utiliza a glicose pela via Entner-Doudoroff mediado por 6-
fosfogliceraldeído desidrogenase e aldolase. Diferentemente das espécies de
35
bactérias da família Enterobacteriaceae, P. aeruginosa não é capaz de utilizar
glicose e outros açúcares pela via fermentativa (YANG, 2014).
O lipopolissacarídeo (LPS) representa um fator de virulência importante
para as bactérias gram-negativas, sendo designado de endotoxina. O LPS está
presente na parede celular, especificamente na membrana externa. A fração
polissacarídica constitui o antígeno somático (antígeno O), cuja grande
diversidade de imunotipos permite subdividi-las em sorogrupos. A fracção lipídio A
do LPS é responsável pelas propriedades tóxicas evidenciadas após a infecção
com micro-organismos Gram negativos, a endotoxina é relacionada à síndrome
séptica caracterizada por febre, choque séptico, oligúria, leucopenia ou
leucocitose, coagulação intravascular disseminada e anomalias metabólicas
(WINN et al., 2008).
No Brasil, P. aeruginosa é uma importante causa de infecção nosocomial,
sendo considerada a primeira causa de pneumonia nosocomial, principalmente
nas unidades de terapia intensivas (UTIs) (SADER et al., 2001; TEIXEIRA et al.,
2004; FIGUEREDO-MENDES et al., 2005; GAYNES; EDWARDS, 2005.;
ZAVASKI et al., 2006).
Em crianças e neonatos, esta bactéria tem sido relacionada como um
importante agente causador de infecções graves, levando a diversas
consequências como sepsemia, infecções do trato urinário, pneumonia associada
à ventilação mecânica, infecções de pele e mucosas, queimaduras e trauma,
além de estar significativamente associada a casos crônicos de otite média
supurativa e infecções respiratórias associadas à fibrose cística (OMS, 2008).
Esta bactéria tornou-se um problema em potencial devido à capacidade
de desenvolver mecanismos de resistência a diferentes classes de agentes
antimicrobianos, podendo tornar-se resistente a todos os antibióticos utilizados no
tratamento de rotina, o que representa um grande desafio para a terapia
antimicrobiana (ROSSOLINI; MANTENGOLI, 2005; PICOLI, 2008; FUENTEFRIA
et al., 2008; GONÇALVES et al., 2009).
A importância de P. aeruginosa se deve pela expressão de múltiplos
mecanismos de resistência, dificultando a ação de antibacterianos, ocasionando
elevados índices de morbidade e mortalidade (SADER et al., 2001; PELLEGRINO
36
et al., 2002; GALES et al., 2004; LAMBERT et al., 2011;; POOLE, 2011;). Dentre
os múltiplos mecanismos de resistência ressaltam-se: enzimas modificadoras de
aminoglicosídeos, super-expressão de bombas de efluxo, perda de porinas,
alterações no sítio alvo de ação da droga antimicrobiana (YORDANOV, 2009;
ZAVASCKI et al., 2010; KANJ, KANAFANI, 2011; MULLER et al., 2011; POOLE,
2011; STRATEVA).
P. aeruginosa é um micro-organismo que pode apresentar resistência
natural ou adquirida a um grande número de antibióticos utilizados na prática
clínica, como cefalosporinas de primeira e segunda geração, tetraciclinas,
cloranfenicol e macrolídeos (YONEDA et al., 2005; STRATEVA, YORDANOV,
2009;). De acordo com Bouza e Muñoz (2000) mesmo as drogas com boa
atividade contra P. aeruginosa não são sempre 100% eficientes contra ela.
Devido aos crescentes casos de morbidade e mortalidade por infeccões
bacterianas juntamente com sua resistência aos antibióticos, é incessante a
buscar por novas estratégias para mocrorganismos multi droga-resistênte (MDR)
sendo uma alternativa viável a procura por novas substâncias capazes combater
esses microrganismos em extratos de plantas.
37
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Avaliar o potencial antimicrobiano e citotóxico de extratos de Annona
glabra Linn. obtida na região da Baixada Maranhense.
2.2. Objetivos Específicos
Determinar os componentes fitoquímicos presentes no extrato bruto de
Annona glabra;
Investigar a atividade antimicrobiana dos extratos contra diferentes
linhagens de bactérias de interesse clínico;
Realizar purificação do extrato por técnicas cromatográficas com
monitoramento da atividade antimicrobiana.
Avaliar a atividade citotoxicidade e antitumoral dos extratos in vitro.
38
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Produtos naturais
Para este estudo foi selecionada a planta Annona glabra Linn, cujo
exemplar foi localizado na região da Baixada Maranhense (Povoado Central do
Maranhão, localizado próximo a cidade de Pinheiros - Maranhão). Para o estudo
de prospecção de substâncias bioativas, folhas de Annona glabra foram coletadas
no município de Central do Maranhão, Maranhão, Brasil (2 ° 16'20.2 "S, 44 °
57'14.2" W). As partes da espécie vegetal selecionadas foram coletadas de
acordo com as normas estabelecidas na literatura e em quantidade adequada
para a realização das análises biológicas e químicas (HARBONE, 1984). Cada
uma das partes das plantas foi identificada pelo Herbário Ático Seabra que
pertence a Universidade Federal do Maranhão (UFMA), como uma espécie
vegetal típica da Baixada Maranhense nomeada de Annona glabra Linn(Araticum
– Registro: 01077). Esta espécie foi selecionada com base em dados prévios
obtidos no Herbário Ático Seabra (UFMA).
3.1.1 Coleta
Nas coletas os materiais utilizados foram:
Facão,
Tesoura de poda,
Sacos plásticos,
Papel pardo (jornal),
Lápis, borracha,
Prensa de madeira e barbante
A coleta foi processada em duas etapas, uma no qual foram coletadas
raízes, caules, folhas, frutos e sementes para a realização da
identificação/exsicata pelo Herbário Ático Seabra da UFMA, e outra o qual foram
coletadas as folhas para a preparação do extrato orgânico. O período de coletada
ocorreu em Setembro de 2014 em turno matutino entre 8 e 11 horas.
39
3.1.2 Preparação do extrato hidroalcoólico
As folhas da planta foram recolhidas no período da manhã (entre 8 e 11
horas), lavadas em água corrente e secas em estufa a 50C por 48 horas. O
material vegetal seco foi triturado com um moinho de pás. Até a consistência de
um pó de granulometria de 1-2 mm. Para a extração dos compostos químicos,
cerca de 300 gramas de pó das folhas foi adicionado a 1.600 mL de etanol a 70%
em um frasco de vidro âmbar de 2 litros (YOUNES et al., 2000). A infusão foi
incubada à temperatura ambiente para o processo de maceração lenta durante 10
dias. A mistura foi filtrada utilizando-se um filtro de celulose. O etanol foi
evaporado em um sistema sob pressão reduzida utilizando-se um evaporador
rotativo a 45C por até 3 horas (HARBONE, 1984). O solvente residual foi
removido após a exposição da amostra em estufa a 50C para a recuperação dos
compostos fitoquímicos de interesse Este foi pesado e diluído em Dimetil-
Sulfóxido (DMSO) puro em concentrações estoques de 10 a 20 mg/mL e
armazenados à 4C até a realização das análises fitoquímicas qualitativas, dos
ensaios antimicrobianos e dos testes citotóxicos.
3.2 Análise fitoquímica do extrato
A análise fitoquímica qualitativa dos compostos extraidos das folhas foi
conduzida utilizando a metodologia descrita por Matos (1997). Para a análise uma
alíquota do extrato (174 mg/mL). A mistura ficou sob agitação magnética a uma
temperatura de 50ºC por 5 minutos. Após o resfriamento a mistura foi filtrada
Para análise do extrato, foram utilizados 12 tubos de ensaios de vidro de
boro silicato (numerados e identificados), nos quais se adicionou 2 mL do extrato.
Os testes foram realizados, em duplicata, sendo que o tubo 12 permanecerá
apenas com o extrato para comparação.
40
3.2.1 Caracterização de Taninos
Para esta caracterização foi necessário inicialmente preparar a gelatina
salgada dissolvendo-se 2g de gelatina em 100 mL de solução de cloreto de sódio
a 10%. Ao tubo 2 adicionou-se de HCl (Ácido Clorídrico) diluído e 3 gotas de
solução de gelatina salgada ao extrato. A formação de precipitado indica a
presença de taninos.
3.2.2 Caracterização de Taninos - 2
Foram adicionados ao tubo 3 de cada extrato cinco gotas de acetato de
chumbo a 10%. A formação de precipitado indica a presença de taninos.
3.3.3 Caracterização de Flavonóides
Reação de Cianidina: Acrescentou-se 1 mL de HCl concentrado e
fragmentos de magnésio ao extrato do tubo 4 e observou-se a coloração formada,
de acordo com a Tabela 3.
Tabela 3 - Coloração observada de Compostos Flavônicos na Reação com Ácido Clorídrico e Magnésio (Reação de Cianidina).
COMPOSTOS REAÇÃO DE CIANIDINA
FLAVONA Laranja
FLAVONOL Vermelho
FLAVANONA Violeta
CHALCONA -
ISOFLAVONA -
Fonte: SIMÕES et al, 2004.
41
3.3 Atividade antimicrobiana in vitro
A avaliação da atividade antimicrobiana do extrato foi inicialmente
realizada pelo método de difusão em ágar com algumas modificações, conforme
previamente descrito (VALGAS et al., 2007). A determinação da concentração
inibitória mínima (CIM) dos extratos foi realizada pela técnica de microdiluição em
caldo. Os valores da CIM (em µg/mL) foram definidos como a menor
concentração capaz de inibir completamente o crescimento microbiano (VALGAS
et al., 2007).
3.3.1 Microrganismos utilizados
Para os testes de atividade antimicrobiana foram utilizadas linhagens
padrões ATCC de bactéria Gram-positiva: Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Gram-negativas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC
25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 e Acinetobacter baunannii ATCC
19606, assim como isolados clínicos sensíveis e multirresistentes de P.
aeruginosa nomeadas de P1C, P2C, P5C, P18C, P27C, P32C, P110C, P113C,
P146C, P165C e isolados clínicos de S. aureus portadores do gene mecA
(MRSA) previamente identificados por métodos moleculares nomeados de S.a.
96, S.a. 98, S.a.116, S.a. 145, S.a. 146, S.a. 156, S.a. 162, S.a. 200, S.a. 252, S.a
258, S.a. 260. Estes foram obtidos da coleção de culturas microbianas do
laboratório da Universidade CEUMA.
3.3.2 Avaliação da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em poços
Para o método de difusão em ágar as bactérias foram inoculadas
previamente caldo Brain Hear Infusion (BHI, Difco) para ativação e as placas
incubadas à 37ºC por 24 horas. Após o crescimento as colônias foram colocadas
em solução salina estéril a 0,85% e a concentração celular foi padronizada na
escala de MacFarland (escala 0,5 1,5x 108 UFC/mL). As células bacterianas
foram inoculadas sob a superfície do ágar Mueller-Hinton (90 x 15 mm) com
auxílio de um swab e em seguida poços foram perfurados utilizando uma haste
42
cilíndrica de aço inoxidável com 6 mm de diâmetro onde foram adicionadas
alíquotas de 40 μL (C = 174 mg/mL) da solução teste do extrato na concentração
disponível. Em seguida as placas foram incubadas a 37C por um período de 18 a
24 horas. Após o tempo de incubação das placas, as leituras dos resultados
foram realizadas mensurando os halos de inibição com um auxílio de uma régua
milimetrada (ROMEIRO, 2011). Todos os testes foram feitos em triplicatas e
foram feitas as médias dos halos encontrados, onde os controles positivos para a
bactéria gram-positiva foi a penicilina e para bactérias gram-negativas foi
gentamicina, e como controle negativo foi utilizado álcool 70% .
3.3.3 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
A atividade antimicrobiana do extrato obtido das folhas foi avaliada
utilizando-se a metodologia de microdiluição em caldo, com base nos documentos
M100-S24 (CLSI, 2014). Previamente aos testes, as linhagens bacterianas foram
ativadas em BHI (Difco) durante 24 h a 35 ± 2ºC. Após este subcultivo, o inoculo
foi padronizado para testes de microdiluição em caldo, cultivando micro-
organismos até a fase log (crescimento exponencial).
Em condições ideais, o inoculo bacteriano foi ajustado em solução salina
até 15 minutos após sua preparação (método de microdiluição), de maneira que,
após a inoculação, cada tubo de ensaio ou poço contém aproximadamente 5 x
105 UFC/mL. Sendo o volume no poço foi de 0,2 mL e o volume de inóculo, 0,005
mL. A suspensão McFarland 0,5 (1,5 x 108 UFC/mL) foi diluída 1:10 para se
conseguir uma diluição de 107 UFC/mL. Quando 0,005 mL dessa suspensão foi
inoculada no caldo, a concentração final de bactérias do teste atingiu
aproximadamente 5 x 105 UFC/mL (ou 5 x 104 UFC/poço, no método de
microdiluição).
O inoculo dos testes correspondem a uma concentração celular na ordem
de 104 UFC/mL. A cada diluição do composto previamente distribuído em cada
orifício da placa foi adicionado 100 L do inoculo, perfazendo um volume final de
200 L. As placas foram incubadas a 35ºC por 24 horas e em seguida foi
realizado a leitura. As concentrações finais dos extratos no meio de cultura foram
43
de: 4.096, 2.048, 1.024, 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1 e 0,5 μg/mL. Os
ensaios antimicrobianos foram efetuados em triplicata e as placas foram
incubadas a 35 ± 2ºC durante 24 h. Como revelador do crescimento celular foi
utilizado 20 μL/poço de resazurina a 0,03%. Os controles negativos dos ensaios
foram realizados com 100 μL do caldo Mueller-Hinton (MH), acrescido do inoculo
bacteriano padronizado. A concentração inibitória mínima (CIM) foi definida como
a menor concentração do composto capaz de inibir completamente o crescimento
microbiano, nos poços de microdiluição conforme detectado a olho nu. A leitura
dos resultados para determinação da CIM foi considerada como positivo para os
poços que permaneceram com a coloração azul e negativa os que mostraram
coloração rosa. Como controle negativo foi inoculado o meio de cultura mais a
bactéria. (SALVAT et al., 2001).
3.3.4 Determinação da atividade bactericida mínima (CBM)
A atividade bactericida mínima calculada a partir da CIM feita com extrato
e com as três concentrações abaixo e acima da CIM onde foram retiradas
alíquotas de 1 µL a e semeadas em ágar MH. Onde a CBM foi definida como a
menor concentração capaz de inibir completamente o crescimento microbiano no
ágar.
3.4 Partição do Extrato
Para a partição da amostra em solventes de diferentes polaridades, uma
amostra de cerca de 20 g da graxa derivada da extração hidro alcoólica foi
misturada com MeOH: H2O (8: 2) utilizando um banho de ultra-son. A amostra foi
então submetida a extrações sucessivas por partição solvente-solvente onde foi
utilizado 100 mL de cada solvente, para se obter as fracções solúveis: hexano
(Hex), diclorometano (DCM) e acetato de etilo (EtOAc). Em seguida cada partição
foi secada por um sistema a vácuo (SpeedVac, Savante) e seus produtos
pesados em uma balança semi-analítica.
44
3.5 Cromatografia em Camada Delgada
As análises de CCD (cromatografia em camada delgada) foram realizadas
em placas sílica gel pré-revestidas G-60/F254 (0,25 mm, Merck, Darmstadt,
Alemanha). As placas de CCD foram eluídas em uma câmara de pré-
saturamento, utilizando-se misturas de solventes com polaridades diferentes em
diferentes proporções de: (a) acetato de etilo: metanol: água (EtOAc: MeOH:
H2O/70: 10: 2 v/v); ou (b) diclorometano: metanol (DCM: MeOH/95: 5 v/v). As
manchas fitoquímicas foram visualizadas sob exposição de luz ultravioleta a 254
nm ou 360 nm, após a pulverização das placas com uma solução de vanilina
diluída em etanol 1% adicionada de ácido sulfúrico a 10% v/v (1:1) ou 2- aminoetil
difenilborinato/polietileno glicol 4000 (solução de NP/PEG) em etanol a 2% (w/v).
3.6 Ensaios Antimicrobianos com partições
Em seguida, foram realizados novos ensaios de susceptibilidade com as
partições obtidas seguindo a mesma metodologia já descrita anteriormente nos
itens 3.3.3 e 3.3.4 de determinação da Concentração Inibitória Mínima e
Concentração Bactericida Mínima.
3.7 Avaliação da atividade citotóxica em linhagens de células tumorais
Os ensaios de avaliação da citotoxicidade dos extratos e das frações
foram conduzidos utilizando células HL60 (Leucemia – promielócitos), Jurkat
(Leucemia – Células T) e THP-1 (Monócitos) foram cultivadas na concentração de
50.000 (HL60), 100.000 (Jurkat e THP-1) e células MDA-MB-231, MCF-7
(Carcinoma de Mama) e HCT-116 (Carcinoma Colorretal) foram utilizados na
concentração de 104 células por poço (placa de 96 poços) e pré-incubado
overnight para estabilização (5% CO2, 95% de ar atmosférico a 37°C). Após
estabilização, todas as células foram cultivadas com as partições por 48h. Todas
as substâncias foram testadas em triplicata em dois experimentos independentes
e como controle foi utilizado o solvente DMSO (0,5%). A viabilidade celular foram
45
baseadas pela redução mitocondrial do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difenltetrazolium (MTT) . Os extratos foram triados a 100 μg/mL e apenas as
substâncias que apresentaram atividade maior que 50%, foram posteriormente
submetidas à determinação da concentração citotóxica para 50% das células
(IC50).
As células foram cultivadas em garrafas de cultivo celular de 50 mL
contendo 10 mL de meio DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Médium, Sigma)
suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB, Gibco), 5 mol/L de bicarbonato
de sódio, 25 mmol/L de HEPES e 40 mg/L de gentamicina. As garrafas foram
incubadas por 24 h a 37ºC com 5% de CO2. Após o crescimento, as células
aderentes (carcinoma de mama - MDA-MB-231 e MCF-7) (carcinoma colorretal –
HT-116) foram tripsinizadas e lavadas em três vezes com PBS. Alíquotas 100 L
de todas as culturas foram transferidas para poços de placas de 96 poços a uma
concentração de 105 células/poço. As placas contendo as células foram então
mantidas nas mesmas condições como descrito anteriormente (5 % de CO2,
37C). Após 24 h de incubação, concentrações crescentes geometricamente
definidas entre 100, 10, 1; 0,1; 0,01; 0,001 e 0,0001 µg/mL dos extratos foram
adicionadas aos poços das placas, que foram incubadas a 37C por 24 h. Os
controles consistiram de células adicionadas do meio de crescimento DMEM sem
adição dos compostos.
Após a incubação, uma alíquota de 10 L de MTT (brometo de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) a 5 mg/mL em tampão fosfato pH 7,0 foi
adicionada em cada poço e as placas incubadas por 4 h a 37º C e 5% de CO2.
Após a incubação, 100 L de uma solução de lise consistindo de dodecilsulfato de
sódio (SDS) 10% e 50% de dimetilformamida foram adicionadas a cada poço. As
amostras foram homogeneizadas para uma completa dissolução dos cristais de
formazan. O conteúdo de cada poço das placas foi submetido à determinação da
absorbância no comprimento de onda de 570 nm. Os resultados foram calculados
a partir da medida da absorbância utilizando a fórmula [1- (Absexp/Abscontr)] x 100,
com porcentagem da medida da absorbância das células tratadas com os
compostos em relação ao controle de células sem adição dos mesmos. As
amostras foram testadas em duplicata. A IC50 (concentração efetiva que mata 50%
das células) foi calculada a partir dos dados obtidos das medidas da redução da
46
absorbância (%) utilizando o programa GraphPad Prism 5.0 software (Jandel
Scientific, San Rafael, CA).
3.8 Cromatografia de Exclusão Molecular
Para o fracionamento da Partição Acetato de etila foi realizado a
Cromatografia de Permeação em Gel (CPG) ou Cromatografia de Exclusão
molecular. A técnica permite separar compostos por peso molecular da maior
molécula para a menor. Foi realizada utilizando três colunas de vidro acopladas
(Buchi coluna No. 17980) injetando 6,3 g da partição acetato de etila em
preenchimento com 2 mL de gel Sephadex LH-20TM (GE Healthcare, EUA)
atingindo uma concentração de 3,15 g/mL, onde o metanol absoluto foi utilizado
como fase móvel, com o caudal bombeado de 480 mL/h durante 4 horas. As
fracções foram recolhidas em 20 mL/tubo, reunidas e após a análise em
cromatografia em camada fina (CCD), reagrupadas as frações semelhantes.
3.9 Cromatografia em Camada Delgada das frações
Para as frações 40 obtidas foram realizadas análises de cromatografia em
camada delgada (CCD) com o objetivo de reagrupar as frações pertencentes aos
mesmos perfis cromatográficos, onde foram realizadas em gel de sílica pré-
revestido comercial placas de L-60 / F254 (0,25 mm, Merck, Darmstadt,
Alemanha). TLC placas foram eluídas em uma câmara de pré-saturado, utilizando
solventes em diferentes proporções de: (a) acetato de etilo: metanol: água
(EtOAc: MeOH: H2O / 70: 10: 2 v / v); ou (b) diclorometano: metanol (DCM:
MeOH / 95: 5 v / v). As manchas foram visualizadas sob luz UV a 254 ou 360 nm,
alternativamente, por meio da pulverização das placas com um mistura (1: 1) de
etanol a uma solução de vanilina 1% w / v e ácido sulfúrico em 10% v / v ou 2-
aminoetil diphenylborinate / polietilenoglicol Solução de 4000 (NP / PEG) em
etanol a 2% (w / v).
3.10 Ensaios Antimicrobianos das frações
47
Após o procedimento de separação de compostos por peso molecular
utilizando o método de Cromatografia de Permeação em Gel em coluna LH-20,
novos ensaios de atividade antimicrobiana (CIM e CBM) com as frações geradas
foram feitos.
3.11 Calorimetria Isotérmica de Titulação
A calorimetria isotérmica de titulação (ITC) foi realizada a fim de
caracterizar a termodinâmica do complexo constituído pela fração Fr. 32-33 e as
células de P. aeruginosa ATCC 27853 em suspensão. Os experimentos foram
realizados em duplicata utilizando um VP-ITC Microcalorimetro da Microcal, a
298,15 K. As titulações consistiram de 200 injeções sucessivas (com intervalos de
tempo de 300 s) de 5 µL da fração Fr. 32-33 (20,4 µg/mL) em 1,5 mL de
suspensões celulares de P. aeruginosa (O.D600 1.0). Uma injeção inicial de 1 µL
foi descarregada a fim de eliminar os efeitos da difusão da fração da ponta da
seringa para o meio, durante o processo de pré-equilíbrio. A concentração da
fração dentro da célula variou de 0 a 0,37 mg/mL, enquanto a concentração das
células de P. aeruginosa (expressa em termos de O.D600) variou de 1 O.D. a 0,86
O.D. A correção da concentração bem como a integração dos picos de fluxo de
calor envolvidos na entalpia especifica do Kcal/mg da fração Fr. 32-33 foram
feitas com o software Microcal Origin 5.0 para ITC. Experimentos controle,
referentes a injeções de células bacterianas sem adição da fração e injeções do
composto em solução aquosa foram feitos para determinar uma possível
liberação de energia durante os ensaios de diluição.
3.12 Potencial Zeta
O potencial zeta reflete o potencial de superfície das partículas
(bactérias), o qual é influenciado pelas mudanças na interface com o meio
dispersante (Fração Fr. 32-33), em razão da dissociação de grupos funcionais na
superfície da partícula ou da adsorção de espécies iônicas presentes no meio
aquoso de dispersão (MAGENHEIM, BENITA, 1991; MOSQUEIRA et al, 2000.).
48
Observando se há alteração da carga elétrica da membrana bacteriana (P.
aeruginosa) quando colocada em contato com a fração ativa.
Os experimentos de Potencial Zeta foram conduzidos a 25C, utilizando
com Zetasizer NanoZS m (Malvern) com 64 canais e correlator de 633 nm (red
Lazer). A técnica utilizada para a medida de ZP foi conduzida de acordo com
padrões Malvern Laser Doppler Velocimetry acoplado com M3-PALS (Phase
Analysis Light Scattering). As suspensões bacterianas foram adicionadas em
cubetas de polietileno com 1 cm de caminho óptico acoplada a elétrodos
(Malvern, Folded Capillary cell-DTS1060). O ensaio foi processado por titulação,
por meio de 51 injeções de 10 µL da fração Fr 32-33 (4 µg/mL) em recipiente de
25 mL contendo suspensão de células de P. aeruginosa ATCC 27853, (O.D600
1.0), de modo que as condições fossem as mais próximas possíveis daquelas
descritas no experimento de ITC. A cada titulação, a solução foi transferida para
uma cubeta (Folded Capillary cell), e a carga líquida foi então determinada. Cada
ponto de ZP correspondeu médias de dez execuções.
3.13 Ensaio de tempo de morte celular bacteriana com MTT
Os dados coletados a partir de estudos de tempo de morte têm fornecido
informações importantes sobre a velocidade e extensão da atividade bactericida,
características farmacodinâmicas, ou seja, a relação entre concentração e o efeito
pós-tratamento, e potencial de antagonismo ou sinergia entre agentes
antibacterianos administrados concomitantemente. Esses dados têm melhorado
significativamente a compreensão sobre as relações dinâmicas que existem entre
agentes antimicrobianos e seus efeitos sobre as bactérias. De fato, o teste de
tempo de morte tornou-se uma ferramenta indispensável para a avaliação da
atividade dos agentes antimicrobianos contra as bactérias (CLSI, 2014).
Após a incubação, uma alíquota de 10 L de MTT (brometo de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) a 5 mg/mL em tampão fosfato pH 7,0 foi
adicionada em cada poço e as placas incubadas por 4 h a 37º C e 5% de CO2.
Após a incubação, 100 L de uma solução de lise consistindo de dodecilsulfato de
sódio (SDS) 10% e 50% de dimetilformamida foram adicionadas a cada poço. As
amostras serão homogeneizadas para uma completa dissolução dos cristais de
49
formazan. O conteúdo de cada poço das placas foi submetido à determinação da
absorbância no comprimento de onda de 570 nm. Os resultados serão calculados
a partir da medida da absorbância utilizando a fórmula [1- (Absexp/Abscontr)] x 100,
com porcentagem da medida da absorbância das células tratadas com os
compostos em relação ao controle de células sem adição dos mesmos. As
amostras foram testadas em duplicata.
Esse ensaio baseia-se na medida do dano induzido pelo composto/extrato
em estudo no metabolismo celular de glicídeos usualmente através da avaliação
da atividade de desidrogenases mitocondriais. O ensaio de MTT é utilizado para
determinar a viabilidade celular, quantificando o MTT presente no meio foi
reduzido pela atividade metabólica celular ligada ao NADH e NADHP formando
cristais de formazan, de cor azul. Dessa maneira a quantidade de formazan,
medida por espectrofotometria, é diretamente proporcional ao número de células
viáveis. Este teste foi primariamente sugerido por Mossman (1983)
3.14 Espectrometria de Massa (ESI)
As análises de cromatografia líquida de alta resolução foram conduzidas
em um sistema de Nexera UHPLC (Shimadzu) acoplado a espectrometria de
massa ETD-QTOF ESI (ionização por electrospray - Quadrupolo Time of Flight)
(Bruker, Alemanha) e controlado pelo software compasso 1,5 (Bruker, Alemanha).
Para as anlises soluções das amostras foram diluídas na concentração de 200
µg/mL em ACN: H2O (1: v/v). Após a diluição da amostra, esta foi injetada em
uma coluna da Shimadzu Shim-pack XR-ODS-III (C18, 2,2 uM, 80 Â, 2,0 x 200
mm) com uma taxa de fluxo de 200 µL/min. As amostras foram eluídas com
misturas de água do tipo MiliQ com 0,1% de ácido fórmico (A) e acetonitrila
adicionada de 0,1% de ácido fórmico (B) usando 10% de B durante 10 min e um
gradiente linear variando de 10% de B a 100% de B em 40 min e 100% de B
durante 5 min.
Os parâmetros de analise foram fornecidos para análise em modo
positivo, com aquisição de faixas de 50-1100 m/z (razão massa/carga); voltagem
capilar de 500-4500 V; com fluxo de gás de secagem 9,0 mL/min; pressão de gás
de nebulização 2 bar a 200°C. Para fragmentação precursor foi utilizada uma
50
energia de colisão de 30 eV, m/z. As configurações de íons mais frias foram
optimizadas para a sensibilidade média de 40 para 1000 gama/z usando uma
solução de formato de sódio (HCOOONa) a 10 mM em 2-propanol 0,2% de ácido
fórmico 99% (1:1, v/v) como solução de calibração. Calibração de massa inicial foi
alcançado por infusão fonte de íons da solução de calibração de 20 µL e
recalibradas após a aquisição dos dados brutos. A identificação dos compostos foi
realizada por meio de dissecção do pico cromatográfico. Com determinação da
fórmula subsequente de acordo com a massa exata e padrão isótopo (MS1) e
comparação de dados de espectros fragmento composto (MS2), bem como por
comparação dos espectros de fragmento do composto e de co-eluição
comparativamente com compostos padrões Sigma–Aldrich (Espanha). As fontes
de referência com os padrões de fragmentação e espectros ESI consistiu de uma
base de dados de compostos comerciais ou isolados e identificados, também
constantes do banco de perfis de espectros de massa de acesso público
(European MassBank Server) (Horai et al., 2010).
51
4. RESULTADOS
4.1 Análise fitoquímica do extrato
A caracterização do perfil fitoquímico do extrato hidro alcoólico obtido
das folhas de Anonna glabra revelou uma presença intensa de flavonoides, porém
revelou ausência de Fenol, Flavononas, Aminocianosídeos, Chalconas e Taninos
(Tabela 4)
Tabela 4 - Prospeção fitoquímica com HCL, NaOH, FeCl3 no extrato de Anonna glabra
Metabólitos Resultados
Fenol +
Flavononas -
Flavonóides +++
Flavonóis +
Aminocianosídeos -
Chalconas -
Taninos -
(-): Ausência de metabólitos, (+): leve presença de metabólitos, (++): moderada presença de
metabólitos, (+++): intensa presença de metabólitos.
4.2 Testes antimicrobianos com o extrato bruto de Anonna glabra
4.2.1 Ensaios com cepas padrões
Os resultados apresentados dos testes antimicrobianos de ágar difusão,
concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM)
52
na Tabela 5, mostram que o extrato bruto hidroalccólico das folhas de Anonna
glabra apresentou um de halo de inibição que varirou de 14 a 20 ± 1 mm para as
bactérias S. aureus ATCC 25923, P. aeruginosa ATCC 27853,E. coli ATCC 25922
e A. baumannii ATCC 19606 no entanto não houve formação de halo para a
bactéria K. pneumoniae ATCC 10031. A concentração inibitória mínima (CIM) e
concentração bactericida mínima (CBM) demostraram os mesmos valores para
todas as bactérias testadas com o CIM a 1024 µg/mL e CBM a 2048 µg/mL.
Tabela 5 - Testes antimicrobianos com o extrato bruto de Anonna glabra
Bacterias Agar difusão
(mm)
CIM
(µg/mL)
CBM
(µg/mL)
S. aureus - ATCC 25923 20 ± 1 1024 2048
P. aeruginosa - ATCC 27853 14 ± 0,7 1024 2048
E. coli - ATCC 25922 16 ± 0,8 1024 2048
K. pneumoniae - ATCC 10031 0 ± 0 1024 2048
A. baumannii - ATCC 19606 19 ± 1 1024 2048
A diferença de resultado para a bactéria K. pneumoniae nos testes de
agar difusão e concentração inibitória mínina se deve a dificuldade de difusão dos
compostos contos no extrato em agar MH, enquanto no teste para a determinação
da concentração inibitória mínima as células bacterianas ficavam em contato
direito em uma suspensão líquida de agar e extrato, facilitando a ação dos
compostos do extrato contra a bactéria.
4.2.2 Ensaios antimicrobianos do extrato bruto de Anonna glabra com Cepas
Clínicas
Os mesmos ensaios de atividade antimicrobiana foram realização com
cepas clínicas, como podemos observar na tabela 6. Com exceção da estirpe
clínica S.a. 146 obteve uma CIM e CBM a 2048 µg/mL e a cepa P146c que teve
uma CIM e CBM a 1024 µg/mL todas as outras bactérias das duas estirpes
53
apresentaram o mesmo resultado de CIM a 1024 µg/mL e CBM a 2048 µg/mL.
demonstraram os mesmos resultados tanto para as cepas padrões quando para
as cepas clínicas, como visualizamos na tabela a baixo:
54
Tabela 6 - Concentração Inibitória e Bactericida Mínima do extrato hidroalcoólico de Anonna glabra em cepas bacterianas clínicas
Bactérias Ensaio (µg/mL)
CIM CBM
S. aureus
ATCC 25923 1024 2048
S.a. 96 1024 2048
S.a. 98 1024 2048
S.a. 116 1024 2048
S.a. 145 1024 2048
S.a. 146 2048 2048
S.a. 156 1024 2048
S.a. 162 1024 2048
S.a. 200 1024 2048
S.a. 252 1024 2048
S.a. 258 1024 2048
S.a. 260 1024 2048
P. aeruginosa
ATCC 27853 1024 2048
P1c 1024 2048
P2c 1024 2048
P5c 1024 2048
P18c 1024 2048
P27c 1024 2048
P32c 1024 2048
P110c 1024 2048
P113c 1024 2048
P146c 1024 1024
P165c 1024 2048
55
4.4 Partição do Extrato
Este procedimento foi utilizado para obter as partições com polaridades
de acordo com os solventes utilizados. Para o particionamento foram usados
quatro solventes que deram origem a partição Metanol (Met) e deu origem a uma
massa de cor verde 0,4629 g, a partição Hexano (Hex) a uma massa de 0,276 g,
Diclorometano (DCM) 0,0475 g e Acetato de Etila (Acet) onde se obteve uma
massa de tom marrom escura de 1,03 g.
4.5 Cromatografia de camada delgada das partições
A cromatografia de camada delgada foi realizada com fins de observar
o perfil químico de flavonoides para cada partição e foi revelado em luz
ultravioleta a 254 e 360 nm como verificamos na figura abaixo:
4.5.1 Revelação dos compostos apolares
As manchas fitoquímicas após a migração dos compostos na placa de
sílica (Cromatografia em camada delgada) foram visualizadas sob exposição de
luz ultravioleta a 254 nm ou 360 nm, após a pulverização das placas com uma
solução de vanilina diluída em etanol 1% adicionada de ácido sulfúrico a 10% v/v
(1:1) ou 2- aminoetil difenilborinato/polietileno glicol 4000 (solução de NP/PEG)
em etanol a 2% (w/v).
Os números 1, 2, 3 e 4 (figuras 6 e 7) representam partição metanol,
partição diclorometano, partição acetato e partição hexano respectivamente. Na
figura 6 se observa manchas na corrida de separação de substâncias apolares,
porém não é possível observar os metabólitos quando colocados sobre a luz
ultraviolenta tanto no comprimento de onde de 254 nm quanto o de 360 nm
56
devido à ausência de flourescencia, subentendendo que não há flavonoides
apolares reveladas.
Figura 6 - Cromatografia em Camada Delgada das Partições (Compostos Apolares)
Legenda: 1 – Partição Metanol, 2 – Partição Diclorometano, 3- Partição Acetato de Etila, 4 – Partição Hexano. (A) Luz branca, (B) 256 nm, (C) 360 nm.
A
B
C
57
4.5.2 Revelação dos compostos polares:
Os números 1, 2, 3 e 4 nas figuras a seguirrepresentam partição metanol,
partição diclorometano, partição acetato e partição hexano respectivamente. A
figura 7 demostra que houve a separação de flavonoides devidos sua formação
de bandas definidas e suas cores (vermelho, azul, laranja), também se observa a
separação bandas com coloração distintas entendendo que há diferentes
flavonoides polares em cada uma das partições, No entanto foi observada uma
maior concentração de flavonoides na partição acetato representada pelo número
3. Revelando então que os flavonoides encontrados nas partições são de origem
polar.
58
Figura 7 – Cromatografia de Camada Delgada das partições (Compostos Polares)
Legenda: 1 – Partição Metanol, 2 – Partição Diclorometano, 3- Partição Acetato de Etila, 4 – Partição Hexano. (A) Luz branca, (B) 256 nm, (C) 360 nm.
A
B
C
59
4.6 Ensaios antimicrobianos com as partições
Os testes de CIM e CBM com estirpes padrão e isolados clínicos foram
refeitos a fim de monitorar o feito antimicrobiano das partições metanol, hexano,
diclorometano e acetato (Tabelas 7 e 8).
A partição metanol apresentou uma CIM de 1024 µg/mL para as bactérias
S. aureus ATCC 25923, K. pneumoniae ATCC 10031, A. baumannii ATCC 19606,
e uma CBM de 2048 µg/mL. Ainda, a fração metanol apresentou uma diminuição
da CIM (512 µg/mL) e CBM (1024 µg/mL) para a bactéria E. coli ATCC 25922. Em
relação ao extrato bruto, a CIM e a CBM para a bactéria P. aeruginosa ATCC
27853 foi de 8 µg/mL e 16 µg/mL respectivamente.
A partição hexano apresentou o mesmo resultado que a Partição metanol
para as bactérias quase todas as bactérias com exceção da bactéria E. coli ATCC
25922 que demostrou uma CIM de 1024 µg/mL e CBM de 2048 µg/mL.
A partição acetato revelou uma CIM de 1024 µg/mL e uma CBM de 2048
µg/mL para as bactérias S. aureus ATCC 25923 e A. baumannii ATCC 19606,
houve uma redução da CIM e CBM também em relação ao extrato bruto para a
bactéria E. coli ATCC 25922 e K. pneumoniae ATCC 10031 onde a CIM e CBM
foi de 512 µg/mL e 1024 µg/mL respectivamente. Já para a bactéria P. aeruginosa
ATCC 27853 a partição acetato demostrou uma CIM de 8 µg/mL e CBM de 16
µg/mL. Para a partição diclorometano o resultado foi semelhante à partição
metanol.
60
Tabela 7 - Concentração inibitória mínima das partições do extrato de Anonna glabra em cepas ATCC
Bactérias/Frações
Concentração (µg/mL)
Part Met Part Hex Part Acet Part Dcm
CIM CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM
S. aureus - ATCC 25923 1024 2048 1024 2048 1024 2048 1024 2048
P. aeruginosa - ATCC 27853 8 16 8 16 8 16 8 16
E. coli - ATCC 25922 512 1024 1024 2048 512 1024 1024 2048
K. pneumoniae - ATCC 10031 1024 2048 1024 2048 512 1024 1024 2048
A. baumannii - ATCC 19606 1024 2048 1024 2048 1024 2048 1024 2048
Part Met.: Partição Metanol; Part Hex: Partição Hexano; Part. Acet: Partição Acetato de Etila; Part Dcm: Partição Diclorometano.
61
Após os testes com as estirpes padrões, foram realizados ensaios com
estirpes bacterianas de origem clinica das espécies S. aureus e P. aeruginosa.
Na tabela 8 estão representados os valores obtidos para a partição em
metanol, hexano e acetato de etila. A fração apresentou o mesmo perfil de CIM
a 1024 µg/mL e CBM a 2048 µg/mL para quase todas as bactérias com
exceção da S.a. 146 onde a CIM de igualou a sua CBM de 2048 µg/mL.
Tabela 8 - Concentração inibitória mínima das partições do extrato de Anonna glabra contra estirpes de S. aureus portadores do gene de resistência mecA
Linhagens
Concentração (µg/mL)
Part Met Part Hex Part Acet
CIM CBM CIM CBM CIM CBM
ATCC 25923 1024 2048 1024 2048 1024 1024
S.a. 96 1024 2048 1024 2048 1024 2048
S.a. 98 1024 2048 1024 2048 1024 2048
S.a. 116 1024 2048 1024 2048 1024 2048
S.a. 145 1024 2048 1024 2048 2048 2048
S.a. 146 2048 2048 2048 2048 1024 2048
S.a. 156 1024 2048 1024 1024 1024 2048
S.a. 162 1024 2048 1024 1024 1024 2048
S.a. 200 1024 2048 1024 2048 1024 2048
S.a. 252 1024 2048 1024 2048 1024 2048
S.a. 258 1024 2048 1024 2048 1024 2048
S.a. 260 1024 2048 1024 2048 1024 2048
Part Met.: Partição Metanol; Part Hex: Partição Hexano; Part. Acet: Partição Acetato de Etila
A Tabela 9 apresenta o resultado dos testes de CIM e CBM
observados para todos os isolados de P. aeruginosa de origem clínica. Nos
testes com os isolados de P. aeruginosa não se observou distinção da CIM e
CBM de todas as partições para todas as estirpes clínicas onde para a maioria
dos isolados, a concentração inibitória e bactericida mínima das partições foi de
8 µg/mL e 16 µg/mL respectivamente, com exceção do isolado P32c, cujo valor
62
de CIM e CBM foi de 4 µg/mL e para o isolado P146c, cujo valor de CIM foi de
4 µg/mL e CBM foi de 8 µg/mL para todas as frações avaliadas.
Tabela 9 - Concentração inibitória mínima das partições do extrato de Anonna glabra em cepas de P. aeruginosa
Linhagens
Concentração (µg/mL)
Part Met Part Hex Part Acet
CIM CBM CIM CBM CIM CBM
ATCC 27853 8 16 8 16 8 16
P1C 8 16 8 16 8 16
P2C 8 16 8 16 8 16
P5C 8 16 8 16 8 16
P18C 8 16 8 16 8 16
P27C 8 16 8 16 8 16
P32C 4 4 4 4 4 4
P110C 8 16 8 16 8 16
P113C 8 16 8 16 8 16
P146C 4 8 4 8 4 8
P165C 8 16 8 16 8 16
Part Met.: Partição Metanol; Part Hex: Partição Hexano; Part. Acet: Partição Acetato de Etila
4.7 Ensaios de atividade antitumoral
Dentre os resultados obtidos no ensaio de citotoxicidade, pode-se
observar que, a partição metanol foi a que obteve maior atividade antitumoral
com viabilidade celular de 24,06% com concentração de 100 µg/mL nas células
HL 60 (leucemia – promielócitos) e 24,1% HCT-116 (Carcinoma colo retal)
chegando a seu IC50 (Capacidade de inibir 50% do crescimento celular) com
baixa dosagem como 10 µg/mL nas células HL-60, THP-1 (leucemia -
mielócitos) e até 0,01 µg/mL na célula Jurkat (leucemia – células T) concluindo
assim que a partição metanol tem maior efeito antitumoral. A partição hexano
apresentou atividade variando de moderada (MO, viabilidade celular de 50 a
63
75%) a pouca atividade (PA, viabilidade de 75 a 100%) juntamente com a
partição acetato onde se verificou que na concentração de 100 µg/mL a
viabilidade celular foi em média de 70,72% para as células THP-1, MDA
(Carcinoma de Mama), MCF-7 (carcinoma de mama), e HCT-116.
Na Figura 8 observar-se que a partição metanol apresentou uma IC50
com a concentração a cerca 1 µg/mL a partição hexano, a partição acetato
apresentaram o mesmo resultado de 41% de viabilidade celular com uma
concentração de 10 µg/mL revelando se assim com menor atividade
antitumoral do que a partição metanol
Figura 8 - Atividade antitumoral em células leucêmicas (promielócitos - HL60)
HL-60
Met
anol
Hex
ano
Ace
tato
0
20
40
60
80
100100 g/mL
10 g/mL
1 g/mL
0,1 g/mL
0,01 g/mL
0,001 g/mL
0,0001 g/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
Na Figura 9 verificar-se que somente a partição metanol chegou a seu
IC50 com uma concentração de 0,01 µg/mL porém, a partição hexano e a
partição acetato apresentaram 40% de viabilidade das células JURKAT a 1 e
10 µg/mL respectivamente.
64
Figura 9 – Atividade antitumoral em células leucêmicas (linfócitos T - Jurkat)
JURKAT
Met
anol
Hex
ano
Ace
tato
0
20
40
60
80
100100 g/mL
10 g/mL
1 g/mL
0,1 g/mL
0,01 g/mL
0,001 g/mL
0,0001 g/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
Na figura 10 se observar que a partição metanol atingiu sua
capacidade de inibir 50% do crescimento celular com uma concentração de 1
µg/mL enquanto as partições hexano e acetato mesmo com a maior
concentração de 100 µg/mL, não antigiram os 50 % de inibição celular que se
manteve com uma média de 67,075% de viabilidade celular para células THP-
1.
Figura 10 - Atividade antitumoral em células leucêmicas (promonócitos THP-1)
THP-1
Met
anol
Hex
ano
Ace
tato
0
20
40
60
80
100100 g/mL
10 g/mL
1 g/mL
0,1 g/mL
0,01 g/mL
0,001 g/mL
0,0001 g/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
65
Neste ensaio com células MDA-MB-231, nenhumas das
partições atingiram 50% da inibição da viabilidade celular, na maior
concentração das partições (100 µg/mL) a viabilidade celular ficou em
torno de 65,64% (Figura 11).
Figura 11 - Atividade antitumoral em células (carcinoma de mama - MDA-MB-231)
MDA-MB-231
Met
anol
Hex
ano
Ace
tato
0
20
40
60
80
100100 g/mL
10 g/mL
1 g/mL
0,1 g/mL
0,01 g/mL
0,001 g/mL
0,0001 g/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
Na Figura 12 mostra o ensaio com células de carcinoma de mama
MCF-7, a única partição que atingiu os 40,51% de viabilidade celular foi a
partição metanol com a concentração a 100 µg/mL, as demais partições não
atingiram esse patamar na mesma concentração, a partição hexano alcançou
uma viabilidade celular de 77,07% e a partição acetato conseguiu 70,37% de
viabilidade celular.
66
Figura 12 - Atividade antitumoral com células (carcinoma de mama MCF-7)
MCF-7
Met
anol
Hex
ano
Ace
tato
0
20
40
60
80
100100 g/mL
10 g/mL
1 g/mL
0,1 g/mL
0,01 g/mL
0,001 g/mL
0,0001 g/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
A Figura 13 mostra apenas 24% das células HCT-116 foram viáveis
com a partição metanol na concentração de 100 µg/mL.
Figura 13 - Atividade antitumoral em células (carcinoma colorretal HCT-116)
HCT-116
Met
anol
Hex
ano
Ace
tato
0
20
40
60
80
100100 g/mL
10 g/mL
1 g/mL
0,1 g/mL
0,01 g/mL
0,001 g/mL
0,0001 g/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
Em seguida foi determinada da concentração capaz de inibir 50%
(IC50) do crescimento das células (Tabela 10):
67
Tabela 10 - Concentração Inibitória do Crescimento de 50% das células tumorais
Células Tumorais IC50 (µg/mL)
Part Met Part Hex Part Acet
HL-60 1 1 1 JURKAT 0,01 ND ND THP-1 1 ND ND MDA-MB-231 ND ND ND MCF-7 ND ND ND HCT-116 ND ND ND
ND: Não descrito
Para a célula HL-60 todas as partições apresentaram IC50 à 1 µg/mL.
em contraversão para as demais céulas, somente a partição metanol
apresentou uma IC50 de 0,01 µg/mL para a célula JURKAT e 1 µg/mL para a
célula THP-1.
4.8 Cromatografia de Exclusão Molecular ou Permeação em Gel
A cromatografia de camada delgada da partição acetato realizada
em coluna LH-20 com o intuito de fracionar a partição dando origem a 200
tubos de ensaio com 20 mL cada tubo, em seguida foram agrupados a cada 5
tubos e numerados de 1 a 40. Um último tubo contendo as frações residuais foi
gerado e nomeado de Tubo R.
4.8.1 Cromatografia de Camada Delgada das Frações
Em seguida foi realizada a cromatografia de camada delgada (CCD)
das 40 frações obtidas para reagrupamento das frações semelhantes. A CCD
foi realizada para a verificação do perfil de flavonoides das frações obtidas pela
cromatografia de exclusão molecular, onde o resultado pode-se verificar nas
figuras a seguir (Fig. 14 e 15):
68
Figura 14 - Cromatografia de Camada Delgada das frações obtidas por cromatografia de gel filtração (360 nm)
Os perfis semelhantes observados pelo precesso de CCD foram
agrupados gerando 12 grupos de fração, conforme mostrando no esquema na
Figura 15:
Figura 15 - Fluxograma das frações obtidas pela Cromatografia de Exclusão Molecular
e
Partição Acetato
6,3 g
Fr 1-15
0,989 g
Fr 16-17
0,133 g
Fr 18-19
0,118 g
Fr 20-22
0,354 g
Fr 23-24
0,173 g
Fr 25-26
0,091 g
Fr 27-28
0,053 g
Fr 29-31
0,058 g
Fr 32-33
0,024 g
Fr 34-36
0,036 g
Fr 37-40
0,060 g
Fr R
0,109 g
69
A figura 15 mostra as 12 frações geradas pela cromatografia de
exclusão molecular e seus respectivos rendimentos em gramas, de 6,3 g da
partição acetato inseridas no gel, apenas o total de 2,203 g foram recuperados
e distribuídos em 12 recipientes.
4.9 Ensaios antimicrobianos das frações
Após os ensaios cromatográficos realizados com as partições
procederam-se os testes antimicrobianos a fim de descobrir quais das frações
continha o (s) principal (s) metabólito (s) responsáveis pela ação
antibacteriana. Teste de CIM e CBM foram realizados com as 12 frações
restantes como mostrado na Tabela 11.
A bactéria S. aureus ATCC 25923 e a estirpe clínica S.a. 96
apresentaram um perfil semelhante de sensibilidade às frações Fr. 1-15, 16-17,
20-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-31, 37-40 e Fr acet R, oriundas da partição
acetato de etila, com uma CIM de 1024 µg/mL. A fração Fr. 32-33 apresentou
uma CIM de 512 µg/mL para ambas as bactérias da mesma espécie, e a fração
Fr. 34-36 apresentou teve um resultado de CIM de 1024 µg/mL para S. aureus
- ATCC 25923, e 512 µg/mL para a estirpe clínica S a. 96.
A bactéria P. aeruginosa - ATCC 27853 e um isolado clínico P2C
apresentaram o mesmo perfil de sensibilidade às frações sendo que as frações
Fr Acet 1-15, 16-17, 20-22, 23-24, 25-26, 27-28, 29-31, 34-36 e R Revelaram
uma CIM de 512 µg/mL. Já a fração Fr Acet 18-19 mostrou uma CIM de 64
µg/mL para as duas linhagem bactérianas, a fração Fr 37-40 apresentou uma
CIM de 256 µg/mL, e a fração Fr Acet 32-33 uma CIM de 4 µg/mL.
70
Tabela 11 - Concentração inibitória mínima das frações obtidas por Cromatografia de Exclusão Molecular
Frações
Concentração (µg/mL)
S. aureus - ATCC
25923
S.a 96
P. aeruginosa -
ATCC 27853
P2C
CIM CIM CIM CIM
Fr Acet 1-15 1024 1024 512 512
Fr Acet 16-17 1024 1024 512 512
Fr Acet 18-19 512 512 64 64
Fr Acet 20-22 1024 1024 512 512
Fr Acet 23-24 1024 1024 512 512
Fr Acet 25-26 1024 1024 512 512
Fr Acet 27-28 1024 1024 512 512
Fr Acet 29-31 1024 1024 512 512
Fr Acet 32-33 512 512 4 4
Fr Acet 34-36 1024 512 512 512
Fr Acet 37-40 1024 1024 256 256
Fr Acet R 1024 1024 512 512
71
4.10 Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC)
A calorimetria isotérmica de titulação teve por objetivo analisar qual
seria o perfil térmico da reação entre a fração Fr 32-33 e a bactéria P.
aeruginosa ATCC 27853, o resultado foi demostrado de acordo com a Figura
16.
Figura 16 - Titulações calorimétricas da fração FR 32-33 e células de P. aeruginosa ATCC 27853 em Água
O experimento de diluição da Fração FR 32-33 em água demonstrou
um forte padrão exotérmico de calor em função da diluição de componentes do
extrato e DMSO em água (Figura 21). Entretanto, na presença do
microrganismo, a calorimetria de titulação mostrou um perfil menos exotérmico,
o que sugere que a interação entre a Fração 32-33 com Pseudomonas
aeruginosa seja uma reação endotérmica.
72
De fato, após a subtração da titulação do ensaio em branco, pode-se
observar que todos os valores da entalpia de injeção (injHo) foram positivos,
corroborando o padrão endotérmico do processo. No entanto, o
comportamento parabólico mostrado na Figura 17 sugere que a interação do
mecanismo deve ocorrer por diferentes padrões.
Figura 17 – Perfil termodinâmico entre a fração FR 32-33 e células de P. aeruginosa ATCC 27853
De um ponto de vista termodinâmico, se um processo é endotérmico,
que necessariamente deve ser conduzido por entropia. Assim, o perfil
endotérmico foi atribuído para ser devido à interação dos componentes do
extrato com a superfície celular, com a consequente de solvatação de íons em
água.
73
4.11 Potencial ZETA
A medida do potencial zeta tem sido descrita como uma nova ferramenta
para estudos de processos de dispersão e agregação de células, bem como
estudos das características de superfície celular de micro-organismos frente a
agentes antimicrobianos. Neste ensaio foi mesurado o potencial zeta em
milivolts (mV) a partir de uma suspensão de células de P. aeruginosa e seu
contanto com o a fração Fr. 32-33 como mostrado na figura 20.
As medidas de potencial zeta (PZ) foram realizadas com o objetivo
de corroborar a hipótese levantada a partir dos dados de ITC, sobre o
mecanismo superficial de interação dos componentes do extrato obtidos pelo
fracionamento com as células bacterianas, uma vez que o PZ representa uma
medida da energia potencial de uma superfície, normalizada pela sua carga
total. Assim, o potencial zeta da superfície celular foi determinado em função
da concentração dos componentes do extrato adicionado a suspensão de
células de P. aeruginosa ATCC 27853, de maneira similar ao realizado nos
experimentos de ITC varrendo-se a mesma faixa de concentração de titulante e
com a mesma concentração de titulado.
A Figura 18 mostra que houve alteração na carga elétrica da
membrana da bactéria P. aeruginosa quando colocada em suspensão com o a
fração ativa Fr 32-33 onde cada barra do gráfico representa uma média de 50
titulações com seus devidos desvios padrões.
74
Figura 18- Alteração do Potencial zeta da membrana celular da Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
1 2 3 4
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
Médias de Titulações
Po
ten
cia
l Zeta
(m
V)
A primeira média das titulações corresponde ao potencial zeta da
membrana de -8,11 ± 1,75 mV relevando uma carga negativa na membrana da
bactéria. Na segunda média das titulações ocorreu uma alteração da carga da
membrana bacteriana positivamente mostrando um potencial zeta de -0,41 ±
1,60 mV. Na terceira média a podemos observar uma inversão de carga do
negativo para o positivo (0,71 ± 1,42 mV). Na quarta média de titulações
verificamou-se que a susceptibilidade da membrana bacteriana quando
colocada em contato com a fração Fr. 32-33, sofreu uma alteração positiva
revelando assim uma reação dose-resposta de maneira positiva onde o
potencial zeta chegou a 3,30 ±1,36 mV.
4.12 Ensaio de viabilidade celular bacteriana com MTT
Foram feitos ensaios de viabilidade celular bacteriana com MTT
(brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) de acordo com o
75
tempo de exposição ao extrato (partição com acetato de etila) para avaliação
da atividade da fração, os resultados estão apresentados na Figura 19.
76
Figura 19 - Viabilidade celular bacteriana em função do tempo de exposição e concentrações da fração FR 32-33
3 horas
ATC
C 2
7853 28
c 5c
0
20
40
60
80
10064µg/mL
32µg/mL
16µg/mL
8µg/mL
4µg/mL
2µg/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
6 horas
ATC
C 2
7853 28
c 5c
0
20
40
60
80
10064µg/mL
32µg/mL
16µg/mL
8µg/mL
4µg/mL
2µg/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
12 horas
ATC
C 2
7853 28
c 5c
0
20
40
60
80
10064µg/mL
32µg/mL
16µg/mL
8µg/mL
4µg/mL
2µg/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
24 horas
ATC
C 2
7853 28
c 5c
0
20
40
60
80
10064µg/mL
32µg/mL
16µg/mL
8µg/mL
4µg/mL
2µg/mL
Via
bilid
ad
e C
elu
lar(
%)
77
Os ensaios de viabilidade celular mostraram que um contato de 3 horas
das células bacterianas com o extrato apresenta já atividade inibitória. A estirpe
clínica 28c foi a que apresentou uma maior redução na atividade metabólica,
onde na mais baixa concentração de 2 µg/mL foi mensurado cerca de 76,23%
de células viáveis, enquanto que na mais alta concentração de 64 µg/mL
atingiu valores de 58,29%. Nas demais estirpes ATCC 27893 e 5c também
houve redução na viabilidade celular, porém não foi na mesma proporção que a
estirpe 28c.
Em 6 horas de contato com a fração ativa ocorreu uma maior redução
da viabilidade celular, na concentração de 2 µg/mL nas estirpes ATCC 279853,
28c e 5c a viabilidade celular de 44,89%, 53,36% e 45, 39% respectivamente.
Compreendendo que a atividade contra as bactérias presentes comece a
atingir seu pico a partir desse tempo de exposição
Com 12 horas de exposição, a fração atingiu o pico de sua atividade
antimicrobiana contra as estirpes de Pseudomonas aeruginosa na
concentração (2 µg/mL), apresentou uma viabilidade de 39,32% para a estirpe
ATCC 279853; 28,19% de viabilidade celular para a estirpe 28c; e 55,05% de
viabilidade celular para a estirpe clínica 5c. Na concentração de 32 µg/mL
houve uma forte redução na viabilidade das células bacterianas em todas as
linhagens formando uma média de aproximadamente 4% de viabilidade.
Com relação à atividade antimicrobiana com 24 horas de exposição à
fração FR 32-33, não mostrou alteração do perfil em relação à avaliação com
12 horas de exposição na concentração de 32 µg/mL.
4.13 Espectrometria de Massa
A amostra foi analisada por HPLC-HRMS (cromatografia liquida de
alta eficiência acoplado a espectrometria de massa de alta resolução) a Figura
20 representa o perfil cromatográfico da análise e cada pico identificado por um
número.
78
Figura 20 - Perfil Cromatográfico dos componentes da fração FR 32-33 da Análise por Espectrometria de Massa
79
Foram analisados os compostos de acordo com os seus respectivos
tempos de retenção, assim como o nome do composto mais provável de ser
em comparação com o perfil de fragmentação, comparado a um banco de
dados (library) e a respectiva correspondência (fit)
Resultados em branco apresentados na análise são porque não houve
correspondência com nenhuma substancia, por isso não tem o nome nem a
biblioteca.
Na figura 21 começa a análise do pico a partir de sua fragmentação
denominada cmpd, Dissect, 1.4 min aparece um fragmento marcado
291.0860
Figura 21 - Análise do pico do composto (-) Epicatequina
Logo a baixo acompanha uma tabela íon formula C15 H15 06, logo a
molécula tem fórmula C15H1406. Com score de 100. Esta é a formula
correspondente a este pico.
Em seguida (Figura 22) foi feita avaliação desta estrutura C15 H15 O6
e por avaliação das fragmentações menores, quando comparada com
estruturas do banco de dados, identificou a estrutura desenhada como (-
)Epicatequina. Esta análise foi realizada com ionização no modo positivo.
80
Figura 22 - Análise estrutural por fragmentação do pico para o composto (-) Epicatequina
Os resultados também apresentaram outro composto com um pico na
posição 287.0553 onde também foi fracionado e identificado como Fisetina
(Figura 23)
Figura 23 – Análise do pico do composto Fisetina
Na figura 24 houve a fragmentação desse pico onde pode visualizar a
sua estrutura química com C15 H10 O6, onde o composto foi denominado de
Fisetina
Figura 24 - Análise da fragmentação do pico para o composto Fisetina
81
E por ultimo houve mais um pico na região 303.0499 onde também foi
fragmentado para ser analisado melhor e conhecer sua estrutura química
(Figura 25)
Figura 25 - Análise do pico para o composto Quercetina
Em seguida esse pico foi fragmentado e sua estrutura química se
revelou com C15 H10 O7, nomeando o composto como Quercetina como
mostra a figura 26.
Figura 26 - Análise da fragmentação do pico para o composto Quercetina
82
5 DISCUSSÃO
Annona glabra Linn é uma espécie de planta dispersa mundialmente,
sendo encontrada principalmente em áreas tropicais e subtropicais. Estudos
fitossociológicos demonstraram uma grande concentração de espécimes em
áreas alagadas como os observados na baixada maranhense (ALVES, 1997;
PAULA; PROTECTION, 2004; PINTO et al., 2005.). Entretanto, nas áreas de
coleta deste estudo e nas adjacências não foram encontrados outros
exemplares da mesma espécie necessitando estudos amplos de biogeografia
para catalogar outros exemplares da mesma área.
Neste estudo foi evidenciado atividade antimicrobiana dos extratos de
Annona glabra contra as bactérias Staphylococcus aureus, Acinetobacter
baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e Pseudomonas
aeruginosa. Contudo, as análises de determinação da CIM apontaram para
atividade específicamente mais relevante contra P. aeruginosa, conforme
mostrado na Tabela 8 com uma CIM de 4 µg/mL a fração Fr 32-33. Pela
variedade das bactérias testadas e números de testes antimicrobianos
realizados, esses resultados mostram que há um efeito antimocrobiano
específico para a bactéria P. aeruginosa
Em estudos feitos no Brasil com extrato de folhas e frutos de Annona
muricata não houve indícios de antividade antimicrobiana (SILVA, ANTUNES,
CATÃO, 2011; Pedroso; Lunardello, 2011) já outro estudo feito com extrato
aquoso e metanólico de folhas de plantas dessa mesma espécie realizado na
Índia por Pathak et al. (2010), Verificou-se sensibilidade frente a bactérias
Gram-positivas (Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus), e Gram-negativas
(Klebsiella pneumoniae e Proteus vulgaris). O que pode nos levar a acreditar
que há diferenças fitogeográficas que interferem na produção de metabólitos.
Outros trabalhos nos leva a evidenciar essa controvérsia de resultados,
como por exemplo, um estudo realizado em Minas Gerais com extratos feitos a
partir de folhas de Annona crassiflora apresentou uma CIM de 1000 µg/mL para
a bactéria S. aureus. Contudo, um estudo realizado no Japão com extrato feito
de folha de Annona glabra apresentou uma concentração inibitória mínima de
500 µg/mL.
83
De acordo com a análise fitoquímica parcial observou-se que os
extratos hidro-alcoólicos obtidos a partir da folha apresentaram flavonoides em
alta concentração também evidenciados por revelação especifica após
cromatografia em camada delgada. Estudos semelhantes sobre caracterização
química de plantas do mesmo gênero como Annona nutans e Annona muricata
demostraram também uma alta concentração de compostos flavonoides em
extratos hidroalcoólicos e subfrações obtidas a partir de folhas (NUNES, 2011;
SILVA et al, 2015.)
Após a realização do particionamento, os extratos de Annona glabra
foram testados em cepas padrão e clínicas. Para a bactéria P. aeruginosa, as
partições do extrato obtiveram resultados, uma concentração inibitória mínima
e uma concentração bactericida mínima ainda não relatado antes na literatura.
Estes resultados foram apresentados tanto para a estirpe padrão ATCC quanto
para estirpes clínicas resistentes a antibióticos, apontando que esse extrato
tem uma ação específica contra a bactéria P. aeruginosa já que o resultado
para esta bactéria não se aproximou dos resultados realizados com outras
espécies bacterianas.
Ensaios antimicrobianos realizados por Rinaldi (2007), utilizando
partições metanol, hexano, diclorometano e acetato de etila obtidos de Annona
hypoglauca sugeriram que as concentrações inibitórias mínimas para as
bactérias S. aureus, E. faecalis, E. coli fossem superior a 100 μg/mL. Outro
estudo feito por Almeida e colaboradores (2014) com partições hexano e
clorofórmio obtidos de Annona vepretorum apresentaram uma CIM variando de
190 - 3120 μg/mL e CBM com variação de 780-6250 μg/mL em testes feitos
com E. coli, K. Pneumoniae, S. aureus.
Na Análise da avaliação da atividade antitumoral com célula HL-60
demostrou um alto potencial de atividade antitumoral em modelos in vivo dos
compostos presentes na partição flavonoídicas também evidenciado no estudo
de Pieme e colaboradores (2014), que utilizaram extratos de Annona muricata
para a determinação da atividade antiproliferativa e indução de apoptose em
células HL-60 onde apresentou um IC50 que variou entre 6-49 µg/mL. Assim
como no estudo de Silva e colaboradores (2015) onde foi utilizado extrato
produzidos a partir de caule e folhas de Annona muricata e apresentou uma
84
IC50 de 7,67 e 15,39 µg/mL. Corroborando com o grande potencial encontrado
em nosso estudo contra esse tipo de células.
Não há relatos na literatura de ensaios feitos com extratos da família
Annonaceae e células JURKAT, Porém, estudos realizados a partir do extrato
de folha de Annona glabra realizados por Cochrane e colaboradores (2008)
apresentaram uma boa resposta com média de IC50 a 0,65 µg/mL em células
leucêmicas que respondem a quimioterapia (CEM) e células leucêmicas que
não respondem a quimioterapia (CEM-VLB MDR).
Em células THP-1 a partição metanol atingiu a concentração capaz de
inibir 50% do crescimento celular em uma concentração baixa. Contudo,
estudos de Reis e colaboradores (2015) observou esse mesmo resultado numa
concentração de 257 µg/mL com a partição hexano de Annona muricata
Lima (2012) sugeriu que o IC50 com extrato de Annona cornifolia para a
célula MDA-MB-231 encontra-se na concentração superior a 20 µg/mL. Porém,
nesse estudo não conseguimos evidenciar esse resultado com nenhuma das
partições e concentrações.
Ensaios realizados com partições hexano, diclorometano e metanol do
extrato de Annona dioica realizados por Formagio e colaboradores (2015) e
Martins (2014) com células MCF-7 conseguiram sua IC50 em uma concentração
das partições abaixo de 12 µg/mL.
Em células HCT-116, a partição em metanol conseguiu obter 24% de
viabilidade a 100 µg/mL Levando assim a conclusão que os demais extratos
têm um menor potencial para atividades citotóxicas, discordando do estudo de
Almeida e colaboradores (2014), onde obteve uma inibição da viabilidade
celular de até 100% com extratos de Annona vepretorum a 50 µg/mL.
Não há relatos na literatura tornando esse o primeiro trabalho onde foi
realizado o fracionamento pela cromatografia de exclusão molecular com
extratos de Annona glabra. Onde foi revelada a fração ativa e foi comprovado
que a planta tem mais de um grupo de compostos com uma forte atividade anti-
pseudomonas.
As substâncias possivelmente ativas foram caracterizadas como (-)
Epicatequina, Fisetina e Quercetina. Até onde se sabe, este é o primeiro relato
da descrição dos compostos da partição acetato (Fração fr 32-33) em Annona
glabra.
85
Estruturalmente, a (-) - epicatequina é um composto de dois anéis
aromáticos ligados por um heterociclo oxigenado com um grupo 4-hidroxila. É
um composto com alta atividade biológica quando analisado isoladamente
(FRAGA et al., 2011). As epicatequinas são compostos representantes de
flavan-3-ols, uma subfamília dos compostos flavonoides polifenólicos, são
abundantes em sementes e casca de uvas, chá verde, nozes, morangos e
vinho tinto (MENARD et al., 2013). Há evidências de que a epicatequina e seus
derivados têm papel significativo na prevenção de doenças cardiovasculares
em seres humanos (RUIJTERS et al., 2013). Ainda, as epicatequinas podem
apresentar uma potente ação antioxidante. Essas substâncias são capazes de
modular a sinalização celular, melhorar a função endotelial, reduzir a pressão
arterial, e ainda apresentar proteção das mitocôndrias (FRAGA et al., 2011).
Com relação a família Annonaceae, existem poucos relatos sobre a
identificação de epicatequinas nas folhas de espécies do gênero. De acordo
com alguns estudos, constituintes do extrato de Annona muricata têm sido
relacionados com o controle de tumores no trato digestivo de cobaias e inibição
e apoptose de linhagens de células tumorais (PIEME et al., 2014;
ZOROFCHIAN et al., 2015;). Entretanto, ainda não há caracterização química
de todos os constituintes ativos presentes nas folhas. Possivelmente, as
epicatequinas podem ser responsáveis também pelos efeitos antagônicos em
tumores. Com relação a Annona glabra, ela é uma planta pouco estudada e
seus principais metabólitos secundários são pouco conhecidos, assim como a
atividade biológica destes. Diante do exposto, esta planta precisa ser explorada
melhor com relação à caracterização dos seus compostos fitoquímicos e suas
possíveis ações biológicas.
Com relação à atividade antimicrobiana, as epicatequinas têm sido
relacionadas por modularem a expressão de virulência em bactérias
patogênicas. Dentre as catequinas, a (-) - epicatequina galato (ECG), tem sido
a mais estudada, onde ela tem sido relacionada com a modificação de algumas
propriedades de Staphylococcus aureus, agindo na reversão do fenótipo
resistente ou anulando a resistência de linhagens a meticilina (MRSA) Ainda
sobre esta substância, a ECG pode também reduzir a secreção de proteínas
associadas à virulência em S. aureus, bem como a formação de biofilme, e
86
induz alterações morfológicas em células MRSA sem comprometer a taxa de
crescimento. Estudos demonstraram que ECG se liga predominantemente à
membrana citoplasmática de S. aureus, inicialmente diminuindo a fluidez da
bicamada lipídica, sendo também relacionado à indução de expressão de
genes relacionados a reparos de danos da parede celular (SHIOTA et al., 1999;
BERNAl et al., 2010; STEVENS et al., 2015)
Flavonoides, como (-) - epicatequina são metabolizados in vivo e
incluem os produtos metilados, sulfatados e derivados glucoronisados. Além
dos flavonóides originais, esses compostos podem também exercer atividades
biológicas in vivo. Um estudo recente mostrou que 4-O-metil-epicatequina e 3-
O-metil-epicatequina apresentavam funções antiproliferativas em células MCF-
7 (linhagem tumoral de câncer de mama) e em células BxPC-3 (linhagem
tumoral de câncer de pâncreas), ao passo que outros derivados mostraram
pouca ou nenhuma atividade, sugerindo assim que certos metabolitos
derivados de epicatequina poderão ser desenvolvidos como agentes
terapêuticos para o câncer (SHAY et al., 2015).
Em outro estudo recente, os autores mostraram que a (-) - epicatequina
tem a capacidade de inibir diretamente a atividade da DNA metiltransferase em
células de mamíferos contribuindo assim para o tratamento de tumores ou
prevenção de processos carcinogênicos, já que a hipermetilação do DNA é
conhecida por ser um mecanismo epigenético chave para o silenciamento de
vários genes, incluindo aqueles que são supressores de tumores e também no
sistema enzimático de reparo de DNA (DELGADO et al., 2014; LEE et al.,
2015).
Os resultados desta pesquisa evidenciaram a ação antitumoral e
antibacteriana de alguns compostos de natureza flavonoídica isolados
principalmente na fase orgânica acetato de etila. A recuperação dos compostos
com ação antimicrobiana foi possível pela técnica cromatográfica de exclusão
de tamanho molecular ou cromatografia de permeação em gel (CPG). O
composto isolado foi caracterizado como (-)- epicatequina pela base de dados
constante na biblioteca de espectros de fragmentação de massa constante no
software. A concentração inibitória mínima do composto purificado foi de 4
87
µg/mL em P. aeruginosa ATCC 27853, este resultado foi comparado com
outras drogas antimicrobianas como meropenem e ciprofloxacina, que
mostraram um resultado de CIM muito elevado, bem como para 3 linhagens P.
aeruginosa multidroga resistentes.
A fisetina (3,3’,4’,7- tetrahidroxiflavona) é uma molécula representante
dos flavonoides, que tem demostrado seu relevante para as pesquisas. Apesar
da sua ausência de atividade antimicrobiana, ela tem sido utilizada em terapias
anti-virulência, segundo estudo de Wanj e colaboradores (2015), essa molécula
é capaz de inibir a ação da Listeriolisina O, uma toxina hemolítica produzida
pela bactéria Listeria monocytogenes cuja função principal é facilitar a
replicação bacteriana no citosol por infringir as membranas fagossomais,
fazendo assim que o patógeno fuja do reconhecimento imunológico do
hospedeiro.
Ela também é conhecida por inibir a ação da proteína quinase C, o qual
é uma proteína viral codificada indispensável para a maturação e
processamento do vírus HIV, tornando a fisetina um alvo viável na terapia anti-
HIV. (GUHARAY, DENNISON , SENGUPTA, 1999; SENGUPTA, BANERJEE,
SENGUPTA, 2004).
A quercetina (3,3’,4’,5,7 -pentahidroxiflavona) é um dos flavonóides de
grande importância, pois possui potencial anticancerígeno, anti-inflamatório,
efeitos benéficos ao sistema hepático, cardiovascular e renal (BEHLING et al.,
2004; WILLIAMS et al., 2004) estando presente em várias frutas e vegetais
(HERTOG; HOLLMAN, 1996; SPAGNUOLO et al., 2012). Essa molécula
juntamente com a epigallocatechin-3-gallate tem sido demostrada como uma
importante opção terapêutica contra Mycobacterium tuberculosis droga-
resistênte (CIM = 32 µg/mL) e Klebsiella pneumoniae. produrota de β-
lactamases do tipo ESLB e KPC com uma CIM de 64 µg/mL (DEY, RAY,
HAZRA, 2015.).
Outro achado com a molécula quercetina sugere que esta molécula em
combinação com diferentes antibióticos agem em sinergismo aumentando o
dano causado pelos antibióticos contra o MRSA, danificando sua membrana
bacteriana (AMIN et al, 2015.)
88
Os ensaios de calorimetria de titulação isotérmica utilizando os dados
(injHo) a partir de injeções sucessivas de soluções de epicatequina em células
de P. aeruginosa ATCC 27853 indicou que a interação das moléculas com a
células planctônicas é de natureza endotérmica. Ainda, os ensaios de variação
do potencial zeta das células de P. aeruginosa ATCC 27853 indicaram o efeito
de alteração de carga superficial com valores que variam de -8,21 mV para
+2,95 mV após 200 injeções sucessivas da fração contendo epicatequina e
outros flavonoides presentes nas frações Fr 32-33 em concentrações
crescentes. Estes resultados corroboram com outras evidencias sobre a ação
de outras catequinas de ação antimicrobiana ou sinérgicas com drogas
antimicrobianas. As catequinas agem presencialmente na superfície celular de
bactérias. Como descrito para (-) - epicatequina galato (ECG), cuja ação
principal em S. aureus é se ligar a membrana celular ou parede celular levando
a um aumento da suscetibilidade antibiótico β-lactâmico oxacilina (ANDERSON
et al., 2011).
A bactéria P. aeruginosa é um dos patógenos microbianos mais críticos
em quadros de infecções hospitalares. Esse micro-organismo pode causar
altas taxas de mortalidade em indivíduos imunodeprimidos, e representa um
protótipo de agente multirresistente aos antimicrobianos, sendo rotineiramente
denominada de "superbactéria", as quais poucas opções terapêuticas eficazes
estão disponíveis (SCIUTO et al., 2014). Muitas estirpes de Pseudomonas
albergam vários marcadores de resistência a antimicrobianos, tais como os
genes para as enzimas metalo-β-lactamase (MBLs). O surgimento de MBLs
nas últimas décadas tem configurado um importante quadro preocupação em
relação a P. aeruginosa que leva muitos esforços para controlar surtos e
graves quadros de infecções em indivíduos suscetíveis. Por tanto, mais
ensaios microbiológicos são necessários para determinar o mecanismo de
ação da epicatequinas e flavonoides correlatos em linhagens de P. aeruginosa,
bem como outros compostos obtidos de Annona glabra, uma planta tropical
pouco estuda em nossa região.
89
6 CONCLUSÂO
Neste estudo foi demonstrado que a extrato acetato de Annona glabra
L apresentou uma excelente atividade antimicrobiana contra a bactéria
Pseudomonas aerurinosa se tornando um potencial candidato para terapias de
infecções contra esta bactéria, tendo uma boa interação com a membrana
celular bacteriana evidenciado pelos ensaios propostos. Ainda, partições do
extrato apresentaram uma boa atividade antitumoral in vitro em células de
mamíferos. Contudo mais estudos devem ser feitos para avaliar melhor a
farmacocinética, farmacodinâmica em modelos vivos a fim de verificar qual ou
quais os mecanismos de ação das moléculas ativas.
90
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