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Uni ANHANGUERA – CENTRO UNIVERSITÁRIO DE GOIÁS
CURSO DE AGRONOMIA
SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma sp. PROVENIENTES DA REGIÃO SUL
DO BRASIL PARA O CONTROLE DE Sclerotinia Sclerotiorum
LETICIA DIAS DE FREITAS
GOIÂNIA
Dezembro/2014
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LETICIA DIAS DE FREITAS
SELEÇÃO DE ISOLADOS DETrichoderma sp. PROVENIENTES DA REGIÃO SUL DO BRASILPARA O CONTROLE DE Sclerotinia sclerotiorum
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Curso de Agronomia do Centro Universitário de Goiás, Uni-ANHANGUERA, sob orientação do Dr. Murillo Lobo Junior, como requisito parcial para obtenção do bacharelado em Agronomia.
GOIÂNIA Dezembro/2014
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TERMO DE APROVAÇÃO
LETICIA DIAS DE FREITAS SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma sp. PROVENIENTES DA REGIÃO SUL DO
BRASIL PARA O CONTROLE DE Sclerotinia sclerotiorum Trabalho de conclusão de curso apresentado à banca examinadora como requisito parcial para obtenção do Bacharelado em Agronomia do Centro Universitário de Goiás - Uni-ANHANGUERA, defendido e aprovado em 24 de Novembro de 2014 pela banca examinadora constituída por:
______________________________________
Dr. Murillo Lobo Junior
(Orientador)
______________________________________
Prof. MSc. Jardel Barbosa dos Santos
(Membro)
_____________________________________________
Prof.ª Dr.ª Luciana Domingues Bittencourt Ferreira
(Membro)
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Dedico primeiramente à Deus, razão de todas
as coisas. À minha família, amigos, colegas de
classe, professores e todos os que participaram
de alguma forma desta conquista.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Centro Universitário de Goiás – Uni-
ANHANGUERA pela oportunidade em me tornar
bacharel em Agronomia.
Aos meus pais Edvaldo Parreira de Freitas e Maria Lúcia
Dias de Freitas, pelos valores e princípios que me foram
ensinados, pelo apoio constante, por serem minha
referência em caráter e humildade e pelo amor
incondicional que dedicaram à mim em todos esses anos.
Às minhas irmãs Marina e Edlene, por serem minhas
primeiras e eternas amigas e por me ensinarem que
partilhar momentos é uma maneira de eternizá-los em
nossos corações.
Aos meus cunhados Bruno e Daniel e ao meu afilhado
Enzo, por fazerem parte deste alicerce tão importante
chamado família.
Aos meus professores, pela dedicação e comprometimento
em cumprir tão bem a missão de transferir conhecimento,
formando profissionais “pensantes”.
Aos meus colegas de classe, pelos momentos de
descontração e também de conflitos, pela troca de opiniões
e por terem tornado estes quatro anos inesquecíveis para
mim.
Ao meu orientador Dr. Murillo Lobo Junior e à toda
equipe do laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz
e Feijão, em especial ao Laboratório de Ecologia, que
tornaram este trabalho possível.
Aos meus amigos pelo apoio durante todo curso e por
compreender minhas ausências.
À toda equipe do Uni-ANHANGUERA pelo cuidado em
atender as necessidades de toda a turma e garantir a
realização deste curso.
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Pouca Ciência torna os homens orgulhosos;
muita Ciência os torna humildes. Assim, as
espigas vazias elevam a cabeça soberba,
enquanto as cheias inclinam-se humildemente
para a terra”. (Anônimo)
"E mesmo que meus passos sejam falsos,
mesmo que os meus caminhos sejam errados,
mesmo que meu jeito de levar a vida te
incomoda, eu sei quem sou, e sei pelo que
devo lutar, se você acha que meu orgulho é
grande, é porque nunca viu o tamanho da
minha FÉ!"
(Tião Carreiro)
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RESUMO
Mofo-branco causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum ocorre frequentemente em feijão, soja, algodão, e mais 400 espécies. Provoca perdas de até 100% e inviabiliza áreas de cultivo. O controle químico apresenta pouca eficiência, pois aplica-se para proteção das plantas, sem alcançar o inóculo do fungo que está no solo. O controle biológico por meio de espécies do fungo Trichodermasp. oferece bons resultados no controle do mofo-branco. Porém, formulados comerciais disponíveis apresentam melhor desempenho em temperaturas próximas a 25ºC. Nota-se redução da eficiência do controle por Trichoderma em regiões com temperaturas moderadas, ideais para ocorrência do mofo branco. O objetivo do trabalho foi selecionar um ou mais isolados de Trichoderma sp. eficientes no controle de S. sclerotiorum a baixas temperaturas. Com o método do bioensaio, preparou-se suspensão de conídios de Trichoderma sp. com concentração de 2x109conídios/mL aspergidos sobre escleródios, e avaliou-se por 30 dias o parasitismo de escleródios de S. sclerotiorum por 27 isolados de Trichoderma sp., da coleção de microrganismos funcionais da Embrapa Arroz e Feijão. Após 30 dias sob 20°C e fotoperíodo de 12 horas, escleródios foram desinfestados e colocados sobre discos de cenoura para avaliar parasitismo e viabilidade. Grande maioria dos isolados de Trichoderma sp. apresentou baixo índice de parasitismo, exceto os isolados TR770 e TR832 os quais proporcionaram mais de 80% de parasitismo. A viabilidade dos escleródios em geral, foi alta, com médias de até 100% de escleródios viáveis. Porém, destacou-se o isolado TR770, com apenas 20% dos escleródios viáveis após aplicação, diferindo dos demais tratamentos. Concluiu-se que em condições de baixa temperatura os isolados de Trichoderma sp. em sua maioria, apresentaram pouca eficiência no controle. Porém, a avaliação da coleção de culturas permitiu a seleção do isolado TR770, que apresentou potencial para o controle do fungo Sclerotinia sclerotiorum sob temperaturas amenas. PALAVRAS-CHAVE:Mofo-branco. Controle biológico.Bioensaio. Coleçãode culturas.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 9
2 REFERENCIAL TEÓRICO 10
2.1Doenças de plantas como causa de perdas de produtividade 11
2.2Mofo-branco e seu manejo 13
2.3Controle biológico 16
2.4Trichoderma como agente de biocontrole de S. sclerotiorum 20
3 MATERIAL E MÉTODOS 23
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 27
5 CONCLUSÕES 29
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 32
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1 INTRODUÇÃO
A população mundial nos últimos 30 anos aumentou em 1 bilhão de pessoas, com
uma expectativa de 7,2 bilhões de consumidores em 2015. Deste modo há uma elevação da
demanda mundial por alimentos, incluindoproteínas de origem vegetal e animal. O aumento
na demanda por grãos provindos do Brasil é estimado em 20% (NEVES, 2009) o que gera
oportunidades para o crescimento da agropecuária e um desafio em atender esse mercado em
crescimento constante.
Existem vários fatores que podem impedir o bom desenvolvimento do agronegócio,
entre eles, está a falta de investimento do país em logística, principalmente em relação ao
escoamento da produção, na melhoria de estradas, etc. Mas por outro lado, há riscos que se
encontram ainda nos sistemas de produção, como os problemas fitossanitários que os
produtores enfrentam em suas lavouras, na forma de epidemias de pragas e doenças, que
colocam em risco a produção agrícola e todo o investimento aplicado.
Como afirma Blum (2006), as perdas provocadas por problemas fitossanitários nas
culturas dependem de cada região e dos tipos de práticas adotadas para o manejo e controle
dessas enfermidades. De acordo com este mesmo autor, as doenças ou fitomoléstias são
alterações deletérias ou maléficas, de ordem bioquímica, fisiológica, citológica, histológica ou
morfológica na planta, que constituem os sintomas provocados pela ação contínua de
fitopatógenos sobre esses indivíduos.De acordo com Carvalho et al.(2011), a presença de
patógenos nas culturas, principalmente habitantes do solo, também provocam perdas de
qualidade das sementes e causam desuniformidade na germinação, reduzindo o estande inicial
e os rendimentos finais para o produtor.
Para que ocorra a doença na planta, é necessária a interação entre três fatores
cruciais, que compõem o triângulo da doença: presença de patógeno virulento na área,
condições climáticas que favoreçam o desenvolvimento do mesmo e hospedeiro susceptível
àquela espécie de patógeno.O homem contribui de forma positiva ou negativa para a
ocorrência de doenças na área de cultivo, pois é dele a decisão quanto à época de semeadura,
que pode coincidir com a época favorável ao patógeno; a variedade a ser cultivada, que deve
ser resistente ou tolerante, se houver essa opção; e a escolha de sementes livres de
contaminantes, preferencialmente tratadas com fungicidas específicos, além da rotação de
culturas com espécies que não sejam hospedeiras (VIEIRA; PAULA JÚNIOR; BORÉM,
2006). Como exemplo de um importante fitopatógeno pode-se citar o fungo causador do
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mofo-branco, Sclerotinia sclerotiorum, que ocorre com frequência nos campos brasileiros,
principalmente em cultivos de soja e feijão.
O manejo de doenças de plantas, visa impedir a entrada do patógeno na área de
produção, quando este não está presente pelo método da exclusão, em que utiliza-se sementes
sadias e tratadas; além do isolamento do campo de produção, a correta limpeza dos
implementos que serão utilizados, entre outras práticas. Porém, quando o patógeno já se
encontra na área, deve-se optar pela rotação de culturas, incorporação profunda de restos de
cultura contaminados, que visa a erradicação ou redução da densidade de inóculo (VIEIRA;
PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2006).
Os danos provocados pelo uso excessivo de produtos químicos é assunto recorrente
em várias partes do planeta, procura-se substituir ou diminuir este uso para assim, reduzir os
efeitos maléficos ao meio ambiente. Como afirma Grigoletti, Santos e Auer (2005), o uso
indiscriminado de agrotóxicos gera vários efeitos como a seleção de patógenos resistentes,
surtos de doenças antes consideradas secundárias, redução dos organismos benéficos
presentes na microbiota do solo, danos à saúde humana, aos animais, ao meio ambiente por
meio do acúmulo de resíduos nos solos, água e alimentos, entre outros.A partir daí, surgiu a
necessidade de se buscar fontes alternativas de controle, como o controle biológico de
doenças de plantas, em que utiliza-se espécies de microrganismos que por meio de
mecanismos próprios conseguem inibir ou reduzir o efeito danoso do patógeno sobre a planta.
O controle biológico com espécies de Trichoderma vêm sendo retratado em várias
publicações e com várias espécies de fitopatógenos. Como destaque o controle do fungo S.
sclerotiorum por espécies do fungo Trichoderma sp.Dentre vários trabalhos publicados, com
os mais variados resultados, há um déficit quando se trata do controle do mofo-branco em
condições ótimas de desenvolvimento da doença, definidas como alta umidade do solo e
temperaturas amenas a baixas (15° a 20°C). O Trichoderma, por sua vez, atua melhor na faixa
próximo a 25ºC. Esta diferença entre faixas de atuação pode gerar reflexos negativos na
eficiência destes produtos no campo, pois é necessário que o produtor controle esta doença em
sua época mais favorável. Como afirma Johnson, Bernard e Qian (1987),Trichodermasp. é
relatado como importante agente de biocontrole para doenças de solo, como as provocadas
por Rhizoctonia sp., Pythium spp., entre outros, porém, apresenta eficiência limitada com
doenças mais severas em condições de baixa temperatura.
Com isso, o objetivo do trabalho foi selecionar isolados de Trichoderma spp.,que
apresentem eficiência no controle de Sclerotinia sclerotiorum, identificando os isolados mais
promissores para etapas mais avançadas de seleção de antagonistas.
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2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Doenças de plantas como causa de perdas de produtividade
As perdas na produção causadas por doenças são conhecidas há muitos anos, como a
requeima da batata, provocada pelo fungo Phytophthora infestans, que causou a morte de
milhões de pessoas entre os anos de 1845 a 1846 na Irlanda, ou a contaminação de produtos
provindos de trigo ou cevada pelo fungo Claviceps purpurea, que causa o ergotismo em seres
humanos, e em casos mais graves até a morte (AMORIM; REZENDE; BERGAMIN FILHO,
2011). De acordo com Ghini e Bettiol (2000), as doenças ocorrem para manter o equilíbrio
biológico e a ciclagem de nutrientes, porém estas se apresentam de forma endêmica,
provocando epidemias, resultado da interferência humana neste equilíbrio, que favorece o
aumento de microrganismos maléficos, como o cultivo de plantas geneticamente homogêneas.
O fator ambiental tem grande influência na ocorrência de doenças, como afirma
Ghini (2005): “o ambiente pode influenciar no desenvolvimento e na suscetibilidade da planta
hospedeira, a multiplicação, a sobrevivência e as atividades do patógeno, assim como na
interação entre planta hospedeira e patógeno”. E reforçamAgrios e Sutton(1997; 1988 apud
DIAS et al., 2005, p. 546), “as variáveis climáticas, entre elas a temperatura, exercem
importância crucial tanto na infecção quanto na colonização do patógeno, constituindo a
variável climática mais correlacionada com respostas biológicas”. Tal importância é relatada
em estudos como realizado por Dias et al. (2005), que avaliou o efeito da temperatura no
crescimento micelial, produção e germinação de conídios de Colletotrichum sp., encontrou-se
a faixa de temperatura entre 22°C e 28°C como a temperatura ideal para o desenvolvimento
deste microrganismo. Com diferentes resultados entre os isolados, percebeu-se que a
temperatura é uma das principais variáveis que influenciam na infecção e colonização do
patógeno sobre o hospedeiro.
No campo, as áreas irrigadas por pivô central apresentam geralmente umidade do
solo mais elevada, e aliadas a temperaturas amenas (15ºC a 20ºC), proporcionamaos
microrganismos boas condições para seu desenvolvimento. Como afirmam Vieira; Paula
Júnior e Borém (2006), técnicas que visam o melhor aproveitamento dos recursos e uma
melhor produtividade, como o uso da irrigação e adoção doSistema Plantio Direto (SPD),
além de vantagens têm apresentado desafios no manejo das lavouras, principalmente quando
se trata de doenças causadas por patógenos habitantes dosolo, que encontram nestes locais,
condições altamente favoráveis para se desenvolverem. Porém, há também trabalhos que
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relatam sobre o benefício da palhada do SPD na proteção de plantas em relação a algumas
doenças, como o mofo-branco, pois o fungo encontra uma barreira física no momento de
liberação de suas estruturas reprodutivas (GÖRGEN et al., 2009).
Vários são os casos relatados na literatura sobre patógenos que atacam as culturas,
sejam elas de valor econômico ou não, como no trabalho realizado pelos autores Oliveira et
al. (2014), em queavaliaram a ocorrência de fungos sobre as folhas de mudas de espécies da
Caatinga, responsáveis por provocar manchas foliares. Entre as espécies encontradas estão
Oidium sp., Ovulariopsis sp. e Uromyces sp., Alternaria sp.,Colletotrichum sp., dentre outros.
Em cultivos de importância econômica, pode se citar como exemploa lavoura de soja, que no
final do seu ciclo produtivo é atacada por vários patógenos, que compõem o complexo de
doenças de final de ciclo, como exemplo a mancha parda, causada pelo fungo Septoria
glycines e a mancha púrpura causada por Cercospora kikuchii. Este conjunto de doenças
provocam perdas de produtividade de grãos acima de 30% (CARNIEL; MENOSSO;
BALBINOT JÚNIOR, 2014).
No cafeeiro, entre as enfermidades de grande importância para a cultura estão
aquelas provocadas por espécies de fungos do gênero Colletotrichum. Este fungo provoca
doenças como a antracnose em folhas, frutos e ramos, seca de ponteiros e a mancha
manteigosa que causam a perda da produtividade do café (PEREIRA et al., 2005). No arroz,
dentre as doenças ocorridas está o mal-do-pé causada por Gaeumannomyces graminis que
provoca amadurecimento rápido dos grãos e até morte dos perfilhos, o sintoma característico
da doença é a coloração marrom escura ou preta na bainha, na base do colmo, o que provoca a
morte da planta em estádios avançados. Em experimento objetivando-se o controle genético
desta doença, avaliou-se 12 genótipos de arroz em relação à resistência relativa, com
resultados pouco satisfatórios, em que todos os genótipos avaliados, apresentaram reação de
suscetibilidade (PRABHU; FILIPPI, 2002). No tomate, dentre outras doenças, ocorre a
septoriose ou mancha-de-septória causada pelo fungo Septoria lycopersici, cada vez mais
recorrente nos campos de produção.O patógeno causa severa desfolha o que reduz a
produtividade e qualidade dos frutos, com perdas de 100% da produção em alguns casos
(RIBEIRO et al., 2013).
Alguns exemplos de doenças que ocorrem no maracujazeiro são a mancha bacteriana
(Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae), queima foliar (Thanatephorus cucumeris),
antracnose (Colletotrichum gloeosporioides), vírus do endurecimento dos frutos do
maracujazeiro (CABMV), verrugose (Cladosporium herbarum e Sphaceloma sp.), entre
outras. Elas provocam a morte precoce da planta, queda na qualidade e produtividade dos
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frutos. Em experimento realizado com objetivo de avaliar a incidência de tais doenças sobre
seis híbridos e quatro cultivares de maracujazeiro, obteve-se 100% de incidência entre as
plantas com diferentes graus de intensidade de infestação (FREIRE, et al., 2014). Há também
relatos da ocorrência de doenças em cultivos protegidos (estufas) sendo estas, algumas vezes,
mais graves do que as ocorridas em ambiente convencional, devido às condições ambientais
mais favoráveis ao desenvolvimento de patógenos (irrigação, densidade de plantas,
monocultivo) e o bom estado nutricional apresentado pelas plantas, o que eleva a
predisposição das mesmas ao ataque de microrganismos. Os danos provocados por tais
doenças além de causar danos aos cultivos, podem inviabilizar a atividade em algumas áreas
(VIDA et al., 2004).
As sementes utilizadas no cultivo de qualquer cultura, devem ser a primeira
preocupação do agricultor, pois junto a elas, podem vir sementes de outras espécies
indesejáveis e/ouinóculos de doenças que ocasionará danos à lavoura e consequente redução
de produtividade. De acordo com Choudhury (1985) entre os danos causados por sementes
infectadas estão a redução da qualidade das sementes, perda de vigor e consequente perda de
germinação, queda na produção e introdução de fitopatógenos em áreas isentas.
Além disso, a produção de alimentos deve adotar algumas normas e exigências, pois
como afirma Neves (2009), o mercado apresenta consumidores cada vez mais exigentes e
preocupados com o modo de produção dos países, o que exige maior preparo do agronegócio
nacional.E reforçam Pria e Silva (2010), o perfil dos consumidores tem sofrido alteração ao
longo dos anos, que estão mais exigentes em qualidade, mas que esta qualidade esteja
associada ao mínimo de degradação dos recursos naturais.Ghini e Bettiol (2000) ainda
afirmam que, a preocupação da sociedade em relação ao impacto da agricultura no meio
ambiente e a contaminação da cadeia alimentar com produtos químicos, têm feito surgir
segmentos de mercado com produtos diferenciados, que não utilizam químicos ou que
apresentem certificação/selos que comprovem a boa utilização desses produtos.Surge a partir
daí, a demanda por uma agricultura sustentável, que visa produzir suprindo as necessidades
das gerações atuais e futuras, degradando o mínimo possível o meio ambiente.
2.2 Mofo-branco e seumanejo
O primeiro registro da ocorrência de S. sclerotiorum no Brasil aconteceu em 1921
em lavouras de batata (Solanum tuberosum L.) no Estado de São Paulo (CHAVES, 1964),
com a transmissão do patógeno por meio de sementes. Atualmente, a doença está presente em
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todas as regiões agrícolas do país. Nos sintomas iniciais, como descritos por Purdy (1979), há
a formação de micélio branco e escleródios tanto no interior como em volta da planta. A
presença do micélio branco e cotonoso dá origem ao nome da doença (NASCIMENTO,
2012), e são notados nos tecidos infectados, que se tornam secos, leves e quebradiços e as
sementes perdem o brilho, com aspecto enrugado e mais leves (VIEIRA; PAULA JÚNIOR;
BORÉM, 2006).
O fungo causador do mofo-branco é conhecido desde 1884 por provocar danos em
hortaliças como a queda de plântulas (damping-of), em cidades do hemisfério norte (PURDY,
1979). De acordo com Nascimento (2012), omofo-branco,ocorre em regiões com
temperaturas amenas e alta umidade, como a Região Sul do Brasil e Chapadas dos Cerrados.O
fungo apresenta uma ampla gama de hospedeiros, com exceção das gramíneas
(NASCIMENTO, 2012).
Como relatado por Purdy (1979) esta doença se tornou muito importante nos cultivos
de girassol no Estados Unidos, em 1920, e logo depois em plantações de amendoim, damasco,
figo, tomates em estufa, entre outros. Henneberg et al. (2012) ainda ressalta que sua
ocorrência está relacionada tanto em regiões temperadas como em tropicais e subtropicais e
em condições favoráveis. Sua disseminação se dá principalmente por sementes infectadas.
Porém, apesar da ocorrência do mofo-branco nas lavouras ser favorecida em áreas
relativamente úmidas e frias, há relatos de sua ocorrência em locais quentes e secos. Purdy
(1979) ressalta que o fungo se torna menos ativo em temperturas abaixo de 0°C e acima de
32°C.
A infecção do fungo ocorre através da penetração de hifas e secreção de ácido
oxálico na planta hospedeira. O ácido oxálico atua na reduçãodo pH da planta hospedeira e
auxilia na produção de enzimas que degradam a parede celular, o que compromete as
respostas de defesa do hospedeiro (CESSNA et al., 2000).Após a infecção são formadas
estruturas de resistência negras e duras, conhecidas por escleródios que por ocasião da
colheita caem sobre o solo e sobrevivem por vários anos.Quando as condições de umidade e
temperatura favoráveis ao patógeno retornam, os escleródios germinam formam os apotécios,
responsáveis por liberar os ascósporos, inóculo primário do fungo (NASCIMENTO, 2012),
que infectam as flores das hospedeiras (PURDY, 1979).Quando as flores infectadas caem
sobre hastes, folhas ou vagens do feijoeiro, ocorre a infecção das plantas. Os ascósporos
permanecem no campo por até 12 dias, e são dispersos pelo vento (FREIRE, 2011) e
porrespingos d’água provindos da chuva ou da irrigação, e são depositados nas plantas da
mesma área ou em cultivos próximos (VIEIRA; PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2006).
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Nascimento (2012) ressalta que a germinação de apotécios é influenciada pelo
fechamento das fileirasda cultura, e é intensificadopelo menor espaçamento entre
linhas.Ethuri et al. (2005) destaca que, a germinação miceliogênica do escleródio, que forma o
micélio branco característico da doença, ataca a base da planta mais próxima e causa
tombamento de pré e pós-emergência, quando a germinação é carpogênica, dando origem ao
apotécio, há a liberação de ascósporos (esporos do fungo) e o ataque se iniciará geralmente na
parte aérea pela infecção de flores.
De acordo com Goulart (2013), o mofo-branco foi constatado pela primeira vez na
cultura do algodoeiro em 1996 na cidade de Paracatu, Minas Gerais, onde se cultivava a
variedade Deltapine. Freire (2011), ressalta que os primeiros relatos ocorreram nos estados da
Bahia e Goiás em áreas cultivadas anteriormente com feijão irrigado por pivô central. Apesar
de também ter sido constatada em áreas com algodão de sequeiro, em regiões de altitude, com
redução do estande inicial e danos severos em plantas adultas. Os sintomas na cultura do
algodão são murcha, necrose e podridão úmida em hastes, pecíolos e maçãs. Os escleródios
são formados tanto na parte externa quanto interna das maçãs do algodoeiro, sendo estes
maiores do que os formados em soja e feijão, e sobrevivem no solo por vários anos. Quando
há condições ambientais favoráveis, os escleródios germinam dando origem a muitos
apotécios.Atualmente, a doença está disseminada em quase todas as áreas produtoras,
independentemente de serem áreas de cultivo irrigado ou sequeiro.
A introdução desta doença em áreas ainda isentas, ocorre principalmente por
sementes infectadas com micélio dormente ou com escleródios misturados ou aderidos à elas.
Provavelmente,a doença foi introduzida nos campos de produção dos Cerrados,
principalmente por sementes de nabo forrageiro, canola, feijão, girassol, soja e algodão
contaminadas com estruturas do fungo (GOULART, 2013). O micélio dormente presente nas
sementes infectadas, mantêm-se viável por até três anos ena maioria das vezes estes não
germinam, mas permanecem viáveis (REIS, 2009).Assim como menciona Goulart (2013), a
disseminação da doença ocorre pelo manejo inadequado dos fatores de produção, como a
utilização de sementes impróprias, que foram mal ou não beneficiadas, sementes piratas,
implementos agrícolas que foram utilizados em áreas contaminadas e que não passaram por
um processo de limpeza adequado.
O controle químico de doenças é utilizado na maioria das culturas de importância
agronômica, já que estas apresentam elevada susceptibilidade à fitopatógenos. Os fungicidas
são uma alternativa viável de controle pela fácil aplicação se comparado a outros métodos, e
por apresentar geralmente resultados rápidos e satisfatórios. Porém, o uso excessivo desses
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produtos pode induzir a resistência de fitopatógenos ao ingrediente ativo que o compõe, além
dos danos ambientais (BLUM, 2006). De acordo com dados da FAO (Food and Agriculture
Organization) em 1998, o Brasil é apontado como um dos países que mais exageram na
aplicação de agrotóxicos nas lavouras, principalmente na horticultura (MORAGAS;
SCHNEIDER, 2003). Ghini e Bettiol (2000), afirma que o uso de químicos é um método
atraente por sua simplicidade, previsibilidade e necessidade de pouco conhecimento sobre o
agroecossistema para sua aplicação porém, estima-se que 90% do que é aplicado não atinge o
alvo, sendo dissipado para reservatórios de água ou para o solo. Essas perdas provêm da má
aplicação, tanto da tecnologia utilizada quanto do momento que o produto foi aplicado.
O manejointegrado de doenças (MID) visa reduzir ou eliminar os danos causados
pelas enfermidades nas plantas por meio de diferentes técnicas. Essas técnicas buscam atuar
sobre os três vértices do triângulo da doença (planta hospedeira, patógeno virulento ou
ambiente favorável), e assim reduzir consequentemente as condições favoráveis para que tal
doença ocorra (BLUM, 2006). A rotação de culturas é uma das alternativas para o controle de
enfermidades, e junto ao SPD há a formaçãoda palhada da cultura anterior que é utilizada por
microrganismos, favorecendo o controle biológico natural, porém, esta tática só funciona para
os primeiros focos da doença. Inicialmente, observa-se umaredução do inóculo da doença
presente na área, no caso do mofo-branco, e de suas estruturas de resistência, os escleródios,
como observadoem solos cultivados com soja erotacionados com cultivos contínuos de
pastagem por um período de três anos (TRECENTI,2012).Outro método de controle é o
tratamento de sementes com fungicidas, que é uma prática econômica e eficaz para evitar ou
retardar a disseminação do fungo, além de auxiliara boa emergência das plântulas e diminuir
as necessidades de ressemeadura (GOULART, 2013).
De acordo com Freire (2011), não existem variedades resistentes ao mofo branco e o
manejo químico além de oneroso, apresenta pouca eficiência, devido à barreira física
apresentada pelo dossel da cultura no momento da aplicação. Umaferramenta para o controle
do mofo-branco muito importante e bastante utilizada nos locais de ocorrência, é o controle
biológico aplicado, por meio da introdução deantagonistas como espécies do fungo
Trichoderma spp.
2.3 Controle biológico
O uso do MID, auxilia na manutençãodas populações de patógenos abaixo do nível
de dano econômico e minimiza os efeitos negativos ao ambiente (VIEIRA; PAULA JÚNIOR;
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BORÉM, 2006). Dentro deste manejo integrado está o controle biológico de doenças, que se
trata da“redução da densidade de inóculo ou das atividades determinantes da doença
provocado por um patógeno ou parasita, nos seus estados de atividade ou dormência, por um
ou mais organismos, realizado naturalmente ou por meio da manipulação do ambiente,
hospedeiro ou antagonista, ou pela introdução em massa de um ou mais
antagonistas”(BAKER e COOK 1974 apud GRIGOLETTI; SANTOS; AUER,2005). De
acordo com Grigoletti, Santos e Auer (2005), o controle biológico quando comparado ao
químico, não apresenta efeito imediato e total, sendo necessário integrar outros métodos de
controle ao sistema. A eficiência do controle biológico está associada ao melhor
conhecimento da interação patógeno x antagonista, e dos fatores edafoclimáticos, que podem
se tornar limitantes ao potencial antagonístico do bioagente quando estiverem fora do ideal.
Há muitos anos, os seres humanos têm adotado práticas empíricas de controle
biológico de enfermidades de plantas. Esse conhecimento foi passado de geração para
geração, até chegar nos modernos experimentos e técnicas adotadas atualmente. No século
XX, vários cientistas introduziram, conscientemente, antagonistas em meios de cultivo
contendo patógenos, e obtiveram bons resultados, como no experimento realizado por Hartley
(1921), se testou o controle do tombamento de plantas com fungos selecionados in vitro
(ROMEIRO, 2007). Os cientistas perceberam que era possível reduzir a severidade de
doenças com microrganismos introduzidos ou nativos. A partir daí, muitostrabalhos foram
publicados em torno deste tema.
A busca pela produção sustentável de alimentos, deve levar em consideração a
redução do uso de insumos químicosnas lavouras, principalmente os produtos fitossanitários,
e optar por outras alternativas que favoreçam o processo biológico e natural em todo o sistema
(PRIA; SILVA, 2010). De acordo com Ghini e Bettiol (2000), agricultura sustentável envolve
o manejo adequado dosrecursos naturais, evitando a degradação do ambiente de forma a
permitir asatisfação das necessidades humanas das gerações atuais e futuras. Dessa forma é
possível reduzir o risco de surgimento de raças de organismos patogênicos resistentes a certos
tipos de ingredientes ativos dos agroquímicos; a menor contaminação dos recursos naturais,
como solos, rios, lençóis freáticos, etc., e manter os ecossistemas locais estáveis e
equilibrados, entre outros benefícios (BLUM, 2006).
O Controle biológico é uma boa alternativa, pois visa a manutenção do equilíbrio do
agroecossistema, em que o antagonista por meiode mecanismos próprios, consegue reduzir os
efeitos danosos da ação dos fitopatógenos ao hospedeiro, utilizando estratégias como a
aplicação maciça de antagonistas, o que auxilia na alteraçãodo ecossistema de modo a
18
favorecer o desenvolvimento do bioagente (GRIGOLETTI; SANTOS; AUER, 2005). Como
afirma Carvalho et al. (2011), o controle biológico pode reduzir a quantidade de produtos
químicos aplicados na lavoura, ou até mesmo extinguir essa prática no processo produtivo,
dependendo dos fatores ambientais encontrados na área, o grau de severidade que a doença se
encontra e a forma de manejo adotado na cultura.Esta estratégia de controle pode ser usada
desde o início do planejamento de uma lavoura, como no tratamento de sementes por meio de
bactérias e leveduras para reduzir o mal-do-pé ou a giberela do trigo, ou ainda a proteção
contra fungos maléficos presentes no solo que causam tombamento de plântulas, como
Rhizoctonia solani (MARIANO, et al., 2004).
Entre os organismos que apresentam potencial para atuarem como bioagentes, há
espécies de fungos, bactérias, nematoides e vírus. As espécies de fungos e bactérias
apresentam maior facilidade para a multiplicação massal, tornando mais prática a preparação
de bioprodutos formulados que serão disponibilizadas ao comércio (BLUM, 2006), o que
contribui para maior oferta desses produtos no mercado. Dentre os microrganismos mais
utilizados para o desenvolvimento de bioprodutos, destacam-se para o controle de insetos as
bactérias Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus e os fungos Beauveria bassiana,
Metarhizium anisopliae, Lecanicillium spp. e Isaria spp. Já para as enfermidades de plantas,
destacam-se a bactéria Bacillus subtilis e espécies do fungo Trichoderma (BETTIOL;
MORANDI, 2009), largamente utilizado em pesquisas ao redor do mundo. Blum (2006)
destaca que as espécies de fungo mais utilizadas sãoAcremonium, Ampelomyces, Arthrobotris,
Candida, Pythium, Trichoderma, Tuberculina, Verticilium, etc., e as espécies de bactérias são
Agrobacterium radiobacter, Bacillussubtillis, Erwinia herbícola, Pseudomonas
fluorescens.Estes microrganismos originam produtos utilizados para os mais diversos agentes
fitopatogênicos.
Os agentes de biocontrole utilizam-se de mecanismos para atuarem sobre os
fitopatógenos, caracterizados por hiperparasitismo, antibiose, competição, parasitismo,
predação, hipovirulência, proteção cruzada e indução de resistência no hospedeiro (BLUM,
2006). Dentre os principais patógenos estudados para controle biológico estão Fusarium,
Rhizoctonia, Macrophomina, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis e Crinipellis, que atacam
várias culturas como feijão, soja, algodão, fumo, morango, tomate, etc. (BETTIOL;
MORANDI, 2009). De acordo com Grigoletti, Santos e Auer (2005), o parasitismo é o mais
eficiente mecanismo de controle biológico natural pois, o antagonista necessita das mesmas
condições do patógeno para sobreviver, sendo assim, quando estes bioagentes são coletados
no mesmo ambiente onde serão utilizados, a possibilidade de se adaptarem e serem eficientes
19
é maior. Espécies de Trichoderma sp. podem atuar por meio de antibiose, competição ou
hiperparasitismo, utilizando um mecanismo ou a associação de vários. O antagonista envolve
a hifa do hospedeiro e cresce utilizando o conteúdo celular das células mortas e assim impede
o crescimento do patógeno, além de parasitar estruturas de resistência, como escleródios de
fungos (LIMA, et al., 2009).
Vários trabalhos publicados visam o controle de doenças por meio de
microrganismos antagonistas, como no trabalho realizado por Cunha et al. (2006),
queanalisaram a inibição do crescimento de bactérias fitopatogênicas por rizobactérias, além
da promoção do crescimento radicular e parte aérea da planta proporcionados por essas
espécies benéficas. Utilizou-se isolados de B.subtillis, obtendo bons resultados na inibição do
crescimento de Pseudomonas chichorii.Concluíram que em nível de campo, este método de
controle pode substituir ou minimizar o uso de antibióticos nas lavouras de eucalipto.Em
outros testes,desta vez realizados em laboratório, alguns microrganismos com potencial para
se tornarem bioagentes foram avaliados, quanto à produção de sideróforos, quitinases ou
celulases, alémda capacidade desses bioagentes em induzir resistência às plantas hospedeiras,
obtendo resultados satisfatórios (BARRA et al., 2008).
Melo e Valarini (1995), isolaram 18 rizobactérias da rizosfera do pepino e
observaram que além de atuarem como protetoras do sistema radicular contra o crescimento
de fitopatógenos, como o fungo Fusarium solani,por meio do mecanismo da
antibiose,promoviam também o crescimento das plantas.Outros autores, avaliaramesta mesma
classe de bactérias (rizobactérias) no controle de fungos que atacam a cultura do citros, como
Phythophthora parasitica e P. citrophthora responsáveis por causar a podridão de raízes de
mudas em condições de viveiro. Observou-se a inibição significativa do crescimento micelial
dos patógenos, por meio da produção de substâncias tóxicas (antibiose), além de considerável
promoção de crescimento das plântulas (AMORIM; MELO, 2002).Outro exemplo do uso de
bactérias no controle biológico de enfermidades de plantas, utilizou-se isolados de
Pseudomonas chlororaphis e Bacillus subtilis para o controleda podridão radicular (Pythium
aphanidermatum) em alface hidropônica, obtendo bons resultados quanto à promoção de
crescimento das plantas e à inibição do patógeno com a produção de antibióticos e
competição por espaço e nutrientes (CORRÊA; BETTIOL; SUTTON, 2010).
Ao comparar o efeito da aplicação de fungicidas biológicos à base de Trichoderma
sp., para o controle da requeima do tomateiro, Souza et al. (2014), observou valores de
severidade de doença entre 11,2 e 11,3%, o que sugere elevada eficácia do biocontrole, este
sucesso pode estar associado à capacidade que este bioagente apresenta de sobressair aos
20
mecanismos de defesa dos patógenos, o alto potencial de competição e resistência aos fatores
abióticos. Os autores concluíram que a capacidade micoparasítica das espécies de
Trichoderma sp., o torna uma boa opção para o controle biológico do fungo Phythophthora
infestans, causador da requeima, em condições de campo.Em outro estudo, objetivou-se
encontrar antagonistas presentes naturalmente nas raízes de pepino cultivado em estufa, por
meio do isolamento de fungos potenciais no controle do mofo-branco. No local foram
encontrados isolados pertencentes a quatro gêneros: Trichoderma, Fusarium,Aspergillus e
Penicillium, com destaque para o gênero Trichoderma, que apresentou maior número de
isolados comtotal de 73, e melhor desempenho nos testes in vitro. Este fungo parasitou todos
os escleródios formados pelo patógeno, e modificou a consistência dos mesmos
(amolecimento) o que causou consequente perda da viabilidade dessas estruturas. Concluiu-se
que isolados de Trichoderma sp. são excelentes agentes de biocontrole de S. sclerotiorum,
além disso, seu uso não apresenta danos à saúde humana e ao meio ambiente (ETHURI, et al.,
2005).
Kupper, Gimenes-Fernandes e Goes (2003), encontraram resultados um pouco
diferentes ao avaliar o potencial de controle de Colletotrichum acutatum que causa a queda
prematura dos frutos cítricos, por isolados de Bacillus subtilis e espécies de Trichoderma sp.,
em testes realizados in vitro e in vivo. Não obtendo bons resultados no controle in vivo, por
espécies de Trichoderma sp., devido ao curto período de incubação (48h), visto que, este
fungo necessita de maior tempo para se estabelecer e apresentar eficiência pois, nos testes
realizadosin vitro, o mesmo apresentou maior produção de metabólitos quando incubado por
maior período de tempo. Já os isolados de B. subitilis proporcionaram os menores níveis de
severidade da doença, por meio do mecanismo da antibiose, considerado desse modo um bom
agente de controle para C. acutatum.
2.4 Trichoderma como agente de biocontrole de S. sclerotiorum
O controle biológico do mofo-branco pode ser feito por biofungicidas à base de
Trichoderma sp. A eficiência do bioproduto está relacionadaà eficiência da cepa selecionada,
às condições ambientais e à concentração de esporos presente no formulado. Há relatos de sua
maior eficiência em solos equilibrados, onde se utiliza SPD com boa formação de palhada
(TRECENTI, 2012). Para que haja um efetivo controle, é necessário a redução de fatores
como a quantidade de inóculo primário; a taxa de aumento de epidemias, e a duração da
interação hospedeiro-patógeno (VIEIRA; PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2006).
21
O primeiro estudo envolvendo espécies deTrichoderma sp. foi relatado no ano de
1936, em que se testou a inativação do vírus do mosaico comum do fumo por filtrados de
culturas de Trichoderma (BETTIOL; MORANDI, 2009). Desde então, vários cientistas vêm
se empenhando em pesquisas referentes a este tema, obtendo resultados diversos. Os autores
Carvalho et al.(2011), testaram o controle de Sclerotinia sclerotiorum e outros fitopatógenos,
sobre sementes de feijão inoculadas artificialmente. As sementes contaminadas foram tratadas
com Trichoderma harzianum, e logo após colocadas para germinar. Avaliou-se a germinação
em condições de laboratório e ao campo e o estado físico das plântulas. Como resultado,
obtiveram no total, redução acima de 60% da incidência dospatógenos avaliados nas
sementes. A redução da incidência deS. sclerotiorumnas sementes, particularmente,
apresentou valores acima de 90% de eficiência, porém, não diferiu estatisticamente do
controle químico sob as mesmas condições.
Lima et al. (2009), utilizou meio de cultura rico em nutrientes, constituído de
cenoura e fubá para o crescimento do fungo de Sclerotinia sclerotiorum, logo após, este
micélio foi transferido para outra placa contendo micélio de Trichoderma sp. para avaliar o
pareamento de culturas destes microrganismos, as placas inoculadas com os fungos, tanto de
S. sclerotiorumquanto de Trichoderma sp., foram incubados a 25°C por um período de 120h,
na ausência de luz. Obtendo resultados entre 0 a 2,6 escleródios formados pelo fungo S.
sclerotiorum, com algumas destas estruturas parasitadas pelo fungo de biocontrole, e a
maioria dos tratamentos apresentou redução do crescimento do patógeno. Em outro estudo,
comparou-se a frequência de isolados de Trichoderma sp., extraídos de solos do Alasca,
àqueles isolados tolerantes ao frio, extraídos de solos do Tennessee, e avaliou-se o
crescimento desses isolados em diferentes temperaturas, a 10°C e 12°C, obtendo como
resultado, maior esporulação em 12°C, com espécie mais frequente deT. viride (JOHSON;
BERNARD; QIAN, 1987). A relação entre o potencial de biocontrole de doenças em regiões
com temperaturas mais frias, e o local que os isolados foram coletados, não foi abordado
pelos autores, podendo ser este o ponto crucial para o sucesso do biocontrole.
Figueiredo et al. (2010), avaliou o possível controle de S. sclerotiorum por espécies
de Trichoderma sp. e Ulocladium atrum juntamente com fungicidas químicos, os autores
observaram resultados satisfatórios em relação aos isolados de Trichodermasp. para
antagonismo, porém o isolado de U. atrum não foi eficiente para o controle de S.
sclerotiorum. Com relação ao controle químico, todos os fungicidas testados apresentaram
eficiência, com destaque para Tiofanato metílico. Ao aplicar os tratamentos simultaneamente
22
(químico e biológico) nos testes in vivo, houve redução de 30% da incidência da doença sobre
as plantas.
Geralmente o fungoTrichoderma sp. se desenvolve em temperaturas moderadas, com
níveis ótimos e máximos para o bom desenvolvimento de seu metabolismo e propriedades
antagonistas. Com isso, avaliou-se o antagonismo de isolados de Trichoderma sp. a isolados
de Heterobasidion annosum, que ataca árvores de florestas boreais, em diferentes
temperaturas, por meio do pareamento de culturas. Notou-se eficiência de 63% na inibição
quando incubados sob 21°C, 33% sob 15°C, e crescimento lento e difícil dos isolados de
Trichoderma quando colocados a 4°C, sendo que alguns dos isolados não apresentaram
crescimento (NIKOLAJEVA et al., 2012). O que demonstra a forte influência da temperatura
na eficiência do controle biológico.
Como afirma Ghini (2005), “testes conduzidos em ambientes controlados podem
caracterizar efeitos isolados de determinados fatores ambientais nas interações patógeno-
hospedeiro” e “para doenças estudadas em ambientes fechados, os resultados geralmente não
são representativos”. Corroborado por Grigoletti, Santos e Auer (2005), os testes realizados in
vitro, apesar de sua praticidade para avaliar o comportamento do microrganismo em relação à
adaptação, crescimento e reprodução, podem por muitas vezes, diferir dos resultados
encontrados em campo.O teste do bioensaio se mostra viável devido a sua facilidade e por ser
pouco oneroso, o que facilita sucessivas repetições. Porém, é necessário dispor de maior
espaço para a realização do trabalho. Pois, para a coleta dos resultados é necessário de no
mínimo 60 dias e durante este tempo novas baterias de testes poderão ser montadas em um
outro local, o que evita que esse período fique ocioso.
23
3 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e
Feijão, localizada em Santo Antônio de Goiás.Inicialmente, foi feita a produção massal de
escleródios, por meio do método adaptado de Garcia, Juliatti e Cassemiro (2012). Neste
procedimento, 100 grãos de feijão foram colocados em Erlemeyers de 250 ml de capacidade,
contendo 10 ml de água destilada, e deixados em embebição por um período de 24 horas.
Após esse período, os grãos de feijão passaram por um processo de autoclavagem a 121°C por
20 minutos. Decorridas mais 24 horas, foram inoculados com cinco discos de 6mm de
diâmetro de BDA (Batata Dextrose Agar), em que se cultivou previamenteoisolado de
Sclerotinia sclerotiorum SS-12obtido na coleção de fungos e microrganismos funcionais do
Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão.
Durante 30 dias, os Erlemeyers contendo grãos de feijão inoculados com
S. sclerotiorum, foram mantidos em BOD’s a 25 °C, e submetidos a agitação manual diária
para melhor formação de escleródios dentro do recipiente. Após o período de formação dos
escleródios, eles foram submetidos à lavagem em água corrente, para total separação dos
restos de feijão aderidos, e posteriormente colocados para secar em temperatura ambiente.
Para a montagem do teste, foi utilizado o método do bioensaio,o qual mais se
aproxima da realidade encontrada no campo e elimina efeitos tendenciosos encontrados nos
testes in vitro. Utilizou-se caixas gerbox de 11 x 11 x 3,5 cm contendo 200 gramas de solo
autoclavado, com umidade mantida próxima a 150% da capacidade de campo. Os escleródios
obtidos em meio de feijão, foram dispostos sobre o solo em cinco linhas e cinco colunas,
totalizando 25 escleródios por caixa e utilizou-se delineamento inteiramente ao acaso. (Figura
1). Essas caixas foram colocadas em sala climatizada com 20+ 1°C de temperatura e
fotoperíodo de 12 horas. Preparou-se uma suspensão de esporos com concentração de
2x109conídios/mlde espécies do fungo Trichoderma spp., que foram aspergidos sobre estes
escleródios para posterior avaliação.
24
Figura 1. Montagem do Teste do Bioensaio, com destaque para alinhamento de escleródios dentro da caixa gerbox (dir.) e delineamento inteiramente casualizado das caixas gerbox em sala climatizada (esq.).
Os 27 isolados de Trichoderma spp. em estudo (Tabela 1) foram recuperados da
coleção de fungos e microrganismos funcionais do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa
Arroz e Feijão, provindos de solos do Estado doParaná. Para a produção de conídios de
Trichoderma spp., utilizou-se 10 gramas de arroz parbolizado previamente autoclavado em
Erlemeyers, por 40 minutos à 121°C (Figura 2). Após o resfriamento dos grãos de arroz, estes
foram inoculados com cincos discos de 6mm de diâmetro de BDA, contendo o micélio do
antagonista. Logo em seguida os recipientes foram colocados em incubadoras BOD’s e
mantidos a 25 + 1°C por sete dias e fotoperíodo de 12 horas, submetidos a agitações diárias,
para melhor formação de conídios sobre os grãos de arroz (Figura 3).
Isolados TEST TR727 TR728 TR730 TR739 TR748 TR750
Origem PR PR PR PR PR PR PR
Isolados TR755 TR757 TR758 TR762 TR770 TR773 TR776
Origem PR PR PR PR PR PR PR
Isolados TR782 TR784 TR786 TR788 TR811 TR813 TR819
Origem PR PR PR PR PR PR PR
Isolados TR822 TR824 TR825 TR832 TR833 TR835 TR836
Origem PR PR PR PR PR PR PR Tabela 1. Identificação dos isolados de Trichoderma sp. utilizados no experimento e seu local de origem.
25
Figura 2. Meio de cultivo à base de arroz parbolizado para produção de conídios de Trichoderma sp.
Figura 3. Formação de conídios de Trichoderma sp. em grãos de arroz, após 7 dias de incubação.
Decorridos os sete dias, houve boa formação micelial dentro dos recipientes, o que
propiciou a continuidade dos procedimentos. Adicionou-se 5mL de água destilada dentro do
Erlemeyer, para agitação e obter uma suspensão de conídios. Esta suspensão foi filtrada em
tecido, dentro de tubos Falcon (Figura 4). Houve a diluição dessa suspensão, para ajuste da
concentração de esporos para 2x109 conídios/mL. A contagem de conídios foi feita em câmera
de Neubauer, com auxílio de microscopia ótica. Esta concentração de conídios foi escolhida
de acordo com a quantidade de esporos viáveis indicada pelos fabricantes com produtos à
base de Trichoderma sp. registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA).
26
Figura 4. Filtragem da suspensão de conídios de Trichoderma sp.
Preparadas as suspensões, estas foram pulverizadas sobre os escleródios, com auxílio
de um borrifador manual, sendo 10 mL de suspensão por caixa e três repetições por isoladode
Trichoderma sp. (Figura 5). Além da testemunha em que houve a pulverização com água
destilada. As caixas foram incubadas a 20°C + 1°C e submetidas a pesagens semanais, para
acompanhamento da queda de umidade e consequente reposição de água, afim de manter a
capacidade de campo próxima a 150%. Passados 30 dias, os escleródios foram submetidos à
avaliação visual em relação ao parasitismo dos isolados de Trichoderma sp. As avaliações
foram feitas de forma a avaliar a presença ou não de micélio característico do fungo de
biocontrolesobre os escleródios, calculando-se assim a porcentagem de escleródios
parasitados (Figura 6).
Figura 5. Aspersão de suspensão de Trichoderma sp. sobre escleródios de Sclerotinia sclerotiorum.
27
Figura 6. Avaliação visual da presença de micélio de Trichoderma sp. sobre os escleródios.
Após 60 dias da inoculação dos escleródios pelo Trichoderma sp., estes foram
cuidadosamente removidos das caixas com solo e colocados, cada um, sobre discos de
cenoura previamente esterilizadas, em placas de Petri, contendo um disco de papel filtro ao
fundo, umedecido com 1um de água destilada, para manter a umidade dentro da placa, sem a
adição de antibióticos. Após incubação por 5 dias a 20 °C, avaliou-se os escleródios quanto à
sua viabilidade, por meio do crescimento micelial característico do fungo S. sclerotiorum
sobre os discos de cenoura, que se trata de um substrato rico em nutrientes e portanto viável
para o desenvolvimento fúngico, tanto de S. sclerotiorum quanto de Trichoderma spp.Em
experimento com objetivo de testar diferentes meios para a produção massal de escleródios in
vitro, observou-se bons resultados em relação aos meios de cultura contendo cenoura, grãos
de feijão, girassol e fubá (GARCIA; JULIATTI; CASEMIRO, 2012).
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e ao teste de Scott-
Knot a 5% para separação de médias.
28
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Houve diferença significativa entre os tratamentos para avaliação do parasitismo de
escleródios, com valores de 0% a mais de 80%. Os isolados foram divididos em três
grupos.Em que houve baixo controle, os valores variaram de 0% a 30% de escleródios
parasitados. Os isolados com desempenho intermediário alcançaram médias de 36% a 59%.
Apenas dois isolados o TR770 e o TR832 apresentaram eficiência no parasitismo de
escleródios superior a80% (Figura 7).
Figura 7. Parasitismo de isolados de Trichoderma spp.sobre escleródios de Sclerotinia sclerotiorum, após
pulverização manual, sob temperatura de 20°C.
Os resultados se mostram importantes em relação ao comportamento do fungo em
estudo, de forma a buscar a melhor forma para sua replicação em condições de campo, para
uma melhor atuação do agente de biocontrole sobre o patógeno.Os autores Paula Júnior et al.
(2012), que avaliaram a aplicação de Trichoderma sp., em cultivos de feijão de outono-
inverno, na região da Zona da Mata Mineira, observaram que não houve efeito da aplicação
de Trichoderma sobre a incidência de mofo-branco, com resultados de até 100% de
severidade, fato este se deve às condições favoráveis ao desenvolvimento do patógeno
encontradas nesta época do ano em que as temperaturas variaram de 15,4°C a 18,4°C, e a alta
concentração de inóculo do fungo presente na área. A redução da doença só ocorreu nos
tratamentos em que se utilizou fungicidas químicos. Os autores afirmam, ainda, que apesar de
29
apresentarem bons resultados no controle do mofo-branco em quase todas as áreas de cultivo
pelo país, espécies de Trichoderma sp. podem não ser eficientes quando aplicados em regiões
com temperaturas moderadas, visto que o antagonista é mais adaptado em temperaturas em
torno de 25°C.
A partir do gráfico percebe-se que houve 6% de parasitismo sobre os escleródios do
tratamento testemunha, que foram pulverizados com água destilada. Este fato se deve ao
parasitismo natural que ocorre nos solos, em situação de campo. Mesmo após o solo ter sido
autoclavado, alguns microrganismos ainda permanecem nele, o que torna possível tal
resultado.
A viabilidade de escleródios determinada sobre discos de cenoura é mostrada no
gráfico a seguir (Figura 8). Após o teste de Scott-Knot a 5% os isolados foram separados em 4
grupos, em que os dois primeiros (a e b) apresentam altos índices de viabilidade com médias
em torno de 50% a 100% de escleródios viáveis. As letras c e d indicam viabilidade abaixo de
40%, apenas os isolados TR770, TR832 e TR 836 fazem parte destes grupos, com destaque
para o isolado TR770 queapresentou diferença significativa em relaçãoaos outros tratamentos,
com 20% de escleródios viáveis.
Figura 8. Viabilidade de escleródios de Sclerotinia sclerotiorum após inoculação por isolados de Trichoderma
spp., avaliada em discos de cenoura, com separação de médias pelo teste de Scott-Knot a 5%.
30
De acordo com estes resultados, será feita a identificação da espécie a que pertencem
os isolados. Além do controle ao fungo causador do mofo-branco, pode-se testar também o
controle de outros fungos fitopatogênicos habitantes do solo, como Fusarium sp., Rhizoctonia
sp., entre outros, em diferentes faixas de temperatura e a recomendação deste controle para
outras plantas hospedeiras de S. sclerotiorum.
31
5 CONCLUSÃO
Os resultados se mostraram promissores para o objetivo principal do estudo, que é de
selecionar um ou mais isolados que possuam eficiência no controle S. sclerotiorum em baixas
temperaturas. Portanto, em vista da grande diversidade de isolados pertencentes à coleção de
microrganismos do Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Arroz e Feijão, em torno de 900
isolados de várias partes do país, novos estudos deverão ser feitos com este mesmo objetivo.
A maioria dos isolados de Trichoderma sp.testados neste trabalho não foi eficiente
no parasitismo de escleródios de S. sclerotiorum. Os isolados TR770 e TR832 se destacaram
com os melhores resultados para parasitismo e merecem ser encaminhados para novas etapas
da seleção de antagonistas.
O isolado TR770 apresentou os melhores resultados para parasitismo e viabilidadede
escleródios, em relação aos isolados avaliados no estudo, o que demonstra seu potencial para
controlar escleródios de S. sclerotiorum em condições de temperaturas amenas, porém,
precisará ser feito estudos de campo.
32
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DECLARAÇÃO E AUTORIZAÇÃO
Eu, Leticia Dias de Freitas, e-mail: [email protected], declaro, para os devidos fins e sob pena da lei, que o Trabalho de Conclusão de Curso: Seleção de isolados de Trichoderma sp. provenientes da região Sul do Brasil para o controle de Sclerotinia
sclerotiorum, é de minha exclusiva autoria.
Autorizo o Centro Universitário de Goiás, Uni – ANHANGUERA a disponibilização do texto integral deste trabalho na biblioteca (consulta e divulgação pela Internet, estando vedadas apenas a reprodução parcial ou total, sob pena de ressarcimento dos direitos autorais e penas cominadas na lei.
______________________________________
LETICIA DIAS DE FREITAS
GOIÂNIA (GO), 24 de NOVEMBRO de 2014.
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SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma sp. PROVENIENTES DA REGIÃO SUL DO BRASILPARA O CONTROLE DE Sclerotinia sclerotiorum
FREITAS, Leticia Dias de¹; LOBO JUNIOR, Murillo²
¹Aluna do curso de Agronomia do Centro Universitário de Goiás – Uni-ANHANGUERA. ²Orientador Dr. Murillo Lobo Junior, Embrapa Arroz e Feijão.
Mofo-branco causado pelo fungo Sclerotinia sclerotiorum ocorre frequentemente em feijão, soja, algodão, e mais 400 espécies. Provoca perdas de até 100% e inviabiliza áreas de cultivo. O controle químico apresenta pouca eficiência, pois aplica-se para proteção das plantas, sem alcançar o inóculo do fungo que está no solo. O controle biológico por meio de espécies do fungo Trichodermasp. oferece bons resultados no controle do mofo-branco. Porém, formulados comerciais disponíveis apresentam melhor desempenho em temperaturas próximas a 25ºC. Nota-se redução da eficiência do controle por Trichoderma em regiões com temperaturas moderadas, ideais para ocorrência do mofo branco. O objetivo do trabalho foi selecionar um ou mais isolados de Trichoderma sp. eficientes no controle de S. sclerotiorum a baixas temperaturas. Com o método do bioensaio, preparou-se suspensão de conídios de Trichoderma sp. com concentração de 2x109conídios/mL aspergidos sobre escleródios, e avaliou-se por 30 dias o parasitismo de escleródios de S. sclerotiorum por 27 isolados de Trichoderma sp., da coleção de microrganismos funcionais da Embrapa Arroz e Feijão. Após 30 dias sob 20°C e fotoperíodo de 12 horas, escleródios foram desinfestados e colocados sobre discos de cenoura para avaliar parasitismo e viabilidade. Grande maioria dos isolados de Trichoderma sp. apresentou baixo índice de parasitismo, exceto os isolados TR770 e TR832 os quais proporcionaram mais de 80% de parasitismo. A viabilidade dos escleródios em geral, foi alta, com médias de até 100% de escleródios viáveis. Porém, destacou-se o isolado TR770, com apenas 20% dos escleródios viáveis após aplicação, diferindo dos demais tratamentos. Concluiu-se que em condições de baixa temperatura os isolados de Trichoderma sp. em sua maioria, apresentaram pouca eficiência no controle. Porém, a avaliação da coleção de culturas permitiu a seleção do isolado TR770, que apresentou potencial para o controle do fungo Sclerotinia sclerotiorum sob temperaturas amenas. PALAVRAS-CHAVE: Mofo-branco. Controle biológico. Bioensaio. Coleção de culturas.